KR101616599B1 - 헬리코박터 파일로리균의 지질 폴리사카라이드 외측 코어 에피토프 - Google Patents

헬리코박터 파일로리균의 지질 폴리사카라이드 외측 코어 에피토프 Download PDF

Info

Publication number
KR101616599B1
KR101616599B1 KR1020127005554A KR20127005554A KR101616599B1 KR 101616599 B1 KR101616599 B1 KR 101616599B1 KR 1020127005554 A KR1020127005554 A KR 1020127005554A KR 20127005554 A KR20127005554 A KR 20127005554A KR 101616599 B1 KR101616599 B1 KR 101616599B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
glucan
helicobacter pylori
compound
lps
residue
Prior art date
Application number
KR1020127005554A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120041235A (ko
Inventor
엘리오노라 알트만
블래어 에이 하리손
반다나 찬단
Original Assignee
내셔날 리서치 카운실 오브 캐나다
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 내셔날 리서치 카운실 오브 캐나다 filed Critical 내셔날 리서치 카운실 오브 캐나다
Publication of KR20120041235A publication Critical patent/KR20120041235A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101616599B1 publication Critical patent/KR101616599B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/121—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Helicobacter (Campylobacter) (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/105—Delta proteobacteriales, e.g. Lawsonia; Epsilon proteobacteriales, e.g. campylobacter, helicobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/02—Dextran; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

가장 일반적인 병인균인 헬리코박터 파일로리균은 인간의 만성 위염, 위궤양과 위암의 발생과 관련된다. 본 발명은 식 Ⅰ의 구조를 포함하는 α1,6-글루칸-함유 헬리코박터 파일로리균 화합물: 여기서 R은 α1,3-DD-헵탄과 연결된 α1,6-글루칸으로 치환된 α-DDHep-3-α-L-Fuc-3-β-GlcNAc 트리사카라이드이고, α1,3-DD-헵탄의 말단 DD-Hep 잔기는, β-GlcNAc 잔기로 캡핑된다. 상기 화합물을 포함하는 조성물, 화합물의 사용, 및 화합물에 대응해 상승하는 항체가 또한 기술된다.

