CN110045119A - 一种基于hiv-1载体的慢病毒滴度检测卡及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于HIV‑1载体的慢病毒滴度检测卡及其制备和应用，涉及生物技术检测领域。该检测卡所用的金标液包括胶体金、鼠抗人p24单克隆抗体、牛血清白蛋白、硫酸软骨素和叠氮钠；所用的检测溶液含有鼠抗兔p24单克隆抗体；所述质控溶液含有羊抗BSA多克隆抗体。可以用于相关慢病毒载体和假病毒包装效率的快速评估，有效提高了检测灵敏度，该检测卡的检测下限为1ng/mL，提高了检测结果的精密度和准确度，缩短了检测时间。与传统的HIV‑1慢病毒滴度检测方法相比，使用更加简便快速，降低了检测成本。

Description

一种基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡及其制备和应用
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及一种基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡及其制备和应用。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是一种逆转录病毒，分为1型和2型。其中p24是HIV-1的核心蛋白，构成病毒的核衣壳，现已被广泛用于艾滋病的临床早期诊断、艾滋病治疗效果评价、HIV感染细胞培养物中病毒生长的指示检测等。
慢病毒是逆转录病毒的一类，因其具有可以感染分裂细胞和非分裂细胞的特点，已成为有效的基因转移载体，是转基因动物和基因治疗研究的重要工具。由于HIV-1慢病毒载体具有容纳外源性目的基因的片段大，可感染非分裂期细胞，可在体内长期稳定整合，较少发生基因沉默现象，免疫反应小，安全性较好等优点，HIV-1已成为目前应用最广泛的慢病毒。另外，在HIV研究领域，HIV-1假病毒的建立也是一种安全可靠、重要的研究技术手段，可用于研究病毒与宿主细胞的相互关系、评价疫苗临床免疫效果、筛选和评价抗病毒药物以及研究病毒调节基因功能等。
HIV-1慢病毒载体构建和HIV-1假病毒包装是基因工程中常用的重要技术手段，慢病毒滴度的检测和包装效率评估是其中的一个重要环节。通常在构建慢病毒/假病毒载体时，加入特定的易检测的标志基因，如绿色荧光蛋白或萤火虫荧光素酶等基因，在转染细胞后收集上清，梯度稀释，在荧光显微镜下观察并统计病毒滴度。该方法操作复杂，统计结果误差较大，准确度不高。通过检测HIV-1p24蛋白含量和核酸拷贝数来评估包装效率，相比于之前的方法更为准确，灵敏度也更高。传统的慢病毒/假病毒包装效率检测的方法有ELISA法(检测p24蛋白含量)和Real-time PCR法(检测核酸拷贝数)，这两种方法均操作复杂、耗时费力、成本高。
胶体金免疫层析(Colloidal gold-based immunochromatographic ssay，GICA)技术是一种将胶体金标记、免疫检测和层析分析等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术，胶体金标记技术结合抗原抗体反应的一种应用形式。根据所需要的胶体金颗粒大小，使用还原剂在可控的范围内将金离子转化为单质金，所用的还原剂包括硼氢化钠、黄磷、乙醇、抗坏血酸、柠檬酸钠和柠檬酸-单宁酸。Frens等人(J.Microsc.(Oxford)1981，123，201)以氯金酸(HAuCl4)为原料使用柠檬酸钠制备胶体金是最常用的方法。胶体金一般呈现红色，溶液疏水，带负电，对蛋白质有很强的吸附功能，在弱碱环境下可与蛋白质分子的正电荷基团牢固结合。基本原理是：检测时，将样品加到试纸端的样品垫上，通过毛细管作用前移，样品中的分析物与结合垫上的免疫胶体金相互作用并形成复合物，复合物移至检测线，与其上的抗体或抗原特异性结合而被截留，在检测线上聚集，当复合物积聚到一定数量便显示出胶体金特征的红色；而未结合分析物的免疫胶体金则不被检测线捕获，迁移至质控线并与其上的抗体结合而显示红色，达到与复合物分离的目的，并且说明试纸工作正常。该方法具有简便、省时、样本用量少、结果易判读等特点，常在资源匮乏或非实验室环境中进行目标物的定性、半定量和定量检测。但仍存在一定的不足，比如：产品质量不稳定、灵敏度低、不易定量等。
