UA118551C2 - Парвовірус свиней 5b, спосіб застосування та вакцина - Google Patents

Abstract

Винахід стосується ізольованого полінуклеотиду та його застосування для формування захисного імунітету до PPV5В

Description

Винахід стосується ізольованого полінуклеотиду та його застосування для формування захисного імунітету до РРУ5В.

СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

Дана заявка містить список послідовностей відповідно до 37 СЕК 1.821-1.825. Список послідовностей, який супроводжує дану заявку, є введеним в неї як посилання. Зазначена АЗСІЇ копія, створена 21 березня 2013, має назву 10-0153-М/0-1-560хХІ та розмір 34,495 біт.

ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ

А. Галузь, до якої відноситься винахід

Даний винахід є пов'язаним з галуззю здоров'я тварин та відноситься до нових штамів парвовірусу свиней, які включають атенуйовані штами для вакцинації, способів виробництва та способів лікування при використанні вакцин, отриманих із зазначених нових штамів парвовірусу.

В. Опис галузі техніки

Парвовіруси інфікують широке коло видів тварин, і деякі з них є відповідальними за важкі клінічні захворювання, проте більшість цих вірусів викликають тільки слабкі або субклінічні інфекції. Вони належать до родини Рагуомігідає та утворюють дві підродини: Юепзомігіпає, члени якої інфікують комах, та Рагмомігіпае, члени якої інфікують хребетних тварин. Остання підродина в даний час включає 5 родів: ЮОерепадоміги5, Егуїпгоміги5, Атаоміги5, Восамігив5 і

Рагуомігизв (1).

Віріони парвовірусу не мають оболонки та містять одноланцюгові, лінійні геноми на основі

ДНК розміром приблизно 5-6 кілобаз (кб). Геном складається з двох основних відкритих рамок зчитування (ОКЕ), які кодують неструктурні та капсидні білки. Нещодавно описані Восамігибе5 містять третю ОКЕ між двома основними ОКЕ (1).

Класичні штами парвовірусу свиней (РРМ1) роду Рагмоміги5 широко поширені в усьому світі та є відповідальними за репродуктивні розлади у свиней, зокрема, у стадах, де не дотримуються правильних прописів вакцинації або ефективність вакцини знижується через імуносупресивні фактори. Протягом останнього десятиліття ряд нових парвовирусів був виявлений у свиней. Вони включають парвовірус свиней 2 (РРУЗ) (2) і споріднені віруси (3).

Нова група парвовірусів свиней та корів, а саме група гоковірусів (РНОоМ, ВНоМ), була виявлена в Гонконзі (4), і ці віруси були визначені як такі, що є генетично подібними до людськими РАКМА4 і 5. Незважаючи на те, що вони спочатку називалися гоковірусами на честь Гонконгу, була запропонована нова класифікація РНОоМ як РРУЗ (5). РРУ4 демонструє найбільшу схожість з

Зо коров'ячим парвовірусом 2, але кодуюча здатність та організація генома є аналогічними до таких бокавірусів, оскільки РРМ4 кодує додаткову ОКЕЗ, як і бокавіруси, розташовану між ОКЕ1 і ОМКЕ2. Проте путативний білок ОКЕЗ, що кодується РРМ4, істотно відрізняється від такого бокавірусів (5).

Існує постійна потреба в моніторингу свиней відносно появи нових вірусів та для розробки вакцин, лікування і способів виявлення нових вірусів.

КОРОТКИЙ ВИКЛАД СУТІ ВИНАХОДУ

Винахід стосується нових нуклеотидних послідовностей, послідовностей білка, імуногенних композицій, вакцин та способів, які відносяться до створення та застосування нових штамів парвовірусів, які заражають, зокрема, домашніх свиней. Ці штами відносяться до нових парвовірусів свиней, ідентифікованих у зразках тканин, отриманих від клінічно хворих домашніх свиней; на основі гомології послідовності з відомими видами та штамами парвовірусів свиней, новий вірус був позначений як парвовірус свиней 5В або РРУБВ.

Композиції та способи згідно з даним винаходом забезпечують виявлення інфекцій за допомогою вказаного нового вірусу, моніторинг генетичних змін у вірусних послідовностях диких та домашніх тварин, та у худоби, а також створення і застосування нових вакцин для захисту тварин від інфекції вірусом.

Імуногенні композиції та вакцини згідно з даним винаходом включають поліпептидні послідовності, які кодуються послідовністю нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮО МО: 1, або їх імуногенні фрагменти, а також необов'язково включають ад'юванти для індукції більш потужної імунної відповіді.

Типові композиції згідно з даним винаходом включають будь-яку з поліпептидних послідовностей 5ЕБЕО ІО МО: 2, 5БО ІЮО МО: 3, 5БО МО: 4, або їх фрагменти, які є імунореактивними з антитілами, специфічними для РРМ5В. Переважні поліпептиди згідно з даним винаходом включають послідовність зЗЕО ІЮ МО: 4. Переважно такі поліпептиди або їх фрагменти є імунореактивними з антитілами, специфічними для РРУБВ.

В іншому аспекті даний винахід забезпечує послідовності нуклеїнової кислоти, які кодують один або кілька поліпептидів, конструкції антитіл або кон'югати антитіл. Генні послідовності, що кодують поліпептиди, включають послідовність нуклеїнової кислоти, яка є принаймні на 95 95, 90 9, 85 95 або навіть 80 95 гомологічною та/або ідентичною до послідовності відповідно до ЗЕО 60 ІО МО: 1, зокрема, нуклеотидні послідовності 2861-5014 5БО ІО МО: 1 (білок капсиду) або фрагменти 5ЕБЕО ІЮ МО: 1, що кодують поліпептид, який є імунореактивним з антитілами, специфічними для РРМ5В. Приклади послідовностей нуклеїнових кислот згідно з даним винаходом включають будь-яку з послідовностей нуклеотидів 9335-2024 5БО ІЮО МО: 1, нуклеотидів 2161-2860 5ЕО ІЮО МО: 1, нуклеотидів 2861-5014 5ЕО ІО МО: 1, ії фрагменти, які кодують поліпептид, який є імунореактивними з антитілами, специфічними для РРУБ5В. Бажаним є коли послідовності нуклеїнових кислот або гени являють собою такі, що кодують поліпептид або пептид, який є імунореактивним з антитілом, специфічним для РРМУБВ.

Крім того, поліпептид згідно з даним винаходом, як використовується в даній заявці, включає, але без обмеження таким, поліпептид, який включає: ї) поліпептид, що включає амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: З або 5ЕО ІО МО: 4; ії) поліпептид, який є принаймні на 80 95 гомологічним та/або ідентичним з поліпептидом і); ії) ррагмент поліпептидів у відповідності з ї) та/або ії); їм) фрагмент ії) або ім), який включає принаймні 13, переважно 15, більш переважно 17, ще більш переважно 20 суміжних амінокислот, що є включеними до послідовності ЗЕО ІЮ МО: З або

ЗЕО ІЮ МО: 4; м) поліпептид, який кодується полінуклеотидом, що включає послідовність нуклеотидів 935- 2024 5ЕО ІЮ МО: 1, нуклеотидів 2161-2860 5ЕО ІО МО: 1 або нуклеотидів 2861-5014 5ЕО І МО: 1; мі) поліпептид, який кодується полінуклеотидом, що є принаймні на 80 95 гомологічним або ідентичним полінуклеотиду відповідно до мі); мії) фрагмент білка, який кодується полінуклеотидом, що включає принаймні 39, переважно 45, більш переважно 51, навіть більш переважно 60 суміжних нуклеотидів, які Є включеними у послідовності нуклеотидів 2161-2860 5ЕО ІЮ МО: 1, або нуклеотидів 2861-5014 5ЕО ІО МО: 1.

Імуногенні композиції згідно з даним винаходом, які містять принаймні один або більше поліпептидів РРМ5В, як визначено в даній заявці, можуть додатково містити фізіологічно прийнятний носій, такий як фармацевтично або ветеринарно прийнятний носій, ад'ювант або їх комбінації.

Будь-який з поліпептидів РРМУ5В, які забезпечуються в даній заявці, або будь-яка з імуногенних композицій, що містять один або більше поліпептидів РРУБВ, які забезпечуються в

Зо даній заявці, можуть бути використані як лікарський засіб, переважно як вакцина або імуногенна композиція, переважно для профілактики або для лікування суб'єкта від інфекції РРУБВ.

Особливо бажані РРМ5В поліпептиди включають такі з імуногенними епітопами, які індукують імунологічну відповідь, специфічну для РРМ5В. Переважні РРМА поліпептиди включають ті, які мають амінокислотні послідовності, спрогнозовані у споріднених РРМ1 як поверхневі антигени (Зітрзоп та ін. УМВ 315, 2002) та включають, але не обмежуються такими, як залишки 289, 375-381 та 431-443 послідовності ФЕО ІЮ МО: 4.

Фахівцям у даній галузі техніки буде зрозуміло, що композиції, які використовуються в даній заявці, можуть включати відомі ін'єкційні, фізіологічно прийнятні стерильні розчини. Для приготування готового до застосування розчину для парентерального введення або інфузії є доступними водні ізотонічні розчини, наприклад, фізіологічний розчин або розчини білка плазми крові. Крім того, імуногенні композиції та вакцини згідно з даним винаходом можуть включати прийнятні для ветеринарії носії, розріджувачі, ізотонічні агенти, стабілізатори або ад'юванти.

Способи згідно з даним винаходом включають, але не обмежуються такими, як спосіб індукції імунної відповіді проти РРУБВ інфекції у суб'єкта, що включає стадію введення суб'єкту імуногенної композиції, що містить один або більше РРУБ5В поліпептидів, як визначено в даній заявці. Є бажаним, коли імунна відповідь індукується проти більш ніж одного серотипу або штаму РРУЗВ. Композиції згідно з даним винаходом можуть бути використані для лікування або, як альтернатива, для запобігання інфекції РРУ5В. Переважно така імунна відповідь знижує частоту виникнення і тяжкість одного або більше клінічних симптомів, які пов'язані з або які викликаються інфекцією одним або більше серотипами РРУБВ.

У даній заявці підходящі суб'єкти та суб'єкти, які цього потребують та яким можуть бути введені композиції згідно з даним винаходом, включають тварин, які потребують профілактики або лікування інфекції, захворювання або стану, асоційованого з вірусами, мікробами, паразитами, найпростішими, бактеріями або грибами. Тварини, в яких стимулюється імунна реакція при використанні композицій або способів згідно з винаходом, включають домашню худобу, наприклад, свиней, корів, птахів (наприклад, курей, качок, гусей або індиків), кіз та овець, а також домашніх тварин таких, як миші, кролики, собаки, кішки та коні. Бажані тварини включають свиней, муридових, непарнокопитих, зайцеподібних то полорогих. Найбільш доцільним є, коли імунна реакція стимулюється у свиней.

Винахід також забезпечує спосіб зниження частоти або тяжкості одного або більше симптомів, асоційованих з або викликаних РРМ5В інфекцією, що включає стадію введення імуногенної композиції згідно з даним винаходом, яка включає один або більше пептидів РРУЗВ згідно з даною заявкою і переважно молекулу носія, наприклад, так, що частота або тяжкість клінічної ознаки РРУБВ інфекції зменшується принаймні на 10 95, переважно принаймні на 20 обо, ще більш переважно принаймні на 30 95, навіть більш переважно принаймні на 50 95, навіть більш переважно принаймні на 70 95, найбільш переважно принаймні на 100 95 у порівнянні з суб'єктом, який не отримує імуногенної композиції, як це передбачено в даній заявці. Такі ознаки включають віремію та імуносупресію як результат інфекції РРУБВ. Такі клінічні ознаки можуть включати неврологічні симптоми (депресія, атаксія, млявість), діарею, задишку, погіршення стану організму, набряк суглобів (який призводить до кульгавості лежачого положення), зниження середнього приросту ваги за добу, смертність та полісерозит в результаті поєднаної інфекції іншим організмом, наприклад, Мусоріазта Ппуогпіпів.

Згідно з ще одним аспектом даний винахід також стосується способу профілактики інфекцій

РРМУБ5БВ, в якому зазначені РРУ5В інфекції можуть бути викликані РРУМ5В, які мають 100 95 ідентичності послідовності з нуклеотидною послідовністю ЗЕО ІО МО: 1, які мають принаймні 9595 ідентичності послідовності з нуклеотидною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 1, які мають принаймні 90 95 ідентичності послідовності з нуклеотидною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 1, або мають принаймні 85 95 ідентичності послідовності з нуклеотидною послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 1, що включає стадію введення імуногенної композиції згідно 3 даним винаходом, яка включає один або більше пептидів РРУБВ, як це передбачено згідно з даною заявкою, тобто принаймні один поліпептид, що має 10095, принаймні 95 95, принаймні 90 95 та/або принаймні 85 95 ідентичності послідовності, відповідно, з поліпептидними послідовностями ЗЕО ІЮ МО: 3 та/або

ЗЕО ІЮО МО: 4, або їх фрагменти, що включають принаймні 12, бажано 15, більш бажано 17, навіть більш бажано 20 послідовних амінокислот, що є включеними у послідовності зЕО ІЮ МО:

З та/або 5ЕО ІЮ МО: 4.

Даний винахід також стосується способу одержання будь-якої з імуногенних композицій, які забезпечуються в даній заявці, який включає змішування одного або більше пептидів РРМБВ, як це передбачено даним винаходом, з молекулою носія, переважно таким чином, що один або більше пептидів РРУМ5В і молекула носія є ковалентно зв'язаними або кон'югованими один з одним. Такі кон'югати можуть бути полівалентними або одновалентними. Полівалентні композиції або вакцини включають імунну кон'югацію декількох пептидів РРУ5В з молекулою носія. У додатковому аспекті даний винахід відноситься до способу отримання одного або більше пептидів РРМ5В, де спосіб включає трансформацію клітини-хазяїна, переважно прокаріотичної клітини, такої як Е.соїї, за допомогою молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує будь-який з пептидів РРМ5В згідно з даною заявкою. Альтернативно, клітина-хазяїн може являти собою еукаріотичну клітину, таку як клітина тварини, клітина комахи, клітина найпростішого, рослинна клітина або клітина грибів. Переважно еукаріотична клітина являє собою клітину ссавця, таку як клітина СНО, ВНК або СОБ5 або клітину грибів таких, як

Засспаготусе5 сегемізіає, або клітинку комах, таку як 5Ю. Також бажаною є бакуловірусна експресія нуклеїнових кислот відповідно до даного винаходу.

Інший аспект даного винаходу стосується способу отримання одного або більше пептидів

РРУЗВ, які індукують імунну відповідь проти принаймні одного генетичного варіанту РРМУБВ і, більш переважно, двох або більше генетичних варіантів РРМ5В. Цей спосіб включає культивування трансформованого експресійного вектора, що кодує та експресує один або більше пептидів РРМ5В, розкритих в даній заявці. Експресовані білки або утримуються організмом, в якому вони були експресовані, або секретуються в культуральне середовище.

Експресію здійснюють в умовах, які є прийнятними для отримання РРУБВ пептиду, здатного індукувати імунну відповідь на РРМ5В. РРУМ5В серотипи, до яких РРУБЗВ пептиди індукують імунну відповідь, включають, але не обмежуються такими, як послідовності, які мають принаймні 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91 або 90 95 ідентичності.

Способи отримання композицій згідно з даним винаходом можуть додатково включати змішування кон'югату одного або більше пептидів РРМ5В та молекули носія з фізіологічно прийнятним носієм таким, як фармацевтично або ветеринарно прийнятний носій, ад'ювант або їх комбінації. Фахівцям у даній галузі техніки буде зрозумілим, що вибір носія, ад'юванта або комбінації буде залежати від шляху доставки, особистих переваг та видів тварин, серед інших.

В іншому аспекті даний винахід відноситься до способу діагностики інфекції РРУ5В у суб'єкта. Цей спосіб включає введення одного або більше пептидів РРМ5В; приведення в контакт одного або більше пептидів РРМУБВ із зразком, отриманим від суб'єкта; та ідентифікацію суб'єкта як такого, що має РРМ5В інфекцію, якщо у зразку виявлено антитіло, яке здатне зв'язуватися з одним або більше пептидів РРМ5В.

В іншому аспекті винахід відноситься до способу встановлення факту того, що суб'єкт раніше піддавався РРУБВ інфекції і здатний формувати імунну відповідь на РРУМ5В. Цей спосіб включає введення одного або більше пептидів РРУБВ; приведення в контакт одного або більше пептидів РРМУБВ із зразком, отриманим від суб'єкта; та ідентифікацію суб'єкта як такого, що має

РРМУЗБВ інфекцію, якщо у зразку виявлено антитіло, яке здатне зв'язуватися з одним або більше пептидів РРМ5В.

Винахід також відноситься до наборів, які включають імуногенну композицію, яка містить один або більше пептидів РРУБВ, переважно разом з молекулою носія; контейнер для упаковки імуногенної композиції; набір надрукованих інструкцій; і дозатор, здатний до введення імуногенної композиції тварині. Необов'язково, один або більше РРУБ5В пептидів і молекула носія можуть бути упаковані у вигляді кон'югата або у вигляді окремих сполук. При забезпеченні окремих компонентів також забезпечуються засоби кон'югації одного або більше пептидів

РРУЗВ і молекули носія, а також відповідні надруковані інструкції.

Винахід також відноситься до наборів для вакцинації тварини, що включає комплект роздрукованих інструкцій; дозатор, здатний до введення імуногенної композиції, як забезпечується в даній заявці, що включає один або більше РРУБВ пептидів, тварині; та де принаймні один з пептидів РРУМ5В ефективно імунізує тварину проти принаймні одного захворювання, пов'язаного з інфекцією РРУ5В. Переважно, один або більше РРУМ5В пептидів вибирають з тих, які передбачені відповідно до даного винаходу. Набори згідно з даним винаходом можуть додатково містити ветеринарно прийнятний носій, ад'ювант або їх комбінацію.

Дозатор в наборі згідно з даним винаходом здатний виділяти свій вміст у вигляді крапель; а імуногенна композиція, що міститься в наборі, яка включає в себе РРУБ5В пептиди, як це передбачено цим винаходом, здатна зменшувати вираженність принаймні одної клінічної ознаки при РРМУБВ інфекції при введенні інтраназально, перорально, підшкірно або внутрішньом'язово в організм тварини. Бажано, коли тяжкість клінічних симптомів зменшується принаймні на 10 Фо переважно принаймні на 20 95, ще більш переважно принаймні на 30 95, навіть більш переважно

Зо принаймні на 50 95, навіть більш переважно принаймні на 70 95, найбільш переважно принаймні на 100 95, у порівнянні з зараженими тваринами, яких не піддавали лікуванню.

Також розкриваються способи лікування або профілактики інфекцій, викликаних РРМУБВ.

Спосіб включає введення ефективної кількості імуногенної композиції згідно з даним винаходом суб'єкту, який відрізняється тим, що лікування або профілактику вибирають з групи, яка складається зі зниження симптомів РРУБ5В інфекції, зниження тяжкості або частоти клінічних симптомів інфекції РРУБВ, зменшення смертності суб'єктів у результаті РРУБВ інфекції, та їх комбінації.

Композиції згідно з даним винаходом додатково містять ветеринарно прийнятний носій, ад'ювант або їх комбінації. Такі композиції можуть використовуватися як вакцини і включати одну або більше додаткові атенуйовані вакцини, інактивовані вакцини або їх комбінації. Такі вакцини викликають протективну імунну відповідь принаймні проти одного захворювання, пов'язаного з вірусами, вибраними з групи, що складається зі свинячих парвовірусів 1, 2, 3, 4,

БА, 5В, інших видів парвовірусів свиней, інших патогенних вірусів і бактерій свині та їх комбінацій. Інші типи вакцин, які можуть бути сумісно введені в комбінації з вакциною до РРМУБВ, включають, але не обмежуються такими, як цирковірус свиней типу 2 (наприклад, ІпдеімасФ

СігсоБГ ЕХ, Іпдеїмаєт?Ф СігоРІ ЕХ-МусоПех), вірус репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (наприклад, Іпдеїмасю РРОСС АТН, Іпдеїмасю РРОС МіМ, ), парвовірус свиней (наприклад, КергоСуст? РРОС-РІ Е), мікоплазма (наприклад, Іпдеїмас? МусопПех), і т.д.

Фахівцям у даній галузі техніки буде зрозумілим, що композиції, які використовуються в даній заявці, можуть включати відомі ін'єкційні, фізіологічно прийнятні стерильні розчини. Для приготування готового до використання розчину для парентерального введення або інфузії водні ізотонічні розчини, наприклад, фізіологічні розчини або розчини білка плазми крові, є легко доступними. Крім того, імуногенні композиції та вакцини згідно з даним винаходом можуть включати в себе фармацевтично або ветеринарно прийнятні носії, розріджувачі, ізотонічні агенти, стабілізатори або ад'юванти.

Способи згідно з даним винаходом можуть також включати змішування композиції згідно з даним винаходом з ветеринарно прийнятним носієм, ад'ювантом або їх комбінацією. Фахівцям у даній галузі техніки буде зрозумілим, що вибір основи, ад'юванта або комбінації буде залежати від способу доставки, особистих міркувань, видів тварин та інших факторів.

Винахід також стосується способу зниження тяжкості існуючої РРМ5В інфекції у тварини шляхом введення композиції тварині. Композиція може включати атенуйовану культуру вірусу або один або більше пептидів РРУБВ у поєднанні з прийнятним у ветеринарії носієм.

Переважні способи введення включають назальне, пероральне (наприклад, у питній воді), інтрадермальне та внутрішньом'язове. Внутрішньом'язове введення, найбільш переважно у вигляді одиничної дози, є бажаним. Фахівцеві в даній області буде зрозумілим, що композиції згідно з даним винаходом можуть також бути введені у вигляді двох або більше доз, а також при використанні інших шляхів введення. Наприклад, такі інші способи включають підшкірне, інтрадермальне, внутрішньовенне, інтраваскулярне, внутрішньоартеріальне, інтраперитонеальне, інтратекальне, інтратрахеальне, інтрадермальне, інтракардіальне, інтралобальне, інтрамедулярне, внутрішньолегеневе або інтравагінальне введення. Залежно від бажаної тривалості та ефективності лікування, композиції згідно з даним винаходом можуть бути введені один або кілька разів, а також можуть вводитися періодично, наприклад, на щоденній основі протягом декількох днів, тижнів або місяців і в різних дозуваннях.

Винахід також відноситься до наборів для вакцинації тварини, що включає комплект надрукованих інструкцій; дозатор, здатний до введення вакцини тварині; і принаймні один ізолят з клітинної культури, в тому числі, але не обмежуючись таким, з культури клітин бактерій, грибів, комах або ссавців, який ефективно імунізує тварин проти принаймні одного захворювання, асоційованого з РРУБВ, інші штами парвовірусу, інші патогени та/або їх комбінацію. Набори згідно з даним винаходом можуть додатково включати ветеринарно прийнятний носій, ад'ювант або їх комбінацію.

Пристрій для дозованого введення в наборі згідно з даним винаходом є здатним вивільняти свій вміст у вигляді крапель; а ізолят, який входить до складу набору, здатний зменшувати вираженність принаймні одного клінічного симптому інфекції РРУМ5В при інтраназальному, пероральному, підшкірному або внутрішньом'язовому введенні в організм тварини. У деяких наборах ізолят також є здатним знижувати тяжкість принаймні одного клінічного симптому інфекції РРУ5В. Переважно, тяжкість клінічного симптому зменшується принаймні на 10 95 у порівнянні з необробленою інфікованою твариною.

