WO2018030878A1 - 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 감염 예방용 백신 조성물 - Google Patents

재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 감염 예방용 백신 조성물 Download PDF

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infection
vaccine
recombinant protein
hyopneumoniae
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한태욱
아비히지트 바레이트카시나스
김기주
신우성
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Definitions

  • the present invention relates to a vaccine composition for the prevention of swine mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hyalurine infection, comprising a recombinant protein for producing a vaccine for producing a vaccine for preventing swine mycoplasma infection and a recombinant protein.
  • Mycoplasma hyopneumoniae is a Porcine Respiratory Disease (PRDC) complex) and respiratory pathogens related to enzootic pneumonia (EP), which has been attracting attention as a causative agent of swine mycoplasma pneumonia due to colonization of respiratory ciliated cells.
  • PRDC Porcine Respiratory Disease
  • EP enzootic pneumonia
  • Mycoplasma hyopneumoniae can only show symptoms such as dry cough when infected with a single infection, but when combined with other respiratory pathogens causes severe respiratory symptoms, reduces macrophage activity, and protects against the invasion of other pathogens. It further increases the risk of additional pathogen infections, including loss of primary defense.
  • Mycoplasma Hyorinis hyorhinis is emerging as a pathogen that plays a new role in the respiratory epidemic of pigs following Mycoplasma hyopneumoniae , and has been reported to exacerbate the disease by combined infection with the pig respiratory virus. It is also known that mycoplasma hyolineis alone may cause mycoplasmal lesions expressed in mycoplasma hyopneumoniae. It may also act as a major pathogen of otitis media in pigs and is known as a cause of eustachian tube inflammation, which is a very high risk pathogen.
  • inactivated vaccines are currently being used commercially. This inactivated vaccine is currently the only vaccine available for swine mycoplasma pneumonia.
  • most commercialized Mycoplasma hyopneumoniae inactivating vaccines do not form antibodies after inoculation, and alleviate clinical symptoms, but show technical limitations in that they cannot prevent the transmission of natural infectious organisms and respiratory ciliary colonization. Therefore, the need for an effective vaccine development that can solve these problems is important.
  • Adhesin P97 is a membrane surface protein of Mycoplasma hyonneumoniae and is known as a highly immunogenic antigen.
  • R1 and R2 sites consisting of repeating sections, of which the R1 site binds to the attachment site (AAKPV / E) of the host respiratory cilia.
  • the bound mycoplasma hyopneumoniae can obtain the amino acids necessary for growth from the host and can arrange various molecules of the host to invade the damaged tissue.
  • the host may produce antibodies to prevent mycoplasma hyopneumoniae from attaching to pig cilia or inhibit the growth of attached pathogens.
  • previous studies have reported that existing commercial vaccines cannot induce antibodies against P97.
  • the present inventors are developing vaccines for effectively preventing Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyopneumoniae.
  • the present invention was confirmed to show a remarkably superior immune response compared to commercial vaccines.
  • an object of the present invention is to provide a recombinant protein for vaccine production for the prevention of swine mycoplasma hyon pneumoniae infection and a vaccine composition for preventing mycoplasma hyon pneumoniae infection comprising the same, consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. will be.
  • Another object of the present invention is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, a recombinant protein for vaccine production for the prevention of pig mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hyornithosis infection and mycoplasma hyopneumoniae comprising the same And it is to provide a vaccine composition for preventing mycoplasma hyorinis infection.
  • the present invention provides a recombinant protein for vaccine production for the prevention of swine mycoplasma hyon pneumoniae infection consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the recombinant protein.
  • the present invention provides a vaccine composition for preventing diseases caused by Mycoplasma hyopneumoniae infection comprising the recombinant protein.
  • the present invention also provides a vaccine adjuvant for preventing mycoplasma hyopneumoniae infection comprising the recombinant protein.
  • the present invention provides a vaccine composition for preventing diseases caused by Mycoplasma hyopneumoniae infection comprising the recombinant protein.
  • the present invention comprises the steps of 1) preparing a vector comprising a polynucleotide encoding the recombinant protein represented by SEQ ID NO: 1; 2) transforming the host with the vector; And 3) expressing said recombinant protein in said transformed host; It provides a method for producing a vaccine adjuvant for preventing mycoplasma hyopneumoniae infection comprising a.
  • the present invention also comprises the steps of inoculating the vaccine composition in pigs; It provides a method for preventing mycoplasma hyopneumoniae infection of the pig.
  • the present invention provides a recombinant protein for the production of a vaccine for the prevention of swine mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hyorainis infection, consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the recombinant protein.
  • the present invention provides a vaccine composition for the prevention of swine mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hyolainis infection comprising the recombinant protein.
  • the present invention provides a vaccine adjuvant for the prevention of porcine mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hyolius infection, comprising the recombinant protein.
  • the present invention provides a vaccine composition for the prevention of diseases caused by Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyoplinis infection comprising the recombinant protein.
  • the present invention comprises the steps of 1) preparing a vector comprising a polynucleotide encoding a recombinant protein represented by SEQ ID NO: 13; 2) transforming the host with the vector; And 3) expressing said recombinant protein in said transformed host; It provides a method for producing a vaccine adjuvant for preventing pig mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hyolius infection.
  • the present invention also comprises the steps of inoculating the vaccine composition in pigs; It provides a method for preventing the mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hiorainitis infection of pigs comprising.
  • Recombinant proteins for vaccine preparation of the present invention when added to the vaccine composition for preventing the prevention of swine mycoplasma infection, by increasing the immune response to the pig mycoplasma hyon pneumoniae and swine mycoplasma hyorainis strain and the immune response to the P97 protein Better protective effect than commercial vaccines. Therefore, the recombinant protein for vaccine preparation of the present invention and the vaccine composition using the same can effectively prevent diseases caused by infection of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyoliinis, especially swine mycoplasma pneumonia and swine mycoplasma arthritis. .
  • Figure 1 shows the mycoplasma hyon pneumoniae after inoculation of pig mycoplasma monovalent vaccine containing rP97 protein in pigs of 3 weeks of age Figures showing the results of identifying specific antibodies. All experimental data are expressed as mean ⁇ SD, and significant differences between the vaccine group and the PBS group are indicated by * ( P ⁇ 0.05) and ** ( P ⁇ 0.01) (G1: lysate containing Mhp HID3138 + rP97 recombinant protein, G2: solution containing Mhp HID3117 + rP97 recombinant protein, G3: solution containing rP97 recombinant protein, G4: saline alone, G5: commercial vaccine Mycoflex®) (DPV: Days post vaccination).
  • Figure 2 shows the results of evaluating rP97-specific antibody titer after inoculation of pig mycoplasma monovalent vaccine containing rP97 protein in 3 weeks old pigs by indirect ELISA. All experimental data are shown in mean ⁇ SD, significant differences in the vaccine group and the PBS group was represented by *** (P ⁇ 0.001) (G1 : Mhp HID3138 + rP97 for bacterial solution containing the recombinant protein, G2: Mhp HID3117 + rP97 recombinant Protein containing lysate, G3: rP97 recombinant protein containing lysate, G4: physiological saline alone, G5: commercial vaccine Mycoflex®) (DPV: Days post vaccination).
  • FIG. 3A is a diagram showing the results of modeling and comparing the structures of rP97 recombinant protein represented by SEQ ID NO: 1 and rP97m recombinant protein represented by SEQ ID NO: 13.
  • FIG. 3A is a diagram showing the results of modeling and comparing the structures of rP97 recombinant protein represented by SEQ ID NO: 1 and rP97m recombinant protein represented by SEQ ID NO: 13.
  • Figure 3b is a diagram showing the result of comparing the sequence of rP97 recombinant protein represented by SEQ ID NO: 1 and rP97m recombinant protein represented by SEQ ID NO: 13.
  • Figure 4 shows the mycoplasma hyon pneumoniae using serum obtained before and after the vaccination of pig mycoplasma divalent vaccine vaccination containing rP97m recombinant protein IDEXX M. hyo for specific antibodies. It is a figure which shows the result of having performed ELISA. All experimental data are expressed as mean ⁇ SD, and significant differences between the vaccine group and the PBS group are indicated by ** ( P ⁇ 0.01) and *** ( P ⁇ 0.001) (G1: PBS alone, G2: commercial vaccine).
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of evaluating rP97m specific antibody titers by indirect ELISA using serum obtained before and after 5 weeks of vaccination of porcine mycoplasma divalent vaccine containing rP97m recombinant protein. All experimental data are expressed as mean ⁇ SD, and significant differences between the vaccine group and the PBS group are indicated by *** ( P ⁇ 0.001) (G1: PBS alone, G2: commercialized vaccine Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224 + rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224 + rP97m).
  • FIG. 6 shows indirect ELISA of all mycoplasma hyorinis bacteria as antigens using mycoplasma hyorinis-specific antibody titers using serum obtained before and 5 weeks after inoculation of porcine mycoplasma divalent vaccine containing rP97m recombinant protein. It is a figure which shows the result evaluated. All experimental data are expressed as mean ⁇ SD, and significant differences between the vaccine group and the PBS group are indicated by ** (P ⁇ 0.01) (G1: PBS alone, G2: commercialized vaccine Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr). HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224 + rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224 + rP97m).
  • PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell
  • Vaccine Respisure® G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m
  • G4 Mhp HID3140 + Mhr HID3224 + rP97m
  • G5 Mhp HID3138 + Mhr HID3224 + rP97m
  • FIG. 8 shows the results of comparing pig body weight changes before and after inoculation of pig mycoplasma divalent vaccine containing rP97m recombinant protein (G1: PBS alone, G2: commercialized vaccine Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224 + rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224 + rP97m).
  • the present invention provides a recombinant protein for producing a vaccine for preventing porcine mycoplasma hyopneumoniae infection consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a polynucleotide encoding the same.
