本申请案含有符合37C.F.R.1.821-1.825之序列表。本申请案随附之序列表特此以全文引用方式并入。该ASCII复本系在2013年3月21日创建,命名为10-0153-PCT-SEQ.txt且大小为34,495个字节。
发明内容
本发明提供新颖核苷酸序列、蛋白序列、免疫原性组合物、疫苗及关于制备及使用尤其感染驯养猪之新细小病毒菌株之方法。该等菌株与在来自临床上发病之驯养猪之组织样品中鉴定之新颖猪细小病毒相关;基于与已知猪细小病毒物种及菌株之序列同源性,将该新颖病毒命名为猪细小病毒5B或PPV5B。
本发明之组合物及方法供以检测由该新病毒导致之感染、监测野生及驯养动物及畜群中病毒序列之遗传改变、及制备及使用新颖疫苗用以保护动物免于感染该病毒。
本发明之免疫原性组合物及疫苗包含由SEQ ID NO:1之核酸序列编码之多肽序列或其免疫原性片段,视情况包括佐剂用以诱导更强的免疫原性反应。
本发明之例示性组合物包含对特异性针对PPV5B之抗体具有免疫反应性之SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ NO:4之多肽序列中之任一者或其片段。本发明之较佳多肽包括SEQ ID NO:4之序列。较佳地,那些多肽或其片段对特异性针对PPV5B之抗体具有免疫反应性。
在另一方面中,本发明提供编码一或多种多肽、抗体构建体或抗体缀合物之核酸序列。编码多肽之基因序列包含与SEQ ID NO:1之序列至少95%、90%、85%或甚至80%同源性及/或相同性之核酸序列,具体而言,编码对特异性针对PPV5B之抗体具有免疫反应性之多肽之SEQ ID NO:1之第2861位第至5014位核苷酸序列(衣壳蛋白)或SEQ ID NO:1之片段。本发明之例示性核酸序列包括编码对特异性针对PPV5B之抗体具有免疫反应性之多肽之SEQ ID NO:1之第935位至第2024位核苷酸、SEQ ID NO:1之第2161位至第2860位核苷酸及SEQ ID NO:1之第2861位至第5014位核苷酸之序列中之任一者及其片段。较佳地,该等核酸序列或基因系编码对特异性针对PPV5B之抗体具有免疫反应性之多肽或肽之那些。
此外,本文所用本发明之多肽包括但不限于包含以下多肽:
i)包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之氨基酸序列之多肽;
ii)与i)之多肽至少80%同源性及/或相同性之多肽;
iii)i)及/或ii)之多肽之片段;
iv)包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之序列中所包括之至少13个、较佳地15个、更佳地17个、甚至更佳地20个邻接氨基酸之iii)或iv)之片段;
v)由包含SEQ ID NO:1之第935位至第2024位核苷酸、SEQ ID NO:1之第2161位至第2860位核苷酸或SEQ ID NO:1之第2861位至第5014位核苷酸之序列之多核苷酸编码之多肽;
vi)由与vi)之多核苷酸至少80%同源性或相同性之多核苷酸编码之多肽;
vii)由包含SEQ ID NO:1之第2161位至第2860位核苷酸或SEQ IDNO:1之第2861位至第5014位核苷酸之序列中所包括之至少39个、较佳地45个、更佳地51个、甚至更佳地60个邻接核苷酸之多核苷酸编码之蛋白质片段。
包含至少一种或多种如本文所定义PPV5B多肽之本发明免疫原性组合物可进一步包含生理学上可接受之媒剂,例如医药上或兽医学上可接受之载剂、佐剂或其组合。
此处所提供之PPV5B多肽中之任一者或任何包含此处所提供之该等PPV5B多肽中之一或多者之免疫原性组合物皆可用作药剂,较佳地用作疫苗或免疫原性组合物,最佳地用于预防或治疗对象以对抗PPV5B感染。
特别佳之PPV5B多肽包括具有诱导对特异性针对PPV5B之免疫反应之免疫原性表位之那些。较佳PPVB多肽包括具有预计在相关PPV1中为表面抗原之氨基酸序列之那些(Simpson等人,JMB 315,2002)且包括但不限于SEQ ID NO:4之第289位、第375位至第381位及第431位至443位残基。
熟习此项技术者应了解,本文所用组合物可纳入已知可注射生理学上可接受之无菌溶液。对于制备用于非经肠注射或输注之即用溶液,水性等渗溶液(例如盐水或血浆蛋白质溶液)可容易地得到。另外,本发明之免疫原性及疫苗组合物可包括兽医学上可接受之载剂、稀释剂、等渗剂、稳定剂或佐剂。
本发明方法包括但不限于在对象中激发对抗PPV5B感染之免疫反应之方法,该方法包含向对象施用包含一或多种如本文所定义PPV5B多肽之免疫原性组合物之步骤。较佳地,所激发免疫反应对抗多于一种PPV5B血清型或菌株。本发明组合物可用于治疗或另一选择为预防PPV5B感染。较佳地,该免疫反应降低与感染一或多种PPV5B血清型相关或因感染一或多种PPV5B血清型而引起之一或多个临床体征之发生率或严重程度。
在本文中,可施用本发明组合物之适宜对象及有需要的对象包括需要预防或治疗相关病毒性、微生物性、寄生性、原虫性、细菌性或真菌性感染、疾病或病况的动物。利用本发明组合物或方法刺激免疫反应之动物包括家畜,例如猪、牛、家禽(例如鸡、鸭、鹅或火鸡)、山羊及绵羊;以及驯养动物,例如小鼠、兔、狗、猫及马。较佳之动物包括猪、鼠科动物、马科动物、兔类动物及牛科动物。最佳地,刺激猪之免疫反应。
本发明亦提供降低与PPV5B感染相关或由该感染引起之一或多个临床体征之发生率或严重程度之方法,其包含施用包含一或多种由此提供之PPV5B肽及较佳地载剂分子之本发明之免疫原性组合物之步骤,以使得PPV5B感染之临床体征之发生率或严重程度相对于未接受由此提供之免疫原性组合物之对象降低至少10%、较佳至少20%、甚至更佳至少30%、甚至更佳至少50%、甚至更佳至少70%、最佳至少100%。该等临床体征包括仅因感染PPV5B导致之病毒血症及免疫抑制。该等临床体征可包括神经学体征(情绪低落、共济失调、嗜睡)、腹泻、呼吸困难、体况下降、关节肿胀(导致跛行及仰卧)、平均日增重减少、死亡率及与另一生物体(例如,猪鼻霉浆菌(Mycoplasma hyorhinis))共感染导致之多发性浆膜炎。
根据又一方面,本发明亦关于预防PPV5B感染之方法,其中该PPV5B感染可能由PPV5B引起,该PPV5B与SEQ ID NO:1之核苷酸序列具有100%序列相同性;与SEQ ID NO:1之核苷酸序列具有至少95%序列相同性;与SEQ ID NO:1之核苷酸序列具有至少90%序列相同性;或与SEQ ID NO:1之核苷酸序列具有至少85%序列相同性;该方法包含施用本发明之免疫原性组合物之步骤,该免疫原性组合物包含一或多种由此提供之PPV5B肽,即,至少一种分别与SEQ ID NO:3及/或SEQ ID NO:4之多肽序列具有100%、至少95%、至少90%及/或至少85%序列相同性之多肽或其包含SEQID NO:3及/或SEQ ID NO:4之序列中所包括之至少12个、较佳地15个、更佳地17个、甚至更佳地20个邻接氨基酸之片段。
本发明亦提供制备任一由此提供之免疫原性组合物之方法,该方法包含将一或多种由此提供之PPV5B肽与载剂分子混合,较佳地使得该一或多种PPV5B肽与载剂分子系彼此共价偶合或缀合。该等缀合物可为多价或单价。多价组合物或疫苗包括多种PPV5B肽与载剂分子之免疫缀合物。在又一方面中,本发明提供制造一或多种PPV5B肽之方法,该方法包含用编码任一由此提供之PPV5B肽之核酸分子转化宿主细胞、较佳地原核细胞(例如大肠杆菌(E.coli))。另一选择为,宿主细胞可为真核细胞,例如动物细胞、昆虫细胞、原虫细胞、植物细胞或真菌细胞。较佳地,真核细胞系哺乳动物细胞,例如CHO、BHK或COS;或真菌细胞,例如啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae);或昆虫细胞,例如Sf9。本发明核酸之杆状病毒表达亦较佳。
本发明之另一方面提供制造一或多种PPV5B肽之方法,该等PPV5B肽诱导对抗至少一种PPV5B遗传变体且更佳地两种或更多种PPV5B遗传变体之免疫反应。此包含培养编码并表达一或多种本文所揭示PPV5B肽之经转化表达载体。经表达蛋白质系保留在表达生物体中或分泌至培养基中。表达系在足以产生能够诱导对PPV5B之免疫反应之PPV5B肽之条件下进行。致使PPV5B肽诱导免疫反应之PPV5B血清型包括但不限于具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%相同性之序列。
制备本发明组合物之方法可进一步包含混合一或多种PPV5B肽与载剂分子之缀合物与生理学上可接受之媒剂,例如医药上或兽医学上可接受之载剂、佐剂或其组合。熟习此项技术者应认识到,媒剂、佐剂或组合之选择将尤其由递送途径、个人偏好及动物种类来决定。
