CN113546162B - 一种支原体疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种支原体疫苗及其制备方法，属于医药技术领域。一种支原体疫苗，是以支原体膜为抗原，以免疫细胞膜为载体材料，采用DSPE‑PEG2000修饰的粒径为50‑500 nm的支原体疫苗。本发明还提供所述疫苗的制备方法，包括如下步骤：（1）分别制备支原体膜和免疫细胞膜；（2）将所述支原体膜和免疫细胞膜混合，得到混合膜悬浮液；将所述混合膜悬浮液与DSPE‑PEG2000水溶液混合均匀，使用脂质体挤出仪挤压过膜，得到所述疫苗。本发明膜融合支原体疫苗，是灭活疫苗，不仅能够有效预防支原体感染，而且安全性高。

Description

一种支原体疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种支原体疫苗及其制备方法。
背景技术
支原体是引起人和动物肺炎的常见病原。目前，尚无针对人肺炎支原体的商品化疫苗，仅有部分灭活疫苗进入临床试验，其预防肺炎的效果约为40％。减毒活疫苗或灭活疫苗被广泛用于控制猪肺炎支原体感染。与活疫苗相比，灭活疫苗更安全，但由于处理过程中的蛋白变性和降解等因素，免疫效果较弱，因此需要开发更安全有效的预防支原体感染的疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种膜融合支原体疫苗，是灭活疫苗，不仅能够有效预防支原体感染，而且安全性高。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种支原体疫苗，是以支原体膜为抗原，以免疫细胞膜为载体材料，采用DSPE-PEG2000修饰的粒径为50-500nm的支原体疫苗。
在本发明中，所述支原体膜为人和动物支原体细胞膜，所述免疫细胞膜为巨噬细胞膜。
在本发明中，所述巨噬细胞膜是采用干扰素γ诱导后的巨噬细胞膜。
本发明还提供所述疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别制备支原体膜和免疫细胞膜；
(2)将所述支原体膜和免疫细胞膜混合，得到混合膜悬浮液；将所述混合膜悬浮液与DSPE-PEG2000水溶液混合均匀，使用脂质体挤出仪挤压过膜，得到所述疫苗。
在本发明中，所述支原体膜和免疫细胞膜分别采用如下方法制备：将支原体或免疫细胞用PMSF水溶液重悬，在冰水浴中孵育，冻融，然后离心，收集支原体膜或免疫细胞膜。
在本发明中，免疫细胞膜来源于干扰素γ诱导培养的巨噬细胞。
在本发明中，所述干扰素γ诱导培养的浓度为20-50ng/ml，诱导培养时间为20-28小时。
在本发明中，所述混合膜液中支原体膜和免疫细胞膜的质量比为1:0.1-2；DSPE-PEG2000水溶液与混合膜悬浮液的体积比为1:8-10，所述DSPE-PEG2000水溶液的浓度为4-6mg/ml；
在本发明中，所述混合膜液中支原体膜和免疫细胞膜的浓度分别为1-3mg/ml。
本发明膜支原体融合疫苗PEG-IM-MP预处理后的BMDCs诱导的CD8+T细胞的比例显著提高，达到了32％，表明PEG-IM-MP能更好地通过树突细胞交叉提呈进而激活T细胞。PEG-IM-MP疫苗组小鼠的淋巴细胞经抗原再刺激后，IFN-γ+CD44+CD8+T细胞比例与对照组相比显著增多；PEG-IM-MP疫苗组小鼠的肺部灌洗液中的细胞，Granzyme B+CD8+T细胞量与对照组相比显著增多，因此PEG-IM-MP疫苗能够在体内有效诱导CD8+T细胞免疫反应。膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP)能有效激活体内效应性记忆T细胞。膜融合支原体疫苗在淋巴结的驻留时间达到72小时。膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP)能明显减少淋巴细胞的浸润，病理学评分为3分，表明膜融合支原体疫苗能够有效预防人和动物支原体感染。由于，膜支原体融合疫苗是一种灭活疫苗，因此安全性高。