  • the present invention provides a recombinant protein for the production of a vaccine for the prevention of swine mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hyorininis infection consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 and a polynucleotide encoding the same.
  • the recombinant protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is included in the monovalent vaccine for the prevention of mycoplasma hyopneumoniae infection
  • the cells for mycoplasma hyopneumoniae by P97 involved in initial infection and adhesion More effective induction of sexual and humoral immune responses, and more effective immune responses than commercial vaccines. In this specification, it is referred to as 'rP97'.
  • the recombinant protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 is included in a bivalent vaccine for the prevention of mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hyoraninis infection, mycoplasma by P97 involved in the initial infection and adhesion It is possible to more effectively induce cellular and humoral immune responses against hyopneumoniae and mycoplasma hyoraniness and to induce more effective immune responses than commercial vaccines. In this specification, it is referred to as 'rP97m'.
  • the recombinant proteins rP97 and rP97m are P. protein and E. coli derived from Mycoplasma hyon pneumoniae. It can be prepared by fusing the heat-labile enterotoxin subunit B gene (eltb). More specifically E. coli The eltb and the R- and R1R2, which are the C-terminal repeat sequences of the P97 gene of mycoplasma hyon pneumoniae, were fused, and the l97R1 and ltbR1R2, which were fused with LTB, were amplified by polymerase chain reaction (PCR). have.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Recombinant proteins of the invention may include all polypeptides having at least 70%, 80%, 90%, 95%, 98% and preferably at least 99% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 13 Can be.
  • "Homology" refers to the determination of similarity between protein or polynucleotide sequences. These polypeptides may have a deletion, addition or substitution of at least one amino acid as compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 13. The degree of homology between the two scored sequences is based on preserving the percentage of identities and / or substitution of the sequences.
  • the recombinant proteins of the present invention may be added to the vaccine in the form of a purified protein, or may be included in a lysate that is not purified and expressed in E. coli.
  • the concentration of the lysate may be 0.2 to 0.3 mg / ml.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the recombinant proteins.
  • the polynucleotide may include all possible sequences encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 13, respectively, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 2 or sequence A polynucleotide having at least 70%, 80%, 90%, 95%, 98% homology with the nucleotide sequence of No. 14, and preferably at least 99%, to maintain the biological activity of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 14. All polynucleotides present.
  • the present invention also provides a vaccine composition for preventing M. hyopneumoniae infection comprising the recombinant protein rP97.
  • the vaccine composition for preventing Mycoplasma hyopneumoniae infection of the present invention means a monovalent vaccine composition capable of preventing an infection and preventing an initial infection of Mycoplasma hyopneumoniae in pigs.
  • Recombinant protein for vaccine production for the prevention of swine mycoplasma hyon pneumoniae infection consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention is contained in the vaccine composition to form a P97 specific antibody inactivated myco contained in the vaccine It is possible to further promote the induction of immune response by plasma high pneumoniae.
  • the present invention provides a vaccine composition for preventing Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyolainis infection comprising a recombinant protein rP97m.
  • the vaccine composition for the prevention of mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hyolainis infection is a bivalent vaccine composition that can prevent the infection and prevent the initial infection of mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hyolainis in pigs. it means.
  • Recombinant protein for vaccine production for the prevention of swine mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hyorinisis infection consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 of the present invention is included in the vaccine composition to form a P97 specific antibody to be included in the vaccine It is possible to further promote the induction of an immune response to the inactivated mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hyolius.
  • the vaccine composition of the present invention may further include inactivated mycoplasma hyopneumoniae or mycoplasma hyiolinis.
  • inactivated refers to killed mycoplasma, which can be purchased or prepared by a method well known in the art from live bacteria.
  • Inactivated mycoplasma included in the vaccine composition of the present invention is a common standard strain or a highly pathogenic high titer strain that forms an antibody isolated from a mycoplasma infected pig individual whose amplification of its immune inducing effect can be amplified by the recombinant protein of the present invention. It may include all, preferably may be mycoplasma that can effectively induce antibodies to the P97 important antigen when inoculated with the recombinant protein of the present invention.
  • Mycoplasma hyopneumoniae or mycoplasma hyolius of the vaccine composition is 1.0.x10 6 To 1.0.x10 It may be included in the vaccine at a concentration of 10 Color-changing units (CCU) / ml, preferably 1.0.x10 7 To 1.0.x10 10 CCU, more preferably 1.0.x10 8 to 1.0.x10 10 CCU.
  • CCU Color-changing units
  • the vaccine composition of the present invention may comprise a mixture of adjuvants and one or more pharmaceutically or veterinary acceptable carriers, excipients or diluents which can enhance the immunogenicity of the vaccine to induce protective immunity with minimal administration.
  • pharmaceutically or veterinary acceptable refers to a composition which is physiologically acceptable and does not normally cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorders, dizziness, or the like when administered to an animal.
  • Examples of such carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • Suitable carriers for use include, but are not limited to, saline, phosphate buffered saline, minimal essential medium (MEM), or an aqueous medium comprising MEM of HEPES buffer.
  • Adjuvant mixtures for use in the vaccine compositions of the present invention enhance the immune response and include metabolizable oils.
  • the vaccine compositions of the invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile powders and the like.
  • the vaccine composition of the present invention may be administered by intramuscular, subcutaneous, transdermal, intravenous, intranasal, intraperitoneal or oral route, and preferably by intramuscular or subcutaneous route.
  • the vaccine contains mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hyoliis, inactivated as an oil-in-water emulsion, metabolizable oil, polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymers and acrylic acid polymers. can do.
  • the dosage of the vaccine can be appropriately selected depending on several factors such as the route of administration, the age, sex, weight and severity of the animal.
  • the vaccine compositions of the present invention may be prepared by standard methods in the art, with the exception of methods specific to the present invention, such as the preparation of rP97 or rP97m recombinant proteins.
  • an organism can be grown in a culture medium such as complete medium, and the growth of the organism can be monitored by standard techniques such as measuring color change units (CCUs) and harvested when sufficiently high titers are achieved.
  • CCUs color change units
  • the stock may be further concentrated or lyophilized by conventional methods prior to inclusion in the vaccine for formulation.
  • the present invention also provides a vaccine adjuvant for preventing mycoplasma hyneumoniae infection comprising recombinant protein rP97 or a vaccine adjuvant for preventing mycoplasma hyneumoniae and mycoplasma hyorainis infection comprising recombinant protein rP97m.
  • the vaccine adjuvant is a substance that enhances immunogenicity and enhances the efficacy of an inactivated vaccine.
  • the vaccine adjuvant is inoculated simultaneously with or sequentially with a vaccine including inactivated mycoplasma hyneumoniae and / or mycoplasma hyorainis. It is possible to further amplify the immune response in the individual by inactivated mycoplasma hyneumoniae and / or mycoplasma hyorainis.
  • the present invention also provides a vaccine composition for preventing diseases caused by Mycoplasma hypneumoniae infection comprising recombinant protein rP97 or a vaccine for preventing diseases caused by Mycoplasma hyneumoniae and Mycoplasma hyoranisis infection comprising recombinant protein rP97m.
  • a vaccine composition for preventing diseases caused by Mycoplasma hypneumoniae infection comprising recombinant protein rP97 or a vaccine for preventing diseases caused by Mycoplasma hyneumoniae and Mycoplasma hyoranisis infection comprising recombinant protein rP97m.
  • Diseases caused by the Mycoplasma hypneumoniae and / or Mycoplasma hyorainis infection may include various clinical diseases caused by the pathogen being infected by the individual, but preferably, pig respiratory complex syndrome, swine Or arthritis due to pandemic pneumonia or mycoplasma hyorainis.
  • the present invention comprises the steps of 1) preparing a vector comprising a polynucleotide encoding the recombinant protein represented by SEQ ID NO: 1; 2) transforming the host with the vector; And 3) expressing said recombinant protein in said transformed host; It provides a method for producing a vaccine adjuvant for preventing mycoplasma hyopneumoniae infection comprising a.
  • the present invention comprises the steps of 1) preparing a vector comprising a polynucleotide encoding a recombinant protein represented by SEQ ID NO: 13; 2) transforming the host with the vector; And 3) expressing said recombinant protein in said transformed host; It provides a method for producing a vaccine adjuvant for preventing pig mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hyolius infection.
  • the present invention comprises the steps of inoculating a pig vaccine composition for the prevention of porcine mycoplasma hyopneumoniae infection comprising a recombinant protein rP97; It provides a method for preventing mycoplasma hyopneumoniae infection of the pig.
  • the present invention comprises the steps of inoculating pigs with a vaccine composition for the prevention of swine mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hyolius infections comprising a recombinant protein rP97m; It provides a method for preventing the mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hiorainitis infection of pigs comprising.
  • the pigs may include any individual that is likely to be infected with mycoplasma, and such infection prevention methods may be used in combination with other treatment methods or prevention methods known in the art.
  • infection prevention methods means providing a subject with a composition of the present invention in any suitable manner.
  • M. hyopneumoniae (Mhp) strains were isolated from domestic pig farms, and Mhp HID3117 and HID3138, the isolates of the isolated strains, were analyzed by protein pattern analysis. ) J (ATCC 25934) and other strains were confirmed.
  • Mycoplasma hyopneumoniae strains HID3117 and HID3138 Friis medium was incubated for 3 weeks under conditions of 5% CO 2 , 37 ° C. The cultured bacterial solution was inactivated by raising the pH to about 7.8. Inactivation of bacteria was carried out using an inactivation reagent such as Binary ethyleneimine (BEI) (US Pat. No. 5,565,205).
  • BEI Binary ethyleneimine
  • BEI was prepared by adding 2-bromoethylaminehydrobromide (BEA) (SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA) to the culture, and then BEI was added with sodium thiosulfate (SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA), a neutralizing reagent. Neutralized. Some of the inactivated culture was added to fresh medium and incubated at 37 ° C., and incubated for at least one week to confirm inactivation. The inactivated culture was concentrated by filtration or centrifugation.
