KR20180018460A - 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 감염 예방용 백신 조성물 - Google Patents
재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 감염 예방용 백신 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발병은 돼지 마이코플라즈마 감염 예방용 백신을 제조하기 위한 백신 제조용 재조합 단백질 및 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 백신 제조용 재조합 단백질들은 돼지 마이코플라즈마 감염 예방용 백신 조성물에 첨가되는 경우, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애와 돼지 마이코플라즈마 하이오라이니스 균주에 대한 면역반응과 P97 단백질에 대한 면역반응을 증가시킴으로써 기존 상용 백신보다 우수한 방어 효과를 나타낼 수 있다. 따라서 본 발명의 백신 제조용 재조합 단백질 및 이를 이용한 백신 조성물은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애와 마이코플라즈마 하이오라이니스의 감염에 의해 발생하는 질병, 특히 돼지 마이코플라즈마성 폐렴과 돼지 마이코플라즈마성 관절염을 효과적으로 예방할 수 있다.
Description
본 발병은 돼지 마이코플라즈마 감염 예방용 백신을 제조하기 위한 백신 제조용 재조합 단백질 및 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
마이코플라즈마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae)는 돼지호흡기복합증후군(PRDC, Porcine respiratory disease complex) 및 돼지유행성폐렴(EP, enzootic pneumonia)과 관련된 호흡기병원체이며, 호흡기 섬모세포에 집락화를 시작으로 감염을 일으켜 돼지 마이코플라즈마성 폐렴의 원인균으로 주목받고 있다.
마이코플라즈마 하이오뉴모니애는 단일 감염되었을 때는 건성 기침 등의 증상만을 나타내나, 다른 호흡기 병원체와 복합 감염되는 경우 심각한 호흡기 증상을 유발하고 대식세포의 활성을 떨어뜨리고, 다른 병원체의 침입을 방어하는 1차 방어 기능을 상실하게 하는 등 추가 병원균 감염의 위험성을 더욱 증가시킨다.
마이코플라즈마 하이오라이니스 (Mycoplasma hyorhinis)는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애에 뒤이어 돼지의 호흡기 전염병에서 새로운 역할을 하는 병원체로 대두되고 있으며, 돼지 생식기호흡기증 바이러스와 혼합 감염으로 병증을 더욱 악화시키는 것으로 보고되어 있다. 또한 마이코플라즈마 하이오라이니스는 단독으로도 마이코플라즈마 하이오뉴모니애에서 발현되는 마이코플라즈마성 병변을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이는 돼지에서 중이염의 주요 병원체로도 작용할 수 있고 유스타키오관염증의 원인체로도 알려져 있어, 그 위험성이 매우 높은 병원균이다.
이처럼 양돈 농가에 큰 피해를 유발하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염을 막기 위해 현재 불활화 형태의 백신이 상용화되어 사용되고 있다. 이러한 불활화 백신은 현재 돼지 마이코플라즈마성 폐렴에 이용될 수 있는 유일한 백신이다. 그러나 상용화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 불활화 백신은 대부분 접종 후 항체를 형성하지 못하고, 임상 증상은 완화시킬 수 있으나 자연 감염균의 전파 및 호흡기 섬모 집락화를 예방할 수 없다는 점에서 기술적 한계점을 나타내고 있다(Maes, et al., 2008). 따라서 이러한 문제점을 해결할 수 있는 효과적인 백신 개발의 필요성이 중요하게 인식되고 있다.
마이코플라즈마 하이오뉴모니애의 감염은 병원체가 호흡기 상피세포의 섬모에 부착하면서 개시된다. 부착인자 (Adhesin) P97은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애의 막 표면 단백질로 면역원성이 높은 항원으로 알려져 있다(Klinkert, et al., 1985, Zhang, et al., 1995, Minion, et al., 2000). P97의 C말단에는 반복되는 구간으로 구성된 R1과 R2 부위가 존재하며, 그 중 R1 부위는 숙주 호흡기 섬모의 부착부위(AAKPV/E)에 결합한다. 결합된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애는 성장에 필요한 아미노산을 숙주로부터 얻을 수 있으며, 상처난 조직에 침입하기 위하여 숙주의 분자들을 다양하게 배열할 수 있게 된다. 한편, 숙주는 항체를 생산하여 돼지 섬모에 마이코플라즈마 하이오뉴모니애가 부착하는 것을 방해하거나 부착된 병원체의 성장을 저해할 수 있다. 그러나, 선행 연구에 따르면 기존의 상용 백신은 P97에 대한 항체를 유도할 수 없는 것으로 보고된 바 있다(Conceicao, et al., 2006, Okamba, et al., 2010).
따라서 돼지 마이코플라즈마 감염, 특히 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스의 자연 감염을 예방하고 효과적으로 항체를 형성할 수 있도록 하는 새로운 백신에 대한 필요성이 있다.
이에 본 발명자들은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스를 효과적으로 예방하기 위한 백신을 개발하던 중 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 유래의 부착단백질인 P97 단백질을 이용한 재조합 P97 단백질을 포함하는 백신이 기존의 상용 백신 대비 현저히 우수한 면역 반응을 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염에 의한 질병 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 보조제를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염에 의한 질병 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 서열번호 1로 표시되는 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 2) 상기 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; 및 3) 상기 형질전환된 숙주에서 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 를 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 보조제의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 돼지에 상기 백신 조성물을 접종하는 단계; 를 포함하는 돼지의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 보조제를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의한 질병 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 서열번호 13으로 표시되는 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 2) 상기 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; 및 3) 상기 형질전환된 숙주에서 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 를 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 보조제의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 돼지에 상기 백신 조성물을 접종하는 단계; 를 포함하는 돼지의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방 방법을 제공한다.
본 발명의 백신 제조용 재조합 단백질들은 돼지 마이코플라즈마 감염 예방용 백신 조성물에 첨가되는 경우, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애와 돼지 마이코플라즈마 하이오라이니스 균주에 대한 면역반응과 P97 단백질에 대한 면역반응을 증가시킴으로써 기존 상용 백신보다 우수한 방어 효과를 나타낼 수 있다. 따라서 본 발명의 백신 제조용 재조합 단백질 및 이를 이용한 백신 조성물은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애와 마이코플라즈마 하이오라이니스의 감염에 의해 발생하는 질병, 특히 돼지 마이코플라즈마성 폐렴과 돼지 마이코플라즈마성 관절염을 효과적으로 예방할 수 있다.
도 1은 rP97 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 일가백신을 3주령의 돼지에 접종 후 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 특이적인 항체를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 모든 실험 데이터는 mean ± S.D.로 나타내고, 백신군과 PBS군의 유의적 차이는 * (P < 0.05)와 ** (P < 0.01)로 표시하였다 (G1: Mhp HID3138+rP97 재조합 단백질 함유 용균액, G2: Mhp HID3117+ rP97 재조합 단백질 함유 용균액, G3: rP97 재조합 단백질 함유 용균액, G4: 생리식염수 단독, G5: 상용화 백신 Mycoflex®) (DPV: Days post vaccination).
도 2는 rP97 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 일가백신을 3주령의 돼지에 접종 후 rP97 특이적인 항체가를 indirect ELISA로 평가한 결과이다. 모든 실험 데이터는 mean ± S.D.로 나타내고, 백신군과 PBS군의 유의적 차이는 ***(P < 0.001)로 표시하였다(G1: Mhp HID3138+rP97 재조합 단백질 함유 용균액, G2: Mhp HID3117+ rP97 재조합 단백질 함유 용균액, G3: rP97 재조합 단백질 함유 용균액, G4: 생리식염수 단독, G5: 상용화 백신 Mycoflex®) (DPV: Days post vaccination).