在另一方面中,本发明提供诊断对象之PPV5B感染之方法。该方法包含提供一或多种PPV5B肽;使该一或多种PPV5B肽与自该对象获得之样品接触;及若在该样品中检测到能够结合该一或多种PPV5B肽之抗体,则将该对象鉴定为具有PPV5B感染。
在另一方面中,本发明提供确定先前已暴露于PPV5B感染且能够表达对PPV5B之免疫反应之对象之方法。该方法包含提供一或多种PPV5B肽;使该一或多种PPV5B肽与自该对象之获得样品接触;及若在该样品中检测到能够结合该一或多种PPV5B肽之抗体,则将该对象鉴定为具有PPV5B感染。
本发明亦提供试剂盒,其包含:包含一或多种PPV5B肽、较佳地连同载剂分子之免疫原性组合物;用于封装该免疫原性组合物之容器;一套印刷说明书;及能够向动物施用该免疫原性组合物之分配器。视情况,该一或多种PPV5B肽及该载剂分子可以缀合物形式或以单独化合物形式封装。当单独供应时,亦供应缀合该一或多种PPV5B肽与载剂分子之构件以及适当印刷说明书。
本发明亦提供用于接种动物之试剂盒,其包含一套印刷说明书;能够向动物施用由此提供之包含一或多种PPV5B肽之该免疫原性组合物之分配器;且其中PPV5B肽中之至少一者有效地免疫该动物以对抗至少一种与PPV5B感染相关之疾病。较佳地,该一或多种PPV5B肽系选自由此提供之那些。本发明试剂盒可进一步包含兽医学上可接受之载剂、佐剂或其组合。
本发明试剂盒中之分配器能够将其内含物以微滴形式分配;且该试剂盒中所包括之包含此处所提供之PPV5B肽之该免疫原性组合物在经鼻内、经口、真皮内或肌内施用动物时能够降低PPV5B感染之至少一个临床体征之严重程度。较佳地,使临床体征之严重程度与未经治疗之受感染动物相比降低至少10%、较佳地至少20%、甚至更佳至少30%、甚至更佳至少50%、甚至更佳至少70%、最佳至少100%。
本发明亦揭示治疗或预防由PPV5B引起之感染之方法。该方法包含向对象施用有效量之本发明之免疫原性组合物,其中该治疗或预防系选自由下列组成之群:减少PPV5B感染之体征、降低PPV5B感染临床体征之严重程度或发生率、降低由PPV5B感染引起之对象死亡率及其组合。
本发明组合物进一步包含兽医学上可接受之载剂、佐剂或其组合。该等组合物可用作疫苗且包含一或多种其它减毒疫苗、灭活疫苗或其组合。该等疫苗引发对抗至少一种与选自由下列组成之群之病毒相关之疾病之保护性免疫反应:猪细小病毒1、2、3、4、5A、5B、其他猪细小病毒物种、其它猪病原性病毒及细菌及其组合。可与PPV5B疫苗组合共同施用之其它类型疫苗包括但不限于2型猪环状病毒(例如,CircoFLEX、CircoFLEX-MycoFLEX)、猪生殖及呼吸症候群病毒(例如,PRRS ATP、PRRSV MLV)、猪细小病毒(例如,PRRSV-PLE)、支原体属(Mycoplasma)(例如,MycoFLEX)等。
熟习此项技术者应了解,本文所用组合物可纳入已知可注射之生理学上可接受之无菌溶液。对于制备用于非经肠注射或输注之即用溶液,水性等渗溶液(例如盐水或血浆蛋白质溶液)可容易地得到。另外,本发明之免疫原性及疫苗组合物可包括医药上或兽医学上可接受之载剂、稀释剂、等渗剂、稳定剂或佐剂。
本发明方法亦可包含将本发明组合物与兽医学上可接受之载剂、佐剂或其组合混合。熟习此项技术者应认识到,载剂、佐剂或组合之选择将尤其由递送途径、个人偏好及动物种类来决定。
本发明亦提供通过向该动物施用组合物来降低动物之进行性PPV5B感染之严重程度之方法。该组合物可包括与可接受之兽医载剂组合之减毒病毒培养物或一或多种PPV5B肽。
较佳之施用途径包括鼻内、经口(例如,于饮用水中)、真皮内及肌内。肌内施用较佳,最佳地以单一剂量。熟习此项技术者应认识到,本发明组合物亦可以两次或更多次剂量以及通过其它施用途径来施用。例如,该等其它途径包括皮下、皮内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜腔内、鞘内、气管内、皮内、心脏内、肺叶内(intralobally)、髓内、肺内或阴道内。取决于视治疗所期望之持续时间及效力,本发明组合物可施用一次或数次,亦可间歇施用,例如以每日计施用数天、数周或数月且以不同剂量。
本发明亦提供用于接种动物之试剂盒,其包含一套印刷说明书;能够向动物施用疫苗之分配器;及至少一种来自细胞培养物(包括但不限于细菌、真菌、昆虫或哺乳动物细胞培养物)之分离株,该分离株有效地免疫该动物以对抗至少一种与PPV5B、其它细小病毒菌株、其他病原体及/或其组合相关之疾病。本发明试剂盒可进一步包含兽医学上可接受之载剂、佐剂或其组合。
本发明试剂盒中之分配器能够将其内含物以微滴形式分配;且该试剂盒中所包括之该分离株在鼻内、经口、真皮内或肌内施用动物时能够降低PPV5B感染之至少一个临床体征之严重程度。在一些试剂盒中,该分离株亦能够降低PPV5B感染之至少一个临床体征之严重程度。较佳地,与未经治疗之受感染动物相比,临床体征之严重程度降低至少10%。
由下列详细说明可明了本发明之其它目标、特征及优点。然而,应了解,当阐述本发明之较佳实施例时,详细说明及具体实例仅以说明方式给出,此乃因熟习此项技术者由该详细说明可明了本发明精神及范围内之各种变化及修改。
具体实施方式
本发明提供与本文所揭示新颖猪细小病毒5B及其变体相关之核酸及其片段、多肽及其免疫有效片段、疫苗、免疫有效制剂、抗体、诊断分析及试剂盒、及制备及使用该等组合物及制剂之方法。
除非另外指明,否则本发明之实践将采用分子生物学、微生物学、重组DNA技术、蛋白质化学及免疫学之习用技术,其均在本领域之技术范围内。该等技术充分阐释于文献中。例如,参见Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第I卷、第II卷及第III卷,第2版(1989);DNA Cloning,第I卷及第II卷(D.N.Glover编辑1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames及S.J.Higgins编辑,1984);Animal Cell Culture(R.K.Freshney编辑,1986);Immobilized Cells and Enzymes(IRL press,1986);Perbal,B.,APractical Guide to Molecular Cloning(1984);the series,Methods InEnzymology(S.Colowick及N.Kaplan编辑,Academic Press公司);Proteinpurification methods-a practical approach(E.L.V.Harris及S.Angal编辑,IRLPress at Oxford University Press);及Handbook of Experimental Immunology,第I卷至第IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell编辑,1986,BlackwellScientific Publications)。
在详细阐述本发明之前,应理解,本发明不限于特定DNA、多肽序列或制程参数,因为该等当然可变化。亦应理解,本文所用术语仅系出于阐述本发明特定实施例之目的,而非意欲为限制性。必须注意,除非内容另外明确指出,否则本说明书及随附申请专利范围中所用之单数形式“一(a,an)”及“该(the)”包括复数个指涉对象。因此,例如,所提及之“一种抗原”包括两个或更多种抗原之混合物,所提及之“一种赋形剂”包括两种或更多种赋形剂之混合物及诸如此类。
A.定义
除非另有定义,否则本文所用之所有技术及科学术语皆具有与申请时熟习本发明所属技术领域者通常所了解含义相同之含义。术语之含义及范围应清楚;然而,假如存在任何潜在歧义,则本文所提供之定义优先于任一字典或外在之定义。此外,除非上下文另外需要,否则单数术语将包括复数形式且复数术语将包括单数。在本文中,除非另有说明,否则使用“或”意指“及/或”。此外,使用术语“包括(including)”以及其它形式(例如“包括(includes)”及“包括(included)”)不具有限制意义。本文所提及之所有专利及出版物皆以引用方式并入本文中。
“保护免受疾病”、“保护性免疫”、“功能性免疫”及相似词组意指通过施用一或多种本发明治疗组合物或其组合产生对抗疾病或病况之反应,其产生比在已暴露于疾病或感染之未经免疫对象中所预计更小之有害作用。即,在经接种对象中减轻感染有害作用之严重程度。在经接种对象中可减少、减慢或可能完全预防感染。在本文中,意指完全预防感染之处将特别指出。若未指出为完全预防,则该术语包括部分预防。