目前，现有的利用胶体金免疫层析技术检测HIV-1p24抗原的技术较少。中国专利CN106771195A公开了一种HIV抗原抗体检测卡及其制备方法，该检测卡包中样品垫层固相有生物素标记的p24抗体，胶体金层固相有重组HIV-1/HIV-2抗原和鼠抗人p24单克隆抗体的胶体金标记物，硝酸纤维素膜依次设有包被重组HIV-1/HIV-2抗原的检测线、包被亲和素的检测线和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线，该检测卡的灵敏度为2.5U/mL。中国专利CN102445538A公开了艾滋病(HIV-1/2)尿液快速检测试剂，其基于胶体金技术检测HIV重组抗原p41、p42和p36。这些现有的技术均是用于艾滋病的检测，并未应用于HIV-1慢病毒滴度检测和HIV-1假病毒包装效率评估，且该方法灵敏度低，不易定量。
因此，根据上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种HIV-1慢病毒滴度检测快速检测卡，其使用简单、检测快速、灵敏度、精密度和准确度高，可用与HIV-1慢病毒载体和假病毒包装效率的快速评估。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡及其制备和应用。本发明基于胶体金侧向层析技术研发了HIV-1p24蛋白半定量检测卡，可以用于相关慢病毒载体和假病毒包装效率的快速评估，有效提高了检测灵敏度和精密度，缩短了检测时间。
本发明一方面提供了一种基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡，包括卡体外壳、试纸条和背板，所述卡体外壳上设有加样孔和检测窗，所述试纸条粘贴在背板上，所述卡体外壳与背板扣合，所述试纸条采用搭接的方式，依次设有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述金标垫上结合有金标液；
所述硝酸纤维素膜上设有检测线T和质控线C；
所述检测线T上喷有检测溶液，检测线C上喷有质控溶液；
所述金标液包括胶体金、鼠抗人p24单克隆抗体、牛血清白蛋白、硫酸软骨素和叠氮钠；
所述检测溶液含有鼠抗兔p24单克隆抗体；
所述质控溶液含有羊抗BSA多克隆抗体。
优选地，所述的金标液包括胶体金10％-20％(v/v)、鼠抗人p24单克隆抗体2-10μg/mL、牛血清白蛋白0.5％-1％(w/v)、硫酸软骨素0.5-2μg/mL和叠氮钠0.05％(w/v)。
进一步优选地，所述的金标液包括胶体金16％(v/v)、鼠抗人p24单克隆抗体8μg/mL、牛血清白蛋白0.7％(w/v)、硫酸软骨素1.3μg/mL和叠氮钠0.05％(w/v)。
优选地，所述的鼠抗人p24单克隆抗体：胶体金＝10-100μg：1mL；进一步优选地，鼠抗人p24单克隆抗体：胶体金＝50μg：1mL。
优选地，所述检测溶液含有浓度为0.5-1mg/mL的鼠抗兔p24单克隆抗体；所述质控溶液含有浓度为0.5-1mg/mL的羊抗BSA多克隆抗体。
进一步优选地，所述检测溶液含有浓度为0.8mg/mL的鼠抗兔p24单克隆抗体；所述质控溶液含有浓度为0.8mg/mL的羊抗BSA多克隆抗体。