도 3a는 서열번호 1로 표시되는 rP97 재조합 단백질과 서열번호 13으로 표시되는 rP97m 재조합 단백질의 구조를 모식화하여 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 3b 는 서열번호 1로 표시되는 rP97 재조합 단백질과 서열번호 13으로 표시되는 rP97m 재조합 단백질의 서열을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 rP97m 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 이가백신 백신접종 전과 접종 후 5주까지 얻은 혈청을 이용하여 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 특이적인 항체에 대한 IDEXX M. hyo. ELISA를 실시한 결과를 나타낸 도이다. 모든 실험 데이터는 mean ± S.D.로 나타내고, 백신군과 PBS군과의 유의적 차이는 ** (P < 0.01)와 *** (P < 0.001)로 표시하였다 (G1: PBS 단독, G2: 상용화 백신 Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224+ rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224+ rP97m).
도 5는 rP97m 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 이가백신 백신접종 전과 접종 후 5주까지 얻은 혈청을 이용하여 rP97m 특이적인 항체가를 indirect ELISA로 평가한 결과를 나타낸 도이다. 모든 실험 데이터는 mean ± S.D.로 나타내고, 백신군과 PBS군과의 유의적 차이는 ***(P < 0.001)로 표시하였다 (G1: PBS 단독, G2: 상용화 백신 Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224+ rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224+ rP97m).
도 6은 rP97m 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 이가백신 접종 전과 접종 후 5주까지 얻은 혈청을 이용하여, 마이코플라즈마 하이오라이니스 특이적인 항체가를 마이코플라즈마 하이오라이니스 전체 세균을 항원으로 하여 indirect ELISA로 평가한 결과를 나타낸 도이다. 모든 실험 데이터는 mean ± S.D.로 나타내고, 백신군과 PBS군과의 유의적 차이는 ** (P < 0.01)로 표시하였다 (G1: PBS 단독, G2: 상용화 백신 Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224+ rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224+ rP97m).
도 7은 rP97m 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 이가백신 접종 후 2주차에 얻은 혈액에서 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 분리하여 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 불활화 균주로 자극 후, 인터페론 감마의 생성량을 평가한 결과이다. 모든 실험 데이터는 mean ± S.D.로 나타내고, 백신군과 상용 백신군과의 유의적 차이는 ** (P < 0.05)와 *** (P < 0.001)로 표시하였다 (G1: PBS 단독, G2: 상용화 백신 Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224+ rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224+ rP97m).
도 8은 rP97m 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 이가백신 접종 전과 접종 후 5주 동안 돼지 체중의 변화를 비교한 결과를 나타낸 도이다 (G1: PBS 단독, G2: 상용화 백신 Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224+ rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224+ rP97m).
도 2는 rP97 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 일가백신을 3주령의 돼지에 접종 후 rP97 특이적인 항체가를 indirect ELISA로 평가한 결과이다. 모든 실험 데이터는 mean ± S.D.로 나타내고, 백신군과 PBS군의 유의적 차이는 ***(P < 0.001)로 표시하였다(G1: Mhp HID3138+rP97 재조합 단백질 함유 용균액, G2: Mhp HID3117+ rP97 재조합 단백질 함유 용균액, G3: rP97 재조합 단백질 함유 용균액, G4: 생리식염수 단독, G5: 상용화 백신 Mycoflex®) (DPV: Days post vaccination).
도 3a는 서열번호 1로 표시되는 rP97 재조합 단백질과 서열번호 13으로 표시되는 rP97m 재조합 단백질의 구조를 모식화하여 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 3b 는 서열번호 1로 표시되는 rP97 재조합 단백질과 서열번호 13으로 표시되는 rP97m 재조합 단백질의 서열을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 rP97m 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 이가백신 백신접종 전과 접종 후 5주까지 얻은 혈청을 이용하여 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 특이적인 항체에 대한 IDEXX M. hyo. ELISA를 실시한 결과를 나타낸 도이다. 모든 실험 데이터는 mean ± S.D.로 나타내고, 백신군과 PBS군과의 유의적 차이는 ** (P < 0.01)와 *** (P < 0.001)로 표시하였다 (G1: PBS 단독, G2: 상용화 백신 Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224+ rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224+ rP97m).
도 5는 rP97m 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 이가백신 백신접종 전과 접종 후 5주까지 얻은 혈청을 이용하여 rP97m 특이적인 항체가를 indirect ELISA로 평가한 결과를 나타낸 도이다. 모든 실험 데이터는 mean ± S.D.로 나타내고, 백신군과 PBS군과의 유의적 차이는 ***(P < 0.001)로 표시하였다 (G1: PBS 단독, G2: 상용화 백신 Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224+ rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224+ rP97m).
도 6은 rP97m 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 이가백신 접종 전과 접종 후 5주까지 얻은 혈청을 이용하여, 마이코플라즈마 하이오라이니스 특이적인 항체가를 마이코플라즈마 하이오라이니스 전체 세균을 항원으로 하여 indirect ELISA로 평가한 결과를 나타낸 도이다. 모든 실험 데이터는 mean ± S.D.로 나타내고, 백신군과 PBS군과의 유의적 차이는 ** (P < 0.01)로 표시하였다 (G1: PBS 단독, G2: 상용화 백신 Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224+ rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224+ rP97m).
도 7은 rP97m 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 이가백신 접종 후 2주차에 얻은 혈액에서 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 분리하여 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 불활화 균주로 자극 후, 인터페론 감마의 생성량을 평가한 결과이다. 모든 실험 데이터는 mean ± S.D.로 나타내고, 백신군과 상용 백신군과의 유의적 차이는 ** (P < 0.05)와 *** (P < 0.001)로 표시하였다 (G1: PBS 단독, G2: 상용화 백신 Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224+ rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224+ rP97m).
도 8은 rP97m 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 이가백신 접종 전과 접종 후 5주 동안 돼지 체중의 변화를 비교한 결과를 나타낸 도이다 (G1: PBS 단독, G2: 상용화 백신 Respisure®, G3: Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m, G4: Mhp HID3140 + Mhr HID3224+ rP97m, G5: Mhp HID3138 + Mhr HID3224+ rP97m).
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 재조합 단백질은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방을 위한 일가 백신에 포함되는 경우, 초기 감염과 부착에 관여하는 P97 에 의하여 마이코플라즈마 하이오뉴모니애에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응을 더욱 효과적으로 유도하고 상용 백신 대비 더욱 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 명세서에서는 이를 'rP97'로 명명한다.
또한 상기 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 재조합 단백질은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방을 위한 이가 백신에 포함되는 경우, 초기 감염과 부착에 관여하는 P97 에 의하여 마이코플라즈마 하이오뉴모니애에 및 마이코플라즈마 하이오라이니스에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응을 더욱 효과적으로 유도하고 상용 백신 대비 더욱 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 명세서에서는 이를 'rP97m'으로 명명한다.
상기 재조합 단백질 rP97과 rP97m은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 유래 P97 단백질과 E. coli heat-labile enterotoxin subunit B 유전자(eltb) 를 융합하여 제조될 수 있다. 보다 구체적으로 E. coli 의 eltb와 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 P97 유전자의 C-말단 반복 서열인 R1과 R1R2를 융합시키고, LTB와 융합된 P97 유전자인 ltbR1과 ltbR1R2를 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭하여 제조될 수 있다.