在本文中,“临床体征之发生率及/或严重程度降低”或“临床症状减少”意指但不限于与野生型感染相比群组中受感染对象之数量减少、呈现感染临床体征之对象之数量减少或消除、或存在于一或多个对象中之任何临床体征之严重程度降低。例如,其应指病原体载量之任何降低、病原体脱落、病原体传播之减少或PPV5B感染之任何症状性临床体征之减轻。较佳地,与未接受该组合物且被感染之对象相比,在接受本发明治疗组合物之一或多个对象中该等临床体征减轻至少10%。更佳地,在接受本发明组合物之对象中临床体征减轻至少20%、较佳至少30%、更佳至少40%且甚至更佳至少50%。
术语“增加之保护”在本文中意指但不限于与未经接种对照对象群组相比在经接种对象群组中与由感染因子(较佳地PPV5B)导致之感染相关之一或多种临床症状显著减轻。术语“临床症状之显著减轻”意指但不限于在使用感染因子攻击后与未经接种对照群组相比在经接种对象群组中至少一种临床症状之发生频率降低至少10%、较佳20%、更佳30%、甚至更佳50%且甚至更佳70%。
“长期保护”应指“改良之功效”持续至少3周,但更佳至少3个月,仍更佳至少6个月。在家畜之情形下,最佳地,该长期保护应持续到直至动物以肉出售之平均年龄。
“免疫原性或免疫组合物”系指包含至少一种PPV5B蛋白或多肽或其免疫原性部分之物质组合物,其在宿主中引发对该组合物之细胞免疫反应或抗体介导之免疫反应。在本发明之较佳实施例中,免疫原性组合物诱导免疫反应,且更佳地,赋予对抗PPV5B感染之一或多个临床体征的保护性免疫。
本文所用“免疫原性”PPV5B多肽或“抗原”系指引发如本文所述免疫反应之多肽或蛋白质。“免疫原性”PPV5B蛋白或多肽包括本文所鉴定编码序列或其类似物或免疫原性片段中任一者之全长序列。术语“免疫原性片段”或“免疫原性部分”系指PPV5B蛋白之氨基酸序列之片段或经截短及/或经取代形式,其包括一或多个表位且因此引发本文所述免疫反应。一般而言,该等经截短及/或经取代形式或片段将包含或编码来自全长蛋白(例如,衣壳蛋白)之至少13个邻接氨基酸。更佳地,该等经截短或经取代形式或片段将具有来自全长蛋白(例如,衣壳蛋白)之至少15个、更佳地至少17个且仍更佳地至少20个、且甚至更佳地30个邻接氨基酸。
术语“表位”意指物质组合物(例如,蛋白质或多肽)中被免疫系统、尤其被抗体、B细胞或T细胞所识别之区段或片段。在本发明中,表位通常系病毒蛋白之多肽序列之一或多个片段。
可使用许多业内熟知表位作图技术来鉴定该等片段。例如,参见,Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris,编辑1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。例如,线性表位可通过以下方式测定:在固体支持物上同时合成诸多种肽(该等肽对应于蛋白质分子之部分)及使该等肽与抗体反应,同时使该等肽仍附接至该支持物。该等技术为业内已知且经阐述,例如,参见美国专利第4,708,871号;Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002;Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715。相似地,构象表位系容易地例如通过(例如)x射线结晶学及二维核磁共振测定氨基酸之空间构象来鉴定。参见表位作图方案,上述合成抗原亦包括在该定义内,例如,多表位、侧翼表位及其它重组或经合成衍生之抗原。例如,参见Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23:2777-2781;Bergmann等人(1996),J.Immunol.157:3242-3249;Suhrbier,A.(1997),Immunol.and Cell Biol.75:402-408;及Gardner等人(1998),第12界世界AIDS研讨会(12th World AIDS Conference),Geneva,Switzerland,6月28日至7月3日,1998(其教示及内容全部以引用方式并入本文中)。
“免疫反应(immune response或immunological response)”意指但不限于出现对目标组合物或疫苗之细胞及/或抗体介导之免疫反应。通常,免疫反应(immune response或immunological response)包括但不限于一或多种下述效应:制造或激活特异性地针对目标组合物或疫苗中所包括之一或多种抗原之抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞及/或细胞毒性T细胞。较佳地,宿主会呈现治疗性或保护性免疫(记忆)反应以增强对新感染之抵抗及/或降低疾病之临床严重程度。该保护可由以下来证实:与病原体感染相关之症状数量减少、症状严重程度降低或一或多种症状消失、病毒血症发作延迟、病毒持续时间缩短、总病毒载量降低及/或病毒分泌减少。
在本文中,“特异性免疫反应性”系指免疫反应性蛋白质或多肽识别PPV5B感染之抗原特性但不与严格攻击对照之抗原特性反应。为测定可能之PPV5B免疫反应性蛋白质或其它多肽之特异性,将使用各种免疫分析(ELISA、IFA、WesternBlot)来测试该蛋白质对抗含有遗传上相似之病毒之动物血清。亦将在各种免疫分析中测试该蛋白质对抗含有相关与该表达方法相关之蛋白质之物质(杆状病毒、Sf9细胞等)。
本文所用“医药上或兽医学上可接受之载剂”或“赋形剂”包括任何及全部溶剂、分散介质、包衣剂、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂及诸如此类。在一些较佳实施例中,且尤其包括冻干免疫原性组合物之那些实施例中,用于本发明之稳定剂包括用于冻干或冷冻干燥之稳定剂。
在一些实施例中,本发明之免疫原性组合物含有佐剂。本文所用之“佐剂”可包括氢氧化铝及磷酸铝;皂苷,例如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech公司,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals公司,Birmingham,AL);油包水乳液;水包油乳液;水包油包水乳液。乳液可尤其基于轻质液体石蜡油(欧洲药典类型(European Pharmacopea type));类异戊二烯油,例如角鲨烷或角鲨烯;由烯烃(尤其异丁烯或癸烯)寡聚制造之油;含有直链烷基之酸或醇之酯,更具体而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯;具支链脂肪酸或醇之酯,尤其异硬脂酸酯。油可与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂较佳系非离子型表面活性剂,具体而言为山梨醇酐、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇与油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸之视情况经乙氧基化之酯,以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段,具体而言普流尼克(Pluronic)产品,尤其L121。参见Hunter等人,The Theoryand Practical Application of Adjuvants(Stewart-Tull,D.E.S.编辑),JohnWileyand Sons,NY,第51页至第94页(1995)及Todd等人,Vaccine 15:564-570(1997)。实例性佐剂系阐述于M.Powell及M.Newman编辑之“VaccineDesign,The Subunit and Adjuvant Approach”,Plenum Press,1995之第147页上之SPT乳液以及阐述于该同一本书第183页上之乳液MF59。
佐剂之又一实例系选自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及马来酸酐与烯基衍生物之共聚物之化合物。较佳之佐剂化合物系丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物,其尤其与糖类或多元醇之聚烯基醚交联。此等化合物被称为术语卡波姆(carbomer)(Pharmeuropa,第8卷,第2册,1996年6月)。熟习此项技术者亦可参考美国专利第2,909,462号,其阐述与聚羟基化化合物交联之该等丙烯酸系聚合物,该聚羟基化化合物具有至少3个(较佳不多于8个)羟基,至少3个羟基之氢原子由具有至少2个碳原子之不饱和脂肪族基团替代。较佳基团系那些含有2个至4个碳原子者,例如乙烯基、烯丙基及其它烯系不饱和基团。不饱和基团自身可含有诸如甲基等其它取代基。以名称Carbopol(BF Goodrich,Ohio,USA)出售之产品尤其适合。其可与烯丙基蔗糖或与烯丙基异戊四醇交联。其中可提及者系Carbopol 974P、934P及971P。最佳使用Cabopol 971P。共聚物EMA(Monsanto)属于马来酸酐与烯基衍生物之共聚物,其为马来酸酐与乙烯之共聚物。将该等聚合物溶解于水中会产生酸性溶液,较佳将其中和至生理pH以得到佐剂溶液,将免疫原性、免疫或疫苗组合物本身纳入该佐剂溶液中。
