CN104204802A - 免疫层析检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种能够使非特异性反应最小化的免疫层析检测方法。本发明涉及一种免疫层析检测方法，包括：将含有检体的检体稀释液添加至层析介质的步骤；通过被金纳米颗粒修饰的标记物识别检测对象的步骤，其中该标记物被干燥保持于标记物保持部；将所述标记物和所述检测对象的复合体展开为流动相的步骤；以及在判定部检测所述展开的流动相中的所述检测对象的步骤，其中所述免疫层析检测方法的特征在于：所述标记物被具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物保护，并且该标记物随后与精氨酸和酪蛋白一同干燥保持在所述标记物保持部。

Description

免疫层析检测方法
技术领域
本发明涉及一种抑制非特异性反应的具有高性能和高灵敏度的免疫层析检测方法。另外，本发明涉及一种通过抑制非特异性反应从而能够迅速、简单且准确地检验/测量样品中的检测对象的检测试剂盒。
更具体而言，本发明涉及一种通过保护被金属纳米颗粒标记的标记物并使其稳定化以对抗干燥处理或干燥状态并抑制非特异性反应，从而迅速、简单且准确地检验样品中的检测对象的方法，其中所述标记物用于对检测对象(待检测物质)进行检测，即，该标记物为一种敏化的金属胶体，其中，金属胶体被与检测对象发生特异性结合的物质敏化。
背景技术
近年来，作为一种基于利用抗体的特异反应性来检测样品液中的抗原的简单且便利的体外诊断试剂盒或便携式诊断装置，用于免疫层析法的试纸型免疫测定法的重要性日益增加，所述免疫测定法不需要对检测样品进行预处理。具体而言，用于病毒或细菌等病原体的检验试剂盒是在普通医院或门诊中广泛使用的常见免疫层析装置。
免疫层析装置的最简单结构为样品添加部位、标记物保持部、判定(检测)部位、免疫层析用多孔支持体和样品吸收部位相互连接的结构。标记物保持部已经通过以下方式生产：用保护性稳定化溶液处理用于检测检测对象的、已被金属纳米颗粒标记的标记物(以下也称作缀合物(conjugate))，然后用所述标记物浸渍或涂布免疫层析用多孔载体，随后进行空气干燥、真空干燥、冷冻干燥等。
作为保护性稳定化溶液，迄今为止，含有牛血清白蛋白(BSA)等蛋白质作为保护性稳定剂的那些是已知的，但是存在如下问题：它们不能在干燥状态下长期维持稳定，因而人们已经进行了进一步改善和研究。例如，已经报道了含有酪蛋白、乳清蛋白或酪蛋白分解产物的保护性稳定化溶液(见专利文献1)。
另外，作为对多种免疫测定法中的标记抗体的保护和稳定化，已知如下技术：向金胶体中添加生物分子(例如，抗体等)，然后通过向其中掺入被硫醇基(thiol)和/或二硫基取代的聚乙二醇来保护并稳定该缀合物(即，使颗粒的聚集降至最低并使能够吸附的自由表面饱和)(见专利文献2)。
另外，作为能够以干燥状态长期稳定贮存固相免疫试剂的一种保护性稳定化溶液，已经提出了由20％至80％的糖(如海藻糖)和0.5mol/L至2mol/L的缓冲液组成的保护性稳定化溶液(见专利文献3)。
另外，为了改善含有敏化金属胶体的冻干产品的稳定性，已知如下技术：在将含有敏化金属胶体的溶液冻干时，向其中掺入海藻糖、单精氨酸谷氨酸盐、色氨酸、氯化钙等中一种或多种(见专利文献4)。
另外，作为蛋白质(特别是贮存于水溶液中并在贮存三个月后诊断准确度轻微下降的酶)贮存性优异的体外诊断药物组合物，已经报道了可以通过向其中额外掺入胍(其盐)或精氨酸(其盐或其衍生物)作为稳定剂来解决在水溶液中引起蛋白质聚集、水解等问题(见专利文献5)。
另一方面，关于免疫层析装置，存在以下常见问题：背景着色(判定部处除固定相抗体以外的其他部分的着色)、空白显色(在检测物不存在的情况下固定相的显色)和前带现象(假阴性现象，其中当使用过量的检验物质作为样品时，明显观察到检验物质似乎以较少的量存在)，这些问题不仅在检测时降低SN率，还引起功能异常。
背景着色由可视化的流动相抗体与多孔载体之间的疏水性结合引起，空白显色由具有负电荷的流动相抗体与具有正电荷的固相载体之间的电相互作用引起，这又称作非特异性显色。另外，前带现象认为归因于如下事实：未能与标记物反应的过多检测物质与判定部发生反应，并且被金属颗粒标记的用于检出检测物质的标记物不能与判定部反应。
作为对策，已经从各种角度进行了众多研究。例如，在利用含有pH缓冲剂等的展开液的免疫层析检测方法中，已使用了各种添加剂以用于抑制因生物亲和力所致的副反应或用于抑制非特异性反应，这类添加剂的例子包括：用于促进抗原-抗体反应或用于抑制非特异性反应的蛋白质(例如，牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶等)、高分子化合物(例如，聚乙二醇、葡聚糖、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等)、非离子型表面活性剂(例如，Tween20、Triton X-100等)、离子型表面活性剂或聚阴离子(例如，硫酸葡聚糖、肝素、聚苯乙烯磺酸、透明质酸、硫酸软骨素等)或它们的盐，等等(见专利文献6)。
另外，已知的有：一种免疫层析分析方法，其中利用含有碱性氨基酸(例如，精氨酸，赖氨酸等)或氨基糖(例如，氨基葡萄糖等)的流动相将检测物质展开(见专利文献7)；和一种膜测定方法，其使用了精氨酸浓度为0.02M至1.5M、pH为7.0至9.5、并且除精氨酸之外基本上不含有缓冲剂的检测介质(见专利文献8)。
此外，作为对抗背景着色和空白显色且用于抑制因生物亲和力所致的副反应、抑制非特异性反应并稳定缀合物(如标记抗体)的对策，可列举蛋白质(例如，牛血清白蛋白、明胶、酪蛋白、乳清蛋白、含有酪蛋白分解产物的物质等)、高分子化合物(例如，被硫醇和/或二硫基取代的聚乙二醇等)、碱性氨基酸(例如，精氨酸等)等。
然而，即便非特异性反应得到抑制，仍会产生检测灵敏度下降的问题，因此仍未满意地实现这个目标，因此仍存在不能充分抑制非特异性反应的类似问题。
引用列表
专利文献
专利文献1：JP-A-9-80051
专利文献2：JP-A-10-73594
专利文献3：JP-A-2003-215127
专利文献4：JP-A-11-125635
专利文献5：JP-A-2011-196996
专利文献6：JP-A-2007-322310
专利文献7：JP-A-2001-289852
专利文献8：JP-A-2007-114049
发明内容
本发明要解决的问题
通过集中对以上高分子化合物(例如，被硫醇基和/或二硫基取代的聚乙二醇等)进行实验，发明人观察到通过免疫层析法检测样品中的检测物时，仍会发生空白显色和非特异性反应。因此，仍存在这样的问题：保护长期干燥保持在标记物保持部处的缀合物并使其稳定，并且充分抑制非特异性反应以实现检测灵敏度的改善。
与常规技术相比，本发明提供了一种保护标记物并使其稳定、并且抑制非特异性反应的高性能高灵敏度的免疫层析检测方法。另外，与常规技术相比，本发明的目的是提供一种免疫层析检测试剂盒，该免疫层析检测试剂盒通过保护标记物并使其稳定、并且抑制非特异性反应，从而能够迅速、简单且高度准确地进行检测。本发明的另一个目的是提供一种免疫层析装置，其能够与诸如病毒或细菌之类的病原体发生特异性反应以实现对病原体感染的迅速且简单的检测。
