KR20220125121A - 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염 예방을 위한 다가 백신 조성물 - Google Patents
돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염 예방을 위한 다가 백신 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 돼지마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염 예방을 위한 다가 백신 조성물 및 이를 이용한 감염 예방 방법에 대한 것으로, 본 발명에 따른 다가 백신 조성물은 실험동물과 목적동물인 돼지에서 면역반응의 상호 보완 효과를 나타내 항원 간의 간섭현상이 나타나지 않았으며, 돼지에 접종하였을 시 혈청학적인 수준에서 높은 수준의 항체가 및 중화항체가를 유도하였고, PBMC에서 Mhp 또는 PCV2 감작에 대해 높은 수준의 IFN-γ를 생성하였으므로 이를 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염 예방을 위하여 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염 예방을 위한 다가 백신 조성물에 대한 것이다.
돼지 농가의 생산 저하를 야기하는 감염성 질환에 대한 여러 가지 원인 중 마이코플라스마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp), 마이코플라스마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis, Mhr) 및 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2, PCV2)은 가장 위험성이 높은 원인으로 알려져 있다.
마이코플라스마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)는 돼지 호흡기 복합증후군(Porcine respiratory disease complex, PRDC) 및 돼지유행성폐렴(enzootic pneumonia, EP)과 관련된 호흡기병원체이며, 호흡기 섬모세포에 집락화를 시작으로 감염을 일으키므로 돼지 마이코플라스마성 폐렴의 원인균으로 주목받고 있다. 마이코플라스마 하이오뉴모니애는 단일 감염되었을 때는 건성 기침 등의 증상만을 나타내나, 다른 호흡기 병원체와 복합 감염되는 경우 심각한 호흡기 증상을 유발하며 대식세포의 활성을 떨어뜨리고, 다른 병원체의 침입을 방어하는 1차 방어 기능을 상실하게 하는 등 추가 병원균 감염의 위험성을 더욱 증가시킨다.
마이코플라스마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis, Mhr)는 마이코플라스마 하이오뉴모니애에 뒤이어 돼지의 호흡기 전염병에서 새로운 역할을 하는 병원체로 대두되고 있으며, 돼지 생식기호흡기증 바이러스와 혼합 감염으로 병증을 더욱 악화시키는 것으로 보고되어 있다. 또한 마이코플라스마 하이오라이니스는 단독으로도 마이코플라스마 하이오뉴모니애에서 발현되는 마이코플라스마성 병변을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다.
한편 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2, PCV2)은 이유자돈 전신성 소모성 증후군(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)의 원인체로, 감염 돼지는 만성적으로 위축돈이 되고, 피부가 창백하며, 림프절이 커지는 것이 특징이다. 또한 호흡곤란, 만성폐렴 등의 호흡기 증상과 설사, 위궤양과 같은 소화기 증상을 나타내며, 이유자돈에서 높은 폐사율(~50%)을 나타내기 때문에 전세계적으로 높은 경제적 손실을 초래하고 있다. PCV2는 이외에도 다수의 다른 감염을 동반하지만 환경과 유기화합물에 대한 저항성이 매우 강하여 일반적인 소독제에 살균이 되지 않기 때문에 백신 접종만이 유일한 대안으로 알려져 있다.
특히 기존의 상용화 백신은 PCV2a (또는 PCV2b) 유전형 바이러스로 제작되었으나, 2012년 이후부터 새롭게 출현한 PCV2d로 유전형 이동이 발생하였고, 최근에는 PCV2d 유전형이 90% 이상 분리되고 있다. PCV2a 유전형은 PCV2b와 91.4%, PCV2d와 90.4%, PCV2b 유전형은 PCV2d와 93.9%의 염기서열 상동성을 가지는 것으로 알려져있다.
이러한 양돈 농가에 큰 피해를 유발하는 마이코플라스마 하이오뉴모니애, 마이코플라스마 하이오라이니스 또는 돼지 써코바이러스 2형의 감염을 막기 위해 현재 불활화 형태의 단일(single) 또는 다가(multivalent) 백신이 상용화되어 사용되고 있다. 특히 돼지 마이코플라스마성 폐렴 예방에 있어서, 이러한 불활화 백신은 이용될 수 있는 유일한 백신이다. 그러나 상용화된 마이코플라스마 하이오뉴모니애 불활화 백신은 대부분 접종 후 항체를 형성하지 못하고, 임상 증상은 완화시킬 수 있으나 자연 감염균의 전파 및 호흡기 섬모 집락화를 예방할 수 없다는 점에서 기술적 한계점을 나타내고 있다(Maes, et al., 2008). 더불어 다가 백신의 경우 혼합되어 있는 개별 항원이 서로 간섭현상을 일으켜 효능을 감소시킬 수 있는 문제가 있다.
특히 마이코플라스마 하이오뉴모니애, 마이코플라스마 하이오라이니스 및 돼지 써코바이러스 2형은 여러 종류의 아종이 존재하여 이로 인한 간섭현상의 발생 가능성이 매우 높다.
따라서 돼지 마이코플라스마 감염, 특히 마이코플라스마 하이오뉴모니애 및 마이코플라스마 하이오라이니스와 기존에 유행하고 있는 PCV2b 및 최근에 유행하고 있는 돼지 써코바이러스 2d 유전형(PCV2d)을 포함한 PCV2의 자연 감염을 동시에 예방하고 효과적으로 항체를 형성할 수 있도록 하는 새로운 다가 백신 개발이 요구되고 있다.
본 발명자들은 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염 예방을 위한 다가 백신 조성물을 개발하고, 상기 다가 백신 조성물을 접종한 동물모델에서 각 항원에 대해 항체가 우수하게 생성된 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염 예방을 위한 다가 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염 예방 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염에 의한 질환 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (ⅰ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) 균주; (ⅱ) 돼지 마이코플라스마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis, Mhr) 균주; (ⅲ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 유래 재조합 P97 단백질; 및 (ⅳ) 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2, PCV2) 유래 재조합 단백질;을 포함하는, 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염 예방을 위한 다가 백신 조성물을 제공한다.
또한 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 돼지에 접종하는 단계;를 포함하는 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염 예방 방법을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (ⅰ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) 균주; (ⅱ) 돼지 마이코플라스마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis, Mhr) 균주; (ⅲ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 유래 재조합 P97 단백질; 및 (ⅳ) 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2, PCV2) 유래 재조합 단백질;을 포함하는, 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염에 의한 질환 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 Mhp+Mhr+재조합 P97 단백질+재조합 PCV2 캡시드 항원 조합의 다가 백신 조성물은 실험동물과 목적동물인 돼지에서 면역반응의 상호 보완 효과를 나타내 항원 간의 간섭현상이 나타나지 않았으며, 돼지에 접종하였을 시 혈청학적인 수준에서 각 항원에 대한 높은 수준의 항체가 및 중화항체가가 유도되었고, 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)에서 Mhp 또는 PCV2 감작에 대해 높은 수준의 인터페론 감마(interferon-gamma, IFN-γ)를 생성하였으므로 이를 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염 예방을 위하여 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 재조합 PCV2d 캡시드 단백질을 투과전자현미경으로 확인한 결과이다.
