CN108761073A - 一种肺炎支原体抗原检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及体外诊断试剂技术领域,具体涉及一种肺炎支原体抗原检测试剂盒,包括盒体,盒体内设有检测卡和样本提取液瓶;检测卡包括卡盖、卡体和试纸条,试纸条依次设有样品垫层、胶体金层、硝酸纤维素膜和吸水层,样品垫固相生物素标记抗肺炎支原体单克隆抗体A,胶体金层固相抗肺炎支原体单克隆抗体B;硝酸纤维素膜依次设有包被链霉亲和素的检测线和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线。本发明还涉及该试剂盒的制备方法;本发明中的检测试剂盒灵敏度高,可以检测到咽拭子样本中的肺炎支原体抗原。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域,具体涉及一种肺炎支原体抗原检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia)是介于细CFU与病毒之间,能独立生活的最小微生物,大小为200nm。它由口、鼻分泌物经空气传播,引起散发和小流行的呼吸道感染,主要见于儿童和青少年,现在发现在成人中亦非少见,秋冬季较多。支原体肺炎是肺炎支原体引起的急性呼吸道感染伴肺炎,约占非细CFU性肺炎的1/3以上,或各种肺炎的10%,严重的支原体肺炎也可导致死亡。
由于支原体培养的困难,临床上常用的肺炎支原体的检测主要是血清学检测。人在初次感染肺炎支原体时,会先后产生的IgM抗体和IgG抗体,由于抗体持续在体内存在,因此血清学检测不适用于早期诊断,可作为回顾性诊断。
用分离培养和检测抗体的方法均不能达到早期诊断的目的。而抗原检测可做到早期快速诊断,即检测痰、咽拭子、支气管灌洗液中的肺炎支原体抗原。目前已使用的方法有ELISA、聚合酶链反应(PCR)法。但由于条件所限,国内目前还未普及。尤其是PCR法由于存在试剂问题、污染问题,因此在结果判断上一定要慎重。由于肺炎支原体抗原仅存在于咽拭子、痰液、支气管中,这些样本干扰物质较多,且肺炎支原体含量较低,常规胶体金法很难检测到。本发明针对现有技术存在的问题,提供一种肺炎支原体抗原检测试剂盒,利用样本提取液可分离干扰物质并提取肺炎支原体有效成分,使用生物素-亲和素放大系统以显著提高试剂灵敏度,从而检测到咽拭子样本中的肺炎支原体抗原。
发明内容
本发明的目的在于是:针对现有技术存在的不足,提供一种肺炎支原体抗原检测试剂盒,该检测试剂盒灵敏度高,可以检测到咽拭子样本中的肺炎支原体抗原。
为了实现上述目的,本发明的技术方案是:
一种肺炎支原体抗原检测试剂盒,包括盒体,所述盒体内设有检测卡和样本提取液瓶;所述检测卡包括卡盖、卡体和试纸条,所述试纸条依次设有样品垫层、胶体金层、硝酸纤维素膜和吸水层;所述样品垫层固相生物素标记抗肺炎支原体单克隆抗体A,所述胶体金层固相抗肺炎支原体单克隆抗体B;所述硝酸纤维素膜依次设有包被链霉亲和素的检测线和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线。
作为一种优选的技术方案,所述样本提取液瓶内的提取溶液由牛血清白蛋白、叠氮钠以及曲拉通X-100配制而成。
作为一种改进的技术方案,每100mL提取溶液中含有0.5~1g/mL的牛血清白蛋白10~15mL和0.03~0.05g/mL的叠氮钠1~3mL。
本发明的另一个目的是提供一种灵敏度更高的肺炎支原体抗原检测试剂盒的制备方法。
为了实现上述发明的目的,本发明的技术方案是:
一种肺炎支原体抗原检测试剂盒的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
(1)样本提取液的配制
取0.5~1g/mL的牛血清白蛋白10~15mL和0.03~0.05g/mL的叠氮钠1~3mL,用0.3~0.5g/mL曲拉通X-100定容至100mL,得到样品提取液;
(2)胶体金的制备及标记
