KR20150117272A - 돼지 파르보바이러스 ５ｂ, 사용방법 및 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 특히, 사육 돼지를 감염시키는 새로운 돼지 파르보바이러스 5B(PPV5B)의 제조 및 사용과 관련된, 신규한 뉴클레오타이드 서열, 단백질 서열, 면역원성 조성물, 백신, 및 방법을 제공한다. 상기 조성물 및 방법은, 상기 새로운 바이러스에 의한 감염의 검출, 야생 및 사육 동물 및 무리에서 바이러스 서열의 유전적 변화의 모니터링, 및 바이러스에 의한 감염으로부터 동물을 보호하기 위한 새로운 백신의 제조 및 사용을 제공한다.

Description

돼지 파르보바이러스 ５Ｂ, 사용방법 및 백신 {PORCINE PARVOVIRUS 5B, METHODS OF USE AND VACCINE}

서열목록

본 출원은 37 C.F.R. 1.821 - 1.825에 따라 서열목록을 포함한다. 본 출원에 첨부된 서열목록은, 이의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. 2013년 3월 21일에 생성된 상기 ASCII 복사본은 10-0153-WO-1-SEQ.txt라고 칭하며, 크기는 34,495 바이트이다.

A. 발명의 분야

본 발명은 동물 보건 분야에 속하며, 백신접종을 위한 약독화된 스트레인을 포함한 신규한 돼지 파르보바이러스 스트레인, 상기 신규한 파르보바이러스 스트레인으로부터 수득된 백신의 제조 방법 및 이를 사용한 치료방법에 관한 것이다.

B. 관련 분야의 설명

파르보바이러스는 매우 다양한 동물 종을 감염시키고, 이들 중 일부는 중증의 임상 질환의 원인이 되지만, 이들 바이러스의 대다수는 단지 경미하거나 준임상적 감염을 야기한다. 이들은 파르보비리다에 과(family Parvoviridae)에 속하며, 2개의 아과를 형성한다: 덴소비리나에(Densovirinae)(이의 구성원들은 곤충을 감염시킨다) 및 파르보비리나에(Parvovirinae)(이의 구성원들은 척추동물을 감염시킨다). 후자의 아과는 현재 5개의 속을 포함한다: 디펜도바이러스(Dependovirus), 에리트로바이러스(Erythrovirus), 암도바이러스(Amdovirus), 보카바이러스(Bocavirus) 및 파르보바이러스(Parvovirus)(1).

파르보바이러스 비리온은 외피를 갖지 않고, 대략 5 내지 6 킬로베이스(kb)의 단일-가닥 선형 DNA 게놈을 함유한다. 게놈은, 비-구조적 캡시드 단백질을 암호화하는 2개의 주요 개방 판독 프레임(ORF: open reading frame)으로 구성된다. 최근에 기술된 보카바이러스는 2개의 주요 ORF 사이에 제3 ORF를 지닌다(1).

파르보바이러스 속의 전형적인 돼지 파르보바이러스(PPV1) 스트레인은 전세계에 걸쳐 널리 분포되어 있으며, 돼지, 특히, 백신접종 프로토콜이 바르게 뒤따르지 않거나 면역억제 인자로 인해 백신 효능이 감소된 무리에서 생식 장애의 원인이 된다. 지난 10년 동안, 다수의 새로운 파르보바이러스가 돼지에서 검출되어 왔다. 이들로는 돼지 파르보바이러스 2(PPV2)(2) 및 관련 바이러스(3)가 포함된다. 새로운 그룹의 돼지 및 소 파르보바이러스, 즉, 호코바이러스(hokovirus)(PHoV, BHoV)가 홍콩에서 동정되었고(4), 이들 바이러스는, 사람 PARV4 및 5와 유전적으로 유사한 것으로 밝혀졌다. 이들은 원래 홍콩의 이름을 따서 호코바이러스라고 명명되었지만, PPV3으로서의 PHoV의 새로운 분류가 제안되었다(5). PPV4는, 소 파르보바이러스 2와 최고의 유사성을 보여주지만, 암호화 능력(coding capacity) 및 게놈 조직화(genome organization)는, PPV4가, ORF1과 ORF2 사이에 위치한 보카바이러스와 같은 추가의 ORF3을 암호화하므로 보카바이러스의 암호화 능력 및 게놈 조직화와 유사하다. 그러나, PPV4-암호화된 추정 ORF3 단백질은 보카바이러스의 것과 매우 상이하다(5).

새로운 바이러스의 출현에 대해 돼지를 모니터링하고, 새로운 바이러스에 대한 백신, 치료 및 검출 방법을 개발하기 위한 계속적 요구가 존재한다.

발명의 요약

본 발명은, 특히 사육 돼지를 감염시키는 새로운 파르보바이러스 스트레인의 제조 및 사용과 관련된, 신규한 뉴클레오타이드 서열, 단백질 서열, 면역원성 조성물, 백신, 및 방법을 제공한다. 이들 스트레인은, 임상 질환이 있는 사육 돼지로부터의 조직 샘플에서 동정된 신규한 돼지 파르보바이러스와 관련되며; 공지된 돼지 파르보바이러스 종 및 스트레인과의 서열 상동성에 기초하여, 신규한 바이러스를 돼지 파르보바이러스 5B 또는 PPV5B로 명명하였다.

본 발명의 조성물 및 방법은, 상기 새로운 바이러스에 의한 감염의 검출, 야생 및 사육 동물 및 무리에서의 바이러스 서열의 유전적 변화의 모니터링, 및 바이러스에 의한 감염으로부터 동물을 보호하기 위한 새로운 백신의 제조 및 사용을 제공한다.

본 발명의 면역원성 조성물 및 백신은, 임의로 보다 강한 면역원성 반응을 유도하기 위한 애쥬번트(adjuvant)를 포함하는, 서열번호 1의 핵산 서열로 암호화된 폴리펩타이드 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함한다.

본 발명의 예시적인 조성물은, PPV5B에 대해 특이적인 항체에 면역반응성인 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4의 폴리펩타이드 서열 중 어느 하나, 또는 이의 단편을 포함한다. 본 발명의 바람직한 폴리펩타이드는 서열번호 4의 서열을 포함한다. 바람직하게는 이들 폴리펩타이드, 또는 이의 단편은 PPV5B에 대해 특이적인 항체에 면역반응성이다.

다른 양상에서, 본 발명은, 하나 이상의 폴리펩타이드, 항체 작제물, 또는 항체 접합체를 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 서열은, PPV5B에 대해 특이적인 항체에 면역반응성인 폴리펩타이드를 암호화하는 서열번호 1의 서열, 특히, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 2861 내지 5014(캡시드 단백질), 또는 서열번호 1의 단편과 적어도 95%, 90%, 85%, 또는 심지어 80% 상동성이고/이거나 동일한 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 예시적인 핵산 서열은, PPV5B에 대해 특이적인 항체에 면역반응성인 폴리펩타이드를 암호화하는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 935 내지 2024, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 2161 내지 2860, 및 서열번호 1의 뉴클레오타이드 2861 내지 5014, 및 이의 단편들의 서열 중 어느 하나를 포함한다. 바람직하게는, 핵산 서열, 또는 유전자는, PPV5B에 대해 특이적인 항체에 면역반응성인 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 것들이다.

또한, 본원에서 사용되는 바와 같은 본 발명의 폴리펩타이드는 다음을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다:

i) 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;

ii) i)의 폴리펩타이드와 80% 이상 상동성이고/이거나 동일한 폴리펩타이드;

iii) i) 및/또는 ii)의 폴리펩타이드의 단편;

iv) 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열에 포함된 적어도 13개, 바람직하게는 15개, 보다 바람직하게는 17개, 보다 더 바람직하게는 20개의 연속한 아미노산을 포함하는 iii) 또는 iv)의 단편;

v) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 935 내지 2024, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 2161 내지 2860, 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 2861 내지 5014의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드;

vi) vi)의 폴리뉴클레오타이드와 80% 이상 상동성이거나 동일한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드;

vii) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 2161 내지 2860 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 2861 내지 5014의 서열에 포함된 적어도 39개, 바람직하게는 45개, 보다 바람직하게는 51개, 보다 더 바람직하게는 60개의 연속한 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질 단편.

본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나 이상의 PPV5B 폴리펩타이드를 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물은, 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트 또는 이들의 배합물과 같은 생리학적으로 허용되는 비히클을 추가로 포함할 수 있다.

본원에 제공된 PPV5B 폴리펩타이드 중 임의의 것 또는 본원에 제공된 이들 PPV5B 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 임의의 면역원성 조성물은, 약제로서, 바람직하게는 백신 또는 면역원성 조성물로서, 가장 바람직하게는 PPV5B 감염에 대항하는 대상체의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.

특히 바람직한 PPV5B 폴리펩타이드는, PPV5B에 대해 특이적인 면역학적 반응을 유도하는 면역원성 에피토프를 갖는 것들을 포함한다. 바람직한 PPVB 폴리펩타이드는, 표면 항원인 관련 PPV1에서 예측된 아미노산 서열을 갖는 것을 포함하며(Simpson et al. JMB 315, 2002), 서열번호 4의 잔기 289, 375 내지 381 및 431 내지 443을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다.

당해 분야 숙련가들은, 본원에 사용된 조성물이 공지의 주사가능한 생리학적으로 허용되는 멸균 용액을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 비경구 주사 또는 주입용의 바로 사용 가능한(reday-to-use) 용액을 제조하기 위해, 등장성 수용액, 예를 들면, 염수 또는 혈장 단백질 용액을 쉽게 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물 및 백신 조성물은 수의학적으로 허용되는 담체, 희석제, 등장성 제제, 안정화제 또는 애쥬번트를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은, 대상체에게 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 PPV5B 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 PPV5B 감염에 대해 면역 반응을 도출하는 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 면역 반응은, PPV5B의 하나 초과의 혈청형 또는 스트레인에 대해 유발된다. 본 발명의 조성물은, PPV5B 감염을 치료하거나 또는 대안으로 예방하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 면역 반응은, 하나 이상의 PPV5B 혈청형으로의 감염과 관련이 있거나 이러한 감염에 의해 야기되는 하나 이상의 임상 증상의 유병률 또는 중증도를 감소시킨다.

본원에서, 적합한 대상체 및 본 발명의 조성물이 투여되는 것을 필요로 하는 대상체로는 바이러스, 미생물, 기생충, 원생동물, 박테리아 또는 진균류 관련 감염, 질환 또는 병태에 대한 예방 또는 치료를 필요로 하는 동물이 포함된다. 본 발명의 조성물 및 방법의 사용에 의해 면역 반응이 자극되는 동물로는 돼지, 소, 가금류(예를 들면, 닭, 오리, 거위, 또는 칠면조), 염소 및 양과 같은 가축, 및 쥐, 토끼, 개, 고양이, 및 말과 같은 사육 동물이 포함된다. 바람직한 동물로는 돼지과, 쥐과, 말과, 토끼과 및 소과가 포함된다. 가장 바람직하게는, 면역 반응은 돼지에서 자극된다.

또한, 본 발명은, PPV5B 감염의 임상 증상의 유병률 또는 중증도가, 본원에 제공된 바와 같은 면역원성 조성물을 투여받지 않은 대상체에 비해, 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 보다 더 바람직하게는 적어도 30%, 보다 더 바람직하게는 적어도 50%, 보다 더 바람직하게는 적어도 70%, 가장 바람직하게는 적어도 100%까지 감소되도록, 본원에 제공된 바와 같은 하나 이상의 PPV5B 펩타이드 및 바람직하게는 담체 분자를 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, PPV5B 감염과 관련이 있거나 이러한 감염에 의해 야기되는 하나 이상의 임상 증상의 유병률 또는 중증도를 감소시키는 방법을 제공한다. 이러한 임상 증상으로는 PPV5B 단독으로의 감염으로부터의 결과로서의 바이러스혈증 및 면역억제가 포함된다. 이러한 임상 증상으로는 신경학적 증상(우울증, 운동실조, 기면), 설사, 호흡곤란, 건강 상태의 저하, 관절 종창(파행 및 횡와 자세를 초래함), 감소된 평균 1일 체중 증가, 사망률, 및 다른 유기체, 예를 들면, 마이코플라스마 하이오리니스(Mycoplasma hyorhinis)로의 동시-감염의 결과로서의 다발성 장막염이 포함될 수 있다.

추가의 양상에 따르면, 본 발명은, 또한, 본원에 제공된 바와 같은 하나 이상의 PPV5B 펩타이드, 즉, 서열번호 3 및/또는 서열번호 4의 서열에 포함된 적어도 12개, 바람직하게는 15개, 보다 바람직하게는 17개, 보다 더 바람직하게는 20개의 연속한 아미노산을 포함하는 서열번호 3 및/또는 서열번호 4의 폴리펩타이드 서열, 또는 이의 단편과 각각 100%, 적어도 95%, 적어도 90% 및/또는 적어도 85%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, PPV5B 감염의 예방 방법에 관한 것이며, 여기서, 상기 PPV5B 감염은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖거나; 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖거나; 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 PPV5B에 의해 야기될 수 있다.

또한, 본 발명은, 바람직하게는 하나 이상의 PPV5B 펩타이드와 담체 분자가 서로 공유 결합되거나 접합되도록 본원에 제공된 바와 같은 하나 이상의 PPV5B 펩타이드를 담체 분자와 혼합함을 포함하는, 본원에 제공된 면역원성 조성물 중 어느 하나를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 접합체는 다가 또는 일가일 수 있다. 다가 조성물 또는 백신은 다중 PPV5B 펩타이드와 담체 분자의 면역-접합체(immuno-conjugation)를 포함한다. 추가의 양상에서, 본 발명은, 숙주 세포, 바람직하게는 이. 콜라이(E. coli)와 같은 원핵생물 세포를 본원에 제공된 바와 같은 PPV5B 펩타이드 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자로 형질전환(transforming)시킴을 포함하는 하나 이상의 PPV5B 펩타이드의 제조 방법을 제공한다. 대안으로, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들면, 동물 세포, 곤충 세포, 원생동물 세포, 식물 세포, 또는 진균 세포일 수 있다. 바람직하게는 진핵생물 세포는 CHO, BHK 또는 COS와 같은 포유동물 세포, 또는 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 진균류 세포, 또는 Sf9와 같은 곤충 세포이다. 본 발명의 핵산의 바큘로바이러스 발현도 바람직하다.

본 발명의 다른 양상은, PPV5B의 적어도 하나의 유전적 변이체, 보다 바람직하게는 PPV5B의 2개 이상의 유전적 변이체에 대해 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 PPV5B 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다. 이것은, 본원에 개시되는 하나 이상의 PPV5B 펩타이드를 암호화하고 발현하는 형질전환된 발현 벡터를 배양함을 포함한다. 발현된 단백질은 발현 유기체에 의해 보유되거나 배양 배지로 분비된다. 발현은, PPV5B에 대해 면역 반응을 유도할 수 있는 PPV5B 펩타이드를 생성하기에 충분한 조건 하에서 수행된다. PPV5B 펩타이드가 면역 반응을 유도하는 PPV5B 혈청형은 적어도 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91 또는 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물의 제조 방법은, 하나 이상의 PPV5B 펩타이드와 담체 분자의 접합체를 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트 또는 이들의 배합물과 같은 생리학적으로 허용되는 비히클과 혼합함을 추가로 포함할 수 있다. 당해 분야 숙련가들은, 비히클, 애쥬번트 또는 배합물의 선택이 특히 전달 경로, 개인적 선호, 및 동물 종에 의해 결정될 것임을 인지할 것이다.