본 발명의 재조합 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또한 바람직하게는 적어도 99%의 상동성을 가지는 폴리펩타이드를 모두 포함할 수 있다. "상동성 (homology)"은 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열들 간 유사도의 측정을 의미한다. 이들 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 13의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환을 가질 수 있다. 점수로 매겨진 두 가지 서열들 간 상동성의 정도는 일치도의 퍼센트 (percentage of identities) 및/또는 서열의 치환을 보존하는 것에 근거한다.
본 발명의 재조합 단백질들은 백신의 제조에 사용되는 경우, 정제된 단백질 형태로 백신에 첨가되거나 대장균에서 발현하여 정제되지 않은 상태인 용균액 상태로 포함될 수 있다. 용균액 상태로 포함되는 경우 상기 용균액의 농도는 0.2 내지 0.3mg/ml 일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 1 또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 암호화하는 모든 가능한 서열을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어지거나 서열번호 2 또는 서열번호 14 의 염기서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또한 바람직하게는 적어도 99%의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드로, 서열번호 2 또는 서열번호 14의 생물학적 활성을 유지할 수 있는 모든 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질 rP97을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (M. hyopneumoniae ) 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물은 돼지에서 마이코플라즈마 하이오뉴모니애의 감염을 예방하고 초기 감염을 방지할 수 있는 일가 백신 조성물을 의미한다. 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질은 백신 조성물에 포함되어 P97 특이적인 항체를 형성하여 백신에 포함되어 있는 불활화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애에 의한 면역 반응 유도를 더욱 촉진할 수 있다.
또한 본 발명은 재조합 단백질 rP97m을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다.
상기 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물은 돼지에서 마이코플라즈마 하이오뉴모니애의 및 마이코플라즈마 하이오라이니스의 감염을 예방하고 초기 감염을 방지할 수 있는 이가 백신 조성물을 의미한다. 본 발명의 서열번호 13로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질은 백신 조성물에 포함되어 P97 특이적인 항체를 형성하여 백신에 포함되어 있는 불활화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스에 대한 면역 반응 유도를 더욱 촉진할 수 있다.
따라서 본 발명의 백신 조성물은 불활화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 또는 마이코플라즈마 하이오라이니스를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어 “불활화된” 은 사멸된 마이코플라즈마를 의미하는 것으로, 이러한 불활화된 마이코플라즈마는 구입하거나, 생균으로부터 당 분야에 널리 알려진 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에 포함되는 불활화된 마이코플라즈마는 본 발명의 재조합 단백질에 의해 그 면역 유도 효과가 증폭될 수 있는 통상의 표준 균주 또는 마이코플라즈마 감염 돼지 개체에서 분리된 항체를 형성하는 고병원성 고역가 균주를 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 재조합 단백질과 함께 접종 시 P97 중요 항원에 대한 항체를 효과적으로 유도할 수 있는 마이코플라즈마일 수 있다.
상기 백신 조성물의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 또는 마이코플라즈마 하이오라이니스는 1.0.x106 내지 1.0.x10 10CCU(Colour-changing units)/ml 의 농도로 백신에 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1.0.x107 내지 1.0.x1010CCU, 더욱 바람직하게는 1.0.x108 내지 1.0.x1010CCU 의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 상기 백신의 면역원성을 증진시켜 최소한의 투여로도 보호 면역을 유도할 수 있는 보조제 혼합물 및 하나 이상의 약제학적 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 '약제학적 또는 수의학적으로 허용되는' 이란 생리학적으로 허용되고 동물에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 사용하기에 적합한 담체로는 식염수, 인산염 완충 식염수, 최소 필수 배지(MEM) 또는 HEPES 완충액의 MEM을 포함하는 수성 매질을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 백신 조성물에 사용하기 위한 보조제 혼합물은 면역 반응을 증진시키고 대사가능한 오일을 포함한다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 근육, 피하, 경피, 정맥, 비강내, 복강내 또는 경구 경로로 투여될 수 있고 바람직하게는 근육내 또는 피하 경로로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 백신은 수중유 에멀젼 형태로서 불활성화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애와 마이코플라즈마 하이오라이니스, 대사 가능한 오일, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 및 아크릴산 중합체를 함유할 수 있다. 백신의 투여량은 투여 경로, 동물의 연령, 성별, 체중 및 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 rP97 또는 rP97m 재조합 단백질의 제조와 같이 본 발명에 특이적인 방법을 제외하고는 당해 기술 분야의 표준 방법에 의해 제조될 수 있다. 가령, 유기체는 완전 배지와 같은 배양 배지에서 증식시킬 수 있고, 유기체의 증식은 색 변화 단위(CCU)를 측정하는 것과 같은 표준 기술로 모니터하고 충분히 높은 역가가 성취된 경우 수거될 수 있다. 스톡은 제형화를 위해 백신에 포함되기 전에 통상적인 방법에 의해 추가로 농축되거나 동결건조시킬 수 있다.
또한 본 발명은 재조합 단백질 rP97 을 포함하는 마이코플라즈마 하이뉴모니애 감염 예방용 백신 보조제 또는 재조합 단백질 rP97m 을 포함하는 마이코플라즈마 하이뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 보조제를 제공한다.
상기 백신 보조제는 면역원성을 증진시키고 불활화 백신의 효능을 증진시키는 물질로, 불활화된 마이코플라즈마 하이뉴모니애 및/또는 마이코플라즈마 하이오라이니스를 포함하는 백신과 동시에, 또는 순차적으로 함께 접종되어 불활화된 마이코플라즈마 하이뉴모니애 및/또는 마이코플라즈마 하이오라이니스에 의한 개체에서의 면역 반응을 더욱 증폭할 수 있다.
또한 본 발명은 재조합 단백질 rP97 을 포함하는 마이코플라즈마 하이뉴모니애 감염 에 의한 질병 예방용 백신 조성물 또는 재조합 단백질 rP97m 을 포함하는 마이코플라즈마 하이뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의한 질병 예방용 백신 조성물을 제공한다.
상기 마이코플라즈마 하이뉴모니애 및/또는 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의한 질병은 상기 병원균이 개체에 감염됨으로써 발생하는 다양한 임상적 질병을 제한없이 포함할 수 있으나, 바람직하게는 돼지 호흡기 복합 증후군, 돼지 유행성 폐렴 또는 마이코플라즈마 하이오라이니스에 의한 관절염일 수 있다.
또한 본 발명은 1) 서열번호 1로 표시되는 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 2) 상기 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; 및 3) 상기 형질전환된 숙주에서 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 를 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 보조제의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 서열번호 13으로 표시되는 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조 하는 단계; 2) 상기 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; 및 3) 상기 형질전환된 숙주에서 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 를 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 보조제의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 재조합 단백질 rP97 을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물을 돼지에 접종하는 단계; 를 포함하는 돼지의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 재조합 단백질 rP97m 을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물을 돼지에 접종하는 단계; 를 포함하는 돼지의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방 방법을 제공한다.