其它适宜佐剂尤其包括但不限于RIBI佐剂系统(Ribi公司)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(重组的或其它性质的)之不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽、或天然存在或重组之细胞因子或其相似物、或者内源细胞因子释放之刺激物。
预计佐剂可以每剂量约100μg至约10mg之量、较佳地以每剂量约500μg至约5mg之量、更佳地以每剂量约750μg至约2.5mg之量且最佳地以每剂量约1mg之量添加。另一选择为,以最终产物之体积计,佐剂之浓度可为约0.01至50%,较佳系约2%至30%,更佳为约5%至25%,仍更佳为约7%至22%,且最佳为10%至20%。
“稀释剂”可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油及诸如此类。等渗剂可尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸之碱金属盐。
“经分离”意指“通过手工”自其天然状态(即,若其存在于自然界中)改变者已自其原始环境变化或去除或二者。例如,天然存在于活生物体中之多核苷酸或多肽系未“经分离”的,但自其天然状态之共存物质分离之相同多核苷酸或多肽系“经分离”的,如本文所使用术语。
“安全性”系指在经接种后经接种动物中不存在包括但不限于以下在内之不利后果:基于活病毒之疫苗可能恢复毒力、临床上显著之副作用,例如持续全身性疾病或在疫苗施用部位不可接受之发炎。
本文所用之术语“经接种(vaccination或vaccinating)”或其变化形式意指但不限于包括施用本发明免疫原性组合物之过程,当将该组合物施用至动物时,其在动物中引发或能够引发(直接或间接)对抗PPV5B之免疫反应。
在本发明之背景下,“死亡率”系指由PPV5B感染及/或由PPV5B感染增强之与其它生物体之共感染导致之死亡,且包括感染十分严重而使动物安乐死以免受痛苦并人道终止其生命的情况。
“减毒(attenuation)”意指降低病原体之毒力。在本发明中,“减毒”与无毒力同义。在本发明中,减毒病毒系毒力已降低从而不会引起PPV5B感染之临床体征但能够在目标哺乳动物中诱导免疫反应之病毒,但亦可意味着与感染未减毒PPV5B且未接受减毒病毒之动物“对照群组”相比在感染减毒PPV5B之动物中临床体征之发生率或严重程度降低。在此背景下,术语降低(reduce/reduced)意指与如上文所定义之对照群组相比降低至少10%、较佳25%、甚至更佳50%、仍更佳60%、甚至更佳70%、仍更佳80%、甚至更佳90%且最佳100%。因此,减毒无毒力PPV5B菌株系适于纳入包含经改良活PPV5B病毒之免疫原性组合物中者。
“经杀灭”或“经灭活”意指用使PPV5B病毒死亡及/或以其它方式不能再现之物理或化学试剂处理。PPV5B可通过习用方式(例如在紫外光存在下由热、辐射或补骨脂素)杀灭。PPV5B可通过习用方式(例如,使用一或多种化学灭活剂经由化学灭活)灭活,该等化学灭活剂包括(但不限于)二乙烯亚胺(BEI)、β-丙内酯、福尔马林、戊二醛及/或十二烷基硫酸钠中之一或多者。使该等病毒之有毒力株减毒之方法及制备灭活病毒制剂之方法为业内已知且阐述于(例如)U.S.4,567,042及4,567,043中。因此,用于本发明疫苗组合物之PPV5B抗原尤其可呈全病毒形式,全病毒系经改良及/或经减毒之活病毒制剂或经杀灭或经灭活之病毒制剂。
本文所用“抗体”包括抗-PPV5B抗体,例如,单克隆及多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、猪抗体及CDR接枝之抗体,包括包括特异性识别本发明PPV5B多肽之CDR序列之化合物。术语“特异性针对”指示本发明抗体之可变区仅识别并结合PPV5B多肽(即,能够将单一PPV5B多肽与相关多肽区分,尽管具有多肽家族中发现之序列相同性、同源性或相似性),且容许(视情况)该等抗体与其它蛋白质(例如,金黄色葡萄球菌(S.aureus)蛋白A或ELISA技术中之其它抗体)藉助与该等抗体之可变区之外且具体而言该抗体分子之恒定区中之序列之相互作用而相互作用。测定本发明抗体之结合特异性之筛选分析众所周知且为业内常规实践。关于该等分析之全面论述参见Harlow等人(编辑),Antibodies ALaboratory Manual:Cold Spring Harbor Laboratory;Cold Spring Harbor,NY(19),第6章。亦涵盖识别并结合本发明PPV5B多肽之片段之抗体,条件系该等抗体首先系如上文所述特异性针对得到该片段之本发明之PPV5B多肽。为清晰起见,“抗体”系指因与特异性抗原之免疫反应而可与该抗原结合之免疫球蛋白分子。免疫球蛋白系由具有“恒定”区及“可变”区之“轻”及“重”多肽链组成之血清蛋白且系基于恒定区之组成进行分类(例如,IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)。抗体可以多种形式(包括(例如)作为Fv、Fab’、F(ab’)2以及以单链形式)存在,且包括含有一或多个抗体单链多肽序列之全部或一部分之合成多肽。
在本文中,“有效剂量”意指(但不限于)抗原引发或能够引发免疫反应而使施用抗原之动物临床症状减轻的量。
在组合物之背景下,本文所用术语“有效量”意指免疫原性组合物能够在动物中诱导免疫反应而降低感染或疾病事件之发生率或减轻其严重程度的量。尤其,通过半数组织培养感染剂量(TCID50)(即病原物将使50%经接种且易患病之细胞培养物产生病理学变化之量)来监测减毒活病毒制剂之有效量(以每单位剂量或等效量度之噬斑形成单位(PFU)数量衡量)。对于经杀灭疫苗或抗原性亚单位,有效量系指相对抗原含量(RAC),即每单位有效剂量之抗原纳入量。另一选择为,在治疗剂之背景下,术语“有效量”系指治疗剂足以减少或改善疾病或病症或其一或多个症状之严重程度或持续时间、预防疾病或病症进展、使疾病或病症复原、预防与疾病或病症相关之一或多个症状复发、发展、发作或进展或增强或改良另一疗法或治疗剂之预防或治疗的量。
如业内已知,“序列相同性”系指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列间之关系,即参考序列与相比于该参考序列之给定序列间之关系。序列相同性系对给定序列及参考序列实施能产生最高程度序列相似性(如通过该等序列串间之匹配来确定)之最佳比对后,通过比较该等序列来确定,并视需要引入空位。在该比对后,在位置对位置(position-by-position)基础上确定序列相同性,例如,若在一特定位置处核苷酸或氨基酸残基系相同性的,则序列在该位置系“相同性”的。然后用该等位置相同性之总数量除以参考序列中核苷酸或残基之总数量得到序列相同性%。序列相同性可容易地通过已知方法计算,该等方法包括但不限于那些阐述于以下中者:Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.编辑,OxfordUniversity Press,New York(19);Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,New York(1993);ComputerAnalysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.及Griffin,H.G.编辑,HumanaPress,New Jersey(1994);Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinge,G.,Academic Press(1987);Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.,编辑,M.Stockton Press,New York(1991);及Carillo,H.及Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(19),其教示以引用方式并入本文中。确定序列相同性之较佳方法经设计以给出所测试序列间之最大匹配。将确定序列相同性之方法编入可公开获得之确定给定序列间序列相同性之计算机程序中。该等程序之实例包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.,等人,Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN及BLASTX(Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)。该BLASTX程序可自NCBI及其它来源公开获得(BLAST Manual,Altschul,S.等人,NCVI NLM NIH Bethesda,MD 20894;Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990),其教示以引用方式并入本文中)。该等程序利用缺省空位权重最佳地比对序列以在给定序列与参考序列间产生最高程度之序列相同性。作为说明,就具有与参考核苷酸序列具有至少(例如)85%、较佳地90%、甚至更佳地95%“序列相同性”之核苷酸序列之多核苷酸而言,欲指除该给定多核苷酸序列可包括至多15个、较佳地至多10个、甚至更佳地至多5个点突变/该参考核苷酸序列之每100个核苷酸以外,该给定多核苷酸之核苷酸序列与该参考序列相同性。换言之,在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85%、较佳地90%、甚至更佳地95%相同性核苷酸序列之多核苷酸中,参考序列中至多15%、较佳地10%、甚至更佳地5%的核苷酸可能缺失或经另一核苷酸取代,或参考序列中总核苷酸之至多15%、较佳地10%、甚至更佳地5%数量之核苷酸可能插入参考序列中。参考序列之该等突变可发生在参考核苷酸序列之5’或3’末端位置或在那些末端位置之间之任何位置,其系个别地散布在参考序列残基中之各核苷酸之间或散布于参考序列内之一或多个邻接基团中。类似地,就具有与参考氨基酸序列具有至少(例如)85%、较佳地90%、甚至更佳地95%序列相同性之给定氨基酸序列之多肽而言,欲指除该给定多肽序列可包括至多15个、较佳地至多10个、甚至更佳地至多5个氨基酸改变/该参考氨基酸序列之每100个氨基酸以外,该多肽之给定氨基酸序列与该参考序列相同性。换言之,为获得与参考氨基酸序列具有至少85%、较佳地90%、甚至更佳地95%序列相同性之给定多肽序列,该参考序列中至多15%、较佳地至多10%、甚至更佳地至多5%的氨基酸残基可能缺失或经另一氨基酸取代,或该参考序列中氨基酸残基总数之至多15%、较佳地至多10%、甚至更佳地至多5%数量之氨基酸可能插入该参考序列中。参考序列之该等改变可发生在参考氨基酸序列之氨基或羧基末端位置或在那些末端位置之间之任何位置,其系单独散布在参考序列残基中之各残基之间或散布于参考序列内之一或多个邻接基团中。较佳地,不相同之残基位置系因保守氨基酸取代而不同。然而,当确定序列相同性时,保守取代并不作为匹配包括在内。
本文所用“序列同源性”涉及确定两个序列之相关性之方法。为确定序列同源性,将两个或更多个序列进行最佳比对,并视需要引入空位。然而,与“序列相同性”相比,当确定序列同源性时保守氨基酸取代亦作为匹配计数。换言之,为获得与参考序列具有95%序列同源性之多肽,参考序列中85%、较佳地90%、甚至更佳地95%氨基酸残基必须匹配或包含经另一氨基酸之保守取代,或参考序列中总氨基酸残基(不包括保守取代)之至多15%、较佳地至多10%、甚至更佳地至多5%数量之氨基酸可能插入参考序列中。较佳地,同源性序列包含至少50个、甚至更佳100个、甚至更佳250个、甚至更佳500个编码同源性氨基酸之核苷酸之片段。
“保守取代”系指一氨基酸残基经另一具有相似特性或性质(包括大小、疏水性等)之氨基酸残基取代,以使得整体功能性不发生显着变化。其亦可意指达成保守氨基酸取代之核苷酸取代。
B.载剂分子
可与本发明之PPV5B蛋白或肽缀合或共价连接之载剂分子较佳系上文所述之那些。用于动物用途之较佳载剂系牛血清白蛋白及钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin)。较佳地,载剂蛋白自身系免疫原。
可通过任一业内已知习用方法将本发明之PPV5B蛋白或肽共价偶合至载剂。尽管使用对称连接体(例如己二酸二酰肼,如Schneerson等人,J.Experimental Medicine,152,361-376(1980)所述)或异双官能连接体(例如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯,如Fattom等人,Infection andImmunity,56,2292-2298(19)所述)系在本发明范围内,但较佳避免使用任一连接体,取而代之,将本发明之PPV5B肽直接偶合至载剂分子。该偶合可藉助还原胺化来达成,如Landi等人,J.Immunology,127,1011-1019(1981)所述。
免疫原性组合物之大小(如由平均分子量定义)系可变的且取决于所选PPV5B蛋白或肽及PPV5B蛋白或肽与载剂之偶合方法。因此,其可小至1,000道尔顿(103)或大于106道尔顿。在还原胺化偶合方法情况下,PPV5B蛋白或肽之分子量通常系在5,000至500,000范围内或更大;例如,对于SEQ ID NO:4之衣壳蛋白,预计分子量为约101,000道尔顿,预计其形成由60个单体蛋白质组成之类病毒粒子(VLP)。
特异性结合本发明之PPV5B蛋白或肽之载剂分子(即肽、其衍生物及类似物、及肽模拟物)可通过业内已知各种方法来制造,包括但不限于固相合成或通过溶液法(Nakanishi等人,1993,Gene 137:51-56;Merrifield,1963,J.Am.Chem.Soc.15:2149-2154;Neurath,H.等人编辑,The Proteins,第II卷,第3版,第105页至第237页,Academic Press,New York,N.Y.(1976),其以全文引用方式并入本文中)。
本发明之PPV5B蛋白或肽或本发明之其抗体或结合部分可通过与医药或兽医载剂溶解或悬浮于稀释剂中以可注射剂量施用。该等分子之安全性及功效系如兽医生物制剂中心(Center for Veterinary Biologics,CVB)所阐述并规定在细胞培养物或实验动物中通过标准程序来测定。该等分子之毒性及治疗功效可在细胞培养物或实验动物中通过标准医药程序来测定,例如测定LD50(使群体50%致死之剂量)。
本发明疫苗可为多价或单价。多价疫苗系由多种PPV5B蛋白或肽与载剂分子之免疫缀合物制成。
在一方面中,PPV5B蛋白或肽组合物包含有效免疫量之免疫原性缀合物,较佳地与免疫刺激剂组合;及生理学上可接受之媒剂。在本发明背景下使用之“免疫刺激剂”意欲涵盖任一能够增强免疫系统之活性之化合物或组合物,不论其系与特异性抗原组合对免疫反应之一或多个要素之活性产生特异性增强作用,或仅独立对免疫反应之一或多个要素之活性发挥作用。免疫刺激剂化合物包括但不限于矿物凝胶,例如,氢氧化铝;表面活性物质,例如溶血卵磷脂、普流尼克多元醇;聚阴离子;肽;油乳液;明矾及MDP。使用该等材料之方法为业内已知,且确定给定疫苗刺激物之最佳量完全在技术人员之能力范围内。在给定制剂中可使用一种以上免疫刺激剂。亦可将免疫原纳入脂质粒中或缀合至多糖及/或其它用于疫苗制剂中之聚合物。
该等组合物视需要可存于可含有一或多种含有该活性成份之单位剂型之包装或分配器装置中。包装可包含例如金属或塑料箔,例如泡罩包装。包装或分配器装置可附带较佳用于施用哺乳动物、尤其猪之施用说明书。
C.佐剂
为进一步增加由此提供且含有一或多种PPV5B蛋白或肽之免疫原性组合物之免疫原性,该组合物亦可包含一或多种佐剂。
佐剂可通过任一先前所述或业内已知技术纯化。较佳纯化技术系硅胶层析,具体而言,“急骤”(快速)层析技术,如W.Clark Still等人,J.OrganicChemistry,43,2923-2925(1978)所述。然而,可使用其它层析方法(包括HPLC)来纯化佐剂。结晶亦可用于纯化佐剂。在一些情形下,因自合成直接获得分析纯产物而无需纯化。
本发明疫苗组合物系根据已知用以制造佐剂化组合物之技术在适当无菌条件下通过将佐剂与PPV5B蛋白或肽进行物理混合来制备。因缀合物上存在可被静电吸引至存于长链烷基化合物佐剂上之正电荷之净负电荷而促进PPV5B蛋白或肽与佐剂复合。
D.生理学上可接受之媒剂