다른 양상에서, 본 발명은, 대상체에서 PPV5B 감염을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 하나 이상의 PPV5B 펩타이드를 제공하는 단계; 하나 이상의 PPV5B 펩타이드를, 대상체로부터 수득한 샘플과 접촉시키는 단계; 및 샘플에서 하나 이상의 PPV5B 펩타이드에 결합할 수 있는 항체가 검출되는 경우 상기 대상체를 PPV5B 감염을 갖는 것으로서 식별하는 단계를 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은, 대상체가 PPV5B 감염에 이전에 노출되었고 PPV5B에 면역 반응을 발현할 수 있는지를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 하나 이상의 PPV5B 펩타이드를 제공하는 단계; 하나 이상의 PPV5B 펩타이드를, 대상체로부터 수득한 샘플과 접촉시키는 단계; 샘플에서 하나 이상의 PPV5B 펩타이드에 결합할 수 있는 항체가 검출되는 경우 상기 대상체를 PPV5B 감염을 갖는 것으로서 식별하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은, 하나 이상의 PPV5B 펩타이드를, 바람직하게는 담체 분자와 함께 포함하는 면역원성 조성물; 면역원성 조성물을 포장하기 위한 컨테이너; 인쇄된 지침서들의 세트; 및 면역원성 조성물을 동물에게 투여할 수 있는 디스펜서를 포함하는 키트를 제공한다. 임의로, 하나 이상의 PPV5B 펩타이드와 담체 분자는 접합체로서 또는 별도의 화합물로서 포장될 수 있다. 별도로 공급되는 경우, 하나 이상의 PPV5B 펩타이드와 담체 분자를 접합시키는 수단뿐만 아니라 적절한 인쇄된 지침서도 공급된다.

또한, 본 발명은, 인쇄된 지침서들의 세트; 동물에게 하나 이상의 PPV5B 펩타이드를 포함하는 본원에 제공된 면역원성 조성물을 투여할 수 있는 디스펜서(여기서, PPV5B 펩타이드 중 하나 이상은, PPV5B 감염과 관련된 하나 이상의 질환에 대해 동물을 효과적으로 면역화시킨다)를 포함하는, 동물에게 백신접종하기 위한 키트를 제공한다. 바람직하게는, 하나 이상의 PPV5B 펩타이드는, 본원에 제공된 것들로부터 선택된다. 본 발명의 키트는, 수의학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트, 또는 이들의 배합물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 키트 내의 디스펜서는 이의 내용물을 액적(droplet)으로서 분배할 수 있으며; 키트 내에 포함된 본원에서 제공된 바와 같은 PPV5B 펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물은, 동물에게 비강내, 경구, 피내 또는 근육내 투여되는 경우 PPV5B 감염의 하나 이상의 임상 증상의 중증도를 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 임상 증상의 중증도는, 치료되지 않은 감염 동물과 비교하여 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 보다 더 바람직하게는 적어도 30%, 보다 더 바람직하게는 적어도 50%, 보다 더 바람직하게는 적어도 70%, 가장 바람직하게는 적어도 100%까지 감소된다.

PPV5B에 의해 야기되는 감염의 치료 또는 예방을 위한 방법도 개시된다. 상기 방법은, 대상체에게 본 발명의 면역원성 조성물의 유효량을 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 치료 또는 예방은, PPV5B 감염의 증상 감소, PPV5B 감염의 임상 증상의 중증도 또는 유병률 감소, PPV5B 감염으로부터의 대상체의 사망률 감소, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 조성물은, 수의학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트, 또는 이들의 배합물을 추가로 포함한다. 이들 조성물은 백신으로서 사용될 수 있으며, 하나 이상의 추가의 약독화된 백신, 불활성화된 백신, 또는 이들의 조합을 포함한다. 이러한 백신은, 돼지 파르보바이러스 1, 2, 3, 4, 5A, 5B, 기타의 돼지 파르보바이러스 종, 기타의 돼지 병원성 바이러스 및 박테리아, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 바이러스와 관련된 하나 이상의 질환에 대해 방어적 면역학적 반응을 유발한다. PPV5B에 대한 백신과 함께 공동-투여될 수 있는 다른 유형의 백신으로는 돼지 써코바이러스 타입 2(예를 들면, Ingelvac® CircoFLEX, Ingelvac® CircoFLEX-MycoFLEX), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(예를 들면, Ingelvac® PRRS ATP, Ingelvac® PRRSV MLV), 돼지 파르보바이러스(예를 들면, ReproCyc® PRRSV-PLE), 마이코플라스마(예를 들면, Ingelvac®MycoFLEX) 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

당해 분야 숙련가들은, 본원에서 사용되는 조성물이 공지의 주사가능한 생리학적으로 허용되는 멸균 용액을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 비경구 주사 또는 주입용의 바로 사용가능한 용액을 제조하기 위해, 등장성 수용액, 예를 들면, 염수 또는 혈장 단백질 용액을 쉽게 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물 및 백신 조성물은, 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 희석제, 등장성 제제, 안정화제 또는 애쥬번트를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은, 본 발명의 조성물을, 수의학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트, 또는 이들의 배합물과 혼합함을 포함할 수 있다. 당해 분야 숙련가들은, 담체, 애쥬번트, 또는 배합물의 선택이, 특히, 전달 경로, 개인적 선호, 및 동물 종에 의해 결정될 것임을 인지할 것이다.

또한, 본 발명은, 조성물을 동물에게 투여함으로써 동물에서 진행중인 PPV5B 감염의 중증도를 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 조성물은, 허용가능한 수의학적 담체와 함께 약독화된 바이러스 배양물 또는 하나 이상의 PPV5B 펩타이드를 포함할 수 있다.

바람직한 투여 경로는 비강내, 경구(예를 들면, 음용수로), 피내 및 근육내를 포함한다. 근육내 투여, 가장 바람직하게는 단일 용량으로의 근육내 투여가 바람직하다. 숙련가는, 본 발명의 조성물이 2회 이상의 용량으로 및 다른 투여 경로에 의해서도 투여될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, 이러한 기타의 경로로는 피하, 피부내, 정맥내, 혈관내, 동맥내, 복강내, 척수강내, 기관내, 피부내, 심장내, 폐엽내, 수질내, 폐내, 또는 질내가 포함된다. 치료의 목적하는 지속시간 및 효과에 따라, 본 발명에 따른 조성물은, 예를 들면, 수일, 수주 또는 수개월 동안 그리고 상이한 용량으로 1일 기준으로 1회 또는 수회, 또한 간헐적으로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은, 인쇄된 지침서들의 세트; 동물에게 백신을 투여할 수 있는 디스펜서; 및 PPV5B, 기타의 파르보바이러스 스트레인, 기타의 병원체 및/또는 이들의 조합과 관련된 하나 이상의 질환에 대해 동물을 효과적으로 면역화시키는 박테리아, 진균, 곤충 또는 포유동물 세포 배양물이 포함되지만 이에 제한되지 않는 세포 배양물로부터의 적어도 하나의 단리물을 포함하는, 동물에게 백신접종하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는, 수의학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트, 또는 이들의 배합물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 키트 내의 디스펜서는, 이의 내용물을 액적으로서 분배할 수 있으며; 키트 내에 포함된 단리물은 동물에게 비강내, 경구, 피내 또는 근육내 투여되는 경우 PPV5B 감염의 하나 이상의 임상 증상의 중증도를 감소시킬 수 있다. 몇몇 키트에서, 단리물은, 또한, PPV5B 감염의 하나 이상의 임상 증상의 중증도를 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 임상 증상의 중증도는, 치료되지 않은 감염 동물과 비교하여 적어도 10%까지 감소된다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점들은 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 취지 및 범위 내의 다양한 변화와 변형이 이러한 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 당해 분야 숙련가들에게 명백해질 것이므로, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 구체적인 실시예는, 본 발명의 바람직한 실시형태들을 나타내기는 하지만, 단지 예시의 방법으로 제공됨을 이해해야 한다.

하기 도면들은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 발명의 소정 양상들을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은, 본원에 제시된 특정 실시형태들의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다. 본 출원은, 색상이 배제된 하나 이상의 도면들을 포함한다. 컬러 도면(들)이 있는 본 특허 출원 공개의 사본은 요청 및 필요 경비 지불비 사무국에 의해 제공될 것이다.
도 1은 PPV5B의 핵산 서열(서열번호 1)을 보여준다.
도 2는 PPV5B 레플리카제의 단백질 서열(서열번호 2)을 보여준다.
도 3은 PPV5B 개방 판독 프레임(ORF) 단백질의 단백질 서열(서열번호 3)을 보여준다.
도 4는 PPV5B 캡시드 단백질의 단백질 서열(서열번호 4)을 보여준다.
도 5는 PPV5B 캡시드 단백질의 단백질 서열 및 다수의 다른 바이러스 서열의 쌍을 이룬(pair-wise) 아미노산 동일성 비교를 보여준다. 바이러스 서열에 대한 참조문헌은 표 1에 열거되어 있다:
[표 1]

도 6은, 표 1에 열거된 다른 바이러스성 VP1 및 캡시드 단백질과 비교한 PPV5B의 VP1/CAP 영역의 계통발생 분석을 보여준다.
도 7은, 53%의 서열 동일성(367/690)을 보여주는, PPV4의 가장 밀접한 관련 단백질(GenBank 수탁 # AFM73881(서열번호 5))에 대한 PPV5B 캡시드 단백질(서열번호 4의 잔기 184 내지 851)의 동일성을 보여준다.
도 8은 87%의 서열 동일성(517/597)을 보여주는, PPV4의 가장 밀접한 관련 단백질(GenBank 수탁 # ADF59557(서열번호 11))에 대한 PPV5B 레플리카제 단백질(서열번호 2의 잔기 1 내지 594)의 동일성을 보여준다.

본 발명은, 핵산 및 이의 단편, 폴리펩타이드 및 이의 면역학적으로 유효한 단편, 백신, 면역학적으로 유효한 제제, 항체, 진단 검정 및 키트, 및 본원에 개시된 신규한 돼지 파르보바이러스 5B 및 이의 변이체와 관련하여 상기 조성물 및 제제를 제조 및 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 단백질 화학 및 면역학의 통상적인 기술들을 사용할 것이며, 이것은 당해 기술 내이다. 이러한 기술들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌[Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press); 및 Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)]을 참조한다.

본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은, 특정 DNA, 폴리펩타이드 서열 또는 공정 파라미터에 제한되지 않는데, 그 이유는 물론 이것이 변할 수 있기 때문임을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 단지 본 발명의 특정 실시형태들을 기술할 목적을 위한 것이고, 제한되는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "한", "하나" 및 "상기"는 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 관계항을 포함함에 주의해야 한다. 따라서, 예를 들면, "한 항원(an antigen)"에 대한 참조는 2개 이상의 항원들의 혼합물을 포함하며, "한 부형제(an excipient)"에 대한 참조는 2개 이상의 부형제의 혼합물을 포함하는 등이다.

A. 정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는, 출원시 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 용어의 의미 및 범위는 명확해야 하지만; 임의의 잠재적 모호성이 있는 경우, 본원에 제공된 정의들은 사전 또는 외인적 정의를 능가하는 선례를 취한다. 또한, 문맥에 달리 요구되지 않는 한, 단수형이 복수를 포함할 수 있고 복수 용어가 단수를 포함할 수 있다. 본원에서, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라 "포함하다" 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한되지 않는다. 본원에 인용된 모든 특허들 및 공보들은 본원에 인용에 의해 포함된다.

"질환에 대한 보호", "방어 면역(protective immunity)", "기능 면역(functional immunity)" 및 유사 어구들은, 질환 또는 감염에 노출되었던 면역화되지 않은 대상체에서 예상되는 것보다 더 적은 유해 효과를 초래하는, 본 발명의 하나 이상의 치료학적 조성물 또는 이의 배합물의 투여에 의해 발생되는 질환 또는 병태에 대한 반응을 의미한다. 즉, 백신접종된 대상체에서는 감염의 유해한 효과의 중증도가 줄어든다. 백신접종된 대상체에서는 감염이 감소되거나, 느려지거나, 가능하게는 완전 예방될 수 있다. 본원에서, 감염의 완전한 예방을 의미하는 경우에는, 구체적으로 언급된다. 완전한 예방이 언급되지 않는 경우, 용어는 부분적 예방을 포함한다.

본원에서, "임상 증상의 유병률 및/또는 중증도의 감소" 또는 "임상 징후의 감소"는, 야생형(wild-type) 감염과 비교하여, 그룹에서의 감염된 대상체의 수 감소, 감염의 임상 증상을 나타내는 대상체의 수 감소 또는 제거, 또는 하나 이상의 대상체에 존재하는 임의의 임상 증상의 중증도 감소를 의미하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 이것은 병원체 부하의 임의의 감소, 병원체 차단(shedding), 병원체 전파의 감소, 또는 PPV5B로의 감염의 징후가 있는 임의의 임상 증상의 감소를 나타내야 한다. 바람직하게는 이러한 임상 증상은, 조성물을 제공받지 못하여 감염된 대상체와 비교하여, 본 발명의 치료학적 조성물을 제공받은 하나 이상의 대상체에서 적어도 10%까지 감소된다. 보다 바람직하게는 임상 증상은, 본 발명의 조성물을 제공받은 대상체에서 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 50%까지 감소된다.

본원에서 용어 "증가된 보호"는, 백신접종 그룹의 대상체 vs. 백신접종되지 않은 대조군 그룹의 대상체에서 감염원(infectious agent), 바람직하게는 PPV5B에 의한 감염과 관련된 하나 이상의 임상 징후의 유의한 감소를 의미하지만, 이에 제한되지 않는다. 용어 "임상 징후의 유의한 감소"는, 백신접종 그룹의 대상체에서의 하나 이상의 임상 징후의 유병률에 있어서의 빈도가 감염원의 시험감염(challenge) 후 백신접종되지 않은 대조군 그룹에서보다 적어도 10%, 바람직하게는 20%, 보다 바람직하게는 30%, 보다 더 바람직하게는 50%, 보다 더 바람직하게는 70% 더 낮음을 의미하지만, 이에 제한되지 않는다.

"장기-지속성 보호"는, 적어도 3주, 보다 바람직하게는 적어도 3개월, 보다 더 바람직하게는 적어도 6개월 동안 지속되는 "개선된 효능"을 나타내야 한다. 가축의 경우에, 장기 지속성 보호는, 동물이 고기용으로 판매되는 평균 연령까지 지속되는 것이 가장 바람직하다.

"면역원성 또는 면역학적 조성물"은, 조성물에 대해 세포성 또는 항체-매개된 면역 반응의 숙주에서 면역학적 반응을 도출하는, 하나 이상의 PPV5B 단백질 또는 폴리펩타이드, 또는 이의 면역원성 부분을 포함하는 물질의 구성물을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 면역원성 조성물은 면역 반응을 유도하며, 보다 바람직하게는, PPV5B 감염의 임상 증상 중 하나 이상에 대한 방어 면역을 부여한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "면역원성" PPV5B 폴리펩타이드, 또는 "항원"은, 본원에 기술된 바와 같은 면역학적 반응을 도출하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 나타낸다. "면역원성" PPV5B 단백질 또는 폴리펩타이드는, 본원에서 확인된 암호화 서열 중 어느 것 또는 이의 유사체 또는 면역원성 단편의 전장 서열(full-length sequence)을 포함한다. 용어 "면역원성 단편" 또는 "면역원성 부분"은 하나 이상의 에피토프를 포함하고, 따라서 본원에 기술된 면역학적 반응을 도출하는 PPV5B 단백질의 아미노산 서열의 단편 또는 절단된 및/또는 치환된 형태를 나타낸다. 일반적으로, 이러한 절단된 및/또는 치환된 형태, 또는 단편은, 전장 단백질, 예를 들면, 캡시드 단백질로부터의 13개 이상의 연속한 아미노산을 포함하거나 암호화할 것이다. 보다 바람직하게는, 절단된 또는 치환된 형태, 또는 단편은 전장 단백질, 예를 들면, 캡시드 단백질로부터의 적어도 15개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 20개, 보다 더 바람직하게는 30개의 연속한 아미노산을 가질 것이다.