另外，本发明的目的是提供一种检测试剂盒，当将检体供至检测试剂盒的样品添加部，该检体与干燥保持在标记物保持部处的标记物一起作为流动相展开，并且展开的流动相中的检测对象在判定部处被检出时，该检测试剂盒能够通过抑制非特异性反应从而迅速、简单且准确地进行检测，其中所述检体是通过利用检体稀释液将样品调节或稀释至适于测定的浓度而获得的。
本发明的目的是提供这样一种检测试剂盒，通过利用检体稀释液来调节或稀释(例如)鼻涕或碳并将其提供至检测试剂盒的样品添加部，该检测试剂盒能够迅速、简单且准确地进行病原体感染检测。
另外，本发明的又一个目的是提供一种通过抑制非特异性反应从而利用免疫层析来检测样品中的检测对象的方法。
解决问题的手段
发明人已经发现，当在免疫层析装置上设置标记物保持部时，提供用具有一个以上的巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物保护标记物，然后将标记物与精氨酸和酪蛋白一同干燥保持在标记物保持部处，从而可保护标记物免于受干燥处理的影响，并且能够以干燥状态长期保持，由此完成了本发明。
即，本发明如下。
1.一种免疫层析检测方法，包括：
将含有检体的检体稀释液添加至层析介质的步骤；
通过被金纳米颗粒修饰的标记物识别检测对象的步骤，其中该标记物被干燥保持于标记物保持部；
将所述标记物和所述检测对象的复合体展开为流动相的步骤；以及
在判定部检测所述展开的流动相中的所述检测对象的步骤，
其中所述标记物被具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物保护，并且该标记物随后与精氨酸和酪蛋白一同干燥保持在所述标记物保持部。
2.上述1中所述免疫层析检测方法，其中所述具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物为具有一个以上巯基且分子量为1,000至30,000的聚乙二醇和/或其衍生物。
3.上述2中所述免疫层析检测方法，其中所述标记物在包含所述具有一个以上巯基的聚乙二醇和/或其衍生物的溶液中经过了保护处理，并且在所述标记物的所述保护处理之后，所述聚乙二醇和/或其衍生物在所述溶液中的浓度为0.0001质量％至0.05质量％。
4.上述1至3中任一项所述的免疫层析检测方法，其中上述精氨酸和酪蛋白通过包含在所述标记物溶液中并浸润上述层析介质从而干燥保持在上述标记物保持部处，并且作为所述标记物溶液润湿所述层析介质之前在所述标记物溶液中的终浓度，精氨酸的浓度为0.01质量％至2质量％，并且酪蛋白的浓度为0.1质量％至10质量％。
5.上述1至4中任一项所述的免疫层析检测方法，其中所述金纳米颗粒是平均粒径为30nm至100nm的红色金纳米颗粒，或者平均粒径为20nm至200nm的蓝色金纳米颗粒。
6.上述1至5中任一项所述的免疫层析检测方法，其中所述检体为鼻涕、鼻腔拭子、咽拭子、或痰。
7.上述1至6中任一项所述的免疫层析检测方法，其中所述检体稀释液中含有胍。
8.上述7中所述的免疫层析检测方法，其中所述检体稀释液中的所述胍的浓度为1mM至200mM。
9.一种免疫层析装置，实质上依次由样品添加部、标记物保持部、层析介质部、检测部和吸收部构成，其中所述标记物保持部设置在所述样品添加部的端部与所述检测部之间，并且所述标记物被具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物保护，并且所述标记物与精氨酸和酪蛋白一同干燥保持在所述标记物保持部处。
10.一种检测试剂盒，其包括免疫层析装置，该免疫层析装置实质上依次由样品添加部、标记物保持部、层析介质部、检测部和吸收部构成，其中所述标记物保持部设置在所述样品添加部的端部与所述检测部之间，并且所述标记物被具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物保护，并且所述标记物与精氨酸和酪蛋白一同干燥保持在所述标记物保持部处。
发明效果
在本发明的免疫层析检测方法中，当在免疫层析装置上设置标记物保持部时，利用具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物保护标记物，并且将该标记物与精氨酸和酪蛋白一同干燥保持在标记物保持部处，其中该标记物被用于检测检测对象的金属纳米颗粒标记。由此，敏化金属胶体受到保护从而免受干燥处理的影响，并能够以干燥状态长期稳定保持在标记物保持部处，其中在该敏化金属胶体中，金属胶体颗粒被与检测对象发生特异性结合的物质敏化。
因此，根据本发明的免疫层析检测方法，在检测样品中的检测对象(例如，抗原等)时，尽管使非特异性反应稳定化或其抑制机理的原理细节是未知的，但由于以下三种因素的组合效果，可明显抑制非特异性反应，这三种因素为：发生了协同作用的具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物、精氨酸和酪蛋白。另外，未观察到灵敏度下降，并且可获得准确的判定结果。
例如，在对用作检体的咽拭子中的病毒等进行检测时，未观察到灵敏度下降，并可准确判定感染等存在与否。
本发明的用于免疫层析的检验试剂盒能有效检测病原体的存在，具体而言，其可以对特定病毒的存在与否作出快速且准确的检测，从而可以采取适宜的治疗措施，因此该试剂盒优选用在医疗现场。
附图简要说明
图1为用于免疫层析装置的试验片的示意图。
具体实施方式
下文将详细描述本发明。
本发明涉及一种免疫层析检测方法，包括：将检体稀释液添加至层析介质的步骤；利用被金纳米颗粒修饰的标记物来识别检测对象的步骤，其中所述标记物被干燥保持在标记物保持部处；将标记物和检测对象的复合体张开为流动相的步骤；以及在判定部处检测被展开的流动相中的检测对象的步骤，其中标记物被具有一个以上的巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物保护，并随后与精氨酸和酪蛋白一同干燥保持在标记物保持部处。
由于标记物被具有一个以上的巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物保护、并随后与精氨酸和酪蛋白一同干燥保持在标记物保持部处，因此敏化金属胶体受到保护从而免受干燥处理的影响，并能够以干燥状态长期稳定保持在标记物保持部处，其中在该敏化金属胶体中，金属胶体颗粒被与检测对象发生特异性结合的物质(例如，诸如抗体、抗原、酶或肽之类的生物分子)敏化。
虽然其机理不明，但据认为，具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物、以及精氨酸和酪蛋白这三种物质发挥了以下作用：它们在协同作用下通过联合吸附从而覆盖了标记物中金属颗粒的自由表面并使该表面饱和，由此明显消除了可能引起非特异性反应的吸附的可能性，并且将金属颗粒的聚集保持为最低水平。
另外，据认为存在如下作用：流动相抗体与多孔载体之间的疏水性结合以及流动相抗体与固定相载体之间的电相互作用因精氨酸、具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物、以及酪蛋白之间的相互作用而高度消除。
另外，据认为，通过具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物、精氨酸和酪蛋白之间的协同作用，实现了检测对象和被标记的检测试剂的稳定化、以及通过检测对象与标记抗体间的反应而获得的复合体的稳定化，并且同时它们起到了使其作为流动相的移动变得顺畅的作用。