优选地，所述检测线T和质控线C上的检测溶液和质控溶液的喷膜量均为0.2-0.8μl/cm；进一步优选地，所述检测线T和质控线C上的检测溶液和质控溶液的喷膜量均为0.5μl/cm。
优选地，所述胶体金的大小为15-28nm；进一步优选地，所述胶体金的大小为22nm。
优选地，所述的慢病毒滴度检测卡还包括比色卡；所述比色卡上显示有对应的检测线显示颜色的深浅度，其对应的检测样品中含有p24蛋白浓度的范围为1-500ng/mL；当样品中p24蛋白浓度在1-500ng/mL时，检测线颜色的深浅与p24浓度呈正相关，通过与比色卡比较，可以半定量待检标本中p24蛋白浓度。
本发明另一方面提供了一种上述的慢病毒滴度检测卡的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、金标液的制备：
将鼠抗人p24单克隆抗体和胶体金按照10-100μg：1mL的比例混合，加入0.2M的KCl调节pH＝7.5-8.0，加入PBS缓冲液，搅拌，离心弃上清；在沉淀中加入终浓度为0.5％-1％(w/v)的牛血清白蛋白水溶液，搅拌，离心弃上清，用PBS缓冲液清洗沉淀，加入终浓度为0.5-2μg/mL硫酸软骨素、0.05％(w/v)的叠氮钠和PBS缓冲液，制得金标液；
S2、检测溶液和质控溶液的配制：
将鼠抗兔p24单克隆抗体用0.1M、pH＝8.0的碳酸氢钠缓冲液稀释至0.5-1mg/mL，加入0.2mg/mL的赖氨酸和1mol/L的NH4Cl溶液，搅拌混匀，得到混合液，再用0.1M、pH＝8.0的碳酸氢钠缓冲液透析混合液，得到检测溶液；
将羊抗BSA多克隆抗体用0.1M、pH＝8.0的碳酸氢钠缓冲液稀释至0.5-1mg/mL，加入0.2mg/mL的赖氨酸和1mol/L的NH4Cl溶液，搅拌混匀，得到混合液，再用0.1M、pH＝8.0的碳酸氢钠缓冲液透析混合液，得到质控溶液；
S3、样品垫的制备：
用含有0.5％(w/v)的NaCl、0.5％(w/v)的蔗糖、0.1％(w/v)的牛血清白蛋白和Tris-HCl缓冲液，pH＝7.5的溶液浸泡玻璃纤维膜，干燥，得到样本垫；
S4、金标垫的制备：
将步骤S1制得的金标液固相于玻璃纤维膜上，得到金标垫；
S5、硝酸纤维素膜的包被：
将步骤S2制得的检测溶液和质控溶液喷于硝酸纤维素膜上，喷膜量均为0.2-0.8μl/cm，形成检测线T和质控线C，烘干，得到硝酸纤维素膜；
S6、试纸条的制备：
在步骤S3得到的样品垫下方粘贴有步骤S4得到的金标垫，样品垫覆盖金标垫边沿1.0毫米；步骤S4得到的金标垫下方粘贴有步骤S5得到的硝酸纤维素膜，金标垫覆盖硝酸纤维素膜边沿1.0毫米；硝酸纤维素膜另一侧上方粘贴有吸水纸，吸水纸覆盖硝酸纤维素膜边沿1.0毫米；得到试纸条；
S7、慢病毒滴度检测卡的组装：
将步骤S6制备的试纸条放入卡体外壳的内部凹槽中，样品垫和硝酸纤维素膜分别位于加样孔和检测窗的正下方，扣合卡体外壳，得到慢病毒滴度检测卡。
具体地，一种上述的慢病毒滴度检测卡的制备方法包括以下步骤：
S1、金标液的制备：
将鼠抗人p24单克隆抗体和胶体金(颗粒大小为15-28nm)按照10-100μg：1mL的比例混合，加入0.2M的KCl调节pH＝7.5-8.0，加入等量PBS缓冲液，室温搅拌15min，12000r/min离心15min，弃上清；在沉淀中加入0.5％-1％(w/v)的牛血清白蛋白水溶液，室温搅拌10min，12000r/min离心15min，弃上清，用PBS缓冲液清洗沉淀2次，加入终浓度为0.5-2μg/mL硫酸软骨素、0.05％(w/v)的叠氮钠和PBS缓冲液，制得金标液；
S2、检测溶液和质控溶液的配制：
将鼠抗兔p24单克隆抗体用0.1M、pH＝8.0的碳酸氢钠缓冲液稀释至0.5-1mg/mL，加入0.2mg/mL的赖氨酸和1mol/L的NH4Cl溶液，搅拌5min混匀，得到混合液，再用0.1M、pH＝8.0的碳酸氢钠缓冲液透析混合液，得到检测溶液；
