CN102482646B - 幽门螺杆菌脂多糖外部核心表位 - Google Patents

幽门螺杆菌脂多糖外部核心表位 Download PDF

Info

Publication number
CN102482646B
CN102482646B CN201080039539.8A CN201080039539A CN102482646B CN 102482646 B CN102482646 B CN 102482646B CN 201080039539 A CN201080039539 A CN 201080039539A CN 102482646 B CN102482646 B CN 102482646B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pylori
dextran
helicobacter pylori
lps
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201080039539.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102482646A (zh
Inventor
E·奥尔特曼
B·A·哈里森
V·钱丹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Research Council of Canada
Original Assignee
National Research Council of Canada
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Research Council of Canada filed Critical National Research Council of Canada
Publication of CN102482646A publication Critical patent/CN102482646A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102482646B publication Critical patent/CN102482646B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/121—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Helicobacter (Campylobacter) (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/105—Delta proteobacteriales, e.g. Lawsonia; Epsilon proteobacteriales, e.g. campylobacter, helicobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/02—Dextran; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)，最常见的人病原体之一，相关于人慢性胃炎，消化性溃疡和胃癌的发展。本发明涉及含有α1，6-葡聚糖的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)化合物，其包含式I的结构：其中R是由连接到α1，3-DD-庚烷的α1，6-葡聚糖取代的α-DDHep-3-α-L-Fuc-3-β-GlcNAc三糖，及其中α1，3-DD-庚烷的最后的DD-Hep残基由β-GlcNAc残基封头。也描述包含化合物的组合物，化合物的用途，及针对化合物产生的抗体。

