MX2012001312A - Epitope externo de nucleo de lipopolisacarido de helicobacter pylori. - Google Patents

Epitope externo de nucleo de lipopolisacarido de helicobacter pylori.

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Abstract

Helicobacter pylori, uno de los patógenos humanos más comunes, se asocia con el desarrollo de gastritis crónica, úlceras pépticas y cáncer gástrico en los humanos; la invención se refiere a un compuesto de Helicobacter pylori que contiene a-1,6-glucano, que comprende la estructura de la fórmula (I): (ver fórmula (I)) en donde R es un trisacárido de a-DDHep-3-a-L-Fuc-3-ß-GlcNAc sustituido con un a-1,6-glucano enlazado a un a-1,3-DD-heptano, y en donde el último residuo de DD-Hep de a-1,3-DD-heptano está bloqueado con un residuo ß-GIcNAc; también se describen composiciones que comprenden el compuesto, y anticuerpos desarrollados contra el compuesto.

Description

EPÍTOPE EXTERNO DE NÚCLEO DE LIPOPOLISACÁRIDO DE HELICOBACTER PYLORI INFORMACIÓN DE SOLICITUD PREVIA La presente solicitud reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE. UU. 61/230,315, presentada el 31 de julio de 2009, la totalidad de la cual se incorpora aquí como referencia.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un epítope externo novedoso de núcleo de LPS de Helicobacter pylori. Más específicamente, la presente invención se refiere a un epítope externo novedoso de núcleo de H. pylori, su síntesis, caracterización y conjugación.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El Helicobacter pylori está reconocido como la infección bacteriana más común asociada con gastritis crónica, úlcera péptica y carcinoma gástrico en los humanos. Se ha calculado que la infección de H. pylori tiene un predominio de aproximadamente la mitad de la población mundial, alcanzando hasta 70% en los países en desarrollo y 20-30 % en los países industrializados (Dunn et al. , 1997). La gran mayoría de las personas adquieren el H. pylorí en la niñez; el predominio de infección entre los niños en los países en desarrollo está vinculado a un estatus socioeconómico bajo e higiene deficiente (Castillo-Rojas et al; 2004). El H. pylorí ha sido identificado por la organización mundial de la salud (OMS) como un carcinógeno de clase I, ya que aumenta por lo menos seis veces el riesgo relativo del cáncer gástrico. El cáncer gástrico es la segunda causa más común de mortalidad en todo el mundo y representa 700,000 muertes anuales (Parkin et al., 2002).
Las estrategias actuales de erradicación de H. pylorí se basan en el uso de inhibidores de la bomba de protones y antibióticos. Sin embargo, la eficacia de la intervención quimioterapéutica está limitada por la frecuencia de resistencia al antibiótico entre los aislados de H. pylorí y la falta de inmunidad contra la reinfección. De esta manera, se requieren terapias novedosas para proveer una estrategia global para la prevención y erradicación de las infecciones de H. pylorí.
Aunque las investigaciones recientes se han enfocado en la función de los componentes de proteina en la patogénesis de H. pylorí y su función en la inmunidad protectora (Ruggiero et al. , 2003; Rossi ef al., 2004), relativamente pocos estudios han explorado la posibilidad de incluir antigenos diferentes de proteínas en las formulaciones de vacuna (Angelakopoulos y Hohmann, 2000). Por ejemplo, se sabe que vacunas de conjugado basadas en polisacárido previenen la infección sistémica e inhiben la colonización del hospedero (Anderson et al. , 1986; Chu ef al. , 1991 ; Pon ef al., 1997; Passwell et al. , 2001 ; Passwell et al., 2003). Estudios recientes de patógenos entéricos han examinado enfoques basados en conjugados de LPS como candidatos de vacuna para uso humano (Gu et al., 1996; Mieszala et al., 2003; Cox et al., 2005; Yu y Gu, 2007).
El lipopolisacárido (LPS) es un componente principal de la superficie celular de H. pylori. Estudios estructurales efectuados en varios aislados de H. pylori (Monteiro, 2001 ) han resultado en un modelo estructural de LPS que consiste en una cadena O y un oligosacárido de núcleo que está unido a una porción de lípido A. La estructura del esqueleto de polisacárido de cadena O de la mayoría de las cepas de H. pylori es única y presenta determinantes de grupo sanguíneo de Lewis (Le) de tipo 1 y/o de tipo 2 que imitan los que están presentes sobre la superficie celular de las células gástricas y de tumor humanas (Wirth et al., 1996); estos pueden estar implicados en reacciones autoinmunes adversas que llevan a gastritis atrófica (Appelmelk et al., 1996). Además, la región de núcleo externo del LPS de H. pylori contiene dos componentes poliméricos inusuales: DD-heptoglicano y a-1 ,6-glucano (Monteiro, 2001 ). El polímero de a-1 ,6-glucano en la región externa del núcleo de LPS de aislados de H. pylori es sintetizado por el producto del marco de lectura abierto HP0 59. La presencia y expresión del gen HP0159 en H. pylori es común.
Varios genes biosintéticos de LPS de H. pylori han sido caracterizados y se ha determinado su función en la patogénesis y colonización (Logan et al. , 2000; Logan et al. , 2005; Hiratsuka et al., 2005; Chandan et al., 2007; Altman et al., 2008). Se construyeron los mutantes de H. pylorí HP0826 y se demostró que esta mutación dio como resultado la formación de LPS truncado que carece del antígeno Le (Logan et al., 2000). Sin embargo, no se logró la caracterización completa de la estructura del LPS.
A pesar de los avances en el campo, siguen sin encontrarse epítopes inmunogénicos eficaces en múltiples tipos de H. pylorí.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un epítope externo novedoso del núcleo de LPS de Helicobacter pylorí. Más específicamente, la presente invención se refiere a un epítope externo novedoso de núcleo de H. pylorí, su síntesis, caracterización y conjugación La presente invención provee un compuesto de Helicobacter pylorí que contiene a-1-6-glucano que comprende la estructura de la fórmula I: K H G F E C B A a-Ok-4_p-Gal-7-a-DDHqj-2-a-Hep^-a^ R I R es un trisacárido de a-DDHep-3-a-L-Fuc-3- -GlcNAc sustituido con un 0-1 ,6-glucano enlazado a un a-1 ,3-DD-heptano, y el último residuo DD-Hep del a-1 ,3-DD-heptano está bloqueado con un residuo ß-GlcNAc. En el compuesto descrito, el a-1 ,6-glucano puede comprender de aproximadamente 3 a aproximadamente 12 residuos de glucosa a-1 , 6-enlazados, y el a-1 ,3-DD-heptano puede comprender de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 residuos de heptosa a-1 ,3-enlazados.
El grupo R del compuesto anteriormente descrito puede ser: glucano |½kNAc-2^-DDHep-3-[a-DDH^ \V P T Y X V Q 2 -a-DDHep-3-a-L-Fuc-3-{J-GlcNAc N M L en donde el residuo L de ß-GlcNAc está enlazado al 0-2 de Hep G. En el compuesto descrito, los residuos Q y Z del glucano son residuos de glucosa a-1 ,6-enlazados, y n puede ser cualquier valor de entre aproximadamente 1 y 11 ; los residuos T, Y y X son residuos de heptosa a-1 , 3-enlazados, y m puede ser cualquier valor de entre aproximadamente 0 y 4.
El compuesto anteriormente descrito se puede aislar o purificar de la cepa HP0826::Kan de H. pylori.
En los compuestos arriba descritos, la estructura de la fórmula I puede comprender adicionalmente una porción de lípido A unida covalentemente al residuo C de Kdo. La molécula de lípido A puede ser O-desacilada o puede ser cortada por hidrólisis del enlace cetosidico del residuo Kdo.
La presente invención también provee un conjugado que comprende un compuesto que contiene a-1 ,6-glucano sustancialmente lineal conjugado con una molécula enlazadora, un transportador de proteína, o una combinación de los mismos. El compuesto que contiene a-1 ,6-glucano sustancialmente lineal puede ser el compuesto descrito en la presente, en donde la estructura de la fórmula I se conjuga con la molécula enlazadora, transportador de proteina, o combinación de los mismos. El compuesto que contiene a-1 ,6-glucano sustancialmente lineal puede ser alternativamente un dextrano, tal como dextrano T5. El transportador de proteína puede ser el toxoide tetánico o albúmina de suero bovino.
La presente invención también abarca una composición que comprende uno o más compuestos o conjugados como los que se describen arriba.
Además, la presente invención incluye un anticuerpo dirigido contra el compuesto que contiene a-1 ,6-glucano descrito en la presente. El anticuerpo puede ser el anticuerpo monoclonal IC4F9. Además, la invención abarca la línea celular de hibridoma IC4F9, que produce el anticuerpo monoclonal IC4F9.
El anticuerpo monoclonal anteriormente descrito se puede utilizar para causar la bacteriólisis mediada por complemento de cepas de H. pylori que expresan a-1 ,6-glucano en un individuo en necesidad de tal tratamiento.
La presente invención también provee el uso de una cantidad eficaz de la composición anteriormente descrita para inducir una respuesta inmune contra H. pylori en un individuo. Los compuestos de la composición se pueden conjugar con una proteina transportadora adecuada; adicionalmente, los compuestos de la composición se pueden conjugar con una proteina transportadora adecuada por medio de un ácido 2-ceto-3-desox¡-octulosónico (Kdo) del lipopolisacárido.
Además, la presente invención provee un antisuero inmune producido inmunizando un mamífero con la composición inmunogénica aquí descrita. El antisuero inmune puede comprender una IgG que reconoce un epítope de glucano a-1 ,6-enlazado de cepas de H. pylori homologas y heterólogas, tipificables y no tipificables, de tipo silvestre y mutantes. La IgG puede causar bacteriólisis mediada por complemento de las cepas mutantes y de tipo silvestre de H. pylori que expresan a-1 ,6-glucano.
Aspectos y ventajas adicionales de la presente invención serán evidentes en vista de la siguiente descripción. La descripción detallada y los ejemplos, aunque indican las modalidades preferidas de la invención, se dan únicamente a manera de ilustración, ya que varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención se harán evidentes para los expertos en la materia a la luz de las enseñanzas de esta invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Estas y otras características de la invención se describirán ahora a manera de ejemplo haciendo referencia a los dibujos anexos, en donde: Las figuras 1A-1 B muestran un análisis de CE-MS de las glicoformas de LPS en la fracción 1 del LPS deslipidado de la cepa 26695 HP0826::Kan de H. pylorí en el modo de ion positivo. La figura 1A muestra el espectro de masa extraído (m/z 1000-1500), mientras que la figura 1 B muestra el espectro del ion de producto de iones a m/z 1266.3.
Las figuras 2A-2B muestran un análisis de CE-MS de las glicoformas de LPS del LPS O-desacilado de la cepa 26695 HP0826::Kan de H. pylorí en el modo de ion negativo. La figura 2A muestra el espectro de masa extraído (m/z 600-2000), mientras que la figura 2B muestra el espectro del ion de producto de iones a m/z 1597.7. Los iones de fragmento que corresponden a la porción de lípido A están marcados con asterisco.
La figura 3 muestra un análisis de CE-MS de la fracción principal del LPS deslipidado de H. pylorí O:3 HP0826::Kan en el modo iónico negativo. ·: glicoformas de LPS que contienen un residuo de Hep en la cadena lateral, R=Hex5-i3, Hep, HexNAc, FUC;B: glicoformas de LPS que contienen dos residuos de Hep en la cadena lateral, R=Hex8-i3, Hep, HexNAc, Fue.
Las figuras 4A-4B muestran gráficas para la determinación de la especificidad de anticuerpos de conejo producidos por el conjugado dLPS-TT por medio de ELISA de inhibición, con LPS de H. pylorí 26695 HP0479::Kan (figura 4A) y 26695 HP0826::Kan (figura 4B). Los LPS de recubrimiento se representan de la siguiente manera: cuadrados negros 26695; diamantes negros 26695 HP0826::Kan¡ círculos negros 26695 HP0159::Kan; triángulos negros 26695 HP0479::Kan; círculos blancos SS1 ; cuadrados blancos SS1 HP0826::Kan; triángulos blancos SS1 HP0159::Kan; triángulos invertidos blancos SS1 HP0479::Kan; La figura 5 muestra gráficas que representan las respuestas de anticuerpo específicas de H. pylori en ratones CD-1. Los ratones se vacunaron 4 veces a intervalos semanales con 25 pg/ratón de conjugado dLPS-TT y 1 pg/ratón de adyuvante de toxina de cólera (barras negras), sonicado libre de células PJ2 con 1 pg/ratón de adyuvante de toxina de cólera (barras rayadas) o solución salina (barras blancas). Cuatro semanas después de la primera inmunización se tomaron muestras de suero, materia fecal y lavado vaginal, y se hicieron pruebas para IgG e IgA específicas de H. pylori. Se graficaron ratones individuales en la gráficas, la barra horizontal indicando la media del grupo (n=5/grupo)¡ * p<0.05, ** p<0.01 según la prueba de Mann Whitney unilateral.