通过这些作用，通过极显著地抑制非特异性反应，本发明的免疫层析检测方法能够以高准确度极为敏感且迅速地对样品中的检测对象进行特异性检测/测定。
用于本发明中的聚亚烷基二醇和/或其衍生物优选为分子量优选为1,000至30,000、更优选为2,000至20,000、并且具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物。
具有一个以上巯基的部分的例子包括单巯基或二巯基。具有分枝结构的情况的例子包括三巯基和四巯基。
聚亚烷基二醇和/或其衍生物的例子包括：均聚物，如聚乙二醇(称作“PEG”)、聚丙二醇(称作“PPG”)和聚丁二醇(称作“PBG”)；以及由乙二醇(称作“EG”)区段、丙二醇(称作“PG”)区段以任意构成比构成的无规共聚物，例如，其中混有EG、PG和BG的无规共聚物、或者其中混有PEG，PPG和PBG嵌段的嵌段共聚物。
例如，可列举任意无规含有或作为嵌段而含有EG、PG、BG的聚合物，如HS-PEG、HS-PEG-SH、HS-PPG、HS-PPG-SHSH-PBG、HS-PBG-HS、HS-PEG-PPG、HS-PEG-PPG-HS、HS-PEG-PBG-HS和HS-PEG-PPG-PBG-HS。
属于聚亚烷基二醇和/或其衍生物部分的范畴的、尤其可用于实施本发明的聚合物为聚乙二醇(PEG)。就其分子量而言，可以使用分子量为1,000至30,000的那些聚乙二醇，作为特定分子量的例子，可使用具有任意分子量的聚乙二醇，如1,500、5,000、8,000、15,000、18,000或25,000。实际上，由于难以获得具有精确数值的分子量的聚合物，因此获得并使用分子量在该数值附近的聚合物已足够。
在任何情况下，必须的条件是属于具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物的范畴。具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物甚至可以作为其混合物使用。
最适合用于保护本发明免疫层析用标记物的、分子量为1,000至30,000并具有一个以上巯基的聚乙二醇(PEG)和/或其衍生物由以下通式代表：
X-(CH2CH2O)n-CH2CH2-SH
其中X表示HS-、可能被保护的HO-、或烷基-O-，并且n表示15至540的整数。作为衍生物，可列举端基处具有OH和SH的保护基团的衍生物。例如，在为OH的情况下，可列举肽合成领域常用的保护基：对甲苯磺酰基、羰基等。优选烷基，并且特别优选甲基。
作为具有一个以上巯基的具体的聚乙二醇和/或其衍生物，可以列举(例如)单巯基聚乙二醇和二巯基聚乙二醇。作为具有分支结构的例子，可列举(例如)三巯基聚乙二醇和/或其衍生物。
作为具有一个以上巯基的聚乙二醇(PEG)和/或其衍生物，可获得并使用具有市售分子量(分子量为1,000至30,000)的那些。
具有一个以上巯基的聚乙二醇(PEG)和/或其衍生物的特别优选的分子量为2,000至20,000。其例子包括甲氧基-PEG-巯基2000、巯基-PEG-巯基3400、甲氧基-PEG-巯基5000、甲氧基-PEG-巯基20000等。
通过将具有一个以上巯基的聚乙二醇(PEG)和/或其衍生物的分子量控制为2,000以上，即使当PEG充分修饰标记物时，也可以防止其对抗干燥的稳定性和保护功能不充分。另外，可以提高对非特异性反应的抑制。
此外，通过将具有一个以上巯基的聚乙二醇(PEG)和/或其衍生物的分子量控制为20,000以下，标记物的PEG修饰变得均匀且充分。因此，可以均匀并充分地展示出对抗干燥作用的稳定性和保护性功能。此外，可以改善对非特异性反应的抑制。
当分子量落入1,000至30,000范围内时，不仅可以获得相对高纯度的聚乙二醇，还可充分进行标记物的PEG修饰，可以均匀并充分地显示出对抗干燥作用的稳定性和保护性功能，并可改善对非特异性反应的抑制，因而这种情况是优选的。
必须使用分子量为1,000至30,000且具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物，但在一些情况下，可使用通过将分子量不同的两种含巯基的聚亚烷基二醇或其衍生物(如分子量为3,000的PEG和分子量为8,000的PEG)以任意比例混合而获得的聚合物共混物。
类似地，从巯基的角度考虑，可列举通过将具有一个巯基的聚亚烷基二醇或其衍生物和具有两个巯基的聚亚烷基二醇或其衍生物以任意比例混合而获得的聚合物共混物，如“HS-PEG和HS-PEG-SH”混合物。
另外，可列举由约20质量％至99质量％的具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇或其衍生物和约1质量％至80质量％的不含巯基的聚亚烷基二醇或其衍生物构成的聚合物共混物，如“HS-PEG和PEG”混合物。在为这种聚合物共混物的情况下，需要注意调节其共混量从而不致削弱具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇的功能。
作为聚合物共混物中的两种分子量不同的含巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物的例子，可使用巯基-PEG-巯基3400和甲氧基-PEG-巯基5000的混合物。
作为具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物、尤其是用于如下标记物中的具有一个以上巯基的代表性聚乙二醇和/或其衍生物的浓度，在标记物经过具有一个以上巯基的聚乙二醇和/或其衍生物的保护处理之后，具有一个以上巯基的聚乙二醇和/或其衍生物在溶液中的浓度优选为0.0001质量％至0.05质量％，更优选0.0005质量％至0.01质量％，其中在上述标记物中，与检测对象发生特异性反应的试剂组分(例如，抗体等)被金纳米颗粒修饰。例如，可以使用分子量为5,000且在水中的浓度为约0.001质量％的甲氧基-PEG-巯基。
通过将具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物在溶液中的浓度控制为小于0.0001质量％，则对抗干燥的稳定性和保护性功能变得足够高并且可以抑制空白显色和非特异性反应，从而可以进行准确的判定。通过控制该浓度为0.05质量％以下，则可抑制标记物颗粒的聚集，并且该浓度为必要且足够的浓度，因此这种情况是经济的。
用于本发明中的精氨酸是也被称作5-胍基-2-氨基戊酸的天然存在的氨基酸。作为精氨酸，优选L-精氨酸(C6H14N4O2)。
优选的是，通过将精氨酸掺入标记物溶液中并用其浸渍层析介质，从而使精氨酸干燥保持在标记物保持部。在用标记物溶液浸渍层析介质之前，精氨酸在标记物溶液中的终浓度优选为0.01质量％至2质量％，更优选为0.02质量％至0.5质量％。例如，优选使用0.1质量％的L-精氨酸水溶液。
通过控制精氨酸的终浓度为0.01质量％以上，对抗干燥的稳定性和保护性功能变得充分并且可以抑制空白显色和非特异性反应，从而可以进行准确判定。通过控制该浓度为2质量％以下，该浓度为必要且足够的浓度，因此这种情况是经济的。
酪蛋白是包含在牛奶和干酪中的一种天然存在的磷蛋白。用于本发明中的酪蛋白的例子包括酪蛋白本身和含有酪蛋白作为主要组分的脱脂乳。