Description

幽门螺杆菌脂多糖外部核心表位
【之前申请信息】
本申请要求2009年7月31日提交的美国临时专利申请61/230,315的权益，将其通过引用整体并入本文。
【技术领域】
本发明涉及新幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)LPS外部核心表位。更特别是，本发明涉及新幽门螺杆菌(H.pylori)外部核心表位，其合成，表征和缀合。
【背景技术】
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)被识别为与人慢性胃炎，消化性溃疡和胃癌关联的最常见的细菌感染。幽门螺杆菌(H.pylori)感染具有约半个世界的人群的估计的流行，在发展中国家中达70％和在工业化的国家中达到20～30％(Dunn等人，1997)。绝大大多数个体在儿童时获取幽门螺杆菌(H.pylori)；发展中国家中儿童之中的感染的流行与低社会-经济状态和差的卫生相关(Castillo-Rojas等人，2004)。幽门螺杆菌(H.pylori)已由世界健康组织(WHO)鉴定为I类致癌物，由于其增加胃癌的相对风险至少6倍。胃癌是世界死亡率的第2个最常见原因，及造成700,000每年死亡(Parkin等人，2002)。
幽门螺杆菌(H.pylori)的当前根除策略基于质子泵抑制物和抗生素的使用。但是，化学治疗性干预的功效被幽门螺杆菌(H.pylori)分离物之中抗生素抗性的频度和针对再感染的免疫的缺乏限制。由此，需要新治疗来提供防止和根除幽门螺杆菌(H.pylori)感染的全局策略。
而新近调查聚焦于幽门螺杆菌(H.pylori)的发病机制中蛋白组分的作用和它们在保护性免疫中的作用(Ruggiero等人，2003；Rossi等人，2004)，相对少的研究探索了包括疫苗制剂中的蛋白之外的抗原的可能性(Angelakopoulos和Hohmann，2000)。例如，基于多糖的缀合物疫苗已知防止系统性感染及抑制宿主定居(Anderson等人，1986；Chu等人，1991；Pon等人，1997；Passwell等人，2001；Passwell等人，2003)。肠病原体的新近研究检查了基于作为用于人使用的候选疫苗的LPS缀合物的方法(Gu等人，1996；Mieszala等人，2003；Cox等人，2005；Yu和Gu，2007)。脂多糖(LPS)是幽门螺杆菌(H.pylori)的主要细胞表面组分。对许多幽门螺杆菌(H.pylori)分离物进行的结构研究(Monteiro，2001)产生了由O-链和附接于脂质A部分的核心寡糖组成的LPS的结构模型。多数幽门螺杆菌(H.pylori)株的O-链多糖主链的结构独特及显示模拟存在于人胃和肿瘤细胞的细胞表面的那些的2型和/或1型Lewis(Le)血型决定子(Wirth等人，1996)；这些可牵涉导致萎缩性胃炎的不利的自身免疫反应(Appelmelk等人，1996)。此外，幽门螺杆菌(H.pylori)LPS的外部核心区含有2种罕见的聚合物组分：DD-七聚糖和α1，6-葡聚糖(Monteiro，2001)。外部核心区幽门螺杆菌(H.pylori)LPS分离物中的α1，6-葡聚糖聚合物由HP0159开放阅读框的产物合成。幽门螺杆菌(H.pylori)中HP0159基因的存在和表达是常见的。
已表征许多幽门螺杆菌(H.pylori)LPS生物合成基因及测定了发病机制和定居中它们的作用(Logan等人，2000；Logan等人，2005；Hiratsuka等人，2005；Chandan等人，2007；Altman等人，2008)。构建了幽门螺杆菌(H.pylori)HP0826突变体及展示此突变导致缺少Le抗原的截短的LPS的形成(Logan等人，2000)。但是，未达到LPS的结构的全表征。
尽管领域内的发展，但尚未触及跨多类型的幽门螺杆菌(H.pylori)的免疫原性表位有效性。
【发明概述】
本发明涉及新的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)LPS外部核心表位。更特别是，本发明涉及新的幽门螺杆菌(H.pylori)外部核心表位，其合成，表征和缀合。
本发明提供含有α1，6-葡聚糖的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)化合物，其包含式I的结构：
R是由连接到α1，3-DD-庚烷(heptan)的α1，6-葡聚糖取代的α-DDHep-3-α-L-Fuc-3-β-GlcNAc三糖，及α1，3-DD-庚烷的最后的DD-Hep残基由β-GlcNAc残基封头。在如上所述的化合物中，α1，6-葡聚糖可包含约3～约12个α1，6-连接的葡萄糖残基，及α1，3-DD-庚烷可包含约2～约6个α1，3-连接的庚糖残基。
上述化合物的R基可为：
其中β-GlcNAc残基L连接到Hep G的O-2。在如上所述的化合物中，葡聚糖的残基Q和Z是α1，6-连接的葡萄糖残基，及n可为约1～11的任何值；残基T，Y和X是α1，3-连接的庚糖残基，及m可为约0～4的任何值。
上述化合物可分离或纯化自幽门螺杆菌(H.pylori)株HP0826::Kan。
在上述化合物中，式I的结构可还包含共价附接到Kdo残基C的脂质A部分。脂质A分子可为O-去酰化的或可通过Kdo残基的酮糖苷键的水解切割。
本发明也提供缀合物，包含缀合于接头分子，蛋白载体，或其组合的含有基本上线性α1，6-葡聚糖的化合物。含有基本上线性α1，6-葡聚糖的化合物可为本文所述的化合物，其中式I的结构缀合于接头分子，蛋白载体或其组合。含有基本上线性α1，6-葡聚糖的化合物可替代性地为葡聚糖，诸如葡聚糖T5。蛋白载体可为破伤风类毒素或牛血清白蛋白。
本发明也包括组合物，其包含一种或多于一种上述化合物或缀合物。
本发明还包括针对本文所述的含有α1，6-葡聚糖表位的化合物的抗体。抗体可为单克隆抗体1C4F9。本发明还包括杂交瘤细胞系1C4F9，其产生单克隆抗体1C4F9。
上述单克隆抗体可用于在需求治疗的个体中导致表达a1，6-葡聚糖的幽门螺杆菌(H.pylori)株的补体-介导的溶菌。
本发明也提供有效量的上述组合物用于在个体中诱导针对幽门螺杆菌(H.pylori)的免疫应答的用途。组合物中的化合物可缀合于适合的载体蛋白；额外地，组合物中的化合物可经脂多糖的2-酮基-3-脱氧-辛酮糖酸(Kdo)缀合于适合的载体蛋白。
本发明还提供通过用本文所述的免疫原性组合物免疫哺乳动物来产生的免疫抗血清。免疫抗血清可包含识别同源和异源可分型的和非-可分型的突变体和野生型株幽门螺杆菌(H.pylori)中的α1，6-连接的葡聚糖表位的IgG。IgG可导致突变体和野生型表达a1，6-葡聚糖的幽门螺杆菌(H.pylori)株的补体-介导的溶菌。
本发明的额外的方面和优势会通过以下说明显而易见。详述和实施例，在指示本发明的优选的实施方式的同时，仅通过例证方式给出，由于在本发明的范围之内的各种变化及修饰会由本领域技术人员通过本发明的教导而显而易见。
【附图说明】
现在会参照附图例示本发明的这些和其他特征，其中：
图1以阳性离子模式显示自幽门螺杆菌(H.pylori)株26695HP0826::Kan的去脂的LPS的级分1中LPS糖型的CE-MS分析。图1A显示提取的质谱(m/z 1000-1500)，而图1B显示以m/z 1266.3的离子的产物离子谱。
图2以阴性离子模式显示自幽门螺杆菌(H.pylori)株26695HP0826::Kan的O-去酰化的LPS的LPS糖型的CE-MS分析。图2A显示提取的质谱(m/z 600-2000)，而图2B显示以m/z 1597.7的离子的产物离子谱。对应于脂质A部分的碎片离子用星号标记。
图3A显示自幽门螺杆菌(H.pylori)株26695HP0826::Kan的主要LPS糖型的结构；未显示酰化。图3A的LPS的KOH脱酰基的产物显示于图3B(化合物1～4)。化合物4的脱氨基的产物显示于图3C(化合物5和6)。化合物6的高碘酸氧化的产物显示于图3D(化合物7和8)。也显示本领域就自株26695的幽门螺杆菌(H.pylori)LPS(图3E)和自株26695HP0826::Kan突变体的幽门螺杆菌(H.pylori)LPS(图3F)的之前建议的结构(从Logan等人，2000改造的)。PEtn＝磷酸乙醇胺；Glc＝D-吡喃葡萄糖；Gal＝D-吡喃半乳糖；Kdo＝2-酮基-3-脱氧-辛酮糖酸；LDHep＝L-甘油基-D-甘露糖型-庚糖；DDHep＝D-甘油基-D-甘露糖型-庚糖；GlcNAc＝2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖；GlcN＝2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖；Fuc＝L-岩藻糖；P＝磷酸；及Gro＝甘油。
图4显示制备本发明的基于LPS的缀合物的反应方案。
图5以阴性离子模式显示去脂的幽门螺杆菌(H.pylori)O：3HP0826::Kan LPS的主要级分的CE-MS分析。●：侧链中含有1个Hep残基的LPS糖型，R＝Hex5-13，Hep，HexNAc，Fuc；■：侧链中含有2个Hep残基的LPS糖型，R＝Hex8-13，Hep，Hep，HexNAc，Fuc。
图6显示由通过用自26695HP0479::Kan(图6A)和26695HP0826::Kan(图6B)的幽门螺杆菌(H.pylori)LPS的抑制ELISA的dLPS-TT缀合物引发的兔抗体的特异性的确定的坐标图。包被LPS如下所示：实心矩形-26695；实心菱形-26695HP0826::Kan；实心圆形-26695HP0159::Kan；实心三角形-26695HP0479::Kan；空心圆形-SS1；空心矩形-SS1HP0826::Kan；空心三角形-SS1HP0159::Kan；空心倒三角形-SS1 HP0479::Kan；
图7显示描绘在CD-1小鼠中的幽门螺杆菌(H.pylori)-特异性抗体应答的坐标图。小鼠经用1μg/小鼠霍乱毒素辅佐的25μg/小鼠dLPS-TT缀合物(实心条)，用1μg/小鼠霍乱毒素(斜线纹条)或盐水(空心条)辅佐的无PJ2细胞的超声处理物以每周间隔免疫接种4次。第1免疫之后4周，收集血清，粪便和阴道洗涤样品及测定幽门螺杆菌(H.pylori)-特异性IgG和IgA。个体小鼠标绘于坐标图，水平条指示组平均值(n＝5/组)。通过单尾Mann Whitney测试的*p＜0.05，**p＜0.01。
图8是描绘CD-1小鼠胃中的幽门螺杆菌(H.pylori)负荷的条形图。小鼠经用1μg/小鼠霍乱毒素辅佐的25μg/小鼠dLPS-TT缀合物(实心条)，用1μg/小鼠霍乱毒素(斜线纹条)或盐水(空心条)辅佐的无PJ2细胞的超声处理物以每周间隔免疫接种4次。第1免疫之后5周，小鼠每隔一天用～108cfu幽门螺杆菌(H.pylori)，PJ2株经口管饲3次。4周后，杀小鼠及自它们的胃计数有活力的细菌。条代表4～5只小鼠±SEM的组。*p＜0.05，单尾Mann-Whitney测试。
【实施方式】
本发明涉及新的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)LPS外部核心表位。更特别是，本发明涉及新的幽门螺杆菌(H.pylori)外部核心表位，其合成，表征和缀合。
除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常明白的相同的含义。尽管类似或相当于本文所述的那些的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，现在描述优选的方法和材料。在下文提及的全部出版物通过引用并入本文。
如本文所用，‘纯化的’不必表示绝对纯度而是作为相对定义。类似地，如本文所用，‘分离的’指称某物自其天然环境移出。
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是通常与人慢性胃炎，消化性溃疡和胃癌关联的细菌病原体；作为与幽门螺杆菌(H.pylori)感染关联的胃癌的增加的风险的结果，其被分类为I类致癌物。脂多糖(LPS)是幽门螺杆菌(H.pylori)的主要细胞表面组分。涉及幽门螺杆菌(H.pylori)LPS的结构研究的之前出版物导致建议的O-链多糖共价连接于核心寡糖，其进而附接于脂质A部分的模型。多数幽门螺杆菌(H.pylori)株的O-链多糖主链独特和可显示2型和/或1型Lewis(Le)血型决定子；此多糖组分是抗原性的。“可分型的”幽门螺杆菌(H.pylori)株具有可被抗-Lewis抗体(抗-Le)识别的Lewis表位(LeX和/或Le Y抗原)；该抗体可为可商购的及辅助分型。“非-可分型的”株不含有Lewis结构。
建立了进一步结构研究，幽门螺杆菌(H.pylori)LPS的外部核心区含有2种罕见的聚合物组分：DD-七聚糖和α1，6-葡聚糖侧链(Monteiro，2001)。Logan等人(2000)也提供了有关LPS结构的洞察。特别是，建议的结构(见图3E和3F)提供，侧链中的DD-庚糖(DD-Hep)附接于主链中的DD-Hep，而α1，6-葡聚糖附接于此侧链DD-Hep及形成另一分支。特别是，Logan等人(2000)基于FAB-MS谱(快原子轰击质量光谱法)测定了0826突变LPS中葡聚糖链的长度是1～3个葡萄糖。也描述了幽门螺杆菌(H.pylori)株26695LPS中α1，6-连接的葡萄糖的存在，及基于甲基化分析数据，但未测定葡聚糖的长度。额外地推荐，在株26695LPS中，3-取代的Hep形成O-链的GlcNAc单元和核心之间的连接。也陈述了幽门螺杆菌(H.pylori)HP0826::Kan LPS中3-连接的庚糖的存在，但未描述α1，3-庚烷的存在或其长度。未提供有关庚烷或葡聚糖侧链的结构或长度的进一步信息。本发明进一步确定了幽门螺杆菌(H.pylori)LPS的结构。
本发明提供含有新α1，6-葡聚糖的幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)化合物，其包含式I的结构：
其中R是由之后是α1，3-DD-庚烷的α1，6-葡聚糖取代的α-DDHep-3-α-L-Fuc-3-β-GlcNAc三糖，其中α1，3-DD-庚烷的最后的DD-Hep残基由β-GlcNAc残基封头。
在上述结构中，三糖(α-DDHep-3-α-L-Fuc-3-β-GlcNAc)的β-GlcNAc连接到α-DDHep G。三糖的α-DDHep连接到α1，6-葡聚糖，其进而连接于α1，3-DD-庚烷。α1，3-DD-庚烷然后连接于β-GlcNAc残基；后者可提供O-链多糖的附接点。术语“连接的”或“取代的”是指通过共价键连接的2个部分。
本文所用的术语“α1，6-葡聚糖”也可与“葡聚糖”，“α1，6-葡聚糖侧链”，“葡聚糖侧链”，“α1，6-葡聚糖部分”和/或“葡聚糖部分”互换。α1，6-葡聚糖是通过α1，6O-糖苷键连接的葡萄糖单体的线性多糖链。在一例中，其不以任何方式受限制，α1，6-葡聚糖可为线性多糖。α1，6-葡聚糖可包含任何适合的量的α1，6-葡萄糖残基。例如，及不以任何方式受限制，葡聚糖可包含约3～约12个α1，6-连接的葡萄糖残基；特别是，葡聚糖部分可包含约3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个α1，6-连接的葡萄糖残基，或通过上述任何2个值定义的任何范围。在一非限制性例中，α1，6-葡聚糖可包含9～12个α1，6-葡萄糖残基；在另一非限制性例中，α1，6-葡聚糖可包含10个α1，6-葡萄糖残基。
本文所用的术语“糖型”指具有相同的LPS结构，但α1，6-葡萄糖或α1，3-庚糖残基数不同的不同形式或类型的化合物。例如，及不旨在被理论束缚，各糖型可包含特定长度葡聚糖和/或庚烷部分或其组合。
本文所用的术语“α1，3-庚烷”也可与“α1，3-DD-庚烷”，“庚烷”，“α1，3-庚烷侧链”，“庚烷侧链”，“α1，3-庚烷部分”，“庚烷部分”，和/或“DD-七聚糖”互换。α1，3-庚烷是通过α1，3O-糖苷键连接的庚糖单体的多糖链。在一例中，其不旨在以任何方式受限，α1，3-庚烷可为线性多糖。α1，3-庚烷可包含任何适合的量的α1，3-庚糖残基。例如，及不旨在以任何方式受限，庚烷可包含约2～约6个α1，3-连接的庚糖残基；特别是，庚烷部分可包含约2，3，4，5或6个α1，3-连接的庚糖残基，或通过上述任何2个值定义的任何范围。
上述α1，3-DD-庚烷的最后的DD-Hep残基由β-GlcNAc残基封头。术语“封头的”是指β-GlcNAc残基是侧链中的最后残基；也可使用术语“终结的”。β-GlcNAc可经庚糖的位置O-2连接到DD-Hep。不旨在被理论束缚，β-GlcNAc残基可提供O-链多糖的附接点。
在一非限制性例中，R可为
其中β-GlcNAc残基L连接到Hep残基G的O-2。在此例中，β-GlcNAc残基W可提供O-链多糖的附接点。在如上所述的化合物中，葡聚糖的残基Q和Z是α1，6-连接的葡萄糖残基，及n可为约1～11的任何值，使得葡聚糖包含约3～约12个α1，6-连接的葡萄糖残基；在一特定，非限制性例中，主要糖型含有10个连续α1，6-连接的葡萄糖残基(n＝9)。在如上所述的化合物中，残基T，Y和X是α1，3-连接的庚糖残基，及m可为约0～4的任何值，使得庚烷包含约2～约6个α1，3-连接的庚糖残基；在一特定，非限制性例中，主要糖型含有4个连续α1，3-连接的庚糖残基(m＝2)。
所述结构可分离和/或纯化自任何适合的幽门螺杆菌(H.pylori)株；例如，及不旨在以任何方式受限，截短的幽门螺杆菌(H.pylori)LPS分子可分离自非-可分型的幽门螺杆菌(H.pylori)株(即，缺乏Lewis抗原的一株)，诸如及不限于在HP0826基因中具有导致缺少O-链多糖的等基因突变体的突变的幽门螺杆菌(H.pylori)株。在非限制性例中，本文所述的化合物可分离和/或纯化自幽门螺杆菌(H.pylori)株26695HP0826::Kan或株PJ2。
式I的结构，在本文中也称为“内部核心分子”，可还包含共价附接于Kdo残基，例如Kdo残基C的脂质A部分。在其他实施方式中，脂质A分子可为O-去酰化的或可为完全去酰化的。在仍其他实施方式中，脂质A部分可通过Kdo残基的酮糖苷键的水解切割。不旨在被理论束缚，可进行脂质A的切割来消除LPS的毒性及避免缀合物的可能的聚集和不溶解性。本领域技术人员会熟悉脂质A部分的酮糖苷键的O-脱酰基，脱酰基或水解的方法(见例如，Holst等人，1991；Altman等人，2003)。