상기 돼지는 마이코플라즈마에 감염될 가능성이 있는 개체를 제한없이 포함할 수 있으며, 이와 같은 감염 예방 방법은 다른 당 분야에 공지된 치료 방법 또는 예방 방법과 함께 병행하여 이용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "접종"은 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
rP97
단백질을 포함하는 일가 백신
1.1
마이코플라즈마
하이오뉴모니애
불활화 균주의 준비
마이코플라즈마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae, Mhp) 균주를 국내의 양돈농가에서 분리하였으며, 단백질 패턴 분석을 통하여 분리된 균주 중 분리주인 Mhp HID3117과 HID3138이 표준 균주인 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (Mhp) J(ATCC 25934) 와 다른 균주임을 확인하였다. 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 균주인 HID3117과 HID3138을 Friis 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃의 조건에서 3주간 배양하였다. 배양된 균액은 pH 를 약 7.8까지 높여 불활화시켰다. Binary ethyleneimine (BEI) (U.S. Pat. No. 5,565,205)와 같은 불활화 시약을 이용하여 균의 불활화를 진행하였다. BEI는 배양액에 2-bromoethylaminehydrobromide (BEA) (SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 제조하였으며, 그 뒤, BEI는 중화시약인 sodium thiosulfate (SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA)를 넣어 중화시켰다. 불활화된 배양액 일부를 새 배지에 첨가하여 37℃에서 배양하였으며, 적어도 일주일 이상 배양하여 불활화가 잘 되었는지 확인하였다. 불활화된 배양액은 여과(filtration)나 원심분리법으로 농축하였다.
1.2 재조합
rP97
단백질의 생산
재조합 rP97 단백질은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애의 P97 단백질과 E. coli heat-labile enterotoxin subunit B 유전자(eltb)를 융합하여 제조하였다. 보다 구체적으로 국내분리주인 Mhp HID3138및 Mhp HID3117균주를 대상으로 Genomic DNA Extraction Mini kit(RBC Biosciences)를 이용하여 유전체 DNA를 추출하였다. 장독성원소 대장균의 유전체 DNA는 boiling 방법으로 추출하였다. E. coli heat-labile enterotoxin subunit B 유전자(eltb)와 P97 유전자의 C-말단 반복 서열 (R1과 R1R2)을 융합시키고, LTB와 융합된 P97 유전자인 ltbR1과 ltbR1R2를 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭하였다. PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 1에 기재된 바와 같다.
| Target | Primer pairs | Reaction condition | Product size |
| Escherichia coli heat-labile enterotoxin subunit B gene(eltb) | LTBF: 5'-CAC CAT GGC TCC CCA GAC TAT TAC A-3' LTBR: 5'-CTG GAT CCC CAT ACT GAT TGC-3' |
95℃ 20s, 57.5℃ 40s, 72℃ 15s, 30cycles |
300 bp |
| P97 gene(r1) | R1F: 5'-CAC CAT GGG GAT CCC TAC AAA AGA AG-3' R1R: 5'-GCC AAG CTT AGT AGC AAC TGG T-3' |
95℃ 20s, 56.5℃ 40s, 72℃ 15s, 30cycles |
280 bp |
| P97 gene( r1r2 ) | R1F: 5'-CAC CAT GGG GAT CCC TAC AAA AGA AG-3' 2RsR: 5'-GGT AGT TGG GCT TTG TTG-3' |
95℃ 20s, 49.5℃ 40s, 72℃ 30s, 30cycles |
697 bp |
| Ltbr1 | LTBF: 5'-CAC CAT GGC TCC CCA GAC TAT TAC A-3' R1R: 5'-GCC AAG CTT AGT AGC AAC TGG T-3' |
95℃ 20s, 56.5℃ 40s, 72℃ 30s, 30cycles |
582 bp |
| Ltbr1r2 | LTBF: 5'-CAC CAT GGC TCC CCA GAC TAT TAC A-3' 2RsR: 5'-GGT AGT TGG GCT TTG TTG-3' |
95℃ 20s, 49.5℃ 40s, 72℃ 40s, 30cycles |
1000 bp |
* Primer designed in this study. Other primer sequences were obtained from previous study(Conceicao et al., 2006)
4개의 염기서열(CACC)이 포함된 LTBF와 R1F 프라이머를 사용하여 증폭한 PCR 산물을 pENTR/SD 벡터(Gateway system, Invitrogen) 내로 삽입하였다. 그 다음 BamHI 제한효소가 포함된 LTBR과 R1F 프라이머를 사용하여 ltb와 R1을 융합하였다. 각각의 유전자 (R1, R1R2, ltbR1 및 ltbR1R2)는 제조사의 방법에 따라 pENTR/SD와 pDEST-42 vector(Gateway system, Invitrogen)내로 삽입하였고, 각 재조합 단백질을 발현하기 위해 전기천공법을 사용하여 E. coli BL21-competent cell 내로 형질전환 후에 100 μg/mL의 암피실린이 함유된 1L LB 배지에서 배양하였다. 배양액은 최종농도 1 mM이 되도록 isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)를 첨가하여 3시간동안 단백질 발현을 유도하였고 sonication 시킨 후 원심분리하여 재조합 단백질이 포함된 용균액을 얻었다. 발현된 단백질은 HisPur Ni-NTA affinity chromatography(Thermo Scientific)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 정제하였다. 제조된 본 발명의 재조합 단백질 rP97의 아미노산 서열은 서열번호 1에 기재하였으며, 서열번호 1의 아미노산을 암호화하는 염기서열은 서열번호 2에 기재하였다. 또한 사용된 프라이머 서열은 서열번호 3 내지 12 에 나타내었다.
1.3 백신의 제조
불활화되고 농축된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애를 부형제와 무균적으로 혼합하고, 표 2와 같이 멸균된 용기에서 희석해준 후 rP97을 함유하는 용균액과 30분 이상 4℃에서 혼합하여 백신을 제조하였다.
| 구분 | 일가백신 |
| 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 | 2.5 x 108 CCU/dose (Mhp HID3138, HID3117) |
| rP97 | total lysate 300 ug/ml |
| adjuvant | Montanide Gel: 20% Carbopol: 1mg/ml |
| PBS | Make volume to 1ml |
| 혼합 시간 | 30분 이상(4℃) |
CCU = Colour-changing units (CCU)
1.4
항체가를
통한 백신 효과의 검증
1.4.1
실험군의
준비
백신후보주의 면역원성을 측정하기 위해 마이코플라즈마 하이오뉴모니애-free인 3주령의 돼지를 사용하였다. 임상 증상, 폐렴 병변 유무, 기타 혈청학적 검사 및 ELISA kit(IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME, USA)를 통해 실험에 사용된 모든 돼지의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 여부를 일정시간 간격으로 확인하였다. 모든 돼지는 각 군당 5마리씩 준비하였으며, 실험군은 실시예 1.1의 방법으로 불활화시킨 Mhp HID3138 및 Mhp HID3117 에 실시예 1.2에서 제조된 rP97 단백질 0.3 mg/ml, Montanide Gel, 카르보폴(Carbopol) 을 상기 표 2와 같은 비율로 혼합하여 제조한 백신을 각각 2 ml씩 접종하였다. 또한 비교군으로는 상용화 백신인 Mycoflex® (Boehringer Ingelheim Animal Health, St. Joseph, MO, USA)을 1 ml 접종한 군을 설정하였으며, 용균액 처리 비교군 (rLysate) 으로 실시예 1.2 에서 제조된 rP97 재조합 단백질을 단독으로 포함하는 용균액을 2 ml 접종하였다. 대조군은 PBS만을 2 ml 접종하였으며, 총 5개 군을 대상으로 실험을 수행하였다. 모든 군은 최초접종 후 21일 뒤에 추가 접종하였다. 혈청 샘플은 최초 백신접종 후 0, 21, 42, 63일차에 분리하여 실험에 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다. 각 실험군의 사항은 하기 표 3에 나타내었다.
| 실험군 | 투여 물질 |
| G1 | Mhp HID3138 및 rP97 재조합 단백질 함유 용균액 |
| G2 | Mhp HID3117 및 rP97 재조합 단백질 함유 용균액 |
| G3 | rP97 재조합 단백질 함유 용균액 |
| G4 | 생리 식염수 단독 |
| G5 | 상용화 백신 Mycoflex® |
1.4.2.