  • BEA 2-bromoethylaminehydrobromide
  • sodium thiosulfate SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA
  • RP97 recombinant protein was prepared by fusing the P97 protein and the E.coli heat-labile enterotoxin subunit B gene of Mycoplasma high ohnyu monitor Ke (eltb). More specifically, genomic DNA was extracted using Genomic DNA Extraction Mini kit (RBC Biosciences) from Mhp HID3138 and Mhp HID3117 strains, which are domestic isolates. Genomic DNA of enterococci E. coli was extracted by boiling method. E.
  • coli The heat-labile enterotoxin subunit B gene (eltb) and the C-terminal repeat sequence (R1 and R1R2) of the P97 gene were fused, and the l97R1 and ltbR1R2 fused with LTB were amplified by polymerase chain reaction (PCR). . Primers used for PCR are as described in Table 1 below.
  • PCR products amplified using LTBF and R1F primers containing four nucleotide sequences were inserted into the pENTR / SD vector (Gateway system, Invitrogen). Then, ltb and R1 were fused using LTBR and R1F primers containing BamHI restriction enzyme.
  • Each gene (R1, R1R2, ltbR1 and ltbR1R2) according to the manufacturer's method was inserted into pENTR / SD and pDEST-42 vector (Gateway system, Invitrogen), by using electroporation in order to express the respective recombinant proteins E .
  • coli BL21-competent after transfection into the cell were cultured in 1L LB medium containing ampicillin in a 100 ⁇ g / mL.
  • the culture medium was added with isopropyl- ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) to a final concentration of 1 mM, inducing protein expression for 3 hours, sonication, and centrifugation to obtain a lysate containing recombinant protein.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside
  • the expressed protein was purified according to the manufacturer's method using HisPur Ni-NTA affinity chromatography (Thermo Scientific).
  • amino acid sequence of the recombinant protein rP97 of the present invention prepared is shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence encoding the amino acid of SEQ ID NO: 1 is described in SEQ ID NO: 2.
  • primer sequences used are shown in SEQ ID NOs: 3 to 12.
  • the inactivated and concentrated Mycoplasma hyopneumoniae was aseptically mixed with excipients, diluted in a sterile container as shown in Table 2, and then mixed with a solution containing rP97 at 4 ° C. for at least 30 minutes to prepare a vaccine. .
  • CCU Color-changing units
  • a comparative group was set up a group inoculated with 1 ml of commercialized vaccine Mycoflex® (Boehringer Ingelheim Animal Health, St.
  • Example 1.2 prepared in Example 1.2 as a lysate treatment comparison group (rLysate) 2 ml of the lysate containing the recombinant protein alone was inoculated.
  • the control group was inoculated with 2 ml of PBS alone, and a total of five groups were tested. All groups were boosted 21 days after initial inoculation. Serum samples were isolated at 0, 21, 42, and 63 days after initial vaccination and stored at ⁇ 20 ° C. until used in the experiment. The details of each experimental group are shown in Table 3 below.
  • Mycoplasma hyopneumoniae specific antibody was determined by IDEXX M. hyo. Measurements were made using ELISA (IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME, USA). Specific antibody titers against rP97 were identified using the expressed and purified P97 protein as antigen, and rP97 (0.5 ⁇ g / well) was placed on 96-well Maxi-Sorp microtiter plates (NUNC, Thermo Scientific, Penfield, NY, USA). Coated and stored at 4 ° C. for 16 hours. Plates were washed with PBS (PBST) added 0.05% Tween 20, and then blocked with PBS (PBSM) containing 5% non-fat milk.
  • PBST PBS
  • PBSM PBS
  • HRP horseradish peroxidase
  • Mycoplasma hyopneumoniae specific serological antibody level measurement results induced by various vaccine candidates were statistically analyzed using GraphPad Prism 5 software (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Differences in antibody titers in serum between two groups were determined by two-way ANOVA incorporating Bonferroni post-test. Significant differences were expressed as P ⁇ 0.05, and the results of antibody level measurement are shown in FIG. 1.
  • the PBS treated control showed negative in the pre-inoculation section.
  • the G1 and G2 groups were positive from 42 days after the inoculation to the end of the experiment.
  • the vaccinated group showed higher antibody levels than the commercial MFlex (G5) group, and the G2 group showed similar levels as the commercial vaccine group (G5) at 63 days after vaccination.
  • the G1 and G2 groups induced the highest levels of antibodies at 42 and 63 days after inoculation, and showed a statistically high value when compared to the PBS group.
  • rP97-specific antibody levels continued to increase, showing the highest value at 42 days after inoculation.
  • the G1, G2 and G3 groups showed significantly higher antibody titers than the control group ( P ⁇ 0.001), and there was no significant difference between the three inoculation groups.
  • the G1, G2 and G3 groups showed 19, 20 and 16 times higher levels of antibody titer than the control group, respectively.
  • the control group (G4) and the commercial vaccine group (G5) did not show an rP97-specific immune response.
  • the vaccine produced in the present invention shows high antibody titer for rP97, whereas the antibody level of P97, which is an adhesion protein, is high. It is similar to the previous report that it is insufficient. Therefore, it can be seen that the vaccine prepared in the present invention is more effective than the conventional commercial vaccine by forming a high antibody titer against rP97.
  • bacteria were isolated from pigs in the mycoplasma farm and the mycoplasma-specific PCR and ELISA antibodies were examined to identify the farms in which the mycoplasma was circulated.
  • the G1 group containing Mhp HID3138 and rP97 observed clinical symptoms (cough, depression, secretion of nasal secretion) for 3 weeks after vaccination at 1 and 4 weeks of age.
  • 5 groups randomly selected from each group were selected to calculate the gross lesion index of the lung.
  • the evaluation method using the gross lesions of the lungs is to analyze the gross lesions of the lungs for respiratory diseases. The total lungs are 100 and the scores are distributed based on the volume of each lobe. Was performed by the method of analyzing, and the results are shown in Table 4.
  • the control group not vaccinated was observed with a high positive rate such as cough, depression, nasal exudate, but almost no clinical symptoms were observed in the vaccinated group.
  • Gross lung lesion index also showed a significant difference between the vaccinated control group and the vaccinated group. Therefore, the vaccine prepared in the present invention was observed to alleviate respiratory symptoms and reduce lung lesions when inoculated on farms containing mycoplasma bacteria.
  • the recombinant rP97 of the present invention can be usefully used for a vaccine against Mycoplasma hyopneumoniae .
  • the vaccine containing the recombinant protein contains P97, which is an important attachment factor for early infection, and thus, it is possible to form a distinct antibody to confirm the presence or absence of vaccination.
  • P97 can prevent propagation and respiratory ciliary colonization of natural infectious bacteria, which have been pointed out as technical limitations of conventional commercial vaccines. That is, the recombinant rP97 of the present invention can effectively achieve the prevention of mycoplasma through the early onset of mycoplasma hyopneumoniae.
  • Mycoplasma high ohnyu monitor Ke M. hyopneumoniae; Mhp
  • Mhp Wow Mycoplasma Hyorinis hyorhinis ; Mhr
  • Mhp HID3134, HID3140, HID3138, and Mhr HID3224 were different strains compared to the respective standard strains of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorainis.
  • the strains were expected to be highly pathogenic high titer strains that induce antibodies.
  • the cultured bacteria solution was adjusted to pH 7.8 and then inactivated by using an inactivation reagent such as Binary ethyleneimine (BEI) (US Pat. No. 5,565,205).
  • BEI is prepared by adding L-bromoethylaminehydrobromide (BEA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) to the culture. Thereafter, neutralizing reagent, sodium thiosulfate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) was added to neutralize, and a portion of the inactivated culture solution was added to a fresh medium, and then cultured at 37 ° C. to confirm that the inactivation was performed. The culture was carried out for at least one week, and the inactivated culture was concentrated by centrifugation.
  • BEI Binary ethyleneimine
  • Recombinant rP97m protein was prepared by fusing Mycoplasma hyopneumoniae P97 protein and E. coli heat-labile enterotoxin subunit B (eltb). After rP97 of Example 1 was obtained without processing from Mhp and fused with LTB, rP97m was prepared by fusion with LTB after separately recombining R1 and R2 using the nucleotide sequences of R1 and R2 which are key sites in P97. More specifically, the recombination of rP97m protein was performed using the pET-30a (+) (Novagen, USA) expression system. Expression plasmids were inserted into E.
  • rP97 and rP97m have mutually different structures, and in particular, rP97m synthesized only R1 and R2 separately to confirm that only essential sites are constituted. As shown in b of FIG. 3, both sequences showed 64.13% homology, indicating that the sequences were very low in homology.
  • Inactivated and concentrated Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyoliinis were aseptically mixed with excipients, diluted in sterile containers as shown in Table 5 and mixed for at least 24 hours to prepare vaccines.
  • CCU Color-changing units
  • Mycoplasma hyopneumoniae and to determine the immunogenicity of vaccine candidates Animal experiments were performed using 3 week old pigs not infected with Mycoplasma hyoranisis. Pigs used in the experiments were treated with clinical symptoms, pneumonia lesions, other serological tests, and mycoplasma hyopneumoniae and ELISA kits (IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME, USA). The presence of mycoplasma hyalurinitis was periodically checked.
  • Example 2.1 Four pigs were prepared in each group, and the experimental group was prepared by mixing Mhp HID3134, Mhp HID3140, Mhp HID3138, Mhr HID3224, and rP97m, which were inactivated by the method of Example 2.1, in a ratio as shown in Table 5, respectively. Each dose was administered once, and samples were taken 4 days before inoculation and 1, 2, 4 and 5 weeks after inoculation. The details of each experimental group are shown in Table 6 below. The control group was treated with Respisure® (Zoetis, USA), a commercial vaccine. Blood was collected after vaccination and serum was separated and stored at -20 ° C for use in experiments.
