BR112012002230A2 - epítopo do núcleo externo do lipopolissacarídeo do h. pylori. - Google Patents

epítopo do núcleo externo do lipopolissacarídeo do h. pylori. Download PDF

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Eleonora Altman
Blair A. Morrinson
Vandana Chandan
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Abstract

EPÍTOPO DO NÚCLEO EXTERNO DO LIPOPOLISSACARÍDEO DO H. PYLORI Helicobacter pylori, um dos mais comuns patógenos humanos, é associado com o desenvolvimento da gastrite crônica humana, úlceras pépticas e câncer gástrico. A invenção se refere a um composto do Helícobacter pytori contendo (Alfa)1,6-glucano compreende a estrutura da Fórmula (I): em que R é um trissacarídeo (Alfa)-DDHep-3-(Alfa)-L-Fuc-3-(Beta)-GlcNac substituído por um (Alfa)1,6-glucano ligado a um (Alfa)1,3-DD-heptano, e um que o último resíduo de DD-Hep do (Alfa)1,3-DD-heptano é tamponado com resíduo de (Beta)-GlcNac. As composições compreendem o composto, o uso do composto, e os anticorpos cultivados contra o composto são também descritos.

Description

“EPÍTOPO DO NÚCLEO EXTERNO DO LIPOPOLISSACARÍDEO DO H.
PYLORI" M Campo da Invenção ' A presente invenção refere a um novo de epítopo do núcleo externo do lipopolissa- . carídeo do H.pylori.
Mais especificamente, a presente invenção se refere a um novo epítopo donúcleo externo do H, pylori, a sua síntese, caracterização e conjugação.
Fundamentos da Invenção Helicobacter pylori é reconhecida como a mais comum infecção bacteriana associada com gastrite crônica humana, úlcera péptica e câncer gástrico.
H. pylori tem uma prevalência estimada de cerca de metade da população do mundo, atingindo até 70% nos paísesem desenvolvimento e 20-30% nos países industrializados (Dunn et al, 1997). À grande maioria dos indivíduos adquirem H. pylori na infância; a prevalência da infecção entre as crianças nos países em desenvolvimento está ligada a um baixo status sócio- econômico baixo e baixo saneamento (Castillo-Rojas et a!, 2004). H. pylori foi identificado | pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como um carcinogênio de classe |, uma vez que | aumentao risco relativo para câncer gástrico, em pelo menos, seis vezes.
Câncer gástrico é a segunda causa mais comum de mortalidade no mundo, e é responsável por 700.000 ; 2 mortes anuais (Parkin et al., 2002). i Estratégias atuais de erradicação do H. pylori são baseadas no uso de inibidores da " ' bomba de prótons e antibióticos.
No entanto, a eficácia da intervenção por quimioterápicos ficalimitada pela frequência da resistência antibiótica entre os isolados de H. pylori e à falta de imunidade contra a reinfecção.
Assim, novas terapias são necessárias para fornecer uma estratégia global para a prevenção e erradicação de infecções por H. pylori.
Embora recentes investigações tenham se concentrado sobre o papel dos componentes das proteínas na patogênese do H. pylori e seu papel na imunidade protetora (Ruggiero et al, 2003; Rossi et al., 2004), relativamente poucos estudos têm explorado a possibilidade de incluir outros antígenos de proteínas nas formulações de vacina (Angeiakopoulos e Hohmann, 2000). Por exemplo, as vacinas conjugadas de base polissacarídeos são conhecidas prevenir a infecção sistêmica e inibir a colonização do hospedeiro (Anderson et al, 1986; Chu et al, 1991; Pon et a!, 1997; Passwell et al., 2001; Passwell et al, 2003). Estudos recentes de patógenos entéricos têm examinado as abordagens baseadas em conjugados LPS como vacinas para uso humano (Gu et al, 1996; Mieszala et al, 2003; Cox et al, 2005; Yu e Gu, 2007). O lipopolissacarídeo (LPS) é um principal componente da superfície das células do H. pylori.
Estudos estruturais realizados em um número de isolados de H. pylori (Monteiro, 2001) resultaram em um modelo estrutural de LPS consistindo de uma cadeia-O e um núcleo de oligossacarídeos, que é anexado a uma molécula do lipídeo A.
A estrutura da cadeia estrutural do polissacarídeo de cadeia-O da maioria das linhagens de H. pylori é única e mostra determinantes do grupo sanguíneo de Lewis (Le) tipo 2 e/ou tipo 1 que ' imitam aqueles presentes sobre a superfície celular das células tumorais e gástricas ' humanas (Wirth et al, 1996); estes podem estar implicados em reações auto-imune . adversas que levam à gastrite atrófica (Appelmeik et al, 1996). Além disso, a região do núcleo extermo do LPS H. pylori contém dois componentes poliméricos incomuns: DD- | heptoglucano e a1,6-glucano (Monteiro, 2001). O polímero a1,6-glucano na região do núcleo externo de isolados de H. pylori é sintetizado pelo produto do quadro de leitura aberta HPO0159, A presença e a expressão do gene HP0159 em H. pylori é comum. ; Um número de genes biossintéticos de LPS H. pylori foram caracterizados e seu | —papelna patogênese e colonização determinado (Logan et al, 2000; Logan et al, 2005; Hiratsuka et al, 2005; Chandan et al, 2007; Altman et al, 2008). Mutantes H. pylori HPO0826 foram construídos e foi demonstrado que esta mutação resultou na formação de LPS truncados faltando o antígeno Le (Logan et al., 2000). No entanto, a caracterização completa da estrutura do LPS não foi atingida. Apesar dos avanços no campo, epítopos imunogênicos eficazes em vários tipos de | H. pylori permanecem ilusórios. . Sumário da Invenção A presente invenção se refere a um novo de epítopo do núcleo externo do 7 lipopolissacarídeo do H.pylori. Mais especificamente, a presente invenção se refere a um — novo epítopo do núcleo externo do H.pylori, sua síntese, caracterização e conjugação. A presente invenção fornece um composto Helicobacter pylori contendo a1,6- glucano compreendendo a estrutura da Fórmula |: K H G F E Cc B A a-Glc-4-B-Gal-7-a-DDHep-2-a-Hep-3-a-Hep7 PEtN-5-0a-Kdo-6-B-GlcN*-6-0a-GlcN*- 1PEIN|
P
R em que R é um trissacarídeo a-DDHep-3-a-L-Fuc-3-B-GIcNAc substituído por um a1,6-glucano ligado a um a1,3-DD-heptan, em que o último resíduo de DD-Hep do a1,3-DD- heptané tamponado com resíduo de B-GICNAc. No composto, tal como descrito, o a1,6- glucano pode compreender de cerca de 3 a cerca de 12 resíduos de glicose de ligação-1,6, e o 1,3-DD-heptan pode compreender de 2 até cerca de 6 resíduos heptose de ligação-1,3. O grupo R do composto como descrito acima pode ser heptan glucano —. B-GIcNAc-2-a-DDHep-3-[a-DDHep-3-].-a-DDHep-3-a-DDHep-3-a-Gle-[-6-a-Gle-],- 6-a-Glc-6- Ww P T Y x Vv Q Zz
-a-DDHep-3-a-L-Fuc-3-B-GlcNAc ' NOM L ] em que o resíduo L de B-GICcNAc é ligado a O-2 de Hep G. No composto agora . descrito, os resíduos Q e Z do glucano podem ser resíduos glicose de ligação a1,6-, en pode ser qualquer valor entre cerca de 1 a 11; resíduos de T, Y e X são resíduos heptose de ligação a1,3-, e m pode ser qualquer valor entre cerca de 0 a 4.
O composto como descrito acima pode ser isolada ou purificada da linhagem H. pylori HP0826::Kan.
Nos compostos descritos acima, a estrutura da Fórmula | pode ainda compreender uma porção do lipídeo A covalentemente ligada ao resíduo C do Kdo. A molécula do lipídeo A pode ser O-deacilada ou pode ser clivada por meio da hidrólise da ligação cetosídica do resíduo Kdo.
A presente invenção também fornece um conjugado, compreendendo um composto substancialmente linear contendo a1,6-glucano conjugado a uma molécula ligadora, um portador da proteina, ou uma combinação destes. O composto substancialmente linear contendo a1,6-glucano pode ser o composto descrito aqui, onde a estrutura da Fórmula | é ”* conjugada com a molécula ligadora, proteína transportadora, ou uma combinação destas. O composto substancialmente linear contendo a1,6-glucano pode ser alternativamente um " Dextran, como Dextran T5. A proteína transportadora pode ser o toxóide do tétano ou albumina de soro bovino. ; i A presente invenção também engloba uma composição que compreende um ou mais que um de compostos ou conjugados, conforme descrito acima.
A presente invenção também inclui um anticorpo dirigido contra o composto contendo epítopo a1,6-glucano aqui descrito. O anticorpo pode ser anticorpo monocional 1C4F9.A invenção ainda inclui linhagens de células hibridoma 1C4F9, que produz anticorpo monocional 1C4F9.
O anticorpo monoclonal descrito acima pode ser utilizado para induzir a bacteriólise complemento-mediada das linhagens H.pylori expressando a1,6-glucano em um indivíduo com necessidade de tal tratamento.
A presente invenção também fornece o uso de uma quantidade eficaz da composição descrita acima para induzir uma resposta imune contra o H. pylori em um indivíduo. O(s) composto(s) na composição pode estar conjugado a um adequado portador da proteína; além disso, o composto(s) na composição pode ser conjugado a um adequado portador da proteina através de um ácido 2-ceto-3-desóxi-octulosônico (Kdo) do lipopolissacarídeo.
A presente invenção também fornece um anti-soro imune produzido pela imunização de um mamífero com a composição imunogênica aqui descrita. O anti-soro o om Mm SMS cc coils A O oro ca id RN SS RUN SNS UNNN,iPÓÓÕ004000DDDLOÉ!ÉM0LOOEOSSSidi SS 4/43 imune pode compreender uma IgG que reconhece um epítopo de glucano ligado ao a1,6- no : mutante tipável e não tipáveis homólogo e heterólogo e linhagens tipo selvagem do H. pylori. ' A IgG pode induzir a bacteriólise mediada pelo complemento do mutante e das linhagens . tipo selvagem do H. pylori expressando o a1,6-glucano.