Description

헬리코박터 파일로리균의 지질 폴리사카라이드 외측 코어 에피토프{H. PYLORI LIPOPOLYSACCHARIDE OUTER CORE EPITOPE}
본 출원은 2009년 7월 31일 제출된 미국임시특허출원 61/230,315의 혜택을 주장하며, 참고적으로 그 전체의 내용이 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 신규한 헬리코박터 파일로리균 LPS의 외측 코어 에피토프에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 신규한 헬리코박터 파일로리균의 외측 코어 에피토프, 그 합성, 특성화, 및 컨쥬게이션(conjugation)에 관한 것이다.
헬리코박터 파일로리균은 인간의 만성 위염, 위궤양과 위암과 관련된 가장 일반적인 감염 세균으로 인정되고 있다. 헬리코박터 파일로리균의 감염은 개발 도상국에서 70%, 선진국에서 20~30%에 달할 정도로, 세계 인구의 약 절반에서 유행하고 있다(Dunn 등, 1997). 개인의 대부분은 어렸을 때 헬리코박터 파일로리균에 감염되고, 개발 도상국의 어린이들의 감염의 유행은 낮은 사회/경제적 상태와 열악한 위생과 관련되어 있다(CastillO-Rojas 등, 2004). 헬리코박터 파일로리균은 클래스 Ⅰ 발암 물질로 세계 보건기구(WHO)에 의해 지정되었고, 그것은 위암에 대한 상대적인 위험을 최소한 6배 증가시킨다. 위암은 연간 700,000명의 사망자가 있고, 전세계 사망에 대해 두 번째로 가장 흔한 원인이 된다(Parkin 등, 2002).
헬리코박터 파일로리균의 현재의 근절 방법은 양성자 펌프 억제제와 항생제의 사용을 기반으로 한다. 그러나 화학요법 개입의 효력은 헬리코박터 파일로리균의 분리에 대한 항생제 저항과 재감염에 대한 면역력 부족에 의해 제한된다. 따라서 신규한 요법은 헬리코박터 파일로리균 감염의 예방과 퇴치를 위한 글로벌 전략을 제공하기 위해 요구된다.
최근의 조사는 헬리코박터 파일로리균의 병인(pathogenesis)에 있어서의 프로테인 성분의 역할과 보호 면역에 있어서의 그들의 역할에 대해 집중했지만(Ruggiero 등, 2003; Rossi 등, 2004), 상대적으로 백신 포뮬레이션에 프로테인 이외의 항원을 포함시키는 가능성을 탐구하는 연구는 거의 없었다(Angeiakopoulos와 Hohmann, 2000). 예를 들어, 폴리사카라이드 기반 컨쥬게이트 백신은 전신 감염을 방지하고 호스트의 정착(colonization)을 억제하는 것으로 알려져 있다(Anderson 등, 1986; Chu 등, 1991; Pon 등, 1997; Passwell 등, 2001; Passwell 등, 2003). 장관 병원균에 관한 최근 연구는 인간 용도를 위한 후보 백신으로서의 LPS 결합체에 기초가 된 접근법을 검사했다(Gu 등, 1996; Mieszala 등, 2003; Cox 등, 2005; Yu and Gu, 2007).
지질 폴리사카라이드(LPS)는 헬리코박터 파일로리균의 주요 세포 표면 성분이다. 다수의 헬리코박터 파일로리균의 분리주(isolates)로 수행된 구조적 연구는 지질 A 모이어티에 부착되는 O-사슬과 코어 올리고사카라이드를 구성하는 LPS의 구조 모형을 결과로 보였다. 대부분의 헬리코박터 파일로리균의 O-사슬 폴리사카라이드 주쇄의 구조는 독특하고, 인간의 위장과 종양 세포의 세포 표면에 그것을 모방하는 루이스(le) 블러드 그룹 결정자의 타입 2 및/또는 타입 1을 나타낸다(Wirth 등, 1996); 이것들은 위축 위염을 초래하는 반대의 면역 자기반응에 연관될 수 있다(Appelmelk 등, 1996). 또한, 헬리코박터 파일로리균 LPS의 외측 코어 영역은 두 특이한 고분자 성분이 포함되어 있다: DD-헵토글리칸과 α1,6-글루칸(Monteiro, 2001). 헬리코박터 파일로리균 LPS 분리주의 외측 코어 영역의 α1,6-글루칸 의 폴리머는 HP0159 개방 판독 프레임의 제품에 의해 합성된다. 헬리코박터 파일로리균의 관련 HP0159 유전자의 존재와 표현은 일반적이다.
많은 헬리코박터 파일로리균의 LPS의 생합성 유전자들은 특징지워졌고, 병인과 정착에서의 그들의 역할은 결정되었다(Logan 등, 2000; Logan 등, 2005; Hiratsuka 등, 2005; Chandan 등, 2007; Altman 등, 2008). 헬리코박터 파일로리균 HP0826의 변이체가 형성되었고, 이 변이체는 Le 항원 부족의 절단된 LPS의 형성을 초래한다(Logan 등, 2000). 그러나 LPS 구조의 전체 특성화는 달성되지 않았다.
본 분야의 발전에도 불구하고, 헬리코박터 파일로리균의 여러 종을 아우르는 효과적인 면역원 에프토프는 이해하기 어려운 채로 남아있다.
본 발명은 신규한 헬리코박터 파일로리균 LPS의 외측 코어 에피토프에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 신규한 헬리코박터 파일로리균의 외측 코어 에피토프, 그 합성, 특성화 및 컨쥬게이션에 관한 것이다.
본 발명은 식 Ⅰ의 구조를 포함하는 α1,6-글루칸-함유 헬리코박터 파일로리균 화합물을 제공한다:
Figure 112012017054947-pct00001
R은 α1,3-DD-헵탄과 연결된 α1,6-글루칸으로 치환된 α-DDHep-3-α-L-Fuc-3-β-GlcNAc 트리사카라이드고, α1,3-DD-헵탄의 말단 DD-Hep 잔기에, 3-DD-헵탄은 β-GlcNAc 잔기로 캡핑된다. 바로 위에서 기술된 화합물에서, α1,6-글루칸은 약 3개에서 약 12개의 α1,6-연결 글루코오스 잔기를 포함할 수 있고, α1,3-DD -헵탄은 약 2개에서 약 6개의 α1,3-연결 헵토스 잔기를 포함할 수 있다.
상술한 바와 같이 화합물의 R기는
Figure 112012017054947-pct00002
일 수 있다.
여기서 β-GlcNAc 잔기 L은 Hep G의 O-2에 연결된다. 바로 위에서 기술된 화합물에서, 글루칸의 잔기 Q와 Z는 α1,6-연결 글루코오스 잔기이고, n은 약 1에서 11 사이의 임의의 값일 수 있다; 잔기 T, Y, 및 X는 α1,3-연결 헵토스 잔기이고, m은 약 0에서 4 사이의 임의의 값일 수 있다.
상술한 바와 같이 화합물은 헬리코박터 파일로리균 균주 HP0826::Kan으로부터 분리되거나 정제된다.
상기에 기술된 화합물에서, 식 Ⅰ의 구조는 Kdo 잔기 C에 공유하여 부착된 지질 A 모이어티를 더 포함할 수 있다. 지질 A 분자는 디아실화된 O- 일 수 있거나, Kdo 잔기의 케토시딕 연계의 가수분해를 통하여 쪼개질 수 있다.
본 발명은 또한 연결기 분자, 프로테인 담체 또는 그들의 조합에 컨쥬게이션된 실질적으로 선형인 α1,6-글루칸-함유 화합물을 포함하는, 컨쥬게이트를 제공한다. 실질적으로 선형인 α1,6-글루칸-함유 화합물은 여기에서 기술된 화합물일 수 있으며, 식 Ⅰ의 구조는 연결기 분자, 프로테인 담체 또는 그들의 조합에 컨쥬게이션된다. 실질적으로 선형인 α1,6-글루칸-함유 화합물은 선택적으로 덱스트란(Dextran) T5와 같은, 덱스트란 일 수 있다. 프로테인 담체는 테타누스 톡소이드(tetanus toxoid) 또는 보빈 세륨 알부민(bovine serum albumin)일 수 있다.
본 발명은 또한 상술한 바와 같이, 1 이상의 화합물 또는 컨쥬게이트를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 여기에서 기술된 α1,6-글루칸 에피토프-함유 화합물에 대하여 디렉팅된 항체를 포함한다. 상기 항체는 모노클로널 항체 1C4F9일 수 있다. 본 발명은 더욱이 하이브리도마 세포 라인 1C4F9를 포함하며, 그것이 모노클로널 항체 1C4F9를 생산한다.
상기에 기술된 모노클로널 항체는 임의의 치료시의 필요에 따라 개인에게(in an individual) α1,6-글루칸-발현 헬리코박터 파일로리균 균주의 보체 관여 용균작용을 초래하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 개인에게 헬리코박터 파일로리균에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 상기에 기술된 조성물의 유효량의 사용을 제공한다. 조성물에 있는 화합물(들)은 적절한 캐리어 프로테인에 컨쥬게이션될 수 있다; 더욱이, 조성물에 있는 화합물(들)은 리포폴리사카라이드의 2-케토-3-데옥시-옥투로소닉산(Kdo)을 통하여 적절한 캐리어 프로테인에 컨쥬게이션될 수 있다.
본 발명은 또한 여기에서 기술된 면역원성 조성물을 가진 포유 동물을 면역시켜 생산된 면역 항혈청을 제공한다. 면역 항혈청은 동형 및 이형, 타입성 및 비타입성, 변이체 및 야생형의 헥리코벡터 파일로리균 균주에 있는 α1,6-연결 글루칸 에피토프를 인식하는 IgG를 포함한다. IgG는 변이체 및 야생형의 α1,6-글루칸-발현 헥리코벡터 파일로리균의 보체 관여 용균작용를 초래할 수 있다.
본 발명의 첨가적 양상과 장점은 다음 설명을 참고하면 명확할 것이다. 상세한 설명과 실시예는 본 발명의 제시하는 적절한 실시예이지만, 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이고, 본 발명의 범주 내의 다양한 변화와 수정은 본 발명의 기재에 비추어 당업자들에게 명백하다.
본 발명의 여러 가지 특징은 첨부된 도면과 관련하여, 실시예에 의해서 기술될 것이다:
도 1은 양이온 모드에서 헬리코박터 파일로리균 균주 26695 HP0826::Kan로부터 탈지된 LPS의 프랙션 1에서 LPS 글리코형의 CE-MS 분석을 나타낸다. 도 1A는 추출된 질량 스펙트럼(m/z 1000-1500)를 나타내고, 반면에 도 1B는 m/z 1266.3에서 이온의 생성물 이온 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 음이온 모드에서 헬리코박터 파일로리균 균주 26695 HP0826::Kan으로부터 O-디아실화 LPS의 LPS 글리코형의 CE-MS 분석을 나타낸다. 도 2A는 추출된 질량 스펙트럼(m/z 600-2000)를 나타내고, 반면에 도 2B는 m/z 1597.7에서 이온의 생성물 이온 스펙트럼을 나타내고, 지질 A 모이어티에 상응하는 프래그먼트 이온은 별표로 표시된다.
도 3A는 헬리코박터 파일로리균 균주 26695 HP0826::Kan으로부터의 메이져 LPS 글리코형의 구조를 나타낸다; 아실레이션은 도시되지 않는다. 도3A의 LPS의 KOH 디아실화의 생성물은 도 3B에 내어진다(화합물 1에서 4). 화합물 4의 탈아미노화 반응의 생성물은 도 3C에 나타내어진다(화합물 5와 6). 화합물 6의 페리오데이트 산화의 생성물은 도 3D에 나타내어진다(화합물 7과 8). 해당 기술분야에서 이전에 제안된 구조, 즉 균주 26695로부터의 헬리코박터 파일로리균 LPS(도 3E), 균주 26695 HP0826::Kan 변이체로부터의 헬리코박터 파일로리균 LPS(도 3F) (Logan 등, 2000에서 적용)를 나타낸다. PEtn=포스포 에탄올아민; Glc=D-글루코피라노스; Gal=D-갈락토피라노스; Kdo=2-케토-3-데옥시-옥투로소닉산; LDHep=L-글리세로-D-마노-헵토스; DDHep=D-글리세로-D-마노-헵토스; GlcNAc=2-아세타미도-2-데옥시-D-글루코오스; GlcN=2-아미노-2-데옥시-D-글루코오스; Fuc=L-푸코스; P=인삼염; 및 Gro=글리세롤
도 4는 본 발명의 LPS-기반 컨쥬게이트의 제조에 대한 반응 설계를 나타낸다.
도 5는 음이온 모드에서 탈지된 헬리코박터 파일로리균 O:3 HP0826::Kan LPS의 메이져 프랙션의 CE-MS 분석을 나타낸다: ●: 측쇄에서 하나의 Hep 잔기를 포함하는 LPS 글리코형, R=Hex5 -13, Hep, HexNAc, Fuc; ■: 측쇄에서 두개의 Hep 잔기를 포함하는 LPS 글리코형,: R=Hex8 -13, Hep, Hep, HexNAc, Fuc.
도 6은 26695 HP0479::Kan(도 6A)와 26695 HP0826::Kan(도 6B)으로부터의 헬리코박터 파일로리균 LPS를 이용한 억제 ELISA에 의해 dLPS-TT 컨쥬게이트로서 유도된 래빗 항체의 특이성의 결정에 대한 그래프를 나타낸다. LPS를 코팅하는 것은 다음과 같이 묘사된다: 채워진 네모 - 26695; 채워진 다이어몬드 - 26695 HP0826::Kan; 채워진 원 - 26695 HP0159::Kan; 채워진 세모 - 26695 HP0479::Kan; 개방된 원 - SS1; 개방된 네모 - SS1HP0826::Kan; 개방된 세모 - SS1HP0159::Kan; 개방된 역삼각형 - SS1HP0479::Kan
도 7은 CD-1 마우스의 헬리코박터 파일로리균-특이성 항체 반응을 묘사하는 그래프를 나타낸다. 마우스는 1μg/마우스 콜레라 톡신(채워진 바)으로 보조된 dLPS-TT 컨쥬게이트, 1μg/마우스 콜레라 톡신(해치된 바) 또는 염류용액(개방된 바)으로 보조된 PJ2 셀-프리 소니케이트 25μg/마우스를 매주 간격으로 네번 백신 접종되었다. 최초의 면역 후 4주 동안, 혈청, 배설물 및 질 세척 샘플이 수집되었고 헬리코박터 파일로리균-특이성 IgG와 IgA를 위해 분석되었다. 개개의 마우스는 그룹 평균(n=5/그룹)를 표시하는 수평 바를 가진 그래프에 프로팅되었다. 단측 만-휘트니(Mann Whitney) 검사에 의한 *p<0.05, *p<0.01.
도 8은 CD-1 마우스의 위에서의 헬리코박터 파일로리균 버든(burdens)을 묘사하는 막대 그래프이다. 마우스는 1μg/마우스 콜레라 톡신(채워진 바)으로 보조된 dLPS-TT 컨쥬게이트, 1μg/마우스 콜레라 톡신(해치된 바) 또는 염류용액(개방된 바)으로 보조된 PJ2 셀-프리 소니케이트 25μg/마우스를 매주 간격으로 네번 백신 접종되었다. 최초의 면역 후 5주 동안, 마우스는 헬리코박터 파일로리균 PJ2 균주 ~108cfu를 격일마다 3번씩 입을 통해 위관영양되었다. 4주 후에 마우스는 죽여졌고, 그들의 위로부터의 생육할 수 있는 박테리아의 수가 세어졌다. 바는 4-5 마우스±SEM. *p<0.05단측 만-휘트니(Mann Whitney) 검사 그룹을 표현한다.
본 발명은 신규의 헬리코박터 파일로리균 LPS 외측 코어 에피토프와 관련된다. 보다 상세하게는, 본 발명은 신규의 헬리코박터 파일로리균 외측 코어 에피토프, 그것의 합성, 특성화와 컨쥬게이션과 관련된다.
특별히 규정하지 않는 한, 여기에서 사용된 모든 기술적, 과학적 용어는 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 여기에 기술된 것들과 비슷하거나 동등한 임의의 방법이나 물질이 본 발명의 실행이나 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법과 물질은 지금 기술된다. 이하에 언급된 모든 공개문헌은 참고문헌으로서 여기에서 구체화된다.
여기에서 사용시, ˝정제된다˝는 반드시 절대 순도를 의미하지는 않지만, 상대적인 정의로 의도된다. 유사하게, 여기에서 사용시, ˝분리된다˝는 그것의 기존 환경으로부터 어떤 것의 제거를 의미한다.
헬리코박터 파일로리균은 인간 만성 위염, 위궤양 및 위암과 일반적으로 관련된 세균성 병원균이다; 헬리코박터 파일로리균 감염과 관련된 위암의 상승 리스크의 결과로서, 그것은 클래스 I 발암물질로서 분류된다. 리포폴리사카라이드(LPS)는 헬리코박터 파일로리균의 주요 세포 표면 성분이다. O-사슬 폴리사카라이드가 결과적으로 지질 A 모이어티에 부착된다. 헬리코박터 파일로리균 LPS의 구조적 연구와 관련되는 종래의 공개문헌은 O-사슬 폴리사카라이드가 코어 올리고사카라이드에 공유적으로 연결되어 있는 제안된 모델을 이끌었고, 이것은 결과적으로 지질 A 모이어티에 부착되었다. 메이져 헬리코박터 파일로리균 균주의 O-사슬 폴리사카라이드 주쇄는 유일하고, 타입 2 및/또는 타입 1 루이스(Le) 블러드 그룹 결정자를 디스플레이할 수 있다; 이 폴리사카라이드 성분은 항원이다. ˝타입성(typeable)˝ 헬리코박터 파일로리균 균주는 반-루이스 항체(항-Le)에 의해 인지될 수 있는 루이스 에피토프(Le X 및/또는 Le Y 항원)를 가진다; 그러한 항체는 시판중이고 타입 분류를 도울 수 있다. ˝비타입성(non-typeable)˝ 균주는 루이스 구조를 포함하지 않는다.