可使用与用于其它医药多肽组合物之技术相似之技术调配本发明疫苗组合物。因此,佐剂及PPV5B蛋白或肽(较佳缀合至载剂分子及/或与佐剂混合)可以冻干形式储存且在施用前在生理学上可接受之媒剂中重构以形成悬浮液。另一选择为,可将佐剂及缀合物储存于媒剂中。较佳媒剂系无菌溶液,具体而言,无菌缓冲溶液,例如磷酸盐缓冲盐水。任一将佐剂及缀合物组合于媒剂中以达成免疫原性组合物改良之免疫效力的方法皆系适当的。
本发明疫苗之单一剂量体积可变化,但通常将在习用疫苗之常用范围内。在上文所说明缀合物及佐剂之浓度下,单一剂量之体积较佳介于约0.1ml与约3ml之间,较佳地介于约0.2ml与约1.5ml之间,更佳地约1.0ml。
本发明疫苗组合物可通过任何习用方式施用。
E.制剂
包含偶合至载剂分子之PPV5B蛋白或肽之免疫原性缀合物可用作对抗一或多种PPV5B血清型之免疫用疫苗。包含该免疫原性缀合物于生理学上可接受之媒剂中之疫苗可用于免疫动物、较佳地猪以治疗或预防PPV5B之感染之方法中。
利用免疫原性缀合物经免疫产生之对抗本发明免疫原性缀合物之抗体可用于被动免疫疗法及产生用于治疗或预防PPV5B感染之抗独特型抗体。
施用组合物之对象较佳系动物,包括但不限于母牛、马、绵羊、猪、家禽(例如,鸡)、山羊、猫、犬、仓鼠、小鼠及大鼠;最佳系猪。
本发明制剂包含有效免疫量之一或多种免疫原性组合物或对其之抗体及生理学上可接受之媒剂。疫苗包含有效免疫量之一或多种免疫原性组合物及生理学上可接受之媒剂。该制剂应适合施用模式。
免疫原性组合物视需要亦可含有少量润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。免疫原性组合物可为液体溶液、悬浮液、乳液、锭剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末。口服制剂可包括标准载剂,例如医药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
F.有效剂量
本文所述化合物可以治疗有效剂量施用对象以治疗PPV5B相关疾病。剂量将取决于接受疫苗之宿主以及诸如宿主之体型、体重及年龄等因素。
用于制剂中之本发明之免疫原性缀合物或抗体之精确量将取决于施用途径及对象性质(例如,物种、年龄、大小、疾病之阶段/程度),且应根据医师之判断及每一对象之情况根据标准临床技术决定。有效免疫量即足以治疗或预防对象之PPV5B传染性疾病之量。有效剂量亦可自源自动物模型测试系统之剂量-反应曲线外推且可自0.1mg/kg至20mg/kg、较佳地1mg/kg至10mg/kg变化。
组合物之免疫原性可通过利用任一业内已知免疫分析监测测试对象在用该组合物免疫后之免疫反应来测定。体液(抗体)反应及/或细胞介导之免疫性之产生可视为免疫反应之指示。测试对象可包括动物,例如猪、小鼠、仓鼠、犬、猫、兔、母牛、马、绵羊及家禽(例如鸡、鸭、鹅及火鸡)。
测试对象之免疫反应可通过诸如以下各种方法来分析:所得免疫血清对该免疫原性缀合物之反应性,如通过(例如)酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀等已知技术来分析;或保护经免疫宿主免于感染该病原体及/或减轻经免疫宿主中由感染该病原体导致之症状,如通过任一业内已知用于分析传染性致病因子之含量之方法(例如,定量PCR、病毒分离或其它业内已知技术)来测定。该传染性致病因子之含量亦可通过量测该免疫球蛋白所针对之抗原之量来测定。该传染性致病因子之量降低或该传染性疾病之症状改善指示该组合物有效。
可于在体内用于动物之前在体外测试本发明治疗剂之预期治疗或预防活性。例如,可用于确定指示是否施用具体治疗剂之体外分析包括体外细胞培养分析,其中将来自细胞系或自患有特定疾病或病症之对象培养之细胞之适当细胞暴露于或经其它方式施用治疗剂,并观察该治疗剂对细胞之影响。
另一选择为,可通过以下方式来分析该治疗剂:使该治疗剂接触易患由该传染性致病因子导致之感染但感染该传染性致病因子之细胞(自对象培养或来自经培养细胞系),将该等细胞暴露于该传染性致病因子,且然后确定与该治疗剂接触之细胞之感染率是否低于未与该治疗剂接触之细胞之感染率。可通过任一业内已知方法来分析传染性致病因子对细胞之感染。
另外,可通过在疗法之前、期间或之后以适宜时间间隔在动物模型对象中量测抗体所针对之分子之量来评价该治疗剂。可鉴定出该分子之量之任何变化或无变化并与该治疗对对象之影响关联。可通过任一业内已知方法来测定该分子之量。
在使用本发明之方法及组合物对动物接种PPV5B后,可使用任一业内已知结合分析来评估所得抗体与特定分子间之结合。亦可实施该等分析来选择对特定抗原展示更高亲和性或特异性之抗体。
G.检测及诊断方法
本发明之抗体或其结合部分(利用天然PPV5B得到)、减毒病毒、蛋白质或肽可用于检测样品中PPV5B之存在。此检测方法包含以下步骤:提供对抗本发明之天然PPV5B、减毒病毒、蛋白质或肽而产生之经分离抗体或其结合部分,向该经分离抗体或其结合部分中添加疑似含有一定量PPV5B病毒之样品,及检测包含与PPV5B病毒结合之该经分离抗体或其结合部分之复合物之存在。
本发明之抗体或其结合部分亦可用于检测样品中PPV5B蛋白或肽之存在。此检测方法包含以下步骤:提供对抗天然PPV5B、减毒病毒、蛋白质或肽而产生之经分离抗体或其结合部分,向该经分离抗体或其结合部分中添加疑似含有一定量PPV5B蛋白或肽之样品,及检测包含与该PPV5B蛋白或肽结合之该经分离抗体或其结合部分之复合物之存在。
结合作为结合对成员之特异性分子之免疫球蛋白、尤其抗体(及其功能性活性片段)可用作诊断学及预测学,如本文所述。在各实施例中,本发明提供结合对成员之量测值,并将该等量测值用于临床应用中。本发明中之免疫球蛋白可用于例如检测生物样品中之抗原,藉此可测试对象之与免疫球蛋白结合之分子之偏离量及/或该等分子之异常形式之存在。“偏离量”意指在来自身体某一部分或来自未患该疾病之对象之类似样品中相对于当前值或代表当前值之标准量增加或减小。本发明抗体亦可作为试剂包括在用于诊断或预后技术之试剂盒中。
在一方面中,与天然PPV5B或减毒病毒、蛋白质或肽免疫特异性结合之本发明抗体可用于诊断、预测或筛选PPV5B感染。
在另一方面中,本发明提供诊断或筛选PPV5B感染或对其之免疫性之存在之方法,其包含在对象中量测抗体与来源于该对象之样品之免疫特异性结合之程度,其中该抗体免疫特异性结合PPV5B蛋白或肽,其中该免疫特异性结合之程度相对于来自不具有该传染性致病因子之对象之类似样品中之该免疫特异性结合之程度增加指示PPV5B之存在。
适于检测PPV5B肽或其拮抗剂之存在之分析之实例包括但不限于ELISA、放射免疫分析、凝胶扩散沉淀反应分析、免疫扩散分析、凝集分析、荧光免疫分析、蛋白A免疫分析或免疫电泳分析。
用于特定分子之免疫分析将通常包含在以可检测方式标记之抗体存在下培育样品(例如生物流体、组织提取物、刚刚收获之细胞或经培养细胞之裂解物)及通过业内熟知多种技术中之任一者检测该经结合抗体。
可根据熟知方法来测定给定抗体之结合活性。熟习此项技术者通过采用常规实验将能够确定各测定之有效最佳分析条件。
本发明之另一方面关于用于检测或量测PPV5B之诊断试剂盒。提供用于诊断用途之试剂盒,其于一或多个容器中包含抗-PPV5B抗体及视情况该抗体之经标记结合配偶体。另一选择为,可对抗-PPV5B抗体进行标记(用可检测之标记物,例如,化学发光、酶性、荧光或放射性部分)。因此,本发明提供包含抗-PPV5B抗体及对照免疫球蛋白之诊断试剂盒。在具体实施例中,该容器中之一种上述化合物可以可检测方式标记。试剂盒视情况可进一步于容器中包含预定量之由该试剂盒之抗体识别之PPV5B病毒、蛋白质或肽用作标准品或对照。
H.向对象之施用
施用途径包括但不限于鼻内、经口(例如,于饮用水中)、真皮内及肌内。肌内施用尤佳。熟习此项技术者应认识到,本发明组合物亦可以一次、两次或更多次剂量以及通过其它施用途径来施用。例如,该等其它途径包括皮下、皮内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜腔内、鞘内、气管内、心脏内、肺叶内(intralobally)、髓内、肺内或阴道内。根据治疗所期望之持续时间及效力而定,本发明组合物可施用一次或数次,亦可间歇施用,例如以每日计施用数天、数周或数月且以不同剂量。
本发明包括下列实例以展示本发明之较佳实施例。熟习此项技术者应了解,下列实例中揭示之技术代表本发明者发现可良好用于实施本发明之技术,且因此可认为该等技术系实施本发明之较佳方式。然而,熟习此项技术者借助于本揭示内容应了解,可在不背离本发明之精神及范围之情况下对所揭示具体实施例作出多种改变且仍获得相同或相似结果。
本申请案与2012年12月17日提出申请之标题为“猪细胞病毒5A、使用方法和疫苗”之美国第61/738,110号申请案相关,该申请案之全部内容以引用方式并入本文中。
实例
材料及方法