Aspectos adicionais e vantagens da presente invenção serão evidentes em vista da descrição a seguir. A descrição detalhada e exemplos, embora indicando modalidades preferidas da invenção, são dadas apenas a título de ilustração, na medida em que várias mudanças e modificações dentro do escopo da invenção se tornarão aparentes por aqueles usualmente versados na técnica à luz dos ensinamentos da presente invenção.
Breve Descrição dos Desenhos Estas e outras características da invenção serão agora descritas a título de exemplo, com referência aos desenhos anexos, onde: A Figura 1 mostra uma análise de CE-MS de glicoformas de LPS na fração 1 do LPS deslipidado da linhagem H. pylori 26695 HP0826::Kan no modo íon positivo. A Figura 1 mostrao espectro de massa extraída (m/z 1000-1500), enquanto a Figura 1B mostra o espectro iônico produzido de íons a m/z 1266.3. . A Figura 2 mostra uma análise da CE-MS de glicoformas LPS da LPS O-deacilada da linhagem H. pylori 26695 HP0826::Kan no modo íons negativos. A Figura 2A mostra o 7 espectro de massa extraída (m/z 600-2000), enquanto que à Figura 2B mostra o espectro iônico produzido de íons a m/z 1597.7. Fragmentos iônicos correspondentes à fração lipídeo A são marcadas com asterisco. A Figura 3A mostra a estrutura da principal glicoforma do LPS da linhagem H. pylori 26695 HPO0826::Kan; acilação não é mostrada. Produtos da deacilação KOH do LPS da Figura 3A são mostrados na Figura 3B (compostos 1 à 4). Produtos da desaminação do composto4 são mostrados na Figura 3C (compostos 5 e 6). Produtos da oxidação periodato do composto 6 são mostrados na Figura 3D (compostos 7 e 8). Estruturas previamente propostas na arte do LPS do H. pylori a partir de linhagem 26695 (Figura 3E) e LPS H. pylori da linhagem mutante 26695 HP0826::Kan (Figura 3F) também são mostrados (adaptado de Logan et al, 2000). PEthn = fosfoetanolamina; Glc = D-glucopiranosida; Gal = D- galactopiranosida; Kdo = ácido 2-ceto-3-desóxi-octulosônico; LDHep = L-glicero-D-mano- heptose; DDHep = D-glicero-D-mano-heptose; GIcNAc-2-acetamido-2-desóxi-glicose-D; GleN=2-amino-2-desóxi-glicose-D; Fuc = L-fucose, P = fosfato; e Gro=glicero|. A Figura 4 mostra um esquema de reação para a preparação de conjugados de base LPS da presente invenção. A Figura 5 apresenta uma análise de CE-MS da principal fração do LPS H. pylori 0:3 HP0826::Kan deslipidado no modo íon negativo +: glicoformas de LPS contendo um resíduo de Hep na cadeia lateral, R HeX = 513, Hep, HexNAc, Fuc; =: glicoformas de LPS
.-p——D—D——— o asa p—— SANA pu—p— Ii s e ass pa. .—QÇ—————— s esse .—— Des... »..OADRM ANA E MA OE O OM MA ———— .— . . 5/43 contendo dois resíduos Hep na cadeia lateral, Hep, Hep, HexNAc, Fuc. ' A Figura 6 mostra gráficos para a determinação da especificidade dos anticorpos de ' coelho provocada por conjugado dLPS-TT através da inibição de ELISA com LPS do H. . pylori a partir de 26.695 HP0479::Kan (Figura 6A) e 26.695 HP0826::Kan (Figura 6B). LPS de revestimento são descritos da forma a seguir: quadrados cheios - 26.695; losangos cheios - 26695 HPO0826::Kan; círculos cheios - 26695 HP0159::Kan; triângulos cheios - 26695 HPO0479::Kan; círculos abertos - SS1; quadrados abertos - SS1 HPO0826::Kan; triângulos abertos - SS1 HP0159::Kan; triângulos abertos invertidos - SS1 HP0479::Kan.
A Figura 7 mostra gráficos que descrevem respostas H.pylori específicas . em ratinhos CD-1. Ratinhos foram vacinados quatro vezes em intervalos semanais, com 25 pg Iratinho de conjugado dLPS-TT adjuvada com toxina do cólera 1 mgrratinho (barras pretas), sonicado sem células PJ2 adjuvado com 1 ugíratinhho de toxina do cólera (barras sombreadas ou salino ( barras abertas). Quatro semanas após a primeira imunização, amostras da lavagem sérica, fecal e vaginal foram coletadas e os ensaios para IgG e IgA H.pylorieespecíficos para os ratinhos são plotados nos gráficos com a barra horizontal indicando a média de grupo (n = 5/grupo). * P <0,05, ” p <0,01 pelo teste Mann Whitney de . uma via.
A Figura 8 é um gráfico de barras representando a aflição por H. pylori nos 7 estômagos de ratinhos CD-1. Ratinhos foram vacinados quatro vezes em intervalos semanais, com 25 mmtfratinho de conjugado dLPS-TT adjuvado com 1 ug/ratinho de toxina do cólera (barras cheias), sonicado a com uma toxina do cólera mg/ratinho (barras pretas), ' sonicado sem células PJ2 adjuvado com uma toxina do cólera mg/ratinho (barras sombreadas) ou salino (barras abertas). Cinco semanas após a primeira imunização, os ratinhos foram alimentados oralmente três vezes a cada dois dias com —10º cfu H. pylori linhagem PJ2. Quatro semanas mais tarde, os ratinhos foram mortos e bactérias viáveis provenientes de seus estômagos foram enumeradas. Barras representam grupos de 4 a 5 ratinhos + SEM.* p <0,05, teste Mann Whitney de uma via.
Descrição das Modalidades Preferidas A presente invenção está relacionada a um novo de epítopo do núcleo externo do lipopolissacarídeo do H.pylori. Mais especificamente, a presente invenção se refere a um novo epítopo do núcleo externo do H.pylori, a sua síntese, caracterização e conjugação.
A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que comumente entendido por aqueles usualmente versados na técnica a qual pertence a invenção. Embora todos os métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os métodos preferidos e os materiais são agora descritos. Todas as publicações mencionadas neste documento aqui se incorporam por referência.
Como usado aqui, “purificado” não significa necessariamente uma pureza absoluta, ' mas preferentemente é pretendido como uma definição relativa.
Da mesma forma, como usado aqui, “isolado” refere-se à remoção de algo de seu ambiente nativo. . Helicobacter pylori é uma bactéria patogênica comumente associada com gastrite crônica humana, úlcera péptica e câncer gástrico, como resultado do aumento do risco de câncer gástrico associado a H.pylori, ele tem sido classificado como um carcinogênio de classe |. Lipopolissacarideo (LPS) é um componente importante de superfície de células de H. pylori, Publicações anteriores relativas a estudos estruturais de LPS do H. pylori levou a um modelo proposto, onde um polissacarídeo de cadeia-O é ligado covalentemente a um núcleo de oligossacarídeos, que por sua vez é ligado a uma molécula do lipídeo A.
A cadeia estrutural polissacarideo de cadeia-O é única e pode exibir determinantes do grupo sanguineo de Lewis (Le) tipo 2 e/ou tipo 1; esse componente polissacarídeo é antigênico.
Linhagens H.pylori tipáveis possuem epítopos de Lewis (antígenos Le X e/ou Le Y) que podem ser reconhecidos pelos anticorpos anti-Lewis (anti-Le); tais anticorpos podem estar comercialmente disponíveis e ajudar na tipagem.
Linhagens “não-tipáveis" não contêm estruturas de Lewis. * Mais estudos estruturais estabeleceram que a região do núcleo externo do LPS H. pylori contém dois componentes poliméricos incomuns: DD-hepatoglicano e cadeias laterais 7 a1,6-glucano (Monteiro, 2001). Logan et al. (2000) também forneceram uma visão sobre a estruturado LPS.
Especificamente, as estruturas propostas (ver fig. 3E e 3F), forneceram que a DD-heptose (DD-Hep) na cadeia lateral está anexada ao DD-Hep na cadeia principal, enquanto que o a1,6-glucano é anexado à esta cadeia lateral DD-Hep e formando outro ramo.
Especificamente, Logan et al. (2000) determinou o comprimento da cadeia de glucana em 0826 LPS mutante a ser dei a 3 glicoses com base em espectros FAB-MS (espectrometria de massa por bombardeio de átomo rápido). A presença de glicose a1,6- ligada na linhagem H. pylori 26695 LPS também foi descrita e foi baseada na análise de dados de metilação, mas o comprimento do glucano não foi determinado.
Foi sugerido que, adicionalmente, na linhagem 26.695 LPS, Hep 3-substituída forma uma conexão entre a unidade GICcNAc da cadeia-O e o núcleo.
A presença de heptose 3-ligada no LPS H. pylori HPO0826::Kan também foi estabelecido, mas a presença de a1,3-heptan ou seu comprimento não foram descritos.
Nenhuma informação adicional sobre a estrutura ou o comprimento do heptan ou cadeias laterais glucan foram fornecidas.
A estrutura do LPS do H. pylori está atualmente mais definida.
A presente invenção proporciona um novo composto Helicobacter pylori contendo a1,6-glucano compreendendo a estrutura da Fórmula |: K H G F E Cc B A a-Glc-4-B-Gal-7-a-DDHep-2-a-Hep-3-a-Hep7 PEtN-5-a-Kdo-6-B-GlcN*-6-a-GlcN*- ' 1PEWN |
P . R em que R é um trissacarídeo a-DDHep-3-a-L-Fuc-3-B-GIcNAc substituído por um a1,6-glucano ligado a um a1,3-DD-heptan, em que o último resíduo de DD-Hep do a1,3-DD- heptan é tamponado com resíduo de E-GIcNAc.