Інші об'єкти, ознаки та переваги даного винаходу будуть очевидними з наведеного нижче

Зо докладного опису. Проте при цьому слід розуміти, що докладний опис і конкретні приклади, які демонструють кращі варіанти здійснення винаходу, наводяться тільки як ілюстрація, оскільки різні зміни і модифікації в межах суті та об'єму винаходу будуть очевидними для фахівців в даній області техніки з цього докладного опису.

КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР

Наступні креслення є частиною цього опису та включені для додаткової демонстрації певних аспектів цього винаходу. Винахід може бути більш зрозумілим з посиланням на одну або більше з цих фігур у поєднанні з докладним описом специфічних варіантів здійснення винаходу, представлених в даній заявці. Заявка містить принаймні один малюнок, виконаний в кольорі.

Копії публікації цієї патентної заявки з кольоровим малюнком(ами) будуть надані Відомству за запитом і після оплати необхідного мита.

ФІГ. 1. показує послідовність нуклеїнової кислоти РРМ5В (ЗЕО ІО МО: 1).

ФІГ. 2. показує послідовність білка реплікази РРМБ5В (5ЕО ІО МО: 2).

ФІГ. 3. показує послідовність відкритої рамки зчитування (ОРЕ) білка РРМБ5В (ЗЕО ІО МО: 3).

ФІГ. 4. показує білкову послідовність капсидного білка РРМ5В (ЗЕО ІЮО МО: 4).

ФІГ. 5. показує попарне порівняння ідентичності амінокислот білкових послідовностей капсидного білка РРУМ5В та численних інших вірусних послідовностей. Посилання на вірусні послідовності є наведеними у Таблиці 1:

Таблиця 1

Ідентифік. номер Інформація про

Послідовність СепВапк журнал Автори худоба 12080-12085 (2007 Ріпієї, 0. 223 (2002 Сагптіснаві, І..Е. и Раїтізи, С.В.

Продовження таблиці 1

ІЗ аром МС 014358 Ріо5 МЕ 5 (7),| Кароог, А., Мена, М., Еврег, К.,

Е11948 (2010) Роїїзак-РгіїатеїЇ, М., Оцап, Р.І.,

Оаївзаг, М., Оєїманй, Е. и ПГіркіп,

М.

І РВоМ'їа НМ 053693 Ріоб5 ОМЕ 5 (10), | Спепд9, МУ.Х., Ії, 9.5., Ниапяод,

Е13583 (2010) С.Р., Мао, О.Р., Пи, М., Си, 5.Х.,

Уп, ХУ. и Юцап, 2.3.

ІБЇ РВоМ1Б НМ 053694 Ріоб5 ОМЕ 5 (10), | Спепд9, МУ.Х., Ії, 9.5., Ниапяод,

Е13583 (2010) С.Р., Мао, О.Р., Пи, М., Си, 5.Х.,

Уп, ХУ. и Юшцап, 2.3.

ІЄЇ НиВоса МО 007455 Ргос. Май. Асай. сі. | АПМапаєї, Т., Татті, М.Т.,

О.5.А. 102 (36), | ЕпК55оп, М., В/ієїКпег, «А,., 12891-12896 (2005) Тіме|ипа-І іпаеїї, А. и Апаетгв55оп,

В.

Г/ НиВосаг МС 012042 У. Іптесі. Оів. 199 (2), | Кароог, А., 5іїКав, Е., Зіттоповв, 196-200 (2009) Р., Спіеоснапвіп, Т., Маєет, А., оЗпацйкаї, 5., Аіат, М.М., 5Нагії,

З., Апде, М., 7аїді, 5. и Оеіман,

Е.

ІВЇ НиВосаз МС 012564 Ріо5 РаїШоядя. 5 (4),| Аййиг, У.С., Ніддіпв, а.0.,

Ет1000391 (2009) Рамідвоп, С.Р., Сімпеу, В.С. и

Ваїсіїйй, В.М.

ІЗ|Ї НиВоса4 МО 012729 У. Іпїесі. Оів. 201 (11), | Кароог, А., бБіттопав, Р., 5іїКав, 1633-1643 (2010) Е., ЦП, С, Воанідана, |/1., оЗеїШариїй, О., ТиКі, Н., Вані, О.,

Одегіпдєе, В.5., Вабра, М.М,.,

Викрик, О.М., Веззет", 9., ВапкКив, у. и ОвІмані, Е.

ТО СЕМВАМК 5., Каїіига, 7. и МаКадакі, М.

Н. и Рашії, С. 121) НоКомігив Б БО 200677 У. Сбеп. МіюіІ. 89 (РТ | Гай, 5.К., М/оо, Р.С., Тве, Н., Ри, 8), 1840-1848 (2008) С.Т., А", МУ.К., Спеп, Х.С., Твої,

НМУ., Твапа, Т.Н., СНнап, .4.5.,

Твапо, О.М., Ії, К.5., Тве, СМУ.,

Ма, Т.К., Твапо, О.Т., 7Непа, В..).,

Тат, 5., Спап, К.Н., 7Ллон, В. и

Уцеп, К.У. 19) РРУ4а НМ 031135 Мігої. У. 7 (1), 333 | Ниапо, ЇГ., 7Наї, 5.Ї., Спеийпо, (2010) А.К., 2папд, Н.В., Гопд, 9.Х. и уУцап, 5.5 14) РРУ4Бб спо 387499 Агси. Мію!. 155 (5),| Спейпа, А.К., Ми, а., Мапо, 0., 801-806 (2010) Вауїез, 0.0О., Іаде, К.М. и

Міпсепі, А... співу 17000010 1993 Тіівзеп, Р.

ФІГ. 6 показує філогенетичний аналіз ділянки МР1/САР РРУБВ у порівнянні з вірусним УР і капсидними білками, наведеними в Таблиці 1.

ФІГ. 7 показує ідентичність капсидних білків РРУБВ (залишки 184-851 послідовності БЕО ІЮ

МО: 4) по відношенню до найближчого спорідненого білка РРУ4 (номер доступу СепВапк й

АРЕМ73881 (ЗЕО ІО МО: 5)), який демонструє ідентичність послідовності на рівні 53 95 (367/690).

ФІГ. 8 показує ідентичність білка реплікази РРУБВ (залишки 1-594 послідовності 5ЕО ІЮ МО: 2) по відношенню до найближчого спорідненого білка РРУ4 (номер доступу СепВапк й

АрЕБ59557 (ЗЕО ІО МО: 11)), який демонструє ідентичність послідовності на рівні 87 95 (517/597). б

ДОКЛАДНИЙ ОПИС

Винахід забезпечує нуклеїнові кислоти та їх фрагменти, поліпептиди та їх імунологічно ефективні фрагменти, вакцини, імунологічно ефективні препарати, антитіла, діагностичні аналізи та набори, а також способи одержання і використання зазначених композицій та препаратів, пов'язаних з розкритим в даній заявці новим парвовірусом свиней 5В та його варіантами.

Здійснення даного винаходу буде використовувати, якщо не вказано інше, традиційні методики молекулярної біології, мікробіології, рекомбінантних ДНК, хімії білка та імунології, які є відомими фахівцям у даній галузі техніки. Такі методики є детально описаними в літературі.

Дивись, наприклад, Ззатргоок, Етпіївсй 5 Мапіаїїз, МоїІесшаг Сіопіпа: А І арогаюгу Мапиаї, томи І,

ПП, друге вид. (1989); ОМА Сіопіпа, томи І і ІІ (0. М. Сіомег ред. 1985); ОіІїдописіеоїіде Зупіпезів (МУ Саїй ред. 1984); Мисівїс Асіа Нубгіаіганйоп (ВО Натевз 4 5 Ніддіп5 ред. 1984); Апіта! Сеї

Сийиге (В. К. ред., 1986); Ітторбіїгей СеїІ5 апа Епгутез (ІВГ. вид., 1986); Ретаї, В., А Ргасіїсаї

Спціде юю Моїіесшіаг Сіопіпд (1984); серії, Меїйпод5 Іп Епгутоїоду (5. Соіоміск і М. Каріап ред., Асадетіс Ргев5, Іпс.); Ргоївіп ригіїйсайоп теїнодвз-а ргасіїса! арргоасі (ЕЇМ Наїтіз і 5. Ападаї ред.,

ІВ. Ргезз аї Охота Опімегейу Ргевзв); і Напароок ої Ехрегітепіа! Іттипоіоду, томи І-ІМ (ОМ УУеїг та СО ВіасКмеї! ред., 1986, ВіасКмєї! Зсієпійіс Рибіісайопв).

Перед описом винаходу слід розуміти, що даний винахід не обмежується конкретною послідовністю ДНК, поліпептидом або послідовностями або параметрами процесів, які, звичайно, можуть варіювати. Також слід розуміти, що використовувана в даній заявці термінологія призначена тільки для цілей опису конкретних варіантів здійснення винаходу і не призначена для обмеження. Слід зазначити, що, як використовується в даному описі та прикладеній формулі винаходу, форми однини "будь-який" або "цей" включають посилання на множину, якщо зі змісту явно не випливає інше. Так, наприклад, посилання на "будь-який антиген" включає в себе суміш двох або більше антигенів, посилання на "будь-який наповнювач" включає суміші двох або більше наповнювачів, тощо.

А. Визначення

Якщо не вказано інше, то всі технічні та наукові терміни, використовувані в даній заявці, мають те саме значення, як зазвичай це розуміється фахівцем у даній галузі техніки, до якої належить цей винахід, на момент подання заявки. Зміст і об'єм термінів повинен бути ясний; однак, у разі будь-якої прихованої двозначності, визначення, представлені в даній заявці, переважають над будь-яким словником або зовнішнім визначенням. Крім того, якщо інше не передбачене контекстом опису, то особливі умови повинні включати множини, а множинні терміни будуть включати однину. При цьому використання сполучника "або" означає "і/або", якщо не вказано інше. Крім того, використання терміну "включає", а також інших форм, таких як "включають" і "включений" не є обмежувальними. Усі патенти та публікації, згадані в цьому документі, є введеними в дану заявку як посилання. "Захист від хвороби", "протективний імунітет", "функціональний імунітет" і подібні фрази, означають відповідь, спрямовану проти захворювання або стану, яка викликається шляхом введення однієї або більше терапевтичних композицій згідно з даним винаходом, або їх комбінації, що призводить до більш знижених шкідливих ефектів, ніж можна було б очікувати у неімунізованого суб'єкта, який страждає від захворювання або інфекції. Тобто, тяжкість шкідливих ефектів інфекції зменшується у вакцинованого суб'єкта. Зараження може бути знижене, загальмоване або, можливо, повністю припинене у вакцинованого суб'єкта. При цьому коли мається на увазі повне запобігання інфекції, то це спеціально вказується. Якщо повне запобігання не вказане, то термін включає в себе часткове запобігання.

У даній заявці "зниження частоти виникнення захворювання та/або клінічних ознак" або "зниження клінічних симптомів" означає, але не обмежується такими, як зменшення кількості інфікованих суб'єктів у групі, зменшення або усунення кількості суб'єктів, які проявляють клінічні ознаки інфекції, або зменшення тяжкості будь-яких клінічних симптомів, які є присутніми в одного або більше суб'єктів, у порівнянні з інфекцією дикого типу. Наприклад, слід згадати будь- яке зниження навантаження патогена, виділення патогена, зниження передачі патогена або зменшення будь-якої клінічної ознаки симптоматичної інфекції РРМ5В. Є бажаним, коли ці клінічні ознаки знижуються в одного або більше суб'єктів, що отримують терапевтичну композицію згідно з даним винаходом принаймні на 10 95 у порівнянні з суб'єктами, які не отримують композицію та які є інфікованими. Більш бажано, коли клінічні ознаки зменшуються у суб'єктів, що отримують композицію згідно з даним винаходом принаймні на 20 95, переважно принаймні на 30 95, ще краще принаймні на 40 95, і навіть більш переважно принаймні на 50 95.

Термін "підвищений захист" в даному документі означає, але не обмежується такими, як 60 значне зниження одного або більше клінічних симптомів, які пов'язані з інфікуванням за допомогою інфекційного агента, переважно РРМУ5В, у групі вакцинованих суб'єктів проти невакцинованої контрольної групи досліджуваних суб'єктів. Термін "значне зниження клінічних симптомів" означає, але без обмеження таким, частоту виникнення принаймні одного клінічного симптому в групі вакцинованих суб'єктів, яка є принаймні на 10 95, переважно на 20 95, більш переважно на 30 95, ще більш переважно на 50 95, і навіть більш переважно на 70 95 нижчою, ніж у невакцинованій контрольній групі після зараження інфекційним агентом. "Тривалий захист" відноситься до "поліпшення ефективності", яка зберігається протягом не менше 3 тижнів, але більш переважно принаймні З місяці, ще більш переважно принаймні 6 місяців. У великої рогатої худоби найбільш бажаним є, коли тривала захист буде зберігатися до досягнення середнього віку, при якому тварини продаються на м'ясо. "Імуногенна або імунологічна композиція" відноситься до композиції речовини, яка містить принаймні один білок або поліпептид РРМУ5В, або його імуногенну частину, яка викликає у хазяїна опосередковану клітинами або антитілами імунну відповідь на композицію. У кращому варіанті здійснення даного винаходу імуногенна композиція викликає імунну відповідь і, більш переважно, забезпечує протективний імунітет щодо однієї або більше клінічних ознак інфекції

РРМБВ.

Термін "імуногенний" РРУМ5В поліпептид або "антиген", використовуваний в даній заявці, відноситься до поліпептиду або білка, який викликає імунну відповідь, як описано в даному описі. "Імуногенний" білок або поліпептид РРУБВ містить послідовність повного розміру будь- якої з кодованих послідовностей, зазначених у цьому документі, або їх аналоги або їх імуногенні фрагменти. Термін "імуногенний фрагмент" або "імуногенна частина" відноситься до фрагменту або вкороченої та/або заміщеної форми амінокислотної послідовності РРУБВ білка, яка включає один або більше епітопів і, таким чином, викликає імунну відповідь, описану в даній заявці. У загальному випадку, такі вкорочені та/або заміщені форми або фрагменти будуть містити або кодувати принаймні 13 послідовних амінокислот з повнорозмірного білка, наприклад, білка капсиду. Більш бажаним є, коли вкорочені або заміщені форми або фрагменти будуть містити принаймні 15, білош переважно принаймні 17, і ще більш переважно принаймні 20, їі навіть більш переважно, 30 суміжних амінокислот з повнорозмірного білка, наприклад, білка капсиду.

Термін "епітоп" означає сегмент або фрагмент композиції речовини, наприклад, білка або поліпептиду, який розпізнається імунною системою, зокрема, антитілами, В-клітинами або Т- клітинами. У цьому винаході, як правило, епітоп в загальному випадку являє собою фрагмент або фрагменти поліпептидної послідовності вірусного білка.

Такі фрагменти можуть бути ідентифіковані при використанні будь-якої з ряду методик, які використовуються для картування епітопів та які є добре відомими в даній галузі техніки.

Дивись, наприклад, Еріюре Марріпд Ргоїосоїв іп Меїподвз іп МоїІесшіаг Віоіоду, том 66 (Сіепп Е.

Могтіз, ред., 1996) Нитапа Ргез5, Тоїрула, Мем Уегзеу. Наприклад, лінійні епітопи можуть бути визначені за допомогою одночасного синтезу великої кількості пептидів на твердих основах, визначення пептидів, відповідних частин білкової молекули і взаємодії пептидів з антитілами, у той час як пептиди все ще залишаються приєднаними до основи. Такі методики є відомими та описані в даній галузі техніки, дивись, наприклад, патент США Мо 4708871; Сеузеп та ін. (1984)

Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 81: 3998-4002; і Сеузеп та ін. (1986) Моїес. Іттипої. 23: 709-715.

Аналогічно, конформаційні епітопи легко ідентифікуються за допомогою визначення просторової конформації амінокислот, наприклад, шляхом рентгенівської кристалографії та двовимірного ядерного магнітного резонансу. Дивись, Ерйоре Марріпд Ргоюсої5, як описано вище. Синтетичні антигени також є включеними у визначення, наприклад, поліепітопи, фланкувальні епітопи та інші рекомбінантні або синтетично отримані антигени. Дивись, наприклад, Вегдтапп та ін. (1993) Єиг. У. Іттипої. 23: 2777-2781; Вегдтапп та ін. (1996), 95.

Іттипої. 157: 3242-3249; Зи,пібієг, А. (1997), Іттипої!. ї Сеї! Віо!. 75: 402-408; і Сагапег та ін., (1998) 12-а всесвітня конференція зі СНІДу, Женева, Швейцарія, 28 липня 1998. (Розкриття і зміст яких є включеними в дану заявку як посилання). "Імунна відповідь" або "імунологічна відповідь" означає, але не обмежується такими, як розвиток клітинної та/або опосередкованої антитілами імунної відповіді на композиції або вакцини, що представляють інтерес. Як правило, імунна або імунологічна відповідь включає в себе, але не обмежується такими, як один або більше з таких ефектів: продукція або активація антитіл, В-клітин, Т-хелперів, супресорних Т-клітин та/або цитотоксичних Т-клітин, що є безпосередньо спрямованими на антиген або антигени, включені в композиції або вакцини, що представляють інтерес. Переважно, хазяїн буде демонструвати або терапевтичну, або захисну імунологічну (імунологічну пам'ять) відповідь так, що опір новій інфекції буде посилюватися та/або клінічна тяжкість захворювання буде знижуватися. Такий захист буде 60 продемонстрований або скороченням кількості симптомів, тяжкості симптомів, відсутністю одного або більше симптомів, пов'язаних з інфекцією патогеном, затримкою настання вирусемії, зниженням вірусної персистенції, зниженням загального вірусного навантаження та/або зменшенням екскреції вірусу.

У даній заявці "специфічно імунореактивний" відноситься до імунореактивного білку або поліпептиду, який розпізнає антиген, характерний для РРМУБ5БВ інфекції, але не реагує з антигеном жорсткого імуногенного контролю. Для того щоб визначити специфічність потенційного РРУБ5В імунореактивного білка або поліпептиду або іншого поліпептиду, можна використовувати різні імунологічні аналізи (ЕГІЗА, ІРА, вестерн-блоттінг аналіз) для дослідження білка, спрямованого проти сироватки тварини, яка містить генетично подібні віруси. Білок буде також піддаватися аналізу в різних імунологічних аналізах проти матеріалу, що містить білки, пов'язані зі способом експресії (бакуловіруси, клітини 519, тощо).

Як використовується в даній заявці, термін "фармацевтично або ветеринарно прийнятний носій" або "наповнювач" включає будь-який та усі розчинники, дисперсійні середовища, покриття, ад'юванти, стабілізувальні агенти, розріджувачі, консерванти, антибактеріальні та протигрибкові агенти, ізотонічні агенти, агенти, що уповільнюють адсорбцію та подібні до них. У деяких бажаних варіантах реалізації, і особливо в тих, які включають ліофілізовані імуногенні композиції, стабілізувальні агенти для використання в даному винаході, включають стабілізатори для ліофілізації або висушування заморожуванням.

У деяких втіленнях імуногенна композиція згідно з даним винаходом містить ад'ювант. "Ад'юванти", як використовується в даній заявці, можуть включати гідроксид алюмінію і фосфат алюмінію, сапоніни, наприклад, Оці А, 05-21 (Сатрбгідде Віоїесй Іпс., Сатбідде МА), СРІ-0100 (СаІепіса Рпагтасешііса!5, Іпс., Віппіпоапат, А), емульсію вода-у-маслі, масло-у-воді, вода-в- маслі-у-воді. Емульсія може базуватися, зокрема, на легкій вазеліновій олії (відповідно до європейської фармакопеї); ізопреноїдному маслі, такому, як сквалан або сквален; маслі, отриманому в результаті олігомеризації алкенів, зокрема, ізобутилу або децену; складних ефірах кислот або спиртів, що містять лінійну алкільних груп, зокрема, рослинне масло, етилолеат, пропіленгліколь ди-(каприлат/капрат), гліцерил три-(каприлат/капрат) або пропіленгліколь діолеат; складних ефірах розгалужених жирних кислот або спиртів, зокрема, складних ефірах ізостеаринової кислоти. Масло використовують в комбінації з емульгаторами з

Зо утворенням емульсії. Емульгатори переважно являють собою неіонні поверхнево-активні речовини, зокрема, складні ефіри сорбітану, маніту (наприклад, олеат ангідроманіту), гліколю, полігліцерину, пропіленгліколю та олеїнової, ізостеаринової, рицинолеїнової або гідроксистеаринової кислоти, які необов'язково є етоксильованими, і блоки співполімеру поліоксипропілену-поліоксіетилену, зокрема, продукти Рішпгопіс, зокрема, І 121. Дивись Нипіег та ін., Те Пеогу апа Ргасіїса! Арріїсайоп ої Адіимапів (Ед.5ієжап-Тий, ОЕ5), ЧоппУмїїєу апа Бопв,

МУ, стор. 51-94 (1995) та Тода та ін., Массіпе 15: 564-570 (1997). Типові ад'юванти являють собою 5РТ емульсію, описану на стор. 147 "Массіпе ЮОевідп, Те Зибрипії апа Адіимапі Арргоасі" під ред. М. Ромеї! і М. Мемж/тап, Ріепит Р'гез5, 1995, і емульсію МЕ59, описану на стор. 183 цього ж джерела.

Ще одним прикладом ад'юванта є сполука, вибрана з полімерів акрилової або метакрилової кислоти та співполімерів малеїнового ангідриду та алкенільних похідних. Переважні ад'ювантні сполуки являють собою полімери акрилової або метакрилової кислоти, які є перехресно зв'язаними, зокрема, з поліалкеніловими етерами цукрів або багатоатомних спиртів. Ці сполуки є відомими під терміном карбомер (Фармакопея том 8, Мо 2, червень 1996 г.). Фахівці в даній галузі техніки можуть також послатися на патент США Мо 2909462, який описує такі акрилові полімери, перехресно зшиті з полігідроксильованою сполукою, яка має принаймні, З гідроксильні групи, переважно не більше 8, при цьому атоми водню принаймні трьох гідроксильних груп замінюються ненасиченими аліфатичними радикалами, що містять принаймні 2 атома вуглецю. Переважні радикали являють собою такі, що містять від 2 до 4 атомів вуглецю, наприклад, вініли, аліл та інші етилен-ненасичені групи. Ненасичені радикали самі по собі можуть містити інші замісники такі, як метил. Продукти, які продаються під назвою

Саборої; (ВЕ Сооагісп, штат Огайо, США) є особливо прийнятними. Вони є перехресно зшитими з алілсахарозою або пентаеритритолом. Серед них можуть бути згадані Сагророї 974Р, 934Р і 971Р. Найбільш доцільним є використання Сагророї 971Р. Серед співполімерів малеїнового ангідриду та похідної алкенілу слід згадати співполімери ЕМА (Мопзапіс), які представляють собою співполімери малеїнового ангідриду та етилену. Розчинення цих полімерів у воді призводить до отримання кислотного розчину, який буде нейтралізований, переважно до фізіологічного значення рН, для того, щоб ввести розчин ад'юванта, в який буде включена імуногенна або імунологічна вакцина.