첨가적인 구조적 연구는 헬리코박터 파일로리균 LPS의 외측 코어 영역이 2개의 비정형적 중합 성분을 포함한다는 것을 수립했다: DD-헵토글리칸과 α1,6-글루칸 측쇄(Monteiro, 2001). 로건(Logan) 등(2000)은 또한 LPS의 구조에 관한 통찰을 제공했다. 특히, 제안된 구조(도 3E와 3F 참조)는 측쇄에 있는 DD-헵토스(DD-Hep)가 주쇄에 있는 DD-Hep에 부착되고, 반면에 α1,6-글루칸이 이 측쇄 DD-Hep에 부착되고, 또 다른 가지를 형성하는 것을 제공했다. 특히, 로건 등(2000)은 FAB-MS 스펙트라(고속 원자 충격 질량 분석)에 기초된 1개에서 3개의 글루코오스가 되기 위한 0826 변이체 LPS에 있는 글루칸 사슬의 길이를 결정했다. 헬리코박터 파일로리균 균주 26695 LPS에 있는 α1,6-연결 글루코오스의 존재가 기술되었고, 메틸화 분석 데이터에 기초되었지만, 글루칸의 길이는 결정되지 않았다. 부가적으로 균주 26695 LPS에서, 3-치환 Hep는 O-사슬의 GlcNAc 단위와 코어 사이의 연결을 형성하는 것을 제안되었다. 헬리코박터 파일로리균 HP0826::Kan LPS에 있는 3-연결 헵토스의 존재는 또한 언급되었지만, α1,3-헵탄의 존재 또는 그것의 길이는 기술되지 않았다. 헵탄 또는 글루칸 측쇄의 구조 또는 길이에 관한 어떤 추가적인 정보도 제공되지 않았다. 헬리코박터 파일로리균 LPS의 구조는 여기에 더 규정된다.
본 발명은 신규한 식 Ⅰ의 구조를 포함하는 α1,6-글루칸-함유 헬리코박터 파일로리균 화합물을 제공한다:
Figure 112012017054947-pct00003
여기에서 R은 α1,3-DD-헵탄이 뒤따라는 α1,6-글루칸으로 치환된 α-DDHep-3-α-L-Fuc-3-β-GlcNAc 트리사카라이드이고, α1,3-DD-헵탄의 말단 DD-Hep 잔기는, β-GlcNAc 잔기로 캡핑된다.
상술한 바와 같이 상기 구조에서, 트리사카라이드의 β-GlcNAc(α-DDHep-3-α-L-Fuc-3-β-GlcNAc)는, α-DDHep G 잔기에 연결된다. 트리사카라이드의 α-DDHep은 α1,6-글루칸에 연결되고, 이것은 결과적으로 α1,3-DD-헵탄에 연결된다. α1,3-DD-헵탄은 β-GlcNAc 잔기에 그 후 연결된다; 후자는 O-사슬 폴리사카라이드에게 부착점을 제공할 수 있다. ˝연결(linked)˝ 또는 ˝치환(substituted)˝의 용어에 의해, 2개의 모이어티는 공유결합에 의해 결합되는 것을 의미한다.
여기에서 사용된 용어 ˝α1,6-글루칸(α1,6-glucan)˝은 ˝글루칸(glucan)˝, ˝α1,6-글루칸 측쇄(α1,6-glucan side chain)˝, ˝글루칸 측쇄(glucan side chain)˝, ˝α1,6-글루칸 모이어티(α1,6-glucan moiety)˝ 및/또는 ˝글루칸 모이어티(glucan moiety)˝로서 또한 교환 가능하게 언급될 수 있다. α1,6-글루칸은 α1,6 글루코시딕 결합에 의해 연결된 글루코스 모노머의 선형 폴리사카라이드 사슬이고, 일 실시예에서, 이것이 임의의 방법으로 제한되는 것을 의미하는 것은 아니지만, α1,6-글루칸은 선형 폴리사카라이드일 수 있다. α1,6-글루칸은 α1,6-글루코오스 잔기의 임의의 적절한 양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 임의의 방법으로 제한하는 것을 원하지 않지만, 글루칸은 약 3개에서 약 12개의 α1,6-연결 글루코오스 잔기를 포함할 수 있다; 특히, 글루칸 모이어티는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 α1,6-연결 글루코오스 또는 방금 나열된 임의의 두 값에 의해 규정된 임의의 범위를 포함할 수 있다. 비한정적 예에서, α1,6-글루칸은 9-12개의 α1,6-글루코오스 잔기를 포함할 수 있다; 또 다른 비한정적 예에서, α1,6-글루칸은 10개의 α1,6-글루코오스 잔기를 포함할 수 있다.
여기에서 사용된 용어 ˝글리코형(glycoform)˝은 동일한 LPS 구조의 다른 형태 또는 타입을 표시하나 다수의 α1,6-글루코오스 또는 α1,3-헵토스 잔기와 다르다. 예를 들어, 이론에 의해 메이는 것을 바라지는 않지만, 각각의 글리코형은 특정 길이의 글루칸 및/또는 헵탄 모이어티 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다.
여기에서 사용된 용어 "α1,3-헵탄(α1,3-heptan)"은 "α1,3-DD-헵탄(α1,3-DD-heptan)", "헵탄(heptan)", "α1,3-헵탄 측쇄(α1,3-heptan side chain)", "헵탄 측쇄(heptan side chain)", "α1,3-헵탄 모이어티(α1,3-heptan moiety)", "헵탄 모이어티(heptan moiety)", 및/또는 "DD-헵토글리칸(DD-heptoglycan)"으로 또한 교환 가능하게 언급될 수 있다. α1,3-헵탄은 α1,3 O-글리코시딕 결합에 의해 연결된 헵토스 모노머의 폴리사카라이드 사슬이다. 일실시예에서, 이것이 임의의 방법으로 제한되는 것을 의미하는 것은 아니지만, α1,3-헵탄은 선형 폴리사카라이드일 수 있다. α1,3-헵탄은 α1,3-헵토스 잔기의 임의의 적절한 양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 임의의 방법으로 제한하기를 바라는 것은 아니지만, 헵탄은 약 2개에서 약 6개의 α1,3-연결 헵토스 잔기를 포함할 수 있다; 특히, 헵탄 모이어티는 약 2, 3, 4, 5 또는 6개의 α1,3-연결 헵토스 잔기 또는 방금 상술된 임의의 두 값에 의해 규정된 임의의 범위를 포함할 수 있다.
상기에 기술된 α1,3-DD-헵탄의 말단의 DD-Hep 잔기는 β-GlcNAc 잔기로 캡핑된다. ˝캡핑(capped)˝ 이라는 용어에 의해, β-GlcNAc 잔기는 측쇄에서 마지막의 잔기라는 의미를 가진다; ˝말단(terminated)˝ 이라는 용어가 또한 사용될 수 있다. β-GlcNAc는 헵토스의 포지션 O-2를 통하여 DD-Hep에 연결될 수 있다. 이론에 의해 매이는 것을 바라지는 않지만, β-GlcNAc 잔기는 O-사슬 폴리사카라이드에게 부착점을 제공할 수 있다. 하나의 비한정적 예에서, R은
Figure 112012017054947-pct00004
일 수 있다.
여기서 β-GlcNAc 잔기 L은 Hep 잔기 G의 O-2에 연결된다. 이 실시예에서, β-GlcNAc 잔기 W는 O-사슬 폴리사카라이드에게 부착점을 제공할 수 있다. 바로 위에 기술된 화합물에서, 글루칸의 잔기 Q와 Z는 α1,6-연결 글루코오스 잔기이고, 그리고 n은 약 1에서 11 사이의 임의의 값일 수 있고, 예를 들어, 글루칸이 α1,6-연결에서 약 3개에서 약 12개의 글루코오스 잔기를 포함할 수 있다; 하나의 특정하고 비한정적 예에서, 메이져 글리코형은 10개의 연속적 α1,6-연결 글루코오스 잔기(n=9)를 포함한다. 바로 위에 기술된 화합물에서, 잔기 T, Y와 X는 α1,3-연결 헵토스 잔기이고, 그리고 m은 약 0에서 4 사이의 임의의 값일 수 있어서, 예를 들어, 헵탄은 α1,3-연결에서 약 2개에서 약 6개의 헵토스 잔기를 포함할 수 있다; 하나의 특정한, 비한정적 예에서, 메이져 글리코형은 4개의 연속적 α1,3-연결 헵토스 잔기(m=2)를 포함한다.
상기 구조는 임의의 적절한 헬리코박터 파일로리균 균주로부터 분리 및/또는 정제된다; 예를 들어, 임의의 방법으로 제한하기를 바라는 것은 아니지만, 절단된 헬리코박터 파일로리균 LPS 분자는 비타입성 헬리코박터 파일로리균 균주(즉, 루이스 항원이 결여된 것)로부터 분리될 수 있어서, 한정적이지는 않지만, 예를 들면, O-사슬 폴리사카라이드 래킹(lacking) 동질 유전자 변이체를 초래하는 HP0826 유전자내의 변형을 가진 헬리코박터 파일로리균 균주를 들 수 있다. 비한정적 예에서, 여기에서 기술된 화합물은 헬리코박터 파일로리균 균주 26695 HP0826::Kan 또는 균주 PJ2로부터 분리 및/또는 정제된 것일 수 있다.
식 Ⅰ의 구조는, 또한 여기에서 ˝내측 코어 분자(inner core molecule)˝로서 주목될수 있고, Kdo 잔기, 예를 들어 Kdo 잔기 C에 공유하여 부착된 지질 A 모이어티를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 지질 A 분자는 O-디아실화 될 수 있고, 또는 완전히 디아실화될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 지질 A 모이어티는 Kdo 잔기의 케토시딕 연결의 가수분해를 통하여 쪼개질 수 있다. 이론에 의해 매이는 것을 바라지는 않지만, 지질 A의 쪼개짐은 LPS의 독성을 제거하고 컨쥬게이트의 가능한 응집과 불용해성을 회피하기 위해 행해질 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 지질 A 모이어티의 케토시딕 연결의 O-디아실화, 디아실화 또는 가수분해를 위한 방법들에 익숙할 것이다(예를 들면, Hoist 등, 1991; Altman 등, 2003 참조).
본 발명은 또한 프로테인 담체에 컨쥬게이션된 실질적으로 선형인 α1,6-글루칸-함유 화합물을 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 실질적으로 선형인 α1,6-글루칸-함유 화합물은 α1,6-연결 글루코오스 잔기가 포함된 임의의 적절한 실질적으로 선형인 폴리사카라이드일 수 있다. ˝실질적으로 선형인˝ 이라는 용어에 의해, α1,6-글루칸은 잔기를 거의 포함하지 않는다는 것이 의미된다; 예를 들어, 임의의 방법으로 제한하기를 바라는 것은 아니지만, α1,6-글루칸은 α1,6-글루칸 내에서 약 0 내지 약 5%의 잔기를 포함할 수 있다. 특히, α1,6-글루칸은 약 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 또는 5%의 잔기 또는 그 사이의 임의의 양을 포함할 수 있다; 화합물은 또한 혼합물일 수 있으며, 혼합물 내에 잔기 양은 하나의 화합물부터 다른 것까지 다양하다. 하나의 비한정적 예에서, α1,6-글루칸-함유 화합물은 위에서 또는 여기서 기술한 바와 같은 구조일 수 있고, 또 다른 실시예에서, α1,6-글루칸-함유 화합물은 덱스트란일 수 있다. 덱스트란은 상기에 기술한 필요사항에 부합하는 임의의 적절한 덱스트란일 수 있고, 1과 10kDa 사이의 분자량을 가질 수 있다; 예를 들어, 임의의 방법으로 제한하기를 바라는 것은 아니지만, 덱스트란은 약 1, 3.5, 5, 6.5, 8 또는 10kDa 또는 그 사이의 임의의 값일 수 있고, 특정하고 비한정적 예에서, 덱스트란은 덱스트란 T5일 수 있다. 또 하나의 실시예에서, α1,6-글루칸-함유 화합물은 약 5개와 8개 사이의 α1,6-연결 글루코오스 잔기의 선형 사슬일 수 있다; 예를 들어, 어떠한 방식으로 제한되는 것을 바라는 것은 아니지만, α1,6-글루칸-함유 화합물은 5, 6, 7 또는 8개의 α1,6-연결 글루코오스 잔기의 선형 사슬일 수 있다.
α1,6-글루칸-함유 화합물은 연결기 분자 및/또는 캐리어 프로테인에 컨쥬게이션된다; 해당 기술분야의 기술자가 이해할 수 있는 것처럼, 여기에서 기술된 구조는 캐리어 프로테인에 직접적으로 컨쥬게이션될 수 있거나, 연결기 분자(또한 여기에서 ˝연결기(linker)˝로서 언급됨)에 컨쥬케이트될 수 있어서, 결과적으로 캐리어 프로테인에 컨쥬게이션될 수 있다. ˝컨쥬게이트(conjugated)˝라는 용어에 의해, 구조는 연결기 분자 및/또는 캐리어 프로테인에 공유하여 부착되거나 연결된 것으로 의도된다. 연결기 및/또는 캐리어 프로테인의 공유 부착에 대한 방법은 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 잘 알려져 있다; 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 것처럼, 공유 부착에 대한 방법(및 연결기의 존재 유무)은 사용된 캐리어 프로테인에 기초하여 다양화될 수 있다. 임의의 방법으로 제한하기를 바라는 것은 아니지만, 그러한 방법은 도 4에 나타내어지며, 그것은 페르난대즈-산타나 (Fernandez-Santana) 등(1998)의 방법에서 도입되었다; 이 방법에서, 디아실화된 또는 탈지된 LPS는 연결기 분자에 대한 Kdo 잔기의 카르복실기와 공유하여 연결함으로써 활성화되고, 말레이미도 기능기(maleimido functionality)의 도입이 뒤따르게 된다. 활성화된 LPS는 공역 구조를 생산하기 위해 티올화 캐리어 프로테인과 혼합되고, As는 해당 기술분야에서 기술자에게 자명하고, 여기에서 기술된 본 방법은 일반적이며 따라서 다른 어느 적절한 방법은 사용될 수 있다(예를 들어, 제한적이지는 않지만, Chu 등, 1991; Cox 등, 2005; Gu 등, 1996; Mieszala 등, 2003; Yu와 Gu, 2007). α1,6-글루칸-함유 화합물은 구조에 있는 임의의 적절한 탄수화물 잔기의 카르복실기를 통하여 연결기/캐리어 프로테인에 부착될 수 있다. 특정한, 비한정적 예에서, α1,6-글루칸-함유 화합물은 본 발명의 구조일 수 있고, 내측 코어 Kdo 잔기 C를 통하여 부착될 수 있다.
캐리어 프로테인은 면역원성 담체를 포함하는, 당업계에 알려져 있는 임의의 적절한 캐리어일 수 있다. 예를 들어, 캐리어 프로테인은 제한되는 것은 아니지만, 테타누스 톡소이드, 시럼 보빈 알부민(BSA), 디프테리아 톡소이드, 변이체 디프테리아 톡소이드, CRM, CRM197 프로테인, 슈도모나스 A 프로테인, 콜레라 톡신(CT) 프로테인, 콜레라 톡신 변이체 CT-E29H 프로테인 및 당업계에 알려진 다른 예일 수 있지만, 편모, 선모 및 다른 독소의 부분에 대해 제한하는 것은 아니다. 이전에 제시된 것처럼, 컨쥬게이트는 자연적으로 발생하는 그룹을 통하여 직접적으로 본 발명의 캐리어 프로테인과 구조를 연결시키거나 스페이서 또는 연결기 분자의 도입을 통하여 연결할 수 있는데, 1차 아미노 그룹, 히드라지드류, 티올류, 카르복실류 및 다른 것으로 제한하는 것은 아니다.
본 발명은 더욱이 여기에서 기술된 것처럼 하나 이상의 화합물을 포함하는 조성물, 여기에서 기술된 것처럼 하나 이상의 컨쥬게이트 또는 그들의 조합을 제공한다. 일 실시예에서, 조성물은 상기에 기술된 화합물의 글리코형의 혼합물을 포함할 수 있다; 예를 들어, 임의의 방법으로 제한하기를 바라는 것은 아니지만, 조성물은 10개의 연속적인 글루칸 모이어티에 있는 α1,6-연결 글루코오스 잔기(n=9)를 포함하는 메이져 글리코형을 포함할 수 있다. 유사하게, 임의의 방법으로 제한하기를 바라는 것은 아니지만, 조성물은 여기에서 기술된 하나 이상의 글리코형으로부터 제조된 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 실시예들에서 증명되는 것처럼, 컨쥬게이트의 제조를 위해 사용되는 헬리코박터 파일로리균 균주 26695 HP0826::Kan에 의해 제작되는 LPS 구조는 3개의 글리코형의 혼합물이었다: CE-MS 분석(표 2, 도 2)에 의해 결정된 것처럼, 주쇄 올리고사카라이드 I, GlcNAc와 [GlcNAc, Fuc, Hep]로 캡핑된 주쇄 올리고사카라이드 I 및 α1,6-연결 글루칸을 포함하는 올리고사카라이드, 거의 12개의 α-1,6-연결 잔기에 대응하는 가장 긴 글루칸 사슬.
방금 기술된 것처럼 조성물은 면역원성이 있을 수 있다. ˝면역원성 (immunogenic)˝이라는 용어에 의해, 조성물은 헬리코박터 파일로리균 야생형 및/또는 변이 균주에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 것이 의도된다. 면역 반응은 헬리코박터 파일로리균의 타입성 및 비타입성 균주에 대하여 광범위한 면역원성 반응을 제공할 수 있다.
본 발명은 헬리코박터 파일로리균에 대하여 개개인에게 면역 반응을 유도하기 위해 여기에서 기술된 것처럼 또한 조성물의 유효량의 사용을 제공한다. 이전에 기술된 것처럼, 조성물은 본 발명에 따른 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 하나 이상의 화합물은 연결기 및/또는 적절한 담체 분자에 컨쥬게이션될 수 있다.