La figura 6 es una gráfica de barras que representa las cargas de H. pylori en los estómagos de ratones CD-1. Los ratones se vacunaron 4 veces a intervalos semanales con 25 pg/ratón de conjugado dLPS-TT y 1 pg/ratón de adyuvante de toxina de cólera (barras negras), sonicado libre de células PJ2 y 1 pg/ratón de adyuvante de toxina de cólera (barras rayadas), o solución salina (barras blancas). Cinco semanas después de la primera inmunización, los ratones recibieron por alimentación oral forzada tres veces cada tercer día -108 cfu de H. pylori, cepa PJ2. Cuatro semanas después, los ratones se sacrificaron y se contaron las bacterias viables de sus estómagos. Las barras representan grupos de 4-5 ratones ±SEM¡ * p<0.05, prueba de Mann-Whitney unilateral.
DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención se refiere a un epítope externo novedoso del núcleo de LPS de Helicobacter pylori. Más específicamente, la presente invención se refiere a un epítope externo novedoso de núcleo de H. pylori, su síntesis, caracterización y conjugación.
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos indicados en la presente tienen el mismo significado entendido comúnmente por el experto en la materia a la que pertenece la invención. Aunque en la práctica o análisis de la presente invención se puede usar cualquier método y materiales similares o equivalentes a los que se describen en la presente, ahora se describen los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones mencionadas más adelante se incorporan aquí como referencia.
Como se usa aquí, "purificado" no necesariamente significa una pureza absoluta; más bien se considera una definición relativa. Similarmente, como se usa aquí, "aislado" se refiere a la remoción de algo de su ambiente nativo.
Helicobacter pylori es un patógeno bacteriano asociado comúnmente con la gastritis crónica, ulcera péptica y carcinoma gástrico de los humanos; como resultado del mayor riesgo del cáncer gástrico asociado con la infección de H. pylori, se ha clasificado como un carcinógeno de clase I. El lipopolisacárido (LPS) es un componente principal de la superficie celular de H. pylori. Publicaciones previas relacionadas con estudios estructurales del LPS de H. pylori condujeron a un modelo propuesto en donde un polisacárido de cadena O está enlazado covalentemente a un oligosacárido de núcleo, que a su vez está unido a una porción de lipido A. El esqueleto de polisacárido de la cadena O de la mayoría de las cepas de H. pylori es único y puede presentar determinantes de grupo sanguíneo de Lewis (Le) de tipo 2 y/o de tipo 1. Este componente polisacárido es antigénico. Las cepas de H. pylori "tipificables" tienen epítopes de Lewis (antígenos Le X y/y Le Y) que pueden ser reconocidos por anticuerpos anti-Lewis (anti-Le); dichos anticuerpos pueden estar disponibles comercialmente y ayudan a la tipificación. Las cepas "no tipificables" no contienen estructuras de Lewis.
Estudios estructurales adicionales establecieron que la región externa del núcleo de LPS de H. pylori contiene dos componentes poliméricos inusuales: cadenas laterales de DD-heptoglicano y a-1 ,6-glucano (Monteiro, 2001). Logan et al. (2000) también dieron información con respecto a la estructura del LPS. Específicamente, las estructuras propuestas (véanse las fórmulas 3E y 3F) muestran que la DD-heptosa (DD-Hep) en la cadena lateral está unida al DD-Hep en el esqueleto, mientras que el a-1 ,6-glucano está unido a esta DD-Hep de cadena lateral y forma otra rama. Específicamente, Logan et al., (2000) determinaron que la longitud de la cadena de glucano del LPS del mutante 0826 es de una a tres glucosas, basándose en los espectros de FAB-MS (espectrometría de masa con bombardeo atómico rápido). La presencia de glucosa a-1 ,6-enlazada en el LPS de la cepa 26695 de H. pylori también se describió y se basó en los datos de análisis de metilación, pero la longitud del glucano no fue determinada. Adicionalmente se sugirió que en el LPS de la cepa 26695, la Hep 3-sustituida forma una conexión entre la unidad GIcNAc de la cadena O y el núcleo. También se determinó la presencia de heptosa 3-enlazada en LPS de H. pylori HP0826::Kan, pero no fue descrita la presencia de a-1 ,3-heptano ni su longitud. No se dio información adicional con respecto a la estructura o longitud de las cadenas laterales de heptano o glucano. Se define ya la estructura del LPS del H. pylori .
FÓRMULA 3A Estructura de la glicoforma de LPS principal de la cepa 26695 HP0826::Kan de H. pylori; no se muestra la acilación K H G F E C B A a-Glc^-J^Gal-7-a-DDHep-2-a-He^^ P R R = H R = |3-G-c Ac (L) R= a-DDHep-3-a-L-Fuc-3-P-GlcNAc M L R = heptano glucano -Glc Ac-2^-DDHep-3-[a-DDHq)-3 c-«-DDHep-3-a-DDHep-3- -G]c-[-6-a-G[c-]n-6-a-Gk-6- W P T Y X V Q Z -a-DDH¾D-3-a-L-F\ic-3-P-Gk JAc N M L FÓRMULA 3B Productos de la desacilación de KOH del LPS de la fórmula 3A (compuestos 1 a 4) K H G F E C B A -Glc^-P-Gal-T-a-DDHep- -a-Hep-S-a-Hcpd^-S-a-Kdo-ó-p-GlcN-ó-^cNol P R 1: R = H; 2: R=a-Glc (L) 3: R = a-DDHep-3-a-L-Fuc-3-p-GlcN N M L 4:R = p-GlcN^-a-DDHep-S-ta-DDHep-B-J^- -DDHep-S-a-DDHep-B-a-Glc-í-ó-a-Glc-í^e-cí-Glc-ó W P T Y X V Q Z -a-DDHq 3-a-L-Fuc-3- -GkN- M L FÓRMULA 3C Productos de la desaminación del compuesto 4 (compuestos 5 y 6) K H G F E C B a-Gk^-p-Gal-T-a-DDHe^-a-He -a-H e/T - -Kdo-e-anh-Maii-ol a-QD½ -34a-DDHe -3-]»-a4}D^ P T Y X V Q Z N M L FORMULA 3D Productos de la oxidación de peryodato del compuesto 6 (compuestos 7 y_81 -L-Fuc-3-an Maii-ol M L a-Slan-3-a-Mau-3-a-Man-3- -Maii -a-Glc- 1-Gro 8 P T Y X V K FORMULA 3E Estructura previamente propuesta para el LPS de H. pylorí de la cepa 26695 a-Glc.3-a-Glc-4-p-GaI-7- -DDHep-2- -Hep-3-a-Hep7P-5-a-Kdo-líP¡do A 12 a-Gk-[-6-a-Glc-lr2-a-DDHep 17 R R = [cadena-o]-{-3-a-DDHep, -2-a-DDHep. -6-a-DDHq5} FÓRMULA 3F Estructura previamente propuestas para el LPS de H. pylori de la cepa mutante 26695 HP0826::Kan (adaptada de Logan ef al., 2000) a-Glc-3-a-Glc-4-p-Gal-7- .DDHep-2- -Hep-3-a-Hep7P-5-a-Kdo- lípido A |2 a-Gk-[-6- -Glc-]n-2-a-DDHep ¡7<— {-3-a-DDHep, -2-a-DDHep, -6-a-DDHep} a-Fuc«? ß-Glc Ac En las fórmulas 3A-3F: PEtn = fosfoetanolamina; Glc = D- glucopiranosa; Gal = D-galactopiranosa; Kdo = ácido 2-ceto-3-desox¡- octulosónico; LDHep = L-glicero-D-mano-heptosa; DDHep = D-glicero-D- mano-heptosa; GIcNAc = 2-acetam¡do-2-desoxi-D-glucosa; GlcN= 2-am¡no-2- desox¡-D-glucosa; Fue = L-fucosa; P = fosfato; y Gro= glicerol.
La presente invención provee un compuesto novedoso de Helicobacter pylori que contiene a-1 ,6-glucano, que comprende la estructura de la fórmula I: H G F E C B A a-GIc^-p-Gal-7-a-DDHcp-2-a-Hep-3-o.-Hep7PEt -5-a-Kdo-ó-p-GlcN«:-Ci- -Glc * l EtN R I en donde R es un trisacárido de a-DDHep-3-a-L-Fuc-3-p-GlcNAc sustituido con un a-1 ,6-glucano, seguido por a-1 ,3-DD-heptano, en donde el último residuo de DD-Hep de a-1 ,3-DD-heptano está bloqueado con un residuo ß-GlcNAc.
En la estructura anteriormente descrita, el ß-GlcNAc del trisacárido (a-DD-Hep-3-a-L-Fuc-3- -GlcNAc) está enlazado a a-DDHepG. El a-DDHep del trisacárido está enlazado al a-1 ,6-glucano, que a su vez está enlazado al a-1 ,3-DD-heptano. El a-1 ,3-DD-heptano está enlazado entonces a un residuo ß-GlcNAc; este último puede proveer un punto de unión para el polisacárido de cadena O. Con el término "enlazado" o "sustituido" se entiende que las dos porciones están unidas por un enlace covalente.
El término "a-1 ,6-glucano" que se usa en la presente también se puede referir intercambiablemente como "glucano", "cadena lateral de a-1 , 6-glucano", "cadena lateral de glucano", "porción a-1 ,6-glucano", y/o "porción de glucano". El a-1 ,6-glucano es una cadena de polisacárido lineal de monómeros de glucosa enlazados por enlaces a-1 ,6-O-glucosídicos. En un ejemplo que no se considera limitativo en modo alguno, el a-1 ,6-glucano puede ser un polisacárido lineal. El a-1 ,6-glucano puede comprender cualquier cantidad adecuada de residuos de a-1 ,6-glucosa. Por ejemplo, y sin desear limitarse en modo alguno, el glucano puede comprender de aproximadamente 3 a aproximadamente 12 residuos de glucosa a-1 , 6-enlazados; específicamente, la porción de glucano puede comprender aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 residuos de glucosa a-1 , 6- enlazados, o cualquier escala definida por dos valores citados cualesquiera. En un ejemplo no limitativo, el a-1 ,6-glucano puede comprender 9-12 residuos de a-1 ,6-glucosa; en otro ejemplo no limitativo, el a-1 ,6-glucano puede comprender 10 residuos de a-1 ,6-glucosa.
El término "glicoforma", como se usa aquí, indica diferentes formas o tipos del compuesto con la misma estructura de LPS pero que difieren en el número de residuos de a-1 ,6-glucosa o a-1 ,3-heptosa. Por ejemplo, y sin desear limitarse por teoría, cada glicoforma puede comprender una porción de glucano y/o heptano de longitud específica, o una combinación de las mismas.
El término "a-1 ,3-heptano", como se usa aquí, también puede referirse intercambiablemente como "a-1 ,3-DD-heptano", "heptano", "cadena lateral de a- ,3-heptano", "cadena lateral de heptano", "porción de a- -3-heptano, "porción de heptano" y/o "DD-heptoglicano". El a-1 ,3-heptano es una cadena de polisacárido de monómeros de heptosa enlazados por enlaces a-1 ,3-O-glicosídicos. En un ejemplo que no se considera limitativo en modo alguno, el a-1 ,3-heptano puede ser un polisacárido lineal. El a-1 ,3-heptano puede comprender cualquier cantidad adecuada de residuos de a-1 , 3-heptosa. Por ejemplo, y sin desear limitarse en modo alguno, el heptano puede comprender de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 residuos de heptosa a-1 ,3-enlazados; específicamente, la porción de heptano puede comprender aproximadamente 2, 3, 4, 5 o 6 residuos de heptosa a-1 , 3-enlazados, o cualquier escala definida por dos valores citados cualesquiera .
El último residuo de DD-Hep del a-1 ,3-DD-heptano anteriormente descrito está bloqueado con un residuo de ß-GlcNAc. Con el término "bloqueado" se entiende que el residuo de ß-GlcNAc es el último residuo de la cadena lateral; también se puede usar el término "terminado". El ß-GlcNAc puede estar enlazado al DD-Hep a través de la posición 0-2 de la heptosa. Sin desear limitarse por la teoría, el residuo ß-GlcNAc puede proveer un punto de unión para el polisacárido de cadena O.
En un ejemplo no limitativo, R puede ser: glucano P-GlcNAc-2^-DDH^-3-[a-DDHep -ln^-DDHep-3^-DDHep Ki^k-t-6-tt-Glc-]3-6-«-Glc-6- \V P T Y X V Q Z -a-DDHcp-3-a-L-Fuc-3-P-GlcNAc M L en donde el residuo L de ß-GlcNAc está enlazado al O-2 del residuo G de Hep. En este ejemplo, el residuo W de ß-GlcNAc puede proveer un punto de unión para el polisacárido de cadena O. En el compuesto recién descrito, los residuos Q y Z del glucano son residuos de glucosa a- ,6-enlazados, y n puede ser cualquier valor entre 1 y 1 1 aproximadamente, de tal manera que el glucano comprende de aproximadamente 3 a aproximadamente 12 residuos de glucosa en un enlace a-1 ,6; en un ejemplo específico no limitativo, una glicoforma mayor contiene 10 residuos de glucosa a-1 ,6-enlazados consecutivos (n=9).