Інші відповідні допоміжні речовини являють собою, але не обмежуються такими, як ад'ювантна система КІВІ (Кірі Іпс.), блок співполімер (Суїх, АМапіа СА), ЗАБЕ-М (СнНігоп,

Етегуміе СА), монофосфорил ліпід А, ад'ювант Амгідіпе на основі ліпід-аміну, термолабільний ентеротоксин з Е.соїї (рекомбінантний або інший), холерний токсин, ІМ5 1314 або мурамілдипептид, або природні, або рекомбінантні цитокініни або їх аналоги, або стимулятори вивільнення ендогенних цитокінів, серед інших.

Очікується, що ад'ювант може бути доданий у кількості від приблизно 100 мкг до приблизно мг на дозу, переважно у кількості від приблизно 500 мкг до приблизно 5 мг на дозу, більш переважно в кількості від приблизно 750 мкг до приблизно 2,5 мг на дозу, а більшість переважно 10 в кількості приблизно 1 мг на дозу. Крім того, ад'ювант може перебувати в концентрації приблизно від 0,01 до 50 95, переважно в концентрації приблизно від 2 95 до 30 95, ще краще у концентрації приблизно від 5 95 до 25 95, ще більш переважно в концентрації приблизно від 7 90 до 22 95 та найбільш бажано в концентрації від 10 95 до 20 95 від об'єму заключного продукту. "Розріджувачі" можуть включати воду, сольовий розчин, декстрозу, етанол, гліцерин тощо.

Ізотонічні агенти можуть включати хлорид натрію, декстрозу, маніт, сорбіт і лактозу, серед інших. Стабілізатори включають альбумін та лужні солі етилендіамінтетраоцтової кислоти, серед інших. "Ігольований" означає "змінений рукою людини" у порівнянні з його природним станом, тобто, якщо це відбувається в природі, то він був змінений або видалений зі свого первісного навколишнього середовища або й те, й інше. Наприклад, полінуклеотид або поліпептид, який природним чином є присутнім в живому організмі не є "ізольованим", але той самий полінуклеотид або поліпептид, відокремлений від матеріалів, які співіснують з ним в його природному стані, є "ізольованим" в тому значенні, як цей термін використовується в даному документі. "Безпека" відноситься до відсутності побічних ефектів у вакцинованих тварин після вакцинації, в тому числі, але не обмежуючись такими: потенційне перетворення живої вірусної вакцини у вірулентну, клінічно значущі побічні ефекти такі, як стійкі, системні хвороби або неприйнятне запалення в сайті введення вакцини.

Терміни "вакцинація" або "вакцинують" або їх варіанти, як вони використовуються в даній

Зо заявці, означають, але не обмежується такими, як процес, який включає в себе введення імуногенної композиції згідно з даним винаходом, яка при введенні в організм тварини, викликає або може викликати - безпосередньо або опосередковано - імунну відповідь у тварини проти

РРМБВ. "Смертність" в контексті даного винаходу стосується смерті, викликаної інфекцією РРУБЗВ та/або супутніми інфекціями іншими організмами, які посилюються завдяки РРУБВ інфекції, і включає ситуацію, коли інфекція є настільки важкою, що тварину піддають евтаназії, щоб запобігти стражданням і забезпечити гуманне закінчення її життя. "Атенуювання" означає зниження вірулентності збудника. В даному винаході "атенуювання" є синонімом "авірулентності". У даному винаході атенуйований вірус являє собою такий, в якому вірулентність була зменшена так, що він не викликає клінічних ознак інфекції РРУБВ, але здатний індукувати імунну відповідь у цільового ссавця, а також може означати, що клінічні ознаки знижуються відносно частоти виникнення захворювання або тяжкості у тварин, заражених ослабленим РРМУБВ, в порівнянні з "контрольною групою" тварин, інфікованих за допомогою неатенуйованого РРМ5В, і тих, які не отримують атенуйований вірус. У цьому контексті термін "зниження/знижений" означає зменшення принаймні на 10 95, переважно на 25 95, ще більш переважно на 50 95, ще більш переважно на 60 95, навіть більш переважно на 70 95, ще більш переважно на 80 95, ще більш переважно на 90 95 і найбільш бажано на 100 95, в порівнянні з контрольною групою, як визначено вище. Таким чином, атенуйований авірулентний штам РРМ5В являє собою такий, який є прийнятним для включення до складу імуногенної композиції, що містить модифікований живий вірус РРУБВ. "Вбитий" або "інактивований" означає оброблений за допомогою фізичного або хімічного агента, який призводить до того, що вірус РРУМ5В стає мертвим та/або іншим нездатним до розмноження. РРМ5В може бути інактивований за допомогою звичайних засобів таких як, наприклад, вплив тепла, радіації або псоралену у присутності ультрафіолетового світла. РРУЗ5В можна інактивувати за допомогою звичайних засобів, таких як, наприклад, за допомогою хімічної інактивації з використанням одного або більше хімічних агентів для інактивації, включаючи, але не обмежуючись такими, один або більше з бінарного етиленіміну (ВЕЇ), пропіолактону, формаліну, глутаральдегіду та/або додецилсульфату натрію. Способи послаблення вірулентних штамів цих вірусів і способи отримання інактивованого вірусного бо препарату є відомими в даній галузі техніки та описані, наприклад, у патентах США Мо 4567042 і

Мо 4567043. Антигени з РРМ5В для використання у вакцинних композиціях згідно з даним винаходом можуть, таким чином, бути у вигляді цілісного вірусу, який являє собою модифікований та/або атенуйований живий вірусний препарат, або вбитий, або інактивований вірусний препарат, серед інших.

Термін "антитіла", як використовується в даній заявці, включає в себе анти-РРМУ5В антитіла, наприклад, моноклональні та поліклональні антитіла, одноланцюгові антитіла, химерні антитіла, гуманізовані антитіла, антитіла людини, свині та СОК-прищеплені антитіла, у тому числі сполуки, які включають СОК послідовності, які специфічно розпізнають поліпептид РРУБВ згідно з даним винаходом. Термін "специфічні для" вказує на те, що варіабельні ділянки антитіл згідно з даним винаходом впізнають та зв'язують виключно РРУМ5В поліпептид (тобто є здатними відрізнити виключно РРМБВ поліпептид від споріднених поліпептидів, незважаючи на ідентичність послідовностей, гомологію або подібність, що виявляється у родині поліпептидів), та які можуть (не обов'язково) взаємодіяти з іншими білками (наприклад, білком А 5. аигеи5 або іншими стафілококовими антитілами у способах ЕБЕЇІЗА) за допомогою взаємодії з послідовностями за межами варіабельної ділянки антитіла і, зокрема, у константній ділянці молекули антитіла. Аналізи скринінгу для визначення специфічності зв'язування антитіла згідно з даним винаходом є добре відомими та звичайно використовуються в даній галузі техніки. Для всебічного обговорення таких аналізів дивись Нагпом/ та ін. (ред.), Апіродіе5 А Іаброгайогу

Мапиа!: Соїа 5ргіпд Нагрог І арогафогу; Соїй Зргіпд Нагрог, МУ (1988), глава 6. Антитіла, які розпізнають і зв'язують фрагменти РРМ5В поліпептидів згідно з даним винаходом, також розглядаються, за умови, що антитіла є, у першу чергу, специфічними для РРУ5В поліпептиду згідно з даним винаходом, як визначено вище, з якого цей фрагмент отриманий. З метою більшої ясності слід уточнити, що "антитіло" відноситься до молекули імуноглобуліну, яка може зв'язуватися зі специфічним антигеном в результаті імунної відповіді на цей антиген.

Імуноглобуліни представляють собою сироваткові білки, що складаються з "легких" і "важких" поліпептидних ланцюгів, що мають "константні" та "варіабельні" ділянки та діляться на класи (наприклад, ІДА, дО, ЧЕ, дО та ІДМ) на основі складу константної ділянки. Антитіла можуть існувати в різних формах, включаючи такі форми, як, Ем, Раб, Е(аб)г, а також у вигляді одиничних ланцюгів, та включають синтетичні поліпептиди, які містять всі або частину однієї або більше поліпептидних послідовностей одиничного ланцюга антитіла.

У даній заявці "ефективна доза" означає, але не обмежується такими, як кількість антигену, яка викликає або здатна викликати імунну відповідь, що забезпечує зменшення клінічних симптомів у тварини, якій вводять антиген.

Як використовується в даній заявці, термін "ефективна кількість"? означає в контексті композиції кількість імуногенної композиції, здатної індукувати імунну відповідь, яка зменшує частоту або тяжкість інфекції, або частоту виникнення захворювання у тварини. Зокрема, ефективна кількість препарату живого атенуйованого вірусу, як вимірюється кількістю бляшкоутворювальних одиниць (БУС) на дозу або в еквівалентній мірі, піддається моніторингу при використанні середньої інфекційної дози для культури тканини (ТСІО50), тобто, кількості патогенного агента, який буде викликати патологічні зміни в 50 95 інокульованих та чутливих клітин культури. Для вбитої вакцини або антигенної субодиниці ефективна кількість відноситься до відносного вмісту антигену (КАС), тобто, до рівня включення антигену на ефективну дозу.

Крім того, в контексті терапії термін "ефективна кількість" відноситься до кількості терапевтичного агенту, яка є достатньою для того, щоб знизити або послабити тяжкість або тривалість захворювання або розладів, або одного або більше симптомів захворювання або розладу, запобігти розвитку захворювання або розладу, викликати регресію захворювання або розладу, запобігти рецидиву, розвитку, початку або прогресуванню одного або більше симптомів, пов'язаних із захворюванням або розладом, або підсилювати, або поліпшувати профілактику або лікування іншої терапії або терапевтичного агента. "Ідентичність послідовності", як це є відомим в даній галузі техніки, відноситься до відносин між двома або більше поліпептгидними послідовностями або двома або більше полінуклеотидними послідовностями, зокрема, референтною послідовністю та заданою послідовністю, для того, щоб порівняти її з референтною послідовністю. Ідентичність послідовності визначається за допомогою порівняння даної послідовності та референтної послідовності після того, як послідовності були оптимально вирівняні для отримання найвищого ступеня подібності послідовності, як визначається шляхом порівняння ланцюгів таких послідовностей, при використанні гепів, введених у разі потреби. Після такого вирівнювання ідентичність послідовності визначається на основі підходу положення-до-положення, наприклад, послідовності є "ідентичними" в певному положенні, якщо в цьому положенні 60 нуклеотиди або амінокислотні залишки є ідентичними. Загальна кількість таких ідентичних положень потім ділиться на загальне число нуклеотидів або залишків у референтній послідовності, щоб отримати 95 ідентичності послідовності. Ідентичність послідовностей може бути легко обчислена за допомогою відомих способів, включаючи, але не обмежуючись такими, як ті, що описані у Сотршиїайнопаї! Моїесшціаг Віоіоду, Гез5К, АМ, ред., Охіога Опімегейу Рге55, Мем/

Хоїк (1988), Віосотршиіпа: Іптогтаїйсз апа Сепоте Рго|есів, тій, ОМУ, ред., Асадетіс Ргев5,

Мем МогкК (1993); Сотршиїег Апаїузі5 ої Зедпепсе Вага, частина І, Сгійп, АМ, і Сгійіп, НО, ред.,

Нитапа Ргез5, Мем Уегзеу (1994); бБедиепсе Апаїувіз іп Моїіесшіаг Віоіоду, моп Неїіпде, а.,

Асадетіс Ргезз (1987); Зедиепсе Апаїувзів Ргітег, Сгір5Ком, М. і Оемегеих, ч)., ред., М. 5іоскіоп

Рге55, Мем/ ХогК (1991); ії Сапіно, Н., ії Гіртап, 0., ЗІАМ у. Арріїеєй Маїй., 48: 1073 (1988); розкриття яких є введенням в дану заявку як посилання. Перевага способи визначення ідентичності послідовностей розроблені дляя того, щоб забезпечити найбільшу збіг між досліджуваними послідовностями. Способи визначення ідентичності послідовностей кодифіковані в загальнодоступних комп'ютерних програмах, що визначають ідентичність між даними послідовностями. Приклади таких програм включають, але не обмежуються такими, як, пакет програм СО (Оемегеишх, у., та ін., Мисівїс Асіаз Кезеагсй, 12 (1): 387 (1984)), ВГА5ТР, ВІ А5ТМ і

ВГА5ТХ (Аї5спиЇ, ЗЕ і ін., У. Моїес. Віої!., 215: 403-410 (1990). Програма ВІ А5ТХ є доступною від

МСВІ та інших джерел (ВГАБТ Мапиаї, АйбспиїЇ, С. та ін, МСМІ ММ МІН Веїйпезаа, МО 20894,

АБС, ЗЕ та ін., у. Віо! Моїес, 215: .... 403-410 (1990), зміст яких є включеним в даний опис як посилання). Ці програми оптимально вирівнюють послідовності при використанні штрафів за відкриття гепа за умовчанням для того, щоб отримати найвищий рівень ідентичності при порівнянні заданої та референтної послідовностей. Для ілюстрації, під полінуклеотидом, який має послідовність нуклеотидів, що є принаймні наприклад, на 85 95, переважно на 90 95, ще більш переважно на 95 95, ідентичною з референтної нуклеотидною послідовністю, розуміють той факт, що нуклеотидна послідовність даного полінуклеотиду є ідентичною референтній послідовності за винятком того, що дана полінуклеотидна послідовність може включати аж до 15, переважно аж до 10, ще більш переважно аж до 5 точкових мутацій на кожні 100 нуклеотидів референтної нуклеотидної послідовності. Іншими словами, у полінуклеотиді з послідовністю нуклеотидів, що має принаймні 85 95, переважно 90 95, ще більш переважно 95 95 ідентичності у порівнянні з референтною нуклеотидною послідовністю, аж до 15 95, переважно 10 95, навіть

Зо більш переважно 595 нуклеотидів в референтній послідовності може бути видалено або замінено іншим нуклеотидом або декількома нуклеотидами, або аж до 15 95, переважно 10 95, ще більш переважно 5 95 від загальної кількості нуклеотидів в референтній послідовності може бути вбудовано в референтну послідовність. Ці мутації референтної послідовності можуть мати місце у 5' або 3' кінцевих положеннях референтної нуклеотидної послідовності або де-небудь між цими кінцевими положеннями, при цьому вони можуть чергуватися або індивідуально поміж нуклеотидів у референтній послідовності, або в одній або більше суміжних групах референтної послідовності. Аналогічно, під поліпептидом, що характеризується заданою амінокислотною послідовністю, яка мають принаймні наприклад, 85 95, переважно 90 95, ще більш переважно 95 95 ідентичності по відношенню до референтної амінокислотної послідовності, розуміють той факт, що дана амінокислотна послідовність поліпептиду є ідентичною референтній послідовності за винятком того, що дана послідовність поліпептиду може включати аж до 15, переважно аж до 10, ще більш переважно аж до 5 амінокислотних змін на кожні 100 амінокислот референтної амінокислотної послідовності. Іншими словами, для отримання даної поліпептидної послідовності, яка має принаймні 85 95, переважно 90 95, ще більш переважно 95 95 ідентичності послідовності з референтною амінокислотною послідовністю, аж до 15 95, переважно аж до 10 95, ще більш переважно аж до 5 95 залишків амінокислот у референтній послідовності може бути видалено або заміщено іншою амінокислотою або кількість амінокислот аж до 15 95, переважно аж до 10 95, ще більш переважно аж до 5 95 від загальної кількості амінокислотних залишків у референтній послідовності може бути вбудовано у референтну послідовність. Ці зміни референтної послідовності можуть мати місце в аміно- або карбокситермінальних положеннях референтної амінокислотної послідовності, що зустрічаються або індивідуально між залишками в референтній послідовності, або в одній або більше суміжних групах у межах референтної послідовності. Переважно, положення залишків, які не є ідентичними, відрізняються консервативними амінокислотними замінами. Проте консервативні заміни не включені як співпадання при визначенні ідентичності послідовності. "Гомологія послідовності" як використовується в даній заявці, відноситься до способу визначення спорідненості двох послідовностей. Для того щоб визначити гомологію послідовності, дві або більше послідовностей піддаються оптимальному вирівнюванню, і, за необхідності, вводяться гепи. Проте, на відміну від "ідентичності послідовності", консервативні 60 заміни амінокислот також вважаються як співпадання при визначенні гомології послідовності.

Іншими словами, для отримання поліпептиду, що має 95595 гомології послідовності з референтною послідовністю, 85 95, переважно 90 95, навіть більш переважно 95 95, залишки амінокислот у референтній послідовності повинні співпадати або містити консервативну заміну іншою амінокислотою, або кількість амінокислот аж до 15 95, переважно аж до 10 95, ще більш переважно аж до 5905 від загальної кількості амінокислотних залишків, в тому числі неконсервативних замін, в референтній послідовності може бути вбудовано в референтну послідовність. Переважно, гомологічна послідовність включає принаймні ділянку, що складається з 50, навіть більш переважно з 100, навіть більш переважно з 250, навіть більш переважно з 500 нуклеотидів, які кодують гомологічні амінокислоти.

Термін "консервативна заміна" відноситься до заміни амінокислотного залишку на інший амінокислотний залишок, який має аналогічні характеристики або властивості, включаючи розмір, гідрофобність, тощо, таким чином, що загальна функціональність істотно не змінюється.

Це також може означати нуклеотидну заміну, яка приводить до консервативної амінокислотної заміни.

В. Молекули носія

Молекули носія, з якими можуть бути кон'юговані або ковалентно зв'язані РРУБВ білки або пептиди згідно з даним винаходом, переважно являють собою ті, які описані вище. Переважні носії для використання у тварин являють собою бичачий сироватковий альбумін та гемоціанін лімфи равлика. Бажаним є коли сам білок носія являє собою імуноген.

РРМ5В білки або пептиди згідно з даним винаходом можуть бути ковалентно зв'язані з носієм будь-яким зручним способом, відомим в даній галузі техніки. Незважаючи на те, що використання симетричного лінкера такого, як дигідразід адипінової кислоти, як описано

Зеппеегзоп та ін., у. Ехрегітепіа! Медісіпе, 152, 361-376 (1980), або гетеробіфункціонального лінкера такого, як М-сукцінімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонат, як описано Бацопт та ін., ІптТесбоп і

Іттиййу, 56, 2292-2298 (1988), знаходиться в межах об'єму даного винаходу, є бажаним уникнути використання будь-якого лінкера, але замість цього поєднувати РРУБВ пептид згідно з даним винаходом безпосередньо з молекулою носія. Таке поєднання може бути отримано за допомогою відновного амінування, як описано І апа та ін., У. Іттипоіоду, 127, 1011-1019 (1981).

Розмір імуногенної композиції, як визначається середньою молекулярною вагою, є змінною

Зо величиною і залежить від вибраного(их) РРУБВ білка(ів) або пептиду(ів) і способу злиття РРУБ5В білка(ів) або пептиду(ів) з носієм. Таким чином, він може бути таким малим, як 1000 дальтон (103) або більшим, ніж 106 дальтон. При використанні способу злиття шляхом відновного амінування молекулярна маса РРУБВ білка(ів) або пептиду(ів), як правило, знаходиться в діапазоні від 5000 до 500000 дальтон або більше; наприклад, для капсидних білка послідовності

ЗЕО ІЮ МО: 4, молекулярна маса, як очікується, буде складати приблизно 101000 дальтон, що, як припускають, забезпечує утворення вірусоподібних частинок (МІ Р), що складаються з 60 мономерних білків.

Молекули носія, тобто пептиди, їх похідні та аналоги, а також пептидні міметики, які специфічно зв'язуються з білюом РРУБ5В або пептидом згідно з даним винаходом, можуть бути отримані різними способами, відомими в даній галузі техніки, у тому числі, але не обмежуючись такими, як твердофазний синтез або при використанні розчину (МакКапізпі та ін., 1993, Сепе 137: 51-56; Ме!тіїієЇд, 1963, 9. Ат. Спет. бос. 15: 2149-2154; Мецшгаїйй, Н. та ін., ред., Те Ргоївїнв, том

ІЇ, З-я ред., стор. 105-237, Асадетіс Ргез55, Мем ХогКк, МУ (1976), зазначені джерела є введеними в даний опис як посилання).

РРУБВ білки або пептиди згідно з даним винаходом або антитіла або їх зв'язувальні частини згідно з даним винаходом можуть бути введені при використанні здатних до ін'єкції дозованих форм у вигляді розчину або суспензії в розчиннику з фармацевтичним або ветеринарним носієм.

Безпека та ефективність таких молекул визначається за допомогою стандартних процедур на клітинних культурах або на експериментальних тваринах, як описано і регулюється Центром ветеринарної медицини (СМУВ). Токсичність та терапевтична ефективність таких молекул може бути визначена за допомогою стандартних фармацевтичних процедур на клітинних культурах або експериментальних тваринах, наприклад, для визначення Іі Ю5о (дози, яка є летальною для 50 95 популяції).

Вакцини згідно з даним винаходом можуть являти собою полівалентні або одновалентні.

Полівалентні вакцини отримують шляхом імунокон'югації множинних білків або пептидів РРУЗВ з молекулою носія.

В одному з аспектів білок або пептидні композиції РРУ5В містять ефективну для імунізації кількість імуногенного кон'югату, переважно в комбінації з імуностимулятором; та фізіологічно бо прийнятний носій. Як використовується в даному контексті, "імуностимулятор" охоплює будь-яку сполуку або композицію, яка має здатність посилювати активність імунної системи, включаючи специфічний ефект потенціювання в комбінації із специфічним антигеном, або просто незалежний вплив на активність одного або більше елементів імунної відповіді.

Імуностимуляторні сполуки включають, але не обмежуються такими, як мінеральні гелі, наприклад, гідроксид алюмінію; поверхнево-активні речовини, такі як лізолецитин, поліоли

Рішйгопіс; поліаніони; пептиди; масляні емульсії; галуни та МОР. Способи з використанням цих матеріалів є добре відомими в даній галузі техніки, і в межах компетенції фахівця в цій галузі є визначити оптимальну кількість стимулятора для даної вакцини. У даній композиції може використовуватися більше, ніж один імуностимулятор. Імуноген може також бути включений у ліпосоми або може бути кон'югованим з полісахаридами та/або іншими полімерами для використання в композиції вакцини.

Композиції, якщо це є бажаним, можуть бути представлені в упаковці або дозувальному пристрої який може містити одну або більше стандартних лікарських форм, що містять активний інгредієнт. Упаковка може, наприклад, містити металеву або пластикову упаковку, таку як блістерна упаковка. Упаковка або пристрій дозатора може супроводжуватися інструкціями щодо введення, переважно для введення ссавцю, зокрема, свині.

С. Ад'юванти

Для додаткового підвищення імуногенності імуногенні композиції, які забезпечуються в даній заявці та які містять один або більше РРУБВ білків або пептидів, можуть також містити один або більше ад'ювантів.

Ад'ювант може бути очищений за допомогою будь-якого із способів, описаних раніше або відомих у даній галузі технікял. Бажаним способом очищення є хроматографія на силікагелі, зокрема, "флеш" (швидкий) хроматографічний спосіб, як описано МУ. СіагкК та ін., у). Огдапіс

Спетівігу, 43, 2923-2925 (1978). Проте інші хроматографічні способи, у тому числі ВЕРХ, можуть бути використані для очищення ад'ювантів. Кристалізація також може використовуватися для очищення ад'ювантів. У деяких випадках ніякого очищення не потрібно, оскільки продукт з аналітичним ступенем чистоти отримують безпосередньо шляхом синтезу.

