TWI536019B - Immunochromatographic assay - Google Patents

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Description

免疫層析檢測方法
本發明是關於抑制非特異性反應的高性能、高敏感度之免疫層析(immunochromatography)檢測方法。又，本發明是關於能夠抑制非特異性反應，迅速、簡便且正確地檢查/測定樣品中的檢測對象物之檢測套組。
更詳細而言，本發明是關於將用於檢測以金屬奈米粒子所標識之檢測對象物(被檢測物質)的標識物質，亦即利用與檢測對象物作特異性鍵結之物質，將金屬膠體粒子敏感化後之敏化金屬膠體，對於乾燥處理或在乾燥狀態中進行保護安定化，且抑制非特異性反應，而迅速、簡便、正確地檢查樣品中的檢測對象物之方法。
近年，不需要進行檢測樣品的前處理之免疫層析用條帶形式的免疫分析，作為利用抗體所具有的特異反應性，檢測樣品液中的抗原之簡便的體外診斷套組或是携帶用診斷裝置，其重要性正在提昇。特別是病毒或是細菌等之病原體檢查套組，是即使一般的醫院或是診所也常用之切身相關的免疫層析裝置。
作為免疫層析裝置最簡單的結構，是樣品添加部位、標識物質保持部、判定(檢測)部位、免疫層析用多孔質擔 體、以及樣品吸收部位互相連接之結構。標識物質保持部，是藉由將標識物質(以下亦稱為共軛物(Conjugate))，其是以用於檢測出檢測對象物之金屬奈米粒子所標識，將該標識物質利用保護安定化溶液進行處理後，含浸或是塗佈於免疫層析用多孔質擔體，其次，進行通氣乾燥、真空乾燥或是凍結乾燥等而製造。
繼而，作為保護安定化溶液，從以往已相當瞭解，作為保護安定化劑，含有牛血清白蛋白(BSA)等，但由於有在乾燥狀態下，無法持續長時間安定地維持這樣的問題，因此更進一步地進行改良、研究。例如，已報告有含有酪蛋白、乳清蛋白、酪蛋白分解物者(參照專利文獻1)。
又，作為各種免疫分析中的標識抗體之保護安定化，已知有於金膠體中添加生體分子(例如，抗體等)後，藉由含有被硫醇及/或二硫基所取代之聚乙二醇，將共軛物進行保護安定化(亦即，將粒子的凝集最小化，且使可能吸附的自由表面加以飽和)的技術(參照專利文獻2)。
進而，由稱為海藻糖(trehalose)這樣的糖類20~80%以及緩衝液0.5~2mol/L而組成之保護安定化溶液，被提案作為能夠將固相免疫試劑在乾燥狀態長時間安定地保存者(參照專利文獻3)。
又，為了改善含有敏化金屬膠體之冷凍乾燥物的安定化，在含有敏化金屬膠體之溶液的冷凍乾燥時，已知有使其含有海藻糖、麩胺酸-精胺酸、色胺酸、氯化鈣等等之1種以上的技術(參照專利文獻4)。
進而，有報告出一種作為保存在水溶液中的蛋白質，特別是酵素等之保存安定性優異，保存3個月後，診斷正確度的降低少的體外診斷藥組成物，藉由胍(其鹽)、或是於此進一步含有精胺酸(其鹽、或其衍生物)當作安定劑，能夠解決引起在水溶液中的蛋白質的凝集和水解等之類的問題點(參照專利文獻5)。
另一方面，習知的免疫層析裝置中，背景著色(判定部的固定相抗體以外的部分的著色)、空白發色(在檢測物質不存在的情況下之固定化相的發色)以及前區現象(prozone phenomenon)(將大量過剩的受驗物質作為樣品時，表面上像受驗物質較少的偽陰性現象)，由於不僅降低檢測時的SN比，也成為誤動作的原因而被視為問題。
背景著色的原因是可視化之移動相抗體與多孔質擔體的疏水性鍵結，又，空白發色的原因是帶有負電荷之移動相抗體與帶有正電荷之固定相擔體的電性相互作用，也稱為非特異發色。並且，前區現象的原因是標識物質與未反應的過剩受驗物質和判定部位產生反應，用於檢測以金屬粒子所標識的受驗物質之標識物質，無法與判定部位進行反應。
作為此對策，來自各種觀點的研究有許多。例如，使用包含了pH緩衝劑等之展開液的免疫層析檢測方法中，為了基於生物學的親和性來抑制副反應、或抑制非特異反應，使用了各種添加劑，例如，作為添加劑可舉出用於促進抗原抗體反應或是非特異反應之抑制的蛋白質(例如牛血清白蛋白、酪蛋白以及明膠等)、高分子化合物(例如聚乙二醇、葡聚 糖、甲基纖維素以及聚乙烯氫吡咯酮等)、非離子性界面活性劑(例如，Tween 20以及Triton X-100等)，離子性界面活性劑或是聚陰離子(例如硫酸葡聚糖、肝素、聚苯乙烯磺酸、玻尿酸以及硫酸軟骨素等)或是其鹽等(參照專利文獻6)。
又，已知有一種免疫層析分析法，其將受驗物質以包含鹼性胺基酸(例如精胺酸、離胺酸等)或是胺醣(例如葡萄糖胺等)之移動相而發展(參照專利文獻7)；以及一種膜分析試驗法，其使用以精胺酸濃度為0.02~1.5M、pH為7.0~9.5，且精胺酸以外實質上不含緩衝劑之分析試驗用介質參照專利文獻8)。
進而，作為背景著色及空白發色等之對策，進而為了基於生物學的親和性來抑制副反應、或抑制非特異反應，進而，為了將稱為標識抗體之共軛物安定化，可舉出蛋白質(例如，牛血清白蛋白、明膠、酪蛋白、乳清蛋白、含有酪蛋白分解物者等)、高分子化合物(例如，硫醇及/或以二硫基所取代之聚乙二醇等)、鹼性胺基酸(例如，精胺酸等)等。
但是，即使非特異反應受到抑制，但會產生檢測敏感度降低這樣的問題點，尚不能說完全達成目的，依然有無法充分抑制非特異反應這樣相同的問題。
[先前技術文獻] (專利文獻)
專利文獻1：日本國特開平9-80051號公報
專利文獻2：日本國特開平10-73594號公報
專利文獻3：日本國特開平2003-215127號公報
專利文獻4：日本國特開平11-125635號公報
專利文獻5：日本國特開2011-196996號公報
專利文獻6：日本國特開2007-322310號公報
專利文獻7：日本國特開2001-289852號公報
專利文獻8：日本國特開2007-114049號公報
本案發明人，著眼於上述高分子化合物(例如，硫醇及/或以二硫基所取代之聚乙二醇等)而進行實驗之結果，將樣品中的受驗物質藉由免疫層析法檢測時，觀察到依然發生空白發色和非特異反應等。因此，依然有著將在標識物質保持部被保持乾燥的共軛物持續長期保護安定化，且充分抑制非特異反應，並達成檢測敏感度提升的問題。
本發明之目的在於提供一種高性能、高敏感度之免疫層析檢測方法，其與習知技術相比，將標識物質保護安定化，且抑制非特異反應。又，本發明之目的在於提供一種免疫層析檢測套組，其與習知技術相比，將標識物質保護安定化，且抑制非特異性反應，能夠迅速、簡便以及高精度地檢查。本發明之目的在於提供一種免疫層析裝置，例如與病毒和細菌等之病原體進行特異性反應，能夠迅速、簡便地進行病原體之感染檢查。