도 2는 마우스에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 Mhp에 대한 항체가를 확인한 결과이다.
도 3은 마우스에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 재조합 P97 단백질에 대한 항체가를 확인한 결과이다.
도 4는 마우스에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 Mhr에 대한 항체가를 확인한 결과이다.
도 5는 기니피그에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물 및 PCV2 단독 백신을 접종하고 재조합 PCV2d 캡시드 단백질 항원에 대한 항체가를 확인한 결과이다.
도 6은 기니피그에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물 및 PCV2 단독 백신을 접종하고 PCV2b에 대한 중화항체가를 확인한 결과이다.
도 7은 기니피그에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물 및 PCV2 단독 백신을 접종하고 PCV2d에 대한 중화항체가를 확인한 결과이다.
도 8은 돼지에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 Mhp에 대한 항체가를 확인한 결과이다.
도 9는 돼지에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 재조합 P97 단백질에 대한 항체가를 확인한 결과이다.
도 10은 돼지에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 Mhr에 대한 항체가를 확인한 결과이다.
도 11은 돼지에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 Mhp 감작에 따른 인터페론 감마(interferon-gamma, IFN-γ) 분비를 확인한 결과이다.
도 12는 돼지에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 PCV2 감작에 따른 IFN-γ의 분비를 확인한 결과이다.
도 2는 마우스에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 Mhp에 대한 항체가를 확인한 결과이다.
도 3은 마우스에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 재조합 P97 단백질에 대한 항체가를 확인한 결과이다.
도 4는 마우스에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 Mhr에 대한 항체가를 확인한 결과이다.
도 5는 기니피그에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물 및 PCV2 단독 백신을 접종하고 재조합 PCV2d 캡시드 단백질 항원에 대한 항체가를 확인한 결과이다.
도 6은 기니피그에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물 및 PCV2 단독 백신을 접종하고 PCV2b에 대한 중화항체가를 확인한 결과이다.
도 7은 기니피그에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물 및 PCV2 단독 백신을 접종하고 PCV2d에 대한 중화항체가를 확인한 결과이다.
도 8은 돼지에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 Mhp에 대한 항체가를 확인한 결과이다.
도 9는 돼지에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 재조합 P97 단백질에 대한 항체가를 확인한 결과이다.
도 10은 돼지에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 Mhr에 대한 항체가를 확인한 결과이다.
도 11은 돼지에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 Mhp 감작에 따른 인터페론 감마(interferon-gamma, IFN-γ) 분비를 확인한 결과이다.
도 12는 돼지에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 PCV2 감작에 따른 IFN-γ의 분비를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 (ⅰ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) 균주; (ⅱ) 돼지 마이코플라스마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis, Mhr) 균주; (ⅲ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 유래 재조합 P97 단백질; 및 (ⅳ) 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2, PCV2) 유래 재조합 단백질;을 포함하는, 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염 예방을 위한 다가 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, '백신'은 항원 물질을 포함하는 수의학용 백신으로, Mhp, Mhr 또는 PCV2에 대하여 특이적이고 능동 또는 수동의 면역성을 유도하기 위한 목적으로 투여된다.
한편, 마이코플라스마 하이오뉴모니애의 감염은 병원체가 호흡기 상피세포의 섬모에 부착하면서 개시된다. 부착인자(Adhesin) P97은 마이코플라스마 하이오뉴모니애의 막 표면 단백질로 면역원성이 높은 항원으로 알려져 있다(Klinkert, et al., 1985, Zhang, et al., 1995, Minion, et al., 2000). P97의 C말단에는 반복되는 구간으로 구성된 R1과 R2 부위가 존재하며, 그 중 R1 부위는 숙주 호흡기 섬모의 부착부위(AAKPV/E)에 결합한다. 결합된 마이코플라스마 하이오뉴모니애는 성장에 필요한 아미노산을 숙주로부터 얻을 수 있으며, 상처난 조직에 침입하기 위하여 숙주의 분자들을 다양하게 배열할 수 있게 된다. 한편, 숙주는 항체를 생산하여 돼지 섬모에 마이코플라스마 하이오뉴모니애가 부착하는 것을 방해하거나 부착된 병원체의 성장을 저해할 수 있다. 그러나, 선행 연구에 따르면 기존의 상용 백신은 P97에 대한 항체를 유도할 수 없는 것으로 보고된 바 있다(Conceicao, et al., 2006, Okamba, et al., 2010).
이에 있어 본 발명의 다가 백신 조성물은 재조합 P97 단백질을 포함하여 P97에 대한 항체를 유도할 수 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서, 백신 조성물에 포함되는 상기 재조합 P97 단백질은 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 유래 P97 유전자와 대장균 이열성 엔테로톡신 서브유닛 B(E. coli heat-labile enterotoxin subunit B, eltb) 유전자를 융합하여 제조될 수 있다. 보다 구체적으로, E. coli의 eltb와 마이코플라스마 하이오뉴모니애 P97 유전자의 C-말단 반복 서열인 R1과 R1R2를 융합시키고, LTB와 융합된 P97 유전자인 ltbR1과 ltbR1R2를 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭하여 제조될 수 있다. 상기 재조합 P97 단백질은 하기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
MHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSEFAPQTITELCSEYRNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMVIITFKSGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAISLEGIPTKEGKREEVDKKVKELDNKIKGILPQPPAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVAAKPEAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVATNEGTPNQGKKAEGAPNQGKKAEGAPSQGKKAEGASNQQSPTTELTNYLPELGKKIDEIIKKQGKNWKTEVELIEDNIAGDAKLLYFVLRDDSKSGDPKKSSLKVKITVKQSNNNQELKSK (서열번호 1).
본 발명의 재조합 P97 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또한 바람직하게는 적어도 99%의 상동성을 가지는 폴리펩타이드를 모두 포함할 수 있다. "상동성 (homology)"은 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열들 간 유사도의 측정을 의미한다. 이들 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환을 가질 수 있다. 점수로 매겨진 두 가지 서열들 간 상동성의 정도는 일치도의 퍼센트(percentage of identities) 및/또는 서열의 치환을 보존하는 것에 근거한다.
더불어 상기 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2, PCV2) 유래 재조합 단백질은 하기와 같이 제조할 수 있다. 돼지의 혈청에서 분리한 PCV2d DNA의 ORF2 유전자를 pFastBac1 vector(Gibco, USA)에 삽입하여 재조합 Bacmid DNA를 제조한 후, 이를 ExpiSf9 cell(Gibco)에 트랜스펙션(Transfection)하여 재조합 베큘로바이러스를 제작할 수 있다. 본 발명의 PCV2 유래 재조합 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
MTYPRRRFRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTIGYTVKKTTVRTPSWNVDMMRFNINDFLPPGGGSNPLTVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSTAVILDDNFVTKANALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDRTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTTGNVDHVGLGTAFENSIYDQGYNIRITMYVQFREFNLKDPPLNPK (서열번호 2).