材料来源:自罕见爆发调查接收来自3只猪之组织匀浆。农场之病史系200lb猪患有全身肌肉震颤,该疾病在休息时存在但在运动期间加剧。在兽医诊断实验室进行广泛测试后,将样品提供本给发明者以帮助测定该等动物中CNS体征之潜在原因,该广泛测试表明为病毒因子(基于微细损伤),但仅鉴定为因子X(非典型猪瘟病毒相关瘟病毒)。
DNA及蛋白质分析:使用购自454Life Sciences(Branford CT)之高通量测序法(“454技术”)来实施受侵袭猪样品之DNA分析,此系由Operon(Huntsville AL)实施。藉助用核酸酶处理病毒粒子保护之核酸,随后进行提取、随机扩增及高通量测序使样品富含病毒序列;通常如Victoria等人PLoSpathogen 2008年9月26日;4(9):e1000163中所述实施。
所得序列最初通过BLASTx分析表征为细小病毒科之分枝成员。使用Sequencher软件来组装序列,且该等DNA分析联合靶向序列之结果产生SEQ ID NO:1之DNA序列,其系命名为PPV5B之病毒之推定完整编码序列。使用Sequencher软件对该DNA序列之进一步分析鉴定出三个推定编码区,该等区对应于那些于其它细小病毒物种中发现者,包括病毒复制酶(SEQ ID NO:2)、开放阅读框“ORF3”(SEQ ID NO:3)及病毒衣壳蛋白(SEQID NO:4)。
实例1:新颖病毒之鉴定
在2只来自不同州之不相关猪之肺匀浆样品中通过454技术(病毒宏基因组学)来鉴定DNA序列。BLASTn及BLASTx分析揭示与猪细小病毒4之相同性最接近,其中在复制酶基因(REP)之保守区中核苷酸相同性之最大值为67%,而在该核苷酸量下衣壳(CAP)编码区未展示可辨别之匹配。在该蛋白质量下,推定复制酶蛋白在衣壳蛋白中展示约60%氨基酸相同性及约50%相同性。将该病毒命名为新物种猪细小病毒5B(PPV5B)。基于衣壳编码序列研发特异性引物且组织及病理学/临床特性相似之匀浆之基于PCR之筛选揭示在约16%样品中存在该病毒因子。基于所报告临床体征及与所筛选组织相关之病毒学数据,观察到与若干其它病毒因子及临床病理学/组织病理学统计学上显著相关。
实例2:PPV5B作为新颖细小病毒之鉴定及谱系分析
多种已知病毒属之推定复制酶(REP)及衣壳(VP1/CAP)蛋白二者之逐对氨基酸相同性显示于图5中。PPV5B与PPV4之序列相同性相对最接近,其中REP及CAP(分别为约90%/65%)支持将PPV5B作为新物种命名。
谱系分析(图6)揭示,基于CAP蛋白之保守区,该病毒为细小病毒科和细小病毒属中之新颖物种。使用更保守REP蛋白序列(未显示)达成相似结果。
实例3:PPV5B作为疾病之致病因子之证实
使用受PPV5B感染之CDCD猪之脑匀浆来接种剖腹分娩且未食初乳(CDCD)之动物以试图扩增病毒并确定是否与该等新颖细小病毒及PRRSV共感染导致临床呼吸体征增加。在此研究中,在用含有该等新颖细小病毒之组织匀浆接种之群组中存在意外高死亡率数值(20%至22%)且使用靶向衣壳编码区之PPV5B特异性PCR在血清中鉴定出高效价PPV5B。然后使用来自此研究中之一只动物之组织来攻击CDCD猪以再现临床体征。在此研究中,在大多数受感染动物中注意到伴有高效价病毒血症之全身性感染。在接受含有PPV5B之接种物之群组中,存在死亡率之高发生率(20%)、跛行、平均每日增重降低、发热及大体损伤及微细损伤二者。
实例4:PPV5B之培养、分离及纯化
使用无菌研钵及研杵将PCR阳性组织(例如脾、脑、肺、肠等)之小切片研碎。将经研磨组织再悬浮于5-10ml含有HEPES缓冲液及抗生素之经改良EMEM中并纯化以消除较大组织块。收集上清液并使其连续地通过多个过滤器以消除包括细菌在内之大多数较大粒子。另外,亦通过连续过滤处理来自PCR阳性动物之粪便样品悬浮液及血清以分离病毒。
将滤液之稀释液用胰蛋白酶处理或保持未处理并在特定温度下吸附至存于6孔板中之已建立细胞培养物及原代细胞培养物(下文所列示)上。抽吸出接种液并用2ml新鲜维持培养基替代。然后在33℃至37℃下在5%CO2气氛中培育板并每日观察与模拟(普通培养基)接种之对照相比之细胞病变效应,例如细胞变圆、细胞融合、脱落、细胞簇聚等。通过PCR筛选可能之阳性孔用于病毒生长/分离。
所建立可用于病毒分离之细胞系尤其包括:ST(猪睪丸)、SK6(猪肾)、BHK-21(幼仓鼠肾)、VIDO R1(胎猪视网膜)、PK-15NADC(猪肾)、PK/WRL(猪肾)、HRT-180(人类结肠直肠腺癌)、Hep2(人类上皮)、Vero(非洲绿猴肾)及RK-13(兔肾)。
可用于该制程之原代细胞培养物尤其包括:胚胎猪肺、肾、睪丸、气管及肠培养物。
当分离出病毒时,通过多轮噬斑纯化或限数稀释法将其纯化并以更大量扩增并产生用于动物实验之储备培养物。
实例5:灭活病毒及疫苗之制备
在约35℃至39℃之间且在2mM至15mM BEI存在下、仍更佳在约10mM BEI存在下实施灭活。实施灭活至少24小时、至多24小时至72小时。然后添加等效量之中和溶液中灭活剂之试剂;例如,等效量之硫代硫酸钠。灭活病毒制剂系根据业内已知方法制备,例如,如Preuss,T.等人,Comparison of Two Different Methods for Inactivation of Viruses in Serum,CLINICAL AND DIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY,(1997),504-508或Bahnemann,H.G.,Inactivation of viral antigens for vaccinepreparation with particular reference to the application of binary ethylenimine,VACCINE,(1990),299-303中所揭示。在制备灭活病毒后,将该物质与载剂制剂组合用于最终疫苗制剂。
实例6:减毒病毒及疫苗之制备
减毒病毒制剂系根据业内已知方法制备,例如,如Vaccine Protocols,第2版;Robinson、Husdon、Cranage编辑,Humana Press 2003中所揭示。例如,“…使野生型病毒在组织培养物/动物宿主中广泛地传代直至在毒力损失与免疫原性保留之间达到可接受之平衡…”。
通过多轮噬斑纯化或限数稀释法来纯化减毒病毒。使用PCR分析、深度测序或免疫荧光分析来测定该培养物质之特异性。
通过将经纯化减毒病毒制剂与载剂制剂组合来制备减毒病毒疫苗。
实例7:包含衣壳蛋白之亚单位疫苗之制备
SEQ ID NO:4之衣壳蛋白系通过使经克隆的SEQ ID NO:4或其片段在各种蛋白质表达系统中表达来制备。
杆状病毒表达:通常根据Kost等人(6),2012中所揭示方法使SEQ IDNO:4之PPV5B衣壳蛋白在杆状病毒表达系统中表达。在初次纯化后在不溶部分中发现少量该蛋白。增加产率及溶解度之方法包括但不限于使用替代缓冲条件(例如脲或胍盐酸盐)、替代结合及纯化条件(例如钴或镍亲和性管柱、阴离子或阳离子交换管柱)、或替代表达条件(例如温度、时间、替代细胞系)。
细菌表达:通常根据EMD Chemicals公司,Novagen User ProtocolTB184中所揭示方法使SEQ ID NO:4之PPV5B衣壳蛋白在细菌表达系统中表达。此方法包括添加包含于细菌载体中之固有HIS标签(EMD Chemicals公司,2011(7))以促进所制造蛋白质之纯化。通常根据GE Healthcare,2012(8)中所揭示方法来纯化用细菌表达之HIS标示之衣壳蛋白且所得产物用来产生PPV5B特异性抗体,如实例8中所述。
通过将经纯化衣壳蛋白制剂与载剂制剂组合来制备减毒亚单位疫苗。
实例8:与PPV5B特异性结合之抗体之制备
通过用PPV5B病毒之抗原性制剂、或衣壳(SEQ ID NO:4)蛋白或其片段之亚单位蛋白制剂免疫兔来制备与PPV5B特异性结合之抗体。针对与PPV5B抗原结合之多克隆抗体筛选来自经接种兔之血清样品。将来自确定对该抗原产生抗体之经接种小鼠之脾与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。然后针对与PPV5B抗原之结合筛选杂交瘤。
多克隆抗体:在客制化抗体制备服务(Rockland Antibodies and Assays;Gilbertsville,PA)下使用根据实例7制备之HIS标示之用细菌表达之衣壳蛋白来免疫2只新西兰白兔。在D0、D7、D14及D28用约100μg抗原/兔免疫兔。对于D0及D7接种,动物系真皮内接种;在D14及28给与之接种系皮下施用。在首次接种中使用费氏完全佐剂(Complete Freund’s adjuvant);在后续接种中使用费氏不完全佐剂(incomplete Freud’s adjuvant)。在免疫前及免疫后38天及45天收集来自该两只兔之血清样品。