附图说明
图1膜融合支原体疫苗的粒径分布图。
图2膜融合支原体疫苗的透射电镜图。
图3膜融合支原体疫苗的免疫荧光图(左列为PEG-MP的免疫荧光图：上图绿色荧光标记的ICAM-1抗体染色结果呈阴性，中图红色荧光标记的支原体膜蛋白P97的抗体染色结果呈阳性红色荧光点，下图合并两种荧光仅呈红色荧光点；中列为PEG-IM的免疫荧光图：上图绿色荧光标记的ICAM-1抗体染色结果呈绿色荧光点，中图红色荧光标记的支原体膜蛋白P97的抗体染色结果呈阴性，下图合并两种荧光仅呈阳性绿色荧光点；右列为PEG-IM-MP的免疫荧光图：上图绿色荧光标记的ICAM-1抗体染色结果呈阳性(绿色荧光点)，中图红色荧光标记的支原体膜蛋白P97的抗体染色结果呈阳性红色荧光点，下图合并两种荧光呈黄色荧光点。)
图4膜融合支原体疫苗通过树突细胞对T细胞的激活作用
图5各疫苗在体内的分布图，左边显示了各小鼠的组别，右边的标尺显示了荧光强度(标尺上由下至上荧光强度逐渐减小)。
图6显示了膜融合支原体疫苗对抗原特异性T细胞的激活作用，纵坐标为IFN-γ+CD44+CD8+T细胞比例。
图7显示了膜融合支原体疫苗对体内T细胞的激活作用，纵坐标为Granzyme B+CD8+T细胞数。
图8显示了膜融合支原体疫苗对支原体感染的保护作用，左边为各组小鼠的肺脏HE染色图，右边为各组小鼠的病理学评分柱状图。
图9显示了膜融合支原体疫苗对体内效应记忆T细胞的激活作用，纵坐标为CD62L低CD44高CD8+T细胞比例。
具体实施方式
完全培养基是在DEME培养基中添加胎牛血清后得到的，胎牛血清的添加量为DEME培养基体积的10％。
实施例1膜融合支原体疫苗的制备
膜融合支原体疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)将猪肺炎支原体J株(购自ATCC公司，编号为27715)培养物经12000g离心20分钟收集菌体。采用如下方法，获得猪肺炎支原体J株的支原体膜：采用PBS缓冲液清洗菌体2次后，用1％(质量百分浓度)的PMSF(苯甲基磺酰氟)水溶液(以去离子水为溶剂)重悬菌体，在冰水浴中孵育15分钟，冻融3次，然后在600-800g离心10分钟收集上清，将该上清在14000g离心30分钟，收集沉淀，即得支原体膜。每次冻融方法如下：将菌体悬浮液在液氮中放置10分钟，然后在37℃水浴中放置10分钟。
(2)传代的鼠巨噬细胞RAW264.7贴壁生长至80％汇合，加入含40ng/ml干扰素γ的完全培养基，在37℃诱导培养24小时，收集活化的巨噬细胞。制备活化的鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞膜(缩写为活化的巨噬细胞膜)，具体方法同猪肺炎支原体J株支原体膜的制备方法。
(3)将支原体膜和活化的巨噬细胞膜分别用去离子水重悬，测定蛋白浓度后，分别调整到蛋白浓度为3mg/ml。将3mg/ml支原体膜悬浮液和3mg/ml活化的巨噬细胞膜悬浮液，按照体积比为1:1混合，得到混合膜悬浮液。按照DSPE-PEG2000水溶液和混合膜悬浮液体积比为1:9，将1体积份5mg/ml的DSPE-PEG2000水溶液加入到9体积份混合膜悬浮液中，37℃搅拌6个小时，使用脂质体挤出仪挤压过孔径为1000nm的膜10次，然后过孔径为100nm的膜10次，最终制备得到尺寸均匀的膜融合支原体疫苗，记为PEG-IM-MP疫苗。
实施例2对照支原体疫苗的制备
1.未融合支原体疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)将猪肺炎支原体J株培养物经12000g离心20分钟收集菌体，按照实施例1中相同方法，制备支原体膜。
(2)将支原体膜用去离子水重悬，测定蛋白浓度后，调整到3mg/ml，得到支原体膜悬浮液。将1体积份5mg/ml的DSPE-PEG2000水溶液加入到9体积份3mg/ml的支原体膜悬浮液中，37℃搅拌6个小时，使用脂质体挤出仪挤压过孔径为1000nm的膜10次，然后过孔径为100nm的膜10次，制备得到尺寸均匀的未融合支原体疫苗，记为PEG-MP疫苗。