将羊抗BSA多克隆抗体用0.1M、pH＝8.0的碳酸氢钠缓冲液稀释至0.5-1mg/mL，加入0.2mg/mL的赖氨酸和1mol/L的NH4Cl溶液，搅拌5min混匀，得到混合液，再用0.1M、pH＝8.0的碳酸氢钠缓冲液透析混合液，得到质控溶液；
S3、样品垫的制备：
用含有0.5％(w/v)的NaCl、0.5％(w/v)的蔗糖、0.1％(w/v)的牛血清白蛋白和Tris-HCl缓冲液，pH＝7.5的溶液浸泡玻璃纤维膜，37℃干燥2小时，得到样本垫；
S4、金标垫的制备：
将步骤S1制得的金标液固相于玻璃纤维膜上，得到金标垫；
S5、硝酸纤维素膜的包被：
将步骤S2制得的检测溶液和质控溶液用喷膜机以泵速16mm/s、膜速320mm/s喷于硝酸纤维素膜上，喷膜量均为0.2-0.8μl/cm，形成检测线T和质控线C，37℃烘干1.5小时，得到硝酸纤维素膜；
S6、试纸条的制备：
在步骤S3得到的样品垫下方粘贴有步骤S4得到的金标垫，样品垫覆盖金标垫边沿1.0毫米；步骤S4得到的金标垫下方粘贴有步骤S5得到的硝酸纤维素膜，金标垫覆盖硝酸纤维素膜边沿1.0毫米；硝酸纤维素膜另一侧上方粘贴有吸水纸，吸水纸覆盖硝酸纤维素膜边沿1.0毫米；得到试纸条；
S7、慢病毒滴度检测卡的组装：
将步骤S6制备的试纸条放入卡体外壳的内部凹槽中，样品垫和硝酸纤维素膜分别位于加样孔和检测窗的正下方，扣合卡体外壳，得到慢病毒滴度检测卡。
本发明另一方面还提供了上述的慢病毒滴度检测卡在慢病毒载体和假病毒包装效率评估中的应用。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
本发明提供了一种基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡及其制备和应用。本发明基于胶体金侧向层析技术研发了HIV-1p24蛋白半定量检测卡，优化了检测卡中所用各种溶液的组分，可以用于相关慢病毒载体和假病毒包装效率的快速评估，有效提高了检测灵敏度，该检测卡的检测下限为1ng/mL，提高了检测结果的精密度和准确度，缩短了检测时间，从检测到结果判读仅需15-20分钟，可随时对转染效果进行评估。与传统的HIV-1慢病毒滴度检测方法相比，使用更加简便快速，降低了检测成本。
附图说明
图1是本发明慢病毒滴度检测卡的卡体外壳结构示意图。
图2是本发明慢病毒滴度检测卡的试纸条结构示意图。
图3是本发明慢病毒滴度检测卡的背板结构示意图。
图4是实验例1中根据不同浓度T线出现的颜色深浅制备的比色卡。
图1中的(1)为卡体外壳、(4)为加样孔、(5)为检测窗；
图2中的(2)为试纸条、(6)为样品垫、(7)为金标垫、(8)为硝酸纤维素膜、(9)为吸水纸、(10)为检测线T、(11)为质控线C；
图3中的(3)为背板。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。下面通过具体实施方案结合附图对本发明作进一步详细说明。
本发明慢病毒滴度检测卡如图1-3所示，包括卡体外壳(1)、试纸条(2)和背板(3)；卡体外壳(1)上设有加样孔(4)和检测窗(5)，试纸条(2)粘贴在背板(3)上，卡体外壳(1)与背板(3)扣合；试纸条(2)采用搭接的方式，依次设有样品垫(6)、金标垫(7)、硝酸纤维素膜(8)和吸水纸(9)；金标垫(7)上结合有金标液，硝酸纤维素膜(8)上设有检测线T(10)和质控线C(11)；检测线T上喷有检测溶液，检测线C上喷有质控溶液。
基础实施例：一种基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡的制备方法
S1、金标液的制备：