本发明也提供缀合物包含含有基本上线性α1，6-葡聚糖的化合物缀合于蛋白载体。含有基本上线性α1，6-葡聚糖的化合物可为包含α1，6-连接的葡萄糖残基的任何适合的基本上线性的多糖。术语“基本上线性”是指α1，6-葡聚糖含有少分支；例如，及不旨在以任何方式受限，α1，6-葡聚糖可包含约0～约5％的α1，6-葡聚糖的分支。特别是，α1，6-葡聚糖可包含约0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5或5％分支，或它们之间的任何量；化合物也可为混合物，其中混合物之内分支的量在化合物之间彼此不同。在一非限制性例中，含有α1，6-葡聚糖的化合物可为上述及本文所述结构。在另一例中，含有α1，6-葡聚糖的化合物可为葡聚糖。葡聚糖可为迎合上述需求及具有1和10kDa之间的分子量的任何适合的葡聚糖；例如但不旨在以任何方式受限，葡聚糖可为约1，3.5，5，6.5，8或10kDa，或它们之间的任何值。在特定，非限制性例中，葡聚糖可为葡聚糖T5。在再一例中，含有α1，6-葡聚糖的化合物可为约5和8之间个α1，6-连接的葡萄糖残基的线性链；例如，及不旨在以任何方式受限，含有α1，6-葡聚糖的化合物可为5，6，7，或8个α1，6-连接的葡萄糖残基的线性链。
含有α1，6-葡聚糖的化合物缀合于接头分子和/或载体蛋白；如本领域技术人员会明白，本文所述的结构可直接缀合于载体蛋白，或可缀合于接头分子(在本文中也称为“接头”)，其进而缀合于载体蛋白。术语“缀合的”是指共价附接或连接于接头分子和/或载体蛋白的结构。本领域技术人员熟知接头和/或载体蛋白的共价连接方法；如本领域技术人员会同意，共价连接(及是否接头存在)的方法可基于使用的载体蛋白而改变。不旨在以任何方式受限，一种该方法显示于图4，其从Fernández-Santana等人(1998)改造；在此方法中，去酰化的或去脂的LPS通过将Kdo残基的羧基与接头分子共价连接，之后导入马来酰亚胺官能性来活化。将活化的LPS与硫醇化的载体蛋白混合，以产生缀合的结构。如本领域技术人员会同意，本文所述的方法是通用的，因此可使用任何其他适合的方法(例如，但不限于Chu等人，1991；Cox等人，2005；Gu等人，1996；Mieszala等人，2003；Yu和Gu，2007描述的那些)。含有α1，6-葡聚糖的化合物可经结构中任何适合的碳水化合物残基的羧基附接于接头/载体蛋白。在特定，非限制性例中，含有α1，6-葡聚糖的化合物可为本发明的结构和可经内部核心Kdo残基C附接。
载体蛋白可为本领域知道的任何适合的载体，包括免疫原性载体。例如，载体蛋白可为，但不限于破伤风类毒素，血清牛白蛋白(BSA)，白喉类毒素，突变白喉类毒素，CRM，CRM197蛋白，假单胞菌属(Pseudomonas)A蛋白，霍乱毒素(CT)蛋白，霍乱毒素突变CT-E29H蛋白，及本领域知道的其他物质，例如但绝不限于鞭毛，菌毛和其他毒素的部分。
如上所述，缀合物可通过经天然存在的基团直接连接载体蛋白和本发明的结构，或经导入间隔物或接头分子，包含但绝不限于伯氨基，酰肼，硫氢基，羧基和其他连接来制备。
本发明额外地提供包含一种或更多本文所述的化合物，一种或更多本文所述的缀合物，或其组合的组合物。在一实施方式中，组合物可包含上述化合物的糖型的混合物；例如，及不旨在以任何方式受限，组合物可包含在葡聚糖部分包含10个连续α1，6-连接的葡萄糖残基(n＝9)的主要糖型。类似地，及不旨在以任何方式受限，组合物可包含自多于一种本文所述的糖型制备的缀合物。如例中展示，由幽门螺杆菌(H.pylori)株26695 HP0826::Kan精制的用于制备缀合物的LPS结构是下列3种糖型的混合物：主链寡糖I，用GlcNAc和[GlcNAc，Fuc，Hep]封头的主链寡糖I，和含有α1，6-连接的葡聚糖的寡糖，最长葡聚糖链对应于约12个α-1，6-连接的残基，如通过CE-MS分析测定(表2，图2)。
如上所述的组合物可为免疫原性的。术语“免疫原性”是指可诱导针对幽门螺杆菌(H.pylori)野生型和/或突变株的免疫应答的组合物。免疫应答可提供针对幽门螺杆菌(H.pylori)的可分型的和非-可分型的株的广免疫原性应答。
本发明也提供有效量的本文所述的组合物用于在个体中诱导针对幽门螺杆菌(H.pylori)的免疫应答的用途。如上所述，组合物可包含一种或多于一种根据本发明的化合物。一种或多于一种化合物可缀合于接头和/或适合的载体分子。
本发明还提供通过用上述免疫原性组合物免疫哺乳动物来产生的免疫抗血清。免疫抗血清可包含或产生识别幽门螺杆菌(H.pylori)的同源和异源可分型的和非-可分型的突变体和野生型株中的α1，6-连接的葡聚糖表位的免疫后血清IgG。IgG可导致突变体和野生型表达a1，6-葡聚糖的幽门螺杆菌(H.pylori)株的补体-介导的溶菌。
本发明额外地提供抗-α1，6-葡聚糖抗体。抗体可针对本文所述的本发明的化合物产生，或可针对其他含有α1，6-葡聚糖的分子诸如葡聚糖(或葡聚糖缀合物，例如但不限于BSA-葡聚糖缀合物)产生。在一非限制性例中，抗体可为根据本领域知道的方法产生的单克隆抗体(见实施例10；Altman等人，2005)。例如，及不旨在以任何方式受限，抗体可为针对存在于幽门螺杆菌(H.pylori)HP0826突变LPS的外部核心区的α1，6-葡聚糖表位产生的单克隆抗体；更特别是，抗体可针对图5中显示的化合物产生。在仍更特定例中，单克隆抗体可为由杂交瘤细胞系1C4F9产生的IgM 1C4F9。此细胞系已于2009年7月30日，以保藏号300709-01保藏在加拿大国际保藏机构(IDAC，加拿大国家微生物学实验室，加拿大公共健康机构，1015 Arlington Street，Winnipeg，Manitoba，CANADA，R3E 3R2)。如实施例中展示，1C4F9识别可分型的和非-可分型的幽门螺杆菌(H.pylori)株的LPS和全体细胞中的α1，6-葡聚糖表位，容易可接近于活细菌表面，及与LPS-OH-TT和dLPS-BSA或dLPS-TT缀合物等同良好反应。
本发明提供1C4F9抗体在需求治疗的个体中导致突变体和野生型可分型的和非-可分型的表达a1，6-葡聚糖的幽门螺杆菌(H.pylori)株的补体-介导的溶菌的用途。如上所述，可分型的幽门螺杆菌(H.pylori)株具有抗-Le抗体识别的Lewis抗原，而非-可分型的株无。但是，由于可分型的和非-可分型的株含有α1，6-葡聚糖，两种类型的株会被1C4F9抗体识别。
目前在本领域中，幽门螺杆菌(H.pylori)株可使用可商购的针对Lewis抗原的抗体分型；但是，由于非-可分型的株不含有Lewis结构，它们不可使用此方法分类。由于多数可分型的和非-可分型的幽门螺杆菌(H.pylori)株携带α1，6-葡聚糖表位，抗-α1，6-葡聚糖抗体(诸如mAb 1C4F9)可提供筛选及表征幽门螺杆菌(H.pylori)分离物的额外的方法。
纯化幽门螺杆菌(H.pylori)株26695HP0826::Kan的LPS及通过组成，甲基化，深入核磁共振(NMR)分析，以及CE-MS数据确定其化学结构。也展示幽门螺杆菌(H.pylori)HP0826突变LPS中外部核心区的α1，6-连接的葡聚糖的存在；此结构被α1，6-葡聚糖-特异性单克隆抗体，1C4F9识别。后来的抗体使用幽门螺杆菌(H.pylori)O：3HP0826::Kan突变株的福尔马林-固定的细胞产生。这些抗体是细胞-表面可接近的和杀细菌性的。之前相信仅Lewis结构是抗原性的；由此，预料不到针对α1，6-葡聚糖的抗体的产生。
为了研究幽门螺杆菌(H.pylori)LPS的疫苗潜力，将幽门螺杆菌(H.pylori)26695HP0826::Kan突变体的修饰的LPS缀合于破伤风类毒素(TT)或牛血清白蛋白(BSA)。利用了部分去脂的或去脂的LPS的2种制备方法：通过弱肼解的LPS的O-脱酰基(LPS-OH)或通过弱酸处理的LPS的去脂(dLPS)。本领域熟知去脂和/或部分去脂的额外的方法，和该适合的方法可在本发明的范围之内使用。将LPS-OH和dLPS通过2-酮基-3-脱氧-辛酮糖酸(Kdo)残基共价连接到含有二氨基的间隔物，之后是导入马来酰亚胺官能性和缀合于硫醇化的TT或BSA，以分别产生缀合物LPS-OH-TT，dLPS-BSA和dLPS-TT。在分开的实验中，将非-可分型的株PJ2去脂及用于缀合，以产生dLPS(PJ2)-TT缀合物。
LPS-OH-TT，dLPS-BSA，dLPS-TT缀合物以及dLPS(PJ2)-TT保留了表面可接近的α1，6-葡聚糖决定子的抗原性，如通过用IgM1C4F9的间接ELISA建立。抗体显示具有优良的对于α1，6-葡聚糖决定子的特异性，和通过用自异麦芽糖-系列的寡糖的抑制ELISA确定其结合特征，及自幽门螺杆菌(H.pylori)的可分型的和非-可分型的株纯化LPS。这些研究确认，1C4F9具有对5～6个连续α1，6-连接的葡萄糖残基的需求，与Kabat(1993)假定的抗-α-(1→6)葡聚糖组合位点的尺寸一致的模式。
LPS-OH-TT，dLPS-BSA，dLPS-TT或dLPS(PJ2)-TT缀合物在小鼠和兔中具有免疫原性，及诱导针对自幽门螺杆菌(H.pylori)的同源，异源和野生型株的LPS的显著的IgG抗体应答。在接收含有dLPS的缀合物的小鼠和兔中产生10倍更强的针对免疫抗原的IgG免疫应答。用LPS-OH-TT，dLPS-BSA，dLPS-TT或dLPS(PJ2)-TT免疫的兔的免疫后血清显示针对幽门螺杆菌(H.pylori)的26695HP0826::Kan突变体和野生型26695株的杀细菌活性。
总之，这些结果指示，缺乏Le抗原及携带长α1，6-葡聚糖链的基于去脂的或部分去脂的幽门螺杆菌(H.pylori)LPS的蛋白缀合物在小鼠和兔中具有免疫原性，及诱导杀细菌抗体。需知，此表位已鉴定为具有免疫原性。此在之前不曾建立，仅Lewis结构已知具有抗原性及产生特异性抗体。
本发明会将在下列实施例中进一步阐述。但是，需知，这些例仅为例证性目的，和应不用于以任何方式限制本发明的范围。
【实施例】
【实施例1：幽门螺杆菌(H.pylori)26696HP0826::Kan LPS的分离和结构分析】
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)株26695获自Dr.R.Alm(AstraZeneca，Boston，MA)，幽门螺杆菌(H.pylori)O：3分离物来自Dr.J.Penner，J99获自Dr.D.Taylor(Alberta大学，Edmonton，Canada)，SS1自Dr.A.Lee(The University of New South Wales，Sydney，Australia)，PJ1和PJ2临床分离物是自Dr.W.Conlan(IBS，NRC)的新鲜临床分离物和M6来自Dr.K.Eaton(Michigan State University，MI)。
细菌株的生长如Hiratsuka等人(2005)所述进行。简言之，如上所述将细胞于37℃在含有7％马血的补充抗生素的Columbia血琼脂(Difco)板上在微需氧环境中生长48h(Kan 20μg/mL)(Hiratsuka等人，2005)。对于在液体培养中的生长，将含有10％胚胎牛血清的补充抗生素的布鲁氏菌属(Brucella)肉汤用自48h Columbia血琼脂/马血板收获的幽门螺杆菌(H.pylori)细胞接种，及如上所述在微需氧条件(85％N2，10％CO2，5％O2)下在摇床中温育48h(Hiratsuka等人，2005)。
将幽门螺杆菌(H.pylori)株培养于上述液体培养中，及将通过细菌生长的离心获得的湿细胞团用乙醇，丙酮和汽油醚连续洗涤两次，并经空气-干燥。从通过Westphal和Jann(1965)的热苯酚-水提取过程的空气-干燥的细胞团提取LPS。在扩展透析和冷冻干燥之后自水相获得LPS。将幽门螺杆菌(H.pylori)LPS通过超速离心(105,000×g，4℃，12h)进一步纯化，并将沉淀悬浮于蒸馏水及冷冻干燥。
通过乙酸糖醇方法(Sawardeker等人，1967)进行糖组成分析。在4M三氟乙酸中于100℃进行4h水解，或在2M三氟乙酸中于100℃进行16h水解，之后是在含NaBH4的H2O中还原，和随后用乙酸酐/吡啶乙酰化。如上所述分析乙酸糖醇衍生物(Altman等人，2003)。根据Ciucanu&Kerek(1984)的方法进行甲基化分析，及通过气相液相层析-质量光谱法(GLC-MS)如上所述(Altman等人，2003)表征过甲基化的乙酸糖醇衍生物。
作为乙酸糖醇的自幽门螺杆菌(H.pylori)26695HP0826::Kan的纯化的LPS的糖分析揭示L-岩藻糖(L-Fuc)，D-葡萄糖(D-Glc)，D-半乳糖(D-Gal)，N-乙酰-D-葡萄糖胺(D-GlcNAc)，D-甘油基-D-甘露糖型-庚糖(DD-Hep)和L-甘油基-D-甘露糖型-庚糖(LD-Hep)以0.4∶5.0∶1.5∶4.3∶6.4∶1.4的近似的摩尔比存在，指示缺乏O-链的结构的存在(Logan等人，2000)。对完整26695HP0826::Kan LPS进行的甲基化分析与这些发现一致，及显示末端L-Fuc，3-取代的L-Fuc，末端D-Glc，末端D-Gal，3-取代的葡萄糖，4-取代的D-Gal，6-取代的葡萄糖，末端DD-Hep，2-取代的DD-Hep，6-取代的DD-Hep，3-取代的DD-Hep，7-取代的DD-Hep，2，7-取代的DD-Hep，2-取代的LD-Hep，3-取代的LD-Hep，末端D-GlcNAc和3-取代的D-GlcNAc以0.1∶1.0∶1.1∶0.1∶1.2∶1.0∶6.0∶0.4∶1.2∶1.1∶3.1∶0.5∶1.6∶1.2∶0.1∶0.3∶0.4的近似的摩尔比存在。检测到无3，4-取代的D-GlcNAc和2-连接的D-Gal，含有O-链的Le抗原的特征。通过RNA来源的核糖醇的缺失确认LPS的纯度。已在别处报道26695LPS的组成和甲基化分析(Logan等人，2005)。全部糖以吡喃糖形式存在。
【实施例2：通过毛细管电泳-质量光谱法(CE-MS)的去脂的幽门螺杆菌(H.pylori)26695HP0826::Kan LPS的表征】
将纯化的在实施例1中获得的26695HP0826::Kan LPS(20mg)在0.1M乙酸钠缓冲剂，pH4.2中于100℃水解2h，及如前所述在Bio-Gel P-2柱(Altman等人，2003)上通过凝胶过滤分级分离，以产生去脂的LPS(dLPS)。收集3个级分(级分1-3)及通过毛细管电泳质量光谱法(CE-MS；表1)分析。
对于CE-MS而言，将Prince CE系统(Prince Technologies，Netherlands)偶联于4000QTRAP质谱仪(Applied Biosystems/MDSSciex，Canada)。以1.0μL/min的流速递送鞘溶液(异丙醇-甲醇，2∶1)。在约90cm长度空的熔融氧化硅毛细管上使用去离子水中的15mM乙酸铵，pH9.0获得分离物。将5kV电喷射电离电压用于阳性离子检测模式。使用增强的产生离子扫描模式(EPI)以4000Da/s的扫描速度获得串联质谱。将氮用作帘(以12的值)和冲突气体(设置到尺度“高”)。
以阳性离子模式的主要级分1的CE-MS分析确认与Hex残基的连续添加一致的m/z 1212.3，m/z 1266.3和m/z 1320.4的一系列三价离子的存在，最长葡聚糖链对应于约11个α-1，6-连接的残基。基于离子的信号强度，m/z 1266.3的最丰富的糖型含有10个α-1，6-连接的Hex(图1)。阳性离子检测模式的m/z 1266.3的离子的产物离子谱确认分别与之前观察的主链核心片段Hex2Hep3(PEtn)Kdo和HexNAcHex2Hep3(PEtn)Kdo一致的m/z 1244.5和m/z 1447.6的诊断离子的存在(图1)。将在LPS核心中携带α1，6-葡聚糖的级分1和2组合，及用于缀合。
表1.自幽门螺杆菌(H.pylori)株26695HP0826::Kan的去脂的LPS中LPS糖型的阳性-离子CE-MS数据及建议的组成
a基于平均原子质量。
bHex，HexNAc，Hep，KDO，PEtn和Fuc分别指己糖，己糖胺，庚糖，3-酮基-脱氧-D-甘露糖型-2-辛酮糖酸，磷酸乙醇胺和岩藻糖。
【实施例3：O-去酰化的26695HP0826::KanLPS通过CE-MS的表征】
根据Holst等人(1991)用一些修饰进行26695HP0826::Kan LPS(实施例1)的O-脱酰基。简言之，将LPS(4mg)在无水肼(0.2ml)中于37℃搅拌4h。将反应混合物冷却，及缓慢添加冷丙酮(2ml)，以毁坏过量肼。30min之后，通过离心(4℃，9300×g，10min)收集沉淀的O-去酰化的LPS(LPS-OH)。将沉淀用冷丙酮洗涤两次，溶解于水及冷冻干燥以给出LPS-OH(3.5mg)。
如在实施例2中描述的以阳性离子模式进行O-去酰化的26695HP0826::Kan LPS(LPS-OH)的CE-MS分析。CE-MS的结果与就去脂的LPS获得的MS数据一致，及提供与主链寡糖和分别用HexNAc和[HexAc，Fuc，Hep]封头的主链寡糖的存在一致的m/z 1137.2，m/z 1239.2和m/z 1408.0的3种主要双价离子(表2)，而m/z 1597.7，m/z 1651.4和m/z 1705.5的三价离子与葡聚糖的存在一致，最长葡聚糖链对应于约12个α-1，6-连接的残基(表2，图2)。m/z 1597.7的MS/MS谱显示分别与[Fuc，Hep]和[Fuc，Hep，HexNAc]的连续损失一致的m/z 1447.6和m/z 1244.5的诊断离子的存在(图2)及，额外地，产生与经Kdo残基连接到O-去酰化的脂质A(脂质A-OH)的核心片段FucHex2HexNAcHep4(PEtn)Kdo一致的m/z 1786.8的一价离子，同时对应于由由2酰胺-连接的3-羟基十八酸[C18:0(3-OH)]脂肪酸链取代的二葡萄糖胺主链组成的脂质A-OH部分的m/z 444.4和m/z 887.8的离子(图2)。
表2.自幽门螺杆菌(H.pylori)株26695HP0826::Kan的O-去酰化的LPS的LPS糖型的阳性-离子CE-MS数据及建议的组成
a基于平均原子质量。
b Hex，HexN，Hep，KDO，PEtn和Fuc分别指己糖，己糖胺，庚糖，3-酮基-脱氧-D-甘露糖型-2-辛酮糖酸，磷酸乙醇胺和岩藻糖。
【实施例4：幽门螺杆菌(H.pylori)株26695HP0826::Kan LPS的NMR分析】
自幽门螺杆菌(H.pylori)株26695HP0826::Kan的LPS的降解(实施例1)起始于用4M KOH在用于脂质A GlcN的立即还原的NaBH4存在下的完全脱酰基，由于PEtN取代基的碱性水解留下无苷元的还原的端GlcN(Holst等人，1991)。通过凝胶层析的产物的分离给2个级分，在层析谱的寡糖区中洗脱。进一步分析显示，这些级分含有类似化合物，葡聚糖链长度明显不同。更低分子质量级分含有化合物1～3，通过质量光谱法鉴定，且两个级分含有具有不同长度的葡聚糖部分的化合物4(图3)。