본 발명의 PCV2 유래 재조합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또한 바람직하게는 적어도 99%의 상동성을 가지는 폴리펩타이드를 모두 포함할 수 있다. "상동성 (homology)"은 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열들 간 유사도의 측정을 의미한다. 이들 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환을 가질 수 있다. 점수로 매겨진 두 가지 서열들 간 상동성의 정도는 일치도의 퍼센트(percentage of identities) 및/또는 서열의 치환을 보존하는 것에 근거한다.
본 발명의 재조합 단백질들은 백신의 제조에 사용되는 경우, 정제된 단백질 형태로 백신에 첨가되거나 대장균에서 발현하여 정제되지 않은 상태인 용균액 상태로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 다가 백신 조성물에 포함되는 마이코플라스마 하이오뉴모니애 균주 및 돼지 마이코플라스마 하이오라이니스 균주는 각각 또는 모두 불활화된 것을 특징으로 할 수 있으며, 불활화는 당 분야에 공지된 방법을 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 다가 백신 조성물에 있어서, 마이코플라스마 하이오뉴모니애는 1×108 내지 1×109 CCU (Colour-changing units)/mL의 농도로 백신에 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1.5×108 내지 5×108 CCU/mL, 더욱 바람직하게는 2×108 CCU/mL의 농도로 포함될 수 있다. 이 때, 백신 접종량은 2mL인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 다가 백신 조성물에 있어서, 마이코플라스마 하이오라이니스는 1×108 내지 1×109 CCU (Colour-changing units)/mL의 농도로 백신에 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1.5×108 내지 5×108 CCU/mL, 더욱 바람직하게는 2×108 CCU/mL의 농도로 포함될 수 있다. 이 때, 백신 접종량은 2mL인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 다가 백신 조성물에 있어서, 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 유래 재조합 P97 단백질은 10 내지 100 μg/dose의 농도로 백신에 포함될 수 있으며, 바람직하게는 20 내지 50 μg/dose, 더욱 바람직하게는 최소 25 μg/dose의 농도로 포함될 수 있다. 이 때, 백신 접종량은 2mL인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 다가 백신 조성물에 있어서, 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2, PCV2) 유래 재조합 단백질은 0.1 내지 1000 μg/dose의 농도로 백신에 포함될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 30 μg/dose, 더욱 바람직하게는 20 μg/dose의 농도로 포함될 수 있다. 이 때, 백신 접종량은 2mL인 것이 바람직하다.
본 발명의 다가 백신 조성물은 상기 백신의 면역원성을 증진시켜 최소한의 투여로도 보호 면역을 유도할 수 있는 면역강화제로서, 보조제 혼합물 및 하나 이상의 약제학적 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 “약제학적 또는 수의학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 동물에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 사용하기에 적합한 담체로는 식염수, 인산염 완충 식염수, 최소 필수 배지(MEM) 또는 HEPES 완충액의 MEM을 포함하는 수성 매질을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 안전성 및 면역지속성을 고려하여 IMS 계열 부형제인 IMS1313을 사용하였다.
더불어 본 발명의 다가 백신 조성물은 백신 조성물을 구성하는데 적절한 하나 이상의 면역증강제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 면역증강제는 주사한 동물의 면역 반응을 증대시키는 물질을 의미하는 것으로, 다수의 상이한 면역증강제가 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 상기 면역증강제는 프로인트 완전 및 불완전 면역 증강제, 비타민 E, 비이온성 차단 폴리머, 뮤라밀디펩티드, Quil A, 광유 및 무광물유 및 카보폴(Carbopol), 유중수형 유제 면역증강제 등을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다가 백신 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 본 발명의 다가 백신 조성물은 근육, 피하, 경피, 정맥, 비강내, 복강내 또는 경구 경로로 투여될 수 있고 바람직하게는 근육내 또는 피하 경로로 투여될 수 있다. 백신의 투여량은 투여 경로, 동물의 연령, 성별, 체중 및 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 다가 백신 조성물은 재조합 단백질 P97 및 PCV2 유래 재조합 단백질의 제조와 같이 본 발명에 특이적인 방법을 제외하고는 당해 기술 분야의 표준 방법에 의해 제조될 수 있다. 가령, 유기체는 완전 배지와 같은 배양 배지에서 증식시킬 수 있고, 유기체의 증식은 색 변화 단위(CCU)를 측정하는 것과 같은 표준 기술로 모니터하고 충분히 높은 역가가 성취된 경우 수거될 수 있다. 스톡(stock)은 제형화를 위해 백신에 포함되기 전에 통상적인 방법에 의해 추가로 농축되거나 동결건조시킬 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 돼지에 접종하는 단계;를 포함하는 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염 예방 방법을 제공한다.
상기 돼지는 마이코플라스마 및/또는 돼지 써코바이러스에 감염될 가능성이 있는 개체를 제한없이 포함할 수 있으며, 이와 같은 감염 예방 방법은 다른 당 분야에 공지된 치료 방법 또는 예방 방법과 함께 병행하여 이용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "접종"은 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 다가 백신 조성물은 1 내지 5주령에 1회 접종을 실시할 수 있고, 보다 바람직하게는 3주령에 1회 접종을 실시할 수 있다.
본 발명의 예방 방법은 돼지에 있어 상기 돼지 마이코플라스마균 및/또는 돼지 써코바이러스에 의해서 야기될 수 있는 감염성 질환의 발병을 예방하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 (ⅰ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) 균주; (ⅱ) 돼지 마이코플라스마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis, Mhr) 균주; (ⅲ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 유래 재조합 P97 단백질; 및 (ⅳ) 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2, PCV2) 유래 재조합 단백질;을 포함하는, 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염에 의한 질환 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염에 의한 질환은 돼지 호흡기 복합증후군(Porcine Respiratory Disease Complex, PRDC), 돼지유행성폐렴(enzootic pneumonia, EP), 이유자돈 전신성 소모성 증후군 (postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS), 돼지 피부염 신부전 증후군(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS), 모돈유산 폐사 증후군(sow abortion and mortality syndrome, SAMS), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS), 가성 광견병 (pseudorabies), 글래서병 (Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염(streptococcal meningitis), 살모넬라증(salmonellosis), 이유후 대장균증(postweaning colibacillosis), 식이성 간증 (dietetic hepatosis), 화농성 기관지폐렴(suppurative bronchopneumonia), 유스타키오관(Eustachian tube) 염증, 다발성 장막염(polyserositis), 마이코플라스마성 폐렴 및 흉막 폐렴으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 바람직하다.
경구 투여의 경우, 구강 내 투여를 포함하며, 본 발명의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제를 포함하여 경구적으로 허용되는 어떠한 형태로도 경구 투여될 수 있다.
경구용 정제의 경우, 흔히 사용되는 담체로는 락토즈 및 옥수수 전분이 포함된다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐형으로 경구 투여하는 경우 유용한 희석제로는 락토즈 및 건조된 옥수수 전분이 포함된다. 수성 현탁액이 경구 투여될 때 활성 성분은 유화제 및 현탁화제와 배합된다. 필요한 경우, 감미제 및/또는 풍미제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다.
구강 내 투여를 위한 약학적 조성물은 고체상의 부형제와 함께 활성 성분을 혼합함으로써 제조할 수 있으며 정제 또는 당의정 형태로 제조하기 위해 과립형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제로는 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소비톨과 같은 슈가 형태 또는 옥수수, 밀가루, 쌀, 감자 또는 다른 식물로부터 전분, 메틸 셀룰로스, 하이드로시프로필메틸-셀룰로스 또는 나트륨 카복시메틸세룰로스와 같은 셀룰로스, 아라빅 검, 타가칸쓰 검을 포함하는 검류와 같은 카보하이드레이트 또는 젤라틴, 콜라겐과 같은 단백질 필러를 사용할 수 있다. 필요한 경우에는, 교차결합된 폴리비닐피롤리돈, 아가 및 알긴산 또는 나트륨 알긴산과 같은 각각의 염 형태의 붕해제 또는 용해제를 첨가할 수 있다.
본 발명에 있어서, “비경구”는 피하, 피내, 정맥 내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서, 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사용액 또는 현탁액(예, 1,3-부탄디올중의 용액)일 수 있다. 허용적으로 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링겔 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 불휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 어떠한 불휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약제학적으로 허용되는 천연 오일(예, 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 것과 마찬가지로 주사 제제에 유용하다. 더불어 비경구적 투여의 경우 본 발명의 약학적 조성물은 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액 (Hank's solution), 링거 용액 (Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 물리적으로 적절한 완충용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입 (injection) 현탁액은 소디움 카복시메틸 셀루로스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성 성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액 (oily injection suspensions)으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수 양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 본 발명의 (ⅰ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) 균주; (ⅱ) 돼지 마이코플라스마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis, Mhr) 균주; (ⅲ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 유래 재조합 P97 단백질; 및 (ⅳ) 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2, PCV2) 유래 재조합 단백질을 혼합한 혼합물과, 실온에서 고형이지만 직장 온도에서는 액상인 적합한 비자극성 부형제를 혼합하여 제조할 수 있다. 이러한 물질로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물을 피부에 국소적으로 적용하는 경우, 상기 약학적 조성물은 담체에 현탁 또는 용해된 활성 성분을 함유한 적합한 연고로 제형되어야 한다. 본 발명의 (ⅰ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) 균주; (ⅱ) 돼지 마이코플라스마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis, Mhr) 균주; (ⅲ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 유래 재조합 P97 단백질; 및 (ⅳ) 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2, PCV2) 유래 재조합 단백질을 혼합한 혼합물을 국소 투여하기 위한 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 광유, 유동 파라핀, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물이 포함된다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 담체에 현탁 또는 용해된 활성 화합물을 함유한 적합한 로션 또는 크림으로 제형될 수 있다. 적합한 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 광유, 솔비탄 모노스테아레이트, 폴리솔베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알코올 및 물이 포함된다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 좌제에 의해 또한 적합한 관장제로 하부 장관으로 국소 적용할 수 있다. 국소 적용된 경피 패치가 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물은 비내 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 약제의 분야에 잘 알려진 기술에 따라 제조하며 벤질알코올 또는 다른 적합한 보존제, 생체이용률을 증가시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 기타 본 분야에 알려진 가용화제 또는 분산제를 사용하여 염수중의 용액으로서 제조할 수 있다.
특정 환자에 대한 특정 유효량은 사용된 (ⅰ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) 균주; (ⅱ) 돼지 마이코플라스마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis, Mhr) 균주; (ⅲ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 유래 재조합 P97 단백질; 및 (ⅳ) 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2, PCV2) 유래 재조합 단백질을 혼합한 혼합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 규정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 변할 수 있다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 다가 백신 조성물의 항원 제작
1-1. 마이코플라스마 하이오뉴모니애 불활화 항원의 제작
마이코플라스마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae, 이하 Mhp)와 마이코플라스마 하이오라이니스 (Mycoplasma hyorhinis, 이하 Mhr) 균주를 돼지의 마이코플라스마성 폐병변을 나타내는 폐에서 분리하였고, PCR을 이용하여 각 균주를 동정하였다.
분리한 Mhp와 Mhr 균주는 Friis’ 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃의 조건에서 3일간 배양하였다. 단백질 패턴 분석과 다형성 DNA의 무작위 증폭 (Random amplification of polymorphic DNA, RAPD) 분석을 통하여 분리된 균주 (Mhp HID3134, HID3140, HID3138, Mhr HID3224)를 확인하였다. 3일간 배양된 균액은 대략 0.1 ~ 5.0 × 109 CCU/mL의 세균 수를 보유하였다. 배양된 균액은 pH를 약 7.8로 맞춘 후 BEI(Binary ethyleneimine (미국등록특허 US 5,565,205 참고))와 같은 불활화 시약을 이용하여 최종 4 mM의 농도로 20 ~ 24시간동안 균의 불활화를 진행하였다. BEI는 배양액에 BEA(L-bromoethylaminehydrobromide (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA))를 첨가하여 제조하였다. 그 후 중화 시약인 티오황산나트륨(sodium thiosulfate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA))을 최종 16 mM의 농도로 혼합하여 20~24시간동안 중화시키고 불활화된 배양액 일부를 새 배지에 첨가하여 37℃에서 최소 일주일간 배양하며 불활화되었는지 확인하였다. 불활화된 배양액은 원심분리법으로 농축하여 백신 항원으로 사용하였다.
1-2. 재조합 Mhp P97 단백질 항원의 제작
재조합 P97 단백질은 마이코플라스마 하이오뉴모니애의 P97 유전자에 eltb 유전자를 융합한 후 pET-30a(+) (Novagen, USA) 발현 시스템을 이용하여 제작하였다. 요약하면, E. coli BL21 codon-plus RIL competent cell (Novagen)에 열충격을 이용하여 재조합 플라스미드로 형질전환시킨 후 50 μg/mL 카나마이신 (Kanamicin)이 첨가된 1L의 LB(Luria-Bertani) 배지에서 배양하였다. 그 후, 1 mM의 IPTG(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside)를 혼합하여 20시간 동안 단백질 발현을 유도한 후 파쇄하고 원심분리하여 상층액에서 재조합 단백질이 포함된 용균액을 얻었다.
수득한 단백질 항원은 하기 2가지 방법으로 정제하였다. 첫 번째로, 재조합 단백질이 포함된 용균액을 Ni-NTA 컬럼에 친화력을 이용하여 결합시킨 후 정제버퍼(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl)로 5CV(컬럼 레진 용량(Column resin volume)의 5배)만큼 세척하여 결합하지 않은 단백질을 제거하였다. 이후 40mM의 이미다졸(Imidazole)이 포함된 정제버퍼로 5CV만큼 비특이적 결합한 단백질을 제거하였고, 400mM의 이미다졸이 포함된 정제버퍼로 재조합 P97 단백질 항원을 용출하여 회수하였다. 회수한 단백질은 용량에 따라 여과하여 농축하였다. 정제된 단백질 항원은 BCA(Bicinchoninic acid) 방법으로 정량하였고, SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) 방법으로 순도를 확인하였다.
두 번째로, 재조합 단백질이 포함된 용균액의 pH를 6.0로 적정하고 약 2시간동안 교반하여 반응시켰다. 이후 원심분리하여 단백질 항원을 침전시켰고, pH 7.2의 PBS를 첨가하여 단백질을 회수하였다. 정제된 단백질은 BCA 방법으로 정량하였고, SDS-PAGE 방법으로 순도를 확인하였다.
상기와 같이 정제된 재조합 P97 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1에 나타내었다.
1-3. 재조합 PCV2d 캡시드 단백질 항원의 제작
1-3-1. 세포 및 균주 준비
PCV-free PK-15 세포는 10% FBS(fetal bovine serum (GenDEPOT))와 1% 항생제-항진균 용액(antibiotic-antimycotic solution (Gibco))이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium (GenDEPOT, Katy, TX, USA)) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 단백질 발현에 사용한 곤충세포(ExpiSf9, Gibco)는 28℃, rpm 100 조건으로 ExpiSf CD medium (Gibco)을 사용하여 진탕배양하였다.
PCV2d 유전형의 ORF2 염기서열은 2017년 충청남도 논산시에 위치한 양돈농가에서 분리된 PCV2d의 바이러스 DNA를 주형으로 증폭되었으며, PCV2d에 대한 바이러스 중화시험은 PCV2에 감염 판정된 돼지의 림프절과 폐 조직으로부터 PCV2d를 분리 및 계대배양하여 사용하였다.
1-3-2. 재조합 배큘로바이러스의 제작
재조합 배큘로바이러스를 제조업체가 권장하는 사용자 지침에 따라 배큘로바이러스 발현 시스템(Baculovirus Expression System (Gibco))을 사용하여 제작하였다. 요약하면, PCV2d의 ORF2 유전자를 정방향 프라이머 (5'-CGCGGATCCGCCGCCACCATGACGTATCCAAGGAGG-3' (서열번호 3))와 역방향 프라이머 (5'-GGCAAGCTTTCATTTAGGGTTAAGTGG-3' (서열번호 4))를 TOPsimple DyeMIX-Forte (Enzynomics Inc., Daejeon, Korea)와 같이 사용하여 증폭하였다. 증폭한 PCV2 캡시드(PCV2 CP) 유전자를 제한효소인 BamHI과 HindIII(Enzynomics Inc.)로 절단하고, HiYield Gel/PCR DNA Extraction Kit (RBC Bioscience, Taipei, Taiwan)를 사용하여 정제한 후 pFastBac1 (pFB) (Gibco) 베큘로바이러스 벡터에 클로닝하였다. 재조합 pFB-2dCP를 competent Escherichia coli DH10BacTM(Gibco)에 삽입하여 형질전환하고, 염기서열을 분석하였다. 재조합 bacmid DNA는 ExpiFectamine reagent (Gibco)를 이용하여 ExpiSf9 세포에 트랜스펙션을 실시하였다. 이를 28℃, 100 rpm 조건에서 5일간 진탕배양하여 PCV2d ORF2를 발현하는 재조합 베큘로바이러스(Bac-2dCP)를 확보하였다. RibospinTM vRD(GeneAll)를 이용하여 바이러스 DNA를 추출한 후 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)으로 상기 재조합 베큘로바이러스의 역가를 측정한 결과, 1.48 X 1011 copies/mL을 나타냈다.
1-3-3. 발현된 재조합 단백질의 정제
ExpiSf9 세포에 재조합 베큘로바이러스를 감염다중도(Multiplicity of infection, MOI) 5의 농도로 감염시킨 후 배양하였다. 배양 5일에 1,000 xg의 속도로 5분간 원심분리하여 세포를 수확하였다. 발현된 재조합 단백질은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정제하였다. 요약하면 수확한 세포를 50 mM NaH2PO4.2H2O(sodium dihydrogen phosphate dihydrate), 300 mM NaCl(sodium chloride), 1% IGEPAL CA-630(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 포함된 용해버퍼에 재현탁시켰다. 이를 30분동안 얼음에서 반응시킨 뒤 10,000 xg로 10분동안 원심분리하였다. 재조합 단백질이 포함된 상층액을 Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Madison, WI, USA) 이온교환 플랫폼에서 정제한 후 0.22 μm 크기의 필터를 통해 여과하였다. 상기와 같이 정제된 PCV2 유래 재조합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타내었다.
더불어 상기 PCV2 유래 재조합 단백질을 한국 기초과학 연구원 춘천센터에서 투과전자현미경(TEM; JEM-2100F; JEOL, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰한 결과 도 1과 같이, 약 17 nm 직경의 PCV2 바이러스 유사입자(Virus-like particle, VLP)가 형성된 것을 확인하였다.
1-3-4. 재조합 단백질 발현 분석
정제된 재조합 단백질을 12% 겔에 주입하여 SDS-PAGE를 시행하였으며 반건조 이송 기기(semidry transfer apparatus (Bio-Rad, Hercules, CA, USA))를 이용하여 하이본드 폴리비닐피롤리돈 멤브레인(Hybond polyvinylpyrrolidone membrane (Amersham Biosciences, Freiburg, Germany))으로 트랜스퍼하였다. 돼지 항-PCV2 항체(porcine anti-PCV2 antibody (1:500 희석))와 HRP-결합된 염소 항-돼지 IgG 항체(HRP(horseradish peroxidase)-conjugated goat anti-porcine IgG antibody (1:5,000 희석) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA))를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과 약 28kDa의 단백질 밴드를 확인하였다.
1-4. 본 발명에 따른 다가 백신 조성물의 제조
2 x 108 CCU/dose 이상 농도의 상기 실시예 1-1을 통해 제조한 Mhp 및 Mhr 불활화 균주 항원과 상기 실시예 1-2를 통해 제조한 25 μg/dose 이상 농도의 재조합 P97 단백질 항원, 상기 실시예 1-3을 통해 제조한 20μg/dose 농도의 재조합 PCV2d 캡시드 단백질 항원을 2X PBS에 혼합한 후(1mL/dose), 20분 이상 교반하여 혼합하였다. 그런 후, 동일 용량의 보조제(adjuvant (IMS1313, Seppic))를 추가하고 20분 이상 교반하여 다가 백신 조성물을 제조하였다.
실시예 2. 실험 동물 준비
2-1. 마우스 준비
체중 15g의 BALB/c 암컷 마우스 5마리에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물(Mhp+Mhr+재조합 P97 단백질+재조합 PCV2 캡시드 단백질 조합)을 접종하였다. 본 발명에 따른 다가 백신(돼지용량의 1/10두분인 200 μL/dose)을 마우스 양쪽 뒷다리의 허벅지 근육 내로 접종하였다. 혈액 샘플은 접종 후 0, 2, 4, 6주에 수집하여 혈청학적 분석을 위해 -70 ℃에 보관하였다가 실험에 사용하였다.
2-2. 기니피그 준비
체중 300~350g의 기니피그 4마리에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물(Mhp+Mhr+재조합 P97 단백질+재조합 PCV2 캡시드 단백질 조합)을 접종하였다. 더불어 기니피그 4마리에 대조군인 PCV2 단독 백신을 접종하였다. 각각의 실험군 기니피그 뒷다리의 허벅지 근육 내로 각 백신(돼지용량의 1/2두분인 1 mL/dose)을 접종하였다. 혈액 샘플은 접종 후 0, 2, 4, 6주에 수집하여 혈청학적 분석을 위해 -70 ℃에 보관하였다가 실험에 사용하였다.
2-3. 돼지 준비
체중 5~8 Kg의 돼지 5마리에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물 (Mhp+Mhr+재조합 P97 단백질+재조합 PCV2 캡시드 단백질 조합)을 접종하였다. 각 돼지의 목 부위 근육 내로 본 발명에 따른 백신(2 mL/dose)을 접종하였다. 혈액 샘플은 접종 후 0, 4, 9, 14, 17주에 수집하여 혈청학적 분석을 위해 -70 ℃에 보관하였다가 실험에 사용하였다. 또한 사이토카인(cytokine) 분석을 위해 접종 후 0, 4, 9, 14주에 경정맥에서 채혈하여 말초 혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리한 뒤 항원으로 자극하여 형성된 IFN-γ를 분석하였다.
실시예 3. 본 발명에 따른 다가 백신 조성물의 효과 검정 방법
3-1. 효소 결합 면역 흡착분석법(Enzyme-liked immunosorbent assay, ELISA)
본 발명에 따른 다가 백신 조성물의 접종에 따른 혈청학적 분석을 위해 간접효소면역측정법(indirect ELISA)을 수행하였다. 보다 구체적으로 Mhp(마우스에서 확인(재조합 P46 단백질)), 재조합 P97 단백질(돼지 및 마우스에서 확인), PCV2(기니피그 및 돼지에서 확인)에 대한 특이적인 IgG 항체역가를 조사하였다. 요약하면, 재조합 P97 단백질(100ng/well), 재조합 P46 단백질(125ng/well) 또는 재조합 PCV2 캡시드 단백질(100 ng/well)을 각각의 농도로 0.05 M 카보네이트 버퍼(carbonate buffer (pH 9.6))에 희석하여 96-웰 마이크로플레이트(Nunc Maxisorp, Roskilde, Denmark)에 100 μL/well씩 분주한 후 4 ℃에서 16시간동안 코팅하였다. 각 웰은 PBS(phosphate-buffered saline)-T (0.05% Tween 20)으로 3회 세척하고 1% BSA가 첨가된 PBS를 첨가한 후 37℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 그 다음 PBS-T로 3회 세척하고 1:100로 희석한 혈청을 100 μL씩 분주하고 37℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 그 후 PBS-T로 3회 세척하고 플레이트에 HRP-결합된 염소 항-마우스(HRP-conjugated goat anti-mouse (또는 항-기니피그(anti-guinea pig) 또는 항-돼지(anti-pig)) IgG 항체(1:10,000 희석; Bethyl Laboratories)를 분주하고 37 ℃에서 1 시간동안 반응시켰다. 이를 PBS-T로 3회 세척한 후 각 웰에 TMB(3,3',5,5;-tetramethylbenzidine) 기질(TMB One Component HRP Microwell Substrate (Surmodics, Inc., Eden Prairie, MN, USA))을 분주하여 5분 동안 암반응시키고, 2N H2SO4로 반응을 중지시켰다. Epoch 마이크로플레이트 리더기(Epoch microplate reader (BioTek, Winooski, VT, USA))를 사용하여 450nm의 파장에서 각 플레이트의 흡광도(optical density, OD)를 측정하였다.
또한 본 발명에 따른 다가 백신의 접종에 따른 혈청학적 분석을 위해 샌드위치 ELISA(sandwich ELISA)를 수행하여 Mhr P37 단백질(마우스 및 돼지에서 확인)에 특이적인 IgG 항체역가를 조사하였다. 항-P37 IgG(Anti-P37 IgG(capture antibody))를 500 ng/mL의 농도로 카보네이트 버퍼에 희석하고 96 웰 마이크로플레이트의 각 웰에 100 μL/well씩 분주한 후 4 ℃에서 16시간동안 코팅시켰다. 코팅 용액을 제거하고 PBS-T로 3회 세척하고 각 웰에 블로킹 용액(Blocking solution)으로써 10% FBS를 포함하는 PBS-T을 200 μL씩 분주한 후 37 ℃에서 4 시간동안 반응시켰다. 블로킹 용액을 제거하고 0.05% PBST로 3회 세척하였다. 그 후, 재조합 P37 단백질을 500 ng/mL로 블로킹 용액에 희석한 후, 각 웰에 이를 100 μL씩 분주하고 37 ℃에서 1시간동안 재조합 P37 단백질과 항-P37 IgG를 반응시켰다. 그 동안 10% FBS 용액(100 ng E. coli 용해물(lysate)과 함께)에 마우스 또는 돼지 혈청을 1/100로 희석하고, 37℃에서 1시간동안 반응시켜 검사혈청을 준비하였다. 재조합 P37 단백질 용액을 제거하고 0.05% PBS-T로 3회 세척하였다. 검사혈청을 90 μL씩 상기 재조합 P37 단백질과 반응시킨 플레이트의 각 웰에 분주한 뒤 37 ℃에서 1시간동안 반응시켰다. 검사혈청을 제거하고 0.05% PBS-T로 3회 세척하였다. 항-마우스(또는 항-돼지) IgG HRP 결합물(conjugate)을 10% FBS 용액에 1/20,000로 희석하고 이를 100 μL씩 각각의 웰에 넣었다. 37 ℃에서 1 시간동안 반응시킨 후 용액을 제거하고 0.05 % PBS-T로 4회 세척하였다. 그 후 TMB 용액 100 μL씩 각각의 웰에 넣고 상온에서 5분간 암반응시켰다. 정지 용액(Stop solution)을 100 μL씩 각 웰에 분주한 후 즉시 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
더불어 본 발명에 따른 다가 백신의 접종에 따른 혈청학적 분석을 위해 IDEXX사의 MH kit를 사용하여 Mhp(돼지에서 확인)에 특이적인 IgG 항체역가를 조사하였다.
3-2. 바이러스 중화 실험(Virus Neutralization test, VN test)
PCV2 중화항체는 면역형광법(immunofluorescence assay, IFA)을 이용하여 측정하였다. 백신 접종 후 기니피그 또는 돼지의 0, 2, 4, 6주 혈청을 56 ℃에서 30 분 동안 가열하여 비동화시킨 후 DMEM에 2진 연속희석하고 이와 동일한 부피의 PCV2b 또는 PCV2d 바이러스(200 x 50% 조직배양감염량(tissue culture infective dose), TCID50)를 밀도 70-80 %가 되는 PK-15 세포에 접종한 후 5% CO2, 37°에서 배양하였다. 72시간 후에 감염된 세포를 90% 아세톤으로 고정시키고, FITC(fluorescein isothiocyanate)-표지된 항-기니피그(또는 항-돼지) IgG (Bethyl Laboratories)를 첨가하여 반응하였다. 중화항체 역가는 형광현미경 하에 90% 이상의 바이러스 중화를 나타내는 최고 혈청의 희석배수로 결정하였다.
3-3. 인터페론 감마(interferon-gamma, IFN-γ) 측정
돼지에서의 본 발명에 따른 다가 백신 조성물에 대한 세포매개성 면역반응을 평가하기 위해 IFN-γ 분비량을 조사하였다. 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종한 후 0, 4, 9, 14주에 혈액에서 분리한 PBMC에 Mhp 불활화 또는 PCV2 항원으로 감작하여 72시간동안 반응시켰다. 이의 상층액을 분리하여 돼지 IFN-γ ELISA 키트 (Invitrogen, Lofer, Austria)로 제조사의 지침에 따라 IFN-γ 분비량을 측정하였다.
3-4. 통계적 분석
GraphPad Prism 7 software(Graph-Pad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)를 사용하여 데이터를 분석하였고, Dunnett의 다중 비교 분석과 함께 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용해 각 그룹을 비교하여 대조군과의 유의한 차이를 나타냈다. P 값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 4. 마우스에 접종 후 항체가 확인
4-1. Mhp에 대한 항체 형성 확인
돼지 마이코플라스마 백신 검정시험 동물인 마우스에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 0, 2, 4주차때 채혈하여 Mhp에 대한 항체가를 확인하였다. 이를 위하여, Mhp의 게놈이 암호화하는 것으로 알려진 면역우세 단백질(immunodominant protein)인 재조합 P46 단백질에 특이적인 IgG 항체 역가를 측정하였다. 그 결과 도 2와 같이, 본 발명에 따른 다가 백신이 Mhp, Mhr, 재조합 P97 단백질 및 재조합 PCV2 캡시드 단백질을 모두 포함하였음에도 Mhp에 대하여 정상적으로 항체가 형성되었고, 접종 주차에 따라 항체 역가가 증가됨을 확인하였다. 따라서 본 발명의 다가 백신을 접종시 다양한 항원에 의한 간섭 현상이 야기되지 않음을 확인하였다.
4-2. Mhp 재조합 P97 단백질에 대한 항체가 확인
돼지 마이코플라스마 백신 검정시험 동물인 마우스에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 0, 2, 4주차때 채혈하여 재조합 P97 단백질에 대한 항체가를 확인하였다. 그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 앞선 결과와 마찬가지로 재조합 P97 단백질에 대한 항체가 정상적으로 형성되었으며, 2주차에 항체 생성이 급격히 증가하였고 4주차에도 높은 항체가를 보임을 확인하였다.
4-3. Mhr에 대한 항체 형성 확인
돼지 마이코플라스마 백신 검정시험 동물인 마우스에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 0, 2, 4주차때 채혈한 후 Mhr에 대한 항체가를 확인하였다. 이를 위하여, Mhr의 게놈이 암호화한다고 알려진 재조합 P37 단백질에 특이적인 IgG 항체 역가를 측정하였다. 그 결과 도 4와 같이, Mhr에 대하여 정상적으로 항체가 형성되었으며, 접종 주차에 따라 증가됨을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 Mhp+Mhr+재조합 P97 단백질+재조합 PCV2 캡시드 단백질 조합의 다가 백신 조성물은 돼지 마이코플라스마 백신 검정시험 동물인 마우스에서 상호 간섭 현상을 나타내지 않고, 각각의 항원에 대한 항체를 효과적으로 형성할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. 기니피그에 접종 후 항체가 확인
5-1. 재조합 PCV2 캡시드 단백질 항원에 대한 항체가 확인
기니피그에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물 또는 PCV2 단독 백신을 접종하고 0, 2, 4, 6주차때 채혈한 후 재조합 PCV2 캡시드 단백질 항원에 대한 항체가를 확인하였다. 그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 다가 백신 조성물은 접종 2주째에 PCV2 단독 백신 접종군과 비교하여 유의적으로 높은 수준의 IgG 항체가를 나타냈다. 접종 4주째 모든 실험군이 가장 높은 피크(peak) 값을 보였으며, 전체적인 기간 동안 본 발명에 따른 다가 백신을 접종한 실험군이 더 높은 항체가를 보였다. 따라서 PCV2 단독 백신보다 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하는 경우, 더 효과적으로 재조합 PCV2 캡시드 단백질 항원에 대한 항체가가 생성되는 것을 확인하였다.
5-2. PCV2b 또는 PCV2d에 대한 중화항체가 확인
기니피그에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물 또는 PCV2 단독 백신을 접종하고 0, 2, 4, 6주차때 채혈한 후 PCV2b 또는 PCV2d 유전형에 대한 중화항체가를 확인하여 도 6 및 도 7에 나타내었다. 그 결과 PCV2 단독 백신 접종군 대비, 본 발명에 따른 다가 백신 조성물은 접종 후 전구간에서 PCV2b 또는 PCV2d 유전형에 대하여 동등 또는 약간 더 높은 중화항체가를 유도하는 것을 확인하였다. 특히, PCV2d에 대한 항체가가 PCV2b보다 높게 나타남을 확인하였다.
실시예 6. 돼지에 접종 후 항체가 확인
6-1. Mhp에 대한 항체가 확인
돼지에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 0, 4, 9, 14, 17주차때 채혈하여 Mhp에 대한 항체가를 확인하였다. 그 결과 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 다가 백신 조성물은 접종 9주 후부터 항체가가 증가하기 시작하여 17주까지 매우 높은 항체가를 유도함을 확인하였다.
6-2. Mhp 재조합 P97에 대한 항체가 확인
돼지에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 0, 4, 9, 14, 17주차때 채혈하여 재조합 P97 단백질에 대한 항체가를 확인하였다. 그 결과 도 9와 같이, 접종 4주만에 매우 높은 수준의 OD값을 나타내어 항체가 형성됨을 확인하였다. 특히 PCV2 항원을 추가함에 따른 P97 항원에 대한 항체가를 방해하는 현상은 나타나지 않음을 확인하였다.