Na estrutura, como descrito acima, o B-GIcNAc dos trissacarídeo (a-DDHep-3-a-L- Fuc-3-B-GIcNAc), está ligada a a-DDHep G. A a-DDHep do trissacarídeo é ligada à a1,6- glucano, que por sua vez é ligada à a1,3-DD-heptan. O a1,3-DD-heptan é então ligado a um resíduo B-GICcNAc; este pode fornecer um ponto de ligação para o polissacarídeo de cadeia- O. Pelo termo “ligado” ou “substituído”, é significado que duas frações são unidas por uma ligação covalente. | O termo “a1,6-glucano” aqui usado pode também ser referido alternadamente como “glucano”, cadeia lateral o1,6-glucano”, “cadeia lateral glucano”, molécula a1,6-glucano”, | e/ou “fração glucano”. O a1,6-glucano é uma cadeia de polissacarídeo linear de monômeros 7 de glicose ligadas por ligações a1, 6 O-glicosídicas. Em um exemplo, que não se destina a ser um fator limitante de nenhum modo, o a1,6-glucano pode ser um polissacarídeo linear. O ' a1,6-glucano pode compreender qualquer quantidade adequada de resíduos a1,6-glicose.
Porexemplo,e sem pretender ficar de nenhum modo limitado, o glucano pode compreender de cerca de 3 a cerca de 12 resíduos de glicose a1,6-ligada, especificamente, a fração glucano pode compreender de cerca de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 resíduos de glicose a1,6-ligada, ou qualquer outra faixa definida por qualquer dois valores mencionados. Em um exemplo não limitante, o a1,6-glucano pode compreender de 9 a 12 resíduos a1,6-glucano, em outro exemplo não limitante, o a1,6-glucano pode compreender 10 resíduos a1,6- glucano.
O termo “glicoforma" como aqui utilizado indica diferentes formas ou tipos de compostos com a mesma estrutura de LPS, mas diferentes em um número de resíduos a1,6-glicose ou a1,3-heptose. Por exemplo, e sem querer se comprometer com a teoria, cada glicoforma pode compreender uma fração glucano e/ou heptan de comprimento específico ou uma composição desses.
O termo “a1,3-heptan”" aqui usado pode ser também referido alternativamente como "a1,3-DD-heptan”, “heptan”, “cadeia lateral a1,3-heptan”, “cadeia lateral heptan”, “o1,3- heptan porção”, fração heptan”, e/ou “DD-heptoglicano”. O a1,3-heptan é uma cadeia de polissacarídeo de monômeros heptose ligados por ligações a1,3 O-glicosídicas. Em um exemplo, que não se destina a ser um fator limitante de nenhum modo, o a1,3-heptan pode ser um polissacarídeo linear. O a1,3-heptan pode compreender qualquer quantidade adequada de resíduos a1,3-heptose.
Por exemplo, e sem pretender ficar de nenhum modo ' limitado, o heptan pode compreender de cerca de 2 a cerca de 6 resíduos heptose a1,3- ligados; especificamente, a fração heptan pode compreender cerca de 2, 3, 4, 5 ou resíduos . heptose a1,3-ligados, ou qualquer faixa definida por quaisquer dois valores já mencionados.
O último resíduo DD-Hep do a1,3-DD-heptan descrito acima é tamponado com um resíduo B-GScNAc.
Pelo termo “tamponado”, que quer dizer que resíduo B-GIcNAc é o último resíduo na cadeia lateral, o termo “terminada” também pode ser usado.
O B-GlIcNAc pode estar ligado ao DD-Hep através da posição 0-2 da heptose.
Sem querer se comprometer com a teoria, o resíduo B-GIcNAc pode fornecer um ponto de ligação para o —polissacarídeo de cadeia-O. | Em um exemplo não-limitante, R pode ser | heptan glucano —. | B-GIcNAc-2-a-DDHep-3-[a-DDHep-3-].,-a-DDHep-3-a-DDHep-3-a-Glc-[-6-a-Glc-],- 6-a-Glc-6- Ww P T Y x NÃ Q Z -a-DDHep-3-a-L-Fuc-3-B-GIcNAc : N M L em que o resíduo L de B-GICNAc é ligado a O-2 de Hep G.
Neste exemplo, o ' resíduo B-GIcNAc W pode fornecer um ponto de ligação para o polissacarideo de cadeia-O.
No composto, tal como acabamos de descrever, resíduos Q e Z do glucano são resíduos glicose a1,6-ligada, e n pode ser qualquer valor entre cerca de 1 a 11, tal que o glucano compreende de cerca de 3 a cerca de 12 resíduos de glicose de ligação a1,6-; em um | exemplo específico não limitante, uma glicoforma principal contém 10 resíduos glicose a1,6- ligada (n = 9) consecutivos.
No composto, tal como acabamos de descrever, resíduos de T, Y e X são resíduos heptose a1,3-ligados, e m pode ser qualquer valor entre cerca de O a 4, tal que o heptan compreende de cerca de 2 a cerca de 6 resíduos heptose de ligação a1,3-; em um exemplo específico não limitante, uma glicoforma principal contém 4 resíduos heptose a1,3-ligados (m = 2) consecutivos.
A estrutura pode ser isolada e/ou purificada a partir de qualquer linhagem H.pylori adequada; por exemplo, e sem pretender ficar de nenhum modo limitado, a molécula truncada de LPS de H.pylori pode ser isolada a partir de uma linhagem H.pylori não tipáveis ( ou seja, uma desprovida de antígenos Lewis), tais como e não limitado a, uma linhagem de H. pylori com mutação no gene HP0826 levando a um mutante isogênico faltante do polissacarídeo de cadeia-O.
Em um exemplo não-limitante, o composto descrito aqui pode ser isolado e/ou purificado a partir da linhagem de H. pylori 26695 HP0826::Kan ou linhagem PJ2.
A estrutura da Fórmula |, também referida como a “molécula do núcleo interno”, ' pode ainda compreender uma porção do lipídeo A ligada covalentemente a um resíduo Kdo, ' por exemplo, o resíduo C do Kdo. Em outras modalidades, a molécula do lipídeo A pode ser x O-deacilada ou pode ser completamente deacilada. Em ainda outras modalidades, fracção lipídica A pode ser clivada por meio da hidrólise da ligação cetosídica do resíduo Kdo. Sem querer se comprometer com a teoria, a clivagem de lipídios A pode ser feita para eliminar a toxicidade do LPS e para evitar a possível agregação e insolubilidade do conjugado. Aquele usualmente versado na técnica poderá estar familiarizado com os métodos de O-deacilação, deacilação, ou de hidrólise da ligação cetosídica da fração do lipídeo A (ver, por exemplo, Hoistetal, 1991; Altman et al., 2003).
A presente invenção também fornece um conjugado compreendendo um i substancialmente linear composto contendo a1,6-glucano conjugado a um portador da proteína. O substancialmente linear composto contendo a1,6-glucano pode ser qualquer polissacarídeo adequado composto de resíduos glicose a1,6-ligada. Pelo termo “substancialmente linear, se que quer dizer que o a1,6-glucano contém poucas ramificações, e sem pretender ficar de nenhum modo limitado, o a1,6-glucano pode . compreender de cerca de O a cerca de 5% ramificação no a1,6-glucano. Especificamente, o a1,6-glucano pode compreender de cerca de 0,0,5, 1, 1,5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4,5, ou 5% de ' ramificação, ou qualquer quantidade entre os mesmos, o composto pode também ser uma mistura, em que a quantidade de ramificações dentro da mistura varia de um composto para outro. Em um exemplo não limitante, o composto contendo a1,6-glucano pode ser a estrutura, como descrito acima e aqui. Em outro exemplo, o composto a1,6-glucano pode ser um Dextran. O Dextran pode ser qualquer Dextran adequado que atenda aos requisitos descritos acima e com um peso molecular de entre 1 e 10 kDa; por exemplo, mas sem | pretender ficar de nenhum modo limitado, o Dextran pode ser cerca de 1, 3,5, 5, 6.5, 8, ou 10 kDa, ou qualquer valor entre os mesmos. Em um exemplo específico não limitante, o Dextran pode ser Dextran T5. Em outro exemplo, o composto contendo a1,6-glucano pode ser uma cadeia linear de entre cerca de 5 e 8 a1, 6-resíduos de glicose tinta;! Por exemplo, | e sem pretender ficar de nenhum modo limitado, o composto contendo a1,6-glucano pode seruma cadeia linear de 5, 6,7 ou 8 resíduos glicose a1,6-ligada.
O composto contendo a1,6-glucano é conjugado a uma molécula ligadora e/ou um portador da proteína, como seria compreendido por aqueles usualmente versados na técnica, a estrutura descrita a qui pode estar conjugada a uma molécula ligadora (também referida como “ligador”) que por sua vez é conjugada com a proteína transportadora. Pelo termo “conjugado”, é aqui significado que a estrutura está anexada de forma covalente ou ligada à molécula ligadora e/ou proteína transportadora. Métodos para a ligação covalente do ligador e/ou proteína transportadora são bem conhecidos por aqueles usualmente
En .—DD—D—D—>——— P—.—— — — a aa a aa oe a sa va e esse e eee ee e ap—esaõe a a a eee o 1 O.
À".P 10/43 versados na técnica; como será notado por aqueles usualmente versados na técnica.
O ' método para a anexação covalente (esteja ou não o ligador presente) pode variar com base ' na proteína transportadora usada.
Sem querer ficar limitado de nenhum modo, tal método é .- mostrado na Figura 4, que é adaptado de Fernandez-Santana et al. (1998); nesse método, o LPS deacilado ou deslipidado é ativado mediante ligar covalentemente o grupo carboxila do resíduo Kdo a uma molécula ligadora, seguido pela introdução de uma funcionalidade maleimido.
O LPS ativado é misturado com proteína transportadora tiolada para produzir uma estrutura conjugada.
Como será apreciado por aqueles usualmente versados na técnica, o método aqui descrito é geral e, portanto, qualquer outro método adequado pode ser usado (por exemplo, mas não limitado a, aqueles descritos por Chu et al, 1991; Cox et al, 2005; Gu et al, 1996; Mieszala et al, 2003; Yu e Gu, 2007). O composto contendo a1,6- glucano pode estar associado à proteína ligadora/transportadora por meio de um grupo carboxila de qualquer resíduo carboidrato adequado na estrutura.
Em um exemplo específico não limitante, o composto contendo a1,6-glucano pode ser a estrutura da presente invenção e pode ser anexado por meio do núcleo interno do resíduo C do Kdo.
A proteína transportadora pode ser qualquer transportadora adequada conhecida . na arte, incluindo as transportadoras imunogênicas.