ELISA 를
이용한 항체가 분석
마이코플라즈마 하이오뉴모니애 특이적인 항체가를 IDEXX M. hyo. ELISA(IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME, USA)를 이용하여 측정하였다. rP97에 대한 특이적인 항체가는 발현 및 정제된 P97 단백질을 항원으로 사용하여 확인하였으며, 96-well Maxi-Sorp microtiter 플레이트 (NUNC, Thermo Scientific, Penfield, NY, USA)에 rP97(0.5 μg/well)을 코팅하고 4℃에서 16시간 동안 보관하였다. 플레이트를 0.05% Tween 20이 첨가된 PBS(PBST)를 사용하여 세척 후, 5% non-fat milk가 포함된 PBS(PBSM)로 blocking하였다. PBST로 세 번 세척 후, 100 μl의 혈청(1:100 PBSM)을 플레이트에 첨가하였다. PBST로 세 번 세척 후, 플레이트에 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated rabbit anti-porcine IgG(SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA)를 첨가한 후 배양하였다. PBST로 세척 후, o-phenylenediamine(OPD) substrate(SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 반응시켰다.
마이코플라즈마
하이오뉴모니애
특이적인 혈청학적 항체 수준 측정
다양한 백신 후보군에 의해 유도된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 특이적인 혈청학적 항체 수준 측정 결과를 GraphPad Prism 5 software(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)를 사용하여 통계적으로 분석하였다. 각 그룹간 혈청 내 항체가에 대한 차이는 Bonferroni post-test가 결합된 Two-way ANOVA를 사용하였으며, 유의적인 차이는 P < 0.05로 표시하고, 항체 수준 측정 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, PBS 처리 대조군은 접종 전 구간에서 음성을 나타냈다. 반면에, G1 및 G2 군은 접종 42일부터 실험종료일까지 양성을 보였다. 또한 백신 접종군은 상용 백신군인 MFlex (G5) 군보다 높은 항체 수준을 보였으며, G2 군은 접종 후 63일에 상용백신군(G5) 과 유사한 수준을 나타냈다. G1 및 G2 군은 접종 후 42일과 63일에 가장 높은 수준의 항체를 유도하였으며, PBS군과 비교하였을 때 통계적으로 높은 유의적인 값을 보였다.
rP97
-특이적인 면역반응의 평가
rP97-특이적인 면역반응을 평가하기 위해, 백신 접종된 돼지의 혈청을 이용하여 indirect ELISA를 실시하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, G1 및 G2, G3 실험군들에서는 rP97-특이적인 항체 수준이 계속 증가하여 접종 후 42일에 가장 높은 값을 나타냈다. 특히, 접종 후 42일과 63일에 G1 및 G2 군, G3군들은 대조군에 비해 상당히 높은 수준의 항체가를 보였으며 (P < 0.001), 세 접종군들 사이의 유의적인 차이는 없었다. 접종 후 42일에 G1, G2 군 및 G3군들은 대조군에 비해 각각 19, 20, 16배 높은 수준의 항체가를 나타냈다. 한편 대조군(G4)과 상용 백신군(G5)은 rP97-특이적인 면역반응을 보이지 않았다. 이러한 결과는 부착 단백질인 P97에 대한 항체가 수준이 기존 상용화된 백신은 거의 없는데 반해 본 발명에서 제조된 백신은 rP97에 대한 높은 항체가를 나타냄을 보여주는 결과이며 상용 백신이 P97 특이적인 항체가를 생성하기에 부족하다는 기존의 보고와 유사하다. 따라서 본 발명에서 제조된 백신은 rP97에 대한 높은 항체가를 형성함으로써 종래 상용 백신에 비해 더 효과적이라는 것을 알 수 있다.
1.5
돼지에서의
불활화 백신의
유효능
평가
제조된 백신의 유효능을 평가하기 위해 마이코플라즈마가 상재해 있는 농장의 돼지를 대상으로 균을 분리하고 마이코플라즈마 특이적 PCR 및 ELISA 항체가를 조사하여 마이코플라즈마가 순환되고 있는 농장을 확인하였다. 실시예 1.4.1 에서 제조한 상기 백신 중 Mhp HID3138 과 rP97 를 포함하는 G1군은 1주와 4주령에 백신을 접종한 후 3주 동안 임상증상(기침, 우울, 비즙의 분비유무)을 관찰하였고, 3주 후에 각 군에서 임의로 선발한 5 두씩 도태하여 폐장의 육안병변지수를 산출하였다. 폐의 육안 병변을 이용한 평가방법은 호흡기 질병에 대한 폐의 육안 병변을 분석하는 것으로 전체 폐장을 100으로 하여 각각의 엽마다 부피를 근거로 각각의 점수를 배분한 후 각각의 폐장에 대한 육안 병변 여부를 분석하는 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
상기 표 4에서와 같이 백신을 접종하지 않은 대조군은 기침, 우울, 비강삼출물의 분비 등이 높은 양성율로 관찰되었으나 백신접종군은 거의 임상증상이 관찰되지 않았다. 육안적 폐병변지수도 백신을 접종하지 않은 대조군과 백신접종군 사이에 유의적인 차이가 나타났다. 따라서 본 발명에서 제조된 백신은 마이코플라즈마균이 상재된 농장에 접종 시 호흡기 증상의 완화 및 폐병변을 감소시키는 것으로 관찰되었다.
상기 결과를 종합하면, 본 발명의 재조합 rP97 이 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae) 에 대한 백신에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다. 또한 해당 재조합 단백질을 포함한 백신은 기존의 상용 백신과 달리 초기 감염에 중요한 부착인자인 P97을 포함함으로써, 뚜렷한 항체를 형성하여 백신 접종 유무를 유용하게 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 초기 감염에 중요한 부착인자인 P97 을 포함함으로써 종래 상용 백신의 기술적 한계점으로 지적되었던 자연 감염균의 전파 및 호흡 섬모 집락화를 방지할 수 있음을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 rP97는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애의 초기 발병 억제를 통해 마이코플라즈마에 대한 예방을 효과적으로 달성할 수 있다.
실시예
2.
rP97m
을 포함하는 이가 백신
2.1
마이코플라즈마
균주 준비
마이코플라즈마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae ; Mhp) 와 마이코플라즈마 하이오라이니스 (Mycoplasma hyorhinis ; Mhr) 균주를 돼지 마이코플라즈마성 폐병변을 나타내는 폐에서 분리하여, Friis 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃의 조건에서 3일간 배양하였다. 단백질 패턴 분석을 통하여 분리된 균주 Mhp HID3134, HID3140, HID3138, 및 Mhr HID3224가 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스의 각각의 표준 균주와 비교하여 서로 다른 균주인 것을 확인하였다. 상기 균주들은 항체를 유도하는 고병원성 고역가 균주일 것으로 기대되었다. 배양된 균액은 pH를 약 7.8로 맞춘 후 Binary ethyleneimine(BEI) (U.S. Pat. No. 5,565,205)와 같은 불활화 시약을 이용하여 균의 불활화를 진행하였다. BEI는 배양액에 L-bromoethylaminehydrobromide(BEA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 제조한다. 그 후 중화 시약인 sodium thiosulfate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 넣어 중화시키고 불활화된 배양액 일부를 새 배지에 첨가하여 37℃에서 배양하여 불활화가 되었는지 확인하였다. 배양은 최소 일주일 이상 수행하였으며, 불활화된 배양액은 원심분리법으로 농축하였다.