2.巨噬细胞膜的纳米囊泡的制备方法，包括如下步骤：
(1)传代的鼠巨噬细胞RAW264.7贴壁生长至80％汇合，加入含40ng/ml干扰素γ的完全培养基，在37℃诱导培养24小时，收集活化的巨噬细胞。按照实施例1中相同方法，制备活化的鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞膜(缩写为活化的巨噬细胞膜，记为IM)。
(2)将活化的巨噬细胞膜用去离子水重悬，测定蛋白浓度后，调整到3mg/ml。将1体积份5mg/ml的DSPE-PEG2000水溶液加入到9体积份活化的巨噬细胞膜(3mg/ml)中，37℃搅拌6个小时，使用脂质体挤出仪挤压过孔径为1000nm的膜10次，然后过孔径为100nm的膜10次，制备得到尺寸均匀的巨噬细胞膜的纳米囊泡，记为PEG-IM。
3.无PEG修饰的膜融合支原体疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)将猪肺炎支原体J株培养物经12000g离心20分钟收集菌体，按照实施例1中相同方法，制备支原体膜。
(2)传代的鼠巨噬细胞RAW264.7贴壁生长至80％汇合，加入含40ng/ml干扰素γ的完全培养基，37℃诱导培养24小时，收集活化的巨噬细胞。制备活化的鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞膜(缩写为活化的巨噬细胞膜)，具体方法同猪肺炎支原体J株细胞膜。
(3)将支原体膜和活化的巨噬细胞膜分别用去离子水重悬，测定蛋白浓度后，调整蛋白浓度到3mg/ml。将支原体膜悬浮液(3mg/ml)和活化的巨噬细胞膜悬浮液(3mg/ml)的按照体积比为1:1混合，得到混合膜悬浮液。将混合膜悬浮液在37℃搅拌6个小时，使用脂质体挤出仪挤压过孔径为1000nm的膜10次，然后过孔径为100nm的膜10次，得到尺寸均匀的无PEG修饰的膜融合支原体疫苗，记为IM-MP疫苗。
4.未激活的巨噬细胞膜融合的支原体疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)将猪肺炎支原体J株培养物经12000g离心20分钟收集菌体，按照实施例1中相同方法，制备支原体膜。
(2)传代的鼠巨噬细胞RAW264.7贴壁生长至80％汇合，加入完全培养基，37℃诱导培养24小时，收集未活化的巨噬细胞。按照实施例1中相同方法，制备未活化的巨噬细胞的细胞膜(缩写为未活化的巨噬细胞膜，记为M)。
(3)将支原体膜和未活化的巨噬细胞膜分别用去离子水重悬，测定蛋白浓度后，调整蛋白浓度到3mg/ml。将3mg/ml支原体膜悬浮液和3mg/ml未活化的巨噬细胞膜悬浮液按照体积比为1:1混合，得到混合膜悬浮液。将1体积份5mg/ml的DSPE-PEG2000水溶液加入到9体积份混合膜悬浮液中，在37℃搅拌6个小时，使用脂质体挤出仪挤压过孔径为1000nm的膜10次，然后过孔径为100nm的膜10次，得到尺寸均匀的未激活的巨噬细胞膜融合的支原体疫苗，记为PEG-M-MP疫苗。
5.红细胞膜融合的支原体疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)将猪肺炎支原体J株培养物经12000g离心20分钟收集菌体，按照实施例1中相同方法，制备支原体膜。
(2)从BALB/c小鼠眼眶取出血液，储存在含有1％(质量百分浓度)EDTA的PBS缓冲液中。然后，2000rpm离心5分钟，收集红细胞。制备红细胞膜，具体方法同猪肺炎支原体J株细胞膜。
(3)将支原体膜和红细胞膜分别用去离子水重悬，测定蛋白浓度后，调整蛋白浓度到3mg/ml。将支原体膜悬浮液(3mg/ml)和红细胞膜悬浮液(3mg/ml)按照体积比为1:1混合，得到混合膜悬浮液。将1体积份5mg/ml的DSPE-PEG2000水溶液加入到9体积份混合膜悬浮液中，37℃搅拌6个小时，使用脂质体挤出仪挤压过孔径为1000nm的膜10次，然后过孔径为100nm的膜10次，得到尺寸均匀的红细胞膜融合的支原体疫苗，记为PEG-R-MP疫苗。