将鼠抗人p24单克隆抗体和胶体金(颗粒平均大小为15-28nm)按照10-100μg：1mL的比例混合，加入0.2M的KCl调节pH＝7.5-8.0，加入等量PBS缓冲液，室温搅拌15min，12000r/min离心15min，弃上清；在沉淀中加入终浓度为0.5％-1％(w/v)的牛血清白蛋白水溶液，室温搅拌10min，12000r/min离心15min，弃上清，用PBS缓冲液清洗沉淀2次，加入终浓度为0.5-2μg/mL硫酸软骨素、0.05％(w/v)的叠氮钠和PBS缓冲液，制得金标液；
S2、检测溶液和质控溶液的配制：
将鼠抗兔p24单克隆抗体用0.1M、pH＝8.0的碳酸氢钠缓冲液稀释至0.5-1mg/mL，加入0.2mg/mL的赖氨酸和1mol/L的NH4Cl溶液，搅拌5min混匀，得到混合液，再用0.1M、pH＝8.0的碳酸氢钠缓冲液透析混合液，得到检测溶液；
将羊抗BSA多克隆抗体用0.1M、pH＝8.0的碳酸氢钠缓冲液稀释至0.5-1mg/mL，加入0.2mg/mL的赖氨酸和1mol/L的NH4Cl溶液，搅拌5min混匀，得到混合液，再用0.1M、pH＝8.0的碳酸氢钠缓冲液透析混合液，得到质控溶液；
S3、样品垫的制备：
用含有0.5％(w/v)的NaCl、0.5％(w/v)的蔗糖、0.1％(w/v)的牛血清白蛋白和Tris-HCl缓冲液，pH＝7.5的溶液浸泡玻璃纤维膜，37℃干燥2小时，得到样本垫；
S4、金标垫的制备：
将步骤S1制得的金标液固相于玻璃纤维膜上，得到金标垫；
S5、硝酸纤维素膜的包被：
将步骤S2制得的检测溶液和质控溶液用喷膜机以泵速16mm/s、膜速320mm/s喷于硝酸纤维素膜上，喷膜量均为0.2-0.8μl/cm，形成检测线T和质控线C，37℃烘干1.5小时，得到硝酸纤维素膜；
S6、试纸条的制备：
在步骤S3得到的样品垫下方粘贴有步骤S4得到的金标垫，样品垫覆盖金标垫边沿1.0毫米；步骤S4得到的金标垫下方粘贴有步骤S5得到的硝酸纤维素膜，金标垫覆盖硝酸纤维素膜边沿1.0毫米；硝酸纤维素膜另一侧上方粘贴有吸水纸，吸水纸覆盖硝酸纤维素膜边沿1.0毫米；得到试纸条；
S7、慢病毒滴度检测卡的组装：
将步骤S6制备的试纸条放入卡体外壳的内部凹槽中，样品垫和硝酸纤维素膜分别位于加样孔和检测窗的正下方，扣合卡体外壳，得到慢病毒滴度检测卡。
实施例1：一种基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡
该慢病毒滴度检测卡包括：卡体外壳、试纸条和背板，卡体外壳上设有加样孔和检测窗，试纸条粘贴在背板上，卡体外壳与背板扣合，试纸条采用搭接的方式，依次设有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，金标垫上结合有金标液；硝酸纤维素膜上设有检测线T和质控线C；检测线T上喷有检测溶液，检测线C上喷有质控溶液。
金标液包括：胶体金10％(v/v)、鼠抗人p24单克隆抗体10μg/mL、牛血清白蛋白0.5％(w/v)、硫酸软骨素0.5μg/mL和叠氮钠0.05％(w/v)。所述胶体金平均大小为15nm。其中，鼠抗人p24单克隆抗体：胶体金＝100μg：1mL。
检测溶液含有浓度为0.5mg/mL的鼠抗兔p24单克隆抗体；所述质控溶液含有浓度为0.5mg/mL的羊抗BSA多克隆抗体。
检测线T和质控线C上的检测溶液和质控溶液的喷膜量均为0.2μl/cm。
按照以上标准，结合基础实施例所述的慢病毒滴度检测卡的制备方法，制得慢病毒滴度检测卡。
实施例2：一种基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡
与实施例1的区别在于，金标液包括：胶体金16％(v/v)、鼠抗人p24单克隆抗体8μg/mL、牛血清白蛋白0.7％(w/v)、硫酸软骨素1.3μg/mL和叠氮钠0.05％(w/v)。所述胶体金平均大小为22nm。其中，鼠抗人p24单克隆抗体：胶体金＝50μg：1mL。