Вакцинні композиції згідно з даним винаходом отримують шляхом фізичного змішування ад'юванта з РРУБ5В білком(ами) або пептидом(ами) у відповідних стерильних умовах згідно з

Зо відомими способами для отримання композиції з ад'ювантом. Комплексоутворення РРУБВ білка(ів) або пептиду(ів) та ад'юванта полегшується наявністю сумарного негативного заряду на кон'югаті, який електростатично притягується до позитивного заряду, присутнього на алкільних сполуках ад'юванта з довгими ланцюгами. р. Фізіологічно прийнятні носії

Вакцинні композиції згідно з даним винаходом можуть бути одержані при використанні способів, аналогічних тим, які використовуються для інших фармацевтичних поліпептидних композицій. Таким чином, ад'ювант і РРМ5В білок(білки) або пептид(и), переважно кон'югований(ї) з молекулою носія та/або змішаний(ї) з ад'ювантом, може(уть) зберігатися в ліофілізованої формі та можуть піддаватися відновлюванню у фізіологічно прийнятному носії з утворенням суспензії перед введенням. Крім того, кон'югат та ад'ювант можуть зберігатися в носії. Переважні носії являють собою стерильні розчини, зокрема, стерильні буферні розчини такі, як фосфатно-сольовий буфер. Будь-який спосіб поєднання ад'юванта та кон'югату в носії, таким чином, що поліпшується імунологічна ефективність імуногенної композиції, є прийнятним.

Об'єм одиничної дози вакцини у відповідності з даними винаходом може варіювати, але буде в загальному випадку знаходитися в межах діапазонів, які звичайно використовуються в звичайних вакцинах. Об'єм одиничної дози переважно складає від приблизно 0,1 мл до приблизно З мл, переважно від приблизно 0,2 мл до 1,5 мл, більш переважно приблизно 1,0 мл при концентрації кон'югату та ад'юванту, як зазначено вище.

Вакцинні композиції згідно з даним винаходом можуть бути введені за допомогою будь-якого зручного засобу.

Е. Композиція

Імуногенні кон'югати, що включають РРМ5УВ білок(білки) або пептид(и), злитий(ї) з молекулою носія, можуть бути використані як вакцини для імунізації проти одного або більше серотипів РРУБЗВ. Вакцини, що містять імуногенний кон'югат у фізіологічно прийнятному носії, є придатними у способі імунізації тварин, переважно свиней, для лікування або профілактики інфекцій, викликаних РРУБВ.

Антитіла, отримані проти імуногенних кон'югатів згідно з даним винаходом шляхом імунізації при використанні імуногенного кон'югату, можуть бути використані в пасивній імунотерапії та для отримання антиідіотипічних антитіл для лікування або профілактики інфекції РРУБВ.

Суб'єкт, якому вводиться композиція, переважно являє собою тварину, у тому числі, але не обмежуючись такими, як корови, коні, вівці, свині, свійська птиця (наприклад, кури) кози, кішки, собаки, хом'яки, миші та щури; найбільш переважними є свині.

Композиції згідно з даним винаходом містять ефективну для імунізації кількість однієї або більше імуногенних композицій або антитіла до них та фізіологічно прийнятний носій. Вакцини містять ефективну для імунізації кількість однієї або більше імуногенних композицій та фізіологічно прийнятний носій. Композиція повинна бути прийнятною для способу введення.

Їмуногенна композиція, якщо це є бажаним, може також містити незначні кількості змочувальних або емульгувальних агентів або рн забуферювальних агентів. Імуногенна композиція може являти собою рідкий розчин, суспензію, емульсію, таблетки, пігулки, капсули, композицію уповільненого вивільнення або порошок. Пероральні препарати можуть включати стандартні носії такі, як маніт, лактоза, крохмаль, стеарат магнію, сахарин натрію, целюлоза, карбонат магнію, тощо.

Е. Ефективна доза

Сполуки, описані в даній заявці, можуть бути введені суб'єкту в терапевтично ефективних дозах для лікування асоційованих з РРУБ5В захворювань. Дозування залежатиме від хазяїна, який отримує вакцину, а також від таких факторів, як розмір, вага та вік хазяїна.

Точна кількість імуногенного кон'югату або антитіла згідно з даним винаходом, який використовується в композиції залежатиме від шляху введення та природи суб'єкта (наприклад, вид, вік, розмір, стадія/рівень розвитку захворювання), і це питання має бути вирішено згідно з висновком лікаря та обставинами для кожного суб'єкта у відповідності зі стандартними клінічними методиками. Ефективна кількість для імунізації являє собою кількість, достатню для лікування або профілактики РРМ5В інфекційного захворювання у суб'єкта.

Ефективні дози можуть також бути виведені з кривих залежності відповіді від дози, отриманих з тест-систем для тваринних моделей, та можуть змінюватися від 0,1 мг/кг до 20 мг/кг, переважно від 1 мг/кг до 10 мг/кг.

Імуногенність композиції може бути визначена за допомогою моніторингу імунної відповіді досліджуваних суб'єктів після імунізації при використанні композиції за допомогою будь-якого імуноаналізу, відомого в даній галузі техніки. Отримання гуморальної (антитілогенез) відповіді

Зо та/або опосередкованого клітинами імунітету може бути прийняте як показник імунної відповіді.

Досліджувані суб'єкти можуть включати тварин таких, як свині, миші, хом'яки, собаки, кішки, кролики, корови, коні, вівці та птиці (наприклад, кури, качки, гуси, індики).

Імунна відповідь досліджуваних суб'єктів може бути проаналізована за допомогою різних підходів, таких як: реактивність отриманої імунної сироватки по відношенню до імуногенного кон'югату, як оцінюється за допомогою відомих методів, наприклад, твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІ5ЗА), імуноблоттінгу, імунопреципітації тощо; або шляхом захисту імунізованих хазяїв від інфекції патогеном та/або ослаблення симптомів, викликаних інфекцією патогеном, в імунізованих хазяїв, як визначається відповідно до будь-якого зі способів, відомих в даній галузі техніки для кількісної оцінки рівнів агента інфекційного захворювання, наприклад, кількісної ПЛР, виділення вірусу або іншого способу, відомого в даній галузі техніки. Рівні агента інфекційного захворювання також можуть бути визначені шляхом вимірювання рівнів антигену, проти якого спрямований імуноглобулін. Зниження рівнів агента інфекційного захворювання або полегшення симптомів інфекційної хвороби показує, що композиція є ефективною.

Терапевтичні засоби згідно з даним винаходом можуть бути проаналізовані іп мійго на бажану терапевтичну або профілактичну активність перед використанням в умовах іп мімо у тварин. Наприклад, аналізи іп міїго, які можуть використовуватися для того, щоб визначити, чи є показаним введення конкретного терапевтичного агента, включають аналізи іп міго в культурі клітин, в яких відповідні клітини з клітинної лінії або культивовані клітини суб'єкта, що має конкретне захворювання або розлад, піддаються впливу або іншим чином вводяться терапевтично, і спостерігається вплив терапевтичного агента на клітини.

Альтернативно, терапевтичний агент може бути визначений шляхом контактування терапевтичного агента з клітинами (або з клітинами, що одержані від суб'єкта, або з клітинами культивованої лінії), які є чутливими до інфекції, викликаної агентом інфекційного захворювання, і подальшого визначення, чи є показник інфекції клітин, які контактували з терапевтичним агентом, нижчим, ніж показник інфекції для клітин, що не контактували з терапевтичним агентом. Зараження клітин агентом інфекційного захворювання може бути визначене за допомогою будь-якого способу, відомого в даній галузі техніки.

Крім того, терапевтичний агент може бути оцінений шляхом вимірювання рівня молекули, проти якої спрямовано антитіло, у суб'єкта в моделі тварини при прийнятних інтервалах часу до, бо під час або після лікування. Будь-яка зміна або відсутність змін в кількості молекули може бути ідентифікована та корелює з ефектом лікування суб'єкта. Рівень молекули може бути визначений будь-яким способом, відомим в даній галузі техніки.

Після вакцинації тварини проти РРМ5В при використанні способів та композицій згідно з даним винаходом для оцінки зв'язування отриманого антитіла і конкретної молекули може бути використаний будь-який аналіз зв'язування, відомий в даній галузі техніки. Такі аналізи можуть бути також проведені для відбору антитіл, які виявляють більш високу спорідненість або специфічність відносно конкретного антигену. б. Визначення та діагностичні способи

Антитіла або їх зв'язувальні частини, отримані в результаті застосування нативного РРМУБВ, атенуйованих вірусів, білків або пептидів згідно з даним винаходом, можуть використовуватися для виявлення у зразку присутності РРМ5В. Цей спосіб виявлення включає наступні етапи: забезпечення ізольованого антитіла або його зв'язувальних частин, що утворилися, проти нативного РРУБВ, атенуйованого вірусу, білка або пептиду згідно з даним винаходом, додання до ізольованого антитіла або його зв'язувальних частин зразка, що ймовірно містить деяку кількість вірусу РРУБВ, і виявлення присутності комплексу, який містить ізольоване антитіло або його зв'язувальні частини, зв'язаного з вірусом РРУБВ.

Антитіла або їх зв'язувальні частини згідно з даним винаходом також є корисними для виявлення у зразку наявності білка або пептиду РРУБВ. Цей спосіб виявлення включає наступні етапи: забезпечення ізольованого антитіла або його зв'язувальних частин, індукованих проти нативного РРУБВ, ослабленого вірусу, білка або пептиду, додання до ізольованого антитіла або його зв'язувальної частини зразка, що ймовірно містить деяку кількість білка або пептиду

РРУЗВБВ, і виявлення присутності комплексу, який містить виділене антитіло або його зв'язувальні частини, зв'язаного з білком або пептидом РРУБВ.

Імуноглобуліни, зокрема, антитіла, (і функціонально активні фрагменти), які зв'язуються зі специфічною молекулою, що є членом пари зв'язування, можуть бути використані як діагностичні та прогностичні агенти, як описано в даній заявці. У різних варіантах здійснення даний винахід забезпечує вимірювання члена пари зв'язування, і використання таких вимірювань в клінічній практиці. Імуноглобуліни згідно з даним винаходом можуть використовуватися, наприклад, при виявленні антигену в біологічному зразку, за допомогою

Зо чого суб'єкти можуть піддаватися аналізу на аберантні рівні молекули, з якою зв'язується імуноглобулін та/або на присутність аномальних форм таких молекул. Під терміном "аномальний рівень" мається на увазі рівень, який є збільшеним або зменшеним у порівнянні з наявним або стандартним рівнем, який присутній в аналогічному зразку суб'єкта або частини тіла суб'єкта, що не має цього захворювання. Антитіла згідно з даним винаходом можуть бути також включені як реагент у вигляді набору для застосування у діагностичній або прогностичній методиці.

В одному аспекті антитіло згідно з даним винаходом, яке імуноспецифічно зв'язується з

РРУБВ нативного або атенуйованого вірусу, білюом або пептидом, може використовуватися для діагностики, прогнозування або скринінгу на РРУБВ інфекцію.

В іншому аспекті даний винахід відноситься до способу діагностики або скринінгу на наявність РРМБ5В інфекції або імунітету до неї, що включає вимірювання у суб'єкта рівня імуноспецифічного зв'язування антитіла із зразком, отриманим від суб'єкта, в якому антитіло імуноспецифічно зв'язує білок або пептид РРМ5В, в якому збільшення рівня зв'язування зазначеного імуноспецифічного зв'язування по відношенню до рівня імуноспецифічногоо зв'язування в аналогічному зразку від суб'єкта, що не має агента інфекційного захворювання, вказує на наявність РРУБВ.

Приклади відповідних аналізів для виявлення присутності пептидів або антагоністів РРУЗВ включають, але не обмежуються такими, як ЕГІЗА, радіоіїмуноаналіз, аналіз на основі гель- дифузійної реакції преципітації, імунодифузія, аналіз аглютинації, реакція флуоресцентного імуноаналізу, імуноаналіз на основі білка А або імуноелектрофоретичний аналіз.

Імуноаналізи для конкретної молекули будуть типово включати інкубацію зразка, такого, як біологічна рідина, екстракт тканини, клітини або лізати культивованих клітин, у присутності антитіла з міткою і виявлення зв'язаного антитіла за допомогою будь-якого з ряду способів, добре відомих в даній галузі техніки.

Зв'язувальна активність даного антитіла може бути визначена згідно з добре відомими способами. Фахівці в даній області техніки зможуть визначити робочі та оптимальні умови аналізу для кожного визначення з використанням звичайного експериментування.

Додатковий аспект даного винаходу стосується діагностичних наборів для вимірювання та виявлення РРУБВ. Забезпечуються набори для діагностики, які містять в одному або більше бо контейнерах антитіла проти РРУБВ і, необов'язково, мічений партнер зв'язування для антитіла.

Крім того, антитіла проти РРМ5В можуть піддаватися міченню (зі здатним до виявлення маркером, наприклад, хемілюмінесцентним, ферментативним, флуоресцентним або радіоактивним фрагментом). У відповідності із цим, даний винахід забезпечує діагностичний набір, що включає, анти-РРУБВ антитіла і контрольний імуноглобулін. У конкретному варіанті здійснення одну із зазначених вище сполук контейнера можна помітити за допомогою здатної до виявлення мітки. Набір може додатково містити в контейнері попередньо визначену кількість вірусу, білка або пептиду РРМ5В, що розпізнається антитілом набору, для використання як стандарту або контролю.

Н. Введення суб'єкту

Способи введення включають, але не обмежуються такими, як інтраназальне, пероральне (наприклад, у питній воді), інтрадермальне та внутрішньом'язове введення. Внутрішньом'язове введення є особливо прийнятним. Фахівцеві у даній галузі буде зрозуміло, що композиції згідно з даним винаходом можуть також бути введені у вигляді однієї, двох або більше доз, а також при використанні інших шляхів введення. Наприклад, такі способи включають також підшкірне, інтрадермальне, внутрішньовенне, інтраваскулярне, внутрішньоартеріальне, інтраперитонеальне, інтратекальне, внутрішньотрахеальне, інтракардіальне, інтралобулярне, інтрамедулярне, внутрішньолегеневе та інтравагінальне введення. Залежно від бажаної тривалості та ефективності лікування композиції згідно з даним винаходом можуть бути введені один або кілька разів, а також періодично, наприклад, на щоденній основі протягом декількох днів, тижнів або місяців та в різних дозуваннях.

Приведені нижче приклади включені для демонстрації кращих варіантів здійснення винаходу. Фахівцям у даній галузі техніки повинно бути зрозумілим, що способи, розкриті в прикладах, являють собою методи, розкриті винахідниками для нормального здійснення даного винаходу, і, таким чином, можуть розглядатися як переважні способи його практичного застосування. Проте фахівцям у даній галузі техніки повинно бути очевидним у контексті даного опису, що багато зміни можуть бути зроблені в конкретних варіантах, які розкриті, і при цьому також вдається отримати схожий або аналогічний результат без відходу від суті та об'єму даного винаходу.

Дана заявка є пов'язаною із заявкою, поданою 17 грудня 2012 року під назвою "Парвовірус

Зо свиней 58, способи застосування та вакцини ", О5 реєстраційний номер 61/738,110, зміст якої є включеним в даний опис як посилання у всій своїй повноті.

ПРИКЛАДИ

Матеріали та методи

Джерело матеріалів: Гомогенати тканини від трьох свиней були отримані в результаті нестандартного спалаху захворювання. Клінічна історія на фермі представляла собою свиней вагою 200 фунтів з м'язовим тремором всього тіла, який був присутній у стані спокою, але посилювався під час руху. Після ретельного дослідження у ветеринарній діагностичній лабораторії, яка припустила наявність вірусного агента (на основі мікроскопічних пошкоджень), але приводила тільки до ідентифікації агента Х (некласична чума свиней, асоційована з пестивірусом), зразки були надані винахідникам, щоб допомогти визначити основну причину симптомів з боку ЦНС у цих тварин.

Аналіз ДНК та білка: Аналіз ДНК зразків, отриманих від хворих свиней, був проведений при використанні високоефективного секвенування від 454 |ШПйе Зсіепсе5 (Вгапіога СТ) (7454 технологія"), яке здійснювали при використанні Орегоп (Нипіємійе АГ). Зразки були збагачені вірусними послідовностями завдяки обробці нуклеазами захищених нуклеїнових кислот вірусної частинки з подальшою екстракцією, випадковою ампліфікацією та високоефективним секвенуванням; які здійснювали так, як описано у Ммісіогіа та ін. Рі о5 раїйподеп 2008 бер. 26; 4 (9): е1000163.

Отримані послідовності спочатку характеризували при використанні ВГАЗТХ аналізу як дивергентні члени родини Рагмомігідае. Послідовності збирали з використанням програмного забезпечення Зедиепспег, і результати цих аналізів ДНК поєднували з націленим секвенуванням, що забезпечувало отримання послідовності ДНК 5ЕБЕО ІЮ МО: 1, яка представляла собою путативну повну послідовність, що кодує вірусу, який позначається як

РРМ5В. Подальший аналіз послідовності ДНК при використанні програмного забезпечення зедцепспег приводив до ідентифікації трьох путативних кодуючих ділянок, що відповідних тим, які зустрічаються в інших видів парвовірусу, включаючи вірусну репліказу (ЗЕО ІЮО МО: 2), відкриту рамку зчитування "ОКЕЗ" (ЗЕО ІО МО: 3) та білок вірусного капсиду (ЗЕО ІЮ МО: 4).

ПРИКЛАД 1: Ідентифікація нового вірусу

Послідовності ДНК були визначені за допомогою 454 технології (вірусна метагеноміка) в бо зразках гомогенатів легень двох не зв'язаних між собою свиней з різних штатів. ВІ А5ТМ і

ВГАБТХ аналіз показав високу ідентичність з парвовірусом свиней 4, максимум 67 90 ідентичності нуклеотидів у консервативних ділянках гена реплікази (КЕР), у той час як кодуючі ділянки капсиду (САР) не виявляли помітного співпадання на рівні нуклеотидів. На рівні білка визначали, що білок путативної реплікази продемонстрував -- 60 95 ідентичності амінокислот, а капсидний білок показав -- 50 95 ідентичності. Вірус був визначений як новий вид, парвовірус свиней 5В (РРУМ5В). Специфічні праймери були розроблені на основі кодуючої послідовності капсиду та скринінгу гомогенатів на основі ПЛР, які були подібними щодо тканинних і патологічних/клінічних характеристик, що виявило присутність агента в - 16 95 зразків. На підставі проведених клінічних симптомів та вірусологічних даних, асоційованих з тканинами, які піддавали скринінгу, спостерігали статистично значущий зв'язок з деякими іншими вірусними агентами та клінічною патологією/гістопатологією.

ПРИКЛАД 2: Ідентифікація РРУБВ як нового парвовірусу та філогенетичний аналіз

Попарна ідентичність амінокислот як для путативної реплікази (КЕР), так і для білків капсиду (МР1/САР), для різних відомих видів вірусів є представленою на фіг. 5. Ідентичність послідовності РРУБ5В з такою РРМУ4, найближчим спорідненим організмом у відношенні як КЕР, такі САР (- 90 925 / 65 95, відповідно), підтримала визначення РРМУЗ5В як нового виду.

Філогенетичний аналіз (Фіг. 6) виявив, що вірус відноситься до нового виду парвовірусу в рамках родини Рагуомігідає на основі консервативної ділянки білка САР. Подібні результати одержували при використанні більш консервативної білкової послідовності КЕР (не показано).

ПРИКЛАД 3: Підтвердження РРУБВ як агента, що спричинює захворювання

Гомогенати мозку, одержані від інфікованих РРУ5В СОСО свиней використовували для інокуляції отриманих шляхом кесаревого розтину тварин, які не одержували молозива (СОСЮ), для ампліфікації вірусу і визначення, чи приводила сумісна інфекція новим парвовірусом і

РЕКЗМ до збільшення клінічних респіраторних симптомів. У цьому дослідженні несподівано отримували велику кількість випадків смертності (20-22 905) у групах, інокульованих при використанні гомогенату тканини, що містить нові парвовіруси, і високі титри РРМ5В були визначені в сироватці за допомогою специфічного для РРУЗ5В ПЛР націлювання на кодючу ділянку капсиду. Тканини з однієї тварини в цьому дослідженні потім використовували для індукції СОСО свиней для відтворення клінічних ознак. У цьому дослідженні були показані

Зо системні інфекції з високими титрами віремії у більшості заражених тварин. У групах, які отримували інокуляти, що містять РРУ5В, одержували високе значення смертності (20 Об), кульгавість, знижувався середньодобовий приріст, спостерігалася гіпертермія, а також макро- та мікроскопічні пошкодження.

ПРИКЛАД 4: Культивування, ізоляція та очищення РРУБЗВ

Невеликі ділянки ПЛР позитивних тканин (наприклад, селезінки, головного мозку, легенів, кишечника і т.д.) подрібнювали при використанні стерильної ступки та товкача. Подрібнену тканину ресуспендували в 5-10 мл модифікованого середовища ЕМЕМ, що містить НЕРЕ5 буфер та антибіотики, та освітлювали для усунення великих шматочків тканини. Супернатант збирали і послідовно пропускали через різні фільтри, щоб усунути більшість великих частинок, включаючи бактерії. Крім того, зразки суспензії фекалій та сироватку позитивних за ПЛР тварин також обробляли шляхом послідовної фільтрації для виділення вірусу.

Розведений фільтрат обробляли трипсином або залишали без обробкита адсорбували на стабільних первинних клітинних культурах (перерахованих нижче) у планшетах на 6 комірок за певних температур. Відсмоктували рідину з інокуляту та замінювали 2 мл свіжого середовища для підтримування. Потім планшети інкубували при 33-37 "С в атмосфері 595 СО: і щодня спостерігали за появою цитопатичного ефекту, такого як округлення клітин, злиття клітин, некротизація клітин, клітинна кластеризація і т.д., у порівнянні з контрольним звичайним середовищем (середовище без агента). Потенційні позитивні комірки піддавали скринінгу на ріст вірусу/ізоляцію при використанні ПЛР.

Стабільні клітинні лінії, що використовувалися для ізоляції вірусу, включали: 57 (свинячі яєчка), 5Кб6 (нирка свині), ВНК-21 (нирка хом'ячка), МІрО КІ (сітківка плода свині), РК-15 МАОС (нирка свині), РКЛИКІГ. (нирка свині), НКТ-180 (колоректальна аденокарцинома людини), Нер2 (людські епітеліальні клітини), Мего (нирка африканської зеленої мавпи) і КК-13 (нирка кролика) та інші.

Первинні культури клітин, що використовуються в способі, включали: культуру ембріональних тканин легені свині, нирки, сім'яників, трахеї та культуру кишечника, серед інших.