由Rockland Antibodies and Assays针对抗-PPV5B特异性筛选多克隆抗体制剂。通过免疫荧光分析(IFA)、西方墨点法(western blot)及酶联免疫吸附分析(ELISA)来制备对经纯化或经部分地纯化之PPV5B蛋白具有结合特异性之抗体。各分析之特异性参数如下:西方墨点法特异性系通过检测预计79.0kDa大小之蛋白质来量测,IFA特异性系通过与未受感染细胞比较来量测,且ELISA特异性系通过用不相关蛋白质包被板来量测。
单克隆抗体:在客制化抗体制备服务(Rockland Antibodies and Assays;Gilbertsville,PA)下在Balb/c小鼠中使用根据实例7制备之HIS标示之经杆状病毒表达之衣壳蛋白来制造单克隆抗体。通过客制化抗体制造设备根据所设计标准方案用各种PPV5B抗原性制剂免疫小鼠。通过客制化抗体制造设备来监测接种后免疫反应并选择抗体候选者用于产生杂交瘤。用于产生单克隆抗体之标准方案为熟习此项技术者所熟知,例如如Gabriele等人(9),第117页至第135页中所揭示。
通过根据标准方案将于杂交瘤培养基中培养至增殖阶段之B细胞肿瘤细胞与自确定对PPV5B抗原产生抗体之经接种小鼠收获之脾细胞组合来产生杂交瘤,如Gabriele等人(9),第117页至第135页所揭示。在对杂交瘤进行融合及培养后,针对与PPV5B抗原之结合筛选杂交瘤,并选择抗-PPV5B产生之杂交瘤。根据标准方案使用亲和性层析来纯化杂交瘤产生之单克隆抗体,如Gabriele等人(9),第209页至第232页中所揭示。
使用该领域熟知之免疫技术(例如ELISA、西方墨点分析及表位作图)来鉴定特异性针对PPV5B之高亲和性抗体并进一步表征,包括测定与其结合之表位、该抗体相对于其它相关病毒物种之特异性及选择对PPV5B病毒抗原具有高特异性之适宜高亲和性抗体(Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris编辑,1996)HumanaPress,Totowa,New Jersey)。
实例9:PPV5B之诊断分析
ELISA分析:使用ELISA程序,使用根据实例8制备之抗体来量测生物样品中之PPV5B。该分析系如下实施:
在包被缓冲液(0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液;pH 9.6)中稀释选自SEQID NO:4之衣壳蛋白之包被抗原(Coating antigen)以达成0.25ng/μl之最终浓度。用50μl/孔包被抗原包被板(高蛋白质结合96孔ELISA板,Phenix目录编号MPG-6061)。将板密封并在37℃下培育1小时或在4℃下过夜。去除包被溶液并将板用200μl/孔PBST(1X PBS+0.05%Tween-20)洗涤3次。用300μl/孔封阻溶液(存于PBS中之0.5%w/v无脂干乳)包被板,密封并在37℃下培育1小时。去除封阻溶液并将板用200μl/孔PBST洗涤3次。将样品以1:100稀释于封阻溶液中;将100μl/孔血清样品添加至板中。将板密封并在37℃下培育1小时。去除血清样品并将板用200μl/孔PBST洗涤3次。将二级抗体(HRP-缀合-山羊抗-猪IgG(H+L);Jackson Immuno-Research114-035-003)于封阻溶液中稀释至1:10,000并用于以100μl/孔包被板。将板密封并在37℃下培育1小时。去除二级抗体并将板用200μl/孔PBST洗涤3次。用50μl/孔TMB(3,5,3’,5’-四甲基联苯胺;KPL目录编号53-00-01)包被板。在室温下在黑暗中将板培育约10分钟。用50μl/孔终止溶液(2MH2SO4;KPL目录编号50-85-04)包被板。在450nm下读取光学密度。
PCR分析:已最佳化PPV5B之基于凝胶之PCR及qPCR分析。该等分析系如下实施:对于qPCR分析,各反应物系通过添加以下试剂来制备:10μl/反应物之2X SsoFast probe supermix(BioRad,目录编号172-5233)、5μl/反应物之经DEPC处理之水、1μl/反应物之6μM浓度正向引物(ACCAGA GAA CAG GCG ACA T:SEQ ID NO:6)、1μl/反应物之6μM浓度反向引物(AAA CAC CTG ATG GGA CCA TAA T:SEQ ID NO:7)、1μl/反应物之4μM浓度探针(6-FAM/ACT CAA CAG CCA GGA CCG AGA ACA CAGGAA/BHQ_1:SEQ ID NO:8)及2μl/反应物之经提取DNA。该反应系在T100热循环仪(Bio-Rad)上实施,在95℃下历经一个循环,持续2分钟,随后在以下两个温度下历经40个循环:95℃持续5秒,随后60℃持续5秒。使用CFX96光学成像系统(Bio-Rad)读取数据。对于基于凝胶之分析,各反应物系通过添加以下试剂来制备:12.5μl/反应物之2X AmpliTaq GoldMastermix(Applied Biosystems,目录编号4302758)、8.0μl/反应物之经DEPC处理之水、1.25μl/反应物之10μM浓度正向引物(CCA GAT TTA CAT TTTGAG CAG CTA ACA CAG TAC:SEQ ID NO:9)、1.25μl/反应物之10μM浓度反向引物(GGA TAT AAG CCC AAA TCT GAG ACT CTA G:SEQ IDNO:10)及2μl/反应物之经提取DNA。该反应系在T100热循环仪(Bio-Rad)上实施,在95℃下历经一个循环,持续5分钟,随后在以下温度下历经40个循环:95℃持续30秒、60℃持续30秒及72℃持续45秒,随后在72℃下最终延长10分钟。
实例10:PPV5B疫苗在猪中之功效评价
为评价包含至少一种PPV5B蛋白或多肽之物质组合物(原型PPV5B疫苗)在猪中之功效,实施随机化研究,该研究使用随机分成三个群组之5周龄未食初乳且剖腹分娩(CDCD)之动物(参见表2)。在研究第0天(D0)及D14用组合物或安慰剂(磷酸盐缓冲盐水;PBS)接种动物。在D28用已知含有PPV5B之物质攻击动物。监测临床观察、直肠温度、体重量测及血液采集。在D56,对动物进行尸检以评价大体损伤。通过在统计学上比较经接种动物与未接种动物之百分比死亡率、病毒血症(效价及持续时间)、血清转化现象(效价及持续时间)及临床体征来测定PPV5B疫苗之功效。
表2
群组编号 |
群组 |
数量 |
房间 |
接种物 |
攻击 |
1 |
PPV5B-Vx |
10 |
1及2 |
PPV5B原型 |
是 |
2 |
PBS-Vx |
10 |
1及2 |
PBS |
是 |
3 |
严格对照 |
5 |
3 |
无 |
否 |
根据本揭示内容无需过多实验即可获得并实施本文所揭示及主张之所有组合物及方法。尽管本发明之组合物及方法已根据较佳实施例予以阐述,但熟习此项技术者应明了,可在不背离本发明之概念、精神及范围之情况下改变该等组合物及方法及本文所述方法之步骤或步骤之顺序。更具体而言,应明了,某些在化学及生理上皆相关之试剂可代替本文所述试剂并同时可达成相同或相似结果。熟习此项技术者显而易见之所有该等相似替代物及修改皆被视为涵盖于随附申请专利范围所界定之本发明之精神、范围及概念内。
参考文献
下列参考文献明确地以引用方式并入本文中,从而提供例示性程序或其它补充本文所阐述者之细节。
(1)Cságola A等人,Detection,prevalence and analysis of emergingporcine parvovirus infections.Arch Virol.Jun;157(6):1003-10(2012)。
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(6)Kost等人,Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors,Trends in Biotechnology,20,173-180,2002年4月,被其它文章引用。
(7)EMD Chemicals公司,2011.Xa/LIC Kits,User Protocol TB184。
(8)GE Healthcare.Recombinant Protein Purification Handbook.18-1142-75。
(9)Gabriele等人(编辑),Antibody Methods and Protocols,Methods inMolecular Biology,2012,第901卷,第7章。