NMR谱(DQCOSY，TOCSY，NOESY，1H-13C HSQC和HMBC)在Varian 500或600MHz分光计上使用如前所述的标准软件(Brisson等人，2002)进行。全部NMR实验于25℃使用丙酮作为内部参照以对于1H谱δ2.225ppm和对于13C谱31.45ppm进行。
2个级分的NMR谱对应于化合物4，尽管谱由于它们的复杂性不可完全解析。α-1，6-葡聚糖和DD-庚烷的末端残基的H-1质子不与其余葡聚糖和庚烷H-1重叠，由此允许鉴定整个结构之内这些同聚物的位置，如示于图3。但是，未测定α-1，6-葡聚糖链的还原末端Glc残基Z的连接位置。其显示与未鉴定的质子的强NOE关联(后分配于HepN的H-6)。化合物4的NMR数据明显显示α-1，6-葡聚糖位于DD-庚烷和内部核心之间，由于庚烷部分(X)的第1Hep残基连接到属于α-1，6-葡聚糖的非-还原末端Glc残基V的O-3。DD-庚烷的非-还原末端在O-3用β-GlcN W取代。与更小寡糖1～3同一的化合物之前发现为少α-1，6-葡聚糖突变HP0159::Kan的幽门螺杆菌(H.pylori)LPS的主要成分，和出版了它们的NMR数据(Altman等人，2008)。化合物4的选择的NMR数据显示于表3。显而易见，连接于Kdo的4个连续的庚糖残基的之前建议的序列不存在于任何检查的化合物(图3)。β-GlcN残基L直接连接于Hep G的O-2，及无GlcN连接于在LPS结构的任何部分的Hep的O-7。
表3.化合物4的1H和13C-NMR分配
  单元   H/C 1   H/C 2   H/C 3   H/C 4   H/C 5   H/C 6   H/C 7
  Hep G   5.19   4.35   3.95   3.83   3.85   4.24   3.78/4.14
  100.5   77.1   70.6   68.7   74.7   70.7   72.0
  GlcN L   4.91   3.36   3.78   3.64   3.52   3.79/3.95
  97.8   56.4   83.7   69.6   77.6   61.5
  Fuc M   5.05   4.05   4.02   4.01   4.28   1.21
  103.0   69.5   77.7   72.5   69.0   16.3
  Hep N   5.15   4.05   3.91   3.84   3.84   4.08   3.90/3.90
  102.8   71.1   71.3   68.7   74.5   79.8   62.0
  Glc Z   5.15   3.61   3.74   3.52   4.11   3.76/3.99
  98.9   72.5   74.5   70.7   71.6   66.7
  Hep P   5.26   4.34   3.96   3.84   3.87   4.06   3.74/3.81
  100.8   77.1   70.7   68.7   74.6   72.8   63.0
  GlcN W   4.86   3.17   3.68   3.52   3.52   3.78/3.93
  98.2   56.3   73.1   70.8   77.6   61.5
作为进一步分析，将LPS结构化合物1～4脱胺基化。简言之，将样品溶于10％AcOH和添加过量的NaNO2；3h之后，通过在Sephadex G-15柱上凝胶层析来分离产物。然后将一些化合物用NaBD4还原及脱盐。得到的产物是化合物5和6。化合物5的NMR谱(如上述进行)显示在Hep E的第6或7位具有磷酸的2种异构体(由于在碱性条件下的磷酸迁移)。再者，如果之前建议的结构正确，如预期，存在3个连续的Hep残基，而非4个。整个侧链通过脱氨基过程的移出(以上描述的)确认，GlcN L形成OS 5和其余分子的糖之间的连接。
化合物6在还原末端含有DD-庚烷，α-1，6-葡聚糖和三糖DDHep-Fuc-anh-Man-醇(N-M-L，源于GlcN L的anh-Man L)。此产物谱欠密集，及可能鉴定α-1，6-葡聚糖与DDHep N的O-6的附接点(自DDHep N的H-1和H-6之间的TOCSY)。结构是线性的，如通过甲基化分析确认，其显示无分支的糖；全部预期的产物鉴定支持建议的结构(表4)。
表4.化合物6的1H-及13C-NMR分配
  单元，化合物   H/C 1   H/C 2   H/C 3   H/C 4   H/C 5   H/C 6   H/C 7
  anh-人-醇L   3.75   4.08   4.07   4.20   3.94   3.72/3.79
  62.1   82.6   84.4   76.6   83.8   62.0
  Fuc M   4.95   3.91   3.97   4.01   4.21   1.21
  99.8   68.7   77.7   72.6   68.3   16.3
  Hep N   5.11   4.05   3.96   3.83   3.85   4.08   3.89
  103.3   71.0   72.5   68.8   75.0   79.8   62.0
  -6-Glc Z   5.16   3.61   3.75   3.52   4.13   3.75/4.00
  98.9   72.5   74.5   70.7   71.6   66.7
  -6-Glc Q   4.99   3.59   3.73   3.52   3.91   3.75/4.00
  98.9   72.5   74.5   70.7   71.4   66.7
  -3-Glc V   4.98   3.63   3.86   3.58   3.73   3.76/3.84
  98.9   71.4   80.8   71.0   72.9   61.4
  Hep X   5.22   4.22   3.94   3.94   3.89   4.06   3.73/3.82
  102.0   70.8   79.2   67.6   75.0   72.5   62.8
  Hep Y   5.10-5.11   4.25   3.98   3.89   3.89   4.06   3.73/3.82
  103.3   70.6   79.0   67.9   75.0   72.5   62.8
  Hep T   5.11   4.25   3.98   3.89   3.89   4.06   3.73/3.82
  103.3   70.6   79.0   67.9   75.0   72.5   62.8
  Hep P   5.12   40.6   3.85   3.75   3.89   4.06   3.73/3.82
  103.3   71.0   71.8   68.6   75.0   72.5   62.8
DD-庚烷-α-1，6-葡聚糖区的结构的进一步确认获自化合物6的高碘酸氧化的结果。高碘酸氧化用过量的0.1M NaIO4进行24h；添加乙二醇，及在Sephadex G-15柱上通过凝胶层析分离产物。将其用NaBD4还原，脱盐及用2％AcOH于100℃水解3h。通过在Sephadex G-15柱上的凝胶层析获得及分离2种主要产物，7和8。
氧化的寡糖用NaBD4的还原允许NMR谱中氧化的碳的鉴定(相比APT-HSQC中的CH2OH信号的CHDOH信号的逆转期)。通过NMR光谱学和甲基化分析测定化合物7和8的结构。化合物7的形成证明，DDHep N不在第3位被取代。由于化合物6的甲基化显示仅末端，3-及6-取代的DD-Hep，DD-Hep N在第6位被取代，如从化合物6的NMR数据建议。用甘油(Gro)在还原末端的化合物8的形成确认，OS 6中的Glc V糖基化在第6位的下一Glc残基，由于无寡糖6的其他组分，其可在氧化-还原后产生甘油。也明显证明，DD-庚烷部分向在末端葡萄糖的第3位的α-1，6-葡聚糖的非-还原末端的附接。
可估计DD-庚烷结构域的尺寸：化合物8含有4个甘露糖残基，源于DD-庚糖。良好解析化合物8的谱，及H-1信号的整合给出几乎等摩尔比，及显示4个甘露糖残基的存在。由此，化合物6中的完整DD-庚烷结构域通常由5个DD-庚糖单元组成，其之一(末端)通过高碘酸氧化去除。此结论通过质量光谱法确认。通过幽门螺杆菌(H.pylori)株26695HP0826::Kan产生的主要LPS糖型的结构示于图3。
【实施例5：LPS-OH-TT，dLPS-BSA，dLPS-TT和dLPS(PJ2)-TT缀合物的制备和表征】
制备LPS-OH(见实施例3)和dLPS(见实施例2)与牛血清白蛋白(BSA)和/或破伤风类毒素(TT)的Kdo-连接的缀合物。
将LPS-OH(4mg，0.8μmol，基于4789Da的估计的平均分子质量)或dLPS(4mg，1μmol，基于3779Da的估计的平均分子质量)溶于含有0.1M NaCl(0.4mL)的0.1M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES；Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)缓冲剂，pH4.8；添加1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺(EDC；34.38mg，100∶1摩尔比；Sigma-Aldrich)，之后是1，8-二氨基-3，6-二噁辛烷(15μL，103μmol；Sigma-Aldrich)，及反应于22℃维持在pH4.8持续4h。将溶液调整到pH7.0及对蒸馏水透析，或使用Microsep离心装置，1,000Da截止值(Pall Life Sciences，Ann Arbor，MI)脱盐及冷冻干燥。
缀合过程基本上如Fernández-Santana等人(1998)对寡糖的描述进行。简言之，使含有间隔物的LPS-OH(2mg，0.4μmol)或dLPS(2mg，0.5μmol)与3-马来酰亚胺基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(BMPS；2mg，7.5μmol；Sigma-Aldrich)在干DMSO中于22℃反应24h。将溶液对蒸馏水透析，及冷冻干燥。
对于BSA的活化，将干DMSO中的3，3’-二硫代二丙酸二(N-羟基琥珀酰亚胺酯)(DTSP；0.63mg，1.6μmol；Sigma-Aldrich)在N2气氛下添加到之前溶解于含有6mM EDTA(终浓度4mg/mL)的10mM PBS缓冲剂(pH8.0)的牛血清白蛋白(BSA)(分子质量66,320Da)(8mg，0.12μmol)溶液，及将混合物于22℃搅拌2h。此之后是在N2气氛下添加二硫苏糖醇(DTT；7.12mg，46μmol；Sigma-Aldrich)，及将混合物于4℃搅拌1h。将得到的溶液对含有5mM EDTA的10mM PBS缓冲剂(pH7.2)在搅拌的超滤池(Millipore，Billerica，MA)中，使用N2作为压力源，于4℃透析过再生的纤维素膜，30,000Da截止值(YM30，Millipore)。分别通过双金鸡宁酸蛋白检定试剂盒(BCA；Pierce，Rockford，IL)和Ellman(1959)方法测定蛋白和SH含量。达到20～22SH基团的摩尔取代。
对于破伤风类毒素(TT)(分子质量，150,000Da)的活化，将干DMSO(25μL)中的DTSP(0.316mg，0.8μmol)在N2气氛下添加到在含有6mM EDTA(终浓度4mg/mL)的10mM PBS缓冲剂(pH8.0)中的TT(4mg，0.03μmol)溶液，及允许反应如对BSA所述进行。此之后是在N2气氛下添加二硫苏糖醇(DTT；3.56mg，23μmol；Sigma-Aldrich)，及将混合物于4℃搅拌1h。将活化的TT转移到搅拌的超滤池(Millipore)及对含有5mM EDTA的10mM PBS缓冲剂(pH7.2)于4℃透析过再生的纤维素膜，100,000Da截止值(YM100，Millipore)。
向在含有5mM EDTA的10mM PBS缓冲剂(pH7.2)中的BSA-SH21-22或TT-SH21-22的溶液，在N2气氛下添加在含有5mM EDTA(终浓度4mg/mL)的10mM PBS缓冲剂(pH7.2)(3∶1摩尔比)中的马来酰亚胺-官能化的LPS-OH或dLPS衍生物溶液。将反应于4℃搅拌24h。此之后是添加N-乙基马来酰亚胺(1mg；Sigma-Aldrich)。允许反应于22℃进行30min，及将得到缀合物对10mM PBS缓冲剂(pH7.2)于4℃透析4天，和将滤器使用0.22μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millex-GV，Millipore，Cork，爱尔兰)灭菌。分别使用用于中性糖的苯酚硫酸方法(Dubois等人，1956)和BCA蛋白检定试剂盒(Pierce)分析缀合物的碳水化合物和蛋白含量，用LPS-OH或dLPS和BSA作为标准物。通过高效液相层析(HPLC；Agilent 1200系列，Agilent Technologies，Waldbronn，德国)使用用10mM PBS缓冲剂(pH7.2)平衡的Superose 12 10/300GL柱(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)确认缀合效率。于室温及以流速0.5mL/min进行层析。在210nm处和280nm用二极管阵列检测器(Agilent Technologies)监控洗脱。
间隔物的存在由通过以3.22ppm(对应于CH2NH2基团)的新质子共振的呈现的1H-NMR光谱学确认。间隔物分子的胺基还通过与3-马来酰亚胺基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应来衍生，以产生马来酰亚胺-官能化的LPS-OH或dLPS，如通过以2.55ppm及6.9ppm(分别对应于β-马来酰亚胺基丙酸酯的CH2α和CH＝CH基)的质子共振的存在来确认(图4)。通过使用化学计量的试剂保持内部核心LD-Hep的磷酸乙醇胺的衍生化最小。复合糖通过载体蛋白的硫醇化和将硫醇化的蛋白添加到马来酰亚胺-官能化的LPS-OH或dLPS来获得(图4)。通过HPLC监控缀合效率。分析得到的缀合物的碳水化合物和蛋白含量。
3种缀合物中LPS-OH与TT的摩尔比跨10∶1～20∶1，及产率跨13％～22％，基于碳水化合物含量(表5)。dLPS与BSA或TT的缀合产生具有显著更高碳水化合物含量的dLPS-BSA-2，dLPS-TT或dLPS(PJ2)-TT缀合物(表5)。通过ELISA，LPS-OH-TT和dLPS-BSA或dLPS-TT缀合物与α1，6-葡聚糖-特异性mAbs等同良好反应，提示葡聚糖表位构象未变化。
表5.此研究中使用的缀合物的组成和产率
1根据Dubois等人(1956)测定碳水化合物(CHO)量；将LPS-OH或dLPS用作标准物。
2通过BCA测试测定蛋白量；将BSA用作标准物。
3使用平均分子质量值基于葡聚糖链的平均长度测定CHO与蛋白的摩尔比：对于LPS-OH是4789Da和对于dLPS是3779Da(n＝10)。dLPS(PJ2)的平均分子质量值基于葡聚糖链的平均长度(n＝8)是3261Da(Altman等人，2003)。
【实施例6：小鼠和兔中LPS-OH-TT，dLPS-BSA，dLPS-TT缀合物和dLPS(PJ2)-TT缀合物的免疫原性】
在小鼠和兔中测试实施例5的缀合物(LPS-OH-TT，dLPS-BSA，dLPS-TT，及dLPS(PJ2)-TT)的免疫原性。
将5只6～8周龄雌性BALB/c小鼠用适当的缀合物腹膜内免疫。各小鼠以0.2mL Ribi佐剂/每次注射接收2μg或10μg的碳水化合物。小鼠在第21和42天追施，并在第51天末端心脏穿刺之后回收血清。
将3只新西兰白兔用适当的缀合物皮下免疫。各兔接收10μg或50μg的在0.5mL不完全的Freunds佐剂中的碳水化合物。兔在第28和56天追施，并在第65天驱血法之后回收血清。
通过ELISA测量血清中抗-LPS抗体水平，其中将纯化的LPS用作包被抗原(1μg/孔)。用PBS洗涤之后，将板用PBS中的1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)或乳稀释液/封闭溶液(MDB)(KPL，Gaithersburg，MD)于37℃封闭1h。添加稀释的小鼠或兔免疫前或免疫后血清，及将板于37℃温育2h。对于抑制ELISA，将抑制26695HP0479::Kan LPS或26695HP0826::Kan LPS的系列稀释液与给OD450＝0.6～0.8的兔血清的之前测定的稀释液混合。将此混合物于22℃温育15min，然后转移到用吸附的LPS抗原封闭的原微孔板，其中其于37℃再温育2h。此步骤之后，后接间接ELISA过程。简言之，将涤用PBS和第2抗体板洗，于室温添加山羊抗-小鼠IgG+IgM辣根过氧化物酶缀合物(Caltag，So.san Francisco，CA)1h。最终洗涤步骤之后，添加3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(KPL，Gaithersburg，MD)底物及用1M磷酸停止反应。在450nm处使用微孔板读取器(Dynatech，Chantilly，VA)测定吸光度。
使用下式计算百分率抑制：
％抑制＝100×[(用抑制物的OD-不用抑制物的OD)/不用抑制物的OD]
对各抑制物标绘抑制对比对数浓度曲线，及从外推曲线测定一半最大抑制性浓度(IC50)需要的浓度。
在3次注射之后，全部缀合物在兔和小鼠中引发针对自同源(26695HP0826::Kan)及对应野生型(26695)株的LPS的IgG应答(表6～9)，尽管相比用dLPS-BSA，dLPS-TT或dLPS(PJ2)-TT免疫的动物，在LPS-OH-TT免疫的小鼠和兔中应答通常更弱。在3次免疫之后，用LPS-OH，dLPS或dLPS(PJ2)和蛋白载体(含佐剂)的混合物免疫的对照兔显示针对自幽门螺杆菌(H.pylori)的同源株(26695HP0826::Kan突变体)或对应野生型26695株的LPS的无或低水平特定应答。
表6.由LPS-OH-TT缀合物引发的针对幽门螺杆菌(H.pylori)26695HP0826::Kan LPS和26695LPS的鼠和兔抗体应答
a各小鼠接收10μg的碳水化合物/每次注射。