  • Respisure® Zoetis, USA
  • GROUP 1 PBS only GROUP 2 (G2) Commercialized Vaccine Respisure® GROUP 3 (G3) Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m GROUP 4 (G4) Mhp HID3140 + Mhr HID3224 + rP97m GROUP 5 (G5) Mhp HID3138 + Mhr HID3224 + rP97m
  • Mycoplasma hyopneumoniae specific antibody titer was used IDEXX M. hyo + .ELISA kit (IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME, USA). P97m specific antibody titer was measured by coating the purified rP97m protein with the antigen, Mycoplasma hyorinis specific antibody titer was measured by coating the mycoplasma hyorinis whole bacterin with the antigen.
  • Each antigen (rP97m: 0.2 ⁇ g / well, Mhr Whole bacterin: 25ng / well) was coated on 96-well Maxi-Sorp microtiter plates (NUNC, Thermo Scientific, Penfield, NY, USA) and 16 hours or 37 ° C at 4 ° C. Store at 2 ° C. for 2 hours. Plates were washed three times with PBS-T with 0.05% Tween 20 and then blocked with 1% BSA in PBS at 37 ° C. for 2 hours. After washing three times with PBS-T, 100 ⁇ l of serum (1: 100 dilution, 0.1% BSA in PBS) was added to the plate and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Abcam horseradish peroxidase
  • BioFX ® TMB One Component HRP Microwell Substrate (SurModics®, USA) into the reaction was terminated to put a stop solution after ambaneung in 5 minutes at room temperature. The absorbance was measured at 450 nm to confirm the result.
  • PBS group (G1) was negative in the pre-inoculation section.
  • G3, G4, and G5 vaccinated were positive from the 2nd week of vaccination to the end of the experiment, confirming that a humoral immune response was formed.
  • the antibody value explosively increased from 2 weeks to 5 weeks after vaccination, which resulted in higher antibody levels than the commercial vaccine group (G2), and statistically high compared to the PBS group (G1). Value was shown.
  • rP97m-specific antibody levels against vaccinated groups G3, G4, and G5 began to increase at 14 days of inoculation and showed statistically high values when compared to PBS group (G1). .
  • the commercial vaccine group (G2) did not detect rP97m specific antibodies.
  • Swine Mycoplasma Iga vaccine contains Mycoplasma hyalurine. Therefore, the antibody level against mycoplasma hyorainis was measured, and the results are shown in FIG. 6. Similarly, all pigs were tested serologically before inoculation and tested.
  • PBS group (G1) was negative in the pre-inoculation section.
  • group G3, G4, and G5 vaccinated they were positive from 4 weeks after the end of the experiment.
  • Group 4 treated group showed statistically high value when compared with PBS group, indicating that humoral immune response was effectively generated.
  • the commercial vaccine group (G2) did not contain mycoplasma hyorainis, and therefore, mycoplasma hyorainis-specific antibodies were not detected, which showed only negative reaction until 5 weeks after inoculation.
  • PBMCs Peripheral Blood Mononuclear Cells
  • the commercial vaccine group showed only a low cellular immune response, but G3, G4, and G5 vaccinated with the bivalent vaccine prepared in Example 2 were all statistically significantly higher than the commercial vaccine group G2. ⁇ was produced. It was confirmed that the prepared bivalent vaccine can induce a better cellular immune response than the commercial vaccine group.
  • the prepared mycoplasma divalent vaccine comprising rP97m was swine It has been confirmed that it can be used as a safe vaccine without any side effects.
  • the bivalent vaccine comprising a recombinant protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 has a high level of mycoplasma hyopneumoniae and mycoplasma hyorainis specific humoral immune response and mycoplasma high It can be seen that the onnumoniae specific cellular immune response can be induced to have a superior effect compared to commercial vaccines.

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Abstract

본 발병은 돼지 마이코플라즈마 감염 예방용 백신을 제조하기 위한 백신 제조용 재조합 단백질 및 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 백신 제조용 재조합 단백질들은 돼지 마이코플라즈마 감염 예방용 백신 조성물에 첨가되는 경우, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애와 돼지 마이코플라즈마 하이오라이니스 균주에 대한 면역반응과 P97 단백질에 대한 면역반응을 증가시킴으로써 기존 상용 백신보다 우수한 방어 효과를 나타낼 수 있다. 따라서 본 발명의 백신 제조용 재조합 단백질 및 이를 이용한 백신 조성물은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애와 마이코플라즈마 하이오라이니스의 감염에 의해 발생하는 질병, 특히 돼지 마이코플라즈마성 폐렴과 돼지 마이코플라즈마성 관절염을 효과적으로 예방할 수 있다.

Description

재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 감염 예방용 백신 조성물
본 발병은 돼지 마이코플라즈마 감염 예방용 백신을 제조하기 위한 백신 제조용 재조합 단백질 및 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
마이코플라즈마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae)는 돼지호흡기복합증후군(PRDC, Porcine respiratory disease complex) 및 돼지유행성폐렴(EP, enzootic pneumonia)과 관련된 호흡기병원체이며, 호흡기 섬모세포에 집락화를 시작으로 감염을 일으켜 돼지 마이코플라즈마성 폐렴의 원인균으로 주목받고 있다.
마이코플라즈마 하이오뉴모니애는 단일 감염되었을 때는 건성 기침 등의 증상만을 나타내나, 다른 호흡기 병원체와 복합 감염되는 경우 심각한 호흡기 증상을 유발하고 대식세포의 활성을 떨어뜨리고, 다른 병원체의 침입을 방어하는 1차 방어 기능을 상실하게 하는 등 추가 병원균 감염의 위험성을 더욱 증가시킨다.
마이코플라즈마 하이오라이니스 (Mycoplasma hyorhinis)는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애에 뒤이어 돼지의 호흡기 전염병에서 새로운 역할을 하는 병원체로 대두되고 있으며, 돼지 생식기호흡기증 바이러스와 혼합 감염으로 병증을 더욱 악화시키는 것으로 보고되어 있다. 또한 마이코플라즈마 하이오라이니스는 단독으로도 마이코플라즈마 하이오뉴모니애에서 발현되는 마이코플라즈마성 병변을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이는 돼지에서 중이염의 주요 병원체로도 작용할 수 있고 유스타키오관염증의 원인체로도 알려져 있어, 그 위험성이 매우 높은 병원균이다.
이처럼 양돈 농가에 큰 피해를 유발하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염을 막기 위해 현재 불활화 형태의 백신이 상용화되어 사용되고 있다. 이러한 불활화 백신은 현재 돼지 마이코플라즈마성 폐렴에 이용될 수 있는 유일한 백신이다. 그러나 상용화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 불활화 백신은 대부분 접종 후 항체를 형성하지 못하고, 임상 증상은 완화시킬 수 있으나 자연 감염균의 전파 및 호흡기 섬모 집락화를 예방할 수 없다는 점에서 기술적 한계점을 나타내고 있다. 따라서 이러한 문제점을 해결할 수 있는 효과적인 백신 개발의 필요성이 중요하게 인식되고 있다.
마이코플라즈마 하이오뉴모니애의 감염은 병원체가 호흡기 상피세포의 섬모에 부착하면서 개시된다. 부착인자 (Adhesin) P97은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애의 막 표면 단백질로 면역원성이 높은 항원으로 알려져 있다. P97의 C말단에는 반복되는 구간으로 구성된 R1과 R2 부위가 존재하며, 그 중 R1 부위는 숙주 호흡기 섬모의 부착부위(AAKPV/E)에 결합한다. 결합된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애는 성장에 필요한 아미노산을 숙주로부터 얻을 수 있으며, 상처난 조직에 침입하기 위하여 숙주의 분자들을 다양하게 배열할 수 있게 된다. 한편, 숙주는 항체를 생산하여 돼지 섬모에 마이코플라즈마 하이오뉴모니애가 부착하는 것을 방해하거나 부착된 병원체의 성장을 저해할 수 있다. 그러나, 선행 연구에 따르면 기존의 상용 백신은 P97에 대한 항체를 유도할 수 없는 것으로 보고된 바 있다.
따라서 돼지 마이코플라즈마 감염, 특히 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스의 자연 감염을 예방하고 효과적으로 항체를 형성할 수 있도록 하는 새로운 백신에 대한 필요성이 있다.
이에 본 발명자들은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스를 효과적으로 예방하기 위한 백신을 개발하던 중 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 유래의 부착단백질인 P97 단백질을 이용한 재조합 P97 단백질을 포함하는 백신이 기존의 상용 백신 대비 현저히 우수한 면역 반응을 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염에 의한 질병 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 보조제를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염에 의한 질병 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 서열번호 1로 표시되는 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 2) 상기 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; 및 3) 상기 형질전환된 숙주에서 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 를 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 보조제의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 돼지에 상기 백신 조성물을 접종하는 단계; 를 포함하는 돼지의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 보조제를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의한 질병 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 서열번호 13으로 표시되는 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 2) 상기 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; 및 3) 상기 형질전환된 숙주에서 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 를 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 보조제의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 돼지에 상기 백신 조성물을 접종하는 단계; 를 포함하는 돼지의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방 방법을 제공한다.
본 발명의 백신 제조용 재조합 단백질들은 돼지 마이코플라즈마 감염 예방용 백신 조성물에 첨가되는 경우, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애와 돼지 마이코플라즈마 하이오라이니스 균주에 대한 면역반응과 P97 단백질에 대한 면역반응을 증가시킴으로써 기존 상용 백신보다 우수한 방어 효과를 나타낼 수 있다. 따라서 본 발명의 백신 제조용 재조합 단백질 및 이를 이용한 백신 조성물은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애와 마이코플라즈마 하이오라이니스의 감염에 의해 발생하는 질병, 특히 돼지 마이코플라즈마성 폐렴과 돼지 마이코플라즈마성 관절염을 효과적으로 예방할 수 있다.