進而，本發明之目的在於提供一種檢測套組，其在將樣品藉由檢體稀釋液調整至適合測定之濃度、或是將已稀釋的檢體供給至此檢測套組的樣品添加部，與在標識物質保 持部被保持乾燥的標識物質一起作成移動相而展開，將展開後的移動相中的檢測對象物以判定部來檢測中，能夠抑制非特異性反應，並迅速、簡便、高精度地進行檢查。
本發明之目的在於提供一種檢測套組，其例如藉由檢體稀釋液將鼻液或是痰調整或是稀釋後，供給至前述檢測套組的樣品添加部，能夠迅速、簡便以及高精度地進行病原體的感染檢查。
又，本發明之目的在於提供一種方法，其抑制非特異性反應，將樣品中的檢測對象物藉由免疫層析法來檢測。
本案發明人，發現藉由於免疫層析裝置中設置標識物質保持部時，將標識物質以具有1個以上巰基之聚烯烴二醇及/或其衍生物來保護，繼而與精胺酸及酪蛋白一起於標識物質保持部加以保持乾燥，藉此，自乾燥處理將標識物質加以保護(防止標識物質受到乾燥處理的影響)，並能夠長時間以乾燥狀態安定地保持，而完成本發明。
亦即，本發明如以下所述。
1.一種免疫層析檢測方法，其特徵在於包含下列步驟：將含檢體之檢體稀釋液添加至層析介質(chromatography media)中之步驟、藉由以在標識物質保持部中被保持乾燥的金奈米粒子加以修飾後的標識物質來辨識檢測對象物之步驟、將該標識物質與該檢測對象物之複合體作成移動相而展開之步驟、以及在判定部中檢測展開後的移動相中的該檢測對象物之步驟，其中，該標識物質以具有1個以上巰基之聚烯烴 二醇及/或其衍生物來保護，繼而與精胺酸及酪蛋白一同於該標識物質保持部中被保持乾燥。
2.如前項1所述之免疫層析檢測方法，其中，前述具有1個以上巰基之聚烯烴二醇及/或其衍生物，是具有1個以上巰基之分子量為1000~30000的聚乙二醇及/或其衍生物。
3.如前項2所述之免疫層析檢測方法，其中，前述標識物質在含有前述具有1個以上巰基之聚乙二醇及/或其衍生物的溶液中受到保護處理，將該標識物質進行保護處理後之溶液中的該聚乙二醇及/或其衍生物的濃度為0.0001~0.05質量%。
4.如前項1~3中的任一項所述之免疫層析檢測方法，其中，前述精胺酸及酪蛋白，藉由含有於標識物質溶液中而由前述層析介質加以溼潤，並於該標識物質保持部中被保持乾燥，作為由該層析介質加以溼潤前之該標識物質溶液中的最終濃度，精胺酸的濃度為0.01~2質量%、酪蛋白的濃度為0.1~10質量%。
5.如前項1~4中的任一項所述之免疫層析檢測方法，其中，前述金奈米粒子是平均粒徑為30~100nm的紅色金奈米粒子或平均粒徑為20~200nm的藍色金奈米粒子。
6.如前項1~5中的任一項所述之免疫層析檢測方法，其中，前述檢體為鼻液、鼻腔拭液、咽頭拭液或痰。
7.如前項1~6中的任一項所述之免疫層析檢測方法，其中，在前述檢體稀釋液中含有胍。
8.如前項7所述之免疫層析檢測方法，其中，前述檢體稀釋 液中之胍的濃度為1~200mM。
9.一種免疫層析裝置，其特徵在於：實質上由樣品添加部、標識物質保持部、層析介質部、檢測部及吸收部的順序所構成，該標識物質保持部設置於該樣品添加部的端部與該檢測部之間的領域部，且標識物質藉由具有1個以上巰基之聚烯烴二醇及/或其衍生物來保護，並與精胺酸及酪蛋白一同於該標識物質保持部中被保持乾燥。
10.一種檢測套組，其特徵在於：含有免疫層析裝置，該免疫層析裝置實質上由樣品添加部、標識物質保持部、層析介質部、檢測部及吸收部的順序所構成，在樣品添加部的端部與檢測部之間的領域部設置該標識物質保持部，且標識物質藉由具有1個以上巰基之聚烯烴二醇及/或其衍生物來保護，並與精胺酸及酪蛋白一同於該標識物質保持部中被保持乾燥。
本發明之免疫層析檢測方法，是於免疫層析裝置設置標識物質保持部時，將以金屬奈米粒子所標識的標識物質(用於檢測檢測對象物)，藉由具有1個以上巰基之聚烯烴二醇及/或衍生物來保護，並與精胺酸及酪蛋白一同於標識物質保持部中被保持乾燥。藉此，能夠將利用與檢測對象物作特異性鍵結之物質，將該金屬膠體粒子敏感化後之敏化金屬膠體，自乾燥處理加以保護，並於該標識物質保持部長時間以乾燥狀態安定地保持。
因此，若根據本發明之免疫層析檢測方法，檢測樣 品中的檢測對象物(例如抗原等)時，其安定化或是非特異反應之抑制機構的原理的細節雖然不明，但是具有1個以上巰基之聚乙二醇及/或衍生物、與精胺酸及酪蛋白之三者成為三位一體，進行協同作用，而能夠顯著地抑制非特異反應。進而，在敏感度未降低的情況下，可正確地判定結果。
例如，檢測作為檢體而使用之咽頭拭液中的病毒等時，由於敏感度未降低，而且，顯著地抑制非特異反應，因此可正確地判定有無感染之檢查等結果。
本發明之免疫層析用檢查套組，藉由對於有無病原菌之檢查有效，特別是有無特定病毒之檢查可迅速且正確，能夠進行正確的治療措施，因此適用於醫療現場。
1‧‧‧樣品添加部(樣品墊)
2‧‧‧標識物質保持部
3‧‧‧層析介質部
4‧‧‧檢測部
5‧‧‧吸收部
6‧‧‧墊片
第1圖是免疫層析裝置的試驗片的概略圖。
以下，詳細說明本發明。
本發明是一種免疫層析檢測方法，其特徵在於包含下列步驟：將含檢體之檢體稀釋液添加至層析介質中之步驟、藉由以在標識物質保持部中被保持乾燥的金奈米粒子加以修飾後的標識物質來辨識該檢測對象物之步驟、將該標識物質與該檢測對象物之複合體作成移動相而展開之步驟、以及在判定部中檢測展開後的移動相中的該檢測對象物之步驟，其中，該標識物質以具有1個以上巰基之聚烯烴二醇及/或其衍生物來保護，繼而與精胺酸及酪蛋白一同於該標識物質保持部中被保持乾燥。
前述標識物質，藉由以具有1個以上巰基之聚烯烴二醇及/或其衍生物來保護，繼而與精胺酸及酪蛋白一同於標識物質保持部中被保持乾燥，利用與檢測對象物作特異性鍵結之物質(例如抗體、抗原、酵素、胜肽等的生體分子)，將金屬膠體粒子敏感化後的敏化金屬膠體，能夠安定地自乾燥處理進行保護，並於標識物質保持部長時間以乾燥狀態安定地保持。
雖然其作用機制不明，但推測是具有1個以上巰基之聚乙二醇及/或其衍生物，與精胺酸及酪蛋白之三者，藉由相互作用而複合吸附於標識物質中的金屬粒子的自由表面，使被覆飽和，並使引起非特異性反應的吸附的可能性顯著地消失，且發揮保持最低的金屬粒子的凝集作用。
又，推測藉由精胺酸、具有1個以上巰基之聚乙二醇及/或其衍生物以及酪蛋白的相互作用，高度地消除掉移動相抗體與多孔質擔體的疏水鍵結和移動相抗體與固定相擔體的電性相互作用。
進而，推測檢測對象物和標識化後的檢測試劑的安定化、以及由於檢測對象物與標識抗體之反應所產生的複合體的安定化，是藉由具有1個以上巰基之聚乙二醇及/或其衍生物、精胺酸及酪蛋白的加乘作用而成，同時發揮使作為該等的移動相的移動流暢之作用。
本發明之免疫層析檢測方法，藉由這些作用，認為能夠高精度且極為顯著地抑制非特異反應，並且特異性高敏感度且迅速地檢測/測定樣品中的檢測對象物。