b各兔接收50μg的碳水化合物/每次注射。
c各兔接收10μg的碳水化合物/每次注射。
表7.由dLPS-BSA缀合物引发的针对幽门螺杆菌(H.pylori)26695HP0826::Kan LPS和26695LPS的鼠和兔抗体应答
a各小鼠接收10μg的碳水化合物/每次注射。
b各小鼠接收2μg的碳水化合物/每次注射
c各兔接收10μg的碳水化合物/每次注射。
d仅佐剂(IFA)。
表8.由dLPS-TT缀合物引发的针对幽门螺杆菌(H.pylori)26695HP0826::Kan LPS和26695LPS的鼠和兔抗体应答
a各小鼠接收2μg的碳水化合物/每次注射。
b各兔接收10μg的碳水化合物/每次注射。
c仅佐剂(IFA)。
表9.由dLPS(PJ2)-TT缀合物引发的针对幽门螺杆菌(H.pylori)26695HP0826::Kan LPS和26695LPS的鼠和兔抗体应答
a各小鼠接收2μg的碳水化合物/每次注射。
b各兔接收10μg的碳水化合物/每次注射。
c仅佐剂(IFA)。
利用使用针对自代表各种LPS糖型(Monteiro，2001)及选择的突变株的幽门螺杆菌(H.pylori)株的LPS的LPS-OH-TT-2，LPS-OH-TT-3，LPS-OH-TT-4，dLPS-BSA-2，dLPS-TT或dLPS(PJ2)免疫的兔的免疫后血清进行交叉反应性研究。结果显示于表10，11和12。
表10.由LPS-OH-TT和dLPS-BSA缀合物c引发的针对纯化的幽门螺杆菌(H.pylori)LPS的兔抗体应答
a免疫后血清滴度1∶100
b免疫后血清滴度1∶1,000
cOD450±10％
表11.由dLPS-TT缀合物b引发的针对纯化的幽门螺杆菌(H.pylori)LPS的兔抗体应答a
a免疫后血清滴度1∶1,000。
b OD450±10％。
表12.由dLPS(PJ2)-TT缀合物b引发的针对纯化的幽门螺杆菌(H.pylori)LPS的兔抗体应答a
a免疫后血清滴度1∶1,000。
bOD450±10％。
自用LPS-OH-TT-2，LPS-OH-TT-3或LPS-OH-TT-4免疫的兔获得的免疫后血清的反应性指示对α1，6-葡聚糖的存在的需求，由于用SS1和SS1 HP0826::Kan LPS获得仅弱交叉反应性，这些代表不能添加α1，6-葡聚糖的幽门螺杆菌(H.pylori)株(Logan等人，2005)(表10)。意外地，自用dLPS-TT免疫的兔获得的血清也识别不含有任何α1，6-葡聚糖的核心LPS表位，即自株SS1，SS1 HP0826::Kan，M6和J99的LPS(表11)，显示更宽的核心识别及推论，dLPS-TT缀合物可能由于TT载体蛋白的存在而更具有免疫原性(表11)。或者，由于缀合物从3种糖型的混合物制备，可已产生针对其他少数LPS组分的免疫应答；此可解释观察的交叉-反应。
向探针，由dLPS-TT缀合物引发的兔血清的结合特异性，用纯化的由2种糖型(大致比1∶1)，线性主链寡糖结构和用[GlcNAc，Fuc]封头的线性主链寡糖组成的26695HP0479::Kan LPS(Hiratsuka等人，2005)和26695 HP0826::Kan LPS进行抑制ELISA。当将26695HP0479::Kan LPS用作抑制物时，兔血清与自株SS1，SS1HP0826::Kan HP0159::Kan和SS1 HP0479::Kan的葡聚糖-阴性LPS的结合(图6)被显著抑制，而当将26695LPS用作包被抗原时，26695HP0826::Kan LPS是最有效的抑制物(图6)。
兔免疫后血清识别异源可分型的和非-可分型的株的能力也在针对代表幽门螺杆菌(H.pylori)的可分型的和非-可分型的株的幽门螺杆菌(H.pylori)的选择的临床分离物的全体细胞间接ELISA(WCE)中确认。如上所述进行全-细胞间接ELISA(WCE)(Altman等人，2008)。简言之，用100μL的细菌悬浮液，108细胞/mL，于4℃过夜包被微孔板的孔。然后将孔用甲醇固定，及用200μL的乳稀释液/封闭溶液(MDB)(KPL，Gaithersburg，MD)于37℃封闭2h。随后，将孔于37℃用在MDB中1∶500稀释的100μL的1C4F9腹水温育2h，之后是用在MDB中1∶1,000稀释的抗-小鼠IgG+IgM辣根过氧化物酶(Caltag)于室温温育1h。如对间接ELISA描述添加底物TMB。非特异性背景值测定为含有细菌细胞，第二抗体缀合物和底物的阴性对照孔的OD450。这些OD450值是≤0.2。OD450＜0.2的光密度值分类为阴性，和将≥0.2的OD450值分类为阳性反应。为了确保板间一致性，将幽门螺杆菌(H.pylori)株26695细胞用作阳性对照。测定不改变多于10％。
使用全体细胞间接ELISA，源于用dLPS-TT缀合物免疫的兔的血清显示与测试的全部株的最强交叉反应性(表13)。
表13.在针对幽门螺杆菌(H.pylori)的临床分离物的全-细胞间接ELISAb中兔免疫后血清a的交叉反应性
a免疫后血清滴度1∶100。
bOD450≥0.2±10％。
【实施例7：兔抗血清的杀细菌活性】
进行使用免疫前接种的或免疫后接种的兔血清的杀细菌测定(实施例6)。
收获板-生长的幽门螺杆菌(H.pylori)细胞及用5mL的PBS每板洗涤。离心后，将沉淀悬浮于25mL的PBS。将最终细菌悬浮液以4×106CFU/mL稀释于Dulbecco氏磷酸盐-缓冲的盐水(DPBS)(Invitrogen，Grand Island，NY)。在平-底微孔板(ICN)中进行杀细菌测定。将去补体的免疫前或免疫后血清的10倍系列稀释液(50μL)加入各孔。然后添加细菌悬浮液(25μL)，及于37℃预温育15min。将幼兔补体(Cedarlane Laboratories，Hornby，ON)1∶50稀释，和将25μL加入适当的孔。将板于37℃温育45min，然后放置在冰上。将10μL等份以一式三份平铺在Columbia血琼脂上，生长4天，然后对板计数，以量度集落形成单位(CFU)数。将有细菌和补体但无血清的对照平铺用于计算百分率杀。杀细菌活性测定为导致50％杀的血清的最高稀释度。
免疫接种前血清或自用蛋白载体和LPS-OH，dLPS或dLPS(PJ2)(含佐剂)的混合物免疫的兔获得的血清显示针对同源幽门螺杆菌(H.pylori)26695HP0826::Kan或野生型26695株的无或低水平的杀细菌活性。用自用呈现针对野生型株26695的最高功能活性的dLPS-TT缀合物免疫的兔的免疫接种后血清(表14)，自用LPS-OH-TT-4，dLPS-BSA-2，dLPS-TT和dLPS(PJ2)-TT免疫的兔获得的免疫后血清显示针对26695HP0826::Kan突变体及对应野生型株的显著功能活性(表14)。
表14.用由缀合物引发的兔抗血清的针对幽门螺杆菌(H.pylori)株26695HP0826::Kan和26695的杀细菌活性
a各兔接收10μg的碳水化合物/每次注射。
b相应兔免疫前血清。
此外，也测试针对幽门螺杆菌(H.pylori)，即株002CL，0153CL和058CL的选择的临床分离物的兔血清的杀细菌活性(Altman等人，2008)。这些分离物基于它们的在用抗-α1，6-葡聚糖mAbs：株002CL-OD450 1.361，高结合物；株153CL-OD450 0.29，中结合物；及株058CL-OD450 0.162，低结合物的WCE检定中的OD450值选择为代表高，中和低结合物。重要的是强调，仅自用dLPS-TT或dLPS(PJ2)-TT缀合物免疫的兔的免疫后血清用测试的全部3种临床分离物显示功能活性(表15)。
表15.用由缀合物引发的兔抗血清的针对幽门螺杆菌(H.pylori)的临床分离物的杀细菌活性
a相应兔免疫前血清。
【实施例8：通过dLPS-TT缀合物在小鼠中的保护研究】
在远亲杂交种CD-1小鼠中评价dLPS-TT缀合物作为候选疫苗的潜力。
将5只CD-1小鼠的组用25μg/小鼠的以1μg/小鼠霍乱毒素(CT；Sigma)辅佐的dLPS-TT缀合物，31.5μg/小鼠的用1μg/小鼠霍乱毒素(对照)，或盐水(对照)辅佐的无PJ2细胞的超声处理物以每周间隔鼻内免疫接种4次。最免疫后之后1周，收集血清，粪便和阴道洗涤样品及检定幽门螺杆菌(H.pylori)-特异性IgG和IgA。通过标准ELISA测定血清IgG和血清，粪便和阴道IgA抗体水平。将板用本文所述的1μg/孔幽门螺杆菌(H.pylori)株26695HP0826::Kan LPS包被。对于IgG测定，将血清样品以1∶100稀释，和对于IgA测定，将血清样品以1∶50稀释。将粪便样品以1∶2稀释，和将阴道样品以1∶20稀释。测定幽门螺杆菌(H.pylori)-特异性抗体水平及通过Mann-Whitney分析，使用GraphPad软件5.0版进行数据分析。
第1免疫之后5周，将小鼠每隔一天用～108cfu幽门螺杆菌(H.pylori)株PJ2经口管饲3次(Altman等人，2003)。4周后，杀小鼠，及自它们的胃计数有活力的细菌，及通过Mann Whitney测试，使用GraphPad软件5.0版进行数据分析。
用dLPS-TT缀合物加CT的鼻内免疫引发非常强幽门螺杆菌(H.pylori)26695HP0826::Kan LPS-特异性IgG应答，如通过ELISA测量，也检测中等幽门螺杆菌(H.pylori)26695HP0826::Kan LPS-特异性血清IgA(表16和17，图7)。此外，也检测阴道或粪便样品中的幽门螺杆菌(H.pylori)26695HP0826::Kan LPS-特异性IgA应答(p＜0.01)(表17，图7)。
表16.通过针对26695HP0826::Kan LPS的ELISA测量幽门螺杆菌(H.pylori)LPS-特异性血清IgG水平。在最后免疫之后1周和在用幽门螺杆菌(H.pylori)株PJ2细菌攻击之前收集血清。
表17.通过针对26695HP0826::Kan LPS的ELISA测量幽门螺杆菌(H.pylori)LPS-特异性血清，粪便和阴道IgA水平。在最后免疫之后1周和在用幽门螺杆菌(H.pylori)株PJ2细菌攻击之前收集样品。
全部组的小鼠随后用之前显示的非-可分型的幽门螺杆菌(H.pylori)小鼠-定居株PJ2经口胃接种，以含有长α1，6-葡聚糖(Altman等人，2003)。保护定义为相比对照组，免疫接种的组中细菌载量的统计学显著降低。用dLPS-TT缀合物加CT鼻内免疫的小鼠的组的定居数据统计学地显著(p＜0.05)(图8)。而且，这些数据提示，幽门螺杆菌(H.pylori)26695HP0826::Kan LPS-特异性血清IgA应答单独可不足以保护免于细菌攻击，及提示LPS-特异性血清IgG应答也可贡献于增加的保护。
【实施例9：葡聚糖-BSA缀合物的制备和表征和免疫原性和功能活性研究】
通过将10mg葡聚糖T5(MW 5KDa，Pharmacosmos A/S，Holbaek，丹麦)溶解于250μL的0.2M硼酸盐缓冲剂，pH9.0来制备葡聚糖-BSA缀合物；将此添加到在0.2M硼酸盐缓冲剂，pH9.0中含有1，8-二氨基-3，6-二噁辛烷(25μL)和氰基硼氢化钠(10mg)的溶液(250μL)(如Roy等人，1984所述)。反应于55℃进行5天。反应产物如上所述纯化而用于制备基于LPS的缀合物。
此反应导致间隔物的导入。间隔物分子的胺基还如对基于LPS的缀合物描述的通过与3-马来酰亚胺基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的反应来衍生(见实施例5)。通过载体蛋白的硫醇化和将硫醇化的蛋白添加到马来酰亚胺-官能化的葡聚糖T5来获得复合糖。缀合物中葡聚糖与BSA的摩尔比是20∶1，及产率是32％，基于碳水化合物含量。
交叉反应性研究利用使用针对自代表各种LPS糖型的幽门螺杆菌(H.pylori)株及选择的突变株的LPS的葡聚糖-BSA免疫的兔的免疫后血清进行(表18)。
表18.由葡聚糖-BSA缀合物c引发的针对纯化的幽门螺杆菌(H.pylori)LPS的兔a抗体应答b
a各兔接收10μg的碳水化合物/每次注射。
b免疫后血清滴度1∶100。
cOD450±10％。
自用葡聚糖-BSA免疫的兔获得的免疫后血清的反应性指示对α1，6-葡聚糖的存在的需求，由于用葡聚糖-阴性株SS1和SS1HP0826::Kan未获得交叉反应性。自用葡聚糖-BSA免疫的兔获得的免疫后血清显示针对26695HP0826::Kan突变体及对应野生型株的功能活性(表19)。
表19.用由葡聚糖-BSA缀合物引发的兔抗血清的针对幽门螺杆菌(H.pylori)株26695HP0826::Kan和26695的杀细菌活性
a各兔接收10μg的碳水化合物/每次注射。
b相应兔免疫前血清。
兔免疫后血清识别异源可分型的和非-可分型的株及诱导杀细菌抗体的能力指示由葡聚糖组成的缀合物，含有α1，6-连接的葡萄糖重复单元的线性主链的聚合物，或包含由连续α1，6-连接的葡萄糖残基组成的优化的线性寡糖的缀合物，及适合的蛋白载体可足以赋予保护免于幽门螺杆菌(H.pylori)感染的可能性。
【实施例10：抗-葡聚糖mAbs的特异性研究】
产生特异于幽门螺杆菌(H.pylori)株O：3HP0826::Kan的单克隆抗体及研究它们的特异性。
如上所述产生杂交瘤(Altman等人，2005)。给6只BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，St Constant，QC)经82天腹膜内(i.p.)注射5次108细胞(200μL)的幽门螺杆菌(H.pylori)株O：3HP0826::Kan的福尔马林-固定的细胞，以达到显著滴度。给最终静脉内(i.v.)注射，3天后是融合。根据Kohler和Milstein(1975)将2只小鼠的脾脏细胞与Sp2/O浆细胞瘤细胞系融合。通过间接酶-连接的免疫吸附测定(ELISA)筛选自368孔的初始融合上清。
关于通过ELISA的杂交瘤筛选，将微孔板(ICN，Costa Mesa，CA)用在50mM碳酸盐缓冲剂，pH9.8中的10μg/mL的对应幽门螺杆菌(H.pylori)O：3HP0826::Kan LPS于37℃包被3h。用PBS洗涤之后，将板用PBS中的5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)封闭。添加耗费的上清液，及将板于室温温育3h。将板用PBS洗涤，和于室温添加第2抗体，山羊抗-小鼠IgG+IgM辣根过氧化物酶缀合物(Caltag，So.sanFrancisco，CA)1h。最终洗涤步骤之后，添加3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(KPL，Gaithersburg，MD)底物，及用1M磷酸停止反应。在450nm处使用微孔板读取器(Dynatech，Chantilly，VA)测定吸光度。此步骤之后，如在实施例6中描述跟随间接ELISA过程。
通过限制的稀释克隆获得2种稳定的杂交瘤。选择一种克隆，1C4F9，IgM用于进一步表征。在BALB/c小鼠中产生腹水，及自腹水使用IgM-特异性亲和性柱(Pierce，Rockford，IL)根据制造商的流程纯化1C4F9单克隆抗体(mAb)。
使用由连续α1，6-连接的葡萄糖残基Glc→[α(1→6)Glc]n＝1-6组成的一系列线性寡糖和选择性纯化的幽门螺杆菌(H.pylori)LPS进行葡聚糖-特异性抗体的特异性的研究。对于抑制ELISA，制备自异麦芽糖-系列[Glcα1→(6Glcα1→)n＝1-6]的线性含有α1，6-连接的葡萄糖的寡糖(USBiologicals，Swampscott，MS)或幽门螺杆菌(H.pylori)26695，O：3和PJ2LPS抑制物的系列稀释液，及与之前制备的给OD450＝1的纯化的1C4F9的稀释液混合。温育(22℃，15min)后，将此混合物转移到含吸附的LPS抗原的原封闭的微孔板，其中将其再于37℃温育2h。此步骤之后，如在实施例6中描述跟随间接ELISA过程。使用下式计算百分率抑制：
％抑制＝100×[(用抑制物的OD-不用抑制物的OD)/不用抑制物的OD]
对各抑制物标绘抑制对比对数浓度曲线，及自外推曲线确定一半最大抑制性浓度(IC50)需要的浓度。
当使用异麦芽糖己糖(n＝5)和异麦芽糖庚糖(n＝6)(表20)时优化抑制性性质。之前显示在葡聚糖链中平均含有6和8个之间的残基(Altman等人，2003)的幽门螺杆菌(H.pylori)PJ2LPS是最有效的抑制物(表20)。
表20.用一系列线性含有α1，6-连接的葡萄糖的寡糖和幽门螺杆菌(H.pylori)株26695，O：3和PJ2的LPS的抑制ELISA
抑制物 IC50 b
异麦芽糖Glcα1→(6Glcα1→)n＝l 0
异麦芽糖丙糖Glcα1→(6Glcα1→)n＝2 a 10,000
异麦芽糖丁糖Glcα1→(6Glcα1→)n＝3 1,600
异麦芽糖戊糖Glcα1→(6Glcα1→)n＝4 460
异麦芽糖己糖Glcα1→(6Glcα1→)n＝5 290
异麦芽糖庚糖Glcα1→(6Glcα1→)n＝6 210
 26695 LPS(n＝3-4) 170
 O：3 LPS(n＝5-6) 52
 PJ2 LPS(n＝6-8) 0.29
aα1，6-连接的葡萄糖残基数
b50％抑制需要的寡糖或LPS浓度(μg/mL)。
【实施例11：使用抗-葡聚糖mAbs的可接近性研究和杀细菌测定】
如通过间接IF显微镜检研究展示，抗-葡聚糖mAbs容易可接近自代表性幽门螺杆菌(H.pylori)株的活细菌的表面(表21)。α1，6-葡聚糖和CagA可在细菌表面同时分化。
为了测定单克隆抗体的杀细菌活性，将自去补体的腹水(50μL)的1C4F9mAb的10倍系列稀释液加入各孔，之后是细菌悬浮液(25μL)及于37℃预温育15min。此步骤之后，跟随如在实施例7中描述的过程。1C4F9的细胞表面结合与功能活性关联，如通过针对幽门螺杆菌(H.pylori)的野生型和突变株的杀细菌检定测定(表21)。
表21.通过WCE，IF附着和杀细菌测定的与幽门螺杆菌(H.pylori)株的α1，6-葡聚糖的1C4F9mAbs结合的表征
a符号：++++，强烈阳性；-，阴性。
b表示为减少有活力的细胞计数50％的抗血清的稀释的倒数的杀细菌(BC50)滴度。
c自Monteiro，2001。
d自Logan等人，2000。
e自Altman等人，2003。
f未测定。
以上描述了本发明的优选的实施方式，本领域技术人员会认识及明白可对此进行各种修饰，及随附的权利要求旨在覆盖可落入本发明的精神和范围之内的全部该修饰。
【参考文献】
将本文通篇引用的全部专利、专利申请和出版物通过引用并入本文。