0.5~1g/mL氯金酸水溶液100mL,加热至沸腾,加入8~10g/mL柠檬酸三钠1.5mL,混匀,继续煮沸10~15分钟,调pH,搅拌下加入2~3mg抗肺炎支原体单克隆抗体B,继续搅拌10~15分钟,加入8~10g/mL NaCl,摇匀,以10000r/min离心10~15min获得的沉淀物即为胶体金标记抗体;
(3)生物素的标记
取1mg/mL N羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)-二甲基亚砜溶液,加入1~2mL、1.2~1.5mg/mL抗肺炎支原体单克隆抗体A,室温下持续搅拌2~3h,在4℃条件下,用缓冲液充分透析后再加入叠氮钠及BSA,得到的生物素标记物置4℃,避光保存;
(4)胶体金和生物素标记物的固相化
4.1预处理:将玻璃纤维用含0.5~1g/L BSA的0.1mol且pH7.2~7.5的PBS缓冲液处理,晾干;
4.2固相化胶体金标记物:取玻璃纤维放入不锈钢盘,量取复溶后胶体金标记物30~40mL倒入不锈钢盘,使金溶液完全均匀吸收,干燥,得到金标垫;
4.3固相化生物素标记物:将玻璃纤维放入不锈钢盘,量取复溶后生物素标记物30~40mL倒入不锈钢盘,使金溶液完全均匀吸收,干燥,得到样品垫;
(5)包被硝酸纤维素膜
5.1包被链霉亲和素:用pH7.2~7.5的PBS缓冲液将链霉亲和素稀释至0.8~1.2mg/mL,喷于硝酸纤维素膜上,形成链霉亲和素检测线;
5.2包被羊抗鼠IgG抗体:用pH7.2~7.5的PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1.4~1.6mg/mL,喷于上述步骤5.1制得的硝酸纤维素膜上,形成羊抗鼠IgG抗体质控线;
5.3将上述步骤5.2制得的硝酸纤维素膜干燥1.5~2小时;
(6)试纸条的制备
在PVC板的中间位置粘贴上述步骤5.3制备的硝酸纤维素膜,在PVC板固定硝酸纤维素膜位置的上方粘贴吸水纸;在PVC板固定硝酸纤维素膜位置的下方,粘贴步骤(4)制备的金标垫及样品垫,压平整后,切成4.0mm宽的试纸条;
(7)检测卡安装
将步骤(6)切好的试纸条置于卡体的凹槽内,将卡盖和卡体扣合,得到肺炎支原体抗原检测卡;将步骤(1)得到的样本提取液装入瓶内,与检测卡分别置于盒体内,得到肺炎支原体抗原检测试剂盒。
作为一种改进的技术方案,所述步骤(2)中用0.1~0.2mol/L的K2CO3或者Na2CO3调pH为7-8。
作为一种改进的技术方案,所述步骤(3)中用pH7.2~7.5磷酸盐缓冲液透析。
作为一种改进的技术方案,所述步骤(3)中叠氮钠的终浓度0.3-0.5g/L,BSA的终浓度为0.8-1.2g/L。
作为一种改进的技术方案,所述步骤4.2中将胶体金标记物与复溶液按1:8-12的比例复溶,所述复溶液含有0.5-1g/mL PEG20000、0.5-1g/mL海藻糖和1-2g/mL Tween20。
作为一种改进的技术方案,所述步骤4.3中将生物素标记物与复溶液按1:8-12的比例复溶,所述复溶液含有1-2g/mL PEG20000、0.5-1g/mL海藻糖和1-2g/mL Tween20。
本发明采用以上技术方案,与现有技术相比,具有以下优点:
1、本发明提供的样本提取液,牛血清白蛋白可保护目的蛋白活性;叠氮钠可延长样本提取液的有效期;曲拉通X-100既可以使抗原蛋白质溶解和分离,又可保留蛋白质的天然构象,大大提高肺炎支原体的提取效率;
2、本发明的试剂盒制备过程中,用0.1~0.2mol/L的K2CO3或者Na2CO3调pH为7-8,可以使胶体金与抗肺炎支原体单克隆抗体A更好的结合,得到稳定的胶体金标记物,同时生物素(BNHS)与抗肺炎支原体单克隆抗体B的比例十分重要,由于与生物素相比抗体体积大,如果抗体量多,聚集在一起会产生空间位阻;本发明采用PEG20000、海藻糖和Tween20的混合液作为胶体金标记物和生物素标记物的复溶液,更有助于胶体金标记物和生物素标记物更好的固相在玻璃纤维上;
3、本发明利用“亲和素-生物素放大系统”,显著提高试剂检测灵敏度,本发明的试剂盒检测灵敏度可达103CFU/mL,具有较好的特异性,能够在抗体出现之前即检测出肺炎支原体抗原,准确判断阳性感染的情况,为治疗提供依据;