6.灭活支原体疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)猪肺炎支原体J株培养物，经12000g离心20分钟收集菌体，经0.01％(体积百分浓度)甲醛水溶液在37℃灭活24小时，然后12000g离心20分钟收集菌体，用PBS溶液重悬，得到灭活支原体疫苗。
实施例3各疫苗的粒径及鉴别
本实施例中膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP疫苗)来源于实施例1，未融合支原体疫苗(PEG-MP疫苗)、无PEG修饰的膜融合支原体疫苗(IM-MP疫苗)、未激活的巨噬细胞膜融合的支原体疫苗(PEG-M-MP疫苗)、红细胞膜融合的支原体疫苗(PEG-R-MP疫苗)和巨噬细胞膜的纳米囊泡(PEG-IM)来源于实施例2。
利用动态光散射法(Zetasizer,Nano-ZS)测量膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP疫苗)的平均粒径和粒径分布，结果如图1所示，膜融合支原体疫苗的平均粒径为125nm；从图2可见，膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP疫苗)在透射电镜下呈典型的囊泡结构，证实膜融合支原体疫苗为纳米颗粒。另外，未融合支原体疫苗(PEG-MP疫苗)、巨噬细胞膜的纳米囊泡(PEG-IM)、无PEG修饰的膜融合支原体疫苗(IM-MP疫苗)、未激活的巨噬细胞膜融合的支原体疫苗(PEG-M-MP疫苗)和红细胞膜融合的支原体疫苗(PEG-R-MP疫苗)的平均粒径分别为123nm、127nm、125nm、128nm和126nm。
疫苗特征蛋白检测：膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP疫苗)、未融合支原体疫苗(PEG-MP疫苗)和巨噬细胞膜的纳米囊泡(PEG-IM)分别用红色荧光标记的支原体膜蛋白P97的抗体(金斯瑞，产品编号为2A10)和绿色荧光标记的ICAM-1抗体(购自Abcam，产品编号为ab24869)在4℃条件下染色过夜，利用激光共聚焦显微镜检测各疫苗表面的特征蛋白：支原体膜蛋白P97和巨噬细胞膜的特征蛋白ICAM-1。从图3可以看出未融合支原体疫苗(PEG-MP)仅含有支原体膜蛋白P97(红色荧光点)，巨噬细胞膜的纳米囊泡(PEG-IM)仅含有巨噬细胞膜的特征蛋白ICAM-1(绿色荧光点)，而膜融合纳米疫苗(PEG-IM-MP)同时含有支原体膜蛋白P97和巨噬细胞膜的特征蛋白ICAM-1(黄色荧光点)，结果说明膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP疫苗)是由支原体膜和巨噬细胞膜融合而成，同时具有两者的特征蛋白。
另外，通过激光共聚焦显微镜检测，发现未激活的巨噬细胞膜融合的支原体疫苗、无PEG修饰的膜融合支原体疫苗表面具有支原体膜蛋白P97和巨噬细胞膜的特征蛋白ICAM-1。巨噬细胞膜的纳米囊泡表面具有巨噬细胞膜的特征蛋白ICAM-1，红细胞膜融合的支原体疫苗表面具有支原体膜蛋白P97。
实施例4膜融合支原体疫苗体外通过树突细胞交叉提呈激活T细胞实验
本实施例中膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP)来源于实施例1，未融合支原体疫苗(PEG-MP)、未激活的巨噬细胞膜融合的支原体疫苗(PEG-M-MP疫苗)和红细胞膜融合的支原体疫苗(PEG-R-MP疫苗)来源于实施例2。