Оскільки вірус ізолювали, то його піддавали очищенню при використанні декількох циклів очищення бляшок або граничного розведення і розмножували у великих кількостях для отримання маткових культур для експериментів на тваринах. бо ПРИКЛАД 5: Отримання інактивованого вірусу та вакцини

Інактивацію здійснювали при температурах приблизно 35-39 "С і в присутності від 2 до 15

ММ ВЕЇ, ще більш переважно в присутності приблизно 10 мМ ВЕЇ. Інактивацію здійснювали протягом принаймні 24 годин, аж до 24-72 годин. Потім додавали еквівалентну кількість агента, який нейтралізує агент інактивації в розчині; наприклад, тіосульфату натрію. Інактивований препарат вірусу готували відповідно зі способами, відомими в даній галузі техніки, наприклад, як описано у Ргєизв5, Т., та ін., Сотрагізоп ої Тмо рРіпйегепі Меїнод3з ог Іпасіїмайноп ої Мігизев іп

Зегпит, СІІМІСАЇ апа ОІАСМОБЗТІС ГАВОВАТОНУ ІММИОМОГ ОС, (1997), 504-508 або

Ванпетапп, На, Іпасіїмайіоп ої міка! апіїдеп5 ог массіпе ргерагайоп м/п рапісціаг гететепсе Юю Ше арріїсайоп ої Біпагу єїпуіепітіпе, МАССІМЕ, (1990), 299-303. Після отримання інактивованого вірусу матеріал поєднували з препаратом носія для рецептування заключної вакцини.

ПРИКЛАД 6: Отримання атенуйованого вірусу та вакцини

Препарат атенуйованого вірусу отримували відповідно до методів, відомих в даній галузі техніки, наприклад, як розкрито в Массіпе Ргоїосої5, друге вид.; Кобіпзоп, Низадоп, Стападе, ред.,

Нитапа Рге55 2003. Наприклад, "... віруси дикого типу піддають екстенсивно пасируванню в тканинній культурі/тваринах-господарях, до тих пір, поки не буде досягнутий прийнятний баланс між втратою вірулентності та збереженням імуногенності .... ".

Атенуйований вірус очищали при використанні безлічі циклів очищення бляшок або шляхом граничних розведень. ПЛР аналізи, глибоке секвенування або імунофлуоресцентні аналізи використовували для визначення специфічності культурального матеріалу.

Атенуйовану вірусну вакцину отримували шляхом поєднання препарату очищеного атенуйованого вірусу з препаратом носія.

ПРИКЛАД 7: Отримання субодиничної вакцини, що включає капсидний білок

Капсидний білок послідовності 5ЕО ІЮ МО: 4 отримували шляхом експресії клонованої послідовності ЗЕО ІЮ МО: 4 або її фрагментів в різних системах експресії білка.

Бакуловірусна експресія: Капсидний білок РРУБВ послідовності 5ЕО ІЮ МО: 4 експресували в бакуловірусній системі експресії, як правило, у відповідності зі способами, описаними у Кові та ін. (6), 2012: Цей білок був виявлений в незначній кількості в нерозчинній фракції після початкової очистки. Способи для підвищення виходу і розчинності включали, але не обмежувались такими, як використання альтернативних буферних умов (наприклад,

Зо гідрохлориду гуанідину або сечовини), альтернативне зв'язування та умови очищення (наприклад, кобальтові або нікелеві афінні колонки, аніоно- або катіонообмінні колонки) або альтернативні умови експресії (наприклад, температура, час, альтернативні лінії клітин).

Бактеріальна експресія: Капсидний білок РРУБВ послідовності 5ЕО ІЮО МО: 4 експресували в бактеріальній системі експресії, як правило, у відповідності зі способами, описаними в ЕМО

Спетісаї!5 Іпс. Момадеп Озег Ргоїосої ТВ184. Цей спосіб включав додання притаманної Нів-мітки, що міститься в бактеріальному векторі (ЕМО СПептісаї5 Іпс., 2011 (7)), для того щоб сприяти очищенню отриманого білка. Експресований у бактеріях мічений капсидний білок очищали, як правило, у відповідності зі способами, описаними у СЕ Неайсаге, 2012 (8), і отримані продукти використовували для отримання специфічних антитіл до РРУБВ, як описано у Прикладі 8.

Атенуйовану субодиничну вакцину отримували шляхом поєднання препарату очищеного капсидного білка з препаратом носія.

ПРИКЛАД 8: Отримання антитіл, які специфічно зв'язуються з РРУ5В

Антитіла, які специфічно зв'язуються з РРУБ5В, отримували шляхом імунізації кроликів за допомогою антигенних препаратів вірусу РРУ5В або субодиничних препаратів білків капсиду (ЗЕО ІО МО: 4) або їх фрагментів. Зразки сироватки, отримані від інокульованих кроликів, піддавали скринінгу на поліклональні антитіла, які зв'язуються з антигенами РРМУБВ. Селезінки, отримані з інокульованих мишей, які були визначені для отримання антитіл до антигену, зливали з клітинами мієломи для отриманням гібридом. Гібридоми потім піддавали скринінгу на зв'язування з антигеном РРМУБВ.

Поліклональні антитіла: Експресований у бактеріях капсидний білок, мічений за допомогою

НІ5, отриманий згідно з Прикладом 7, використовували при імунізації двох новозеландських білих кроликів у службі виробництва антитіл на замовлення (КосКіІапа Апіїродіе5 апа Авзауз; сіїрегіхміПе, РА). Кроликів імунізували при використанні приблизно 100 мкг антигену/кролик у о, 07, р14 ї 028. Для інокуляції у СО ї 07 тварин інокулювали інтрадермально; інокуляції, які проводили в 014 і 028, здійснювали підшкірно. Повний ад'ювант Фрейнда використовували в першій інокуляції неповний ад'ювант Фрейнда використовували для подальших щеплень.

Зразки сироватки від обох кроликів збирали до імунізації та через 38 і 45 днів після імунізації.

Препарати поліклональних антитіл піддавали скринінгу на анти-РРМ5В специфічність відповідно до КосКіапа Апіїродіеє5 апа Авзауз. Були отримані антитіла, що мають специфічність бо зв'язування з очищеним або частково очищеним білюм РРМ5В, за допомогою імунофлуоресцентного аналізу (ІФА), вестерн-блоттінгу та твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІ5А). Параметри для специфічності кожного аналізу були наступними: специфічність в вестерн-блоттінгу вимірювали за допомогою виявлення прогнозованого білка вагою 79,0 кДа,

ІРА специфічність вимірювали в порівнянні з неінфікованими клітинами, а ЕГІЗА специфічність визначали шляхом покриття планшетів при використанні нерелевантного білка.

Моноклональні антитіла: Мічений за допомогою НІЗ експресуваний в бакуловірусах капсидний білок, отриманий згідно з Прикладом 7, використовували для створення моноклональних антитіл у ВаІр/с мишей у службі виробництва антитіл на замовлення (КосКіапа

Апііродіє5х апа Авзауз; СірегізміІе, РА). Мишей імунізували при використанні різних антигенних препаратів РРМ5В у відповідності зі стандартними прописами, розробленими на службі виробництва антитіл на замовлення. Імунну відповідь після інокуляції піддавали моніторингу в службі по виробництву антитіл. Стандартні прописи для отримання моноклональних антитіл є добре відомими фахівцям у даній галузі техніки, наприклад, як розкривається у СаБбгівйе та ін. (9), стор. 117-135.

Гібридоми отримували шляхом злиття пухлинних В-клітин, культивованих в середовищі для вирощування гібридоми до фази проліферації, з клітинами селезінки, отриманими від інокульованих мишей, яких визначали як таких, які виробляють антитіла до антигенів РРУБЗВ у відповідності зі стандартними прописами, як описано у СаБбгієїе та ін. (9), стор. 117-135. Після злиття і культивування гібридоми піддавали скринінгу на зв'язування з РРУБ5В антигенами, і відбирали анти-РРУ5В антитіла, які виробляються гібридомами. Моноклональні антитіла, які виробляються гібридомами, очищали при використанні афінної хроматографії у відповідності зі стандартними прописами, як описано у Сабгівїе та ін. (9), стор. 209-232.

Антитіла з високою афінністю, специфічні для РРМ5В, ідентифікували і додатково характеризували, включаючи визначення епітопів, з якими вони зв'язуються, специфічності антитіла відносно споріднених видів вірусів, і відбирали прийнятні високоафінні антитіла з високою специфічністю для РРМУБВ вірусного(их) антигену(ів) при використанні імунологічних методик, добре відомих в даній галузі техніки, наприклад, ЕГІЗА, вестерн-блоттінг аналіз і картування епітопів (Ерйоре Марріпод Ргогосої5 іп Меїпоа5 іп МоїІесшціаг ВіоІоду, тому 66 (СіІепп Е.

Могті5, ред., 1996) Нитапа Ргез5, Тоїома, Мем Уегзеу).

Зо ПРИКЛАД 9: Діагностичні аналізи для РРУЗВ

Аналіз ЕГІ5А: Антитіла, отримані згідно з Прикладом 8, використовували для вимірювання

РРМ5БВ в біологічному зразку із застосуванням ЕГІБА процедур. Аналіз здійснювали так, як описано нижче:

Антиген для покриття, вибраний з капсидного білка послідовності ЗЕО ІЮ МО: 4, розводили в буфері для покриття (0,05 М карбонат-бікарбонатний буфер; рН 9,6) для отримання заключної концентрації 0,25 нг/мкл. Планшети (планшети для високоефективного зв'язування ЕГІЗА на 96 комірок Рпепіх, каталожний номер МРО-655061) покривали при використанні 50 мкг/комірка антигену для покриття. Планшети закривали та інкубували протягом 1 години при 37 "С або протягом ночі при 4 "С. Видаляли розчин для покриття та планшети промивали три рази за допомогою 200 мкл/комірка РВЗТ (1Х РВБ5шО,0595 Твін-20). Планшет покривали при використанні 300 мкл/комірка розчину для блокування (0,595 ваг./об. знежиреного сухого молока в РВ5), закривали та інкубували протягом 1 години при 37 "С. Розчин для блокування видаляли, і планшет три рази промивали за допомогою 200 мкл/комірка РВ5Т. Зразки розводили 1: 100 у розчині для блокування; додавали до планшета 100 мл/комірка зразків крові.

Планшети закривали та інкубували протягом 1 години при 37 "С. Видаляли зразки сироватки та планшети тричі промивали за допомогою 200 мл/кюомірка РВ5БТ. Вторинне антитіло (кон'югований з пероксидазою хрону козячий анти-свинячий ІдсС (Неї); даскбзоп Іттипо-

Везеагсп 114-035-003) розводили до 1:10000 у розчині для блокування і використовували для покриття планшета з розрахунку 100 мкл/комірка. Планшети закривали та інкубували протягом 1 години при 37 "С. Вторинне антитіло видаляли і планшет тричі промивали за допомогою 200 мл/комірка РВЗТ. Планшети покривали при використанні 50 мл/комірка ТМВ (3,5,3,5'- тетраметилбензидин; КРІ каталожний номер 53-00-01). Планшети інкубували при кімнатній температурі в темряві приблизно протягом 10 хвилин. Планшети покривали при використанні стоп-розчину з розрахунку 50 мкл/комірка (2 М Не50О4; КРІ каталожний номер 50-85-04).

Зчитували оптичну щільність при 450 нм.

ПЛР аналізи: Оптимізували аналізи ПЛР в гелі та кількісну ПЛР для РРУБВ. Ці аналізи здійснювали так, як описано нижче: Для кількісного аналізу ПЛР кожну реакцію здійснювали при доданні наступних реагентів: 10 мкл/реакція 2Х 55оРавзі Ргобе Зирегтіх (ВіоКай, каталожний номер 172-5233), 5 мкл/реакція обробленої ОЕРС води, 1 мкл/реакція прямого праймера при 60 концентрації б мкМ (АСС САС САА САС Со АСА Т: 5ЕО ІО МО: 6), 1 мкл/реакція зворотного праймера при концентрації 6 мкМ (ТААА САС Ста АТО аоаА ССА ТАА Т: 5ЕО ІЮО МО: 7), 1 мкл/реакція зонда при концентрації 4 мкм (6-РАМ / АСТ САА САС ССА йОсА ба АПА АСА

САС; САА / ВНО 1: 5ЕО ІО МО: 8) та 2 мкл/реакція екстрагованої ДНК. Реакцію здійснювали на

Т100 термоблоці для проведення реакцій (Віо-Кай) протягом одного циклу при 95 "С протягом 2 хвилин, після чого здійснювали сорок циклів при наступних температурах: 95 "С протягом 5 секунд, а потім 60 "С протягом 5 секунд. Дані зчитували при використанні системи для формування зображень (Віо-Кай). Для гелевого аналізу кожну реакцію здійснювали шляхом додавання наступних реагентів: 12,5 мкл/реакція 2Х АтріїТад соЇй Мабхіептіх (Арріїей

Віозубзієт5, каталожний номер 4302758), 8,0 мкл/реакція обробленої ЮЕРС води, 1,25 мкл/реакція прямого праймера (ССА САТ ТТА САТ ТТ сАСсі САС СТА АСА САС ТАС: 5ЕО Ір

МО: 9) при концентрації 10 мкМ, 1,25 мкл/реакція зворотного праймера (йСА ТАТ Да СОС

ААА ТСТ спАСшС АСТ СТА сб: ЗЕБЕО ІЮО МО: 10) при концентрації 10 мкМ ї 2 мкл/реакція екстрагованої ДНК. Реакцію здійснювали на Т100 термоблоці для проведення реакцій (Віо-Над) протягом одного циклу при 95 "С протягом 5 хвилин, після чого здійснювали сорок циклів при наступних температурах: 95 "С протягом 30 секунд, 60 "С протягом 30 секунд і 72 "С протягом 45 секунд, і далі проводили заключне подовження при температурі 72 "С протягом 10 хвилин.

ПРИКЛАД 10: Оцінка ефективності РРУБВ вакцини у свиней

Для оцінки ефективності композиції речовини, яка містить принаймні один білок або поліпептид РРМ5В (прототипна вакцина РРМ5В), у свиней здійснювали рандомізоване дослідження при використанні отриманих шляхом кесаревого розтину тварин у віці п'яти тижнів, які не отримували молозива (СОСО), рандомізованих у три групи (див Таблицю 2). Тварини були вакциновані за допомогою композиції або плацебо (фізіологічний розчин з фосфатним буфером; РВ5) у день дослідження 0 (00) і 014. Тваринам у 028 вводили матеріал, який містив

РРМУБВ. Здійснювали клінічні спостереження, вимірювали ректальні температури, вагу і брали аналізи крові У 056 тварин забивали та здійснювали розтин для оцінки макроскопічних пошкоджень. Ефективність вакцини РРМ5В визначалася статистично шляхом порівняння відсотка смертності, віремії (титри і тривалість), сероконверсії (титри та тривалість) та клінічних ознак вакцинованих та невакцинованих тварин.

Коо)

Таблиця 2

Вакцинація антигеном пил СС ЗНИК Е.О НИ УНН прототип 772 |РВ5Мх | ло | ли2 |РВ5 | - да

З Жорсткий . . 7 ело | 5 | 8 ван

Всі композиції та способи, розкриті та заявлені вданій заявці, можуть бути отримані і здійснені без зайвих експериментів з урахування даного опису. Хоча композиції і способи згідно з даним винаходом були описані в контексті кращих варіантів здійснення, фахівцям у даній галузі техніки буде очевидним, що у композиції і способи можуть бути внесені зміни, а також в етапи або в послідовності етапів описаного в даній заявці способу без відходу від концепції та об'єму даного винаходу. Більш конкретно, буде очевидним, що певні агенти, які є як хімічно, так і фізіологічно, спорідненими, можуть бути замінені на агенти, описані в даній заявці, в той час як при цьому будуть досягнуті ті ж або аналогічні результати. Усі такі подібні заміни і модифікації, очевидні для фахівців в даній галузі техніки, маються на увазі як такі, що відповідають об'єму та концепції винаходу, як визначено у представленій формулі винаходу.

ПОСИЛАННЯ

Наступні посилання в тій мірі, в якій вони забезпечують ілюстративні або інші деталі, додаткові до тих, які викладені в даному описі, спеціально включені в дану заявку як посилання. (1) Сзадоїа А, и др., Оєїесійп, ргемаІепсе апа апаїувзів ої етегдіпу рагуомігив 5м/іпе іптесійопв.

Агеп Мігої. дип; 157(6):1003-10 (2012). (2) НійКаїа М, и др., Ідепійісайоп ої пе рагуоміги5 ОМА 5едиепсе іп зм/іпе 5ега їот Муаптахг.

Урп У Ійтесі бів 54:244-245 (2001). (3) УМапо Р, и др., Момеї! рагуоміги5 з!ибіїпеаде іп пе Татіїу ої Рагуомігідає. Мігив Сепез 41:305- 308 (2010).

(4) ай 5К, и др., Ідепійісайоп ої помеї рогсіпе апа роміпе рагуомігизев сіозеїу геїагед ю питап рагуомігив 4. У еп Міго! 89:1840-1848 (2008). (5) Спешйпа АК, и др., Ідепійісайоп апа тоїіесціаг сіопіпуд ої а помеї! рогсіпе рагуоміги5. Агсп

Міго! 155(5):801-806 (2010). (6) Кові и др., Несотбіпапі Басицомігизе5 аз таттаїап сеї! депе-деїїмегу месіог5, Тгтепав іп

Віотесппо!оду, 20, 173-180, Арг. 2002. цитируются другими. (7) ЕМО СПетісаї!5 Іпс. 2011. Ха/Л/ ІС Кіїв, Овег Ргоїосої ТВ184. (8) СЕ Неайсаге. Весотрбіпапі Ргоївїп Ригітїісайоп Напароок. 18-1142-75. (9) Сабіієїє и др. (єдз.), Апіїбоду Меїнодз апа Ргоїюосої5, Меїйодз іп Моїесшіаг Віоіоду, 2012, том 901, глава 7.

СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 ВОЕНВІМСЕВ ІМС! НЕІМ МЕТМЕПІСА, ІМС. «120» ПАРВОВІРУС СВИНЕЙ 58, СПОСОБИ ЗАСТОСУВАННЯ ТА ВАКЦИНА -1305 10-0153-РСТ -140» «1415 -1505 13/800,413 -1515 2013-03-13 -1505 61/765,204 -1515 2013-02-15 «1605» 11 «170» Раїепіп версія 3.5 «2105 1 «2115 5302 «212» ДНК «213» Парвовірус свиней 5В «4005» 1 дснсаацдіє їіанаащшу саїаашаї дсааададда адіаассю аподісаді (610)

Зо пшо9дсо9а даадсааш данддасодо даасісааді ссізашос айдасдіча 120 ассааїсада андадіаса їіапазагаа ддаддссдаа ааададдаад Шдісаші 180 дсоаішода дассаїсдсу адсадаасіс сдісдїніс ддосідіай даадаюда 240 7 аассіасідд асадаїай дсадасійн Іссюаїдії Нааааайассіддюша зо00 щдааддасодс їатаншо ааднссіді Ясіассада дзасшаїда ааїддссіда 360 їаїашсаа ааїдаааааа агаадаааа сідідадісї ддсдсддсус сідсдудсудсс 0420 дсодсдадаа андасацдіа аїсіадіаас додсіднада сааддодадо сісташад 480 ададснсаа ааадаасна дааааїссід їадайаодда діадаїссід дсанисаї 540 7 дсаанодаа ададіїдасі саааадоїдд снасаша сайдащіо дісідідіє /6о00 содсіддіасс ссдсдадацд ІШаасіаї айсаааааї асадаааааааадшсанй 660 азанаснш ддщіщдадао даснадсії шшдідсса сасаааааіааасасодадс 720 аддаааадс асададаад ддашаша їіаацашо сіааааааасіассасідаа 780 адааціси їаїдсадда сіасаандд аддіасаата ддідаадссі дШааатас 840 7 адаааааада ааадаасіаї іадаїааіад асаадаїсса дсаднацо аадаацаїс 900

Ідсісссаїд їасааацід ссасіддада ааааайдсіа дасандіас адіддноаді 960 бо адасааїааї ашойнсід ааїссадаїдд ддаадоадаааа ааїдсісіаа дснагасіс 1020 айсцадсс асасаадсід даддаїазаї ддсаааасаа іосіїдадаа ісдсісадса 1080 аааанасіа ааадаааааї сасіаддадйї аасснаац даїшаааа асаюддаєс 1140 і Шаададсі посаасааа дідасадда дідсісанс даїсаїааса дааїасаца 1200 саншоса дсіаасаасі аїдаїссіаа аацосідса оМаїааці Нсасіддад 1260 садааасаа асдддааааа дааасідіді адаіщшас доіссідсіа саасаддааа 1320 аасааатай дсасаддсаа ісідссаїад сісадсіааї іаїдосаац Паасіддаа 1380 сааїссаааї Шессішс аадагацної аддадсісад діаддоаюді ддааадаадд 1440 й даааащдаса доаадасаїдао їадаадсідс ааааасшао сіддддддаа сідсшосЯ 1500 саїсдассдс ааашіацс ааїсідіїда адісаасаді ссассуша Найаасаїс 1560 даадіддас ащдассдща йсаадаадо аадішдіа адсшдаас ассаасадсс 1620 однададдас аддаїдаїаа аацйнсаї! Іаассідаса сіассіддааасшодісї 1680 данасаасі даадаадіда ааїсннії ссодадчаі дсаааасш саднааасс 1740 7 Заааїсаїд аайдссааа Шсааааяд аддассідсс адсаїссдсс ассіадйсс 1800

Існддаадаа айссіссас саааддадаї дсаїаааааа сдасадссасісташдад 1860

Зо адсдаасса даїдаадаас аадааасасс адасдісно даїсайдої ндаадаасс 1920 аадісааааа адааадаада садаадассс Ідсааасасяо асассіссід сддсНаюда 1980 даашадаї дасаасщу9 аассіднсс аддіаадаа! Шосашаіїсашша 2040 7 ашдіссааа асааіададс ааасіддіда їагдідсаїа айсцасад аїадссааді 2100 даассідаїа Шдасаї99 іІстїіасдаада дасассадад діддасдаадіддаддааса 2160 ащадсщша діддоїанс їаааааїсіс сссссддаїй їададдаадіїасайсоса 2220

Ішодааона ашшасі (дссадаата дасщдаїша НПаацйодід одагацаї 2280 ааїацаааї діссадаадс адааааддіа Шадіано дасааїсіас асаддаіша 2340 7 снааацдс сдддідсаса дадаааадаа аассдадна адаасшас сдаадсідся 2400 шесаїайа дааацдіасс ідадасса дасаасано аадданаа ааїссадад 2460 адсіасаїа ацаідаїад асаааїааса ссдсадасаа сдадаацда Шасндса 2520 дсіаїсасід сідасіїсда Іісадададад аїсаїссаїс садісассдуд сдадаааюд 2580 дішсодага адаааасада адсішаосі асідашод аадаадссді ддаюдаадаа 2640 7 даїссідайа сададааааа асаассіасі даїаааасас ааадіааіаа саадаааддд 2700 дааацйодою аааадааада адааддідаї асссцасоді саааюдадда асаїсассаа 2760 60 Іїсаадаааас їіапйадааса сдасісаадс даадаасаас садаадаадс іддісассда 2820 даасадааад аасіадаада сааіайдаа дасаїсааас аїддадс9д99 адаадассаа 2880 ассддаассод діаїсаасід дссаддасаї сдсіасасад діссіддааа іссасісссії 2940 і сасддасдсіс сісдсааїда ааноаїсіс ісідсідсда аасащдагаїсаддіасааа 3000 сааїзайсіс даїашддіса сіддссаїас ашдадсос саїазайдааааааааюд 3060 саадаадаїа Надададаї адіааааааа ддашШаддаї їадааддіаа асішадаї 3120 аассНаїаї садсшаїд дсаадсаааа іасадацад дадссссдаї аїадааай 3180