4、本发明所采用的技术方案,减少了许多繁琐的程序,方便、快捷、直观,不需特殊仪器也不需专业培训,按说明书即可完成操作,全过程只需20分钟,降低了使用成本,适合医院等基层单位。
附图说明
图1为本发明实施例中试纸条的俯视结构示意图;
图2为本发明实施例中试纸条的侧视结构示意图;
其中,1-试纸条,11-样品垫层,12-胶体金层,13-硝酸纤维素膜,131-检测线,132-质控线,14-吸水层。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1
一种肺炎支原体抗原检测试剂盒,包括盒体和盒盖,盒体内设有检测卡和样本提取液瓶,检测卡包括卡盖、卡体和试纸条,如图1和图2所示,试纸条1依次设有样品垫层11、胶体金层12、硝酸纤维素膜13和吸水层14,样品垫层固相有生物素标记的抗肺炎支原体单克隆抗体A;胶体金层固相有胶体金标记物为抗肺炎支原体单克隆抗体B;硝酸纤维素膜依次设有包被链霉亲和素的检测线131和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线132。
实施例2
一种肺炎支原体抗原检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
(1)样本提取液的配制
将1g/mL的牛血清白蛋白10mL和0.05g/mL的叠氮钠1mL,用0.5%g/mL曲拉通X-100定容至100mL,装入试剂瓶内,得到样品提取液;
(2)胶体金的制备及标记
1g/mL氯金酸水溶液100mL,加热至沸腾,加入10%柠檬酸三钠1.5mL,迅速混匀,继续煮沸10分钟,以0.2mol/L K2CO3调pH,搅拌下加入抗肺炎支原体单克隆抗体B 2mg,继续搅拌10分钟,加入10g/mL NaCl,摇匀,以10000r/min离心10min获得的沉淀物即为胶体金标记物;
(3)生物素的标记
用1mL二甲基亚砜溶解1mg生物素N羟基丁二酰亚胺酯,得到1mg/mL N羟基丁二酰亚胺酯-二甲基亚砜溶液,加入2mL,浓度为1.5mg/mL抗肺炎支原体单克隆抗体A,室温下持续搅拌3h,在4℃条件下,用pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)充分透析,除去游离的生物素,加入叠氮钠(终浓度0.5g/L)及1.0g/L BSA,将结合产物置4℃,避光保存;
(4)胶体金和生物素标记物的固相化
4.1预处理:将玻璃纤维用含0.5%BSA的0.1mol pH7.4PBS缓冲液处理,晾干;
4.2固相化胶体金标记物:将玻璃纤维放入不锈钢盘,量取复溶后胶体金标记物34mL倒入不锈钢盘,使金溶液完全均匀吸收,推入干燥间干燥12小时;
4.3固相化生物素标记物:将玻璃纤维放入不锈钢盘,量取复溶后生物素标记物34mL倒入不锈钢盘,使金溶液完全均匀吸收,推入干燥间干燥12小时;
4.4固相化胶体金标记物即为金标垫,固相化生物素标记物即为样品垫;
(5)包被硝酸纤维素膜
5.1包被链霉亲和素:用pH7.4的PBS缓冲液将链霉亲和素至1.0mg/mL,用喷膜机以泵速16mm/s、膜速320mm/s喷于硝酸纤维素膜上,形成检测线;
5.2包被羊抗鼠IgG抗体:用pH7.4的PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1.5mg/mL,用喷膜机以泵速16mm/s、膜速320mm/s喷于上述步骤5.1制得的硝酸纤维素膜上,形成质控线;
5.3将上述步骤5.2制得的硝酸纤维素膜置37℃烘箱中干燥2小时;
(6)试纸条的制备
6.1在PVC板的中间位置粘贴上述步骤5.3制备的硝酸纤维素膜;
6.2在PVC板固定硝酸纤维素膜位置的上方,粘贴吸水纸,吸水纸覆盖硝酸纤维素膜边沿1.0毫米;
6.3在PVC板固定硝酸纤维素膜位置的下方,粘贴步骤(5)制备的胶体金标记物的金标垫及标有生物素-抗体结合物的样品垫,玻璃纤维金标垫覆盖硝酸纤维素膜1.0毫米,聚酯膜样品垫覆盖金标垫1.0毫米;