도 1은 rP97 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 일가백신을 3주령의 돼지에 접종 후 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 특이적인 항체를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 모든 실험 데이터는 mean ± S.D.로 나타내고, 백신군과 PBS군의 유의적 차이는 * (P < 0.05)와 ** (P < 0.01)로 표시하였다 (G1: Mhp HID3138+rP97 재조합 단백질 함유 용균액, G2: Mhp HID3117+ rP97 재조합 단백질 함유 용균액, G3: rP97 재조합 단백질 함유 용균액, G4: 생리식염수 단독, G5: 상용화 백신 Mycoflex®) (DPV: Days post vaccination).
도 2는 rP97 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 일가백신을 3주령의 돼지에 접종 후 rP97 특이적인 항체가를 indirect ELISA로 평가한 결과이다. 모든 실험 데이터는 mean ± S.D.로 나타내고, 백신군과 PBS군의 유의적 차이는 ***(P < 0.001)로 표시하였다(G1: Mhp HID3138+rP97 재조합 단백질 함유 용균액, G2: Mhp HID3117+ rP97 재조합 단백질 함유 용균액, G3: rP97 재조합 단백질 함유 용균액, G4: 생리식염수 단독, G5: 상용화 백신 Mycoflex®) (DPV: Days post vaccination).
도 3a는 서열번호 1로 표시되는 rP97 재조합 단백질과 서열번호 13으로 표시되는 rP97m 재조합 단백질의 구조를 모식화하여 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 3b 는 서열번호 1로 표시되는 rP97 재조합 단백질과 서열번호 13으로 표시되는 rP97m 재조합 단백질의 서열을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 rP97m 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 이가백신 백신접종 전과 접종 후 5주까지 얻은 혈청을 이용하여 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 특이적인 항체에 대한 IDEXX M. hyo. ELISA를 실시한 결과를 나타낸 도이다. 모든 실험 데이터는 mean ± S.D.로 나타내고, 백신군과 PBS군과의 유의적 차이는 ** (P < 0.01)와 *** (P < 0.001)로 표시하였다 (G1: PBS 단독, G2: 상용화 백신 Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224+ rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224+ rP97m).
도 5는 rP97m 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 이가백신 백신접종 전과 접종 후 5주까지 얻은 혈청을 이용하여 rP97m 특이적인 항체가를 indirect ELISA로 평가한 결과를 나타낸 도이다. 모든 실험 데이터는 mean ± S.D.로 나타내고, 백신군과 PBS군과의 유의적 차이는 ***(P < 0.001)로 표시하였다 (G1: PBS 단독, G2: 상용화 백신 Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224+ rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224+ rP97m).
도 6은 rP97m 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 이가백신 접종 전과 접종 후 5주까지 얻은 혈청을 이용하여, 마이코플라즈마 하이오라이니스 특이적인 항체가를 마이코플라즈마 하이오라이니스 전체 세균을 항원으로 하여 indirect ELISA로 평가한 결과를 나타낸 도이다. 모든 실험 데이터는 mean ± S.D.로 나타내고, 백신군과 PBS군과의 유의적 차이는 ** (P < 0.01)로 표시하였다 (G1: PBS 단독, G2: 상용화 백신 Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224+ rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224+ rP97m).
도 7은 rP97m 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 이가백신 접종 후 2주차에 얻은 혈액에서 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 분리하여 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 불활화 균주로 자극 후, 인터페론 감마의 생성량을 평가한 결과이다. 모든 실험 데이터는 mean ± S.D.로 나타내고, 백신군과 상용 백신군과의 유의적 차이는 ** (P < 0.05)와 *** (P < 0.001)로 표시하였다 (G1: PBS 단독, G2: 상용화 백신 Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224+ rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224+ rP97m).
도 8은 rP97m 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 이가백신 접종 전과 접종 후 5주 동안 돼지 체중의 변화를 비교한 결과를 나타낸 도이다 (G1: PBS 단독, G2: 상용화 백신 Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224+ rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224+ rP97m).
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 재조합 단백질은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방을 위한 일가 백신에 포함되는 경우, 초기 감염과 부착에 관여하는 P97 에 의하여 마이코플라즈마 하이오뉴모니애에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응을 더욱 효과적으로 유도하고 상용 백신 대비 더욱 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 명세서에서는 이를 'rP97'로 명명한다.
또한 상기 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 재조합 단백질은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방을 위한 이가 백신에 포함되는 경우, 초기 감염과 부착에 관여하는 P97 에 의하여 마이코플라즈마 하이오뉴모니애에 및 마이코플라즈마 하이오라이니스에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응을 더욱 효과적으로 유도하고 상용 백신 대비 더욱 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 명세서에서는 이를 'rP97m'으로 명명한다.
상기 재조합 단백질 rP97과 rP97m은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 유래 P97 단백질과 E. coli heat-labile enterotoxin subunit B 유전자(eltb) 를 융합하여 제조될 수 있다. 보다 구체적으로 E. coli 의 eltb와 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 P97 유전자의 C-말단 반복 서열인 R1과 R1R2를 융합시키고, LTB와 융합된 P97 유전자인 ltbR1과 ltbR1R2를 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭하여 제조될 수 있다.
본 발명의 재조합 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또한 바람직하게는 적어도 99%의 상동성을 가지는 폴리펩타이드를 모두 포함할 수 있다. "상동성 (homology)"은 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열들 간 유사도의 측정을 의미한다. 이들 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 13의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환을 가질 수 있다. 점수로 매겨진 두 가지 서열들 간 상동성의 정도는 일치도의 퍼센트 (percentage of identities) 및/또는 서열의 치환을 보존하는 것에 근거한다.
본 발명의 재조합 단백질들은 백신의 제조에 사용되는 경우, 정제된 단백질 형태로 백신에 첨가되거나 대장균에서 발현하여 정제되지 않은 상태인 용균액 상태로 포함될 수 있다. 용균액 상태로 포함되는 경우 상기 용균액의 농도는 0.2 내지 0.3mg/ml 일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 1 또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 암호화하는 모든 가능한 서열을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어지거나 서열번호 2 또는 서열번호 14 의 염기서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또한 바람직하게는 적어도 99%의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드로, 서열번호 2 또는 서열번호 14의 생물학적 활성을 유지할 수 있는 모든 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질 rP97을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (M. hyopneumoniae ) 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물은 돼지에서 마이코플라즈마 하이오뉴모니애의 감염을 예방하고 초기 감염을 방지할 수 있는 일가 백신 조성물을 의미한다. 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질은 백신 조성물에 포함되어 P97 특이적인 항체를 형성하여 백신에 포함되어 있는 불활화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애에 의한 면역 반응 유도를 더욱 촉진할 수 있다.
또한 본 발명은 재조합 단백질 rP97m을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다.
상기 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물은 돼지에서 마이코플라즈마 하이오뉴모니애의 및 마이코플라즈마 하이오라이니스의 감염을 예방하고 초기 감염을 방지할 수 있는 이가 백신 조성물을 의미한다. 본 발명의 서열번호 13로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질은 백신 조성물에 포함되어 P97 특이적인 항체를 형성하여 백신에 포함되어 있는 불활화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스에 대한 면역 반응 유도를 더욱 촉진할 수 있다.
따라서 본 발명의 백신 조성물은 불활화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 또는 마이코플라즈마 하이오라이니스를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어 “불활화된” 은 사멸된 마이코플라즈마를 의미하는 것으로, 이러한 불활화된 마이코플라즈마는 구입하거나, 생균으로부터 당 분야에 널리 알려진 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에 포함되는 불활화된 마이코플라즈마는 본 발명의 재조합 단백질에 의해 그 면역 유도 효과가 증폭될 수 있는 통상의 표준 균주 또는 마이코플라즈마 감염 돼지 개체에서 분리된 항체를 형성하는 고병원성 고역가 균주를 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 재조합 단백질과 함께 접종 시 P97 중요 항원에 대한 항체를 효과적으로 유도할 수 있는 마이코플라즈마일 수 있다.
상기 백신 조성물의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 또는 마이코플라즈마 하이오라이니스는 1.0.x106 내지 1.0.x10 10CCU(Colour-changing units)/ml 의 농도로 백신에 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1.0.x107 내지 1.0.x1010CCU, 더욱 바람직하게는 1.0.x108 내지 1.0.x1010CCU 의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 상기 백신의 면역원성을 증진시켜 최소한의 투여로도 보호 면역을 유도할 수 있는 보조제 혼합물 및 하나 이상의 약제학적 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 '약제학적 또는 수의학적으로 허용되는' 이란 생리학적으로 허용되고 동물에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 사용하기에 적합한 담체로는 식염수, 인산염 완충 식염수, 최소 필수 배지(MEM) 또는 HEPES 완충액의 MEM을 포함하는 수성 매질을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 백신 조성물에 사용하기 위한 보조제 혼합물은 면역 반응을 증진시키고 대사가능한 오일을 포함한다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 근육, 피하, 경피, 정맥, 비강내, 복강내 또는 경구 경로로 투여될 수 있고 바람직하게는 근육내 또는 피하 경로로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 백신은 수중유 에멀젼 형태로서 불활성화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애와 마이코플라즈마 하이오라이니스, 대사 가능한 오일, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 및 아크릴산 중합체를 함유할 수 있다. 백신의 투여량은 투여 경로, 동물의 연령, 성별, 체중 및 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 rP97 또는 rP97m 재조합 단백질의 제조와 같이 본 발명에 특이적인 방법을 제외하고는 당해 기술 분야의 표준 방법에 의해 제조될 수 있다. 가령, 유기체는 완전 배지와 같은 배양 배지에서 증식시킬 수 있고, 유기체의 증식은 색 변화 단위(CCU)를 측정하는 것과 같은 표준 기술로 모니터하고 충분히 높은 역가가 성취된 경우 수거될 수 있다. 스톡은 제형화를 위해 백신에 포함되기 전에 통상적인 방법에 의해 추가로 농축되거나 동결건조시킬 수 있다.