经小鼠胫骨中提取骨髓间充质干细胞，用含有10ng/ml重组白细胞介素4(购自Stem Cell公司，产品编号为78047.1)、20ng/ml重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(购自Stem Cell公司，产品编号为78017.1)和10％(体积百分浓度)FBS(胎牛血清)的1640培养基培养，每两天换液。一周后，以500g的转速离心10分钟，收集分化得到的小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)。
膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP，总蛋白浓度50μg/ml)、未融合支原体疫苗(PEG-MP，总蛋白浓度50μg/ml)、未激活的巨噬细胞膜融合的支原体疫苗(PEG-M-MP，总蛋白浓度50μg/ml)和红细胞膜融合的支原体疫苗(PEG-R-MP，总蛋白浓度50μg/ml)分别与BMDCs共培养24小时，对BMDCs进行预处理。对照组用含有10％(体积百分浓度)FBS(胎牛血清)的1640培养基对BMDCs进行预处理24小时。将T淋巴细胞按照BMDCs数量的10倍加入各预处理后的BMDCs中，共培养48小时后，将T淋巴细胞用PBS洗三次，接着用抗CD3抗体(Biolegend，产品编号为100205)和抗CD8抗体(Biolegend，产品编号为100733)在4℃条件下染色30min。之后用预冷的PBS洗三次，用流式细胞仪检测细胞的荧光。
实验结果(图4)显示，与未融合支原体疫苗(PEG-MP)、未激活的巨噬细胞膜融合的支原体疫苗(PEG-M-MP疫苗)和红细胞膜融合的支原体疫苗(PEG-R-MP疫苗)预处理后的BMDCs相比，PEG-IM-MP预处理后的BMDCs诱导的CD8+T细胞的比例显著提高，达到了32％，表明PEG-IM-MP能更好地通过树突细胞交叉提呈激活T细胞。
实施例5膜融合支原体疫苗体内分布实验
本实施例中膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP)来源于实施例1，未融合支原体疫苗(PEG-MP)和无PEG修饰的膜融合支原体疫苗(IM-MP)来源于实施例2。
BALB/c小鼠分为三个组别，分别为膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP)组，未融合支原体疫苗(PEG-MP)组，无PEG修饰的膜融合支原体疫苗(IM-MP)组，每组3只。PEG-IM-MP疫苗、PEG-MP疫苗和IM-MP疫苗分别按照常规方法用荧光染料(PKH-67)标记后，经皮下注射到小鼠后颈部，分别在注射后12、24、48和72小时用小动物成像仪(In Vivo Imaging System)拍摄成像。实验结果如图5。可以看到，注射膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP)组的小鼠淋巴结部位的荧光强度在48小时达到最高值，而且荧光强度持续到72小时；未融合支原体疫苗(PEG-MP)组小鼠在整个过程中的荧光强度要弱于膜融合支原体疫苗组(PEG-IM-MP)；无PEG修饰的膜融合支原体疫苗(IM-MP)的荧光在72小时严重衰减，表明膜融合支原体疫苗在淋巴结的驻留时间较长。
实施例6膜融合支原体疫苗体内诱导特异性T细胞实验
本实施例中膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP)来源于实施例1，未融合支原体疫苗(PEG-MP)、巨噬细胞膜的纳米囊泡(PEG-IM)和灭活支原体疫苗来源于实施例2。
