CN106771195A - 一种hiv抗原抗体检测卡及其制备方法 - Google Patents

一种hiv抗原抗体检测卡及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物学检测技术领域，具体涉及一种HIV抗原抗体检测卡及其制备方法。检测卡包括卡盖、卡体和试纸条，所述卡盖上依次设有稀释液加样孔、样本加样孔、观测孔和安装标示孔，卡体的内部设有放置试纸条的凹槽；所述试纸条依次设有样品垫层、胶体金层、硝酸纤维素膜和吸水层。其制备方法包括：胶体金的制备、胶体金分别标记重组HIV‑1/HIV‑2抗原和鼠抗p24单克隆抗体、生物素标记p24抗体、胶体金和生物素标记物固相化、包被硝酸纤维素膜、试纸条的制备、检测卡的扣合。利用本发明的检测卡可检测HIV抗原抗体，灵敏度高，样本用量少。

Description

一种HIV抗原抗体检测卡及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物监测技术领域，具体涉及一种HIV抗原抗体检测卡及其制备方法。
背景技术
艾滋病，全名为“获得性免疫缺陷综合症”(Acquired Immune DeficiencySyndrome)，英文缩写AIDS，是人体感染了人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiencyvirus,HIV)所导致的传染病。HIV本身并不会引发任何疾病，而是当免疫系统被HIV破坏后，人体由于失去抵抗能力而感染其他的疾病导致死亡。
HIV的感染可通过检测HIV特异性抗体、抗原、核酸或病毒分离培养加以确立，常规使用的标准诊断项目是血清学抗体检测。从1985年第一代HIV抗体检测试剂问世到现在，HIV血清学检测试剂已经发展到了第四代。1998年，国际上出现第四代HIV检测试剂，它可同时检测抗体和p24抗原，又称为HIV抗原/抗体诊断试剂。
生物素-亲和素系统(Biotin-Avidin-System，BAS)是一种具有高亲和力、灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点的信号放大标记技术，BAS具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等特点。生物素易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，具多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。
目前，现有技术已实现HIV抗原抗体的检测，但样本用量较大，大约需要60至100μL，灵敏度有待于提高。因此本发明人利用生物素-亲和素系统的优点，开发了一种HIV抗原抗体的检测卡。
发明内容
本发明的目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种灵敏度高，样本用量少的HIV抗原抗体检测卡。
为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：
一种HIV抗原抗体检测卡，所述检测卡包括卡盖、卡体和试纸条，所述卡盖上依次设有稀释液加样孔、样本加样孔、观测孔和安装标示孔，所述卡体的内部设有放置试纸条的凹槽；所述试纸条依次设有样品垫层、胶体金层、硝酸纤维素膜和吸水层，所述样品垫层固相有生物素标记的p24抗体，所述胶体金层固相有重组HIV-1/HIV-2抗原和鼠抗p24单克隆抗体的胶体金标记物；所述硝酸纤维素膜依次设有包被重组HIV-1/HIV-2抗原的检测线、包被亲和素的检测线和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线。