检测溶液含有浓度为0.8mg/mL的鼠抗兔p24单克隆抗体；所述质控溶液含有浓度为0.8mg/mL的羊抗BSA多克隆抗体。
检测线T和质控线C上的检测溶液和质控溶液的喷膜量均为0.5μl/cm。
按照以上标准，结合基础实施例所述的慢病毒滴度检测卡的制备方法，制得慢病毒滴度检测卡。
实施例3：一种基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡
与实施例1的区别在于，金标液包括：胶体金20％(v/v)、鼠抗人p24单克隆抗体2μg/mL、牛血清白蛋白1％(w/v)、硫酸软骨素2μg/mL和叠氮钠0.05％(w/v)。所述胶体金平均大小为28nm。其中，鼠抗人p24单克隆抗体：胶体金＝10μg：1mL。
检测溶液含有浓度为1mg/mL的鼠抗兔p24单克隆抗体；所述质控溶液含有浓度为1mg/mL的羊抗BSA多克隆抗体。
检测线T和质控线C上的检测溶液和质控溶液的喷膜量均为0.8μl/cm。
按照以上标准，结合基础实施例所述的慢病毒滴度检测卡的制备方法，制得慢病毒滴度检测卡。
对比例1：一种基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡
与实施例2的区别仅在于，金标液中的胶体金为10％(v/v)、鼠抗人p24单克隆抗体为0.5μg/mL，即：鼠抗人p24单克隆抗体：胶体金＝5μg：1mL。
对比例2：一种基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡
与实施例2的区别仅在于，金标液中不添加硫酸软骨素。
对比例3：一种基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡
与实施例2的区别仅在于，结合基础实施例所述的慢病毒滴度检测卡的制备方法，制得慢病毒滴度检测卡，但在步骤S2的检测溶液和质控溶液的配制过程中不添加赖氨酸。
实验例1：一种基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡的灵敏度
取一份HIV-1慢病毒上清液，利用Lenti-XTM p24 Rapid Titer Kit(慢病毒滴度测定p24 ELISA试剂盒，购自美国clontech公司，货号：632200)和Lenti-XTM qRT-PCRTitration Kit(qRT-PCR法快速测定慢病毒滴度，购自美国clontech公司，货号：631235)测定其含量为1.83mg/mL，用磷酸盐缓冲液将其分别稀释为0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和500ng/mL的标准品。分别取50μl标准品加入到实施例2所述的基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡的加样孔，15-20分钟后读取检测结果。
结果判断：
a、阳性：质控线C和检测线T均显色；
b、阴性：质控线C显色，检测线T不显色；
c、无效：质控线C不显色。
根据不同浓度T线出现的颜色深浅制备了一个比色卡，如图4所示，可见，该慢病毒滴度检测卡的检测灵敏度不高于1ng/mL。另外，本发明还利用实施例1、3和对比例1-3进行了上述检测，结果发现，实施例1、3和对比例1均能检测出p24蛋白浓度低至1ng/mL的标准品，对比例2和3可检测p24蛋白浓度低至10ng/mL的标准品。
实验例2：一种基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡的精密度和准确度