본 발명은 상술한 바와 같이 면역원성 조성물을 가진 포유 동물을 면역시켜 생산된 면역 항혈청을 더 제공한다. 면역 항혈청은 동종 및 이종 기원 타입성 및 비타입성 변이체와 야생형 헬리코박터 파일로리균의 균주에서 α1,6-연결 글루칸 에피토프를 인지하는 면역 후 혈청 IgG를 포함하거나 수득할 수 있다. IgG는 변이체와 야생형 α1,6-글루칸-발현 헬리코박터 파일로리균 균주의 보체 관여 용균작용을 초래할 수 있다.
본 발명은 더욱이 항-α1,6-글루칸 항체를 제공한다. 항체는 여기에서 기술된 것처럼 본 발명의 화합물에 대응하여 증가할 수 있거나, 덱스트란(또는 덱스트란 컨쥬게이트, 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 BSA-덱스트란 컨쥬게이트)과 같은 다른 α1,6-글루칸-함유 분자에 대응하여 증가할 수 있는데, 비제한적 실시예에서, 항체는 당업계에 알려져 있는 방법에 따라서 생산되는 모노클로널 항체일 수 있다(실시예 10; Altman 등, 2005 참조). 예를 들어, 임의의 방법으로 제한하기를 바라는 것은 아니지만, 항체는 헬리코박터 파일로리균 HP0826 변이체 LPS의 외측 코어 영역에 존재하는 α1,6-글루칸 에피토프에 대응하여 증가하는 모노클로널 항체일 수 있다; 더 특정하게는, 항체는 도 5에 나타내어진 화합물에 대응하여 증가할 수 있다. 좀 더 특정한 실시예에서, 모노클로널 항체는 하이브리도마 세포주 1C4F9에 의해 생산되는 IgM 1C4F9일 수 있다. 이 셀 라인은 2009년 7월 30일 캐나다의 국제적 기탁 당국(국가적 미생물 연구소, 캐나다 공중보건국, 1015 알링턴 스트리트, 위니페그, 매니토바주, 캐나다)에 예치되었고, 실시예에서 상기한 어세션 넘버 300709-01 As로 기탁되었고, LPS 내의 α1,6-글루칸 에피토프로 인지되는 1C4F9 및 타입성 및 비타입성 헬리코박터 파일로리균 균주의 전체 셀은 생균의 표면에 쉽게 접근가능하고, LPS-OH-TT와 dLPS-BSA 또는 dLPS-TT 컨쥬게이트 양자에 동등하게 잘 반응한다.
본 발명은 임의의 치료가 필요한 때에 개인에게, α1,6-글루칸-발현 헬리코박터 파일로리균의 변이체와 야생형의 타입성 및 비타입성의 보체 관여 용균작용을 초래하는 1C4F9 항체의 사용을 제공한다. 이전에 기술된 것처럼, 타입성 헬리코박터 파일로리균 균주는 항-Le 항체에 의해 인지되는 루이스 항원을 가지지만, 비타입성 균주는 그렇지 않다. 그러나, 타입성 그리고 비타입성 균주 양자는 α1,6-글루칸을 포함하기 때문에, 균주의 양쪽 타입은 1C4F9의 항체에 의해 인지될 수 있다.
현재 해당 기술분야에서, 헬리코박터 파일로리균 균주는 루이스 항원에 대한 시판중인 항체를 사용하여 타입화 될 수 있다; 그러나, 비타입성 균주가 루이스 구조를 포함하지 않으면, 그들은 이 접근법을 사용하여 분류될 수 없다. 대부분의 타입성 그리고 비타입성 헬리코박터 파일로리균 균주는 α1,6-글루칸 에피토프를 운반하고, 항-α1,6-글루칸(예를 들어 mAb 1C4F9)은 항체는 헬리코박터 파일로리균 분리주의 부가적인 스크리닝과 특성화의 방법을 제공할 수 있다.
헬리코박터 파일로리균 균주 26695 HP0826::Kan의 LPS는 정제되었고 그것의 화학적 구조는 조성물, 메틸화 반응, 상세한 핵 자기 공명(NMR) 분석 및 CE-MS 데이터에 의해 결정되었다. 헬리코박터 파일로리균 HP0826 변이체 LPS의 외측 코어 영역에 있는 α1,6-연결 글루칸의 존재가 또한 증명되었다; 이 구조는 α1,6-글루칸-특이성 모노클로널 항체, 1C4F9에 의해 인지되었다. 후자의 항체는 헬리코박터 파일로리균 O:3 HP0826::Kan 변이 균주의 포말린 고정 셀을 사용하여 생성되었다. 이러한 항체는 세포 표면에 접근가능하고 살균력이 있다. 이전에, 단지 루이스 구조가 항원이라 여겨졌다; 그러므로, α1,6-글루칸에 대한 항체의 발생은 예상될 수 없었다.
헬리코박터 파일로리균 LPS, 헬리코박터 파일로리균 26695 HP0826::Kan 변이체의 수정된 LPS의 백신 포텐셜을 조사하기 위해, 테타누스 톡소이드(TT) 또는 보빈 세륨 알부민(BSA)에 컨쥬게이션되었다. 부분적으로 탈지되거나 탈지된 LPS의 제조를 위한 2 가지의 접근법이 활용되었다: 마일드한 히드라진 분해(LPS-OH)에 의한 LPS의 O-디아실화 또는 마일드한 산 처리(dLPS)에 의한 LPS의 탈지화. 탈지 및/또는 부분적 탈지의 부가적인 방법은 당업계에 잘 업계에 알려져 있고 그와 같은 적절한 방법은 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있다. LPS-OH와 dLPS 양자는 디아미노기-포함 스페이서에 2-케토-3-데옥시-옥투로소닉산(Kdo) 잔기를 통하여 공유하여 연결되고, 말레이미도 기능기가 도입되며, 컨쥬게이트 LPS-OH-TT, dLPS-BSA와 dLPS-TT 각각을, 별개의 실험에서, 부여하는 티올화 TT 또는 BSA에 대한 컨쥬게이션이 뒤따랐고, 비타입성 균주 PJ2는 dLPS(PJ2)-TT 컨쥬게이트를 부여하는 컨쥬게이션을 위해 탈지되고 이용되었다.
IgM 1C4F9로 간접 ELISA에 의해 달성됨으로써, dLPS(PJ2)-TT와 마찬가지로 LPS-OH-TT, dLPS-BSA, dLPS-TT 컨쥬게이트는 표면 접근가능 α1,6-글루칸 결정자에 대한 항원성을 보유했다. 항체는 α1,6-글루칸 결정자에 대해 우수한 특이성을 가지는 것이 보여졌고 그것의 바인딩 특성은 이소말토-시리즈로부터 올리고사카라이드을 이용한 억제 ELISA에 의해 결정되었고, 헬리코박터 파일로리균의 타입성 및 비타입성 균주로부터 LPS를 정제했다. 이러한 연구는 1C4F9가 5개에서 6개의 연속적 α1,6-연결 글루코오스 잔기를 위한 필요사항과, 카벗(Kabat)(1993)에 의해 가정된 사이트를 결합하는 항-α-(1→6) 덱스트란의 사이즈와 일치하는 패턴을 가졌다는 것을 확인했다.
LPS-OH-TT, dLPS-BSA, dLPS-TT 또는 dLPS(PJ2)-TT 컨쥬게이트는 마우스와 래빗에서 면역원성이 있고 헬리코박터 파일로리균의 동종, 이종과 야생형으로부터의 LPS에 대한 중요한 IgG 항체 반응이 유도된다. 면역하는 항원에 대한 10배 더 강한 IgG 면역 반응이 dLPS-함유한 컨쥬게이트를 얻은 마우스와 래빗에서 발생되었다. LPS-OH-TT, dLPS-BSA, dLPS-TT 또는 dLPS(PJ2)-TT 각각으로 면역된 래빗의 면역 후 혈청들은 헬리코박터 파일로리균의 26695 HP0826::Kan 변이체와 야생형 26695에 대하여 면역성을 나타냈다.
요약하면, 이러한 결과는 긴 α1,6-글루칸 사슬을 운반하고 Le 항원이 부족한 탈지된 또는 부분적으로 탈지된 헬리코박터 파일로리균 LPS-기반 프로테인 컨쥬게이트는 마우스와 래빗 양자에서 면역원성을 가지고, 살균 항체를 유도한다. 이 에피토프는 면역원성이 있는 것으로 인지되었다는 점이 중요하다. 이것은 단지 루이스 구조가 항원이고 특정 항체를 생산한다고 알려진 것처럼 이전에는 설정되지 않았었다.
본 발명은 다음 실시예에서 더 설명될 것이다. 그러나, 이러한 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이고, 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하기 위해 사용되지 말아야 하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1: 헬리코박터 파일로리균 26696 HP0826 :: Kan LPS의 분리와 구조 해석.
헬리코박터 파일로리 균주 26695는 Dr. R. Alm(아스트라 제내카, 보스톤, MA)에 의해 획득되었고, 헬리코박터 파일로리균 O:3 분리주는 Dr. J. Penner에 의해, J99는 Dr. Taylor(앨버타 대학교, 에드먼톤, 캐나다)에 의해, SS1는 Dr. A. Lee(뉴 사우스 웨일즈 대학교, 시드니, 오스트레일리아)에 의해, PJ1 및 PJ2 임상적 분리주는 Dr. W. Conlan(IBS, NRC) 및 M6은 Dr. K. Eaton(미시건 주립 대학교, MI)에 의해 획득되었다.
박테리아성 균주의 성장은 기술된 것처럼 Hiratsuka 등(2005)에 의해 수행되었다. 요약하면, 셀은 이전에 기술된 것처럼 48시간 동안(Kan 20μg/mL)를 위한 미호기성 조건에서 말 혈액 7%를 포함하는 항생 보정된 컬럼비아 혈액 아가(Difco) 플레이트에서, 37℃로에서 성장했다(Hiratsuka 등, 2005). 액체 배양액에서 성장을 위해, 10% 태아 보민 혈청을 포함하는 브루셀라 브로스는 이전에 기술된 것처럼 컬럼비아 혈액 아가/말 혈액 플레이트에서 48시간 동안 배양된 헬리코박터 파일로리균 셀을 접종 받고, 미호기성 조건(85% N2, 10% CO2, 5% O2) 하의 셰이커에서 48시간 동안 배양된다(Hiratsuka 등, 2005).
헬리코박터 파일로리균 균주는 상술한 바와 같이 액체 배양액에서 배양되었고, 세균 생장의 원심분리에 의해 획득된 습한 셀 덩어리가 에탄올, 아세톤과 경석유 에테르로 두 번 연속하여 세정처리되었고, 그리고 공기건조되었다. LPS는 공기건조된 셀 덩어리로부터 웨스트펄과 잔(Westphal and Jann)의 더운 페놀-물 추출 절차(1965)에 의해 추출되었다. LPS는 익스텐시브 투석과 냉동건조 뒤에 액상으로부터 획득되었고, 헬리코박터 파일로리균 LPS는 초원심력(105,000xg, 4℃, 12h)에 의해 더 정제되었고, 펠릿은 증류수에서 부유되고 냉동건조되었다.
슈가 조성물 분석은 알디톨 아세테이트 방법(Sawardeker 등, 1967)에 의해 수행되었다. 가수분해가 4시간 동안 100℃로 트리플루오로아세트산 4M 또는 16시간 동안 100℃로 트리플루오로아세트산 2M에서 이루어졌고, NaBH4로 H2O에서 환원되고, 언하이드라이드/피리딘에 의한 후속 아세틸화 반응이 이어졌다. 알디톨 아세테이트 유도체는 이전에 기술되는 것처럼 분석되었다(Altman 등, 2003). 메틸화 분석은 Ciucanu & Kerek 방법(1984)에 의해 수행되고, 이전에 기술된 것처럼 가스 액체 크로마토그래피-분광계(GLC-MS)에 의해 퍼메틸화 알디톨 아세테이트 유도체의 특성화가 실시되었다(Altman 등, 2003)
알디톨 아세테이트로서의 헬리코박터 파일로리균 26695 HP0826::Kan으로부터의 정제된 LPS의 슈가 분석은 O-사슬의 결여된 구조의 존재를 표시함으로써(로간 등, 2000), 0.4:5.0:1.5:4.3:6.4:1.4의 대략의 몰비로 L-푸코스(L-Fuc), D-글루코스(D-Glc), D-갈락토스(D-Gal), N-아세틸-D-글루코사민(D-GlcNAc), D-글리세로-D-마노-헵토스(DD-Hep) 및 L-글리세로-D-마노-헵토스(LD-Hep)의 존재를 나타냈다. 원상태의 26695 HP0826::Kan LPS에서 수행된 메틸화 분석은 이러한 결과물들로 유지되었고, 0.1:1.0:1.1:0.1:1.2:1.0:6.0:0.4:1.2:1.1:3.1:0.5:1.6:1.2:0.1:0.3:0.4의 대략의 몰비로 말단 L-Fuc, 3-치환 L-Fuc, 말단 D-Glc, 말단 D-Gal, 3-치환 글루코오스, 4-치환 D-Gal, 6-치환 글루코오스, 말단 DD-Hep, 2-치환 DD-Hep, 6-치환 DD-Hep, 3-치환 DD-Hep, 7-치환 DD-Hep, 2,7-치환 DD-Hep, 2-치환 LD-Hep, 3-치환 LD-Hep, 말단 D-GlcNAc 및 3-치환 D-GlcNAc의 존재를 나타냈다. 3,4-치환 D-GlcNAc와 2-연결 D-Gal, Le 항원 포함 O-사슬의 특성은 탐지되지 않았다. LPS의 퓨리티는 RNA 유도 리비톨의 부존재에 의해 확인되었다. 26695 LPS의 조성물과 메틸화 분석은 다른 곳에서 보고되었다(로간 등, 2005). 모든 당질은 피라노오즈 형태로 존재했다.
실시예 2: 모세관의 전기 영동 질량 분광계( CE - MS )에 의해 탈지된 헬리코박터 파일로리균 26695 HP0826::Kan LPS 의 특성화.
실시예 1에서 획득된 정제된 26695 HP0826::Kan LPS(20mg)는 0.1 M 초산나트륨 완충액, pH 4.2, 100℃로 2시간 동안 가수분해되었고, 그리고 탈지된 LPS(dLPS)를 생성하기 위해 이전에 기술된 것처럼(Altman 등, 2003) 바이오-겔 P-2 칼럼에서 겔 여과에 의해 분류되었다. 3개의 프랙션(프랙션 1-3)은 모세관에 의해 수집되고 전기이동 질량 분광계로 분석되었다(CE-MS 표 1).
CE-MS에 의해, 프린스 CE 시스템(프린스 테크놀로지, 네덜란드)은 4000 QTRAP 질량 분광계(응용된 바이오시스템/MDS 사이엑스, 캐나다)에 커플링되었다. 시스 솔루션(이소프로판올-에탄올, 2:1)은 1.0μL/min의 유량으로 전달되었다. 분리는 탈이온수에서 pH 9.0, 15mM 암모늄 아세테이트를 사용하는 약 90cm 길이 극소량의 용융 실리카 캐필러리에서 획득되었다. 5kV 전기분무 이온화 전압은 양 이온 검출 모드를 위해 사용되었다. 직렬 질량 분광은 4000Da/s의 주사율로 생산 증진 이온 주사 모드(EPl)를 사용하여 획득되었다. 질소는 커튼(curtain)(12의 값에서)과 충돌 가스(˝하이˝ 스케일로 세팅)로서 사용되었다.
양이온 모드에 있는 메이져 프랙션 1의 CE-MS 분석은 대략 11개의 α-1,6-연결 잔기에 대응하는 가장 긴 글루칸 사슬, Hex 잔기의 연속적 부가물에 일치하는, m/z 1212.3, m/z 1266.3, 및m/z 1320.4의 세배 차지된 이온 시리즈의 존재를 확인했다. 이온의 신호 세기에 기초 되어, 가장 풍부한 글리코형은 10개의 α-1,6-연결 Hex를 포함했다(도 1). 양 이온 검출 모드에서 m/z 1266.3의 생성물 이온 스펙트럼은, 이전에 관찰된 주쇄 코어 프래그먼트 Hex2Hep3(PEtn)Kdo와 HexNAcHex2Hep3 (PEtn)Kdo에 각각 일치하는 m/z 1244.5와 m/z 1447.6의 진단 이온의 존재를 확인했다(도 1). LPS 코어에서 α1,6-글루칸을 운반하는, 프랙션 1과 2는 결합되었고, 컨쥬게이션을 위해 사용되었다.
Figure 112012017054947-pct00005
실시예 3: CE - MS 에 의한 O- 디아실화 26695 HP0826 :: KanLPS 의 특성화.
26695 HP0826::Kan LPS의 O-디아실화(실시예 1)는 홀스트(Holst) 등(1991)의 방법을 약간의 수정하여 실시되었다. 요약하면, LPS(4mg)는 4시간 동안 37℃로 무수 하이드라진(2ml)에서 교반되었다. 반응 혼합물은 냉각되었고, 냉아세톤(2ml)은 초과 히드라진을 파기시키기 위해 천천히 첨가되었다. 30분 뒤에, 침전된 O-디아실화된 LPS(LPS-OH)는 원심분리(4℃, 9300xg, 10분)에 의해 수집되었다. 펠릿은 냉아세톤으로 두 번 세정처리되고, 물에서 용해되고, LPS-OH(3.5mg)를 부여하여 동결 건조되었다.
양이온 모드에 있는 O-디아실화 26695 HP0826::Kan LPS(LPS-OH)의 CE-MS 분석은 실시예 2에서 기술된 것처럼 수행되었다. CE-MS의 결과는 탈지된 LPS를 위해 획득된 MS 데이터에 일치하고, HexNAc와 [HexAc, Fuc, Hep]로 각각 캡핑된 주쇄 올리고사카라이드와 주쇄 올리고사카라이드의 존재에 일치하는, m/z 1137.2, m/z 1239.2와 m/z 1408.0의 3개의 메이져 2배 차지 이온을 제시했고(표 2), 반면에 m/z 1597.7, m/z 1651.4와 m/z 1705.5의 3배 차지 이온은, 대략 12개의 α-1,6-연결 잔기에 대응하는 가장 긴 글루칸 사슬, 글루칸의 존재와 일치함을 제시했다(표 2, 도 2). m/z 1597.7의 MS/MS 스펙트럼은 [Fuc, He]와 [Fuc, Hep, HexNAc] 각각의 시퀀스 손실에 일치하는 m/z 1447.6 and m/z 1244.5의 진단 이온의 존재를 보였고(도 2), 그리고 더욱이, O-디아실화된 지질 A(지질 A-OH)의 Kdo 잔기를 통하여 연결된 코어 프래그먼트 FucHex2HexNAcHep4(PEtn)Kdo와 일치하는 m/z 1786.8의 한배 차지 이온을 제시했고, 반면에 m/z 444.4와 m/z 887.8의 이온은　 2개의 아미드-연결 3-하이드록시옥타데카노익 [C18:0(3-OH)] 지방산 사슬로 치환된 디글루코사민 주쇄를 구성하는 지질 A-OH 모이어티에 대응했다(도 2).
Figure 112012017054947-pct00006