优选的是，通过将酪蛋白掺入标记物溶液中并用其浸渍层析介质，从而使酪蛋白干燥保持于标记物保持部。在用标记物溶液浸渍层析介质之前，酪蛋白在标记物溶液中的终浓度优选为0.1质量％至10质量％，更优选为0.2质量％至5质量％。例如，优选使用含有1质量％的酪蛋白的缓冲液。
通过将酪蛋白的终浓度控制为0.1质量％以上，可展示出充分的效果。通过将该浓度控制为10质量％以下，该浓度为必要且足够的浓度，因此这种情况是经济的。
优选的是，将精氨酸的水溶液(缩写为“B”)和酪蛋白的水溶液(缩写为“C”)适当组合，并将其混入已被具有一个以上巯基的聚乙二醇衍生物保护的标记物的水溶液中，从而获得如上所述的浓度。B和C的浓度分别优选为0.01质量％至2质量％和0.1质量％至10质量％，更优选为0.05质量％至1质量％和0.5质量％至5质量％。
在本发明中，优选向检体稀释液中引入胍或其盐。胍盐可以是无机盐或有机盐，其例子包括盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐和柠檬酸盐。胍或其盐在检体稀释液中的浓度优选为1mM至200mM，更优选为2mM至100mM，进一步优选为5mM至50mM。
作为检体稀释液，例如，优选使用含有20mM盐酸胍的缓冲液。通过将检体稀释液中胍或其盐的浓度控制为1mM以上，可以实现足够的效果。通过将该浓度控制为200mM以下，该浓度为必要且足够的浓度，因此这种情况是经济的。
用于本发明中的金纳米颗粒优选为平均粒径为30nm至100nm的红色金纳米颗粒和/或平均粒径为20nm至200nm的蓝色金纳米颗粒。显而易见的是，也可以使用诸如铂、银、锗、铑或钯之类的贵金属的颗粒，或者诸如钛、铁或锌之类的平均粒径优选为约10nm至250nm、更优选为约35nm至120nm的金属金纳米颗粒。
就诊断准确度而言，最推荐金纳米颗粒，但是也可以使用含有金作为主要组分的金属(如金和铂)混合物。另外，对于某些特殊诊断而言，还可设法控制金属纳米颗粒以尽可能具有相同形状(例如，真球形)或尽可能使各个颗粒的粒径均一。
可以使金属纳米颗粒处于分散状态。例如，可列举被抗体或抗原敏化的金属胶体、敏化的金胶体、敏化的铂-金胶体、敏化的金-银胶体、铁胶体等。然而，就便于处理、测定精度等而言，推荐金胶体。为改善测定灵敏度，推荐组合使用被胶体金标记的敏化剂。
在为了诊断目的而需要高灵敏度和高精度的特殊情况下，还可设法使胶体颗粒的形状相同，例如，增加具有真球形的那些颗粒，或使胶体颗粒的粒径均一，例如，使粒径集中至特定粒径，如40nm、80nm或120nm，即，形成所谓的具有窄粒径分布曲线的胶体。
另外，为了调和金属胶体的显色能力，由于颜色根据金的颗粒状态及其聚集而不同，所以还可通过将在可见光区域具有特定颜色的胶体(例如，红色金纳米颗粒胶体和蓝色金纳米颗粒胶体)以任意比例混合来制备具有预定颜色的金纳米颗粒胶体。
在判定时，还可通过设计更鲜明的色彩显示来提高判定精度。例如，要领是适当地组合光的三原色，即，红色(波长：770nm至640nm)、绿色(波长：490nm至430nm)和蓝色(波长：490nm至430nm)。所有这些金属纳米颗粒胶体均是市售易得的产品。
顺便提及的是，可以通过各种常规测量方法确定平均粒径，如在通过使用动态光散射粒径分析仪测量胶体的粒度分布后来确定平均粒径。
包括用于本发明中的标记物溶液、检体稀释液等在内的试剂组合物优选含有缓冲剂或表面活性剂，尤其为非离子型表面活性剂。
对缓冲剂没有特别限制，只要缓冲剂即使在因样品的添加或者样品的蒸发或稀释导致浓度发生变化或在受到来自外界的异物的污染时，缓冲剂也不会产生造成严重影响的作用(缓冲作用)即可。
缓冲剂的例子包括乙酸盐缓冲液(乙酸+乙酸钠)、磷酸盐缓冲液(磷酸+磷酸钠)、柠檬酸盐缓冲液(柠檬酸+柠檬酸钠)、硼酸盐缓冲液、tris-HCl缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷+盐酸)、TE缓冲液(tris+乙二胺四乙酸)、TAE缓冲液(tris+乙酸+乙二胺四乙酸)、TBE缓冲液(tris+硼酸+乙二胺四乙酸)和HEPES缓冲液(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)。优选HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和tris-HCl缓冲液，并且更优选的是HEPES缓冲液。另外，可以在不产生不良效果的范围内混合使用其他缓冲剂。
非离子型表面活性剂的例子包括聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯/聚氧丙烯烷基醚(商品名：Nonion(商标)MN811，由NOF公司制造；商品名：NP-40，由Nakarai Tesque公司制造)、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯(商品名“Tween”系列)、聚氧乙烯对叔辛基苯基醚(商品名“Triton”系列)、聚氧乙烯对叔壬基苯基醚(商品名“TritonN”系列)、烷基聚葡糖苷、脂肪酸二乙醇酰胺和烷基单甘油基醚。非离子型表面活性剂可以单独使用或作为其两种以上的混合物使用。
用于本发明的试剂组合物可含有已知能够抑制基于生物亲和力性的副反应和/或非特异性反应的添加剂。该添加剂的例子包括：用于促进抗原-抗体反应或抑制非特异性反应的蛋白质(例如，牛血清蛋白、明胶等)、高分子化合物(例如，聚乙二醇、甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、葡聚糖等)、离子型表面活性剂或聚阴离子(例如，硫酸葡聚糖、肝素、聚苯乙烯磺酸、硫酸软骨素等)和抗菌剂。可添加它们中的一种以上来使用。
此外，将用于促进抗原抗体反应或抑制非特异性反应的蛋白质、高分子化合物、离子型表面活性剂或聚阴离子、或者抗菌剂中的一种以上保持在位于构成固定相的层析介质上的移动相迁移路径上也是可能并有效的，这是允许的。
在将标记物溶液保持于固定相中时，标记物溶液中可包含保护性稳定化物质或溶解促进物质。保护性稳定化物质或溶解促进物质的例子包括糖类，即单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。单糖的例子包括葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖等。二糖的例子包括海藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖等。三糖和寡糖的例子包括蜜三糖等。多糖的例子包括葡糖酸、葡聚糖等。它们可以单独使用或作为其两种以上的混合物使用。
另外，在本发明中，具体而言，为了在免疫层析装置的区域中设置标记物保持部，将下述溶液与精氨酸和酪蛋白(稳定化试剂)混合，从而制备了含有用于保护并稳定标记物的试剂的组合物(含有标记物保护并稳定化试剂的组合物)，并将该组合物涂布、吸附或浸入至样品添加部的端部与判定部之间的区域中，然后将其干燥，由此可在标记物保持部上担载、保持或形成标记物，其中在上述溶液中，利用了分子量为1,000至30,000且具有一个以上巯基的亚烷基二醇和/或其衍生物(保护试剂)对标记物进行了保护处理。
在制备含有标记物保护并稳定化试剂的组合物时，就将与经过保护处理的标记物溶液混合的试剂的添加顺序而言，可以通过考虑含有标记物保护并稳定化试剂的组合物的状态从而任意确定何种稳定化试剂首先添加或者何种稳定化试剂最后添加，这落入设计事项的范围内。