用於本發明之聚烯烴二醇及/或其衍生物，較佳是分子量為1000~30000，更佳是分子量為2000~20000的具有1個以上巰基之聚烯烴二醇及/或其衍生物為宜。
作為前述所謂具有1個以上巰基之部分，例如，可舉出單巰基及二巰基。作為採用分枝結構的情況，例如，可舉出三巰基以及四巰基。
作為前述烯烴二醇及/或其衍生物部分，例如，可舉出如聚乙二醇(稱為「PEG」)、聚丙二醇(稱為「PPG」)、聚丁二醇(稱為「PBG」)的同元聚合物；以及由乙二醇(稱為「EG」)片段、丙二醇(稱為「PG」)片段之任意構成比例而成。例如，可舉出EG、PG以及BG之隨機混合或是PEG、PPG以及PBG嵌段的混合嵌段共聚物。
例如，可舉出藉由隨機、或嵌段而任意含有HS-PEG、HS-PEG-SH、HS-PPG、HS-PPG-SHSH-PBG、HS-PBG-HS、HS-PEG-PPG、HS-PEG-PPG-HS、HS-PEG-PBG-HS、HS-PEG-PPG-PBG-HS等各種EG、PG、BG等之聚合物。
屬於聚烯烴二醇及/或其衍生物部分之範疇，特別於本發明之實施中有用的聚合物為聚乙二醇(PEG)。作為其分子量，例如，分子量為1000~30000的範圍者，具體的分子量的例子，能夠使用如1500、5000、8000、15000、18000、25000之類的任意的分子量者。實際上，因為不容易獲得其正確的數值之分子量，只要獲得其分子量之前後者而使用即可。
無論如何，屬於具有1個以上巰基之聚烯烴二醇及/ 或其衍生物之範疇者為必須要件。並且，具有1個以上巰基之聚烯烴二醇或是其衍生物，即使是此等之混合物也可使用。
最適合用於本發明之免疫層析用標識物質的保護之分子量為1000~30000的具有1個以上巰基之聚乙二醇(PEG)及/或其衍生物，以通式X-(CH2CH2O)n-CH2CH2-SH(此處，X表示HS-、亦可受到保護的HO-、烷-O-，n表示15~540的整數。)來表示。作為其衍生物，例如，可舉出末端基亦即OH及SH之保護基或衍生物。例如，在OH的情況，於胜肽合成的領域所通用的保護基，可舉出：對甲苯磺醯基及羰基等，較佳為烷基，特佳為甲基。
作為具體的具有1個以上巰基之聚乙二醇及/或其衍生物，例如，可舉出單巰基聚乙二醇、二巰基聚乙二醇。作為採用分枝結構的情況，例如，可舉出三巰基聚乙二醇及/或其衍生物。
作為本發明之具有1個以上巰基的聚乙二醇(PEG)及/或其衍生物，能夠取得市售之分子量者(分子量為1000~30000)來使用。
具有1個以上巰基之聚乙二醇(PEG)及/或其衍生物之特佳的分子量為2000~20000。例如，可舉出甲氧基-PEG-硫醇2000、硫醇-PEG-硫醇3400、甲氧基-PEG-硫醇5000、甲氧基-PEG-硫醇20000等。
具有1個以上巰基之聚乙二醇(PEG)及/或其衍生物的分子量，藉由在2000以上，即使對於標識物質有相當的PEG 修飾，也能夠防止發生對於乾燥時的安定性和保護機能無法充分發揮的情況。又，能夠提昇非特異反應的抑制。
又，具有1個以上巰基之聚乙二醇(PEG)及/或其衍生物的分子量，藉由在20000以下，對於標識物質有相當且均一的PEG修飾，其結果，對於乾燥時的安定性和保護機能能夠均一且充分的發揮。又，能夠提昇非特異反應的抑制。
分子量若在1000~30000的範圍內，並不只是能獲得比較高純度者，由於對於標識物質有相當的PEG修飾，充分發揮對於乾燥時安定性和保護機能，而且非特異反應的抑制也充分而較佳。
雖然必須使用分子量為1000~30000的具有1個以上巰基之聚烯烴二醇或是其衍生物，但根據情況，例如，亦可使用像是分子量為3000之PEG與8000之PEG，將分子量相異的二種類的含巰基聚烯烴二醇或是其衍生物，以任意比例而成聚合物摻合物(polymer blend)。
同樣地，若從巰基之觀點來考量，將具有1個巰基之聚烯烴二醇或是其衍生物與具有2個之聚烯烴二醇或是其衍生物以任意比例而成聚合物摻合物，例如，亦可舉出像是「HS-PEG與HS-PEG-SH」之混合物。
並且，具有1個以上巰基之聚烯烴二醇或是其衍生物20~99質量%左右與不含巰基之聚烯烴二醇1~80質量%左右之聚合物摻合物，例如，亦可舉出像是「HS-PEG與PEG」之混合物。在此聚合物摻合物(高分子摻合物，polymer blend)的情況，為了不使具有1個以上巰基之聚烯烴二醇的機能降 低，需要注意摻合量的調整。
作為摻聚物(blend polymer)中的分子量相異之二種類的含巰基聚烯烴二醇及/或其衍生物的例子，可使用硫醇-PEG-硫醇3400與甲氧基-PEG-硫醇5000的混合物所得之規格者。
作為將具有1個以上巰基之聚烯烴二醇及/或其衍生物，特別是作為代表的具有1個以上巰基之聚乙二醇及/或衍生物，使用於標識物質之濃度，該標識物質是將對檢測對象物有特異性反應之試劑成分(例如抗體等)藉由金奈米粒子所修飾而成，藉由具有1個以上巰基之聚乙二醇衍生物將標識物質進行保護處理後的溶液中具有1個以上巰基之聚乙二醇及/或其衍生物的濃度，較佳為0.0001~0.05質量%，更佳為0.0005~0.01質量%。例如，能夠使用水中0.001質量%濃度之分子量5000的甲氧基-PEG-硫醇。
前述溶液中的具有1個以上巰基之聚乙二醇及/或其衍生物的濃度，藉由未達0.0001質量%，對於乾燥的安定性和保護機能充分，且能夠抑制空白發色和非特異性反應而可進行正確的判定。藉由在0.05質量%以下，可抑制標識物質粒子的凝集，並達到必要充分的濃度而經濟。
所謂用於本發明的精胺酸，亦稱為2-胺-5胍戊酸，是天然存在的胺基酸類。作為精胺酸，較佳為L-精胺酸(C6H14N4O2)。
精胺酸藉由含有於標識物質溶液中而由層析介質加以溼潤，於標識物質保持部中被保持乾燥為宜。由該層析介 質加以溼潤前之標識物質溶液中精胺酸的最終濃度，較佳為液中0.01~2質量%，更佳為0.02~0.5質量%。例如，使用0.1質量%的L-精胺酸水溶液為佳。
藉由將前述精胺酸的最終濃度定為0.01質量%以上，對於乾燥的安定性和保護機能充分，且抑制空白發色和非特異性反應而能夠進行正確的判定。藉由定於2質量%以下，可達到必要充分的濃度而經濟。
所謂酪蛋白，是於牛乳和乳酪中含有之天然存在的磷蛋白類的一種。作為使用於本發明中的酪蛋白，例如，可舉出酪蛋白本身、以及含有酪蛋白作為主成分之脫脂牛奶。
酪蛋白，較佳是藉由含有於標識物質溶液中而由層析介質加以溼潤，並於標識物質保持部中被保持乾燥。由該層析介質加以溼潤前之標識物質溶液中的酪蛋白的最終濃度，較佳為液中0.1~10質量%的濃度，更佳為0.2~5質量%的濃度。例如，使用含有1質量%酪蛋白的緩衝液為佳。