2.2
rP97m
단백질의 제작
재조합 rP97m 단백질은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애의 P97 단백질과 E.coli heat-labile enterotoxin subunit B (eltb) 를 융합하여 제조하였다. 실시예 1의 rP97 은 Mhp 로부터 가공없이 얻은 후 LTB 와 융합하였으나, rP97m은 P97에서 핵심 부위인 R1, R2 의 염기서열을 이용하여 R1, R2 만 따로 만들어 재조합한 후 LTB와 융합하여 제조하였다. 보다 구체적으로 rP97m 단백질의 재조합은 pET-30a(+) (Novagen, USA) 발현시스템을 사용하여 수행하였다. E. coli BL21 codon-plus RIL competent cell (Novagen)에 발현 플라스미드를 열충격을 이용하여 삽입시키고, 50 μg/mL 카나마이신 (Kanamicin)이 첨가된 1 L의 Luria-Bertani (LB) 배지에서 배양하였다. 그 후, 1 mM의 isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 이용하여 단백질 발현을 3시간 동안 유도한 다음, sonication 시키고, 원심분리하여 재조합 단백질이 포함된 용균액을 얻었다. Ni-NTA 컬럼을 사용하여 용균액으로부터 재조합 단백질을 정제 및 농축하였다. 제조된 본 발명의 재조합 단백질 rP97m의 아미노산 서열은 서열번호 13에 기재하였으며, 서열번호 13의 아미노산을 암호화하는 염기서열은 서열번호 14에 기재하였다.
또한 재조합 단백질 rP97m과 실시예 1.2 에서 제조한 재조합 rP97 단백질의 유사성을 확인하기 위하여 제조된 rP97과 rP97m의 서열 구조 및 상동성을 비교하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3의 a 에 나타낸 바와 같이, rP97과 rP97m 은 상호 상이한 구조를 가지고 있으며, 특히 rP97m은 R1 및 R2 만을 따로 합성하여 필수적인 부위만을 구성으로 하는 것을 확인하였다. 도 3의 b에 나타낸 바와 같이 양 서열은 64.13%의 상동성을 나타내어 상호 상동성이 매우 낮은 서열인 것으로 나타났다.
2.3 백신의 제조
불활화되고 농축된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스를 부형제와 무균적으로 혼합하고, 표 5와 같이 멸균된 용기에서 희석한 후 24시간 이상 혼합하여 백신을 제조하였다.
| 구분 | 이가백신 |
| 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 | 1.0 x 109 CCU/dose (Mhp HID3134, HID3140, 또는 HID3138) |
| 마이코플라즈마 하이오라이니스 | 1.0 x 109 CCU/dose (Mhr HID3224) |
| rP97m | purified protein 100 ug/dose |
| adjuvant | IMS1313: 50% |
| PBS | Make volume to 2ml |
| 혼합 시간 | 24시간 이상(4℃) |
CCU = Colour-changing units (CCU)
2.4 백신 효과의 검증
2.4.1
실험군의
준비
백신후보주의 면역원성을 측정하기 위해 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스에 감염되지 않은 3주령의 돼지를 사용하여 동물 실험을 수행하였다. 실험에 사용된 돼지는 임상 증상, 폐렴 병변 유무, 기타 혈청학적 검사 및 ELISA kit(IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME, USA)를 사용하여 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 유무를 주기적으로 확인하였다. 모든 돼지는 각 군당 4마리씩 준비하였으며, 실험군은 실시예 2.1의 방법으로 불활화시킨 Mhp HID3134, Mhp HID3140, Mhp HID3138 와 Mhr HID3224및 rP97m을 상기 표 5와 같은 비율로 혼합하여 제조한 백신을 각각 2ml 씩 1회 투여하였으며, 샘플은 접종 4일 전, 접종 후 1, 2, 4, 5 주에 채취하였다. 각 실험군의 사항은 하기 표 6에 나타내었다. 비교군으로는 상용화 백신인 Respisure®(Zoetis, USA) 를 처리한 군을 설정하였다. 백신 접종 후 혈액을 채취하여 혈청을 분리 후 -20℃에 보관하여 실험에 사용하였다.
| 실험군 | 투여 물질 |
| GROUP 1(G1) | PBS 단독 |
| GROUP 2 (G2) | 상용화 백신 Respisure® |
| GROUP 3 (G3) | Mhp HID3134 + Mhr HID3224 + rP97m |
| GROUP 4 (G4) | Mhp HID3140 + Mhr HID3224+ rP97m |
| GROUP 5 (G5) | Mhp HID3138 + Mhr HID3224+ rP97m |
2.4.2
ELISA 를
이용한 항체가 분석
마이코플라즈마 하이오뉴모니애 특이 항체가는 IDEXX M. hyo+.ELISA kit(IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME, USA)를 사용하였다. P97m 특이 항체가는 정제된 rP97m 단백질을 항원으로 코팅하여 측정하였으며, 마이코플라즈마 하이오라이니스 특이 항체가는 마이코플라즈마 하이오라이니스 whole bacterin을 항원으로 코팅하여 측정하였다. 96-well Maxi-Sorp microtiter 플레이트 (NUNC, Thermo Scientific, Penfield, NY, USA)에 각각의 항원(rP97m: 0.2 μg/well, Mhr Whole bacterin: 25ng/well)을 코팅하고 4℃에서 16시간 또는 37℃에서 2시간 동안 보관하였다. 플레이트를 0.05% Tween 20이 첨가된 PBS-T를 사용하여 3회 세척 후, 1% BSA in PBS로 37℃에서 2시간 동안 차단하였다. PBS-T로 3번 세척 후, 100 μl의 혈청 (1:100 희석, 0.1% BSA in PBS)을 플레이트에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. PBS-T로 3번 세척 후, palte에 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-swine IgG (Abcam, UK)를 첨가한 후 1시간동안 37℃에서 반응시켰다. 이후 PBS-T로 4회 세척하고, BioFX® TMB One Component HRP Microwell Substrate(SurModics®, USA) 을 넣고 5분간 상온에서 암반응 후 정지 용액을 넣어 반응을 종결시켰다. 450nm에서 흡광도를 측정하여 결과를 확인하였다.