BALB/c小鼠分为五个组别，分别为对照组和膜融合支原体疫苗组(PEG-IM-MP)，未融合支原体疫苗组(PEG-MP)，巨噬细胞膜的纳米囊泡组(PEG-IM)和灭活支原体疫苗组。每组3只小鼠。小鼠经皮下注射各组疫苗，免疫两次，每次免疫剂量为50μg/只，其中的50μg是指疫苗中的总蛋白质量。具体免疫方法为：分别将总蛋白质量为50μg的膜融合支原体疫苗、未融合支原体疫苗、巨噬细胞膜的纳米囊泡和灭活支原体疫苗分别溶于100μl PBS溶液接种小鼠，14天后进行第二次免疫，剂量同第一次；对照组的每只小鼠均经皮下注射100μlPBS溶液。二免后14天，取各免疫组和对照组小鼠的脾淋巴细胞，用25mg/mL的猪肺炎支原体J株全菌蛋白处理脾淋巴细胞24小时，收集淋巴细胞，分别用抗CD3抗体(购自Biolegend,产品编号100203)、抗CD8抗体(购自Biolegend,产品编号100733)和抗CD44抗体(购自Biolegend,产品编号103011)在4℃条件下染色30分钟，透膜固定后用抗IFN-γ抗体(购自Biolegend,产品编号505807)室温染色30分钟。之后用预冷的PBS洗三次，用流式细胞仪检测细胞的荧光。
实验结果如图6，可以看到，PEG-IM-MP疫苗组小鼠脾淋巴细胞，经抗原再刺激后，其中抗原特异性的IFN-γ+CD44+CD8+T细胞的比例与对照组、PEG-MP疫苗组、PEG-IM组以及灭活支原体疫苗组相比显著增多，提示PEG-IM-MP疫苗能够有效诱导抗原特异性的CD8+T细胞免疫反应。
实施例7膜融合支原体疫苗体内激活T细胞实验
本实施例中膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP)来源于实施例1。
BALB/c小鼠分为两个组别，分别为对照组和膜融合支原体疫苗组(PEG-IM-MP)，每组3只小鼠。各组小鼠经皮下注射对应疫苗后3天，用NJ株强毒株支原体(Liu,M.；Du,G.；Liu,B.；Hu,Y.；Liu,J.；Jia,Y.；Minion,F.C.；Shao,G.；Zhao,R.,Cholesterolexacerbates Mycoplasma hyopneumoniae-induced apoptosis via stimulatingproliferation and adhesion to porcine alveolar macrophages.VeterinaryMicrobiology 2017,211,112-118.)进行滴鼻感染，感染3天后收集各小鼠的肺部灌洗液中的细胞，用PBS洗三次(每次1ml)。将各小鼠的肺部灌洗液分别用抗CD3抗体(购自Biolegend,产品编号100203)和抗CD8抗体(购自Biolegend,产品编号100733)在4℃条件下染色30分钟，透膜固定后用抗Granzyme B抗体(购自Biolegend,产品编号515406)在4℃条件下染色过夜。之后用预冷的PBS洗三次，用流式细胞仪检测细胞的荧光。
实验结果如图7，可以看到，PEG-IM-MP疫苗组小鼠的肺部灌洗液中的细胞，其Granzyme B+CD8+T细胞量与对照组相比显著增多，提示PEG-IM-MP疫苗能够在体内有效诱导CD8+T细胞免疫反应。
实施例8膜融合支原体疫苗体内预防支原体感染实验
本实施例中膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP)来源于实施例1。
BALB/c小鼠分为三个组别，分别为攻毒组、空白组和膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP)组，每组3只。膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP)组小鼠经皮下注射膜融合支原体疫苗，免疫剂量为50μg/只，其中50μg是指疫苗中的总蛋白质量。具体免疫方法为：将总蛋白质量为50μg膜融合支原体疫苗溶于100μl PBS溶液接种小鼠，14天后进行第二次免疫，剂量同第一次；空白组和攻毒组的每只小鼠均经皮下注射100μl PBS溶液。二免后14天，攻毒组和膜融合支原体疫苗组均用猪肺炎支原体强毒株NJ株进行滴鼻感染，空白组不攻毒；感染14天后，各小组分别取小鼠肺脏，固定后进行HE染色。
实验结果如图8，可见空白组肺结构正常，无明显的组织病理学改变。攻毒组肺泡腔狭窄或闭塞，肺泡壁显著增厚，肺泡腔、肺泡壁和支气管腔有大量淋巴细胞和巨噬细胞等炎细胞浸润，病理学评分为10分。与攻毒组相比，膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP)能明显少淋巴细胞的浸润，病理学评分为3分，表明膜融合支原体疫苗能够有效预防支原体感染。