Por exemplo, a proteína transportadora pode ser, mas não se limita ao toxóide do tétano, albumina de soro bovino (BSA), toxóide 7 diftérico, toxóide diftérico mutante, proteina CRM, proteína CRM;i97, Pseudomonas A, proteína da toxina do cólera (CT), proteína da toxina do Cólera mutante CT-E29H, e outros conhecidos na arte, por exemplo, mas de nenhum modo limitado às partes de flagelos, pili e outras toxinas.
Conforme indicado anteriormente, conjugados podem ser preparados ou mediante conectar diretamente a proteína transportadora e a estrutura da presente invenção via natural grupos ou conectar através da introdução de um espaçador ou moléculas ligadoras, compreendendo, mas de modo algum limitado a, grupos amino primários, hidrazonas, tióis, carboxilas e outras.
A presente invenção fornece adicionalmente uma composição que compreende um ou mais compostos como descrito aqui, um ou mais conjugado como descrito aqui, ou uma combinação destes.
Em uma modalidade, a composição pode compreender uma mistura de glicoformas do composto descrito acima, por exemplo, e sem pretender ficar de nenhum modo limitado, a composição pode compreender uma glicoforma principal composta por 10 consecutivos resíduos glicose a1,6-ligada (n = 9) na fração glucano.
De modo similar, e sem pretender ficar de nenhum modo limitado, uma composição poderia incluir conjugados preparados a partir de mais de uma glicoforma aqui descrita.
Como demonstrado nos exemplos, a estrutura de LPS elaborada pela linhagem H. pylori 26695 HP0826::Kan que foi usada para a preparação de conjugados foi uma mistura de três glicoformas: cadeia principal do oligosacarídeo | tamponado com GlcNAc e [GICNAc, Fuc, Hep), e ' oligosacarídeo contendo glucano a1,6-ligado, com a cadeia mais longa glucano ' correspondendo a cerca de doze resíduos a1,6-ligados, conforme determinado pela análise . CE-MS (Tabela 2, Figura 2). A composição como acabamos de descrever pode ser imunogênica. Pelo termo “imunogênica”, que quer dizer que a composição pode induzir uma resposta imune contra o H. pylori do tipo selvagem e/ou linhagens mutantes. A resposta imune pode fornecer uma ampla resposta imunogênica contra linhagens tipáveis e não-tipáveis de H. pylori.
A presente invenção também fornece um uso de uma quantidade eficaz da composição, conforme descrito neste documento, para induzir uma resposta imune contra o H. pylori em um indivíduo. Conforme descrito anteriormente, a composição pode compreender uma ou mais de um composto de acordo com a presente invenção. O um ou mais composto pode ser conjugado com uma molécula ligadora e/ou uma molécula transportadora adequada.
A presente invenção também fornece um anti-soro imune produzido mediante imunizar um mamífero com a composição imunogênica, como descrito acima. O anti-soro . imune pode compreender ou produzir um soro pós-imune IgG que reconhece um epitopo glucano a1,6-ligado em um mutante tipável e não tipáveis homólogo e heterólogo e 7 linhagens tipo selvagem do H. pylori, O IgG pode induzir a bacteriólise mediada pelo complemento do mutante e das linhagens tipo selvagem do H. pylori expressando o a1,6- glucano.
A presente invenção fornece adicionalmente anticorpos anti-a1,6-glucano. Os anticorpos podem ser cultivados contra o composto da invenção aqui descrita, ou podem ser cultivados contra outras moléculas contendo a1,6-glucano como Dextran (Dextran ou conjugados, por exemplo, mas não limitado a conjugados BSA-Dextran), em um exemplo não limitante, o anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal, produzido de acordo com métodos conhecidos na arte (veja o Exemplo 10; Altman et al, 2005). Por exemplo, e sem pretender ficar de nenhum modo limitado, o anticorpo pode ser um anticorpo monocional, cultivado contra o presente epítopo a1,6-glucano presente na região de núcleo externo do LPSdo mutante do H. pylori HPO8S26, mais especificamente, o anticorpo pode ser cultivado contra o composto mostrado na Figura 5. Em mais um exemplo mais específico, o anticorpo monocional pode ser um IGM C4F9, produzido por linhagens de células hibridoma 1C4F9. Esta linhagem celular foi depositado com a Autoridade Depositária Internacional do Canadá (National Microbiology Laboratory, Agência de Saúde Pública do Canadá, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canadá) em 30 de julho de 2009 e número de acesso atribuído 300709-01. Como demonstrado na exemplos, 1C4F9 reconheceu o epítopo a1,6-glucano no LPS e células integrais de linhagens H.pylori tipáveis e não tipáveis, foram facilmente acessíveis na superfície da bactéria viva, e igualmente bem reagidas com ambos os ' conjugados LPS-OH-TT e dLPS -BSA ou dLPS-TT. ' A presente invenção proporciona o uso de anticorpos para induzir bacteriólise . complemento-mediada das linhagens H.pylori expressando a1,6-glucano mutante e tipo selvagem ipáveis e não tipáveis em um indivíduo com necessidade de tal tratamento. Como anteriormente descrito, as linhagens H.pylori têm antígenos de Lewis reconhecidos pelos anticorpos anti-Le enquanto que as linhagens não tipáveis, não. Todavia, uma vez que tanto as linhagens tipáveis e não tipáveis contêm a1, 6-glucano, ambos os tipos de linhagens serão reconhecidos pelo anticorpo C4F9.
Atualmente na arte, linhagens de H. pylori podem ser tipadas usando anticorpos comercialmente disponíveis contra antígenos de Lewis; todavia, como as linhagens não tipáveis não contêm estruturas de Lewis, elas não podem ser classificadas de acordo com esta abordagem. Como as linhagens H.pylori mais tipáveis e não tipáveis conduzem epítopos a1,6-glucano, os anticorpos anti-a1i,6-glucano (como mAb 1C4F9) podem proporcionar um método adicional de triagem e caracterização dos isolados de H. pylori.
O LPS da linhagem H. pylori 26695 HP0826::Kan foi purificado e sua estrutura 7 química determinada por metilação, composição, em análise de ressonância mgnetica nuclear profunda (RMN), bem como dados de CE-MS. A presença de glucano a1,6-ligado ' na região do núcleo externo do LPS do mutante H. pylori HPO0826 também foi demonstrada; | esta estrutura foi reconhecida pelo anticorpo monoconal a1,6-glucano específico, 1C4F9. O último anticorpo foi gerado usando células fixadas em formalina da linhagem mutante H.pylori 0:3 HP0826::Kan. Esses anticorpos estavam acesiveis na superfície celular e bactericidas. Anteriormente, acreditava-se que apenas as estruturas de Lewis eram antigênicas; assim a geração de anticorpos contra a1,6-glucano foi inesperada.
Para investigar o potencial da vacina LPS H. pylori, LPS modificado do mutante H. pylori 26695 HP0826::Kan, foi conjugado com o toxóide do tétano (TT) ou albumina de soro bovino (BSA). Duas abordagens para a preparação do LPS parcialmente deslipidado ou deslipidado foram utilizadas: O-deacilação do LPS por hidrazinólise branda (LPS-OH) ou deslipidação do LPS por tratamento com ácido brando (dLPS). Métodos adicionais de deslipidação e/ou deslipidação parcial são bem conhecidos na arte e tais métodos adequados podem ser utilizados no âmbito da presente invenção. Ambos os LPS-OH e dLPS foram covalentemente ligados através de um resíduo ácido 2-ceto-3-desóxi- octulosônico (Kdo) a um espaçador contendo um grupo diamino, seguido pela introdução de uma funcionalidade maleimido e conjugação de TT ou BSA tiolados para dar conjugados —LPS-OH-TT, dLPS-BSA e dLPS-TT, respectivamente. Em um experimento separado, PJ2 de linhagem não tipável foi deslipidada e utilizada para conjugação para produzir o conjugado dLPS (PJ2)-TT.
Os conjugados O LPS-OH-TT, dLPS-BSA, dLPS-TT, bem como dLPS (PJ2)-TT ' mantiveram antigenicidade do determinante a1,6-glucano acessível em superfície, conforme ] estabelecido pelo ensaio ELISA indireto com I9gM 1C4F9. O anticorpo foi mostrado para ter - excelente especificidade para o determinante a1,6-glucano e suas características de ligação ' foram determinadas através da inibição de ELISA com oligossacarídeos provenientes de séries isomalto e purificados LPS provenientes de linhagens tipáveis e não tipáveis de H.
pylori. Esses estudos confirmaram que 1C4F9 tinha um requisito para 5-6 consecutivos resíduos glicose a1,6-ligada, um padrão consistente com o tamanho dos sítios combinantes anti-a-(1 — 6) dextran postulados por Kabat (1993).
Os conjugados LPS-OH-TT, dLPS-BSA, dLPS-TT ou dLPS (PJ2)-TT foram imunogênicos em ratinhos e coelhos e induziu significativas respostas de anticorpos IgG para LPS a partir de linhagens homólogas, heterólogas e tipo selvagem do H. pylori. Uma resposta igG imune dez vezes mais forte ao antígeno imunizante foi gerada em ratinhos e coelhos que receberam conjugado contendo dLPS. Os soros pós-imunes de coelhos imunizados com LPS-OH-TT, dLPS-BSA, dLPS-TT ou dLPS (PJ2)TT apresentaram atividade bactericida contra as linhagens mutante 26.695 HP0826::Kan e do tipo selvagem 7 26.695 de H. pylori.
Em resumo, estes resultados indicam que conjugados de proteína de base LPS de Í H.pylori deslipidados ou parcialmente deslipidados desprovidas do antígeno Le e conduzindo uma longa cadeia a1,6-glucano são imunogênicas tanto em ratinhos e coelhos e induzem anticorpos bactericidas. É importante notar que este epítopo foi identificado como sendo imunogênico. Isso não foi estabelecido previamente porque somente as estruturas de Lewis eram conhecidas serem antigênicas e produzir anticorpos específicos.
A presente invenção será ainda ilustrada nos exemplos a seguir. No entanto, é preciso entender que esses exemplos são apenas para fins ilustrativos e não devem ser usados para limitar o escopo da presente invenção de nenhum modo.