마이코플라즈마
하이오뉴모니애
특이적인 혈청학적 항체 수준 측정
접종하기 전 모든 돼지는 혈청학적으로 음성을 확인한 후 실험을 진행하였다. 돼지 마이코플라즈마 이가 백신에 의해 유도된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 특이적인 혈청학적 항체 수준을 GraphPad Prism 5 software(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)를 사용하여 통계적으로 분석하였다. 각 그룹간 혈청 내 항체가에 대한 차이는 Bonferroni post-test가 결합된 Two-way ANOVA를 사용하였으며, 유의적인 차이는 P < 0.05로 표시하고, 항체 수준 측정 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, PBS군 (G1)은 접종 전 구간에서 음성을 나타냈다. 반면에 백신을 접종한 G3, G4, G5에서는 백신접종 2주차부터 실험 종료일까지 양성을 보여 체액성 면역 반응이 형성되었음을 확인하였다. 특히 백신접종 후 2주후부터 5주까지 항체가가 폭발적으로 증가하여 실험 전 구간에 걸쳐 상용 백신군(G2)보다 높은 항체 수준을 보였으며, PBS군(G1)과 비교하였을 때 통계적으로 높은 유의적인 값을 보였다. 이러한 결과는 제조된 rP97m 단백질이 포함된 마이코플라즈마 이가백신이 상용화 백신보다 항체를 더 잘 유도할 수 있으며, 이는 rP97m 단백질이 균주에 의한 항체 형성 반응을 더욱 촉진할 수 있음을 보여주는 결과이다.
rP97
특이적인 혈청학적 항체 수준 측정
돼지마이코플라즈마 이가백신을 사용한 실험에서 다양한 백신 후보군에 의해 유도된 rP97m-특이적인 면역반응을 평가하기 위해, 백신접종된 돼지의 혈청을 이용하여 indirect ELISA를 실시하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 백신 접종군 G3, G4, G5에 대한 rP97m-특이적인 항체 수준은 접종 14일부터 증가하기 시작하였고, PBS군(G1)과 비교하였을 때 통계적으로 높은 유의적인 값을 보였다. 반면 상용 백신군(G2)은 rP97m 특이적인 항체가 검출되지 않았다. 이러한 결과는 상용백신에는 초기방어에 중요한 P97 단백질이 함유되어 있지 않음을 보여주는 예이다.
마이코플라즈마
하이오라이니스
특이적인 혈청학적 항체 수준 측정
돼지마이코플라즈마 이가백신에는 마이코플라즈마 하이오라이니스가 함유되어 있다. 따라서 마이코플라즈마 하이오라이니스에 대한 항체 수준을 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 마찬가지로 접종하기 전 모든 돼지는 혈청학적으로 음성을 확인한 후 실험을 진행하였다
도 6에 나타낸 바와 같이, PBS군(G1)은 접종 전 구간에서 음성을 나타냈다. 반면 이가 백신을 접종한 군 G3, G4, G5에서는 4주 후부터 실험종료일까지 양성을 보였으며 Group 4 처리군은 PBS군과 비교하였을 때 통계적으로 높은 유의적인 값을 보여 체액성 면역반응이 효과적으로 생성되었음을 알 수 있었다. 한편 상용 백신군(G2)에서는 마이코플라즈마 하이오라이니스가 포함되어 있지 않아 마이코플라즈마 하이오라이니스 특이적인 항체가 검출되지 않았으며, 이는 접종 후 5주까지 음성반응만을 나타내었다.
2.4.3 이가 백신 접종에 의한 세포성 면역 반응 확인
돼지 마이코플라즈마 이가 백신의 세포성 면역능을 평가하기 위하여 항체가 형성되기 시작하는 접종 2주 후의 돼지 혈액 샘플로부터 PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 분리하였다. 마이코플라즈마 하이오뉴모니애로 자극한 후 생성되는 INF-γ의 생성량을 Novex 사의 Swine INF-γ ELISA Kit를 사용하여 평가하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 상용 백신군은 낮은 세포성 면역 반응만을 나타내었으나, 실시예 2에서 제조된 이가 백신을 접종한 G3, G4, G5은 모두 통계적으로 유의하게 상용 백신군 G2보다 높은 INF-γ 를 생산하였다. 이를 통해 제조된 이가 백신이 상용 백신군 대비 더욱 우수한 세포성 면역 반응을 유도할 수 있음을 확인하였다.
2.4.4 이가 백신 접종에 의한 부작용 확인
돼지 마이코플라즈마 이가 백신의 부작용을 평가하기 위하여 실험군의 체중을 측정하여 비교하였다. 일반적으로 백신 접종에 따른 부작용이 발생할 경우 작게는 염증, 피부 괴사등의 증상이 발생하며, 발작등을 일으키고 심하면 폐사에 까지 이르게 되어 농장에서 손실을 입게 된다. 아울러 백신접종 후의 부작용이 나타나면 사료섭취율이 급속히 떨어져 증체율이 감소하게 된다. 제조된 돼지 마이코플라즈마 이가 백신이 배신 접종에 따른 부작용을 유발하는지 여부를 평가하기 위하여 대조군(G1), 상용백신군(G2) 및 백신 접종군(G3, 4, 5) 에서 돼지의 체중을 접종 후 5주간 측정하여 비교하고 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이 백신 접종군(G3, 4, 5)과 대조군(G1), 상용백신군(G2)간의 체중 차이는 나타나지 않았으며, 이를 통해 rP97m 을 포함하는 제조된 마이코플라즈마 이가 백신이 돼지에게 미치는 부작용이 없고 안전한 백신으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 통해, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 재조합 단백질을 포함하는 이가 백신은 높은 수준의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 특이적인 체액성 면역 반응과 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 특이적인 세포성 면역 반응을 유도할 수 있어 상용 백신 대비 더욱 우수한 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Innovac
<120> Vaccine composition comprising recombinant protein for preventing
swine mycoplasma infection
<130> INNOVAC1-1P-1
<150> 2016-0103259
<151> 2016-08-12
<160> 14
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 274
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Mycoplasma hyopneumoniae rP97 protein sequence
<400> 1
Met Gly Ile Pro Thr Lys Glu Gly Lys Arg Glu Glu Val Asp Lys Lys
1 5 10 15
Val Lys Glu Leu Asp Asn Lys Ile Lys Gly Ile Leu Pro Gln Pro Pro
20 25 30
Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala
35 40 45
Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala
50 55 60
Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys
65 70 75 80
Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Thr Asn Thr Asn Thr Gly Phe Ser
85 90 95
Leu Thr Asn Lys Pro Lys Glu Asp Tyr Phe Pro Met Ala Phe Ser Tyr
100 105 110
Lys Leu Glu Tyr Thr Asp Glu Asn Lys Leu Ser Leu Lys Thr Pro Glu
115 120 125
Ile Asn Val Phe Leu Glu Leu Val His Gln Ser Glu Tyr Glu Glu Gln
130 135 140
Lys Ile Ile Lys Glu Leu Asp Lys Thr Val Leu Asn Leu Gln Tyr Gln
145 150 155 160
Phe Gln Glu Val Lys Val Thr Ser Glu Gln Tyr Gln Lys Leu Ser His
165 170 175
Pro Met Met Thr Glu Gly Ser Pro Asn Gln Gly Lys Lys Gly Glu Gly
180 185 190
Thr Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro Asn Gln Gly Lys
195 200 205
Lys Ala Glu Gly Ala Pro Ser Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ser
210 215 220
Asn Gln Gln Ser Pro Thr Thr Lys Gly Gly Arg Ala Asp Pro Ala Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Lys Val Val Ile Asn Ser Lys Leu Glu Gly Lys Pro Ile Pro
245 250 255
Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His
260 265 270
His His
<210> 2
<211> 825
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Mycoplasma hyopneumoniae rP97 DNA sequence
<400> 2
atggggatcc ctacaaaaga aggtaaaaga gaagaagtag ataaaaaagt taaagaatta 60
gataataaaa taaaaggtat attacctcag cccccagcag ctaaaccaga agcagcaaaa 120
ccagtagcag ctaaacctga agcagcaaaa ccagtagcgg ctaaacctga agcagcaaaa 180
cctgaagcag caaaaccagt agcggctaaa cctgaagcag caaaaccagt agcagctaaa 240
cctgaagcag caaaaccagt tgctactaat actaatactg gcttttcact tacaaataaa 300
ccaaaagaag actatttccc aatggctttt agttataaat tagaatatac tgacgaaaat 360
aaattaagcc taaaaacacc ggaaattaat gtatttttag aactagttca tcaaagcgag 420
tatgaagaac aaaaaataat aaaggaacta gataaaactg ttttaaatct tcaatatcaa 480
ttccaggaag tcaaggtaac tagtgaacaa tatcagaaac ttagccaccc aatgatgacc 540
gagggatctc ctaatcaagg taaaaaagga gaaggaactc ctaaccaagg caaaaaagcc 600
gaaggcgctc ctaaccaagg caaaaaagcc gaaggcgcac ctagtcaagg gaaaaaagca 660
gagggtgctt ctaatcaaca aagcccaact accaagggtg ggcgcgccga cccagctttc 720
ttgtacaaag tggtgatcaa ttcgaagctt gaaggtaagc ctatccctaa ccctctcctc 780
ggtctcgatt ctacgcgtac cggtcatcat caccatcacc attga 825
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> LTB Forward primer
<400> 3
caccatggct ccccagacta ttaca 25
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> LTB Reverse primer
<400> 4
ctggatcccc atactgattg c 21
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> R1 Forward primer
<400> 5
caccatgggg atccctacaa aagaag 26
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> R1 Reverse primer
<400> 6
gccaagctta gtagcaactg gt 22