용어 "에피토프"는, 면역계에 의해, 구체적으로는 항체, B 세포 또는 T 세포에 의해 인식되는, 물질의 구성물, 예를 들면, 단백질 또는 폴리펩타이드의 절편 또는 단편을 의미한다. 본 발명에서, 에피토프는 일반적으로 바이러스성 단백질의 폴리펩타이드 서열의 단편 또는 단편들이다.

이러한 단편은, 당해 분야에 널리 공지되어 있는 임의의 수의 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 동정할 수 있다, 예를 들면, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey]을 참조한다. 예를 들면, 선형 에피토프는, 단백질 분자의 일부에 상응하는 다수의 펩타이드를 고체 지지체 상에서 동시에 합성하고, 이 펩타이드가 여전히 지지체에 부착되도록 하면서 항체와 펩타이드를 반응시킴으로써 측정할 수 있다. 이러한 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[미국 특허 제4,708,871호; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; and Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715]을 참조한다. 유사하게, 입체배좌 에피토프는, 예를 들면, x선 결정학 및 2차원 핵자기 공명에 의해 아미노산의 공간적 입체배좌를 측정함으로써 쉽게 동정할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Epitope Mapping Protocols, supra]을 참조한다. 합성 항원, 예를 들면, 폴리에피토프, 플랭킹 에피토프 및 다른 재조합 또는 합성적으로 유도된 항원도 정의 내에 포함된다. 예를 들면, 문헌[Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; 및 Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998]을 참조한다. (이의 교시 및 내용은 모두 본원에 인용에 의해 포함된다.)

"면역 반응" 또는 "면역학적 반응"은, 목적하는 조성물 또는 백신에 대한 세포성 및/또는 항체-매개된 면역 반응의 전개를 의미하지만, 이에 제한되지 않는다. 통상적으로, 면역 또는 면역학적 반응은 하기 효과들 중 하나 이상을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다: 목적하는 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 지시되는 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포의 생산 또는 활성화. 바람직하게는, 숙주는, 새로운 감염에 대한 내성이 향상되고/되거나 질환의 임상적 중증도가 감소되도록 치료학적 또는 방어적 면역학적 (기억) 반응을 나타낼 것이다. 이러한 보호는, 징후의 수, 징후의 중증도의 감소, 또는 병원체의 감염과 관련된 징후 중 하나 이상의 결여, 바이러스혈증의 개시 지연, 감소된 바이러스 지속성, 전체 바이러스 부하의 감소 및/또는 바이러스 배설의 감소에 의해 입증될 것이다.

본원에서, "특이적으로 면역반응성인"은, PPV5B 감염을 특징으로 하는 항원을 인식하지만 엄격한 시험감염 대조군을 특징으로 하는 항원과는 반응하지 않는 면역반응성 단백질 또는 폴리펩타이드를 나타낸다. 잠재적인 PPV5B 면역반응성 단백질 또는 기타의 폴리펩타이드의 특이성을 측정하기 위해, 다양한 면역검정(ELISA, IFA, 웨스턴블롯)을 사용하여 유전적으로 유사한 바이러스를 함유하는 동물 혈청에 대해 단백질을 시험할 것이다. 단백질은, 또한, 발현 방법과 관련된 단백질을 함유하는 물질에 대한 각종 면역검정으로 시험될 것이다(바큘로바이러스, Sf9 세포 등).

본원에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체" 또는 "부형제"로는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 애쥬번트, 안정화제, 희석제, 방부제, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제, 흡착 지연제 등이 포함된다. 몇몇의 바람직한 실시형태에서, 그리고, 특히 감압 동결건조된 면역원성 조성물을 포함하는 것에서, 본 발명에서 사용하기 위한 안정화제는 감압 동결건조(lyophilization) 또는 동결-건조(freeze-drying)를 위한 안정화제를 포함한다.

몇몇의 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 애쥬번트를 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "애쥬번트"로는, 수산화 알루미늄 및 인산 알루미늄, 사포닌, 예를 들면, Quil A, QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), 유-중-수 에멀젼, 수-중-유 에멀젼, 수-중-유-중-수 에멀젼이 포함될 수 있다. 에멀젼은, 특히, 경질 액체 파라핀 오일(유럽 약전 타입); 스쿠알란 또는 스쿠알렌과 같은 이소프레노이드 오일; 알켄의 올리고머화, 특히, 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로부터 야기되는 오일; 선형 알킬 그룹을 함유하는 산 또는 알콜의 에스테르, 보다 구체적으로는 식물 오일, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산 또는 알콜의 에스테르, 특히, 이소스테아르산 에스테르를 기본으로 할 수 있다. 오일은, 에멀젼을 형성하기 위해 유화제와 함께 사용된다. 유화제는 바람직하게는 비이온성 계면활성제, 특히, 소르비탄의 에스테르, 만니드의 에스테르(예를 들면, 안하이드로만니톨 올레에이트), 글리콜의 에스테르, 폴리글리세롤의 에스테르, 프로필렌 글리콜의 에스테르 및 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르(이것은 경우에 따라 에톡실화된다), 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 특히, 플루로닉(Pluronic) 제품, 특히, L121이다. 문헌[Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, p51-94(1995) 및 Todd et al., Vaccine 15: 564-570(1997)]을 참조한다. 예시적인 애쥬번트는 문헌["Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995]의 147면에 기술된 SPT 에멀젼, 및 동일 서적의 183면에 기술된 에멀젼 MF59이다.

애쥬번트의 추가의 예는, 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체로부터 선택되는 화합물이다. 유리한 애쥬번트 화합물은, 특히, 당 또는 폴리알콜의 폴리알케닐 에테르와 가교-결합된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이다. 이들 화합물은 용어 카보머(carbomer)(Phameuropa Vol. 8, No. 2, 1996년 6월)로 공지되어 있다. 당해 분야 숙련가는, 또한, 하이드록실 그룹이 적어도 3개, 바람직하게는 8개 이하이고, 적어도 3개의 하이드록실의 수소 원자가, 적어도 2개의 탄소원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로 대체되어 있는 폴리하이드록실화 화합물과 가교-결합된 이러한 아크릴 중합체를 기술하는 미국 특허 제2,909,462호를 참조할 수 있다. 바람직한 라디칼은, 2개 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 것, 예를 들면, 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 그룹이다. 불포화 라디칼은 자체에 다른 치환체, 예를 들면, 메틸을 함유할 수 있다. 상표명 Carbopol(BF Goodrich, Ohio, USA)로 시판되는 제품이 특히 적절하다. 이들은 알릴 수크로스 또는 알릴 펜타에리트리톨과 가교결합된다. 이들 중에서, Carbopol 974P, 934P 및 971P가 언급될 수 있다. Carbopol 971P의 사용이 가장 바람직하다. 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체 중에는, 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체인 공중합체 EMA(Monsanto)가 있다. 물에 이들 중합체를 용해시키는 것은, 산 용액을 초래하고, 이것은, 면역원성, 면역학적 또는 백신 조성물 자체가 혼입될 애쥬번트 용액을 제공하기 위해 바람직하게는 생리학적 pH로 중화될 것이다.

추가의 적합한 애쥬번트로는 다수의 다른 것들 중에서도 RIBI 애쥬번트 시스템(Ribi Inc.), 블록 공중합체(CytRx, Atlanta GA), SAF-M(Chiron, Emeryville CA), 모노포스포릴 지질 A, Avridine 지질-아민 애쥬번트, 이. 콜라이(재조합 또는 기타) 유래의 열-불안정성(heat-labile) 내독소, 콜레라 독소, IMS 1314 또는 뮤라밀 디펩타이드, 또는 천연 발생 또는 재조합 사이토킨 또는 이의 유사체 또는 내인성 사이토킨 방출의 자극제가 포함되지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

애쥬번트는, 용량당 약 100㎍ 내지 약 10mg의 양으로, 바람직하게는 용량당 약 500㎍ 내지 약 5mg의 양으로, 보다 바람직하게는 용량당 약 750㎍ 내지 약 2.5mg의 양으로, 가장 바람직하게는 용량당 약 1mg의 양으로 첨가될 수 있는 것으로 예상된다. 대안으로, 애쥬번트는, 최종 생성물의 약 0.01 내지 50용적%의 농도, 바람직하게는 약 2용적% 내지 30용적%의 농도, 보다 바람직하게는 약 5용적% 내지 25용적%의 농도, 보다 더 바람직하게는 약 7용적% 내지 22용적%의 농도, 가장 바람직하게는 10용적% 내지 20용적%의 농도로 존재할 수 있다.

"희석제"로는 물, 염수, 덱스트로스, 에탄올, 및 글리세롤 등이 포함될 수 있다. 등장성 제제로는 특히 염화 나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스가 포함될 수 있다. 안정화제로는 특히 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리 염이 포함된다.

"단리된(isolated)"은 이의 천연 상태로부터 "사람의 손에 의해" 변경됨을 의미하며, 즉, 자연에서 발생한 경우, 이것이 이의 원래의 환경으로부터 변화되거나 제거되거나 변화 및 제거되었음을 의미한다. 예를 들면, 생물체에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 "단리"되지 않지만, 이의 자연 상태의 공존하는 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는, 당해 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이, "단리"된다.

"안전성"은 독성(virulence)에 대한 생 바이러스계 백신의 잠재적인 역전, 지속적인 전신성 질병 또는 백신 투여 부위에서의 허용되지 않는 염증과 같은 임상적으로 유의한 부작용을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 백신접종 후 백신접종된 동물에서의 유해한 결과의 부재를 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "백신접종" 또는 "백신접종하는" 또는 이의 변형은, 동물에게 투여되는 경우, PPV5B에 대해 동물에서 면역 반응을 - 직접 또는 간접적으로- 도출하거나 도출할 수 있는 본 발명의 면역원성 조성물의 투여를 포함하는 프로세스를 의미하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 맥락에서 "사망률"은, PPV5B 감염에 의해 야기되는 사망 및/또는 PPV5B 감염에 의해 강화된 다른 유기체로의 동시-감염을 나타내며, 감염이 너무 심해서 고통을 방지하고 일생이 인도적으로 마감되도록 동물을 안락사시키는 상황을 포함한다.

"약독화"는, 병원체의 독성을 감소시킴을 의미한다. 본 발명에서, "약독화"는 "무독성(avirulent)"과 동의어이다. 본 발명에서, 약독화된 바이러스는, PPV5B 감염의 임상 증상을 야기하지 않지만 표적 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있도록 독성이 감소된 것이지만, 또한, 임상 증상이, 약독화되지 않은 PPV5B로 감염되고 약독화된 바이러스를 투여받지 않은 동물의 "대조군 그룹"과 비교하여 약독화된 PPV5B로 감염된 동물에서 유병률 또는 중증도에 있어서 감소됨을 의미할 수 있다. 이러한 맥락에서, 용어 "감소하다/감소된"은, 상기 정의된 바와 같은 대조군 그룹과 비교하여 적어도 10%, 바람직하게는 25%, 보다 더 바람직하게는 50%, 보다 더 바람직하게는 60%, 보다 더 바람직하게는 70%, 보다 더 바람직하게는 80%, 보다 더 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 100%의 감소를 의미한다. 따라서, 약독화된 무독성 PPV5B 스트레인이, 변형된 생 PPV5B 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물에 혼입하기에 적합한 것이다.

"사멸된" 또는 "불활성화된"은, PPV5B 바이러스가 사멸되게 하고/하거나 그렇지 않으면 생식할 수 없게 하는 물리적 또는 화학적 제제로 처리됨을 의미한다. PPV5B는, 예를 들면, 자외선 광의 존재 하에서 열, 방사선 또는 소랄렌과 같은 통상의 수단에 의해 사멸될 수 있다. PPV5B는, 예를 들면, 이원성 에틸렌이민(BEI), 베타-프로피오락톤, 포르말린, 글루테르알데히드 및/또는 나트륨 도데실 설페이트 중 하나 이상을 포함하거나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 화학적 불활성화제를 사용한 화학적 불활성화를 통해서와 같은 통상의 수단으로 불활성화될 수 있다. 이러한 바이러스의 독성 스트레인을 약독화시키는 방법 및 불활성화된 바이러스 제제를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, U.S. 제4,567,042호 및 제4,567,043호에 기술되어 있다. 따라서, 본 발명의 백신 조성물에서 사용하기 위한 PPV5B로부터의 항원은, 특히, 변형된 및/또는 약독화된 생 바이러스 제제 또는 사멸되거나 불활성화된 바이러스 제제인 전 바이러스(whole virus)의 형태로 존재할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "항체"는, 항-PPV5B 항체, 예를 들면, 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 단일쇄 항체, 키메라 항체, 사람화된, 사람, 돼지, 및 본 발명의 PPV5B 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 CDR 서열을 포함하는 화합물을 포함하는 CDR-절편이식ehls 항체를 포함한다. 용어 "에 특이적인"은, 본 발명의 항체의 가변 영역이 PPV5B 폴리펩타이드만을 인식하고 결합함(즉, 폴리펩타이드 부류에서 발견된 서열 동일성, 상동성 또는 유사성에도 불구하고 관련 폴리펩타이드로부터 단일 PPV5B 폴리펩타이드를 구분할 수 있음)을 나타내며, 이것은 항체의 가변 영역 바깥에, 그리고, 특히, 항체 분자의 불변 영역에서의 서열과의 상호작용을 통해 다른 단백질(예를 들면, 에스. 아우레우스(S. aureus) 단백질 A 또는 ELISA 기술에서의 기타의 항체)과 상호작용하도록 (임의로) 허용된다. 본 발명의 항체의 결합 특이성을 측정하기 위한 스크리닝 검정은 널리 공지되어 있으며, 당해 분야에서 일상적으로 실시되고 있다. 이러한 검정의 포괄적인 논의를 위해, 문헌[Harlow et al. (Eds), Antibodies A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6]을 참조한다. 항체가, 단편이 유도되는 본 발명의 PPV5B 폴리펩타이드에 대해 상기에 정의된 바와 같이 다른 무엇보다도 더 특이적인 한, 본 발명의 PPV5B 폴리펩타이드의 단편을 인식하고 결합하는 항체가 또한 고려된다. 명료성의 목적으로, "항체"는, 항원에 대한 면역 반응의 결과로서 특정 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 나타낸다. 면역글로불린은 "불변" 및 "가변" 영역을 갖는 "경" 및 "중" 폴리펩타이드 쇄로 이루어진 혈청 단백질이며, 불변 영역의 조성에 기초하여 종류별로 분류된다(예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM). 항체는, 예를 들면, Fv, Fab', F(ab')2를 포함하는 다양한 형태뿐만 아니라 단일 쇄로 존재할 수 있으며, 하나 이상의 항체 단일 쇄 폴리펩타이드 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 합성 폴리펩타이드를 포함한다.

본원에서, "유효 용량"은, 항원이 투여되는 동물에서 임상 징후의 감소를 야기하는 면역 반응을 도출하거나 도출할 수 있는 항원의 양을 의미하지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "유효량"은, 조성물의 맥락에서, 동물에서 감염의 유병률을 감소시키거나 감염의 중증도 또는 질환의 유병률을 줄이는 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물의 양을 의미한다. 특히, 용량당 플라크 형성 단위(PFU)의 수 또는 등가의 척도에 의해 측정되는 바와 같은 약독화된 생 바이러스 제제의 유효량은, 중앙 조직 배양 감염량(TCID50), 즉, 접종된 감수성 세포 배양물의 50%에서 병리학적 변화를 생성할 것인 병원성 제제(pathogenic agent)의 양에 의해 모니터링된다. 사 백신 또는 항원성 서브유닛의 경우, 유효량은 상대적 항원 함량(relative antigen content; RAC), 즉, 유효 용량당 항원의 포함 수준(inclusion level)을 나타낸다. 대안으로, 치료요법의 맥락에서, 용어 "유효량"은 질환 또는 장애 또는 이의 하나 이상의 징후들의 중증도 또는 지속기간을 감소 또는 개량하거나, 질환 또는 장애의 진전을 예방하거나, 질환 또는 장애의 퇴행을 야기하거나, 질환 또는 장애와 관련된 하나 이상의 징후들의 재발, 발달, 개시 또는 진행을 예방하거나, 다른 치료요법 또는 치료학적 제제의 예방 또는 치료를 증진 또는 개선시키는데 충분한 치료요법의 양을 나타낸다.