Altman E，Chandan V，Larocque S，Aubry A，Logan SM，Vinogradov E，Li J.Effect of the HP0159 ORF mutation on thelipopolysaccharide structure and colonizing ability of Helicobacterpylori.FEMS Immunol Med Microbiol 2008；53：204-213.
Altman E，Fernández H，Chandan V，Harrison BA，WilsonSchuster M，Otth Rademacher L，Toledo C.Analysis of Helicobacterpylori isolates from Chile：occurrence of a selective type 1 Lewis bantigen expression in lipopolysaccharide.J Med Microbiol 2008；57：585-591.
Altman E，Harrison BA，Hirama T，Chandan V，To R，MacKenzie R.Characterization of murine monoclonal antibodiesagainst Helicobacter pylori lipopolysaccharide specific for Lex and Leyblood group antigens.Biochem Cell Biol 2005；83：589-596.
Altman E，Smirnova N，Li J，Aubry A，Logan SM.Occurrence ofa nontypable Helicobacter pylori strain lacking Lewis blood group Oantigens and DD-heptoglycan：evidence for the role of the corealpha1，6-glucan in colonization.Glycobiology 2003；13：777-783.
Anderson PW，Pichichero ME，Insel RA，Betts R，Eby R，SmithDH.Vaccines consisting of periodate-cleaved oligosaccharides fromthe capsule of Haemophilus influenzae type b coupled to a proteincarrier：structural and temporal requirements for priming in thehuman infant.J Immunol 1986；137：1181-1186.
Angelakopoulos H，Hohmann EL.Pilot study ofphoP/phoQ-deleted Salmonella enterica serovar Typhimuriumexpressing Helicobacter pylori urease in adult volunteers.InfectImmun 2000；68：2135-2141.
Appelmelk BJ，Simmons-Smit L，Negrini R，Moran AP，AspinallGO，Forte JG et al.Potential role of molecular mimicry betweenHelicobacter pylori lipopolysaccharide and host Lewis blood groupantigens in autoimmunity.Infect Immun 1996；64：2031-2040.
Brisson J-R，Crawford E，Uhrín D，Khieu NH，Perry MB，SevernWB，Richards JC.The core oligosaccharide component fromMannheimia(Pasteurella)haemolytica serotype A1 lipopolysaccharidecontains L-glycero-D-manno-and D-glycero-D-manno-heptoses：Analysis of the structure and conformation by high-resolution NMRspectroscopy.Can J Chem 2002；80：949-963.
Castillo-Rojas G，Mazari-Hiriart M &López-Vidal Y(2004).Helicobacter pylori：focus on CagA and VacA major virulencefactors.Salud pública de México 46：538-548.
Chandan V，Logan SM，Harrison BA，Vinogradov E，Aubry A，Stupak J，Li J，Altman，E.Characterization of a waaF mutant ofHelicobacter pylori strains 26695 provides evidence that an extendedlipopolysaccharide structure has a limited role in the invasion ofgastric cancer cells.Biochem Cell Biol 2007；85：582-590.
Chu C，Liu B，Watson D，Szu S，Bryla D，Shiloach J，SchneersonR，Robbins JB.Preparation，characterization，and immunogenicity ofconjugates composed of the O-specific polysaccharide of Shigelladysenteriae type 1(Shiga’s bacillus)bound to tetanus toxoid.InfectImmun 1991；59：4450-4458.
Ciucanu I，Kerek F.A simple and rapid method for thepermethylation of carbohydrates.Carbohydr Res 2004；131：209-217.
Ciucanu I，Kerek，F.A simple and rapid method for thepermethylation of carbohydrates.Carbohydr Res 2004，131：209-217.
Cox AD，Zou W，Gidney MA J，Lacelle S，Plested JS，MakepeaceK，Wright JC，Coull PA，Moxon ER，Richards JC.Candidacy ofLPS-based glycoconjugates to prevent iuvasive meningococcal disease：Developmental chemistry and investigation of immunologicalresponses following immunization of mice and rabbits.Vaccine 2005；23：5045-5054.
Dubois M，Gilles KA，Hamilton JK，Rebers PA，Smith，F.Colorimetric method for determination of sugars and relatedsubstances.Anal Chem 1956；28：350-356.
Dunn BE，Cohen H，Blaser MJ.Helicobacter pylori.ClinMicrobiol Rev 1997；10：720-741.
Ellman GL.Tissue sulfhydryl groups.Arch Biochem Biophys1959；82：70-77.
Fernández-Santana V，González-Lio R，Sarracent-Pérez J，Verez-Bencomo V.Conjugation of 5-azido-3-oxapentyl glycosides withthiolated proteins through the use of thiophilic derivatives.Glycoconjugate J 1998；15：549-553.
Gu X-X，Tsai C-M，Ueyama T，Barenkamp SJ，Robbins JB，LimDJ.Synthesis，characterization，and immunological properties ofdetoxified lipooligosaccharide from nontypable Haemophilusinfluenzae conjugated to proteins.Infect Immun 1996；64：4047-4053.
Hiratsuka K，Logan SM，Conlan JW，Chandan V，Aubry A，Smirnova N，Ulrichsen H，Chan KHN，Griffith DW，Harrison BA，Li J，Altman E.Identification of a D-glycero-D-manno-heptosyltransferasegene from Helicobacter pylori.J Bacteriol 2005；187：5156-5165.
Holst O，Brade L，Kosma P，Brade，H.Structure，serologicalspecificity，and synthesis of artificial glycoconjugates representing thegenus-specific lipopolysaccharide epitope of Chlamidia spp.J Bacteriol1991；173：1862-1866.
Kabat EA.Chapter 11.Molecular Biology ofAnti-α-(1→6)dextrans.Antibody responses to a Single-Site-FillingAntigenic Determinant.In：Carbohydrate Antigens(vol.159).GareggPJ，Lindberg AA，eds.ACS Symposium Series，Washington：American Chemical Society，1993；146-58.
Kohler G，Milstein C.Continuous cultures of fused cells secretingantibody of predefined specificity.Nature 1975；256：495-497.
Logan SM，Altman E，Mykytczuk O，Brisson J-R，Chandan V，StMichael F，Masson A，Leclerc S，Hiratsuka K，Smirnova N，Li J，WuY，Wakarchuk  WW.Novel biosynthetic functions oflipopolysaccharide rfaJ homologs from Helicobacter pylori.Glycobiology 2005；15：721-733.
Logan SM，Conlan JW，Monteiro MA，Wakarchuk WW，AltmanE.Functional genomics of Helicobacter pylori：identification of a β-1，4galactosyltransferase and generation of mutants with alteredlipopolysaccharide.Mol Microbiol 2000；35：1156-1167.
Mieszala M，Kogan G，Jennings HJ.Conjugation ofmeningococcal lipooligosaccharides through their lipid A terminusconserves their epitopes and results in conjugate vaccines havingimproved immunological properties.Carbohydr Res 2003；338：167-175.
Monteiro MA.Helicobacter pylori：a wolf in sheep’s clothing：theglycotype families of Helicobacter pylori lipopolysaccharidesexpressing histo-blood groups：structure，biosynthesis，and role inpathogenesis.Adv Carbohydr Chem Biochem 2001；57：99-158.
Passwell JH，Ashkenazi S，Harley E，Miron D，Ramon R，FarzamN，Lerner-Geva L，Levi Y，Chu C，Shiloach J，Robbins JB，Schneerson R，Israel Shigella Study Group.Safety andimmunogenicity of Shigella sonnei-CRM9 and Shigella flexneri type2a-rEPAsucc conjugate vaccines in one-to four-year old children.Pediatr Infect Dis J 2003；22：701-706.
Passwell JH，Harlev E，Ashkenazi S，Chu C，Miron D，Ramon R，Farzan N，Shiloach J，Bryla DA，Majadly F，Roberson R，Robbins JB，Schneerson R.Safety and immunogenicity of improved ShigellaO-specific polysaccharide-protein conjugate vaccines in adults inIsrael.Infect Immun 2000；69：1351-1357.
Pon RA，Lussier M，Yang Q-L，Jennings HJ.N-Propionylatedgroup B meningococcal polysaccharide mimics a unique bactericidalcapsular epitope in group B Neisseria meningitidis.J Exp Med 1997；185：1929-1938.
Rossi G，Ruggiero P，Peppoloni S，Pancotto L，Fortuna D，Lauretti L，Volpini G，Mancianti S，Corazza M，Taccini E，Di Pisa F，Rappuoli R，Del Giudice G.Therapeutic vaccination againstHelicobacter pylori in the beagle dog experimental model：safety，immunogenicity，and efficacy.Infect Immun 2004；72：3252-3259.
Roy，R.，Katzenellenbogen，E.，and Jennings，H.J.1984.Improved procedures for the conjugation of oligosaccharides toprotein by reductive amination.Can J.Biochem.Cell Biol.62，270-275.
Ruggiero P，Peppoloni S，Rappuoli R，Del Giudice G.The questfor a vaccine against Helicobacter pylori：how to move from mouse toman？Microbes Infect 2003；5：749-756.
Sawardeker JH，Sloneker JH，Jeannes A.Quantitativedetermination of monosaccharides as their alditol acetates by gasliquid chromatography.Anal Chem 1967；39：1602-1604.
Westphal，O Jann K.Bacterial polysaccharides.Extraction withphenol-water and further applications of the procedure.MethCarbohydr Chem 1965；5：83-91.
Wirth HP，Yang M，Karita M，Blaser MJ.Expression of thehuman cell surface glycoconjugates Lewis X and Lewis Y byHelicobacter pylori isolates is related to cagA status.Infect Immun1996；64：4598-4605.
Yokota，S.，Amano，K.，Fujii，N.，Yokochi，T.Comparison ofserum antibody titers to Helicobacter pylori lipopolysaccharides，CagA，VacA and partially purified cellular extracts in a Japanese population.FEMS Microbiol Left 2000；185：193-198.
Yu S，Gu X-X.Biological and immunological characteristics oflipooligosaccharide-based conjugate vaccines for serotype CMoraxella catarrhalis.Infect Immun 2007；75：2974-2980.