Exemplo 1: Isolamento e análise estrutural de LPS H. pylori 26696 HP0826::Kan. Linhagem Helicobacter pylori 26695 foi obtido de Dr. R. Alm (Astra Zeneca, Boston, MA), isolado H.pylori 0:3 foi do Dr. J. Penner, J99 foi obtido do Dr. D. Taylor (University of Alberta, Edmonton, Canadá), SS1 do Dr. A. Lee (The University of New South Wales, Sydney, Austrália), isolados clínicos frescos PJ1 e PJ2 foram isolados do Dr. W. Conlan (IBS, NRC) e M6 foi do Dr. K. Eaton (Michigan State University, MI).
O desenvolvimento das linhagens bacterianas foi realizado como descrito por Hiratsuka et al. (2005). Resumidamente, as células foram cultivadas a 37 ºC em placas de ágar sangue Columbia (Difco) suplementadas com antibiótico contendo 7% de sangue de cavalo em ambiente microaerofílico por 48 h (Kan 20 ug/mL) como anteriormente descrito (Hiratsuka et al., 2005). Para o crescimento em cultura líquida, calda Brucella suplementada
14/43 | com antibiótico contendo 10% de soro fetal bovino foi inoculada com células de H. pylori ' colhidas de placas a 48 h de ágar sangue Columbia/sangue de cavalo e incubadas por 48 h ' em um agitador em condições de microaerofilia (85% N2, 10% CO, 5% O>) como descrito . anteriormente (Hiratsuka et al., 2005). As linhagens de H. pylori foram cultivadas em cultura líquida, conforme descrito | acima, e a massa celular úmida obtida por centrifugação do crescimento bacteriano foi lavada duas vezes sucessivamente com etanol, acetona e éter leve de petróleo e secada ao ar. O LPS foi extraído da massa celular secada ao ar através do procedimento de extração renol-água de Westphal e Jann (1965). O LPS foi obtido da fase aquosa após extensiva diálisee liofiização. O LPS do H. pylori foi ainda purificado por ultracentrifugação (105.000 xg, 4 ºC, 12h), e o “pellet' foi suspenso em água destilada e liofilizado.
A análise da composição de açúcar foi realizada pelo método acetato de alditol (Sawardeker et al., 1967). A hidrólise foi feita em ácido trfluoracético 4 M a 100 ºC por 4 h ou ácido trifluoroacético 2 M a 100 ºC por 16 h seguido de redução em H;O em NaBH, e —acetilação posterior com anidrido acético/piridina. Os derivados de acetato de alditol foram analisados conforme descrito anteriormente (Altman et al., 2003). A análise da metilação foi 7 realizada de acordo com o método de Ciucanu & Kerek (1984) e com a caracterização de derivados de acetato de alditol permetilado por cromatografia líquida de fase gasosa — ' espectrometria de massa (GLC-MS), como descrito anteriormente (Altman et al., 2003).
Análise de açúcar do LPS purificado do H. pylori 26695 HPO0826::Kan como acetatos de alditol revelou a presença de L-fucose (L-Fuc), D-glicose (D-Glc), D-galactose (D-Gás), N- acetil-D-glucosamina (D-GIcNAc), D-glicero-D-mano-heptose (DD-Hep) e L- glicero-D-mano-heptose (LD-Hep) na razão molar aproximada de 0.4:5.0: 1.5:4.3:6.4:1.4, indicando a presença da estrutura desprovida de cadeia-O (Logan et al., 2000). Análise de | metilaçãorealizada no intacto LPS 26695 HP0826::Kan foi coerente com essas descobertas | e mostrou a presença de terminal L-Fuc, L-Fuc 3-substituído, terminal D-Glc, terminal D-Gal, glicose 3-substituída, D-Gal 4-substituído, glicose 6-substituída, terminal DD-Hep, DD-Hep 2-substituído, DD-Hep 6-substituído, DD-Hep 3-substituída, DD-Hep 7-substituída, DD-Hep 2,7-substituído, LD-Hep 2-substituído, LD-Hep 3-substituído, terminal D-GIcNAc e 3-D- GlcNAc substituídos na relação molar aproximada de 01: 1,011: O: 1,2:1,0:6,0:0,4:1,2:1,1: 3,1: 0,5:1,6:1,2:0,1, 0,3:0,4. Não foram detectados D-GIcNAc 3,4- substituído e D-Gal 2-ligado, característicos de antígenos Le contendo cadeia-O, A pureza do LPS foi confirmada pela ausência de rabitol erivado de RNA. A composição e a análise de metilação de LPS 26.695 estão reportadas (Logan et al., 2005). Todos os açúcares estavam presentes na forma piranose.
Exemplo 2: Caracterização do de LPS deslipidado de H. pylori 26695 HP0826::Kan por eletroforese capilar-espectrometria de massa (CE-MS).
LPS 26695 HPO0826::Kan (20 mg) purificado obtido no Exemplo 1 foi hidrolisado em ' tampão 0,1M acetato de sódio, pH 4,2, por 2 h a 100 ºC e fracionado por filtração em gel em ' uma coluna Bio-Gel P-2, conforme descrito anteriormente (Aitman et al., 2003) para gerar . LPS deslipidado (dLPS). Três frações (frações 1-3) foram coletadas e analisadas por eletroforese capilar-espectrometria de massa (CE-MS; Tabela 1).
Para CE-MS, um sistema Prince CE (Prince Technologies, Holanda) foi acoplado a um espectrômetro de massa 4000 QTRAP (Applied Biosystems/MDS Sciex, Canadá). Uma solução de capeamento (isopropanol-metanol, 2:1) foi aplicada a uma vazão de 1,0 uL/min. As separações foram obtidas em capilar de sílica fundida vazio de comprimento de cerca de 90 cm usando acetato de amônio 15 mM em água deionizada, pH 9,0. A voltagem de ionização de eletrospray de 5 kV foi utilizada para o modo de detecção íon positivo. Espectros de masa em sequência foram obtidos usando o modo aprimorado de produção por varredura de íons (EPI) com uma taxa de varredura de 4000 Da/s. Nitrogênio foi usado como cortina (no valor de 12) e gás de colisão (ajustado em escala “alta”).
A análise CE-Ms da fração principal 1 no modo íon positivo confirmou a presentça de uma serie de íons triplamente carregados a m/z 1212,3, m/z 1266,3 e m/z 1320,4 * consistente com adições consecutivas de resíduos Hex, a maior cadeia glucano correspondendo a aproximadamente onze resíduos a1,6-ligados. Com base na intensidade ' do sinal dos íons, a glicoforma mais abundante em m/z 1266,3 continha dez Hex a-1,6- ligado (Fig. 1). O espectro iônico produzido de íons a m/z 1266,3 no modo de detecção ion positivo confirmou a presença de íons de diagnóstico a m/z 1244,5 e m/z 1447,6 consistentes com os anteriormente observados fragmentos da cadeia principal do núcleo Hex, Heps (PEtn)Kdo e HexNAcHex,Hep;3 (PEtn)Kdo, respectivamente (Fig. 1). Frações 1 e 2, que levam a1,6-glucano no núcleo LPS, foram combinados e usados em conjugação.
Tabela 1. Dados CE-MS (íon positivo e composição proposta de glicoformas de LPS em LPs deslipidado de linhagem H. pylori 26695 HP0826::Kan Latas fia ms ORI
FR RARA ES
1.212,3 3.599,9 3.599,1 Hex, Heps PEtn, HexNAc1 Fuc, anidroKdo,
1.218,1 3.617,3 3.617,1 Hex Hep s; PEtm,
AA AA
1.266,3 3.761,9 3.761,2 Hex13 Heps PEtn, HexNAc; Fuc, anidroKdo,
E" 16/43
1.272,0 3.779,0 3.779,2 Hex; “Heps PEtm, uv orar |
1.320,4 3.924,2 3.923,4 Hex Heps PEtn; . HexNAc; Fuc; ; anidroKdo;
1.326,4 3.942,2 3.941,4 Hex Heps PETN,
AAA [Fa RR OS] 902,4 1.785,8 1.785,5 Hex, Hep, PEtn, HexNAc;, Fuc; anidroKdo, | 911,4 1.803,8 1.803,5 Hex > Hep . PEtn, us in 983,5 1.948,0 1.947,7 Hex; Hep, PEtn, HexNAc;, Fuc, anidroKdo, " 992,5 1.966,0 1.965,7 Hex; Hep. PEtn, us amena | ' 1.064,6 2.110,2 2.109,8 Heu —Heps PE, HexNAc; Fuc, anidroKdo,
1.073,6 2.128,2 2.127,8 Hex, Hep. PEtn,
RNA
1.145,5 2.272,0 2.271,9 Hexs Hep,. PEtn, HexNAc; Fuc, anidroKdo;,
1.154,5 2.290,0 2.290,0 Hex ; Hep , PEtn1 o Ea [FR [RR OS
1.244,2 1.244,0 Hex >; Hep ; PEtn, un atas | 640,6 1.262,2 1.262,0 Hex ;, Hep ; PEtn, us nas | 733,2 1.447,4 1.447,2 Hex ; Hep ; PEtn,
NA AA 742,1 1.465,2 1.465,2 Hex >; Hep ; PEtm, em E ee
ºcom base nas massas atômicas médias ' "Hex, HexNAc, Hep, Kdo, PEtn e Fuc designam hexose, hexosamina, heptose, ' ácido 3-ceto-desóxi-D-mano-2-octulosônico, fosfoetanolamina e fucose, respectivamente. . Exemplo 3: Caracterização de LPS O-deacilado 26695 HP0826::Kan por CE-MS.
A O-deacilação de LPS 26.695 HP0826::Kan (do Exemplo 1) foi realizada de acordo com Hoist et al. (1991) com algumas modificações. Resumidamente, LPS (4 mg) foi agitado em hidrazina anidra (0,2 m!), a 37 *C durante 4 h. A mistura foi resfriada, e acetona fria (2 mL) foi adicionada lentamente para destruir o excesso de hidrazina. Após 30 min, o ( LPS O-deacilado precipitado (LPS-OH) foi coletado por centrifugação (4 ºC, 9300 xg, 10 min), O pelet foi lavado duas vezes com acetona fria, dissolvido em água e liofilizado para dar LPS-OH (3,5 mg).