En el compuesto recién descrito, los residuos T, Y, y X son residuos de heptosa a-1 -3 enlazados y m puede ser cualquier valor de entre aproximadamente 0 y 4, de tal manera que el heptano comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 residuos de heptosa en enlace a- 1 ,3; en un ejemplo no limitativo específico, una glicoforma mayor contiene 4 residuos consecutivos de heptosa a-1 ,3-enlazados (m=2).
La estructura se puede aislar o purificar de cualquier cepa de H. pylori disponible; por ejemplo, y sin desear limitarse en modo alguno, la molécula de LPS truncada de H. pylori se puede aislar de una cepa de H. pylori no tipificable (es decir, una carente de antígenos de Lewis), tal como por ejemplo, sin limitación, una cepa de H. pylori que tiene una mutación en el gen HP08926 que conduce a un mutante isogénico que carece del polisacárido de cadena O. En un ejemplo no limitativo, el compuesto aquí descrito se puede aislar o purificar de la cepa 26695 HP0826::Kan o la cepa PJ2 de H. pylori.
La estructura de la fórmula I, también denominada aquí la "molécula interna de núcleo" puede comprender adicionalmente una porción de lipido A unida covalentemente a un residuo Kdo, por ejemplo el residuo C de Kdo. En otras modalidades, la molécula de lipido A puede estar O-desacilada, o puede estar completamente desacilada. En otras modalidades, la porción de lipido A puede ser cortada por hidrólisis del enlace cetosídico del residuo Kdo. Sin desear limitarse por teoría, el corte del lipido A se puede hacer para eliminar la toxicidad del LPS y para evitar la posible agregación e insolubilidad del conjugado. Los expertos en la materia será familiares con los métodos de O-desacilación, desacilación o hidrólisis del enlace cetosídico de la porción de lipido A (véase por ejemplo Holst et al., 1991 ; Altman et al., 2003).
La presente invención también provee un conjugado que comprende un compuesto que contiene a-1 ,6-glucano sustancialmente lineal, conjugado con un transportador de proteína. El compuesto que contiene a-1 ,6-glucano sustancialmente lineal puede ser cualquier polisacárido sustancialmente lineal adecuado comprendido de residuos de glucosa a-1 , 6-enlazados. Con el término "sustancialmente lineal" se entiende que el a-1 , 6-glucano contiene algunas ramas; por ejemplo, y sin desear limitarse en modo alguno, el a-1 ,6-glucano puede comprender de aproximadamente 0 a aproximadamente 5% de ramificación en el a- ,6-glucano. Específicamente, el a-1 ,6-glucano puede comprender 0, 0.5, 1 , 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, o 5 % de ramificación, o cualquier cantidad entre los mismos, el compuesto también puede ser una mezcla, en donde la cantidad de ramificación dentro de la mezcla varía de un compuesto a otro. En un ejemplo no limitativo, el compuesto que contiene o-1 ,6-glucano puede ser la estructura anteriormente descrita. En otro ejemplo, el compuesto que contiene a-1 ,6-glucano puede ser un dextrano. El dextrano puede ser cualquier dextrano adecuado que cumple los requerimientos anteriormente descritos y que tiene un peso molecular de entre 1 y 10 kDa; por ejemplo, sin desear limitarse en modo alguno, el dextrano puede ser de aproximadamente 1 , 3.5, 5, 6.5, 8, o 10 kDa, o cualquier valor entre los mismos. En un ejemplo no limitativo específico, el dextrano puede ser dextrano T5. En otro ejemplo, el compuesto que contiene a-1 ,6-glucano puede ser una cadena lineal de entre aproximadamente 5 y 8 residuos de glucosa a-1 ,6-enlazados; por ejemplo y sin desear limitarse en modo alguno, el compuesto que contiene a-1 ,6-glucano puede ser una cadena lineal de 5, 6, 7 u 8 residuos de glucano a-1 ,6-enlazados.
El compuesto que contiene a-1 ,6-glucano se conjuga con una molécula enlazadora o una proteína transportadora; como entenderá el experto en la materia, la estructura descrita en la presente se puede conjugar directamente con la proteína transportadora, o se puede conjugar con una molécula enlazadora (denominada también "enlazador" en la presente), que a su vez se conjuga con la proteína transportadora. Con el término "conjugado" se entiende que la estructura se une o se enlaza covalentemente a la molécula enlazadora o proteína transportadora. Los métodos de unión covalente de la proteína transportadora o enlazador son muy conocidos; como apreciará el experto en la materia, el método de unión covalente (y si está presente o no un enlazador) se puede basar en la proteína transportadora utilizada. Sin desear limitarse en modo alguno, uno de estos métodos se muestra en el esquema A, que está adaptado de Fernández-Santana et al. (1998); en este método, el LPS desacilado o deslipidado se activa uniendo covalentemente el grupo carboxilo de un residuo Kdo con una molécula enlazadora, seguido por la introducción de una funcionalidad maleimido. El LPS activado se mezcla con una proteína transportadora tiolada para producir una estructura conjugada. Como apreciará el experto en la materia, el método descrito en la presente es general y por consiguiente se puede utilizar cualquier otro método adecuado (por ejemplo, sin limitación, los descritos por Chu et al. , 1991 ; Cox er a/. , 2005; Gu et al., 1996; Mieszala er al., 2003; Yu y Gu, 2007). El compuesto que contiene a-1 ,6-glucano se puede unir al enlazador/proteína transportadora por medio de un grupo carboxilo de cualquier residuo de carbohidrato adecuado en la estructura. En un ejemplo no limitativo especifico, el compuesto que contiene a-1 ,6-glucano puede ser la estructura de la presente invención y puede estar unido por medio del residuo C de Kdo del núcleo interno.
ESQUEMA A Esquema de reacción para la preparación de conjugados basados en LPS de la presente invención La proteina transportadora puede ser cualquier transportador adecuado conocido, que incluye transportadores inmunogénicos. Por ejemplo, la proteina transportadora puede ser, sin limitación, toxoide tetánico, albúmina de suero bovino (BSA), toxoide de difteria, toxoide de difteria mutante, CRM, proteína CRM197, proteína de Pseudomonas A, proteína de toxina de cólera (CT), una proteína Ct-E29H mutante de toxina de cólera, y otras conocidas; por ejemplo, sin limitación, partes de flagelos, pelos y otras toxinas.
Como se indicó anteriormente, los conjugados se pueden preparar ya sea directamente conectando la proteína transportadora y la estructura de la presente invención mediante grupos naturales, o por conexión mediante la introducción de moléculas espadadoras o enlazadoras que comprenden, sin limitación, grupos amino primarios, hidrazidas, tioles, carboxilos y otros.
Adicionalmente, la presente invención provee una composición que comprende uno o más compuestos que se describen en la presente, uno o más conjugados que se describen en la presente, o una combinación de los mismos. En una modalidad, la composición puede comprender una mezcla de glicoformas del compuesto anteriormente descrito; por ejemplo, y sin desear limitarse en modo alguno, la composición puede comprender una glicoforma mayor que comprende 10 residuos consecutivos de glucosa a-1 ,6-enlazados (n=9) en la porción de glucano. Similarmente y sin desear limitarse en modo alguno, una composición podría comprender conjugados preparados de más de una glicoforma descrita en la presente. Como se muestra en los ejemplos, la estructura de LPS elaborada por la cepa 26695 HP0826::Kan de H. pylorí que fue usada para la preparación de los conjugados fue una mezcla de tres glicoformas: oligosacárido esqueleto I, oligosacárido esqueleto I bloqueado con GIcNAc y [GIcNAc, Fue, Hep], y oligosacárido que contiene glucano a-1 ,6-enlazado; la cadena de glucano más larga correspondiendo a aproximadamente doce residuos a-1 ,6-enlazados, determinado mediante análisis de CE-MS (cuadro 2, figura 2).
La composición recién descrita puede ser inmunogénica. Con el término "inmunogénica" se entiende que la composición puede inducir una respuesta inmune contra H. pylori de tipo silvestre o cepas mutantes. La respuesta inmune puede proveer una amplia respuesta inmunogénica contra cepas tipificables y no tipificables de H. pylori.
La presente invención también provee el uso de una cantidad eficaz de la composición descrita en la presente para inducir una respuesta inmune contra H. pylori en un individuo. Como se describe anteriormente, la composición puede comprender uno o más compuestos de acuerdo con la presente invención. El compuesto puede estar conjugado con un enlazador o una molécula transportadora adecuada.
Además, la presente invención provee un antisuero inmune producido inmunizando a un mamífero con la composición inmunogénica anteriormente descrita. El antisuero inmune puede comprender o producir una IgG de suero postinmune que reconoce un epitope de glucano ct-1 ,6-enlazado en cepas de H. pylori mutantes y de tipo silvestre, homologas y heterólogas, tipificables y no tipificables. La IgG puede causar bacteriólisis mediada por complemento de cepas de H. pylori mutantes y de tipo silvestre que expresan a-1 ,6-glucano.
Adicionalmente, la presente invención provee anticuerpos anti-a,1 ,6-glucano. Los anticuerpos se pueden desarrollar contra el compuesto de la invención descrito en la presente, o se pueden desarrollar contra otras moléculas que contienen a-1 ,6-glucano, tales como dextrano (o conjugados de dextrano, por ejemplo sin limitación conjugados de BSA-dextrano). En un ejemplo no limitativo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal producido de acuerdo con los métodos conocidos (véase el ejemplo 10; Altman et al., 2005). Por ejemplo, y sin desear limitarse en modo alguno, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal desarrollado contra el epítope de a-1 ,6-glucano presente en la región externa del núcleo de LPS de H. pylori HP0826 muíante; más específicamente, el anticuerpo se puede desarrollar contra el compuesto mostrado en la figura 3. En un ejemplo más específico, el anticuerpo monoclonal puede ser IgM IC4F9, producido por la línea celular de hibridoma IC4F9. Esta línea celular se depositó en la Autoridad Depositaría Internacional de Canadá (National Microbiology Laboratory, Public Health Agency of Canadá, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canadá) el 30 de julio de 2009, con el número de registro 300709-01 . Como se muestra en los ejemplos, el IC4F9 reconoció el epítope de a-1 ,6-glucano en LPS y células completas de cepas de H. pylori tipificables y no tipificables, y estuvo muy accesible sobre la superficie de las bacterias vivas, y reaccionó igualmente bien con conjugados LPS-OH-TT y dLPS-BSA o dLPS-TT.
La presente invención provee el uso del anticuerpo IC4F9 para causar bacteriólisis mediada por complemento de las cepas de H. pylori mutantes y de tipo silvestre, tipificables y no tipificables, que expresan a-1 ,6-glucano, en un individuo en necesidad de dicho tratamiento. Como se describió anteriormente, las cepas de H. pylori tipificables tienen antígenos de Lewis reconocidos por el anticuerpo anti-Le, mientras que las cepas no tipificables no los tienen. Sin embargo, puesto que las cepas tanto tipificables como no tipificables contienen a-1 ,6-glucano, los dos tipos de cepas serán reconocidos por el anticuerpo IC4F9.
Actualmente, las cepas de H. pylori se pueden tipificar usando anticuerpos disponibles comercialmente contra antígenos de Lewis; sin embargo, como las cepas no tipificables no contienen estructuras de Lewis, no pueden ser clasificadas usando este enfoque. Como la mayoría de las cepas de H. pylori tipificables y no tipificables llevan epítopes de a-1 ,6-glucano, los anticuerpos anti-a-1 ,6-glucano (tales como el mAb IC4F9) proveerían un método adicional de tamizado y caracterización de aislados de H. pylori.
El LPS de la cepa 26695 HP0826::Kan de H. pylori se purificó, y se determinó su estructura química por análisis de composición, metilación, resonancia magnética nuclear (RMN) en profundo, y también datos de CE- MS. También se demostró la presencia de glucano a-1 ,6-enlazado en la región externa del núcleo del LPS de H. pylori HP0826 mutante; esta estructura fue reconocida por el anticuerpo monoclonal específico de a- ,6-glucano, 1 C4F9. Este último anticuerpo se generó usando células fijadas en formalina de la cepa mutante 0:3 HP0826::Kan de H. pylori. Estos anticuerpos fueron accesibles a la superficie celular y bactericidas. Previamente se creyó que solo las estructuras de Lewis eran antigénicas; de esta manera, era inesperada la generación de anticuerpos contra a-1 , 6-glucano.
Para investigar la vacuna potencial de LPS de H. pylori, el LPS modificado del mutante 26695 HP0826::Kan de H. pylori se conjugó con toxoide tetánico (TT) o albúmina de suero bovino (BSA). Se utilizaron dos enfoques para preparar el LPS deslipidado o parcialmente deslipidado: O-desacilación del LPS por hidrazinólisis suave (LPS-OH) o deslipidación del LPS por tratamiento ácido suave (dLPS). Métodos adicionales de deslipidación y/o deslipidación parcial son muy conocidos y se pueden usar dentro del alcance de la presente invención. Tanto el LPS-OH como el dLPS se enlazaron covalentemente por medio de un residuo de ácido 2-ceto-3-desoxi-octulosónico (Kdo) a un espaciador que contiene un grupo diamino, seguido por la introducción de una funcionalidad de maleimido y conjugación con TT tiolado o BSA, para producir los conjugados LPS-OH-TT, dLPS-BSA y dLPS-TT, respectivamente. En un experimento separado, la cepa no tipíficable PJ2 se deslipidó y se utilizó para la conjugación para producir el conjugado dLPS(PJ2)-TT.
Los conjugados LPS-OH-TT, dLPS-BSA y dLPS-TT y también el dLPS(PJ2)-TT retuvieron la antigenicidad del determinante a-1 ,6-glucano accesible a la superficie, según se estableció por ELISA indirecta con IgM 1 C4F9. Se observó que el anticuerpo tiene una excelente especificidad para el determinante a-1 ,6-glucano, y sus características de unión se determinaron por medio de ELISA de inhibición con oligisacáridos de serie isomaltosa y LPS purificado de cepas de H. pylori tipificables y no tipificables. Estos estudios confirmaron que el 1 C4F9 requiere de 5 a 6 residuos consecutivos de glucosa a-1 ,6-enlazados, un patrón consistente con el tamaño de anti-a-(1->6)dextrano que combina los sitios postulados por Kabat (1993).
Los conjugados LPS-OH-TT, dLPS-BSA y dLPS-TT o dLPS(PJ2)-TT fueron inmunogénicos en ratones y conejos e indujeron respuestas significativas de anticuerpo IgG contra LPS de cepas de H. pylori homologas, heterólogas y de tipo silvestre. Se generó una respuesta inmune de IgG diez veces más fuerte para el antígeno inmunizante en los ratones y conejos que recibieron conjugado que contenía sLPS. El suero postinmune de conejos inmunizados con cualquiera de LPS-OH-TT, dLPS-BSA y dLPS-TT o dLPS(PJ2)-TT presentó actividad bactericida contra las cepas mutantes 26695 HP0826::Kan y 26695 de tipo silvestre de H. pylori.
En resumen, estos resultados indican que conjugados de proteina basados en LPS de H. pylori deslipidados o parcialmente deslipidados, carentes del antígeno Le y que llevan una cadena larga de a- 1 ,6-glucano, son inmunogénicos tanto en ratones como en conejos e inducen anticuerpos bactericidas. Es importante notar que este epitope ha sido identificado como inmunogénico. Esto no fue establecido previamente pues se sabia que solo las estructuras de Lewis eran antigénicas y productoras de anticuerpos específicos.
La presente invención se ilustrará adicionalmente en los siguientes ejemplos. Sin embargo, se entiende que estos ejemplos solo tienen fines ilustrativos y no se deben usar para limitar el alcance de la presente invención en modo alguno.
EJEMPLO 1 Aislamiento y análisis estructural del LPS de H. pylori 26696 HP0826::Kan La cepa 26695 de Helicobacter pylori se obtuvo del Dr. R. Aim (Astra Zeneca, Boston, Massachusetts); el aislado H. pylori 0:3 era del Dr. J. Penner; J99 se obtuvo del Dr. D. Taylor (University of Alberta, Edmonton, Canadá); el SS1 era del Dr. A. Lee (The University of New South Wales, Sidney, Australia); los aislados clínicos PJ1 y PJ2 eran aislados clínicos recientes del Dr. W. Conlan (IBS, NRC); y M6 era del Dr. K. Eaton (Michigan State University, Michigan).
El desarrollo de las cepas bacterianas se efectuó como lo describen Hiratsuka et al. (2005). Brevemente, las células se desarrollaron a 37 °C sobre placas de agar de sangre suplementado con antibiótico Columbia (Difco) que contenía 7% de sangre de caballo en medio microaerofílíco, durante 48 h (Kan 20 pg/ml) como se describió previamente (Hiratsuka et al., 2005). Para desarrollo en cultivo líquido, se inoculó caldo de Brucella suplementado con antibiótico que contenía 10% de suero fetal bovino con células de H. pylori cosechadas de placas de agar/sangre de caballo Columbia de 48 h, y se incubaron durante 48 h en un agitador bajo condiciones microaerofílicas (85% N2, 10% C02l 5% 02) como se describió previamente (Hiratsuka et al., 2005).
Las cepas de H. pylori se cultivaron en cultivo líquido como se describe arriba, y la masa celular húmeda obtenida por centrifugación del crecimiento bacteriano se lavó dos veces sucesivamente con etanol, acetona y éter de petróleo ligero, y se secó al aire. El LPS se extrajo de la masa celular secada al aire por medio de un procedimiento de extracción de fenol caliente-agua de Westphal y Jann (1965). El LPS se obtuvo de la fase acuosa después de diálisis exhaustiva y liofilización. El LPS de H. pylori se purificó adicionalmente por ultracentrifugación (105,000 x g, 4 °G, 12 h), y la pella se suspendió en agua destilada y se liofilizó.
Se hizo un análisis de la composición de azúcar por medio del método de acetato de alditol (Sawardeker et al., 1967). La hidrólisis se hizo en ácido trifluoroacético 4 M a 100 °C durante 4 h, o ácido trifluoroacético 2 M a 100 °C durante 16 h, seguido por reducción en H2O con NaBH4 y acetilación subsiguiente con anhídrido acético/piridina. Los derivados de acetato de alditol se analizaron como se describió previamente (Altman el at., 2003). El análisis de metilación se hizo de acuerdo con el método de Ciucanu y Kerek (1984), con caracterización de los derivados de acetato de alditol permetilados por cromatografía de gas-líquido - espectrometría de masa (GLC-MS), como se describió previamente (Altman et al., 2003).
El análisis de azúcares del LPS purificado de H. pylori 26695 HP0826::Kan como acetatos de alditol reveló la presencia de L-fucosa (L-Fuc), D-glucosa (D-Glc), D-galactosa (D-Gal), N-acetil-D-glucosamina (D-GIcNAc), D-glicero-D-mano-heptosa (DD-Hep) y L-glicero-D-mano-heptosa (LD-Hep), en una proporción molar aproximada de 0.4:5.0:1.5:4.3:6.4:1.4, indicando la presencia de la estructura carente de la cadena O (Logan et al., 2000). El análisis de metilación efectuado sobre LPS intacto de 26695 HP0826::Kan fue consistente con estos hallazgos y mostró la presencia de L-Fue terminal, L-Fuc 3-sustituida, D-Glc terminal, D-Gal terminal, glucosa 3-sustituida, D-Gal 4-sustituida, glucosa 6-sustituida, DD-Hep terminal, DD-Hep 2-sustituida, DD-Hep 6-sustituida, DD-Hep 3-sustituida, DD-Hep 7-sustituida, DD-Hep 2, 7-sustituida, LD-Hep 2-sustituida, LD-Hep 3-sustituida, D-GIcNAc terminal y D-GIcNAc 3-sustituida, en una proporción molar aproximada de 0.1 : 1.0:1.1 :0.1 :1.2:1.0:6.0:0.4:1.2:1.1 :3.1 :0.5:1.6:1.2:0.1 :0.3:0.4. No se detectó D-GIcNAc 3,4-sustituida ni D-Gal 2-enlazada, características de los antigenos Le que contienen la cadena O. La pureza del LPS se confirmó por la ausencia de ribitol derivado de ARN. El análisis de composición y metilación del LPS 26695 se ha reportado en otra parte (Logan et al., 2005). Todos los azúcares estaban presentes en forma de piranosa.
EJEMPLO 2 Caracterización de LPS de H. pylorí 26695 HP0826: :Kan deslipidado por medio de espectrometría de masa con electroforesis capilar (CE-MS) El LPS 26695 HP0826::Kan purificado (20 mg) obtenido en el ejemplo 1 se hidrolizó en un amortiguador de acetato de sodio 0.1 M, pH 4.2, durante 2 h a 100 °C, y se fraccionó por filtración en gel en una columna Bio-Gel P-2 como se describió previamente (Altman et al., 2003) para generar LPS deslipidado (dLPS). Estas fracciones (fracciones 1-3) se recolectaron y se analizaron por medio de espectrometría de masa con electroforesis capilar (CE-MS; cuadro 1).
Para la CE-MS, un sistema Prince CE (Prince Technologies, Países Bajos), se acopló con un espectrómetro de masa 4000 QTRAP (Applied Biosystems/MDS Sciex, Canadá). Una solución de revestimiento (isopropanol-metanol, 2:1 ) se suministró a una velocidad de flujo de 1.0 µ?/min. Se obtuvieron separaciones sobre capilares simples de sílice fundida de aproximadamente 90 cm de longitud usando acetato de amonio 15 mM en agua desionizada, pH 9.0. Se usó el voltaje de ionización de electroaspersión de 5 kV para el modo de detección de ion positivo. Se obtuvieron espectros de masa en tándem usando el modo de barrido iónico de producción intensificada (EPI) con una velocidad de barrido de 4000 Da/s. Se usó nitrógeno como cortina (a un valor de 12) y gas de colisión (puesto en la escala "alto").
El análisis de CE-MS de la fracción molar 1 en el modo de ion positivo confirmó la presencia de una serie de iones triplemente cargados a m/z 1212.3, m/z 1266.3 y m/z 1320.4, consistentemente con las adiciones consecutivas de residuos de Hex; la cadena más larga de glucano corresponde a aproximadamente once residuos a-1 ,6-enlazados. Basándose en la intensidad de señal de los iones, la glicoforma más abundante a m/z 1266.3 contenía diez Hex a-1 ,6-enlazados (figura 1). El espectro iónico producto de los iones a m/z 1266.3 en el modo de detección de ion positivo, confirmó la presencia de iones diagnósticos a m/z 1244.5 y m/z 1447.6, consistentemente con los fragmentos de núcleo del esqueleto observados previamente Hex2Hep3(PEtn)Kdo y HexNAcHex2Hep3(PEtn)Kdo, respectivamente (figura 1). Las fracciones 1 y 2, que llevan a-1 ,6-glucano en el núcleo de LPS, se combinaron y se usaron para conjugación, CUADRO 1 Datos de CE-MS de ion positivo v composición propuesta de qlicoformas de LPS en el LPS deslipidado de la cepa 26695 HP0826::Kan de H. pylori Fracción Ion observado Masa molecular (Da) Composición propuesta recolectada Observada Calculada9 Fracción 1 [?+?+2??4 1212.3 3599.9 3599.1 Hex 2 Hep5 PEtn, i HexNAc, Fue, anhidroKDO, 1218.1 3617.3 3617.1 Hexi2 Hep5 PEtm HexNAc, Fue, KDO, 1266.3 3761.9 3761.2 He i3 Hep5 PEUv 1 HexNAc, Fue, anhidroKDO, 1272.0 3779.0 3779.2 Hex,3 Hep5 PEtn 1 HexNAc, Fue, KDO, 1320.4 3924.2 3923.4 Hex Hep5 PEtn 1 HexNAc, Fue, anhidroKDO, 1326.4 3942.2 3941.4 Hex,< Hep5 PEtn 1 HexNAc, Fue, KDO, Fracción 2 [M+H+NH4]2' 902.4 1785.8 1785.5 Hex2 Hep4 PEtni HexNAc, Fue, anhidroKDO, 911.4 1803.8 1803.5 Hex2 Hep PEtn, HexNAc, Fue, KDO, 983.5 1948.0 1947.7 Hex3 Hep4 PEtn, HexNAc, Fue anhidroKDO, 992.5 1966.0 1965.7 Hexj Hep4 PEtni HexNAc, Fue, KDO, 1064.6 2110.2 2109.8 Hex4 Hep4 PEtn, HexNAc, Fue, anhidroKDO, 1073.6 2128.2 2127.8 Hex4 Hep4 PEtn! HexNAc, Fue, KDO, 1145.5 2272.0 2271.9 Hex5 Hep4 PEtnt HexNAc, Fue, anhidroKDO, 1154.5 2290.0 290.0 Hex5 Hep4 PEtn, HexNAc, Fue, KDO, Fracción 3 [M+H+NH4f* 631.6 1244.2 1244.0 Hex2 Hep3 PEtni anhidroKDO, 640.6 1262.2 1262.0 Hex2 Hep3 PEtn, , HexNAc, KDO, 733.2 1447.4 1447.2 Hex2 Hep3 PEtn, HexNAc, anhidroKDO, 742.1 1465.2 1465.2 Hex2 Hep3 PEtn, HexNAc, KDO, a Basada en las masas atómicas promedio b Hex, HexNAc, Hep, KDO, PEtn y Fue designan a hexosa, hexosamina, heptosa, ácido 3-ceto-desoxi-D-mano-2-octulosónico, fosfoetanolamina y fucosa, respectivamente EJEMPLO 3 Caracterización del LPS 26695 HP0826::Kan desacilado por medio de CE- MS La O-desacilación del LPS 26695 HP0826::Kan (del ejemplo 1) se efectuó de acuerdo con Hoist et al. (1991) con algunas modificaciones. Brevemente, se agitó LPS (4 mg) en hidrazina anhidra (0.2 mi) a 37 °C durante 4 h. La mezcla de reacción se enfrió y se le agregó lentamente acetona fría (2 mi) para destruir el exceso de hidrazina. Después de 30 min, el LPS O-desacilado (LPS-OH) precipitado se recolectó por centrifugación (4 °C, 9300 x g, 10 min). La pella se lavó dos veces con acetona fría, se disolvió en agua y se liofilizó para producir LPS-OH (3.5 mg).
El análisis de CE-MS del LPS 26695 HP0826::Kan O-desacilado (LPS-OH) en el modo de ion positivo se hizo como se describe en el ejemplo 2. Los resultados de la CE-MS fueron consistentes con los datos de MS obtenidos para LPS deslipidado, y produjeron tres iones mayores doblemente cargados a m/z 1137.2, m/z 1239.2 y m/z 1408.0, consistentemente con la presencia del olígosacárido esqueleto y el oligosacárido esqueleto bloqueado con HexNAc y [HexAc, Fue, Hep], respectivamente (cuadro 2), mientras que los iones triplemente cargados a m/z 1597.7, m/z 1651.4 y m/z 1705.5 fueron consistentes con la presencia de glucano, la cadena más larga de glucano correspondiendo a aproximadamente doce residuos a-1 ,6-enlazados (cuadro 2, figura 2). El espectro de MS/MS de m/z 1597.7 mostró la presencia de iones diagnósticos a m/z 1447.6 y m/z 1244.5, consistentemente con la pérdida secuencial de [Fue, Hep] y [Fue, Hep, HexNAc], respectivamente (figura 2) y, adicionalmente, produjo un ion de una sola carga a m/z 1 786.8, consistentemente con el fragmento de núcleo FucHex2HexNAcHep4(PEtn)Kdo enlazado por medio de un residuo de Kdo al lipido A O-desacilado (lípido A-OH), mientras que los iones a m/z 444.4 y m/z 887.8 correspondieron a la porción lípido A-OH que consiste en un esqueleto de diglucosamina sustituida con dos cadenas de ácido graso 3-hidroxioctadecanoico [C18:0(3-OH)] enlazadas con amida (figura 2).
CUADRO 2 Datos de CE- S de ion positivo y composición propuesta de qlicoformas de LPS en el LPS O-desacilado de la cepa 26695 HP0826::Kan de H. pylori 1137.2 2272.4 2272.1 Hex2 Hep3 PEtn2 HexN2 (3-OH C18:0)2 KDO1 1239.2 2476.6 2475.3 Hex2 Hep3 HexNAci PEtn2 HexN2 (3-OH C18:0)2 KDO1 1408 2814.4 2813.5 Fue, Hex2 Hep4 HexNAci PEtn2 HexN2 (3-OH C18:0)2 KDO, [ +3H]34 1597.7 4790.1 4789.2 Fud Hexis Hep5 HeXNAci PE1n2 HexN2 (3-OH C18:0)2 KDO1 1651.4 4951.2 4951 .3 FuCi Hexi4 Hep5 HexNAci PEtn2 HexN2 (3-OH C18:0)2 KDO1 1705.5 51 13.5 51 13.5 Fuci He is Hep5 HexNAci PEIn2 HexN2 (3-OH C18:0)2 KDO1 3 Basada en las masas atómicas promedio b Hex, HexN, Hep, KDO, PEtn y Fue designan a hexosa, hexosamina, heptosa, ácido 3-ceto-desoxi-D- nar)o-2-octulosónico, fosfoetanolamina y fucosa, respectivamente EJEMPLO 4 Análisis de RMN del LPS de la cepa 26695 HP0826.:Kan de H. pylori La degradación del LPS de la cepa 26695 HP0826::Kan de H. pylori (del ejemplo 1 ) fue iniciada con desacilación completa con KOH 4 M en presencia de NaBH4 para la reducción instantánea de GlcN del lipido A, puesto que la hidrólisis alcalina del sustituyente PetN deja el extremo reductor GlcN sin aglicona (Hoist et al. , 1991 ). La separación de los productos por cromatografía en gel dio dos fracciones eluidas en la región del oligosacárido del cromatograma. Un análisis ulterior mostró que estas fracciones contenían compuestos similares, que difieren aparentemente en la longitud de una cadena de glucano. La fracción de masa molecular más baja contenía los compuestos 1 -3, identificados por espectrometría de masa, y ambas fracciones contenían el compuesto 4 con diferente longitud de la porción de glucano (fórmulas 3A-3F).
Se tomaron los espectros de RMN (DQCOSY, TOCSY, NOESY, 1 H-13C HSQC y HMBC) en un espectrómetro Varían a 500 o 600 MHz usando software estándar como se describió previamente (Brisson et al., 2002). Todos los experimentos de RMN se hicieron a 25 °C usando acetona como referencia interna a d 2.225 ppm para espectros de 1 H y 31.45 ppm para espectros de 13C.
Los espectros de RMN de las dos fracciones corresponden al compuesto 4, aunque los espectros no se pudieron interpretar completamente debido a su complejidad. Los protones H-1 de residuos terminales de a-1 ,6-glucano y DD-heptano no se traslapan con el resto de H 1 de glucano y heptano, permitiendo así la identificación de la posición de estos homopolímeros dentro de toda la estructura, como se muestra en las fórmulas 3A-3F. Sin embargo, la posición de enlace del residuo Z terminal reductor de Glc de la cadena de a-1 ,6-glucano no fue determinada. Mostró fuerte correlación de NOE con un protón no identificado (asignado más tarde a H-6 de Hep N). Los datos de RMN del compuesto 4 mostraron claramente que el a-1 ,6-glucano estaba ubicado entre el DD-heptano y el núcleo interno, puesto que el primer residuo Hep de la porción de heptano (X) estaba enlazado al O-3 de un residuo V terminal no reductor de Glc que pertenece al a-1 ,6-glucano. El extremo no reductor de DD-heptano se sustituyó en O-3 con ß-GlcN W. Los compuestos idénticos a los oligosacáridos más pequeños 1 -3 se encontraron previamente como componentes principales del LPS de H. pylori del mutante sin glucano HP0159::Kan, y los datos de RMN para ellos fueron publicados (Altman et al., 2008). En el cuadro 3 se muestran datos de RMN seleccionados para el compuesto 4. Se puede ver claramente que la secuencia previamente propuesta de cuatro residuos de heptosa contiguos enlazados a Kdo no estaba presente en ninguno de los compuestos examinados (fórmulas 3A-3F). El residuo L de ß-GlcN estaba enlazado directamente al O-2 de Hep G, y no hubo GlcN unida al O-7 de Hep en ninguna parte de la estructura del LPS.
CUADRO 3 Asignaciones de RMN de H y 3C para el compuesto 4 Para análisis ulterior de la estructura del LPS, los compuestos 1- 4 se desaminaron. Brevemente, las muestras se disolvieron en AcOH al 10% y se les agregó un exceso de NaN02; después de 3 h, el producto se aisló por cromatografía de gel sobre una columna de Sephadex G-15. Después, algunos compuestos se redujeron con NaBD4 y se desalaron. Los productos resultantes eran los compuestos 5 y 6. Los espectros de R N del compuesto 5 (tomados como se describe arriba) mostraron dos isómeros con fosfato en la posición 6 o 7 del Hep E (debido a la migración de fosfato bajo condiciones alcalinas). Nuevamente, estuvieron presentes tres residuos de Hep contiguos, no cuatro como era de esperar si la estructura previamente propuesta fuera correcta. La remoción de la cadena lateral entera por un proceso de desaminación (arriba descrito) confirmó que el GlcN L formó la conexión entre los azúcares del OS 5 y el resto de la molécula.
El compuesto 6 contenía DD-heptano, a-1 ,6-glucano y el trisacárido DDHep-Fuc-anh-Man-ol (N-M-L, anh-Man L que deriva de GlcN L) en el extremo reductor. Los espectros de este producto estuvieron menos encimados y se hizo posible identificar el punto de uriión del a-1 ,6-glucano al O-6 del DDHep N (de TOCSY entre H-1 y H-6 de DDHep N). La estructura era lineal, confirmado por análisis de metilación, que no mostró azúcares ramificados; todos los productos esperados fueron identificados en concordancia con la estructura propuesta (cuadro 4).
CUADRO 4 Asignaciones de R N de H y 12C para el compuesto 6 Se obtuvo confirmación adicional de la estructura de la región DD-heptan-a-1 ,6-glucano de los resultados de la oxidación del peryodato del compuesto 6. La oxidación del peryodato se hizo con un exceso de Nal04 0.1 M durante 24 h; se agregó etilenglicol y el producto se aisló por cromatografía de gel sobre una columna de Sephadex G-15. Se redujo con NaBD4, se desaló y se hidrolizó con AcOH al 2% durante 3 h a 100 °C. Se obtuvieron dos productos principales, 7 y 8, y se aislaron por cromatografía de gel sobre una columna de Sephadex G-15.
La reducción del oligosacárido oxidado con NaBD4 permitió la identificación de los carbonos oxidados en los espectros de RMN (fase invertida de señales de CHDOH en comparación con las señales de CH2OH en APT-HSQC). La estructura de los compuestos 7 y 8 se determinó por espectroscopia de RMN y análisis de metilación. La formación del compuesto 7 probó que DDHep-N no fue sustituido en la posición 3. Puesto que la metilación del compuesto 6 mostró DD-Hep 3- y 6-sustituido solo terminal, el DD-Hep N fue sustituido en la posición 6, como fue propuesto de los datos de RMN del compuesto 6. La formación del compuesto 8 con glicerol (Gro) en el extremo reductor confirmó que Glc V en el OS 6 se glicosiló enseguida del residuo Glc en la posición 6, puesto que no hubo otros componentes del oligosacárido 6 que pudieran producir glicerol por oxidación-reducción. También probó claramente la unión de la porción DD-heptano al extremo no reductor de a- ,6-glucano en la posición 3 de la glucosa terminal.
El tamaño del dominio DD-heptano pudo ser estimado: el compuesto 8 contenía cuatro residuos de mañosa derivados de DD-heptosa. El espectro del compuesto 8 fue bien resuelto y la integración de las señales de H-1 dio una relación casi equimolar mostrando la presencia de cuatro residuos de mañosa. De esta manera, el dominio intacto de DD-heptano en el compuesto 6 consistió principalmente de 5 unidades de DD-heptosa, una de las cuales (terminal) fue removida por oxidación con peryodato. Esta conclusión fue confirmada por espectrometría de masa. La estructura de la glicoforma principal de LPS producida por la cepa 26695 HP0826::Kan de H. pylori se ilustra en las fórmulas 3A-3F.
EJEMPLO 5 Preparación y caracterización de los conjugados LPS-OH-TT, dLPS-BSA, dLPS-TT y d _PS(PJ2)-TT Se prepararon conjugados enlazados a Kdo de LPS-OH (véase el ejemplo 3) y dLPS (véase el ejemplo 2) con albúmina de suero bovino (BSA) y/o toxoide tetánico (TT).
Se disolvió LPS-OH (4 mg, 0.8 pmol, basado en una masa molecular promedio calculada de 4789 Da) o dLPS (4 mg, 1 pmol, basado en la masa molecular promedio calculada de 3779 Da) en amortiguador de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico 0.1 M (MES; Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri), pH 4.8, que contenia 0.1 M de NaCI (0.4 mi); se le agregó 1 -etil-3-dimetilaminopropilcarbodiimida (EDC; 34.38 mg, proporción molar 100: 1 ; Sigma-Aldrich), seguida por 1 ,8-diamino-3,6-dioxaoctano (15 µ?, 103 pmol; Sigma-Aldrich), y la reacción se mantuvo a pH 4.8 durante 4 h a 22 °C. El pH de la solución se ajustó a 7.0 y se dializó contra agua destilada o se desaló usando un dispositivo de centrifugación Microsep, corte de 1 ,000 Da (Pall Life Sciences, Ann Arbor, Michigan) y se liofilizó.
El procedimiento de conjugación se efectuó esencialmente como lo describen Fernández-Santana et al. (1998) para oligosacáridos. Brevemente, el LPS-OH que contiene el espaciador (2 mg, 0.4 pmol) o dLPS (2 mg, 0.5 pmol) se hicieron reaccionar con éster de N-hidroxisuccinimida de ácido 3-maleimidopropiónico (BMPS; 2 mg, 7.5 pmol; Sigma-Aldrich) en DMSO seco durante 24 h a 22°C. La solución se dializó contra agua destilada y se liofilizó.
Para la activación de BSA, a una solución de albúmina de suero bovino (BSA) (masa molecular 66,320 Da) (8 mg, 0.12 pmol) previamente disuelta en solución amortiguadora de PBS 10 mM, pH 8.0, que contenia 6 mM de EDTA (concentración final 4 mg/ml), se le agregó di(éster de N-hidroxisuccinimida) de ácido 3,3'-ditiodipropiónico (DTSP; 0.63 mg, 1.6 pmol; Sigma-Aldrich) en DMSO seco, bajo una atmósfera de N2; y la mezcla se agitó 2 h a 22 °C. Después se le agregó ditiotreitol (DTT; 7.12 mg, 46 prnol; Sigma-Aldrich), bajo una atmósfera de N2, y la mezcla se agitó 1 h a 4°C. La solución resultante se dializó contra una solución amortiguadora de PBS 10 mM, pH 7.2, que contenia 5 mM de EDTA, en una celda de ultrafiltración con agitación (Millipore, Billerica, Massachusetts), usando N2 como una fuente de presión, sobre una membrana de celulosa regenerada, corte de 30,000 Da (YM30, Millipore) a 4 °C. La proteína y el contenido de SH se determinaron por medio de un kit de proteína de ácido bicinchonínico (BCA; Pierce, Rockford, Illinois) y métodos de Ellman (1959), respectivamente. Se obtuvo una sustitución molar de 20-22 grupos SH.
Para la activación del toxoide tetánico (TT) (masa molecular, 150,000 Da), a una solución de TT (4 mg, 0.03 prnol) en 10 mM de solución amortiguadora de PBS, pH 8 0, que contenia 6 mM de EDTA (concentración final, 4 mg/ml), se le agregó DTSP (0.316 mg, 0.8 prnol) en DMSO seco (25 pl) bajo una atmósfera de N2; y la reacción se dejó proceder como se describe para BSA. Después se le agregó ditiotreitol (DTT; 3.56 mg, 23 pmol; Sigma-Aldrich) bajo una atmósfera de N2, y la mezcla se agitó 1 h a 4°C. El TT activado se transfirió a una celda de ultrafiltración con agitación (Millipore) y se dializó contra una solución amortiguadora de PBS 10 mM, pH 7.2, que contenía 5 mM de EDTA, sobre una membrana de celulosa regenerada, corte de 100,000 Da (YM100, Millipore) a 4°C.
A una solución de BSA-SH21 22 o TT-SH21.22 en una solución amortiguadora de PBS 10 mM, pH 7.2, que contenía 5 mM de EDTA, se le agregó una solución de derivado de LPS-OH o dLPS funcionalizado con maleimido en una solución amortiguadora de PBS 10 mM PBS, pH 7.2, que contenía 5 mM de EDTA (concentración final 4 mg/ml) (proporción molar 3: 1 ), bajo una atmósfera de N2. La reacción se agitó 24 h a 4°C. Después se le agregó N-etilmaleimida (1 mg; Sigma-Aldrich). La reacción se dejó proceder 30 min a 22 °C, y el conjugado resultante se dializó contra una solución amortiguadora de PBS 10 mM, pH 7.2, por 4 d a 4 °C, y se esterilizó por filtración usando una membrana de fluoruro de polivinilideno de 0.22 pm (PVDF) (Millex-GV, Millipore, Cork, Irlanda). Se analizó el contenido de carbohidrato y proteína de los conjugados usando el método de fenol-ácido sulfúrico para azúcares neutros (Dubois et al., 1956) y el kit de prueba de proteína BCA (Pierce), respectivamente, con LPS-OH o dLPS y BSA como estándares. La eficiencia de la conjugación se confirmó por cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC; Serie Agilent 1200, Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) usando una columna Superóse 12 10/300 GL (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) equilibrada con una solución amortiguadora de PBS 10 mM pH 7.2. La cromatografía se hizo a temperatura ambiente a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min. La elución se monitoreó a 210 nm y 280 nm con un detector de arreglo de diodo (Agilent Technologies).
La presencia de un espaciador se confirmó por espectroscopia de RMN de 1H por la aparición de una nueva resonancia de protón a 3.22 ppm que corresponde al grupo CH2NH2. El grupo amino de la molécula espadadora se modificó adicionalmente por reacción con el éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-maleimidopropiónico para producir LPS-OH o dLPS modificado con maleimido, confirmado por la presencia de resonancias de protones a 2.55 ppm y 6.9 ppm, que corresponden a los grupos CH2a y CH=CH de ß-maleimidopropionato, respectivamente (esquema A). La modificación con fosfoetanolamina en el LD-Hep interno del núcleo se mantuvo al mínimo usando cantidades estequiométricas del reactivo. El glicoconjugado se obtuvo mediante tiolación de una proteína transportadora y adición de la proteína tiolada al LPS-OH o dLPS modificados con maleimido (esquema A). La eficiencia de la conjugación se monitoreó por medio de HPLC. El contenido de carbohidrato y proteína del conjugado resultante se analizó.
La proporción molar de LPS-OH a TT en los tres conjugados varió de 10:1 a 20:1 , y el rendimiento varió de 13% a 22% basándose en el contenido de carbohidrato (cuadro 5). La conjugación de dLPS a BSA o TT produjo los conjugados dLPS-BSA-2, dLPS-TT o dLPS(PJ2)-TT, con un contenido de carbohidrato significativamente más alto (cuadro 5). Los conjugados LPS-OH-TT y dLPS-BSA o dLPS-TT reaccionaron igualmente bien con mAbs específicos de a-1 ,6-glucano por ELISA, sugiriendo que la conformación del epítope de glucano no cambió.
CUADRO 5 Composición y rendimiento de los coniuqados usados en este estudio 1 La cantidad de carbohidrato (CHO) se determinó de acuerdo con Dubois ef al. (1956); se usó como estándar LPS-OH o dLPS. 2 La cantidad de proteína se determinó mediante la prueba BCA; se usó como estándar BSA. 3 La relación molar de CHO a proteína se determinó usando valores de masa molecular promedio con base en la longitud promedio de la cadena de glucano: 4789DA para LPS- OH y 3779 Da para dLPS (n=10). Para dLPS(PJ2) el valor de masa molecular promedio fue 3261 Da con base en la longitud promedio de la cadena de glucano (n=8) (Altman et. al., 2003).
EJEMPLO 6 Inmunoqenicidad de los conjugados LPS-OH-TT. dLPS-BSA. dLPS-TT, y los conjugados dl_PS(PJ2)-TT en ratones y conejos La inmunogenicidad de los conjugados (LPS-OH-TT, dLPS-BSA, dLPS-TT, y dLPS(PJ2)-TT) del ejemplo 5 se probó en ratones y conejos.
Cinco ratones BALB/c hembras de 6-8 semanas de edad se inmunizaron vía intraperitoneal con los conjugados apropiados. Cada ratón recibió 2 pg o 10 pg de carbohidrato en 0.2 mi de adyuvante Ribi por inyección. Los ratones recibieron refuerzos el día 21 y 42, y el suero se recuperó después de punción cardiaca terminal el día 51.
Tres conejos blancos de Nueva Zelanda se inmunizaron por vía subcutánea con los conjugados apropiados. Cada conejo recibió 10 pg o 50 pg de carbohidrato en 0.5 mi de adyuvante de Freund incompleto. Los conejos recibieron refuerzos el día 28 y 56, y el suero se recuperó después de exsanguinación el día 65.
El nivel del anticuerpo anti-LPS en el suero se midió por medio de una prueba ELISA en la que se usó LPS purificado como antígeno de recubrimiento (1 pg/pocillo). Después de lavar con PBS, las placas se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA) al 1% (p/v) en PBS o diluente de leche/solución bloqueadora (MDB) (KPL, Gaithersburg, Maryland) durante 1 h a 37 °C. Se les agregó suero preinmune o postinmune diluido de ratón o conejo, y las placas se incubaron 2 h a 37 °C. Para la ELISA de inhibición, diluciones seriadas de LPS 26695 HP0479::Kan o LPS 26695 HP0826::Kan de inhibición se mezclaron con la dilución previamente determinada de suero de conejo que dio una DO450 = 0.6-0.8. Esta mezcla se incubó 15 min a 22 °C y después se transfirió a la placa de microtitulación original bloqueada con antigeno LPS adsorbido, en donde se incubó otras 2 h a 37 °C. Después de este paso se siguió el procedimiento de ELISA indirecto. Brevemente, las placas se lavaron con PBS y se agregó el segundo anticuerpo, un conjugado anti-lgG+lgM de ratón de cabra con peroxidasa de rábano (Callag, So., San Francisco, California) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de un paso de lavado final, se le agregó el substrato 3,3',5,5'-tetrametilbencideno (T B) (KPL, Gaithersburg, Maryland) y la reacción se detuvo con ácido fosfórico 1 M. La absorbancia se determinó a 450 nm usando una lectora de placa de microtitulación (Dynatech, Chantilly, Virginia).
El porcentaje de inhibición se calculó usando la siguiente fórmula: % de inhibición = 100 x [(DO con inhibidor - DO sin inhibidor) / DO sin inhibidor] Se hicieron gráficas de inhibición contra el log de la concentración de cada inhibidor, y se determinaron las concentraciones necesarias para obtener la mitad de la inhibición máxima (CI50) partiendo de curvas extrapoladas.
Todos los conjugados provocaron una respuesta de IgG contra el LPS de las cepas homologa (26695 HP0826::Kan) y la correspondiente de tipo silvestre (26695), tanto en conejos como en ratones después de tres inyecciones (cuadros 6 a 9), aunque la respuesta generalmente fue más débil en ratones y conejos inmunizados con LPS-OH-TT que en los animales inmunizados con cualquiera de dLPS-BSA, dLPS-TT o clLPS(PJ2)-TT. Conejos de control inmunizados con una mezcla de LPS-OH, dLPS o dLPS(PJ2) y un transportador de proteína (con un adyuvante), mostraron poca o ninguna respuesta al LPS de la cepa homologa (mutante 26695 HP0826::Kan) o la cepa correspondiente de tipo silvestre 26695 de H. pilori después de las tres inmunizaciones.
CUADRO 6 Respuestas de anticuerpo en ratones y conejos al LPS 26695 HP0826::Kan y el LPS 26695 de H. pylori, provocadas por los conjugados LPS-OH-TT a Cada ratón recibió 10 pg de carbohidrato por inyección. b Cada conejo recibió 50 pg de carbohidrato por inyección. c Cada conejo recibió 10 pg de carbohidrato por inyección.
CUADRO 7 Respuestas de anticuerpo en ratones y conejos al LPS 26695 P0826::Kan y el LPS 26695 de H. pylori, provocadas por los conjugados d-LPS-BSA a Cada ratón recibió 10 pg de carbohidrato por inyección. b Cada ratón recibió 2 pg de carbohidrato por inyección. c Cada conejo recibió 10 µ? de carbohidrato por inyección. d Solo adyuvante (IFA).
CUADRO 8 Respuestas de anticuerpo en ratones y conejos al LPS 26695 0826::Kan y el LPS 26695 de H. pylori, provocadas por el conjugado d- LPS-TT a Cada ratón recibió 2 g de carbohidrato por inyección. b Cada conejo recibió 10 µ? de carbohidrato por inyección. c Solo adyuvante (IFA).
CUADRO 9 Respuestas de anticuerpo en ratones y conejos al LPS 26695 HP0826::Kan y el LPS 26695 de H. pylori, provocadas por el conjugado d- LPS(PJ2)-TT Cada ratón recibió 2 pg de carbohidrato por inyección. b Cada conejo recibió 10 pg de carbohidrato por inyección. c Solo adyuvante (IFA).
Se hicieron estudios de reactividad cruzada con el suero postinmune de conejos inmunizados con LPS-OH-TT-2, LPS-OH-TT-3, LPS-OH-TT-4, dLPS-BSA-2, dLPS-TT, o dLPS(PJ2), contra LPS de cepas de H. pylori representativas de varios glicotipos de LPS (Monteiro, 2001 ) y cepas mutantes seleccionadas. Los resultados se muestran en los cuadros 10, 1 1 y 12.
CUADRO 10 Respuestas de anticuerpo3 en conejos al LPS purificado de H. pylori. provocadas por los conjugados LPS-OH-TT y dLPS-BSAc a Titulo del suero postinmune 1:100 ° Titulo del suero postinmune 1:1,000 cD045o ± 10% CUADRO 11 Respuestas de anticuerpo3 en conejos al LPS purificado de H. pylori, provocadas por el conjugado dLPS-TTb 3 Título del suero postinmune 1:1,000 b D045o± 10% CUADRO 12 Respuestas de anticuerpo3 en conejos al LPS purificado de H. pylori. provocadas por el conjugado dLPS(PJ2)-TTb a Título del suero postinmune 1 : 1 ,000 b DO450 + 10% La reactividad del suero postinmune obtenido de los conejos que fueron inmunizados con LPS-OH-TT-2, LPS-OH-TT-3, o LPS-OH-TT-4 fue indicativa de la necesidad de la presencia de a-1 ,6-glucano, puesto que solo se obtuvo una débil reactividad cruzada con LPS de SS1 y SS1 HP0826::Kan, éstas siendo representativas de las cepas de H. pylori incapaces de añadir a-1 ,6-glucano (Logan ef al., 2005) (cuadro 10). Sorprendentemente, el suero obtenido de los conejos que fueron inmunizados con dLPS-TT también reconoció epítopes de LPS de núcleo que no contienen ningún a-1 ,6-glucano, particularmente LPS de las cepas SS1 , SS1 HP0826::Kan, M6 y J99 (cuadro 1 1), mostrando un reconocimiento de núcleo más amplio e infiriéndose que el conjugado dLPS-TT fue más inmunogénico, posiblemente debido a la presencia de la proteína transportadora TT (cuadro 1 1). Alternativamente, como los conjugados fueron preparados de una mezcla de 3 glicoformas, la respuesta inmune pudo haber sido generada para otros componentes menores del LPS; esto podría explicar las reacciones cruzadas observadas.
Para sondear la especificidad de unión del suero de conejo producido por el conjugado dLPS-TT, se hizo una ELISA de inhibición con LPS purificado de 26695 HP0479::Kan, que consiste en dos glicoformas (proporción aproximada de 1 :1), una estructura de esqueleto lineal de oligosacárido y un esqueleto de oligosacárido lineal bloqueado con [GIcNAc, Fue] (Hiratsuka et al., 2005), y LPS de 26695 HP0826::Kan. La unión del suero de conejo al LPS negativo de glucano de las cepas SS1 , SS1 HP0826::Kan HP0159::Kan y SS1 HP0479::Kan (figuras 4A-4B), fue inhibida significativamente cuando se usó LPS 26695 HP0479::Kan como inhibidor, mientras que el LPS 26695 HP0826::Kan fue el inhibidor más eficaz cuando se usó LPS 26695 como un antígeno de recubrimiento (figuras 4A-4B).
La capacidad del suero postinmune de conejo para reconocer cepas heterólogas tipificables y no tipificables, también se validó en una prueba ELISA indirecta de célula completa (WCE) contra aislados clínicos seleccionados de H. pylori representativos de cepas tanto tipificables como no tipificables de H. pylori. La ELISA indirecta de célula completa (WCE) se hizo como se describió previamente (AItman et al., 2008). Brevemente, los pocilios de una placa de microtitulación se recubrieron con 100 µ? de una suspensión bacteriana, 108 células /mi, durante la noche, a 4 °C. Los pocilios se fijaron después con metanol y se bloquearon con 200 µ? de diluente de leche/solución bloqueadora (MDB) (KPL, Gaithersburg, Maryland) durante 2 h a 37 °C. Subsiguientemente, los pocilios se incubaron 2 h a 37 °C con 100 µ? de ascitis 1 C4F9 diluida 1 :500 en MDB, seguido por anti-lgG+lgM de ratón con peroxidasa de rábano (Caltag), diluido 1 :1 ,000 en MDB, durante 1 h a temperatura ambiente . El substrato TMB se agregó como se describe para la ELISA indirecta. Los valores de fondo no específicos se determinaron como DO450 de los pocilios de control negativo que contenían células bacterianas, conjugado de anticuerpo secundario y substrato. Estos valores de DO450 eran =0.2. Los valores de densidad óptica DO450 <0.2 se clasificaron como reacciones negativas y los valores de DO450 =0.2 se clasificaron como reacciones positivas. Para asegurar la consistencia de placa a placa se usaron células de H. pylori de la cepa 26695 como control positivo. Las pruebas no variaron más de 10%.
El suero derivado de los conejos que fueron inmunizados con el conjugado dLPS-TT mostraron la reactividad cruzada más fuerte a todas las cepas probadas (cuadro 13) usando ELISA indirecta de célula completa.
CUADRO 13 Reactividad cruzada de suero postinmune de conejo3 en la prueba ELISA indirecta de célula completa13 contra aislados clínicos de H. oylorí Cepas Inmunógeno Conejos 002CL 026CL 027CL 048CL 058CL 101CL 113CL 153CL 217CL 240CL LPS-OH-TT-2 1 0.215 0.298 0.637 0.141 0.567 0.386 0.629 0.591 0.312 0.771 2 0.132 0.104 0.484 0.072 0.491 0.248 0.481 0.475 0.245 0.635 LPS-OH-TT-3 1 0.311 0.333 0.644 0.121 0.606 0.484 0.678 0.587 0.347 0.803 2 0.248 0.229 0.575 0.118 0.308 0.242 0.256 0.211 0.177 0.368 LPS-OH-TT-4 1 0.213 0.359 0.492 0.105 0.393 0.431 0.673 0.639 0.246 0.717 2 0.125 0.231 0.305 0.103 0.253 0.295 0.225 0.246 0.169 0.266 3 0.138 0.277 0.386 0.07 0.288 0.352 0.378 0.348 0.153 0.384 dLPS-BSA-2 1 0.995 0.694 0.916 0.283 0.738 1.126 0.995 1.14 0.448 1.02 2 0.712 0.544 0.337 0.299 0.372 0.821 0.522 0.655 0.271 0.694 3 0.773 0.664 0.351 0.502 0.475 0.884 0.788 0.947 0.443 0.791 dLPS-TT 1 0.835 1.167 0.621 0.945 0.876 1.471 1.300 1.277 1.146 1.243 2 0.737 0.429 0.582 0.143 0.527 1.225 1.135 0.634 0.515 1.025 3 0.838 1.168 0.652 0.999 0.823 1.500 1.361 1.254 1.1 18 1.157 3 Titulo del suero postinmune 1 :100 DO 0.2 ±10% EJEMPLO 7 Actividad bactericida de antisuero de conejo Se hizo una prueba bactericida usando suero de conejo prevacunado o postvacunado (ejemplo 6).
Células de H. pylori desarrolladas en placa se cosecharon y se lavaron con 5 mi de PBS por placa. Después de centrifugación, las pellas se suspendieron en 25 mi de PBS. La suspensión bacteriana final se diluyó en solución salina amortiguadora de fosfato de Dulbecco (DPBS) (Invitrogen, Grand Island, Nueva York) a 4x106 UFC/ml. La prueba bactericida se hizo en una placa de microtitulación de fondo plano (ICN). A cada pocilio se le agregó una dilución seriada de diez veces de suero preinmune o postinmune descomplementado (50 µ?). Después se agregó la suspensión bacteriana (25 µ?) y se preincubó 15 min a 37 °C. Se diluyó 1 :50 complemento de crio de conejo (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario) y se agregaron 25 µ? a los pocilios apropiados. La placa se incubó 45 min a 37 °C y después se puso sobre hielo. Una alícuota de 10 µ? se depositó por triplicado sobre agar de sangre Columbia, se desarrolló por 4 días, y después las placas se contaron para medir el número de unidades formadoras de colonia (UFC). La placa de control con bacterias y complemento pero sin suero se usó para calcular el porcentaje de muerte. La actividad bactericida se determinó a la dilución más alta de suero que causó 50% de muerte.
El suero de prevacunación o el suero obtenido de conejos inmunizados con una mezcla de un transportador de proteína y cualquiera de LPS-OH, dLPS, o dLPS(PJ2) (con un adyuvante) mostraron poca o ninguna actividad bactericida contra las cepas homologas 26695 HP0826::Kan o de tipo silvestre 26695 de H. pylori. El suero postinmune obtenido de conejos inmunizados con LPS-OH-TT-4, dLPS-BSA-2, dLPS-TT y dLPS(PJ2)-TT mostró actividad funcional significativa contra el muíante 26695 HP0826::Kan y las cepas de tipo silvestre correspondientes (cuadro 14), el suero postvacunación de conejos inmunizados con el conjugado dLPS-TT exhibiendo la actividad funcional más alta contra la cepa de tipo silvestre 26695 (cuadro 14).
CUADRO 14 Actividad bactericida contra las cepas 26695 HP0826::Kan y 26695 de H. pylori con antisuero de conejo producido por los conjugados a Cada conejo recibió 10 pg de carbohidrato por inyección. 0 Suero preinmune de conejo correspondiente.
Además, la actividad bactericida del suero de conejo también se probó contra aislados clínicos seleccionados de H. pylori, particularmente las cepas 002CL, 0153CL y 058CL (Altman eí al., 2008). Estos aislados se seleccionaron como representativos de algutinadores altos, medios y bajos basándose en sus valores de DO450 en pruebas WCE con mAbs anti-a-1 ,6-glucano: cepa 002CL -DO450 1.361 , aglutinador alto; cepa 153CL - DO450 0.29, aglutinador medio; y cepa 058CL -DO450 0.162, aglutinador bajo. Es importante enfatizar que solo el suero postinmune de los conejos inmunizados con el conjugado dLPS-TT o dLPS(PJ2)-TT mostró actividad funcional con los tres aislados clínicos probados (cuadro 15).
CUADRO 15 Actividad bactericida contra aislados clínicos de H. pylori con antisuero de conejo producido por los conjugados 3 Suero preinmune de conejo correspondiente.
EJEMPLO 8 Estudios de protección con el conjugado dLPS-TT en ratones El potencial del conjugado dLPS-TT como un candidato de vacuna se evaluó en ratones cruzados CD-1.
Grupos de 5 ratones CD-1 se vacunaron cuatro veces por vía intranasal a intervalos semanales con 25 pg/ratón del conjugado dLPS-TT con 1 pg/ratón de adyuvante de toxina de cólera (CT; Sigma), 31.5 pg/ratón de sonicado libre de células PJ2 con 1 pg/ratón de adyuvante de toxina de cólera (control), o solución salina (control). Una semana después de la última inmunización, se recolectaron muestras de suero, materia fecal y lavado vaginal, y se analizaron para determinar IgG e IgA específicas de H. pylori. Los niveles de IgG en suero e IgA en suero, materia fecal y vaginal se determinaron mediante una ELISA estándar. Las placas se recubrieron con 1 pg/pocillo de LPS de la cepa 26695 HP0826::Kan de H. pylori como se describe en la presente. Las muestras de suero se diluyeron para la prueba 1 :100 para IgG y 1 :50 para IgA. Las muestras fecales se diluyeron 1 :1 y las muestras vaginales se diluyeron 1 :20. Los niveles de anticuerpo especifico de H. pylori se determinaron y los datos se analizaron por medio de análisis de Mann-Whitney usando el software GraphPad versión 5.0.
Cinco semanas después de la primera inmunización, los ratones recibieron por alimentación oral forzada tres veces cada tercer día ~108 cfu de la cepa PJ2 de H. pylori (Altman et al., 2003). Cuatro semanas después, los ratones se sacrificaron y las bacterias viables de sus estómagos se contaron; los datos se analizaron mediante la prueba de Mann Whitney usando el software GraphPad versión 5.0.
La inmunización intransal con el conjugado dLPS-TT más CT provocó una respuesta de IgG muy fuerte específica de LPS de H. pylori 26695 HP0826::Kan medida por ELISA, y también se detectó IgA sérica moderada específica de LPS de H. pylori 26695 HP0826::Kan (cuadros 16 y 17, figura 5). Además, también se detectaron respuestas de IgA específicas de LPS de H. pylori 26695 HP0826::Kan en las muestras vaginales o fecales (p<0.01) (cuadro 17, figura 5).
CUADRO 16 Niveles de IqG sérica específica de LPS de H. pylori medidos por ELISA contra LPS 26695 HP0826::Kan* * El suero se recolectó una semana después de la última inmunización y antes de la provocación bacteriana con la cepa PJ2 de H. pylori CUADRO 17 Niveles de IqA sérica, fecal y vaginal especifica de LPS de H. pylori medidos por ELISA contra LPS 26695 HP0826::Kan* * Las muestras se recolectaron una semana después de la última inmunización y antes de la provocación bacteriana con la cepa PJ2 de H. pylori Subsiguientemente, todos los grupos de ratones se inocularon por vía orogástrica con la cepa de H. pylori colonizadora de ratón no tipificable PJ2, que previamente se mostró que contenía un a-1 ,6-glucano largo (Altman ef a/., 2003). La protección se define como una reducción estadísticamente significativa en la carga bacteriana en los grupos vacunados en comparación con los grupos de control. Los datos de colonización en los grupos de ratones inmunizados por vía intranasal con el conjugado dLPS-TT más CT fueron estadísticamente significativos (p<0.05) (figura 6). Más aún, estos datos sugieren que la respuesta de IgA sérica específica de LPS de H. pylori 26695 HP0826::Kan por si sola no es suficiente para proteger contra la provocación bacteriana, y que respuestas de IgG sérica específica de LPS también pueden contribuir al aumento de la protección.
EJEMPLO 9 Preparación y caracterización del conjugado de dextrano-BSA y estudios de inmunogenicidad y actividad funcional El conjugado dextrano-BSA se preparó disolviendo 10 mg de dextrano (PM 5 KDa, Pharmacosmos A/S, Holbaek, Dinamarca) en 250 µ? de solución amortiguadora de borato 0.2 M, pH 9.0; esto se agregó a una solución (250 µ?) que contenía 1 ,8-diamino-3,6-dioxaoctano (25 µ?) y cianoborohidruro de sodio (10 mg) en solución amortiguadora de borato 0.2 M, pH 9.0 (como lo describen Roy ef al., 1984). La reacción se efectuó durante 5 días a 55 °C. El producto de reacción se purificó como se describe arriba para la preparación de conjugados basados en LPS.
Esta reacción resulta en la introducción de un espaciador. El grupo amino de la molécula espaciadora se modificó adicionalmente por reacción con éster de N-hidroxisuccinimida de ácido 3-maleimidopropiónico, como se describe para los conjugados basados en LPS (véase el ejemplo 5). El glicoconjugado se obtuvo mediante la tiolación de una proteína transportadora y la adición de la proteína tiolada al dextrano T-5 modificado con maleimido. La proporción molar de dextrano a BSA en el conjugado fue de 20:1 , y el rendimiento fue de 32% basado en el contenido de carbohidrato.
Se hicieron estudios de reactividad cruzada con suero postinmune de conejos inmunizados con dextrano-BSA contra el LPS de las cepas de H. pylorí representativas de varios glicotipos de LPS y cepas mutantes seleccionadas (cuadro 8).
CUADRO 18 Respuestas de anticuerpo en conejos3 al LPS de H. pylorí purificado, provocadas por el conjugado de dextrano-BSAc Cada conejo recibió 10 ig de carbohidrato por inyección. b Título de suero postinmune 1 : 100. c DO450 ¿0% La reactividad del suero postinmune obtenido de los conejos que fueron inmunizados con dextrano-BSA fue indicativa de la necesidad de la presencia de a- ,6-glucano, puesto que no se obtuvo reactividad cruzada con las cepas SS1 y SS1 HP0826::Kan negativas de glucano. El suero postinmune obtenido de los conejos inmunizados con dextrano-BSA mostraron actividad funcional contra el mutante 26695 HP0826::Kan y la cepa correspondiente de tipo silvestre (cuadro 19).
CUADRO 19 Actividad bactericida contra las cepas de H. pylorí 26695 HP0826::Kan y 26695 con antisuero de conejo producido por el conjugado de dextrano- BSA a Cada conejo recibió 10 µa, de carbohidrato por inyección. b Suero preinmune de conejo correspondiente.
La capacidad del suero postinmune de conejo para reconocer cepas heterólogas tipificables y no tipificables e inducir anticuerpos bactericidas, indica la posibilidad de que un conjugado que consiste en dextrano, un polímero que contiene un esqueleto lineal de unidades repetidas de glucosa a-1 ,6-enlazadas, o un conjugado que comprende oligosacárido lineal optimizado que consiste en residuos consecutivos de glucosa a-1 ,6-enlazados y un transportador de proteína adecuado, podría ser suficiente para conferir protección contra la infección de H. pylorí.
EJEMPLO 10 Estudios de especificidad de mAbs anti-glucano Se produjeron anticuerpos monoclonales específicos para la cepa 0:3 HP0826::Kan de H. pylori y se estudiaron sus especificidades.
Se produjeron hibridomas como se describió previamente (Altman et al., 2005). A seis ratones BALB/c (Charles River Laboratories, St Constant, Quebec) se les inyectaron por vía intraperitoneal (i.p.) 108 células (200 µ?) fijadas con formalina de la cepa O:3 HP0826::Kan de H. pylori, 5 veces durante 82 días para obtener un título significativo. Se administró una inyección intravenosa (i.v.) final y 3 días después se hizo fusión. Las células de bazo de dos ratones se fusionaron con una linea celular de plasmacitoma Sp2/O de acuerdo con Kohler y ilstein (1975). Los sobrenadantes iniciales de la fusión de 368 pocilios se examinaron por medio de una prueba de inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) indirecta.
Para el examen del hibridoma por ELISA, placas de microtitulación (ICN, Costa Mesa, California) se recubrieron con 10 pg/ml de LPS de O:3 HP0826::Kan de H. pylori en una solución amortiguadora de carbonato 50 mM, pH 9.8, durante 3 h a 37°C. Después de lavar con PBS, las placas se bloquearon con 5% (p/v) de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS. Se agregaron sobrenadantes consumidos, y las placas se incubaron 3 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS y el segundo anticuerpo, un anti-lgG+lgM de ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (Caltag, So. San Francisco, California), se agregó durante 1 h a temperatura ambiente. Después de un paso de lavado final se le agregó el substrato, 3,3',5,5'-tetrametilbencideno (TMB) (KPL, Gaithersburg, Maryland), y la reacción se detuvo con ácido fosfórico 1 M. Se determinó la absorbancia a 450 nm usando una lectora de placas de microtitulación (Dynatech, Chantilly, Virginia). Después de este paso, el procedimiento de ELISA indirecta se siguió como se describe en el ejemplo 6.
Se obtuvieron dos hibridomas estables después de una clonación de dilución limitada. Un clon, 1 C4F9, una IgM, se seleccionó para caracterización ulterior. Se desarrolló fluido ascítico en ratones BALB/c y el anticuerpo monoclonal (mAb) 1C4F9 se purificó del fluido ascítico usando una columna de afinidad específica de IgM (Pierce, Rockford, Illinois), de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Se hicieron estudios de la especificidad del anticuerpo específico de glucano usando una serie de oligosacáridos lineales que consisten en residuos consecutivos de glucosa a-1 ,6-enlazados Glc?[a(1?6)Glc]n=i-6 y LPS purificado selectivo de H. pylori. Para la ELISA de inhibición, se prepararon diluciones seriadas de oligosacáridos lineales que contienen glucosa a-1 ,6-enlazada a partir de la serie de isomaltosa [Glca1?(6Glca1?)n=i.6] (USBiologicals, Swampscott, Massachusetts), o inhibidores de LPS de H. pylori 26695, 0:3 y PJ2, y se mezclaron con diluciones previamente preparadas del 1 C4F9 purificado que dio una DO450 = 1. Después de la incubación (22 °C, 15 min) esta mezcla se transfirió a la placa bloqueada de microtitulación original con el antigeno de LPS adsorbido, en donde se incubó otras 2 h a 37 °C. Después de este paso, el procedimiento de ELISA indirecta se siguió como se describe en el ejemplo 6. El porcentaje de inhibición se calculó usando la siguiente fórmula: % de inhibición = 100 x [(DO con inhibidor -DO sin inhibidor) / DO sin inhibidor] Se hicieron gráficas de la inhibición contra el log de la concentración para cada inhibidor, y se determinaron las concentraciones necesarias para obtener la mitad de la inhibición máxima (CI50) partiendo de curvas extrapoladas.
Las propiedades inhibitorias se optimizaron cuando se usó isomaltohexosa (n=5) e isomaltoheptosa (n=6) (cuadro 20). Previamente se observó que el LPS de H. pylori PJ2, que contiene en promedio entre seis y ocho residuos en la cadena de glucano (AItman et al., 2003), fue el inhibidor más eficaz (cuadro 20).
CUADRO 20 Inhibición de ELISA con una serie de oligosacáridos lineales que contienen glucosa a-1.6-enlazada y LPS de las cepas 26695. 0:3 y PJ2 de H. pylorí Inhibidor Cl50° Isomaltosa Glca1?(6Glca1?)n=1 0 Isomaltotriosa Glca1?(6Glca1?)n_2a 10,000 Isomaltotetrosa Glca1-?(6Glca1?)n_3 1 ,600 Isomaltopentosa Glca1?(6Glca1?)n-4 460 Isomaltohexosa Glca1?(6Glca1?)n-5 290 Isomaltoheptosa Glca1?(6Glca1?)n-6 210 LPS 26695 (n=3-4) 170 LPS 0:3 (n=5-6) 52 LPS PJ2 (n=6-8) 0.29 a Número de residuos de glucosa a-1 ,6-enlazados. b Concentración del oligosacárido o LPS ( g/ml) para 50% de inhibición EJEMPLO 11 Estudios de accesibilidad y pruebas bactericidas usando mAbs anti- glucano Los mAbs anti-glucano estuvieron muy accesibles sobre la superficie de bacterias vivas de cepas representativas de H. pylorí como lo muestran los estudios de microscopía IF indirecta (cuadro 21 ). Tanto a- ,6- glucano como CagA pudieron ser diferenciados sobre la superficie bacteriana simultáneamente.
Para determinar la actividad bactericida del anticuerpo monoclonal, se agregó a cada pocilio una dilución seriada de diez veces del mAb 1 C4F9 de ascitis descomplementada (50 pl), seguido por la suspensión bacteriana (25 pl), y se preincubaron 15 min a 37 °C. Después de este paso, el procedimiento se siguió como se describe en el ejemplo 7. La unión de 1 C4F9 en la superficie celular se correlacionó con la actividad funcional determinada por pruebas bactericidas contra cepas de tipo silvestre y mutantes de H. pylori (cuadro 21).
CUADRO 21 Caracterización de la unión de mAbs 1 C4F9 al a-1 ,6-glucano de las cepas de H. pylori por WCE, adherencia IF y pruebas bactericidas a Símbolos: ++++ fuertemente positivo; - negativo.
Los títulos bactericidas (CB50) se representan como el recíproco de la dilución del antisuero que redujo la cuenta de células viables en 50%. c De Monteiro, 2001. d De Logan et al. , 2000. e De Altman et al. , 2003. d n.d. No determinado Aunque se han descrito las modalidades preferidas de la invención, se reconocerá y entenderá que se le pueden hacer varias modificaciones, y que las reivindicaciones anexas pretenden cubrir todas estas modificaciones que pueden estar dentro del espíritu y alcance de la invención.
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Claims (24)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Un compuesto de Helicobacter pylori que contiene a-1 , 6-glucano, que comprende la estructura de la fórmula I: H G F E C B A a-GIc- -p-Gal-7-a-DDHcp-2-a-Hep-3-a-H^ |2 I en donde R es un trisacárido de a-DDHep-3-a-L-Fuc-3- -GlcNAc sustituido con un a-1 ,6-glucano enlazado a un a-1 ,3-DD-heptano, en donde el último residuo de DD-Hep de a-1 ,3-DD-heptano está bloqueado con un residuo ß-GIcNAc.
2 - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el glucano comprende de 3 a 12 residuos de glucosa a-1 ,6-enlazados.
3. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción heptano comprende de 2 a 6 residuos de heptosa a- ,3-enlazados.
4. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque R comprende: heptano glucano |^lcNAc-2^-DDHep-3-(a-DDHep-3-]^ W P T Y X V Q Z - -DDHcp-3- -L-Fuc-3-P-Glc Ac N M L en donde el residuo L de ß-GlcNAc está enlazado al 0-2 del Hep G; n=1 a 1 1 , y m = O a 4.
5.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque n=9.
6.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 4 o 5, caracterizado además porque m=2.
7. - El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque la estructura de la fórmula I también comprende una porción de lípido A unida covalentemente al residuo C de Kdo.
8. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la molécula de lípido A es O-desacilada o es cortada por hidrólisis del enlace cetosidico del residuo Kdo.
9. - El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque se aisla o purifica de la cepa HP0826::Kan de H. pylori.
10 - Un conjugado que comprende un compuesto que contiene a-1 ,6-glucano sustancialmente lineal conjugado con una molécula enlazadora, un transportador de proteína, o una combinación de los mismos.
1 1 . - El conjugado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el compuesto que contiene a-1 ,6-glucano sustancialmente lineal es el compuesto que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la estructura de la fórmula I está conjugada con la molécula enlazadora, transportador de proteína, o una combinación de los mismos.
12. - El conjugado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el compuesto que contiene a-1 ,6-glucano sustancialmente lineal es el dextrano.
13. - El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado además porque el transportador de proteína es el toxoide tetánico, albúmina de suero bovino, CRM o CRM1 97.
14. - Una composición que comprende uno o más de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y/o el conjugado que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13.
15. - Un anticuerpo que reconoce el compuesto que contiene el epítope a-1 ,6-glucano de la reivindicación 1.
16. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque es el anticuerpo monoclonal 1 C4F9.
17 - El uso del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 5 en la elaboración de un medicamento para causar bacteriólisis mediada por complemento de las cepas de H. pylori que expresan a-1 ,6-glucano en un individuo.
18. - El uso de una cantidad eficaz de la composición de la reivindicación 14 en la elaboración de un medicamento para inducir una respuesta inmune contra H. pylori en un individuo.
19. - El uso que se reclama en la reivindicación 18, en donde el compuesto está conjugado con una proteína transportadora adecuada.
20. - El uso que se reclama en la reivindicación 18, en donde la composición está conjugada con una proteína transportadora adecuada por medio de un ácido 2-ceto-3-desoxi-octulosónico (Kdo) del lipopolisacárido.
21. - Un antisuero inmune producido inmunizando un mamífero con la composición inmunogénica de la reivindicación 14.
22. - El antisuero inmune de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque comprende una IgG que reconoce un epitope de glucano a-1 ,6-enlazado en cepas homologas y heterólogas tipificables y no tipificables, mutantes y de tipo silvestre, de H. pylori.
23. - El antisuero inmune de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la IgG causa bacteriólisis mediada por complemento de cepas mutantes y de tipo silvestre de H. pylori que expresan a-1 ,6-glucano.
24 - La línea celular de hibridoma 1 C4F9.
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