당해 분야에 공지된 바와 같은 "서열 동일성"은, 2개 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열, 즉, 참조 서열 및 이 참조 서열과 비교할 주어진 서열 간의 관계를 나타낸다. 서열 동일성은, 주어진 서열과 참조 서열을 이 서열들의 줄 간에 정합도(match)로 측정되는 서열 유사성이 최고 정도가 되도록 최적으로 정렬하고, 필요에 따라, 갭을 도입한 후 두 서열을 비교함으로써 결정된다. 이러한 정렬시에, 서열 동일성은 위치마다 기준하여 확인하며, 예를 들면, 특정 위치에서 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 동일하다면 그 위치의 서열은 "동일한" 것이다. 이어서, 이러한 위치 동일성의 총 수를 참조 서열의 뉴클레오타이드 또는 잔기의 총 수로 나누어 서열 동일성 %를 제공한다. 서열 동일성은 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); 및 Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988); 이의 교시들은 본원에 인용에 의해 포함된다]에 기술된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공지된 방법으로 쉽게 계산할 수 있다. 서열 동일성을 측정하는 바람직한 방법은, 시험된 서열 간에 최대 정합도를 제공하도록 설계된다. 서열 동일성을 측정하는 방법은 주어진 서열 간에 서열 동일성을 측정하는 공공의 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 성문화된다. 이러한 프로그램의 예로는 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al.. Nucleic Acids Research, 12(1):387(1984)), BLASTP, BLASTN 및 BLASTX(Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990))가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 공급원으로부터 공공으로 이용가능하다(BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), 이의 교시들은 본원에 인용에 의해 포함된다). 이들 프로그램은 주어진 서열과 참조 서열 간에 서열 동일성을 최고 수준으로 생성하기 위해 디폴트 갭 가중치(default gap weight)를 사용하여 서열을 최적으로 정렬한다. 일례로서, 참조 뉴클레오타이드 서열과 예를 들면, 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 보다 더 바람직하게는 95% "서열 동일성"을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드란, 주어진 폴리뉴클레오타이드 서열이 참조 뉴클레오타이드 서열의 각 100개의 뉴클레오타이드당 15개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 보다 더 바람직하게는 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는, 주어진 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 참조 서열과 동일한 것으로 의도된다. 즉, 참조 뉴클레오타이드 서열에 비해 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 보다 더 바람직하게는 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에서, 참조 서열의 뉴클레오타이드의 15% 이하, 바람직하게는 10%, 보다 더 바람직하게는 5%가 다른 뉴클레오타이드로 치환 또는 결실될 수 있거나, 참조 서열의 총 뉴클레오타이드의 15% 이하, 바람직하게는 10%, 보다 더 바람직하게는 5%의 뉴클레오타이드 수가 참조 서열에 삽입될 수 있다. 이러한 참조 서열의 돌연변이는, 참조 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 이러한 말단 위치 사이의 어디서든 일어날 수 있으며, 참조 서열 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속한 그룹의 뉴클레오타이드들 중에서 개별적으로 산발적으로 일어날 수 있다. 유사하게, 참조 아미노산 서열과, 예를 들면, 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 보다 더 바람직하게는 95% 서열 동일성을 갖는 주어진 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드란, 주어진 폴리펩타이드 서열이 참조 아미노산 서열의 각 100개의 아미노산당 15개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 보다 더 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있음을 제외하고는 폴리펩타이드의 주어진 아미노산 서열이 참조 서열과 동일한 것으로 의도된다. 즉, 참조 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 보다 더 바람직하게는 95% 서열 동일성을 갖는 주어진 폴리펩타이드 서열을 수득하기 위해, 참조 서열의 아미노산 잔기 중 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 더 바람직하게는 5% 이하가 다른 아미노산으로 치환 또는 결실될 수 있거나, 참조 서열의 아미노산 잔기의 총 수의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 더 바람직하게는 5% 이하의 아미노산 수가 참조 서열에 삽입될 수 있다. 이러한 참조 서열의 변경은 참조 아미노산 서열의 아미노 또는 카복시 말단 위치 또는 이러한 말단 위치 사이의 어디서든 일어날 수 있으며, 참조 서열 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속한 그룹의 잔기들 중에서 개별적으로 산발적으로 일어날 수 있다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 달라진다. 그러나, 보존적 치환은, 서열 동일성을 결정할 때 정합도로서 포함되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "서열 상동성"은, 두 서열의 관계성을 측정하는 방법을 나타낸다. 서열 상동성을 측정하기 위해, 2개 이상의 서열을 최적으로 정렬하고, 필요에 따라 갭을 도입한다. 그러나, "서열 동일성"과는 대조적으로, 보존적 아미노산 치환은, 서열 상동성을 측정할 때 정합도로서도 계수된다. 즉, 참조 서열과 95% 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 수득하기 위해, 참조 서열의 아미노산 잔기의 85%, 바람직하게는 90%, 보다 더 바람직하게는 95%가 정합되거나 다른 아미노산으로의 보존적 치환을 포함해야 하거나, 참조 서열의, 보존적 치환을 포함하지 않는 총 아미노산 잔기의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 더 바람직하게는 5% 이하의 아미노산 수가 참조 서열에 삽입될 수 있다. 바람직하게는 상동 서열은 적어도 50개, 보다 더 바람직하게는 100개, 보다 더 바람직하게는 250개, 보다 더 바람직하게는 500개의 일련의 뉴클레오타이드 암호화 상동 아미노산을 포함한다.

"보존적 치환"은, 아미노산 잔기를 전반적인 기능성이 유의하게 변화하지 않도록 크기, 소수성 등을 포함하는 특성이나 성질이 유사한 다른 아미노산 잔기로 치환함을 나타낸다. 또한, 이것은, 보존적 아미노산 치환을 초래하는 뉴클레오타이드 치환을 의미할 수 있다.

B. 담체 분자

본 발명의 PPV5B 단백질 또는 펩타이드가 접합하거나 공액 결합할 수 있는 담체 분자는 바람직하게는 상기한 것들이다. 동물 사용에 바람직한 담체는 소 혈청 알부민 및 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole Limpet Hemocyanin)이다. 바람직하게는, 담체 단백질 자체가 면역원이다.

본 발명의 PPV5B 단백질 또는 펩타이드는 당해 분야에 공지된 통상의 방법으로 담체에 공액 결합될 수 있다. 문헌[Schneerson et al, J. Experimental Medicine, 152, 361-376 (1980)]에 기재된 바와 같은 아디프산 디하이드라지드와 같은 대칭 링커, 또는 문헌[Fattom et al, Infection and Immunity, 56, 2292-2298 (1988)]에 기재된 바와 같은 N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트와 같은 헤테로이작용성 링커의 사용이 본 발명의 범위내에 있지만, 다른 링커의 사용을 피하되 대신 본 발명의 PPV5B 펩타이드를 담체 분자에 직접 결합시키는 것이 바람직하다. 이러한 결합은 문헌[Landi et al J. Immunology, 127, 1011-1019 (1981)]에 기재된 바와 같이 환원적 아민화에 의해 달성할 수 있다.

평균 분자량에 의해 정의되는, 면역원성 조성물의 크기는 가변적이며, 선택된 PPV5B 단백질(들) 또는 펩타이드(들) 및 PPV5B 단백질(들) 또는 펩타이드(들)를 담체에 결합시키는 방법에 따라 좌우된다. 따라서, 이것은 1,000 달톤(10³) 정도로 작거나 10⁶ 달톤보다 클 수 있다. 환원적 아민화 결합방법에서는, PPV5B 단백질(들) 또는 펩타이드(들)의 분자량이 통상적으로 5,000 내지 500,000 또는 그 이상의 범위내이다; 예를 들면, 서열번호 4의 캡시드 단백질의 경우, 분자량은 대략 101,000 달톤인 것으로 예측되며, 이것이 60개의 단량체성 단백질로 이루어진 바이러스 유사 입자(VLP)를 형성하는 것으로 예측된다.

담체 분자, 즉, 본 발명의 PPV5B 단백질 또는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 이의 유도체 및 유사체, 및 펩타이드 모방체는 고체상 합성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당해 분야에 공지된 각종 방법들에 의해 또는 솔루션(Nakanishi et al., 1993, Gene 137:51-56; Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 15:2149-2154; Neurath, H. et al., Eds., The Proteins, Vol II, 3d Ed., p. 105-237, Academic Press, New York, N.Y. (1976), 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다)에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 PPV5B 단백질 또는 펩타이드 또는 본 발명의 항체 또는 이의 결합 부분은 약제학적 또는 수의학적 담체를 갖는 희석제 중의 용액 또는 현탁액에 의해 주사가능한 투여량으로 투여될 수 있다.

이러한 분자의 안전성 및 효능은 CVB(Center for Veterinary Biologics)에 의해 기술되고 규제된 바와 같이 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 절차에 의해 측정된다. 이러한 분자의 독성 및 치료 효능은, 예를 들면, LD₅₀(개체군의 50%를 치사시키는 용량)을 측정하기 위해, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 과정으로 측정할 수 있다.

본 발명의 백신은 다가이거나 일가일 수 있다. 다가 백신은 다중 PPV5B 단백질 또는 펩타이드와 담체 분자의 면역-접합체로부터 만들어진다.

한 양상에서, PPV5B 단백질 또는 펩타이드 조성물은 유효 면역량의 면역원성 접합체를, 바람직하게는 면역자극제; 및 생리학적으로 허용되는 비히클과 함께 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "면역자극제"는, 이것이 특정 항원과 조합된 특정한 상승 효과이든, 그저 면역 반응의 하나 이상의 요소의 활성에 대한 독립적인 효과이든 간에, 면역계의 활성을 증진시키는 능력을 갖는 어떠한 화합물 또는 조성물도 포함하는 것으로 의도된다. 면역자극제 화합물은 미네랄 겔, 예를 들면, 수산화알루미늄; 표면 활성 성분, 예를 들면, 리소레시틴, 플루론산 폴리올; 폴리음이온; 펩타이드; 오일 에멀젼; 명반 및 MDP를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 물질을 사용하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 주어진 백신에 대한 자극제의 최적량을 결정하는 것은 숙련된 기술자의 능력으로 충분히 할 수 있다. 하나 이상의 면역자극제가 주어진 제형에서 사용될 수 있다. 면역원이 또한 리포솜에 삽입되거나, 다당류 및/또는 백신 제형에 사용하기 위한 기타의 중합체에 접합될 수 있다.

조성물은, 경우에 따라, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여형을 함유할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치에 존재할 수 있다. 팩은, 예를 들면, 금속 또는 플라스틱 호일, 예를 들면, 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치에는 투여용 지침서, 바람직하게는 동물, 특히 돼지에게 투여하기 위한 지침서가 동반될 수 있다.

C. 애쥬번트

하나 이상의 PPV5B 단백질 또는 펩타이드을 함유하는 본원에 제공된 면역원성 조성물의 면역원성을 더욱 증가시키기 위해, 이것은 또한 하나 이상의 애쥬번트를 포함할 수 있다.

애쥬번트는 이전에 기재되거나 당해 분야에 공지된 기술들에 의해 정제될 수 있다. 바람직한 정제 기술은 문헌[W. Clark Still et al, J. Organic Chemistry, 43, 2923-2925 (1978)]에 기재된 바와 같은 실리카겔 크로마토그래피, 특히 "섬광" (급속) 크로마토그래피 기술이다. 그러나, HPLC를 포함한 다른 크로마토그래피법이 애쥬번트의 정제에 사용될 수 있다. 결정화가 또한 애쥬번트를 정제하는데 사용될 수 있다. 몇몇 경우에는, 분석적 순도의 생성물이 합성으로부터 바로 수득되기 때문에 정제가 필요치 않다.

본 발명의 백신 조성물은 애쥬번트를 항원보강된 조성물을 제조하기 위한 공지된 기술들에 따라 적합한 살균 조건하에서 PPV5B 단백질(들) 또는 펩타이드(들)와 물리적으로 혼합함으로써 제조된다. PPV5B 단백질(들) 또는 펩타이드(들)와 애쥬번트의 착화는 장쇄 알킬 화합물 애쥬번트 상에 존재하는 양전하에 정전기적으로 부착된 접합체 상의 순 음전하의 존재에 의해 촉진된다.

D. 생리학적으로 허용되는 비히클

본 발명의 백신 조성물은 다른 약제학적 폴리펩타이드 조성물에 사용되는 것과 유사한 기술을 사용하여 제형화될 수 있다. 따라서, 애쥬번트와 바람직하게는 담체 분자에 접합되고/되거나 애쥬번트와 혼합된 PPV5B 단백질(들) 또는 펩타이드(들)는 감압 동결건조된 형태로 저장되고, 투여전에 현탁액을 형성하기 위해 생리학적으로 허용되는 비히클에서 재구성될 수 있다. 또는, 애쥬번트와 접합체는 비히클에 저장할 수 있다. 바람직한 비히클은 멸균 용액, 특히, 멸균 완충액, 예를 들면, 인산염 완충 염수이다. 면역원성 조성물의 면역학적 효과가 개선되도록 애쥬번트와 접합체를 비히클 중에서 배합하는 어떠한 방법이라도 적합하다.

본 발명의 백신의 단일 용량의 용적은 변할 수 있지만, 일반적으로 통상의 백신에서 통상적으로 사용되는 범위내에 있을 것이다. 단일 용량의 용적은 상기 주지된 접합체와 애쥬번트의 농도에서 바람직하게는 약 0.1ml 내지 약 3ml, 바람직하게는 약 0.2ml 내지 약 1.5ml, 보다 바람직하게는 약 1.0ml이다.

본 발명의 백신 조성물은 통상의 수단으로 투여될 수 있다.

E. 제형화

담체 분자에 결합된 PPV5B 단백질(들) 또는 펩타이드(들)를 포함하는 면역원성 접합체가 PPV5B의 하나 이상의 혈청형에 대한 면역화를 위한 백신으로서 사용될 수 있다. 생리학적으로 허용되는 비히클 중의 면역원성 접합체를 포함하는 백신이 PPV5B에 의한 감염의 치료 또는 예방을 위해 동물, 바람직하게는 돼지를 면역화하는 방법에서 유용하다.

면역원성 접합체로의 면역화에 의해 본 발명의 면역원성 접합체에 대해 생성된 항체가 PPV5B의 감염을 치료 또는 예방하기 위해 수동적 면역요법 및 항유전자형 항체의 생성에 사용될 수 있다.

조성물이 투여되는 대상체는 바람직하게는 소, 말, 양, 돼지, 가금류(예를 들면, 닭), 염소, 고양이, 개, 햄스터, 마우스 및 쥐를 포함하지만 이에 제한되지 않는 동물; 가장 바람직하게는 돼지이다.

본 발명의 제형은 유효 면역량의 하나 이상의 면역원성 조성물 또는 이의 항체 및 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함한다. 백신은 유효 면역량의 하나 이상의 면역원성 조성물 및 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함한다. 제형은 투여 모드에 적합해야 한다.

면역원성 조성물은, 경우에 따라, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 면역원성 조성물은 액체 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐제, 서방형 제형 또는 산제일 수 있다. 경구 제형은 표준 담체, 예를 들면, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다.

F. 유효 용량

본원에 기재된 화합물은 PPV5B-관련 질환을 치료하기에 치료학적으로 유효한 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 투여량은 백신을 제공받는 숙주 뿐만 아니라 숙주의 신장, 체중 및 연령과 같은 인자에 따라 좌우될 것이다.