실시예 4: 헬리코박터 파일로리균 균주 26695 HP0826 :: Kan LPS 의 NMR 분석.
PEtN 치환체의 알칼리성 가수분해는 글리콘 없이 환원 단부 GlcN 치환기를 남기므로(Hoist 등, 1991),　헬리코박터 파일로리균 균주 26695 HP0826::Kan(실시예 1)으로부터의 LPS의 저하는 지질　 A GlcN의 즉각적 환원을 위한 NaBH4의 존재 하에서 4M KOH로 완전한 디아실화로 초기화되었다. 겔 크로마토그래피에 의한 생성물의 분리는 2개의 프랙션을 부여했고, 크로마토그램의 올리고사카라이드 영역에서 희석되었다. 첨가적인 분석은 분명히 글루칸 사슬의 길이와 다른, 유사화합물을 포함하는 이들 프랙션을 보여줬다(도 3).
NMR 스펙트라(DQCOSY, TOCSY, NOESY, 1H-13C HSQC 및 HMBC)는 이전에 기술된 것처럼 표준 소프트웨어를 사용하는 베리안 500 또는 600MHz 분광계로 수행되었다(Brisson 등, 2002). 모든 NMR 실험은 1H 스펙트라의　 δ 2.225ppm과 13C 스펙트라의 31.45ppm에 있는 내부 레퍼런스로서 아세톤을 사용하여 25℃에 수행되었다.
스펙트라가 그것들의 복잡성 때문에 완전히 해석될 수 없을지라도, 양 프랙션의 NMR 스펙트라는 화합물 4에 대응한다. α-1,6-글루칸 및 DD-헵탄의 말단 잔기의 H-1 양성자는 글루칸과 헵탄 H-1의 나머지와 중첩하지 않았기 때문에 도 3에 도시된 바와 같이, 전체 구조 내에 이러한 호모폴리머의 포지션의 식별을 허용했다. 그러나 α-1,6-글루칸 사슬의 환원 말단 Glc 잔기 Z의 연결 위치는 결정되지 않았다. 그것은 미확인된 양성자와 강한 NOE 상관 관계를 보였다(후에 Hep N의 H-6으로 지정됨). 화합물 4의 NMR 데이터는　 헵탄 모이어티(X)의 제 1 Hep 잔기가 α-1,6-글루칸에 속하는 비-환원 말단 Glc 잔기 V의 O-3에 연결되었기 때문에, α-1,6-글루칸이 DD-헵탄과 내측 코어 사이에 위치된다는 것을 분명히 나타낸다. DD-헵탄의 비-환원 단부는 β-GlcN W를 가진 O-3에 치환되었다. 더 작은 올리고사카라이드 1-3에 일치하는 화합물들은 이전에 α-1,6-글루칸-less 변이체 HP0159::Kan 헬리코박터 파일로리균의 주요 성분으로서 발견되었고, 그들의 NMR 데이터가 공고되었다(Altman 등, 2008). 화합물 4를 위한 선택된 NMR 데이터는 표 3에 도시된다. 이전에 제안된 Kdo에 연결된 4개의 근접한 헵토스 잔기의 시퀀스는 임의의 검사된 화합물(도 3)에 존재하지 않는다는 것을 것은 분명히 보일 수 있다. β-GlcN 잔기 L은 직접적으로 Hep G의 O-2에 연결되었고, LPS 구조의 임의의 부분에서 Hep의 O-7에 연결된 GlcN은 없었다.
Figure 112012017054947-pct00007
LPS 구조의 첨가적인 분석을 위해 화합물 1-4를 디아실화 했다. 요약하면, 샘플은 10% AcOH에서 용해되었고 과량의 NaNO2가 첨가되었다; 3시간 뒤에, 생성물은 세파덱스 G-15 칼럼의 겔 크로마토그래피에 의해 분리되었다. 몇 가지 화합물은 그리고 NaBD4로 환원되고 탈염되었다. 결과물 화합물은 5와 6이었다. (상술한 바와 같이 수행된) 화합물 5의 NMR 스펙트라는 (알칼리성 조건 하에 있는 포스페이트 이동 때문에) Hep E의 포지션 6 또는 7에서 2개의 이성질체를 보였다. 다시, 3개의 근접한 Hep 잔기는 이전에 제안된 구조가 정확했으면 기대될 수 있는 것처럼 4개가 아니었다. (상기에 기술된) 디아미노화 반응 절차에 의한 전체 측쇄의 제거가 GlcN L이 OS 5의 당질과 분자의 잔여부와의 사이에 형성했다는 것을 확인했다.
화합물 6은 환원 단부에 있는　 DD-헵탄, α-1,6-글루칸 및 트리사카라이드 DDHep-Fuc-anh-Man-ol(N-M-L, GlcN L로부터 유도한 anh-Man L)를 포함했다. 이 생성물의 스펙트라는 거의 붐비지 않았고,　 DD-Hep N(DD-Hep N의 H-1과 H-6 사이의 TOCSY로부터)의 O-6에 α-1,6-글루칸의 부착점을 식별하는 것이 가능하게 되었다. 메틸화 분석에 의해 확인된 것처럼, 구조는 선형이었으며, 그것은 어떤 분기된 당질도 보여주지 않았다; 모든 예상 생성물은 제안된 구조(표 4)와 일치하여 식별된다.
Figure 112012017054947-pct00008
또한 DD-헵탄-α-1,6-글루칸 영역의 구조 형성 영역 화합물 6의 페리오데이트 산화의 결과로부터 획득되었다. 페리오데이트 산화는 24 시간 동안 과량의 0.1M NaIO4에서 수행되었다; 에틸렌글리콜이 첨가되었고 생성물은 세파덱스 G-15 칼럼 상의 겔 크로마토그래피에 의해 분리되었다. 그것은 NaBD4로 환원되고, 탈염되며, 100℃로 3시간 동안 2% AcOH에서 가수분해되었다. 2개의 주요 생성물, 7 및 8은 획득되었고 세파덱스 G-15 칼럼 상의 겔크로마토그래피에 의해 분리되었다.
NaBD4로의 산화된 올리고사카라이드의 환원은 NMR 스펙트라(APT-HSQC에 있는 CH2OH 신호와 비교되어 CHDOH 신호의 위상으로 전환)에서 산화된 탄소의 식별로 가능했다. 화합물 7과 8의 구조는 NMR 스펙트로스코피와 메틸화 분석에 의해 결정되었다. 화합물 7의 형성은　 DD-Hep N이 포지션 3에서 대체되지 않는다는 것을 입증했다. 화합물 6의 메틸화 반응은, 화합물 6의 NMR 데이터로부터 제안된 것처럼, 단지 말단, 3-와 6-치환 DD-Hep, DD-Hep N이 포지션 6에서 대체된다는 것을 보였다. 산화 환원에 글리세롤을 생산할 수 있는 올리고사카라이드 6의 어떤 다른 성분이 없었기 때문에, 환원 단부에 있는 글리세롤(Gro)을 가진 화합물 8의 형성은 OS 6내의 Glc V는 포지션 6의 Glc 잔기를 글리코실화 했다는 것을 확인했다. 또한 말단 글루코오스의 포지션 3에 있는 α-1,6-글루칸의 비-환원 단부에 대한 DD-헵탄 모이어티의 부착이 분명히 입증되었다.
DD-헵탄 도메인의 사이즈가 추정될 수 있다: 화합물 8은 DD-헵토스로부터 유도되는 4개의 만노스 잔기를 포함했다. 화합물 8의 스펙트라는 잘 분석되었고 H-1 신호의 통합은 거의 당량몰비율을 부여했고, 4개의 만노스 잔기의 존재를 보여줬다. 그러므로 화합물 6의 원상태의 DD-헵탄 도메인은 대부분 5개의 DD-헵토오스 단위로 구성했으며, (말단)의 하나는 페리오데이트 산화에 의해 제거되었다. 이 결론은 질량 분광계에 의해 확인되었다. 헬리코박터 파일로리균 균주 26695 HP0826::Kan에 의해 생산된 메이져 LPS 글리코형의 구조는 도 3에서 도해된다.
실시예 5:　 LPS - OH - TT . dLPS - BSA . dLPS - TT . 및 dLPS ( PJ2 )- TT 컨쥬게이트의 제조와 특성화.
보빈 세륨 알부민(BSA) 및/또는 테타누스 톡소이드(TT)에 대한 LPS-OH(실시예 3 참조)와 dLPS(실시예 2 참조)의 KdO-연결 컨쥬게이트가 준비되었다.
LPS-OH(4mg, 0.8μmol, 4789Da의 대략 평균 분자량에 기초가 된다) 또는 dLPS(4mg, 1μmol, 3779Da의 대략 평균 분자량에 기초가 된다)는 0.1M NaCl(0.4 mL)를 포함하는 0.1M 2-(N-morpholino)에탄술포닉산(MES; 시그마-알드리치, 성 루이스, Mo) 버퍼액, pH 4.8에서 용해되었다; 1-에틸-3-디메틸아미노프로필 카보드이미드(EDC; 34.38mg, 100:1 몰비; 시그마-알드리치)가 첨가되었고, 1,8-디아미노-3,6-다이옥소옥탄(15μL, 103μmol; 시그마-알드리치)도 첨가되었으며, 반응은 22℃로 4시간 동안 pH 4.8에서 유지되었다. 용액은 pH 7.0로 조절되고 증류수로 투석되거나 또는　마이크로샙 원심 장치, 1,000Da 절단(폴 라이트 사이언스, 앤 아르보르, Ml)을 사용하여 탈염되고, 그리고 동결 건조되었다.
컨쥬게이션 절차는 Fernandez-Santana 등에 의한 올리고사카라이드에 대해　기술된 것처럼 본질적으로 실시되었다(1998). 요약하면, 간격자-함유 LPS-OH(2mg, 0.4μmol) 또는 dLPS(2mg, 0.5μmol)는 22℃로 24시간 동안 건조 DMSO에서 3-말래이미도프로피오닉산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(BMPS; 2mg, 7.5μmol; 시그마-알드리치)와 반응되었다. 용액은 증류수에 대하여 투석되었고 동결 건조되었다.
BSA의 활성을 위해, 건조 DMSO1에서 3,3'-디티오디프로피온산 디(N-하이드록시숙신이미드 에스테르)(DTSP 0.63mg, 1.6μmol 시그마-알드리치)이 N2 분위기 하에서, pH 8.0의 10mM PBS 버퍼액에 미리 용해된 6mM EDTA를(최종 농도 4mg/ml) 포함한, 보빈 세륨 알부민(BSA)(분자량 66,320Da) (8mg, 0.12μmol) 의 용액에 첨가되었고, 혼합물은 22℃로 2시간 동안 교반되었다. 이것에 N2 분위기 하에서, 디티오 트레이톨(DTT 7.12mg, 46μmol 시그마-알드리치)가 첨가되었고, 혼합물은 4℃로 1시간 동안 교반되었다. 생성된 용액은 4℃에서 재생 셀룰로스막, 30,000Da 절단(YM30, 밀리폴) 상에서, 압력원으로 N2를 사용함으로써, 5mM EDTA를 포함한, 10mM PBS 버퍼액에 대해 투석되었다. 프로테인과 SH 콘탠츠는 바이친초닉산(bicinchoninic acid) 프로테인 분석 키트(BCA; 피어스,　록포드, IL)와 Ellman(1959) 방법에 의해 각각 결정되었다. 20-22 SH기의 몰 치환물이 이루어졌다.
테타누스 톡소이드(TT)(분자량, 150,000Da)의 활성을 위해, 건조 DMSO(25μL)에 있는 DTSP(0.316mg, 0.8μmol)는 6mM EDTA를(최종 농도 4mg/ml) 포함한, pH 8.0 10mM PBS 버퍼액에서, TT(4mg, 0.03μmol)의 용액으로, N2 분위기 하에서, 첨가되었고, 반응은 BSA에 대해 기술된 것처럼 진행되었다. 이것에 N2 분위기 하에서, 디티오 트레이톨(DTT 3.56mg, 23μmol 시그마-아이드리치)가 첨가되었고, 혼합물은 4℃로 1시간 동안 교반되었다. 활성화된 TT는 교반된 한외여과 셀(밀리포아)에 이동되고, 4℃에 재생 셀룰로스막, 100,000Da 절단(YM100, 밀리폴) 상에서 5mM EDTA를 포함한 pH 7.2, 10mM PBS 버퍼액에 투석되었다.
5mM EDTA를 포함한 pH 7.2, 10mM PBS 버퍼액에 있는 BSA-SH21.22 또는 TT-SH21.22의 용액으로, 5mM EDTA(최종 농도 4mg/ml)(3:1 몰비) 포함한 pH 7.2, 10mM PBS 버퍼액에 있는　말레이미도-작용 LPS-OH 또는 dLPS 유도체의 용액은 N2 분위기 하에서 첨가되었다. 반응은 4℃로 24시간 동안 교반되었다. 이것에 N-에틸말레이미드(1mg 시그마-아이드리치)가 첨가되었다. 반응은 22℃로 30분 동안 진행되었고, 결과적인 컨쥬게이트는 pH 7.2, 4℃, 4d동안, 10mM PBS 버퍼액에 대하여 투석되었다. 필터는 0.22μm 폴리비닐리덴 플루오르화물(PVDF) 멤브레인(밀렉스-GV, 밀리폴, 코르크, 아일랜드)을 사용하여 소독되었다. 컨쥬게이트는 각각, 표준으로서LPS-OH 또는 dLPS 및 BSA를 중성 당(Dubois 등, 1956)과 BCA 프로테인 분석 키트(피어스) 페놀 황산법을 사용하여 그들 탄수화물과 프로테인 함량에 대해 분석되었다. 컨쥬게이션의 효율성은 pH 7.2 10mM PBS 버퍼액과 평형된 수퍼로스(Superose) 12 10/300 GL 칼럼(아머샴 바이오사이언스, 웁살라, 스웨덴)를 사용하는 하이 퍼포먼스 액체 크로마토그래피(HPLC; 아질렌트 1200 시리즈, 아질렌트 테크놀러지스, 왈드브론, 독일)에 의해 확인되었다. 크로마토그래피는 실온에서 유량 0.5mL/min로 실시되었다. 용리는 다이오드 어레이 검출기(아질렌트 테크놀러지스)에 의해 210nm과 280nm로 모니터링되었다.
스페이서의 존재는, CH2NH2기에 대응하는 3.22ppm의 새로운 양자 공명의 외양에 의해 1H-NMR 스펙트로스코피로 확인되었다. β-말레이미도 프로피오네이트의 CH2α와 CH=CH기에 각각 상응하는, 2.55ppm과 6.9ppm에 있는 양자공명의 존재에 의해 확인된 것처럼, 스페이서 분자의 아민기는 말레이미도-작용 LPS-OH 또는 dLPS를 수득하기 위한 3-말레이미도 프로피오네익산의 N-하이드록시숙신이미드 에스테르를 가진 반응에 의해 더 유도되었다(도 4). 내측 코어 LD-Hep의 포스포 에탄올아민의 유도화는 반응제의 이론적인 양의 사용으로 최소까지만 유지되었다. 글리코 컨쥬게이트는 캐리어 프로테인의 티올화와 말레이미도-작용 LPS-OH 또는 dLPS에 대한 티올화된 프로테인의 첨가를 통하여 획득되었다(도 4). 컨쥬게이션의 효율성은 HPLC에 의해 모니터링되었다. 결과물 컨쥬게이트는 그것의 탄수화물과 프로테인 함량에 대해 분석되었다.
3개의 컨쥬게이트에서의 TT에 대한 LPS-OH의 몰비는 10:1에서 20:1로 범위가 정해졌고, 수율에 있는 탄수화물 함량에 기초하여, 13%에서 22%였다(표 5). BSA 또는 TT에 대한 dLPS의 컨쥬게이션은 현저하게 높은 탄수화물 함량을 가진 dLPS-BSA-2, dLPS-TT 또는 dLPS(PJ2)-TT 컨쥬게이트를 수득했다(표 5). LPS-OH-TT와 dLPS-BSA 또는 dLPS-TT 컨쥬게이트 모두는, 글루칸 에피토프의 구조가 변하지 않는다고 제안하는 ELISA에 의해 α1,6-글루칸 특이성 mAbs와 동일하게 반응했다.
Figure 112012017054947-pct00009
실시예 6: 마우스와 래빗의 LPS - OH - TT , dLPS - BSA , dLPS - TT 컨쥬게이트 및 dLPS(PJ2)-TT 컨쥬게이트의 면역원성.
실시예 5의 컨쥬게이트(LPS-OH-TT, dLPS-BSA, dLPS-TT와 dLPS(PJ2)-TT)의 면역원성은 마우스와 래빗에서 시험되었다.
5마리의 6-8주된 암컷 BALB/c 마우스는 적절한 컨쥬게이트로 복내강이 면역되었다. 각각의 마우스는 주사 당 0.2mL 리비 에쥬벤트에 탄수화물 2μg 또는 10μg이 주입되었다. 마우스가 말단 뒤에 리커버링된 21일과 42일동안 키워졌고, 혈청들은 51일째에 마지막 심장 천공 후에 회수되었다.
3마리의 뉴질랜드 백색 래빗은 적절한 컨쥬게이트에 의해 피하적으로 면역되었다. 각각의 래빗은 0.5mL 미완성 프로인트 에쥬벤트(adjuvant)에서 탄수화물의 10μg 또는 50μg이 주입되었다. 래빗은 28과 56일 동안 키워졌고 혈청은 65일째에 위의 전채혈 뒤에 회수되었다.
혈청에 있는 항-LPS 항체의 레벨이 정제된 LPS가 코팅 항원(1μg/well)으로서 사용된 ELISA에 의해 측정되었다. PBS로 세척된 후, 플레이트는 37℃로 1시간 동안 PBS 에 있는 1%(w/v) 보빈 세륨 알부민(BSA) 또는 MNk 희석/블로킹 용액(MDB) (KPL, 개이터스버그, MD)로 블로킹되었다. 희석된 마우스 또는 래빗의 면역 전 또는 면역 후 혈청들이 첨가되었고, 플레이트는 37℃로 2시간 동안 배양되었다. 억제 ELlSA를 위해, 억제하는 26695 HP0479::Kan LPS 또는 26695의 연속 희석은 OD45D=0.6-0.8을 부여하는 래빗 혈청들의 이전에 결정된 희석액과 혼합되었다. 이 혼합물은 22℃로 15분 동안 배양되고 그리고 나서 그것이 흡착된 LPS 항원으로 블로킹된 원래 마이크로티터 플레이트로 이동되고, 37℃로 또 다른 2시간 동안 배양되었다. 이 단계 뒤에, 간접 ELISA 절차가 뒤따른다. 요약하면, 플레이트는 PBS로 세정처리되었고, 제 2 항체, 염소 항-마우스 IgG+IgM 양고추냉이 과산화 효소 컨쥬게이트(칼택, So. 샌프랜시스코, CA)는 실온에 있는 1시간 동안 첨가되었다. 마지막 세척 단계 뒤에, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)(KPL, 개이터스버그, MD) 기질이 첨가되었고 반응은 1M 인산으로 스톱되었다. 흡광도는 마이크로타이터 플레이트 판독기를(다이나테크, 찬틸리, VA) 사용하여 450nm에서 결정되었다.
백분율 억제(inhibition)는 다음 식을 사용하여 계산되었다:
% 억제 = 100 x [ (억제제를 가진 OD - 억제제가 없는OD) / 억제제가 없는 OD ]