取三种不同浓度的HIV-1慢病毒上清液(样品1-3)，用实施例2所述的基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡进行检测。取20μl上清液加入到加样孔，再加入磷酸盐缓冲液50μl，每组测试10次，15-20分钟后对比实施例4中制作的比色卡，估算p24蛋白的含量，检测结果如表1所示。除此之外，还利用了实施例1、3和对比例1所述的基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡进行了检测，精密度检测结果如表2所示。
表1：精密度检测结果
样品1 样品2 样品3
重复1(ng/mL) 11 45 360
重复2(ng/mL) 12 43 350
重复3(ng/mL) 11 46 350
重复4(ng/mL) 11 45 380
重复5(ng/mL) 12 44 350
重复6(ng/mL) 11 45 360
重复7(ng/mL) 12 43 370
重复8(ng/mL) 12 45 360
重复9(ng/mL) 11 45 360
重复10(ng/mL) 12 44 350
平均值(ng/mL) 11.5 44.5 359
SD 0.53 0.97 9.94
CV 4.6％ 2.2％ 2.8％
表2：精密度检测结果
检测结果表明，本发明提供的慢病毒滴度检测卡的批内精密度小于8％，批间精密度小于15％，精密度较高，符合要求。
另外，使用Lenti-XTM p24 Rapid Titer Kit(慢病毒滴度测定p24 ELISA试剂盒，购自美国clontech公司，货号：632200)和Lenti-XTM qRT-PCR Titration Kit(qRT-PCR法快速测定慢病毒滴度，购自美国clontech公司，货号：631235)测定样品1-3中p24蛋白含量，并与本发明提供的慢病毒滴度检测卡的检测结果的平均值进行比较，结果如表3所示。
表3：p24蛋白含量检测结果的平均值
组别 样品1(ng/mL) 样品2(ng/mL) 样品3(ng/mL)
实施例1 12.1 45.3 367
实施例2 11.5 44.5 359
实施例3 11.7 44.3 365
对比例1 12.9 45.6 371
对比例2 13.4 46.2 377
对比例3 13.8 46.7 385
ELISA试剂盒 10.3 43.6 332.8
qRT-PCR法 10.5 43.5 332.6
检测结果表明，本发明提供的慢病毒滴度检测卡与市售的ELISA检测试剂盒和qRT-PCR法相比，检测结果无显著性差异，其准确度较高。
综上，利用本发明提供的基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡检测p24蛋白浓度，其灵敏度、精密度和准确度均较高，且操作简单快速，并降低了检测成本。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于HIV-1载体的慢病毒滴度检测卡，包括卡体外壳、试纸条和背板，所述卡体外壳上设有加样孔和检测窗，所述试纸条粘贴在背板上，所述卡体外壳与背板扣合，所述试纸条采用搭接的方式，依次设有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其特征在于，所述金标垫上结合有金标液；
所述硝酸纤维素膜上设有检测线T和质控线C；
所述检测线T上喷有检测溶液，检测线C上喷有质控溶液；
所述金标液包括胶体金、鼠抗人p24单克隆抗体、牛血清白蛋白、硫酸软骨素和叠氮钠；
所述检测溶液含有鼠抗兔p24单克隆抗体；