제형에서 사용되는 본 발명의 면역원성 접합체 또는 항체의 정확한 양은 투여 경로 및 대상체의 성질(예를 들면, 종, 연령, 신장, 질환의 단계/수준)에 따라 좌우될 것이며, 표준 임상 기술에 따라 담당의의 판단 및 각 대상체의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 면역량은 대상체에서 PPV5B 감염 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양이다. 유효 용량은 또한 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있으며, 0.1mg/kg 내지 20mg/kg, 바람직하게는 1mg/kg 내지 10mg/kg로 다양할 수 있다.

조성물의 면역원성은 당해 분야에 공지된 면역검정의 사용에 의해 조성물로 면역화한 후 시험 대상체의 면역 반응을 모니터링함으로써 결정될 수 있다. 체액(항체) 반응 및/또는 세포-매개된 면역력의 생성이, 면역 반응의 지표로 간주될 수 있다. 시험 대상체는 돼지, 마우스, 햄스터, 개, 고양이, 토끼, 소, 말, 양 및 가금류(예를 들면, 닭, 오리, 거위 및 칠면조)와 같은 동물을 포함할 수 있다.

시험 대상체의 면역 반응은 공지된 기술, 예를 들면, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 면역블롯, 면역침강 등에 의해 검정되는 바와 같이 면역원성 접합체에 대한 생성된 면역 혈청의 반응성과 같은 각종 방안에 의해; 또는 질환 감염원의 수준을 검정하기 위한 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 정량적 PCR, 바이러스 단리 또는 당해 분야에 공지된 기타의 기술에 의해 측정되는 바와 같이 병원체에 의한 감염으로부터의 면역화된 숙주의 보호 및/또는 면역화된 숙주에서 병원체에 의한 감염으로 인한 징후들의 약독화에 의해 분석될 수 있다. 질환 감염원의 수준은 또한 면역글로불린이 지시되는 항원의 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 질환 감염원의 수준의 감소 또는 감염성 질환의 징후들의 개량은 조성물이 효과적임을 나타낸다.

본 발명의 치료제는 동물에서 생체내 사용 전에, 목적하는 치료 또는 예방 활성에 대해 시험관내 시험될 수 있다. 예를 들면, 특정 치료제의 투여가 지시되는지를 결정하는데 사용될 수 있는 시험관내 검정은 세포주로부터의 적합한 세포 또는 특정 질환 또는 장애를 갖는 대상체로부터 배양된 세포가 노출되거나 달리 치료제를 투여하고, 세포에 대한 치료제의 효과를 관찰하는 시험관내 세포 배양 검정을 포함한다.

또는, 치료제는 치료제를 질환 감염원에 의한 감염에 감수성이 있지만 질환 감염원으로 감염되진 않은 세포(대상체로부터 배양된 세포 또는 배양된 세포주로부터의 세포)에 접촉시키고, 세포를 질환 감염원에 노출시킨 다음, 치료제와 접촉한 세포의 감염 속도가 치료제와 접촉하지 않은 세포의 감염 속도보다 낮은지의 여부를 결정함으로써 검정할 수 있다. 질환 감염원으로의 세포의 감염은 당해 분야에 공지된 어떠한 방법으로도 검정할 수 있다.

또한, 치료제는 치료 전, 치료 동안 또는 치료 후 적합한 시간 간격으로 동물 모델 대상체에서 항체가 지시된 분자의 수준을 측정함으로써 검정할 수 있다. 분자의 양의 어떠한 변화 또는 변화의 부재를 확인하고, 대상체에 대한 치료 효과와 상관지을 수 있다. 분자의 수준은 당해 분야에 공지된 어떠한 방법으로도 측정할 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 PPV5B에 대해 동물을 백신접종한 후, 당해 분야에 공지된 임의의 결합 검정을 사용하여, 생성된 항체와 특정 분자간의 결합을 평가할 수 있다. 이러한 검정은 또한 특정 항원에 대해 보다 높은 친화성 또는 특이성을 나타내는 항체를 선택하기 위해 수행될 수 있다.

G. 검출 및 진단 방법

본 발명의 천연 PPV5B, 약독화된 바이러스, 단백질 또는 펩타이드의 사용으로부터 야기된 항체, 또는 이의 결합 부분은 샘플에서 PPV5B의 존재를 검출하는데 유용하다. 이러한 검출방법은 본 발명의 천연 PPV5B, 약독화된 바이러스, 단백질 또는 펩타이드에 대해 야기된 단리된 항체 또는 이의 결합 부분을 제공하는 단계, 다량의 PPV5B 바이러스를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 단리된 항체 또는 이의 결합 부분에 가하는 단계 및 PPV5B 바이러스에 결합된 단리된 항체 또는 이의 결합 부분을 포함하는 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 항체 또는 이의 결합 부분은 또한 샘플에서 PPV5B 단백질 또는 펩타이드의 존재를 검출하는데 유용하다. 이러한 검출방법은 천연 PPV5B, 약독화된 바이러스, 단백질 또는 펩타이드에 대해 야기된 단리된 항체 또는 이의 결합 부분을 제공하는 단계, 다량의 PPV5B 단백질 또는 펩타이드를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 단리된 항체 또는 이의 결합 부분에 가하는 단계 및 PPV5B 단백질 또는 펩타이드에 결합된 단리된 항체 또는 이의 결합 부분을 포함하는 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.

결합 쌍의 구성원인 특정 분자에 결합하는 면역글로불린, 특히 항체, (및 이의 기능적으로 활성인 단편)이, 본원에 기재된 바와 같이, 진단제(diagnostics) 및 예후제(prognostics)로서 사용될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 본 발명은 결합 쌍의 구성원의 측정, 및 임상 응용에서의 이러한 측정의 사용을 제공한다. 본 발명에서 면역글로불린은, 예를 들면, 생물학적 샘플에서 항원의 검출에 사용될 수 있으며, 이에 의해 대상체를 면역글로불린이 결합하는 분자의 이상 수준(aberrant level)에 대해 및/또는 이러한 분자의 비정상 형태의 존재에 대해 시험할 수 있다. "이상 수준"이란 신체 일부로부터 또는 질환을 갖지 않는 대상체로부터의 유사한 샘플에 존재하는 것(이것이 표준 수준을 나타낸다)과 비교하여 증가되거나 감소됨을 의미한다. 본 발명의 항체는 또한 진단 또는 예후 기술에서 사용하기 위한 키트에서 시약으로서 포함될 수 있다.

한 양상에서, 천연 PPV5B 또는 약독화된 바이러스 단백질 또는 펩타이드에 면역특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 PPV5B 감염에 대해 진단, 예후 또는 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

다른 양상에서, 본 발명은 대상체에서 대상체로부터 유도된 샘플에 대한 항체의 면역특이 결합의 수준을 측정함을 포함하여, PPV5B 감염 또는 이에 대한 면역력의 존재에 대해 진단 또는 스크리닝하는 방법을 제공하며, 여기서, 항체는 PPV5B 단백질 또는 펩타이드에 면역특이적으로 결합하고, 질환 감염원을 갖는 않는 대상체로부터의 유사 샘플에서의 상기 면역특이 결합의 수준과 비교하여 상기 면역특이 결합의 수준의 증가가 PPV5B의 존재를 나타낸다.

PPV5B 펩타이드 또는 이의 길항제의 존재를 검출하는데 적합한 검정의 예는 ELISA, 방사면역검정, 겔-확산 침강 반응 검정, 면역확산 검정, 응집 검정, 형광 면역검정, 단백질 A 면역검정 또는 면역전기영동 검정을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

특정 분자에 대한 면역검정은 전형적으로, 샘플, 예를 들면, 생물학적 유체, 조직 추출물, 새로 회수한 세포, 또는 배양된 세포의 용리물을 검출 가능하게 표지된 항체의 존재하에서 배양하고, 결합된 항체를 당해 분야에 널리 공지된 다수의 기술에 의해 검출함을 포함할 것이다.

주어진 항체의 결합 활성은 널리 공지된 방법에 따라 측정할 수 있다. 당해 분야 숙련가들은 일상적인 실험을 사용함으로써 각 측정을 위한 최적의 조작 검정 조건을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 다른 양상은 PPV5B의 검출 또는 측정을 위한 진단용 키트에 관한 것이다. 하나 이상의 용기에 항-PPV5B 항체, 및 임의로, 항체에 대한 표지된 결합 상대(binding partner)를 포함하는 진단 용도를 위한 키트가 제공된다. 또는, 항-PPV5B 항체는 (검출가능한 마커, 예를 들면, 화학발광성, 효소성, 형광성 또는 방사성 잔기로) 표지될 수 있다. 따라서, 본 발명은 항-PPV5B 항체 및 대조 면역글로불린을 포함하는 진단용 키트를 제공한다. 특정 실시형태에서, 용기의 상기한 화합물들 중 하나는 검출 가능하게 표지될 수 있다. 키트는 임의로, 표준물 또는 대조물로서 사용하기 위해, 키트의 항체에 의해 인지되는 소정량의 PPV5B 바이러스, 단백질 또는 펩타이드를 용기내에 추가로 포함할 수 있다.

H. 대상체로의 투여

투여 경로는 비강내, 경구(예를 들면, 음용수로), 피내 및 근육내를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 근육내 투여가 특히 바람직하다. 숙련가는 본 발명의 조성물이 또한 하나, 둘 또는 그 이상의 용량으로 및 다른 투여 경로에 의해 투여될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, 이러한 기타의 경로는 피하, 피부내, 정맥내, 혈관내, 동맥내, 복강내, 척수강내, 기관내, 심장내, 폐엽내, 수질내, 폐내 또는 질내를 포함한다. 치료의 목적하는 지속시간 및 효과에 따라, 본 발명에 따르는 조성물은, 예를 들면 수 일, 주 또는 개월 동안 상이한 투여량으로 1일 기준으로 1회 또는 수회, 또한 간헐적으로 투여될 수 있다.

하기 실시예는 발명의 바람직한 실시형태를 입증하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 기재된 기술들은 본 발명을 실시하는데 있어서 잘 기능하도록 본 발명자들에 의해 밝혀진 기술들을 나타내며, 따라서, 이의 실시를 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 당해 분야 숙련가들은 인지해야 한다. 그러나, 당해 분야 숙련가들은, 본 기재내용에 비추어, 다수의 변화들이 기재된 특정 실시형태들에서 이루어질 수 있으며, 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 동일하거나 유사한 결과를 여전히 수득할 수 있다는 것을 인지해야 한다.

본 출원은 "돼지 파르보바이러스 5A, 사용 방법 및 백신"이라는 발명의 명칭으로 2012년 12월 17일자로 출원된 출원, U.S. 제61/738,110호에 관한 것이며, 이의 내용은 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.

실시예

재료 및 방법

재료의 공급원 : 3마리 돼지로부터의 조직 균질화물을 특이적 발생 조사(unusual outbreak investigation)로부터 제공받았다. 농장에 대한 병력은, 휴식시에 나타나지만 움직이는 동안에는 과대해지는 전신 근육 떨림을 갖는 200lb 돼지의 병력이었다. (현미경적 병변을 기초로 하여) 바이러스제를 시사하였을 뿐만 아니라 제제 X(비-전형적 돼지 열 바이러스 관련 페스티바이러스)를 식별한 수의학 진단 실험실에서의 광범위한 시험 후, 이들 동물에서의 CNS 증상의 근원적인 원인을 밝히는데 도움을 주기 위해 샘플을 발명자들에게 제공하였다.

DNA 및 단백질 분석 : 병에 걸린 돼지로부터의 샘플의 DNA 분석은, Operon(Huntsville AL)에 의해 수행된, 454 Life Sciences(Branford CT)로부터의 고속 대량 서열분석("454 기술")을 사용하여 수행되었다. 샘플은 바이러스성 입자 보호 핵산의 뉴클레아제 처리에 이은 추출, 무작위 증폭 및 고속 대량 서열분석을 통해 바이러스 서열을 풍부하게 하였으며; 일반적으로 문헌[Victoria et. al PLoS pathogen 2008 Sep 26;4(9):e1000163]에 기술된 바와 같이 수행하였다.

생성된 서열을 초기에 파르보비리다에 과의 다른 구성원으로서 BLASTx 분석에 의해 특성확인하였다. 서열을 Sequencher 소프트웨어를 사용하여 모으고, 이러한 DNA 분석의 결과를 표적화된 서열분석과 결부시켜 서열번호 1의 DNA 서열을 수득하였으며, 이것이 PPV5B로서 나타낸 바이러스의 추정 완전 암호화 서열이다. Sequencher 소프트웨어를 사용하여 DNA 서열을 추가로 분석하는 것은, 바이러스 레플리카제(서열번호 2), 개방 판독 프레임 "ORF3"(서열번호 3) 및 바이러스 캡시드 단백질(서열번호 4)을 포함하는 다른 파르보바이러스 종에서 발견된 것들에 상응하는 3개의 추정 암호화 영역을 확인하였다.

실시예 1: 신규한 바이러스의 확인

DNA 서열을 상이한 상태로부터의 2마리의 비관련 돼지의 폐 균질화물의 샘플에서 454 기술(바이러스 메타유전자학)에 의해 확인하였다. BLASTn 및 BLASTx 분석은, 레플리카제 유전자(REP)의 보존 영역에서 최대 67% 뉴클레오타이드 동일성을 가지면서 돼지 파르보바이러스 4에 대해 가장 밀접한 동일성을 나타내지만 캡시드(CAP) 암호화 영역은 뉴클레오타이드 수준에서 식별가능한 정합도를 나타내지 않음을 밝혔다. 단백질 수준에서, 추정적 레플리카제 단백질은 약 60% 아미노산 동일성 및 캡시드 단백질에서 약 50% 동일성을 나타내었다. 바이러스를 새로운 종, 돼지 파르보바이러스 5B(PPV5B)라고 표시하였다. 특이적 프라이머는 캡시드 암호화 서열을 기초로 하여 개발하였으며, 조직 및 병리학적/임상적 특징에 있어서 유사한 균질화물의 PCR 기반 스크리닝은 샘플의 약 16%에서 바이러스원의 존재를 밝혔다. 보고된 임상 증상 및 스크리닝된 조직과 관련된 바이러스학 데이터를 기초로 하여, 몇몇의 다른 바이러스원 및 임상 병리학/조직병리학과의 통계학적으로 유의한 관계를 관찰하였다.

실시예 2: 신규한 파르보바이러스로서의 PPV5B 의 동정 및 계통발생 분석

다수의 공지의 바이러스 종의 추정적 레플리카제(REP) 및 캡시드(VP1/CAP) 단백질 둘 다에 대한 쌍을 이룬 아미노산 동일성이 도 5에 도시되어 있다. REP 및 CAP(각각 약 90%/65%) 둘 다와, 가장 밀접한 친족인 PPV4에 대한 PPV5B 서열 동일성이 새로운 종으로서의 PPV5B의 지정을 지지한다.

계통발생 분석(도 6)은, 바이러스가 CAP 단백질의 보존된 영역에 기초하여 파르보비리다에 과 및 파르보바이러스 속에 속하는 새로운 종임을 밝혔다. 유사한 결과는, 더 많은 보존된 REP 단백질 서열(도시되지 않음)을 사용하여 달성된다.

실시예 3: 질환의 원인 인자로서의 PPV5B 의 확인

바이러스를 증폭시키고 새로운 파르보바이러스 및 PRRSV로의 동시-감염이 임상 호흡기 증상을 증가시키는지를 결정하기 위한 시도로, PPV5B-감염된 CDCD 돼지로부터의 뇌 균질화물을 사용하여 CDCD(cesarean-derived-colostrum-deprived) 동물에게 접종하였다. 이 연구에서, 새로운 파르보바이러스를 함유하는 조직 균질화물을 접종한 그룹에서 사망률의 수치(20 내지 22%)가 예기치 않게 높았으며, 캡시드 암호화 영역을 표적화하는 PPV5B-특이적 PCR을 사용하여 혈청에서 높은 역가의 PPV5B가 확인되었다. 이어서, 이 연구 중 한 동물 유래의 조직을 사용하여 CDCD 돼지를 시험감염시켜 임상 증상을 재현하였다. 이 연구에서, 감염 동물의 대다수에서 높은 역가의 바이러스혈증으로의 전신 감염이 주지되었다. PPV5B를 함유하는 접종물을 투여받은 그룹에서, 높은 사망 발생률(20%), 파행, 평균 1일 체중증가의 감소, 및 거시적 및 현미경적 병변 둘 다가 존재하였다.