藉由前述酪蛋白的最終濃度定為0.1質量%以上，有充分的作用效果。藉由定為10質量%以下，可達到必要充分的濃度而經濟。
對藉由具有1個以上巰基之聚乙二醇衍生物來保護的標識物質之水溶液(簡稱為「A」)，將精胺酸之水溶液(簡稱為「B」)以及酪蛋白之水溶液(簡稱為「C」)，以成為如上述的濃度般地適當組合而調配為佳。B及C的各濃度較佳為0.01~2質量%及0.1~10質量%，更佳為0.05~1質量%及0.5~5質量%。
在本發明中，較佳是於檢體稀釋液中含有胍或其鹽。作為胍的鹽，無機鹽或有機鹽皆可，例如，可舉出鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、酒石酸鹽、蘋果酸鹽、檸檬酸鹽。胍或其鹽的濃度，較佳為檢體稀釋液中1~200mM，更佳為2~100mM，進而更佳為5~50mM。
作為檢體稀釋液，例如，使用含有20mM的胍鹽酸鹽之緩衝液為佳。藉由將檢體稀釋液中的胍或是其鹽之濃度定為1mM以上，能夠達成充分的作用效果。藉由定為200mM以下，可達到必要充分的濃度而經濟。
於本發明所使用的金奈米粒子，較佳是平均粒徑為30~100nm的紅色金奈米粒子、及/或平均粒徑為20~200nm的藍色金奈米粒子。當然，也能使用鉑、銀、鍺、銠或是鈀等之貴金屬粒子、鈦、鐵或是鋅等的平均粒徑較佳為10~250nm，更佳為35~120nm左右的奈米金屬粒子。
金奈米粒子，以診斷精度方面而言最為推薦，但也能使用以金為主體的如金與鉑這樣的金屬之混合物。並且，為了某種特殊的診斷，盡可能將金屬奈米粒子作成同一形狀，例如作成真球狀等，也能夠盡可能想辦法使各粒子的粒徑均一整齊。
前述金屬奈米粒子也可以是分散狀態，例如，可舉出抗體、由抗原所產生之敏化金屬膠體、敏化金膠體、敏化鉑-金膠體、敏化金-銀膠體或是鐵膠體等，金膠體從操作容易、測定的精度等方面而言受到推薦。為了提昇診斷的測定感度也推薦膠體金標識增感劑的併用。
診斷的目的，在尋求如高敏感度、高精度的特殊情況中，以金膠體的例子而言，可盡力增加相同外形的膠體粒子形狀，例如增加真球狀者、或像是將膠體粒子之粒徑均一化，例如像是集中在如40nm、80nm、或是120nm的特定之一種粒徑上，作成所謂窄化粒度分布曲線之膠體。
並且，由於為了調和金屬膠體的發色性，藉由金的粒子狀態以及其集合而色彩不同，可見光線的範圍中具有特有色彩，例如，藉由將紅色金奈米粒子膠體與藍色金奈米粒子膠體以任意的比例摻合，可製備具有既定之色彩的金奈米粒子膠體。
在判定時，調節色彩，藉由設法顯示更鮮明的色彩，亦可加以提昇判定的精度，例如為適當組合紅(波長770~640nm)綠(波長490~430nm)藍(490~430nm)之光的三原色的要領。任何的金屬奈米粒子膠體，作為製品亦能夠容易從市場獲得。
另外，平均粒徑，能夠根據求取將膠體的粒度分布以動態光散射粒度分布計測定後之平均粒徑的各種慣用測定法而決定。
使用於本發明之含標識物質溶液或檢體稀釋液等之試劑組成物，為緩衝劑或是界面活性劑，特別是含有非離子界面活性劑為佳。
作為前述緩衝劑，樣品的添加或是樣品的蒸發或稀釋所導致濃度的變化，若具有即使從外部混入少量的異物也不發生致命的影響之作用(緩衝作用)，則無特別限制。
作為前述緩衝劑，例如，可舉出乙酸緩衝液(乙酸+乙酸鈉)、磷酸緩衝液(磷酸+磷酸鈉)、檸檬酸緩衝液(檸檬酸+檸檬酸鈉)、硼酸緩衝液、Tris鹽酸緩衝液(三(羥甲基)氨基甲烷+鹽酸)、TE緩衝液(Tris+乙二胺四乙酸)、TAE緩衝液(Tris+酢酸+乙二胺四乙酸)、TBE緩衝液(Tris+硼酸+乙二胺四乙酸)以及HEPES緩衝液(2-[4-(2-羥乙基)-1-哌基]乙烷磺酸)。較佳為HEPES緩衝液、磷酸緩衝液、乙酸緩衝液或是Tris鹽酸緩衝液，更佳為HEPES緩衝液。又，在不發生不良影響的範圍內亦可摻合其他的緩衝劑來使用。
作為前述非離子性界面活性劑，例如，可舉出聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯/聚氧丙烯烷基醚(日油(股)製造，商品名：NONION(註冊商標)MN811，Nacalai Tesque公司製造，商品名：NP-40)、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(商品名「Tween」系列)、聚氧乙烯-對-第三辛基苯基醚(商品名「Triton」系列)、聚氧乙烯-對-第三壬基苯基醚(商品名「TritonN」系列)、烷基聚葡萄糖苷、脂肪酸二乙醇醯胺以及烷基單甘油醚。非離子性界面活性劑，可以單獨或是混合2種以上來使用。
用於本發明之各種試劑組成物中，亦可含有基於生物學的親和性來抑制副反應、或抑制非特異性反應所公知的添加劑。作為添加劑，例如，可舉出用於促進抗原抗體反應或是抑制非特異性反應的蛋白質(例如，牛血清白蛋白以及明膠等)、高分子化合物(例如，聚乙二醇、甲基纖維素、聚乙烯氫吡咯酮、聚乙烯醇以及葡聚糖等)、離子性界面活性劑或是聚陰離子(例如，硫酸葡聚糖、肝素、聚苯乙烯磺酸以及硫酸 軟骨素等)以及抗菌劑。此等亦可添加1種或是2種以上而使用。
又，可以且有效地使1種或是2種以上之前述用於促進抗原抗體反應或是抑制非特異性反應之蛋白質、高分子化合物、離子性界面活性劑或是聚陰離子、以及抗菌劑等等，保持在構成固定相之層析介質上的移動相的移動路徑上，並不造成任何妨礙。
將前述標識物質溶液保持於固相中時，亦可使標識物質溶液中含有保護安定化物質或是溶解促進物質。作為保護安定化物質或是溶解促進物質，例如，可舉出糖類，亦即，單糖類、雙糖類、三糖類、寡糖或是多糖類。作為單糖類，例如，可舉出葡萄糖、半乳糖、木糖以及果糖等。作為雙糖類，例如，海藻糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖等，作為三糖類或寡糖，可舉出棉子糖等。作為多糖類，例如，可舉出葡萄糖酸以及葡聚糖等。此等使用1種或是混合2種以上使用也沒有任何妨礙。
又，在本發明中，將標識物質保持部設置於免疫層析裝置的領域部內，具體而言，例如藉由混合以分子量為1000~30000之具有1個以上巰基之烯烴二醇及/或其衍生物(保護試劑)將標識物質進行保護處理後之溶液、與精胺酸及酪蛋白(安定化試劑)，來製備含有將標識物質保護安定化之試劑(含有標識物質保護安定化試劑組成物)的組成物，然後將該組成物藉由塗佈、吸附或是含浸於樣品添加部的端部與判定部之間的領域內之後加以乾燥，能夠載持、保持或形成於標識物 質保持部。
製備前述含有標識物質保護安定化試劑組成物時，作為與受到保護處理的標識物質溶液混合之試劑的添加順序，最初時混合哪個安定化試劑、或最後時混合哪個安定化試劑，能夠考慮標識物質保護安定化試劑含有組成物的狀態來任意決定，是設計事項的範圍內。
例如，亦可在標識物質中首先添加分子量為1000~30000之具有1個以上巰基之聚乙二醇及/或其衍生物，繼而將精胺酸或是酪蛋白一種一種依序添加於此。
或者，亦可首先添加該聚乙二醇及/或其衍生物於標識物質，繼而添加精胺酸及酪蛋白二者之混合物於此。或是亦可對精胺酸及酪蛋白二者之混合物(添加順序不同)之溶液，加入於標識物質中添加了該聚乙二醇衍生物的溶液。
在添加時，對應的添加量是在可做適當設計事項的範圍內，只要可均勻地添加，亦可每次少量連續地添加或是間歇地添加，亦可一次添加。標識物質保持部的大小(寬)、濃度等，可考慮其性能而任意決定，屬於在設計事項的範圍內。
作為將含有用於本發明之標識物質溶液或是其他的試劑組成物之部位，設置於免疫層析裝置的方法，例如，可舉出藉由塗佈或含浸免疫層析用標識物質溶液在免疫層析裝置的玻璃纖維墊(標識物質保持構件)中後，加以乾燥(例如通氣乾燥、真空乾燥、自然乾燥以及冷凍乾燥)，而載持或保持在玻璃纖維墊中的方法。
本發明中所使用的檢體稀釋液，也可以作為展開液 或是樣品稀釋液使用。作為檢體稀釋液，通常是使用水當作溶劑，於此添加緩衝液、鹽、以及非離子界面活性劑，進一步添加前述用於促進抗原抗體反應或是抑制非特異性反應的蛋白質、高分子化合物(例如PVP等)、離子性界面活性劑或聚陰離子、或是抗菌劑、螯合劑等1種或是2種以上。添加順序沒有特別規定，同時添加也不造成妨礙。
在將檢體稀釋液作為展開液使用時，可將預先混合的檢體與展開液供給、滴加至樣品墊(樣品添加部)上加以展開，亦可先將檢體供給、滴加至樣品墊(樣品添加部)上後，再將展開液供給、滴加至樣品墊(樣品添加部)上加以展開。
在將檢體稀釋液作為樣品稀釋液使用時，調整或稀釋至適合於測定檢體之濃度的稀釋液，能夠藉由供給、滴加到樣品墊(樣品添加部)上而直接作為展開液使用。
作為本發明中的檢體(包含檢測對象物的樣品)，例 如，主要的生體樣品，亦即，可舉出血液、血清、血漿、尿、唾液、髓液、汗、淚、羊水、乳頭分泌液、鼻液、痰、鼻腔、咽頭拭液、來自皮膚的滲出液、來自組織、細胞以及糞便的萃取物。
於本發明中的檢測對象物，只要與其特異性鍵結，例如像抗原-抗體反應，存在或是能夠製造出與其作特異性鍵結的物質即可，沒有特別限定。檢測對象物亦可為完全抗原這樣其本身具有抗原性，或是亦可為半抗原(不完全抗原)這樣其本身不具有抗原性但藉由化學性修飾物質(chemical modified product)而達到具有抗原性。只要存在或是能夠製造 與該等檢測對象物作特異性鍵結的物質即可，能夠定為單株抗體或是多株抗體。
作為本發明中的檢測對象物，例如，可舉出胜肽激素(成長激素(GH)、促腎上腺皮質激素(ACTH)、促黑素細胞激素(MSH)、催乳激素、促甲狀腺激素(TSH)、黃體形成激素(LH)、促濾泡激素(FSH)、腦下垂體激素、鈣代謝調節激素、胰激素、消化道激素、血管作用激素、人類絨毛膜促性腺激素(hCG)、雌素酮等之卵泡激素、孕酮等之天然或是合成黃體激素、睪固酮等之男性激素、皮質醇等之腎上腺皮質素、二碘甲狀腺素等之甲狀腺激素類等之激素、前列腺酸性磷酸脢(PAP)、前列腺特異抗原(PSA)、鹼性磷酸脢、轉胺脢、胰蛋白脢、胃蛋白脢原、甲型胎蛋白(AFP)、癌瘤胚性抗原(CEA)等之癌瘤特異物質、免疫球蛋白G(IgG)等之血清蛋白成分、風濕病因子、血清素、尿激酶、鐵蛋白、物質P、糞便潛血、梅毒抗體、流行性感冒病毒、腺病毒、輪狀病毒、黴漿菌、HBS抗原、HBS抗體、披衣菌抗原、β溶血性A群鏈球菌抗原、膽固醇、膽汁酸、強心類固醇、皂苷素等之其他的類固醇類、腎上腺素、多巴胺、生理活性生物鹼類、含胺基精神用藥類、TRH等之低分子胜肽類、前列腺素類、維生素類、青黴素等之抗生物質類、其他生體內成分、投與生體內藥物以及其代謝產物等。
此等之中，特別是病毒或是細菌等之病原體為佳，更佳為流行性感冒病毒、腺病毒、輪狀病毒、黴漿菌。此時，作為檢體(含檢測對象物的樣品)，例如，可舉出鼻液、痰、鼻 腔以及咽頭拭液。
使用咽頭拭液來作為檢體時，用檢體稀釋液稀釋咽頭拭液後，供給/滴加至免疫層析裝置中的樣品墊上。本發明之免疫層析用檢查套組，對病原菌有無的檢查為有效，特別是藉由特定病毒有無的檢查之結果能夠迅速進行正確的治療措施。
用於檢查存在於鼻液、痰、鼻腔或是咽頭拭液等之生體樣品中的病毒等之有無的免疫層析裝置，其結構以及其動作、檢測手法為公知。
將含生體樣品(檢體)的本發明之檢體稀釋液供給/滴加給習知之免疫層析裝置的樣品墊中，加以載持本發明之標識物質溶液，例如，含浸後，使用乾燥後的免疫層析裝置，進行特異性鍵結反應，例如，能夠藉由抗原抗體反應進行樣品中的檢測對象物，例如，咽頭拭液中之流行性感冒病毒等的鑑定、定量等之檢查。
以下，針對免疫層析裝置以及規格說明。免疫層析裝置，是由樣品添加部(1)(樣品墊)、標識物質保持部(2)、層析介質部(3)、檢測部(4)、吸收部(5)、以及墊片(6)所構成。該等各部位的結構、規格以及態樣如下。
1)樣品添加部(1)(樣品墊)，若參考第1圖，是以多孔質薄片所構成，該多孔質薄片具有樣品迅速地被吸收，但樣品保持力弱、快速地往反應部移動的性質。作為多孔質薄片，例如，可舉出纖維素濾紙、玻璃纖維濾紙、聚胺酯、聚乙酸酯、乙酸纖維素、尼龍以及綿布。此等之中，較佳為玻 璃纖維濾紙。
在本發明中，為了抑制非特異性反應，於樣品添加部(1)中，預先加以含浸含有緩衝液以及非離子界面活性劑等等之免疫層析用試劑組成物後，藉由乾燥等手段能夠成為加以載持之態樣。例如，可有效作為預先將含有Tris鹽酸緩衝液以及單側末端具有烷基之聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段共聚物的各成分之免疫層析用試劑組成物的成分加以載持或是保持之態樣，沒有任何妨礙。
2)在標識物質保持部(2)，藉由標識成分使標示試劑成分之標識試劑加以載持或是保持。作為標識成分，能夠使用金膠體粒子、銀膠體粒子等之金屬膠體粒子、將(共)聚合各種單體所合成的合成高分子染色而獲得之著色乳膠粒子、酵素、螢光化合物、其他。作為試劑成分，是具有辨識分析物能力的粒子或是分子，較佳為單株抗體或是多株抗體或是其片段(第二試劑)。
3)層析介質部(3)，是在膜擔體上作成判定部位(4)。作為膜擔體，只要是能夠藉由毛細管現象吸收樣品檢體並使其移動者，則沒有特別限定。例如，由硝化纖維素、乙酸纖維素、尼龍、聚醚碸、聚乙烯醇、聚酯、玻璃纖維、聚烯烴以及纖維素以及由此等混合纖維構成的人工聚合物而成的群組中選擇。由此等的纖維、織布、不織布、布、膜等之任意者而成。
4)在檢測部(4)，單株抗體或是多株抗體或是其片段(第一試劑)，載持固定在硝化纖維素的薄片上。用於判定部 位(4)的試劑成分(第一試劑)以及用於標識試劑的試劑成分(第二試劑)，其中一方或是雙方亦可為單株抗體，亦可為多株抗體，但在保有特異性上，考慮製造成本或是抗體的安定供給的情況，至少一方為多株抗體較佳。進而，用於標識試劑的試劑成分(第二試劑)，從測定感度等方面來看特異性高的單株抗體更佳。在叫做流行性感冒病毒之病原性高的檢體的檢查，雙方為單株抗體最佳。
單株抗體以及多株抗體或是其片段，為公知且可取得，能夠藉由公知的方法來製備。作為抗體產生動物種，例如，可舉出人類、小鼠、大鼠、兔子以及山羊。作為免疫球蛋白，IgG、IgM、IgA、IgE、IgD的任一種皆可。
單株抗體，依據常法，將以抗原(例如流行性感冒病毒等)免疫過的小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞加以融合，選擇出會產生目的之抗體的融合瘤細胞，取得由此融合瘤細胞產生而來的單株抗體。例如，參照Köhler與Milstein的技法(Nature256(1975)P.495-497)。
多株抗體，依照慣用手法，藉由將抗原(流行性感冒病毒等)對抗體產生動物(例如，人類、小鼠、大鼠、兔子、山羊以及馬等)進行免疫而獲得之抗血清，從中分離出目的之抗體而取得。
流行性感冒病毒，在構成病毒粒子的蛋白質之中，根據M1蛋白(在外膜的內側，以將其補強的形式局部存在，發揮實質上外殼的角色。)與NP蛋白(在外膜內部，對著核蛋白質捲成螺旋狀，基於核蛋白殼(nucleocapsid))的抗原性之不 同，分類成A型、B型、C型。
流行的規模或是感染時的危害大的A型流行性感冒病毒，為直徑80~120nm左右，具有外膜(殼)負鏈的單鏈RNA病毒，A型更進一步，根據病毒表面蛋白質亦即血凝素(血球凝集素，HA)與神經胺酸脢(NA)的抗原性之不同，HA分類成16種類(H1至H16)、NA分類成9種類(N1至N9)的亞型。
作為用於檢測部(4)的試劑成分(第一試劑)以及用於標識試劑的試劑成分(第二試劑)，各自都可以使用抗流行性感冒病毒單株抗體或是抗流行性感冒病毒多株抗體。然而，從反應的正確性與效率性的觀點而言，最佳為雙方使用抗流行性感冒病毒單株抗體。
5)吸收部(5)，為具有迅速吸收過剩的樣品之能力的材料，使用玻璃濾紙等。
6)墊片(6)，為基材。藉由在單面塗佈黏著劑，貼上黏著膠帶，而單面具有黏著性，在該黏著面上緊貼而設置樣品添加部(1)、標識物質保持部(2)、層析介質部(3)、檢測部(4)以及吸收部(5)的一部分或是全部。墊片(6)，只要是藉由黏著劑而對樣品液成為不透過性、非透濕性的話，作為基材而言沒有特別限定。
將檢測對象物為流行性感冒病毒的情況作為具體例，概述判定的原理如下：
1.將樣品(例如咽頭拭液等的檢體)，以檢體稀釋液製備或是稀釋至不使測定精度降低而在免疫層析介質中流暢地移動程度的濃度，作為檢體樣品(含檢體之檢體稀釋液)。在樣品 添加部(1)上，將該檢體樣品滴加既定量(通常為0.1~2ml)。檢體樣品一滴加，樣品添加部(1)中的檢體樣品就開始移動。
2.其次，檢體樣品往標識物質保持部(2)移動。檢體樣品通過此的時候，保持於標識物質保持部(2)的溶解補助物質，首先溶解於檢體樣品的水分裡，繼而與標識物質一起保持的保護安定化物質以及標識物質，溶解於檢體樣品的水分裡，與檢體樣品一起移動。
3.繼而，溶解於檢體樣品的水分中的標識試劑，通過層析介質部(3)上的檢測部(4)。此處，藉著含有溶解於檢體樣品中的保護安定化物質等之免疫層析用試劑組成物，非特異性鍵結反應受到抑制，藉由抗原、抗體之特異性鍵結反應，在流行性感冒病毒存在時，檢體樣品中的流行性感冒病毒，保持於檢測部(4)，亦即，對於被載持固定的抗體與標識試劑，如挾成三明治狀進行特異性的反應鍵結，而檢測部(4)進行著色。在流行性感冒病毒不存在時，由於溶解於樣品的水分中的標識試劑，即使通過層析介質部(3)上的檢測部(4)，也不引起特異性鍵結反應，因此檢測部(4)不著色。
4.在最後，樣品的水分，往吸收部(5)移動。如此一來，藉由檢查樣品，例如，檢查檢體樣品中的流行性感冒病毒之有無，能夠正確地判定流行性感冒病毒感染的有無。
採取到的樣品亦即鼻液、痰、鼻腔或是咽頭拭液，藉由利用樣品稀釋液稀釋約10~100倍，將其150μL滴加/供給至樣品添加部(1)上而展開，能夠與上述進行同樣的檢查，能夠與上述達成同樣的結果。
以下，舉出各規格之實施例以及實施態樣來說明本發明之有效性，但本發明並不限定於此等。
[實施例]
於以下，舉出實施例以及比較例，來說明本發明的重要性。其實施的規格如下所述。
[實施例1]
(1)對層析介質上之判定部的製作
使用由硝化纖維素而成的薄片(Millipore公司製造，商品名：HF12250mm×25mm)作為薄膜。以含有5質量%之蔗糖以及5質量%之異丙醇的10mM磷酸緩衝液(pH7.4)，稀釋抗流行性感冒A型病毒單株抗體(第一抗體)成為1.0mg/mL的濃度，將其稀釋的溶液150μL利用抗體塗佈機(BioDot公司製造)在薄膜上以1mm的寬度塗佈，於50℃乾燥30分鐘，於室溫乾燥一晚，於層析介質上製作判定部。
(2)標識物質溶液的製作
於金膠體懸濁液(田中貴金屬工業公司製造：平均粒子徑40nm)0.5mL中，添加經以HEPES緩衝液(pH7.5)稀釋的抗流行性感冒A單株抗體0.1mL並使濃度成為0.1mg/mL，於室溫靜置10分鐘。其次，添加0.1mL之含有0.01質量%之PEG-SH(日本油脂股份有限公司製，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量5000)的HEPES緩衝液(pH7.5)(添加後之PEG-SH濃度：0.001質量%)，於室溫靜置10分鐘。之後，充分攪拌後，以8000×g進行15分鐘的離心分離，去除上清液後添加含有1質量%之牛血清白蛋白的磷酸緩衝液 (pH7.4)0.1mL，來製作標識物質溶液。
(3)免疫層析用試驗片的製作
在上述所製作之標識物質溶液200μl中加入100μl之25質量%海藻糖水溶液與80μl之含有5質量%酪蛋白(最終濃度：1質量%)的磷酸緩衝液(pH9.0)、5μl之10質量%的L-精胺酸水溶液(最終濃度：0.1質量%)，將此溶液均勻地添加至12mm×100mm的玻璃纖維墊(Millipore公司製造)後，在真空乾燥機加以乾燥，製作標識保持構件。其次，於由墊片而成的基材，將上述製作之具有判定部的層析介質、標識物質保持構件、用於添加樣品部分之玻璃纖維製的樣品墊、用於吸收已展開之樣品和標識物質的吸收墊加以貼合。然後，用裁斷機以寬成為5mm的方式裁斷，作為免疫層析用試驗片。
(4)檢體稀釋液的製作
製備含1質量%之非離子界面活性劑(日油股份有限公司製造，商品名：MN811與Nacalai Tesque公司製造，商品名NP-40之1：1混合物)、80mM之氯化鉀、20mM之胍鹽酸鹽、0.4質量%之聚乙烯氫吡咯酮(平均分子量36萬)的50mM之HEPES緩衝液(pH7.5)，作為用於稀釋處理鼻液、痰、咽頭拭液等之檢體的試劑。
(5)測定
使用上述製作之免疫層析用試驗片以及檢體稀釋液，以以下的方法測定檢體中的抗原亦即流行性感冒A型病毒之存在與否。亦即，將吸集機其中一邊的管插入吸引泵，將另一邊的管插入未感染流行性感冒的人的鼻腔之內部，將吸引泵 以負壓採取鼻液。
將採取到的鼻液以上述檢體稀釋液稀釋20倍，將此作為陰性檢體樣品。又，於陰性檢體樣品中，使蛋白濃度成為25ng/mL的方式添加市售之不活化流行性感冒A型病毒抗原，將此作為陽性檢體樣品。
陰性檢體樣品、陽性檢體樣品也添加120μL在免疫層析用試驗片的樣品墊上加以展開，15分鐘後進行目視判定。能夠確認到試驗線之紅線的評為「+」，能鮮明地確認到的評為「++」，能更強烈鮮明地確認到的評為「+++」，雖然能確認到紅線，但顏色非常淡的評為「±」，無法確認到紅線的評為「-」。結果顯示於表1。
[實施例2]
在實施例1的(2)標識物質溶液之製作步驟，使用0.01質量%之PEG-SH(分子量2000)來作為標識物質的保護劑，並以與實施例1相同的程序態樣而實施。然後，依照相同的目視判定基準來判定。其判定結果顯示於表1。
[實施例3]
在實施例1的(2)標識物質溶液之製作步驟，使用0.01質量%之PEG-SH(分子量20000)來作為標識物質的保護劑，並以與實施例1相同的程序態樣而實施。然後，依照相同的目視判定基準來判定。其判定結果顯示於表1。
[比較例1]
在實施例1的(2)標識物質溶液之製作步驟，使用0.01質量%之稱為PEG(分子量20000)這樣的不具有巰基之聚乙二醇 來作為標識物質的保護劑，並以與實施例1相同的程序態樣而實施。然後，依照相同的目視判定基準來判定。其判定結果顯示於表1。
[比較例2]
在實施例1的(2)標識物質溶液之製作步驟，使用預測有同樣機能的聚乙烯氫吡咯酮(PVP K-90分子量630000)取代0.01質量%之PEG(分子量5000)，來作為標識物質的保護劑，並以與實施例1相同的程序態樣而實施。然後，依照相同的目視判定基準來判定。其判定結果顯示於表1。
[比較例3]
在實施例1的(2)標識物質溶液之製作步驟，使用0.01質量%之PEG-SH(分子量5000)來作為標識物質的保護劑，標識物質保持部的胺基酸成分使用「L-麩胺酸」來取代L-精胺酸，並以與實施例1相同的程序態樣而實施。然後，依照相同的目視判定基準來判定。其判定結果顯示於表1。
[比較例4]
在實施例1的(2)標識物質溶液之製作步驟，使用0.01質量%之PEG-SH(分子量5000)來作為標識物質的保護劑，將標識物質保持部之胺基酸成分使用「L-麩胺酸+胍鹽酸鹽」來取代L-精胺酸，並以與實施例1相同的程序態樣而實施。然後，依照相同的目視判定基準來判定。其判定結果顯示於表1。
[比較例5]
在實施例1的(2)標識物質溶液之製作步驟，使用含有PEG-SH(日本油脂股份有限公司製，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量5000)之HEPES緩衝液(pH7.5)來作為標識物質的保護劑，使用L-精胺酸來作為標識物質保持部的胺基酸成分，使用「BSA」來取代標識物質保持部的蛋白質成分也就是酪蛋白，並以與實施例1相同的程序態樣而實施。然後，依照相同的目視判定基準來判定。其判定結果顯示於表1。
5. 摻合的成分造成之影響的評價
1)從表1的實施例1~3之結果，使用含有PEG-SH(分子量2000~20000)的HEPES緩衝液(pH7.5)來作為標識物質的保護劑，僅在此摻合有含有酪蛋白之磷酸緩衝液(pH9.0)與L-精胺酸水溶液的情況，在抗原量為0ng未顯示稱為陽性、偽陽性的「+」和「±」，得知空白發色以及非特異反應受到抑制。
2)如同「比較例1」以及「比較例2」，在不使用PEG-SH(日本油脂股份有限公司製，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量5000)而使用PEG(分子量20000)或是PVP K-90(分子量630000)作為標識物質的保護劑的情況(亦即比較例1、2的情況)，即便使用酪蛋白來作為標識物質保持部的蛋白質成分，且使用L-精胺酸來作為標識物質保持部的胺基酸成分，在抗原量為0ng顯示出稱為陽性、偽陽性的「+」和「±」，得知無法獲得正確的檢查結果。
3)又，如同比較例3、4，使用包含PEG-SH(日本油指股份有限公司製，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量5000)的HEPES緩衝液(pH7.5)來作為標識物質的保護劑，即便在此使用含有酪蛋白的磷酸緩衝液(pH9.0)，在不使用L-精胺酸而使用L-麩胺酸或是L-麩胺酸與胍鹽酸鹽的混合物來作為標識物質保持部的胺基酸成分的情況(亦即比較例3、4的情況)，在抗原量為0ng顯示出稱為陽性的「+」，得知引起了空白發色或是非特異反應。
4)如同「比較例5」，使用含有PEG-SH(日本油脂股份有限公司製，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量5000)的HEPES緩衝液(pH7.5)來作為標識物質的保護劑，即便使用L-精胺酸來作為標識物質保持部的胺基酸成分，在不使用酪蛋白而使用BSA來作為標識物質保持部的蛋白質成分的情況(亦即比較例5的情況)，在抗原量為0ng以及25ng顯示出稱為偽陽性的「±」，得知無法獲得正確的檢查結果。
實施本發明時，能夠依據上述實施例1~3而實 施，藉此確認顯著性(significance)，在以下舉出試驗例或是實施態樣來詳細地說明即使稍微更改該實施例之條件而實施時也同樣能夠確認顯著性，但並不限定在此等之試驗例或是實施態樣。
[實施態樣1]