实施例9膜融合支原体疫苗持续期实验
本实施例中膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP)来源于实施例1。
BALB/c小鼠分为两个组别，分别为对照组和膜融合支原体疫苗组(PEG-IM-MP)，每组3只。膜融合支原体疫苗(PEG-IM-MP)组小鼠经皮下注射膜融合支原体疫苗，免疫剂量为50μg/只，50μg为疫苗中总蛋白的质量。具体免疫方法为：将总蛋白的质量为50μg的膜融合支原体疫苗溶于100μl PBS溶液接种小鼠，14天后进行第二次免疫，剂量同第一次；对照组的每只小鼠均经皮下注射100μl PBS溶液。二免后30天，用抗凝管收集各组小鼠血液，分别用抗CD3抗体(购自Biolegend,产品编号100203)、抗CD8抗体(购自Biolegend,产品编号100733)、抗CD44抗体(购自Biolegend,产品编号103011)和抗CD62L抗体(购自Biolegend,产品编号104407)在4℃条件下染色30分钟。之后用预冷的PBS洗三次，用流式细胞仪检测细胞的荧光。
实验结果如图9，可以看到，PEG-IM-MP疫苗组小鼠外周血中，其中效应记忆T细胞(CD62L低CD44高CD8+T细胞)的量与对照组相比显著增多，提示在二免后30天，PEG-IM-MP疫苗仍然能够在体内有效诱导效应记忆T细胞免疫反应。

Claims (8)

1.一种支原体疫苗，其特征在于：是以猪肺炎支原体膜为抗原，以巨噬细胞的细胞膜为载体材料，采用DSPE-PEG2000修饰的粒径为50-500 nm的支原体疫苗；所述疫苗是采用如下方法制备：（1）分别制备猪肺炎支原体膜和巨噬细胞膜；（2）将所述支原体膜和巨噬细胞膜混合，得到混合膜悬浮液；将所述混合膜悬浮液与DSPE-PEG2000水溶液混合均匀，使用脂质体挤出仪挤压过膜，得到所述疫苗；所述混合膜液中支原体膜和巨噬细胞膜的质量比为1:0.1-2；DSPE-PEG2000水溶液与混合膜悬浮液的体积比为1:8-10，所述DSPE-PEG2000水溶液的浓度为4-6mg/ml。
2.根据权利要求1所述疫苗，其特征在于所述巨噬细胞膜是采用干扰素γ诱导后的巨噬细胞膜。
3.权利要求1所述疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）分别制备猪肺炎支原体膜和巨噬细胞膜；
（2）将所述支原体膜和巨噬细胞膜混合，得到混合膜悬浮液；将所述混合膜悬浮液与DSPE-PEG2000水溶液混合均匀，使用脂质体挤出仪挤压过膜，得到所述疫苗。
4.根据权利要求3所述疫苗的制备方法，其特征在于所述支原体膜和巨噬细胞膜分别采用如下方法制备：将支原体或免疫细胞用PMSF水溶液重悬，在冰水浴中孵育，冻融，然后离心，收集支原体膜或免疫细胞膜。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于所述巨噬细胞膜来源于干扰素γ诱导培养的巨噬细胞。
6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于所述干扰素γ诱导培养的浓度为20-50ng/ml，诱导培养时间为20-28小时。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于所述混合膜液中支原体膜和巨噬细胞膜的质量比为1:0.1-2；DSPE-PEG2000水溶液与混合膜悬浮液的体积比为1:8-10，所述DSPE-PEG2000水溶液的浓度为4-6mg/ml。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于所述混合膜液中支原体膜和巨噬细胞膜的浓度分别为1-3mg/ml。
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