A análise CE-MS do LPS O-deacilado 26695 HP0826::Kan (LPS-OH) no modo íon positivo foi realizada conforme descrito no Exemplo 2. Resultados de CE-MS foram consistentes com os dados obtidos por MS para LPS deslipidado e proporcionou três principais íons duplamente carregados a m/z 1137,2, m/z 1239,2 e m/z 1408,0 consistente com a presença da cadeia estrutural do oligossacarideo tamponado com HexNAc e [HexAc, 7 Fuc, Hep], respectivamente (Tabela 2), enquanto que íons triplamente carregados a m/z 1597,7, m/z 1651,4 e m/z 1705,5 foram consistentes com a presença de glucano, a mais : longa cadeia glucano correspondendo a aproximadamente doze resíduos a1,6-ligados (Tabela 2, fig. 2) O espectro MS/MS de m/z 1597,7 mostrou a presença de íons diagnósticos em m/z 1447,6 e m/z 1244,5 consistente com a perda sequencial de [Fuc, Hep] e [Fuc, Hep, HexNAc], respectivamente (Fig. 2) e, adicionalmente, deu origem a um ion individualmente carregado a 1786,8 m/z consistente com o fragmento de núcleo FucHex, HexNAcHep, (PEtn)Kdo ligado via um resíduo Kdo ao lipídeo A O-deacilado (A- OH), enquanto os íons aml/z444,4e ml/z 887,8 corresponderam à fração lipídeo A-OH molécula consistindo de uma cadeia estrutural principal diglucosamina substituída com duas cadeias de ácidos graxos 3-hidroxioctadecanóico amida-ligados [C18:0(3-OH)] (Fig. 2).
Tabela 2. Dados CE-MS íon positivo e composição proposta de glicoformas de LPS em LPS O-deacilado de linhagem H. pylori 26695 HP0826::Kan on Massa molecular Composição proposta” observado —Observada Calculada*? IM+2HT
1137.2 2272.4 22721 Hex Hep, PEins HexNs(3-OH C18:0); KDO,
1239.2 2476,6 2475.3 Hex Hop, HexNAc, PEtns HexNa (3-OH C18:0): KDO, 1408 + 28144 2813.5 Fuc,Hex; Hepa HexNAc, PEtn, HexN, (3-0H C18:0): KDO, 16514 4851,2 40951.3 Fuc Hex, Heps HexNÃo, PEtnz HexN, (3-O0H C18:0): KDO, 17055 — 51185 51185 FuciHex, HensHexNAo, PEtno HexNs(3-OH C18:0)KDO,
OSS SS 18/43 *ºcom base nas massas atômicas médias , "Hex, HexNAc, Hep, Kdo, PEtn e Fuc designam hexose, hexosamina, heptose, ácido 3-ceto-desóxi-D-mano-2-octulosônico, fosfoetanolamina e fucose, respectivamente. - Exemplo 4: Análise de RMN de LPS da linhagem H. pylori 26695 HP0826::Kan.
A degradação do LPs da linhagem H. pylori 26695 HP0826::Kan (do Exemplo 1) foi iniciada com deacilação completa com 4 M KOH na presença de NaBH, para a redução imediata de lipídeo A GIcN, uma vez que a hidrólise alcalina do substituinte PEtn deixa ponta redutora GIcN sem glicon (Hoist et al., 1991). A separação dos produtos por cromatografia de gel produziu duas frações, eluídas na região oligossacarídeo do cromatograma. Análise posterior mostrou que essas frações continham compostos similares, aparentemente diferindo pelo comprimento de uma cadeia glucano. A fração de massa molecular inferior continha compostos 1-3, identificados por espectrometria de Massa, e ambas as frações continham o composto 4 com comprimento diferente da porção glucano (Fig. 3).
Os espectros RMN (DQCOSY, TOCSY, NOESY, 'H-*C HSQC e HMBC) foram realizados em um espectrômetro Varian de 500 ou 600 MHz utilizando software padrão ] como descrito anteriormente (Brisson et al.., 2002). Todos os experimentos de RMN foram realizados a 25 ºC utilizando acetona como uma referência interna em 5 2,225 ppm para . espectros 'H e 31,45 ppm para espectros "*C, Os espectros de RMN de ambas as frações corresponderam ao composto 4, embora composto correspondeu a 4, embora espectros não poderia ser completamente interpretada devido à sua complexidade. Os prótons H-1 de resíduos terminais do a-1,6- glucano e DD-heptan não se sobrepõem com o resto do glucan e heptan H-1, permitindo assim a identificação da posição destes homopolíimeros dentro de toda a estrutura, como mostrado na fig. 3, No entanto, a posição de ligação ao resíduo Z do terminal redutor Glc da cadeia a-1,6-glucano não foi determinada. Ela mostrou forte correlação NOE com um próton não identificado (mais tarde atribuído a H-6 de Hep N). Dados de RMN do composto 4 mostraramu claramente que a-1,6-glucano estava posicionada entre DD-heptan e núcleo interno, uma vez que o primeiro resíduo Hep da fração heptan (X) estava ligado a 0-3 de um resíduo V do terminal não redutor Glc pertencente a a-1,6-glucano. A terminação não redutora do DD-heptan foi substituída em O-3 com B-GIcnN W. Compostos idênticos ao menor dos oligossacarídeos 1-3 foram previamente descobertos como os principais componentes do LPS do H. pylori do mutante a menos de a1,6-glucano HP0159 mutante::Kan e RMN de dados de RMN para eles foram publicados (Altman et al, 2008).
—Dadosde RMN selecionados para o composto 4 estão apresentados na Tabela 3. Pode ser visto claramente que a sequência proposta anteriormente de quatro resíduos heptose contíguos ligados a Kdo não estavam presentes em quaisquer dos compostos examinados
(Fig. 3). O resíduo L de B-GIcN estava ligado diretamente a O-2 de Hep G, e não havia GIcN : conectado a O-7 de Hep em qualquer parte da estrutura do LPS. Ú Tabela 3. Atribuições RMN 'H e *C para o composto 4. : pe 5 as 55 5 ss o area | Pe Rs fa 7 7 o er ss 7 se ss as o Pe e fes Tr Ts [Rem sos Tas a Tam Tas mao E Tas Tn Ts Tas e LE ee 7 7 es [ez 55 mm se am es [5 Tas Tas Tr re fa psp sa a 5 sm ls as avasat | ae Rm e Rs 7 as pra ra e Tem — Co e Ee Ee Tm as 1 Para análise adicional da estrutura do LPS, os compostos 1-4 foram desaminados. | Em resumo, as amostras foram dissolvidas em ACOH 10% e um excesso de NaNO, foi adicionado; após 3h, o produto foi isolado por cromatografia de gel em coluna Sephadex G-
15. Alguns compostos foram então reduzidos com NaBD, e dessalinizados. Os produtos resultantes foram os compostos 5 e 6. Os espectros RMN do composto 5 (realizado como descrito acima) apresentaram dois isômeros com fosfato na posição 6 ou 7 de Hep E (devidoà migração de fosfato em meio alcalino). Mais uma vez, três resíduos contíguos Hep estavam presentes, e não quatro como seria de esperar se a estrutura anteriormente proposta estivessem corretas. A remoção da cadeia lateral completa pelo procedimento de desaminação (descrito acima) confirmou que o GIcN L formou a conexão entre os açúcares de OS 5 e o restante da molécula. O composto 6 continha DD-heptan, a-1,6-glucano e trissacarídeo DDHep-Fuc-anh- Man-ol (NML, anh-Man L decorrentes GIcN L) na ponta redutora. Os espectros desse produto foram menos agrupados e isso tornou possível identificar o ponto de anexação do a- 1,6-glucano a O-6 do DDHep N (de TOCSY entre H-1 e H-6 de DDHep N). A estrutura foi linear, como foi confirmado pela análise de metilação, que não mostrou açúcares ramificados; todos os produtos esperados foram identificados de acordo com a estrutura proposta (Tabela 4).
Tabela 4. Atribuições de RMN 'H e "ºC para o composto 6. O peer ss a a Ta Tam Tan | — [POOO e e e ee
EE E EEE o [EE Te TR e es er sm [as [5 [35 1355 105 Tas fe [7 as fes 7 as Je EE e sm 5 [52 Ts amam | LE [as e oa a as faze fam fan faz CC BRs 75 Te 7 7 | ev mm [56 [35 [555 [57 [576 [— | [7 ss 7 ns fãs | o ee e 7 5 75 as Te [per assita Tam Tm [55 [105 [a7anma| . Fo e ss Te [Tr fes 175 ns es pr se [26 Tas Taz Tss [106 — Ta7a5) Mais confirmação da estrutura da região do DD-heptan-a-1,6-glucano foi obtida a partir dos resultados da oxidação periodato do composto 6. Oxidação periodato foi realizada com um excesso de 0,1 M NalO, por 24 h; etilenoglicol foi adicionado e o produto isolado porcromatografia gel em coluna Sephadex G-15. Ele foi reduzido com NaBD;,, dessalgado e hidrolisado com ACOH 2% por 3 horas a 100 ºC. Dois produtos principais, 7 e 8, foram obtidos e isolados por cromatografia de gel em as e isoladas por ge! cromatografia em coluna Sephadex G-15. A redução do oligossacarídeo oxidado com NaBD, permitiu a identificação dos carbonos oxidados nos espectros de RMN (fase invertida de sinais CHDOH em comparação com sinais de CH;OH em APT-HSQC). A estrutura dos compostos 7 e 8 foi determinada por espectroscopia de RMN e análise de metilação. A formação do composto 7 mostrou que DDHep N não foi substituído na posição 3. Uma vez que a metilação do composto 6 se mostrou apenas DD-Hep 3- e 6- substituído terminal, DD-Hep N foi substituída na posição 6, como foi proposto pelos dados de RMN do composto 6. A formação do composto 8 com glicerol (Gro) na ponta redutora confirmou que Glc V no OS 6 glicosilado próximo do resíduo ' Glc na posição 6, uma vez que não javiam outros componentes do oligossacarídeo 6 que ' pudessem produzir glicerol quando em oxidação-redução. Foi também claramente provada . a anexação da fração DD-heptan à ponta não redutora de a1,6-glucano na posição 3 do terminal glicose.