실시예 4: PPV5B 의 배양, 단리 및 정제

PCR 양성 조직(예를 들면, 비장, 뇌, 폐, 장 등)의 작은 단편을 멸균 막자사발 및 막자를 사용하여 분쇄한다. 분쇄한 조직을 HEPES 완충액과 항생제를 함유하는 변형된 EMEM 5 내지 10ml에 재현탁시키고, 큰 조직 덩어리를 제거하기 위해 정화하였다. 상청액을 수집하고, 각종 필터를 통해 일련 통과시켜 박테리아를 포함하는 큰 입자의 대부분을 제거한다. 추가로, PCR 양성 동물로부터의 변 샘플 현탁액 및 혈청을 또한 바이러스 단리를 위한 일련 여과에 의해 가공한다.

여액의 희석물을 트립신으로 처리하거나 처리하지 않은 채로 두고, 특정 온도에서 6-웰 플레이트에서 확립된 1차 세포 배양물(아래 열거됨)에 흡착시킨다. 접종물을 흡입시키고, 신선한 보존 배지 2ml로 대체한다. 이어서, 플레이트를 33 내지 37℃에서 5% CO₂ 대기 중에서 항온배양하고, 모의 (플레인 배지) 접종된 대조군과 비교한 세포 라운딩(cell rounding), 세포-세포 융합, 탈리, 세포 클러스터링 등과 같은 세포병변 효과에 대해 매일 관찰한다. 잠재적인 양성 웰을 PCR에 의한 바이러스 성장/단리에 대해 스크리닝한다.

바이러스의 단리에 유용한 확립된 세포주는 특히 ST(돼지 고환), SK6(돼지 신장), BHK-21(새끼 햄스터 신장), VIDO R1(돼지 태아 망막), PK-15 NADC(돼지 신장), PK/WRL(돼지 신장), HRT-180(사람 결장직장 선암종), Hep2(사람 상피), Vero(아프리카 녹색 원숭이 신장) 및 RK-13(토끼 신장)이 포함된다.

공정에 유용한 1차 세포 배양물로는 특히 배아 돼지 폐, 신장, 고환, 기관 및 장 배양물이 포함된다.

바이러스가 단리됨에 따라, 이를 다수회의 플라크 정제 또는 한계 희석에 의해 정제하고, 다량으로 증폭시키고, 동물 실험을 위한 스톡 배양물을 생성한다.

실시예 5: 불활성화된 바이러스 및 백신의 제조

불활성화는, 2 내지 15mM BEI의 존재 하에서, 보다 더 바람직하게는 약 10mM BEI의 존재 하에서 약 35 내지 39℃에서 수행한다. 불활성화는, 적어도 24시간 동안, 24 내지 72시간 이내 수행한다. 이어서, 용액 내의 불활성화제를 중화시키는 등가량의 제제를 가한다; 예를 들면, 나트륨 티오설페이트를 등가량으로 가한다. 불활성화된 바이러스 제제는, 당해 분야에 공지되어 있는 방법에 따라, 예를 들면, 문헌[Preuss, T., et al., Comparison of Two Different Methods for Inactivation of Viruses in Serum, CLINICAL AND DIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY, (1997), 504-508 또는 Bahnemann, H.G., Inactivation of viral antigens for vaccine preparation with particular reference to the application of binary ethylenimine, VACCINE, (1990), 299-303]에 개시된 바와 같이 제조한다. 일단 불활성화된 바이러스가 제조되면, 최종 백신 제형을 위해 재료를 담체 제제와 배합한다.

실시예 6: 약독화된 바이러스 및 백신의 제조

약독화된 바이러스 제제는 당해 분야에 공지된 방법에 따라, 예를 들면, 문헌[Vaccine Protocols, 2nd edition; Robinson, Husdon, Cranage, eds, Humana Press 2003]에 개시된 바와 같이 제조한다. 예를 들면, "...야생형 바이러스를, 독성의 감소와 면역원성의 보유 간의 허용가능한 균형이 도달될 때까지 조직 배양물/동물 숙주에서 광범위하게 계대배양한다..."

약독화된 바이러스를 다수회의 플라크 정제 또는 한계 희석에 의해 정제한다. PCR 검정, 심층 서열분석(deep sequencing) 또는 면역형광 검정을 사용하여 배양 재료의 특이성을 측정한다.

정제된 약독화 바이러스 제제를 담체 제제와 배합함으로써 약독화된 바이러스 백신을 제조한다.

실시예 7: 캡시드 단백질을 포함하는 서브유닛 백신의 제조

서열번호 4의 캡시드 단백질은, 각종 단백질 발현 시스템에서 클로닝된 서열번호 4, 또는 이의 단편의 발현에 의해 제조하였다.

바큘로바이러스 발현: 서열번호 4의 PPV5B 캡시드 단백질은, 일반적으로 문헌[Kost et al. (6), 2012]에 개시된 방법에 따라 바큘로바이러스 발현 시스템에서 발현되었다. 단백질은 초기 정제시 불용성 분획 내에서 소량으로 발견되었다. 수율 및 용해도를 증가시키는 방법은, 대안의 완충액 조건(예를 들면, 우레아 또는 구아니딘 하이드로클로라이드), 대안의 결합 및 정제 조건(예를 들면, 코발트 또는 니켈 친화도 컬럼, 음이온 또는 양이온 교환 컬럼), 또는 대안의 발현 조건(예를 들면, 온도, 시간, 대안의 세포주)의 사용을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다.

박테리아 발현: 서열번호 4의 PPV5B 캡시드 단백질은 일반적으로 문헌[EMD Chemicals Inc. Novagen User Protocol TB184]에 개시된 방법에 따라 박테리아 발현 시스템에서 발현되었다. 이 방법은, 제조된 단백질의 정제를 촉진하기 위해 박테리아 벡터에 함유된 고유의 HIS-태그(EMD Chemicals Inc., 2011 (7))의 첨가를 포함하였다. 박테리아에 의해 발현된 HIS-태그된 캡시드 단백질은, 일반적으로 문헌[GE Healthcare, 2012 (8)]에 개시된 방법에 따라 정제하고, 얻어진 생성물을 사용하여 실시예 8에 기술된 바와 같이 PPV5B 특이적 항체를 생성하였다.

약독화된 서브유닛 백신은, 정제된 캡시드 단백질 제제를 담체 제제와 배합함으로써 제조하였다.

실시예 8: PPV5B 에 특이적으로 결합하는 항체의 제조

PPV5B에 특이적으로 결합하는 항체를, 토끼를 PPV5B 바이러스의 항원성 제제, 또는 캡시드(서열번호 4) 단백질의 서브유닛 단백질 제제 또는 이의 단편으로 면역화함으로써 제조한다. 접종된 토끼 유래의 혈청 샘플을, PPV5B 항원에 결합된 폴리클로날 항체에 대해 스크리닝한다. 항원에 대한 항체를 생성한 것으로 측정된 접종된 마우스 유래의 비장을 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성한다. 이어서, 하이브리도마를, PPV5B 항원에 대한 결합에 대해 스크리닝한다.

폴리클로날 항체: 실시예 7에 따라 제조한 HIS-태그된 박테리아에 의해 발현된 캡시드 단백질을 사용하여, 사용자 지정 항체 생산 서비스(Rockland Antibodies and Assays; Gilbertsville, PA)에서 2마리의 뉴질랜드 백 토끼(New Zealand White rabbit)를 면역화하였다. 토끼를 D0, D7, D14 및 D28에 대략 100㎍ 항원/토끼로 면역화하였다. D0 및 D7 접종의 경우, 동물을 피내 접종하였다; D14 및 28에 제공된 접종은 피하 투여하였다. 완전 프로인트 애쥬번트를 1차 접종에서 사용하고; 불완전 프로인트 애쥬번트를 후속 접종에서 사용하였다. 2마리 토끼 둘 다로부터의 혈청 샘플을 면역화 전, 면역화한지 38일 및 45일째에 수집하였다.

폴리클로날 항체 제제를 록랜드 항체 및 검정에 의해 항-PPV5B 특이성에 대해 스크리닝하였다. 면역형광 검정(IFA), 웨스턴 블롯 및 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 정제된 또는 부분 정제된 PPV5B 단백질에 대해 결합 특이성을 갖는 항체를 생산하였다. 각 검정의 특이성에 대한 파라미터는 다음과 같았다: 웨스턴 블롯 특이성은 예측된 79.0 kDa 크기의 단백질의 검출에 의해 측정하고, IFA 특이성은 비감염 세포와의 비교에 의해 측정하고, ELISA 특이성은 플레이트를 비관련 단백질로 코팅함으로써 측정하였다.

모노클로날 항체: 실시예 7에 따라 제조된 HIS-태그된 바큘로바이러스 발현된 캡시드 단백질을 사용하여, 사용자 지정 항체 생산 서비스(록랜드 항체 및 검정; Gilbertsville, PA)에서 Balb/c 마우스에서 모노클로날 항체를 생성하였다. 마우스를 사용자 지정 항체 생산 설비에 의해 설계된 표준 프로토콜에 따라 다양한 PPV5B 항원 제제로 면역화한다. 접종 후 면역 반응을 사용자 지정 항체 생산 설비에 의해 모니터링하고, 항체 후보물질을 하이브리도마의 생산을 위해 선택한다. 모노클로날 항체의 생산을 위한 표준 프로토콜은, 예를 들면, 문헌[Gabriele et al. (9), p.117-135]에 기재된 바와 같이 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

하이브리도마는 하이브리도마 배지에서 증식 단계(proliferation phase)로 배양된 B-세포 종양 세포를 문헌[Gabriele et al. (9), p.117-135]에 기재된 바와 같이 표준 프로토콜에 따라 PPV5B 항원에 대한 항체를 생산하는 것으로 측정된 접종된 마우스로부터 수거한 비장 세포와 배합함으로써 생산한다. 하이브리도마를 융합 및 배양한 후, 하이브리도마를 PPV5B 항원에 대한 결합에 대해 스크리닝하고, 하이브리도마를 생산하는 항-PPV5B를 선택한다. 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체를 문헌[Gabriele et al. (9), p.209-232]에 기재된 바와 같이 표준 프로토콜에 따라 친화력 크로마토그래피를 사용하여 정제한다.

PPV5B에 대해 특이적인 고 친화도 항체를 식별하고, 이들이 결합하는 에피토프, 다른 관련 바이러스 종에 대한 항체의 특이성을 측정함을 포함하여 추가로 특성확인하고, PPV5B 바이러스 항원(들)에 대해 높은 특이성을 갖는 적합한 고 친화도 항체를 당해 분야에 널리 공지된 면역학적 기술, 예를 들면, ELISA, 웨스턴블롯 분석 및 에피토프 맵핑[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey)]을 사용하여 선택한다.

실시예 9: PPV5B 에 대한 진단 검정

ELISA 검정: 실시예 8에 따라 제조된 항체를, ELISA 절차를 사용하여 생물학적 샘플에서 PPV5B를 측정하는데 사용한다. 검정은 다음과 같이 수행한다:

서열번호 4의 캡시드 단백질로부터 선택된 코팅 항원을 코팅 완충액(0.05M 탄산염-중탄산염 완충액; pH 9.6)에서 희석시켜 0.25ng/㎕의 최종 농도를 달성한다. 플레이트(고 단백질 결합 96-웰 ELISA 플레이트 Phenix cat no. MPG-655061)를 50㎕/웰의 코팅 항원으로 코팅한다. 플레이트를 밀봉하고, 37℃에서 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 배양한다. 코팅 용액을 제거하고, 플레이트를 200㎕/웰 PBST(1X PBS + 0.05%Tween-20)로 3회 세척한다. 플레이트를 300㎕/웰 차단 용액(PBS 중의 0.5% w/v 탈지 분유)으로 코팅하고, 밀봉하고, 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 차단 용액을 제거하고, 플레이트를 200㎕/웰 PBST로 3회 세척한다. 샘플을 차단 용액에서 1:100로 희석시키고; 100㎕/웰의 혈청 샘플을 플레이트에 가한다. 플레이트를 밀봉하고, 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 혈청 샘플을 제거하고, 플레이트를 200㎕/웰 PBST로 3회 세척한다. 이차 항체(HRP-접합된-염소 항-돼지 IgG(H+L); Jackson Immuno-Research 114-035-003)를 차단 용액에서 1:10,000로 되도록 희석시키고, 플레이트를 100㎕/웰로 코팅하는데 사용한다. 플레이트를 밀봉하고, 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 이차 항체를 제거하고, 플레이트를 200㎕/웰 PBST로 3회 세척한다. 플레이트를 50㎕/웰 TMB(3,5,3',5'-테트라메틸벤지딘; KPL cat no. 53-00-01)로 코팅한다. 플레이트를 실온에서 암흑 속에서 대략 10분 동안 배양한다. 플레이트를 50㎕/웰 정지 용액(2M H₂SO₄; KPL cat no. 50-85-04)으로 코팅한다. 광학 밀도를 450nm에서 판독한다.

PCR 검정: PPV5B에 대한 겔-기반 PCR 및 qPCR 검정을 최적화하였다. 이러한 검정은 다음과 같이 수행한다: qPCR 검정을 위해, 각각의 반응물을 다음의 시약을 첨가하여 제조한다: 10㎕/반응의 2X SsoFast 프로브 수퍼믹스(BioRad, cat no. 172-5233), 5㎕/반응의 DEPC-처리수, 1㎕/반응의 6μM 농도의 전방향 프라이머(ACC AGA GAA CAG GCG ACA T: 서열번호 6), 1㎕/반응의 6μM 농도의 역방향 프라이머(AAA CAC CTG ATG GGA CCA TAA T: 서열번호 7), 1㎕/반응의 4μM 농도의 프로브(6-FAM/ ACT CAA CAG CCA GGA CCG AGA ACA CAG GAA /BHQ_1: 서열번호 8) 및 2㎕/반응의 추출된 DNA. 반응은 T100 써멀 사이클러(Bio-Rad)에서 1회 사이클 동안은 95℃에서 2분에 이어 40회 사이클 동안은 다음의 두 가지 온도에서 수행한다: 95℃에서 5초에 이어 60℃에서 5초. 데이터를 CFX96 광학 이미징 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 판독한다. 겔-기반 검정을 위해, 각 반응물을 다음의 시약을 첨가하여 제조한다: 12.5㎕/반응의 2X AmpliTaq Gold Mastermix(Applied Biosystems, cat no.4302758), 8.0㎕/반응의 DEPC-처리수, 1.25㎕/반응의 10μM 농도의 전방향 프라이머(CCA GAT TTA CAT TTT GAG CAG CTA ACA CAG TAC: 서열번호 9), 1.25㎕/반응의 10μM 농도의 역방향 프라이머(GGA TAT AAG CCC AAA TCT GAG ACT CTA G: 서열번호 10) 및 2㎕/반응의 추출된 DNA. 반응은 T100 써멀 사이클러(Bio-Rad)에서 1회 사이클 동안은 95℃에서 5분에 이어 40회 사이클 동안은 다음의 온도에서 수행한다: 95℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 45초에 이어 72℃에서 10분 동안 최종 연장.