Claims (23)

1.分离的含有α1,6-葡聚糖的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)化合物，其由式I的结构组成：
其中R是
其中β-GlcNAc残基L连接到Hep G的O-2，n＝1～11，及m＝0～4，且
其中对应于脂质A部分的碎片离子用星号标记。
2.权利要求1的化合物，其中n＝9。
3.权利要求1的化合物，其中m＝2。
4.权利要求1的化合物，其中n＝9且m＝2。
5.权利要求1～4中任一项的化合物，其中式I中的6-β-GlcN*-6-α-GlcN*1PEtN部分是脂质A部分。
6.权利要求5的化合物，其中脂质A部分是O-去酰化的、完全去酰化的或通过Kdo残基的酮糖苷键的水解被切割。
7.权利要求1～4和6中任一项的化合物，其中化合物分离或纯化自幽门螺杆菌(H.pylori)株HP0826::Kan。
8.权利要求5的化合物，其中化合物分离或纯化自幽门螺杆菌(H.pylori)株HP0826::Kan。
9.缀合物，其由缀合于接头分子、蛋白载体或其组合的权利要求1～8中任一项的基本上线性的含有α1,6-葡聚糖的化合物组成，
其中所述基本上线性意味着含有α1,6-葡聚糖的化合物含有0％～5％的α1,6-葡聚糖的分支，且
其中所述基本上线性的含有α1,6-葡聚糖的化合物经脂多糖的2-酮基-3-脱氧-辛酮糖酸缀合于接头分子、蛋白载体或其组合。
10.权利要求9的缀合物，其中基本上线性的含有α1,6-葡聚糖的化合物是葡聚糖。
11.权利要求9或10的缀合物，其中蛋白载体是破伤风类毒素，牛血清白蛋白或CRM。
12.权利要求9或10的缀合物，其中蛋白载体是CRM197。
13.组合物，其包含一种或多于一种权利要求1～8中任一项的化合物和/或权利要求9～12中任一项的缀合物。
14.抗体，其特异性识别权利要求1的化合物所含有的α1,6-葡聚糖表位。
15.权利要求14的抗体，其中抗体是由保藏号为300709-01的杂交瘤细胞系1C4F9产生的单克隆抗体。
16.权利要求14的单克隆抗体用于制备药物的用途，其中所述药物导致幽门螺杆菌(H.pylori)株的补体-介导的溶菌，其中所述幽门螺杆菌(H.pylori)株表达α1,6-葡聚糖。
17.有效量的权利要求13的组合物用于制备诱导针对幽门螺杆菌(H.pylori)的免疫应答的药物的用途。
18.权利要求17的用途，其中组合物缀合于适合的载体蛋白。
19.权利要求17的用途，其中组合物经脂多糖的2-酮基-3-脱氧-辛酮糖酸缀合于适合的载体蛋白。
20.免疫抗血清，其通过用权利要求13的免疫原性组合物免疫哺乳动物而产生。
21.权利要求20的免疫抗血清，其中所述抗血清包含IgG，所述IgG识别α1,6-连接的葡聚糖表位，所述表位是幽门螺杆菌(H.pylori)的同源和异源、可分型的和非-可分型的突变型和野生型株中的表位。
22.权利要求21的免疫抗血清，其中IgG导致突变型和野生型表达α1,6-葡聚糖的幽门螺杆菌(H.pylori)株的补体-介导的溶菌。
23.保藏号为300709-01的杂交瘤细胞系1C4F9。
CN201080039539.8A 2009-07-31 2010-07-30 幽门螺杆菌脂多糖外部核心表位 Expired - Fee Related CN102482646B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23031509P 2009-07-31 2009-07-31
US61/230,315 2009-07-31
PCT/CA2010/001173 WO2011011879A1 (en) 2009-07-31 2010-07-30 H. pylori lipopolysaccharide outer core epitope