O tamanho do domínio DD-heptan pode ser estimado: o composto 8 continha quatro resíduos de manose, derivados do DD-heptose. Espectros do composto 8 foram bem resolvidos e a integração dos sinais H-1 produziram relação quase geuimolar e apresentou a presença de quatro rds manosa. Assim, o domínio DD-heptan intacto no composto 6 consistiu principalmente de 5 unidades DD-heptose, uma das quais (terminal) foi removida por oxidação periodato. Essa conclusão foi confirmada por espectrometria de massa. À estrutura da principal glicoforma LPS produzida pela linhagem H. pylori 26695 HP0826::Kan é ilustrada na Figura 3.
Exemplo 5: Preparação e caracterização de conjugados LPS-OH-TT, dLPS-BSA, dLPS-TT, e dLPS(PJ2)TT.
Conjugados Kdo-ligados de LPS-OH (ver Exemplo 3) e dLPS (ver Exemplo 2) a ] albumina de soro bovino (BSA) e/ou toxóide do tétano (TT) foram preparados.
LPS-OH (4 mg, 0,8 mmol, com base em uma massa molecular média estimada de 7 4.789 Da) ou dLPS (4 mg, 1 mmol, com base em uma massa molecular média estimada de
3.779 Da) foi dissolvido em 0,1 M de ácido 2-(N-morfolino) etanosulfônico (MES; Sigma- Aldrich, St. Louis, Mo), pH 4,8, contendo 0,1 M NaCl (0,4 mL); 1-etil-3-aminopropil dimetil carbodiimida (EDC; 34,38 mg, relação molar 100:1; Sigma-Aldrich) foi adicionado seguido por 1 ,8B-diamino-3 ,6-dioxaoctano (15 mL, 103 umol, Sigma-Aldrich), e a reação foi mantida em pH 4,8 por 4 h a 22 ºC. A solução foi ajustada para pH 7,0 e dialisada contra água destilada ou dessalinizada usando um equipamento centrífuga Microsep, corte a 1.000 Da (Pall Life Sciences, Ann Arbor, MI) e liofilizada.
O procedimento de conjugação foi realizado essencialmente como descrito por oligossacarídeos por Fevrnández-Santana et al. (1998). Resumidamente, o LPS-OH contendo espaçador (2 mg, 0,4 umol) ou dLPS (2 mg, 0,5 umol) foi reagido com éster N- —hidroxisuccinimida de ácido 3-maleimidopropiônico (BMPS, 2 mg, 7,5 umol; Sigma-Aldrich) em DMSO anidro por 24 horas a 22 ºC. A solução foi dializada contra água destilada e liofilizada.
Para a ativação de BSA, di(éster N-hidroxisuccinimida) de ácido 3,3- ditiodipropiônico (DTSP; 0,62 mg, 1,6 umol; Sigma-Aldrich) em DMSO anidro foi adicionado, sob atmosfera N,, a uma solução de albumina de soro bovino (BSA) (massa molecular
66.320 Da) (8 mg, 0,12 umol), previamente dissolvido em tampão 10 mM PBS, pH 8,0, contendo 6 mM EDTA (concentração final 4 mg/mL), e a mistura foi agitada por 2h a 22ºC. ! Isto foi seguido por adição de ditiotreitol (DTT; 7,12 mg, 46 upmol; Sigma-Aldrich), sob 1 atmosfera N,, e a mistura foi agitada por 1 h, a 4 ºC.
A solução resultante foi dializada , contra tampão 10 mM PBS, pH 7,2, contendo 5 MM EDTA em uma célula de ultrafiltração ' agitada (Millipore, Biilerica, MA), utilizando N7 como fonte de pressão, através de uma . membrana de celulose regenerada, corte 30.000 Da (YM30, Millipore) a 4 ºC.
O conteúdo de proteinas e SH foram determinados pelo método do kit de ensaio de proteína por ácido bicinconínico (BCA; Pierce, Rockford, IL) e (1959) e Ellman, respectivamente.
Uma | substituição molar de 20 a 22 grupos SH foi conseguida.
Para a ativação do toxóide do tétano (TT) (massa molecular, 150.000 Da), DTSP (0,316 mg, 0,8 umol) em DMSO anidro (25 uL) foi adicionado, sob atmosfera de N,, a uma solução de TT (4 mg, 0,03 umol) em tampão 10 mM PBS, pH 8,0, contendo 6 mM EDTA (concentração final 4 mg/mL), e a reação foi deixada progredir como descrito para BSA.
Isto foi seguido por adição de ditiotreitol (DTT; 3,56 mg, 23 umol; Sigma-Aidrich), sob atmosfera de N,, e a mistura foi agitada por 1 h, a 4 ºC.
TT ativado foi transferido para uma célula de ultrafiltração agitada (Millipore) e dialisadas contra tampão 10 mM PBS, pH 7,2, contendo EDTA 5mM sobre uma membrana de celulose regenerada, corte 100.000 Da (YM100, Millipore) a 4 ºC. . A uma solução de BSA-SH>7,.22 ou TT-SH;,.2> em tampão 10 mM PBS, pH 7,2, contendo 5 mM EDTA, uma solução de derivado maleimido-funcionalizado de LPS-OH ou r dLPS em tampão 10 mM PBS, pH 7,2, contendo 5 mM EDTA (concentração final de 4 mgimL)(3:1 molar) foi adicionado sob atmosfera de N,. A reação foi agitada por 24 horas a 4 ºC.
Isto foi seguido por adição de N-etilmaleimida (1 mg, Sigma Aldrich). A reação foi deixada prosseguir por 30 min a 22 ºC, e o conjugado resultante foi dialisado contra tampão 10 mM PBS, pH 7,2, por 4d a 4 ºC e esterilizado por filtração usando membrana de fluoreto de polivinilideno a 0,22 um (PVDF) (Millex -GV, Miilipore de Cork, Irlanda). Os conjugados foram analisados quanto ao seu conteúdo de carboidratos e proteínas usando método fenol ácido sulfúrico para açúcares neutros (Dubois et al., 1956) e kit de ensaio de proteína BCA (Pierce), respectivamente, com LPS-OH ou dLPS e BSA como padrões.
A eficiência da Conjugação foi confirmada por cromatografia líquida de alta performance (HPLC, Agilent série 1200, Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha), utilizando 12 colunas Superose 10/300 GL (Amersham Biosciences, Uppsala, Swedenborg) equilibrada com tampão PBS 10 mM a pH 7,2. A cromatografia foi realizada à temperatura ambiente e com um caudal 0,5 mL/min.
A eluição foi monitorada a 210 nm e 280 nm com detector por arranjo de díodos (Agilent Technologies). A presença de um espaçador foi confirmada por espectroscopia "'H-RMN pelo aparecimento de uma nova ressonância protônica a 3,22 ppm, correspondente ao grupo CH;NH>. O grupo amina da molécula do espaçador foi ainda derivado por reação com éster N-hidroxisuccinimida do ácido 3-maleimidopropiônico para produzir LPS-OH ou dLPS pp) 23/43 maleimido-funcionalizados, como confirmado pela presença de ressonâncias de prótons em ' 2,55 ppm e 6,9 ppm, correspondente aos grupos CH;a e grupos CH=CH de a- ] maleimidopropionato, respectivamente (Figura 4). A derivação da fosfoetanolamina do - núcleo interno de LD-HEP foi mantida a um mínimo mediante uso de quantidades estequiométricas do reagente.
O glicoconjugado foi obtido através da tiolação de uma proteína portadora e adição da proteína tiolada ao LPS-OH ou dLPS maleimido- funcionalizados (Figura 4). A eficiência de conjugação foi monitorada por HPLC.
O conjugado resultante foi analisado quanto ao seu teor de carboidrato e proteína.
A relação molar de LPS-OH para TT nos três conjugados variou de 10:1 a 20:1,e0 rendimento variou de 13% a 22%, com base no conteúdo de carboidratos (Tabela 5). À conjugação de dLPS a BSA ou TT produziu conjugados dLPS-BSA-2, dLPS-TT ou dLPS (PJ2)-TT com teor de carboidratos significativamente maior (Tabela 5) Ambos os conjugados LPS-OH-TT e dLPS-BSA ou dLPS-TT reagiram igualmente bem com mAbs a1,6-glucan-específicos por ELISA, sugerindo que a conformação do epítopo glucano ficou inalterada.
Tabela 5. Composição e produção dos conjugados utilizados neste estudo. . Conjugado Relação molar de CHO* | Rendimento (%) A E ER eai — pp Ts Ti ma [FERIR TT TR TR [Forma Ja o TR [aee fm o e lg Fr a TR quantidade de carboidrato (CHO) foi determinada de acordo com Dubois et al. (1956); LPS-OH ou dLPS foi usado como um padrão. ?quantidade de proteína foi determinada pelo teste BCA; BSA foi utilizado como um padrão. *relação molar de CHO relativamente à proteina foi determinada utilizando valores médios de massa molecular com base no comprimento médio de cadeia de glucano: 4789 Da para LPS-OH e 3779 Da para dLPS (n = 10). Para dLPS(PJ2) o valor da massa molecular média foi de 3261 Da com base no composição médio da cadeia glucano (n = 8) (Altmanetal. 2003). Exemplo 6: Immunogenicidade de conjugados LPS-OH-TT, dL.PS-BSA, dLPS-TT e dLPS (PJ2)-TT em ratinhos e coelhos.
A imunogenicidade de conjugados (LPS-OH-TT, dLPS-BSA, dLPS-TT, e dLPS ' (PJ2)-TT) do Exemplo 5 foi testada em ratinhos e coelhos. ' Ratinhos BALB/c fêmeas de 6 a 8 semanas foram imunizados de modo . intraperitoneal com conjugados apropriados. Cada ratinho recebeu 2 ug ou 10 ug de carboidrato em 0,2 mL de adjuvante Ribi por injeção. Os ratinhos foram estimulados no dia 21 e 42 e soros recuperados após punção cardíaca terminal no dia 51.
Três coelhos brancos Nova Zelândia foram imunizados por via subcutânea com conjugados apropriados. Cada coelho recebeu 10 ug ou 50 ug de carboidrato em 0,5 mL de adjuvante incompleto de Freund. Os coelhos foram estimulados no dia 28 e 56 e os soros recuperados após sangria no dia 65.