6.4将上述步骤6.3得到的产品压平整后,切成4.0mm宽的试纸条;
(7)取卡盖和卡体,将上述制备的试纸条置于卡体的凹槽内,将卡盖和卡体扣合,得到肺炎支原体抗原检测卡。
(8)检测卡安装好后与步骤(1)得到的样本提取液和步骤(7)得到的检测卡分别置于盒体内,得到肺炎支原体抗原检测试剂盒。
实施例3
试剂盒的使用方法:
(1)检测
a、在附属的试剂管中加入0.5mL样本提取液。
b、将采集样本后的棉棒浸在试剂管中的提取液中搅拌,从试剂管的外侧,用手指挤压棉棒数次,使提取液充分浸透棉棒,然后拔出棉棒,绞出的液体作为样品待测。
c、滴加3滴样品液(约100μL)到检测卡的加样孔,15分钟观察结果,20分钟后结果无效。
(2)结果判断
a、阴性:仅质控区(C)出现一条红色条带,在测试区(T)内无红色条带出现。阴性结果表明:样本中不含肺炎支原体抗原或是含量低于可检范围。
b、阳性:两条条带出现。一条红色条带位于测试区(T)内,另一条红色条带位于质控区(C)。阳性结果表明:样本中含有肺炎支原体抗原。
c、无效:质控区(C)未出现红色条带,表明操作过程不正确或检测卡已损坏。
实施例4
本发明试剂盒的灵敏度试验
将肺炎支原体标准菌株培养至107CFU/mL,再进行梯度稀释,浓度如下表1中所示,分别采用本发明提供的胶体金法试剂盒与普通胶体金法试剂盒进行检测,结果如下:
表1肺炎支原体抗原检测灵敏度对比
由以上表格可以看出,在肺炎支原体标准品浓度为104CFU/mL时,两种检测方法分别检测100例样本的检测结果均能显示阳性;但在肺炎支原体标准品浓度为103CFU/mL时,本发明的试剂盒检测结果有97例出现阳性,普通胶体金法试剂盒的检测结果有79例出现阳性,根据检测结果阳性率在90%(样本量大于20)以上的数值作为试剂盒灵敏度的定义,说明本发明的试剂盒检测灵敏度可达103CFU/mL。
实施例5
本发明试剂盒的特异性(抗干扰能力)试验
临床检验中,检测样本常包含与抗原结构相近或临床症状相似的其他病原体,选取临床确诊副流感病毒(混合)、结核、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎链球CFU、流感病毒A型、流感病毒B型阳性(肺炎支原体抗原阴性)样本各10例,用本发明的试剂盒检测,结果仍均为阴性,证明本试剂盒特异性好,不与副流感病毒(混合)、结核、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎链球CFU、流感病毒A型、流感病毒B型产生交叉反应。
本专利不局限于上述具体的实施方式,本领域的普通技术人员从上述构思出发,不经过创造性的劳动,所作出的种种变换,均落在本专利的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种肺炎支原体抗原检测试剂盒,包括盒体,所述盒体内设有检测卡和样本提取液瓶;所述检测卡包括卡盖、卡体和试纸条,所述试纸条依次设有样品垫层、胶体金层、硝酸纤维素膜和吸水层,其特征在于:所述样品垫层固相生物素标记抗肺炎支原体单克隆抗体A,所述胶体金层固相抗肺炎支原体单克隆抗体B;所述硝酸纤维素膜依次设有包被链霉亲和素的检测线和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线;所述样本提取液瓶内的提取溶液由牛血清白蛋白、叠氮钠以及曲拉通X-100配制而成。
2.根据权利要求1所述的一种肺炎支原体抗原检测试剂盒,其特征在于:每100mL提取溶液中含有0.5~1g/mL的牛血清白蛋白10~15mL和0.03~0.05g/mL的叠氮钠1~3mL。
3.一种如权利要求1或2所述肺炎支原体抗原检测试剂盒的制备方法,其特征在于所述制备方法包括以下步骤:
(1)样本提取液的配制
取0.5~1g/mL的牛血清白蛋白10~15mL和0.03~0.05g/mL的叠氮钠1~3mL,用0.3~0.5g/mL曲拉通X-100定容至100mL,得到样品提取液;
(2)胶体金的制备及标记
0.5~1g/mL氯金酸水溶液100mL,加热至沸腾,加入8~10g/mL柠檬酸三钠1.5mL,混匀,继续煮沸10~15分钟,调pH,搅拌下加入2~3mg抗肺炎支原体单克隆抗体B,继续搅拌10~15分钟,加入8~10g/mL NaCl,摇匀,以10000r/min离心10~15min获得的沉淀物即为胶体金标记抗体;
(3)生物素的标记
取1mg/mL N羟基丁二酰亚胺酯-二甲基亚砜溶液,加入1~2mL、1.2~1.5mg/mL抗肺炎支原体单克隆抗体A,室温下持续搅拌2~3h,在4℃条件下,用缓冲液充分透析后再加入叠氮钠及BSA,得到的生物素标记物置4℃,避光保存;
(4)胶体金和生物素标记物的固相化
4.1预处理:将玻璃纤维用含0.5~1g/L BSA的0.1mol且pH7.2~7.5的PBS缓冲液处理,晾干;
4.2固相化胶体金标记物:将玻璃纤维放入不锈钢盘,量取复溶后胶体金标记物30~40mL倒入不锈钢盘,使金溶液完全均匀吸收,干燥,得到金标垫;
4.3固相化生物素标记物:将玻璃纤维放入不锈钢盘,量取复溶后生物素标记物30~40mL倒入不锈钢盘,使金溶液完全均匀吸收,干燥,得到样品垫;
(5)包被硝酸纤维素膜
5.1包被链霉亲和素:用pH7.2~7.5的PBS缓冲液将链霉亲和素稀释至0.8~1.2mg/mL,喷于硝酸纤维素膜上,形成链霉亲和素检测线;
5.2包被羊抗鼠IgG抗体:用pH7.2~7.5的PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1.4~1.6mg/mL,喷于上述步骤5.1制得的硝酸纤维素膜上,形成羊抗鼠IgG抗体质控线;
5.3将上述步骤5.2制得的硝酸纤维素膜干燥1.5~2小时;
(6)试纸条的制备
在PVC板的中间位置粘贴上述步骤5.3制备的硝酸纤维素膜,在PVC板固定硝酸纤维素膜位置的上方粘贴吸水纸;在PVC板固定硝酸纤维素膜位置的下方,粘贴步骤(4)制备的金标垫及样品垫,压平整切成试纸条;
(7)检测卡安装
将步骤(6)切好的置于卡体内,将卡盖和卡体扣合,得到肺炎支原体抗原检测卡;将步骤(1)得到的样本提取液装入瓶内,与检测卡分别置于盒体内,得到肺炎支原体抗原检测试剂盒。
4.根据权利要求3所述肺炎支原体抗原检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中用0.1~0.2mol/L的K2CO3或者Na2CO3调pH为7-8。
5.根据权利要求3所述肺炎支原体抗原检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)中用pH7.2~7.5磷酸盐缓冲液透析。
6.根据权利要求3所述肺炎支原体抗原检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)中叠氮钠的终浓度0.3-0.5g/L,BSA的终浓度为0.8-1.2g/L。
7.根据权利要求3所述肺炎支原体抗原检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述步骤4.2中将胶体金标记物与复溶液按1:8-12的比例复溶,所述复溶液含有0.5-1g/mLPEG20000、0.5-1g/mL海藻糖和1-2g/mL Tween20。
8.根据权利要求3所述肺炎支原体抗原检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述步骤4.3中将生物素标记物与复溶液按1:8-12的比例复溶,所述复溶液含有1-2g/mL PEG20000、0.5-1g/mL海藻糖和1-2g/mL Tween20。
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2018
- 2018-04-12 CN CN201810326336.5A patent/CN108761073A/zh active Pending
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