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102482646A CN102482646A (zh) 2012-05-30
CN102482646B true CN102482646B (zh) 2015-09-16

Family

ID=43528669

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080039539.8A Expired - Fee Related CN102482646B (zh) 2009-07-31 2010-07-30 幽门螺杆菌脂多糖外部核心表位

Country Status (10)

Country Link
US (4) US9085610B2 (zh)
EP (1) EP2459708B1 (zh)
JP (2) JP6166533B2 (zh)
KR (1) KR101616599B1 (zh)
CN (1) CN102482646B (zh)
BR (1) BR112012002230A2 (zh)
CA (1) CA2762366C (zh)
MX (1) MX2012001312A (zh)
RU (1) RU2558257C2 (zh)
WO (1) WO2011011879A1 (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2012001312A (es) 2009-07-31 2012-06-01 Nat Research Council Epitope externo de nucleo de lipopolisacarido de helicobacter pylori.
US10669353B2 (en) 2017-12-11 2020-06-02 Jiangnan University Preparation method of outer core octasaccharide of Helicobacter pylori lipopolysaccharide
CN107955082B (zh) * 2017-12-11 2019-05-10 江南大学 幽门螺旋杆菌脂多糖外核心八糖的制备方法
CN108440667A (zh) * 2018-02-24 2018-08-24 广东工业大学 一种抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体及制备方法与应用
US20210215695A1 (en) * 2018-10-03 2021-07-15 Seikagaku Corporation Method for enhancing sensitivity of endotoxin measuring agent
CN110804617B (zh) * 2019-09-27 2020-09-22 黑龙江伊品生物科技有限公司 一种kdtA基因改造的重组菌株及其构建方法与应用
CN111467368B (zh) * 2020-04-13 2021-05-28 江南大学 含庚糖链的寡糖化合物在制备幽门螺旋杆菌疫苗中的应用
CN111943995A (zh) * 2020-08-21 2020-11-17 华东理工大学 低聚糖、糖蛋白缀合物及其制备方法和应用
CN114874345B (zh) * 2022-05-09 2023-04-28 江南大学 一种幽门螺旋杆菌核心脂多糖寡糖抗原糖链的化学合成方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10502366A (ja) * 1994-07-01 1998-03-03 リカン・リミテッド ヘリコバクター・ピロリ抗原タンパク質調製品およびイムノアッセイ
WO1999012416A1 (en) * 1997-09-09 1999-03-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York T-independent conjugate-vaccines
AU761927B2 (en) * 1998-04-10 2003-06-12 Andrew Lees Conjugate vaccines for the prevention of dental caries
CU22904A1 (es) 1999-08-30 2004-01-23 Univ De Ottawa Oligosacáridos derivados de ribosa- ribitol-fosfato, métodos para prepararlos, inmunógenos que los comprenden y vacunas que comprenden dichos inmunógenos
US20020107368A1 (en) * 2000-12-07 2002-08-08 Jing-Hui Tian Helicobacter proteins, gene sequences and uses thereof
EP1699824A2 (en) * 2003-12-16 2006-09-13 ZymoGenetics, Inc. Ztnf 12, a tumor necrosis factor
WO2006034320A2 (en) * 2004-09-21 2006-03-30 Sanofi Pasteur, Inc. Multivalent meningococcal derivatized polysaccharide-protein conjugates and vaccine
EP1672075A1 (en) * 2004-12-17 2006-06-21 Bayer CropScience GmbH Transformed plant expressing a dextransucrase and synthesizing a modified starch
US7691368B2 (en) * 2005-04-15 2010-04-06 Merial Limited Vaccine formulations
US8025880B2 (en) * 2007-03-01 2011-09-27 Helicure Ab Immunoglobulin against Helicobacter pylori
MX2012001312A (es) * 2009-07-31 2012-06-01 Nat Research Council Epitope externo de nucleo de lipopolisacarido de helicobacter pylori.

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Effect of the HP0159 ORF mutation on the lipopolysaccharide structure and colonizing ability of Helicobacter pylori;Eleonora Altman et al;《FEMS Immunol Med Microbiol》;20081231(第53期);204-213 *
Functional genomics of Helicobacter pylori:identification of a b-1,4 galactosyltransferase and generation of mutants with altered lipopolysaccharide;S.M. Logan et al;《 Molecular Microbiology》;20001231;第35卷(第5期);1156-1167 *
Novel biosynthetic functions of lipopolysaccharide rfaJ homologs from Helicobacter pylori;Susan M. Logan et al;《GLYCOBIOLOGY》;20050406;第15卷(第7期);721-733 *
余庆等.类脂A的生物活性及免疫学特性.《国外医学(微生物学分册)》.1985,(第4期),160-163. *

Also Published As

Publication number Publication date
JP6381147B2 (ja) 2018-08-29
JP2013501080A (ja) 2013-01-10
MX2012001312A (es) 2012-06-01
EP2459708A4 (en) 2013-03-13
US20120164145A1 (en) 2012-06-28
CA2762366A1 (en) 2011-02-03
WO2011011879A1 (en) 2011-02-03
CN102482646A (zh) 2012-05-30
JP2017101036A (ja) 2017-06-08
RU2558257C2 (ru) 2015-07-27
JP6166533B2 (ja) 2017-07-19
US9328158B2 (en) 2016-05-03
KR101616599B1 (ko) 2016-04-28
RU2012107480A (ru) 2013-09-10
CA2762366C (en) 2017-09-19
KR20120041235A (ko) 2012-04-30
EP2459708B1 (en) 2016-06-22
BR112012002230A2 (pt) 2020-08-18
US9085610B2 (en) 2015-07-21
EP2459708A1 (en) 2012-06-06
US20170129941A1 (en) 2017-05-11
US20120301480A1 (en) 2012-11-29
US20150284449A1 (en) 2015-10-08
US9475863B2 (en) 2016-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102482646B (zh) 幽门螺杆菌脂多糖外部核心表位
US20230364214A1 (en) Novel Polysaccharide and Uses Thereof
US11931405B2 (en) Bioconjugates of E. coli O-antigen polysaccharides, methods of production thereof, and methods of use thereof
US11491220B2 (en) Methods of producing bioconjugates of E. coli o-antigen polysaccharides, compositions thereof, and methods of use thereof
Altman et al. Design and immunological properties of Helicobacter pylori glycoconjugates based on a truncated lipopolysaccharide lacking Lewis antigen and comprising an α-1, 6-glucan chain
Altman et al. The potential of dextran-based glycoconjugates for development of Helicobacter pylori vaccine
CN101014698A (zh) 作为多种疫苗候选物的保守性内核脂多糖表位
CA2565247C (en) Conserved inner core lipopolysaccharide epitopes as multi-species vaccine candidates
Pequegnat A Diagnostic Target Against Clostridium bolteae, Towards a Multivalent Vaccine for Autism-Related Gastric Bacteria
KR20070031936A (ko) 다종 백신 후보로서의 보존된 내부 코어 지질다당류에피토프

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150916

Termination date: 20210730

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee