JP2022523027A

JP2022523027A - 無核細胞由来のワクチン

Info

Publication number: JP2022523027A
Application number: JP2021542385A
Authority: JP
Inventors: アーモンアール．シャレイ，; ハワードバーンスタイン，; ジョナサンビー．ギルバート，; フィノラムーア，; デビンブリッドジェン，; ルークカセロー，
Original assignee: スクイーズバイオテクノロジーズカンパニー
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2020-01-24
Publication date: 2022-04-21
Also published as: AU2020212601A1; EP3914722A1; WO2020154696A1; US20220105166A1; KR20210121106A; CN113614237A; CA3127665A1

Abstract

本発明は、抗原に対する免疫応答を刺激するための方法であって、個体に、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞は、インプット無核細胞を含有する細胞懸濁液を狭窄に通すことにより生成され、狭窄は、インプット無核細胞を変形させ、これにより、抗原および／またはアジュバントが無核細胞由来の小胞に進入するように、細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する。一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞は、個体に送達され、抗原は、免疫原性環境に送達され、そこでプロセシングされて、疾患が処置され、疾患が予防され、および／または個体が抗原に対してワクチン接種される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１９年１月２５日に出願された米国特許仮出願第６２／７９７，１８５号、２０１９年１月２５日に出願された米国特許仮出願第６２／７９７，１８７号、２０１９年１１月８日に出願された米国特許仮出願第６２／９３３，３０１号、および２０１９年１１月８日に出願された米国特許仮出願第６２／９３３，３０２号の利益を主張し、これらの仮出願のそれぞれの内容全体を参照により本明細書に組み込む。

本開示は、全般的には、無核細胞由来の小胞を個体に送達することにより、免疫応答を刺激するための方法、またはがん、感染性疾患もしくはウイルス関連疾患を処置する方法であって、無核細胞由来の小胞が、抗原および／またはアジュバントをローディングされている、方法に関する。一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントは、細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄（ｃｅｌｌ－ｄｅｆｏｒｍｉｎｇｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）に通すことにより、無核細胞に送達される。

異物に対する免疫系および免疫応答の複雑さは、ｉｎｖｉｖｏ抗原特異的免疫応答を誘発するための効果的なアプローチの開発を困難にする。抗原特異的免疫応答を誘発することができる小分子ならびにポリペプチドおよび／またはヌクレオチドに基づくワクチン等の薬剤の継続した開発に加えて、斯かる薬剤と共に使用するための担体戦略は、送達および免疫応答を最適化するためのさらなる開発を必要とする。ポリマーに基づく担体、粒子担体、リポソーム、および赤血球細胞に由来する小胞等の細胞に基づく小胞を含む当技術分野で公知の担体は、依然として、ｉｎｖｉｖｏ抗原特異的免疫応答を誘発するためのその使用を限定する課題に直面する。例えば、赤血球細胞が、変則的な（ｉｒｒｅｇｕｌａｒｌｙ）形状であり（両凹）、無核であり、転写的に不活性であることを考慮すると、担体としての赤血球細胞の使用は、抗原材料を会合させるための赤血球細胞の操作に関連する課題のために困難である。結果として、標準トランスフェクション技法は、効果がない。これらの課題を克服するために、免疫応答を誘発するための担体として赤血球細胞を使用する方法は、材料を赤血球表面にコンジュゲートすることに着目した。例えば、Ｌｏｒｅｎｔｚｅｔａｌ．，Ｓｃｉ．Ａｄｖ，ｌ：ｅｌ５００１１２２０１５；Ｇｒｉｍｍｅｔａｌ．，ＳｃｉＲｅｐ，５，２０１５；およびＫｏｎｔｏｓｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１１０，２０１３を参照されたい。表面コンジュゲーションを使用した初期研究は、モデル抗原および１型糖尿病のマウスモデルにより有望な結果を示したが、（ａ）取り付けのための化学修飾された抗原の必要；（ｂ）ローディングのための表面積が限られていること；および（ｃ）免疫原性を含むいくつかの著しい弱点を有する。

化合物を細胞に送達するためにマイクロ流体狭窄を使用する方法について記載する参考文献は、ＷＯ２０１３０５９３４３、ＷＯ２０１５０２３９８２、ＷＯ２０１６０７０１３６、ＷＯ２０１６０７７７６１およびＷＯ／２０１７／１９２７８５を含む。
特許出願および刊行物を含む本明細書に引用されているあらゆる参考文献の全体を参照により本明細書に組み込む。

Ｌｏｒｅｎｔｚｅｔａｌ．，Ｓｃｉ．Ａｄｖ，ｌ：ｅｌ５００１１２２０１５Ｇｒｉｍｍｅｔａｌ．，ＳｃｉＲｅｐ，５，２０１５Ｋｏｎｔｏｓｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１１０，２０１３

一部の態様では、本発明は、抗原を無核細胞由来の小胞内に送達するための方法であって、ａ）インプット（例えば、親）無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートするステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、アジュバントをさらに含む。

一部の態様では、本発明は、アジュバントを無核細胞由来の小胞内に送達するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、アジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）アジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をアジュバントと共にインキュベートするステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、抗原をさらに含む。

一部の態様では、本発明は、抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞内に送達するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートするステップとを含む方法を提供する。

一部の実施形態では、本発明は、個体における抗原に対する免疫応答を刺激するための方法であって、方法が、個体に、抗原を含む無核細胞由来の小胞を有効量投与するステップを含み、抗原を含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、アジュバントを個体に全身投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、アジュバントは、無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に全身投与される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、アジュバントを含む。

一部の態様では、本発明は、個体における抗原に対する免疫応答を刺激するための方法であって、方法が、個体に、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を有効量投与するステップを含み、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、アジュバントを個体に全身投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、アジュバントは、無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に全身投与される。一部の態様では、本発明は、個体における疾患を処置するための方法であって、方法が、個体に、疾患関連抗原を含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原に対する免疫応答が、疾患の状態を軽快させ、疾患関連抗原を含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法を提供する。

一部の態様では、本発明は、個体における疾患を予防するための方法であって、方法が、個体に、疾患関連抗原を含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原に対する免疫応答が、疾患の発症を予防し、疾患関連抗原を含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、抗原に対して個体にワクチン接種するための方法であって、方法が、個体に、抗原を含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原を含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、アジュバントを個体に全身投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、アジュバントは、無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に全身投与される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、アジュバントを含む。

一部の態様では、本発明は、個体における疾患を処置するための方法であって、方法が、個体に、疾患関連抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原に対する免疫応答が、疾患の状態を軽快させ、疾患関連抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法を提供する。一部の態様では、本発明は、個体における疾患を予防するための方法であって、方法が、個体に、疾患関連抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原に対する免疫応答が、疾患の発症を予防し、疾患関連抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法を提供する。一部の態様では、本発明は、抗原に対して個体にワクチン接種するための方法であって、方法が、個体に、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法を提供する。

一部の態様では、本発明は、個体における疾患を処置するための方法であって、疾患関連抗原に対する免疫応答が、疾患の状態を軽快させ、方法が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）抗原を含む無核細胞由来の小胞を、個体に投与するステップとを含む、方法を提供する。一部の態様では、本発明は、個体における疾患を予防するための方法であって、疾患関連抗原に対する免疫応答が、疾患の発症を予防し、方法が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）抗原を含む無核細胞由来の小胞を、個体に投与するステップとを含む、方法を提供する。一部の態様では、本発明は、抗原に対して個体にワクチン接種するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）抗原を含む無核細胞由来の小胞を、個体に投与するステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、小胞外（ｅｘｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒ）アジュバントを個体に全身投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、小胞外アジュバントは、無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に投与される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、アジュバントを含む。

一部の態様では、本発明は、個体における疾患を処置するための方法であって、疾患関連抗原に対する免疫応答が、疾患の状態を軽快させ、方法が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、疾患関連抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を、個体に投与するステップとを含む、方法を提供する。一部の態様では、本発明は、個体における疾患を予防するための方法であって、疾患関連抗原に対する免疫応答が、疾患の発症を予防し、方法が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を、個体に投与するステップとを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、抗原に対して個体にワクチン接種するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を、個体に投与するステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、小胞外アジュバントを個体に全身投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、小胞外アジュバントは、無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に投与される。

上述の態様の一部の実施形態では、疾患は、がん、感染性疾患またはウイルス関連疾患である。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、個体にとって自家である。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、個体にとって同種異系である。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、医薬製剤中に存在する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、全身投与される。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内または腹腔内投与される。

上述の態様の一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、治療剤と組み合わせて、個体に投与される。一部の実施形態では、治療剤は、無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に投与される。一部の実施形態では、治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤および／またはサイトカインである。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１０またはＩＬ－１５のうち１種または複数である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ１、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）およびＢＴＬＡのうちいずれか１種に標的化される。一部の実施形態では、治療剤は、二重特異性薬剤；例えば、サイトカイン成分および標的化成分を含む二重特異性薬剤である。一部の実施形態では、二重特異性薬剤は、ＴＧＦｂ等の分子に対する標的化成分およびトラップを含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、化学療法または放射線療法と組み合わせて、個体に投与される。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、抗原提示を改善する（例えば、ＣＤ４０またはＯｘ４０Ｌ）、Ｔ細胞増殖を改善する、および／または腫瘍微小環境を改善する（例えば、ＩＣＯＳ）１種または複数の薬剤と組み合わせて、個体に投与される。

上述の態様の一部の実施形態では、抗原は、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされ得る。一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ－１拘束性抗原である。一部の実施形態では、抗原は、疾患関連抗原である。一部の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。一部の実施形態では、抗原は、ライセートに由来する。一部の実施形態では、ライセートは、腫瘍ライセートである。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である。一部の実施形態では、抗原は、微生物である。一部の実施形態では、抗原は、ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原は、脂質抗原である。一部の実施形態では、抗原は、糖鎖抗原である。一部の実施形態では、抗原をコードする核酸は、細胞に送達される。一部の実施形態では、抗原は、修飾された抗原である。一部の実施形態では、修飾された抗原は、ポリペプチドと融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、標的化ペプチドと融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、脂質と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、炭水化物と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、ナノ粒子と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、抗原をコードする核酸は、細胞に送達される。一部の実施形態では、複数の抗原が、無核細胞由来の小胞に送達される。

上述の態様の一部の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧＯＤＮ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、ポリリシンおよびカルボキシメチルセルロースにより安定化されたポリイノシン・ポリシチジル酸（ＨＩＬＴＯＮＯＬ（登録商標））、イミキモド、レシキモド、ならびに／またはリポ多糖（ＬＰＳ）である。一部の実施形態では、アジュバントは、低分子量ポリＩ：Ｃである。

上述の態様の一部の実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球細胞である。一部の実施形態では、赤血球細胞は、赤血球である。一部の実施形態では、赤血球細胞は、網状赤血球である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、血小板である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタまたはウサギ細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、ヒト細胞である。

上述の態様の一部の実施形態では、狭窄は、マイクロ流体チャネル内に含有される。一部の実施形態では、マイクロ流体チャネルは、複数の狭窄を含む。一部の実施形態では、複数の狭窄は、直列におよび／または並列に配置される。一部の実施形態では、狭窄は、複数の微小な支柱（ｍｉｃｒｏｐｉｌｌａｒ）の間；アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間；または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する。一部の実施形態では、狭窄は、ポアである、またはポア内に含有される。一部の実施形態では、ポアは、表面に含有される。一部の実施形態では、表面は、フィルターである。一部の実施形態では、表面は、膜である。一部の実施形態では、狭窄サイズは、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数である。一部の実施形態では、狭窄サイズは、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である。一部の実施形態では、狭窄は、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約４μｍ、約３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約２．２μｍの幅を有する。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、約１０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、狭窄に通す前に、それと同時発生的にまたはその後に、抗原と接触させられる。

一部の態様では、本発明は、抗原を含む無核細胞由来の小胞であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製される、無核細胞由来の小胞を提供する。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、アジュバントを含む。一部の態様では、本発明は、アジュバントを含む無核細胞由来の小胞であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、アジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）アジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をアジュバントと共にインキュベートし、これにより、アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製される、無核細胞由来の小胞を提供する。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、抗原を含む。一部の態様では、本発明は、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製される、無核細胞由来の小胞を提供する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、赤血球細胞由来の小胞または血小板由来の小胞である。一部の実施形態では、赤血球細胞由来の小胞は、赤血球由来の小胞または網状赤血球由来の小胞である。

上述の無核細胞由来の小胞の一部の実施形態では、抗原は、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされ得る。一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ－１拘束性抗原である。一部の実施形態では、抗原は、疾患関連抗原である。一部の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。一部の実施形態では、抗原は、ライセートに由来する。一部の実施形態では、ライセートは、腫瘍ライセートである。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である。一部の実施形態では、抗原は、微生物である。一部の実施形態では、抗原は、ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原は、脂質抗原である。一部の実施形態では、抗原は、糖鎖抗原である。一部の実施形態では、抗原をコードする核酸は、細胞に送達される。一部の実施形態では、抗原は、修飾された抗原である。一部の実施形態では、修飾された抗原は、ポリペプチドと融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、標的化ペプチドと融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、脂質と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、炭水化物と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、ナノ粒子と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、複数の抗原が、無核細胞由来の小胞に送達される。

上述の無核細胞由来の小胞の一部の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧＯＤＮ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、ポリリシンおよびカルボキシメチルセルロースにより安定化されたポリイノシン・ポリシチジル酸（ＨＩＬＴＯＮＯＬ（登録商標））、イミキモド、レシキモド、ならびに／またはＬＰＳである。一部の実施形態では、アジュバントは、低分子量ポリＩ：Ｃである。

上述の無核細胞由来の小胞の一部の実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、網状赤血球である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、血小板である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタまたはウサギ細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、ヒト細胞である。

上述の無核細胞由来の小胞の一部の実施形態では、哺乳動物への投与後の無核細胞由来の小胞の半減期は、哺乳動物への投与後のインプット無核細胞の半減期と比較して減少している。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞のヘモグロビン含量は、インプット無核細胞のヘモグロビン含量と比較して減少している。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞のＡＴＰ産生は、インプット無核細胞のＡＴＰ産生と比較して減少している。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、球状の形態を示す。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球であり、無核細胞由来の小胞は、インプット無核細胞と比較して低減された両凹形状を有する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、赤血球細胞ゴーストである。一部の実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞は、インプット無核細胞と比較して、その表面に約１．５倍をより多くえて多いホスファチジルセリンを有する。一部の実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞の集団プロファイルは、インプット無核細胞と比較して、表面におけるより高い平均ホスファチジルセリンレベルを示す。一部の実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞の集団プロファイルの少なくとも５０％が、インプット無核細胞と比較して、表面におけるより高いホスファチジルセリンレベルを示す。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプット無核細胞と比較して、組織または細胞における増強された取込みを示す。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプット無核細胞と比較して、貪食細胞および／または抗原提示細胞における増強された取込みを示す。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、修飾されていない無核細胞由来の小胞と比較して、組織または細胞における取込みを増強するように修飾されている。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、修飾されていない無核細胞由来の小胞と比較して、貪食細胞および／または抗原提示細胞における取込みを増強するように修飾されている。一部の実施形態では、貪食細胞および／または抗原提示細胞は、樹状細胞またはマクロファージのうち１種または複数を含む。一部の実施形態では、組織または細胞は、肝臓または脾臓のうち１種または複数を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、その表面にＣＤ４７を含む。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、無核細胞由来の小胞の調製中に、（ａ）熱処理されていない、（ｂ）化学的に処置されていない、および／または（ｃ）低浸透圧性もしくは高浸透圧性条件に付されていない。一部の実施形態では、細胞懸濁液の容積オスモル濃度は、プロセスを通して維持される。一部の実施形態では、細胞懸濁液の容積オスモル濃度は、プロセスを通して２００ｍＯｓｍ～４００ｍＯｓｍの間に維持される。

上述の無核細胞由来の小胞の一部の実施形態では、狭窄は、マイクロ流体チャネル内に含有される。一部の実施形態では、マイクロ流体チャネルは、複数の狭窄を含む。一部の実施形態では、複数の狭窄は、直列におよび／または並列に配置される。一部の実施形態では、狭窄は、複数の微小な支柱の間；アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間；または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する。一部の実施形態では、狭窄は、ポアである、またはポア内に含有される。一部の実施形態では、ポアは、表面に含有される。一部の実施形態では、表面は、膜である。一部の実施形態では、狭窄サイズは、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数である。一部の実施形態では、狭窄サイズは、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である。一部の実施形態では、狭窄は、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約２．２μｍの幅を有する。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、約１０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、狭窄に通す前に、それと同時発生的にまたはその後に、抗原と接触させられる。

一部の態様では、本発明は、本明細書に記載されている複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。

一部の態様では、本発明は、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、アジュバントを含む。

一部の態様では、本発明は、アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、アジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）アジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をアジュバントと共にインキュベートし、これにより、アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、抗原を含む。

一部の態様では、本発明は、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含む方法を提供する。

無核細胞由来の小胞を生成するための上述の方法の一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、赤血球細胞由来の小胞または血小板由来の小胞である。一部の実施形態では、赤血球細胞由来の小胞は、赤血球由来の小胞または網状赤血球由来の小胞である。

無核細胞由来の小胞を生成するための上述の方法の一部の実施形態では、抗原は、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされ得る。一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ－１拘束性抗原である。一部の実施形態では、抗原は、疾患関連抗原である。一部の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。一部の実施形態では、抗原は、ライセートに由来する。一部の実施形態では、ライセートは、腫瘍ライセートである。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である。一部の実施形態では、抗原は、微生物である。一部の実施形態では、抗原は、ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原は、脂質抗原である。一部の実施形態では、抗原は、糖鎖抗原である。一部の実施形態では、抗原をコードする核酸は、細胞に送達される。一部の実施形態では、抗原は、修飾された抗原である。一部の実施形態では、修飾された抗原は、ポリペプチドと融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、標的化ペプチドと融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、脂質と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、炭水化物と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、ナノ粒子と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、複数の抗原が、無核細胞由来の小胞に送達される。

無核細胞由来の小胞を生成するための上述の方法の一部の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧＯＤＮ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、ポリリシンおよびカルボキシメチルセルロースにより安定化されたポリイノシン・ポリシチジル酸（ＨＩＬＴＯＮＯＬ（登録商標））、イミキモド、レシキモド、ならびに／またはＬＰＳである。一部の実施形態では、アジュバントは、低分子量ポリＩ：Ｃである。

無核細胞由来の小胞を生成するための上述の方法の一部の実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、網状赤血球である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、血小板である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタまたはウサギ細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、ヒト細胞である。

無核細胞由来の小胞を生成するための上述の方法の一部の実施形態では、哺乳動物への投与後の無核細胞由来の小胞の半減期は、哺乳動物への投与後のインプット無核細胞の半減期と比較して減少している。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞のヘモグロビン含量は、インプット無核細胞のヘモグロビン含量と比較して減少している。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞のＡＴＰ産生は、インプット無核細胞のＡＴＰ産生と比較して減少している。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、球状の形態を示す。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球であり、無核細胞由来の小胞は、インプット無核細胞と比較して低減された両凹形状を有する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、赤血球細胞ゴーストである。一部の実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞は、インプット無核細胞と比較して、その表面に約１．５倍をより多くえて多いホスファチジルセリンを有する。一部の実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞の集団プロファイルは、インプット無核細胞と比較して、表面におけるより高い平均ホスファチジルセリンレベルを示す。一部の実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞の集団プロファイルの少なくとも５０％は、インプット無核細胞と比較して、表面におけるより高いホスファチジルセリンレベルを示す。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプット無核細胞と比較して、組織または細胞における増強された取込みを示す。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプット無核細胞と比較して、貪食細胞および／または抗原提示細胞における増強された取込みを示す。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプット無核細胞と比較して、組織または細胞における取込みを増強するように修飾されている。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、修飾されていない無核細胞由来の小胞と比較して、貪食細胞および／または抗原提示細胞における取込みを増強するように修飾されている。一部の実施形態では、貪食細胞および／または抗原提示細胞は、樹状細胞またはマクロファージのうち１種または複数を含む。一部の実施形態では、組織または細胞は、肝臓または脾臓のうち１種または複数を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、その表面にＣＤ４７を含む。

無核細胞由来の小胞を生成するための上述の方法の一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の調製中に、無核細胞由来の小胞は、（ａ）熱処理されていない、（ｂ）化学的に処置されていない、および／または（ｃ）低浸透圧性もしくは高浸透圧性条件に付されていない。一部の実施形態では、細胞懸濁液の容積オスモル濃度は、プロセスを通して維持される。一部の実施形態では、細胞懸濁液の容積オスモル濃度は、プロセスを通して約２００ｍＯｓｍ～約４００ｍＯｓｍの間に維持される。

無核細胞由来の小胞を生成するための上述の方法の一部の実施形態では、狭窄は、マイクロ流体チャネル内に含有される。一部の実施形態では、マイクロ流体チャネルは、複数の狭窄を含む。一部の実施形態では、複数の狭窄は、直列におよび／または並列に配置される。一部の実施形態では、狭窄は、複数の微小な支柱の間；アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間；または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する。一部の実施形態では、狭窄は、ポアである、またはポア内に含有される。一部の実施形態では、ポアは、表面に含有される。一部の実施形態では、表面は、フィルターである。一部の実施形態では、表面は、膜である。一部の実施形態では、狭窄サイズは、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数である。一部の実施形態では、狭窄サイズは、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である。一部の実施形態では、狭窄は、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約２．２μｍの幅を有する。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、約１０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、狭窄に通す前に、それと同時発生的にまたはその後に、抗原と接触させられる。

本開示は、一態様では、親無核細胞から調製された無核細胞由来の小胞であって、次の特性：（ａ）親無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期、（ｂ）親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベル、（ｃ）球状の形態、（ｄ）親無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベル、または（ｅ）親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生のうち１種または複数を有する無核細胞由来の小胞を提供する。

一部の実施形態では、親無核細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、親無核細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、親無核細胞は、赤血球細胞または血小板である。一部の実施形態では、赤血球細胞は、赤血球または網状赤血球である。

一部の実施形態では、哺乳動物における無核細胞由来の小胞の循環半減期は、親無核細胞と比較して減少している。一部の実施形態では、哺乳動物における循環半減期は、親無核細胞と比較して、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％をより多くえて減少している。

一部の実施形態では、親無核細胞は、ヒト細胞であり、無核細胞由来の小胞の循環半減期は、約１分間、約２分間、約５分間、約１０分間、約１５分間、約３０分間、約１時間、約６時間、約１２時間、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約１０日間、約２５日間、約５０日間、約７５日間、約１００日間、約１２０日間未満である。

一部の実施形態では、親無核細胞は、赤血球細胞であり、無核細胞由来の小胞におけるヘモグロビンレベルは、親無核細胞と比較して減少している。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞におけるヘモグロビンレベルは、親無核細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９９％または約１００％減少している。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞におけるヘモグロビンレベルは、親無核細胞におけるヘモグロビンのレベルの約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％である。

一部の実施形態では、親無核細胞は、赤血球であり、無核細胞由来の小胞は、球状の形態である。一部の実施形態では、親無核細胞は、赤血球であり、無核細胞由来の小胞は、親無核細胞と比較して低減された両凹形状を有する。

一部の実施形態では、親無核細胞は、赤血球細胞または赤血球であり、無核細胞由来の小胞は、赤血球細胞ゴースト（ＲＢＣゴースト）である。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、親無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベルを有する。一部の実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞は、その表面に、親無核細胞と比較して約１．５倍をより多くえて多いホスファチジルセリンを有する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、親無核細胞と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９９％、約１００％または約１００％より多く多いホスファチジルセリンをその表面に有する。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、親無核細胞によって産生されるＡＴＰのレベルの約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％未満でＡＴＰを産生する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、ＡＴＰを産生しない。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、親無核細胞と比較して、組織または細胞における取込みを増強するように修飾されている。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、親無核細胞の取込みと比較して、肝臓もしくは脾臓におけるまたは貪食細胞もしくは抗原提示細胞による取込みを増強するように修飾されている。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、その表面にＣＤ４７を含む。

一部の実施形態では、親無核細胞は、無核細胞由来の小胞の調製中に、（ａ）熱処理されなかった、（ｂ）化学的に処置されなかった、および／または（ｃ）低浸透圧性もしくは高浸透圧性条件に付されなかった。一部の実施形態では、容積オスモル濃度は、親無核細胞からの無核細胞由来の小胞の調製中に維持された。一部の実施形態では、容積オスモル濃度は、約２００ｍＯｓｍ～約６００ｍＯｓｍの間に維持された。一部の実施形態では、容積オスモル濃度は、約２００ｍＯｓｍ～約４００ｍＯｓｍの間に維持された。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプット親無核細胞を含む懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、ペイロードの通過に十分なほど大きい無核細胞の撹乱を引き起こし、これにより、無核細胞由来の小胞を生成する、ステップを含むプロセスによって調製された。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、ペイロードを含む。一部の実施形態では、ペイロードは、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、小分子、複合体、ナノ粒子である。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、ペイロードの通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）ペイロードを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をペイロードと共にインキュベートし、これにより、ペイロードを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、抗原を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、アジュバントを含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、抗原および／または免疫寛容原性因子を含む。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、アジュバントの通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）アジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をアジュバントと共にインキュベートし、これにより、アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、抗原およびアジュバントを含み、無核細胞由来の小胞は、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、抗原および免疫寛容原性因子を含み、無核細胞由来の小胞は、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原および免疫寛容原性因子の通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）抗原および免疫寛容原性因子を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原および免疫寛容原性因子と共にインキュベートし、これにより、抗原および免疫寛容原性因子を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された。

一部の実施形態では、狭窄は、マイクロ流体チャネル内に含有される。一部の実施形態では、マイクロ流体チャネルは、複数の狭窄を含む。一部の実施形態では、複数の狭窄は、直列におよび／または並列に配置される。一部の実施形態では、狭窄は、複数の微小な支柱の間；アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間；または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する。一部の実施形態では、狭窄は、ポアである、またはポア内に含有される。一部の実施形態では、ポアは、表面に含有される。一部の実施形態では、表面は、フィルターである。一部の実施形態では、表面は、膜である。一部の実施形態では、狭窄サイズは、細胞直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である。一部の実施形態では、狭窄は、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約２．２μｍの幅を有する。一部の実施形態では、インプット親無核細胞は、約１０ｐｓｉ～約１５０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄に通す前に、それと同時発生的にまたはその後に、ペイロードと接触させられる。

一部の実施形態では、抗原は、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされ得る。

一部の実施形態では、抗原は、疾患関連抗原である。一部の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。一部の実施形態では、抗原は、ライセートに由来する。一部の実施形態では、抗原は、移植片ライセートに由来する。一部の実施形態では、ライセートは、腫瘍ライセートである。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である。一部の実施形態では、ウイルス抗原は、ウイルス、ウイルス粒子またはウイルスカプシドである。一部の実施形態では、抗原は、微生物である。一部の実施形態では、抗原は、ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原は、脂質抗原である。一部の実施形態では、抗原は、糖鎖抗原である。一部の実施形態では、抗原をコードする核酸は、細胞に送達される。

一部の実施形態では、抗原は、修飾された抗原である。一部の実施形態では、修飾された抗原は、ポリペプチドと融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、標的化ペプチドと融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、脂質と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、炭水化物と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、ナノ粒子と融合された抗原を含む。

一部の実施形態では、複数の抗原が、無核細胞に送達される。

一部の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧＯＤＮ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、イミキモド、レシキモドおよび／またはリポ多糖（ＬＰＳ）である。

本開示は、別の態様では、本明細書における記載に係る複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物を提供する。

本開示は、別の態様では、親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、次の特性：（ａ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多くが、親無核細胞と比較して減少した哺乳動物における循環半減期を有する、（ｂ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、（ｃ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、球状の形態を有する、（ｄ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、ＲＢＣゴーストである、（ｅ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞の集団と比較してより高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または（ｆ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、のうち１種または複数を有する組成物を提供する。

本開示は、別の態様では、親無核細胞の集団から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、次の特性：（ａ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多くが、親無核細胞の集団の平均と比較して減少した哺乳動物における循環半減期を有する、（ｂ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞の集団の平均と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、（ｃ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、球状の形態を有する、（ｄ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、ＲＢＣゴーストである、（ｅ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞の集団の平均と比較して、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または（ｆ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞の集団の平均と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、のうち１種または複数を有する組成物を提供する。

一部の実施形態では、組成物の調製に使用される親無核細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、組成物の調製に使用される親無核細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、組成物の調製に使用される親無核細胞は、赤血球細胞または血小板である。一部の実施形態では、赤血球細胞は、赤血球または網状赤血球である。

一部の実施形態では、哺乳動物における組成物における無核細胞由来の小胞の２０％の循環半減期は、親無核細胞または親無核細胞の集団の平均と比較して減少している。一部の実施形態では、哺乳動物における組成物における無核細胞由来の小胞の２０％の循環半減期は、親無核細胞または親無核細胞の集団の平均と比較して、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％または約９０％をより多くえて減少している。一部の実施形態では、組成物の調製に使用される親無核細胞は、ヒト細胞であり、組成物における無核細胞由来の小胞の２０％の循環半減期は、約５分間、約１０分間、約１５分間、約３０分間、約１時間、約６時間、約１２時間、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約１０日間未満である。

一部の実施形態では、組成物の調製に使用される親無核細胞は、赤血球細胞であり、組成物における無核細胞由来の小胞の２０％のヘモグロビンレベルは、親無核細胞または親無核細胞の集団の平均と比較して減少している。

一部の実施形態では、組成物における無核細胞由来の小胞の２０％のヘモグロビンレベルは、親無核細胞または親無核細胞の集団の平均と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９９％または約１００％減少している。一部の実施形態では、組成物における無核細胞由来の小胞の２０％のヘモグロビンレベルは、親無核細胞または親無核細胞の集団の平均におけるヘモグロビンのレベルの約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％である。

一部の実施形態では、組成物の調製に使用される親無核細胞は、赤血球であり、組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くは、球状の形態である。一部の実施形態では、組成物の調製に使用される親無核細胞は、赤血球であり、組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くは、親無核細胞と比較して低減された両凹形状を有する。

一部の実施形態では、組成物の調製に使用される親無核細胞は、赤血球細胞または赤血球であり、組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くは、赤血球細胞ゴーストである。

一部の実施形態では、組成物における無核細胞由来の小胞は、表面ホスファチジルセリンを含む。一部の実施形態では、組成物における無核細胞由来の小胞の２０％は、親無核細胞または親無核細胞の集団の平均と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベルを含む。一部の実施形態では、組成物における無核細胞由来の小胞の２０％は、複数の親無核細胞を含む組成物と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９９％、約１００％または約１００％より多く高い表面ホスファチジルセリンレベルを有する。

一部の実施形態では、組成物における無核細胞由来の小胞の２０％は、親無核細胞または親無核細胞の集団の平均と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する。一部の実施形態では、組成物における無核細胞由来の小胞の２０％は、親無核細胞または親無核細胞の集団の平均によって産生されるＡＴＰのレベルの約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％未満でＡＴＰを産生する。一部の実施形態では、組成物における無核細胞由来の小胞は、ＡＴＰを産生しない。

一部の実施形態では、組成物の調製に使用される親無核細胞は、組成物の調製中に、（ａ）熱処理されなかった、（ｂ）化学的に処置されなかった、および／または（ｃ）低浸透圧性もしくは高浸透圧性条件に付されなかった。一部の実施形態では、容積オスモル濃度は、親無核細胞からの無核細胞由来の小胞の調製中に維持された。一部の実施形態では、容積オスモル濃度は、約２００ｍＯｓｍ～約６００ｍＯｓｍの間に維持された。一部の実施形態では、容積オスモル濃度は、約２００ｍＯｓｍ～約４００ｍＯｓｍの間に維持された。

一部の実施形態では、組成物の無核細胞由来の小胞は、インプット親無核細胞を含む懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、ペイロードの通過に十分なほど大きい無核細胞の撹乱を引き起こし、これにより、無核細胞由来の小胞を生成する、ステップを含むプロセスによって調製された。

一部の実施形態では、組成物の無核細胞由来の小胞は、ペイロードを含む。一部の実施形態では、ペイロードは、治療ペイロードである。一部の実施形態では、ペイロードは、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、小分子、複合体、ナノ粒子である。

一部の実施形態では、組成物の無核細胞由来の小胞は、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、ペイロードの通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）ペイロードを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をペイロードと共にインキュベートし、これにより、ペイロードを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された。

一部の実施形態では、組成物の無核細胞由来の小胞は、抗原を含む。一部の実施形態では、組成物の無核細胞由来の小胞は、アジュバントを含む。一部の実施形態では、組成物の無核細胞由来の小胞は、抗原および免疫寛容原性因子を含む。

一部の実施形態では、組成物の無核細胞由来の小胞は、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された。

一部の実施形態では、組成物の無核細胞由来の小胞は、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、アジュバントの通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）アジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をアジュバントと共にインキュベートし、これにより、アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された。

一部の実施形態では、組成物の無核細胞由来の小胞は、抗原およびアジュバントを含み、組成物の無核細胞由来の小胞は、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された。

一部の実施形態では、組成物の無核細胞由来の小胞は、抗原および免疫寛容原性因子を含み、組成物の無核細胞由来の小胞は、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原および免疫寛容原性因子の通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）抗原および免疫寛容原性因子を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原および免疫寛容原性因子と共にインキュベートし、これにより、抗原および／または免疫寛容原性因子を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された。

一部の実施形態では、組成物の調製に使用される狭窄は、マイクロ流体チャネル内に含有される。一部の実施形態では、組成物の調製に使用されるマイクロ流体チャネルは、複数の狭窄を含む。一部の実施形態では、複数の狭窄は、直列におよび／または並列に配置される。一部の実施形態では、組成物の調製に使用される狭窄は、複数の微小な支柱の間、アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間、または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する。一部の実施形態では、組成物の調製に使用される狭窄は、ポアである、またはポア内に含有される。一部の実施形態では、組成物の調製に使用されるポアは、表面に含有される。一部の実施形態では、組成物の調製に使用される表面は、フィルターである。一部の実施形態では、組成物の調製に使用される表面は、膜である。一部の実施形態では、組成物の調製に使用される狭窄サイズは、細胞直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である。一部の実施形態では、組成物の調製に使用される狭窄は、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する。一部の実施形態では、組成物の調製に使用される狭窄は、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの幅を有する。一部の実施形態では、組成物の調製に使用される狭窄は、約２．２μｍの幅を有する。一部の実施形態では、組成物の調製に使用されるインプット親無核細胞は、約１０ｐｓｉ～約１５０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。一部の実施形態では、組成物の調製に使用される細胞懸濁液は、狭窄に通す前に、それと同時発生的にまたはその後に、抗原と接触させられる。

一部の実施形態では、組成物の抗原は、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされ得る。一部の実施形態では、抗原は、疾患関連抗原である。一部の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。一部の実施形態では、抗原は、ライセートに由来する。一部の実施形態では、ライセートは、移植片ライセートである。一部の実施形態では、ライセートは、腫瘍ライセートである。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である。一部の実施形態では、抗原は、微生物である。一部の実施形態では、抗原は、ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原は、脂質抗原である。一部の実施形態では、抗原は、糖鎖抗原である。一部の実施形態では、抗原をコードする核酸は、細胞に送達される。

一部の実施形態では、組成物の抗原は、修飾された抗原である。一部の実施形態では、修飾された抗原は、ポリペプチドと融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、標的化ペプチドと融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、脂質と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、炭水化物と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、ナノ粒子と融合された抗原を含む。

一部の実施形態では、組成物の無核細胞由来の小胞は、複数の抗原を含み、複数の抗原は、無核細胞に送達される。

一部の実施形態では、組成物のアジュバントは、ＣｐＧＯＤＮ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、イミキモド、レシキモドおよび／またはＬＰＳである。

一部の実施形態では、組成物は、医薬組成物である。

本開示は、別の態様では、親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物を作製するための方法であって、組成物が、次の特性：（ａ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞と比較して減少した哺乳動物における循環半減期を有する、（ｂ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、（ｃ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、球状の形態を有する、（ｄ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、ＲＢＣゴーストである、（ｅ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または（ｆ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、のうち１種または複数を有し、方法が、親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液における親無核細胞の直径の関数であり、これにより、ペイロードの通過に十分なほど大きい親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成し、これにより、無核細胞由来の小胞を生成する、ステップを含む、方法を提供する。

一部の実施形態では、本明細書に記載されている作製方法において使用される狭窄は、マイクロ流体チャネル内に含有される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている作製方法において使用されるマイクロ流体チャネルは、複数の狭窄を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されている作製方法において使用される複数の狭窄は、直列におよび／または並列に配置される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている作製方法において使用される狭窄は、複数の微小な支柱の間、アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間、または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する。一部の実施形態では、本明細書に記載されている作製方法において使用される狭窄は、ポアである、またはポア内に含有される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている作製方法において使用されるポアは、表面に含有される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている作製方法において使用される表面は、フィルターである。一部の実施形態では、本明細書に記載されている作製方法において使用される表面は、膜である。一部の実施形態では、本明細書に記載されている作製方法において使用される狭窄サイズは、細胞直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である。一部の実施形態では、本明細書に記載されている作製方法において使用される狭窄は、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されている作製方法において使用される狭窄は、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの幅を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されている作製方法において使用される狭窄は、約２．２μｍの幅を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されている作製方法において使用されるインプット親無核細胞は、約１０ｐｓｉ～約１５０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている作製方法において使用される細胞懸濁液は、ペイロードが細胞に進入するように、狭窄に通す前に、それと同時発生的にまたはその後に、ペイロードと接触させられる。

一部の実施形態では、本明細書に記載されている作製方法において使用されるペイロードは、治療ペイロードである。一部の実施形態では、ペイロードは、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、小分子、複合体またはナノ粒子である。一部の実施形態では、ペイロードは、抗原および／またはアジュバントである。一部の実施形態では、ペイロードは、抗原および／または免疫寛容原性因子である。

本開示は、別の態様では、それを必要とする個体における疾患または障害を処置するための方法であって、本明細書に記載されている無核細胞由来の小胞を投与するステップを含む方法を提供する。本開示は、別の態様では、それを必要とする個体における疾患または障害を処置するための方法であって、本明細書に記載されている組成物を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載されている処置方法において使用される無核細胞由来の小胞は、治療ペイロードを含む。一部の実施形態では、個体は、がんを有し、ペイロードは、抗原を含む。一部の実施形態では、個体は、がんを有し、ペイロードは、抗原およびアジュバントを含む。一部の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。一部の実施形態では、個体は、感染性疾患またはウイルス関連疾患を有し、ペイロードは、抗原を含む。一部の実施形態では、個体は、感染性疾患またはウイルス関連疾患を有し、ペイロードは、抗原およびアジュバントを含む。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である。一部の実施形態では、個体は、自己免疫性疾患を有し、ペイロードは、抗原を含む。一部の実施形態では、個体は、自己免疫性疾患を有し、ペイロードは、抗原および／または免疫寛容原性因子を含む。

本開示は、別の態様では、それを必要とする個体における疾患または障害を予防するための方法であって、本明細書に記載されている無核細胞由来の小胞を投与するステップを含む方法を提供する。本開示は、別の態様では、それを必要とする個体における疾患または障害を予防するための方法であって、本明細書に記載されている組成物を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載されている予防方法において使用される無核細胞由来の小胞は、抗原を含む。一部の実施形態では、個体は、がんを有し、ペイロードは、抗原およびアジュバントを含む。一部の実施形態では、疾患または障害は、がんであり、抗原は、腫瘍抗原である。一部の実施形態では、個体は、感染性疾患を有し、ペイロードは、抗原を含む。一部の実施形態では、個体は、感染性疾患を有し、ペイロードは、抗原およびアジュバントを含む。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である。

図１Ａは、各条件に対するテトラマー染色によって測定した抗原特異的Ｔ細胞のパーセンテージを示す。図１Ｂは、ＯＶＡエピトープであるＳＩＩＮＦＥＫＬによる再刺激後（円形のドット）に、各条件に対する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって測定したＩＦＮ－γ陽性細胞のパーセンテージを示す。抗ＣＤ２８単独による（ＳＩＩＮＦＥＫＬを用いない）刺激を陰性対照（四角のドット）として使用し、一方、ＰＭＡ／イオノマイシンによる非特異的刺激を陽性対照（三角のドット）として使用する。図１Ｃは、各条件に対するＩＣＳにおいて、各細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定した各細胞におけるＩＦＮ－γの量を示す。図１Ｄは、ＯＶＡエピトープであるＳＩＩＮＦＥＫＬによる再刺激後（円形のドット）に、各条件に対する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって測定したＩＬ－２陽性細胞のパーセンテージを示す。抗ＣＤ２８単独による（ＳＩＩＮＦＥＫＬを用いない）刺激を陰性対照（四角のドット）として使用し、一方、ＰＭＡ／イオノマイシンによる非特異的刺激を陽性対照（三角のドット）として使用する。図１Ｅは、各条件に対するＩＣＳにおいて、各細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定した各細胞におけるＩＬ－２の量を示す。同上。同上。

図２Ａは、各条件に対してテトラマー染色によって測定した抗原特異的Ｔ細胞のパーセンテージを示す。図２Ｂは、ＯＶＡエピトープであるＳＩＩＮＦＥＫＬによる再刺激後（円形のドット）に、各条件に対する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって測定したＩＦＮ－γ陽性細胞のパーセンテージを示す。図２Ｃは、ＯＶＡエピトープであるＳＩＩＮＦＥＫＬによる再刺激後（円形のドット）に、各条件に対する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって測定したＩＬ－２陽性細胞のパーセンテージを示す。図２Ｂと２Ｃの両方では、抗ＣＤ２８単独による（ＳＩＩＮＦＥＫＬを用いない）刺激を陰性対照（四角のドット）として使用し、一方、ＰＭＡ／イオノマイシンによる非特異的刺激を陽性対照（三角のドット）として使用する。同上。

図３Ａは、各条件に対するテトラマー染色によって測定した抗原特異的Ｔ細胞のパーセンテージを示す。図３Ｂは、ＯＶＡエピトープであるＳＩＩＮＦＥＫＬによる再刺激後（円形のドット）に、各条件に対する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって測定したＩＦＮ－γ陽性細胞のパーセンテージを示す。図３Ｃは、ＯＶＡエピトープであるＳＩＩＮＦＥＫＬによる再刺激後（円形のドット）に、各条件に対する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって測定したＩＬ－２陽性細胞のパーセンテージを示す。図３Ｂと３Ｃの両方では、抗ＣＤ２８単独による（ＳＩＩＮＦＥＫＬを用いない）刺激を陰性対照（四角のドット）として使用し、一方、ＰＭＡ／イオノマイシンによる非特異的刺激を陽性対照（三角のドット）として使用する。同上。

図４は、未処理のインプット赤血球細胞に対する狭窄媒介性送達（ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄｄｅｌｉｖｅｒｙ）によって処理した赤血球細胞由来の小胞（ＳＱＺ）の乳酸レベルを示す。

図５Ａは、未処置のＲＢＣ（Ｕｎｔｒｔｄ）、ＦＩＴＣで標識したデキストラン（Ｄ－ＦＩＴＣ）と共にインキュベートしたＲＢＣ（ＳＱＺなし）、ならびにＳＱＺを使用してローディングしたＤ－ＦＩＴＣを含むＲＢＣ由来の小胞（ＳＱＺ）に対する、明視野顕微鏡、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ染色（ＣＴ）に関する蛍光顕微鏡、ならびにＤ－ＦＩＴＣに関する蛍光顕微鏡からの画像を示す。図５Ｂは、未処置のＲＢＣ（Ｕｎｔｒｔ）、Ｄ－ＦＩＴＣと共にインキュベートしたＲＢＣ（ＳＱＺなし）、ならびにＳＱＺを使用してローディングしたＤ－ＦＩＴＣを含むＲＢＣ由来の小胞（ＳＱＺ）に対するホスファチジルセリン染色のレベルを示す。

図６Ａは、ＳＱＺ処理によって生成した無核細胞由来の小胞の循環半減期を決定するための実験の代表的概略図を示す。図６Ｂは、別々に標識したＲＢＣとＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞の経時的な循環レベルを示す。図６Ｃは、マウスに注射したＲＢＣとＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞との混合物のフロープロットにおける前方散乱および側方散乱を示す。同上。

図７Ａは、未処置のＲＢＣ（ＮＣ）、およびそれぞれ、１０ｐｓｉおよび１２ｐｓｉの圧力でＳＱＺによって処理したＲＢＣ由来の小胞の遠心分離後の細胞ペレットおよび上清の外観を示す。図７Ｂは、未処置のＲＢＣ（ＮＣ）、１０ｐｓｉおよび１２ｐｓｉの圧力でＳＱＺによって処理したＲＢＣ由来の小胞、ならびに水中で希釈したＲＢＣ（溶解対照）に対して、ＨｅｍｏＣｕｅ（登録商標）システムで測定したヘモグロビンの喪失（溶血）を示す。

図８Ａおよび８Ｂは、それぞれ、Ｂ９－２３と共にインキュベートしたＲＢＣ（Ｅｎｄｏ対照）およびＢ９－２３をＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞（ＳＱＺ）において、２種のヘモグロビンペプチドの液体クロマトグラフィー／質量分析によって定量したヘモグロビンの喪失（溶血）を示す。

図９は、ＳＱＺ処理における様々な狭窄幅および駆動圧力の下で、ＲＢＣ由来の小胞のＳＱＺに媒介される誘導におけるゴースト形成のパーセンテージを示す。

図１０は、レシピエントマウスにおける未処理のマウスＲＢＣおよびＳＱＺによって処理したマウスＲＢＣ小胞のｉｎｖｉｖｏでの持続性を示す。

図１１Ａは、ＳＱＺによって処理したＲＢＣ由来の小胞の内在化に関与する臓器を示す。図１１Ｂは、ＳＱＺによって処理したＲＢＣ由来の小胞の内在化に関与した肝臓および脾臓内の細胞の種類を示す。

図１２Ａは、ＯＶＡおよびポリＩ：ＣをＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞によって誘導されたＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の増殖を示す。図１２Ｂは、ＯＶＡおよびポリＩ：ＣをＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞によって誘導されたＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の増殖を示す。

図１３は、（ｉ）ポリＩ：Ｃのみ、（ｉｉ）ＯＶＡのみ、または（ｉｉｉ）ＯＶＡおよびポリＩ：ＣをＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞によって誘導されたマウスに関する、ｅｘｖｉｖｏでＳＩＩＮＦＥＫＬにより再刺激（ｒｅ－ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）した際の内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。

図１４は、（ｉ）ポリＩ：Ｃのみ、（ｉｉ）Ｅ７のみ、または（ｉｉｉ）Ｅ７およびポリＩ：ＣをＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞によって誘導されたマウスに関する、ｅｘｖｉｖｏでＥ７により再刺激した際の内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。

図１５は、Ｅ７およびポリＩ：ＣをＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞の様々なプライミングおよびブースティング投与レジメンで処置したマウスに関するＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の定量を示す。

図１６Ａおよび１６Ｂは、Ｅ７陽性腫瘍を経験しているマウスモデルにおける、それぞれ腫瘍成長および生存率に関する、Ｅ７およびポリＩ：ＣをＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞の予防的投与の効果を示す。

図１７Ａおよび１７Ｂは、Ｅ７陽性腫瘍を有するマウスモデルにおける、それぞれ腫瘍成長および生存率に関する、様々な投薬量でのＥ７およびポリＩ：ＣをＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞の治療的投与の効果を示す。

図１８Ａおよび１８Ｂは、Ｅ７陽性腫瘍を有するマウスモデルにおける、それぞれ腫瘍成長および生存率に関する、様々な投与レジメンでのＥ７およびポリＩ：ＣをＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞の治療的投与の効果を示す。

図１９Ａ～１９Ｄは、Ｅ７陽性腫瘍を有するマウスモデルにＥ７およびポリＩ：ＣをＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞を投与した場合の、Ｅ７およびポリＩ：ＣをＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞によって誘導された抗原特異的免疫応答、特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＥ７陽性腫瘍への動員（図１９Ａ）、Ｅ７に対して特異的である腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ（図１９Ｂ）、腫瘍における調節性Ｔ細胞に対するＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の比（図１９Ｃ）、および腫瘍重量に対するＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の相関（図１９Ｄ）を示す。同上。

図２０Ａ～２０Ｃは、ヒトＲＢＣ由来の小胞が、Ｅ７－ＳＬＰ（ペイロード）の存在下でＳＱＺ処理によって生成された場合の、ゴースト形成、ペイロード送達の効率、および表面ホスファチジルセリンレベルをそれぞれ示す。同上。

図２１は、３７℃および０℃で、ヒト単球由来の樹状細胞によるヒトＲＢＣ由来の小胞の内在化を示す。

図２２は、ＣＭＶ抗原をローディングしたヒトＲＢＣ由来の小胞、および外因性アジュバントと共培養した場合の、ＣＭＶ抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生および分泌を示す。

図２３Ａ～２３Ｃは、マウスＲＢＣ由来の小胞が、ＳＱＺ処理によって生成された場合の、ゴーストおよび非ゴースト集団におけるペイロード送達の効率、ゴースト形成、および表面ホスファチジルセリンレベルをそれぞれ示す。同上。

図２４Ａは、ｉｎｖｉｖｏでのウイルスキャプシドに対する抗原依存性寛容がＳＱＺローディングした抗原を含む無核細胞由来の小胞によって誘導されるかどうかを決定するための実験の代表的概略図を示す。図２４Ｂは、ナイーブマウス、ＳＮＹＮＫＳＶＮＶと共にインキュベートしたＲＢＣで処置したマウス（ペプチド）、またはＳＮＹＮＫＳＶＮＶをローディングしたＲＢＣ由来の小胞で処置したマウス（ＳＱＺ）の脾細胞における、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって測定したＩＦＮ－γ陽性細胞のパーセンテージを示す。図２４Ｃは、４３日間の経過にわたって、ペプチド群およびＳＱＺ群のマウスに関する血清中のルシフェラーゼレベルを示す。

図２５Ａは、ｉｎｖｉｖｏでの抗体に対する抗原依存性寛容がＳＱＺローディングした抗原を含む無核細胞由来の小胞によって誘導されるかどうかを決定するための実験の代表的概略図を示す。図２５Ｂは、２０日目に、ＥＬＩＳＡによって決定した、対照マウス、遊離したラットＩｇＧ２ｂを注射したマウス、およびラットＩｇＧ２ｂをＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞を注射したマウス（ＳＱＺ）に関する血清中の循環ラットＩｇＧ２ｂのレベルを示す。図２５Ｃは、７６日目に、対照、遊離ラットＩｇＧ２ｂ、およびＳＱＺ群におけるマウスに関する血清中の循環ラットＩｇＧ２ｂのレベルを示す。

図２６Ａは、ｉｎｖｉｖｏでのＢ９－２３に対する抗原依存性寛容がＳＱＺローディングした抗原を含む無核細胞由来の小胞によって誘導されるかどうかを決定するための実験の代表的概略図を示す。図２６Ｂは、対照マウス、ＨＥＬをローディングしたＲＢＣ由来の小胞で処置したマウス（ＳＱＺＨＥＬ）、またはＩｎｓＢ９－２３をローディングしたＲＢＣ由来の小胞で処置したマウス（ＳＱＺＦＡＭ）の脾細胞における、ＡＡＶ－ＮＬウイルスで再刺激した後の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって測定したＩＦＮ－γまたはＩＬ－２陽性細胞のパーセンテージを示す。図２６Ｃは、ｉｎｖｉｖｏでの１０４０－ｐ３１に対する抗原依存性寛容がＳＱＺローディングした抗原を含む無核細胞由来の小胞によって誘導されるかどうかを決定するための実験の代表的概略図を示す。図２６Ｄは、対照マウスおよび１０４０－３１をローディングしたＲＢＣ由来の小胞で処置したマウス（ＳＱＺ）において測定した血清血糖のレベルを示す。図２６Ｅは、血清血糖測定値から決定した対照マウスおよびＳＱＺマウスに関する疾患の発症を示す。同上。

本願は、無核細胞および／または無核細胞由来の小胞が、抗原、アジュバントまたは治療剤のうち１種または複数をローディングされている、および／またはこれらと混合されている、無核細胞由来の小胞（インプット無核細胞から調製された小胞等）を含む無核細胞、およびその組成物を提供する。本願はまた、本明細書に記載されている狭窄媒介性送達（ＳＱＺ）により無核細胞由来の小胞を生成する方法、およびその使用方法を提供する。本願は、本明細書に記載されている狭窄媒介性送達（ＳＱＺ）により生成された無核細胞由来の小胞を使用して、個体における免疫応答を刺激する方法ならびに疾患を処置および／または予防する方法をさらに提供する。

本願の開示は、少なくとも一部には、インプット無核細胞を狭窄媒介性送達（ＳＱＺ）によって処理して、無核細胞由来の小胞を生成することができるという知見に基づく。本願の開示はまた、少なくとも一部には、抗原（複数可）および／またはアジュバント（複数可）を有する無核細胞由来の小胞（無核細胞由来の小胞内に被包されているか否かにかかわらず）が、ｉｎｖｉｖｏ抗原特異的免疫応答を誘導することができるという知見に基づく。

本発明は、抗原および／またはアジュバントを無核細胞由来の小胞内に送達するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原および／またはアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原および／またはアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原および／またはアジュバントと共にインキュベートするステップとを含む方法を提供する。

本開示のある特定の態様は、個体における抗原に対する免疫応答を刺激するための方法であって、方法が、個体に、抗原を含む無核細胞由来の小胞を有効量投与するステップを含み、抗原を含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、撹乱されたインプット無核細胞を抗原と共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法に関する。一部の実施形態では、アジュバントも無核細胞由来の小胞に送達される。他の実施形態では、アジュバントは、抗原を含む無核細胞由来の小胞と組み合わせて、個体に全身投与される。

ある特定の態様では、本発明は、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原および／またはアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原および／またはアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原および／またはアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された無核細胞由来の小胞を提供する。

ある特定の態様では、本発明は、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原および／またはアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原および／またはアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原および／またはアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含む方法を提供する。

一部の態様では、本願は、無核細胞由来の小胞が、抗原、アジュバントまたは免疫寛容原性因子のうちいずれか１種または複数等のペイロードをローディングされた、無核細胞由来の小胞（親無核細胞から調製された小胞等）およびその組成物を提供する。本願はまた、本明細書に記載されている無核細胞由来の小胞の組成物を作製する方法、およびその使用方法を提供する。

本願の開示はまた、少なくとも一部には、抗原（複数可）および／またはアジュバント（複数可）等のペイロードを含む無核細胞由来の小胞を含む組成物が、ｉｎｖｉｖｏ抗原特異的免疫応答を誘導することができるという知見に基づく。本願の開示はまた、少なくとも一部には、抗原（複数可）および／またはアジュバント（複数可）をローディングされた無核細胞由来の小胞を含むより高用量の組成物が、より大きいｉｎｖｉｖｏ抗原特異的免疫応答を誘導することができるという知見に基づく。さらに、本願の開示は、少なくとも一部には、組成物のアジュバント；無核細胞由来の小胞に被包された抗原等のペイロードの量；および／または無核細胞由来の小胞を含む組成物の投与に使用される投薬戦略に基づき、ｉｎｖｉｖｏ抗原特異的免疫応答をモジュレートすることができるという知見に基づく。本願の開示はまた、少なくとも一部には、複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物を能動的に調整して、１種または複数の選択特性を有する組成物内に、無核細胞由来の小胞の集団等の無核細胞由来の小胞を生成することができるという知見に基づく。その中に所望の量および／または特性の無核細胞由来の小胞を有する無核細胞由来の小胞の組成物の生成は、例えば、親無核細胞から無核細胞由来の小胞が調製される際に、調製パラメーターのうち１種または複数を調整することにより達成される。

よって、一部の態様では、親無核細胞から調製された無核細胞由来の小胞であって、次の特性：（ａ）親無核細胞と比較して減少した哺乳動物における循環半減期、（ｂ）親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベル、（ｃ）球状の形態、（ｄ）親無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベル、または（ｅ）親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生のうち１種または複数を有する無核細胞由来の小胞が本明細書に提供されている。

別の態様では、本明細書に記載されている複数のいずれかの無核細胞由来の小胞を含む組成物が本明細書に提供されている。一部の実施形態では、組成物は、次の特性：（ａ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞と比較して減少した哺乳動物における循環半減期を有する、（ｂ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、（ｃ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、球状の形態を有する、（ｄ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、ＲＢＣゴーストである、（ｅ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または（ｆ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、のうち１種または複数を有する。

別の態様では、本明細書に記載されている通り、アジュバントと混合された複数のいずれかの無核細胞を含む組成物が本明細書に提供されている。

別の態様では、本明細書に開示されている組成物を作製する方法、例えば、親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物を作製するための方法であって、組成物が、次の特性：（ａ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞と比較して減少した哺乳動物における循環半減期を有する、（ｂ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、（ｃ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、球状の形態を有する、（ｄ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、ＲＢＣゴーストである、（ｅ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または（ｆ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、のうち１種または複数を有し、方法が、親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液における親無核細胞の直径の関数であり、これにより、ペイロードの通過に十分なほど大きい親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成し、これにより、無核細胞由来の小胞を生成する、ステップを含む、方法が本明細書に提供されている。

別の態様では、本明細書に記載されている組成物のいずれかを使用するための方法が本明細書に提供されている。一部の実施形態では、使用のための方法は、それを必要とする個体における疾患または障害を処置するための方法であって、本明細書に記載されている無核細胞由来の小胞のいずれかを投与するステップを含む方法である。一部の実施形態では、使用のための方法は、それを必要とする個体における疾患または障害を予防するための方法であって、本明細書に記載されている無核細胞由来の小胞のいずれかを投与するステップを含む方法である。
定義

本明細書を解釈する目的のため、次の定義が適用され、適切であれば常に、単数形で使用される用語は、複数形も含み、逆もまた同じであろう。下に示されるいずれかの定義が、参照により本明細書に組み込むいずれかの文書と矛盾する場合、示される定義が優先するものとする。

本明細書で使用される場合、単数形の形態「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別段の指示がない限り、複数形の参照を含む。

用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに他の同様の形態、ならびにそれらの文法上の均等は、本明細書で使用される場合、意義において均等であることが意図され、また、これらの単語のうちいずれか１つの前にある項目（単数または複数）が、斯かる項目（単数または複数）の包括的リストであることを意味せず、収載されている項目（単数または複数）のみに限定されることも意味しないという点において、オープンエンドであることが意図される。例えば、成分Ａ、ＢおよびＣ「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」物品は、成分Ａ、ＢおよびＣからなる（すなわち、それのみを含有する）ことができる、または成分Ａ、ＢおよびＣのみならず、１種もしくは複数の他の成分も含有することができる。そのようなものとして、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」およびその同様の形態、ならびにそれらの文法上の均等が、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」の実施形態の開示を含むことが意図および理解される。

値の範囲が提示される場合、当該範囲の上限と下限との間にある、文脈がそうでないことを明らかに指示しない限り下限値の単位で小数第１位まで刻んだ（ｔｏｔｈｅｔｅｎｔｈｏｆｔｈｅｕｎｉｔｏｆｔｈｅｌｏｗｅｒｌｉｍｉｔ）介在する値のそれぞれ、および当該の記述されている範囲におけるいずれか他の記述されている値または介在する値が、本開示の内に包含され、記述されている範囲におけるいずれか特に除外された限界の対象となることが理解される。記述されている範囲が、限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれた限界のいずれか一方または両方を除外した範囲も、本開示に含まれる。

用語「約」は、本明細書で使用される場合、本技術分野の当業者にとって容易に公知となるそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」ある値またはパラメーターの参照は、当該の値またはパラメーターそれ自体を対象にする実施形態を含む（およびこれを記載する）。例えば、「約Ｘ」を参照する記載は、「Ｘ」の記載を含む。

本明細書で使用される場合、「無核細胞」は、核を欠く細胞を指す。斯かる細胞は、血小板、赤血球および網状赤血球等の赤血球細胞（ＲＢＣ）を含むことができるがこれらに限定されない。網状赤血球は、典型的に人体の赤血球細胞の約１％を構成する、未成熟（例えば、未だ両凹でない）赤血球細胞である。網状赤血球もまた、無核である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されているシステムおよび方法は、濃縮された（例えば、自然界で見出され得るものよりも大きい、総細胞集団パーセンテージを構成する）、精製されたまたは単離された（例えば、その天然の環境から、実質的に純粋なまたは均一な形態で）無核細胞（例えば、ＲＢＣ、網状赤血球および／または血小板）集団の処置および／または処理に使用される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されているシステムおよび方法は、ＲＢＣ（例えば、赤血球または網状赤血球）、血小板や他の血球細胞を含有する全血の処置および／または処理に使用される。これらの細胞型の精製または濃縮は、密度勾配システム（例えば、フィコール・ハイパック）、蛍光励起細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気細胞選別、または赤芽球および赤血球系前駆体のｉｎｖｉｔｒｏ分化等の公知方法を使用して達成される。

用語「小胞」は、本明細書で使用される場合、脂質二重層によって封入された液体を含む構造を指す。一部の例では、脂質二重層は、天然に存在する脂質組成物から調達される。一部の例では、脂質二重層は、細胞膜から調達することができる。一部の例では、小胞は、細胞等の様々な種類の実体に由来することができる。斯かる例では、小胞は、起源となる実体由来の分子（細胞内タンパク質または膜成分等）を保持することができる。例えば、赤血球細胞に由来する小胞は、赤血球細胞および／または赤血球細胞の膜成分に存在した、いずれかの数の細胞内タンパク質を含有することができる。一部の例では、小胞は、所望のペイロードに加えて、細胞内にいずれかの数の分子を含有することができる。

本明細書で使用される場合、「ペイロード」は、無核細胞由来の小胞（例えば、ＲＢＣ由来の小胞）内にローディングされている等、送達されている材料を指す。「ペイロード」、「カーゴ」、「送達材料」および「化合物」は、本明細書で互換的に使用される。一部の実施形態では、ペイロードは、タンパク質、小分子、核酸（例えば、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）、脂質、炭水化物、巨大分子、ビタミン、ポリマー、蛍光色素およびフルオロフォア、カーボンナノチューブ、量子ドット、ナノ粒子、およびステロイドを指すことができる。一部の実施形態では、ペイロードは、タンパク質または小分子薬物を指すことができる。一部の実施形態では、ペイロードは、１種または複数の化合物を含むことができる。

用語「ポア」は、本明細書で使用される場合、材料内の孔、裂け目、空洞、開口部、割れ目、ギャップまたは穿孔を限定することなく含む、開口を指す。一部の例では、（指示があれば）、この用語は、本開示の表面内のポアを指す。他の例では、（指示があれば）、ポアは、細胞膜におけるポアを指すことができる。

用語「膜」は、本明細書で使用される場合、ポアを含有する選択的障壁またはシートを指す。この用語は、境界または裏打ちとして作用する柔軟なシート状構造を含む。一部の例では、この用語は、ポアを含有する表面またはフィルターを指す。この用語は、用語「細胞膜」とは別個のものである。

用語「フィルター」は、本明細書で使用される場合、ポアの選択的通過を可能にする多孔性の物品を指す。一部の例では、この用語は、ポアを含有する表面または膜を指す。

用語「異種」は、コード配列および制御配列等の核酸配列に関する場合、正常であれば繋ぎ合わされていない配列および／または正常であれば特定の細胞に関連しない配列を表示する。よって、核酸構築物またはベクターの「異種」領域は、別の核酸分子内に存在するまたはこれに取り付けられた核酸のセグメントであって、自然界ではその別の分子と会合した状態では見出されないセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、自然界ではコード配列と会合した状態では見出されない配列に隣接した、コード配列を含むことができる。異種コード配列の別の例は、コード配列それ自体が自然界では見出されない構築物である（例えば、ネイティブ遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、正常であれば細胞に存在しない構築物により形質転換された細胞は、本発明の目的のために異種と考慮されるであろう。アレル変形形態または天然に存在する突然変異事象は、本明細書で使用される場合、異種ＤＮＡを生じない。

用語「異種」は、ペプチド配列およびポリペプチド配列等のアミノ酸配列に関する場合、正常であれば繋ぎ合わされていない配列および／または正常であれば特定の細胞に関連しない配列を表示する。よって、ペプチド配列の「異種」領域は、別のアミノ酸分子内に存在するまたはこれに取り付けられたアミノ酸のセグメントであって、自然界ではその別の分子と会合した状態では見出されないセグメントである。例えば、ペプチド構築物の異種領域は、自然界ではペプチドのアミノ酸配列と会合した状態では見出されない配列に隣接したペプチドのアミノ酸配列を含むことができる。異種ペプチド配列の別の例は、ペプチド配列それ自体が自然界では見出されない構築物である（例えば、コードされた場合に、ネイティブ遺伝子とは異なるアミノ酸を有する合成配列）。同様に、正常であれば細胞に存在しないアミノ酸構築物を発現するベクターにより形質転換された細胞は、本発明の目的のために異種と考慮されるであろう。アレル変形形態または天然に存在する突然変異事象は、本明細書で使用される場合、異種ペプチドを生じない。

用語「外因的」は、細胞に関して、抗原またはアジュバント等の薬剤を参照して使用される場合、細胞外間隙から（すなわち、細胞の外部から）送達された薬剤を指す。細胞は、薬剤が既に存在していても存在していなくてもよく、外因的薬剤が送達された後に、薬剤を産生しても産生しなくてもよい。

用語「相同」は、本明細書で使用される場合、同じ生物に由来する分子を指す。一部の例では、この用語は、所与の生物内に正常に見出されるまたは発現される核酸またはタンパク質を指す。

本明細書で使用される場合、「処置」または「処置する」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のため、有益なまたは所望の臨床結果は、次のうち１種または複数を含むがこれらに限定されない：疾患に起因する１種もしくは複数の症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の予防または遅延）、疾患の拡散（例えば、転移）の予防もしくは遅延、疾患の再発の予防もしくは遅延、疾患の進行の遅延もしくは緩徐化、病状の軽快、疾患の寛解（部分または全）をもたらすこと、疾患の処置に要求される１種もしくは複数の他の薬物療法の用量の減少、疾患の進行の遅延、クオリティ・オブ・ライフの増加もしくは改善、体重増の増加、および／または生存の延長。「処置」によって、がんの病理学的帰結（例えば、腫瘍体積等）の低減も包含される。本発明の方法は、処置のこれらの態様のうちいずれか１種または複数を企図する。

本明細書で使用される場合、用語「モジュレートする」は、特定の標的の存在または活性を変化、変更、変動または他の仕方で修飾する行為を指すことができる。例えば、免疫応答のモジュレートは、免疫応答の変化、変更、変動または他の仕方での修飾をもたらすいずれかの行為を指すことができる。他の例では、核酸の発現のモジュレートは、核酸の転写の変化、ｍＲＮＡ存在量の変化（例えば、ｍＲＮＡ転写の増加）、ｍＲＮＡの分解の対応する変化、ｍＲＮＡ翻訳の変化、その他を含むことができるがこれらに限定されない。

本明細書で使用される場合、用語「阻害する」は、特定の標的の存在または活性を遮断、低減、排除または他の仕方で拮抗する行為を指すことができる。阻害は、部分的阻害または完全阻害を指すことができる。例えば、免疫応答の阻害は、免疫応答の遮断、低減、排除または他のいずれかの拮抗作用をもたらすいずれかの行為を指すことができる。他の例では、核酸の発現の阻害は、核酸の転写の低減、ｍＲＮＡ存在量の低減（例えば、ｍＲＮＡ転写のサイレンシング）、ｍＲＮＡの分解、ｍＲＮＡ翻訳の阻害、遺伝子編集その他を含むことができるがこれらに限定されない。他の例では、タンパク質の発現の阻害は、タンパク質をコードする核酸の転写の低減、タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の低減、タンパク質の翻訳の阻害、タンパク質の安定性の低減その他を含むことができるがこれらに限定されるものではない。

本明細書で使用される場合、用語「抑制する」は、特定の標的の存在または活性を減少、低減、禁止、限定、低下または他の仕方で縮小する行為を指すことができる。抑制は、部分的抑制または完全抑制を指すことができる。例えば、免疫応答の抑制は、免疫応答の減少、低減、禁止、限定、低下または他の仕方での縮小をもたらすいずれかの行為を指すことができる。他の例では、核酸の発現の抑制は、核酸の転写の低減、ｍＲＮＡ存在量の低減（例えば、ｍＲＮＡ転写のサイレンシング）、ｍＲＮＡの分解、ｍＲＮＡ翻訳の阻害その他を含むことができるがこれらに限定されない。他の例では、タンパク質の発現の抑制は、タンパク質をコードする核酸の転写の低減、タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の低減、タンパク質の翻訳の阻害、タンパク質の安定性の低減その他を含むことができるがこれらに限定されるものではない。

本明細書で使用される場合、用語「増強する」は、特定の標的の存在または活性を改善、ブースト、高めるまたは他の仕方で増加させる行為を指すことができる。例えば、免疫応答の増強は、免疫応答の改善、ブースト、高めることまたは他の仕方での増加をもたらすいずれかの行為を指すことができる。他の例では、核酸の発現の増強は、核酸の転写の増加、ｍＲＮＡ存在量の増加（例えば、ｍＲＮＡ転写の増加）、ｍＲＮＡの分解の減少、ｍＲＮＡ翻訳の増加その他を含むことができるがこれらに限定されない。他の例では、タンパク質の発現の増強は、タンパク質をコードする核酸の転写の増加、タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の増加、タンパク質の翻訳の増加、タンパク質の安定性の増加その他を含むことができるがこれらに限定されるものではない。

本明細書で使用される場合、用語「誘導する」は、結果を開始、促進、刺激、確立または他の仕方で産生する行為を指すことができる。例えば、免疫応答の誘導は、所望の免疫応答の開始、促進、刺激、確立または他の仕方での産生をもたらすいずれかの行為を指すことができる。他の例では、核酸の発現の誘導は、核酸の転写の開始、ｍＲＮＡ翻訳の開始その他を含むことができるがこれらに限定されない。他の例では、タンパク質の発現の誘導は、タンパク質をコードする核酸の転写の増加、タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の増加、タンパク質の翻訳の増加、タンパク質の安定性の増加その他を含むことができるがこれらに限定されるものではない。

用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で使用される場合、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含む、いずれかの長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。よって、この用語は、一本鎖、二本鎖または多重（ｍｕｌｔｉ）鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基または他の天然の、化学もしくは生化学的に修飾された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むがこれらに限定されない。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（ＲＮＡまたはＤＮＡに典型的に見出すことができるように）、または修飾もしくは置換された糖またはリン酸基を含むことができる。ポリヌクレオチドの骨格は、ペプチド結合によって連結された、Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン等の反復単位を含むことができる（すなわち、ペプチド核酸）。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）等の合成サブユニットのポリマーを含むことができ、よって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミデート（Ｐ－ＮＨ２）または混合ホスホロアミデート・ホスホジエステルオリゴマーであり得る。加えて、相補鎖を合成し、適切な条件下で鎖をアニーリングすること、またはＤＮＡポリメラーゼと適切なプライマーを使用してｄｅｎｏｖｏで相補鎖を合成することのいずれかにより、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から二本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。

用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用されており、最小の長さに限定されない。したがって、本明細書で使用される場合、ポリペプチドは、短いペプチドを含む。斯かるアミノ酸残基のポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含有することができ、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基のダイマー、トリマーおよびマルチマーを含むがこれらに限定されない。全長タンパク質およびその断片の両方が、この定義に包含される。これらの用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化その他も含む。さらに、本発明の目的のため、タンパク質が所望の活性を維持する限りにおいて、「ポリペプチド」は、ネイティブ配列に対する欠失、付加および置換（一般に保存的な性質の）等の修飾を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発による等、計画的であり得る、またはタンパク質を産生する宿主の突然変異もしくはＰＣＲ増幅が原因のエラーによる等、偶発的であり得る。

本明細書で使用される場合、用語「アジュバント」は、免疫応答をモジュレートするおよび／または発生させる物質を指す。一般に、アジュバントは、抗原と併せて投与されて、抗原単独と比較して、抗原に対する免疫応答の増強をもたらす。様々なアジュバントが、本明細書に記載されている。

用語「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド」および「ＣｐＧＯＤＮ」は、リン酸に隔てられたシトシンおよびグアニンのジヌクレオチド（本明細書において「ＣｐＧ」ジヌクレオチドまたは「ＣｐＧ」とも称される）を含有するＤＮＡ分子を指す。本開示のＣｐＧＯＤＮは、少なくとも１個の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する。すなわち、ＣｐＧジヌクレオチドにおけるシトシンは、メチル化されていない（すなわち、５－メチルシトシンではない）。ＣｐＧＯＤＮは、部分的または完全ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を有することができる。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」または「薬理学的に適合性」とは、生物学的にまたは他の面で望ましくないものではない材料を意味する、例えば、この材料は、いかなる著しい望ましくない生物学的効果を引き起こすこともなく、またはそれが含有される組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、患者に投与される医薬組成物中に取り込むことができる。薬学的に許容される担体または賦形剤は、好ましくは、毒物学的および製造検査の要求される標準を満たしている、ならびに／または米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって作成された不活性成分ガイド（ＩｎａｃｔｉｖｅＩｎｇｒｅｄｉｅｎｔＧｕｉｄｅ）に含まれる。

本明細書に記載されている構造的および機能的特徴のいずれかのため、これらの特徴を決定する方法が、当技術分野で公知である。

本明細書で使用される場合、「マイクロ流体システム」は、少ない体積（例えば、ｍ＼Ｌ、ｎＬ、ｐＬ、ｆＬ）の流体が処理されて少体積の液体の別々の処置を達成する、システムを指す。本明細書に記載されているある特定のインプリメンテーションは、マルチプレックス化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）、自動化およびハイスループットスクリーニングを含む。流体（例えば、緩衝剤、溶液、ペイロード含有溶液または細胞懸濁液）は、移動、混合、分離または他の仕方で処理することができる。本明細書に記載されているある特定の実施形態では、マイクロ流体システムは、機械的狭窄を、緩衝剤に懸濁された細胞に適用し、ペイロードまたは化合物を細胞のサイトゾルに進入させることができる、細胞における撹乱（例えば、孔）を誘導するために使用される。

本明細書で使用される場合、「狭窄」は、進入口部分、中心点および脱出口部分によって定義されるマイクロ流体チャネルの部分を指すことができ、中心点は、幅、長さおよび深さによって定義される。他の例では、狭窄は、ポアを指すことができる、またはポアの部分であり得る。ポアは、表面（例えば、フィルターおよび／または膜）に含有され得る。

本明細書で使用される場合、「狭窄の幅」は、中心点におけるマイクロ流体チャネルの幅を指す。一部の実施形態では、狭窄は、約６μｍ未満の幅を有する。例えば、一部の実施形態では、狭窄は、約０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、１．０μｍ、１．５μｍまたは２μｍ未満のいずれかであり得る。一部の実施形態では、狭窄は、約４μｍ未満の幅を有する。本発明のある特定の態様では、狭窄は、約０．５μｍ～約４μｍの間の幅を有する。さらなる実施形態では、狭窄は、約３μｍ～約４μｍの間の幅を有する。さらなる実施形態では、狭窄は、約２μｍ～約４μｍの間の幅を有する。さらなる態様では、狭窄は、約３．９μｍまたはそれ未満の幅を有する。さらなる態様では、狭窄は、約３．９μｍまたはそれ未満の幅を有する。さらなる態様では、狭窄は、約２．２μｍの幅を有する。ある特定の実施形態では、狭窄は、一度に単一の細胞が狭窄を通るように構成される。

本明細書で使用される場合、「狭窄の長さ」は、中心点におけるマイクロ流体チャネルの長さを指す。本発明のある特定の態様では、狭窄の長さは、約３０μｍまたはそれ未満である。一部の実施形態では、狭窄の長さは、約１０μｍ～約３０μｍの間である。ある特定の実施形態では、狭窄の長さは、約１０μｍ～約２０μｍの間である。例えば、狭窄の長さは、約１０μｍ～約３０μｍの間のあらゆる整数、小数および分数を含む、約１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、２０μｍまたは２５μｍのいずれかであり得る。狭窄の長さは、細胞が狭窄中に存在する時間の長さを増加させるように変動し得る（例えば、より長い長さは、所与の流速でより長い狭窄時間をもたらす）。狭窄の長さは、細胞が狭窄中に存在する時間の長さを減少させるように変動し得る（例えば、より短い長さは、所与の流速でより短い狭窄時間をもたらす）。

本明細書で使用される場合、「狭窄の深さ」は、中心点におけるマイクロ流体チャネルの深さを指す。狭窄幅の調整と同様に、狭窄の深さは、よりきつい狭窄をもたらすように調整し、これにより、送達を増強することができる。一部の実施形態では、狭窄の深さは、約１μｍ～約１ｍｍの間のあらゆる整数、小数および分数を含む、約１μｍ～約１ｍｍの間である。一部の実施形態では、深さは、約２０μｍである。一部の実施形態では、深さは、チャネル全体で一様である。ある特定の実施形態では、深さは、狭窄のポイントで減少して、細胞のより大きい狭窄をもたらす。一部の実施形態では、深さは、狭窄のポイントで増加して、細胞のより小さい狭窄をもたらす。一部の実施形態では、狭窄の深さは、狭窄の幅よりも大きい。ある特定の実施形態では、狭窄の深さは、狭窄の幅に満たない。一部の実施形態では、狭窄の深さおよび狭窄の幅は、等しい。

一部の実施形態では、マイクロ流体デバイスの寸法は、狭窄の長さ、狭窄の幅、および直列の狭窄の数によって表示される。例えば、３０μｍの狭窄長さ、５μｍの幅、および５個の直列の狭窄を有するマイクロ流体デバイスは、本明細書において、３０×５×５（Ｌ×Ｗ×狭窄の数）として表される。

一部の実施形態では、マイクロ流体システムは、少なくとも１個の狭窄を含む少なくとも１個のマイクロ流体チャネルを含む。一部の実施形態では、マイクロ流体システムは、少なくとも１個の狭窄をそれぞれ含む複数のマイクロ流体チャネルを含む。例えば、マイクロ流体システムは、１０～５０、５０～１００、１００～５００、５００、１０００、１００００～２０，０００その他のあらゆる整数を含む、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１０００、１０，０００、２０，０００またはそれよりも多いマイクロ流体チャネルを含むことができる。ある特定の態様では、１個の狭窄をそれぞれ含む複数のマイクロ流体チャネルは、並列に配置される。ある特定の態様では、１個の狭窄をそれぞれ含む複数のマイクロ流体チャネルは、直線的に直列に配置される。本発明のある特定の態様では、マイクロ流体システムは、複数の狭窄を含む１個のマイクロ流体チャネルを含む。例えば、１個のマイクロ流体チャネルは、２、３、４、５、１０、２０またはそれよりも多い狭窄を含むことができる。一部の実施形態では、マイクロ流体システムは、複数の狭窄を含む複数のマイクロ流体チャネルを含む。本発明の一部の態様では、複数の狭窄を含む複数のマイクロ流体チャネルは、並列に配置される。本発明の一部の態様では、複数の狭窄を含む複数のマイクロ流体チャネルは、直線的に直列に配置される。

進入口部分は、狭窄の中心点に向かってチャネルの直径が減少する速さを増加または減少させるように変動し得る、「狭窄角度」を含むことができる。狭窄角度は、そこに細胞を通しつつマイクロ流体システムの目詰まりを最小化するように変動し得る。例えば、狭窄角度は、１～１４０度の間であり得る。ある特定の実施形態では、狭窄角度は、１～９０度の間であり得る。脱出口部分は、非層流をもたらし得る乱流／渦の見込みを低減させる角度を含むこともできる。例えば、脱出口部分の角度は、１～１４０度の間であり得る。ある特定の実施形態では、脱出口部分の角度は、１～９０度の間であり得る。

マイクロ流体チャネル、進入口部分、中心点および脱出口部分の横断面は、変動し得る。様々な横断面の非限定的な例は、円形、楕円形、細長いスリット、四角、六角形または三角形横断面を含む。

無核細胞（例えば、ＲＢＣ）が、本明細書に記載されているマイクロ流体チャネルを通る速度も、細胞への送達材料の送達を制御するように変動され得る。例えば、マイクロ流体チャネルを通る細胞の速度の調整は、変形させる力が細胞に加えられる時間の量を変動し得、変形させる力が細胞に加えられる迅速さを変動し得る。一部の実施形態では、マイクロ流体チャネルを通る細胞の速度の調整は、圧力が細胞に加えられる時間の量を変動し得、圧力が細胞に加えられる迅速さを変動し得る。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも０．１ｍｍ／秒の速さでマイクロ流体システムを通ることができる。さらなる実施形態では、細胞は、その中のあらゆる整数および小数を含む、０．１ｍｍ／秒～５ｍ／秒の間の速さでマイクロ流体システムを通ることができる。またさらなる実施形態では、細胞は、その中のあらゆる整数および小数を含む、１０ｍｍ／秒～５００ｍｍ／秒の間の速さでマイクロ流体システムを通ることができる。一部の実施形態では、細胞は、５ｍ／秒をより多くえる速さでシステムを通ることができる。

細胞は、圧力を加えることにより、狭窄を通して移動される（例えば、押される）。一部の実施形態では、前記圧力は、細胞ドライバーによって加えられる。本明細書で使用される場合、細胞ドライバーは、狭窄を通るように細胞を駆動するために、緩衝剤または溶液に圧力または力を加えるデバイスまたは成分である。一部の実施形態では、入口において細胞ドライバーによって圧力を加えることができる。一部の実施形態では、出口において細胞ドライバーによって真空圧を加えることができる。ある特定の実施形態では、細胞ドライバーは、約１０～約９０ｐｓｉ等、約１０～約１５０ｐｓｉの圧力を供給するように適応される。さらなる実施形態では、細胞ドライバーは、１２０ｐｓｉの圧力を加えるように適応される。ある特定の実施形態では、細胞ドライバーは、圧力ポンプ、ガスボンベ、コンプレッサー、真空ポンプ、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、ピペット、ピストン、毛細管作用装置（ｃａｐｉｌｌａｒｙａｃｔｏｒ）、ヒトの心臓、ヒトの筋肉、重力、マイクロ流体ポンプおよびシリンジからなる群から選択される。細胞ドライバーによって加えられる圧力に対する修飾も、細胞がマイクロ流体チャネルを通る速度に影響を与える（例えば、圧力の量の増加は、細胞速度増加をもたらすであろう）。細胞（例えば、無核細胞）が狭窄を通るときに、その膜は撹乱され、膜に一時的な破壊を引き起こし、周囲の培地中に存在するペイロードの取込みをもたらす。本明細書で使用される場合、このような一時的な破壊は、「撹乱」と称される。本明細書に記載されている方法によって生じる撹乱は、細胞の外部からの材料が、細胞内に移動することを可能にする細胞における穴である。撹乱の非限定的な例は、孔、裂け目、空洞、開口部、ポア、割れ目、ギャップまたは穿孔を含む。本明細書に記載されている方法によって生じる撹乱（例えば、ポアまたは孔）は、補体または細菌溶血素によって生じるもの等のマルチマーポア構造を形成するためのタンパク質サブユニットのアセンブリの結果として形成されるのではない。
個体における抗原に対する免疫応答を刺激するための方法
抗原を無核細胞由来の小胞内に送達するための方法

ある特定の態様では、抗原を無核細胞由来の小胞内に送達するための方法であって、インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートするステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、アジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、アジュバントをさらに含む。

ある特定の態様では、アジュバントを無核細胞由来の小胞内に送達するための方法であって、インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、アジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、アジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をアジュバントと共にインキュベートするステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、抗原をさらに含む。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、抗原をさらに含む。

ある特定の態様では、抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞内に送達するための方法であって、インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートするステップとを含む方法が提供される。
免疫応答を刺激するための方法

ある特定の態様では、個体における抗原に対する免疫応答を刺激するための方法であって、方法が、個体に、抗原を含む無核細胞由来の小胞を有効量投与するステップを含み、抗原を含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法が提供される。一部の実施形態では、本方法は、アジュバントを個体に全身投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、全身アジュバントは、無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に投与される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、アジュバントを含む。一部の実施形態では、全身アジュバントは、細胞外アジュバントである。一部の実施形態では、全身アジュバントは、小胞外アジュバントである。一部の実施形態では、個体における抗原に対する免疫応答を刺激する方法は、抗原に対する既存の免疫応答を増強する。

ある特定の態様では、個体における抗原に対する免疫応答を刺激するための方法であって、方法が、個体に、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を有効量投与するステップを含み、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法が提供される。一部の実施形態では、本方法は、アジュバントを個体に全身投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、全身アジュバントは、無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に投与される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、アジュバントを含む。一部の実施形態では、全身アジュバントは、細胞外アジュバントである。一部の実施形態では、全身アジュバントは、小胞外アジュバントである。一部の実施形態では、個体における抗原に対する既存の免疫応答を刺激する方法は、抗原に対する免疫応答を増強する。
個体における疾患を処置または予防するための方法

ある特定の態様では、個体における疾患を処置するための方法であって、方法が、個体に、疾患関連抗原を含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原に対する免疫応答が、疾患の状態を軽快させ、疾患関連抗原を含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法が提供される。

ある特定の態様では、個体における疾患を予防するための方法であって、方法が、個体に、疾患関連抗原を含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原に対する免疫応答が、疾患の発症を予防し、疾患関連抗原を含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法が提供される。

ある特定の態様では、抗原に対して個体にワクチン接種するための方法であって、方法が、個体に、抗原を含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原を含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法が提供される。

本明細書に記載されている方法のいずれかに係る一部の実施形態では、本方法は、アジュバントを個体に全身投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、全身アジュバントは、無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に投与される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、アジュバントを含む。一部の実施形態では、全身アジュバントは、細胞外アジュバントである。一部の実施形態では、全身アジュバントは、小胞外アジュバントである。

他の態様では、個体における疾患を処置するための方法であって、方法が、個体に、疾患関連抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原に対する免疫応答が、疾患の状態を軽快させ、疾患関連抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法が提供される。

ある特定の態様では、個体における疾患を予防するための方法であって、方法が、個体に、疾患関連抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原に対する免疫応答が、疾患の発症を予防し、疾患関連抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法が提供される。

ある特定の態様では、抗原に対して個体にワクチン接種するための方法であって、方法が、個体に、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法が提供される。

ある特定の態様では、個体における疾患を処置するための方法であって、疾患関連抗原に対する免疫応答が、疾患の状態を軽快させ、方法が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）抗原を含む無核細胞由来の小胞を、個体に投与するステップとを含む、方法が提供される。

ある特定の態様では、個体における疾患を予防するための方法であって、疾患関連抗原に対する免疫応答が、疾患の発症を予防し、方法が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）無核細胞由来の小胞を個体に投与するステップとを含む、方法が提供される。

ある特定の態様では、抗原に対して個体にワクチン接種するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）抗原を含む無核細胞由来の小胞を、個体に投与するステップとを含む方法が提供される。

一部の実施形態では、本方法は、アジュバントを個体に全身投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、全身アジュバントは、無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に投与される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、アジュバントを含む。一部の実施形態では、全身アジュバントは、細胞外アジュバントである。一部の実施形態では、全身アジュバントは、小胞外アジュバントである。

他の態様では、個体における疾患を処置するための方法であって、疾患関連抗原に対する免疫応答が、疾患の状態を軽快させ、方法が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、疾患関連抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を、個体に投与するステップとを含む、方法が提供される。

一部の態様では、個体における疾患を予防するための方法であって、疾患関連抗原に対する免疫応答が、疾患の発症を予防し、方法が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を、個体に投与するステップとを含む、方法が提供される。

ある特定の態様では、抗原に対して個体にワクチン接種するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を、個体に投与するステップとを含む方法が提供される。

本明細書に記載されている方法のいずれかに係る一部の実施形態では、疾患は、がん、感染性疾患またはウイルス関連疾患である。一部の実施形態では、がんは、頭頸部、子宮頸部、子宮、直腸、陰茎、卵巣、精巣、骨、軟部組織、皮膚（黒色腫）、胃、腸、結腸、前立腺、乳、食道、肝臓、肺、膵、脳または血液がんのうち１種または複数を含む。一部の実施形態では、感染性疾患またはウイルス関連疾患は、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＲＳＶまたはＫＳＨＶのうち１種または複数に関連する。一部の実施形態では、疾患関連抗原は、ＨＰＶ抗原またはＨＰＶ関連抗原である。一部の実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８抗原である。一部の実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶＥ６抗原またはＨＰＶＥ７抗原である。一部の実施形態では、ＨＰＶ関連疾患は、ＨＰＶ関連がんである。一部の実施形態では、ＨＰＶ関連がんは、子宮頸部がん、肛門がん、中咽頭がん、腟がん、外陰部がん、陰茎がん、皮膚がんまたは頭頸部がんである。一部の実施形態では、ＨＰＶ関連疾患は、ＨＰＶ関連感染性疾患である。一部の実施形態では、ＨＰＶ関連疾患は、尋常性疣贅、足底疣贅、扁平疣贅、肛門性器疣贅、肛門病変、表皮異形成、局所性上皮過形成、口腔パピローマ、いぼ状嚢胞、喉頭乳頭腫、扁平上皮内病変（ＳＩＬ）、子宮頸部上皮内新生物（ＣＩＮ）、外陰部上皮内新生物（ＶＩＮ）および腟上皮内新生物（ＶＡＩＮ）を含むことができる。ある特定の実施形態では、疾患関連抗原は、ＥＢＶ抗原またはＥＢＶ関連抗原である。一部の実施形態では、ＥＢＶ抗原またはＥＢＶ関連抗原は、ＥＢＮＡ－１、ＥＢＮＡ－２、ＥＢＮＡ－３Ａ、ＥＢＮＡ－３Ｂ、ＥＢＮＡ－３Ｃ、ＥＢＮＡ－ＬＰ、ＬＭＰ－１、ＬＭＰ－２Ａ、ＬＭＰ－２ＢまたはＥＢＥＲのうち１種または複数である。一部の実施形態では、ウイルス関連疾患は、ＥＢＶ関連疾患である。一部の実施形態では、ＥＢＶ関連疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）である。一部の実施形態では、疾患関連抗原は、ヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）抗原またはＨＣＭＶ関連抗原である。一部の実施形態では、抗原は、系統Ｍｅｒｌｉｎ、Ｔｏｌｅｄｏ、Ｄａｖｉｓ、Ｅｓｐ、Ｋｅｒｒ、Ｓｍｉｔｈ、ＴＢ４０Ｅ、ＴＢ４０Ｆ、ＡＤ１６９またはＴｏｗｎｅＨＣＭＶのいずれかに由来する。一部の実施形態では、ＨＣＭＶ抗原またはＨＣＭＶ関連抗原は、ｐＵＬ４８、ｐＵＬ４７、ｐＵＬ３２、ｐＵＬ８２、ｐＵＬ８３およびｐＵＬ９９、ｐＵＬ６９、ｐＵＬ２５、ｐＵＬ５６、ｐＵＬ９４、ｐＵＬ９７、ｐＵＬ１４４またはｐＵＬ１２８のうち１種または複数に由来する。一部の実施形態では、ウイルス関連疾患は、ＨＣＭＶ関連疾患である。他の実施形態では、疾患関連抗原は、ＨＩＶ抗原またはＨＩＶ関連抗原である。一部の実施形態では、ウイルス関連疾患は、ＨＩＶ関連疾患である。日和見感染は、ＨＩＶ患者を含む、衰弱した免疫系を有する個体においてより高頻度で発生し、より重篤となる感染である。一部の実施形態では、ＨＩＶ関連疾患は、日和見感染であり、これは、気管支、気管、食道または肺のカンジダ症；浸潤性子宮頸部がん；コクシジオイデス症；クリプトコッカス症；慢性腸クリプトスポリジウム症、サイトメガロウイルス疾患；ＨＩＶ関連脳症；ＨＳＶ関連慢性潰瘍または気管支炎、肺臓炎または食道炎；ヒストプラスマ症；慢性腸イソスポーラ症；カポジ肉腫；リンパ腫；結核；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍコンプレックス（ＭＡＣ）；Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓｃａｒｉｎｉｉ肺炎（ＰＣＰ）；再発性肺炎；進行性多巣性白質脳症；再発性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ敗血症；脳のトキソプラズマ症；およびＨＩＶが原因の消耗症候群を含むことができるがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントが無核細胞由来の小胞に進入するように、インプット無核細胞を狭窄に通して無核細胞由来の小胞を形成することにより生成された、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を個体に導入することにより、個体を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、自家細胞である。例えば、インプット無核細胞は、個体（例えば、患者）から単離され、開示されている方法に従って処理され、その結果得られる無核細胞由来の小胞は、同じ個体に戻し導入される。したがって、一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、個体にとって自家である。他の実施形態では、インプット無核細胞は、同種異系細胞である。例えば、無核細胞は、異なる個体（例えば、ドナー）から単離され、開示されている方法に従って処理され、その結果得られる無核細胞由来の小胞は、第１の個体（例えば、患者）に導入される。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、個体にとって同種異系である。一部の実施形態では、複数の個体由来のインプット無核細胞のプールは、開示されている方法に従って処理され、無核細胞由来の小胞のプールは、第１の個体（例えば、患者）に導入される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、個体から単離され、開示された方法に従って処理され、無核細胞由来の小胞は、異なる個体に導入される。一部の実施形態では、インプット無核細胞の集団は、個体（患者）または異なる個体から単離され、狭窄に通されて、抗原および／またはアジュバントの送達が達成され、次に、無核細胞由来の小胞の集団は、患者に再注入されて、治療応答が増大する。

一部の態様では、本発明は、抗原および／またはアジュバントが無核細胞由来の小胞に進入するように、インプット無核細胞を狭窄に通して無核細胞由来の小胞を形成することにより生成された、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を個体に導入することにより、患者を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、処置は、斯かる無核細胞由来の小胞を個体に導入する複数の（２、３、４、５、６回またはそれよりも多い回数のいずれか等の）ステップを含む。例えば、一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントが無核細胞由来の小胞に進入するように、インプット無核細胞を狭窄に通して無核細胞由来の小胞を形成することにより生成された、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を個体に、２、３、４、５、６回またはそれよりも多い回数投与することにより、個体を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、いずれか２回の連続した細胞投与の間の持続時間は、少なくとも約１日間（これらの値の間のいずれかの範囲を含む、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１年間またはそれよりも長い時間のいずれか等）である。

一部の実施形態では、インプット無核細胞は、個体から単離され、開示されている方法に従って処理され、その結果得られる抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞は、同じ個体（例えば、患者）に戻し導入される。例えば、インプット無核細胞の集団は、個体から単離され、狭窄に通されて、抗原および／またはアジュバントの送達が達成され、次に、その結果得られる無核細胞由来の小胞は、個体に再注入されて、治療免疫応答が増大する。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、個体から単離され、開示された方法に従って処理され、その結果得られる無核細胞由来の小胞は、個体に戻し導入される。例えば、インプット無核細胞の集団は、個体から単離され、狭窄に通されて、抗原および／またはアジュバントの送達が達成され、次に、その結果得られる無核細胞由来の小胞は、個体に再注入されて、個体における免疫応答が刺激および／または増強される。

一部の実施形態では、インプット無核細胞は、汎用血液ドナー（例えば、Ｏ型血液ドナー）から単離され、次いで、後の狭窄媒介性送達のために貯蔵および／または凍結される。一部の実施形態では、抗原は、個体から単離され、汎用ドナーから単離されたインプット無核細胞に送達される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、血液ドナーから単離され、次いで、後の狭窄媒介性送達（ＳＱＺ）のために貯蔵および／または凍結される。一部の実施形態では、抗原は、個体から単離され、血液ドナーから単離されたインプット無核細胞に送達される。一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞は、上述の狭窄媒介性送達によって生成される。一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞は、個体に導入される。一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞は、貯蔵および／または凍結される（例えば、後の処置のため）。一部の実施形態では、個体は、血液ドナーと適合した血液型を有する。一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞は、上述の狭窄媒介性送達によって生成される。一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞は、個体に導入される。一部の実施形態では、個体は、血液ドナーと適合した血液型を有する。一部の実施形態では、個体は、血液ドナーと適合しない血液型を有する。

一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントが無核細胞由来の小胞に進入するように、インプット無核細胞を狭窄に通して無核細胞由来の小胞を形成することにより生成された抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を個体に導入することにより、個体における疾患を予防する方法が提供される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、自家細胞である。例えば、インプット無核細胞は、個体（例えば、患者）から単離され、開示されている方法に従って処理され、その結果得られる無核細胞由来の小胞は、同じ個体に戻し導入される。したがって、一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、個体にとって自家である。他の実施形態では、インプット無核細胞は、同種異系細胞である。例えば、無核細胞は、異なる個体（例えば、ドナー）から単離され、開示されている方法に従って処理され、その結果得られる無核細胞由来の小胞は、第１の個体（例えば、患者）に導入される。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、個体にとって同種異系である。一部の実施形態では、複数の個体由来のインプット無核細胞のプールは、開示されている方法に従って処理され、無核細胞由来の小胞のプールは、第１の個体（例えば、患者）に導入される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、個体から単離され、開示された方法に従って処理され、無核細胞由来の小胞は、異なる個体に導入される。一部の実施形態では、インプット無核細胞の集団は、個体（患者）または異なる個体から単離され、狭窄に通されて、抗原および／またはアジュバントの送達が達成され、次に、無核細胞由来の小胞の集団は、患者に再注入されて、予防応答が増大する。

一部の実施形態では、予防方法は、本明細書に記載されている無核細胞由来の小胞を個体に投与する複数の（２、３、４、５、６回またはそれよりも多い回数のいずれか等の）ステップを含む。例えば、一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントが無核細胞由来の小胞に進入するように、インプット無核細胞を狭窄に通して無核細胞由来の小胞を形成することにより生成された、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を個体に２、３、４、５、６回またはそれよりも多い回数投与することにより、抗原に対して個体にワクチン接種する方法が提供される。一部の実施形態では、いずれか２回の連続した細胞投与の間の持続時間は、少なくとも約１日間（これらの値の間のいずれかの範囲を含む、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１年間またはそれよりも長い時間のいずれか等）である。

一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントが無核細胞由来の小胞に進入するように、インプット無核細胞を狭窄に通して無核細胞由来の小胞を形成することにより生成された抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を個体に導入することにより、抗原に対して個体にワクチン接種する方法が提供される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、自家細胞である。例えば、インプット無核細胞は、個体（例えば、患者）から単離され、開示されている方法に従って処理され、その結果得られる無核細胞由来の小胞は、同じ個体に戻し導入される。したがって、一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、個体にとって自家である。他の実施形態では、インプット無核細胞は、同種異系細胞である。例えば、無核細胞は、異なる個体（例えば、ドナー）から単離され、開示されている方法に従って処理され、その結果得られる無核細胞由来の小胞は、第１の個体（例えば、患者）に導入される。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、個体にとって同種異系である。一部の実施形態では、複数の個体由来のインプット無核細胞のプールは、開示されている方法に従って処理され、無核細胞由来の小胞のプールは、第１の個体（例えば、患者）に導入される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、個体から単離され、開示された方法に従って処理され、無核細胞由来の小胞は、異なる個体に導入される。一部の実施形態では、インプット無核細胞の集団は、個体（患者）または異なる個体から単離され、狭窄に通されて、抗原および／またはアジュバントの送達が達成され、次に、無核細胞由来の小胞の集団は、患者に再注入されて、予防応答が誘導される。

一部の実施形態では、ワクチン接種は、本明細書に記載されている無核細胞由来の小胞を個体に投与する複数の（２、３、４、５、６回またはそれよりも多い回数のいずれか等の）ステップを含む。例えば、一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントが無核細胞由来の小胞に進入するように、インプット無核細胞を狭窄に通して無核細胞由来の小胞を形成することにより生成された、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を個体に２、３、４、５、６回またはそれよりも多い回数投与することにより、抗原に対して個体にワクチン接種する方法が提供される。一部の実施形態では、いずれか２回の連続した細胞投与の間の持続時間は、少なくとも約１日間（これらの値の間のいずれかの範囲を含む、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１年間またはそれよりも長い時間のいずれか等）である。

上述の方法のいずれかは、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏで実行される。ｉｎｖｉｖｏ適用のため、デバイスを血管内腔に植え込むことができる、例えば、動脈または静脈内のインライン（ｉｎ－ｌｉｎｅ）ステント。一部の実施形態では、本方法は、患者細胞のｅｘｖｉｖｏ処置および患者への細胞の即時再導入のためのベッドサイドシステムの一部として使用される。斯かる方法は、個体における免疫応答を増強および／または刺激する手段として用いることができる。一部の実施形態では、本方法は、典型的な病院検査室において、最低限訓練された技術者により行うことができる。一部の実施形態では、患者に操作される処置システムを使用することができる。一部の実施形態では、本方法は、インライン血液処置システムを使用して行われ、インライン血液処置システムにおいて、血液が患者から直接的に転用され、狭窄に通され、血液中の無核細胞に由来する小胞の形成ならびに血液中の無核細胞由来の小胞への抗原および／またはアジュバントの送達をもたらし、処置後に患者に戻るように直接的に輸注される。

本明細書に記載されている方法のいずれかに係る一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、医薬製剤中に存在する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、全身投与される。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内または腹腔内投与される。ある特定の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、治療剤と組み合わせて、個体に投与される。一部の実施形態では、治療剤は、無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に投与される。

一部の実施形態では、治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤および／またはサイトカインである。一部の実施形態では、治療剤は、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２（その天然または修飾形態のいずれか）、ＩＬ－１０またはＩＬ－１５のうち１種または複数を含む。一部の実施形態では、治療剤は、１種または複数の形態の免疫療法である。免疫療法は、モノクローナル抗体、免疫チェックポイント阻害剤、サイトカイン、がんを処置するためのワクチン、および養子細胞移入を含むがこれらに限定されない。本明細書に記載されている方法のいずれかに係る一部の実施形態では、本方法は、免疫療法の投与をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、１種または複数の治療剤を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ１、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）およびＢＴＬＡのうちいずれか１種に標的化される。一部の実施形態では、治療剤は、二重特異性薬剤；例えば、サイトカイン成分および標的化成分を含む二重特異性薬剤である。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、化学療法または放射線療法と組み合わせて、個体に投与される。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、抗原提示を改善する、Ｔ細胞増殖を改善する、および／または腫瘍微小環境を改善する１種または複数の薬剤と組み合わせて、個体に投与される。
無核細胞

本明細書に記載されている方法のいずれかに係る一部の実施形態では、インプット無核細胞は、哺乳動物細胞である。無核細胞は、核を欠く。一部の実施形態では、無核細胞は、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタまたはウサギ細胞である。一部の実施形態では、無核細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、無核細胞は、非哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、無核細胞は、ニワトリ、カエル、昆虫、魚類または線虫細胞である。

一部の実施形態では、無核細胞は、赤血球細胞である。赤血球細胞（ＲＢＣ）は、柔軟かつ卵円形の両凹円盤であり、細胞質は、酸素担体生体分子ヘモグロビンに富む。ＲＢＣは、人体の全身で酸素送達および二酸化炭素除去のための主要手段として機能する。ＲＢＣは、循環中に最大１２０日間留まることができ、その後、肝臓および脾臓におけるクリアランスにより身体から除去される。一部の実施形態では、無核細胞は、ＲＢＣの前駆体である。一部の実施形態では、無核細胞は、網状赤血球である。網状赤血球は、無核未成熟（未だ両凹でない）赤血球細胞であり、典型的に、人体における赤血球細胞の約１％を構成する。成熟赤血球細胞は、赤血球とも称される。一部の実施形態では、無核細胞は、赤血球である。一部の実施形態では、無核細胞は、血小板である。スロンボサイト（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ）とも呼ばれる血小板は、その機能が凝血に関与する血液の成分である。血小板は、直径２～３μｍの両凸円板状（レンズ形の）構造である。

本明細書に記載されている方法のいずれかに係る一部の実施形態では、免疫原性環境における抗原の提示は、抗原に対する免疫応答を増強する、および／または抗原に対する免疫応答を刺激する。肝臓および脾臓の免疫原性環境において排除され得る、無核細胞由来の小胞等、アポトーシス小体に由来する抗原は、Ｔ細胞の活性化により、抗原に対する免疫応答を刺激および／または増強することができる。一部の実施形態では、免疫応答は、抗原特異的である。赤血球細胞由来の小胞等の無核細胞由来の小胞は、限定された寿命を有し、自己修復することができず、その後に血流からの無核細胞由来の小胞の除去をもたらす、アポトーシスに類似したプロセスであるエリプトーシスを引き起こす。一部の実施形態では、抗原は、免疫原性環境内で無核細胞由来の小胞のエリプトーシス後に放出され得、そこで抗原はその後、抗原提示細胞によって貪食、プロセシングおよび提示される。一部の実施形態では、抗原を含む無核細胞由来の小胞は、抗原提示細胞によってファゴサイトーシスされ、抗原はその後、抗原提示細胞によってプロセシングおよび提示される。一部の実施形態では、抗原を含む無核細胞由来の小胞は、常在性マクロファージによってファゴサイトーシスされ、抗原はその後、常在性マクロファージによってプロセシングおよび提示される。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞に含有される抗原はその後に提示される。一部の実施形態では、免疫原性環境における抗原の提示は、抗原に対する免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、抗原は、免疫原性環境においてプロセシングされる。一部の実施形態では、免疫応答は、抗原特異的である。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、アジュバントを含む。一部の実施形態では、アジュバントは、免疫原性環境を生成または促進し、前記免疫原性環境における抗原の提示は、抗原に対する免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激は、複数の抗原に対する免疫応答の刺激を含む、多特異性である。

本明細書に記載されている方法のいずれかに係る一部の実施形態では、本方法は、インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄に通すステップであって、前記狭窄が、インプット無核細胞を変形させ、これにより、抗原および／またはアジュバントが、無核細胞由来の小胞に進入するように、インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップを含む。一部の実施形態では、抗原は、免疫原性環境において提示される。一部の実施形態では、アジュバントは、免疫原性環境を生成または促進し、免疫原性環境における抗原の提示は、抗原に対する免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、抗原は、免疫原性環境においてプロセシングされる。一部の実施形態では、免疫刺激は、抗原特異的である。一部の実施形態では、免疫刺激は、複数の抗原に対する免疫応答の刺激を含む、多特異性である。

本明細書に記載されている方法のいずれかに係るある特定の実施形態では、本方法は、第１のインプット無核細胞を含む第１の細胞懸濁液を狭窄に通すステップであって、前記狭窄が、細胞を変形させ、これにより、抗原が、第１のインプット無核細胞の撹乱に由来する小胞に進入するように、第１のインプット無核細胞の撹乱を引き起こす、ステップと、第２のインプット無核細胞を含む第２の細胞懸濁液を狭窄に通すステップであって、前記狭窄が、第２のインプット無核細胞を変形させ、これにより、アジュバントが、第２のインプット無核細胞の撹乱に由来する小胞に進入するように、第２のインプット無核細胞の撹乱を引き起こす、ステップと、第１のインプット無核細胞に由来する小胞および第２のインプット無核細胞に由来する小胞を個体に導入し、これにより、抗原に対する免疫応答を刺激するステップとを含む。したがって、一部の実施形態では、第１のインプット無核細胞に由来する小胞は、抗原を含み、第２のインプット無核細胞に由来する小胞は、アジュバントを含む。一部の実施形態では、抗原は、免疫原性環境において提示される。一部の実施形態では、アジュバントは、免疫原性環境を生成または促進し、免疫原性環境における抗原の提示は、抗原に対する免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、抗原は、免疫原性環境においてプロセシングされる。一部の実施形態では、第１のインプット無核細胞に由来する小胞および第２のインプット無核細胞に由来する小胞は、同時に導入される。一部の実施形態では、第１のインプット無核細胞に由来する小胞および第２のインプット無核細胞に由来する小胞は、逐次に導入される。一部の実施形態では、第１のインプット無核細胞に由来する小胞は、第２のインプット無核細胞に由来する小胞の導入の前に、個体に導入される。一部の実施形態では、第１のインプット無核細胞に由来する小胞は、第２のインプット無核細胞に由来する小胞の導入の約１分、５分、１０分、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間または２４時間のいずれかをより多くえた時間前に、個体に導入される。一部の実施形態では、第１のインプット無核細胞に由来する小胞は、第２のインプット無核細胞に由来する小胞の導入の約１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日のいずれかをより多くえた時間前に、個体に導入される。一部の実施形態では、第２のインプット無核細胞に由来する小胞は、第１のインプット無核細胞に由来する小胞の導入の前に、個体に導入される。一部の実施形態では、第２のインプット無核細胞に由来する小胞は、第１のインプット無核細胞に由来する小胞の導入の約１分、５分、１０分、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間または２４時間のいずれかをより多くえた時間前に、個体に導入される。一部の実施形態では、第２のインプット無核細胞に由来する小胞は、第１のインプット無核細胞に由来する小胞の導入の約１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日のいずれかをより多くえた時間前に、個体に導入される。一部の実施形態では、免疫刺激は、抗原特異的である。一部の実施形態では、免疫刺激は、複数の抗原に対する免疫応答の刺激を含む、多特異性である。

一部の実施形態では、刺激および／または増強された免疫応答は、増加したＴ細胞応答を含む。例えば、増加したＴ細胞応答は、増加したＴ細胞活性化もしくは増殖、増加したＴ細胞生存、または増加した細胞機能性を限定することなく含むことができる。一部の実施形態では、増加したＴ細胞応答は、増加したＴ細胞活性化を含む。一部の実施形態では、増加したＴ細胞応答は、増加したＴ細胞生存を含む。一部の実施形態では、増加したＴ細胞応答は、増加したＴ細胞増殖を含む。一部の実施形態では、増加したＴ細胞応答は、増加したＴ細胞機能性を含む。例えば、増加したＴ細胞機能性は、モジュレートされたサイトカイン分泌、炎症部位への増加したＴ細胞遊走、および増加したＴ細胞の細胞傷害活性を限定することなく含むことができる。一部の実施形態では、刺激および／または増強された免疫応答は、増加した炎症性サイトカイン産生および／もしくは分泌、ならびに／または減少した抗炎症性サイトカイン産生および／もしくは分泌を含む。一部の実施形態では、刺激および／または増強された免疫応答は、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－２、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）から選択される１種または複数の炎症性サイトカインの増加した産生および／または分泌を含む。一部の実施形態では、刺激および／または増強された免疫応答は、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－３５、ＩＦＮ－αおよびトランスフォーミング増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－β）から選択される１種または複数の抗炎症性サイトカインの減少した産生および／または分泌を含む。一部の実施形態では、刺激および／または増強された免疫応答は、Ｔ細胞表現型の変化を含む。例えば、Ｔ細胞状態は、調節性（Ｔｒｅｇ）または抗炎症性表現型から炎症促進性表現型に変化し得る。一部の実施形態では、刺激および／または増強された免疫応答は、Ｔ細胞の非特異的活性化を抑制し、これは、そうでなければ、その後、細胞死をもたらし得る。一部の実施形態では、刺激および／または増強された免疫応答は、抑制されたＴｒｅｇ応答を含む。一部の実施形態では、刺激および／または増強された免疫応答は、増加したＢ細胞応答を含む。一部の実施形態では、増加したＢ細胞応答は、増加した抗体産生を含む。
無核細胞由来の小胞

一部の態様では、本願は、親無核細胞から調製された無核細胞由来の小胞であって、次の特性：（ａ）親無核細胞と比較して減少した哺乳動物における循環半減期、（ｂ）親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベル、（ｃ）球状の形態、（ｄ）親無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベル、または（ｅ）親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生のうち１種または複数を有する無核細胞由来の小胞を提供する。

ある特定の態様では、抗原を含む無核細胞由来の小胞であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製される、無核細胞由来の小胞が提供される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、アジュバントを含む。

ある特定の態様では、アジュバントを含む無核細胞由来の小胞であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、アジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をアジュバントと共にインキュベートし、これにより、アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製される、無核細胞由来の小胞が提供される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、抗原を含む。

ある特定の態様では、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製される、無核細胞由来の小胞が提供される。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、赤血球細胞由来の小胞または血小板由来の小胞である。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、赤血球由来の小胞または網状赤血球由来の小胞である。

本明細書に記載されている無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、インプットまたは親無核細胞は、哺乳動物細胞である。無核細胞は、核を欠く。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタまたはウサギ細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、非哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、ニワトリ、カエル、昆虫、魚類または線虫細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球細胞の前駆体である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、網状赤血球である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、血小板である。

一部の実施形態では、免疫原性環境における抗原の提示は、抗原に対する免疫応答を増強する、または抗原に対する免疫応答を誘導する。肝臓および脾臓の免疫原性環境において排除され得る無核細胞由来の小胞等のエリプトーシス小体（ｅｒｙｐｔｏｔｉｃｂｏｄｙ）に由来する抗原は、Ｔ細胞の活性化により、抗原に対する免疫応答を刺激および／または増強することができる。一部の実施形態では、免疫応答は、抗原特異的である。ＲＢＣ由来の小胞等の無核細胞由来の小胞は、限定された寿命を有し、自己修復することができず、アポトーシスに類似したプロセスであるエリプトーシスを引き起こし、これにより、血流からの無核細胞由来の小胞の除去がもたらされる。一部の実施形態では、抗原は、免疫原性環境内で無核細胞由来の小胞のエリプトーシス後に放出され得、そこで抗原はその後、抗原提示細胞によって貪食、プロセシングおよび提示される。一部の実施形態では、抗原を含有する無核細胞由来の小胞は、マクロファージ等の抗原提示細胞によってファゴサイトーシスされ、抗原はその後、抗原提示細胞によってプロセシングおよび提示される。一部の実施形態では、抗原提示細胞は、常在性マクロファージである。

一部の実施形態では、インプットまたは親無核細胞は、赤血球細胞である。一部の実施形態では、インプットまたは親無核細胞は、血小板である。一部の実施形態では、赤血球細胞は、赤血球である。一部の実施形態では、赤血球細胞は、網状赤血球である。

一部の実施形態では、哺乳動物における無核細胞由来の小胞の循環半減期は、インプットまたは親無核細胞と比較して減少している。無核細胞、例えば、赤血球細胞等の細胞または無核細胞由来の小胞の半減期を測定するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｆｒａｎｃｏ，Ｒ．Ｓ．，ＴｒａｎｓｆｕｓＭｅｄＨｅｍｏｔｈｅｒ，３９，２０１２を参照されたい。例えば、一部の実施形態では、無核細胞または無核細胞由来の小胞の半減期を測定するための方法は、コホート標識技法またはランダム標識技法を含む。一部の実施形態では、無核細胞または無核細胞由来の小胞の半減期を測定するための方法は、細胞または小胞を標識、再注入し、再注入後の消失を測定するステップを含む。一部の実施形態では、本願に包含される無核細胞または無核細胞由来の小胞の半減期を測定するための方法は、インプットもしくは親無核細胞またはインプットもしくは親無核細胞の集団を含む対照等の適切な参照対照（複数可）の半減期を測定するステップを含む。

一部の実施形態では、哺乳動物における循環半減期は、インプットまたは親無核細胞と比較して、約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％のいずれかをより多くえる等、約５０％をより多くえて減少している。一部の実施形態では、哺乳動物における循環半減期は、インプットまたは親無核細胞と比較して、約７０％～約９９．９％、約８５％～約９９．９％または約９５％～約９９．９％のいずれか等、約５０％～約９９．９％減少している。一部の実施形態では、哺乳動物における循環半減期は、インプットまたは親無核細胞と比較して、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％のいずれかだけ減少している。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の循環半減期は、約５分間、１０分間、１５分間、３０分間、１時間、６時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間または１０日間未満のいずれかである。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の循環半減期は、約０．５分間、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間、３時間、６時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、１０日間、２０日間、３０日間、４０日間、５０日間、６０日間、７０日間、８０日間、９０日間または１００日間のいずれかである。

一部の実施形態では、インプットまたは親無核細胞は、ヒト細胞であり、無核細胞由来の小胞の循環半減期は、約５分間、１０分間、１５分間、３０分間、１時間、６時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間または１０日間未満のいずれかである。一部の実施形態では、インプットまたは親無核細胞は、ヒト細胞であり、無核細胞由来の小胞の循環半減期は、約０．５分間、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間、３時間、６時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、１０日間、２０日間、３０日間、４０日間、５０日間、６０日間、７０日間、８０日間、９０日間または１００日間未満のいずれかである。

一部の実施形態では、インプットまたは親無核細胞は、赤血球細胞であり、無核細胞由来の小胞におけるヘモグロビンレベルは、インプットまたは親無核細胞と比較して減少している。無核細胞、例えば、赤血球細胞等の細胞、または無核細胞由来の小胞、例えば、赤血球細胞由来の小胞のヘモグロビンレベルを測定する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｒ．，ＪＢｌｏｏｄＭｅｄ，８，２０１７を参照されたい。例えば、一部の実施形態では、本方法は、代謝前駆体または産物を測定して、ヘモグロビンのターンオーバーを決定するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、１種または複数のヘモグロビン由来の（Ｈｂ）ペプチドを測定するステップを含む。一部の実施形態では、本願に包含される無核細胞または無核細胞由来の小胞のヘモグロビンレベルを測定するための方法は、インプットもしくは親無核細胞またはインプットもしくは親無核細胞の集団を含む対照等の適切な参照対照（複数可）のヘモグロビンのレベルを測定するステップを含む。

一部の実施形態では、無核細胞は、親無核細胞と比較した、細胞内成分のレベルの低減等の損失によって特徴付けされる。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞におけるヘモグロビンレベルは、インプットまたは親無核細胞と比較して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％のいずれかだけ減少している。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞におけるヘモグロビンレベルは、インプットまたは親無核細胞と比較して、約７０％～約９９．９％、約８５％～約９９．９％または約９５％～約９９．９％のいずれか等、約５０％～約９９．９％減少している。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞におけるヘモグロビンレベルは、インプットまたは親無核細胞と比較して、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％のいずれかだけ減少している。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、ヘモグロビンを欠如する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞におけるヘモグロビンレベルは、インプットまたは親無核細胞におけるヘモグロビンレベルの約０．０１％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％のいずれかである。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞における１種または複数のヘモグロビン（Ｈｂ）ペプチドのレベルは、インプットまたは親無核細胞と比較して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または１００％のいずれかだけ減少している。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞における１種または複数のＨｂペプチドのレベルは、インプット無核細胞と比較して、約７０％～約９９．９％、約８５％～約９９．９％または約９５％～約９９．９％のいずれか等、約５０％～約９９．９％減少している。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞における１種または複数のＨｂペプチドのレベルは、インプットまたは親無核細胞と比較して、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％のいずれかだけ減少している。

一部の実施形態では、インプットまたは親無核細胞は、赤血球であり、無核細胞由来の小胞の形態は、インプットまたは親無核細胞の形態からモジュレートされる。形態は、例えば、細胞または細胞由来の小胞の形状、構造、幾何学、強度、形態、平滑性、粗度、円形度、体積、表面積および／またはサイズの分類に関係する。形態を決定（測定等）するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｂｏｕｔｒｏｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３，２０１５；Ｇｉｒａｓｏｌｅ，Ｍ．ｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａＢｉｏｍｅｍｂｒ，１７６８，２００７；およびＣｈｅｎｅｔａｌ．，ＣｏｍｐｕｔＭａｔｈＭｅｔｈｏｄｓＭｅｄ，２０１２を参照されたい。一部の実施形態では、形態を決定するための方法は、ハイコンテンツイメージングを含む。例えば、細胞の形態は、ヘキスト色素による染色と、続く自動ハイコンテンツ画像解析によって評価することができる。他の例では、形態は、フローサイトメトリーからの前方および側方散布図におけるシフトにより決定することができる。一部の実施形態では、インプットまたは親無核細胞は、赤血球であり、無核細胞由来の小胞は、球状の形態である。一部の実施形態では、インプットまたは親無核細胞は、赤血球であり、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、低減された両凹形状を有する。一部の実施形態では、本願に包含される無核細胞または無核細胞由来の小胞の形態を測定するための方法は、インプットもしくは親無核細胞またはインプットもしくは親無核細胞の集団を含む対照等の適切な参照対照（複数可）の形態を測定するステップを含む。

一部の実施形態では、インプットまたは親無核細胞は、赤血球であり、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％のいずれかをより多くえた低減等、低減された両凹形状を有する。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、実質的に球状の形態を含む球状の形態によって特徴付けされる。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の球状の形態は、定性的に評価される。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の球状の形態は、定量的に評価される。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のいずれかをより多くえた低減等、低減した表面積対体積比を有する。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の複数の直径測定値の各直径測定値の間の変形形態は、約４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満のいずれか等、約５０％未満であり、複数の直径測定値は、無核細胞由来の小胞の異なるポイントで直径を測定する少なくとも２つの直径測定値を含む。

一部の実施形態では、懸濁液における無核細胞由来の小胞の直径等の最小寸法は、約６μｍ～約７μｍまたは約６．２５μｍ～約６．７５μｍのいずれか等、約５μｍ～約７．２５μｍである。一部の実施形態では、懸濁液における無核細胞由来の小胞の直径等の最小寸法は、少なくとも約５．２５μｍ、５．５μｍ、５．７５μｍ、６μｍ、６．２５μｍ、６．５μｍ、６．７５μｍ、７μｍまたは７．２５μｍのいずれか等、少なくとも約５μｍである。一部の実施形態では、懸濁液における無核細胞由来の小胞の直径等の最大寸法は、約６μｍ～約７μｍまたは約６．２５μｍ～約６．７５μｍのいずれか等、約５μｍ～約７．２５μｍである。一部の実施形態では、懸濁液における無核細胞由来の小胞の直径等の最大寸法は、約７μｍ、６．７５μｍ、６．５μｍ、６．２５μｍ、６μｍ、５．７５μｍ、５．５μｍ、５．２５μｍまたは５μｍ以下のいずれか等、約７．２５μｍ以下である。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、次の特性：（ａ）親無核細胞と比較して減少した哺乳動物における循環半減期、（ｂ）親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベル、（ｃ）球状の形態、（ｄ）親無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベル、または（ｅ）親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生のうち１種または複数を示す。

一部の実施形態では、インプットまたは親無核細胞は、赤血球細胞または赤血球であり、無核細胞由来の小胞は、赤血球細胞ゴースト（ＲＢＣゴースト）である。

一部の実施形態では、無核細胞は、インプットまたは親無核細胞と比較した、特性のレベルの増加等の獲得によって特徴付けされる。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、増加した表面ホスファチジルセリンレベルを有する。細胞外膜表面におけるホスファチジルセリン露出は、アポトーシスの証明であり、貪食を促進する様式で、ファゴサイト表面における受容体によって認識される。無核細胞、例えば、赤血球細胞等の細胞または無核細胞由来の小胞のホスファチジルセリンレベル（表面ホスファチジルセリンレベル等）を測定する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｍｏｒｉｔａ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，ＪＬｉｐｉｄＲｅｓ，５３，２０１２；Ｋａｙ，Ｊ．Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ），１１，２０１１；およびＦａｂｉｓｉａｋＪＰｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ，１１０５，２０１４を参照されたい。一部の実施形態では、本願に包含される無核細胞または無核細胞由来の小胞のホスファチジルセリンレベルを測定するための方法は、インプットもしくは親無核細胞またはインプットもしくは親無核細胞の集団を含む対照等の適切な参照対照（複数可）のホスファチジルセリンレベルを測定するステップを含む。

一部の実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、約２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍または２５倍のいずれかをより多くえて多い等、約１．５倍をより多くえて多いホスファチジルセリンをその表面に有する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、約２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍または２５倍のいずれかをより多くえて多い等、約１．５倍をより多くえて多いホスファチジルセリンをその表面に有する。

一部の実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、単位体積当たり約２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍または２５倍のいずれかをより多くえて多い等、約１．５倍をより多くえて多いホスファチジルセリンをその表面に有する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、単位体積当たり約２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍または２５倍のいずれかをより多くえて多い等、約１．５倍をより多くえて多いホスファチジルセリンをその表面に有する。

一部の実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、単位表面積当たり約２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍または２５倍のいずれかをより多くえて多い等、約１．５倍をより多くえて多いホスファチジルセリンをその表面に有する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、単位表面積当たり約２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍または２５倍のいずれかをより多くえて多い等、約１．５倍をより多くえて多いホスファチジルセリンをその表面に有する。

一部の実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、膜リン脂質の単位当たり約２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍または２５倍のいずれかをより多くえて多い等、約１．５倍をより多くえて多いホスファチジルセリンをその表面に有する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、膜リン脂質の単位当たり約２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍または２５倍のいずれかをより多くえて多い等、約１．５倍をより多くえて多いホスファチジルセリンをその表面に有する。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％もしくは２００％のいずれかまたはそれよりも多いホスファチジルセリンをその表面に有する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、約５０％～約１００％、約１００％～約２００％または約７５％～約１２５％多いのいずれか等、約５０％～約２００％多いホスファチジルセリンをその表面に有する。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、単位体積当たり約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％もしくは２００％のいずれかまたはそれよりも多いホスファチジルセリンをその表面に有する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、単位体積当たり約５０％～約１００％、約１００％～約２００％または約７５％～約１２５％多いのいずれか等、約５０％～約２００％多いホスファチジルセリンをその表面に有する。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、単位表面積当たり約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％もしくは２００％のいずれかまたはそれよりも多いホスファチジルセリンをその表面に有する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、単位表面積当たり約５０％～約１００％、約１００％～約２００％または約７５％～約１２５％多いのいずれか等、約５０％～約２００％多いホスファチジルセリンをその表面に有する。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、膜リン脂質の単位当たり約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％もしくは２００％のいずれかまたはそれよりも多いホスファチジルセリンをその表面に有する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、膜リン脂質の単位当たり約５０％～約１００％、約１００％～約２００％または約７５％～約１２５％多いのいずれか等、約５０％～約２００％多いホスファチジルセリンをその表面に有する。

本明細書に記載されている無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、総膜ホスファチジルセリンの５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９．５％より多くのいずれかは、無核細胞由来の小胞における外膜リーフレット（ｅｘｔｅｒｎａｌｍｅｍｂｒａｎｅｌｅａｆｌｅｔ）に局在化する。一部の実施形態では、総膜ホスファチジルセリンの５０％より多くは、無核細胞由来の小胞における外膜リーフレットに局在化する。

本明細書に記載されている無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞の集団プロファイルは、インプットまたは親無核細胞と比較して、表面におけるより高い平均ホスファチジルセリンレベルを示す。一部の実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞の集団プロファイルは、インプットまたは親無核細胞と比較して、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％または２００％のいずれかだけ、表面におけるより高い平均ホスファチジルセリンレベルを示す。一部の実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞の集団プロファイルは、インプットまたは親無核細胞と比較して、約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍または１００倍のいずれかだけ、表面におけるより高い平均ホスファチジルセリンレベルを示す。

本明細書に記載されている無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞の集団プロファイルの少なくとも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％のうちいずれか１種は、インプットまたは親無核細胞と比較して、表面におけるより高いホスファチジルセリンレベルを示す。一部の実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞の集団プロファイルの少なくとも５０％は、インプットまたは親無核細胞と比較して、表面におけるより高いホスファチジルセリンレベルを示す。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の半減期は、さらに修飾することができる。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の半減期は、さらなる修飾によって増加する。例えば、無核細胞由来の小胞は、無核細胞由来の小胞が、肝臓および脾臓におけるクリアランス前に血流中を循環する時間を増加させるように修飾することができる。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の半減期は、修飾によってさらに減少する。例えば、無核細胞由来の小胞は、無核細胞が、肝臓および脾臓におけるクリアランス前に血流中を循環する時間を減少させるように修飾することができる。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の表面におけるリン脂質の比の変更は、無核細胞由来の小胞の半減期を減少させる。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の表面におけるホスファチジルセリンの他のリン脂質に対する比の増加は、無核細胞由来の小胞の半減期を減少させる。例えば、表面ホスファチジルセリンを増加させるための当技術分野で公知のいずれかの方法（Ｈａｍｉｄｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，２００７，１１８（２）：１４５－６０を参照）を使用することによる等、無核細胞由来の小胞の表面におけるホスファチジルセリンの存在をさらに増加させて、無核細胞由来の小胞の半減期を減少させることができる。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、個体への送達に先立ち、脂質またはリン脂質と共にインキュベートされる。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、個体への送達に先立ち、ビス（スルホサクシニミジル）スベリン酸塩または他の架橋剤等の化学物質によって処置される。他の実施形態では、無核細胞由来の小胞の表面ホスファチジルセリンを減少させて、無核細胞由来の小胞の半減期を増加させることができる。フリッパーゼは、原形質膜においてリン脂質を外部表面からサイトゾル表面へと輸送する酵素である。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、個体への送達に先立ち、フリッパーゼで処置される。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、個体への送達に先立ち、ホスファチジルセリンを切断する酵素で処置される。ホスファチジルセリンを切断する酵素の非限定的な例は、ホスファチジルセリンカルボキシラーゼである。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、低減されたＡＴＰ産生を有する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、経時的に低減されたＡＴＰ産生または細胞内ＡＴＰのレベルを有する。無核細胞、例えば、赤血球細胞等の細胞または無核細胞由来の小胞のＡＴＰを測定する方法（経時的に低減されたＡＴＰ産生または細胞内ＡＴＰのレベル等）は、当技術分野で公知である。例えば、Ｍｏｒｃｉａｎｏ，Ｇ．ｅｔａｌ．，ＮａｔＰｒｏｔｏｃ，１２，２０１７を参照されたい。一部の実施形態では、ＡＴＰ産生は、乳酸塩産生等、代理またはマーカーにより測定される。一部の実施形態では、本願に包含される無核細胞または無核細胞由来の小胞のＡＴＰ産生を測定するための方法は、インプットもしくは親無核細胞またはインプットもしくは親無核細胞の集団を含む対照等の適切な参照対照（複数可）のＡＴＰ産生を測定するステップを含む。一部の実施形態では、試料および対照の間のＡＴＰ産生の比較を可能にする、ＡＴＰ産生を測定するための方法は、同様の条件下で試料および対照のＡＴＰ産生を測定するステップを含む。一部の実施形態では、本願に包含される無核細胞由来の小胞のＡＴＰ産生または細胞内ＡＴＰレベルを測定するための方法は、第１の時点および第２の時点で、無核細胞由来の小胞の集団の（ｏｆ）無核細胞由来の小胞のＡＴＰ産生または細胞内ＡＴＰレベルを測定するステップであって、第１の時点が、第２の時点の前である、ステップと、第１の時点および第２の時点の結果を比較するステップとを含む。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞によって産生されたＡＴＰのレベルの約０．０１％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％未満のいずれかでＡＴＰを産生する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、ＡＴＰを産生しない。

一部の実施形態では、ＡＴＰ産生は、乳酸塩アッセイによって決定される。一部の実施形態では、インプット無核細胞、対、無核細胞由来の小胞のＡＴＰ産生等の代謝活性を測定するために、蛍光酵素アッセイを使用して乳酸塩産生のレベルをモニタリングすることにより、解糖のレベルを経時的に間接的に測定することができる。例えば、インプット無核細胞は、アデニンを含むクエン酸塩－リン酸塩－デキストロース（ｄＣＰＤＡ－１）緩衝剤に十億個の細胞／ｍＬで再懸濁され、モデル抗原および／またはアジュバント（２０μｇ／ｍＬ）は、ＳＱＺ（５０ｐｓｉで２．２μｍ狭窄幅）により室温で送達されて、無核細胞由来の小胞が生成する。次に、無核細胞由来の小胞と未処理インプット無核細胞は、示されている時間３７℃でインキュベートされ、上清が収集される。インプット無核細胞、対、無核細胞由来の小胞によって産生された乳酸塩のレベルを定量化するために、乳酸塩－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、それぞれの時点の上清をアッセイすることができる。簡潔に説明すると、上清は、蛍光乳酸塩検出試薬の添加に先立ち、不活性化および中和ステップに供される。蛍光は、ブランク対照に対して正規化され、上清中の絶対的乳酸塩レベルは、乳酸塩検量線（０．１～１０μＭ）を使用して決定される。一部の実施形態では、絶対的乳酸塩レベルは、約０．０１μＭ～約１０μＭ、約０．０１μＭ～約のいずれか等、約０μＭ～約２００μＭである。

一部の態様では、本願は、親無核細胞から調製された無核細胞由来の小胞であって、本明細書にさらに記載されている通り、次の特性：（ａ）親無核細胞と比較して減少した哺乳動物における循環半減期、（ｂ）親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベル、（ｃ）球状の形態、（ｄ）親無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベル、または（ｅ）親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生のうちいずれか１種または複数を有する無核細胞由来の小胞を提供する。

一部の態様では、本願は、親無核細胞から調製された無核細胞由来の小胞であって、本明細書にさらに記載されている通り、次の特性：（ａ）親無核細胞と比較して減少した哺乳動物における循環半減期、（ｂ）親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベル、（ｃ）球状の形態、（ｄ）親無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベル、または（ｅ）親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生のうちいずれか２種またはそれよりも多くを有する無核細胞由来の小胞を提供する。

一部の態様では、本願は、親無核細胞から調製された無核細胞由来の小胞であって、本明細書にさらに記載されている通り、次の特性：（ａ）親無核細胞と比較して減少した哺乳動物における循環半減期、（ｂ）親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベル、（ｃ）球状の形態、（ｄ）親無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベル、または（ｅ）親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生のうちいずれか３種またはそれよりも多くを有する無核細胞由来の小胞を提供する。

一部の態様では、本願は、親無核細胞から調製された無核細胞由来の小胞であって、本明細書にさらに記載されている通り、次の特性：（ａ）親無核細胞と比較して減少した哺乳動物における循環半減期、（ｂ）親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベル、（ｃ）球状の形態、（ｄ）親無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベル、または（ｅ）親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生のうちいずれか４種またはそれよりも多くを有する無核細胞由来の小胞を提供する。

一部の態様では、本願は、親無核細胞から調製された無核細胞由来の小胞であって、本明細書にさらに記載されている通り、次の特性：（ａ）親無核細胞と比較して減少した哺乳動物における循環半減期、（ｂ）親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベル、（ｃ）球状の形態、（ｄ）親無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベル、または（ｅ）親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する無核細胞由来の小胞を提供する。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、親無核細胞の取込みと比較して、組織または細胞における取込みを増加させる等、取込みを増強するように修飾されている。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、それぞれの組織における親無核細胞の取込みと比較して、肝臓および／または脾臓における取込みを増加させる等、取込みを増強するように修飾されている。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、それぞれの貪食細胞における親無核細胞の取込みと比較して、マクロファージまたは樹状細胞等の貪食細胞または抗原提示細胞における取込みを増加させる等、取込みを増強するように修飾されている。一部の実施形態では、マクロファージは、脂肪組織マクロファージ、単球、クッパー細胞、洞組織球（ｓｉｎｕｓｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ）、肺胞マクロファージ、組織マクロファージ、マイクログリア、ホーフバウアー（Ｈｏｆｂａｕｅｒ）細胞、糸球体内メサンギウム細胞、破骨細胞、類上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｏｉｄ）細胞、赤色髄マクロファージ、腹膜マクロファージまたはＬｙｓｏＭａｃである。一部の実施形態では、抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞である。一部の実施形態では、抗原提示細胞は、非プロフェッショナル抗原提示細胞である。一部の実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞またはマクロファージである。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、肝臓および／または脾臓において貪食細胞および／または抗原提示細胞によって排除され、これにより、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答によるものを含む抗原提示をもたらす。

本明細書に記載されている無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、組織または細胞における増強された取込みを示す。一部の実施形態では、修飾された無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約５０倍、約１００倍、約２００倍、約５００倍または約１０００倍のいずれか１種をより多くえて増強された、組織または細胞における取込み速度を示す。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、貪食細胞および／または抗原提示細胞における増強された取込みを示す。一部の実施形態では、貪食細胞および／または抗原提示細胞は、マクロファージおよび／または樹状細胞を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞と比較して、肝臓、脾臓またはマクロファージにおける増強された取込みを示す。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞の取込みと比較して、肝臓および／もしくは脾臓におけるまたは貪食細胞および／もしくは抗原提示細胞による増強された取込みを示す。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、肺において排除されない。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、肝臓および／または脾臓においてマクロファージによって排除され、これにより、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答によるものを含む抗原提示をもたらす。

本明細書に記載されている無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、修飾されていない無核細胞由来の小胞と比較して、組織または細胞における取込みを増強するように修飾されている。一部の実施形態では、修飾された無核細胞由来の小胞は、修飾されていない無核細胞由来の小胞と比較して、約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約５０倍、約１００倍、約２００倍、約５００倍または約１０００倍のいずれか１種をより多くえて増強された、組織または細胞における取込み速度を示す。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、修飾されていない無核細胞由来の小胞と比較して、貪食細胞および／または抗原提示細胞における取込みを増強するように修飾されている。一部の実施形態では、貪食細胞および／または抗原提示細胞は、マクロファージおよび／または樹状細胞を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、修飾されていない無核細胞由来の小胞と比較して、肝臓、脾臓またはマクロファージにおける取込みを増強するように修飾されている。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、インプットまたは親無核細胞の取込みと比較して、肝臓および／もしくは脾臓におけるまたは貪食細胞および／もしくは抗原提示細胞による取込みを増強するように修飾されている。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、肺において排除されない。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、肝臓および／または脾臓においてマクロファージによって排除され、これにより、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答によるものを含む抗原提示をもたらす。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、無核細胞由来の小胞の調製中に、（ａ）熱処理されていない、（ｂ）化学的に処置されていない、および／または（ｃ）低浸透圧性もしくは高浸透圧性条件に付されていない。ある特定の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、熱処置または熱ショック処理されていない。ある特定の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、ビス（スルホサクシニミジル）スベリン酸塩または他の架橋剤等の化学物質によって処置されない。ある特定の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、イオノフォアまたは他のイオントランスポーターを発現または含有するようにさらに修飾されない。ある特定の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、抗ＴＥＲ１１９等の抗体と会合しない。

本明細書に記載されている無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、細胞懸濁液の容積オスモル濃度は、プロセスを通して維持される。さらなる実施形態では、細胞懸濁液の容積オスモル濃度は、プロセスを通して約２００ｍＯｓｍ～約４００ｍＯｓｍの間に維持される。一部の実施形態では、細胞懸濁液の容積オスモル濃度は、プロセスを通して約２００ｍＯｓｍ～約６００ｍＯｓｍの間に維持される。さらなる実施形態では、細胞懸濁液の容積オスモル濃度は、プロセスを通して約２００ｍＯｓｍ～約８００ｍＯｓｍの間に維持される。一部の実施形態では、細胞懸濁液の容積オスモル濃度は、約２００ｍＯｓｍ～約３００ｍＯｓｍ、約３００ｍＯｓｍ～約４００ｍＯｓｍ、約４００ｍＯｓｍ～約５００ｍＯｓｍ、約５００ｍＯｓｍ～約６００ｍＯｓｍ、約６００ｍＯｓｍ～約７００ｍＯｓｍ、約７００ｍＯｓｍ～約８００ｍＯｓｍ、約２００ｍＯｓｍ～約４００ｍＯｓｍ、約４００ｍＯｓｍ～約６００ｍＯｓｍまたは約６００ｍＯｓｍ～約８００ｍＯｓｍのうちいずれか１種の間に維持される。一部の実施形態では、容積オスモル濃度は、インプットまたは親無核細胞からの無核細胞由来の小胞の調製中に維持された。一部の実施形態では、容積オスモル濃度は、約２００ｍＯｓｍ～約３００ｍＯｓｍ、約２００ｍＯｓｍ～約４００ｍＯｓｍ、約２００ｍＯｓｍ～約５００ｍＯｓｍ、約３００ｍＯｓｍ～約５００ｍＯｓｍまたは約３５０ｍＯｓｍ～約４５０ｍＯｓｍのいずれかの間等、約２００ｍＯｓｍ～約６００ｍＯｓｍの間に維持された。一部の実施形態では、容積オスモル濃度は、約２００ｍＯｓｍ～約４００ｍＯｓｍの間に維持された。

一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄に通す前に、それと同時発生的に、および／またはその後に、抗原と接触される。

本明細書に記載されている無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物が提供される。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
抗原およびアジュバント

本明細書に記載されている方法または無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、抗原は、疾患関連抗原である。さらなる実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。一部の実施形態では、抗原は、ライセートに由来する。一部の実施形態では、ライセートは、個体の生検に由来する。一部の実施形態では、ライセートは、細菌またはウイルス等の病原体に感染した個体の生検に由来する。一部の実施形態では、ライセートは、腫瘍を有する個体の生検に由来する（すなわち、腫瘍生検ライセート）。よって、一部の実施形態では、ライセートは、腫瘍ライセートである。一部の実施形態では、抗原は、移植片ライセートに由来する。一部の実施形態では、ライセートは、移植された臓器の生検に由来する。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である。一部の実施形態では、抗原は、微生物である。

本明細書に記載されている方法または無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、免疫原性エピトープを含む抗原を含む。一部の実施形態では、抗原は、疾患関連抗原である。一部の実施形態では、抗原は、罹患した細胞から単離されたペプチドまたはｍＲＮＡに由来する。一部の実施形態では、抗原は、罹患した細胞において異所的に発現または過剰発現されるタンパク質に由来する。一部の実施形態では、抗原は、ネオ抗原、例えば、がん関連ネオ抗原に由来する。一部の実施形態では、抗原は、ネオエピトープ、例えば、がん関連ネオエピトープを含む。一部の実施形態では、抗原は、非自己抗原である。一部の実施形態では、抗原は、突然変異されたまたは他の仕方で変更された自己抗原である。一部の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である。一部の実施形態では、抗原は、異種ペプチド配列に融合された免疫原性エピトープを含む。一部の実施形態では、抗原は、複数の免疫原性エピトープを含む。一部の実施形態では、複数の免疫原性エピトープの一部は、同じ供給源に由来する。例えば、一部の実施形態では、複数の免疫原性エピトープの一部は、同じウイルス抗原に由来する。一部の実施形態では、複数の免疫原性エピトープの全てが、同じ供給源に由来する。一部の実施形態では、複数の免疫原性エピトープのいずれも、同じ供給源に由来しない。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、複数の異なる抗原を含む。一部の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種の異なる型の抗原のいずれか等、複数の抗原が、無核細胞に送達される。

本明細書に記載されている方法または無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、抗原は、ポリペプチド抗原である。一部の実施形態では、抗原は、非タンパク質抗原である。例えば、一部の実施形態では、抗原は、脂質抗原である。一部の実施形態では、抗原は、多糖等の糖鎖抗原である。一部の実施形態では、抗原は、糖脂質である。一部の実施形態では、抗原をコードする核酸は、細胞に送達される。一部の実施形態では、抗原は、インタクトな細菌等の微生物全体である。一部の実施形態では、抗原は、疾患関連抗原である。一部の実施形態では、抗原は、細菌、真菌、ウイルスまたはアレルゲン等の外来性供給源に由来する。一部の実施形態では、抗原は、修飾された抗原である。例えば、抗原は、治療剤または標的化ペプチドと融合することができる。一部の実施形態では、修飾された抗原は、ポリペプチドと融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、標的化ペプチドと融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、脂質と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、炭水化物と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、ナノ粒子と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、複数の抗原が、無核細胞に送達される。

本明細書に記載されている方法または無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、抗原を含み、抗原は、免疫原性エピトープを含む。一部の実施形態では、抗原は、ポリペプチドであり、免疫原性エピトープは、免疫原性ペプチドエピトープである。一部の実施形態では、免疫原性ペプチドエピトープは、Ｎ末端隣接ポリペプチドおよび／またはＣ末端隣接ポリペプチドに融合される。一部の実施形態では、Ｎ末端隣接ポリペプチドおよび／またはＣ末端隣接ポリペプチドに融合された免疫原性ペプチドエピトープは、天然に存在しない配列である。一部の実施形態では、Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチドは、非天然である。一部の実施形態では、Ｎ末端隣接ポリペプチドおよび／またはＣ末端隣接ポリペプチドに融合された免疫原性ペプチドエピトープは、合成である。一部の実施形態では、Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチドは、免疫原性合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）に由来する。一部の実施形態では、Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチドは、疾患関連免疫原性ＳＬＰに由来する。

本明細書に記載されている方法または無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、抗原を含み、抗原は、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされ得る。一部の実施形態では、抗原は、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされ得る。一部の実施形態では、抗原は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされ得る。一部の実施形態では、抗原は、複数の免疫原性エピトープを含み、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされ得る。一部の実施形態では、抗原を含む無核細胞由来の小胞は、抗原提示細胞によって取り入れられ、抗原は、抗原提示細胞によって１種もしくは複数のＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよび／または１種もしくは複数のＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされる。一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ－１拘束性抗原である。一部の実施形態では、ＣＤ－１拘束性抗原は、脂質抗原である。一部の実施形態では、抗原は、複数の免疫原性エピトープを含み、複数のＣＤ－１拘束性抗原へとプロセシングされ得る。一部の実施形態では、抗原を含む無核細胞由来の小胞は、抗原提示細胞によって取り入れられ、抗原は、抗原提示細胞によって１種または複数のＣＤ－１拘束性抗原へとプロセシングされる。一部の実施形態では、抗原は、複数の免疫原性エピトープを含み、（ａ）ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチド；（ｂ）ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチド；または（ｃ）ＣＤ－１拘束性抗原のうち１種または複数へとプロセシングされ得る。一部の実施形態では、複数の免疫原性エピトープの一部は、同じ供給源に由来する。一部の実施形態では、複数の免疫原性エピトープの全てが、同じ供給源に由来する。一部の実施形態では、複数の免疫原性エピトープのいずれも、同じ供給源に由来しない。

本明細書に記載されている方法または無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、複数の免疫原性エピトープを含む複数の抗原を含む。一部の実施形態では、複数の免疫原性エピトープを含む複数の抗原を含む無核細胞由来の小胞の個体への投与後に、複数の免疫原性エピトープのいずれも、他の免疫原性エピトープのいずれかに対する個体における免疫応答を減少させない。

本明細書に記載されている方法のいずれかまたは無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、アジュバントを含む。一部の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ（低および／または高分子量）、ポリリシンおよびカルボキシメチルセルロースにより安定化されたポリイノシン・ポリシチジル酸（ＨＩＬＴＯＮＯＬ（登録商標））、イミキモド、レシキモド、ならびに／またはリポ多糖（ＬＰＳ）である。一部の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧＯＤＮである。一部の実施形態では、アジュバントは、低分子量ポリＩ：Ｃである。一部の実施形態では、ＣｐＧＯＤＮは、約５０個以下（約４５、４０、３５、３０、２５、２０個またはそれよりも少ない数以下のいずれか等）のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ＣｐＧＯＤＮは、クラスＡＣｐＧＯＤＮ、クラスＢＣｐＧＯＤＮまたはクラスＣＣｐＧＯＤＮである。一部の実施形態では、ＣｐＧＯＤＮは、米国特許仮出願第６２／６４１，９８７号に開示されているヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、複数の異なるＣｐＧＯＤＮを含む。例えば、一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、クラスＡ、クラスＢおよびクラスＣＣｐＧＯＤＮの中から選択される複数の異なるＣｐＧＯＤＮを含む。）。一部の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種の異なる型のアジュバントのいずれか等、複数のアジュバントが、無核細胞に送達される。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、抗原および／またはアジュバントを含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、約１ｐＭ～約１０ｍＭの間の濃度で抗原を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、約１ｐＭ～約１０ｍＭの間の濃度でアジュバントを含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、約０．１μＭ～約１０ｍＭの間の濃度で抗原を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、約０．１μＭ～約１０ｍＭの間の濃度でアジュバントを含む。例えば、一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞におけるアジュバントの濃度は、約１ｐＭ、約１０ｐＭ、約１００ｐＭ、約１ｎＭ、約１０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１μＭ、約１０μＭ、約１００μＭ、約１ｍＭまたは約１０ｍＭ未満のいずれかである。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞におけるアジュバントの濃度は、約１０ｍＭをより多くえる。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞における抗原の濃度は、約１ｐＭ、約１０ｐＭ、約１００ｐＭ、約１ｎＭ、約１０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１μＭ、約１０μＭ、約１００μＭ、約１ｍＭまたは約１０ｍＭ未満のいずれかである。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞における抗原の濃度は、約１０ｍＭをより多くえる。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞における抗原の濃度は、約１ｐＭ～約１０ｐＭの間、約１０ｐＭ～約１００ｐＭの間、約１００ｐＭ～約１ｎＭの間、約１ｎＭ～約１０ｎＭの間、約１０ｎＭ～約１００ｎＭの間、約１００ｎＭ～約１μＭの間、約１μＭ～約１０μＭの間、約１０μＭ～約１００μＭの間、約１００μＭ～約１ｍＭの間または１ｍＭ～約１０ｍＭの間のいずれかである。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞におけるアジュバントの濃度は、約１ｐＭ～約１０ｐＭの間、約１０ｐＭ～約１００ｐＭの間、約１００ｐＭ～約１ｎＭの間、約１ｎＭ～約１０ｎＭの間、約１０ｎＭ～約１００ｎＭの間、約１００ｎＭ～約１μＭの間、約１μＭ～約１０μＭの間、約１０μＭ～約１００μＭの間、約１００μＭ～約１ｍＭの間または１ｍＭ～約１０ｍＭの間のいずれかである。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞におけるアジュバントの抗原に対するモル比は、約１００００：１～約１：１００００の間のいずれかである。例えば、一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞におけるアジュバントの抗原に対するモル比は、１００００：１、約１０００：１、約１００：１、約１０：１、約１：１、約１：１０、約１：１００、約１：１０００または約１：１００００のいずれかである。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、ａ）抗原、ｂ）アジュバント、ならびに／またはｃ）抗原およびアジュバントを含む複合体を含む。

本明細書に記載されている方法または無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、追加の薬剤を含まない対応する無核細胞由来の小胞と比較して無核細胞由来の小胞の機能を増強する追加の薬剤をさらに含む。一部の実施形態では、追加の薬剤は、安定化剤または補因子である。一部の実施形態では、薬剤は、アルブミンである。一部の実施形態では、アルブミンは、マウス、ウシまたはヒトアルブミンである。一部の実施形態では、追加の薬剤は、二価金属カチオン、グルコース、ＡＴＰ、カリウム、グリセロール、トレハロース、Ｄ－スクロース、ＰＥＧ１５００、Ｌ－アルギニン、Ｌ－グルタミンまたはＥＤＴＡである。

本明細書に記載されている方法または無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、１種または複数の治療剤をさらに含む。
他のペイロード

一部の実施形態では、ペイロードは、免疫寛容原性因子である。一部の実施形態では、ペイロードは、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、小分子、複合体（タンパク質に基づく複合体、核酸複合体、タンパク質－タンパク質複合体、核酸－核酸複合体またはタンパク質－核酸複合体等）、ナノ粒子、ウイルスまたはウイルス粒子である。

一部の実施形態では、ペイロードは、ウリカーゼ（半合成形態、例えば、ペグロチカーゼを含む）、グルコセレブロシダーゼ（例えば、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、β－グルコシダーゼ）、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）（例えば、アスホターゼアルファ）、ライソゾーム酸性リパーゼ（例えば、セベリパーゼアルファ）、アルファ－グルコシダーゼ（例えば、アルグルコシダーゼアルファ）、α－Ｌ－イズロニダーゼ（例えば、ラロニダーゼ（Ｉａｒｏｎｉｄａｓｅ））、イズロン酸スルファターゼ（例えば、イデュルスルファーゼ）、ヘパラン硫酸、ケラチン硫酸、コンドロイチン６－硫酸（例えば、エロスルファーゼアルファ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ（例えば、ガルスルファーゼ）、β－グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、α－ガラクトシダーゼＡ（例えば、アガルシダーゼベータ）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、中鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、グリアジン、アセチルコリン受容体および受容体関連タンパク質、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、デスモグレイン１および３、アクアポリン４、ＧＡＤＤ６５、インスリン、プロインスリン、ならびにプレプロインスリンからなる群から選択される。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、抗原および免疫寛容原性因子を含む。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、抗原に対する免疫応答の抑制を増強する、および／または抗原に対する寛容の誘導を増強する。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、抗原提示細胞による抗原の免疫寛容原性提示を促進することができる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－３５、ＩＦＮ－αまたはＴＧＦ－βである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、治療ポリペプチドである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、治療ポリペプチドの断片である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、炭水化物にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、核酸である。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを限定することなく含むことができる。例えば、免疫寛容原性因子は、炎症性遺伝子の発現をノックダウンするためのｓｉＲＮＡを含むことができる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、ＮＦ－κＢに結合し、ＮＦ－κＢ活性化および下流シグナル伝達を防止するＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、小分子である。

一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、免疫調節剤（免疫刺激剤（例えば、共刺激分子）、免疫抑制剤、または炎症性もしくは抗炎症性分子等）の発現および／または活性をモジュレートする。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、免疫刺激剤（例えば、共刺激分子）の発現および／または活性を阻害する、免疫抑制分子の発現および／または活性を増強する、炎症性分子の発現および／または活性を阻害する、および／または抗炎症性分子の発現および／または活性を増強する。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共刺激分子の活性を阻害する。共刺激分子およびそのリガンドの間の相互作用は、最適なＴ細胞増殖および分化を刺激するためのＴＣＲシグナル伝達の持続および統合に重要である。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共刺激分子の発現を減少させる。抗原提示細胞表面に発現される例示的な共刺激分子は、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ５４、ＣＤ８３、ＣＤ７９、Ｏｘ４０またはＩＣＯＳリガンドを限定することなく含む。一部の実施形態では、共刺激分子は、ＣＤ８０またはＣＤ８６である。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共刺激分子を発現するまたはその発現をモジュレートする核酸の発現を阻害する。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共刺激分子を発現するまたはその発現をモジュレートする核酸を欠失する。一部の実施形態では、共刺激分子を発現するまたはその発現をモジュレートする核酸の欠失は、遺伝子編集により達成される。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共刺激分子を阻害する。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共刺激分子を阻害するｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共刺激分子の発現を抑制する転写調節因子の活性を増加させる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共刺激分子の発現を抑制するタンパク質阻害剤の活性を増加させる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共刺激分子の抑制因子をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共刺激分子を分解する。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、破壊のために共刺激分子を標識する。例えば、免疫寛容原性因子は、共刺激分子のユビキチン化を増強し、これにより、これを破壊のために標的化することができる。

一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、免疫抑制分子の発現および／または活性を増強する。一部の実施形態では、免疫抑制分子は、共阻害分子、転写調節因子または免疫抑制分子である。共阻害分子は、リンパ球の活性化を負に調節する。例示的な共阻害分子は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＨＶＥＭ、Ｂ７－Ｈ３、ＴＲＡＩＬ、免疫グロブリン様転写物（ＩＬＴ）受容体（ＩＬＴ２、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４）、ＦａｓＬ、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３９、ＣＤ７３およびＢ７－Ｈ４を限定することなく含む。一部の実施形態では、共阻害分子は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２である。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共阻害分子の活性を増加させる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共阻害分子の発現を増加させる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共阻害分子をコードする。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共阻害分子の活性を増加させる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共阻害分子の発現を増強することができる転写調節因子の活性を増加させる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共阻害分子の発現を増加させるポリペプチドの活性を増加させる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共阻害分子の増強因子をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、共阻害分子の阻害剤を阻害する。

一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、免疫抑制分子の発現および／または活性を増加させる。例示的な免疫抑制分子は、アルギナーゼ－１（ＡＲＧ１）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、誘導型一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）、一酸化窒素（ＮＯ）、一酸化窒素シンターゼ２（ＮＯＳ２）、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、血管性腸（ｖａｓｃｕｌａｒｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）ペプチド（ＶＩＰ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－β（ΤＧＦ－β）、ＩＦＮ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３およびＩＬ－３５を限定することなく含む。一部の実施形態では、免疫抑制分子は、ＮＯまたはＩＤＯである。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、免疫抑制分子をコードする。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、免疫抑制分子の活性を増加させる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、免疫抑制分子の発現を増強する転写調節因子の活性を増加させる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、免疫抑制分子の発現を増強するポリペプチドの活性を増加させる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、免疫抑制分子の増強因子をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、免疫抑制分子の負の制御因子を阻害する。

一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、炎症性分子の発現および／または活性を阻害する。一部の実施形態では、炎症性分子は、炎症性転写因子である。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、炎症性転写因子を阻害する。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、炎症性転写因子の発現を減少させる。一部の実施形態では、炎症性転写因子は、ＮＦ－ＫＢ、インターフェロン調節性因子（ＩＲＦ）、またはＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路に関連する分子である。ＮＦ－κＢ経路は、サイトカイン、ケモカインおよび接着分子を含む炎症促進性遺伝子の発現を媒介する、プロトタイプの炎症促進性シグナル伝達経路である。インターフェロン調節性因子（ＩＲＦ）は、炎症促進性遺伝子の発現を調節することができる転写因子のファミリーを構成する。ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路は、細胞外サイトカインシグナルから核へと情報を伝達し、免疫細胞増殖および分化に関与する遺伝子のＤＮＡ転写および発現をもたらす。ＪＡＫ－ＳＴＡＴシステムは、細胞表面受容体、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）およびシグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）タンパク質からなる。例示的なＪＡＫ－ＳＴＡＴ分子は、ＪＡＫｌ、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、Ｔｙｋ２、ＳＴＡＴＩ、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴＳ（ＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５Ｂ）およびＳＴＡＴ６を限定することなく含む。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、サイトカインシグナル伝達（ＳＯＣＳ）タンパク質の抑制因子の発現を増強する。ＳＯＣＳタンパク質は、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路を介したシグナル伝達を阻害することができる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、炎症性転写因子をコードする核酸の発現を阻害する。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、炎症性転写因子をコードする核酸を欠失する。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、炎症性転写因子の発現を抑制する転写調節因子の活性を増加させる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、炎症性転写因子の発現を抑制するタンパク質阻害剤の活性を増加させる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、炎症性転写因子の抑制因子をコードする核酸を含む。

一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、抗炎症性分子の発現および／または活性を増強する。一部の実施形態では、抗炎症性分子は、抗炎症性転写因子である。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、抗炎症性転写因子を増強する。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、抗炎症性転写因子の発現を増加させる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、抗炎症性転写因子をコードする核酸の発現を増強する。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、抗炎症性転写因子の発現を抑制する転写調節因子の活性を減少させる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、抗炎症性転写因子の発現を抑制するタンパク質阻害剤の活性を減少させる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、抗炎症性転写因子の増強因子をコードする核酸を含む。

一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、核酸を含む。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、核酸である。例示的な核酸は、組換え核酸、ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｇＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを限定することなく含む。一部の実施形態では、核酸は、細胞における核酸に対して相同である。一部の実施形態では、核酸は、細胞における核酸に対して異種である。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、プラスミドである。一部の実施形態では、核酸は、治療核酸である。一部の実施形態では、核酸は、治療ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードする核酸を含む。例えば、免疫寛容原性因子は、炎症性遺伝子の発現をノックダウンするためのｓｉＲＮＡを含むことができる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、ＮＦ－κＢに結合し、ＮＦ－κＢ活性化および下流シグナル伝達を防止するＤＮＡ配列である。

一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、ポリペプチドである。一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、治療タンパク質、抗体、融合タンパク質、抗原、合成タンパク質、レポーターマーカーまたは選択可能マーカーである。一部の実施形態では、タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ＣＲＥリコンビナーゼ、トランスポサーゼ、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＡＳ９酵素）、ＤＮＡガイドエンドヌクレアーゼまたはインテグラーゼ酵素等、遺伝子編集タンパク質またはヌクレアーゼである。一部の実施形態では、融合タンパク質は、抗体薬物コンジュゲート等のキメラタンパク質薬（ｄｒａｇ）、またはＧＳＴもしくはストレプトアビジンをタグ付けされたタンパク質等の組換え融合タンパク質を限定することなく含むことができる。一部の実施形態では、化合物は、転写因子である。例示的な転写因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ－４、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＦｏｘＰ３およびＲＯＲγｔを限定することなく含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－３５、ＩＦＮ－αまたはＴＧＦβである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、治療ポリペプチドである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、治療ポリペプチドの断片である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。

一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、タンパク質－核酸複合体を含む。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、タンパク質－核酸複合体である。一部の実施形態では、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ９等のタンパク質－核酸複合体が、ゲノム編集適用において使用される。このような複合体は、非特異的ＤＮＡ切断ヌクレアーゼと組み合わせた、配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを含有する。このような複合体は、特異的遺伝子の配列の付加、破壊または変化を含む、標的化されたゲノム編集を可能にする。一部の実施形態では、無効になったＣａｓ９（ｄＣａｓ９）が、標的遺伝子の転写の遮断または誘導に使用される。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡおよびドナーＤＮＡを含有する。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、遺伝子編集複合体は、共刺激分子（例えば、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６）の発現を標的とする。

一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、小分子を含む。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、小分子である。一部の実施形態では、小分子は、共刺激分子の活性を阻害する、共阻害分子の活性を増強する、および／または炎症性分子の活性を阻害する。例示的な小分子は、医薬剤、代謝物または放射性核種を限定することなく含む。一部の実施形態では、医薬剤は、治療薬および／または細胞傷害剤である。一部の実施形態では、化合物は、ナノ粒子を含む。ナノ粒子の例は、金ナノ粒子、量子ドット、カーボンナノチューブ、ナノシェル、デンドリマーおよびリポソームを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、治療分子を含有する、またはそれに連結される（共有結合または非共有結合により）。一部の実施形態では、ナノ粒子は、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ等の核酸を含有する。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、サイトカインを含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、ＤＮＡ等の遺伝材料をモジュレートするための薬剤を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、ＣＲＩＳＰＲ成分等の遺伝子編集成分を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、ＲＮＡ種の存在を減少させる等、ＲＮＡをモジュレートするための薬剤を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、ｓｉＲＮＡを含む。
無核細胞由来の小胞を生成するための方法

ある特定の態様では、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するための方法であって、ａ）インプット（例えば、親）無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、アジュバントを含む。

ある特定の態様では、アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するための方法であって、ａ）インプット（例えば、親）無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、アジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をアジュバントと共にインキュベートし、これにより、アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、アジュバントを含む。

ある特定の態様では、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するための方法であって、ａ）インプット（例えば、親）無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含む方法が提供される。

本明細書に記載されている方法のいずれかに係る一部の実施形態では、インプット（例えば、親）無核細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタまたはウサギ細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、非哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、ニワトリ、カエル、昆虫、魚類または線虫細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球細胞である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、ＲＢＣの前駆体である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、網状赤血球である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、血小板である。

一部の実施形態では、免疫原性環境における抗原の提示は、抗原に対する免疫応答を増強する、または抗原に対する免疫応答を誘導する。肝臓および脾臓の免疫原性環境において排除され得る、無核細胞由来の小胞等のエリプトーシス小体に由来する抗原は、Ｔ細胞の活性化により抗原に対する免疫応答を刺激または増強することができる。一部の実施形態では、免疫応答は、抗原特異的である。ＲＢＣ由来の小胞等の無核細胞由来の小胞は、限定された寿命を有し、自己修復することができず、血流からの無核細胞由来の小胞の除去をもたらす、アポトーシスに類似したプロセスであるエリプトーシスを引き起こす。一部の実施形態では、抗原は、免疫原性環境内で無核細胞由来の小胞のエリプトーシス後に放出され得、そこで抗原はその後、抗原提示細胞によって貪食、プロセシングおよび提示される。一部の実施形態では、抗原を含有する無核細胞由来の小胞は、マクロファージ等の抗原提示細胞によってファゴサイトーシスされ、抗原はその後、抗原提示細胞によってプロセシングおよび提示される。一部の実施形態では、抗原提示細胞は、常在性マクロファージである。

一部の実施形態では、哺乳動物における無核細胞由来の小胞の循環半減期は、インプット（例えば、親）無核細胞と比較して減少している。無核細胞、例えば、赤血球細胞等の細胞または無核細胞由来の小胞の半減期を測定するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｆｒａｎｃｏ，Ｒ．Ｓ．，ＴｒａｎｓｆｕｓＭｅｄＨｅｍｏｔｈｅｒ，３９，２０１２を参照されたい。例えば、一部の実施形態では、無核細胞または無核細胞由来の小胞の半減期を測定するための方法は、コホート標識技法またはランダム標識技法を含む。一部の実施形態では、無核細胞または無核細胞由来の小胞の半減期を測定するための方法は、細胞または小胞を標識、再注入し、再注入後の消失を測定するステップを含む。一部の実施形態では、本願に包含される無核細胞または無核細胞由来の小胞の半減期を測定するための方法は、インプット無核細胞またはインプット無核細胞の集団を含む対照等の適切な参照対照（複数可）の半減期を測定するステップを含む。

一部の実施形態では、哺乳動物における循環半減期は、インプット（例えば、親）無核細胞と比較して、約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のいずれかをより多くえる等、約５０％をより多くえて減少している。一部の実施形態では、哺乳動物における循環半減期は、インプット無核細胞と比較して、約７０％～約９９．９％、約８５％～約９９．９％または約９５％～約９９．９％のいずれか等、約５０％～約９９．９％減少している。一部の実施形態では、哺乳動物における循環半減期は、インプット無核細胞と比較して、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％のいずれかだけ減少している。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の循環半減期は、約５分間、１０分間、１５分間、３０分間、１時間、６時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、１０日間、２０日間、３０日間、４０日間、５０日間、６０日間、７０日間、８０日間、９０日間または１００日間未満のいずれかである。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の循環半減期は、約０．５分間、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間、３時間、６時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、１０日間、２０日間、３０日間、４０日間、５０日間、６０日間、７０日間、８０日間、９０日間または１００日間のいずれかである。

一部の実施形態では、インプット（例えば、親）無核細胞は、ヒト細胞であり、無核細胞由来の小胞の循環半減期は、約５分間、１０分間、１５分間、３０分間、１時間、６時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、１０日間、２０日間、３０日間、４０日間、５０日間、６０日間、７０日間、８０日間、９０日間または１００日間未満のいずれかである。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、ヒト細胞であり、無核細胞由来の小胞の循環半減期は、約０．５分間、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間、３時間、６時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、１０日間、２０日間、３０日間、４０日間、５０日間、６０日間、７０日間、８０日間、９０日間または１００日間のいずれかである。

一部の実施形態では、インプット（例えば、親）無核細胞は、赤血球細胞であり、無核細胞由来の小胞におけるヘモグロビンレベルは、インプット無核細胞と比較して減少している。無核細胞、例えば、赤血球細胞等の細胞または無核細胞由来の小胞のヘモグロビンレベルを測定する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｒ．，ＪＢｌｏｏｄＭｅｄ，８，２０１７を参照されたい。例えば、一部の実施形態では、本方法は、代謝前駆体または産物を測定して、ヘモグロビンのターンオーバーを決定するステップを含む。一部の実施形態では、本願に包含される無核細胞または無核細胞由来の小胞のヘモグロビンレベルを測定するための方法は、インプット無核細胞またはインプット無核細胞の集団を含む対照等の適切な参照対照（複数可）のヘモグロビンレベルを測定するステップを含む。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞におけるヘモグロビンレベルは、インプット（例えば、親）無核細胞と比較して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または１００％のいずれかだけ減少している。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞におけるヘモグロビンレベルは、インプット無核細胞と比較して、約７０％～約９９．９％、約８５％～約９９．９％または約９５％～約９９．９％のいずれか等、約５０％～約９９．９％減少している。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞におけるヘモグロビンレベルは、インプット無核細胞と比較して、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％のいずれかだけ減少している。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞におけるヘモグロビンレベルは、インプット（例えば、親）無核細胞におけるヘモグロビンレベルの約０．０１％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％のいずれかである。

一部の実施形態では、インプット（例えば、親）無核細胞は、赤血球であり、無核細胞由来の小胞の形態は、インプット無核細胞の形態からモジュレートされる。形態は、例えば、細胞または細胞由来の小胞の形状、構造、幾何学、強度、形態、平滑性、粗度、円形度、体積、表面積および／またはサイズの分類に関係する。形態を決定（測定等）するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｂｏｕｔｒｏｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３，２０１５；Ｇｉｒａｓｏｌｅ，Ｍ．ｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａＢｉｏｍｅｍｂｒ，１７６８，２００７；およびＣｈｅｎｅｔａｌ．，ＣｏｍｐｕｔＭａｔｈＭｅｔｈｏｄｓＭｅｄ，２０１２を参照されたい。一部の実施形態では、形態を決定するための方法は、ハイコンテンツイメージングを含む。例えば、細胞の形態は、ヘキスト色素による染色と、続く自動ハイコンテンツ画像解析によって評価することができる。他の例では、形態は、フローサイトメトリーからの前方および側方散布図におけるシフトにより決定することができる。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球であり、無核細胞由来の小胞は、球状の形態である。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球であり、無核細胞由来の小胞は、インプット無核細胞と比較して低減された両凹形状を有する。一部の実施形態では、本願に包含される無核細胞または無核細胞由来の小胞の形態を測定するための方法は、インプット無核細胞またはインプット無核細胞の集団を含む対照等の適切な参照対照（複数可）の形態を測定するステップを含む。

一部の実施形態では、インプット（例えば、親）無核細胞は、赤血球であり、無核細胞由来の小胞は、インプット無核細胞と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％のいずれかをより多くえた低減等、低減された両凹形状を有する。

一部の実施形態では、インプット（例えば、親）無核細胞は、赤血球細胞または赤血球であり、無核細胞由来の小胞は、赤血球細胞ゴースト（ＲＢＣゴースト）である。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の半減期は、さらに修飾することができる。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の半減期は、さらなる修飾によって増加する。例えば、無核細胞由来の小胞は、無核細胞由来の小胞が、肝臓および脾臓におけるクリアランス前に血流中を循環する時間を増加させるように修飾することができる。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の半減期は、修飾によってさらに減少する。例えば、無核細胞由来の小胞は、無核細胞が、脾臓におけるクリアランス前に血流中を循環する時間を減少させるように修飾することができる。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の表面におけるリン脂質の比の変更は、無核細胞由来の小胞の半減期を減少させる。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の表面におけるホスファチジルセリンの他のリン脂質に対する比の増加は、無核細胞由来の小胞の半減期を減少させる。例えば、表面ホスファチジルセリンを増加させるための当技術分野で公知のいずれかの方法（Ｈａｍｉｄｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，２００７，１１８（２）：１４５－６０を参照）を使用することによる等、無核細胞由来の小胞の表面におけるホスファチジルセリンの存在をさらに増加させて、無核細胞の半減期を減少させることができる。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、個体への送達に先立ち、脂質またはリン脂質と共にインキュベートされる。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、個体への送達に先立ち、ビス（スルホサクシニミジル）スベリン酸塩または他の架橋剤等の化学物質によって処置される。他の実施形態では、無核細胞由来の小胞の表面ホスファチジルセリンを減少させて、無核細胞由来の小胞の半減期を増加させることができる。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、個体への送達に先立ち、フリッパーゼで処置される。一般に、フリッパーゼは、原形質膜において外部リーフレットからサイトゾルリーフレットへとリン脂質を輸送する酵素である。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、個体への送達に先立ち、ホスファチジルセリンを切断する酵素で処置される。ホスファチジルセリンを切断する酵素の非限定的な例は、ホスファチジルセリンカルボキシラーゼである。

本明細書に記載されている方法のいずれかに係る一部の実施形態では、細胞懸濁液の容積オスモル濃度は、プロセスを通して維持される。さらなる実施形態では、細胞懸濁液の容積オスモル濃度は、プロセスを通して２００ｍＯｓｍ～４００ｍＯｓｍの間に維持される。一部の実施形態では、細胞懸濁液の容積オスモル濃度は、プロセスを通して２００ｍＯｓｍ～６００ｍＯｓｍの間に維持される。さらなる実施形態では、細胞懸濁液の容積オスモル濃度は、プロセスを通して２００ｍＯｓｍ～８００ｍＯｓｍの間に維持される。一部の実施形態では、細胞懸濁液の容積オスモル濃度は、２００ｍＯｓｍ～３００ｍＯｓｍ、３００ｍＯｓｍ～４００ｍＯｓｍ、４００ｍＯｓｍ～５００ｍＯｓｍ、５００ｍＯｓｍ～６００ｍＯｓｍ、６００ｍＯｓｍ～７００ｍＯｓｍ、７００ｍＯｓｍ～８００ｍＯｓｍのうちいずれか１種の間に維持される。

本明細書に記載されている方法または無核細胞由来の小胞のいずれかに係る一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、追加の薬剤を含まない対応する無核細胞由来の小胞と比較して無核細胞由来の小胞の機能を増強する追加の薬剤をさらに含む。一部の実施形態では、追加の薬剤は、安定化剤または補因子である。一部の実施形態では、薬剤は、アルブミンである。一部の実施形態では、アルブミンは、マウス、ウシまたはヒトアルブミンである。一部の実施形態では、追加の薬剤は、二価金属カチオン、グルコース、ＡＴＰ、カリウム、グリセロール、トレハロース、Ｄ－スクロース、ＰＥＧ１５００、Ｌ－アルギニン、Ｌ－グルタミンまたはＥＤＴＡである。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、１種または複数の治療剤をさらに含む。

一部の実施形態では、狭窄は、マイクロ流体チャネル内に含有される。一部の実施形態では、マイクロ流体チャネルは、複数の狭窄を含む。一部の実施形態では、複数の狭窄は、直列におよび／または並列に配置される。一部の実施形態では、狭窄は、複数の微小な支柱の間；アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間；または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する。一部の実施形態では、狭窄は、複数の微小な支柱によって形成される。一部の実施形態では、狭窄は、アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間に形成される。一部の実施形態では、狭窄は、１枚または複数の可動プレートによって形成される。

一部の実施形態では、狭窄は、ポアである、またはポア内に含有される。一部の実施形態では、ポアは、表面に含有される。一部の実施形態では、表面は、フィルターである。一部の実施形態では、表面は、膜である。

一部の実施形態では、狭窄サイズは、懸濁液における無核細胞の最大直径等、細胞の直径の約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％のいずれかである。一部の実施形態では、狭窄サイズは、懸濁液における無核細胞の最大直径等、細胞の直径の約８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％未満のいずれかである。一部の実施形態では、狭窄は、約１μｍ～約３μｍ、約１．７５μｍ～約２．５μｍまたは約２μｍ～約２．５μｍのいずれか等、約０．１μｍ～約４μｍの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約４μｍ、３．５μｍ、３μｍ、２．５μｍ、２μｍ、１．５μｍ、１μｍ、０．５μｍまたは約０．２５μｍのいずれかの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約１．８μｍ、１．９μｍ、２μｍ、２．１μｍ、２．２μｍ、２．３μｍ、２．４μｍ、２．５μｍまたは２．６μｍのいずれかの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約２．２μｍの幅を有する。

一部の実施形態では、インプット親無核細胞は、約３０ｐｓｉ～約６０ｐｓｉ、約１０ｐｓｉ～約４０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉのいずれか等、約１０ｐｓｉ～約１５０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。一部の実施形態では、インプット親無核細胞は、少なくとも約５ｐｓｉ、１０ｐｓｉ、１５ｐｓｉ、２０ｐｓｉ、２５ｐｓｉ、３０ｐｓｉ、３５ｐｓｉ、４０ｐｓｉ、４５ｐｓｉ、５０ｐｓｉ、５５ｐｓｉ、６０ｐｓｉ、６５ｐｓｉ、７０ｐｓｉ、７５ｐｓｉ、８０ｐｓｉ、８５ｐｓｉ、９０ｐｓｉ、９５ｐｓｉ、１００ｐｓｉ、１０５ｐｓｉ、１１０ｐｓｉ、１１５ｐｓｉ、１２０ｐｓｉ、１２５ｐｓｉ、１３０ｐｓｉ、１３５ｐｓｉ、１４０ｐｓｉ、１４５ｐｓｉまたは１５０ｐｓｉのいずれかの圧力下で、狭窄に通される。一部の実施形態では、インプット親無核細胞は、少なくとも約５ｐｓｉかつ、約１５０ｐｓｉ、１４５ｐｓｉ、１４０ｐｓｉ、１３５ｐｓｉ、１３０ｐｓｉ、１２５ｐｓｉ、１２０ｐｓｉ、１１５ｐｓｉ、１１０ｐｓｉ、１０５ｐｓｉ、１００ｐｓｉ、９５ｐｓｉ、９０ｐｓｉ、８５ｐｓｉ、８０ｐｓｉ、７５ｐｓｉ、７０ｐｓｉ、６５ｐｓｉ、６０ｐｓｉ、５５ｐｓｉ、５０ｐｓｉ、４５ｐｓｉ、４０ｐｓｉ、３５ｐｓｉ、３０ｐｓｉ、２５ｐｓｉ、２０ｐｓｉまたは１５ｐｓｉ未満のいずれかの圧力下で、狭窄に通される。

一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄に通す前に、ペイロードと接触させられる（先ず接触させられる等）。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄に通すのと同時発生的に、ペイロードと接触させられる（先ず接触させられる等）。一部の実施形態では、狭窄に通した後に、細胞懸濁液は、ペイロードと接触させられる（先ず接触させられる等）。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄に通すのと同時発生的に、および狭窄に通した後に、ペイロードと少なくとも接触させられる。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄に通す前に、狭窄に通すのと同時発生的に、および狭窄に通した後に、ペイロードと接触させられる。

一部の実施形態では、本明細書に記載されている抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞は、活性化抗原担体（ＡＡＣ）である。

一部の実施形態では、本明細書に記載されている寛容化（ｔｏｌｅａｒｉｚａｔｉｏｎ）のための抗原を含む無核細胞由来の小胞は、寛容化抗原担体（ＴＡＣ）である。
組成物

一部の態様では、本出願は、本明細書に記載の無核細胞由来の小胞のいずれかを複数含む組成物を提供する。

一部の実施形態では、親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、次の特性：（ａ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期を有する、（ｂ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、（ｃ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、球状の形態を有する、（ｄ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、ＲＢＣゴーストである、（ｅ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または（ｆ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、のうちいずれか１種または複数を有する、組成物が提供される。

一部の実施形態では、複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物は、（ａ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期を有する、（ｂ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、（ｃ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、球状の形態を有する、（ｄ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、ＲＢＣゴーストである、（ｅ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または（ｆ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、のうち１種または複数を含む、１種または複数の選択特性を有する組成物内に、所望のプロファイルの無核細胞由来の小胞を生じるように積極的に調整されてもよい。

一部の実施形態では、所望のプロファイルの選択特性を有する複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物は、マイクロ流体狭窄の使用を含む本明細書に記載の作製方法を使用して親無核細胞から調製され、狭窄寸法、親無核細胞を狭窄に通すスピード、狭窄の構造（例えば、堰の構造およびサイズ）、処理時間、圧力、および緩衝剤組成物を含む作製方法のパラメーターは、所望のプロファイルの選択特性を有する複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物を生じるように選択される。一部の実施形態では、所望のプロファイルの選択特性を有する複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物を作製する方法は、狭窄寸法、親無核細胞を狭窄に通すスピード、狭窄の構造（例えば、堰の構造およびサイズ）、処理時間、圧力、および緩衝剤組成物を含むパラメーターのセットを選択して、組成物を生成するステップを含む。一部の実施形態では、所望のプロファイルの選択特性を有する複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物を作製する方法は、狭窄寸法、親無核細胞を狭窄に通すスピード、狭窄の構造（例えば、堰の構造およびサイズ）、処理時間、圧力、および緩衝剤組成物を含むパラメーターのセットを使用して、組成物を生成するステップを含む。

例えば、一部の実施形態では、所望のプロファイルの選択特性を有する複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物は、例えば約２．２μｍまたは約２．５μｍの狭窄寸法、および例えば約３０ｐｓｉまたは約５０ｐｓｉの圧力を含むパラメーターのセットを使用して調製される。一部の実施形態では、所望のプロファイルの選択特性を有する複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物は、約２．２μｍの狭窄寸法および約３０ｐｓｉの圧力を含むパラメーターのセットを使用して調製される。一部の実施形態では、所望のプロファイルの選択特性を有する複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物は、約２．２μｍの狭窄寸法および約５０ｐｓｉの圧力を含むパラメーターのセットを使用して調製される。一部の実施形態では、所望のプロファイルの選択特性を有する複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物は、約２．５μｍの狭窄寸法および約３０ｐｓｉの圧力を含むパラメーターのセットを使用して調製される。一部の実施形態では、所望のプロファイルの選択特性を有する複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物は、約２．５μｍの狭窄寸法および約５０ｐｓｉの圧力を含むパラメーターのセットを使用して調製される。

一部の実施形態では、親無核細胞は、以下に限定されないが、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、齧歯類、または霊長類由来の細胞を含む哺乳動物の細胞である。一部の実施形態では、親無核細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、親無核細胞は、以下に限定されないが、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、齧歯類、または霊長類を含む哺乳動物由来の無核細胞である。

一部の実施形態では、親無核細胞は、赤血球細胞である。一部の実施形態では、親無核細胞は、血小板である。一部の実施形態では、赤血球細胞は、赤血球である。一部の実施形態では、赤血球細胞は、網状赤血球である。

一部の実施形態では、哺乳動物の組成物における無核細胞由来の小胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかの循環半減期は、親無核細胞と比較して減少している。一部の実施形態では、哺乳動物の組成物における無核細胞由来の小胞の少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかの循環半減期は、親無核細胞と比較して減少している。一部の実施形態では、哺乳動物の組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかの循環半減期は、親無核細胞と比較して減少している。一部の実施形態では、哺乳動物の組成物における無核細胞由来の小胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかの循環半減期は、親無核細胞と比較して約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９０％より多くのいずれかまで減少している。一部の実施形態では、親無核細胞はヒト細胞であり、組成物における無核細胞由来の小胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかの循環半減期は、約５分、１０分、１５分、３０分、１時間、６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、または１０日未満のいずれかである。一部の実施形態では、親無核細胞はヒト細胞であり、組成物における無核細胞由来の小胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかの循環半減期は、約１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、３０分、４５分、１時間、３時間、６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、または１０日のいずれかである。

一部の実施形態では、親無核細胞は赤血球細胞であり、組成物における無核細胞由来の小胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかのヘモグロビンレベルは、親無核細胞と比較して減少している。一部の実施形態では、哺乳動物の組成物における無核細胞由来の小胞の少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかのヘモグロビンレベルは、親無核細胞と比較して減少している。一部の実施形態では、組成物における無核細胞由来の小胞の２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかのヘモグロビンレベルは、親無核細胞と比較して少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％のいずれかまで減少している。一部の実施形態では、組成物における無核細胞由来の小胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかのヘモグロビンレベルは、親無核細胞におけるヘモグロビンのレベルの約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％のいずれかである。

一部の実施形態では、親無核細胞は赤血球であり、組成物における無核細胞由来の小胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかは、親無核細胞と比較してモジュレートされた形態を有する。一部の実施形態では、親無核細胞は赤血球であり、組成物における無核細胞由来の小胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかは、球状の形態である。一部の実施形態では、親無核細胞は赤血球であり、組成物における無核細胞由来の小胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかは、親無核細胞と比較して低減された、例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％より多くのいずれかまで低減された両凹形状を有する。

一部の実施形態では、親無核細胞は赤血球細胞または赤血球であり、組成物における無核細胞由来の小胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかは、赤血球細胞ゴーストである。

一部の実施形態では、組成物における無核細胞由来の小胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかは、表面ホスファチジルセリンを含む。一部の実施形態では、組成物における無核細胞由来の小胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかは、親無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベルを含む。一部の実施形態では、組成物における無核細胞由来の小胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかは、複数の親無核細胞を含む組成物と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、または２００％より多くのいずれかより高い表面ホスファチジルセリンレベルを有する。

一部の実施形態では、組成物における無核細胞由来の小胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかは、親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する。一部の実施形態では、組成物における無核細胞由来の小胞の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかは、親無核細胞によって産生されるＡＴＰのレベルの約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％未満のいずれかのＡＴＰを産生する。一部の実施形態では、試料および対照のＡＴＰ産生は、類似する条件下で測定される。一部の実施形態では、少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかは、ＡＴＰを産生しない。

一部の実施形態では、親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、本明細書にさらに記載されるように、次の特性、すなわち、組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して減少した哺乳動物における循環半減期を有するという特性を含む、組成物が提供される。

一部の実施形態では、親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、本明細書にさらに記載されるように、次の特性、すなわち、組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベルを有するという特性を含む、組成物が提供される。

一部の実施形態では、親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、本明細書にさらに記載されるように、次の特性、すなわち、組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％より多くのいずれかが、球状の形態を有する、組成物が提供される。

一部の実施形態では、親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、本明細書にさらに記載されるように、次の特性、すなわち、組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％より多くのいずれかが、ＲＢＣゴーストである、組成物が提供される。

一部の実施形態では、親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、本明細書にさらに記載されるように、次の特性、すなわち、組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％より多くのいずれかが、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、組成物が提供される。

一部の実施形態では、親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、本明細書にさらに記載されるように、次の特性、すなわち、組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、組成物が提供される。

一部の実施形態では、親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、本明細書にさらに記載されるように、次の特性：（ａ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期を有する、（ｂ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、（ｃ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、球状の形態を有する、（ｄ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、ＲＢＣゴーストである、（ｅ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または（ｆ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、のうちいずれか２種を含む、組成物が提供される。

一部の実施形態では、親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、本明細書にさらに記載されるように、次の特性：（ａ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期を有する、（ｂ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、（ｃ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、球状の形態を有する、（ｄ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、ＲＢＣゴーストである、（ｅ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または（ｆ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、のうちいずれか３種を含む、組成物が提供される。

一部の実施形態では、親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、本明細書にさらに記載された、次の特性：（ａ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期を有する、（ｂ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、（ｃ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、球状の形態を有する、（ｄ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、ＲＢＣゴーストである、（ｅ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または（ｆ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、のうちいずれか４種を含む、組成物が提供される。

一部の実施形態では、親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、本明細書にさらに記載された、次の特性：（ａ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期を有する、（ｂ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、（ｃ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、球状の形態を有する、（ｄ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、ＲＢＣゴーストである、（ｅ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または（ｆ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、のうちいずれか５種を含む、組成物が提供される。

一部の実施形態では、親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、本明細書にさらに記載された、次の特性：（ａ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期を有する、（ｂ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、（ｃ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％より多くのいずれかが、球状の形態を有する、（ｄ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％より多くのいずれかが、ＲＢＣゴーストである、（ｅ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％より多くのいずれかが、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、および（ｆ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％より多くのいずれかが、親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、を含む、組成物が提供される。

本明細書に記載の一部の実施形態では、複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物の１種または複数の特性は、無核細胞由来の小胞が調製された親無核細胞の集団に対する比較に基づく。一部の実施形態では、比較は、親無核細胞の集団に関して測定された平均値に基づく。一部の実施形態では、比較は、親無核細胞の集団に関して測定された値の範囲に基づく。一部の実施形態では、親無核細胞の集団から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、次の特性：（ａ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞の集団の平均値と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期を有する、（ｂ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞の集団の平均値と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、（ｃ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、球状の形態を有する、（ｄ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、ＲＢＣゴーストである、（ｅ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞の集団の平均値と比較してより高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または（ｆ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％より多くのいずれかが、親無核細胞の集団の平均値と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、のうち１種または複数を有する、組成物が提供される。

一部の実施形態では、親無核細胞は、無核細胞由来の小胞の調製中に、次のうち１種または複数、例えばすべてに付されなかった；（ａ）熱処理される、例えば、熱処置されるかまたは熱ショックを与えられる、（ｂ）化学的に処置される、および（ｃ）低浸透圧性または高浸透圧性条件に付される。

一部の実施形態では、親無核細胞からの無核細胞由来の小胞の調製中に容積オスモル濃度が維持された。一部の実施形態では、約２００ｍＯｓｍ～約６００ｍＯｓｍの間、例えば、約２００ｍＯｓｍ～約３００ｍＯｓｍ、約２００ｍＯｓｍ～約４００ｍＯｓｍ、約２００ｍＯｓｍ～約５００ｍＯｓｍ、約３００ｍＯｓｍ～約５００ｍＯｓｍまたは約３５０ｍＯｓｍ～約４５０ｍＯｓｍの間のいずれかで容積オスモル濃度が維持された。一部の実施形態では、約２００ｍＯｓｍ～約４００ｍＯｓｍの間で容積オスモル濃度が維持された。

一部の実施形態では、組成物の無核細胞由来の小胞は：インプット親無核細胞を含む懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、ペイロードの通過に十分なほど大きい無核細胞の撹乱を引き起こし；これにより、無核細胞由来の小胞を生成する、ステップを含むプロセスによって調製された。一部の実施形態では、組成物の無核細胞由来の小胞は、ペイロードを含む。一部の実施形態では、ペイロードは、治療用ペイロードである。一部の実施形態では、ペイロードは、抗原である。一部の実施形態では、ペイロードは、アジュバントである。一部の実施形態では、ペイロードは、寛容原性因子である。一部の実施形態では、ペイロードは、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、低分子、複合体（タンパク質ベースの複合体、核酸複合体、タンパク質－タンパク質複合体、核酸－核酸複合体、またはタンパク質－核酸複合体など）、またはナノ粒子である。

一部の実施形態では、組成物の無核細胞由来の小胞は：（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、ペイロードの通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと；（ｂ）ペイロードを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をペイロードと共にインキュベートし；これにより、ペイロードを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、本明細書に記載の任意の抗原などの抗原を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、本明細書に記載の任意の抗原から選択されるような複数の異なる種類の抗原（例えば、２、３、４、または５種の異なる種類の抗原）を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、本明細書に記載の任意のアジュバントなどのアジュバントを含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、本明細書に記載の任意のアジュバントから選択されるような複数の異なる種類のアジュバント（例えば、２、３、４、または５種の異なる種類のアジュバント）を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、本明細書に記載の任意の寛容原性因子などの寛容原性因子を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、本明細書に記載の任意の寛容原性因子から選択されるような複数の異なる種類の寛容原性因子（例えば、２、３、４、または５種の異なる種類の寛容原性因子）を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、抗原およびアジュバントを含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、アジュバントおよび寛容原性因子を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、抗原および寛容原性因子を含む。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、抗原、アジュバント、および寛容原性因子を含む。

一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞は、活性化抗原担体（ＡＡＣ）である。

例えば、一部の実施形態では、抗原は、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされることが可能である。一部の実施形態では、抗原は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされることが可能である。一部の実施形態では、抗原は、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされることが可能である。一部の実施形態では、抗原は、疾患関連抗原である。一部の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。一部の実施形態では、抗原は、ライセートに由来する。一部の実施形態では、ライセートは、移植された組織のライセートである。一部の実施形態では、ライセートは、腫瘍ライセートである。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、または真菌抗原である。一部の実施形態では、抗原は、微生物である。一部の実施形態では、抗原は、ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原は、脂質抗原である。一部の実施形態では、抗原は、糖鎖抗原である。一部の実施形態では、抗原をコードする核酸は、細胞に送達される。一部の実施形態では、抗原は、修飾された抗原である。一部の実施形態では、修飾された抗原は、ポリペプチドに融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、標的ペプチドと融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、脂質と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、炭水化物と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、ナノ粒子と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、複数の抗原は、無核細胞に送達される。一部の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧＯＤＮ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、イミキモド、レシキモド、および／またはＬＰＳである。

一部の実施形態では、組成物の無核細胞由来の小胞は、抗原およびアジュバントを含み、組成物の無核細胞由来の小胞は、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された。

一部の実施形態では、組成物の無核細胞由来の小胞は、抗原および寛容原性因子を含み、組成物の無核細胞由来の小胞は、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原および寛容原性因子の通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）抗原および寛容原性因子を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原および寛容原性因子と共にインキュベートし、これにより、抗原および寛容原性因子を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された。

一部の実施形態では、狭窄は、マイクロ流体チャネル内に含有される。一部の実施形態では、マイクロ流体チャネルは、複数の狭窄を含む。一部の実施形態では、複数の狭窄は、直列および／または並列に配列されている。一部の実施形態では、狭窄は、複数の微小な支柱の間；アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間；または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する。一部の実施形態では、狭窄は、複数の微小な支柱によって形成される。一部の実施形態では、狭窄は、アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間に形成される。一部の実施形態では、狭窄は、１枚または複数の可動プレートによって形成される。

一部の実施形態では、狭窄サイズは、細胞の直径、例えば、無核細胞の最大直径の約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％のいずれかである。一部の実施形態では、狭窄サイズは、細胞の直径、例えば、無核細胞の最大直径の約８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、または１０％未満のいずれかである。一部の実施形態では、狭窄は、０．１μｍ～約４μｍ、例えば、約１μｍ～約３μｍ、約１．７５μｍ～約２．５μｍ、または約２μｍ～約２．５μｍのいずれかの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約４μｍ、３．５μｍ、３μｍ、２．５μｍ、２μｍ、１．５μｍ、１μｍ、０．５μｍ、または約０．２５μｍのいずれかの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約１．８μｍ、１．９μｍ、２μｍ、２．１μｍ、２．２μｍ、２．３μｍ、２．４μｍ、２．５μｍまたは２．６μｍのいずれかの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約２．２μｍの幅を有する。

一部の実施形態では、インプット親無核細胞は、約１０ｐｓｉ～約１５０ｐｓｉ、例えば、約３０ｐｓｉ～約６０ｐｓｉ、約１０ｐｓｉ～約４０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉのいずれかに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。一部の実施形態では、インプット親無核細胞は、少なくとも約５ｐｓｉ、１０ｐｓｉ、１５ｐｓｉ、２０ｐｓｉ、２５ｐｓｉ、３０ｐｓｉ、３５ｐｓｉ、４０ｐｓｉ、４５ｐｓｉ、５０ｐｓｉ、５５ｐｓｉ、６０ｐｓｉ、６５ｐｓｉ、７０ｐｓｉ、７５ｐｓｉ、８０ｐｓｉ、８５ｐｓｉ、９０ｐｓｉ、９５ｐｓｉ、１００ｐｓｉ、１０５ｐｓｉ１１０ｐｓｉ、１１５ｐｓｉ、１２０ｐｓｉ、１２５ｐｓｉ、１３０ｐｓｉ、１３５ｐｓｉ、１４０ｐｓｉ、１４５ｐｓｉ、または１５０ｐｓｉのいずれかの圧力下で、狭窄に通される。一部の実施形態では、インプット親無核細胞は、少なくとも約５ｐｓｉおよび約１５０ｐｓｉ、１４５ｐｓｉ、１４０ｐｓｉ、１３５ｐｓｉ、１３０ｐｓｉ、１２５ｐｓｉ、１２０ｐｓｉ、１１５ｐｓｉ、１１０ｐｓｉ、１０５ｐｓｉ、１００ｐｓｉ、９５ｐｓｉ、９０ｐｓｉ、８５ｐｓｉ、８０ｐｓｉ、７５ｐｓｉ、７０ｐｓｉ、６５ｐｓｉ、６０ｐｓｉ、５５ｐｓｉ、５０ｐｓｉ、４５ｐｓｉ、４０ｐｓｉ、３５ｐｓｉ、３０ｐｓｉ、２５ｐｓｉ、２０ｐｓｉ、または１５ｐｓｉ未満のいずれかの圧力下で、狭窄に通される。

一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄に通す前に、ペイロードと接触させられる（例えば、最初に接触させられる）。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄を通すのと同時発生的に、ペイロードと接触させられる（例えば、最初に接触させられる）。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄を通した後に、ペイロードと接触させられる（例えば、最初に接触させられる）。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄を通すのと同時発生的におよび狭窄を通した後に、ペイロードと少なくとも接触させられる。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄に通す前に、狭窄を通すのと同時発生的に、および狭窄を通した後に、ペイロードと接触させられる。

一部の実施形態では、組成物は、少なくとも約５００，０００個、例えば、少なくとも約１００万（Ｍ）、１．５Ｍ、２Ｍ、２．５Ｍ、３Ｍ、３．５Ｍ、４Ｍ、４．５Ｍ、５Ｍ、５．５Ｍ、６Ｍ、６．５Ｍ、７Ｍ、７．５Ｍ、８Ｍ、８．５Ｍ、９Ｍ、９．５Ｍ、１０億（Ｂ）、１．１Ｂ、１．２Ｂ、１．３Ｂ、１．４Ｂ、１．５Ｂ、１０Ｂ、１００Ｂ、または１兆（Ｔ）個のいずれかの無核細胞由来の小胞を含む。

一部の実施形態では、組成物は、少なくとも約５００，０００個、例えば、少なくとも約１００万（Ｍ）、１．５Ｍ、２Ｍ、２．５Ｍ、３Ｍ、３．５Ｍ、４Ｍ、４．５Ｍ、５Ｍ、５．５Ｍ、６Ｍ、６．５Ｍ、７Ｍ、７．５Ｍ、８Ｍ、８．５Ｍ、９Ｍ、９．５Ｍ、１０億（Ｂ）、１．１Ｂ、１．２Ｂ、１．３Ｂ、１．４Ｂ、もしくは１．５Ｂ、１０Ｂ、１００Ｂ、または１兆（Ｔ）個のいずれかの無核細胞およびアジュバントを含む。

一部の実施形態では、組成物は、約２５％～約８０％、例えば、約２５％～約４５％、約３５％～約５５％、約３５％～約６５％、または約４５％～約７０のいずれかのヘマトクリット（Ｈｔ）レベルを有する。一部の実施形態では、組成物は、約２０％より多く、例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％より多くのいずれかのヘマトクリット（Ｈｔ）レベルを有する。一部の実施形態では、組成物は、約８０％未満、例えば、約７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、または２０％未満のいずれかのヘマトクリット（Ｈｔ）レベルを有する。一部の実施形態では、組成物は、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％のいずれかのヘマトクリット（Ｈｔ）レベルを有する。

一部の実施形態では、組成物は、医薬組成物である。一部の実施形態では、組成物は、滅菌医薬組成物である。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物のいずれかによれば、組成物は、ゴースト形成および／もしくは生存率および／もしくは機能を増強させる１種または複数の追加の薬剤をさらに含み、ならびに／または１種または複数の追加の薬剤を有さない無核細胞および／もしくは無核細胞由来の小胞を含む対応する組成物と比較して、無核細胞および／もしくは無核細胞由来の小胞に対する、例えば、投与のための、実用性を提供する。一部の実施形態では、追加の薬剤は、安定剤または補因子である。一部の実施形態では、追加の薬剤は、緩衝剤である。一部の実施形態では、追加の薬剤は、哺乳動物への投与に好適な緩衝剤である。一部の実施形態では、薬剤は、アルブミンである。一部の実施形態では、アルブミンは、マウス、ウシ、またはヒトアルブミンである。一部の実施形態では、追加の薬剤は、二価の金属カチオン、グルコース、ＡＴＰ、カリウム、グリセロール、トレハロース、Ｄ－スクロース、ＰＥＧ１５００、Ｌ－アルギニン、Ｌ－グルタミン、またはＥＤＴＡである。
細胞を変形させる狭窄

本明細書に記載の方法のいずれかまたは無核細胞由来の小胞のいずれかによる一部の実施形態では、狭窄は、マイクロ流体チャネル内に含有される。一部の実施形態では、マイクロ流体チャネルは、複数の狭窄を含む。複数の狭窄は、マイクロ流体チャネル内に、並列および／または直列に配列され得る。したがって、一部の実施形態では、複数の狭窄は、直列および／または並列に配置されている。一部の実施形態では、狭窄は、複数の微小な支柱の間；アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間；または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する。一部の実施形態では、狭窄は、複数の微小な支柱によって；アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間に；または１枚または複数の可動プレートによって形成されている。本明細書に開示されている方法において使用するための細胞を変形させる狭窄を含有する例示的なマイクロ流体チャネルは、ＷＯ２０１３０５９３４３に記載されている。一部の実施形態では、狭窄は、ポアである、またはポア内に含有される。本明細書に開示されている方法において使用するためのポアを有する例示的な表面は、ＷＯ２０１７０４１０５０に記載されている。

一部の実施形態では、マイクロ流体チャネルは、内腔を含み、緩衝剤中に懸濁されたインプット無核細胞が通過できるように構成され、ここで、マイクロ流体チャネルは、狭窄を含む。マイクロ流体チャネルは、ケイ素、金属（例えば、ステンレス鋼）、プラスチック（例えば、ポリスチレン、ＰＥＴ、ＰＥＴＧ）、セラミック、ガラス、結晶性基質、非結晶性基質、またはポリマー（例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ＰＤＭＳ、環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）など）を含む、いくつかの材料のうちいずれか１種から作製することができる。マイクロ流体チャネルの製作は、乾燥エッチング、湿式エッチング、フォトリソグラフィー、インジェクションモールディング、レーザーアブレーション、またはＳＵ－８マスクを含む、当技術分野で公知の任意の方法によって実施することができる。

一部の実施形態では、マイクロ流体チャネル内の狭窄は、入口部分、中心点、および出口部分を含む。一部の実施形態では、マイクロ流体チャネル内の狭窄の長さ、深さ、および幅は変動され得る。一部の実施形態では、狭窄の直径は、懸濁液におけるインプット無核細胞またはインプット無核細胞のクラスターの直径の関数である。一部の実施形態では、マイクロ流体チャネル内の狭窄の直径は、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、狭窄サイズは、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％である。一部の実施形態では、狭窄サイズは、懸濁液におけるインプット無核細胞（例えば、ＲＢＣ）の最小断面距離の約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％である。一部の実施形態では、狭窄サイズは、懸濁液における無核細胞の最大直径などの細胞の直径の約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％のいずれかである。一部の実施形態では、狭窄サイズは、懸濁液における無核細胞の最大直径などの細胞の直径の約８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、または１０％未満のいずれかである。一部の実施形態では、狭窄は、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約７μｍ、約６μｍ、約５μｍ、約４μｍ、約３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１μｍ、約０．５μｍ、または約０．２５μｍ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約１．６μｍ、約１．８μｍ、約２．０μｍ、約２．２μｍ、約２．４μｍ、約２．６μｍ、約２．８μｍ、または約３．０μｍのいずれか１つの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約２．２μｍの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約０．１μｍ～約４μｍ、例えば、約１μｍ～約３μｍ、約１．７５μｍ～約２．５μｍ、または約２μｍ～約２．５μｍのいずれかの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約４μｍ、３．５μｍ、３μｍ、２．５μｍ、２μｍ、１．５μｍ、１μｍ、０．５μｍ、または約０．２５μｍのいずれかの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約１．８μｍ、１．９μｍ、２μｍ、２．１μｍ、２．２μｍ、２．３μｍ、２．４μｍ、２．５μｍまたは２．６μｍのいずれかの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約２．２μｍの幅を有する。

一部の適用では、狭窄幅は、インプット無核細胞からのゴースト形成の相対量をモジュレートするために変動され得る。一部の適用では、狭窄幅は、インプット無核細胞からのゴースト形成の相対量を増加させるために低減され得る。一部の適用では、狭窄長さは、インプット無核細胞からのゴースト形成の相対量をモジュレートするために変動され得る。一部の適用では、狭窄長さは、インプット無核細胞からのゴースト形成の相対量を増加させるために増加され得る。

ある特定の実施形態では、インプット無核細胞は、約１０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。ある特定の実施形態では、インプット無核細胞は、約５ｐｓｉ～約１５０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。ある特定の実施形態では、インプット無核細胞は、約５ｐｓｉ～約１０ｐｓｉ、約１０ｐｓｉ～約２０ｐｓｉ、約２０ｐｓｉ～約３０ｐｓｉ、約３０ｐｓｉ～約４０ｐｓｉ、約４０ｐｓｉ～約５０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ～約６０ｐｓｉ、約６０ｐｓｉ～約７０ｐｓｉ、約７０ｐｓｉ～約８０ｐｓｉ、約８０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉ、約９０ｐｓｉ～約１００ｐｓｉ、約１００ｐｓｉ～約１１０ｐｓｉ、約１１０ｐｓｉ～約１２０ｐｓｉ、約１２０ｐｓｉ～約１３０ｐｓｉ、約１３０ｐｓｉ～約１４０ｐｓｉ、約１４０ｐｓｉ～約１５０ｐｓｉ、または約１５０ｐｓｉ～約２００ｐｓｉのいずれか１つに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。一部の実施形態では、親無核細胞は、約１０ｐｓｉ～約１５０ｐｓｉ、例えば、約３０ｐｓｉ～約６０ｐｓｉ、約１０ｐｓｉ～約４０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉのいずれかに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。一部の実施形態では、親無核細胞は、少なくとも約５ｐｓｉ、１０ｐｓｉ、１５ｐｓｉ、２０ｐｓｉ、２５ｐｓｉ、３０ｐｓｉ、３５ｐｓｉ、４０ｐｓｉ、４５ｐｓｉ、５０ｐｓｉ、５５ｐｓｉ、６０ｐｓｉ、６５ｐｓｉ、７０ｐｓｉ、７５ｐｓｉ、８０ｐｓｉ、８５ｐｓｉ、９０ｐｓｉ、９５ｐｓｉ、１００ｐｓｉ、１０５ｐｓｉ、１１０ｐｓｉ、１１５ｐｓｉ、１２０ｐｓｉ、１２５ｐｓｉ、１３０ｐｓｉ、１３５ｐｓｉ、１４０ｐｓｉ、１４５ｐｓｉ、または１５０ｐｓｉのいずれかの圧力下で、狭窄に通される。一部の実施形態では、親無核細胞は、少なくとも約５ｐｓｉおよび約１５０ｐｓｉ、１４５ｐｓｉ、１４０ｐｓｉ、１３５ｐｓｉ、１３０ｐｓｉ、１２５ｐｓｉ、１２０ｐｓｉ、１１５ｐｓｉ、１０５ｐｓｉ、１００ｐｓｉ、９５ｐｓｉ、９０ｐｓｉ、８５ｐｓｉ、８０ｐｓｉ、７５ｐｓｉ、７０ｐｓｉ、６５ｐｓｉ、６０ｐｓｉ、５５ｐｓｉ、５０ｐｓｉ、４５ｐｓｉ、４０ｐｓｉ、３５ｐｓｉ、３０ｐｓｉ、２５ｐｓｉ、２０ｐｓｉ、または１５ｐｓｉ未満のいずれかの圧力下で、狭窄に通される。一部の適用では、圧力は、インプット無核細胞からのゴースト形成の相対量をモジュレートするために変動され得る。一部の実施形態では、圧力は、インプット無核細胞からのゴースト形成の相対量を増加させるために増加され得る。チャネル、入口部分、中心点、および出口部分の断面も変動し得る。例えば、断面は、形状が円形、楕円形、細長いスリット、四角、六角形、または三角形であり得る。入口部分は、狭窄角を規定し、ここで、狭窄角は、チャネルの詰まりを低減するために最適化され、抗原および／またはアジュバントの細胞内への増強された送達のために最適化される。出口部分の角度も同様に変動し得る。例えば、出口部分の角度は、非層流をもたらし得る乱流の尤度を低減するよう構成される。一部の実施形態では、入口部分および／または出口部分の壁は、直線状である。他の実施形態では、入口部分および／または出口部分の壁は、曲線状である。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄に通す前に、それと同時発生的に、および／またはその後に、抗原と接触させられる。

本明細書に記載の方法または無核細胞由来の小胞のいずれかによる一部の実施形態では、インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄に通し、ここで、狭窄は、インプット無核細胞を変形させ、これにより、抗原および／またはアジュバントがインプット無核細胞に進入するように、インプット無核細胞の撹乱を引き起こす。一部の実施形態では、狭窄は、ポアである、またはポア内に含有される。一部の実施形態では、ポアは、表面に含有される。本明細書に開示されている方法において使用するためのポアを有する例示的な表面は、ＷＯ２０１７０４１０５０に記載されている。

一部の実施形態では、狭窄サイズは、無核細胞の関数である。一部の実施形態では、狭窄サイズは、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、狭窄サイズは、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の約１０％～約７０％である。一部の実施形態では、狭窄サイズは、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％である。一部の実施形態では、狭窄サイズは、懸濁液におけるインプット無核細胞（例えば、ＲＢＣなどの無核細胞）の最小断面距離の約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％である。最適な狭窄サイズまたは狭窄幅は、適用および／または細胞の種類に基づいて変動し得る。一部の実施形態では、狭窄は、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約７μｍ、約６μｍ、約５μｍ、約４μｍ、約３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１μｍ、約０．５μｍ、または約０．２５μｍ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約７μｍ、約６μｍ、約５μｍ、約４μｍ、約３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍ、約０．２５μｍ、または約０．１μｍ未満のいずれかの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約１．６μｍ、約１．８μｍ、約２．０μｍ、約２．２μｍ、約２．４μｍ、約２．６μｍ、約２．８μｍ、または約３．０μｍのいずれか１つの幅を有する。一部の実施形態では、狭窄は、約２．２μｍの幅を有する。一部の適用では、狭窄幅は、インプット無核細胞からのゴースト形成の相対量をモジュレートするために変動されてもよい。一部の適用では、狭窄幅は、インプット無核細胞からのゴースト形成の相対量を増加させるために低減されてもよい。一部の適用では、狭窄長さは、インプット無核細胞からのゴースト形成の相対量をモジュレートするために変動されてもよい。一部の適用では、狭窄長さは、インプット無核細胞からのゴースト形成の相対量を増加させるために増加されてもよい。ある特定の実施形態では、インプット無核細胞は、約１０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。ある特定の実施形態では、インプット無核細胞は、約５ｐｓｉ～約１５０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。ある特定の実施形態では、インプット無核細胞は、約５ｐｓｉ～約１０ｐｓｉ、約１０ｐｓｉ～約２０ｐｓｉ、約２０ｐｓｉ～約３０ｐｓｉ、約３０ｐｓｉ～約４０ｐｓｉ、約４０ｐｓｉ～約５０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ～約６０ｐｓｉ、約６０ｐｓｉ～約７０ｐｓｉ、約７０ｐｓｉ～約８０ｐｓｉ、約８０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉ、約９０ｐｓｉ～約１００ｐｓｉ、約１００ｐｓｉ～約１１０ｐｓｉ、約１１０ｐｓｉ～約１２０ｐｓｉ、約１２０ｐｓｉ～約１３０ｐｓｉ、約１３０ｐｓｉ～約１４０ｐｓｉ、約１４０ｐｓｉ～約１５０ｐｓｉ、または約１５０ｐｓｉ～約２００ｐｓｉのいずれか１つに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。一部の実施形態では、圧力は、インプット無核細胞からのゴースト形成の相対量をモジュレートするために変動されてもよい。一部の実施形態では、圧力は、インプット無核細胞からのゴースト形成の相対量を増加させるために増加されてもよい。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄に通す前に、それと同時発生的に、および／またはその後に、抗原と接触させられる。

本明細書に開示されている表面は、いくつかの材料のうちいずれか１種から作製され、いくつかの形態のうちいずれか１種をとり得る。一部の実施形態では、表面は、フィルターである。一部の実施形態では、表面は、膜である。一部の実施形態では、フィルターは、接線流フィルターである。一部の実施形態では、表面は、スポンジまたはスポンジ様マトリックスである。一部の実施形態では、表面は、マトリックスである。

一部の実施形態では、表面は、蛇行経路表面である。一部の実施形態では、蛇行経路表面は、酢酸セルロースを含む。一部の実施形態では、表面は、限定されないが、合成または天然のポリマー、ポリカーボネート、ケイ素、ガラス、金属、合金、硝酸セルロース、銀、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリプロピレン、ＰＶＤＦ、ポリテトラフルオロエチレン、混合セルロースエステル、磁器、およびセラミックから選択される材料を含む。

本明細書に開示されている表面は、当技術分野で公知の任意の形状；例えば、３次元形状を有し得る。表面の２次元形状は、限定されないが、円形、楕円形、丸型、正方形、星型、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形、または八角形であり得る。一部の実施形態では、表面は、形状が丸型である。一部の実施形態では、表面の３次元形状は、円柱形、円錐形、または立方体状である。

表面は、様々な断面幅および厚さを有し得る。一部の実施形態では、表面断面幅は、約１ｍｍ～約１ｍの間またはこれらの間の断面幅の任意の断面幅もしくは範囲である。一部の実施形態では、表面は、規定された厚さを有する。一部の実施形態では、表面の厚さは、均一である。一部の実施形態では、表面の厚さは、可変である。例えば、一部の実施形態では、表面の一部は、その表面の他の部分よりも厚いかまたは薄い。一部の実施形態では、表面の厚さは、約１％～約９０％、またはそれらの間の任意のパーセンテージもしくはパーセンテージの範囲で変動する。一部の実施形態では、表面は、約０．０１μｍ～約５ｍｍの間の厚さ、またはそれらの間の任意の厚さもしくは厚さの範囲である。

本明細書に記載の方法のいずれかによる一部の実施形態では、狭窄は、ポアである、またはポア内に含有される。一部の実施形態では、ポアは、表面に含有される。一部の実施形態では、表面は、フィルターである。一部の実施形態では、表面は、膜である。ポアの断面幅は、処置される細胞の種類に関連する。一部の実施形態では、ポアサイズは、処置されるインプット無核細胞またはインプット無核細胞のクラスターの懸濁液における直径の関数である。一部の実施形態では、ポアサイズは、インプット無核細胞がポアを通過する際に撹乱されるようなサイズである。一部の実施形態では、ポアサイズは、インプット無核細胞の直径未満である。一部の実施形態では、ポアサイズは、無核細胞の直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、ポアサイズは、インプット無核細胞の直径の約１０％～約７０％である。一部の実施形態では、ポアサイズは、インプット無核細胞の約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％である。最適なポアサイズまたはポア断面幅は、適用および／または細胞の種類に基づいて変動し得る。一部の適用では、ポアサイズまたはポア断面幅は、インプット無核細胞からのゴースト形成の相対量をモジュレートするために変動されてもよい。一部の適用では、ポアサイズまたはポア断面幅は、インプット無核細胞からのゴースト形成の相対量を増加させるために低減されてもよい。一部の実施形態では、ポアサイズまたはポア断面幅は、約０．１μｍ～約４μｍである。一部の実施形態では、ポアサイズまたはポア断面幅は、約０．２５μｍ～約４μｍである。一部の実施形態では、ポアサイズまたはポア断面幅は、約４μｍ、約３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍ、約０．２５μｍ、または約０．１μｍである。一部の実施形態では、ポアサイズまたはポア断面幅は、約４μｍ、約３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍ、約０．２５μｍ、もしくは約０．１μｍのいずれかであるか、またはそれ未満である。一部の実施形態では、ポアサイズまたはポア断面幅は、約１．６μｍ、約１．８μｍ、約２．０μｍ、約２．２μｍ、約２．４μｍ、約２．６μｍ、約２．８μｍ、または約３．０μｍのいずれか１つである。一部の実施形態では、ポアサイズまたはポア断面幅は、約２．２μｍである。ある特定の実施形態では、インプット無核細胞は、約１０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、ポアに通される。ある特定の実施形態では、インプット無核細胞は、約５ｐｓｉ～約１５０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。ある特定の実施形態では、インプット無核細胞は、約５ｐｓｉ～約１０ｐｓｉ、約１０ｐｓｉ～約２０ｐｓｉ、約２０ｐｓｉ～約３０ｐｓｉ、約３０ｐｓｉ～約４０ｐｓｉ、約４０ｐｓｉ～約５０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ～約６０ｐｓｉ、約６０ｐｓｉ～約７０ｐｓｉ、約７０ｐｓｉ～約８０ｐｓｉ、約８０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉ、約９０ｐｓｉ～約１００ｐｓｉ、約１００ｐｓｉ～約１１０ｐｓｉ、約１１０ｐｓｉ～約１２０ｐｓｉ、約１２０ｐｓｉ～約１３０ｐｓｉ、約１３０ｐｓｉ～約１４０ｐｓｉ、約１４０ｐｓｉ～約１５０ｐｓｉ、または約１５０ｐｓｉ～約２００ｐｓｉのいずれか１つに及ぶ圧力下で、ポアに通される。一部の実施形態では、圧力は、インプット無核細胞からのゴースト形成の相対量をモジュレートするために変動されてもよい。一部の実施形態では、圧力は、インプット無核細胞からのゴースト形成の相対量を増加させるために増加されてもよい。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、ポアに通す前に、それと同時発生的に、および／またはその後に、抗原と接触させられる。

ポア通路の入口および出口は、種々の角度を有してもよい。ポアの角度は、無核細胞が通過する間のポアの目詰まりを最小限にするように選択され得る。例えば、入口または出口部分の角度は、約０度～約９０度の間であり得る。一部の実施形態では、入口または出口部分は、９０度より多くであり得る。一部の実施形態では、ポアは、同一の入口および出口の角度を有する。一部の実施形態では、ポアは、異なる入口および出口の角度を有する。一部の実施形態では、ポアの縁は、滑らか、例えば、丸みを帯びているまたはカーブしている。滑らかなポアの縁は、隆起も畝も起伏のある部分もない、連続した平坦で平らな表面を有する。一部の実施形態では、ポアの縁は、鋭い。鋭いポアの縁は、とがったまたは鋭角の薄い縁を有する。一部の実施形態では、ポア通路は、まっすぐである。まっすぐなポア通路は、カーブも屈曲も角度も他の不規則性も含有しない。一部の実施形態では、ポア通路は、カーブしている。カーブしたポア通路は、屈曲している、またはまっすぐな線から逸脱している。一部の実施形態では、ポア通路は、複数のカーブ、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多くのカーブを有する。

ポアは、２次元または３次元の形状を含む、当技術分野で公知の任意の形状を有し得る。ポア形状（例えば、断面形状）は、限定されないが、円形、楕円形、丸型、四角、星型、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形、および八角形であり得る。一部の実施形態では、ポアの断面は、形状が丸型である。一部の実施形態では、ポアの３次元形状は、円柱形または円錐形である。一部の実施形態では、ポアは、溝付きの入口および出口形状を有する。一部の実施形態では、ポアの形状は、所与の表面内のポアの間で均質（すなわち、一貫したまたは規則的）である。一部の実施形態では、ポアの形状は、所与の表面内のポアの間で不均質（すなわち、混合されるかまたは変動した）である。

本明細書に記載の表面は、一定範囲のポアの総数を有し得る。一部の実施形態では、ポアは、総表面積の約１０％～約８０％を包含する。一部の実施形態では、表面は、１．０×１０^５～約１．０×１０^３０個の総ポアまたはそれらの間のいずれかの数もしくは数の範囲を含有する。一部の実施形態では、表面は、１ｍｍ^２の表面積当たり約１０～約１．０×１０^１５個の間のポアを含む。

ポアは、所与の表面内に多数の方法で分布され得る。一部の実施形態では、ポアは、所与の表面内に並行に分布される。このような一例では、ポアは、同じ方向に並んで分布され、所与の表面内に同じ距離離れて存在する。一部の実施形態では、ポアの分布は、整然としているかまたは均質である。このような一例では、ポアは、規則的な規則正しいパターンで分布されるか、または所与の表面内で同じ距離離れて存在する。一部の実施形態では、ポア分布は、ランダムまたは不均質である。このような一例では、ポアは、不規則な無秩序なパターンで分布されるか、または所与の表面内で異なる距離離れて存在する。一部の実施形態では、複数の表面は、直列に分布される。複数の表面は、表面サイズ、形状および／または粗さが均質または不均質であり得る。複数の表面は、均質または不均質なポアサイズ、形状、および／または数を有するポアをさらに含有し、これにより、異なる種類の無核細胞への一定範囲の抗原および／またはアジュバントの同時送達が可能になる。

一部の実施形態では、個々のポアは、一様な幅寸法（すなわち、ポア通路の長さに沿って一定の幅）を有する。一部の実施形態では、個々のポアは、可変の幅（すなわち、ポア通路の長さに沿って増加するかまたは減少する幅）を有する。一部の実施形態では、所与の表面内のポアは、同じ個々のポアの深さを有する。一部の実施形態では、所与の表面内のポアは、異なる個々のポアの深さを有する。一部の実施形態では、ポアは、互いに直接隣接する。一部の実施形態では、ポアは、互いに一定の距離離れている。一部の実施形態では、ポアは、約０．００１μｍ～約３０ｍｍの距離、またはそれらの間の任意の距離もしくは距離の範囲、互いに離れている。

一部の実施形態では、表面は、材料でコーティングされている。材料は、限定されないが、テフロン（登録商標）、接着剤コーティング、界面活性剤、タンパク質、接着分子、抗体、抗凝固剤、細胞機能をモジュレートする因子、核酸、脂質、炭水化物、ナノ粒子、または膜貫通タンパク質を含む、当技術分野で公知の任意の材料から選択され得る。一部の実施形態では、表面は、ポリビニルピロリドンでコーティングされている。一部の実施形態では、材料は、表面に共有結合により結合している。一部の実施形態では、材料は、表面に非共有結合により結合している。一部の実施形態では、表面分子は、ポアを通過して無核細胞として放出される。

一部の実施形態では、表面は、修飾された化学的特性を有する。一部の実施形態では、表面は、親水性である。一部の実施形態では、表面は、疎水性である。一部の実施形態では、表面は、荷電されている。一部の実施形態では、表面は、正におよび／または負に荷電されている。一部の実施形態では、表面は、一部の領域において正に荷電されており、他の領域において負に荷電されていてもよい。一部の実施形態では、表面は、全体的に正のまたは全体的に負の荷電を有する。一部の実施形態では、表面は、平滑であるか、電解研磨されているか、粗面であるか、またはプラズマ処理されているかのいずれか１種であり得る。一部の実施形態では、表面は、両性イオンまたは二極性化合物を含む。一部の実施形態では、表面は、プラズマ処理されている。

一部の実施形態では、表面は、より大きなモジュール内に含有される。一部の実施形態では、表面は、シリンジ、例えば、プラスチックまたはガラスシリンジ内に含有される。一部の実施形態では、表面は、プラスチックフィルターホルダー内に含有される。一部の実施形態では、表面は、ピペットチップ内に含有される。

本明細書に記載の方法のいずれかまたは無核細胞由来の小胞のいずれかによる一部の実施形態では、インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄に通し、ここで、狭窄は、インプット無核細胞を変形させ、これにより、抗原および／またはアジュバントがインプット無核細胞に進入するように、細胞の撹乱を引き起こし、インプット無核細胞における撹乱は、細胞の外側からインプット無核細胞中に材料を移動させる、インプット無核細胞における破損である（例えば、孔、裂け目、空洞、開口、ポア、割れ目、ギャップ、穿孔）。変形は、例えば、機械的ひずみおよび／または剪断力によって誘導される圧力によって引き起こされ得る。一部の実施形態では、撹乱は、無核細胞膜内の撹乱である。一部の実施形態では、撹乱は、一過性である。一部の実施形態では、細胞の撹乱は、約１．０×１０^－９秒～約２４時間、またはそれらの間の任意の時間または時間の範囲、続く。一部の実施形態では、細胞の撹乱は、約１．０×１０^－９秒～約１秒、約１秒～約１分、約１分～約１時間、約１時間～約２時間、約２時間～約４時間、約４時間～約６時間、約６時間～約８時間、約８時間～約１０時間、約１０時間～約１２時間、約１２時間～約１６時間、約１６時間～約２０時間、または約２０時間～約２４時間、続く。一部の実施形態では、細胞の撹乱は、約１．０×１０^－９～約１．０×１０^－１、約１．０×１０^－９～約１．０×１０^－２、約１．０×１０^－９～約１．０×１０^－３、約１．０×１０^－９～約１．０×１０^－４、約１．０×１０^－９～約１．０×１０^－５、約１．０×１０^－９～約１．０×１０^－６、約１．０×１０^－９～約１．０×１０^－７、または約１．０×１０^－９～約１．０×１０^－８秒の間のいずれか１つの間、続く。一部の実施形態では、細胞の撹乱は、約１．０×１０^－８～約１．０×１０^－１、約１．０×１０^－７～約１．０×１０^－１、約１．０×１０^－６～約１．０×１０^－１、約１．０×１０^－５～約１．０×１０^－１、約１．０×１０^－４～約１．０×１０^－１、約１．０×１０^－３～約１．０×１０^－１、または約１．０×１０^－２～約１．０×１０^－１秒のいずれか１つの間、続く。本明細書に記載の方法によって生じる細胞の撹乱（例えば、ポアまたは孔）は、補体または細菌溶血素によって生じるもの等のマルチマーポア構造を形成するためのタンパク質サブユニットのアセンブリの結果として形成されるのではない。

一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントの無核細胞由来の小胞への通過は、インプット無核細胞を狭窄に通すことおよび／または細胞の撹乱と同時に起こる。一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントの無核細胞由来の小胞への通過は、インプット無核細胞を狭窄に通した後に起こる。一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントの無核細胞由来の小胞への通過は、インプット無核細胞を狭窄に通した後、数分のオーダーで起こる。一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントの無核細胞由来の小胞への通過は、インプット無核細胞を狭窄に通した約１．０×１０^－２秒～少なくとも約３０分後に起こる。例えば、抗原および／またはアジュバントの無核細胞由来の小胞への通過は、インプット無核細胞を狭窄に通した約１．０×１０^－２秒～約１秒、約１秒～約１分、または約１分～約３０分後に起こる。一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントの無核細胞由来の小胞への通過は、インプット無核細胞を狭窄に通した約１．０×１０^－２秒～約１０分、約１．０×１０^－２秒～約５分、約１．０×１０^－２秒～約１分、約１．０×１０^－２秒～約５０秒、約１．０×１０^－２秒～約１０秒、約１．０×１０^－２秒～約１秒、または約１．０×１０^－２秒～約０．１秒後に起こる。一部の実施形態では、抗原および／またはアジュバントの無核細胞由来の小胞への通過は、インプット無核細胞を狭窄に通した約１．０×１０^－１秒～約１０分、約１秒～約１０分、約１０秒～約１０分、約５０秒～約１０分、約１分～約１０分、または約５分～約１０分後に起こる。一部の実施形態では、インプット無核細胞を狭窄に通した後に得られる無核細胞由来の小胞における撹乱は、インプット無核細胞を狭窄に通した約５分後のオーダー内に補正される。

無核細胞からのゴースト形成は、実体形状がより球状の形態に向かって変化する場合に起こり、その元の細胞質の構造および内容物の一部の喪失が伴う可能性がある。ＲＢＣゴーストおよび赤血球ゴーストの形成は、当技術分野で公知の現象である。一部の実施形態では、狭窄に通した後のゴースト形成は、約５％～約１００％である。一部の実施形態では、狭窄に通した後のゴースト形成は、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％である。一部の実施形態では、ゴースト形成は、細胞を狭窄に通した約１．０×１０^－２秒～少なくとも約１０日後に測定される。例えば、ゴースト形成は、細胞を狭窄に通した約１．０×１０^－２秒～約１秒、約１秒～約１分、約１分～約３０分、または約３０分～約２時間後に測定される。一部の実施形態では、ゴースト形成は、細胞を狭窄に通した約１．０×１０^－２秒～約２時間、約１．０×１０^－２秒～約１時間、約１．０×１０^－２秒～約３０分、約１．０×１０^－２秒～約１分、約１．０×１０^－２秒～約３０秒、約１．０×１０^－２秒～約１秒、または約１．０×１０^－２秒～約０．１秒後に測定される。一部の実施形態では、ゴースト形成は、細胞を狭窄に通した約１．５時間～約２時間、約１時間～約２時間、約３０分～約２時間、約１５分～約２時間、約１分～約２時間、約３０秒～約２時間、または約１秒～約２時間後に測定される。一部の実施形態では、ゴースト形成は、細胞を狭窄に通した約２時間～約５時間、約５時間～約１２時間、約１２時間～約２４時間、または約２４時間～約１０日後に測定される。

いくつかのパラメーターは、本明細書に記載の方法または無核細胞由来の小胞のいずれかによる、抗原および／またはアジュバントの無核細胞由来の小胞への送達に影響を及ぼし得る。一部の実施形態では、インプット無核細胞を含む細胞懸濁液は、狭窄に通す前に、それと同時発生的に、またはその後に、抗原および／またはアジュバントと接触させられる。送達される抗原および／またはアジュバントを含む溶液中に懸濁されたインプット無核細胞が狭窄を通過してもよいが、抗原および／またはアジュバントは、インプット無核細胞が狭窄を通過した後に細胞懸濁液に添加され、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を形成してもよい。一部の実施形態では、送達される抗原および／またはアジュバントは、狭窄にコーティングされる。一部の実施形態では、送達される抗原および／またはアジュバントは、表面にコーティングされる。一部の実施形態では、送達される抗原および／またはアジュバントは、ポアにコーティングされる。一部の実施形態では、送達される抗原および／またはアジュバントは、フィルターにコーティングされる。

抗原および／またはアジュバントの無核細胞由来の小胞への送達に影響を及ぼし得るパラメーターの例としては、以下に限定されないが、狭窄の寸法、狭窄の入口の角度、狭窄の表面特性（例えば、粗さ、化学的修飾、親水性、疎水性など）、作動流スピード（例えば、狭窄を通る細胞の通過時間）、インプット無核細胞の濃度、細胞懸濁液における抗原および／またはアジュバントの濃度が挙げられ、狭窄に通した後に無核細胞由来の小胞を回収またはインキュベートする時間量は、送達された抗原および／またはアジュバントの細胞への通過に影響を与え得る。抗原および／またはアジュバントの無核細胞由来の小胞への送達に影響を及ぼす追加のパラメーターとしては、狭窄中でのインプット無核細胞の速度、狭窄中での剪断速度、インプット無核細胞懸濁液の粘度、流れ速度に対して垂直な速度構成成分、および狭窄中での時間を挙げることができる。このようなパラメーターは、抗原および／またはアジュバントの送達を制御するために設計され得る。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞の濃度は、約１０～少なくとも約１０^１２個の小胞／ｍＬ、またはそれらの間の任意の濃度もしくは濃度の範囲に及ぶ。一部の実施形態では、送達される抗原および／またはアジュバントの濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１ｇ／ｍＬ、またはそれらの間の任意の濃度もしくは濃度の範囲に及び得る。一部の実施形態では、送達される抗原および／またはアジュバントの濃度は、約１ｐＭ～少なくとも約２Ｍ、またはそれらの間の任意の濃度もしくは濃度の範囲に及び得る。細胞懸濁液の組成物（例えば、容積オスモル濃度、塩濃度、血清含量、細胞濃度、ｐＨなど）は、免疫応答を刺激および／または増強するための抗原および／またはアジュバントの送達に影響を及ぼし得る。一部の実施形態では、水性溶液は、等容積オスモル濃度であるか、または等張である。

本開示の方法において使用される温度は、抗原および／もしくはアジュバントの送達ならびに／または無核細胞由来の小胞におけるゴースト形成に影響を及ぼすよう調整され得る。一部の実施形態では、方法は、約－５℃～約４５℃の間で実施される。例えば、方法は、室温（例えば、約２０℃）、生理的温度（例えば、約３７℃）、生理的温度よりも高い温度（例えば、約３７℃より高い温度～４５℃またはそれより高い温度）、もしくは低下した温度（例えば、約－５℃～約４℃）、またはこれらの例示的温度の間の温度で行うことができる。

様々な方法を利用して、懸濁液におけるインプット無核細胞を駆動して狭窄を通すことができる。例えば、圧力は、入口側のポンプ（例えば、ガスボンベ、またはコンプレッサー）によって加えられ得る、真空は、出口側の真空ポンプによって加えられ得る、毛細管作用は、管を介して加えられ得る、および／またはシステムは、重力送りされ得る。置き換えベースの流れシステム（例えば、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、手動シリンジまたはピペット、ピストンなど）もまた使用することができる。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、陽圧または陰圧によって狭窄に通される。したがって、本明細書に記載の方法または無核細胞由来の小胞のいずれか１つによる一部の実施形態では、インプット無核細胞は、入口側から陽圧によって狭窄に通される。さらなる実施形態では、陽圧は、ポンプを使用して加えられる。一部の実施形態では、陽圧は、ガスボンベまたはコンプレッサーを使用して加えられる。ある特定の実施形態では、インプット無核細胞は、約１０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。ある特定の実施形態では、インプット無核細胞は、約５ｐｓｉ～約１５０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。ある特定の実施形態では、インプット無核細胞は、約５ｐｓｉ～約１０ｐｓｉ、約１０ｐｓｉ～約２０ｐｓｉ、約２０ｐｓｉ～約３０ｐｓｉ、約３０ｐｓｉ～約４０ｐｓｉ、約４０ｐｓｉ～約５０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ～約６０ｐｓｉ、約６０ｐｓｉ～約７０ｐｓｉ、約７０ｐｓｉ～約８０ｐｓｉ、約８０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉ、約９０ｐｓｉ～約１００ｐｓｉ、約１００ｐｓｉ～約１１０ｐｓｉ、約１１０ｐｓｉ～約１２０ｐｓｉ、約１２０ｐｓｉ～約１３０ｐｓｉ、約１３０ｐｓｉ～約１４０ｐｓｉ、約１４０ｐｓｉ～約１５０ｐｓｉ、または約１５０ｐｓｉ～約２００ｐｓｉのいずれか１つに及ぶ圧力下で、狭窄に通される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、不変の圧力または可変の圧力によって狭窄に通される。一部の実施形態では、圧力は、シリンジを使用して加えられる。一部の実施形態では、圧力は、ポンプを使用して加えられる。一部の実施形態では、ポンプは、蠕動ポンプまたは隔膜ポンプである。一部の実施形態では、圧力は、真空を使用して加えられる。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、重力によって狭窄に通される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、遠心力によって狭窄に通される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、毛細管圧によって狭窄に通される。一部の実施形態では、インプット無核細胞は、細胞ドライバーを使用して圧力を加えることにより、狭窄を通って移動される（例えば、押し出される）。本明細書で使用される場合、細胞ドライバーは、インプット無核細胞を駆動して狭窄に通すために、懸濁液に圧力または力を加えるデバイスまたは構成成分である。ある特定の実施形態では、細胞ドライバーは、圧力ポンプ、ガスボンベ、コンプレッサー、真空ポンプ、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、ピペット、ピストン、毛細管作用装置、ヒトの心臓、ヒトの筋肉、重力、マイクロ流体ポンプ、およびシリンジからなる群から選択される。

一部の実施形態では、流体の流れが、インプット無核細胞を狭窄に通すように導く。一部の実施形態では、流体の流れは、細胞を狭窄に通す前の撹乱流である。撹乱流は、所与の地点における速度が大きさおよび方向において不安定に変動する流体の流れである。一部の実施形態では、狭窄を通る流体の流れは、層流である。層流には、あらゆる地点での流れの方向が不変のままである、固体境界近傍の流体における途切れなく続く流れが関与する。一部の実施形態では、流体の流れは、細胞を狭窄に通した後の撹乱流である。細胞が狭窄を通過する速度は、変動され得る。一部の実施形態では、細胞は、一様な細胞スピードで狭窄を通過する。一部の実施形態では、細胞は、変動する細胞スピードで狭窄を通過する。

細胞懸濁液は、細胞の混合集団または精製集団であってもよい。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、全血などの混合細胞集団である。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、無核細胞の混合集団などの混合細胞集団である。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、無核細胞の精製集団などの精製細胞集団である。

細胞懸濁液の組成（例えば、容積オスモル濃度、塩濃度、血清含量、細胞の濃度、ｐＨなど）は、免疫応答を刺激および／または増強するための抗原および／またはアジュバントの送達に影響を及ぼし得る。一部の実施形態では、懸濁液は、全血を含む。あるいは、細胞懸濁液は、生理食塩水または血液以外の生理学的媒体における細胞の混合物である。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、水性溶液を含む。一部の実施形態では、水性溶液は、細胞培養培地、ＰＢＳ、塩、糖、増殖因子、動物由来の産物、バルキング材料、界面活性剤、潤滑剤、ビタミン、アミノ酸、タンパク質、細胞周期阻害剤、および／またはアクチン重合に影響を及ぼす薬剤を含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、ＤＭＥＭ、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）、ＩＭＤＭ、またはＲＰＭＩである。さらに、溶液緩衝剤としては、例えば、表面の目詰まりを低減もしくは排除し、インプット細胞の生存率を改善するように設計され得る１種または複数の潤滑剤（プルロニック（登録商標）または他の界面活性剤）を挙げることができる。例示的な界面活性剤としては、限定されないが、ポロクサマー、ポリソルベート、糖または糖アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、動物由来血清、およびアルブミンタンパク質が挙げられる。一部の実施形態では、水性溶液は、等容積オスモル濃度であるか、または等張である。一部の実施形態では、水性溶液は、血漿を含む。

ある種の細胞を含む一部の構成では、インプット無核細胞または無核細胞由来の小胞は、化合物の無核細胞由来の小胞内部への送達を助ける１種または複数の溶液中でインキュベートされ得る。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、未処理および未処置のインプット無核細胞と比較して、細胞骨格構造のすべてまたは本質的にすべてを保持する。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、未処理および未処置のインプット無核細胞の細胞骨格構造の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９．５％のいずれか１つを保持する。一部の実施形態では、溶液は、アクチン重合に影響を及ぼす薬剤を含む。一部の実施形態では、アクチン重合に影響を及ぼす薬剤は、ラトランクリンＡ、サイトカラシン、および／またはコルヒチンである。例えば、インプット無核細胞または無核細胞由来の小胞は、送達前に１時間、ラトランクリンＡ（０．１μｇ／ｍｌ）などの脱重合溶液中でインキュベートされ、アクチン細胞骨格を脱重合し得る。追加の例として、細胞は、送達前に２時間、１０μＭのコルヒチン（Ｓｉｇｍａ）中でインキュベートされ、微小管ネットワークを脱重合し得る。

一部の実施形態では、インプット無核細胞集団は、本開示の方法において使用する前に濃縮される。例えば、インプット無核細胞は、体液、例えば、末梢血から得られ、必要に応じて濃縮または精製され、無核細胞の濃度を上げる。細胞は、限定されないが、磁気細胞分離、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、または密度勾配遠心分離を含む、当技術分野で公知の任意の方法によって濃縮されてもよい。

細胞懸濁液の粘度は、本明細書に開示されている方法にも影響を及ぼし得る。一部の実施形態では、細胞懸濁液の粘度は、約８．９×１０^－４Ｐａ・ｓ～約４．０×１０^－３Ｐａ・ｓまたはそれらの間の任意の値もしくは値の範囲に及ぶ。一部の実施形態では、粘度は、約８．９×１０^－４Ｐａ・ｓ～約４．０×１０^－３Ｐａ・ｓ、約８．９×１０^－４Ｐａ・ｓ～約３．０×１０^－３Ｐａ・ｓ、約８．９×１０^－４Ｐａ・ｓ～約２．０×１０^－３Ｐａ・ｓ、または約８．９×１０^－３Ｐａ・ｓ～約１．０×１０^－３Ｐａ・ｓの間のいずれか１つの範囲に及ぶ。一部の実施形態では、粘度は、約０．８９ｃＰ～約４．０ｃＰ、約０．８９ｃＰ～約３．０ｃＰ、約０．８９ｃＰ～約２．０ｃＰ、または約０．８９ｃＰ～約１．０ｃＰの間のいずれか１つの範囲に及ぶ。一部の実施形態では、細胞懸濁液の粘度が剪断ひずみの条件下で低下する、ずり流動化効果が観察される。粘度は、限定されないが、粘度計、例えば、ガラス毛細管粘度計、または血流計を含む当技術分野で公知の任意の方法によって測定され得る。粘度計は、１つの流れ条件下での粘度を測定するが、血流計は、流れ条件と共に変動する粘度を測定するために使用される。一部の実施形態では、粘度は、ずり流動化溶液、例えば、血液について測定される。一部の実施形態では、粘度は、約－５℃～約４５℃の間で測定される。例えば、粘度は、室温（例えば、約２０℃）、生理的温度（例えば、約３７℃）、生理的温度よりも高い温度（例えば、約３７℃よりも高い温度～４５℃またはそれよりも高い温度）、低下した温度（例えば、約－５℃～約４℃）、またはこれらの例示的な温度の間の温度で測定される。

一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄に通す前に、ペイロードと接触させられる（例えば、最初に接触させられる）。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄を通すのと同時発生的に、ペイロードと接触させられる（例えば、最初に接触させられる）。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄を通した後に、ペイロードと接触させられる（例えば、最初に接触させられる）。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄を通すのと同時発生的におよび狭窄を通した後に、少なくともペイロードと接触させられる。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄に通す前に、狭窄を通すのと同時発生的に、および狭窄を通した後に、ペイロードと接触させられる。

一部の実施形態では、ペイロードは、治療用ペイロードである。一部の実施形態では、ペイロードは、抗原である。一部の実施形態では、ペイロードは、アジュバントである。一部の実施形態では、ペイロードは、寛容原性因子である。一部の実施形態では、ペイロードは、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、低分子、複合体（タンパク質ベースの複合体、核酸複合体、タンパク質－タンパク質複合体、核酸－核酸複合体、またはタンパク質－核酸複合体など）、またはナノ粒子である。

一部の実施形態では、細胞懸濁液は、本明細書に記載の任意の抗原などの抗原と接触させられる。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、本明細書に記載の任意の抗原から選択されるような複数の異なる種類の抗原（例えば、２、３、４、または５種の異なる種類の抗原）と接触させられる。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、本明細書に記載の任意のアジュバントなどのアジュバントと接触させられる。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、本明細書に記載の任意のアジュバントから選択されるような、複数の異なる種類のアジュバント（例えば、２、３、４、または５種の異なる種類のアジュバント）と接触させられる。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、本明細書に記載の任意の寛容原性因子などの寛容原性因子と接触させられる。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、本明細書に記載の任意の寛容原性因子から選択されるような複数の異なる種類の寛容原性因子（例えば、２、３、４、または５種の異なる種類の寛容原性因子）と接触させられる。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、抗原およびアジュバントと接触させられる。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、アジュバントおよび寛容原性因子と接触させられる。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、抗原および寛容原性因子と接触させられる。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、抗原、アジュバント、および寛容原性因子を含む。

例えば、一部の実施形態では、抗原は、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされることが可能である。一部の実施形態では、抗原は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされることが可能である。一部の実施形態では、抗原は、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされることが可能である。一部の実施形態では、抗原は、疾患関連抗原である。一部の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。一部の実施形態では、抗原は、ライセートに由来する。一部の実施形態では、ライセートは、腫瘍ライセートである。一部の実施形態では、抗原は、移植ライセートに由来する。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、または真菌抗原である。一部の実施形態では、抗原は、微生物である。一部の実施形態では、抗原は、ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原は、脂質抗原である。一部の実施形態では、抗原は、糖鎖抗原である。一部の実施形態では、抗原をコードする核酸は、細胞に送達される。一部の実施形態では、抗原は、修飾された抗原である。一部の実施形態では、修飾された抗原は、ポリペプチドに融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、標的ペプチドと融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、脂質と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、炭水化物と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、修飾された抗原は、ナノ粒子と融合された抗原を含む。一部の実施形態では、複数の抗原は、無核細胞に送達される。一部の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧＯＤＮ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、イミキモド、レシキモド、および／またはＬＰＳである。
追加の使用方法

一部の態様では、本出願は、本明細書に記載の無核細胞由来の小胞および／または組成物を使用する方法を提供する。

一部の実施形態では、それを必要とする個体における疾患または障害を処置するための方法であって、本明細書に記載の任意の無核細胞由来の小胞および／または組成物を投与するステップを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、治療用ペイロードを含む。一部の実施形態では、治療用ペイロードは、抗原、アジュバント、および寛容原性因子のうちいずれか１種または複数を含む。一部の実施形態では、組成物の無核細胞由来の小胞は、抗原、アジュバント、および寛容原性因子のうちいずれかまたは複数を含む。一部の実施形態では、組成物は、無核細胞およびアジュバントを含む。

一部の実施形態では、疾患または障害は、がん、感染性疾患、またはウイルス関連疾患である。一部の実施形態では、疾患は、酵素補充療法（ＥＲＴ）によって処置可能である；例えば、ゴーシェ病。一部の実施形態では、疾患または障害は、ゴーシェＩ型疾患、痛風、低ホスファターゼ症、ライソゾーム酸性リパーゼ欠損症、ポンペ病、ＭＰＳＩＨ（ハーラー症候群）、ＭＰＳＩＩ（ハンター症候群）、ＭＰＳＩＩＩＡ、Ｂ、ＣおよびＤ（サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）、ＭＰＳＩＶＡ、Ｂ（モルキオ症候群）、ＭＰＶＶＩ（マロトーラミー症候群）、ＭＰＳＶＩＩ（スライ症候群）、ＭＰＳＩＸ（Ｎａｔｏｗｉｃｚ症候群）、ファブリー症候群、ＰＫＵ症候群、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＭＣＡＤＤ）、セリアック病、重症筋無力症、グレーブス病、尋常性天疱瘡、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、またはＩ型糖尿病である。一部の実施形態では、がんは、頭頸部がん、子宮頸がん、子宮がん、直腸がん、陰茎がん、卵巣がん、精巣がん、骨がん、軟組織がん、皮膚がん（例えば、黒色腫）、胃がん、腸がん、結腸がん、前立腺がん、乳がん、食道がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、脳がん、または血液がんである。

一部の実施形態では、疾患または障害は、痛風であり、ペイロードは、例えば、半合成形態のウリカーゼ、例えば、ペグロチカーゼである。一部の実施形態では、疾患または障害は、ゴーシェＩ型疾患であり、ペイロードは、グルコセレブロシダーゼ、例えば、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、またはβ－グルコシダーゼである。一部の実施形態では、疾患または障害は、低ホスファターゼ症であり、ペイロードは、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）、例えば、アスホターゼアルファである。一部の実施形態では、疾患または障害は、ライソゾーム酸性リパーゼ欠損症であり、ペイロードは、ライソゾーム酸性リパーゼ、例えば、セベリパーゼアルファである。一部の実施形態では、疾患または障害は、ポンペ病であり、ペイロードは、アルファグルコシダーゼ、例えば、アルグルコシダーゼアルファである。一部の実施形態では、疾患または障害は、ＭＰＳＩＨ（ハーラー症候群）、ＩＨ／Ｓ（ハーラーシャイエ症候群）、またはＩＳ（ＭＰＳＶとしても公知のシャイエ）であり、ペイロードは、α－Ｌ－イズロニダーゼ、例えば、ラロニダーゼである。一部の実施形態では、疾患または障害は、ＭＰＳＩＩ（ハンター症候群）であり、ペイロードは、イズロン酸スルファターゼ、例えば、イズルスルファーゼである。一部の実施形態では、疾患または障害は、ＭＰＳＩＩＩＡ、Ｂ、ＣまたはＤ（サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ）であり、ペイロードは、ヘパラン硫酸である。一部の実施形態では、疾患または障害は、ＭＰＳＩＶＡ、Ｂ（モルキオ症候群）であり、ペイロードは、ケラチン硫酸またはコンドロイチン６－硫酸、例えば、エロスルファーゼアルファである。一部の実施形態では、疾患または障害は、ＭＰＶＶＩ（マロトーラミー症候群）であり、ペイロードは、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ、例えば、ガルスルファーゼである。一部の実施形態では、疾患または障害は、ＭＰＳＶＩＩ（スライ症候群）であり、ペイロードは、β－グルクロニダーゼである。一部の実施形態では、疾患または障害は、ＭＰＳＩＸ（Ｎａｔｏｗｉｃｚ症候群）であり、ペイロードは、ヒアルロニダーゼである。一部の実施形態では、疾患または障害は、ファブリー症候群であり、ペイロードは、α－ガラクトシダーゼＡ、例えば、アガルシダーゼベータである。一部の実施形態では、疾患または障害は、ＰＫＵ症候群であり、ペイロードは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼである。一部の実施形態では、疾患または障害は、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＭＣＡＤＤ）であり、ペイロードは、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼである。一部の実施形態では、疾患または障害は、セリアック病であり、ペイロードは、グリアジンである。一部の実施形態では、疾患または障害は、重症筋無力症であり、ペイロードは、アセチルコリン受容体および受容体関連タンパク質である。一部の実施形態では、疾患または障害は、グレーブス病であり、ペイロードは、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）である。一部の実施形態では、疾患または障害は、尋常性天疱瘡であり、ペイロードは、デスモグレイン１および３である。一部の実施形態では、疾患または障害は、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）であり、ペイロードは、アクアポリン４である。一部の実施形態では、疾患または障害は、Ｉ型糖尿病であり、ペイロードは、ＧＡＤＤ６５、インスリン、プロインスリン、またはプレプロインスリンである。

一部の実施形態では、ウイルス関連疾患は、ＥＢＶ関連疾患である。一部の実施形態では、ウイルス関連疾患は、ＥＢＶ関連疾患であり、抗原は、ＥＢＮＡ－１、ＥＢＮＡ－２、ＥＢＮＡ－３Ａ、ＥＢＮＡ－３Ｂ、ＥＢＮＡ－３Ｃ、ＥＢＮＡ－ＬＰ、ＬＭＰ－１、ＬＭＰ－２Ａ、ＬＭＰ－２Ｂ、およびＥＢＥＲのうち１種または複数である。一部の実施形態では、ＥＢＶ関連疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）である。一部の実施形態では、ウイルス関連疾患は、ＨＩＶ関連疾患である。一部の実施形態では、ＨＩＶ関連疾患は、日和見感染症であり、以下に限定されないが、気管支、気管、食道、または肺のカンジダ症；浸潤性子宮頸がん；コクシジオイデス症；クリプトコッカス症；慢性腸クリプトスポリジウム症、サイトメガロウイルス疾患；ＨＩＶ関連脳症；ＨＳＶ関連慢性潰瘍または気管支炎、肺臓炎または食道炎；ヒストプラスマ症；慢性腸イソスポーラ症；カポジ肉腫；リンパ腫；肺結核；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍコンプレックス（ＭＡＣ）；Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓｃａｒｉｎｉｉ肺炎（ＰＣＰ）；再発性肺炎；進行性多巣性白質脳症；再発性サルモネラ敗血症；脳のトキソプラズマ症、およびＨＩＶが原因の消耗症候群を含んでもよい。一部の実施形態では、ウイルス関連疾患は、ＨＰＶである。一部の実施形態では、ウイルス関連疾患はＨＰＶであり、抗原はＥ７への応答を誘導する。一部の実施形態では、ウイルス関連疾患はＨＰＶであり、抗原はＥ６への応答を誘導する。一部の実施形態では、ウイルス関連疾患は、ＨＢＶ関連疾患である。一部の実施形態では、ウイルス関連疾患は、ＲＳＶ関連疾患である。一部の実施形態では、ウイルス関連疾患は、ＫＳＨＶ関連疾患である。

一部の実施形態では、個体はがんを有し、ペイロードは抗原を含む。一部の実施形態では、個体はがんを有し、ペイロードは抗原およびアジュバントを含む。一部の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。

一部の実施形態では、個体は感染性疾患またはウイルス関連疾患を有し、ペイロードは抗原およびアジュバントを含む。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である。一部の実施形態では、個体は自己免疫疾患を有し、ペイロードは抗原を含む。一部の実施形態では、個体は自己免疫疾患を有し、ペイロードは抗原および寛容原性因子を含む。

一部の実施形態では、個体は感染性疾患またはウイルス関連疾患を有し、ペイロードは抗原を含む。一部の実施形態では、個体は多発性硬化症（ＭＳ）を有し、ペイロードはＥＢＶ抗原を含む。一部の実施形態では、個体はＨＩＶを有し、ペイロードは、ＨＩＶ関連疾患、例えば、日和見感染症を処置するための抗原を含む。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、個体に、別の治療剤を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、処置するための方法は、個体に、１種または複数の治療剤を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、他の治療剤は、個体に、本明細書に記載の無核細胞由来の小胞および／または組成物を投与する前に、それと同時発生的に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤、またはサイトカインのいずれか１種である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ１、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）およびＢＴＬＡのいずれか１種に標的化される。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、もしくはＩＬ－２またはその修飾形態である。一部の実施形態では、サイトカインは、寛容原性サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－Ｂ、およびＩＬ－２の寛容性誘導形態である。一部の実施形態では、治療剤は、寛容原性剤、例えば、ラパマイシンである。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、個体に、放射線療法を投与するステップをさらに含む。

一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、免疫応答を抑制する、および／または寛容性を誘導する抗原および／または寛容原性因子を含む。一部の実施形態では、抑制された免疫応答および／または誘導された寛容性は、低下した自己免疫応答を含む。例えば、低下した自己免疫応答としては、限定されないが、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、アルツハイマー病、ＡＬＳ、ハンチントン病、およびパーキンソン病などの免疫構成成分を有し得る神経変性疾患、全身性エリテマトーデス（ＳｙｓｔｅｍｉｃＬｕｐｕｓＥｒｔｈｙｒｏｍａｔｏｓｕｓ）、シェーグレン病、クローン病、または潰瘍性大腸炎に関連する抗原に対する、低下した免疫応答または誘導された寛容性を挙げることができる。一部の実施形態では、抑制された免疫応答および／または誘導された寛容性は、低下したアレルギー応答を含む。例えば、低下したアレルギー応答としては、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（枯れ草熱）、または食物アレルギーに関連する抗原に対する低下した免疫応答または誘導された寛容性を挙げることができる。一部の実施形態では、低下したアレルギー応答としては、セリアック病に関連する抗原に対する低下した免疫応答または誘導された寛容性を挙げることができる。一部の実施形態では、抗原は、移植された組織に関連する抗原である。一部の実施形態では、抑制された免疫応答および／または誘導された寛容性は、移植された組織に対する低下した免疫応答または誘導された寛容性を含む。一部の実施形態では、抗原は、ウイルスに関連する。一部の実施形態では、抑制された免疫応答および／または誘導された寛容性は、低下した病原体免疫応答またはウイルスに対する誘導された寛容性を含む。例えば、病原体免疫応答としては、ある特定のウイルス感染によって生じるサイトカインストームを挙げることができる。サイトカインストームは、サイトカインと白血球の間の正のフィードバックループからなる致命的となる可能性のある免疫反応である。

一部の実施形態では、抑制された免疫応答は、治療剤に対する低下した免疫応答を含む。一部の実施形態では、治療剤は、凝固因子である。例示的な凝固因子としては、限定されないが、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子が挙げられる。一部の実施形態では、治療剤は、抗体である。例示的な治療抗体としては、限定されないが、抗ＴＮＦα、抗ＶＥＧＦ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２０、抗ＩＬ－２Ｒ、抗Ｈｅｒ２、抗ＲＳＶＦ、抗ＣＥＡ、抗ＩＬ－１β、抗ＣＤ１５、抗ミオシン、抗ＰＳＭＡ、抗４０ｋＤａ糖タンパク質、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ５２、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１ａ、抗ＥＧＦＲ、抗Ｃ５、抗α－４インテグリン、抗ＩＬ－１２／ＩＬ－２３、抗ＩＬ－６Ｒ、および抗ＲＡＮＫＬが挙げられる。一部の実施形態では、治療剤は、増殖因子である。例示的な治療用増殖因子としては、限定されないが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）および巨核球の分化と増殖因子（ＭＤＧＦ）が挙げられる。一部の実施形態では、治療剤は、ホルモンである。例示的な治療用ホルモンとしては、限定されないが、インスリン、ヒト成長ホルモン、および卵胞刺激ホルモンが挙げられる。一部の実施形態では、治療剤は、組換えサイトカインである。例示的な治療用組換えサイトカインとしては、限定されないが、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）が挙げられる。

一部の実施形態では、抑制された免疫応答は、治療用ビヒクルに対する低下した免疫応答を含む。一部の実施形態では、治療用ビヒクルは、ウイルス、例えば、遺伝子療法に使用されるアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、またはレトロウイルスである。一部の実施形態では、治療用ビヒクルは、リポソームである。一部の実施形態では、治療用ビヒクルは、ナノ粒子である。一部の実施形態では、抑制された免疫応答は、ウイルスキャプシド；例えば、ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３キャプシドタンパク質）に対する低下した免疫応答を含む。一部の実施形態では、ウイルス治療用ビヒクルに対する低下した免疫応答は、ウイルスのいずれかの血清型；例えば、以下に限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ８、またはＡＡＶｒｈ１０を対象とする。一部の実施形態では、例えば、ウイルスキャプシドに対する低下した免疫応答は、より高い初期投薬量、繰り返し投与、より長い半減期、およびより長い発現のうち１種または複数、例えば、ＡＡＶ治療用ビヒクルの繰り返し投与を可能にする。

一部の実施形態では、抑制された免疫応答は、治療用ビヒクル（例えば、遺伝子療法ビヒクル）によって発現される導入遺伝子産物に対する低下した免疫応答を含む。一部の実施形態では、抑制された免疫応答は、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターによって発現された導入遺伝子産物に対する低下した免疫応答を含む。

一部の実施形態では、処置するための方法は、個体に、本明細書に記載の無核細胞由来の小胞および／または組成物の１回または複数の用量、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の用量のいずれかを投与するステップを含む。一部の実施形態では、処置するための方法は、個体に、本明細書に記載の無核細胞由来の小胞および／または組成物の、１年当たり最大１２回の用量、例えば、１年当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回の用量のいずれかを投与するステップを含む。一部の実施形態では、２回またはそれより多い用量は、均一または不均一な間隔で、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、または２週間のいずれかの間隔を空けてなど、処置経過にわたって投与される。一部の実施形態では、２回またはそれより多い用量は、処置経過にわたって投与され、ここで、１回目の用量と２回目の用量の間の間隔は、約１週間～約１年、例えば、約２週間～約１カ月、約２週間～約３カ月、約２週間～約４カ月、約２週間～約６カ月、約２週間～約９カ月、または約２週間～約１２カ月のいずれかである。

一部の実施形態では、それを必要とする個体における疾患または障害を予防するための方法であって、個体に、本明細書に記載の無核細胞由来の小胞および／または組成物のいずれかを投与するステップを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、無核細胞由来の小胞は、抗原を含む。一部の実施形態では、個体はがんを有し、ペイロードはアジュバントを含む。一部の実施形態では、個体はがんを有し、ペイロードは抗原およびアジュバントを含む。一部の実施形態では、疾患または障害はがんであり、抗原は腫瘍抗原である。一部の実施形態では、個体は感染性疾患を有し、ペイロードは抗原を含む。一部の実施形態では、個体は感染性疾患を有し、ペイロードは抗原およびアジュバントを含む。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である。
システムおよびキット

一部の態様では、本発明は、本明細書に開示されている方法において使用するための狭窄、細胞懸濁液、および化合物を含むシステムを提供する。このシステムは、細胞を変形させる狭窄、細胞懸濁液、細胞の撹乱、送達パラメーター、化合物、および／または適用などをもたらす、マイクロ流体チャネルまたはポアを有する表面を含む、上記に開示されている方法について記載された任意の実施形態を含み得る。一部の実施形態では、細胞を変形させる狭窄は、抗原および／またはアジュバントをインプット無核細胞に送達するためのサイズにされる。一部の実施形態では、作動流スピード、細胞の濃度、抗原および／またはアジュバントの濃度、狭窄中での細胞の速度、および細胞懸濁液の組成などの送達パラメーター（例えば、容積オスモル濃度、塩濃度、血清含量、細胞の濃度、ｐＨなど）は、抗原および／またはアジュバントに対する免疫応答の刺激または増強の最大化のために最適化される。

免疫応答を刺激または増強するために、抗原および／またはアジュバントを無核細胞由来の小胞に送達する際に使用するためのキットまたは製品も提供される。一部の実施形態では、キットは、好適なパッケージング中に、本明細書に記載の組成物（例えば、マイクロ流体チャネルまたはポアを含有する表面、細胞懸濁液、および／または化合物）を含む。好適なパッケージング材料は、当技術分野で公知であり、例えば、バイアル（密封されたバイアルなど）、容器、アンプル、ボトル、ジャー、可撓性のパッケージング（例えば、密封されたマイラーバッグまたはプラスチックバッグ）などを含む。これらの製品は、さらに、滅菌および／または密封されてもよい。

本開示は、本明細書に記載の方法の構成成分を含むキットも提供し、免疫応答を刺激または増強するために、前記方法を実施するための使用説明書をさらに含んでもよい。本明細書に記載のキットは、他の緩衝剤、希釈液、フィルター、ニードル、シリンジ、および本明細書に記載の任意の方法を実施するための使用説明書、例えば、免疫応答を刺激または増強するための使用説明書を含む添付文書を含む他の材料をさらに含んでもよい。
例示的な実施形態

実施形態１．抗原を無核細胞由来の小胞内に送達するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートするステップとを含む方法。

実施形態２．インプット無核細胞が、アジュバントをさらに含む、実施形態１に記載の方法。

実施形態３．アジュバントを無核細胞由来の小胞内に送達するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、アジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）アジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をアジュバントと共にインキュベートするステップとを含む方法。

実施形態４．インプット無核細胞が、抗原をさらに含む、実施形態３に記載の方法。

実施形態５．抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞内に送達するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートするステップとを含む方法。

実施形態６．個体における抗原に対する免疫応答を刺激するための方法であって、方法が、個体に、抗原を含む無核細胞由来の小胞を有効量投与するステップを含み、抗原を含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法。

実施形態７．アジュバントを個体に全身投与するステップをさらに含む、実施形態６に記載の方法。

実施形態８．アジュバントが、無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に、全身投与される、実施形態７に記載の方法。

実施形態９．インプット無核細胞が、アジュバントを含む、実施形態６～８のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１０．個体における抗原に対する免疫応答を刺激するための方法であって、方法が、個体に、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を有効量投与するステップを含み、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法。

実施形態１１．アジュバントを個体に全身投与するステップをさらに含む、実施形態１０に記載の方法。

実施形態１２．アジュバントが、無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に、全身投与される、実施形態１１に記載の方法。

実施形態１３．個体における疾患を処置するための方法であって、方法が、個体に、疾患関連抗原を含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原に対する免疫応答が、疾患の状態を軽快させ、疾患関連抗原を含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法。

実施形態１４．個体における疾患を予防するための方法であって、方法が、個体に、疾患関連抗原を含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原に対する免疫応答が、疾患の発症を予防し、疾患関連抗原を含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法。

実施形態１５．抗原に対して個体にワクチン接種するための方法であって、方法が、個体に、抗原を含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原を含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法。

実施形態１６．アジュバントを個体に全身投与するステップをさらに含む、実施形態１３～１５のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１７．アジュバントが、無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に、全身投与される、実施形態１６に記載の方法。

実施形態１８．インプット無核細胞が、アジュバントを含む、実施形態１３～１７に記載の方法。

実施形態１９．個体における疾患を処置するための方法であって、方法が、個体に、疾患関連抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原に対する免疫応答が、疾患の状態を軽快させ、疾患関連抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法。

実施形態２０．個体における疾患を予防するための方法であって、方法が、個体に、疾患関連抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原に対する免疫応答が、疾患の発症を予防し、疾患関連抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法。

実施形態２１．抗原に対して個体にワクチン接種するための方法であって、方法が、個体に、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートするステップとを含むプロセスによって調製される、方法。

実施形態２２．個体における疾患を処置するための方法であって、疾患関連抗原に対する免疫応答が、疾患の状態を軽快させ、方法が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）抗原を含む無核細胞由来の小胞を個体に投与するステップとを含む、方法。

実施形態２３．個体における疾患を予防するための方法であって、疾患関連抗原に対する免疫応答が、疾患の発症を予防し、方法が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）抗原を含む無核細胞由来の小胞を個体に投与するステップとを含む、方法。

実施形態２４．抗原に対して個体にワクチン接種するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）抗原を含む無核細胞由来の小胞を個体に投与するステップとを含む方法。

実施形態２５．小胞外アジュバントを個体に全身投与するステップをさらに含む、実施形態１９～２４のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態２６．小胞外アジュバントが、無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に投与される、実施形態２５に記載の方法。

実施形態２７．インプット無核細胞が、アジュバントを含む、実施形態１９～２４に記載の方法。

実施形態２８．個体における疾患を処置するための方法であって、疾患関連抗原に対する免疫応答が、疾患の状態を軽快させ、方法が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、疾患関連抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を、個体に投与するステップを含む、方法。

実施形態２９．個体における疾患を予防するための方法であって、疾患関連抗原に対する免疫応答が、疾患の発症を予防し、方法が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を、個体に投与するステップを含む、方法。

実施形態３０．抗原に対して個体にワクチン接種するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、ｃ）抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を、個体に投与するステップを含む方法。

実施形態３１．小胞外アジュバントを個体に全身投与するステップをさらに含む、実施形態２８～３０のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態３２．小胞外アジュバントが、無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に投与される、実施形態３１に記載の方法。

実施形態３３．疾患が、がん、感染性疾患またはウイルス関連疾患である、実施形態１３～３２のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態３４．無核細胞由来の小胞が、個体にとって自家である、実施形態６～３３のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態３５．無核細胞由来の小胞が、個体にとって同種異系である、実施形態６～３３のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態３６．無核細胞由来の小胞が、医薬製剤中に存在する、実施形態６～３５のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態３７．無核細胞由来の小胞が、全身投与される、実施形態６～３６のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態３８．無核細胞由来の小胞が、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内または腹腔内投与される、実施形態６～３７のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態３９．無核細胞由来の小胞が、治療剤と組み合わせて、個体に投与される、実施形態６～３８のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態４０．治療剤が、無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に投与される、実施形態３９に記載の方法。

実施形態４１．治療剤が、免疫チェックポイント阻害剤および／またはサイトカインである、実施形態３９または４０に記載の方法。

実施形態４２．サイトカインが、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２またはＩＬ－１５のうち１種または複数である、実施形態４１に記載の方法。

実施形態４３．免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ１、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）およびＢＴＬＡのうちいずれか１種に標的化される、実施形態４１に記載の方法。

実施形態４４．抗原が、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされ得る、実施形態１、２または４～４３のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態４５．抗原が、ＣＤ－１拘束性抗原である、実施形態１、２または４～４３のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態４６．抗原が、疾患関連抗原である、実施形態１、２または４～４５のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態４７．抗原が、腫瘍抗原である、実施形態１、２または４～４６のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態４８．抗原が、ライセートに由来する、実施形態１、２または４～４７のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態４９．ライセートが、腫瘍ライセートである、実施形態４８に記載の方法。

実施形態５０．抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である、実施形態１、２または４～４６のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態５１．抗原が、微生物である、実施形態１、２または４～４６のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態５２．抗原が、ポリペプチドである、実施形態１、２または４～５０のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態５３．抗原が、脂質抗原である、実施形態１、２または４～５０のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態５４．抗原が、糖鎖抗原である、実施形態１、２または４～５０のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態５５．抗原が、修飾された抗原である、実施形態１、２または４～５４のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態５６．修飾された抗原が、ポリペプチドと融合された抗原を含む、実施形態５５に記載の方法。

実施形態５７．修飾された抗原が、標的化ペプチドと融合された抗原を含む、実施形態５６に記載の方法。

実施形態５８．修飾された抗原が、脂質と融合された抗原を含む、実施形態５５に記載の方法。

実施形態５９．修飾された抗原が、炭水化物と融合された抗原を含む、実施形態５５に記載の方法。

実施形態６０．修飾された抗原が、ナノ粒子と融合された抗原を含む、実施形態５５に記載の方法。

実施形態６１．複数の抗原が、無核細胞由来の小胞に送達される、実施形態１～６０のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態６２．アジュバントが、ＣｐＧＯＤＮ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、ポリリシンおよびカルボキシメチルセルロースにより安定化されたポリイノシン・ポリシチジル酸（ＨＩＬＴＯＮＯＬ（登録商標））、イミキモド、レシキモド、ならびに／またはリポ多糖（ＬＰＳ）である、実施形態２～５、７～１２、１６～２１、２５～６１のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態６３．アジュバントが、低分子量ポリＩ：Ｃである、実施形態６２に記載の方法。

実施形態６４．インプット無核細胞が、赤血球細胞である、実施形態１～６３のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態６５．赤血球細胞が、赤血球である、実施形態１～６３のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態６６．赤血球細胞が、網状赤血球である、実施形態１～６３のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態６７．インプット無核細胞が、血小板である、実施形態１～６３のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態６８．インプット無核細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態１～６７のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態６９．インプット無核細胞が、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタまたはウサギ細胞である、実施形態１～６８のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態７０．インプット無核細胞が、ヒト細胞である、実施形態１～６８のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態７１．狭窄が、マイクロ流体チャネル内に含有される、実施形態１～７０のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態７２．マイクロ流体チャネルが、複数の狭窄を含む、実施形態７１に記載の方法。

実施形態７３．複数の狭窄が、直列におよび／または並列に配置されている、実施形態７２に記載の方法。

実施形態７４．狭窄が、複数の微小な支柱の間；アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間；または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する、実施形態１～７３のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態７５．狭窄が、ポアである、またはポア内に含有される、実施形態１～７０のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態７６．ポアが、表面に含有される、実施形態７５に記載の方法。

実施形態７７．表面が、フィルターである、実施形態７６に記載の方法。

実施形態７８．表面が、膜である、実施形態７６に記載の方法。

実施形態７９．狭窄サイズが、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数である、実施形態１～７６のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態８０．狭窄サイズが、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である、実施形態１～７９のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態８１．狭窄が、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する、実施形態１～７９のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態８２．狭窄が、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの幅を有する、実施形態１～７９のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態８３．狭窄が、約２．２μｍの幅を有する、実施形態１～７９のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態８４．インプット無核細胞が、約１０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される、実施形態１～８３のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態８５．前記細胞懸濁液が、狭窄に通す前に、それと同時発生的にまたはその後に、抗原と接触させられる、実施形態１～８４のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態８６．抗原を含む無核細胞由来の小胞であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製される、無核細胞由来の小胞。

実施形態８７．インプット無核細胞が、アジュバントを含む、実施形態８６に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態８８．アジュバントを含む無核細胞由来の小胞であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、アジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）アジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をアジュバントと共にインキュベートし、これにより、アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製される、無核細胞由来の小胞。

実施形態８９．インプット無核細胞が、抗原を含む、実施形態８８に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態９０．抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製される、無核細胞由来の小胞。

実施形態９１．赤血球細胞由来の小胞または血小板由来の小胞である、実施形態８６～９０のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態９２．赤血球細胞由来の小胞が、赤血球由来の小胞または網状赤血球由来の小胞である、実施形態９１に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態９３．抗原が、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされ得る、実施形態８６、８７または８９～９２のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態９４．抗原が、ＣＤ－１拘束性抗原である、実施形態８６、８７または８９～９２のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態９５．抗原が、疾患関連抗原である、実施形態８６、８７または８９～９４のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態９６．抗原が、腫瘍抗原である、実施形態８６、８７または８９～９５のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態９７．抗原が、ライセートに由来する、実施形態８６、８７または８９～９６のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態９８．ライセートが、腫瘍ライセートである、実施形態９７に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態９９．抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である、実施形態８６、８７または８９～９５のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１００．抗原が、微生物である、実施形態８６、８７または８９～９５のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１０１．抗原が、ポリペプチドである、実施形態８６、８７または８９～９９のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１０２．抗原が、脂質抗原である、実施形態８６、８７または８９～９９のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１０３．抗原が、糖鎖抗原である、実施形態８６、８７または８９～９９のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１０４．抗原が、修飾された抗原である、実施形態８６、８７または８９～１０３のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１０５．修飾された抗原が、ポリペプチドと融合された抗原を含む、実施形態１０４に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１０６．修飾された抗原が、標的化ペプチドと融合された抗原を含む、実施形態１０５に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１０７．修飾された抗原が、脂質と融合された抗原を含む、実施形態１０４に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１０８．修飾された抗原が、炭水化物と融合された抗原を含む、実施形態１０４に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１０９．修飾された抗原が、ナノ粒子と融合された抗原を含む、実施形態１０４に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１１０．複数の抗原が、無核細胞由来の小胞に送達される、実施形態８６、８７または８９～１０９のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１１１．アジュバントが、ＣｐＧＯＤＮ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、ポリリシンおよびカルボキシメチルセルロースにより安定化されたポリイノシン・ポリシチジル酸（ＨＩＬＴＯＮＯＬ（登録商標））、イミキモド、レシキモド、ならびに／またはＬＰＳである、実施形態８７～１１０のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１１２．アジュバントが、低分子量ポリＩ：Ｃである、実施形態１１１に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１１３．インプット無核細胞が、赤血球細胞である、実施形態８６～１１２のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１１４．インプット無核細胞が、赤血球である、実施形態８６～１１２のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１１５．インプット無核細胞が、網状赤血球である、実施形態８６～１１２のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１１６．インプット無核細胞が、血小板である、実施形態８６～１１２のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１１７．インプット無核細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態８６～１１６のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１１８．インプット無核細胞が、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタまたはウサギ細胞である、実施形態８６～１１７のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１１９．インプット無核細胞が、ヒト細胞である、実施形態８６～１１７のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１２０．哺乳動物への投与後の無核細胞由来の小胞の半減期が、哺乳動物への投与後のインプット無核細胞の半減期と比較して減少している、実施形態８６～１１９のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１２１．無核細胞由来の小胞のヘモグロビン含量が、インプット無核細胞のヘモグロビン含量と比較して減少している、実施形態８６～１１５または１１７～１２０のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１２２．無核細胞由来の小胞のＡＴＰ産生が、インプット無核細胞のＡＴＰ産生と比較して減少している、実施形態８６～１２０のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１２３．次の特性：（ａ）インプット無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期；（ｂ）インプット無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベル；（ｃ）球状の形態；（ｄ）インプット無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベル；（ｅ）インプット無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生のうち１種または複数を示す、実施形態１１３、１１４、１１７～１２２のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１２４．インプット無核細胞が、赤血球であり、無核細胞由来の小胞が、インプット無核細胞と比較して低減された両凹形状を有する、実施形態１１３、１１４、１１７～１２２のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１２５．赤血球細胞ゴーストである、実施形態１１３、１１４、１１７～１２２に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１２６．プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞が、インプット無核細胞と比較して、その表面に約１．５倍をより多くえて多いホスファチジルセリンを有する、実施形態８６～１２５のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１２７．プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞の集団プロファイルが、インプット無核細胞と比較して、表面におけるより高い平均ホスファチジルセリンレベルを示す、実施形態８６～１２６のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１２８．プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞の集団プロファイルの少なくとも５０％が、インプット無核細胞と比較して、表面におけるより高いホスファチジルセリンレベルを示す、実施形態８６～１２７のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１２９．インプット無核細胞と比較して、組織または細胞における増強された取込みを示す、実施形態８６～１２８のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１３０．インプット無核細胞の取込みと比較して、肝臓および／もしくは脾臓におけるまたは貪食細胞および／もしくは抗原提示細胞による増強された取込みを示す、実施形態１２９に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１３１．修飾されていない無核細胞由来の小胞と比較して、組織または細胞における取込みを増強するように修飾されている、実施形態８６～１３０のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１３２．インプット無核細胞の取込みと比較して、肝臓および／もしくは脾臓におけるまたは貪食細胞および／もしくは抗原提示細胞による取込みを増強するように修飾されている、実施形態１３１に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１３３．その表面にＣＤ４７を含む、実施形態８６～１３２のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１３４．無核細胞由来の小胞の調製中に、（ａ）熱処理されていない、（ｂ）化学的に処置されていない、および／または（ｃ）低浸透圧性もしくは高浸透圧性条件に付されていない、実施形態８６～１３３のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１３５．細胞懸濁液の容積オスモル濃度が、プロセスを通して維持される、実施形態８６～１３４のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１３６．細胞懸濁液の容積オスモル濃度が、プロセスを通して２００ｍＯｓｍ～４００ｍＯｓｍの間に維持される、実施形態８６～１３５に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１３７．狭窄が、マイクロ流体チャネル内に含有される、実施形態８６～１３６のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１３８．マイクロ流体チャネルが、複数の狭窄を含む、実施形態１３７に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１３９．複数の狭窄が、直列におよび／または並列に配置されている、実施形態１３８に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１４０．狭窄が、複数の微小な支柱の間；アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間；または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する、実施形態８６～１３９のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１４１．狭窄が、ポアである、またはポア内に含有される、実施形態８６～１３６のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１４２．ポアが、表面に含有される、実施形態１４１に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１４３．表面が、フィルターである、実施形態１４２に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１４４．表面が、膜である、実施形態１４２に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１４５．狭窄サイズが、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数である、実施形態８６～１４４のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１４６．狭窄サイズが、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である、実施形態８６～１４４のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１４７．狭窄が、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する、実施形態８６～１４６のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１４８．狭窄が、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの幅を有する、実施形態８６～１４７のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１４９．狭窄が、約２．２μｍの幅を有する、実施形態８６～１４７のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１５０．インプット無核細胞が、約１０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される、実施形態８６～１４９のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１５１．前記細胞懸濁液が、狭窄に通す前に、それと同時発生的にまたはその後に、抗原と接触させられる、実施形態８６～１５０のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１５２．実施形態８６～１５１のいずれか一実施形態に記載の複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物。

実施形態１５３．薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、実施形態１５２に記載の組成物。

実施形態１５４．抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含む方法。

実施形態１５５．インプット無核細胞が、アジュバントを含む、実施形態１５４に記載の方法。

実施形態１５６．アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、アジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）アジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をアジュバントと共にインキュベートし、これにより、アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含む方法。

実施形態１５７．インプット無核細胞が、抗原を含む、実施形態１５６に記載の方法。

実施形態１５８．抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含む方法。

実施形態１５９．無核細胞由来の小胞が、赤血球細胞由来の小胞または血小板由来の小胞である、実施形態１５４～１５８のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１６０．赤血球細胞由来の小胞が、赤血球由来の小胞または網状赤血球由来の小胞である、実施形態１５９に記載の方法。

実施形態１６１．抗原が、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされ得る、実施形態１５４、１５５または１５７～１６０のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１６２．抗原が、ＣＤ－１拘束性抗原である、実施形態１５４、１５５または１５７～１６０のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１６３．抗原が、疾患関連抗原である、実施形態１５４、１５５または１５７～１６２のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１６４．抗原が、腫瘍抗原である、実施形態１５４、１５５または１５７～１６３のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１６５．抗原が、ライセートに由来する、実施形態１５４、１５５または１５７～１６４のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１６６．ライセートが、腫瘍ライセートである、実施形態１６５に記載の方法。

実施形態１６７．抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である、実施形態１５４、１５５または１５７～１６３のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１６８．抗原が、微生物である、実施形態１５４、１５５または１５７～１６３のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１６９．抗原が、ポリペプチドである、実施形態１５４、１５５または１５７～１６７のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１７０．抗原が、脂質抗原である、実施形態１５４、１５５または１５７～１６７のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１７１．抗原が、糖鎖抗原である、実施形態１５４、１５５または１５７～１６７のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１７２．抗原が、修飾された抗原である、実施形態１５４、１５５または１５７～１７１のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１７３．修飾された抗原が、ポリペプチドと融合された抗原を含む、実施形態１７２に記載の方法。

実施形態１７４．修飾された抗原が、標的化ペプチドと融合された抗原を含む、実施形態１７３に記載の方法。

実施形態１７５．修飾された抗原が、脂質と融合された抗原を含む、実施形態１７４に記載の方法。

実施形態１７６．修飾された抗原が、炭水化物と融合された抗原を含む、実施形態１７５に記載の方法。

実施形態１７７．修飾された抗原が、ナノ粒子と融合された抗原を含む、実施形態１７６に記載の方法。

実施形態１７８．複数の抗原が、無核細胞由来の小胞に送達される、実施形態１５４、１５５または１５７～１７７のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１７９．アジュバントが、ＣｐＧＯＤＮ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、ポリリシンおよびカルボキシメチルセルロースにより安定化されたポリイノシン・ポリシチジル酸（ＨＩＬＴＯＮＯＬ（登録商標））、イミキモド、レシキモド、ならびに／またはＬＰＳである、実施形態１５５～１７８のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１８０．アジュバントが、低分子量ポリＩ：Ｃである、実施形態１７９に記載の方法。

実施形態１８１．インプット無核細胞が、赤血球細胞である、実施形態１５４～１８０のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１８２．インプット無核細胞が、赤血球である、実施形態１５４～１８１のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１８３．インプット無核細胞が、網状赤血球である、実施形態１５４～１８１のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１８４．インプット無核細胞が、血小板である、実施形態１５４～１８０のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１８５．インプット無核細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態１５４～１８４のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１８６．インプット無核細胞が、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタまたはウサギ細胞である、実施形態１５４～１８５のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１８７．インプット無核細胞が、ヒト細胞である、実施形態１５４～１８５のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１８８．哺乳動物への投与後の無核細胞由来の小胞の半減期が、哺乳動物への投与後のインプット無核細胞の半減期と比較して減少している、実施形態１５４～１８７のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１８９．無核細胞由来の小胞のヘモグロビン含量が、インプット無核細胞のヘモグロビン含量と比較して減少している、実施形態１８１～１８３または１８５～１８８のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１９０．無核細胞由来の小胞のＡＴＰ産生が、インプット無核細胞のＡＴＰ産生と比較して減少している、実施形態１８１～１８９のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１９１．無核細胞由来の小胞が、次の特性：（ａ）インプット無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期；（ｂ）インプット無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベル；（ｃ）球状の形態；（ｄ）インプット無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベル；（ｅ）インプット無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生のうち１種または複数を示す、実施形態１８１～１８２または１８５～１９０のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１９２．インプット無核細胞が、赤血球であり、無核細胞由来の小胞が、インプット無核細胞と比較して低減された両凹形状を有する、実施形態１８１～１８２または１８５～１９１のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１９３．無核細胞由来の小胞が、赤血球細胞ゴーストである、実施形態１８１～１８２または１８５～１９２に記載の方法。

実施形態１９４．プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞が、インプット無核細胞と比較して、その表面に約１．５倍をより多くえて多いホスファチジルセリンを有する、実施形態１５４～１９３のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態１９５．プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞の集団プロファイルが、インプット無核細胞と比較して、表面におけるより高い平均ホスファチジルセリンレベルを示す、実施形態１５４～１９４のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１９６．プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞の集団プロファイルの少なくとも５０％が、インプット無核細胞と比較して、表面におけるより高いホスファチジルセリンレベルを示す、実施形態１５４～１９５のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１９７．インプット無核細胞と比較して、組織または細胞における増強された取込みを示す、実施形態１５４～１９６のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１９８．インプット無核細胞の取込みと比較して、肝臓および／もしくは脾臓におけるまたは貪食細胞および／もしくは抗原提示細胞による増強された取込みを示す、実施形態１９７に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態１９９．インプット無核細胞と比較して、組織または細胞における取込みを増強するように修飾されている、実施形態１５４～１９８のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態２００．インプット無核細胞の取込みと比較して、肝臓および／もしくは脾臓におけるまたは貪食細胞および／もしくは抗原提示細胞による取込みを増強するように修飾されている、実施形態１９９に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態２０１．その表面にＣＤ４７を含む、実施形態１５４～２００のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態２０２．無核細胞由来の小胞が、無核細胞由来の小胞の調製中に、（ａ）熱処理されていない、（ｂ）化学的に処置されていない、および／または（ｃ）低浸透圧性もしくは高浸透圧性条件に付されていない、実施形態１５４～２０１のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態２０３．細胞懸濁液の容積オスモル濃度が、プロセスを通して維持される、実施形態１５４～２０２のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態２０４．細胞懸濁液の容積オスモル濃度が、プロセスを通して約２００ｍＯｓｍ～約４００ｍＯｓｍの間に維持される、実施形態１５４～２０３に記載の方法。

実施形態２０５．狭窄が、マイクロ流体チャネル内に含有される、実施形態１５４～２０４のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態２０６．マイクロ流体チャネルが、複数の狭窄を含む、実施形態２０５に記載の方法。

実施形態２０７．複数の狭窄が、直列におよび／または並列に配置されている、実施形態２０６に記載の方法。

実施形態２０８．狭窄が、複数の微小な支柱の間；アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間；または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する、実施形態１５４～２０７のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態２０９．狭窄が、ポアである、またはポア内に含有される、実施形態１５４～２０８のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態２１０．ポアが、表面に含有される、実施形態２０９に記載の方法。

実施形態２１１．表面が、フィルターである、実施形態２１０に記載の方法。

実施形態２１２．表面が、膜である、実施形態２１０に記載の方法。

実施形態２１３．狭窄サイズが、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の関数である、実施形態１５４～２１２のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態２１４．狭窄サイズが、懸濁液におけるインプット無核細胞の直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である、実施形態１５４～２１３のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態２１５．狭窄が、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する、実施形態１５４～２１４のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態２１６．狭窄が、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの幅を有する、実施形態１５４～２１５のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態２１７．狭窄が、約２．２μｍの幅を有する、実施形態１５４～２１５のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態２１８．インプット無核細胞が、約１０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される、実施形態１５４～２１７のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態２１９．前記細胞懸濁液が、狭窄に通す前に、それと同時発生的にまたはその後に、抗原と接触させられる、実施形態１５４～２１８のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態２２０．実施形態１５４～２１９のいずれか一実施形態に記載の方法によって調製された無核細胞由来の小胞の集団を含む組成物。

実施形態３０１．親無核細胞から調製された無核細胞由来の小胞であって、次の特性：（ａ）親無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期、（ｂ）親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベル、（ｃ）球状の形態、（ｄ）親無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベル、または（ｅ）親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生のうち１種または複数を有する無核細胞由来の小胞。

実施形態３０２．親無核細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態３０１に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３０３．親無核細胞が、ヒト細胞である、実施形態３０１または３０２に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３０４．親無核細胞が、赤血球細胞または血小板である、実施形態３０１～３０３のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３０５．赤血球細胞が、赤血球または網状赤血球である、実施形態３０４に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３０６．哺乳動物における無核細胞由来の小胞の循環半減期が、親無核細胞と比較して減少している、実施形態３０１～３０５のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３０７．哺乳動物における循環半減期が、親無核細胞と比較して、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％をより多くえて減少している、実施形態３０６に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３０８．親無核細胞が、ヒト細胞であり、無核細胞由来の小胞の循環半減期が、約１分間、約２分間、約５分間、約１０分間、約１５分間、約３０分間、約１時間、約６時間、約１２時間、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約１０日間、約２５日間、約５０日間、約７５日間、約１００日間、約１２０日間未満である、実施形態３０７に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３０９．親無核細胞が、赤血球細胞であり、無核細胞由来の小胞におけるヘモグロビンレベルが、親無核細胞と比較して減少している、実施形態３０１～３０８のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３１０．無核細胞由来の小胞におけるヘモグロビンレベルが、親無核細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９９％または約１００％減少している、実施形態３０９に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３１１．無核細胞由来の小胞におけるヘモグロビンレベルが、親無核細胞におけるヘモグロビンのレベルの約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％である、実施形態３０９に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３１２．親無核細胞が、赤血球であり、無核細胞由来の小胞が、球状の形態である、実施形態３０１～３１１のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３１３．親無核細胞が、赤血球であり、無核細胞由来の小胞が、親無核細胞と比較して低減された両凹形状を有する、実施形態３０１～３１１のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３１４．親無核細胞が、赤血球細胞または赤血球であり、無核細胞由来の小胞が、赤血球細胞ゴースト（ＲＢＣゴースト）である、実施形態３０１～３１１のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３１５．親無核細胞と比較して、増加した表面ホスファチジルセリンレベルを有する、実施形態３０１～３１２のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３１６．プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞が、その表面に、親無核細胞と比較して約１．５倍をより多くえて多いホスファチジルセリンを有する、実施形態３１５に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３１７．親無核細胞と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９９％、約１００％または約１００％より多く多いホスファチジルセリンをその表面に有する、実施形態３１５に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３１８．親無核細胞と比較して、低減されたＡＴＰ産生を有する、実施形態３０１～３１７のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３１９．親無核細胞によって産生されるＡＴＰのレベルの約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％未満でＡＴＰを産生する、実施形態３１８に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３２０．ＡＴＰを産生しない、実施形態３１９に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３２１．親無核細胞と比較して、組織または細胞における取込みを増強するように修飾されている、実施形態３０１～２０のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３２２．親無核細胞の取込みと比較して、肝臓もしくは脾臓におけるまたは貪食細胞もしくは抗原提示細胞による取込みを増強するように修飾されている、実施形態３２１に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３２３．その表面にＣＤ４７を含む、実施形態３０１～３２０のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３２４．親無核細胞が、無核細胞由来の小胞の調製中に、（ａ）熱処理されなかった、（ｂ）化学的に処置されなかった、および／または（ｃ）低浸透圧性もしくは高浸透圧性条件に付されなかった、実施形態３０１～３１９のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３２５．容積オスモル濃度が、親無核細胞からの無核細胞由来の小胞の調製中に維持された、実施形態３０１～３２４のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３２６．容積オスモル濃度が、約２００ｍＯｓｍ～約６００ｍＯｓｍの間に維持された、実施形態３２５に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３２７．容積オスモル濃度が、約２００ｍＯｓｍ～約４００ｍＯｓｍの間に維持された、実施形態３２５または３２６に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３２８．インプット親無核細胞を含む懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、ペイロードの通過に十分なほど大きい無核細胞の撹乱を引き起こし、これにより、無核細胞由来の小胞を生成するステップを含むプロセスによって調製された、実施形態３０１～３２７のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３２９．ペイロードを含む、実施形態３０１～３２８のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３３０．ペイロードが、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、小分子、複合体、ナノ粒子である、実施形態３２９に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３３１．（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、ペイロードの通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）ペイロードを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をペイロードと共にインキュベートし、これにより、ペイロードを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された、実施形態３２９に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３３２．抗原を含む、実施形態３０１～３３１のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３３３．アジュバントを含む、実施形態３０１～３３２のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３３４．抗原および／または免疫寛容原性因子を含む、実施形態３０１～３３２のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３３５．（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された、実施形態３３２に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３３６．（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、アジュバントの通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）アジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をアジュバントと共にインキュベートし、これにより、アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された、実施形態３３３に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３３７．抗原およびアジュバントを含み、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された、実施形態３３３に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３３８．抗原および免疫寛容原性因子を含み、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原および免疫寛容原性因子の通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）抗原および免疫寛容原性因子を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原および免疫寛容原性因子と共にインキュベートし、これにより、抗原および免疫寛容原性因子を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された、実施形態３３４に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３３９．狭窄が、マイクロ流体チャネル内に含有される、実施形態３２８～３３８のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３４０．マイクロ流体チャネルが、複数の狭窄を含む、実施形態３３９に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３４１．複数の狭窄が、直列におよび／または並列に配置されている、実施形態３４０に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３４２．狭窄が、複数の微小な支柱の間；アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間；または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する、実施形態３２８～３４１のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３４３．狭窄が、ポアである、またはポア内に含有される、実施形態３２８～３３８のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３４４．ポアが、表面に含有される、実施形態３４３に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３４５．表面が、フィルターである、実施形態３４４に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３４６．表面が、膜である、実施形態３４４に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３４７．狭窄サイズが、細胞直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である、実施形態３２８～３４６のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３４８．狭窄が、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する、実施形態３２８～３４６のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３４９．狭窄が、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの幅を有する、実施形態３２８～３４６のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３５０．狭窄が、約２．２μｍの幅を有する、実施形態３２８～３４６のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３５１．インプット親無核細胞が、約１０ｐｓｉ～約１５０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される、実施形態３２８～３５０のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３５２．前記細胞懸濁液が、狭窄に通す前に、それと同時発生的にまたはその後に、ペイロードと接触させられる、実施形態３２８～３５１のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３５３．抗原が、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされ得る、実施形態３３２～３５２のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３５４．抗原が、疾患関連抗原である、実施形態３３２～３５３のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３５５．抗原が、腫瘍抗原である、実施形態３３２～３５４のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３５６．抗原が、ライセートに由来する、実施形態３３２～３５４のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３５７．抗原が、移植片ライセートに由来する、実施形態３５６に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３５８．ライセートが、腫瘍ライセートである、実施形態３５６に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３５９．抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である、実施形態３３２～３５８のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３６０．ウイルス抗原が、ウイルス、ウイルス粒子またはウイルスカプシドである、実施形態３５９に記載の無核（ａｃｕｌｅａｔｅ）細胞由来の小胞。

実施形態３６１．抗原が、微生物である、実施形態３３２～３５４のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３６２．抗原が、ポリペプチドである、実施形態３３２～３６１のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３６３．抗原が、脂質抗原である、実施形態３３２～３６１のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３６４．抗原が、糖鎖抗原である、実施形態３３２～３６１のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３６５．抗原が、修飾された抗原である、実施形態３３２～３６１のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３６６．修飾された抗原が、ポリペプチドと融合された抗原を含む、実施形態３６５に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３６７．修飾された抗原が、標的化ペプチドと融合された抗原を含む、実施形態３６６に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３６８．修飾された抗原が、脂質と融合された抗原を含む、実施形態３６６に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３６９．修飾された抗原が、炭水化物と融合された抗原を含む、実施形態３６６に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３７０．修飾された抗原が、ナノ粒子と融合された抗原を含む、実施形態３６６に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３７１．複数の抗原が、無核細胞に送達される、実施形態３３２～３７０のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３７２．アジュバントが、ＣｐＧＯＤＮ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、イミキモド、レシキモドおよび／またはリポ多糖（ＬＰＳ）である、実施形態３３３、３３６、３３７および３３９のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態３７３．実施形態３０１～３７２のいずれか一実施形態に記載の複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物。

実施形態３７４．親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、次の特性：（ａ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多くが、親無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期を有する、（ｂ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、（ｃ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、球状の形態を有する、（ｄ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、ＲＢＣゴーストである、（ｅ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞の集団と比較して、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または（ｆ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、のうち１種または複数を有する組成物。

実施形態３７５．親無核細胞の集団から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、次の特性：（ａ）組成物における無核細胞由来の小胞の約２０％より多くが、親無核細胞の集団の平均と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期を有する、（ｂ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞の集団の平均と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、（ｃ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、球状の形態を有する、（ｄ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、ＲＢＣゴーストである、（ｅ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞の集団の平均と比較して、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または（ｆ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞の集団の平均と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、のうち１種または複数を有する組成物。

実施形態３７６．親無核細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態３７４または３７５に記載の組成物。

実施形態３７７．親無核細胞が、ヒト細胞である、実施形態３７４～３７６のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態３７８．親無核細胞が、赤血球細胞または血小板である、実施形態３７４～３７７のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態３７９．赤血球細胞が、赤血球または網状赤血球である、実施形態３７８に記載の組成物。

実施形態３８０．哺乳動物における組成物における無核細胞由来の小胞の２０％の循環半減期が、親無核細胞または親無核細胞の集団の平均と比較して減少している、実施形態３７４～３７８のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態３８１．哺乳動物における組成物における無核細胞由来の小胞の２０％の循環半減期が、親無核細胞または親無核細胞の集団の平均と比較して、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％または約９０％をより多くえて減少している、実施形態３８０に記載の組成物。

実施形態３８２．親無核細胞が、ヒト細胞であり、組成物における無核細胞由来の小胞の２０％の循環半減期が、約５分間、約１０分間、約１５分間、約３０分間、約１時間、約６時間、約１２時間、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約１０日間未満である、実施形態３８１に記載の組成物。

実施形態３８３．親無核細胞が、赤血球細胞であり、組成物における無核細胞由来の小胞の２０％のヘモグロビンレベルが、親無核細胞または親無核細胞の集団の平均と比較して減少している、実施形態３７４～３８２のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態３８４．組成物における無核細胞由来の小胞の２０％のヘモグロビンレベルが、親無核細胞または親無核細胞の集団の平均と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９９％または約１００％減少している、実施形態３８３に記載の組成物。

実施形態３８５．組成物における無核細胞由来の小胞の２０％のヘモグロビンレベルが、親無核細胞または親無核細胞の集団の平均におけるヘモグロビンのレベルの約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％である、実施形態３８４に記載の組成物。

実施形態３８６．親無核細胞が、赤血球であり、組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、球状の形態である、実施形態３７４～３８５のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態３８７．親無核細胞が、赤血球であり、組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞と比較して低減された両凹形状を有する、実施形態３７４～３８５のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態３８８．親無核細胞が、赤血球細胞または赤血球であり、組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、赤血球細胞ゴーストである、実施形態３７４～３８６のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態３８９．組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、表面ホスファチジルセリンを含む、実施形態３７４～３８８のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態３９０．組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞または親無核細胞の集団の平均と比較して、増加した表面ホスファチジルセリンレベルを含む、実施形態３７４～３８９のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態３９１．組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、複数の親無核細胞を含む組成物と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９９％、約１００％または約１００％より多く高い表面ホスファチジルセリンレベルを有する、実施形態３９０に記載の組成物。

実施形態３９２．組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞または親無核細胞の集団の平均と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、実施形態３７４～３９１のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態３９３．組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞または親無核細胞の集団の平均によって産生されるＡＴＰのレベルの約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％未満でＡＴＰを産生する、実施形態３９２に記載の組成物。

実施形態３９４．無核細胞由来の小胞が、ＡＴＰを産生しない、実施形態３９３に記載の組成物。

実施形態３９５．親無核細胞が、組成物の調製中に、（ａ）熱処理されなかった、（ｂ）化学的に処置されなかった、および／または（ｃ）低浸透圧性もしくは高浸透圧性条件に付されなかった、実施形態３７４～３９３のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態３９６．容積オスモル濃度が、親無核細胞からの無核細胞由来の小胞の調製中に維持された、実施形態３０１～３２４のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態３９７．容積オスモル濃度が、約２００ｍＯｓｍ～約６００ｍＯｓｍの間に維持された、実施形態３９６に記載の組成物。

実施形態３９８．容積オスモル濃度が、約２００ｍＯｓｍ～約４００ｍＯｓｍの間に維持された、実施形態３９６または３９７に記載の組成物。

実施形態３９９．組成物の無核細胞由来の小胞が、インプット親無核細胞を含む懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、ペイロードの通過に十分なほど大きい無核細胞の撹乱を引き起こし、これにより、無核細胞由来の小胞を生成する、ステップを含むプロセスによって調製された、実施形態３７４～３９８のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４００．組成物の無核細胞由来の小胞が、ペイロードを含む、実施形態３７４～３９９のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４０１．ペイロードが、治療ペイロードである、実施形態４００に記載の組成物。

実施形態４０２．ペイロードが、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、小分子、複合体、ナノ粒子である、実施形態４００に記載の組成物。

実施形態４０３．組成物の無核細胞由来の小胞が、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、ペイロードの通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）ペイロードを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をペイロードと共にインキュベートし、これにより、ペイロードを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された、実施形態４０２に記載の組成物。

実施形態４０４．無核細胞由来の小胞が、抗原を含む、実施形態３７４～４０３のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４０５．無核細胞由来の小胞が、アジュバントを含む、実施形態３７４～４０４のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４０６．無核細胞由来の小胞が、抗原および免疫寛容原性因子を含む、実施形態３７４～４０４のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４０７．組成物の無核細胞由来の小胞が、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原の通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）抗原を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原と共にインキュベートし、これにより、抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された、実施形態４０４に記載の組成物。

実施形態４０８．組成物の無核細胞由来の小胞が、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、アジュバントの通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）アジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞をアジュバントと共にインキュベートし、これにより、アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された、実施形態４０５に記載の組成物。

実施形態４０９．組成物の無核細胞由来の小胞が、抗原およびアジュバントを含み、組成物の無核細胞由来の小胞が、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原およびアジュバントと共にインキュベートし、これにより、抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された、実施形態４０５に記載の組成物。

実施形態４１０．組成物が、抗原および免疫寛容原性因子を含み、組成物の無核細胞由来の小胞が、（ａ）インプット親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液におけるインプット親無核細胞の直径の関数であり、これにより、抗原および免疫寛容原性因子の通過に十分なほど大きいインプット親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、（ｂ）抗原および免疫寛容原性因子を無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、無核細胞由来の小胞を抗原および免疫寛容原性因子と共にインキュベートし、これにより、抗原および／または免疫寛容原性因子を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップとを含むプロセスによって調製された、実施形態４０６に記載の組成物。

実施形態４１１．狭窄が、マイクロ流体チャネル内に含有される、実施形態３９９、４０３および４０７～４１０のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４１２．マイクロ流体チャネルが、複数の狭窄を含む、実施形態３８４に記載の組成物。

実施形態４１３．複数の狭窄が、直列におよび／または並列に配置されている、実施形態４１２に記載の組成物。

実施形態４１４．狭窄が、複数の微小な支柱の間；アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間；または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する、実施形態４００～４１３のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４１５．狭窄が、ポアである、またはポア内に含有される、実施形態３９９、４０３および４０７～４１０のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４１６．ポアが、表面に含有される、実施形態４１５に記載の組成物。

実施形態４１７．表面が、フィルターである、実施形態４１６に記載の組成物。

実施形態４１８．表面が、膜である、実施形態４１６に記載の組成物。

実施形態４１９．狭窄サイズが、細胞直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である、実施形態３９９～４１８のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４２０．狭窄が、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する、実施形態３９９～４１９のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４２１．狭窄が、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの幅を有する、実施形態３９９～４２０のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４２２．狭窄が、約２．２μｍの幅を有する、実施形態３９９～４２０のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４２３．インプット親無核細胞が、約１０ｐｓｉ～約１５０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される、実施形態３９９～４２２のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４２４．前記細胞懸濁液が、狭窄に通す前に、それと同時発生的にまたはその後に、抗原と接触させられる、実施形態３９９～４２３のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４２５．抗原が、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされ得る、実施形態４０４～４２４のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４２６．抗原が、疾患関連抗原である、実施形態４０４～４２５のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４２７．抗原が、腫瘍抗原である、実施形態４０４～４２６のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４２８．抗原が、ライセートに由来する、実施形態４０４～４２７のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４２９．ライセートが、移植片ライセートである、実施形態４２８に記載の組成物。

実施形態４３０．ライセートが、腫瘍ライセートである、実施形態４２８に記載の組成物。

実施形態４３１．抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である、実施形態４０４～４２６のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４３２．抗原が、微生物である、実施形態４０４～４２６のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４３３．抗原が、ポリペプチドである、実施形態４０４～４３２のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４３４．抗原が、脂質抗原である、実施形態４０４～４３３のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４３５．抗原が、糖鎖抗原である、実施形態４０４～４３３のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４３６．抗原が、修飾された抗原である、実施形態４０４～４３３のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４３７．修飾された抗原が、ポリペプチドと融合された抗原を含む、実施形態４３６に記載の組成物。

実施形態４３８．修飾された抗原が、標的化ペプチドと融合された抗原を含む、実施形態４３７に記載の組成物。

実施形態４３９．修飾された抗原が、脂質と融合された抗原を含む、実施形態４３７に記載の組成物。

実施形態４４０．修飾された抗原が、炭水化物と融合された抗原を含む、実施形態４３７に記載の組成物。

実施形態４４１．修飾された抗原が、ナノ粒子と融合された抗原を含む、実施形態４３７に記載の組成物。

実施形態４４２．複数の抗原が、無核細胞に送達される、実施形態４０４～４４１のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４４３．アジュバントが、ＣｐＧＯＤＮ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、イミキモド、レシキモドおよび／またはＬＰＳである、実施形態４０５、４０８、４０９および４１１～４４２のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４４４．医薬組成物である、実施形態３７３～４４３のいずれか一実施形態に記載の組成物。

実施形態４４５．親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物を作製するための方法であって、組成物が、次の特性：（ａ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期を有する、（ｂ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、（ｃ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、球状の形態を有する、（ｄ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、ＲＢＣゴーストである、（ｅ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または（ｆ）組成物における無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、のうち１種または複数を有し、方法が、親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、狭窄の直径が、懸濁液における親無核細胞の直径の関数であり、これにより、ペイロードの通過に十分なほど大きい親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成し、これにより、無核細胞由来の小胞を生成する、ステップを含む、方法。

実施形態４４６．狭窄が、マイクロ流体チャネル内に含有される、実施形態４４５に記載の方法。

実施形態４４７．マイクロ流体チャネルが、複数の狭窄を含む、実施形態４４６に記載の方法。

実施形態４４８．複数の狭窄が、直列におよび／または並列に配置されている、実施形態４４７に記載の方法。

実施形態４４９．狭窄が、複数の微小な支柱の間；アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間；または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する、実施形態４４５～４４８のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞。

実施形態４５０．狭窄が、ポアである、またはポア内に含有される、実施形態４４６または４４７に記載の方法。

実施形態４５１．ポアが、表面に含有される、実施形態４５０に記載の方法。

実施形態４５２．表面が、フィルターである、実施形態４５１に記載の方法。

実施形態４５３．表面が、膜である、実施形態４５１に記載の方法。

実施形態４５４．狭窄サイズが、細胞直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である、実施形態４４５～４５３のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態４５５．狭窄が、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する、実施形態４４５～４５４のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態４５６．狭窄が、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの幅を有する、実施形態４４５～４５４のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態４５７．狭窄が、約２．２μｍの幅を有する、実施形態４４５～４５４のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態４５８．インプット親無核細胞が、約１０ｐｓｉ～約１５０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、狭窄に通される、実施形態４４５～４５７のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態４５９．ペイロードが細胞に進入するように、前記細胞懸濁液が、狭窄に通す前に、それと同時発生的にまたはその後に、ペイロードと接触させられる、実施形態４４５～４５８のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態４６０．ペイロードが、治療ペイロードである、実施形態４５９に記載の方法。

実施形態４６１．ペイロードが、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、小分子、複合体またはナノ粒子である、実施形態４５９または４６０に記載の方法。

実施形態４６２．ペイロードが、抗原および／またはアジュバントである、実施形態４５９～４６１のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態４６３．ペイロードが、抗原および／または免疫寛容原性因子である、実施形態４５９～４６１のいずれか一実施形態に記載の方法。

実施形態４６４．それを必要とする個体における疾患または障害を処置するための方法であって、実施形態３０１～３７２のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞を投与するステップを含む方法。

実施形態４６５．それを必要とする個体における疾患または障害を処置するための方法であって、実施形態３７３～４４４のいずれか一実施形態に記載の組成物を投与するステップを含む方法。

実施形態４６６．無核細胞由来の小胞が、治療ペイロードを含む、実施形態４６４または４６５に記載の方法。

実施形態４６７．個体が、がんを有し、ペイロードが、抗原を含む、実施形態４６６に記載の方法。

実施形態４６８．個体が、がんを有し、ペイロードが、抗原およびアジュバントを含む、実施形態４６６または４６７に記載の方法。

実施形態４６９．抗原が、腫瘍抗原である、実施形態４６７または４６８に記載の方法。

実施形態４７０．個体が、感染性疾患またはウイルス関連疾患を有し、ペイロードが、抗原を含む、実施形態４６６に記載の方法。

実施形態４７１．個体が、感染性疾患またはウイルス関連疾患を有し、ペイロードが、抗原およびアジュバントを含む、実施形態４６６または４７０に記載の方法。

実施形態４７２．抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である、実施形態４７１に記載の方法。

実施形態４７３．個体が、自己免疫性疾患を有し、ペイロードが、抗原を含む、実施形態４６６に記載の方法。

実施形態４７４．個体が、自己免疫性疾患を有し、ペイロードが、抗原および／または免疫寛容原性因子を含む、実施形態４６６または４７３に記載の方法。

実施形態４７５．それを必要とする個体における疾患または障害を予防するための方法であって、実施形態３０１～３７２のいずれか一実施形態に記載の無核細胞由来の小胞を投与するステップを含む方法。

実施形態４７６．それを必要とする個体における疾患または障害を予防するための方法であって、実施形態３７３～４４４のいずれか一実施形態に記載の組成物を投与するステップを含む方法。

実施形態４７７．無核細胞由来の小胞が、抗原を含む、実施形態４７５または４７６に記載の方法。

実施形態４７８．個体が、がんを有し、ペイロードが、抗原およびアジュバントを含む、実施形態４７５または４７６に記載の方法。

実施形態４７９．疾患または障害が、がんであり、抗原が、腫瘍抗原である、実施形態４７７または４７８に記載の方法。

実施形態４８０．個体が、感染性疾患を有し、ペイロードが、抗原を含む、実施形態４７７または４７８に記載の方法。

実施形態４８１．個体が、感染性疾患を有し、ペイロードが、抗原およびアジュバントを含む、実施形態４７７または４７８に記載の方法。

実施形態４８２．抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である、実施形態４８１に記載の方法。

以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を例証するために与えられ、本開示をいかなるようにも限定することを意味しない。当業者は、本開示が、目的を実行し、言及された目標および利点、ならびに本明細書に固有の目的、目標および利点を得るために、十分に適応されることを容易に認識するであろう。特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨の範囲内に包含される、本明細書における変化および他の使用を当業者なら想起するであろう。
（実施例１）

この実施例は、部分的に、ローディングされた抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞が、ｉｎｖｉｖｏで、抗原特異的免疫応答を誘導し得ることを実証する。
材料および方法

ｉｎｖｉｖｏでの抗原特異的免疫応答を決定するために、表１の条件に従って処置された細胞由来の小胞、例えば、モデル抗原および／またはアジュバントをローディングされた赤血球由来の小胞をマウスに投与し、次いで、抗原特異的Ｔ細胞の数および炎症性サイトカイン、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２のレベルをフローサイトメトリーによって測定した。具体的には、赤血球細胞（ＲＢＣ）をＣ５７ＢＬ／６Ｊドナーマウスから得て、表１に詳細に記載した群Ａ～Ｈ（５匹のマウス／群）に従って、遊離Ｏｖａ（１０μｇ／マウス）および／またはポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）（２５μｇ／マウス）による全身処置を用いてまたは用いないで、蛍光的にタグ付けしたＩｇＧ抗体（ＩｇＧ４８８、２０μｇ／ｍＬ）、Ｏｖａタンパク質（２００μｇ／ｍＬ）、および／またはポリＩ：Ｃ（３００μｇ／ｍＬ）を細胞内にローディングした。表１では、ＲＢＣの後の括弧内の条件は、細胞内カーゴを示し、ＲＢＣの後の括弧の外側の条件は、全身に同時投与した（すなわち、細胞内カーゴではない）。

ＲＢＣを投与した群は、１億５千万（Ｍ）個のＲＢＣの用量を受けた。陰性対照の動物には：Ｏｖａ（２００μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、洗浄した１５０ＭのＲＢＣを与え、遊離ポリＩ：Ｃ（Ｅｎｄｏ＋ポリＩ：Ｃ）をマウスに同時注射した（群Ａ）；抗体を単独でローディングした１５０ＭのＲＢＣを与えた（ＲＢＣ（ＩｇＧ４８８））（群Ｂ）；または抗体および抗原をローディングした１５０ＭのＲＢＣを与えた（ＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ））（群Ｄ）。陽性対照の動物には：抗体を単独でローディングした１５０ＭのＲＢＣを与え、遊離ＯＶａおよびポリＩ：Ｃを同時投与した（ＲＢＣ（ＩｇＧ４８８）＋Ｏｖａ＋ポリＩ：Ｃ）（群Ｃ）；またはＯｖａの最小エピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ－１μｇ／ｍＬ）でパルス刺激した１Ｍの樹状細胞（ＤＣ）を与えた（群Ｈ）。０日目に、各処置条件に対するそれぞれの組成物をレシピエントＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに養子移入した。７日目に、脾臓を回収し、Ｏｖａ特異的テトラマーに対してＳＩＩＮＦＥＫＬ（１μｇ／ｍＬ）で再刺激し、以下の記載に従って、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２に関する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）に供した。
表１．処置群。

＊ＲＢＣの後の括弧内の条件は、細胞内カーゴを示す；ＲＢＣの後の括弧の外側の条件は、全身に同時投与された。
結果

抗原特異的Ｔ細胞の数を上記で議論したようにテトラマー染色によって測定した。群Ｆ（ＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ）＋ポリＩ：Ｃ）、群Ｇ（ＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ＋ポリＩ：Ｃ））、および陽性対照のパルス刺激したＤＣ（群Ｈ）は、Ｏｖａ反応性Ｔ細胞において統計的に有意な増加を誘導した（図１Ａ）。これらのデータは、テトラマー染色によって決定される抗原特異的応答を誘導するために、抗原およびアジュバント（同時に封入されたかまたは全身投与されたアジュバント）に関する要件が存在することを示した。ＩＦＮ－γを有する細胞のパーセンテージは、群Ｆ（ＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ）＋ポリＩ：Ｃ）および群Ｈ（パルス刺激したＤＣ）において有意に増加したが、一方、群Ｇ（ＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ＋ポリＩ：Ｃ））では、統計的に有意でないわずかな増加が存在した（図１Ｂ）。細胞当たりのＩＦＮ－γの量は、ＩＦＮ－γ＋細胞の％で観察した場合、同じ群において統計的に有意に増加したが（群ＦおよびＨ）、一方、群Ｃ（ＲＢＣ（ＩｇＧ４８８）＋Ｏｖａ＋ポリＩ：Ｃ）および群Ｇ（ＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ＋ポリＩ：Ｃ）でも有意な増加が存在した（図１Ｃ）。ＩＦＮ－γに関して観察した傾向と同様に、ＩＬ－２＋細胞のパーセンテージは、パルス刺激したＤＣ（群Ｈ）およびＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ）＋ポリＩ：Ｃ（群Ｆ）においてのみ有意に増加した（図１Ｄ）。細胞当たりのＩＬ－２のレベルは、パルス刺激したＤＣ（群Ｈ）およびＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ）＋ポリＩ：Ｃ（群Ｆ）、ならびにＲＢＣ（ＩｇＧ４８８）＋Ｏｖａ＋ポリＩ：Ｃ（群Ｃ）およびＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ＋ポリＩ：Ｃ）（群Ｇ）の条件で有意に増加し、これは、細胞当たりのＩＦＮ－γの量に関して観察したのと同じ傾向である（図１Ｅ）。まとめると、これらのデータは、無核細胞由来の小胞が、抗原およびアジュバント（封入されたかまたはされていない）に関する要件を伴って、抗原特異的応答を誘導することができることを示し、最も良い応答は、ＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ）＋ポリＩ：Ｃ条件（群Ｆ）で観察された。すべての比較は、Ｅｎｄｏ＋ポリＩ：Ｃ陰性対照（群Ａ）に対して行った（５匹／群、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．００５）。
（実施例２）

この実施例は、部分的に、ローディングされた抗原および／またはアジュバントを含む様々な用量の無核細胞由来の小胞が、変動するレベルのｉｎｖｉｖｏでの抗原特異的免疫応答を誘導し得ることを実証する。詳細には、ローディングされた抗原および／またはアジュバントを含むより高用量の無核細胞由来の小胞は、より大きなｉｎｖｉｖｏでの抗原特異的免疫応答を誘導し得る。
材料および方法

ｉｎｖｉｖｏでの抗原特異的免疫応答を決定するために、表２の条件に従って処置した細胞由来の小胞、例えば、モデル抗原および／またはアジュバントをローディングした赤血球由来の小胞をマウスに投与し、次いで、抗原特異的Ｔ細胞の数および炎症性サイトカイン、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２のレベルをフローサイトメトリーによって測定した。具体的には、赤血球細胞（ＲＢＣ）をＣ５７ＢＬ／６Ｊドナーマウスから得て、表２に詳細に記載した群（５匹のマウス／群）に従って、遊離Ｏｖａ（１０μｇ／マウス）および／またはポリＩ：Ｃ（２５μｇ／マウス）による全身処置を用いてまたは用いないで、蛍光的にタグ付けしたＩｇＧ抗体（ＩｇＧ４８８、２０μｇ／ｍＬ）、Ｏｖａタンパク質（２００μｇ／ｍＬ）および／またはポリＩ：Ｃ（３００μｇ／ｍＬ）をローディングした。表２では、ＲＢＣの後の括弧内の条件は、細胞内カーゴを示し、ＲＢＣの後の括弧の外側の条件は、全身に同時投与した（すなわち、細胞内カーゴではない）。

ローディングおよび全身投与した遊離抗原およびアジュバントの様々な組合せを比較した。陰性対照の動物に、Ｏｖａ（２００μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした１５０Ｍの赤血球細胞を与え、洗浄し、遊離ポリＩ：Ｃ（Ｅｎｄｏ＋ポリＩ：Ｃ）をマウスに同時注射した（群Ｉ）。陽性対照の動物は、Ｏｖａの最小エピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ－１μｇ／ｍＬ）でパルス刺激した１Ｍの樹状細胞（ＤＣ）を受けた（群Ｎ）。０日目に、ローディングした無核細胞由来の小胞、インキュベートした赤血球細胞、または樹状細胞をレシピエントＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに養子移入した。７日目に、脾臓を回収し、Ｏｖａ特異的テトラマーに関してＳＩＩＮＦＥＫＬ（１μｇ／ｍＬ）で再刺激し、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２に関する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）に供した。
表２．処置群。

ＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ）＋ポリＩ：Ｃ（群Ｋ）および陽性対照のパルス刺激したＤＣ（群Ｎ）は、Ｏｖａ反応性Ｔ細胞において統計的に有意な増加を誘導した（図２Ａ）。無核細胞由来の小胞が抗体のみを含有し、遊離ＯｖａとポリＩ：Ｃと共に同時投与された条件（ＲＢＣ（ＩｇＧ４８８）＋Ｏｖａ＋ポリＩ：Ｃ；群Ｊ）、ならびに１億５千万個の細胞／動物（群Ｌ）および１０億（Ｂ）個の細胞／動物（群Ｍ）の両方で、抗体、Ｏｖａ、およびポリＩ：Ｃを含有する小胞（ＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ＋ポリＩ：Ｃ）は、Ｏｖａ特異的Ｔ細胞のパーセンテージにおいて、統計的に有意でないわずかな増加を示した（図２Ａ）。興味深いことに、より高用量のローディングした小胞（１Ｂ個のＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ＋ポリＩ：Ｃ）（群Ｍ））によって、より低い１５０Ｍの用量（群Ｌ）に対して、より低い内因性の応答がもたらされた。ＩＦＮ－γ＋細胞のパーセンテージは、ＩＦＮ－γ＋細胞の比率において有意な増加をもたらす、パルス刺激したＤＣ陽性対照（群Ｎ）およびＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ）＋ポリＩ：Ｃ（群Ｋ）条件に関してのみ、テトラマーデータと類似する傾向にあった（図２Ｂ）。より低用量のＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ＋ポリＩ：Ｃ）（群Ｌ）におけるＩＦＮ－γ＋細胞のパーセンテージにおいてもわずかな増加が存在したが、これは有意ではなかった（図２Ｂ）。しかし、ＩＬ－２＋細胞のパーセンテージだけが、陽性対照において有意に増加した（図２Ｃ）。まとめると、これらのデータは、最も良い応答は、抗原をローディングした小胞と遊離ポリＩ：Ｃの全身同時投与により得られ、予期せぬことに、より高用量の抗原＋アジュバントをローディングした小胞（１Ｂ個）（群Ｍ）によってより低い内因性応答がもたらされたことを示す。すべての比較は、Ｅｎｄｏ＋ポリＩ：Ｃ陰性対照（群Ｉ）に対してなされた（５匹のマウス／群、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．００５）。
（実施例３）

この実施例は、部分的に、ｉｎｖｉｖｏでの抗原特異的免疫応答に関して、様々なアジュバントまたは投与戦略を使用する効果を実証する。
材料および方法

ｉｎｖｉｖｏでの抗原特異的免疫応答を決定するために、表３の条件に従って処置した細胞由来の小胞、例えば、モデル抗原および／またはアジュバントをローディングした赤血球由来の小胞をマウスに投与し、次いで、抗原特異的Ｔ細胞の数および炎症性サイトカイン、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２のレベルをフローサイトメトリーによって測定した。具体的には、赤血球細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊドナーマウスから得て、表３に詳細に記載した群（５匹のマウス／群）に従って、変動する用量およびプライム－ブーストスケジュールで、蛍光的にタグ付けしたＩｇＧ抗体（ＩｇＧ４８８、２０μｇ／ｍＬ）、Ｏｖａタンパク質（２００μｇ／ｍＬ）および／またはアジュバント（ポリＩ：Ｃ（３００または３０００μｇ／ｍＬ）、リポ多糖（ＬＰＳ、３００μｇ／ｍＬ）、またはＲ８４８（１００μｇ／ｍＬ）のいずれか）をローディングした。
表３．処置群。

＊ＲＢＣの後の括弧内の条件は、細胞内カーゴを示す；ＲＢＣの後の括弧の外側の条件は、全身に同時投与された。

陰性対照動物に、Ｏｖａ（２００μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした赤血球細胞を与え、洗浄し、遊離ポリＩ：Ｃをマウスに同時注射した（Ｅｎｄｏ＋ポリＩ：Ｃ）（群Ｏ）。０日目に、ＲＢＣをローディングした無核細胞由来の小胞、インキュベートした赤血球細胞または樹状細胞を、レシピエントＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに養子移入した。２日目に、群Ｒ（ＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ＋ポリＩ：Ｃ）＋ブースト）は、第２の（ブースト）用量の１５０ＭのＲＢＣ（Ｏｖａ＋ポリＩ：Ｃ）をローディングした小胞を受けた。７日目に、脾臓を回収し、Ｏｖａ特異的テトラマーに関してＳＩＩＮＦＥＫＬ（１μｇ／ｍＬ）で再刺激し、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２に関する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）に供した。
結果

抗原特異的Ｔ細胞の数を、Ｅｎｄｏ対照に対してＯｖａ反応性Ｔ細胞の統計的に有意な増加を生じる、群Ｒ（ブーストした条件（ＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ＋ポリＩ：Ｃ）＋ブースト）と群Ｓ（高用量のアジュバント（ＲＢＣ（ＩｇＧ４８８＋Ｏｖａ＋高用量のポリＩ：Ｃ））に関してのみ、テトラマー染色によって測定した（図３Ａ）。テトラマー染色に関して観察された傾向は、ＩＣＳによって測定したＩＦＮ－γについて陽性の細胞のパーセンテージによってさらに支持され、同一の条件が、対照に対するＩＦＮ－γの％において統計的に有意な増加を生じた（図３Ｂ）。この傾向は、ＩＬ－２ＩＣＳによるブースト条件について観察されたが、高用量のポリＩ：Ｃ条件は、ＩＬ－２＋細胞の比率において、中程度の、統計的に有意でない増加をもたらしただけであった（図３Ｃ）。まとめると、これらのデータは、アジュバントであるポリＩ：Ｃを使用することによって、最も高い内因性応答がもたらされたこと、および２日目に２回目のブースターを使用することによって、Ｏｖａおよび１０倍高用量のポリＩ：Ｃを含む小胞の単回投与に対してさえも、はるかに高い応答をもたらしたことを示す。すべての比較は、Ｅｎｄｏ＋ポリＩ：Ｃ陰性対照（群Ｏ）に対してなされた（５匹のマウス／群、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．００５）。
（実施例４）

正常な無核細胞由来の小胞カウンターパートと比較した正常な無核細胞の代謝活性を決定するために、ＲＢＣとＲＢＣ由来の小胞の解糖のレベルは、蛍光酵素アッセイを使用して乳酸産生レベルをモニターすることによって、経時的に間接的に測定され得る。ＲＢＣ代謝活性は、解糖による乳酸の生成によって測定することができる。ミトコンドリアがない場合、解糖は、ＲＢＣがＡＴＰを作製する唯一の方法であり、これには、外膜リーフレット（ｅｘｔｅｒｎａｌｍｅｍｂｒａｎｅｌｅａｆｌｅｔ）のホスファチジルセリンを反転させて細胞内膜リーフレット（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍｅｍｂｒａｎｅｌｅａｆｌｅｔ）に戻すことが必要である。ＡＴＰの欠乏は、ＲＢＣが、細胞表面のホスファチジルセリンを基礎レベルに戻すことができないことを意味する。
材料および方法

ヒトＲＢＣをフィコール分離によって全血から得て、アデニンを含むクエン酸塩－リン酸塩－デキストロース（ｄＣＰＤＡ－１）緩衝剤に１０億個の細胞／ｍＬで再懸濁させ、蛍光標識したラットＩｇＧ（２０μｇ／ｍＬ）をＳＱＺによって室温で送達し（５０ｐｓｉで、２．２μｍの狭窄幅）、ＩｇＧを含むＲＢＣ由来の小胞を生成した。次いで、細胞を示されている時間３７℃でインキュベートし、上清を採取した。ＲＢＣおよびＲＢＣ由来の小胞によって産生された乳酸レベルを定量するために、乳酸－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、各時点からの上清をアッセイした。簡潔には、上清を、蛍光乳酸検出試薬の添加前に、不活性化および中和ステップに供した。蛍光光度をブランク対照に対して正規化し、上清における絶対的乳酸レベルを乳酸標準曲線（０．１～１０μＭ）を使用して決定した。
結果

ＳＱＺによって生成したヒトＲＢＣ由来の小胞は、４時間と２１時間の両方で有意により低いレベルの乳酸産生を示した（図４）。４時間では、ＳＱＺによって生成したＲＢＣ由来の小胞（ＳＱＺ）は、未処置のＲＢＣ（ＳＱＺなし）に対して乳酸産生において約５分の１の低下を有し、代謝活性とＡＴＰ生成の減少を示した（左のバー、＃Ｐ＜０．００５）。延長された回収時間（２１時間）後であっても、ＳＱＺによって生成したＲＢＣ由来の小胞（ＳＱＺ）は、ＳＱＺなしに対して有意に低い（２分の１；右のバー、^＊Ｐ＜０．０５）量の乳酸産生を有した。まとめると、これらのデータは、ＳＱＺローディングされたＲＢＣ由来の小胞が、有意に変更された代謝能を有することを示す。
（実施例５）

この実施例は、部分的に、無核細胞由来の小胞の形態および表面のホスファチジルセリンレベルに関するＳＱＺによって媒介されるローディングの効果を実証する。
材料および方法

無核細胞由来の小胞の形態および表面のホスファチジルセリンレベルに関するＳＱＺによって媒介される送達の影響を定量するために、赤血球細胞（ＲＢＣ）由来の小胞を蛍光的にタグ付けした抗原にローディングし、レシピエントマウスに注射し、その後、経時的に連続して採血した。次いで、無核細胞由来の小胞の半減期を血中の蛍光シグナルの持続から決定した。具体的には、赤血球細胞（ＲＢＣ）をＣ５７ＢＬ／６Ｊドナーマウスから得て、未処置のままにされ（Ｕｎｔｒｔｄ）、蛍光的にタグ付けした（Ｄ－ＦＩＴＣ）３ｋＤａのデキストラン（２００μｇ／ｍＬ－ＳＱＺなし）の存在下でインキュベートしたか、またはＳＱＺに媒介されるローディングによって処理して、デキストランをローディングしたＲＢＣ由来の小胞を生成した（ＳＱＺ）。各条件で生成した細胞または小胞を、膜標識色素であるＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（登録商標）（ＣＴ）で染色した。各条件からの試料は、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）分析によって評価し、形態学的変化を決定した。

形態および表面のホスファチジルセリンレベルに関するＳＱＺに媒介される送達の影響を定量するために、上記で調製したデキストランとインキュベートしたＲＢＣをＣａＣｌ_２緩衝剤を含有するＲＰＭＩ（０．４ｍＭ）中で３７℃にて２時間さらにインキュベートし、その後、イオノマイシン（８μＭ）で３０分間処理した（ホスファチジルセリンの表面提示を誘導することが公知の条件）（陽性対照を生じる、＋ｃｔｒｌ）。次いで、Ｕｎｔｒｔ、＋ｃｔｒｌおよびＳＱＺなしの試料からの細胞、ならびにＳＱＺローディングした小胞（ＳＱＺ）をアネキシンＶで染色し、表面のホスファチジルセリンレベルをフローサイトメトリーによって並行して測定した。
結果

ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ分析の結果は、未処置のまま（Ｕｎｔｒｔ）であるか、またはＳＱＺの非存在下でデキストランと共にインキュベートした（ＳＱＺなし）ＲＢＣが、明視野で画像化された場合に、通常ＲＢＣと関連する両凹形状を維持した（図５Ａ）。しかし、ＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞は、形態において別個の変化を示し、明視野での画像化によって示されたように、概してより球形状を示した。さらに、未処置（Ｕｎｔｒｔｄ）でもインキュベートしたＲＢＣ（ＳＱＺなし）でもなく、ＳＱＺローディングした小胞（ＳＱＺ）のみが、蛍光的にタグ付けしたデキストラン（Ｄ－ＦＩＴＣ）からの蛍光シグナルを示し、送達が、ＳＱＺに媒介されるローディングによってのみ達成されたことを示した。すべての条件で、試料は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（登録商標）に関して陽性であり、脂質二重層の存在を示した。

上記のＲＢＣまたはＲＢＣ由来の小胞は、ＲＢＣ由来の小胞における膜スクランブリングのマーカーである表面のホスファチジルセリンレベルのレベルについても試験した（図５Ｂ）。未処置（Ｕｎｔｒｔ）およびインキュベートしたＲＢＣ（ＳＱＺなし）と比較した場合、ＳＱＺローディングした小胞（ＳＱＺ）は、ホスファチジルセリン染色について有意により高いレベルを示し、ＳＱＺ処理を有さないＲＢＣに関する５％未満に対して、ＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞ではアネキシンＶについて陽性の細胞が８０％をより多くえた。ＳＱＺ条件でのより高いレベルの表面のホスファチジルセリンについて陽性の細胞のパーセンテージは、陽性対照（＋ｃｔｒｌ）に関してみられるものに類似した。全体的に、これらのデータは、ＳＱＺに媒介される送達が、ＲＢＣ由来の小胞の効率的なローディング、インプットＲＢＣからの形態の顕著なモジュレーションをもたらす一方で、表面のホスファチジルセリンレベルを有意に増加させたことを示す。
（実施例６）

この実施例は、部分的に、無核細胞由来の小胞の循環半減期に関するＳＱＺに媒介されるローディングの効果を実証する。
材料および方法

無核細胞由来の小胞の循環半減期に関するＳＱＺに媒介される送達の影響を定量するために、赤血球細胞由来の小胞は、蛍光的にタグ付けした抗原をローディングされ、レシピエントマウスに注射され、その後、経時的に連続的に採血した。次いで、無核細胞由来の小胞の半減期を血中の蛍光シグナルの持続から決定した。具体的には、赤血球細胞（ＲＢＣ）をＣ５７ＢＬ／６Ｊドナーマウスから得て、ＳＱＺローディングにより処理し、図６Ａにおいて概説したように、蛍光的にタグ付けしたＯｖａタンパク質（Ｏｖａ－６４７－２００μｇ／ｍＬ）を有するＲＢＣ由来の小胞を生成した（１群当たり３匹のマウス）。０分において、ＯｖａをローディングしたＲＢＣ由来の小胞（２億の小胞／動物）をＣＦＳＥで染色した。非ＳＱＺ対照として使用される等量のＲＢＣをＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔで染色した。ＣＦＳＥ染色した、ＯＶＡをローディングしたＲＢＣ由来の小胞とＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔで染色したＲＢＣを混合し、レシピエントＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに養子移入した。５、３０、６０および２４０分において、各マウスの尾静脈から血液を採取し、循環する蛍光的にタグ付けしたＲＢＣ由来の小胞およびＶｉｏｌｅｔで染色したＲＢＣの数をフローサイトメトリーによって定量した。
結果

循環中のＣＦＳＥ陽性のＲＢＣ由来の小胞（抗原でＳＱＺローディングした）のレベルは、最初の時点（５分）までに有意に下降し、１５分までにほぼ検出不能であった（図６Ｂ）。しかし、ＳＱＺによって処理しなかったが、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（登録商標）で標識したＲＢＣは、プロットした時間経過にわたって同様のレベルを持続した（図６Ｂ）。プロットされた時間経過をより多くえて繰り返し実施した採血は、ＳＱＺ処理したＲＢＣに由来する小胞とＳＱＺなしのＲＢＣの両方の相対レベルは、概して、約１時間後に安定であることを示したが、８週間まで回収したデータを使用すると、ＳＱＺ処理したＲＢＣに由来する小胞とＳＱＺなしのＲＢＣの両方に関する半減期である。比較的寿命の短いＲＢＣ由来の小胞は、１４．３分の半減期を有したが、ＳＱＺ処理なしの標識したＲＢＣは、７６６１分（約５日）の半減期を有した。レシピエントマウスに注射したＲＢＣ／ＲＢＣ由来の小胞の混合物のフロープロット図を図６Ｃに示す。この前方対側方の散乱プロットは、形態の変化を示す実体の定量も提供した。グラフの上方右側の四分位の細胞のより大きなパーセンテージは、ＳＱＺ処理されなかったＲＢＣを表し、一方、ＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞のより小さな集団は、左側にクラスターで表わされた。これはまた、ＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞の形態は、ＳＱＺによって処理されなかったＲＢＣのものから有意に変更されていたという知見を例証する。まとめると、これらのデータは、ＲＢＣ由来の小胞は、ＳＱＺ処理されなかったＲＢＣよりも有意に早く取り除かれること、およびこの２つは、フローサイトメトリーによって形態的に顕著に異なることを示した。
（実施例７）

この実施例は、部分的に、無核細胞由来の小胞のヘモグロビン含量に関するＳＱＺに媒介されるローディングの効果を実証する。
材料および方法

無核細胞由来の小胞のヘモグロビン（Ｈｂ）含量に関するＳＱＺに媒介される送達の影響を定量するために、ＲＢＣ由来の小胞を様々な条件下でＳＱＺ処理によって生成し、インプットＲＢＣのものと比較して、残っているヘモグロビンの量をＨｅｍｏＣｕｅ（登録商標）システムを使用して定量した。具体的には、ＲＢＣをＣ５７ＢＬ／６Ｊドナーマウスから得て、未処置のままとし（ＮＣ－陰性対照）、水中で１：２０に希釈した溶液中でインキュベートした（９５μＬの水中５μＬの血液－溶解対照）か、または２つの異なる圧力で（１０および１２ｐｓｉ）ＳＱＺ処理した。遠心分離後に、溶血（Ｈｂの喪失）の量を、以下の等式に従って、全細胞懸濁液中のＨｂ濃度に対する上清中のＨｂ濃度を決定することによって、ＨｅｍｏＣｕｅ（登録商標）システムを使用して決定した：溶血（％）＝（［遊離Ｈｂ］／［全Ｈｂ］）^＊１００。
結果

遠心分離後に、ＳＱＺ処理したＲＢＣ由来の小胞が、かなりの溶血（Ｈｂの喪失）をもたらすことが視覚的に明らかであり、このことは、ＳＱＺ処理されなかったＲＢＣで観察された強烈な赤色の細胞ペレットを伴う本質的に透明な上清と比較して、ＲＢＣ由来の小胞の上清で赤色が拡散していることから容易に観察された（図７Ａ）。ＨｅｍｏＣｕｅ（登録商標）システムを使用して定量する場合、溶解対照は８％の溶血を示したが、一方、ＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞の両条件（１０および１２ｐｓｉ）は、およそ３％の溶血を示した。比較すると、ＳＱＺによって処理されなかったＲＢＣは、単に０．２％の溶血を記録したに過ぎなかった（図７Ｂ）。まとめると、これらのデータは、Ｈｂレベルは、未処置のインプットＲＢＣに対して、ＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞において減少したことを示す。
（実施例８）

無核細胞由来の小胞のヘモグロビン（Ｈｂ）含量に関するＳＱＺに媒介される送達の影響を定量するために、ＲＢＣ由来の小胞を様々な条件下でＳＱＺ処理することによって生成し、インプットＲＢＣの量と比較して残っているヘモグロビンの量をＬＣ／ＭＳによって定量した。具体的には、ＲＢＣをＮＯＤドナーマウスから得て、ＰＢＳ中でＦＡＭでタグ付けしたインスリンＢ９－２３ペプチド（７５μＭ）とインキュベートしたか（Ｅｎｄｏ対照）、またはＳＱＺに媒介されるローディングにより処理して、インスリンＢ９－２３ペプチドをローディングしたＲＢＣ由来の小胞を生成した（ＳＱＺ）。次いで、Ｅｎｄｏ対照またはＳＱＺからの試料（５Ｅ７～１．５Ｅ８個の細胞または小胞／複製試料）を、液体クロマトグラフィー／質量分析による分析（ＬＣ／ＭＳ）の前に、標準的なペプチド変性、還元、アルキル化およびトリプシン処理（ＤＲＡＴ）手順に供した。誘導体化後、逆相ＬＣを使用して試料をランし、２種の公知のヘモグロビンペプチド（Ｈｂペプチド番号１－ＦＬＡＳＶＳＴＶＬＴＳＫ；Ｈｂペプチド番号２－ＶＧＡＨＡＧＥＹＧＡＥＡＬＥＲ）のレベルを、各ピークに対する曲線下面積を計算することによって定量した。
結果

ＬＣ／ＭＳ分析により、ＳＱＺ処理されなかったＲＢＣ（Ｅｎｄｏ対照）が、ＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞のほぼ１０倍多いＨｂ含量を有したことが示された（２種の技術的複製／試料；別々に示される）。Ｅｎｄｏ対照とＳＱＺの間で観察されたこの傾向は、両方のＨｂペプチドで観察され、ＳＱＺ試料のＨｂ含量の８０％をより多くえる相対的低下を有した（図８Ａ～８Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ＲＢＣがＳＱＺ処理されて、ＲＢＣ由来の小胞となった場合、これらの未処理のＲＢＣカウンターパートと比較して、かなりの量のＨｂが失われたことを示す。
（実施例９）

この例は、部分的に、無核細胞由来の小胞の誘導において、ゴースト形成に関するＳＱＺに媒介されるローディングにおける狭窄サイズおよび圧力の効果を実証する。
材料および方法

無核細胞由来の小胞の誘導において、ゴースト形成に関するＳＱＺに媒介されるローディングにおける狭窄幅および圧力の影響を定量するために、ＲＢＣ由来の小胞を、様々な狭窄幅および圧力条件下でＳＱＺ処理によって生成し、ゴースト形成の量をフローサイトメトリーによって定量した。具体的には、赤血球細胞（ＲＢＣ；１００Ｍの細胞／ｍＬ）をＣ５７ＢＬ／６Ｊドナーマウスから得て、希釈したＣＰＤＡ－１溶液中で蛍光的にタグ付けしたＯｖａ（１０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートしたか（Ｅｎｄｏ）、または２種の異なる狭窄直径（２．２μｍまたは２．５μｍ）と２種の異なる駆動圧力（３０および５０ｐｓｉ）の組合せを使用して、ＳＱＺによってＯｖａをローディングした。次いで、ゴースト形成の量をフローサイトメトリーによって決定した。非ゴーストおよびゴースト小胞のプロファイルは、以前に、図６Ｃに示した。
結果

ＳＱＺ処理の狭窄幅および／または圧力を変更することによって、ＲＢＣ由来の小胞のＳＱＺローディングから生じるゴースト形成の相対量をモジュレートすることができる。期待したように、ＳＱＺ処理されなかったＲＢＣ（Ｅｎｄｏ）は、非常に低いパーセンテージのゴースト形成を示した（約５％）。試験したすべてのＳＱＺ条件は、Ｅｎｄｏに対して有意に高いパーセンテージのゴースト形成をもたらした（Ｐ＜０．００５）（図９）。２．５μｍの狭窄幅では、３０ｐｓｉの駆動圧力でのＳＱＺ処理によって、約６０％のゴースト形成がもたらされたが、５０ｐｓｉの駆動圧力でのＳＱＺ処理の場合には、９０％をより多くえてゴースト形成が増加した（Ｐ＜０．０５）（図８）。さらに、より狭い狭窄幅（２．２μｍ）を使用するＳＱＺ処理におけるゴースト形成によって、３０ｐｓｉの同じ駆動圧力が加えられた場合に、より広い狭窄幅（２．５μｍ、約６０％のゴースト形成）と比較して、より高いパーセンテージのゴースト形成（９０％をより多くえるゴースト形成）ももたらされた（Ｐ＜０．０５）（図９）。まとめると、これらのデータは、駆動圧力または狭窄幅を変更することによって、無核細胞由来の小胞へのＳＱＺローディングに起因するゴースト形成のパーセンテージが積極的に調整され得ることを示す。
（実施例１０）

ＳＱＺによって処理された無核細胞の循環動態を決定するために、マウスＲＢＣを最初にＰＫＨ－２６で標識し、次いで、ＳＱＺ処理に供して、ＲＢＣ由来の小胞を生成した。次いで、ＲＢＣ由来の小胞をマウスに注射し（２匹のマウスのそれぞれに対して１０億個の小胞）、蛍光的に（ＰＨＫ－２６）標識した、ＳＱＺ処理したＲＢＣ由来の小胞を、投与後２４時間の経過にわたって、マウス血液において追跡した。具体的には、投与の０分、１５分、３０分、１時間、４時間、および２４時間後の蛍光光度によって小胞を測定した。

別の設定のマウスに、ＳＱＺ処理に供されなかった、蛍光標識したＲＢＣを注射した（３匹のマウスのそれぞれに対して１０億個の細胞）。蛍光的に（ＰＨＫ－２６）標識した、未処理のＲＢＣを、投与後２４時間の経過にわたって、マウス血液において追跡した。具体的には、投与の０分、１５分、３０分、１時間、４時間、および２４時間後の蛍光光度によって未処理のＲＢＣを測定した。

マウスの血流における蛍光的に（ＰＫＨ－２６）標識したＲＢＣ由来の小胞と未処理のＲＢＣカウンターパートの持続性をフローサイトメトリーによってアッセイしたように蛍光光度によって決定した。
結果

図１０に示したように、ＳＱＺによって処理したＲＢＣ由来の小胞は、血液から迅速に取り除かれた。具体的には、ＲＢＣ由来の小胞のほとんどは、６０分以内に血液から取り除かれ、約１０分の循環半減期を有した。比較すると、未処理のＲＢＣは、実験の期間（７２時間）血流中で持続した。まとめると、これらのデータは、ＲＢＣ由来の小胞が、ＳＱＺ処理されなかったＲＢＣより有意に早く取り除かれることを示した。
（実施例１１）

ＳＱＺ処理した無核細胞由来の小胞がＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する機序を評価するために、ｉｎｖｉｖｏで無核細胞由来の小胞の取込みに関与する細胞型および臓器を検査した。この実施例は、部分的に、静脈内注射の後のＳＱＺ処理した無核細胞由来の小胞の即時の取込みに関与する細胞型および臓器を実証する。
材料および方法

Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙから得て、そこから、２０匹の雌をワクチン接種のためのレシピエントマウスとして使用し、１０匹の雌をドナーマウスとして使用した。ドナーマウスから抽出したＲＢＣをＰＫＨ－２６で蛍光標識し、次に、抗原（Ｅ７ＳＬＰ）およびアジュバント（ポリＩ：Ｃ）の存在下でＳＱＺ処理して、Ｅ７をローディングしたＲＢＣ由来の小胞を生成した。レシピエントマウスの第１の群にＥ７およびポリＩ：Ｃを含有する蛍光標識したＲＢＣ由来の小胞を注射した。レシピエントマウスの対照群にＰＢＳを注射した（対照）。

注射の１時間後に、注射したマウスの肝臓、肺、脾臓、および骨髄を回収し、標識したＳＱＺ処理したＲＢＣ由来の小胞の存在について検査した。回収した肝臓および脾臓から、細胞を抽出し、マクロファージ（Ｍφ；ＣＤ４５^＋、Ｆ４／８０^＋、ＣＤ１１ｂ^{－／ｌｏｗ}）、樹状細胞（ＤＣ；ＣＤ４５＋、Ｆ４／８０^－、ＣＤ１１ｃ^ｈｉ、ＭＨＣ－ＩＩ^ｈｉ）およびＢ細胞（ＣＤ４５＋、Ｆ４／８０^－、ＣＤ１９^＋、ＦＳＣ^ｌｏ、ＳＳＣ^ｌｏ）を、フローサイトメトリーによりこれらの蛍光標識によってアッセイしたように、ＲＢＣ由来の小胞の取込みについて分析した。
結果

図１１Ａに示したように、ＳＱＺ処理したＲＢＣ小胞は、主に肝臓および脾臓に取り込まれ、骨髄および肺ではそれより少なかった。図１１Ｂに示したように、肝臓および脾臓では、ＳＱＺ処理したＲＢＣの小胞は、主に、マクロファージ（Ｍφ）および樹状細胞によって貪食された。ＰＢＳを注射したマウス由来の脾臓または肝臓由来の細胞において観察されたバックグラウンドシグナルは、検出閾値を下回っていた。
（実施例１２）

この実施例は、部分的に、ローディングされた抗原および／またはアジュバントを含む無核細胞由来の小胞が、ｉｎｖｉｖｏで抗原特異的免疫応答を誘導し得ることを実証する。
材料および方法

０日目に、１０匹の雌のＯＴ－Ｉマウスと１０匹の雌のＯＴ－ＩＩマウスを屠殺した。脾臓およびリンパ節（鼠径部、腋窩、上腕、首、および腸間膜の）を回収し、それらから単一細胞懸濁液を生成した。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を免疫磁気によりＯＴ－Ｉマウス細胞から分離した。抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を免疫磁気によりＯＴ－ＩＩマウス細胞から分離した。ＯＶＡ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ４５．１マウスへの注射の前に、ＣＦＳＥで染色し、ここで、２．５ＭのＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかを、それぞれマウスごとに投与した。

１日目に、３匹の安楽死させたＢ６マウス由来のマウス血液からＲＢＣを単離し、マウスＲＢＣを、ＯＶＡ（２００μＭ）およびポリＩ：Ｃ（１ｍｇ／ｍｌ）の存在下でＳＱＺ処理して、抗原およびアジュバントを含有するＲＢＣ由来の小胞を生成した。次に、事前にＣＦＳＥ標識したＯＴ－ＩＣＤ８＋Ｔ細胞またはＯＴ－ＩＩＣＤ４＋Ｔ細胞を投与したＣＤ４５．１マウスに、ＰＢＳ（対照）または２５０ＭのローディングしたＲＢＣ由来の小胞を注射した。

４日目に、ＣＦＳＥ標識したＯＶＡ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を投与し、次に（ｉ）ＰＢＳ；または（ｉｉ）ＯＶＡおよびポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞のいずれかを注射したマウスを屠殺し、それらの脾臓を回収した。回収した脾臓を、フィルターに通して手動で分離させ、フローサイトメトリーによってＣＳＦＥ希釈によりＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を測定した。
結果

図１２Ａおよび１２Ｂに示したように、ＯＶＡおよびポリＩ：ＣをＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞を受けたマウスは、対照と比較した有意なＣＦＳＥ希釈によって示されるように、それぞれ強力なＯＴ－ＩＣＤ４＋Ｔ細胞とＯＴ－ＩＩＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を示した。これらの結果は、ローディングした抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞は、ｉｎｖｉｖｏで抗原特異的免疫応答を誘導することができることを示す。
（実施例１３）

この実施例は、部分的に、ローディングした抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞が、内因性抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導し得ることを実証する。
材料および方法

０日目に、ＲＢＣは、３匹の安楽死させたＢ６マウス由来のマウス血液から単離し、マウスＲＢＣを、（ｉ）ＯＶＡ（２００μＭ）；または（ｉｉ）ポリＩ：Ｃ（１ｍｇ／ｍｌ）；または（ｉｉｉ）ＯＶＡおよびポリＩ：Ｃの存在下で分配およびＳＱＺ処理して、抗原および／またはアジュバントを含有する各ＲＢＣ由来の小胞を生成した。次に、ＣＤ４５．１マウスに、ＰＢＳ（対照）または抗原および／もしくはアジュバントをローディングした２５０Ｍの各ＲＢＣ由来の小胞を注射した。

７日目に、ＰＢＳまたは各ＲＢＣ由来の小胞のいずれかを投与したマウスを屠殺し、それらの脾細胞を回収した。脾細胞をＳＩＩＮＦＥＫＬで再刺激し、ＣＤ４４に関する染色およびＩＦＮ－ガンマに関する細胞内サイトカイン染色に供し、任意の内因性Ｔ細胞活性化を検出した。
結果

図１３に示したように、抗原（ＯＶＡ）のみまたはアジュバント（ポリＩ：Ｃ）のみのいずれかをローディングしたＲＢＣ由来の小胞を受けたマウスは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を示さなかったが、一方、ＯＶＡとポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞を受けたマウスは、ＳＩＩＮＦＥＫＬで再刺激した際の全内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の中でのＣＤ４４^ｈｉおよびＩＦＮγ^＋細胞のパーセンテージの有意な増加によって示されるように、強力なＯＶＡ特異的Ｔ細胞増殖を示した。これらの結果は、抗原とアジュバントの両方をローディングした無核細胞由来の小胞が、内因性抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導し得ることを示す。
（実施例１４）

０日目に、１３匹の安楽死させたＢ６ドナーマウスのマウス血液から、フィコール勾配手順を使用してＲＢＣを単離し、１０億個／ｍＬの細胞濃度を有するＲＢＣ懸濁液を調製した。ＲＢＣ懸濁液を４つの群に分配し、これを（ｉ）アジュバント（ポリＩ：Ｃ）のみ、（ｉｉ）抗原（Ｅ７ＳＬＰ）のみ、または（ｉｉｉ）抗原およびアジュバント（Ｅ７ＳＬＰ＋ポリＩ：Ｃ）の存在下で、２．２μｍの直径の狭窄により５０ｐｓｉでＳＱＺ処理し；各ペイロードを含有するＲＢＣ由来の小胞を生成した。

次に、ＣＤ４５．１マウスの後眼窩（ＲＯ）に、ＰＢＳ（対照）、または抗原および／またはアジュバントをローディングした２億５千万個の各ＲＢＣ由来の小胞を注射した。

７日目に、マウスを屠殺し、それらの脾細胞を回収した。脾細胞をＥ７ペプチドで再刺激し、ＣＤ４４に関する染色およびＩＦＮ－ガンマに関する細胞内サイトカイン染色に供して、任意の内因性Ｔ細胞活性化を検出した。
結果

図１４に示したように、抗原（Ｅ７）のみまたはアジュバント（ポリＩ：Ｃ）のみのいずれかをローディングしたＲＢＣ由来の小胞を受けたマウスは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を示さなかったが、一方、Ｅ７およびポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞を受けたマウスは、Ｅ７ペプチドで再刺激した際の全ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の中でのＣＤ４４^ｈｉおよびＩＦＮγ^＋細胞のパーセンテージの有意な増加によって示されるように、強力なＥ７特異的Ｔ細胞増殖を示した。これらの結果は、抗原とアジュバントの両方をローディングした無核細胞由来の小胞が、内因性抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導し得ることを示す。
（実施例１５）

この実施例は、部分的に、ｉｎｖｉｖｏでの抗原特異的免疫応答に関する、抗原をローディングした無核細胞由来の小胞の様々なプライミングおよびブースティングレジメンを使用する効果を実証する。

１３匹の安楽死させたＢ６ドナーマウスのマウス血液から、フィコール勾配手順を使用してＲＢＣを単離し、得られたＲＢＣ懸濁液を、抗原およびアジュバント（１００μＭのＥ７ＳＬＰ＋１ｍｇ／ｍＬのポリＩ：Ｃ）の存在下でＳＱＺ処理して、抗原およびアジュバントを含有するＲＢＣ由来の小胞を生成した。

０日目に、ＣＤ４５．１マウスの後眼窩（ＲＯ）に、ＰＢＳ（対照）または抗原およびアジュバントをローディングしたＲＢＣ由来の小胞（プライム）をマウス１匹当たり２億５千万個の小胞で、注射した。ローディングしたＲＢＣ由来の小胞のプライミング投与を受けたマウスのサブセットは、（ｉ）２日目にブースティング用量のローディングしたＲＢＣ由来の小胞（２日目のブースト）；または（ｉｉ）２日目と７日目に２回のブースティング用量のローディングしたＲＢＣ由来の小胞（７日目のブースト）をさらに受けた。

最終免疫化（プライムおよびＰＢＳ対照では７日目；２日目のブーストでは９日目、７日目のブーストでは１４日目）の７日後に、各マウスを屠殺し、それらの脾細胞を回収した。脾細胞を、ＣＤ４４およびＥ７特異的テトラマー染色に供し、フローサイトメトリーによって測定して、内因性Ｅ７特異的Ｔ細胞の活性化を検出した。
結果

図１５に示したように、Ｅ７およびポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞を受けたマウスは、全ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の中でのＣＤ４４^ｈｉおよびテトラマー^＋細胞のパーセンテージのかなりの増加によって示されるように、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を示した。さらに、内因性Ｔ細胞活性化の誘導は、マウスがＥ７およびポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞のさらなるブースティング用量を受けるにつれて、ますます強力になることが観察された（図１５）。これらの結果は、抗原とアジュバントの両方をローディングした無核細胞由来の小胞が、内因性抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導することができ、この誘導が、プライムおよびブースト投与レジメンを使用することによって増強され得ることを示す。
（実施例１６）

この実施例は、部分的に、ローディングした腫瘍抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を腫瘍に対する予防免疫化として使用することができることを実証する。
材料および方法

雌のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙから得て、ワクチン接種に対するレシピエントマウスとして、またドナーマウスとしても使用した。０日目に、ＲＢＣをドナーマウスから抽出し、１００μＭのＥ７ＳＬＰおよび１ｍｇ／ｍＬのポリＩ：Ｃの存在下でＳＱＺ処理して、腫瘍抗原およびアジュバントを含有するＲＢＣ由来の小胞を生成した。次いで、レシピエントマウスに、（ｉ）ＰＢＳ、または（ｉｉ）腫瘍抗原およびアジュバントを含有する２億５千万個のＲＢＣ由来の小胞を投与した。

免疫化の７日後（７日目）に、ＨＰＶＥ７を発現するＴＣ－１腫瘍細胞をマウスの右側の背側脇腹の皮下に埋め込んだ。次いで、ＴＣ－１腫瘍成長を週に２回測定し、未処置マウスにおける腫瘍成長と４１日間比較した。腫瘍サイズを、式（（長さ×幅^２）／２）によって測定した。マウスの体重および生存率を６０日にわたって記録した。
結果

図１６Ａに示したように、腫瘍成長は、腫瘍が不変であった対照マウスと比較して、Ｅ７＋ポリＩ：Ｃをローディングした小胞で処置したマウスにおいて、完全に阻害された。図１６Ｂに示したように、ＰＢＳで処置したマウスは４１日目の後には生存していなかったが（０／１０）（生存期間中央値＝３４日）、一方、Ｅ７＋ポリＩ：Ｃをローディングした小胞で予防的に免疫化したすべてのマウスは（１０／１０）、少なくとも６０日間腫瘍を有さないままであった。これらのデータは、腫瘍抗原およびアジュバントをローディングした無核細胞由来の小胞が、腫瘍成長を効果的に妨げ、ＨＰＶに関連するがんの予防モデルにおける生存率を改善することができることを示す。
（実施例１７）

この実施例は、部分的に、ローディングした腫瘍抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を腫瘍に対する治療免疫化として使用することができることを実証する。
材料および方法

雌のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙから得て、ワクチン接種に対するレシピエントマウスとして、またドナーマウスとしても使用した。

０日目に、ＨＰＶＥ７を発現するＴＣ－１腫瘍細胞を、レシピエントマウスの皮下に埋め込んだ。１０日目に、ＲＢＣをドナーマウスから抽出し、１００μＭのＥ７ＳＬＰおよび１ｍｇ／ｍＬのＬＭＷポリＩ：Ｃの存在下で、２．２μｍの直径の狭窄により５０ｐｓｉでＳＱＺ処理して、腫瘍抗原およびアジュバントを含むＲＢＣ由来の小胞を生成した。次に、レシピエントマウスに、（ｉ）未処置のままにした／ＰＢＳを投与した（対照）；または（ｉｉ）１０億、２億５千万、または１億個のＥ７＋ポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞の用量を投与した。

ＴＣ－１の腫瘍成長を、腫瘍埋め込みの１週間後に開始して、週に２回測定し、未処置のマウスにおける腫瘍成長と４１日間比較した。腫瘍サイズを、式（（長さ×幅^２）／２）によって測定した。マウスの体重および生存率を５０日にわたって記録した。
材料および方法

図１７Ａに示したように、腫瘍成長は、腫瘍が不変であった対照マウスと比較して、１０億または２億５千万個のＥ７＋ポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞で処置したマウスにおいて有意に阻害され、注目すべきことに、１億個のＥ７＋ポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞で処置したマウスにおいても同様であった。図１７Ｂに示したように、対照マウスは４１日目の後には生存していなかったが（生存期間中央値＝３２．５日）、一方、１０億または２億５千万個のＥ７＋ポリＩ：Ｃをローディングした小胞で治療的に免疫化したマウスの半分より多くは、少なくとも４１日間生存可能であり、治療有効性は、投与した小胞の用量と相関した（１億個の小胞の投与に関しては生存期間中央値＝３９．５日；２億５千万個の小胞の投与に関しては４６日；１０億個の小胞の投与に関しては、４６日において生存期間中央値に達しなかった）。これらのデータは、腫瘍抗原およびアジュバントをローディングした無核細胞由来の小胞が、ＨＰＶに関連するがんの治療モデルにおいて、腫瘍退縮を誘導し、生存率を増強することができることを示す。
（実施例１８）

この実施例は、部分的に、腫瘍に対する治療免疫化としての有効性に関する、抗原をローディングした無核細胞由来の小胞の様々なプライミングおよびブースティングレジメンを使用する効果を実証する。
材料および方法

０日目に、ＨＰＶＥ７を発現するＴＣ－１腫瘍細胞を、レシピエントマウスの皮下に埋め込んだ。

ＲＢＣをドナーマウスから抽出し、１００μＭのＥ７ＳＬＰおよび１ｍｇ／ｍＬのＬＭＷポリＩ：Ｃの存在下で、２．２μｍの直径の狭窄により５０ｐｓｉでＳＱＺ処理して、腫瘍抗原およびアジュバントを含有するＲＢＣ由来の小胞を生成した。次に、レシピエントマウスに、（ｉ）未処置のままにした／ＰＢＳを投与した（対照）；または（ｉｉ）１０日目に１億個のＥ７＋ポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞の用量を投与した（プライム）；または（ｉｉｉ）１０日目および１２日目に、それぞれ、１億個のＥ７＋ポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞の用量を投与した（プライム／ブースト）；または（ｉｖ）１０日目、１２日目および１４日目に、それぞれ、１億個のＥ７＋ポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞の用量を投与した（プライム／ブースト／ブースト）。

ＴＣ－１の腫瘍成長を、腫瘍埋め込みの１週間後に開始して、週に２回測定し、未処置のマウスにおける腫瘍成長と４１日間比較した。腫瘍サイズを、式（（長さ×幅^２）／２）によって測定した。マウスの体重および生存率を５０日にわたって記録した。
結果

図１８Ａに示したように、注目すべきことに、腫瘍成長は、対照マウスと比較して、１億個のＥ７＋ポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞の１回用量で処置したマウスにおいて阻害されたが（プライム）；マウスが、Ｅ７＋ポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞の追加のブースティング用量で処置された場合には（プライム／ブースト、プライム／ブースト／ブースト）、腫瘍退縮がより有意であった。図１８Ｂに示したように、すべての対照マウスは４１日に死亡していたが（生存期間中央値＝３２．５日）、一方、１億個のＥ７＋ポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞の１処置用量を有するマウス（プライム）の約３０％は、４１日目に生存していた（生存期間中央値＝３９．５日）。さらなるブースティング用量によって４１日目の生存率が有意に増加し、ローディングした小胞の２回用量を受けたマウス（プライム／ブースト）に関しては５０％をより多くえる生存率およびローディングした小胞の３回用量を受けたマウス（プライム／ブースト／ブースト）に関しては１００％の生存率であった（両方とも生存期間中央値＝５２日）。これらのデータは、腫瘍抗原およびアジュバントをローディングした無核細胞由来の小胞が、ＨＰＶに関連するがんの治療モデルにおいて、腫瘍退縮を誘導し、生存率を増強することができ、腫瘍退縮および生存率が、さらなるブースティングレジメンにより改善され得ることを示す。
（実施例１９）

この実施例は、部分的に、ＳＱＺローディングされた無核細胞由来の小胞による免疫化後に、ＴＣ－１腫瘍の腫瘍微小環境におけるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の定量およびＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍成長モデルにおける腫瘍クリアランスとの相関を実証する。
材料および方法

０日目に、レシピエントマウスの皮下にＨＰＶＥ７を発現するＴＣ－１腫瘍細胞を埋め込んだ（１００μＬのＰＢＳ中５０ｋ個／マウス）。

１４日目に、ＲＢＣをドナーマウスから抽出し、（ｉ）１ｍｇ／ｍＬのポリＩ：Ｃのみ；または（ｉｉ）１００μＭのＥ７ＳＬＰおよび１ｍｇ／ｍＬのポリＩ：Ｃの存在下で、２．２μｍの直径の狭窄により５０ｐｓｉでＳＱＺ処理して、腫瘍抗原および／またはアジュバントを含有するＲＢＣ由来の小胞を生成した。次に、レシピエントマウスに、（ｉ）ＰＢＳを投与した（対照）；または（ｉｉ）２億５千万個のポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞を投与した；または（ｉｉｉ）２億５千万個のＥ７＋ポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞を投与した。

２１日目および２６日目（免疫化の７日後および１２日後）に、腫瘍を切除し、秤量し、そこから、各単一細胞懸濁液を生成した。単一細胞懸濁液を、フローサイトメトリーによって、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（ＣＤ４５^＋、Ｂ２２０^－、ＣＤ１１ｂ^－、ＣＤ４^＋、ＦｏｘＰ３^＋）、および抗原特異的腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）について評価した。
結果

図１９Ａに示したように、Ｅ７＋ポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞で免疫化したマウスは、ポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞を受けたマウスおよび対照マウスと比較して、免疫化の７日後と１２日後（すなわち、腫瘍の埋め込みの２１日後および２６日後）の両方で、腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージにおいて有意な増加を有した。Ｅ７＋ポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞を受けたマウスでは、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞の大多数は、テトラマー染色によって決定したように、Ｅ７抗原に対して特異的であった（ＣＤ８＋集団の７０％より多く）（図１９Ｂ）。各小胞による調節性Ｔ細胞活性化の相対量を調査するために、腫瘍におけるＥ７特異的テトラマー染色に対して陽性の細胞のパーセンテージも、腫瘍における調節性Ｔ細胞の量に対して正規化し（図１９Ｃ）、この結果は、Ｅ７＋ポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞による免疫化が、ポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞またはＰＢＳの投与と比較して、免疫化後の腫瘍微小環境における調節性Ｔ細胞と比較したＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴＩＬ）の存在のより有意な増加を実証する。図１９Ｄに示したように、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴＩＬ）の量は、腫瘍重量と逆相関することも観察され、腫瘍退縮がＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の流入と相関することを実証した。これらのデータは、ＴＣ－１マウス腫瘍モデルにおけるＥ７＋ポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞による免疫化によって、腫瘍に浸潤するＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増加がもたらされたことを実証する。腫瘍体積の相関する減少（図１９Ｄ）と連動したＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加は（図１９Ａ～１９Ｃ）、Ｅ７＋ポリＩ：ＣをローディングしたＲＢＣ由来の小胞が、Ｅ７特異的ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を拡大することによって、腫瘍負荷を低減したことを支持した。
（実施例２０）

この実施例は、部分的に、ヒト無核細胞由来の小胞におけるペイロードの送達、ゴースト形成および表面のホスファチジルセリンレベルにおけるＳＱＺに媒介される処理の効果を実証する。
材料および方法

ヒト赤血球細胞（ＲＢＣ）を健康なドナーから得て、得られたＲＢＣ懸濁液（２０億個／ｍＬ）を、未処置のままにしたか（ＳＱＺなしの細胞）、または蛍光的にタグ付けしたＥ７ＳＬＰ（抗原）およびポリＩ：Ｃ（アジュバント）の存在下でＳＱＺ処理して（６０ｐｓｉ、２．２μｍの直径の狭窄）、抗原およびアジュバントをローディングしたヒトＲＢＣ由来の小胞を生成した（Ｈ－ＳＱＺ－小胞）。

ＳＱＺに媒介される送達の有効性を定量するために、ＳＱＺなしの細胞およびＨ－ＳＱＺ－小胞を、フローサイトメトリーによって蛍光的にタグ付けしたＥ７ＳＬＰの存在について測定した。

ゴースト形成を定量するために、ＳＱＺなしの細胞およびＨ－ＳＱＺ－小胞をフローサイトメトリーに供し、実施例６および図６Ｃに記載した手順を使用して、前方散乱および側方散乱について分析した。

表面のホスファチジルセリンレベルに関するＳＱＺに媒介される処理の影響を定量するために、ＳＱＺなしの細胞およびＨ－ＳＱＺ－小胞を、実施例５に記載した手順を使用して、アネキシンＶで染色し、表面のホスファチジルセリンのレベルを、フローサイトメトリーによって測定した。
結果

図２０Ａに示したように、ヒトＲＢＣのＳＱＺ処理によって、その大多数がゴーストプロファイルを示すＲＢＣ由来の小胞（Ｈ－ＳＱＺ－小胞）が得られた。対照的に、非常に低い比率の未処置のヒトＲＢＣ（ＳＱＺなしの細胞）しか、ゴーストプロファイルを示さなかった。さらに、図２０Ｂに示したように、ペイロードの存在下でのヒトＲＢＣのＳＱＺ処理は、得られたＲＢＣ由来の小胞（Ｈ－ＳＱＺ－小胞）の高いパーセンテージに対して有効な送達を示した。図２０Ｃに示したように、ヒトＲＢＣのＳＱＺ処理は、その大多数が表面ホスファチジルセリン（アネキシンＶ＋）を示すＲＢＣ由来の小胞（Ｈ－ＳＱＺ－小胞）をもたらした。対照的に、非常に低い比率の未処置のヒトＲＢＣ（ＳＱＺなしの細胞）しか、表面ホスファチジルセリンを示さなかった。
（実施例２１）

ＳＱＺ処理したヒト無核細胞由来の小胞が、抗原提示およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の活性化をもたらす機序について評価した。抗原提示細胞による無核細胞由来の小胞の取込みの動態を理解することが重要である。この実施例は、部分的に、ｉｎｖｉｔｒｏで、ＳＱＺ処理したヒト無核細胞由来の小胞を内在化させる際の、ヒト単球由来の樹状細胞（ＭｏＤＣ）の効率を実証する。
材料および方法

ヒト赤血球細胞（ＲＢＣ）を健康なドナーから得て、得られたＲＢＣ懸濁液（２０億個／ｍＬ）をＰＫＨ－２６で蛍光標識し、未処置のままにしたか、またはＥ７ＳＬＰの存在下でＳＱＺ処理して（６０ｐｓｉ、２．２μｍの直径の狭窄）、抗原をローディングしたヒトＲＢＣ由来の小胞（Ｈ－ＳＱＺ－小胞）を生成した。ＳＱＺ処理したヒト無核細胞由来の小胞を内在化させる際のＭｏＤＣの有効性を定量するために、ＭｏＤＣを９６ウェルプレートに播種し、３７℃または０℃（氷上）で終夜、小胞濃度のスペクトルのＨ－ＳＱＺ－小胞と共にインキュベートした。次に、ＭｏＤＣを単離し、フローサイトメトリーによって、蛍光光度の増加について分析した。
結果

図２１に示したように、Ｈ－ＳＱＺ小胞と共にインキュベートした場合、ＭｏＤＣは、０℃よりも３７℃で、Ｈ－ＳＱＺ－小胞の内在化において有意により効率的であった。さらに、Ｈ－ＳＱＺ－小胞の内在化は、播種したＭｏＤＣの１ウェル当たり最大少なくとも１億個の小胞のＨ－ＳＱＺ小胞の濃度に依存することが観察された。
（実施例２２）

この実施例は、部分的に、ローディングした抗原およびアジュバントを含むヒト無核細胞由来の小胞が、ｉｎｖｉｔｒｏで、抗原特異的免疫応答を誘導することができることを実証する。
材料および方法

ヒト赤血球細胞（ＲＢＣ）を健康なドナーから得て、得られたＲＢＣ懸濁液（２０億個／ｍＬ）をＣＭＶ抗原（ｐｐ６５）の存在下でＳＱＺ処理して、ＣＭＶ抗原ｐｐ６５をローディングしたヒトＲＢＣ由来の小胞（Ｈ－ＳＱＺ－ＣＭＶ－小胞）を生成した。ｐｐ６５特異的ＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞を、外因性アジュバント（１０μｇ／ｍＬのポリＩ：Ｃ）、および（ｉ）培地（陰性対照）、（ｉｉ）ｐｐ６５ペプチド（陽性対照）、または（ｉｉｉ）Ｈ－ＳＱＺ－ＣＭＶ－小胞のいずれかと共培養し；３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後に、各条件から上清を回収し、ＩＦＮ－γ産生のレベルをＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡによって評価した。
結果

図２２に示したように、ＣＭＶ抗原特異的ＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞によるＩＦＮ－γの産生および分泌は、培地と共にインキュベートした（陰性対照）レスポンダーＴ細胞での最小限のＩＦＮ－γ分泌と比較して、Ｈ－ＳＱＺ－ＣＭＶ－小胞またはＣＭＶ抗原ペプチド（陽性対照）と共培養した場合に有意に増加した。これらの結果は、ローディングした抗原およびアジュバントを含むヒト無核細胞由来の小胞が、ｉｎｖｉｔｒｏで、抗原特異的免疫応答を誘導することができることを示す。
（実施例２３）

この実施例は、部分的に、マウス無核細胞由来の小胞におけるペイロードの送達、ゴースト形成および表面のホスファチジルセリンレベルにおけるＳＱＺに媒介される処理の効果を実証する。
材料および方法

ＲＢＣを、安楽死させたＢ６ドナーマウスのマウス血液から、フィコール勾配手順を使用して単離し、１０億個／ｍＬの細胞濃度を有するＲＢＣ懸濁液を調製した。得たＲＢＣ懸濁液を、（ｉ）蛍光標識したＯＶＡまたは蛍光標識したＩｇＧと共にインキュベートし（未処理のＲＢＣ；ＳＱＺなし）、または（ｉｉ）蛍光標識したＯＶＡまたは蛍光標識したＩｇＧの存在下でＳＱＺ処理して、各ペイロードをローディングしたヒトＲＢＣ由来の小胞を生成した（ＳＱＺ）。

ＳＱＺに媒介される送達の有効性を定量するために、未処理のＲＢＣ（ＳＱＺなし）およびＳＱＺ処理したＲＢＣ小胞（ＳＱＺ）を、フローサイトメトリーによって、蛍光的にタグ付けしたペイロードの存在について測定した。

ゴースト形成を定量するために、未処理のＲＢＣ（ＳＱＺなし）およびＳＱＺ処理したＲＢＣ小胞（ＳＱＺ）を、実施例６および図６Ｃに記載した手順を使用して、フローサイトメトリーに供し、前方散乱および側方散乱について分析した。

表面のホスファチジルセリンレベルに関するＳＱＺに媒介される処理の影響を定量するために、未処理のＲＢＣ（ＳＱＺなし）およびＳＱＺ処理したＲＢＣ小胞（ＳＱＺ）を、実施例５に記載した手順を使用して、アネキシンＶで染色し、表面のホスファチジルセリンのレベルをフローサイトメトリーによって測定した。
結果

図２３Ａに示したように、ペイロードの存在下でのマウスＲＢＣのＳＱＺ処理は、ＯＶＡまたはＩｇＧのいずれかの、得られたＲＢＣ由来の小胞（ＳＱＺ）の高パーセンテージ（約８０％）への有効な送達を示した。図２３Ｂに示したように、マウスＲＢＣのＳＱＺ処理は、その大多数がゴーストプロファイルを示すＲＢＣ由来の小胞をもたらした。対照的に、非常に低い比率の未処置のＲＢＣ（ＳＱＺなし）しか、ゴーストプロファイルを示さなかった。さらに、図２３Ｃに示したように、未処理のＲＢＣ（ＳＱＺなし）またはＲＢＣ由来の小胞（ＳＱＺ）由来のゴーストおよび非ゴースト集団を、表面のホスファチジルセリンレベルについて分析した。未処理のＲＢＣのおよそ２５％のゴースト集団しか表面のホスファチジルセリンを示さなかったが、ＲＢＣ由来の小胞内のゴースト集団のほとんどすべては、表面のホスファチジルセリンを示した。一方、未処理のＲＢＣにおける非ゴースト集団はいずれも、表面のホスファチジルセリンを事実上示さなかったが、一方、ＲＢＣ由来の小胞における非ゴースト集団の約１５％が表面のホスファチジルセリンを示した。
（実施例２４）

この実施例は、部分的に、ウイルスキャプシドに対するｉｎｖｉｖｏでの抗原依存性寛容を誘導する、ＳＱＺによって送達された抗原を含有する無核細胞由来の小胞の能力を実証する。
材料および方法

ウイルスキャプシドに対するｉｎｖｉｖｏでの抗原依存性寛容を誘導する、ＳＱＺによって送達された抗原を含有する無核細胞由来の小胞の能力を決定するために、ウイルスおよびＡＡＶ２の最小エピトープをＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞で処置した動物由来の脾細胞の応答をＩＦＮ－γ ＩＣＳによって測定した。具体的には、０日目に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊレシピエントマウスに、ＡＡＶ２ＧＦＰウイルス（ＧＦＰを発現するＡＡＶ２ウイルス；マウス１匹当たり１００μＬのＰＢＳにおいて、１ｍＬ当たり１Ｅ１２個のウイルス粒子；１群当たり２０匹のマウス）またはＰＢＳ単独（１群あたり５匹のマウス）を注射した（すべて、後眼窩（ＲＯ）に投与した）。７日目と１１日目に、マウスに、ＡＡＶ２キャプシドに関する免疫原性ペプチド（ＳＮＹＮＫＳＶＮＶ、２００μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートしたＲＢＣ（ペプチド）またはＳＮＹＮＫＳＶＮＶをＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞（ＳＱＺ）のいずれかを注射した（１００Ｍ／マウス）。１５日目に、マウスのＲＯに、ＡＡＶ２ＮａｎｏＬｕｃウイルス（可溶性ルシフェラーゼを発現するＡＡＶ２ウイルス；マウス１匹当たり１００μＬのＰＢＳにおいて、１ｍＬ当たり１Ｅ１２個のウイルス粒子；１群当たり２０匹のマウス）またはＰＢＳ単独（５匹のマウス）を、それぞれ注射した。２回目に投与したウイルスを、最初のウイルス投与からのＧＦＰ導入遺伝子に対するいずれの免疫応答も回避するために、異なる導入遺伝子で標識した。２２、２９、３６、４３日目に、１００～２００μＬの血液を頬出血により採取し、血清中のルシフェラーゼレベルを分光光度法によって測定した。さらに、４３日目に、マウスを屠殺し、それらの脾臓を回収し、単離し、抗原ペプチドで再刺激し；サイトカインＩＦＮ－γのレベルを細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）およびフローサイトメトリーによって測定した（図２４Ａ）。
結果

ＡＡＶ２－ＮＬによる刺激の際にナイーブ動物において観察されたＩＦＮ－γ応答は存在しなかったが、ＩＦＮ－γレベルの有意な増加が、ＳＮＹＮＫＳＶＮＶと共にインキュベートしたＲＢＣで処置したマウス（ペプチド）において観察され（Ｐ＜０．００５、ナイーブと比較して）、一方、ＳＮＹＮＫＳＶＮＶをＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞で処置したマウス（ＳＱＺ）は、ナイーブ動物のものと同様に、ＡＡＶ２ペプチドに対する最小限の免疫応答しか示さず（図２４Ｂ）、ＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞がローディングした抗原に対して特異的なサイトカイン応答を低下させ得ることを示した。さらに、血清中ルシフェラーゼの測定値は、インキュベートしたＲＢＣで処置したマウス（ペプチド）が、試験した時間経過にわたって測定可能なレベルのルシフェラーゼを示さなかったことを示し、これらの動物においてＡＡＶ２に対する寛容が誘導されず、ＡＡＶ２－ＮＬの繰り返し投与によって導入遺伝子の発現がもたらされなかったことを示唆した。比較すると、ＳＱＺローディングしたＲＢＣ小胞で処置したマウスは、血清中ルシフェラーゼレベルの１００～２００％の増加を示し（＃Ｐ＜０．００５ペプチドと比較して）、ＡＡＶ２に対する寛容が、繰り返し投与の際のＡＡＶ－ＮＬの発現の成功を可能にしたことを示した（図２４Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ウイルスキャプシド抗原をローディングした無核細胞由来の小胞が、ウイルス抗原特異的免疫寛容を誘導することができ、治療剤としてのＡＡＶベクターの繰り返し投与を可能にするという観察を支持する。
（実施例２５）

この実施例は、部分的に、ＳＱＺによって送達された抗原を含有する無核細胞由来の小胞の、ｉｎｖｉｖｏで、抗体に対する抗原依存性寛容を誘導する能力を実証する。
材料および方法

ＳＱＺによって送達された抗原を含有する無核細胞由来の小胞の、ｉｎｖｉｖｏで、抗体に対する抗原依存性寛容を誘導する能力を決定するために、ラット抗体（ＩｇＧ２ｂ）を、ＩｇＧ２ｂをＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞で処置したマウスに繰り返し投与し、循環抗体のレベルを経時的に定量した。具体的には、－６日目および－２日目に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊレシピエントマウスに、（ｉ）ＰＢＳ（対照；５匹のマウス／群）、（ｉｉ）遊離ラットＩｇＧ２ｂ（２００μｇ／ｍＬ；５匹のマウス／群）、または（ｉｉｉ）ＳＱＺによってラットＩｇＧ２ｂをローディングしたＲＢＣ由来の小胞（１００Ｍ／マウス；１０匹のマウス／群）を注射した。ラットＩｇＧ２ｂの次のＩＶ注射は、図２５Ａに例示したスケジュールに従って、０日目～１４日目および６３日目～７０日目に繰り返し行い、血清中の循環ラットＩｇＧ２ｂのレベルを、ＥＬＩＳＡによって、２０日目および７６日目に評価した。
結果

図２５Ｂおよび２５Ｃに示したように、ＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞で処置したマウスのみが、循環中の検出可能レベルのラットＩｇＧの統計的に有意な増加から観察されたように、ラットＩｇＧに対する免疫反応の低下を示した。この増加した循環ラットＩｇＧは、より早い時点でも観察され（２０日；＃Ｐ＜０．００５）（図２５Ｂ）、７０日にわたるより長い処置レジメン後であっても維持された（７６日；^＊Ｐ＜０．０５）（図２５Ｃ）。まとめると、このデータは、ＳＱＺローディングした無核細胞由来の小胞を使用して、ｉｎｖｉｖｏで、抗原依存性寛容を誘導し、延長された期間、抗薬物抗体反応を克服し、潜在的に免疫原性の生物製剤の繰り返し投与を可能にすることができることを示す。
（実施例２６）

この実施例は、部分的に、ＳＱＺによって送達された抗原を含有する無核細胞由来の小胞の、ｉｎｖｉｖｏで、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）に関連する抗原に対する抗原依存性寛容を誘導する能力を実証する。
材料および方法

ＳＱＺローディングされた抗原を含有する無核細胞由来の小胞の、ｉｎｖｉｖｏで、糖尿病関連抗原に対する抗原依存性寛容を誘導する能力を決定するために、Ｔ１Ｄの２種の異なる動物モデルを用いた：インスリンＢ９－２３（ＩｎｓＢ９－２３）モデルおよびＢＤＣ２．５移入モデル。

ＩｎｓＢ９－２３モデルでは、ＩｎｓＢ９－２３に対する寛容化の大きさを、ＩｎｓＢ９－２３ペプチドをＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞で処置したマウスの脾細胞におけるＩｎｓＢ９－２３ペプチドによる再刺激後のサイトカイン産生によって決定した。具体的には、０日目に、ＮＯＤマウスを、（ｉ）ビヒクル（対照）、（ｉｉ）対照ペプチドをローディングしたＲＢＣ由来の小胞（２００μＬ中動物１匹当たり１Ｂ個の細胞）（ＳＱＺＨＥＬ；８０μＭ）または（ｉｉｉ）蛍光的にタグ付けしたＩｎｓＢ９－２３をＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞（ＳＱＺＦＡＭ；７５μＭ）のいずれかで処置した。７日目に、マウスに、ＩｎｓＢ９－２３およびフロイント完全アジュバントの１：１エマルション（１ｍｇ／ｍＬ－１００μＬ）をチャレンジした。１４日目に、鼠径部リンパ節を回収し、ＩｎｓＢ９－２３を再度チャレンジし、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２について細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を行い、フローサイトメトリーによって測定した（図２６Ａ）。

ＢＤＣ２．５移入モデルでは、寛容化の大きさを、ペプチドミメオトープ（ｍｉｍｅｏｔｏｐｅ）１０４０－ｐ３１をＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞で処置した動物におけるＴ１Ｄ発症の遅延によって測定した。具体的には、Ｔ１Ｄの急速な発症を誘導するために、リンパ節を雌のＢＤＣ２．５ドナーマウスから最初に回収し（３Ｍの細胞／ｍＬ）、アセチル化ｐ３１ペプチド（Ｄ１０ｖ２中５００ｎＭ）と共に３日間培養することによって活性化した。次いで、－１日目に、ＢＤＣ２．５Ｔ細胞を培養したリンパ節から回収し、ＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントマウスに養子移入した（１Ｅ６個の細胞／マウス；５匹のマウス／群）。０日目に、赤血球細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤドナーマウスから回収し、１０４０－ｐ３１ミメオトープペプチドをＳＱＺローディングし、ローディングしたＲＢＣ由来の小胞（ＳＱＺ；１Ｂ個の細胞／マウス）またはビヒクル（対照；２００μＬのＰＢＳ）をレシピエントＮＯＤ／ＳＣＩＤに注射した。マウスから毎日採血し、血中グルコースの循環量を定量した（図２６Ｃ）。記録された血中グルコースが、２回連続して２５０ｍｇ／ｄＬをより多くえる測定値であることによって、糖尿病の発症を定義した。４５日間の期間、または疾患が発症するまでのいずれか早い方の間、動物をモニターした。
結果

ＩｎｓＢ９－２３モデルでは、この結果は、ＳＱＺＨＥＬマウス（＃Ｐ＜０．００５）またはナイーブマウス（対照）（＃Ｐ＜０．００５）のいずれかと比較して、ＩｎｓＢ９－２３をＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞で処置したマウス（ＳＱＺＦＡＭ）に由来する再刺激した脾細胞における炎症性サイトカインＩＦＮ－γおよびＩＬ－２のレベルの統計的に有意な減少を示した（図２６）。この結果は、Ｔ１Ｄに関連する抗原をＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞で処置したマウスにおける抗原特異的サイトカイン応答の有意な低下を示した。

ＢＤＣ２．５移入モデルでは、疾患の発症は、対照で処置した動物に対して、１０４０－ｐ３１をＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞で処置したマウスにおいて、平均で約３５日遅延した（図２６Ｄ、図２６Ｅ）。この遅延した発症は、１０４０－ｐ３１をＳＱＺローディングしたＲＢＣ由来の小胞で処置したマウスにおける、１０４０－ｐ３１に対する寛容の増加を示した。

まとめると、これらのデータは、自己免疫関連自己抗原のＲＢＣ由来の小胞へのＳＱＺに媒介される送達を使用して、免疫応答および自己免疫疾患の発症を妨げることができるという知見を支持する。

Claims

抗原を無核細胞由来の小胞内に送達するための方法であって、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原の通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原を前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原と共にインキュベートするステップと
を含む方法。
前記インプット無核細胞が、アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の方法。
アジュバントを無核細胞由来の小胞内に送達するための方法であって、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記アジュバントの通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記アジュバントを前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記アジュバントと共にインキュベートするステップと
を含む方法。
前記インプット無核細胞が、抗原をさらに含む、請求項３に記載の方法。
抗原およびアジュバントを無核細胞由来の小胞内に送達するための方法であって、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原および前記アジュバントの通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原および前記アジュバントを前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原および前記アジュバントと共にインキュベートするステップと
を含む方法。
個体における抗原に対する免疫応答を刺激するための方法であって、前記方法が、前記個体に、抗原を含む無核細胞由来の小胞を有効量投与するステップを含み、前記抗原を含む前記無核細胞由来の小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原の通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原を前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原と共にインキュベートするステップと
を含むプロセスによって調製される、方法。
アジュバントを前記個体に全身投与するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
前記アジュバントが、前記無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に、全身投与される、請求項７に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、アジュバントを含む、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
個体における抗原に対する免疫応答を刺激するための方法であって、前記方法が、前記個体に、抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を有効量投与するステップを含み、前記抗原および前記アジュバントを含む前記無核細胞由来の小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原および前記アジュバントの通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原および前記アジュバントを前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原および前記アジュバントと共にインキュベートするステップと
を含むプロセスによって調製される、方法。
アジュバントを前記個体に全身投与するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
前記アジュバントが、前記無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に、全身投与される、請求項１１に記載の方法。
個体における疾患を処置するための方法であって、前記方法が、前記個体に、疾患関連抗原を含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、前記抗原に対する免疫応答が、前記疾患の状態を軽快させ、前記疾患関連抗原を含む前記無核細胞由来の小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原の通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原を前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原と共にインキュベートするステップと
を含むプロセスによって調製される、方法。
個体における疾患を予防するための方法であって、前記方法が、前記個体に、疾患関連抗原を含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、前記抗原に対する免疫応答が、前記疾患の発症を予防し、前記疾患関連抗原を含む前記無核細胞由来の小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原の通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原を前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原と共にインキュベートするステップと
を含むプロセスによって調製される、方法。
抗原に対して個体にワクチン接種するための方法であって、前記方法が、前記個体に、前記抗原を含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、前記抗原を含む前記無核細胞由来の小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原の通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原を前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原と共にインキュベートするステップと
を含むプロセスによって調製される、方法。
アジュバントを前記個体に全身投与するステップをさらに含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
前記アジュバントが、前記無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に、全身投与される、請求項１６に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、アジュバントを含む、請求項１３～１７に記載の方法。
個体における疾患を処置するための方法であって、前記方法が、前記個体に、疾患関連抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、前記抗原に対する免疫応答が、前記疾患の状態を軽快させ、前記疾患関連抗原および前記アジュバントを含む前記無核細胞由来の小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原および前記アジュバントを前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原および前記アジュバントと共にインキュベートするステップと
を含むプロセスによって調製される、方法。
個体における疾患を予防するための方法であって、前記方法が、前記個体に、疾患関連抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、前記抗原に対する免疫応答が、前記疾患の発症を予防し、疾患関連抗原およびアジュバントを含む前記無核細胞由来の小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原および前記アジュバントを前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原および前記アジュバントと共にインキュベートするステップと
を含むプロセスによって調製される、方法。
抗原に対して個体にワクチン接種するための方法であって、前記方法が、前記個体に、前記抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を投与するステップを含み、前記抗原および前記アジュバントを含む前記無核細胞由来の小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原および前記アジュバントを前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原および前記アジュバントと共にインキュベートするステップと
を含むプロセスによって調製される、方法。
個体における疾患を処置するための方法であって、疾患関連抗原に対する免疫応答が、前記疾患の状態を軽快させ、前記方法が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原の通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原を前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原と共にインキュベートし、これにより、前記抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、
ｃ）前記抗原を含む前記無核細胞由来の小胞を前記個体に投与するステップと
を含む、方法。
個体における疾患を予防するための方法であって、疾患関連抗原に対する免疫応答が、前記疾患の発症を予防し、前記方法が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原の通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原を前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原と共にインキュベートし、これにより、前記抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、
ｃ）前記抗原を含む前記無核細胞由来の小胞を前記個体に投与するステップと
を含む、方法。
抗原に対して個体にワクチン接種するための方法であって、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原の通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原を前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原と共にインキュベートし、これにより、前記抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、
ｃ）前記抗原を含む前記無核細胞由来の小胞を前記個体に投与するステップと
を含む方法。
小胞外アジュバントを前記個体に全身投与するステップをさらに含む、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の方法。
前記小胞外アジュバントが、前記無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に投与される、請求項２５に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、アジュバントを含む、請求項１９～２４に記載の方法。
個体における疾患を処置するための方法であって、疾患関連抗原に対する免疫応答が、前記疾患の状態を軽快させ、前記方法が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記疾患関連抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原および前記アジュバントを前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原および前記アジュバントと共にインキュベートし、これにより、前記抗原および前記アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、
ｃ）前記抗原および前記アジュバントを含む前記無核細胞由来の小胞を、前記個体に投与するステップ
を含む、方法。
個体における疾患を予防するための方法であって、疾患関連抗原に対する免疫応答が、前記疾患の発症を予防し、前記方法が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原および前記アジュバントを前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原および前記アジュバントと共にインキュベートし、これにより、前記抗原および前記アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、
ｃ）前記抗原および前記アジュバントを含む前記無核細胞由来の小胞を、前記個体に投与するステップ
を含む、方法。
抗原に対して個体にワクチン接種するための方法であって、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原およびアジュバントの通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原および前記アジュバントを前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原および前記アジュバントと共にインキュベートし、これにより、前記抗原および前記アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと、
ｃ）前記抗原および前記アジュバントを含む前記無核細胞由来の小胞を、前記個体に投与するステップ
を含む方法。
小胞外アジュバントを前記個体に全身投与するステップをさらに含む、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
前記小胞外アジュバントが、前記無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に投与される、請求項３１に記載の方法。
前記疾患が、がん、感染性疾患またはウイルス関連疾患である、請求項１３～３２のいずれか一項に記載の方法。
前記無核細胞由来の小胞が、前記個体にとって自家である、請求項６～３３のいずれか一項に記載の方法。
前記無核細胞由来の小胞が、前記個体にとって同種異系である、請求項６～３３のいずれか一項に記載の方法。
前記無核細胞由来の小胞が、医薬製剤中に存在する、請求項６～３５のいずれか一項に記載の方法。
前記無核細胞由来の小胞が、全身投与される、請求項６～３６のいずれか一項に記載の方法。
前記無核細胞由来の小胞が、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内または腹腔内投与される、請求項６～３７のいずれか一項に記載の方法。
前記無核細胞由来の小胞が、治療剤と組み合わせて、前記個体に投与される、請求項６～３８のいずれか一項に記載の方法。
前記治療剤が、前記無核細胞由来の小胞の前に、その後にまたはそれと同時に投与される、請求項３９に記載の方法。
前記治療剤が、免疫チェックポイント阻害剤および／またはサイトカインである、請求項３９または４０に記載の方法。
前記サイトカインが、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２またはＩＬ－１５のうち１種または複数である、請求項４１に記載の方法。
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ１、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）およびＢＴＬＡのうちいずれか１種に標的化される、請求項４１に記載の方法。
前記抗原が、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされ得る、請求項１、２または４～４３のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、ＣＤ－１拘束性抗原である、請求項１、２または４～４３のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、疾患関連抗原である、請求項１、２または４～４５のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、腫瘍抗原である、請求項１、２または４～４６のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、ライセートに由来する、請求項１、２または４～４７のいずれか一項に記載の方法。
前記ライセートが、腫瘍ライセートである、請求項４８に記載の方法。
前記抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である、請求項１、２または４～４６のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、微生物である、請求項１、２または４～４６のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、ポリペプチドである、請求項１、２または４～５０のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、脂質抗原である、請求項１、２または４～５０のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、糖鎖抗原である、請求項１、２または４～５０のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、修飾された抗原である、請求項１、２または４～５４のいずれか一項に記載の方法。
前記修飾された抗原が、ポリペプチドと融合された抗原を含む、請求項５５に記載の方法。
前記修飾された抗原が、標的化ペプチドと融合された抗原を含む、請求項５６に記載の方法。
前記修飾された抗原が、脂質と融合された抗原を含む、請求項５５に記載の方法。
前記修飾された抗原が、炭水化物と融合された抗原を含む、請求項５５に記載の方法。
前記修飾された抗原が、ナノ粒子と融合された抗原を含む、請求項５５に記載の方法。
複数の抗原が、前記無核細胞由来の小胞に送達される、請求項１～６０のいずれか一項に記載の方法。
前記アジュバントが、ＣｐＧＯＤＮ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、ポリリシンおよびカルボキシメチルセルロースにより安定化されたポリイノシン・ポリシチジル酸（ＨＩＬＴＯＮＯＬ（登録商標））、イミキモド、レシキモド、ならびに／またはリポ多糖（ＬＰＳ）である、請求項２～５、７～１２、１６～２１、２５～６１のいずれか一項に記載の方法。
前記アジュバントが、低分子量ポリＩ：Ｃである、請求項６２に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、赤血球細胞である、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。
前記赤血球細胞が、赤血球である、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。
前記赤血球細胞が、網状赤血球である、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、血小板である、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１～６７のいずれか一項に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタまたはウサギ細胞である、請求項１～６８のいずれか一項に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、ヒト細胞である、請求項１～６８のいずれか一項に記載の方法。
前記狭窄が、マイクロ流体チャネル内に含有される、請求項１～７０のいずれか一項に記載の方法。
前記マイクロ流体チャネルが、複数の狭窄を含む、請求項７１に記載の方法。
前記複数の狭窄が、直列におよび／または並列に配置されている、請求項７２に記載の方法。
前記狭窄が、複数の微小な支柱の間；アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間；または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する、請求項１～７３のいずれか一項に記載の方法。
前記狭窄が、ポアである、またはポア内に含有される、請求項１～７０のいずれか一項に記載の方法。
前記ポアが、表面に含有される、請求項７５に記載の方法。
前記表面が、フィルターである、請求項７６に記載の方法。
前記表面が、膜である、請求項７６に記載の方法。
前記狭窄サイズが、懸濁液における前記インプット無核細胞の前記直径の関数である、請求項１～７６のいずれか一項に記載の方法。
前記狭窄サイズが、懸濁液における前記インプット無核細胞の前記直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である、請求項１～７９のいずれか一項に記載の方法。
前記狭窄が、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する、請求項１～７９のいずれか一項に記載の方法。
前記狭窄が、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの幅を有する、請求項１～７９のいずれか一項に記載の方法。
前記狭窄が、約２．２μｍの幅を有する、請求項１～７９のいずれか一項に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、約１０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、前記狭窄に通される、請求項１～８３のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞懸濁液が、前記狭窄に通す前に、それと同時発生的にまたはその後に、前記抗原と接触させられる、請求項１～８４のいずれか一項に記載の方法。
抗原を含む無核細胞由来の小胞であって、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原の通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原を前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原と共にインキュベートし、これにより、前記抗原を含む前記無核細胞由来の小胞を生成するステップと
を含むプロセスによって調製される、無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞が、アジュバントを含む、請求項８６に記載の無核細胞由来の小胞。
アジュバントを含む無核細胞由来の小胞であって、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記アジュバントの通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記アジュバントを前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記アジュバントと共にインキュベートし、これにより、前記アジュバントを含む前記無核細胞由来の小胞を生成するステップと
を含むプロセスによって調製される、無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞が、抗原を含む、請求項８８に記載の無核細胞由来の小胞。
抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞であって、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原および前記アジュバントの通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原および前記アジュバントを前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原および前記アジュバントと共にインキュベートし、これにより、前記抗原および前記アジュバントを含む前記無核細胞由来の小胞を生成するステップと
を含むプロセスによって調製される、無核細胞由来の小胞。
赤血球細胞由来の小胞または血小板由来の小胞である、請求項８６～９０のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記赤血球細胞由来の小胞が、赤血球由来の小胞または網状赤血球由来の小胞である、請求項９１に記載の無核細胞由来の小胞。
前記抗原が、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされ得る、請求項８６、８７または８９～９２のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記抗原が、ＣＤ－１拘束性抗原である、請求項８６、８７または８９～９２のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記抗原が、疾患関連抗原である、請求項８６、８７または８９～９４のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記抗原が、腫瘍抗原である、請求項８６、８７または８９～９５のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記抗原が、ライセートに由来する、請求項８６、８７または８９～９６のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記ライセートが、腫瘍ライセートである、請求項９７に記載の無核細胞由来の小胞。
前記抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である、請求項８６、８７または８９～９５のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記抗原が、微生物である、請求項８６、８７または８９～９５のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記抗原が、ポリペプチドである、請求項８６、８７または８９～９９のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記抗原が、脂質抗原である、請求項８６、８７または８９～９９のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記抗原が、糖鎖抗原である、請求項８６、８７または８９～９９のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記抗原が、修飾された抗原である、請求項８６、８７または８９～１０３のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記修飾された抗原が、ポリペプチドと融合された抗原を含む、請求項１０４に記載の無核細胞由来の小胞。
前記修飾された抗原が、標的化ペプチドと融合された抗原を含む、請求項１０５に記載の無核細胞由来の小胞。
前記修飾された抗原が、脂質と融合された抗原を含む、請求項１０４に記載の無核細胞由来の小胞。
前記修飾された抗原が、炭水化物と融合された抗原を含む、請求項１０４に記載の無核細胞由来の小胞。
前記修飾された抗原が、ナノ粒子と融合された抗原を含む、請求項１０４に記載の無核細胞由来の小胞。
複数の抗原が、前記無核細胞由来の小胞に送達される、請求項８６、８７または８９～１０９のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記アジュバントが、ＣｐＧＯＤＮ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、ポリリシンおよびカルボキシメチルセルロースにより安定化されたポリイノシン・ポリシチジル酸（ＨＩＬＴＯＮＯＬ（登録商標））、イミキモド、レシキモド、ならびに／またはＬＰＳである、請求項８７～１１０のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記アジュバントが、低分子量ポリＩ：Ｃである、請求項１１１に記載の無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞が、赤血球細胞である、請求項８６～１１２のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞が、赤血球である、請求項８６～１１２のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞が、網状赤血球である、請求項８６～１１２のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞が、血小板である、請求項８６～１１２のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項８６～１１６のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞が、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタまたはウサギ細胞である、請求項８６～１１７のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞が、ヒト細胞である、請求項８６～１１７のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
哺乳動物への投与後の前記無核細胞由来の小胞の半減期が、前記哺乳動物への投与後の前記インプット無核細胞の半減期と比較して減少している、請求項８６～１１９のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記無核細胞由来の小胞のヘモグロビン含量が、前記インプット無核細胞のヘモグロビン含量と比較して減少している、請求項８６～１１５または１１７～１２０のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記無核細胞由来の小胞のＡＴＰ産生が、前記インプット無核細胞のＡＴＰ産生と比較して減少している、請求項８６～１２０のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
次の特性：
（ａ）前記インプット無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期；
（ｂ）前記インプット無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベル；
（ｃ）球状の形態；
（ｄ）前記インプット無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベル；
（ｅ）前記インプット無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生
のうち１種または複数を示す、請求項１１３、１１４、１１７～１２２のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞が、赤血球であり、前記無核細胞由来の小胞が、前記インプット無核細胞と比較して低減された両凹形状を有する、請求項１１３、１１４、１１７～１２２のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
赤血球細胞ゴーストである、請求項１１３、１１４、１１７～１２２に記載の無核細胞由来の小胞。
前記プロセスによって調製された前記無核細胞由来の小胞が、前記インプット無核細胞と比較して、その表面に約１．５倍をより多くえて多いホスファチジルセリンを有する、請求項８６～１２５のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞の集団プロファイルが、前記インプット無核細胞と比較して、表面におけるより高い平均ホスファチジルセリンレベルを示す、請求項８６～１２６のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞の前記集団プロファイルの少なくとも５０％が、前記インプット無核細胞と比較して、表面におけるより高いホスファチジルセリンレベルを示す、請求項８６～１２７のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞と比較して、組織または細胞における増強された取込みを示す、請求項８６～１２８のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞の取込みと比較して、肝臓および／もしくは脾臓におけるまたは貪食細胞および／もしくは抗原提示細胞による増強された取込みを示す、請求項１２９に記載の無核細胞由来の小胞。
修飾されていない無核細胞由来の小胞と比較して、組織または細胞における取込みを増強するように修飾されている、請求項８６～１３０のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞の取込みと比較して、肝臓および／もしくは脾臓におけるまたは貪食細胞および／もしくは抗原提示細胞による取込みを増強するように修飾されている、請求項１３１に記載の無核細胞由来の小胞。
その表面にＣＤ４７を含む、請求項８６～１３２のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記無核細胞由来の小胞の調製中に、（ａ）熱処理されていない、（ｂ）化学的に処置されていない、および／または（ｃ）低浸透圧性もしくは高浸透圧性条件に付されていない、請求項８６～１３３のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記細胞懸濁液の容積オスモル濃度が、前記プロセスを通して維持される、請求項８６～１３４のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記細胞懸濁液の容積オスモル濃度が、前記プロセスを通して２００ｍＯｓｍ～４００ｍＯｓｍの間に維持される、請求項８６～１３５に記載の無核細胞由来の小胞。
前記狭窄が、マイクロ流体チャネル内に含有される、請求項８６～１３６のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記マイクロ流体チャネルが、複数の狭窄を含む、請求項１３７に記載の無核細胞由来の小胞。
前記複数の狭窄が、直列におよび／または並列に配置されている、請求項１３８に記載の無核細胞由来の小胞。
前記狭窄が、複数の微小な支柱の間；アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間；または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する、請求項８６～１３９のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記狭窄が、ポアである、またはポア内に含有される、請求項８６～１３６のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記ポアが、表面に含有される、請求項１４１に記載の無核細胞由来の小胞。
前記表面が、フィルターである、請求項１４２に記載の無核細胞由来の小胞。
前記表面が、膜である、請求項１４２に記載の無核細胞由来の小胞。
前記狭窄サイズが、懸濁液における前記インプット無核細胞の前記直径の関数である、請求項８６～１４４のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記狭窄サイズが、懸濁液における前記インプット無核細胞の前記直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である、請求項８６～１４４のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記狭窄が、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する、請求項８６～１４６のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記狭窄が、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの幅を有する、請求項８６～１４７のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記狭窄が、約２．２μｍの幅を有する、請求項８６～１４７のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞が、約１０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、前記狭窄に通される、請求項８６～１４９のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記細胞懸濁液が、前記狭窄に通す前に、それと同時発生的にまたはその後に、前記抗原と接触させられる、請求項８６～１５０のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
請求項８６～１５１のいずれか一項に記載の複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物。
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１５２に記載の組成物。
抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するための方法であって、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原の通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原を前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原と共にインキュベートし、これにより、前記抗原を含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと
を含む方法。
前記インプット無核細胞が、アジュバントを含む、請求項１５４に記載の方法。
アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するための方法であって、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記アジュバントの通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記アジュバントを前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記アジュバントと共にインキュベートし、これにより、前記アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと
を含む方法。
前記インプット無核細胞が、抗原を含む、請求項１５６に記載の方法。
抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するための方法であって、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記インプット無核細胞の直径の関数であり、これにより、前記抗原および前記アジュバントの通過に十分なほど大きい前記インプット無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成する、ステップと、
ｂ）前記抗原および前記アジュバントを前記無核細胞由来の小胞に進入させるのに十分な時間、前記無核細胞由来の小胞を前記抗原および前記アジュバントと共にインキュベートし、これにより、前記抗原および前記アジュバントを含む無核細胞由来の小胞を生成するステップと
を含む方法。
前記無核細胞由来の小胞が、赤血球細胞由来の小胞または血小板由来の小胞である、請求項１５４～１５８のいずれか一項に記載の方法。
前記赤血球細胞由来の小胞が、赤血球由来の小胞または網状赤血球由来の小胞である、請求項１５９に記載の方法。
前記抗原が、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドへとプロセシングされ得る、請求項１５４、１５５または１５７～１６０のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、ＣＤ－１拘束性抗原である、請求項１５４、１５５または１５７～１６０のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、疾患関連抗原である、請求項１５４、１５５または１５７～１６２のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、腫瘍抗原である、請求項１５４、１５５または１５７～１６３のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、ライセートに由来する、請求項１５４、１５５または１５７～１６４のいずれか一項に記載の方法。
前記ライセートが、腫瘍ライセートである、請求項１６５に記載の方法。
前記抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原である、請求項１５４、１５５または１５７～１６３のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、微生物である、請求項１５４、１５５または１５７～１６３のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、ポリペプチドである、請求項１５４、１５５または１５７～１６７のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、脂質抗原である、請求項１５４、１５５または１５７～１６７のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、糖鎖抗原である、請求項１５４、１５５または１５７～１６７のいずれか一項に記載の方法。
前記抗原が、修飾された抗原である、請求項１５４、１５５または１５７～１７１のいずれか一項に記載の方法。
前記修飾された抗原が、ポリペプチドと融合された抗原を含む、請求項１７２に記載の方法。
前記修飾された抗原が、標的化ペプチドと融合された抗原を含む、請求項１７３に記載の方法。
前記修飾された抗原が、脂質と融合された抗原を含む、請求項１７４に記載の方法。
前記修飾された抗原が、炭水化物と融合された抗原を含む、請求項１７５に記載の方法。
前記修飾された抗原が、ナノ粒子と融合された抗原を含む、請求項１７６に記載の方法。
複数の抗原が、前記無核細胞由来の小胞に送達される、請求項１５４、１５５または１５７～１７７のいずれか一項に記載の方法。
前記アジュバントが、ＣｐＧＯＤＮ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、ポリリシンおよびカルボキシメチルセルロースにより安定化されたポリイノシン・ポリシチジル酸（ＨＩＬＴＯＮＯＬ（登録商標））、イミキモド、レシキモド、ならびに／またはＬＰＳである、請求項１５５～１７８のいずれか一項に記載の方法。
前記アジュバントが、低分子量ポリＩ：Ｃである、請求項１７９に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、赤血球細胞である、請求項１５４～１８０のいずれか一項に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、赤血球である、請求項１５４～１８１のいずれか一項に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、網状赤血球である、請求項１５４～１８１のいずれか一項に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、血小板である、請求項１５４～１８０のいずれか一項に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１５４～１８４のいずれか一項に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタまたはウサギ細胞である、請求項１５４～１８５のいずれか一項に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、ヒト細胞である、請求項１５４～１８５のいずれか一項に記載の方法。
哺乳動物への投与後の前記無核細胞由来の小胞の半減期が、前記哺乳動物への投与後の前記インプット無核細胞の半減期と比較して減少している、請求項１５４～１８７のいずれか一項に記載の方法。
前記無核細胞由来の小胞のヘモグロビン含量が、前記インプット無核細胞のヘモグロビン含量と比較して減少している、請求項１８１～１８３または１８５～１８８のいずれか一項に記載の方法。
前記無核細胞由来の小胞のＡＴＰ産生が、前記インプット無核細胞のＡＴＰ産生と比較して減少している、請求項１８１～１８９のいずれか一項に記載の方法。
前記無核細胞由来の小胞が、次の特性：
（ａ）前記インプット無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期；
（ｂ）前記インプット無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベル；
（ｃ）球状の形態；
（ｄ）前記インプット無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベル；
（ｅ）前記インプット無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生
のうち１種または複数を示す、請求項１８１～１８２または１８５～１９０のいずれか一項に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、赤血球であり、前記無核細胞由来の小胞が、前記インプット無核細胞と比較して低減された両凹形状を有する、請求項１８１～１８２または１８５～１９１のいずれか一項に記載の方法。
前記無核細胞由来の小胞が、赤血球細胞ゴーストである、請求項１８１～１８２または１８５～１９２に記載の方法。
前記プロセスによって調製された前記無核細胞由来の小胞が、前記インプット無核細胞と比較して、その表面に約１．５倍をより多くえて多いホスファチジルセリンを有する、請求項１５４～１９３のいずれか一項に記載の方法。
前記プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞の集団プロファイルが、前記インプット無核細胞と比較して、表面におけるより高い平均ホスファチジルセリンレベルを示す、請求項１５４～１９４のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記プロセスによって調製された無核細胞由来の小胞の前記集団プロファイルの少なくとも５０％が、前記インプット無核細胞と比較して、表面におけるより高いホスファチジルセリンレベルを示す、請求項１５４～１９５のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞と比較して、組織または細胞における増強された取込みを示す、請求項１５４～１９６のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞の取込みと比較して、肝臓および／もしくは脾臓におけるまたは貪食細胞および／もしくは抗原提示細胞による増強された取込みを示す、請求項１９７に記載の無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞と比較して、組織または細胞における取込みを増強するように修飾されている、請求項１５４～１９８のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記インプット無核細胞の取込みと比較して、肝臓および／もしくは脾臓におけるまたは貪食細胞および／もしくは抗原提示細胞による取込みを増強するように修飾されている、請求項１９９に記載の無核細胞由来の小胞。
その表面にＣＤ４７を含む、請求項１５４～２００のいずれか一項に記載の無核細胞由来の小胞。
前記無核細胞由来の小胞が、前記無核細胞由来の小胞の調製中に、（ａ）熱処理されない、（ｂ）化学的に処置されない、および／または（ｃ）低浸透圧性もしくは高浸透圧性条件に付されない、請求項１５４～２０１のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞懸濁液の容積オスモル濃度が、前記プロセスを通して維持される、請求項１５４～２０２のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞懸濁液の容積オスモル濃度が、前記プロセスを通して約２００ｍＯｓｍ～約４００ｍＯｓｍの間に維持される、請求項１５４～２０３に記載の方法。
前記狭窄が、マイクロ流体チャネル内に含有される、請求項１５４～２０４のいずれか一項に記載の方法。
前記マイクロ流体チャネルが、複数の狭窄を含む、請求項２０５に記載の方法。
前記複数の狭窄が、直列におよび／または並列に配置されている、請求項２０６に記載の方法。
前記狭窄が、複数の微小な支柱の間；アレイ状に構成された複数の微小な支柱の間；または１枚もしくは複数の可動プレートの間に存在する、請求項１５４～２０７のいずれか一項に記載の方法。
前記狭窄が、ポアである、またはポア内に含有される、請求項１５４～２０８のいずれか一項に記載の方法。
前記ポアが、表面に含有される、請求項２０９に記載の方法。
前記表面が、フィルターである、請求項２１０に記載の方法。
前記表面が、膜である、請求項２１０に記載の方法。
前記狭窄サイズが、懸濁液における前記インプット無核細胞の前記直径の関数である、請求項１５４～２１２のいずれか一項に記載の方法。
前記狭窄サイズが、懸濁液における前記インプット無核細胞の前記直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である、請求項１５４～２１３のいずれか一項に記載の方法。
前記狭窄が、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する、請求項１５４～２１４のいずれか一項に記載の方法。
前記狭窄が、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの幅を有する、請求項１５４～２１５のいずれか一項に記載の方法。
前記狭窄が、約２．２μｍの幅を有する、請求項１５４～２１５のいずれか一項に記載の方法。
前記インプット無核細胞が、約１０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉに及ぶ圧力下で、前記狭窄に通される、請求項１５４～２１７のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞懸濁液が、前記狭窄に通す前に、それと同時発生的にまたはその後に、前記抗原と接触させられる、請求項１５４～２１８のいずれか一項に記載の方法。
請求項１５４～２１９のいずれか一項に記載の方法によって調製された無核細胞由来の小胞の集団を含む組成物。
親無核細胞から調製された無核細胞由来の小胞であって、次の特性：
（ａ）前記親無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期、
（ｂ）前記親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベル、
（ｃ）球状の形態、
（ｄ）前記親無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベル、または
（ｅ）前記親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生
のうち１種または複数を有する無核細胞由来の小胞。
親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、次の特性：
（ａ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の約２０％より多くが、前記親無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期を有する、
（ｂ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、前記親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、
（ｃ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、球状の形態を有する、
（ｄ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、ＲＢＣゴーストである、
（ｅ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、親無核細胞の集団と比較して、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または
（ｆ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、前記親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、
のうち１種または複数を有する組成物。
親無核細胞の集団から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物であって、次の特性：
（ａ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の約２０％より多くが、前記親無核細胞の前記集団の平均と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期を有する、
（ｂ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、前記親無核細胞の前記集団の平均と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、
（ｃ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、球状の形態を有する、
（ｄ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、ＲＢＣゴーストである、
（ｅ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、前記親無核細胞の前記集団の平均と比較して、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または
（ｆ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、前記親無核細胞の前記集団の平均と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、
のうち１種または複数を有する組成物。
親無核細胞から調製された複数の無核細胞由来の小胞を含む組成物を作製するための方法であって、前記組成物が、次の特性：
（ａ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、前記親無核細胞と比較して減少した、哺乳動物における循環半減期を有する、
（ｂ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、前記親無核細胞と比較して減少したヘモグロビンレベルを有する、
（ｃ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、球状の形態を有する、
（ｄ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、ＲＢＣゴーストである、
（ｅ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、より高いレベルのホスファチジルセリンを有する、または
（ｆ）前記組成物における前記無核細胞由来の小胞の２０％より多くが、前記親無核細胞と比較して低減されたＡＴＰ産生を有する、
のうち１種または複数を有し、
前記方法が、前記親無核細胞を含む細胞懸濁液を、細胞を変形させる狭窄に通すステップであって、前記狭窄の直径が、前記懸濁液における前記親無核細胞の直径の関数であり、これにより、ペイロードの通過に十分なほど大きい前記親無核細胞の撹乱を引き起こして、無核細胞由来の小胞を形成し、これにより、無核細胞由来の小胞を生成する、ステップを含む、方法。
それを必要とする個体における疾患または障害を処置するための方法であって、請求項２２１に記載の無核細胞由来の小胞を投与するステップを含む方法。
それを必要とする個体における疾患または障害を処置するための方法であって、請求項２２２に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
それを必要とする個体における疾患または障害を予防するための方法であって、請求項２２１に記載の無核細胞由来の小胞を投与するステップを含む方法。
それを必要とする個体における疾患または障害を予防するための方法であって、請求項２２２に記載の組成物を投与するステップを含む方法。