Нааааасаа ІШассссс даааадіа ссіасіааад ааісіціадааааасаша 3240 й ссаааассії дсссайода іссіссасад асаїсснас саддідсаїс іссіссісда 3300 асіссщасі І(дддідасода дасіддааід ааїдаададс сіссадсааа аадаадаадюд 3360 асадаадаса даїдідасад сассасаадд дсдааасаї (ддасасаса аїададдаї 3420

Істааааідо сдддача999 юдоададода доадааїсаас сіааааднс Модандоад 3480 ддчаснцісі Насіюдаїас дасоаднасі аснадіа стадаадаю іоснадс 3540 7 іспшНссдс агаасіасід сассасадад адсддддаїс аїагассіад сспдунаїс 3600 щіасіссаї ддтасіана ідаїснаас айсіаїсад сісашсіс ісссісідсі 3660

Зо дасааасдс Шадаада діаюа!йцсі Шааассії Іаааайдда аднпаааай 3720 ааададаїад понааада шюцнааїааї аїдасаддда аасаацсід дасасади 3780

Істдасааід ссаїддсдс аддсідідї шШдаддаїа сасацасда осідссайа: 3840 7 даішаддад даддасадсі аасадіоссі ддісаїсіс саддасааас Падааси 3900 ссааааїйасі дсіаїадаас Ідідддаааа ссосаїадсо адащдідадіс ассідіадаї 3960 40 дунссаааа дадсссасії адасадссі Шоунсадс саасасадаа сасідадіє 4020

Шшаїшад адаасадаса сісіассаїс сісасасад дсааїдаай спісааасс 4080 таїдасціс садашаса Шідадсад сіаасасаді асаїдіддда сдасдаддада 4140 7 спдасааїс сааїдааадяа ісааадааа садднащюа аааасааассіасадаааас 4200 ааадаїсааа шШодіаї сададсісо аднассісду Носсіддаї іїдісаасісї 4260 50 сіааасадас сідсіадії Шасаадда ддааданаа аадасдддда Чайссай 4320 дндадссід ддассадада асаддсдаса їассасіасі Чаадаїйас ассідісаїд 4380 дидааадад аїашасаа ашасаасі адіаюсна ааададааасісаасадсса 4440 7 ддассдадаа сасаддааас аасддіаааа асассіда!д ддассаїааї агаасаасі 4500 аасадшад саїа(ддаса дддссідаа аасанодаїйа асаїассдад даїсасааа 4560 бо дссдсешс9 додойасадао аїасаддсиї дсідісосід аасадададо діаїйдсаса 4620 ссіддаайдс сіїсісаїа! аадддадаїа Найдасаа ааасассдаа асіайадаа 4680 ааадаїсадс аадаааїсас ашссааас Шодаадодвді сіцісадсда ааааасйсс 4740 дсіааїсіад адісісадаї НКддодснаї аїсссіааса сідаїаасаа асаіаасідс 4800 ддаасдсссс сШаїсіаї адддддаац дааааїссіс сассіаддаі шщшоадо 4860

Насісссіс аасюддасс сссідааааа іссадсіції сіддаадсаа ассісіааа 4920 ааднснода аїсадіасід ссаанша сіддааїаа сідіаасатд досіойноїд 4980 аддсдааада аасаїасісс даддіддаас ссіаїдссду дадісасаайіссааснаї 5040 аасаасдаїйс сідшщіасаї ссндассаа ааддацйії аїааацйдсс адааасідн 5100

Іддасадсаа адсаасціаї їіададсдсда адаїааїааа аааааашоу адаааааааа 5160 аоцаснсс ІСІ їдаашодаа аадсдссада ссісісдссоу дісдссссід 5220 асдісасаїс сдсісс9ддо Ісааадддсу дддісааадо ісааадчадісі ісаїасдіса 5280

Таїссдсне сддаїсаїщда сс 5302 -21052 «-2115 601 «212» Білок

Зо «213» Парвовірус свиней 5В «40052

Меї Спи ТАигк Тук Ттр ТАг сту Пе Суз Агу І еи РНе Рго Авр Маї І єи 1 5 10 15

Гуз Пе Рго СіІу Ма! Туг Спи Спу Аг Туг Пе РНе Сім Маї Рго Маї 20 25 зо зЗег ТНг Агу Авр РНе Меї Гуз Тр Рго Авр Іе РНе Сп Авп Сім Гув 35 40 45

Авп Авп Сім Авп Суз Сіи Зег СПу Аа Аа Рго Аїйа Аа Рго Ага А5р бо

Сім Пе Азвр 5ег Азп І єи Маї ТНг Аа Маї! Ага Сіп Спу Спи Ада їЇ єи 50 65 70 75 80

Ре Аг Си І єи Сіп І ув Сі І єи Агу Гуз бег Суз Ага І єи Сіу Маї 85 90 95 55

Азр Рго Сіу Пе Рпе Меї Сп І єи Спи Агу Маї Авр 5ег Гуз СЧу Спу 100 105 110 (516)

Ї еи Ніз Геи Ні Тгтр Суз Маї бег Ма! Зег Аіа Спіу Тнг Рго Ага Авр 115 120 125 ма! Геи Тит Пе Рне Гуз Азп Тнг Си І уз Гуз Ма! Зег І єи Тут Туг 130 135 140

Рпе Стпу Ма! Спи Сну Гей 5ег Рпе Ре Маї Рго Ні Гуз Авп Гуз Нів 145 150 155 160

Су Аїа Тр Гуз 5ег Тиг Авр Спи Спу РНе Пе Туг Авп Туг І єи Гей 165 170 175

Гуз Гуз Геи Рго І еи Гуз Спи Суз І єи Туг Аа Ттр Тит Те Пе Спу 180 185 190 сСіу Ти Пе Спу Спи Аа Суз І єи Авп ТАг Сім Гуз Агу Гуз Сім Гей 195 200 205

І еи Азр Азп Аго ап Авр Рго Аа Ма! Пе Спи Спи І еи 5ег Аа Рго 210 215 220

Меї Туг Гуз Суз Аа Тиг Спу Спи Гуз Меї І єи Азр ЇІе Маї Сип Ттр

Ко) 225 230 235 240

Ї еи Ма! Азр Азп Азп Пе Суз бег Сіи бег Ага Тгтр Спи Спу Гуз Авп 245 250 255

Аа І еи Зег І еи Туг Зег РНе І єи Аа Тиг Сп Аа Сіу Спіу Тук Меї 260 265 270

Аа Гуз Сп Суз ГІ еи Аго Пе Аа Сітп Сіп Гуз Геи Гей Гуз Спи Гув 275 280 285 зегі ви Спу Геи ТНг І еи Меї Авр Ре Гуз Азп Меї Азр Аа ГГ еи Ага 290 295 00

Аа РНе Сп Сіп 5ег Азр Меї Сіи Сув5 бег Рпє Авр Ні Авп Ага Пе 305 310 315 з20

Ні5 Тут Пе Рне Аїйа Аа Авп Азп Туг Азр Рго Гуз Іе Аїа Аїа Маї 325 330 335

Пе Меї Рне Ні Ттр бег Меї Гуз Сіп ТНг Спу Гуз Агу Авп Суз Маї 340 345 350 (516)

Тер Ре Туг Су Рго Аа Тнг Тиг Спу Гув ТАг Авп Пе Аа Сіп Аа 355 360 365

Пе Суз Ні бег Зег Аа Азп Туг Спіу Азп Маї Авп Тгр Авп Авп Рго 370 375 380

Азп РНе Рго РНеє Сп Азр Іе Маї Сіу Аїа Сіп Маї Спіу Тгр Тгтр Спи 385 390 395 400

Сім Сіу Гуз Меї Тнг Спу Азр Меї Маї Сім Аїа Аїйа Гуз Аа ГІ еи І еи 405 до 415 сСіу Спу Тк Аа І еи Ага Пе Ар Аго Гуз Сув Меї Сіп Зег Ма! Спи 420 425 430 маї Авп 5ег Рго Рго РНе Пе Пе Тнг Зег Азп Маї Авр Меї Тнг Маї 435 440 445 маї Сіп См СпПу 5ег Ре Маї Зег РНе Сім Нів Сіп Сіп Рго Г еи Си 450 455 460

Азр Агу Ме! Пе Гуз Рне 5ег РНе Авп Г єи ТНг Геи Рго Сіу Авзп Рпе 465 470 475 480

СІУ Геи Пе ТАиг ТАиг Спи Спи Ма! Гу5 Зег Рне РНе Агу Меї Сіу Аа 485 490 495

З5

Гуз Геи Зег Ма! Гу Рго Сім Пе Меї Азп Суз Сіп Пе Ре Гуз Аг9 500 505 510

Сіу Рго Аїа 5ег Іе Ага Ніз І єи Маї Рго Гей Спу Сім Пе Рго Рго 515 520 525

Рго Гуз Сіи Меї Нів Гуз Гуз Ага Сіп Рго Геи Туг І еи Ага Аа Спи 530 535 540

Рго Авр Си Спи Сп Сім ТНг Рго Авр Маї І еи Авр Ніз Тгтр Рпе Си 545 550 555 560

Сім Рго 5ег Сп Гуз Ага Гуз Гу5 Тнг См Авр Рго Аа Авзп ТНг ТНг 565 570 575

Рго Рго Аа Аа Туг Сім Авп Гей Авр Авр Авп РНе Си Рго Маї Рго 580 585 590 60

Сіу Гуз Авп Ріє Аа РНе Іе Пе Рпе 595 600 «2105 3 «2115 233 «212» Білок «213» Парвовірус свиней 5В «4005» З

Меї Зег РНе 5ег Спіу Туг Зег Гуз Авп ГГ еи Рго Рго Су І ви СПми Спи 1 5 10 15

Ма! Тнг Рне Рго РнНе Тр Маї Азр РнНе І еи І еи Аа Агу Іе Аа Азр 0)

Ре Пе Авп Тр Суз Стпу Туг Туг Авп Пе Гуз Сув Рго Сім Аа Си 20 35 40 45

Гуз Ма! Ре Зег Пе Сіу Сп Зег ТАг Сп Маї І єи Геи Гуз Тр Рго 50 55 60 25

Стпу Аа Сп Спу Гуз Спи Авп Ага Маї Гуз Азп РНе Тнг Сім Аа Аа 65 70 75 80

Зо

Рпє Рго Туг Меї Гуз Маї Рго Маї Агу Рго Авр Авп Іе Спи Тр Пе 85 90 95

Гуз Пе Ні Сіи Меї Г еи Ні Авп Туг Авр Ага Сп Пе ТНг Рго Сп 100 105 110

ТА Тнг Си Авп Азр І еи І єи Аїйа Аїа Пе Тнг Аа Авр Рне Авр Сп 115 120 125

Аго Си Пе Пе Нів Рго Ма! Тиг Спу Спи Гуз Тгр Маї Рне Су Гув 130 135 140

Гуз Тнг Сім Аа РНе Аа Тнг Азр І єи Спи Спи Аа Ма! Азр Спи Спи 145 150 155 160

Азр Рго Азр Тиг Сім Гуз Гуз Сп Рго ТНг Авр Гуз ТАг Сп бег Авп 165 170 175

Авп Гуз Гуз Спу Спи Пе СПу Сім Гуз Гув Спи СПИ Спту А5р ТА І єи 180 185 190

ТАг Зег Авп Сім Ст Нів Ніз Сип бег Аг І уз І єи І єи Спи Ні Азр бо 195 200 205 зЗег Зег Сім Спи Сп Рго СПми Спи Аа Сіу Нів Агу Спи Сп ув Си 210 215 220

Ї ви Спи Авр Авп Іе Спи Авр Іе Г ув 225 230 «2105 4 «2115 891 «212» Білок «213» Парвовірус свиней 5В «400» 4

Меї ГГ еи Ні Авп Туг Авр Ага ап Пе ТНг Рго Сп Тиг ТАг Си Авп 1 5 10 15

Азр Гец І ви Аа Айа Іе Тнг Аа Авр Ріє Азвр ап Аго Спи Пе Пе 20 25 0)

Ні Рго Маї Тнг Спу Спи Гуз Тгтр Ма! Ре Сту Гуз Гу Тнг Сім Аа 35 40 45

Рпє Аа Тнг Азвр І єи Сім Спи Аа Маї Азр Спи Сім Авр Рго Авр ТНг 50 55 60 сій Гуз Гуз Сп Рго Тиг Авр Гуз Тиг Сп Зег Авп Авп Гуз Гу Спу 65 70 75 80

З5

Стій Пе Спу Спи Гуз Гуз Спи СТ Сіу А5р ТНг І єи Тнг Зег Азп Си 85 90 95

Сім Нів Нів Сип 5ег Аго Гуз Ге ГГ єи Сім Нів А5р бег 5ег СПми Спи 100 105 110

Сіп Рго Спи Сім Аа Спу Нів Ага Спи Спп Гув Спи Гей Спи Авр Авп 115 120 125

Пе См Авр Іе Гуз Ні Спу АІа Спу Сім Авр Сіп ТАиг Спу ТАг Спу 130 135 140

Пе Авп Тр Рго Су Ні Агу Туг Тиг Су Рго Спу Авп Рго І еи Рго 145 150 155 160

Ніз Сіу Аїа Рго Ага Авп Си Пе Авр І єи 5ег Аа Аа Гуз Нів А5р 165 170 175 60

Зо

Пе Аго Туг Гуз Сип Туг Зег Агу Туг Спу Ні Ттр Рго Тут Пе Ттр 180 185 190

Аа Рго Туг Пе Авр Гуз Гуз Меї Сп Спи Авр Іе Ага Сім Пе Маї 195 200 205

Гуз Гуз Су Геи СПУ Геи Сти Сну Гуз Гей Ї еи Стпу Авп І єи Пе Зег 210 215 220

Ага Гей Тгр Сп Айа Гуз Туг Агу І єи Спу Аа Рго Пе Туг Спи Пе 225 230 235 240

Ї еи Гуз Тни Пе І єи Рго Рго Гуз бег Меї Рго ТнНг І уз СПИ 5ег Маї 245 250 255

Спи Гуз Нів І єи Рго ГІ ув Рго І єи Рго Іе Авр Рго Рго Сіп ТНг 5ег 260 265 270

Ї еи Рго Сіу Ага 5ег Рго Рго Агу Тнг Рго Авр І єи Сіу Спу СПм ТНг 275 280 285

Сіу Меї Авп Сім Спи Рго Рго Аїа Гуз Агу Ага Меї Тниг Си Авр Ага 290 295 00

Сув Авр 5ег Тпг ТНг Ага Суз Спи ТНг І еи Авр ТАг Сп Туг Спи Авр 305 з10 315 з20

З5 зЗег І уз Меї АІа Сіу СПУ Спу Спу Счу Спу Спу Авп Сп Рго Гуз 5ег 325 330 335 зЗег Тр Пе Спіу Спу Аа Рне РНе Тиг Ар Тнг Тниг Маї Тиг Тнг Туг 340 345 350

Спу ТАиг Ага Агу Суз Маї І и бег 5ег РНе Рго Нів Авп Туг Суз ТНг 355 360 365

Тигаїи Бег Спу Ар Ніз Іе Рго зе"! І єи Маї Ма! Суз Тнг Рго Тр 370 375 380

Туг Туг Туг Авр ГГ еи Авп Пе ГГ еи 5ег Аа Ні РНе 5ег Рго 5ег Аа 385 390 395 400

Тер Сп Тиг Гей Її ви Спи Спи Туг Азр Аа Рне Гуз Рго І єи Гуз І еи 405 до 415 60

Сі Ма! Гуз Пе Гуз Спи Пе Маї Ма! Гуз Авр Маї Авп Авзп Меї ТНг 420 425 430

Спіу Гуз Сп Суз Суз Авзр ТНг Маї Зег Авр Авп Аа Меї Аїа Аа Маї 435 440 445

Ї еи Су РНе Сіи Авр Тниг Ніз Туг Сім Г еи Рго Туг Маї Гей Спу Спу 450 455 460

Сіу Сп І еи Тнг Маї Рго Сіу Нів І еи Рго Сіу Сп Тк Туг Сім Гей 465 470 475 480

Рго Гуз Туг Суз Туг Агу Тниг Маї Сіу Гуз Рго Ні Зег Спи Меї Ттр 485 490 495 зЗег Рго Маї Авр Сіпу бе" І уз Ага Аїа Ніз І ей Ар Меї Рго Рнеє Маї 500 505 510

Сіп Рго ТАг Сп Авп ТАг Спи Рпє Ре Пе І єи Спи Авп Ага Нів Зег 515 520 525

Ти Пе Геи Нів Тиг Спу Авп Спи Рпе Ре Сп ТАг Туг А5р РНе Рго 0) 530 535 540

Азр Геи Нів Ріє Сім Сіп Г еи ТАг Сп Туг Меї Ттр Ар Аїа Аго Агд 545 550 555 560

З5

І еи Авр Авп Рго Меї Гуз Спу Сіп Ага Пе Сіпп Ма! Меї Гуз Авп Гуз 565 570 575

Рго Тиг Си Авп Гуз Авр Сп Меї РНе ау Іе Агу Аїа 5ег Зег Туг 580 585 590

Ї еи Маї Рго Ттгр Іе Маї Авп зе" І єи Авп Аг Рго Аа Меї Ре Гей 595 (100) 605

Сіп Сіу Спу Аго І єи Гуз Авр Су Авр Туг Зег Пе Ма! Спу Рго Спу 610 615 620

Тиг Агу Си Сп Ава Тнг Туг Ні Туг Рне Авп Азр Тнг Рго Маї Маї 625 630 635 640 маї Спи Ага Авр Іе Туг Гу5 Рпе Тит Тниг Зег Меї І еи Гуз Агу Сі 645 650 655 60

Тиг ап Сп Рго Спу Рго Ага Тнг Сп Спи ТНг Тиг Ма! Гуз Тнк Рго 660 665 670

Азр Стпу ТА Пе Пе Пе Тк Тнг Авп зег І ви Аа Туг Спу Сп Маї 675 680 685

Рго Ст Авп Пе Авр Авп Іе Рго 5ег Авр Нів Гуз Аа АІа Рпе Су 690 695 700 маї Тиг ау Туг Аго Г еи Аа Маї Аа Спи Сіп Агу Спу Туг Зег ТНг 705 710 715 720

Рго Стпу Меї Рго 5ег Ніз Пе Аго Сіи Пе Геи Геи ТАг Гуз Тнк Рго 725 730 735

Гуз Геи Г ви Спи Гуз Ар Сп Сп Спи Пе ТНг Ре Рго Авп Рпє Стій 740 745 750

Спу бег Ма! Зег Спи Гуз Тнг Зег Аа Авп І єи Спи бег Сп Пе Тгтр 755 760 765

Аа Тут Пе Рго Авп Тнг Ар Авп І уз Ні Азп Суз Спу ТНг Рго Рго

Ко) 770 775 780

Ї еи Бег Пе Ттр Спу Меї Си Авп Рго Рго Рго Меї Маї Рнеє І еи Аг9 785 790 795 800

З5

Ї еи І єи Рго Сп І еи Су Рго Рго Спи Гуз бЗег Зег Суз бЗег СПу Зег 805 810 815

Гуз Рго 5ег Гуз Гуз РПє І єи Авп Сп Туг Су Сип РНе І єи Геи Си 820 825 830

Тут Тнг Маї Тиг Тер Аа Маї Маї Агу Ага Гуз Гуз Ні Те Рго Аг9 835 840 845

Тр Авп Рго Меї Рго Су Маї Тнг Пе Рго Тнг Туг Азп Авп Авр Рго 850 855 860 маї Тут Пе І еи Авр Сп Авп Сіу РНе Туг Гуз ГІ еи Рго Сіи ТНг Маї 865 870 875 880

Тер Тнг Аа Гуз Сіп Ага Маї Аго Аїа Аго Агд 885 890 60

«2115» 685 «212» Білок «213» Парвовірус свиней 4 «4005» 5

Гуз Ніз ау Нів Тр Рго Ніз І єи Тгр Аа Рго РНе Маї Азр Аг Сп 1 5 10 15

Меї бег Сп Спи Пе Стій С1пп Ма! І еи ув Спу бег ТНг Гуз І єи Зег 20 25 0)

Сіп Гуз Гей І єи Айва Азп Ре Пе Пе АЇа І єи Тгр Ага Аїа Гуз Сіи 35 40 45

Гуз Пе Стпу Аа Рго Іе Туг Спи Пе Ма! Гуз Спу Маї Рне Рго 5ег 50 55 бо маї Авр Гуз Гуз ТАг Маї Спи Зег І єи ГГ еи Рго Нів Рго Ар Рго Пе 65 70 75 80

Рго Айїа Рго Рго 5ег Зег Рго Сп Ага Спу 5ег І уз Ага Аа 5ег Рго 85 90 95

Зо

Рго СіІп бег Рго Авп Аїа Ні Авр Си Авр ТНг Меї 5ег Су Нів І ув 100 105 110

Ага Сіп Гуз ТНиг Меї Сім Маї Спи Зег СПи Сув Авр І уз Зегі ей Ї еи 115 120 125

Сув Рго Тниг Сп Авп Аа Сіу Аа Азр Ре Спи Геи Суб Спу Тк Спу 130 135 140

Сіу Спу Аа Тиг Авп Спи ГГ ув Спу Тк Ттр Маї Сіу Сіу Тнг Сп Ре 145 150 155 160

Тпиг Авр ТАг Зег Пе Ага ТАг Рне Сіу Тниг Агу Аго Суз Ма! І еи Зег 165 170 175

Аа Ре Рго Ар ТНг Туг Су5 5ег Меї Меї Зег Спу Авр Аа Пе Рго 180 185 190 зег Пе Пе Рпе Авп ТНг Рго Тр Туг Туг Туг Ав5р ГГ еи Авп Пе Меї 195 200 205 зЗег Суз Нів Рпе 5ег Рго 5ег АІа Рпе Сіп ТНг Гей Пе СП Авр Туг бо 210 215 220

Азр Аа РНе Ага Рго Ага зе! І еи ТАг Маї Ніз І єи Гуз Спи ГІ еи Маї 225 230 235 240

Пе Гуз Ар Маї Су Сп Сіп Сп С1у Гей Сп Айа Спи Сіп Маї 5ег 245 250 255

Авр Азп Авп 5ег Аа ТНг І єи І єи Аа Рнєе Сіи Авр Маї Азп Туг Си 260 265 270

Ї еи Рго Туг Ма! Геи Спу СПу Спу Сп Маї Зег Ма! Рго Су Нів Гей 275 280 285

Рго Стпу Сп Рго Туг Сип Гей Рго Гуз Туг Зег Туг Аг Тиг Ма! Спу 290 295 00

Гуз Рго Авр Рго Авп 5ег Сіу РНе Маї Рго Сіу Агу Авп ТНг Нів Рго 305 з10 315 320

Азр Сп сапу Рго ау Ні Рго Гуз Айїа Зег Гуз Тнг Пе Тр Туг Зег 325 330 335

Зо

Сіп Туг ГГ еи Сім ТНг Сп Авр ТНг Спи РНе Тут Пе Гей Спи Авп Нів 340 345 350

Гуз АІа ТА Пе І єи Ні Зег Спу Азп Тит РНе Зег Сп Авп Туг Авп 355 360 365

РНе Ро Авр І єи Рго Рнє Сім Сп І еи ТНг Сп Туг Меї Тр Азр Аїа 370 375 380

Агу Ага Сп Авр Авп Рго Г еи Пе Авр Сп Ага Пе Сіп Ма! Меї Зег 385 390 395 400

Агу Меї Туг Азр Авр ау Рго Сп Гуз Тнг Ре Аїа Іе Гуз Маї Авп 405 до 415

Рго Туг Пе Маї Рго Рпе ТАг Ма! Гу 5ег Тиг 5ег Ага Рго Аа Меї 420 425 430

Рпє ГІ єи Аа Слу Спу Агу Ріе Гуз Авр Стпу Авр Туг Зег Пе Тиг Спу 435 440 445

Рго Стпу Азр Аго Сім Гу ТНг Зег Ре Аго Туг Туг Авзп Авр Рго Рго бо 450 455 460

Тер Пе Пе Тниг Агу Авр ТНг Туг Геи Ре 5ег 5ег Азр І єи Аа ГГ уз 465 470 475 480

Тиг ам Агу Си С1п Рго Спу Рго Агу Сіп Спу Авр Тнг Маї Маї Аг 485 490 495

Тиг Рго Авр Сту ТНАг ГГ еи Пе Маї ТАиг Тнг Авп Аа І єи Аа Туг Спу 500 505 510

Туг Тиг Тиг сти Туг ГГ еи Гуз Авп Пе Рго ГГ еи ГГ еи Зег Зег Гуз Туг 515 520 525

Ніз Сіу Маї Спи Авп Ре Ага Г еи Аа Маї Спи Авп Сі Агу Спу Туг 530 535 540

Зег Меї Рго ау Нів Рго 5ег Нів Пе Агу Спи ТНг ГГ еи РНе Аг Спіу 545 550 555 560

Гуз Геи Рго Зег Спи Пе Агу Спи бег ТНг Пе Гуз Зег Спи Авр Сп 565 570 575

Зо

Аго Гуз Сіи Пе Тк Рне Рго Авр Туг Меї Спу 5ег Маї Авп Си Гув 580 585 590

Тиг Тиг Ада Авп ГГ еи Сім 5ег Сп Пе Ттр 5ег Сп Пе Рго Авп ТНг 595 600 605

Азр Пе Тиг Спи Гув Сувз ТАг ТНг Рго Рго І єи Зег Пе Ттр Спу Меї 610 615 620

Гуз Азп Рго Рго Рго Меї Маї РНе І еи Аг І єи І єи Аа Сіп Меї Спу 625 630 635 640

Рго Рго Агу Агу бег Аіа Суз 5ег Сіу 5ег Пе Рго бег Азп ТНг Туг 645 650 655

Ї еи Авп Сіп Туг Суз СіІп РНе Гей еи Тнг Туг Спи Меї Сім Тгтр Ар 660 665 670 ма! Ме Гуз Агу ТНг Ага Гуз Тнг Маї Агу Тр Авп Рго 675 680 685 «2105 6 бо «2115 19

Зб

«212» ДНК 213» Штучная послідовність «220» «221» Джерело «223» /примітка-Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер" «4005 6 ассададаас адасдасаї 19 -2105 7 «2115 22 «212» ДНК 213» Штучная послідовність «220» «221» Джерело «223» /примітка-:Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер" «4005 7 ааасассіда щодассаїа аї 22

2105» 8 «2115 30 «212» ДНК 213» Штучная послідовність «220» «221» Джерело «223» /примітка-Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер" «400» 8 асісаасадс саддассдад аасасаддаа зо

«2105 9 «2115 33 «212» ДНК 213» Штучная послідовність

«220» «221» Джерело «223» /примітка-Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер"

«4005» 9 ссадашас айдасдса дсіаасасад їас З «210510 «2115» 28 «212» ДНК 213» Штучная послідовність 60 «220»

«221» Джерело «223» /примітка-Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер" «4005» 10 ддаїаїіаадс ссаааїсіда дасісіад 28 -2105 11 «2115 597 «212» Білок -213» Парвовірус свиней 4 «4005 11

Меї Спи ТАик Тук Ттр ТАг сту Пе Суз Аго Геи Рне Рго Авр Маї І єи 1 5 10 15

Гуз Пе Рго Су Ма! Туг Спи Спу Ага Туг Пе Рнеє Сім Маї Рго Пе 20 25 Зо

Зег Тиг Агу Азр Суз Меї Гуз Тр Рго Авр Пе РНе Сіу Авп Си Авп 35 40 45

Авп Бег Сім Авп Сп Сп Зег Спу Аа Айа Рго Аїа Аа Рго Агу Сі 50 55 бо

Зо

Авп І єи Азп 5ег Ав І єи Маї Пе Аа Маї Ага Сп АїІа Сім Аа І еи 65 70 75 80

Рпє Аг9 Си І єи Сп Гуз Спи Ге Ага Гуз Зег Суз Аг ГІ ви Спу Маї 85 90 95

Ар Рго СІу Пе Рне Меї ап І єи Спи Спи Ма! Авр 5ег Гуз Спу Спу 100 105 110

Ї еи Ніз Геи Ні Тгтр Суз Маї бег Ма! Зег Аіа Спіу Тнг Рго Ага Авр 115 120 125 маї Геи Ти Пе Рнє Гуз Азп ТНг Сім Гуз Гуз Маї Зег І єи Туг Туг 130 135 140

Рпе Стпу Ма! Спи Сну Гей 5ег Рпе Ре Маї Рго Ні Гуз Авп Гуз Нів 145 150 155 160

Сіу Аїа Тр Гуз 5ег ТНиг Азр Сіи Спу РНе Пе Туг Авп Туг І еи Гей 165 170 175

Гуз Гуз Геи Рго І еи Гуз Спи Суз І єи Туг Аа Ттр Тит Те Пе Спу бо 180 185 190

Сіу Аїа Іе Спу Авр Аа Суз Гей Авп ТНг Ар Гуз Ага Гуз Сім І еи 195 200 205

Ї еи Авр Азп Агу Сп Авр Рго Аа Ма! Пе Спи Спи І ей бег Аа Рго 210 215 220

Меї Туг Гуз Суз Аа Тиг Спу Спи І ув Меї І єи Авр Іе Маї Сип Тр 225 230 235 240

Ї еи Маї Авр Авп Авп Іе Суз 5ег Спи Зег Агу Тгр Спи Авп Гув Авп 245 250 255

Аа І еи Зег І еи Туг бег РНе Геи Аа Тиг Сип Аа Спіу Спу Тук Меї 260 265 270

Аа Гуз Сп Суз ГІ еи Аго Пе Аа Сітп Сіп Гуз Геи Гей Гуз Спи Гув 275 280 285

Рго І єи Су Геи ТНг Геи Меї Спи Рпє Гуз Авр Меї Авп Аа І єи Ага 290 295 00

Зо

Агу РНе Сіп Сіп Авр Сім Спіу Спи Меї Тнг Рпе Авр Авп Азп Аго Меї 305 з10 315 з20

Ніз Тут Пе Рне Аїа Іе Авп Авп Туг Авр Рго Гуз Пе Аа 5ег Маї 325 330 335

Пе Меї Туг РНе Тгр Зег Меї Гуз СІп Тиг Спу Гуз Ага Авп Суз Маї 340 345 350

Тер Ре Туг Су Рго Аа Тнг Тиг Стпу Гуз Тиг Авп Меї Аа Сіп Аа 355 360 365

Пе Суз Ні 5ег Зег Аа Азп Туг Спіу Азп Маї Авп Тгр Авп Авп Аїа 370 375 380

Авп РНе Рго РНе Сп Азр Пе Маї Сіпу Аа Сіп Маї Спу Тгтр Ттр Сім 385 390 395 400

Спи Спу Гуз Меї Тиг Спу Азр Меї Маї Сім Аїа Аїа І уз Аіа Гей Ї еи 405 до 415

Сіу Спу Тнг Аа ГГ еи Ага Пе Ар Аго Гуз Сувз Меї Сіп 5ег Пе Спи бо 420 425 430 маї Авп 5ег Рго Рго РНе І єи Пе Тнг 5ег Азп Маї Азр Меї Тнг Пе 435 440 445 маї Сіп См СпПу 5ег Ре Маї Зег РНе Сім Нів Сіп Сіп Рго Г еи Си 450 455 460

Азр Агу Ме! Пе Гуз Рне 5ег Ре Авзп Меї ТНг Гей Рго Сіу Авп Ріе 465 470 475 480

СІУ Г єи Пе ТАиг Зег Спи СПм Маї! Гуз Зег Рпе РНе Ага Меї Сіу Аа 485 490 495

І уз І єи Аа Аїа Сп Рго Азр Іе Меї Азп Суз Рго Іе Рне І уз І уз 500 505 510

Сіу Рго Аа 5ег Іе Ага Ніз І єи Маї Рго Ма! Спу Спи Пе Рго Рго 515 520 525

Рго Гуз Сім Меї Гуз Нів Гуз Агу Сіп Рго Геи Туг Меї Ага Аїа Спи 530 535 540

Зо

Рго Авр Си Пе Сип Авр Авп Рго Сім Сім Геи Авр Нів Ттр РНе Сі 545 550 555 560

Сім Сім Айа Рго Ага Гуз Гуз І уз Сип Гув Тиг Гуз Авп ТНг Аа ТнНг 565 570 575

Гуз Авп Рго Аа Сіи Тиг Маї Спи Пе Пе ТАг Стіи Тк Спи РНе Пе 580 585 590

Рго Аїа Рго Су ГГ ув 595

Claims (7)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Ізольований полінуклеотид, який містить полінуклеотид, що має послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид послідовності ЗЕО ІЮ МО: 4.

2. Ізольований поліпептид, який містить поліпептид, що має амінокислотну послідовність ХЕО ІО МО: 4.

3. Вакцина для лікування або запобігання інфекції вірулентним РРМ5В, яка містить РРУЗ5В капсидний білок послідовності 5ЕО ІЮО МО: 4.

4. Імуногенна композиція, яка містить імунологічно ефективну кількість поліпептиду за пунктом 2 і фармацевтично або ветеринарно прийнятний носій, наповнювач або розріджувач.

5. Застосування поліпептиду за пунктом 2 або вакцини за п. З для формування захисного імунітету до РРУБВ.

6. Вектор або плазміда, що містить полінуклеотид за пунктом 1.

7. Клітина-хазяїн, що містить вектор за пунктом 6.

Месхакчнанеть САН БРУК ВУ ван: жа За. ОК Кама жя с юр Нне В Ома а КЕ Ак и еф свверє КоурсенокеевамНЙ щем з мевівовою функ те Еш. А Давид сесрпркисенУвне Мена есе неви нь В Во о СВ и В В НЕ ВК М ВВЕ ДВ С ЗВ ЕН СЕЗ ВОКУ Ов о НА ЕК НИ ОО КВ В КН КЕ СЯ МЕС ЕТИКА ТАТА ТИСА ВВЕ МТМО МКК ТОВ ВТ В В БЕК АТ КОКС ОВАЛ В ПОВСТАННІ Т А ГОДУ ТЕТКЕТЕЕУТЕВ СКК АТОАВВ ТКС ВОВК ТО АВА ТОВ ТАТО В ОН НК ТОН КО ОА ВЕЛИКУ ЕВ ЕМ КВН КВ ВН КО КК КАН КСВ СТОЛА ОМОО АКВА КО Ви НН М В НК ЕЕ ЕК ШЕТАШСМККЕ МОМОТ ОВТ НК ММ ВОВНИ ОХ ТАТА ТВА АВВОААН ТКС А КГ ТА ВО В В К ВВ ТТН ОВ ВШ ТП ТАВВТОННМ ГАК ВАМККЕ ДОМСАВОВТСКОИКНУ М АВС ААТТАТСТОС ТОВ ТОВ ВУ КЕКС КОНЯХ КАЛБАХОСТВОВОА ТЕАТР КЕ о КЕН У З КН о НН ДЕВСАКТТ ОО ОСТ ТАС АЛАНА ТЕ АТІКА АВАВОА ТОВ ТАНК СТО АВСЛВ АНТ ОВО АТО КОТ УОрОАТСАТАВОКИ ТЕС А ОВЕС ВОАС ЕС ІКТ ТТ ТВА СОСОК ОДА ЕТ КУТОК ЕКО ВЕСТ ЗИ ОК ММА М ТА ВИКО НО КС КО КОСТА ЕК КЕ и с З ОА Ж КЕ КИ ен В ЕНН не Ви КК и ЕІ ВИ ЕК В Я НО ЗО КЕ У в о КК в ВК ов СЕВСВОСКО МТМ С АОКОХ ТА ВА АМЕТ ТТ ОА ТТ АВОССТ АСВ ТВО СТ ОЄВУЮТ ЖЕДУККУТ ОВУ КТ КА А КК ЕКО КН КУКА ВАССТВАС ВТ ВН Ток ВАИВОВ ВС ТК ат КОТОВА СВО АТАК СТА КК ВСЕМ ОВ КОМА ВИМ СТАВ КАВОВИХ МСА ВБАЛОВАЛОВ ОВО ВАК ТО ЛАА СВО ТКА ОВО ре ЗЕ вн З ки ен в УК КОН С Же ЗМ нев кя СВААВСВИ ВОВКА ОО АТС АТ ВТО рез КК З СК НИ ОК НЕК НН НК ВК НН ев НА М и КН В Кв И ЕТТТІВИ МНК АТАКА КТК ТТ ОА КЕ КЮ ДОКИ ВМ ВН КОКОН ЕТ ОВТ ЕТ ТЕ КВК КВ ен м в с ви Ок ни

Фіг. 1

МЕВБТВІЦАКАВІВОС ОВО ВО СВВОСА ТВ ОАТСОК ТВА АТОМИ МО МЕ ЕТО ВЕК ТАВСВМО САМОТІ АК МИ ТАТА КУ ТЕН ЕХ ВН В В Как КВ В КЕ МН ПОСТАВОК МНЕ ПО НН и КН В В о и НИ ВК НН В В ЗНО ВИН ОК ВВ КЗ СК ЕЕ спе кое ЕК В МО Я В ОНИ ОМ КЕ В Ов ВО а ВВ КЕ КИ М СОС ВЕК ВЕСНА АОС УВК НИ НК В я па СО В ВО ВЕ ВААС ТАНЕ и ЕН ВИН ВН СН в А МАН Кн В ФОТО АЛЛА КОВО ВА ОТ ТАКА БНО ЕЕ КО Во в КК СА ЕК КО ЗВ НИ о М В А В ВЕ ЗА УОЗ ВЕСНА ТВА ВАТА ТТ ТАЛА ТЕКТИ Я ТК ООПІВОТААВОЛИ ОСТ АВАВОС ТЕВААОС ТК ООО МК КО ОК В ОА В В КІВ СТ ЕКО ВО НИЄ СЕ КК КС ЯК ЕКО в Опале ватиА ВИС АА ТИТОВА АС ОВ ОА ТОВСТА УНК А КК ОК и ВК Ве ВЕ В ВК ВЕН НИ ЕК се А СИН о М В НН и З В КК Я ТЕСТАМИ КО СОУ ПВС КТА ЗА ВОТОАТТСтА АТС ТТ ОКА ТТ АВ КИ КК М В КИ ОК КИ КА В КЕ АТУАТАТОА ВААС ТОВ АСТ КОВО ТЕ ТЕКА ТКА ТИС КТ АТО ОО АСК ОСТ СЕН СМТ ОТО Х ПОТУ КТ ТАМ ІА ТЕ В КАВА НИВУ У Е КН С КЕ КИ ЗВ НВ ВО В ЕВ ОО ЕН ЛШ КЕ МВ ВКМ НАТО ВИ АТХ ТАКЕ ЕЕ АТТ ТИМКО МЛК НК ІТТ СВ ЕОМ ВАВ АТО АОС ВАСКО ОА ВВЕ ТЕ ЕН АС КА НК КК КЕР ВО Ве о и НИ ВК и В АТС КВАУКЕТУМ М АТАСВОКІ МТУ ТМ НМ ГУК І ТЛО ЕК ЕВ А В ЕК и В дОСЕТААТеВІа ВАСІ АСАСТ ТАС СТВО ВОВЧОК ВААС АДСВТАОКОВ ПТН ОН ШО В ВИ ДВ КАТ ПМ КЕ КИТА ОО НУ У АТ ТВА ЕВ В и ВН НН и и НУ КН НН СО Я В КК ВЕ ЕН ОК о ЗНО ОН ЗИ ТАКОМУ МІ МО ТТ ТО У КОДУ МЕ СОМИ ТЕ САТ КВОТ МАО КТ ТАН КЕ ТК ВАВ ОВТ ВС СА ЕК ОСА АТАКА М АОС КК КОВІ КЕ ОКОМ ТІКАТИ ОА ТВА ТОВСТА ТАВВ ТЕЦ КАВИ КОДЕК ОО ОТ В ОСА ТВ АК ТОНЯ ве А ВИ ТОВ Кт т МАСОВО АСА СОМ КАМ ОВ ВН АВК КВН ТУ НУ КТ МЕТО КА

Фіг. 1 (продовження) ІКОН ТьКа ВЕЛИ ВВ. КОХА К ІВ ККУ КМ ЕХЕКУЮМЕАК КК ОКУЮК, МЕТІ ОКуКОМУ УВО ТОК МН ОВІ МЕ КННоАВІААКВОИИНЬОХ МЕЗО Я А КК ЗНА НИ НЯ В ЗИ В КІ ЕВ Я У и В ОН КК а НОЯ УБЕКІНМЕКИВІ І ВИНЕН У ТОМА І ОКО ВИТ Е КИМ ВОВК ЛАМП ТММ ОК ЕЕ З КЗ ОН ЕН З КЕ ОК НЕ ВИ ЗВЕБЕЕТ ММ ТУНІКИ КУКИ Е ВАК УВК ВЕООІЕКВОБАдТЕНЕУ КЕ ВВЕ КЕМНЕ МО и НЯ УАНМ

Фіг. 2 ника вок; СЕКЕ Ре : сте елк ї У ух уд уче ххх злі Ікс ВсркВККВЕш Мур КТ ККУ, СЕ ОНИ МВ З ЕК В З З З В НВ Я МВ: ЖТКХ Ка ІІ Дід ММ М ДУ МЛК ХОМА АВМ ІМе дак иКиК і а : що МКК о ВО и чЕмЕтТНодАКЕМиУвУкиМІ Кік НЕМА М ВОК ТК ЕЗУНЕН ЯК ІК КИ Ж АХ ММ УКМЕТКАККЕВКУВУКВИМІКНІ КІНО О ГТУ оон сама я я чи "У о ВТші мих ТК КЕН г шко ти амМи пив вики но а ВНТ МОВИ МЛ хтЕаватт КЕ Е ютера Ку ЕЗНЕЕНЕ ЧЕНО яке КІБАВАТИ КВАНТ ОВММЕКІХ КЕ зсипроуцері шк МКУ ВЖК МАТИМЕ ДОК МК Ж каре ке апа ЗК с ке МЕСТО ЦО МАНКУ ВРУХВ пк тури сину Ки гц МОМ ТИВИ им мимі ОВК В ВЕ (У Хо и Ки В ЕЕ МИ з: х. МН МЕД МАЮ ЕМ и КО МДУ КК В пани и им и МЕ томи сим ум ЕХ ПОЗ АХЕМІЖ ЕК ТОМ МКЕЛІ ОККО ЕМКОН ЕКО ПІДКУПУ КИ КК у омана нм Ок а екв Й 7 що пУкцие Ки и ВКо, КоМ ЕК ТК Овни ха КОТИ о ДУ х пчимт в шву тш У Ку и ее лу їх Ж ЗАШИТИ Ми МК ДАК ЮК КА КИИАХ КТ, ша о по со по п о в, пров по вн ОТ лЬКО нив чне ; соус оте УКВ те МУК ви КЕ СКК а и КН и В НН В НН коми МОМ КВ НК В В СІЯ МЕ З ТьОМКХ ПОД лІКНуХ КОХАВ КК КЕДИ ККУ зо Пк нь АНА ак» БІ у меім с ХТО ЕК ЕК МУ ІА МО ПеМЕКИВАКВВМІКОВ КВТ ПОН я ОВ В КК ЦЕ ЗИ ЗК КН ЗНОВ ОК а о БО КО УК ОА еВ: алея ши се т тан пох ве Он нн ОН НН Ав МЕБКМЖМ ОМВК ЕК КЕКВ хе УвЕуА МКМ МОЮ ЖЕ КУКИ аа корова Ан : і Б ев ех с НЕ КК КК Кв А п а ПЕН НЕ пИКЕКММЕКЕнСККОВК ХА я им Ки І ТАМ ІТАЛ ТІ В сооттк вух таку Му ваКВККХ ВОКЕ Кук в сухе т они дин Гм ха МОТЕЛІ ОКА КОКСУ КЕ Ве КН и и и ИН Я ТІТКА КГ Ж ММ ТА КО АТМ МКУ ом офен нйок кшен нео и КВ КН ВН ОО. Ко о КН Ки В в А КИ АН ОН ВІ ЕКЗ ХК КАХ ДЛ КОМ ХЕ КК КМ МТК И я їй а в ува дина ду штт й кис сх жк У ік Ук КК нти ух КІВ КУ ММ м ще ср Ер ВЕК В УК КЕКВ р ЕК о фАн и тя ТЕКА ЕМ КАМ ОКО М М о ЛКК я х пе ой не ни : Ну ОК и и НВ в НН ЗО ЕК НИ НИ ЕН Я оон и мое АН хі Я кдд тки ик км екрцт У же їх жк УТ. вх ЕК іл ие КВ о КК КИ о НИ В НИ ВИН КВН В ЕК В ИН ЕК НН ИН ема КЄ МВ ХХ ЕЕ кв оте ЗоЖК нку поток КН Б ПАН АН ТММ