作為別的實施態樣，使用PEG-SH(日本油指股份有限公司製，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量5000)與PEG-SH(日本油脂股份有限公司製，商品名：SUNBRIGHT ME-02OSH，分子量2000)的混合物，取代上述實施例1中標識物質的保護劑亦即PEG-SH(日本油指股份有限公司製，商品名：SUNBRIGHT ME-05OSH，分子量5000)進行同樣的測定。能達成與僅有上述實施例1中的PEG-SH(日本油脂股份有限公司製，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量5000)時大略相同的目的。
[實施態樣2]
又，使用與PEG-SH(日本油脂股份有限公司製，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量5000)的混合物，取代上述實施例3中的PEG-SH(日本油脂股份有限公司製，商品名：SUNBRIGHT ME-200SH，分子量20000)，同樣地進行測定。能夠確認到可達成與上述實施例3中的PEG-SH(分子量20000)單獨的情況大略相同的目的。
[實施態樣3]
並且，上述實施例1中，使用PEG-SH(日本油脂股份有限公司製，商品名：SUNBRIGHT ME-100SH，分子量10000) 取代PEG-SH(日本油脂股份有限公司製，商品名：SUNBRIGHT ME-050SH，分子量5000)來作為標識物質的保護劑，同樣地進行測定。能夠確認到可達成與上述試驗例1的情況大略相同的目的。
[實施態樣4]
其次，表示藉由具有1個以上巰基之聚乙二醇衍生物的保護劑來將標識物質進行保護處理之溶液中的該保護劑之濃度、混合在經保護處理之溶液的胺基酸成分的精胺酸及蛋白質成分的酪蛋白之二成分的最終濃度之規格(表2)。
．具有1個以上巰基之聚乙二醇衍生物(A)，將其保護處理後的溶液濃度(質量%)定在0.0005、0.005、0.01、0.001、0.001的質量%濃度來將標識物質進行保護處理，除此以外與實施例1同樣地實施。
．精胺酸溶液(B)，將其最終濃度(質量%)定在0.5、0.2、0.02、0、0.1的質量%濃度，除此以外與實施例1同樣地實施。
．酪蛋白溶液(C)，將其最終濃度(質量%)定在0.2、5、2、1、0的質量%濃度，除此以外與實施例1同樣地實施。
(另外，以各成分之重量份=各成分濃度×各成分之摻合量×100來計算。)
即便有使用如上述實施態樣(調配例)1~3之三成分 的組成比例(固體換算：重量份)之溶液的情況，於歷時變化中為安定，進而，因為標識物質的色彩非常鮮明，所以測定時間、操作性、測定精度有提升，達成與實施例1大約同程度的判定結果。
又，如上述實施態樣(調配例)4，在不含胺基酸成分之精胺酸時，即使抗原量為0ng也顯示陽性，不只引起空白發色或是非特異反應，而且在展開時標識粒子部分凝集並敏感度降低和發生展開不均。進而，如上述實施態樣(調配例)5，即使在不含蛋白質成分之酪蛋白時，在抗原量為0ng顯示偽陽性，不只引起非特異反應而無法獲得正確的檢查結果，而且在展開時標識粒子部分凝集並敏感度降低或是發生展開不均。
其次，將於實施例1的檢體稀釋液中之胍鹽酸鹽的濃度規格，作為實施例5~9來表示。
[實施例5~9]
將實施例5~9之各實施例中的檢體處理液中的胍鹽酸鹽濃度定於2、5、20、50、100mM，除此以外與實施例1同樣地實施，各自重複3次進行實驗。其規格與結果顯示於表3。
根據以上，發現藉由使用作為標識物質之保護劑之具有1個以上巰基之聚乙二醇衍生物、作為標識物質保持部的胺基酸成分的L-精胺酸、以及作為標識物質保持部的蛋白質成分的酪蛋白之組合，能夠抑制空白發色和非特異性反應，敏感度佳且正確地檢查出病原菌之有無。
雖然已使用特定的態樣來詳細地說明本發明，但顯然對於本發明所屬技術領域具有通常知識者，可以不偏離本發明的意圖與範圍有各種變更以及變形。另外本申請案，是根據2012年3月22日提出申請之日本專利申請案(特願2012-066409)，藉由引用其全部而援用於此。
[產業利用性]
本發明之檢測套組，由於抑制空白發色和非特異性反應，能夠特異地將鼻液、鼻腔拭液、咽頭拭液或是痰中病原菌之有無，高敏感度且正確地檢測出來，因此可以迅速治療疾病，而具有產業利用性。
1‧‧‧樣品添加部(樣品墊)
2‧‧‧標識物質保持部
3‧‧‧層析介質部
4‧‧‧檢測部
5‧‧‧吸收部
6‧‧‧墊片

Claims (8)

  1. 一種免疫層析檢測方法，其特徵在於包含下列步驟：將含檢體之檢體稀釋液添加至樣品添加部之步驟；藉由在標識物質保持部中保持乾燥的經金奈米粒子所標識的標識物質，來辨識檢測對象物之步驟；將該標識物質與該檢測對象物之複合體作成移動相而展開之步驟；以及，在檢測部中檢測展開後的移動相中的該檢測對象物之步驟；其中，該標識物質在含有具有1個以上巰基之聚烯烴二醇及/或其衍生物的溶液中受到保護處理，繼而與精胺酸及酪蛋白一同於該標識物質保持部中保持乾燥，前述具有1個以上巰基之聚烯烴二醇及/或其衍生物，是具有1個以上巰基之分子量為1000~30000的聚乙二醇及/或其衍生物，該標識物質經保護處理後之溶液中的該聚乙二醇及/或其衍生物的濃度為0.0001~0.05質量%。
  2. 如請求項1所述之免疫層析檢測方法，其中，前述精胺酸及酪蛋白，藉由含於標識物質溶液中而由層析介質加以溼潤，並於該標識物質保持部中保持乾燥，作為由該層析介質加以溼潤前之該標識物質溶液中的最終濃度，精胺酸的濃度為0.01~2質量%、酪蛋白的濃度為0.1~10質量%。
  3. 如請求項1所述之免疫層析檢測方法，其中，前述金奈米粒子是平均粒徑為30~100nm的紅色金奈米粒子或平均粒徑為20~200nm的藍色金奈米粒子。
  4. 如請求項1所述之免疫層析檢測方法，其中，前述檢體為鼻液、鼻腔拭液、咽頭拭液或痰。
  5. 如請求項1所述之免疫層析檢測方法，其中，在前述檢體稀釋液中含有胍。
  6. 如請求項5所述之免疫層析檢測方法，其中，前述檢體稀釋液中之胍的濃度為1~200mM。
  7. 一種免疫層析裝置，其特徵在於：實質上由樣品添加部、標識物質保持部、層析介質部、檢測部及吸收部的順序所構成，該標識物質保持部設置於該樣品添加部的端部與該檢測部之間的領域部，且標識物質藉由具有1個以上巰基之聚烯烴二醇及/或其衍生物來保護，並與精胺酸及酪蛋白一同於該標識物質保持部中保持乾燥。
  8. 一種檢測套組，其特徵在於：含有免疫層析裝置，該免疫層析裝置實質上由樣品添加部、標識物質保持部、層析介質部、檢測部及吸收部的順序所構成，在樣品添加部的端部與檢測部之間的領域部設置該標識物質保持部，且標識物質藉由具有1個以上巰基之聚烯烴二醇及/或其衍生物來保護，並與精胺酸以及酪蛋白一同於該標識物質保持部中保持乾燥。
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