또한 본 발명은 재조합 단백질 rP97 을 포함하는 마이코플라즈마 하이뉴모니애 감염 예방용 백신 보조제 또는 재조합 단백질 rP97m 을 포함하는 마이코플라즈마 하이뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 보조제를 제공한다.
상기 백신 보조제는 면역원성을 증진시키고 불활화 백신의 효능을 증진시키는 물질로, 불활화된 마이코플라즈마 하이뉴모니애 및/또는 마이코플라즈마 하이오라이니스를 포함하는 백신과 동시에, 또는 순차적으로 함께 접종되어 불활화된 마이코플라즈마 하이뉴모니애 및/또는 마이코플라즈마 하이오라이니스에 의한 개체에서의 면역 반응을 더욱 증폭할 수 있다.
또한 본 발명은 재조합 단백질 rP97 을 포함하는 마이코플라즈마 하이뉴모니애 감염 에 의한 질병 예방용 백신 조성물 또는 재조합 단백질 rP97m 을 포함하는 마이코플라즈마 하이뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의한 질병 예방용 백신 조성물을 제공한다.
상기 마이코플라즈마 하이뉴모니애 및/또는 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의한 질병은 상기 병원균이 개체에 감염됨으로써 발생하는 다양한 임상적 질병을 제한없이 포함할 수 있으나, 바람직하게는 돼지 호흡기 복합 증후군, 돼지 유행성 폐렴 또는 마이코플라즈마 하이오라이니스에 의한 관절염일 수 있다.
또한 본 발명은 1) 서열번호 1로 표시되는 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 2) 상기 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; 및 3) 상기 형질전환된 숙주에서 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 를 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 보조제의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 서열번호 13으로 표시되는 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조 하는 단계; 2) 상기 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; 및 3) 상기 형질전환된 숙주에서 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 를 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 보조제의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 재조합 단백질 rP97 을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물을 돼지에 접종하는 단계; 를 포함하는 돼지의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 재조합 단백질 rP97m 을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물을 돼지에 접종하는 단계; 를 포함하는 돼지의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방 방법을 제공한다.
상기 돼지는 마이코플라즈마에 감염될 가능성이 있는 개체를 제한없이 포함할 수 있으며, 이와 같은 감염 예방 방법은 다른 당 분야에 공지된 치료 방법 또는 예방 방법과 함께 병행하여 이용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "접종"은 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. rP97 단백질을 포함하는 일가 백신
1.1 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 불활화 균주의 준비
마이코플라즈마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae, Mhp) 균주를 국내의 양돈농가에서 분리하였으며, 단백질 패턴 분석을 통하여 분리된 균주 중 분리주인 Mhp HID3117과 HID3138이 표준 균주인 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (Mhp) J(ATCC 25934) 와 다른 균주임을 확인하였다. 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 균주인 HID3117과 HID3138을 Friis 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃의 조건에서 3주간 배양하였다. 배양된 균액은 pH 를 약 7.8까지 높여 불활화시켰다. Binary ethyleneimine (BEI) (U.S. Pat. No. 5,565,205)와 같은 불활화 시약을 이용하여 균의 불활화를 진행하였다. BEI는 배양액에 2-bromoethylaminehydrobromide (BEA) (SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 제조하였으며, 그 뒤, BEI는 중화시약인 sodium thiosulfate (SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA)를 넣어 중화시켰다. 불활화된 배양액 일부를 새 배지에 첨가하여 37℃에서 배양하였으며, 적어도 일주일 이상 배양하여 불활화가 잘 되었는지 확인하였다. 불활화된 배양액은 여과(filtration)나 원심분리법으로 농축하였다.
1.2 재조합 rP97 단백질의 생산
재조합 rP97 단백질은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애의 P97 단백질과 E.coli heat-labile enterotoxin subunit B 유전자(eltb)를 융합하여 제조하였다. 보다 구체적으로 국내분리주인 Mhp HID3138및 Mhp HID3117균주를 대상으로 Genomic DNA Extraction Mini kit(RBC Biosciences)를 이용하여 유전체 DNA를 추출하였다. 장독성원소 대장균의 유전체 DNA는 boiling 방법으로 추출하였다. E. coli heat-labile enterotoxin subunit B 유전자(eltb)와 P97 유전자의 C-말단 반복 서열 (R1과 R1R2)을 융합시키고, LTB와 융합된 P97 유전자인 ltbR1과 ltbR1R2를 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭하였다. PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 1에 기재된 바와 같다.
Figure PCTKR2017008851-appb-T000001
* Primer designed in this study. Other primer sequences were obtained from previous study(Conceicao et al., 2006)
4개의 염기서열(CACC)이 포함된 LTBF와 R1F 프라이머를 사용하여 증폭한 PCR 산물을 pENTR/SD 벡터(Gateway system, Invitrogen) 내로 삽입하였다. 그 다음 BamHI 제한효소가 포함된 LTBR과 R1F 프라이머를 사용하여 ltb와 R1을 융합하였다. 각각의 유전자 (R1, R1R2, ltbR1 및 ltbR1R2)는 제조사의 방법에 따라 pENTR/SD와 pDEST-42 vector(Gateway system, Invitrogen)내로 삽입하였고, 각 재조합 단백질을 발현하기 위해 전기천공법을 사용하여 E. coli BL21-competent cell 내로 형질전환 후에 100 μg/mL의 암피실린이 함유된 1L LB 배지에서 배양하였다. 배양액은 최종농도 1 mM이 되도록 isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)를 첨가하여 3시간동안 단백질 발현을 유도하였고 sonication 시킨 후 원심분리하여 재조합 단백질이 포함된 용균액을 얻었다. 발현된 단백질은 HisPur Ni-NTA affinity chromatography(Thermo Scientific)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 정제하였다. 제조된 본 발명의 재조합 단백질 rP97의 아미노산 서열은 서열번호 1에 기재하였으며, 서열번호 1의 아미노산을 암호화하는 염기서열은 서열번호 2에 기재하였다. 또한 사용된 프라이머 서열은 서열번호 3 내지 12 에 나타내었다.
1.3 백신의 제조
불활화되고 농축된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애를 부형제와 무균적으로 혼합하고, 표 2와 같이 멸균된 용기에서 희석해준 후 rP97을 함유하는 용균액과 30분 이상 4℃에서 혼합하여 백신을 제조하였다.
구분 일가백신
마이코플라즈마 하이오뉴모니애 2.5 x 108 CCU/dose(Mhp HID3138, HID3117)
rP97 total lysate300 ug/ml
adjuvant Montanide Gel: 20%Carbopol: 1mg/ml
PBS Make volume to 1ml
혼합 시간 30분 이상(4℃)
CCU = Colour-changing units (CCU)
1.4 항체가를 통한 백신 효과의 검증
1.4.1 실험군의 준비
백신후보주의 면역원성을 측정하기 위해 마이코플라즈마 하이오뉴모니애-free인 3주령의 돼지를 사용하였다. 임상 증상, 폐렴 병변 유무, 기타 혈청학적 검사 및 ELISA kit(IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME, USA)를 통해 실험에 사용된 모든 돼지의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 여부를 일정시간 간격으로 확인하였다. 모든 돼지는 각 군당 5마리씩 준비하였으며, 실험군은 실시예 1.1의 방법으로 불활화시킨 Mhp HID3138 및 Mhp HID3117 에 실시예 1.2에서 제조된 rP97 단백질 0.3 mg/ml, Montanide Gel, 카르보폴(Carbopol) 을 상기 표 2와 같은 비율로 혼합하여 제조한 백신을 각각 2 ml씩 접종하였다. 또한 비교군으로는 상용화 백신인 Mycoflex® (Boehringer Ingelheim Animal Health, St. Joseph, MO, USA)을 1 ml 접종한 군을 설정하였으며, 용균액 처리 비교군 (rLysate) 으로 실시예 1.2 에서 제조된 rP97 재조합 단백질을 단독으로 포함하는 용균액을 2 ml 접종하였다. 대조군은 PBS만을 2 ml 접종하였으며, 총 5개 군을 대상으로 실험을 수행하였다. 모든 군은 최초접종 후 21일 뒤에 추가 접종하였다. 혈청 샘플은 최초 백신접종 후 0, 21, 42, 63일차에 분리하여 실험에 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다. 각 실험군의 사항은 하기 표 3에 나타내었다.
실험군 투여 물질
G1 Mhp HID3138 및 rP97 재조합 단백질 함유 용균액
G2 Mhp HID3117 및 rP97 재조합 단백질 함유 용균액
G3 rP97 재조합 단백질 함유 용균액
G4 생리 식염수 단독
G5 상용화 백신 Mycoflex®
1.4.2. ELISA 를 이용한 항체가 분석
마이코플라즈마 하이오뉴모니애 특이적인 항체가를 IDEXX M. hyo. ELISA(IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME, USA)를 이용하여 측정하였다. rP97에 대한 특이적인 항체가는 발현 및 정제된 P97 단백질을 항원으로 사용하여 확인하였으며, 96-well Maxi-Sorp microtiter 플레이트 (NUNC, Thermo Scientific, Penfield, NY, USA)에 rP97(0.5 μg/well)을 코팅하고 4℃에서 16시간 동안 보관하였다. 플레이트를 0.05% Tween 20이 첨가된 PBS(PBST)를 사용하여 세척 후, 5% non-fat milk가 포함된 PBS(PBSM)로 blocking하였다. PBST로 세 번 세척 후, 100 μl의 혈청(1:100 PBSM)을 플레이트에 첨가하였다. PBST로 세 번 세척 후, 플레이트에 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated rabbit anti-porcine IgG(SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA)를 첨가한 후 배양하였다. PBST로 세척 후, o-phenylenediamine(OPD) substrate(SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 반응시켰다.