作为一种优选的技术方案，所述卡盖和卡体为卡扣连接。
作为一种改进的技术方案，所述试纸条的样品垫层与所述卡盖的稀释液加样孔和样本加样孔相对应；所述试纸条的胶体金层和硝酸纤维素膜与所述卡盖的观测孔相对应。
本发明的另一个目的是提供一种HIV抗原抗体检测卡的制备方法。
为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：
一种HIV抗原抗体检测卡的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)胶体金的制备
0.8～1.5wt％氯金酸水溶液100mL，加热至沸腾，加入0.8～1.2wt％柠檬酸三钠1.0mL，迅速混匀，继续煮沸10分钟，胶体金溶液变酒红色，冷却备用；
(2)胶体金的标记
2.1胶体金标记重组HIV-1/HIV-2抗原：取步骤(1)中制备的胶体金溶液50mL，用0.1mol/L K2CO3调pH6.0～6.5，随后加入2～4mL浓度为0.8～1.2mg/mL的重组HIV-1/HIV-2抗原，搅拌2～5分钟，加入4～6mL质量分数为0.8～1.2％的PEG20000水溶液，于8000～12000r/min离心25～35分钟，吸去上清液，将沉淀悬浮于0.1～0.3mg/mL PEG20000的水溶液中，以0.5mg/mL叠氮钠防腐，置3～5℃保存；
2.2胶体金标记鼠抗p24单克隆抗体：取步骤(1)中制备的剩余胶体金溶液50mL，用0.1mol/L K2CO3调至pH8.9～9.2，随后加入4～6mL浓度为0.8～1.2mg/mL的鼠抗p24单克隆抗体，搅拌2～5分钟，加入4～6mL质量分数为0.8～1.2％的PEG20000水溶液，于15000r/min离心35～45分钟，吸去上清液，将沉淀悬浮于浓度为0.4～0.6mg/mL PEG20000的水溶液中，以0.5mg/mL叠氮钠防腐，置3～5℃保存；
(3)生物素标记p24抗体
3.1p24抗体溶液的配置：将p24抗体用0.1mol/L、pH8.0的碳酸氢钠缓冲液稀释到0.8～1.2mg/mL，再用0.1mol/L、pH 8.0的碳酸氢钠缓冲液对1mLp24抗体充分透析，得到p24抗体溶液；
3.2生物素溶液的配置：用1mL二甲基亚砜溶解1mg生物素N羟基丁二酰亚胺酯，得到N羟基丁二酰亚胺酯溶液；
3.3标记处理：向1mL p24抗体溶液加入115～122μL N羟基丁二酰亚胺酯溶液，在室温下持续搅拌，保温2～4小时；然后加入9.4～9.7μL，浓度为1mol/L的NH4Cl溶液，在室温下搅拌8～12分钟，得到生物素与p24抗体的结合产物；
3.4除杂及防腐处理：在2～4℃条件下，用磷酸盐缓冲液将生物素与p24抗体的结合产物充分透析，除去游离的生物素，最后加入终浓度0.5g/L叠氮钠及0.8～1.2g/L BSA，将结合产物置2～4℃，避光保存；
(4)胶体金和生物素标记物的固相化
将步骤2.1和2.2制得的胶体金标记物溶液等量混合，固相于胶体金层，得到玻璃纤维金标垫；将步骤(3)制得的生物素标记物固相于样品垫层，得到聚酯膜样品垫；
(5)包被硝酸纤维素膜
5.1包被重组HIV-1/HIV-2抗原：用pH7.2～7.5的PBS缓冲液将重组HIV-1/HIV-2抗原稀释至0.8～1.2mg/mL，用喷膜机以泵速16mm/s、膜速320mm/s喷于硝酸纤维素膜上，形成重组HIV-1/HIV-2抗原检测线；
5.2包被亲和素：用pH7.2～7.5的PBS缓冲液将亲和素稀释至0.4～0.6mg/mL，用喷膜机以泵速16mm/s、膜速320mm/s喷于上述步骤5.1制得的硝酸纤维素膜上，形成亲和素检测线；
5.3包被羊抗鼠IgG抗体：用pH7.2～7.5的PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1.4～1.6mg/mL，用喷膜机以泵速16mm/s、膜速320mm/s喷于上述步骤5.2制得的硝酸纤维素膜上，形成羊抗鼠IgG抗体质控线；
5.4将上述步骤5.3制得的硝酸纤维素膜置37℃烘箱中干燥1.5～2小时；
(6)试纸条的制备
6.1在PVC板的中间位置粘贴上述步骤5.4制备的硝酸纤维素膜；
6.2在PVC板固定硝酸纤维素膜位置的上方，粘贴吸水纸，吸水纸覆盖硝酸纤维素膜边沿1.0毫米；
6.3在PVC板固定硝酸纤维素膜位置的下方，粘贴步骤(4)制备的胶体金标记物的玻璃纤维金标垫及标有生物素-抗体结合物的聚酯膜样品垫，玻璃纤维金标垫覆盖硝酸纤维素膜1.0毫米，聚酯膜样品垫覆盖金标垫1.0毫米；
6.4将上述步骤6.3得到的产品压平整后，切成4.0mm宽的试纸条；
(7)取卡盖和卡体，将上述制备的试纸条置于卡体的凹槽内，将卡盖和卡体扣合，得到HIV抗原抗体检测卡。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：
1、本专利利用“亲和素-生物素放大系统”，显著提高试剂检测灵敏度，能够检测早期的血清阳转，缩短了检测的窗口期，进一步提高了输血的安全性。
2、由于亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰，最大限度地降低试剂的非特异性作用。
3、由于检测卡灵敏度提高，样本用量减少，仅需50μL血清、血浆或全血即可实现HIV抗原抗体的检测，并且操作简单，检测速度快，适用于临床推广。
附图说明
附图1为本发明实施例中卡盖的结构示意图；
附图2为本发明实施例中卡体的结构示意图；
附图3为本发明实施例中试纸条的俯视结构示意图；
附图4为本发明实施例中试纸条的侧视结构示意图；
其中，1-卡盖；11-稀释液加样孔；12-样本加样孔；13-观测孔；14-安装标示孔；2-卡体；21-凹槽；3-试纸条；31-样品垫层；32-胶体金层；33-硝酸纤维素膜；331-重组HIV-1/HIV-2抗原检测线；332-亲和素检测线；333-羊抗鼠IgG抗体质控线；34-吸水层；341-吸水纸；342-安装标志。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
如图1和图2所示，一种利用生物素-亲和素系统检测HIV抗原抗体的检测卡，包括卡盖1、卡体2和试纸条3，卡盖1上设有稀释液加样孔11、样本加样孔12、观测孔13和安装标示孔14，卡体2的内部设有放置试纸条3的凹槽21。试纸条3上的样品垫层31与卡盖1上的稀释液加样孔11和样本加样孔12相对应；试纸条3上的胶体金层32和硝酸纤维素膜33与卡盖1上的观测孔13相对应。
如图3和图4所示，试纸条3依次设有样品垫层31、胶体金层32、硝酸纤维素膜33和吸水层34，样品垫层31为聚酯膜，聚酯膜固相有生物素标记的p24抗体；胶体金层32为玻璃纤维，固相的胶体金标记物为重组HIV-1/HIV-2抗原和鼠抗p24单克隆抗体；硝酸纤维素膜33依次设有包被重组HIV-1/HIV-2抗原的检测线331、包被亲和素的检测线332和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线333，重组HIV-1/HIV-2抗原的检测线331、亲和素的检测线332和羊抗鼠IgG抗体的质控线333依次被标注字母“T1”、“T2”和“C”。
检测卡的使用方法：
(1)检测
a、打开密封铝箔袋，取出检测卡，平放于水平桌面上。
b、用微量移液器将50μL血清、血浆或全血标本加入样本加样孔，等待1分钟，加入1滴(约30μL)稀释液进入稀释液加样孔。
c、在20分钟时读取检测结果，30分钟后结果无效。
(2)结果判断
a、阴性：在观测孔标注有字母“C”的质控线333上形成一个红色沉积反应标记，在标注有字母“T1”的检测线331和标注有字母“T2”的检测线332上无反应标记出现，表示被测样品中无HIV p24抗原，也无HIV-1/HIV-2抗体；
b、阳性：
1、在观测孔标注有字母“C”的质控线333上形成一个红色沉积反应标记，同时在标注有字母“T2”的检测线332上形成一个红色沉积反应标记，表示HIVp24抗原阳性，HIV抗原的存在意味着感染处在一个早期阶段；
2、在观测孔标注有字母“C”的质控线333上形成一个红色沉积反应标记，同时在标注有字母“T1”的检测线331上形成一个红色沉积反应标记，表示HIV-1/HIV-2抗体阳性；
3、在观测孔标注有字母“C”的质控线333上形成一个红色沉积反应标记，同时在标注有字母“T2”的检测线332和标注有字母“T1”的检测线331上各形成一个红色沉积反应标记，表示HIV p24抗原阳性和HIV-1/HIV-2抗体阳性，HIV抗原的存在意味着感染处在一个早期阶段；
c、无效：在观测孔标注有字母“C”的质控线333不显色，表示本次检测无效。
实施例2
一种利用生物素-亲和素系统检测HIV抗原抗体的检测卡的制备方法，由上述的卡盖1、卡体2和试纸条3组装而成，试纸条3依次设有样品垫层31、胶体金层32、硝酸纤维素膜33和吸水层34。
1、样品垫层31的制备过程如下：
(1)生物素标记p24抗体
1.1p24抗体溶液的配置：将p24抗体用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)稀释到1mg/mL，再用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)对1mL p24抗体充分透析；
1.2生物素溶液的配置：用1mL二甲基亚砜(DMSO)溶解生物素N羟基丁二酰亚胺酯(NHSB)1mg；
1.3标记处理：向1mL p24抗体溶液加入120μL NHSB溶液(即含NHSB 120μg)，在室温下持续搅拌，保温2-4小时，然后加入9.6μL 1mol/L NH4Cl(每25μg NHSB加1μL)，在室温下搅拌10分钟。
1.4除杂及防腐处理：在4℃条件下，用磷酸盐缓冲液(PBS)充分透析，除去游离的生物素，加入叠氮钠(终浓度0.5g/L)及1.0g/L BSA，将结合产物置4℃，避光保存。
(2)生物素标记物的固相化
将上述步骤制得的生物素标记p24抗体固相于聚酯膜。
2、胶体金层32的制备过程如下：
(1)胶体金的制备
1％氯金酸(HAuCl4)水溶液100mL，加热至沸腾，加入1％柠檬酸三钠0.8mL，迅速混匀，继续煮沸10分钟，胶体金溶液变酒红色，冷却备用。
(2)胶体金的标记
2.1胶体金标记重组HIV-1/HIV-2抗原
取步骤(1)中制备的胶体金溶液50mL，用0.1mol/L K2CO3调pH6.2，随后加入3mL浓度为1mg/mL的重组HIV-1/HIV-2抗原，搅拌3分钟，加入5mL质量分数为1％的PEG20000水溶液，于10000r/min离心30分钟，吸去上清液，将沉淀悬浮于0.2mg/mL PEG20000的水溶液中，以0.5mg/mL叠氮钠防腐，置4℃保存；
2.2胶体金标记鼠抗p24单克隆抗体
取步骤(1)中制备的剩余胶体金溶液50mL，用0.1mol/L K2CO3调至pH9.0，随后加入5mL浓度为1mg/mL的鼠抗p24单克隆抗体，搅拌3分钟，加入5mL 1％PEG20000溶液，于15000r/min离心40分钟，吸去上清液，将沉淀悬浮于0.5mg/mL PEG20000的水溶液中，以0.5mg/mL叠氮钠防腐，置4℃保存；
(3)胶体金标记物的固相化
将上述步骤2.1和2.2制得的胶体金标记物溶液等量混合，固相于玻璃纤维。
4、硝酸纤维素膜33的制备过程如下：
(1)包被重组HIV-1/HIV-2抗原
用PH7.4的PBS缓冲液将重组HIV-1/HIV-2抗原稀释至1.0mg/mL，用喷膜机以泵速16mm/s、膜速320mm/s喷于硝酸纤维素膜上，形成重组HIV-1/HIV-2抗原检测线。
(2)包被亲和素(抗生物素蛋白)
用PH7.4的PBS缓冲液将亲和素稀释至0.5mg/mL，用喷膜机以泵速16mm/s、膜速320mm/s喷于上述步骤(1)制得的硝酸纤维素膜上，形成亲和素检测线。
(3)包被羊抗鼠IgG抗体
用PH7.4的PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1.5mg/mL，用喷膜机以泵速16mm/s、膜速320mm/s喷于上述步骤(2)制得的硝酸纤维素膜上，形成羊抗鼠IgG抗体质控线。
(4)将上述步骤(3)制得的硝酸纤维素膜置37℃烘箱中干燥2小时。
实施例3
从中国食品药品检定研究院购买HIV-1p24抗原国家参考品(批号220015-20150505)，共44份，包括10份阳性、20份阴性和10份最低检出量(灵敏度)参考品(L1～L10，抗原浓度依次为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.0781、0U/mL)，2份抗原精密性参考品，2份抗原抗体精密度参考品。按照上述检测卡的操作方法，检测上述国家参考品，结果如下：
阳性参考品符合率：10份阳性参考品检测结果未出现阴性，阳性符合率为10/10；
阴性参考品符合率：20份阴性参考品检测结果未出现阳性，阴性符合率为20/20；
最低检出量参考品：对于HIV抗原抗体检测卡，最低检出量L1-L4均检出为阳性，L5-L10均检出为阴性，即检测卡的灵敏度为2.5U/mL；
抗原抗体精密度参考品：平行检测10次，反应结果应均为阳性，显色度均一。
本专利不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本专利的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种HIV抗原抗体检测卡，其特征在于：所述检测卡包括卡盖、卡体和试纸条，所述卡盖上依次设有稀释液加样孔、样本加样孔、观测孔和安装标示孔，所述卡体的内部设有放置试纸条的凹槽；所述试纸条依次设有样品垫层、胶体金层、硝酸纤维素膜和吸水层，所述样品垫层固相有生物素标记的p24抗体，所述胶体金层固相有重组HIV-1/HIV-2抗原和鼠抗p24单克隆抗体的胶体金标记物；所述硝酸纤维素膜依次设有包被重组HIV-1/HIV-2抗原的检测线、包被亲和素的检测线和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线。
2.根据权利要求1所述的一种HIV抗原抗体检测卡，其特征在于：所述卡盖和卡体为卡扣连接。
3.根据权利要求1所述的一种HIV抗原抗体检测卡，其特征在于：所述试纸条的样品垫层与所述卡盖的稀释液加样孔和样本加样孔相对应；所述试纸条的胶体金层和硝酸纤维素膜与所述卡盖的观测孔相对应。
4.一种HIV抗原抗体检测卡的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)胶体金的制备
0.8～1.5wt％氯金酸水溶液100mL，加热至沸腾，加入0.8～1.2wt％柠檬酸三钠1.0mL，迅速混匀，继续煮沸10分钟，胶体金溶液变酒红色，冷却备用；
(2)胶体金的标记
2.1胶体金标记重组HIV-1/HIV-2抗原：取步骤(1)中制备的胶体金溶液50mL，用0.1mol/L K2CO3调pH6.0～6.5，随后加入2～4mL浓度为0.8～1.2mg/mL的重组HIV-1/HIV-2抗原，搅拌2～5分钟，加入4～6mL质量分数为0.8～1.2％的PEG20000水溶液，于8000～12000r/min离心25～35分钟，吸去上清液，将沉淀悬浮于0.1～0.3mg/mL PEG20000的水溶液中，以0.5mg/mL叠氮钠防腐，置3～5℃保存；
2.2胶体金标记鼠抗p24单克隆抗体：取步骤(1)中制备的剩余胶体金溶液50mL，用0.1mol/L K2CO3调至pH8.9～9.2，随后加入4～6mL浓度为0.8～1.2mg/mL的鼠抗p24单克隆抗体，搅拌2～5分钟，加入4～6mL质量分数为0.8～1.2％的PEG20000水溶液，于15000r/min离心35～45分钟，吸去上清液，将沉淀悬浮于浓度为0.4～0.6mg/mL PEG20000的水溶液中，以0.5mg/mL叠氮钠防腐，置3～5℃保存；
(3)生物素标记p24抗体
3.1p24抗体溶液的配置：将p24抗体用0.1mol/L、pH8.0的碳酸氢钠缓冲液稀释到0.8～1.2mg/mL，再用0.1mol/L、pH 8.0的碳酸氢钠缓冲液对1mL p24抗体充分透析，得到p24抗体溶液；
3.2生物素溶液的配置：用1mL二甲基亚砜溶解1mg生物素N羟基丁二酰亚胺酯，得到N羟基丁二酰亚胺酯溶液；
3.3标记处理：向1mL p24抗体溶液加入115～122μL N羟基丁二酰亚胺酯溶液，在室温下持续搅拌，保温2～4小时；然后加入9.4～9.7μL，浓度为1mol/L的NH4Cl溶液，在室温下搅拌8～12分钟，得到生物素与p24抗体的结合产物；
3.4除杂及防腐处理：在2～4℃条件下，用磷酸盐缓冲液将生物素与p24抗体的结合产物充分透析，除去游离的生物素，最后加入终浓度0.5g/L叠氮钠及0.8～1.2g/L BSA，将结合产物置2～4℃，避光保存；
(4)胶体金和生物素标记物的固相化
将步骤2.1和2.2制得的胶体金标记物溶液等量混合，固相于胶体金层，得到玻璃纤维金标垫；将步骤(3)制得的生物素标记物固相于样品垫层，得到聚酯膜样品垫；
(5)包被硝酸纤维素膜
5.1包被重组HIV-1/HIV-2抗原：用pH7.2～7.5的PBS缓冲液将重组HIV-1/HIV-2抗原稀释至0.8～1.2mg/mL，用喷膜机以泵速16mm/s、膜速320mm/s喷于硝酸纤维素膜上，形成重组HIV-1/HIV-2抗原检测线；
5.2包被亲和素：用pH7.2～7.5的PBS缓冲液将亲和素稀释至0.4～0.6mg/mL，用喷膜机以泵速16mm/s、膜速320mm/s喷于上述步骤5.1制得的硝酸纤维素膜上，形成亲和素检测线；
5.3包被羊抗鼠IgG抗体：用pH7.2～7.5的PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1.4～1.6mg/mL，用喷膜机以泵速16mm/s、膜速320mm/s喷于上述步骤5.2制得的硝酸纤维素膜上，形成羊抗鼠IgG抗体质控线；
5.4将上述步骤5.3制得的硝酸纤维素膜置37℃烘箱中干燥1.5～2小时；
(6)试纸条的制备
6.1在PVC板的中间位置粘贴上述步骤5.4制备的硝酸纤维素膜；
6.2在PVC板固定硝酸纤维素膜位置的上方，粘贴吸水纸，吸水纸覆盖硝酸纤维素膜边沿1.0毫米；
6.3在PVC板固定硝酸纤维素膜位置的下方，粘贴步骤(4)制备的胶体金标记物的玻璃纤维金标垫及标有生物素-抗体结合物的聚酯膜样品垫，玻璃纤维金标垫覆盖硝酸纤维素膜1.0毫米，聚酯膜样品垫覆盖金标垫1.0毫米；
6.4将上述步骤6.3得到的产品压平整后，切成4.0mm宽的试纸条；
(7)取卡盖和卡体，将上述制备的试纸条置于卡体的凹槽内，将卡盖和卡体扣合，得到HIV抗原抗体检测卡。
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