억제 대 로그 농도 곡선은 각각의 억제제에 대해 프로팅되었고, 절반(half) 최대 억제 농도(IC50)를 위해 요구된 농도는 보외법 곡선으로부터 결정되었다.
모든 컨쥬게이트가 세번의 주사 뒤에 양쪽 래빗과 마우스에서 동형주(26695 HP0826::Kan)와 상응하는 야생형 균주(26695)로부터의 LPS에 대하여 IgG 반응을 도출했지만(표 6에서 9), 반응은 각각의 dLPS-BSA, dLPS-TT 또는 dLPS(PJ2)- TT 로 면역된 동물에서보다 LPS-OH-TT로 면역된 마우스와 래빗에서 일반적으로 더 약했다. 각각의 LPS-OH, dLPS 또는 dLPS(PJ2)와 프로테인 담체(에쥬벤트)의 혼합물로 면역된 대조군 래빗이 동형주(26695 HP0826::Kan변이체) 또는 세번의 면역 뒤에 헬리코박터 파일로리균의 균주의 상응하는 야생형 26695로부터 LPS에 반응하지 않거나 낮은 레벨의 특이성 반응을 보였다.
Figure 112012017054947-pct00010
Figure 112012017054947-pct00011
Figure 112012017054947-pct00012
Figure 112012017054947-pct00013
교차-반응성 연구는 다양한 LPS 글리코형을 대표하는 헬리코박터 파일로리균 (몬테이로, 2001)와 선택 변이체 균주로부터의 LPS에 대한 각각의 LPS-OH-TT-2, LPS-OH-TT-3, LPS-OH-TT-4, dLPS-BSA-2, dLPS-TT 또는dLPS(PJ2)로 면역된 래빗의 면역 후 혈청들로 수행되었다. 결과는 표 10, 11과 12에 나타내어진다.
Figure 112012017054947-pct00014
Figure 112012017054947-pct00015
Figure 112012017054947-pct00016
단지 약한 교차-반응성이 α1,6-글루칸에 첨가가 불가능한 헬리코박터 파일로리균을 대표하는 SS1과 SS1HP0826::Kan LPS에 의해서 획득되었기 때문에, LPS-OH-TT-2, LPS-OH-TT-3 또는 LPS-OH-TT-4로 면역되는 래빗으로부터 획득되는 면역 후 혈청들의 반응도는, α1,6-글루칸의 존재를 위한 요구조건을 나타낸다(로간 등, 2005)(표 10). 놀랍게도, dLPS-TT로 면역되는 래빗으로부터 획득된 혈청들은 임의의 α1,6-글루칸, 즉 균주 SS1, SS1HP0826::Kan, M6 및 J99(표 11)로부터의 LPS를 포함하지 않는 코어 LPS 에피토프를 또한 인식했고, 이것은, 더 광범위한 코어 인식을 나타내고, 가능하면 TT 캐리어 프로테인의 존재 때문에, dLPS-TT 컨쥬게이트가 더 면역원성있다는 것을 제시한다.(표 11). 선택적으로, 컨쥬게이트가 3개의 글리코형의 혼합물로부터 제조된 것처럼, 면역 반응은 다른 마이너 LPS 성분에서 생성될 수 있다; 이것은 관찰된 교차 반응을 설명할 수 있다.
dLPS-TT 컨쥬게이트에 의해 유도된 래빗 혈청들의 바인딩 구체화를 입증하기 위해, 억제 ELISA는 2개의 글리코형(approx. 비율 1:1), [GlcNAc, Fuc 및 HP0826::Kan LPS로 캡핑된 선형 주쇄 올리고사카라이드 구조 그리고 선형 주쇄 올리고사카라이드](Hiratsuka 등, 2005)를 구성하는 정제된 26695 HP0479::Kan LPS로 수행되었다. 26695HP0826::Kan LPS.(도 6) 균주 SS1, SS1HP0826::Kan HP0159::Kan 및 SS1 HP0479::Kan으로부터의 글루칸-음성 LPS에 대한 래빗 혈청들의 바인딩이 26695 HP0479::Kan LPS가 억제제로서 사용되었을 때 현저하게 저지되었고, 반면에 26695 HP0826::Kan LPS는 26695 LPS가 코팅 항원으로서 사용되었을 때 가장 효율적인 억제제였다(도 6).
이종 기원 타입성 및 비타입성 균주를 인지하기 위한 래빗 면역 후 혈청들의 능력은 헬리코박터 파일로리균의 양쪽 타입성 그리고 비타입성 균주의 양자의 헬리코박터 파일로리균 레프리젠터티브의 선택된 임상적 분리주에 대한 전체-셀 ELISA(WCE)에서 또한 유효했다. 전체 셀 간접 ELISA(WCE)는 이전에 기술된 것처럼 수행되었다(Altman 등, 2008). 요약하면, 마이크로리터 플레이트의 웰은 밤새, 4℃로 100μL 균현탁액, 103cells/mL으로 코팅되었다. 웰은 메탄올로 고정되고 37℃로 2시간 동안 200μL의 MHK 희석액/블로킹 용액(MDB)(KPL, 개이터스버그, MD)으로 블로킹되었다. 다음에, 웰은 lMDB내의 1:500으로 희석된 100μL 1C4F9 복수(ascites)로 37℃에서 2시간 동안 배양되었고, 다음에 실온에서 1시간 동안 MDB내에 1:1,000으로 희석된 안티-마우스 IgG + IgM 홀스래디쉬 과산화효소(칼택) 처리되었다. 기질 TMB은 간접 ELISA에 대해 기술되는 것처럼 첨가되었다. 비특이적 백그라운드 값은 세균 세포, 2차 항체 컨쥬게이트 및 기질을 포함하는 음성 대조군 웰의 OD450으로서 결정되었다. 이러한 OD450 값은 ≤ 0.2이었다. OD450 <0.2의 광학 밀도 값은 음성적(negative)이라고 분류되었고 OD450 >0.2는 양성적 반응으로서 분류되었다. 플레이트 컨시스턴시 헬리코박터 파일로리균 균주 26695에 대한 플레이트를 확인하기 위해, 셀은 양성적 대조군으로서 사용되었다. 분석은 10% 이상 가변되지 않았다.
dLPS-TT 컨쥬게이트로 면역되는 래빗으로부터 파생된 혈청들은 전체-셀 간접 ELISA을 사용하는 시험(표 13)된 모든 균주에 대해 가장 강한 교차-반응성을 나타냈다.
Figure 112012017054947-pct00017
실시예 7: 래빗 항혈청의 살균 활성.
접종 전 또는 접종 후 래빗 혈청들(실시예 6)을 사용하는 살균 검사가 수행되었다.
플레이트 성장 헬리코박터 파일로리균 셀은 플레이트 당 PBS 5mL으로 수확되고 세정처리되었다. 원심분리 다음에, 펠릿이 PBS 25mL에서 부유되었다. 최종적 균현탁액이 4x106CFU/mL의 둘베코(Dulbecco) 인산염 완충 염류용액(DPBS)(인비트로겐, 그래드 아일랜드, NY)에서 희석되었다. 살균 검사는 바닥이 평편한 마이크로티터 플레이트(ICN)에서 수행되었다. 보체 제거 면역 전 또는 면역 후 혈청들(50μL)의 10배 연속 희석액은 각각의 웰에 첨가되었다. 균현탁액(25μL)은 그 후 첨가되고 37℃에서 15 분 동안 예비 배양되었다. 새끼 래빗 보체(세달란 연구소, 혼비, ON)는 1:50으로 희석되었고, 25μL가 적절한 웰에 첨가되었다. 플레이트는 37℃로 45분 동안 배양되고 그리고 나서 얼음 위에 놓여졌다. 10μL 부분 표본은 콜럼비아 혈액 한천 위의 트리플리케이트에 깔리고, 4일 동안 성장하고 그리고 나서, 플레이트는 콜로니형성단위(CFU)의 수를 측정하기 위해 세어졌다. 혈청들은 없는 박테리아와 보체의 대조군 플레이트는 퍼센트 치사를 계산하기 위해 사용되었다. 항균력은 50% 킬링을 초래하는 혈청들의 가장 높은 희석으로서 결정되었다.
예방 백신화 혈청들 또는 (에쥬벤트와 함께) 프로테인 담체와 LPS-OH, dLPS 또는 dLPS(PJ2)의 혼합물로 면역된 래빗으로부터 획득된 혈청들은 일치하는 헬리코박터 파일로리균 26695 HP0826::Kan 또는 야생형 26695 균주에 대한 항균력을 보여주지 않거나, 저레벨의 항균력을 보여주었다. LPS-OH-TT-4, dLPS-BSA-2, dLPS-TT 로 면역된 래빗으로부터의 사전 백신 접종 혈청들은 야생형 균주 26695에 대해 가장 높은 기능적 활성을 나타내는 dLPS-TT 컨쥬게이트로 면역된 래빗으로부터의 예방 백신화 혈청을 가진26695 HP0826::Kan변이체와 상응하는 야생형 균주(표 14) 모두에 대하여 중요한 기능적 활성을 나타냈다(표 14).
Figure 112012017054947-pct00018
더욱이, 래빗 혈청들의 항균력은 헬리코박터 파일로리균의 선택된 임상적 분리주, 즉 002CL, 0153CL과 058CL(Altman 등, 2008)에 대하여 또한 시험되었다. 이러한 분리주는 항-α1, 6-글루칸 mAbs의 WCE 분석에서 그들 OD450 값에 기초가 된 높은, 중간의 및 낮은 바인더의 대표로 선택되었다: 균주 002CL - OD450 1.361, 높은 바인더; 균주 153CL - OD450 0.29, 중간의 바인더; 접착 그리고 균주 058CL -OD450 0.162, 낮은 바인더. dLPS-TT 또는 dLPS(PJ2)-TT 컨쥬게이트로 면역된 래빗으로부터의 면역 후 혈청들만 테스트된 모든 3개의 임상적 분리주의 활동도를 나타낸다는 것을 강조하는 것이 중요하다(표 15).
Figure 112012017054947-pct00019
실시예 8: 마우스에서의 dLPS - TT컨쥬게이션에 의한 보호 연구
후보 백신으로서 dLPS-TT컨쥬게이트의 포텐셜이 과공급된 CD-1 마우스에서 평가되었다.
5 CD-1 마우스의 5개 그룹이 1μg/마우스 콜레라 톡신(CT; 시그마)를 에쥬벤트로 가진 25μg/마우스 dLPS-TT 컨쥬게이트, 1μg/마우스콜레라 톡신(대조군) 또는 염류용액(대조군)을 에쥬벤트로 가진 31.5μg/마우스 PJ2 무세포 소니케이트으로 비강을 통해 매주의 간격에 4번 백신 접종을 받았다. 마지막 면역 후 1주간, 혈청, 배설물 및 질세척액 샘플이 헬리코박터 파일로리균 특이성 IgG와 IgA를 위해 수집되고 분석되었다. 혈청 IgG와 혈청, 배설물 및 질 IgA 항체 레벨은 표준 ELISA에 의해 결정되었다. 플레이트는 여기에서 기술된 것처럼 1μg/well 헬리코박터 파일로리균 균주 26695 HP0826::Kan LPS로 코팅되었다. 혈청 샘플이 IgG 분석을 위해 1:100으로, IgA 분석을 위해 1:50으로 희석되었다. 배설물 샘플은 1:2로 희석되었고, 질 샘플은 1:20으로 희석되었다. 헬리코박터 파일로리균 특이성 항체 레벨은 결정되었고, 그래프패드 소프트웨어 버전 5.0을 사용함으로써, 데이터는 만-휘트니 분석에 의해 분석되었다.
제 1 면역, 마우스 뒤에 있는 5주간이 구두로 위관 영양 3배 이다 ~108 cfu 헬리코박터 파일로리균 균주 PJ2(Altman 등, 2003)를 가진 모든 다른 일. 4주간 후에, 마우스는 살해되었고 그들 위로부터의 실용적인 박테리아는 열거되었고 그래프패드 소프트웨어 버전 5.0을 사용함으로써, 데이터는 만-휘트니 검사에 의해 분석되었다.
CT 플러스 dLPS-TT컨쥬게이트를 가진 비강 내 면역은 매우 강한 헬리코박터 파일로리균 26695 HP0826::Kan LPS-특이성IgG 반응이 ELISA에 의해 측정됨으로써 유도되었고, 적당한 헬리코박터 파일로리균 26695 HP0826::Kan LPS-특이성IgA가 또한 탐지되었다(표 16과 17, 도 7). 게다가, 질 또는 배설물 샘플에 있는 헬리코박터 파일로리균 26695 HP0826::Kan LPS-특이성 IgA 반응이 또한 탐지되었다(p<0.01)(표 17, 도 7).
Figure 112012017054947-pct00020
Figure 112012017054947-pct00021
모든 마우스의 그룹이 이전에 긴 α1,6-글루칸을 포함한다는 것을 보여준 비타입성 헬리코박터 파일로리균 마우스-정착 균주 PJ2(Altman 등, 2003)로 구위를 통해 다음으로 접종을 받았다. 보호(protection)는 대조군 그룹과 비교하여 백신 접종 그룹에 있는 박테리아의 부하가 있는 통계적으로 상당하게 감소한 것으로 정의 되었다. dLPS-TT 컨쥬게이트 플러스 CT로 비강을 통해 면역된 마우스의 그룹의 정착 데이터는 통계적으로 상당하였다(p< 0.05)(도 8). 더욱이, 이러한 데이터는 단지 헬리코박터 파일로리균 26695 HP0826::Kan LPS-특이성IgA 항체 반응이 세균 첼린지에 대한 보호를 위해 충분하지 않고 LPS-특정성 혈청 IgG 반응이 또한 상승된 보호에 기여할 수 있다고 제안한다.
실시예 9: 덱스트란 - BSA 컨쥬게이트의 제조와 특성화 및 면역원성과 기능적 활성 연구.
덱스트란-BSA 컨쥬게이트는 pH 9.0의 0.2 M 붕산염 버퍼액, 250μL에 10mg덱스트란 T5(MW 5kDa, 파마코스모스 A/S,　 홀베크, 덴마크)를 용해함으로써 준비되었다; 이것이 pH 9.0의 0.2 M 붕산염 버퍼액에 있는 1,8-디아미노-3,6-다이옥사옥탄(25μL) 및 나트륨 시아노보로하이드라이드(10mg)를 포함하는 용액(250μL)에 첨가되었다(Roy 등(1984)에 에 의해 기술된 것과 같음). 반응은 55℃로 5일 동안 실시되었다. 반응 생성물은 LPS-기반 컨쥬게이트의 제조를 위해 상술한 바와 같이 정제되었다.
이 반응 결과는 스페이서의 도입의 결과를 낳는다. 스페이서 분자의 아민기는 LPS-기반 컨쥬게이트(실시예 5 참조)에 관해 기술된 것처럼 3-말레이미도프로피어닉산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르를 가진 반응에 의해 더 유도되었다. 글리코 컨쥬게이트는 캐리어 프로테인의 티올화 및 말레이미도-작용 덱스트란 T5에의 티올화 프로테인의 첨가를 통하여 획득되었다. 컨쥬게이트에 있는 BSA에 대한 덱스트란의 몰비는 20:1이었고, 수득율은 탄수화물 함량에 기초해서, 32%였다.
교차-반응성 연구는 다양한 LPS 글리코형과 선택 변이체 균주를 대표하는 헬리코박터 파일로리균으로부터의 LPS에 대하여 덱스트란-BSA로 면역된 래빗의 면역 후 혈청들로 수행되었다(표 18).
Figure 112012017054947-pct00022
덱스트란-BSA로 면역되는 래빗으로부터 획득된 면역 후 혈청들의 반응도는, 어떤 교차-반응도 글루칸-음성 균주 SS1과 SS1HP0826::Kan에 의해서 얻어지지 않았기 때문에, α1,6-글루칸의 존재를 위한 필요조건을 나타냈다.
덱스트란-BSA로 면역된 래빗으로부터 획득된 면역 후 혈청들은 26695 HP0826::Kan변이체 및 상응하는 야생형 변형 모두에 대한 기능적 활성을 보여줬다(표 19).
Figure 112012017054947-pct00023
이종 기원 타입성 및 비타입성 균주를 인지하고 살균 항체를 유도하기 위한 래빗 면역 후 혈청들의 성능은 덱스트란을 구성하는 컨쥬게이트, α1,6-연결 글루코오스 반복 단위의 선형 주쇄를 포함하는 고분자, 또는 연속적인 α1,6-연결 글루코오스 잔기로 구성되는 최적화된 선형 올리고사카라이드/들을 포함하는 컨쥬게이트, 및 적절한 프로테인 담체는 헬리코박터 파일로리균 감염에 대한 보호를 부여하기에 충분할 수 있다는 가능성을 제시한다.
실시예 10:　 항- 글루칸 mAbs 의 특이성 연구.
헬리코박터 파일로리균 균주 0:3 HP0826::Kan 특이성 단클론성 항체가 생산되었고 그들의 특이성이 연구되었다.
하이브리도마는 이전에 기술된 방식으로(Altman 등, 2005) 생산되었다. 6 BALB/c 마우스(찰스 리버 실험실, St 콘스턴트, QC)는 중요한 적정 농도를 달성하기 위해 108 셀(200μL)의 헬리코박터 파일로리균 균주 O:3 HP0826::Kan의 포말린 고정 셀로, 82일 이상 5회, 복강내에 주입되었다. 최종적 정맥내(i.v.) 주사가 투여되었고, 3일 후에 퓨전되었다. 2개의 마우스의 췌장 세포는 쾰러와 밀스타인(Kohler and Milstein)(1975)의 방법에 따라 Sp2/O 형질 세포종 세포 라인(plasmacytoma cell line)으로 퓨젼되었다. 368개 웰로부터의 초기의 퓨전 상청액은 간접 효소-연결 면역 흡착 분석법(ELISA)에 의해 스크리닝되었다.
ELISA에 의한 하이브리도마 스크리닝을 위해, 마이크로티터 플레이트( ICN, 코스타 메사, CA)가 37℃로 3시간 동안 pH 9.8의 50mM 카보네이트 버퍼액에서 10μg/mL의 상응하는 헬리코박터 파일로리균 0:3 HP0826::Kan LPS로 코팅되었다. PBS로 세척된 후, 플레이트는 PBS에서 5%(w/v) 보빈 세륨 알부민(BSA)로 블로킹되었다. 소비된 상청액은 첨가되었고, 플레이트는 실온에서 3시간 동안 배양되었다. 플레이트는 PBS로 제 2 항체로 세정처리되었고, 염소 항-마우스 IgG+IgM 홀스래디쉬 과산화 효소 컨쥬게이트(칼텍, So. 샌프랜시스코, CA)는 실온에서 1시간 동안 첨가되었다. 마지막 세척 단계 뒤에, 3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘(티엠비)(KPL, 개이터스버그, MD) 기질이 첨가되었고, 반응은 1M 인산으로 정지되었다. 흡광도는 마이크로타이터 플레이트 판독기를(디나테크, 찬틸리, VA) 사용하여 450nm로 결정되었다. 이 단계 뒤에, 간접 ELISA 절차가 실시예 6에서 기술된 바대로 행해졌다.