마이코플라즈마 하이오뉴모니애 특이적인 혈청학적 항체 수준 측정
다양한 백신 후보군에 의해 유도된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 특이적인 혈청학적 항체 수준 측정 결과를 GraphPad Prism 5 software(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)를 사용하여 통계적으로 분석하였다. 각 그룹간 혈청 내 항체가에 대한 차이는 Bonferroni post-test가 결합된 Two-way ANOVA를 사용하였으며, 유의적인 차이는 P < 0.05로 표시하고, 항체 수준 측정 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, PBS 처리 대조군은 접종 전 구간에서 음성을 나타냈다. 반면에, G1 및 G2 군은 접종 42일부터 실험종료일까지 양성을 보였다. 또한 백신 접종군은 상용 백신군인 MFlex (G5) 군보다 높은 항체 수준을 보였으며, G2 군은 접종 후 63일에 상용백신군(G5) 과 유사한 수준을 나타냈다. G1 및 G2 군은 접종 후 42일과 63일에 가장 높은 수준의 항체를 유도하였으며, PBS군과 비교하였을 때 통계적으로 높은 유의적인 값을 보였다.
rP97-특이적인 면역반응의 평가
rP97-특이적인 면역반응을 평가하기 위해, 백신 접종된 돼지의 혈청을 이용하여 indirect ELISA를 실시하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, G1 및 G2, G3 실험군들에서는 rP97-특이적인 항체 수준이 계속 증가하여 접종 후 42일에 가장 높은 값을 나타냈다. 특히, 접종 후 42일과 63일에 G1 및 G2 군, G3군들은 대조군에 비해 상당히 높은 수준의 항체가를 보였으며 (P < 0.001), 세 접종군들 사이의 유의적인 차이는 없었다. 접종 후 42일에 G1, G2 군 및 G3군들은 대조군에 비해 각각 19, 20, 16배 높은 수준의 항체가를 나타냈다. 한편 대조군(G4)과 상용 백신군(G5)은 rP97-특이적인 면역반응을 보이지 않았다. 이러한 결과는 부착 단백질인 P97에 대한 항체가 수준이 기존 상용화된 백신은 거의 없는데 반해 본 발명에서 제조된 백신은 rP97에 대한 높은 항체가를 나타냄을 보여주는 결과이며 상용 백신이 P97 특이적인 항체가를 생성하기에 부족하다는 기존의 보고와 유사하다. 따라서 본 발명에서 제조된 백신은 rP97에 대한 높은 항체가를 형성함으로써 종래 상용 백신에 비해 더 효과적이라는 것을 알 수 있다.
1.5 돼지에서의 불활화 백신의 유효능 평가
제조된 백신의 유효능을 평가하기 위해 마이코플라즈마가 상재해 있는 농장의 돼지를 대상으로 균을 분리하고 마이코플라즈마 특이적 PCR 및 ELISA 항체가를 조사하여 마이코플라즈마가 순환되고 있는 농장을 확인하였다. 실시예 1.4.1 에서 제조한 상기 백신 중 Mhp HID3138 과 rP97 를 포함하는 G1군은 1주와 4주령에 백신을 접종한 후 3주 동안 임상증상(기침, 우울, 비즙의 분비유무)을 관찰하였고, 3주 후에 각 군에서 임의로 선발한 5 두씩 도태하여 폐장의 육안병변지수를 산출하였다. 폐의 육안 병변을 이용한 평가방법은 호흡기 질병에 대한 폐의 육안 병변을 분석하는 것으로 전체 폐장을 100으로 하여 각각의 엽마다 부피를 근거로 각각의 점수를 배분한 후 각각의 폐장에 대한 육안 병변 여부를 분석하는 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
Figure PCTKR2017008851-appb-T000002
상기 표 4에서와 같이 백신을 접종하지 않은 대조군은 기침, 우울, 비강삼출물의 분비 등이 높은 양성율로 관찰되었으나 백신접종군은 거의 임상증상이 관찰되지 않았다. 육안적 폐병변지수도 백신을 접종하지 않은 대조군과 백신접종군 사이에 유의적인 차이가 나타났다. 따라서 본 발명에서 제조된 백신은 마이코플라즈마균이 상재된 농장에 접종 시 호흡기 증상의 완화 및 폐병변을 감소시키는 것으로 관찰되었다.
상기 결과를 종합하면, 본 발명의 재조합 rP97 이 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae) 에 대한 백신에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다. 또한 해당 재조합 단백질을 포함한 백신은 기존의 상용 백신과 달리 초기 감염에 중요한 부착인자인 P97을 포함함으로써, 뚜렷한 항체를 형성하여 백신 접종 유무를 유용하게 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 초기 감염에 중요한 부착인자인 P97 을 포함함으로써 종래 상용 백신의 기술적 한계점으로 지적되었던 자연 감염균의 전파 및 호흡 섬모 집락화를 방지할 수 있음을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 rP97는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애의 초기 발병 억제를 통해 마이코플라즈마에 대한 예방을 효과적으로 달성할 수 있다.
실시예 2. rP97m 을 포함하는 이가 백신
2.1 마이코플라즈마 균주 준비
마이코플라즈마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae ; Mhp) 와 마이코플라즈마 하이오라이니스 (Mycoplasma hyorhinis ; Mhr) 균주를 돼지 마이코플라즈마성 폐병변을 나타내는 폐에서 분리하여, Friis 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃의 조건에서 3일간 배양하였다. 단백질 패턴 분석을 통하여 분리된 균주 Mhp HID3134, HID3140, HID3138, 및 Mhr HID3224가 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스의 각각의 표준 균주와 비교하여 서로 다른 균주인 것을 확인하였다. 상기 균주들은 항체를 유도하는 고병원성 고역가 균주일 것으로 기대되었다. 배양된 균액은 pH를 약 7.8로 맞춘 후 Binary ethyleneimine(BEI) (U.S. Pat. No. 5,565,205)와 같은 불활화 시약을 이용하여 균의 불활화를 진행하였다. BEI는 배양액에 L-bromoethylaminehydrobromide(BEA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 제조한다. 그 후 중화 시약인 sodium thiosulfate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 넣어 중화시키고 불활화된 배양액 일부를 새 배지에 첨가하여 37℃에서 배양하여 불활화가 되었는지 확인하였다. 배양은 최소 일주일 이상 수행하였으며, 불활화된 배양액은 원심분리법으로 농축하였다.
2.2 rP97m 단백질의 제작
재조합 rP97m 단백질은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애의 P97 단백질과 E.coli heat-labile enterotoxin subunit B (eltb) 를 융합하여 제조하였다. 실시예 1의 rP97 은 Mhp 로부터 가공없이 얻은 후 LTB 와 융합하였으나, rP97m은 P97에서 핵심 부위인 R1, R2 의 염기서열을 이용하여 R1, R2 만 따로 만들어 재조합한 후 LTB와 융합하여 제조하였다. 보다 구체적으로 rP97m 단백질의 재조합은 pET-30a(+) (Novagen, USA) 발현시스템을 사용하여 수행하였다. E. coli BL21 codon-plus RIL competent cell (Novagen)에 발현 플라스미드를 열충격을 이용하여 삽입시키고, 50 μg/mL 카나마이신 (Kanamicin)이 첨가된 1 L의 Luria-Bertani (LB) 배지에서 배양하였다. 그 후, 1 mM의 isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 이용하여 단백질 발현을 3시간 동안 유도한 다음, sonication 시키고, 원심분리하여 재조합 단백질이 포함된 용균액을 얻었다. Ni-NTA 컬럼을 사용하여 용균액으로부터 재조합 단백질을 정제 및 농축하였다. 제조된 본 발명의 재조합 단백질 rP97m의 아미노산 서열은 서열번호 13에 기재하였으며, 서열번호 13의 아미노산을 암호화하는 염기서열은 서열번호 14에 기재하였다.
또한 재조합 단백질 rP97m과 실시예 1.2 에서 제조한 재조합 rP97 단백질의 유사성을 확인하기 위하여 제조된 rP97과 rP97m의 서열 구조 및 상동성을 비교하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3의 a 에 나타낸 바와 같이, rP97과 rP97m 은 상호 상이한 구조를 가지고 있으며, 특히 rP97m은 R1 및 R2 만을 따로 합성하여 필수적인 부위만을 구성으로 하는 것을 확인하였다. 도 3의 b에 나타낸 바와 같이 양 서열은 64.13%의 상동성을 나타내어 상호 상동성이 매우 낮은 서열인 것으로 나타났다.
2.3 백신의 제조
불활화되고 농축된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스를 부형제와 무균적으로 혼합하고, 표 5와 같이 멸균된 용기에서 희석한 후 24시간 이상 혼합하여 백신을 제조하였다.
구분 이가백신
마이코플라즈마 하이오뉴모니애 1.0 x 109 CCU/dose(Mhp HID3134, HID3140, 또는 HID3138)
마이코플라즈마 하이오라이니스 1.0 x 109 CCU/dose(Mhr HID3224)
rP97m purified protein 100 ug/dose
adjuvant IMS1313: 50%
PBS Make volume to 2ml
혼합 시간 24시간 이상(4℃)
CCU = Colour-changing units (CCU)
2.4 백신 효과의 검증
2.4.1 실험군의 준비
백신후보주의 면역원성을 측정하기 위해 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스에 감염되지 않은 3주령의 돼지를 사용하여 동물 실험을 수행하였다. 실험에 사용된 돼지는 임상 증상, 폐렴 병변 유무, 기타 혈청학적 검사 및 ELISA kit(IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME, USA)를 사용하여 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 유무를 주기적으로 확인하였다. 모든 돼지는 각 군당 4마리씩 준비하였으며, 실험군은 실시예 2.1의 방법으로 불활화시킨 Mhp HID3134, Mhp HID3140, Mhp HID3138 와 Mhr HID3224및 rP97m을 상기 표 5와 같은 비율로 혼합하여 제조한 백신을 각각 2ml 씩 1회 투여하였으며, 샘플은 접종 4일 전, 접종 후 1, 2, 4, 5 주에 채취하였다. 각 실험군의 사항은 하기 표 6에 나타내었다. 비교군으로는 상용화 백신인 Respisure®(Zoetis, USA) 를 처리한 군을 설정하였다. 백신 접종 후 혈액을 채취하여 혈청을 분리 후 -20℃에 보관하여 실험에 사용하였다.