例如，可首先将分子量为1,000至30,000并具有一个以上巯基的聚乙二醇(PEG)和/或其衍生物添加至标记物，然后依次添加精氨酸或酪蛋白。
作为可供替代的方案，可首先将聚乙二醇和/或其衍生物添加至标记物，然后向其中加入精氨酸和酪蛋白的混合物。或者，可以将通过向标记物中加入聚乙二醇衍生物而获得的溶液添加至精氨酸和酪蛋白的混合物溶液中(以任意顺序添加)。
在添加时，添加可以连续少量进行或间断进行，或可一次性进行，只要实现均匀添加即可，这可根据添加量而适当进行，这些落入设计事项的范围内。可以通过考虑性能从而任意确定标记物保持部的尺寸(宽度)、浓度等，这些落入设计事项的范围内。
作为在免疫层析装置上设置含有用于本发明中的标记物溶液或其他试剂组合物的部位的方法，例如，可列举这样一种方法：将免疫层析用标记物溶液涂布或渗入至免疫层析装置中的玻璃纤维垫(标记物保持部件)，然后干燥该溶液(例如，通气干燥、真空干燥、空气干燥和冷冻干燥)，由此使标记物溶液担载或保持在玻璃纤维垫中。
用于本发明中的检体稀释液是也能够用作展开液或样品稀释液的一种溶液。作为样品稀释液，通常使用水作为溶剂，并向其中添加缓冲液、盐和非离子型表面活性剂、此外还添加用于促进抗原-抗体反应或抑制非特异性反应的蛋白质、高分子化合物(例如，PVP等)、离子型表面活性剂或聚阴离子、抗菌剂、螯合剂等中的一种或两种以上。不特别限制添加顺序，并可同时添加。
在使用检体稀释液作为展开液的情况下，可以通过将预先由检测样品和展开液制成的混合物供给并滴加至样品垫(样品添加部)从而进行展开；或者可首先将样品供给并滴落至样品垫(样品添加部)，然后将展开液供给并滴落至样品垫(样品添加部)，从而进行展开。
在使用检体稀释液作为样品稀释液的情况下，对于将检体调节或稀释至适于测定的浓度的稀释液，可将该稀释液供给并滴加至样品垫(样品添加部)上从而将其直接用作展开液。
本发明中检体(含有检测对象的样品)的主要例子包括生物样品，即血液、血清、血浆、尿、唾液、脑脊液、汗、眼泪、羊水、乳头分泌液、鼻涕、痰、鼻腔或咽拭子、皮肤分泌物、组织、细胞和粪便提取物。
对本发明的检测对象没有特别的限制，只要存在与其特异性结合的物质(例如，如抗原-抗体反应中那样的特异性结合的物质)或能够制备出这样的物质即可。所述检测对象可以本身具有免疫原型，如完全抗原；或者本身不具有免疫原性，但可以通过化学修饰获得免疫原性，如半抗原(不完全抗原)。只要存在或可以制备与任何这些检测对象特异性结合的物质即可，该物质可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明中的检测对象的例子包括肽激素(生长激素(GH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、黑素细胞刺激激素(MSH)、催乳激素、促甲状腺激素(TSH)、黄体化激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、垂体激素、钙代谢调节激素、胰腺激素、胃肠激素、血管活性激素、胎盘激素如人绒毛膜促性腺激素(hCG))、卵泡激素如雌酚酮、天然或合成性黄体激素如孕酮、雄性激素如睾酮、肾上腺皮质激素如皮质醇、甲状腺激素如二碘甲状腺原氨酸、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特异性抗原(PSA)、碱磷酸酶、氨基转移酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶原、α-胎蛋白(AFP)、肿瘤特异性物质如癌胚抗原(CEA)、血清蛋白组分如免疫球蛋白G(IgG)、风湿病因子、血清素、尿激酶、铁蛋白、P物质、大便潜血、梅毒抗体、流感病毒、腺病毒、轮状病毒、支原体(Mycoplasma)、HBs抗原、HBs抗体、衣原体抗原、A组β溶血链球菌抗原、其他类固醇如胆固醇、胆汁酸、强心类固醇和皂角苷配基、肾上腺素、多巴胺、生理活性生物碱、含有氨基的精神病治疗药、低分子量肽如TRH、前列腺素、维生素、抗生素如青霉素、其他体内组分、待体内施用的药物及其代谢物。
其中，优选病毒或细菌等病原体，更优选流感病毒、腺病毒、轮状病毒和支原体。在这种情况下，检体(含有检测对象的样品)的例子包括鼻涕、痰和鼻腔或咽拭子。
在使用咽拭子作为检体的情况下，在使用检体稀释液稀释咽拭子后，将其供给并滴加在免疫层析装置中的样品垫上。本发明的免疫层析的检验试剂盒能够有效检验病原体的存在与否，特别地，可以基于该特定病毒存在与否的检验结果来采取快速且精准的治疗措施。
用于检验生物样品(如鼻涕、痰和鼻腔或咽拭子)中病毒等存在与否的免疫层析装置的结构和操作及检测方法是已知的。
通过将含有生物样品(检体)的本发明检体稀释液供给并滴加至常规的免疫层析装置的样品垫上，并利用免疫层析装置进行诸如抗原-抗体反应之类的特异性结合反应，由此进行样品中检测对象的鉴定和定量等检测，如咽拭子中的流感病毒的检测，其中在所述免疫层析装置上，通过(例如)用标记物溶液浸渍免疫层析装置并随后将溶液干燥，由此使标记物溶液担载于免疫层析介质上。
下文将描述免疫层析装置及其规格。免疫层析装置由(1)样品添加部(1)(样品垫)、标记物保持部(2)、层析介质部(3)、检测部(4)、吸收部(5)和底板(6)组成。其各部分的结构、规格和形态如下。
1)参见图1，样品添加部(1)(样品垫)由多孔片构成，其具有可以使试样被迅速吸收、但保持力弱而使试样迅速地向反应部移动的特性。多孔片的例子包括纤维素滤纸、玻璃纤维滤纸、聚氨酯、聚乙酸酯、醋酸纤维素、尼龙和棉花。其中，优选玻璃纤维滤纸。
在本发明中，为了抑制非特异性反应，可以采用如下实施方案：其中，预先用含有缓冲液、非离子型表面活性剂等的免疫层析用试剂组合物浸渍样品添加部(1)并随后将其干燥，从而担载该试剂组合物。例如，可有效地采取这样的实施方案，其中，预先将含有tris-盐酸缓冲液以及一端为烷基的聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段共聚物成分的免疫层析用试剂组合物中的任何成分预先担载或保持在其上。
2)在标记物保持部(2)中，担载或保持有标记试剂，在该标记试剂中，试剂组分被标记组分标记。作为标记组分，可以使用：金属胶体颗粒，如金胶体颗粒和银胶体颗粒；染色胶乳颗粒，其通过对使各种单体(共)聚合所合成的合成高分子进行染色而获得；酶；荧光化合物；等等。试剂组分是能够识别待分析物质的颗粒或分子，并优选为单克隆抗体或多克隆抗体或其片段(第二试剂)。
3)层析介质部(3)由膜载体和在膜载体上形成的判定部(4)构成。对膜载体没有特别限定，只要其可借助毛细现象吸收样品检体并且可以使检体移动即可。例如，载体可以选自由硝酸纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚醚砜、聚乙烯基醇、聚酯、玻璃纤维、聚烯烃、纤维素、以及由它们的混合纤维制成的合成聚合物。载体可由纤维、织布、无纺布、布、膜等中任一者构成。
4)在检测部(4)中，单克隆抗体或多克隆抗体或其片段(第一试剂)担载并固定于硝酸纤维素板上。用于判定部(4)中的试剂组分(第一试剂)和用于标记试剂中的试剂组分(第二试剂)中的一者或两者可以是单克隆抗体或多克隆抗体，但是若在维持特异性的同时考虑抗体的制造成本和稳定供给，则优选这二者中的至少一者是多克隆抗体。另外，从测量灵敏度等的观点看，用于标记试剂中的试剂组分(第二试剂)更优选为具有高特异性的单克隆抗体。在检验诸如流感病毒之类的具有高致病性的检体时，最优选的是这二者均为单克隆抗体。
单克隆抗体和多克隆抗体及其片段是已知并可获得的，并能够通过已知的方法制备。产生抗体的物种的例子包括人、小鼠、大鼠、兔和山羊。免疫球蛋白可以是IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任意一种。
单克隆抗体可以根据常规方法获得：将经抗原(例如，流感病毒)免疫的小鼠的脾脏细胞和骨髓瘤细胞杂交，选择产生目标抗体的杂交瘤细胞，并获得由该杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。例如，可参照和Milstein的技术(Nature,256(1975),495-497页)。
多克隆抗体可通过常规方式，利用抗原(流感病毒等)对可产生抗体的动物(例如，人、小鼠、大鼠、兔、羊或马等)进行免疫得到抗血清，在所得的抗血清中分离获得目标抗体而获得。
基于构成病毒粒子的蛋白质当中M1蛋白(该蛋白以内衬包膜的方式位于薄膜内，实质上充当了壳的作用)和NP蛋白(其存在于包膜内，以螺旋形式缠绕在核蛋白上，相当于核壳体)的抗原性差异，将流感病毒分成A型、B型和C类型。
大规模流行且感染时伤害巨大的A型流感病毒是一种负链单链RNA病毒，其具有约80至120nm的直径并具有包膜(壳)，并且基于作为病毒表面蛋白的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，将A型病毒按HA(H1至H16)进一步划分成16种亚型，并且按NA(N1至N9)进一步划分成9种亚型。
作为用于检测部(4)中的试剂组分(第一试剂)和用于标记试剂中的试剂组分(第二试剂)，可以使用抗流感病毒单克隆抗体或抗流感病毒多克隆抗体。然而，从反应精度和效率的角度看，最优选使用抗流感病毒单克隆抗体作为这两种试剂。
5)在吸收部(5)中，使用能够迅速地吸收过量样品的材料、玻璃滤纸等。
6)底板(6)是基材。通过在底板的一侧上涂布粘合剂或者粘贴胶带从而使该侧具有粘合性，将样品添加部(1)、标记物质保持部(2)、层析介质(3)、检测部(4)和吸收部(5)中的一部分或全部紧密粘合于底板的粘合侧上。对于底板(6)，对其基材没有特别的限制，只要是通过压敏粘合剂使其对样品液具有不透过性并且具有非透湿性即可。
以下将以检测对象是流感病毒为具体例子来概述判定原理：
1.用检体稀释液来制备或稀释样品(例如，咽拭子等检体)至使样品在免疫层析介质中顺畅移动而不降低测量精度的浓度，由此形成检体样品(含有检体的检体稀释液)。将预定量(通常为0.1ml至2ml)的检体样品滴加至样品添加部(1)。当滴加检体样品时，检体样品开始在样品添加部(1)中移动。
2.接着，检体样品移动至标记材料保持部(2)。当检体样品通过该部分时，保持在标记材料保持部(2)处的溶解辅助物质首先溶解于检体样品的水分中，然后与标记物一同保持的保护性稳定化物质和标记物溶解于检体样品的水分中并随检体样品一同移动。
3.接着，溶解于检体样品的水分中的标记试剂通过层析介质部(3)上的检测部(4)。此处，免疫层析用试剂组合物通过含有溶解于检体样品中的保护性稳定化物质等从而抑制了非特异性反应，并且凭借抗原和抗体之间的特异性结合反应，在流感病毒存在的情况下，检体样品中的流感病毒发生特异性反应并以夹在抗体和标记试剂之间的方式结合至保持(即，担载)并固定于检测部(4)处的抗体和标记试剂，由此使检测部(4)着色。在不存在流感病毒的情况下，即使溶解于样品的水分中的标记试剂通过位于层析介质部(3)上的检测部(4)时，其也不会引发特异性反应，因此检测部(4)不会着色。
4.最后，样品中的水分向吸收部(5)移动。以这种方式，例如，通过检测检体样品中是否存在流感病毒，可以准确判断是否感染流感病毒。
对于作为采集样品的鼻涕、痰、或鼻腔或咽拭子，可以通过与上述类似的检验：用样品稀释液将其稀释约10倍至100倍，并将150μL的稀释后的样品溶液滴加/供给至样品添加部(1)，然后进行展开，由此可以获得与上述相似的结果。
以下内容将参照根据各说明的实施例和实施方案解释本发明的有效性，但是不应解释为本发明局限于此。
实施例
下文将参考实施例和比较例解释本发明的意义。实施这些实施例和比较例的详情如下。
[实施例1]
(1)层析介质上判定部的制备
作为膜，使用由硝化纤维素制成的片(由Millipore制造，商品名：HF 12250mm×25mm)。用含有5质量％蔗糖和5质量％异丙醇的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)将抗A型流感病毒单克隆抗体(第一抗体)稀释为1.0mg/ml的浓度。借助抗体涂布机(BioDot公司制造)将稀释的溶液(150μL)涂布在宽1mm的膜上，然后在50℃干燥30分钟，然后在室温下干燥过夜以制备层析介质上的判定部。
(2)标记物溶液的制备
将经HEPES缓冲液(pH 7.5)稀释至0.1mg/mL的浓度的抗A型流感单克隆抗体(0.1mL)添加至0.5mL金胶体悬浮液(由TanakaKikinzoku Kogyo制造，平均粒径：40nm)，然后在室温下静置10分钟。然后添加含有0.01质量％的PEG-SH(由NOF公司制造，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量：5,000)的0.1ml HEPES缓冲液(pH 7.5)(添加后的PEG-SH浓度：0.001质量％)，然后在室温下静置10分钟。在充分搅拌后，以8000×g进行离心15分钟。在移除上清液后，添加含有1质量％的牛血清白蛋白的0.1mL磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，由此制备标记物溶液。
(3)免疫层析用试验片的制备
向200μL上述制备的标记物溶液中添加含有100μL的25质量％海藻糖水溶液和80μL的5质量％酪蛋白(终浓度：1质量％)的磷酸盐缓冲液(pH 9.0)以及5μL的10质量％L-精氨酸水溶液(终浓度：质量0.1％)。将所得混合物均匀添加至12mm×100mm玻璃纤维垫(由Millipore制造)，然后在真空干燥器中干燥以制备标记物保持部件。接下来，将具有如上制备的判定部的层析介质、标记物保持部件、待用作样品添加部的玻璃纤维制样品垫、以及用于吸收展开的样品或标记物的吸收垫粘合到由背板制成的基材上。用切割机将所得层压体切割为5mm宽的薄片并且将该薄片用作免疫层析用试验片。
(4)检体稀释液的制备
制备含有1质量％的非离子表面活性剂(由NOF公司制造的MN811(商品名)与由Nakarai Tesque制造的NP-40(商品名)的1:1混合物)、80mM的氯化钾、20mM的盐酸胍和0.4质量％的聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量：360,000)的50mM HEPES缓冲液(pH7.5)，将该缓冲液用作对鼻涕、痰或鼻腔拭子等检体进行稀释处理的试剂。
(5)测量
通过使用上述制备的免疫层析用试验片和检体稀释液并根据下面的方法对检体中作为抗原的A型流感病毒的存在与否进行测定。即，通过以下方式采集鼻涕：将吸引器的管的一端插入吸引泵，将管的另一端插入未患流感的人的鼻腔的内部，并将吸引泵设置为负压。
用检体稀释液将如此收集的鼻涕稀释20倍，并且将稀释后的样品作为阴性检体样品。通过向阴性检体样品中添加市售可得的非活性A型流感病毒抗原从而得到25ng/mL的蛋白质浓度，由此制备阳性检体样品。
将阴性检体样品和阳性检体样品各120μL添加至免疫层析用试验片的样品垫上并展开，15分钟后进行目视判定。当确认到红色检测线时，判定样品为“+”；当清晰地确认到红色检测线时，判定样品为“++”；当更清晰地确认到红色检测线时，判定样品为“+++”；当确认到红线，但其为非常浅的红线时，判定样品为“±”；并且当没有确认到红线时，判定样品为“-”。结果示于表1。
[实施例2]
按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于使用0.01质量％的PEG-SH(分子量：2,000)作为实施例1中步骤(2)标记物溶液的制备中标记物的保护剂。根据相同的目视判定标准进行判定。判定结果示于表1。
[实施例3]
按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于使用0.01质量％的PEG-SH(分子量：20,000)作为实施例1中步骤(2)标记物溶液的制备中标记物的保护剂。根据相同的目视判定标准进行判定。判定结果示于表1。
[比较例1]
按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于使用0.01质量％的PEG(分子量：20,000)(即，不具有巯基的聚乙二醇)作为实施例1中步骤(2)标记物溶液的制备中标记物的保护剂。根据相同的目视判定标准进行判定。判定结果示于表1。
[比较例2]
按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于使用预期具有相同功能的聚乙烯吡咯烷酮(PVP K-90，分子量：630,000)作为标记物的保护剂，以代替实施例1中步骤(2)标记物溶液的制备中0.01质量％PEG(分子量：5,000)。根据相同目视判定标准进行判定。判定结果示于表1。
[比较例3]
按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于使用0.01质量％的PEG-SH(分子量：5,000)作为实施例1中步骤(2)标记物溶液的制备中标记物的保护剂，并且使用“L-谷氨酸”作为标记物保持部的氨基酸组分以替代L-精氨酸。根据相同目视判定标准进行判定。判定结果示于表1。
[比较例4]
按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于使用0.01质量％的PEG-SH(分子量：5,000)作为实施例1中步骤(2)标记物溶液的制备中标记物的保护剂，并且使用“L-谷氨酸+盐酸胍”作为标记物保持部的氨基酸组分以替代L-精氨酸。根据相同目视判定标准进行判定。判定结果示于表1。
[比较例5]
按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于使用含有PEG-SH(由NOF公司制造，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量：5,000)的HEPES缓冲液(pH7.5)作为实施例1中步骤(2)标记物溶液的制备中标记物的保护剂，使用L-精氨酸作为标记物保持部的氨基酸组分，并且使用“BSA”替代作为标记物保持部的蛋白质组分的酪蛋白。根据相同目视判定标准进行判定。判定结果示于表1。
表1
5.归因于待混合组分的效果评价
1)从表1中实施例1至3的结果可认识到：仅在将含有PEG-SH(分子量：2,000至20,000)的HEPES缓冲液(pH 7.5)用作标记物的保护剂并且向其中混入含有酪蛋白的磷酸盐缓冲液(pH9.0)和L-精氨酸水溶液的情况下，在0ng的抗原水平下未显示诸如“+”或“±”之类的阳性或假阳性，因此空白显色和非特异性反应被抑制。
2)如“比较例1”和“比较例2”中所示，可认识到：在未使用PEG-SH(由NOF公司制造，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量：5,000)而使用PEG(分子量：20,000)或PVP K-90(分子量：630,000)作为标记物的保护剂的情况中(即，在比较例1和2的情况中)，即使在使用酪蛋白作为标记物保持部的蛋白质组分并且使用L-精氨酸作为标记物保持部的氨基酸组分时，在0ng的抗原水平下也会显示诸如“+”或“±”之类的阳性或假阳性，因此未获得正确的检验结果。
3)如比较例3和4中所示，可认识到：在未使用L-精氨酸而是使用L-谷氨酸或L-谷氨酸与盐酸胍的混合物作为标记物保持部的氨基酸组分的情况中(即，在比较例3和4的情况中)，即使当使用含有PEG-SH(由NOF公司制造，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量：5,000)的HEPES缓冲液(pH 7.5)作为标记物的保护剂并且在其中使用含有酪蛋白的磷酸盐缓冲液(pH 9.0)时，在0ng的抗原水平下也会显示出诸如“+”之类的阳性，因此引发了空白显色或非特异性反应。
4)如“比较例5”中所示，可认识到：在未使用酪蛋白而使用BSA作为标记物保持部的蛋白质组分的情况下(即，在比较例5的情况下)，即使当使用含有PEG-SH(由NOF公司制造，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量：5,000)的HEPES缓冲液(pH 7.5)作为标记物的保护剂并且使用L-精氨酸作为标记物保持部的氨基酸组分时，在0ng和25ng的抗原水平下也会显示出诸如“±”之类的假阳性，因此不能获得正确的检验结果。
以下将通过给出检验例或实施方案详细解释如下事实：在实施本发明时，可以按照以上实施例1至3来实施本发明从而确认其意义，同样，即使通过略微改变实例条件来实施本发明的情况下，也能确认其意义。然而，不应将本发明解释为限于这些检验例和实施方案。
[实施方案1]
作为另一个实施方案，使用PEG-SH(由NOF公司制造，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量：5,000)和PEG-SH(由NOF公司制造，商品名：SUNBRIGHT ME-020SH，分子量：2,000)的混合物来替代上述实施例1中作为标记物的保护剂的PEG-SH(由NOF公司制造，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量：5,000)，通过相同的方式进行测定。可以实现与上述实施例1中单独使用PEG-SH(由NOF公司制造，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量：5,000)的情况下大致相同的目的。
[实施方案2]
另外，使用PEG-SH(由NOF公司制造，商品名：SUNBRIGHTME-200SH，分子量：20,000)和PEG-SH(由NOF公司制造，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量：5,000)的混合物来替代上述实施例3中的PEG-SH(由NOF公司制造，商品名：SUNBRIGHTME-200SH，分子量：20,000)，并通过相同的方式进行测定。可以确认可实现与上述实施例3中单独使用PEG-SH(分子量：20,000)的情况下大致相同的目的。
[实施方案3]
另外，使用PEG-SH(由NOF公司制造，商品名：SUNBRIGHTME-100SH，分子量：10,000)来替代作为上述实施例1中标记物的保护剂的PEG-SH(由NOF公司制造，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量：5,000)，并通过相同的方式进行测定。可以确认可实现与上述检验例1中情况大致相同的目的。
[实施方案4]
接着，示出了具有一个以上的巯基(巯基为保护基团)的聚乙二醇衍生物在溶液中的浓度、以及混入经过保护处理的溶液中的精氨酸(其为氨基酸组分)和酪蛋白(其为蛋白质组分)这两种组分的终浓度的详情(表2)，其中在上述溶液中，保护基团对标记物进行保护处理。
-按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于，将保护处理之后具有一个以上巯基的聚乙二醇衍生物(A)的溶液浓度(质量％)控制为0.0005质量％、0.005质量％、0.01质量％、0.001质量％或0.001质量％，如此对标记物进行保护处理。
-按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于将精氨酸溶液(B)的终浓度(质量％)控制为0.5质量％、0.2质量％、0.02质量％、0质量％或0.1质量％。
-按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于将酪蛋白溶液(C)的终浓度(质量％)控制为0.2质量％、5质量％、2质量％、1质量％或0质量％。
(顺便提及的是，根据如下计算：各组分的重量份＝各组分的浓度×各组分的混合量×100。)
表2
即使在使用三组分的组成比为上述实施方案(配制例)1至3的的溶液的情况下，在经时变化方面是稳定，另外，标记物的颜色非常鲜明，测量时间、操作和测量精度得以改善，并且实现了与实施例1中大致同等程度的判定结果。
另外，如上述实施方案(配制例)4中那样，在不含精氨酸作为氨基酸组分的情况下，即使在0ng的抗原水平下也显示出了阳性，不仅引起了空白显色或非特异性反应，而且在展开时部分标记颗粒发生聚集，从而使灵敏度降低并且/或者发生了不均匀展开。另外，如上述实施方案(配制例)5中那样，在不含有酪蛋白作为蛋白质组分的情况下，同样即使在0ng的抗原水平下也显示出了假阳性，不仅引起了非特异性反应并且未获得准确的检验结果，而且在展开时部分标记颗粒还发生了聚集，从而使灵敏度降低或发生不均匀展开。
接下来，实施例5至9示出了实施例1中的盐酸胍在检体稀释液中的浓度详情。
[实施例5至9]
按照与实施例1相同的方式进行测定，不同之处在于在实施例5至9的个实施例中，将盐酸胍在检体处理溶液中的浓度控制为2mM、5mM、20mM、50mM或100mM，并且对于每项测量，均将实验重复进行三次。表3中示出了详情及其结果。
表3
如上所示，发现通过使用如下组合，能够以良好的灵敏度和精度检验病原体的存在，同时抑制空白显色和非特异性反应，所述组合物由如下成分组成：具有一个以上的巯基的聚乙二醇衍生物，其作为标记物的保护剂；L-精氨酸，其作为标记物保持部的氨基酸组分；以及酪蛋白，其作为标记物保持部的蛋白质组分。
尽管参考具体实施方案详细地描述了本发明，但是对本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可以做出各种变更或修改。本申请基于2012年3月22日提交的日本专利申请(日本专利申请No.2012-066409)，其内容以引用方式并入本文。
工业实用性
本发明的检测试剂盒能够抑制空白显色和非特异性反应并且能够以高灵敏度和准确度特异性地检测病原体在鼻涕、鼻腔拭子、咽拭子或痰中的存在与否，从而使得快速治疗疾病成为可能，因此该试剂盒具有工业实用性。
附图标记和符号描述
1：样品添加部(样品垫)
2：标记物保持部
3：层析介质部
4：检测部
5：吸收部
6：底板

Claims (10)

1.一种免疫层析检测方法，包括：
将含有检体的检体稀释液添加至层析介质的步骤；
通过被金纳米颗粒修饰的标记物识别检测对象的步骤，其中该标记物被干燥保持于标记物保持部；
将所述标记物和所述检测对象的复合体展开为流动相的步骤；以及
在判定部检测所述展开的流动相中的所述检测对象的步骤，
其中所述标记物被具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物保护，并且该标记物随后与精氨酸和酪蛋白一同干燥保持在所述标记物保持部。
2.根据权利要求1所述的免疫层析检测方法，其中所述具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物为具有一个以上巯基且分子量为1,000至30,000的聚乙二醇和/或其衍生物。
3.根据权利要求2所述的免疫层析检测方法，其中所述标记物在包含所述具有一个以上巯基的聚乙二醇和/或其衍生物的溶液中经过了保护处理，并且在所述标记物的所述保护处理之后，所述聚乙二醇和/或其衍生物在所述溶液中的浓度为0.0001质量％至0.05质量％。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫层析检测方法，其中上述精氨酸和酪蛋白通过包含在所述标记物溶液中并浸润上述层析介质从而干燥保持在上述标记物保持部处，并且作为所述标记物溶液润湿所述层析介质之前在所述标记物溶液中的终浓度，精氨酸的浓度为0.01质量％至2质量％，并且酪蛋白的浓度为0.1质量％至10质量％。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫层析检测方法，其中所述金纳米颗粒是平均粒径为30nm至100nm的红色金纳米颗粒，或者平均粒径为20nm至200nm的蓝色金纳米颗粒。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫层析检测方法，其中所述检体为鼻涕、鼻腔拭子、咽拭子、或痰。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫层析检测方法，其中所述检体稀释液中含有胍。
8.根据权利要求7所述的免疫层析检测方法，其中所述检体稀释液中的所述胍的浓度为1mM至200mM。
9.一种免疫层析装置，实质上依次由样品添加部、标记物保持部、层析介质部、检测部和吸收部构成，其中所述标记物保持部设置在所述样品添加部的端部与所述检测部之间，并且所述标记物被具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物保护，并且所述标记物与精氨酸和酪蛋白一同干燥保持在所述标记物保持部处。
10.一种检测试剂盒，其包括免疫层析装置，该免疫层析装置实质上依次由样品添加部、标记物保持部、层析介质部、检测部和吸收部构成，其中所述标记物保持部设置在所述样品添加部的端部与所述检测部之间，并且所述标记物被具有一个以上巯基的聚亚烷基二醇和/或其衍生物保护，并且所述标记物与精氨酸和酪蛋白一同干燥保持在所述标记物保持部处。
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