실시예 10: 돼지에서 PPV5B 백신의 효능의 평가

돼지에서 적어도 하나의 PPV5B 단백질 또는 폴리펩타이드(원형 PPV5B 백신)를 포함하는 물질의 구성물의 효능을 평가하기 위해, 3개의 그룹으로 무작위화된 5주령의 CDCD(colostrum-deprived-cesarean-derived) 동물(표 2 참조)을 사용한 무작위 연구를 수행한다. 동물을 연구일 0(D0) 및 D14에 조성물 또는 위약(인산염 완충 염수; PBS)로 백신접종한다. 동물을 D28에 PPV5B를 함유하는 것으로 알려진 물질로 시험감염한다. 임상 관찰, 직장 온도, 체중 변화 및 혈액 수집을 모니터링한다. D56에, 동물을 해부하여 거시적 병변을 평가한다. PPV5B 백신의 효능을 백신접종된 동물과 비-백신접종된 동물 간의 사망률 퍼센트, 바이러스혈증(역가 및 지속기간), 혈청전환(역가 및 지속기간) 및 임상 증상을 통계적으로 비교함으로써 측정한다.

[표 2]

본원에 기재되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 기재내용에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 실시형태와 관련하여 기재되어 있지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에 기재된 방법의 단계에서 또는 단계의 순서에서 조성물 및 방법에 변화가 적용될 수 있음이 당해 분야 숙련가들에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적 둘 다로 관련된 특정 제제가 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서 본원에 기재된 제제로 치환될 수 있음이 자명할 것이다. 당해 분야 숙련가에게 자명한 이러한 모든 유사한 치환 및 변형은 하기 청구항에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.

참조문헌

하기 참조문헌은, 본원에 기재된 바를 보완하는 예시적인 절차상 또는 기타의 상세한 설명을 제공하는 정도로, 구체적으로 본원에 인용에 의해 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA, INC. <120> PORCINE PARVOVIRUS 5B, METHODS OF USE AND VACCINE <130> 10-0153-PCT <150> US 61/765,204 <151> 2013-02-15 <150> US 13/800,413 <151> 2013-03-13 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5302 <212> DNA <213> Porcine parvovirus 5B <400> 1 gcttcaagtc tattaatttg cataatttat gcaaagagga agttaacctg attggtcagt 60 tttttggcgg gaagcaattt gattggacgg gaactcaagt cctaatttgc attgacgtgg 120 accaatcaga attgagtaca tattatataa ggaggccgaa aaagaggaag tttgtcattt 180 gcgttttgga gaccatcgcg agcagaactc cgtcgttttc ggcctgtatt tgaagatgga 240 aacctactgg acaggtattt gcagactttt tcctgatgtt ttaaaaatac ctggtgttta 300 tgaaggacgc tatatttttg aagttcctgt ttctaccaga gactttatga aatggcctga 360 tatatttcaa aatgaaaaaa ataatgaaaa ctgtgagtct ggcgcggcgc ctgcggcgcc 420 gcgcgatgaa attgacagta atctagtaac ggctgttaga caaggggagg ctctatttag 480 agagcttcaa aaagaactta gaaaatcctg tagattagga gtagatcctg gcattttcat 540 gcaattggaa agagttgact caaaaggtgg cttacatttg cattggtgtg tgtctgtgtc 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Gln Gly Glu Ala Leu 65 70 75 80 Phe Arg Glu Leu Gln Lys Glu Leu Arg Lys Ser Cys Arg Leu Gly Val 85 90 95 Asp Pro Gly Ile Phe Met Gln Leu Glu Arg Val Asp Ser Lys Gly Gly 100 105 110 Leu His Leu His Trp Cys Val Ser Val Ser Ala Gly Thr Pro Arg Asp 115 120 125 Val Leu Thr Ile Phe Lys Asn Thr Glu Lys Lys Val Ser Leu Tyr Tyr 130 135 140 Phe Gly Val Glu Gly Leu Ser Phe Phe Val Pro His Lys Asn Lys His 145 150 155 160 Gly Ala Trp Lys Ser Thr Asp Glu Gly Phe Ile Tyr Asn Tyr Leu Leu 165 170 175 Lys Lys Leu Pro Leu Lys Glu Cys Leu Tyr Ala Trp Thr Thr Ile Gly 180 185 190 Gly Thr Ile Gly Glu Ala Cys Leu Asn Thr Glu Lys Arg Lys Glu Leu 195 200 205 Leu Asp Asn Arg Gln Asp Pro Ala Val Ile Glu Glu Leu Ser Ala Pro 210 215 220 Met Tyr Lys Cys Ala Thr Gly Glu Lys Met Leu Asp Ile Val Gln Trp 225 230 235 240 Leu Val Asp Asn Asn Ile Cys Ser Glu Ser Arg Trp Glu Gly Lys Asn 245 250 255 Ala Leu Ser Leu Tyr Ser Phe Leu Ala Thr Gln Ala Gly Gly Tyr Met 260 265 270 Ala Lys Gln Cys Leu Arg Ile Ala Gln Gln Lys Leu Leu 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Met Gly Ala 485 490 495 Lys Leu Ser Val Lys Pro Glu Ile Met Asn Cys Gln Ile Phe Lys Arg 500 505 510 Gly Pro Ala Ser Ile Arg His Leu Val Pro Leu Gly Glu Ile Pro Pro 515 520 525 Pro Lys Glu Met His Lys Lys Arg Gln Pro Leu Tyr Leu Arg Ala Glu 530 535 540 Pro Asp Glu Glu Gln Glu Thr Pro Asp Val Leu Asp His Trp Phe Glu 545 550 555 560 Glu Pro Ser Gln Lys Arg Lys Lys Thr Glu Asp Pro Ala Asn Thr Thr 565 570 575 Pro Pro Ala Ala Tyr Glu Asn Leu Asp Asp Asn Phe Glu Pro Val Pro 580 585 590 Gly Lys Asn Phe Ala Phe Ile Ile Phe 595 600 <210> 3 <211> 233 <212> PRT <213> Porcine parvovirus 5B <400> 3 Met Ser Phe Ser Gly Tyr Ser Lys Asn Leu Pro Pro Gly Leu Glu Glu 1 5 10 15 Val Thr Phe Pro Phe Trp Val Asp Phe Leu Leu Ala Arg Ile Ala Asp 20 25 30 Phe Ile Asn Trp Cys Gly Tyr Tyr Asn Ile Lys Cys Pro Glu Ala Glu 35 40 45 Lys Val Phe Ser Ile Gly Gln Ser Thr Gln Val Leu Leu Lys Trp Pro 50 55 60 Gly Ala Gln Gly Lys Glu Asn Arg Val Lys Asn Phe Thr Glu Ala Ala 65 70 75 80 Phe Pro Tyr Met Lys Val Pro Val Arg Pro Asp Asn Ile Glu Trp Ile 85 90 95 Lys Ile His Glu Met Leu His Asn Tyr Asp Arg Gln Ile Thr Pro Gln 100 105 110 Thr Thr Glu Asn Asp Leu Leu Ala Ala Ile Thr Ala Asp Phe Asp Gln 115 120 125 Arg Glu Ile Ile His Pro Val Thr Gly Glu Lys Trp Val Phe Gly Lys 130 135 140 Lys Thr Glu Ala Phe Ala Thr Asp Leu Glu Glu Ala Val Asp Glu Glu 145 150 155 160 Asp Pro Asp Thr Glu Lys Lys Gln Pro Thr Asp Lys Thr Gln Ser Asn 165 170 175 Asn Lys Lys Gly Glu Ile Gly Glu Lys Lys Glu Glu Gly Asp Thr Leu 180 185 190 Thr Ser Asn Glu Glu His His Gln Ser Arg Lys Leu Leu Glu His Asp 195 200 205 Ser Ser Glu Glu Gln Pro Glu Glu Ala Gly His Arg Glu Gln Lys Glu 210 215 220 Leu Glu Asp Asn Ile Glu Asp Ile Lys 225 230 <210> 4 <211> 891 <212> PRT <213> Porcine parvovirus 5B <400> 4 Met Leu His Asn Tyr Asp Arg Gln Ile Thr Pro Gln Thr Thr Glu Asn 1 5 10 15 Asp Leu Leu Ala Ala Ile Thr Ala Asp Phe Asp Gln Arg Glu Ile Ile 20 25 30 His Pro Val Thr Gly Glu Lys Trp Val Phe Gly Lys Lys Thr Glu Ala 35 40 45 Phe Ala Thr Asp Leu Glu Glu Ala Val Asp Glu Glu Asp Pro Asp Thr 50 55 60 Glu Lys Lys Gln Pro Thr Asp Lys Thr Gln Ser Asn Asn Lys Lys Gly 65 70 75 80 Glu Ile Gly Glu Lys Lys Glu Glu Gly Asp Thr Leu Thr Ser Asn Glu 85 90 95 Glu His His Gln Ser Arg Lys Leu Leu Glu His Asp Ser Ser Glu Glu 100 105 110 Gln Pro Glu Glu Ala Gly His Arg Glu Gln Lys Glu Leu Glu Asp Asn 115 120 125 Ile Glu Asp Ile Lys His Gly Ala Gly Glu Asp Gln Thr Gly Thr Gly 130 135 140 Ile Asn Trp Pro Gly His Arg Tyr Thr Gly Pro Gly Asn Pro Leu Pro 145 150 155 160 His Gly Ala Pro Arg Asn Glu Ile Asp Leu Ser Ala Ala Lys His Asp 165 170 175 Ile Arg Tyr Lys Gln Tyr Ser Arg Tyr Gly His Trp Pro Tyr Ile Trp 180 185 190 Ala Pro Tyr Ile Asp Lys Lys Met Gln Glu Asp Ile Arg Glu Ile Val 195 200 205 Lys Lys Gly Leu Gly Leu Glu Gly Lys Leu Leu Gly Asn Leu Ile Ser 210 215 220 Ala Leu Trp Gln Ala Lys Tyr Arg Leu Gly Ala Pro Ile Tyr Glu Ile 225 230 235 240 Leu Lys Thr Ile Leu Pro Pro Lys Ser Met Pro Thr Lys Glu Ser Val 245 250 255 Glu Lys His Leu Pro Lys Pro Leu Pro Ile Asp Pro Pro Gln Thr Ser 260 265 270 Leu Pro Gly Ala Ser Pro Pro Arg Thr Pro Asp Leu Gly Gly Glu Thr 275 280 285 Gly Met Asn Glu Glu Pro Pro Ala Lys Arg Arg Met Thr Glu Asp Arg 290 295 300 Cys Asp Ser Thr Thr Arg Cys Glu Thr Leu Asp Thr Gln Tyr Glu Asp 305 310 315 320 Ser Lys Met Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asn Gln Pro Lys Ser 325 330 335 Ser Trp Ile Gly Gly Ala Phe Phe Thr Asp Thr Thr Val Thr Thr Tyr 340 345 350 Gly Thr Arg Arg Cys Val Leu Ser Ser Phe Pro His Asn Tyr Cys Thr 355 360 365 Thr Glu Ser Gly Asp His Ile Pro Ser Leu Val Val Cys Thr Pro Trp 370 375 380 Tyr Tyr Tyr Asp Leu Asn Ile Leu Ser Ala His Phe Ser Pro Ser Ala 385 390 395 400 Trp Gln Thr Leu Leu Glu Glu Tyr Asp Ala Phe Lys Pro Leu Lys Leu 405 410 415 Glu Val Lys Ile Lys Glu Ile Val Val Lys Asp Val Asn Asn Met Thr 420 425 430 Gly Lys Gln Cys Cys Asp Thr Val Ser Asp Asn Ala Met Ala Ala Val 435 440 445 Leu Cys Phe Glu Asp Thr His Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Leu Gly Gly 450 455 460 Gly Gln Leu Thr Val Pro Gly His Leu Pro Gly Gln Thr Tyr Glu Leu 465 470 475 480 Pro Lys Tyr Cys Tyr Arg Thr Val Gly Lys Pro His Ser Glu Met Trp 485 490 495 Ser Pro Val Asp Gly Ser Lys Arg Ala His Leu Asp Met Pro Phe Val 500 505 510 Gln Pro Thr Gln Asn Thr Glu Phe Phe Ile Leu Glu Asn Arg His Ser 515 520 525 Thr Ile Leu His Thr Gly Asn Glu Phe Phe Gln Thr Tyr Asp Phe Pro 530 535 540 Asp Leu His Phe Glu Gln Leu Thr Gln Tyr Met Trp Asp Ala Arg Arg 545 550 555 560 Leu Asp Asn Pro Met Lys Gly Gln Arg Ile Gln Val Met Lys Asn Lys 565 570 575 Pro Thr Glu Asn Lys Asp Gln Met Phe Gly Ile Arg Ala Ser Ser Tyr 580 585 590 Leu Val Pro Trp Ile Val Asn Ser Leu Asn Arg Pro Ala Met Phe Leu 595 600 605 Gln Gly Gly Arg Leu Lys Asp Gly Asp Tyr Ser Ile Val Gly Pro Gly 610 615 620 Thr Arg Glu Gln Ala Thr Tyr His Tyr Phe Asn Asp Thr Pro Val Val 625 630 635 640 Val Glu Arg Asp Ile Tyr Lys Phe Thr Thr Ser Met Leu Lys Arg Glu 645 650 655 Thr Gln Gln Pro Gly Pro Arg Thr Gln Glu Thr Thr Val Lys Thr Pro 660 665 670 Asp Gly Thr Ile Ile Ile Thr Thr Asn Ser Leu Ala Tyr Gly Gln Val 675 680 685 Pro Glu Asn Ile Asp Asn Ile Pro Ser Asp His Lys Ala Ala Phe Gly 690 695 700 Val Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Val Ala Glu Gln Arg Gly Tyr Ser Thr 705 710 715 720 Pro Gly Met Pro Ser His Ile Arg Glu Ile Leu Leu Thr Lys Thr Pro 725 730 735 Lys Leu Leu Glu Lys Asp Gln Gln Glu Ile Thr Phe Pro Asn Phe Glu 740 745 750 Gly Ser Val Ser Glu Lys Thr Ser Ala Asn Leu Glu Ser Gln Ile Trp 755 760 765 Ala Tyr Ile Pro Asn Thr Asp Asn Lys His Asn Cys Gly Thr Pro Pro 770 775 780 Leu Ser Ile Trp Gly Met Glu Asn Pro Pro Pro Met Val Phe Leu Arg 785 790 795 800 Leu Leu Pro Gln Leu Gly Pro Pro Glu Lys Ser Ser Cys Ser Gly Ser 805 810 815 Lys Pro Ser Lys Lys Phe Leu Asn Gln Tyr Cys Gln Phe Leu Leu Glu 820 825 830 Tyr Thr Val Thr Trp Ala Val Val Arg Arg Lys Lys His Thr Pro Arg 835 840 845 Trp Asn Pro Met Pro Gly Val Thr Ile Pro Thr Tyr Asn Asn Asp Pro 850 855 860 Val Tyr Ile Leu Asp Gln Asn Gly Phe Tyr Lys Leu Pro Glu Thr Val 865 870 875 880 Trp Thr Ala Lys Gln Arg Val Arg Ala Arg Arg 885 890 <210> 5 <211> 685 <212> PRT <213> Porcine parvovirus 4 <400> 5 Lys His Gly His Trp Pro His Leu Trp Ala Pro Phe Val Asp Arg Gln 1 5 10 15 Met Ser Gln Glu Ile Gln Gln Val Leu Lys Gly Ser Thr Lys Leu Ser 20 25 30 Gln Lys Leu Leu Ala Asn Phe Ile Ile Ala Leu Trp Arg Ala Lys Glu 35 40 45 Lys Ile Gly Ala Pro Ile Tyr Glu Ile Val Lys Gly Val Phe Pro Ser 50 55 60 Val Asp Lys Lys Thr Val Glu Ser Leu Leu Pro His Pro Asp Pro Ile 65 70 75 80 Pro Ala Pro Pro Ser Ser Pro Gln Arg Gly Ser Lys Arg Ala Ser Pro 85 90 95 Pro Gln Ser Pro Asn Ala His Asp Glu Asp Thr Met Ser Gly His Lys 100 105 110 Arg Gln Lys Thr Met Glu Val Glu Ser Glu Cys Asp Lys Ser Leu Leu 115 120 125 Cys Pro Thr Gln Asn Ala Gly Ala Asp Phe Glu Leu Cys Gly Thr Gly 130 135 140 Gly Gly Ala Thr Asn Glu Lys Gly Thr Trp Val Gly Gly Thr Gln Phe 145 150 155 160 Thr Asp Thr Ser Ile Arg Thr Phe Gly Thr Arg Arg Cys Val Leu Ser 165 170 175 Ala Phe Pro Asp Thr Tyr Cys Ser Met Met Ser Gly Asp Ala Ile Pro 180 185 190 Ser Ile Ile Phe Asn Thr Pro Trp Tyr Tyr Tyr Asp Leu Asn Ile Met 195 200 205 Ser Cys His Phe Ser Pro Ser Ala Phe Gln Thr Leu Ile Glu Asp Tyr 210 215 220 Asp Ala Phe Arg Pro Arg Ser Leu Thr Val His Leu Lys Glu Leu Val 225 230 235 240 Ile Lys Asp Val Cys Gln Gln Gln Gly Leu Gln Ala Glu Gln Val Ser 245 250 255 Asp Asn Asn Ser Ala Thr Leu Leu Ala Phe Glu Asp Val Asn Tyr Glu 260 265 270 Leu Pro Tyr Val Leu Gly Gly Gly Gln Val Ser Val Pro Gly His Leu 275 280 285 Pro Gly Gln Pro Tyr Gln Leu Pro Lys Tyr Ser Tyr Arg Thr Val Gly 290 295 300 Lys Pro Asp Pro Asn Ser Gly Phe Val Pro Gly Arg Asn Thr His Pro 305 310 315 320 Asp Gln Gly Pro Gly His Pro Lys Ala Ser Lys Thr Ile Trp Tyr Ser 325 330 335 Gln Tyr Leu Glu Thr Gln Asp Thr Glu Phe Tyr Ile Leu Glu Asn His 340 345 350 Lys Ala Thr Ile Leu His Ser Gly Asn Thr Phe Ser Gln Asn Tyr Asn 355 360 365 Phe Pro Asp Leu Pro Phe Glu Gln Leu Thr Gln Tyr Met Trp Asp Ala 370 375 380 Arg Arg Gln Asp Asn Pro Leu Ile Asp Gln Arg Ile Gln Val Met Ser 385 390 395 400 Arg Met Tyr Asp Asp Gly Pro Gln Lys Thr Phe Ala Ile Lys Val Asn 405 410 415 Pro Tyr Ile Val Pro Phe Thr Val Lys Ser Thr Ser Arg Pro Ala Met 420 425 430 Phe Leu Ala Gly Gly Arg Phe Lys Asp Gly Asp Tyr Ser Ile Thr Gly 435 440 445 Pro Gly Asp Arg Glu Lys Thr Ser Phe Arg Tyr Tyr Asn Asp Pro Pro 450 455 460 Trp Ile Ile Thr Arg Asp Thr Tyr Leu Phe Ser Ser Asp Leu Ala Lys 465 470 475 480 Thr Glu Arg Glu Gln Pro Gly Pro Arg Gln Gly Asp Thr Val Val Arg 485 490 495 Thr Pro Asp Gly Thr Leu Ile Val Thr Thr Asn Ala Leu Ala Tyr Gly 500 505 510 Tyr Thr Thr Glu Tyr Leu Lys Asn Ile Pro Leu Leu Ser Ser Lys Tyr 515 520 525 His Gly Val Glu Asn Phe Arg Leu Ala Val Glu Asn Glu Arg Gly Tyr 530 535 540 Ser Met Pro Gly His Pro Ser His Ile Arg Glu Thr Leu Phe Arg Gly 545 550 555 560 Lys Leu Pro Ser Glu Ile Arg Glu Ser Thr Ile Lys Ser Glu Asp Gln 565 570 575 Arg Lys Glu Ile Thr Phe Pro Asp Tyr Met Gly Ser Val Asn Glu Lys 580 585 590 Thr Thr Ala Asn Leu Glu Ser Gln Ile Trp Ser Gln Ile Pro Asn Thr 595 600 605 Asp Ile Thr Glu Lys Cys Thr Thr Pro Pro Leu Ser Ile Trp Gly Met 610 615 620 Lys Asn Pro Pro Pro Met Val Phe Leu Arg Leu Leu Ala Gln Met Gly 625 630 635 640 Pro Pro Arg Arg Ser Ala Cys Ser Gly Ser Ile Pro Ser Asn Thr Tyr 645 650 655 Leu Asn Gln Tyr Cys Gln Phe Leu Leu Thr Tyr Glu Met Glu Trp Asp 660 665 670 Val Ile Lys Arg Thr Arg Lys Thr Val Arg Trp Asn Pro 675 680 685 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6 accagagaac aggcgacat 19 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 7 aaacacctga tgggaccata at 22 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 8 actcaacagc caggaccgag aacacaggaa 30 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 9 ccagatttac attttgagca gctaacacag tac 33 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 10 ggatataagc ccaaatctga gactctag 28 <210> 11 <211> 597 <212> PRT <213> Porcine parvovirus 4 <400> 11 Met Glu Thr Tyr Trp Thr Gly Ile Cys Arg Leu Phe Pro Asp Val Leu 1 5 10 15 Lys Ile Pro Gly Val Tyr Glu Gly Arg Tyr Ile Phe Glu Val Pro Ile 20 25 30 Ser Thr Arg Asp Cys Met Lys Trp Pro Asp Ile Phe Gly Asn Glu Asn 35 40 45 Asn Ser Glu Asn Gln Gln Ser Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Arg Glu 50 55 60 Asn Leu Asn Ser Asn Leu Val Ile Ala Val Arg Gln Ala Glu Ala Leu 65 70 75 80 Phe Arg Glu Leu Gln Lys Glu Leu Arg Lys Ser Cys Arg Leu Gly Val 85 90 95 Asp Pro Gly Ile Phe Met Gln Leu Glu Glu Val Asp Ser Lys Gly Gly 100 105 110 Leu His Leu His Trp Cys Val Ser Val Ser Ala Gly Thr Pro Arg Asp 115 120 125 Val Leu Thr Ile Phe Lys Asn Thr Glu Lys Lys Val Ser Leu Tyr Tyr 130 135 140 Phe Gly Val Glu Gly Leu Ser Phe Phe Val Pro His Lys Asn Lys His 145 150 155 160 Gly Ala Trp Lys Ser Thr Asp Glu Gly Phe Ile Tyr Asn Tyr Leu Leu 165 170 175 Lys Lys Leu Pro Leu Lys Glu Cys Leu Tyr Ala Trp Thr Thr Ile Gly 180 185 190 Gly Ala Ile Gly Asp Ala Cys Leu Asn Thr Asp Lys Arg Lys Glu Leu 195 200 205 Leu Asp Asn Arg Gln Asp Pro Ala Val Ile Glu Glu Leu Ser Ala Pro 210 215 220 Met Tyr Lys Cys Ala Thr Gly Glu Lys Met Leu Asp Ile Val Gln Trp 225 230 235 240 Leu Val Asp Asn Asn Ile Cys Ser Glu Ser Arg Trp Glu Asn Lys Asn 245 250 255 Ala Leu Ser Leu Tyr Ser Phe Leu Ala Thr Gln Ala Gly Gly Tyr Met 260 265 270 Ala Lys Gln Cys Leu Arg Ile Ala Gln Gln Lys Leu Leu Lys Glu Lys 275 280 285 Pro Leu Gly Leu Thr Leu Met Glu Phe Lys Asp Met Asn Ala Leu Arg 290 295 300 Arg Phe Gln Gln Asp Glu Gly Glu Met Thr Phe Asp Asn Asn Arg Met 305 310 315 320 His Tyr Ile Phe Ala Ile Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Ile Ala Ser Val 325 330 335 Ile Met Tyr Phe Trp Ser Met Lys Gln Thr Gly Lys Arg Asn Cys Val 340 345 350 Trp Phe Tyr Gly Pro Ala Thr Thr Gly Lys Thr Asn Met Ala Gln Ala 355 360 365 Ile Cys His Ser Ser Ala Asn Tyr Gly Asn Val Asn Trp Asn Asn Ala 370 375 380 Asn Phe Pro Phe Gln Asp Ile Val Gly Ala Gln Val Gly Trp Trp Glu 385 390 395 400 Glu Gly Lys Met Thr Gly Asp Met Val Glu Ala Ala Lys Ala Leu Leu 405 410 415 Gly Gly Thr Ala Leu Arg Ile Asp Arg Lys Cys Met Gln Ser Ile Glu 420 425 430 Val Asn Ser Pro Pro Phe Leu Ile Thr Ser Asn Val Asp Met Thr Ile 435 440 445 Val Gln Glu Gly Ser Phe Val Ser Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Glu 450 455 460 Asp Arg Met Ile Lys Phe Ser Phe Asn Met Thr Leu Pro Gly Asn Phe 465 470 475 480 Gly Leu Ile Thr Ser Glu Glu Val Lys Ser Phe Phe Arg Met Gly Ala 485 490 495 Lys Leu Ala Ala Gln Pro Asp Ile Met Asn Cys Pro Ile Phe Lys Lys 500 505 510 Gly Pro Ala Ser Ile Arg His Leu Val Pro Val Gly Glu Ile Pro Pro 515 520 525 Pro Lys Glu Met Lys His Lys Arg Gln Pro Leu Tyr Met Arg Ala Glu 530 535 540 Pro Asp Glu Ile Gln Asp Asn Pro Glu Glu Leu Asp His Trp Phe Glu 545 550 555 560 Glu Glu Ala Pro Arg Lys Lys Lys Gln Lys Thr Lys Asn Thr Ala Thr 565 570 575 Lys Asn Pro Ala Glu Thr Val Glu Ile Ile Thr Glu Thr Glu Phe Ile 580 585 590 Pro Ala Pro Gly Lys 595