І". нин а п п В В зно Мо У ем Ком ун І : ОВД КОВІ НВК ЗАМОК КН ВЕЖ СК ННете ств ви ве іде ви : надо речи а зліва зе а ові зи кі асо зай іо си ооо с СМ т55і ї 1 ї з : ЗУ пон ние НИ и НУ ЕН МИ Ве ЖЕ: За З ЗУ Не КІН Я Н : КІ : | ше нин, СЛ я : НН ВИЩ я Шон «Корони тифі : Кігенннтнй нед тут прита ф уми типо и т дент Вт доми зи ЕК щи пудри ру жа шк ЕК ха: БІК СОЛІ СУМ: ВТК: ВИКО МКК І пути тях атм ЖЕ: Ж М І І ЗО: У БВ ЖЕК: і : : Я : : ІБК Яенеха шен: ни МО ВВ Е : Я ! | Е : ' І зей : І Н В ; ї : нн нн и ки в КО й ! | Е пон г А Я ШО ж дк жи ОМА: МІК КІ ІК меми а нин КН В В НИ А НН НО ОБ реловия ак у. ен о нини ми ОЗ и о Ве НИ тиаюу 00 В Ки ЗВ З ВІ: МК В: ВК З ХОМ З ШО ОМ Ко Я :І3аБУ ОЗ ЯК ск а ває в з р с ве вв со Б ак пре чнни Е ч р зо ЗА МЕДИК Лак: ЗОХМК І ОК ОЇ ВЖК: ЗВУ: не Б: ВЕ З Я СВІ САН БК В ВК ЯК, о ОВК канав Гуда ких п З ПМД дн АК ДА А дн м поши ик нн ви НЕК ВИ НК І МК пи КК Ди и нн ни нн вия хви Па ви я : івІЕЖ С крам: КІ ТК лам МАК по ХК: ВК в | З ЇЇ о ВК: ІБ: Ха: І ЗІ ЗМК: МУ 1 МАЮ МУК ННІ МИ ІТК ВНОЕ ЖК І БК Ж ВТ НЕ о В А НА А пан НК НБН Я, ів ке ее а а ЗК В НК ро КК хо І ах КК С БУВ ЕІ М САМУ: І ЯМИ А ВЖЯ І КС ІТ БРНЕХ і Мт ВОК ІК КК: Ж с ЦВК ВЕЖ ОБОВ ВВ ВО се Ура чи кеди кв ее НН РК ОК І ЖЕК шЕОМН о МАЕ: ВИНІ КБ: ВВ: ЗВАНІ тк ех ІТИ ВОЮ: Та МО ЗМК І ЕКО п в о и ко ов о я хом ї ин в ее б уж нн ек и о о НН ех с зу ми с сили З З І щи: ОА БОБ ВІ ОБ ВІК ОКОМ ВО ЯКО І ЕР НОюкая Ї де ан ше а а ви я сені й й й не ГЕО ки ИН: Ж Іза: ІОЖО ЖУК І ЖК ОСІВ ТАК І ВЖК, ЗК іо ГвНнос ЩІ Кишинів ши шя ех ЕЕ ня шт ва в в я Манн нак и їжи Ми ІЧ: БМ КК РО АБ: ЖЕЖІ БИБІ БО БОБ: фо и вн Кш ик КК иа ГБ М В За ЕК і ВИ Нокочвих ІЕМ МО З ОКХ: ЗААНО З МК С У ЖЕН І ОК МЕН с В НН ВВЕ ЛИН сш: шо вв С дення сус пути па В КИ Я ПМК о ее ВЕН ен їни ЇМ корж виш н рнр ия ки шин пафею вва зх ення МО М Кн ВЕ ІВ ЕІ ДІМ І ВІ ВЛ ГКІ ООН Крах дому ХАІ ШКЕМІ ЯКІ МУ СХЕМ ОО ЗО І ОББЯ ї ОУН ДУМИ ТИМ дО МТ Ве я І В ренні Іі НаРИКУае ї пе о ше ші ше вини я пе кл І и КИМ Ж ЗІ с: ШЕ: КІМ І МОЛЬ: МЕЖ: ОЇ ЕН о в Ко Ба ВЕ ЗЕ аж: ВК ЕВ І КА о о по и п МН В ож я ЕЕ НВ нн по а ще г 53 5: 35: Зали Важ о Я ВІК КІ есе хв ІННИ ІНВ евУя ЯМ: БВ М ВЕ ІК я ин шо но ни и пе : : они а и и нив що миля: ЖАВ ЗК БАК БЖ ОК: ЯКІ Ілля х З о А З А НК НО ВО Я ІМ ВЖЕ ЯКЕ І ЯБВ І КЕ ОСЗЯКИ: ЯУ : оку еко отя ння ск ТАЛА п ооо оо ооо І Заешкух БАМИ ТИКИ. УДК УХ БО ДИ ПО А ОА п ПП ОА : ї Бо ВИК МАКЕТ СХ се ут у трупу ту туту тут те т пт туту туту т пу тет т В тт пет тр Кто КК жк КК жи кА он о З

Я рема нчвим Х се 3 шчя око енетнеНим НД МАЄ вона ним ВЕК хї КУНА ки. вчених Ж 5 ЗХ дюн НИ ЕХ Ще: З са І Е Е РУ Я ще ї ї ї Я кв о В ки ї 1 ї сс Мина са ве Я Е і Н в ШЕ Е і Е ХЕ ккд сих Дука ЯК іх зе Мах ї і ще в ВК ЕК ВЕ І КК МТК 1 пн ВИНОС ВСІ ТЕЖ» МИТИ ХКА Я І З і і : «5 как КЕ вах Н З і КО мееесок КО ТИКо КВ і 3 і ж денний ! ї і 1 53 де ев а в и е В З Е ї у ЕК в З З У пи КЗ 7 : і хз» но на вн сок вк ТЕМ сх і Е: ооо аа п і : ! і з Н : х Ж У дж їх ІК Кс ї ї ! ї ЯК де КЕКВ НО КОНЯ Я і Н з ть Опов ооооююдововодос З Щі Й 1 І І Е З о собою 1 ї 1 - б Я ї У ї К К -Я оджввнх М див веду я м і : шко Внннй бан ВОК ЕВ КУ Ккдн і : з пл ши і ї Е: КОС Я : : Н Я ог хдоіпіанах кл -О са. дк, ї 3 їух- Й ! не КВ МОУ див кен ковани : і Карен Е ; М Н ІДИ Е З Танки нка Мк хв я й І1БАИиа : имени У Вфнкнтв ЗВОНКА з КІ : с: ВІЙ х ї 1 ЖК ї Я. Зоо В КВ ВАЕХ ї х ї КЕШ МОм Не ВЕН ї і «З на т ї Н - й не: Ш нок їй можн ТК КУТІ т ї : ; З і ох ІЗ ї ІЗ З У джлккклннлянки ї в Зк і . не унісекс КАК ЗМОВ ГА пвх ; : : : пом вище ї Н ШЕ: Баня пллліх у ї із яз у «мали МИ КЕ ї Її ї ї ШЕ: -- ПРЕ КО Ї : зі ї длляяккю дао о Н ї ї х й Ес: сн ї ї ; й У мМ жк УЖ жк Н ї Н ЩЕ З РВК : Н 3 ої но ї І ЕЯ УНН еККУ Н ж З : КО бою Н 5 ожамваквеках 00 шк Ко ІМ - : : мамине Зно век асан З х - о УТ яке ами Ева сооене й х Геосумох ца ВНС 0 ЛНВ КВК Ж

Фіг. 6

- у и о ВУ не скота ку Еге коуч ЕВ ху хакі ка В. ж х сок укі З ах ут МУМИсИЕ ВІК и МІК МЕ У Ух. Ух Ки. Рехууквтвти ВАТ кавев ВВУТВ пром зага овне всесвиеннеОсвь В ЗВИК. в в НН В НН НН НН НН НН НН НОМ: ММК ТЕКИ А ВУЖ ШИЖЕ ХО КОКО ДЖЕ УМИВ МУХИ ОСММЖАТТМЯШТІ КУ СИХ ОЛИВ узвар пек: ШМК свити КО ХО КН МЕЖЕЮ САМУ ДДТУ М ОМ КТ МТК Я ож ся ї Ач о з. ал ШОУ Еш я ІМТ ЕЛл Ох ОО УБУНИТЕ З ЛИШ ММА. В ЖЕЛЕ ТМ яшма шк м ко КН А В ВО В А МАНВ ААЯ хх ШЕУ ПМ МН и В НН ВН КО КЛІ поко ки р ОВ НОЯ ї ЖЖ. ЖК ою лю шк СД А КИ ск КК, ЕТИКА КК х хо щи ОО Са А ЕВ РУКУ КУ оре у и и о НК А ОО НК я ЖІ АХ, З ОВ Я о не В КЕ Зоя ВОМ В Зо ЗОВ НЕ ОО КВ КЕ З В М ВОК З ВД КО ЗВ СВК У М НН чл ККоОмлУш ОМ ки ие МЕД ФУ КК Км о М М т рим ди Ки ВОМ Му ШУМИТЬ ЩИХ ПІІ лу КМ ВТІМ ТИ М М ЕЕ КИ МТЕ МАЛИМ ВНИХ Я БУМ ОВ ЗО ЕК ЕК а ек В В ВНІ З ЗВ Я С З СВ З В В КВ ОК и овен ІЕЕ жо ЩО МД ІНК Ж ВОМ ЛИСТМИМ МК щ- Я Я п міка що Кн и ЕН ПИЛИ Х ТЕ ХОДА МУТУАК ОХ ЖАТКИ КА ЕТ НИ МОМ КОМУ МТА МИМО УТОМИ МТ КМЕТ В МИТ ШИ ПМД А МАЮ Мити ення зп ХК І КИМ КИ Ки Км ди и КИ вив и о и МОМ КИ вини А КК ДВ Бен МТУ МЖІТИ КАК МК Мід МОХ МОМ ОАЕ ДІ УХ А ХМ ПОБІТИК АСЖХ БОЛОЮХ ГІЛКИ ОТАК т

КК. школо тод БЛОФщЕх щих о дод А ИН ек А НК ХОЛМС о М ЗШ У ОО КК Кок и МИ МЕ о жа ПИ Еее В пе КЕт я ПЕРЕ ЕВ КТ ОІВ ОХ ЕКО МИ ПМ КИ ДОМИ КВК КИ ЕД хїм ФІЛЕ ЖИ КК А фі КОН З КО В М питуг пилу СЛУ ри и ЖК поууу ки пу Ки ФМ пт: Во ВИ З дити щит ЕР Кі й ЕЕУЦИК ше БММУСУКЕМСЕУ ЦУКАТИ МКК КЕ КИТ ОН - хату шетим жду Кр ня ото уд х Ж ши ЖУТУ УСЕ ТЕМ ПЕЖО ЕЛ АКИ ОО р торі тки МУК и и шим У МД М М ах МОЮ МТ М о о в а В С З ЗВ КО ЯН ВК І З В Ні В Я ПЕ МІ КЕ при тему ни І Еш Ти М Мт Кз у І ПИ ПИТ КЕ ЗЕ ЕК СЖТЬМ ОХ ШОМЖОЖМ ЕММА М ТЕКИ В Ми и ТИМ МІ ПМК І ВН КЕ У ЗМ ОКА В КВК ПОЛЕ сах кажу вн собу МАх ен не СУМ В жи дини УМХ Еш К її ї ПТ я, ШМК сс МДЕ ГЕЛЮ З І ЗИ СК, ТОЖ КХ, Мел к ЖИ ВОЗИ ЖЕ ЩЕ Р ЕхУУ УМ М ЖИМ ОК АЛ прах а пед тт духи уми и Ми у МІК у и Ки І ЕМ и т ЩКООСХд ЗИ ро ВУЖ АЛАВУ ХК ММ КИ ХК МТА КАК ОА ХА Ж МД МОЖ ХО АХУКМІ УК Ж А Є ЕВ МКС ЖК ях СУМИ ТА па водо Мо и иин КО тег шЖЕЖ Ж ОО ХИЖІ НК ТМ Ж ОНИ 0 мому Я ще що сх хе пед міх я Ж ООЖІЕМККИ х З во і: оно ВЕН миру НН и и о НН ПОЖЖЛ ПИ С я и КЗ КН ЗНЗ МУ КВ В КЗ С ЕНН М СНИ Я ЗК ВН ОКУ З ВН ВО Я ВУ «З «ую мя пижих «спі я В и КИ КК МАК му МІВ в мл. вн а КВК и ме мли дю у кит ХИТ рр ечя тку у у і М к УТ УКМиилв СІДМпу Ин МІ х. фл МОЖОМЛЕХТ, ПУХ ЖЖ МІЖУУМИ М ЖІ ЕЖЕКУМЕ КУ ММ М У МАУ Мо ПЕК ЮМ ТЕМ УК ЛДМУ ЦИМ У Сх КУ тхора м щМ ту Ар. ШТ ми оДмЕи я у пу : оо ДК НО я ОО ЖУКИ ОХ Тищ ПУХ МЖУЕВ МК ПТАХИ, т кою дних по ці жк муки тв ие Ж Кит Е МИ КИ Ки Кен и и и и М ЗЕВ КЕ сг ших ПЛ ЕСЕ В ВЕ МКК ки КН Кн о Ко НН ОК пл ПАМ ДИКІ КиМУ КИШКИ ке МК УЖ ту шк у Кот шо ДК и ДМК лу, ЖЖ Му МІХ ЖЕ МИ МІК ЛЮК ТМуМА ВХ МЛ Ж МИ ЛИ І М Ж Ж КИТА А СМТАКЯ нин ВОЖжешЕе ЗЕ ОЩІ им МЕ МІМІЦІ У Ме ве СБ Мо ОО Х «вих хто Мотрук КО пот Ку Ск ти ик о тик тиви ЮК ду МЕЛЖЛЮ ОН ВВ ВЕ ВОК С В ВИ КО ВК СН КТ Ху п оролнерт МЕ КЕ веду КЕНЕ В ту У ВИДУ ЕК ЕИМЮ ТК КОДИ В В КИ МК, я ЖОМУ МОЯ ШОШКМВ НК ЕК Ки КК МАКОМ МТК ОО МИ УЖЕ КОЛО. Ж ПОШИ МК ТК рН Ки КК ЩІ шо оо щих пи Ст ут ВК ие ЕК подо кут пух ке ОН СВК 5 Ж КЕКС ВТМ Ух. п МЕ Ух їх а М ск вів Ком по Кому шнех у МК и т І кец ЕЕМЕ ОООЩОІ ДдЖХ Тл м о по кн о в В З т о М КВ М С у з В а а В В Вк ХЕ. ТК сешалцюе пек Кн ун в я СКС кв Кк ккд шле, МЕТ ке ЖЖ МКМ МІМІКА МОЖЕ вим МК Мн кю я КК ЖК І КІМ КРЖНУ ДК «ІДД. КТ ЩІЛИН КМ СО шо де Со фдІтуМИитЕию и ПК ДИКА МУ ЖЕ КуИ ЖК ДОД КУМ х Ох т хх КЕЛИХУ ух ших дж Укр ек УК и М І ЦЕ КИ МК КОВШ КК в думу КИ КЕ ДАТАХ ПИКА зд ЖЖ ПОМІВ НЕ ОН А І АК М В ВВ ся

КИТ. ак нок о и КО и ОНИ в гадити УМІВ Кен ДИ ЕК ММ КК МОВУ КОХ ТМ КИ ДИ УАД ЗИМ КЛ ШК УКХ о ДУ В: СЕ КАДМКИх шоу ук Ким му емо м т ах. ди фл й мит ЖОВ МКМ ТК МОСТИ КМТ ли МКК. КО ЕЮМИ ОЖУх МУ ших Поу КК В У и В В и Ж ДИ. дЖСиХ ТИ ВО ОН В у Я МИМО НАМ ПУ ИИ ОІИД ХХ жу п І МлоОхм умі чи им их меня МЛ роя МАЛИМ ЖУ КОЮ Ж ОКХ ККУ КК ТК ТЕ ПОКТЮДУжеши юю. дещо дж тих о що що Ди х ен Кн в ЕН ЗНУ МА ЛА коки чу т мур у им ди МІУ те ХУЦИ ЕВ Е а В К ов Я МГ Х тя п КК; Кф кока. що ссв ще у у Я Визнати ВІД ТВ папка ВИК КВ зх Ім інт КВК БЕК БЕАК ЕВ МЕЗО КВУ УВК МОГ ПЕН НЕКК ОВЕН ДІЖКИ хаосу СИРУ мох моло пп хмлих сеанс дивне Жов МАКИ я І ВО В КЕ У ВВ ЛАТЕАТІИТЬ ОБАЩЛТАЛІКИ МЕЖ ХЄМУТА ОВК СХ ТММ ва НН Но Не ЕК и Я ВО в зво се З КК п М МВ ЗВ Зичимо и КК см кн ОМА ОК МВ ІШЖВМОЖЕКТАЬК ОО ОЕМ ОМ ПОожОеОт х срмукцх т жу уми ма ик КІ МК ІВиЗК У ли ЕМ КТ Ин ТИ КИ КМ ВЕ ши ТІНИ Її ОА В ек У и ЯК НН НН КВ За ВЕ З ЗО И ЗК Е и МЗВЯО У вв ев Е СВК ви ФУ ее ІІ КК М у Ж ВИК Ки ЖЕ Ж М де ВВ, о Я В в НН Ж ЖЕ ЖАВ ЗНАКУ ПО НО ННЯ ик КЖЦИ КК Аж цу о шт гу диск - здутті хащі Мт т ши ит ХЕ КУ КК м гав КМИН І ТО ї.

МЕТЕМ ТІК ЕП Кін ЕВ М МІОМИ Му рожа Шх підт КВУ но ЕК КК ЕКО ДУМИ ДВ КУКИ КЕ ІК, плату ШИХ п ЖІ ММ ЕМ МИ НІМІ КК В МДЕ Іди ККАХЇ КУН попу Жж и ти ЩЕ КІ КИ Х пре МИеКи сти Ж КАВУ О ЗКешлИшиИ Ми ЦЕ КОВУИК ТО КХ ДЕБЕ хеиМОя ДУМ ЖЕКи Ми МЕН жк ж ЩІ іш ІМТ ДИ ЩлМ ЕІ ЕК ЛАВИ т ПОКИ Ус пд У ВИ ЕД КІ Я ІБ ТНОЕ по МАМО КОЖ КД, КОС ВА а ни олень СВ аНяя ВСЯ ев В КО о НК о ОК ККУ ше Еш Героя о о АН В еВ у ОО и ОО Од ЛЕВИ КІ КО и Ко А КН я КК Бар ХК У у М т МЕ и В и ТІ КТК ДІД ДИВ М НК М ТТ ВИТ СОКИ, Тх ОМ КЕ М А ЖОВ я СЕМИ ХХ ХК КУКИ Ж ОМ КІМ КМ КМ М МЕ кА КУТА ТТ Ж ню жиух я мими КІМН ит У М ЕІ І А М МАКИ ЕВ ЕТИКИ М, Кат МЕТИ ОО шошЯ СЖ ПАМ Ю І яд ОККО КЗ МА Ж КАК КО У ТУ ЗЕ ТЯ ЕК ВКУ КІВ М ИШКК Х КО ХЕ У М ЖЕК МИХ ОВ падшит хКот х Ктуе кимик щ пК Й ве ким Км КМ КК ТК А ТИЖ КЕ Ж ее о в вв п В С в в в В ВЛ о В В о в в в В ЕЕ В В ВХ хиТИ ІМТ и ТІК У ву КМ МТК КК КМ НИ ТЕ УК ІДЕ А ТВ Е КК КЕ ТК КЕ УМ в НЯ и и В В НН ЦЮ ТЖИКИИ УМ ЖЖ КАМИ КМ МІ ГК ЕК СКК КЕ МАО ТК ЕЕ КО зоімини чу ФУТ ВУ І ки ми ий НИ виду Деми ака пики «ОК миши й Мекииции ШМХ ОМ у спожи ріки тедину З ТК ом м тиф т им М пишу МКК и п КК чичя СЕЩЛІНИХ КЕ ЕН ок О Н О БОТК А ННУ тапки Кт ми мет рити М Ки КИ ТЕН вину МЕ МЛЕМХА МУЦІІМОМТИМТ ПМК КІВІ КК КОМ МУКИ З МКК МИТ Ж КУМ МИХА КИ МД ХИ У ИМЕИТОСМИ КІ шт ким ОВУ хм че М и ж КК ВК МИХ ХЕ ВЕК З МИМО ЖОЖИЮ ЖЖ 0 ДУЖОК МНК КОМ КК В КН КМИН АН ткач, чих М в В ННЯ ПІНА ЛТИЛ ха ІКТ КУ ЦИМ, ШМК ОСКІЛЬ КІМ МИТТІ ЕХ ЗК ДЖЕК ЖЕ МАКЕТУ «ЖК щем 4 Бе ду ву оу то муки в тА м рр Кон т р тд юитех Зам ша З жу КЕ А Це КК их ММК М БК КМ ММ КК стих дики пЕК.

І у и и ВК Ки у ВВЕ КИ КИКЕТУ КЕДИ у КК и а ВК вк ик види МИТ при ШИ КІВ ли Млини ЛА МЕМ ІЛОВ УМХ о В і ЗВ КУ е я ЕМ як шохкжктих Зх пух ді тт М о Ки ви и М пи пи КВ ОО ТК Ки СИОБАЗИКЕ «ЗЛЕ НО МН Ки в НН В А ННЯ пежихкал е о п ши Куц КК МО Ма ш ИИ т Ки уки кум Ши ОО ЕЕ Пи сОшщесеУ М ми Му ЕЮНІ У ТТ ЕК А КВ УК УМХ, МАК КМ УКХ КНУ ЗАМ МЕ ЦК ИХ МУЛ У УТ ХУ МД МАХ М МИ ТММ я под окт во нн ори ОН р Нр а ше ИКЕ МЕ п КХ ХУ ММ ДМ МЕНЕ ша ШФКК ХМК У ЖЕК ЕХ МК о Я ЕК хи ЕЕиХ шт: ТД м ютер ШК ис МК тих ДЕК Є ВИДІВ В ДК шт, ЗАЛІК ТИ жмиХх ЕК М І КІ КИ ЕЛЕКТ ХМ КАВИ МВ КІ М Пи МУ У пд жа ем ЕЕ КИ ЕМ и КВ Ен ЕД ДИВО ви ЗК ЖКІ КЕ КДД КАК КЕ ЕХ ТВ КИ ЕН КОМЕТ ШК КМ ВИН КК МАЛИК ОК ІК В КК ФІ и м ша паж Климишин ни Ід КІ ВКМ п Ки КМ МИ ЩІ дити КУ пд УЮ НІВОМу АХ К Ел тку КИ АВК Е ТЕ ПІТ УМХ МК, СНИ пох іх І УоМ Ул У ИДКМКУУТ Ме ІХКИ КеХ Ккху МИ и К УМ УВИМоп киН пиЖК ХК кеипкуиеии ди ко ЕЕ А.

ЕЕ а в і В р В о В В В ВК Б о В В В ЗВ С КВ ОВ Я ПИКА погли ММ не в ММ КЕ ваш щдВк КК КУМ КВ, цих ПРІ ВЕМЕИЕКЕВЦИМіск ЕЕ ВИМІ сш мМІВНЦИмцю вим МКК теркою. й МЕТИ Ек Ж ВАК Ком ви ми п Ж Ку а Ки ВК щодд МИЙКИ щи ШЕЛЛІ ВБЛВАИИУХ КК КОМУ МАКИ КА КИМ ВАЛИК КЕ МКК М ІІ КТ ОМ БЕ ПИ пилою ше І КЕ Ул и с ВН НН Мк СЯ Н ПІКИ МЖК КК НКИ МК КК М мим юр па ПДВ УТУ МАТ МЕ КЛИМ КІМ ЖКТУЮАТЯ ЖУК ПУЕ МИМО Е ТУКА МИТ ШУМОК ТУЮ ТЕЛЕ шва еютиМ о шум УК токах пу пи щ л. д т Феоцоо ше до сидж ЖЕКу м м у пе КУ ЩІОСЖУ Ж КВЕД МО В У ШОК СХ щООДИ ОПИХ ЕК ня шОЖЛО цім щити Кеди Ки КК М ЗК МК М КМ, «шле Дю Ки ШИ БУ кя ПИТ КТК ША МЕТІ ЗЕКЛИХОМІЛМ и МИМКХ КИ АЕН КД ІУДИ КЛЄМ МЛИОТИ ХО МЕ МИТО ІТК. ф | 8 7 ГІ Я