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> R1 Forward primer
<400> 7
caccatgggg atccctacaa aagaag 26
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 2Rs Reverse primer
<400> 8
ggtagttggg ctttgttg 18
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> LTB Forward primer
<400> 9
caccatggct ccccagacta ttaca 25
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> R1 Reverse primer
<400> 10
gccaagctta gtagcaactg gt 22
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> LTB Forward primer
<400> 11
caccatggct ccccagacta ttaca 25
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 2RsR
<400> 12
ggtagttggg ctttgttg 18
<210> 13
<211> 380
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Mycoplasma hyopneumoniae rP97m protein sequence
<400> 13
Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10 15
Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp
20 25 30
Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp Ile
35 40 45
Gly Ser Glu Phe Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr
50 55 60
Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr
65 70 75 80
Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser
85 90 95
Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser
100 105 110
Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr
115 120 125
Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr
130 135 140
Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Leu Glu Gly Ile Pro Thr Lys Glu
145 150 155 160
Gly Lys Arg Glu Glu Val Asp Lys Lys Val Lys Glu Leu Asp Asn Lys
165 170 175
Ile Lys Gly Ile Leu Pro Gln Pro Pro Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala
180 185 190
Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys
195 200 205
Pro Glu Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro
210 215 220
Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val
225 230 235 240
Ala Thr Asn Glu Gly Thr Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala
245 250 255
Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro Ser Gln Gly Lys Lys
260 265 270
Ala Glu Gly Ala Ser Asn Gln Gln Ser Pro Thr Thr Glu Leu Thr Asn
275 280 285
Tyr Leu Pro Glu Leu Gly Lys Lys Ile Asp Glu Ile Ile Lys Lys Gln
290 295 300
Gly Lys Asn Trp Lys Thr Glu Val Glu Leu Ile Glu Asp Asn Ile Ala
305 310 315 320
Gly Asp Ala Lys Leu Leu Tyr Phe Val Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ser
325 330 335
Gly Asp Pro Lys Lys Ser Ser Leu Lys Val Lys Ile Thr Val Lys Gln
340 345 350
Ser Asn Asn Asn Gln Glu Leu Lys Ser Lys Gln Ala Cys Gly Arg Thr
355 360 365
Arg Ala Pro Pro Pro Pro Pro Leu Arg Ser Gly Cys
370 375 380
<210> 14
<211> 1143
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Mycoplasma hyopneumoniae rP97m DNA sequence
<400> 14
atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt ctggtgccac gcggttctgg tatgaaagaa 60
accgctgctg ctaaattcga acgccagcac atggacagcc cagatctggg taccgacgac 120
gacgacaagg ccatggctga tatcggatcc gaattcgctc cccagactat tacagaacta 180
tgttcggaat atcgcaacac acaaatatat acgataaatg acaaaatact atcatatacg 240
gaatcgatgg caggcaaaag agaaatggtt atcattacat ttaagagcgg cgcaacattt 300
caggtcgaag tcccgggcag tcaacatata gactcccaaa aaaaagccat tgaaaggatg 360
aaggacacat taagaatcgc atatctgacc gagaccaaaa ttgataaatt atgtgtatgg 420
aataataaaa cccccaattc aattgcggca atcagtctcg aggggatccc tacaaaagaa 480
ggtaaaagag aagaagtaga taaaaaagtt aaagaattag ataataaaat aaaaggtata 540
ttacctcagc ccccagcagc taaaccagaa gcagcaaaac cagtagcagc taaacctgaa 600
gcagcaaaac cagtagcggc taaacctgaa gcagcaaaac ctgaagcagc aaaaccagta 660
gcggctaaac ctgaagcagc aaaaccagta gcagctaaac ctgaagcagc aaaaccagtt 720
gctactaatg aaggaactcc taaccaaggc aaaaaagccg aaggcgctcc taaccaaggc 780
aaaaaagccg aaggcgcacc tagtcaaggg aaaaaagcag agggtgcttc taatcaacaa 840
agcccaacta ccgaattaac taattacctt cctgaattag gtaaaaaaat tgacgaaatc 900
attaaaaaac aaggtaaaaa ttggaaaaca gaggttgaac taatcgagga taatatcgct 960
ggagatgcta aattgctata ctttgtccta agggatgatt caaaatccgg tgatcctaaa 1020
aaatcaagtc taaaagttaa aataacagta aaacaaagta ataataatca ggaattaaaa 1080
tctaaacaag cttgcggccg cactcgagca ccaccaccac caccactgag atccggctgc 1140
taa 1143
Claims (20)
- 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질.
- 제1항의 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제2항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
- 제1항의 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물.
- 제4항에 있어서, 불활화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (M. hyopneumoniae) 를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 마이코플라즈마 하이오뉴모니애는 1.0.x106 내지 1.0.x10 10CCU(Colour-changing units)/ml 의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물.
- 제1항의 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 보조제.
- 제1항의 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염에 의한 질병 예방용 백신 조성물.
- 1) 서열번호 1로 표시되는 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; 및
3) 상기 형질전환된 숙주에서 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 를 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 보조제의 제조 방법.
- 돼지에 제8항의 백신 조성물을 접종하는 단계; 를 포함하는 돼지의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 감염 예방 방법.
- 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis ) 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질.
- 제11항의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제12항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
- 제11항의 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물.
- 제14항에 있어서, 불활화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (M. hyopneumoniae) 및 불활화된 마이코플라즈마 하이오라이니스를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물.
- 제15항에 있어서,
상기 불활화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 또는 마이코플라즈마 하이오라이니스는 1.0.x106 내지 1.0.x10 10CCU(Colour-changing units)/ml 의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 조성물.
- 제11항의 재조합 단백질을 포함하는, 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 보조제.
- 제11항의 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의한 질병 예방용 백신 조성물.
- 1) 서열번호 13으로 표시되는 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; 및
3) 상기 형질전환된 숙주에서 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 를 포함하는 돼지 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방용 백신 보조제의 제조 방법.
- 돼지에 제14항의 백신 조성물을 접종하는 단계; 를 포함하는 돼지의 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염 예방 방법.
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