6-3. Mhr에 대한 항체 확인
돼지에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 0, 4, 9, 14, 17주차때 채혈한 후 재조합 P37 단백질에 대한 항체가를 확인하여, Mhr에 대한 항체 형성을 확인하였다. 그 결과 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하였을 때 Mhr 유래 재조합 P37 단백질에 대한 항체를 우수하게 형성함을 확인하였다.
6-4. Mhp 감작에 따른 인터페론 감마(Interferon-gamma(IFN-gamma, IFN-γ)) 분비 확인
돼지에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 0, 4, 9, 14주차때 채혈한 후 Mhp 감작에 따른 IFN-γ 분비를 확인하였다. 그 결과 도 11과 같이, 접종 후 9주차부터 IFN-γ 분비량이 증가하면서 14주차까지 꾸준히 증가하는 경향을 확인하였다.
6-5. PCV2 감작에 따른 IFN-γ 분비 확인
돼지에 본 발명에 따른 다가 백신 조성물을 접종하고 0, 4, 9, 14주차때 채혈한 후 PCV2 감작에 따른 IFN-γ 분비를 확인하였다. 그 결과 도 12에 나타낸 바와 같이, 접종 후 9주차부터 IFN-γ 분비량이 증가하면서 14주차까지 꾸준히 증가하는 경향을 보였다. 특히 백신 접종 14주 후 높은 수준의 IFN-γ가 관찰되었다.
종합적으로 본 발명에 따른 Mhp+Mhr+재조합 P97 단백질+재조합 PCV2 캡시드 단백질 조합의 다가 백신 조성물은 마우스와 기니피그에 접종시 면역반응에서 상호 보완 효과를 나타냈으며, 특히 목적 동물인 돼지에 접종하였을 시 혈청학적인 수준에서 높은 수준의 항체가 및 중화항체가를 유도하였고, PBMC에서 Mhp 또는 PCV2 감작에 대해 높은 수준의 IFN-γ를 생성하였으므로, 이를 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염 예방을 위하여 유용하게 활용할 수 있다.
<110> Innovac
KNU-Industry Cooperation Foundation
<120> Polyvalent vaccine composition comprising for preventing swine
mycoplasma and Porcine circovirus infection
<130> 1-3P-1
<150> KR 1020210028980
<151> 2021-03-04
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 362
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant P97 protein
<400> 1
Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10 15
Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp
20 25 30
Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp Ile
35 40 45
Gly Ser Glu Phe Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr
50 55 60
Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr
65 70 75 80
Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser
85 90 95
Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser
100 105 110
Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr
115 120 125
Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr
130 135 140
Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Leu Glu Gly Ile Pro Thr Lys Glu
145 150 155 160
Gly Lys Arg Glu Glu Val Asp Lys Lys Val Lys Glu Leu Asp Asn Lys
165 170 175
Ile Lys Gly Ile Leu Pro Gln Pro Pro Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala
180 185 190
Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys
195 200 205
Pro Glu Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro
210 215 220
Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val
225 230 235 240
Ala Thr Asn Glu Gly Thr Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala
245 250 255
Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro Ser Gln Gly Lys Lys
260 265 270
Ala Glu Gly Ala Ser Asn Gln Gln Ser Pro Thr Thr Glu Leu Thr Asn
275 280 285
Tyr Leu Pro Glu Leu Gly Lys Lys Ile Asp Glu Ile Ile Lys Lys Gln
290 295 300
Gly Lys Asn Trp Lys Thr Glu Val Glu Leu Ile Glu Asp Asn Ile Ala
305 310 315 320
Gly Asp Ala Lys Leu Leu Tyr Phe Val Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ser
325 330 335
Gly Asp Pro Lys Lys Ser Ser Leu Lys Val Lys Ile Thr Val Lys Gln
340 345 350
Ser Asn Asn Asn Gln Glu Leu Lys Ser Lys
355 360
<210> 2
<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant protein from PCV2
<400> 2
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Phe Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr Thr Val Arg Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
195 200 205
Gln Gly Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys
225 230
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCV2d ORF2 forward primer
<400> 3
cgcggatccg ccgccaccat gacgtatcca aggagg 36
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCV2d ORF2 reverse primer
<400> 4
ggcaagcttt catttagggt taagtgg 27
Claims (15)
- (ⅰ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) 균주;
(ⅱ) 돼지 마이코플라스마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis, Mhr) 균주;
(ⅲ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 유래 재조합 P97 단백질; 및
(ⅳ) 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2, PCV2) 유래 재조합 단백질;을 포함하는, 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염 예방을 위한 다가 백신 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 재조합 P97 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 다가 백신 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 돼지 써코바이러스 2형 유래 재조합 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 다가 백신 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애는 1×108 내지 1×109 CCU(Colour-changing units)/mL의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 다가 백신 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 돼지 마이코플라스마 하이오라이니스는 1×108 내지 1×109 CCU(Colour-changing units)/mL의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 다가 백신 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 유래 재조합 P97 단백질은 10내지 100 μg/dose의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 다가 백신 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2, PCV2) 유래 재조합 단백질은 0.1 내지 1000 μg/dose의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 다가 백신 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 균주는 불활화된 것을 특징으로 하는, 다가 백신 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 돼지 마이코플라스마 하이오라이니스 균주는 불활화된 것을 특징으로 하는, 다가 백신 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 다가 백신 조성물은 부형제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 다가 백신 조성물.
- 제 10항에 있어서,
상기 부형제는 IMS1313인 것을 특징으로 하는, 다가 백신 조성물.
- 제 1항에 따른 다가 백신 조성물을 돼지에 접종하는 단계;를 포함하는 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염 예방 방법.
- 제 12항에 있어서,
상기 다가 백신 조성물은 근육, 피하, 경피, 정맥, 비강내, 복강내 및 경구로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 접종하는 것을 특징으로 하는, 예방 방법.
- (ⅰ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) 균주;
(ⅱ) 돼지 마이코플라스마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis, Mhr) 균주;
(ⅲ) 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 유래 재조합 P97 단백질; 및
(ⅳ) 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2, PCV2) 유래 재조합 단백질;을 포함하는, 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염에 의한 질환 예방용 약학적 조성물.
- 제 14항에 있어서,
상기 돼지 마이코플라스마균 및 돼지 써코바이러스 감염에 의한 질환은 돼지 호흡기 복합증후군(Porcine Respiratory Disease Complex, PRDC), 돼지유행성폐렴(enzootic pneumonia, EP), 이유자돈 전신성 소모성 증후군 (postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS), 돼지 피부염 신부전 증후군(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS), 모돈유산 폐사 증후군(sow abortion and mortality syndrome, SAMS), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS), 가성 광견병 (pseudorabies), 글래서병 (Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염(streptococcal meningitis), 살모넬라증(salmonellosis), 이유후 대장균증(postweaning colibacillosis), 식이성 간증 (dietetic hepatosis), 화농성 기관지폐렴(suppurative bronchopneumonia), 유스타키오관(Eustachian tube) 염증, 다발성 장막염(polyserositis), 마이코플라스마성 폐렴 및 흉막 폐렴으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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