Claims (27)

1. a) 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드;
   b) 서열번호 3 또는 서열번호 4의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드;
   c) 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 폴리펩타이드의 생물학적 또는 면역학적으로 유효한 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는, 서열번호 1과 80% 이상 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드;
   d) 서열번호 4를 암호화하는 30개 이상의 연속한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 서열번호 1의 핵산 서열의 단편인 폴리뉴클레오타이드, 또는
   e) 서열번호 1의 30개 이상의 연속한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 서열번호 1의 핵산 서열의 단편이고, 면역학적으로 유효한 활성의 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드
   를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
2. a) 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드;
   b) 서열번호 3 또는 서열번호 4와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖고, 서열번호 3 또는 서열번호 4에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 생물학적 또는 면역학적으로 유효한 활성을 갖는 폴리펩타이드;
   c) 서열번호 3 또는 서열번호 4의 13개 이상의 연속한 아미노산을 포함하는, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열의 단편인 폴리펩타이드;
   d) 서열번호 3 또는 서열번호 4의 13개 이상의 연속한 아미노산을 포함하고, 면역학적으로 유효한 활성을 갖는, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열의 단편인 폴리펩타이드; 또는
   e) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 2161 내지 2860 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 2861 내지 5014의 서열에 포함된 39개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질 단편인 폴리펩타이드
   를 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.
3. a) 서열번호 1의 핵산 서열, 또는
   b) 서열번호 3 또는 서열번호 4의 폴리펩타이드의 생물학적 또는 면역학적으로 유효한 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는, 서열번호 1과 80% 이상 동일한 핵산 서열
   을 포함하는, 단리된 돼지 파르보바이러스 5B(PPV5B).
4. 제3항에 있어서, PPV5B의 약독화된 비-독성 형태를 포함하는, PPV5B.
5. 제3항의 PPV5B의 사멸된 형태 또는 약독화된 형태를 포함하는, 독성 PPV5B에 의한 감염의 치료 또는 예방용 백신.
6. 제3항의 PPV5B의 사멸된 형태 또는 약독화된 형태의 서브유닛을 포함하는, 독성 PPV5B에 의한 감염의 치료 또는 예방용 백신.
7. 제6항에 있어서, 상기 서브유닛이 서열번호 4의 캡시드 단백질인, 백신.
8. 제6항에 있어서, 상기 서브유닛이 서열번호 4의 폴리펩타이드의 면역학적으로 유효한 단편인, 백신.
9. 면역학적 유효량의 제2항의 폴리펩타이드, 및 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 면역원성 제제.
10. 면역학적 유효량의 제3항의 PPV5B를 투여함을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 생성하는 방법.
11. 면역학적 유효량의 제2항의 폴리펩타이드를 투여함을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 생성하는 방법.
12. 면역학적 유효량의 제5항의 백신을 투여함을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 생성하는 방법.
13. 면역학적 유효량의 제6항의 백신을 투여함을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 생성하는 방법.
14. 면역학적 유효량의 제7항의 백신을 투여함을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 생성하는 방법.
15. 제10항에 있어서, 상기 포유동물이 돼지이고, 상기 면역 반응이, PPV5B 감염에 의해 야기된 질환에 대한 방어 면역을 제공하는, 방법.
16. 제11항에 있어서, 상기 포유동물이 돼지이고, 상기 면역 반응이, PPV5B 감염에 의해 야기된 질환에 대한 방어 면역을 제공하는, 방법.
17. 제12항에 있어서, 상기 포유동물이 돼지이고, 상기 면역 반응이, PPV5B 감염에 의해 야기된 질환에 대한 방어 면역을 제공하는, 방법.
18. 제13항에 있어서, 상기 포유동물이 돼지이고, 상기 면역 반응이, PPV5B 감염에 의해 야기된 질환에 대한 방어 면역을 제공하는, 방법.
19. 제14항에 있어서, 상기 포유동물이 돼지이고, 상기 면역 반응이, PPV5B 감염에 의해 야기된 질환에 대한 방어 면역을 제공하는, 방법.
20. 서열번호 1의 서열을 갖는 돼지 파르보바이러스 5B 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 PPV5B 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서,
    상기 폴리펩타이드는 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고,
    상기 항체는, 상이한 파르보바이러스에 의해 암호화된 폴리펩타이드에는 결합하지 않는, 단리된 항체.
21. a) 생물학적 샘플을 제20항의 항체와 접촉시키는 단계,
    b) 상기 항체와 PPV5B 폴리펩타이드 간의 복합체의 형성을 검출하는 단계(여기서, 상기 복합체의 존재는 생물학적 샘플 중의 PPV5B의 존재를 나타낸다)
    를 포함하는, 생물학적 샘플 중의 PPV5B의 존재를 확인하는 방법.
22. 제1항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 플라스미드.
23. 제22항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
24. 제20항의 항체를 발현하는 하이브리도마.
25. a) 제20항의 항체, 및
    b) 항체와 PPV5B 폴리펩타이드 간의 복합체의 형성을 검출하기 위한 시약
    을 포함하는, 생물학적 샘플 중의 PPV5B의 존재를 확인하기 위한 진단용 키트.
26. a) PPV5B 감염과 관련된 하나 이상의 질환에 대해 동물을 면역화하는데 효과적인 하나 이상의 면역원성 PPV5B 펩타이드;
    b) 하나 이상의 담체 또는 애쥬번트(adjuvant) 분자;
    c) 면역원성 조성물을 포장하기 위한 컨테이너;
    d) 인쇄된 지침서들의 세트; 및
    e) 면역원성 조성물을 동물에게 투여할 수 있는 디스펜서
    를 포함하는, 면역원성 키트.
27. 제26항에 있어서, 상기 바이러스 또는 박테리아로의 감염과 관련된 질환을 야기하는 하나 이상의 다른 돼지 병원성 바이러스 또는 박테리아에 대해 상기 동물을 면역화하는데 효과적인 하나 이상의 면역원성 단백질을 추가로 포함하는 면역원성 키트.

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