2개의 안정적 하이브리도마는 제한된 희석액 클로닝 뒤에 획득되었다. 1 클론, 1C4F9, IgM은 첨가적인 특성화를 위해 선택되었다. 복수액이 BALB/c 마우스에서 상승했고, 1C4F9 모노클로널 항체(mAb)가 제조자의 프로토콜에 따라서 IgM-특이성 친화적 컬럼을 사용하는 복수액으로부터 정제되었다(피어스, 록포드, IL).
글루칸 특이성 항체의 특이성의 연구는 연속적인 α1,6-연결 글루코오스 잔기 Glc→[α(1→6)Glc]n=1-6과 선택적으로 정제된 헬리코박터 파일로리균 LPS를 구성하는 일련의 선형 올리고사카라이드를 사용하여 실시되었다. 억제 ELISA를 위해, 이소말토-시리즈 [Glcα1→(6Glcα1→)π=1.6](US 바이올로지컬스, 스완프스콧, MS)로부터의 선형 α1,6-연결 글루코스 함유 올리고사카라이드 또는 헬리코박터 파일로리균 26695, O:3과 PJ2 LPS 억제제의 연속 희석이 준비되었고, OD450 =1을 부여하는 정제된 1C4F9의 이전에 준비가 되어 있는 희석액과 함께 혼합되었다. 배양(22℃, 15분)뒤에, 이 혼합물은 흡착된 LPS 항원을 가진 원래 블로킹된 마이크로티터 플레이트로 이동되었고, 그것이 37℃로 또 다른 2시간 동안 배양되었다. 이 단계 뒤에, 간접 ELISA 절차는 실시예 6에서 기술된 바대로 행해졌다. 백분율 억제(percentage inhibition)가 다음 식을 사용하여 계산되었다:
% 억제 = 100 x [(억제제를 가진 OD - 억제제가 없는OD) / 억제제가 없는 OD]
억제 대 로그 농도 곡선은 각각의 억제제에 대해 프로팅되었고, 절반(half) 최대 억제 농도(IC50)를 위해 요구된 농도는 보외법 곡선으로부터 결정되었다.
억제 특성이 아이소말토헥사오제(n=5) 및 아이소말토햅타오제(n=6)를 사용할 때 최적화되었다(표 20). 이전에 글루칸사슬의 6과 8 잔기 사이에 평균에 포함된다고 보여진 헬리코박터 파일로리균 PJ2 LPS(Altman 등, 2003)는 가장 효과적인 억제제가 되었다.(표 20)
Figure 112012017054947-pct00024
실시예 11: 항- 글루칸 mAbs 를 이용한 접근성 연구와 살균 검사.
항글루칸 mAbs는 간접 IF 현미경 연구(표 21)에 의해 증명된 것처럼 대표되는 헬리코박터 파일로리균으로부터 생균의 표면에 쉽게 접근가능했다. α1,6-글루칸 및 CagA 양자는 동시에 세균 표면에 구별될 수 있었다.
모노클로널 항체의 항균력을 결정하기 위해, 보체 제거 복수(50μL)로부터의 1C4F9 mAb의 10배 연속 희석은 각 웰에 첨가되었고, 균현탁액(25μL)이 첨가되었고, 37℃로 15분 동안 예비 배양되었다. 이 단계 뒤에, 절차는 실시예 7에서 기술된 것처럼 행해졌다. 1C4F9의 셀 표면 바인딩은 헬리코박터 파일로리균의 야생형과 변이 균주에 대하여 살균 검사에 의해 결정된 것처럼 기능적 활성과 상호 관련된다(표 21).
Figure 112012017054947-pct00025
본 발명의 바람직한 실시예가 상기에 기술되었지만, 다양한 변형이 거기서 만들어질 수 있는 것은 인지되고 이해될 수 있고, 첨부된 청구항이 본 발명의 사상과 범위에 포함될 수 있는 모든 변형을 커버할 수 있다.
[참고문헌]
출원 전체에서 언급된 모든 특허, 특허출원 및 출판물은 참조문헌으로서 여기에 제시한다.
Altman E, Chandan V, Larocque S, Aubry, Logan SM, Vinogradov E, Li J. 지질 폴리사카라이드 구조에서의 HP0159 ORF 변이체의 효과 및 헬리코박터 파일로리균의 정착 능력. FEMS 이뮤노 메드 마이크로 바이올 2008; 53: 204-213.
Alman E, Fernandez H, Chandan V, Harrison BA, Wilson Schuster M, Otth Rademacher L, Toledo C. 칠레로부터의 헬리코박터 파일로리균 분리주의 분석: 지질 폴리사카라이드에서의 선택형 1 루이스의 b 항원 발현의 발생. J 메드 마이크로바이올(Med Microbiol) 2008, 57: 585-591.
Altman E, Harrison BA, Hirama T, Chandan V, To R, MacKenzie R. Lex 및 Ley 혈액형 항원 특이성 헬리코박터 파일로리균 지질 폴리사카라이드에 대한 마우스 모노클로널 항체의 특성화. 바이오 켐 셀 바이올(Biochem Cell Biol) 2005, 83: 589-596.
Altman E, Smirnova N, Li J, Aubry A, Logan SM. 루이스 혈액형 O의 항원과 DD-헵토글리칸 부족 비타입성 헬리코박터 파일로리균의 발생: 정착시 코어 알파 1,6-글루칸의 역할에 대한 증거. 글리코바이올로지(Glycobiology) 2003; 13: 777-783.
Anderson PW, Pichichero ME, lnsel RA, Betts R, Eby R, Smith DH. 인간의 유아 프라이밍(priming)을 위한 구조 및 시간적 요구 사항: 프로테인 캐리어에 결합 헤모필러스 인플루엔자 B 타입의 캡슐로부터 주기적-분열 올리고사카라이드 구성 백신. J 이뮤놀(Immunol) 1986; 137: 1181-1186.
Angelakopoulos H, Hohmann EL. 성인 지원자에 있어서 헬리코박터 파일로리균 요소분해효소 발현 phoP/phoQ-삭제 살모넬라 엔테리카 혈청형 변이주 티푸스균의 시험적 연구. 인팩트 이뮨(Infect Immun) 2000; 68: 2135-2141.
Appelmelk BJ, Simmans-Smit L, Negrini R, Moran AP, Aspinall GO, Forte JG 등 자가면역에 있어 헬리코박터 파일로리균의 지질 폴리사카라이드와 호스트 루이스 혈액형 항원간의 분자 의태 포텐셜룰. 인팩트 이뮨(Infect Immun) 1996; 64: 2031-2040.
Brisson J-R, Crawford E, Uhrin D, Khieu NH, Perry MB, Severn WB, Richards JC. Mannheimia(Pasteurella) haemolytica 혈청형 A1 지질 폴리사카라이드로부터의 코어 올리고사카라이드 성분은 L-글리세로-D-마노- 및 D-글리세로-D-마노-헵토세스를 포함한다: 고해상도 NMR 분광법에 의한 구조 및 형태 분석. 켄 제이 캠(Can J Chem) 2002; 80: 949-963.
Castillo-Rojas G, Mazari-Hiriart M & Lopez-Vidal Y(2004). 헬리코박터 파일로리균: CagA 및 VacA 주요 독성 요인에 대한 포커스. 살로드 퍼블리카 드 맥시코(Salud publica de Mexico) 46: 538-548.
Chandan V, Logan SM, Harrison BA, Vinogradov E, Aubry A, Stupak J, Li J, Altman, E. 헬리코박터 파일로리균의 균주 26,695의 waaF 변이체의 특성화는 확장된 지질폴리사카라이드 구조가 위암 켈트족의 침입(invasion)시 제한된 역할을 한다는 증거를 제공한다. 바이오켐 셀 바이올(Biochem Cell Biol) 2007, 85: 582-590.
Chu C, Liu B, Watson D, Szu S, Bryla D, Shiloach J, Schneerson R, Robbins JB. 테타누스 톡소이드와 인접된 쉬겔라 다이센테리애 타입 1(쉬가의 간상균)의 O-특이 폴리사카라이드로 구성된 컨쥬게이트의 제조, 특성화와 면역원성. 인팩트 이뮨(Infect Immun) 1991; 59: 4450-4458.
Ciucanu I, Kerek F. 탄수화물의 퍼메틸화를 위한 단순하고 빠른 방법. 칼보하이드 래스(Carbohydr Res) 2004; 131: 209-217.
Cox AD, Zou W, Gidney MAJ, Lacelle S, Plested JS, Makepeace K, Wright JC, Coull PA, Moxon ER, Richards JC. 침입성 수막염 질환을 방지하기 위한 LPS-기반 글리코컨쥬게이트의 후보: 마우스와 래빗의 면역에 따른 면역학적 반응의 개발적 화학과 조사. 백신(Vaccine) 2005; 23: 5045-5054.
Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith, F. 당질과 관련 물질의 결정을 위한 색 측정 방법. 아놀 켐(Anal Chem) 1956; 28: 350-356.
Dunn BE, Cohen H, Blaser MJ. 헬리코박터 파일로리균. 크린 마이크로바이올 렙(Clin Microbiol Rev) 1997; 10: 720-741.
Ellman GL. 조직 술프히드릴기. 알크 바이오켐 바이오피스(Arch Biochem Biophys) 1959; 82: 70-77.
Fernandez-Santana V, Gonzalez-Lio R, Sarracent-Perez J, Verez-Bencomo V. 황친화성의 유도체의 사용을 통한 티올화 프로테인을 가진 5-아지도-3-옥사펜틸 글리코시드의 컨쥬게이션. 글리코컨쥬게이트(Giycoconjugate) J 1998; 15: 549-553.
Gu X-X, Tsai C-M, Ueyama T, Barenkamp SJ, Robbins JB, Lim DJ. Synthesis, 프로테인에 컨쥬게이션된 비타입성 해모필루스 인플루엔자로부터 독성이 제거된 리포올리고사카라이드의 합성, 특성화와 면역학적 성질. 인팩트 이뮨(Infect Immun) 1996; 64: 4047-4053.
Hiratsuka K, Logan SM, Conlan JW, Chandan V, Aubry A, Smirnova N, Ulrichsen H, Chan KHN, Griffith DW, Harrison BA, Li J, Altman E. 헬리코박터 파일로리균으로부터 D-글리세로-D-마노-헵토실트렌스퍼라제 유전자의 식별. J 박테리올(Bacteriol) 2005; 187: 5156-5165.
Hoist O, Brade L, Kosma P, Brade, H. 클라미디아(Chlamidia) SPP의 속-특이적 리포폴리사카라이드 에피토프를 표현하는 인공 글리코 결합의 구조, 혈청학적 특이성과 합성. J 박테리올(Bacteriol) 1991; 173: 1862-1866.
Kabat EA. 제 11 장. 항-α-(1→6)덱스트란의 분자 생물학. 단일-사이트-필링 항원 결정자에 대한 항체 반응: 탄수화물 항원(vol. 159). Garegg PJ, 린드버그 AA, eds. ACS 심포지엄 시리즈, 워싱턴: 미국 화학 학회, 1993; 146-58.
Kohler G, Milstein C. 미리 정의된 특이성의 항체를 분비하는 융합된 셀의 연속 배양. 네이쳐(Nature) 1975; 256: 495-497.
Logan SM, Altman E, Mykytczuk O, Brisson J-R, Chandan V, St Michael F, Masson A, Lecierc S, Hiratsuka K, Smirnova N, Li J, Wu Y, Wakarchuk WW. 헬리코박터 파일로리균으로부터의 리포폴리사카라이드 rfaJ 모노로그의 신규의 생합성 기능. 글리코바이오로지(Glycobiology) 2005; 15: 721-733.
Logan SM, Conian JW, Monteiro MA, Wakarchuk WW, Altman E. 헬리코박터 파일로리균의 기능 유전자학: β-1,4 글리코실트렌스라아제의 식별과 개조된 리포폴리사카라이드를 가진 변이체의 발생. 몰 마이크로바이올)(Mol Microbiol 2000; 35: 1156-1167.
Mieszala M, Kogan G, Jennings HJ. 그들의 지질 A 터미너스을 통한 메닌고코칼 리포올리고사카라이드의 컨쥬게이션은 그들의 에피토프를 보존하고, 개선된 면역학적 성질을 가지는 컨쥬게이트 백신을 낳는다. 칼보하이드 래스(Carbohydr Res) 2003; 338: 167-175.
Monteiro MA. 헬리코박터 파일로리균: 양의 탈을 쓴 늑대: 히스토 혈액형을 발현하는 헬리코박터 파일로리균 글리코 타입족: 구조, 생합성과 병원균에서의 역할. 에드 칼보하이드 켐 바이오켐)Adv Carbohydr Chem Biochem 2001; 57: 99-158.
Passwell JH, Ashkenazi S, Harlev E, Miron D, Ramon R, Farzam N, Lerner-Geva L, Levi Y, Chu C, Shiloach J, Robbins JB, Schneerson R, 이스라엘 쉬겔라 연구 그룹. 사세 어린이 한명에게의 쉬겔라 sonne/-CRM9 및 쉬겔라 플렉스네리(flexneri) 타입 2A-rEPAsucc 컨쥬게이트 백신의 안전성 및 면역원성. 페디아 인팩트 디스(Pediatr infect Dis) J 2003; 22: 701-706.
Passweli JH, Harlev E, Ashkenazi S, Chu C, Miron D, Ramon R, Farzan N, ShiSoach J, BrylaDa, Majadly F, Robθrson R, Robbins JB, Schneerson R. 이스라엘의 성인에 대한 개선된 쉬겔라 O-특이성 폴리사카라이드-프로테인 컨쥬게이트 백신의 안정성과 면역원. 인팩트 이뮨(Infect Immun) 2000; 69: 1351-1357.
Pon RA, Lussier M, Yang Q-L, Jennings HJ. N-프로피오닐화 그룹 B 메닌고코칼 폴리사카라이드는 그룹 B 나이세리아 메닝지티디스에서 유일한 살균 캡슐 에피토프를 미믹(mimic)한다. J 익스 메드(Exp Med) 1997; 185: 1929-1938.
Rossi G, Ruggiero P, Peppoloni S, Pancotto L, Fortuna D, Lauretti L, Volpini G, Mancianti S, Corazza M, Taccini E, Di Pisa F, Rappuoli R, Del Giudice G. 비글견 실험 모델의 헬리코박터 파일로리균에 대한 치료적 백신화: 안전성, 면역원성과 효능. 인팩트 이뮨(Infect Immun) 2004; 72: 3252-3259.
Roy, R., Katzenellenbogen, E., and Jennings, HJ. 1984. 변환 아미노화에 의한 프로테인에 대한 올리고사카라이드의 컨쥬게이션을 위한 향상된 절차. 켄 ㅈ이 바이오켐 셀 바이올(Can J. Biochem. Cell Biol). 62, 270-275.
Ruggiero P, Peppoloni S, Rappuoli R, Del Giudice G. 헬리코박터 파일로리균에 대한 백신을 위한 퀘스트: 마우스로부터 인간에게 어떻게 이동하는가? 마이크로브 인팩트(Microbes Infect) 2003; 5: 749-756.
Sawardeker JH, Sloneker JH, Jeannes A. 기체-액체 크로마토그래프법에 의한 그들의 알디톨(alditol) 아세테이트로서의 단당류의 정량적 결정. 아나이 켐(Anai Chem) 1967; 39: 1602-1604.
Westphal, O Jann K. 세균 폴리사카라이드. 페놀수를 이용한 추출 및 공정에서의 후속 적용법. 메스 칼보하이드 켐)Meth Carbohydr Chem 1965; 5: 83-91.
Wirth HP, Yang M, Karita M, Blaser MJ. 헬리코박터 파일로리균 분리주에 의한 인간 세포 표면의 루이스 x와 루이스 y의 글리코컨쥬게이트의 발현은 cagA 상태와 관련된다. 인펙트 이뮨(Infect Immun) 1996; 64: 4598-4605.
Yokota, S., Amano, K., Fujii, N., Yokochi, T. 일본 모집단에서의 헬리코박터 파일로리균 리포폴리사카라이드, CagA, VacA와 부분적으로 정제된 세포성 추출물에 대한 혈청 항체 역가의 비교. FEMS 마이크로비올 랫(Microbiol Lett) 2000; 185: 193-198.
Yu S, Gu X-X. 혈청형 C 모락셀라 카타르할리스에 대한 리포올리고사카라이드-기반 컨쥬게이트 백신의 생물학적 및 면역학적 특성. 인펙트 이뮨(Infect Immun) 2007; 75: 2974-2980.