所述质控溶液含有羊抗BSA多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的慢病毒滴度检测卡，其特征在于，所述的金标液包括胶体金10％-20％(v/v)、鼠抗人p24单克隆抗体2-10μg/mL、牛血清白蛋白0.5％-1％(w/v)、硫酸软骨素0.5-2μg/mL和叠氮钠0.05％(w/v)。
3.根据权利要求2所述的慢病毒滴度检测卡，其特征在于，所述的鼠抗人p24单克隆抗体：胶体金＝10-100μg：1mL。
4.根据权利要求3所述的慢病毒滴度检测卡，其特征在于，所述的鼠抗人p24单克隆抗体：胶体金＝50-100μg：1mL。
5.根据权利要求1所述的慢病毒滴度检测卡，其特征在于，所述检测溶液含有浓度为0.5-1mg/mL的鼠抗兔p24单克隆抗体；所述质控溶液含有浓度为0.5-1mg/mL的羊抗BSA多克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的慢病毒滴度检测卡，其特征在于，所述检测线T和质控线C上的检测溶液和质控溶液的喷膜量均为0.2-0.8μl/cm。
7.根据权利要求1所述的慢病毒滴度检测卡，其特征在于，所述胶体金的大小为15-28nm。
8.根据权利要求1所述的慢病毒滴度检测卡，其特征在于，所述的检测还包括比色卡；所述比色卡上显示有对应的检测线显示颜色的深浅度，其对应的检测样品中含有p24蛋白浓度的范围为1-500ng/mL。
9.一种权利要求1-8任意一项所述的慢病毒滴度检测卡的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1、金标液的制备：
将鼠抗人p24单克隆抗体和胶体金按照10-100μg：1mL的比例混合，加入0.2M的KCl调节pH＝7.5-8.0，加入PBS缓冲液，搅拌，离心弃上清；在沉淀中加入终浓度为0.5％-1％(w/v)的牛血清白蛋白水溶液，搅拌，离心弃上清，用PBS缓冲液清洗沉淀，加入终浓度为0.5-2μg/mL硫酸软骨素、0.05％(w/v)的叠氮钠和PBS缓冲液，制得金标液；
S2、检测溶液和质控溶液的配制：
将鼠抗兔p24单克隆抗体用0.1M、pH＝8.0的碳酸氢钠缓冲液稀释至0.5-1mg/mL，加入0.2mg/mL的赖氨酸和1mol/L的NH4Cl溶液，搅拌混匀，得到混合液，再用0.1M、pH＝8.0的碳酸氢钠缓冲液透析混合液，得到检测溶液；
将羊抗BSA多克隆抗体用0.1M、pH＝8.0的碳酸氢钠缓冲液稀释至0.5-1mg/mL，加入0.2mg/mL的赖氨酸和1mol/L的NH4Cl溶液，搅拌混匀，得到混合液，再用0.1M、pH＝8.0的碳酸氢钠缓冲液透析混合液，得到质控溶液；
S3、样品垫的制备：
用含有0.5％(w/v)的NaCl、0.5％(w/v)的蔗糖、0.1％(w/v)的牛血清白蛋白和Tris-HCl缓冲液，pH＝7.5的溶液浸泡玻璃纤维膜，干燥，得到样本垫；
S4、金标垫的制备：
将步骤S1制得的金标液固相于玻璃纤维膜上，得到金标垫；
S5、硝酸纤维素膜的包被：
将步骤S2制得的检测溶液和质控溶液喷于硝酸纤维素膜上，喷膜量均为0.2-0.8μl/cm，形成检测线T和质控线C，烘干，得到硝酸纤维素膜；
S6、试纸条的制备：
在步骤S3得到的样品垫下方粘贴有步骤S4得到的金标垫，样品垫覆盖金标垫边沿1.0毫米；步骤S4得到的金标垫下方粘贴有步骤S5得到的硝酸纤维素膜，金标垫覆盖硝酸纤维素膜边沿1.0毫米；硝酸纤维素膜另一侧上方粘贴有吸水纸，吸水纸覆盖硝酸纤维素膜边沿1.0毫米；得到试纸条；
S7、慢病毒滴度检测卡的组装：
将步骤S6制备的试纸条放入卡体外壳的内部凹槽中，样品垫和硝酸纤维素膜分别位于加样孔和检测窗的正下方，扣合卡体外壳，得到慢病毒滴度检测卡。
10.根据权利要求1-8任意一项所述的慢病毒滴度检测卡在慢病毒载体和假病毒包装效率评估中的应用。
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