실험군 투여 물질
GROUP 1(G1) PBS 단독
GROUP 2 (G2) 상용화 백신 Respisure®
GROUP 3 (G3) Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m
GROUP 4 (G4) Mhp HID3140 + Mhr HID3224+ rP97m
GROUP 5 (G5) Mhp HID3138 + Mhr HID3224+ rP97m
2.4.2 ELISA 를 이용한 항체가 분석
마이코플라즈마 하이오뉴모니애 특이 항체가는 IDEXX M. hyo+.ELISA kit(IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME, USA)를 사용하였다. P97m 특이 항체가는 정제된 rP97m 단백질을 항원으로 코팅하여 측정하였으며, 마이코플라즈마 하이오라이니스 특이 항체가는 마이코플라즈마 하이오라이니스 whole bacterin을 항원으로 코팅하여 측정하였다. 96-well Maxi-Sorp microtiter 플레이트 (NUNC, Thermo Scientific, Penfield, NY, USA)에 각각의 항원(rP97m: 0.2 μg/well, Mhr Whole bacterin: 25ng/well)을 코팅하고 4℃에서 16시간 또는 37℃에서 2시간 동안 보관하였다. 플레이트를 0.05% Tween 20이 첨가된 PBS-T를 사용하여 3회 세척 후, 1% BSA in PBS로 37℃에서 2시간 동안 차단하였다. PBS-T로 3번 세척 후, 100 μl의 혈청 (1:100 희석, 0.1% BSA in PBS)을 플레이트에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. PBS-T로 3번 세척 후, palte에 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-swine IgG (Abcam, UK)를 첨가한 후 1시간동안 37℃에서 반응시켰다. 이후 PBS-T로 4회 세척하고, BioFX® TMB One Component HRP Microwell Substrate(SurModics®, USA) 을 넣고 5분간 상온에서 암반응 후 정지 용액을 넣어 반응을 종결시켰다. 450nm에서 흡광도를 측정하여 결과를 확인하였다.
마이코플라즈마 하이오뉴모니애 특이적인 혈청학적 항체 수준 측정
접종하기 전 모든 돼지는 혈청학적으로 음성을 확인한 후 실험을 진행하였다. 돼지 마이코플라즈마 이가 백신에 의해 유도된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 특이적인 혈청학적 항체 수준을 GraphPad Prism 5 software(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)를 사용하여 통계적으로 분석하였다. 각 그룹간 혈청 내 항체가에 대한 차이는 Bonferroni post-test가 결합된 Two-way ANOVA를 사용하였으며, 유의적인 차이는 P < 0.05로 표시하고, 항체 수준 측정 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, PBS군 (G1)은 접종 전 구간에서 음성을 나타냈다. 반면에 백신을 접종한 G3, G4, G5에서는 백신접종 2주차부터 실험 종료일까지 양성을 보여 체액성 면역 반응이 형성되었음을 확인하였다. 특히 백신접종 후 2주후부터 5주까지 항체가가 폭발적으로 증가하여 실험 전 구간에 걸쳐 상용 백신군(G2)보다 높은 항체 수준을 보였으며, PBS군(G1)과 비교하였을 때 통계적으로 높은 유의적인 값을 보였다. 이러한 결과는 제조된 rP97m 단백질이 포함된 마이코플라즈마 이가백신이 상용화 백신보다 항체를 더 잘 유도할 수 있으며, 이는 rP97m 단백질이 균주에 의한 항체 형성 반응을 더욱 촉진할 수 있음을 보여주는 결과이다.
rP97 특이적인 혈청학적 항체 수준 측정
돼지마이코플라즈마 이가백신을 사용한 실험에서 다양한 백신 후보군에 의해 유도된 rP97m-특이적인 면역반응을 평가하기 위해, 백신접종된 돼지의 혈청을 이용하여 indirect ELISA를 실시하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 백신 접종군 G3, G4, G5에 대한 rP97m-특이적인 항체 수준은 접종 14일부터 증가하기 시작하였고, PBS군(G1)과 비교하였을 때 통계적으로 높은 유의적인 값을 보였다. 반면 상용 백신군(G2)은 rP97m 특이적인 항체가 검출되지 않았다. 이러한 결과는 상용백신에는 초기방어에 중요한 P97 단백질이 함유되어 있지 않음을 보여주는 예이다.
마이코플라즈마 하이오라이니스 특이적인 혈청학적 항체 수준 측정
돼지마이코플라즈마 이가백신에는 마이코플라즈마 하이오라이니스가 함유되어 있다. 따라서 마이코플라즈마 하이오라이니스에 대한 항체 수준을 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 마찬가지로 접종하기 전 모든 돼지는 혈청학적으로 음성을 확인한 후 실험을 진행하였다
도 6에 나타낸 바와 같이, PBS군(G1)은 접종 전 구간에서 음성을 나타냈다. 반면 이가 백신을 접종한 군 G3, G4, G5에서는 4주 후부터 실험종료일까지 양성을 보였으며 Group 4 처리군은 PBS군과 비교하였을 때 통계적으로 높은 유의적인 값을 보여 체액성 면역반응이 효과적으로 생성되었음을 알 수 있었다. 한편 상용 백신군(G2)에서는 마이코플라즈마 하이오라이니스가 포함되어 있지 않아 마이코플라즈마 하이오라이니스 특이적인 항체가 검출되지 않았으며, 이는 접종 후 5주까지 음성반응만을 나타내었다.
2.4.3 이가 백신 접종에 의한 세포성 면역 반응 확인
돼지 마이코플라즈마 이가 백신의 세포성 면역능을 평가하기 위하여 항체가 형성되기 시작하는 접종 2주 후의 돼지 혈액 샘플로부터 PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 분리하였다. 마이코플라즈마 하이오뉴모니애로 자극한 후 생성되는 INF-γ의 생성량을 Novex 사의 Swine INF-γ ELISA Kit를 사용하여 평가하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 상용 백신군은 낮은 세포성 면역 반응만을 나타내었으나, 실시예 2에서 제조된 이가 백신을 접종한 G3, G4, G5은 모두 통계적으로 유의하게 상용 백신군 G2보다 높은 INF-γ 를 생산하였다. 이를 통해 제조된 이가 백신이 상용 백신군 대비 더욱 우수한 세포성 면역 반응을 유도할 수 있음을 확인하였다.
2.4.4 이가 백신 접종에 의한 부작용 확인
돼지 마이코플라즈마 이가 백신의 부작용을 평가하기 위하여 실험군의 체중을 측정하여 비교하였다. 일반적으로 백신 접종에 따른 부작용이 발생할 경우 작게는 염증, 피부 괴사등의 증상이 발생하며, 발작등을 일으키고 심하면 폐사에 까지 이르게 되어 농장에서 손실을 입게 된다. 아울러 백신접종 후의 부작용이 나타나면 사료섭취율이 급속히 떨어져 증체율이 감소하게 된다. 제조된 돼지 마이코플라즈마 이가 백신이 배신 접종에 따른 부작용을 유발하는지 여부를 평가하기 위하여 대조군(G1), 상용백신군(G2) 및 백신 접종군(G3, 4, 5) 에서 돼지의 체중을 접종 후 5주간 측정하여 비교하고 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이 백신 접종군(G3, 4, 5)과 대조군(G1), 상용백신군(G2)간의 체중 차이는 나타나지 않았으며, 이를 통해 rP97m 을 포함하는 제조된 마이코플라즈마 이가 백신이 돼지에게 미치는 부작용이 없고 안전한 백신으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 통해, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 재조합 단백질을 포함하는 이가 백신은 높은 수준의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 특이적인 체액성 면역 반응과 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 특이적인 세포성 면역 반응을 유도할 수 있어 상용 백신 대비 더욱 우수한 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.

Claims (20)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질.
  2. 제1항의 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항의 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 불활화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (M. hyopneumoniae) 를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 마이코플라즈마 하이오뉴모니애는 1.0.x106 내지 1.0.x10 10CCU(Colour-changing units)/ml 의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물.
  7. 제1항의 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 보조제.
  8. 제1항의 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염에 의한 질병 예방용 백신 조성물.
  9. 1) 서열번호 1로 표시되는 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;
    2) 상기 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; 및
    3) 상기 형질전환된 숙주에서 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 를 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 보조제의 제조 방법.
  10. 돼지에 제8항의 백신 조성물을 접종하는 단계; 를 포함하는 돼지의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방 방법.
  11. 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis ) 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질.
  12. 제11항의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  14. 제11항의 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 불활화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (M. hyopneumoniae) 및 불활화된 마이코플라즈마 하이오라이니스를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 불활화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 또는 마이코플라즈마 하이오라이니스는 1.0.x106 내지 1.0.x10 10CCU(Colour-changing units)/ml 의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물.
  17. 제11항의 재조합 단백질을 포함하는, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 보조제.
  18. 제11항의 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의한 질병 예방용 백신 조성물.
  19. 1) 서열번호 13으로 표시되는 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;
    2) 상기 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; 및
    3) 상기 형질전환된 숙주에서 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 를 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 보조제의 제조 방법.
  20. 돼지에 제14항의 백신 조성물을 접종하는 단계; 를 포함하는 돼지의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방 방법.
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