Claims (26)

  1. 식 Ⅰ의 구조를 포함하는 분리된 α1,6-글루칸-함유 헬리코박터 파일로리균 화합물:
    Figure 112015033828824-pct00026

    (R은 α1,3-DD-헵탄과 연결된, 4개에서 12개의 α1,6-연결 글루코오스 잔기를 포함하는 α1,6-글루칸으로 치환된 α-DDHep-3-α-L-Fuc-3-β-GlcNAc 트리사카라이드이고, α1,3-DD-헵탄의 말단 DD-Hep 잔기는, β-GlcNAc 잔기로 캡핑된다.)
  2. 제 1 항에 있어서, 헵탄 모이어티가 2개에서 6개의 α1,3-연결 헵토스 잔기를 포함하는 것인 화합물.
  3. 제 1 항에 있어서, R은
    Figure 112015033828824-pct00027

    를 포함하며, 여기서 β-GlcNAc 잔기 L은 Hep G의 O-2로 연결되고, n=1에서 11, 및 m=0에서 4인, 화합물.
  4. 제 3 항에 있어서, n=9인 화합물.
  5. 제 3 항에 있어서, m=2인 화합물.
  6. 제 1 항에 있어서, 식 Ⅰ의 구조는 Kdo 잔기 C에 공유하여 부착된 지질 A 모이어티를 더 포함하는 화합물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 지질 A 모이어티는 O-디아실화 또는 Kdo 잔기의 케토시딕(ketosidic) 연계의 가수분해를 통하여 쪼개어지는, 화합물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 화합물은 헬리코박터 파일로리균 균주 HP0826::Kan으로부터 분리되거나 정제된, 화합물.
  9. 연결기, 프로테인 담체 또는 그들의 조합에 컨쥬게이션된 선형 α1,6-글루칸-함유 화합물을 포함하는 컨쥬게이트로서, 상기 선형 α1,6-글루칸-함유 화합물은 제 1 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항의 화합물이고, 상기 화합물은 상기 연결기, 프로테인 담체 또는 연결기를 통해 프로테인 담체에 컨쥬게이션되는 컨쥬게이트.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 선형 α1,6-글루칸-함유 화합물은 덱스트란인 컨쥬게이트.
  11. 제 9 항에 있어서, 프로테인 담체는 테타누스 톡소이드, 보빈 세륨 알부민, CRM 또는 CRM197인 컨쥬게이트.
  12. 식 Ⅰ의 구조를 포함하는 분리된 α1,6-글루칸-함유 헬리코박터 파일로리균 화합물:
    Figure 112015033828824-pct00041

    (R은 α1,3-DD-헵탄과 연결된, 4개에서 12개의 α1,6-연결 글루코오스 잔기를 포함하는 α1,6-글루칸으로 치환된 α-DDHep-3-α-L-Fuc-3-β-GlcNAc 트리사카라이드이고, α1,3-DD-헵탄의 말단 DD-Hep 잔기는, β-GlcNAc 잔기로 캡핑된다.) 또는,
    연결기, 프로테인 담체 또는 그들의 조합에 컨쥬게이션된 식 Ⅰ의 구조를 포함하는 분리된 α1,6-글루칸-함유 헬리코박터 파일로리균(H. pylori) 화합물(R은 α1,3-DD-헵탄과 연결된 α1,6-글루칸으로 치환된 α-DDHep-3-α-L-Fuc-3-β-GlcNAc 트리사카라이드이고, α1,3-DD-헵탄의 말단 DD-Hep 잔기는, β-GlcNAc 잔기로 캡핑된다.)을 포함하는 컨쥬게이트로서, 상기 분리된 α1,6-글루칸-함유 헬리코박터 파일로리균(H. pylori) 화합물은 상기 연결기, 프로테인 담체 또는 Kdo 잔기를 그들의 조합에 컨쥬게이션되는 컨쥬게이트;
    를 포함하는, 헬리코박터 파일로리균(H. pylori)에 대한 항체 생성용 조성물.
  13. 제 1 항의 α1,6-글루칸-함유 헬리코박터 파일로리균(H. pylori) 화합물을 인지하는 항체.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 항체는 모노클로널 항체 1C4F9인 항체.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제 12 항의 항체 생성용 조성물로 포유 동물을 면역시켜 생산된 면역 항혈청.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 항혈청은 동형 및 이형, 타입성 및 비타입성, 변이체 및 야생형의 헥리코벡터 파일로리균 균주에 있는 α1,6-연결 글루칸 에피토프를 인식하는 IgG를 포함하는, 면역 항혈청.
  19. 제 18 항에 있어서, IgG는 변이체 및 야생형의 α1,6-글루칸-발현 헥리코벡터 파일로리균의 보체 관여 용균작용를 초래하는 것인, 면역 항혈청.
  20. 하이브리도마 셀 라인 1C4F9.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
KR1020127005554A 2009-07-31 2010-07-30 헬리코박터 파일로리균의 지질 폴리사카라이드 외측 코어 에피토프 KR101616599B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23031509P 2009-07-31 2009-07-31
US61/230,315 2009-07-31

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120041235A KR20120041235A (ko) 2012-04-30
KR101616599B1 true KR101616599B1 (ko) 2016-04-28

Family

ID=43528669

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127005554A KR101616599B1 (ko) 2009-07-31 2010-07-30 헬리코박터 파일로리균의 지질 폴리사카라이드 외측 코어 에피토프

Country Status (10)

Country Link
US (4) US9085610B2 (ko)
EP (1) EP2459708B1 (ko)
JP (2) JP6166533B2 (ko)
KR (1) KR101616599B1 (ko)
CN (1) CN102482646B (ko)
BR (1) BR112012002230A2 (ko)
CA (1) CA2762366C (ko)
MX (1) MX2012001312A (ko)
RU (1) RU2558257C2 (ko)
WO (1) WO2011011879A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6166533B2 (ja) 2009-07-31 2017-07-19 ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ ピロリ菌リポ多糖類の外殻エピトープ
US10669353B2 (en) 2017-12-11 2020-06-02 Jiangnan University Preparation method of outer core octasaccharide of Helicobacter pylori lipopolysaccharide
CN107955082B (zh) * 2017-12-11 2019-05-10 江南大学 幽门螺旋杆菌脂多糖外核心八糖的制备方法
CN108440667A (zh) * 2018-02-24 2018-08-24 广东工业大学 一种抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体及制备方法与应用
JP6785521B2 (ja) * 2018-10-03 2020-11-18 生化学工業株式会社 エンドトキシン測定剤の感度の増強方法
CN110804617B (zh) * 2019-09-27 2020-09-22 黑龙江伊品生物科技有限公司 一种kdtA基因改造的重组菌株及其构建方法与应用
CN111467368B (zh) * 2020-04-13 2021-05-28 江南大学 含庚糖链的寡糖化合物在制备幽门螺旋杆菌疫苗中的应用
CN111943995A (zh) * 2020-08-21 2020-11-17 华东理工大学 低聚糖、糖蛋白缀合物及其制备方法和应用
CN114874345B (zh) * 2022-05-09 2023-04-28 江南大学 一种幽门螺旋杆菌核心脂多糖寡糖抗原糖链的化学合成方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2303855B (en) * 1994-07-01 1998-10-28 Rican Limited Helicobacter pylori antigenic protein preparation and immunoassays
WO1999012416A1 (en) * 1997-09-09 1999-03-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York T-independent conjugate-vaccines
WO1999052548A2 (en) * 1998-04-10 1999-10-21 Andrew Lees Conjugate vaccines for the prevention of dental caries
CU22904A1 (es) 1999-08-30 2004-01-23 Univ De Ottawa Oligosacáridos derivados de ribosa- ribitol-fosfato, métodos para prepararlos, inmunógenos que los comprenden y vacunas que comprenden dichos inmunógenos
US20020107368A1 (en) * 2000-12-07 2002-08-08 Jing-Hui Tian Helicobacter proteins, gene sequences and uses thereof
US20050255496A1 (en) * 2003-12-16 2005-11-17 Zeren Gao Ztnf12, a tumor necrosis factor
WO2006034320A2 (en) * 2004-09-21 2006-03-30 Sanofi Pasteur, Inc. Multivalent meningococcal derivatized polysaccharide-protein conjugates and vaccine
EP1672075A1 (en) * 2004-12-17 2006-06-21 Bayer CropScience GmbH Transformed plant expressing a dextransucrase and synthesizing a modified starch
US7691368B2 (en) * 2005-04-15 2010-04-06 Merial Limited Vaccine formulations
US8025880B2 (en) * 2007-03-01 2011-09-27 Helicure Ab Immunoglobulin against Helicobacter pylori
JP6166533B2 (ja) * 2009-07-31 2017-07-19 ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ ピロリ菌リポ多糖類の外殻エピトープ

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Molecula Microbiology. 2000, Vol.35, No.5, pp.1156-1167*

Also Published As

Publication number Publication date
MX2012001312A (es) 2012-06-01
US9475863B2 (en) 2016-10-25
US9085610B2 (en) 2015-07-21
US20120301480A1 (en) 2012-11-29
BR112012002230A2 (pt) 2020-08-18
RU2012107480A (ru) 2013-09-10
US20120164145A1 (en) 2012-06-28
CA2762366C (en) 2017-09-19
EP2459708A1 (en) 2012-06-06
WO2011011879A1 (en) 2011-02-03
EP2459708B1 (en) 2016-06-22
JP2013501080A (ja) 2013-01-10
US20170129941A1 (en) 2017-05-11
RU2558257C2 (ru) 2015-07-27
JP2017101036A (ja) 2017-06-08
US20150284449A1 (en) 2015-10-08
CN102482646A (zh) 2012-05-30
US9328158B2 (en) 2016-05-03
JP6166533B2 (ja) 2017-07-19
CN102482646B (zh) 2015-09-16
JP6381147B2 (ja) 2018-08-29
CA2762366A1 (en) 2011-02-03
KR20120041235A (ko) 2012-04-30
EP2459708A4 (en) 2013-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101616599B1 (ko) 헬리코박터 파일로리균의 지질 폴리사카라이드 외측 코어 에피토프
JP6771499B2 (ja) 新規の多糖及びその使用
Kabanova et al. Evaluation of a Group A Streptococcus synthetic oligosaccharide as vaccine candidate
TWI751513B (zh) E. coli O-抗原多醣生物結合物、其製備方法及其使用方法
TWI771663B (zh) E. coli O-抗原多醣生物結合物之製備方法、其組合物及其使用方法
Altman et al. Design and immunological properties of Helicobacter pylori glycoconjugates based on a truncated lipopolysaccharide lacking Lewis antigen and comprising an α-1, 6-glucan chain
Altman et al. The potential of dextran-based glycoconjugates for development of Helicobacter pylori vaccine
Naini et al. Semisynthetic glycoconjugate vaccine candidates against Escherichia coli O25B induce functional IgG antibodies in mice
US20130344104A1 (en) Oligosaccharides and oligosaccharide-protein conjugates derived from clostridium difficile polysaccharide ps-ii, methods of synthesis and uses thereof, in particular as a vaccine
US20160136285A1 (en) An isolated immunogenic bacterial antigen and its use in the prevention and treatment of infections caused by gram-negative bacteria
Kelly et al. Development of Shigella conjugate vaccines targeting Shigella flexneri 2a and S. flexneri 3a using a simple platform-approach conjugation by squaric acid chemistry
Ftacek et al. Immunochemical characterization of synthetic hexa-, octa-and decasaccharide conjugate vaccines for Vibrio cholerae O: 1 Serotype Ogawa with emphasis on antigenic density and chain length
US9616139B2 (en) Conjugating amines
Jamshidi et al. Optimization of the Synthesis and Conjugation of the Methyl Rhamnan Tip of Pseudomonas aeruginosa A-Band Polysaccharide and Immunogenicity Evaluation for the Continued Development of a Potential Glycoconjugate Vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190418

Year of fee payment: 4