Os níveis séricos do anticorpo anti-LPS foram medidos por ELISA em que LPS purificado foi usaodo como um antígeno de revestimento (1ug/poço). Após a lavagem com PBS, as placas foram bloqueadas com 1% (p/v) de albumina de soro bovino (BSA) em PBS ou diluente leite/solução de bloqueio (MDB) (KPL, Gaithersburg, MD) por 1 hora a 37 ºC.
Soros diluídos de ratinho ou de coelho pré- ou pós-imune foram adicionados, e as placas foram incubadas por 2 h a 37 ºC. Para inibição por ELISA, diluições seriais de inibição de . LPS 26695 HPO479:Kan ou LPS 26695::HP0826::Kan foram misturadas com as previamente determinadas diluições de soro de coelho que produziu ODa50=0,6-0,8. Essa ' mistura foi incubada por 15 min a 22 ºC e, em seguida, transferida para a placa de microtitulação original bloqueada com o antígeno LPS adsorvido, onde foi incubado por mais 2h a37"C Após esta etapa, o procedimento de ELISA indireto foi seguido. Resumidamente, as placas foram lavadas com PBS e o segundo anticorpo, um conjugado “goat anti-mouse IgG+IlgM horseradish peroxidase” (Caltag, So. San Francisco, CA) foi adicionado por 1 h em temperatura ambiente. Depois de uma etapa de lavagem final, o substrato 3,3,3',3-tetrametilbenzideno (TMB) (KPL, Gaithersburg, MD) foi adicionado e a reação foi interrompida com ácido fosfórico 1M. A absorbância foi determinada a 450 nm usando um leitor de placa de microtitulação (Dynatech, Chantilly, VA).
A porcentagem de inibição foi calculada usando a seguinte fórmula: % inibição = 100x[(OD com inibidor-OD sem inibidor/OD sem inibidor] As cuvras de inibição versus log da concentração foram plotadas para cada inibidor, e as concentrações exigidas para a metade da concentração máxima inibitória (ICs5) foram determinadas a partir das curvas de extrapolação.
Todos os conjugados induziram uma resposta IgG contra LPS a partir do homólogo (26695 HPO0826::Kan) e correspondentes linhagens tipo selvagem (26695) em ambos os coelhos e ratinhos depois de três injeções (Tabelas 6 a 9), embora a resposta fosse geralmente geralmente mais fraca em ratinhos e coelhos imunizados com LPS-OH-TT do que em animais imunizados com dLPS-BSA, dLPS-TT ou cILPS (PJ2)-TT. Coelhos controle
VNN——————.—.—º.—————————€«—<—«epee—p—sss.s—s—————p———o—p—p—p—————————==————... — 25/43 imunizados com uma mistura de ambos os LPS-OH, dLPS ou dLPS (PJ2) e um portador da ' proteina (com um adjuvante) não mostraram resposta específica ou mostraram resposta ] específica baixa a LPs a partir da linhagem de homólogo (26695 HP0826::Kan mutante) ou . correspondente à linhagem tipo selvagem 26695 do H.pylori após três imunizações. Tabela 6. Respostas de anticorpos murinos e de coelho para LPS de H. pylori 26695 HPO0826::Kan e LPS 26.695 suscitado por conjugados LPS-OH-TT.
Imunogênio Soro imune NAN ca [FERIR rr ELLE ES —— Loo EE ELE e ELO E E —— FIOOOsIsIiAsliI LEE E
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RR E Lo E aa O as o e ag [Pontal o E Cada ratinho recebeu 10 ug de carboidratos por injeção ” Cada coelho recebeu 50 ug de carboidratos por injeção. * Cada coelho recebeu 10 ug de carboidratos por injeção.
Tabela 7. Respostas de anticorpos murinos e de coelho para LPS H. pylori 26695 HPO0826::Kan e LPS 26.695 suscitado por conjugados dLPS-BSA.
TOU Cr teenFfnvcdENNDDD A A AAAAAAAtAAAAKAhASAtAAAAAKsAsslisssAjAbASSssSsSsSsSsiiSSASSSsScSsiDssimnettuaasstSmqq»qOqCSOO<xZo7LLLÊLRRROS tt etnia 26/43 | | EEPSBSA TE Retinhos Balla : o are o rea A RA oa BR BB ras po a feras asa
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CE DE Cada ratinho recebeu 10 ug de carboidratos por injeção ? Cada coelho recebeu 2 ug de carboidratos por injeção. * Cada coelho recebeu 10 ug de carboidratos por injeção. * Adjuvante (IFA) apenas. Tabela 8. Respostas de anticorpos murinos e coelho para LPS H. pylori 26695 HPO0826::Kan e LPS 26,695 suscitado por conjugado dLPS-TT. AN a o gg IRA FR o ir) LL a LL e LE E ee Ls Es es
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E e e e atra : Cada ratinho recebeu 2 ug de carboidratos por injeção ? Cada coelho recebeu 10 ug de carboidratos por injeção. º* Adjuvante (IFA) apenas. Tabela 9. Respostas de anticorpos murinos e coelho para LPS de H. pylori 26695 HPO826:KaneLPS 26.695 suscitado por conjugado dLPS(PJ2)-TT.
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[ESP RA a . aj Lo i en LE | Cada ratinho recebeu 2 ug de carboidratos por injeção ” Cada coelho recebeu 10 ug de carboidratos por injeção. * Adjuvante (IFA) apenas.
Estudos de reatividade foram realizados com o soro pós-imunes de coelhos imunizados com um ou outro de LPS-OH-TT-2, LPS-OH-TT-3, LPS-OH-TT-4, dLPS-BSA-2, dLPS-TT, ou dLPS (PJ2) contra LPS de linhagens H. pylori representativas de diversos glicotipos LPS (Monteiro, 2001) e selecionadas linhagens mutantes.
Resultados são mostrados nas Tabelas 10, 11 e 12. Tabela 10. Respostas de anticorpos de coelho a LPS de H. pylori purificado provocada por LPS-OH-TT e conjugados dLPS-BSA *, ' 26695 1.72 (1,430) [1,521 [(1,523) [1,469 /(0,529) | 1,553 | (1,140) E a A o:3 1,569 |(1,386) | 1,541 (1,689) | 1,473 |(0,492) | 1,568 (1,158) paia 1 1 SAS US VS CSS SS SsSs1 0,713 |(0,121) [0,695 (0,177) [0,442 |(0,032) | 1,259 |(0,539) epogagãç [SA 1 TS UT SS 1 * Título do soro pós-imune 1:100 ” Título do soro pós-imune 1:1000 º* ODaso + 10% Tabela 11. Respostas de anticorpos de coelhoº a LPS de H.pylori purificado induzidas pelo conjugado dLPS-TT ”, o ET ez Teses 5 o a
TOOCOU0OOCDOCONANSONANOO VN MA MA AA A A AA MA MR MA A MA MA Ro rr aaMn————— 29/43 [ERRAR TER 5 8 : :
EE E E o Ti ELOI ie —— FE a º? Título do soro pós-imune 1:1000 * ODaso É 10% Tabela 12. Respostas de anticorpos de coelhoº a LPS de H.pylori purificado induzidas pelo conjugado dLPS-TTº. o SI OO JA er PE rNO B g—— "— pp Tr Ti : [EE REI REI [ssTAPORZTAR Tor ogas Togs ? Título do soro pós-imune 1:1000 ? ODaso & 10% A reatividade dos soros pós-imune obtidos de coelhos que foram imunizados com LPS-OH-TT-2, LPS-OH-TT-3, ou LPS-OH-TT-A foi indicativo do requisito quanto à presença de a1,6-glucano uma vez qu apenas fraca reatividade cruzada foi obtida com LPS SS1 e SS2 de HPO826::Kan, estas sendo representativas de linhagens de H.Pylori incapazes de acrescentar a1,6-glucano (Logan et al., 2005.) (Tabela 10). De modo surpreendente, os soros obtidos de coelhos que foram imunizados com dLPS-TT também reconheceram epítopos de LPS de núcleo que não continham qualquer o1,6-glucano, ou seja, LPS provenientes de linhagens SS1, SS1 HPO0826::Kan, M6 e J99 (Tabela 11), mostrando um reconhecimento de núcleo mais amplo e inferindo que oconjugado dLPS-TT foi mais imunogênico, possivelmente devido à presença de proteína portadora TT (Tabela 11). Alternativamente, como os conjugados foram preparados a partir de uma mistura de 3 glicoformas, a resposta imune pode ter sido gerada para outros componentes LPS menores; ' isso poderia explicar as observadas reações cruzadas. ' Para investigar a especificidade de ligação de soros de coelho provocada por . conjugado dLPS-TT, a inibição ELISA foi realizada com LPS 26.695 HP0479::Kan purificada consistindo de duas glicoformas (aprox. relação de 1:1), uma estrutura oligossacarídeo linear e uma estrutura oligossacarídeo linear tamponado com [GICNAc, Fuc] (Hiratsuka et al., 2005), e LPS 26.695 HPO0826::Kan. A ligação do soro de coelho ao LPS glucano- negativo proveniente das linhagens SS1, SS1 HPO0826:Kan, HPO0159:Kan e SS1 HPO479::Kan (Fig. 6) foi significativamente inibida quando LPS 26.695 HPO0479::Kan foi usado como um inibidor, enquanto que LPS 26695 HPO0826::Kan foi o inibidor mais eficaz quando LPS 26,695 foi usado como um antígeno de revestimento (Fig. 6).
A capacidade de soros pós-imune de coelho para reconhecer linhagens heterólogas tipáveis e não tipáveis também foi validado no ELISA indireto da célula integral (WCE) contra selecionados isolados clínicos de H. pylori representantivos de ambas as linhagens tipáveis e não-tipáveis de H. pylori. O ELISA indireto de célula integral (WCE) foi realizada conforme descrito anteriormente (Altman et al., 2008). Resumidamente, os poços de uma . placa de microlitro foram revestidos com 100 ul de uma suspensão bacteriana, 10º células/mL, durante a noite, a 4 ºC. Os poços foram fixados com metanol e bloqueados com " 200 uL de Diluente Leite/solução de bloqueio (MDB) (KPL, Gaithersburg, MD) por 2 horas a 37ºC. Posteriormente, os poços foram incubados por 2 horas a 37 ºC, com 100 yL de ascites 1C4F9 diluídos a 1:500 em MDB, seguido por “anti-mouse IGG+IgM horseradish peroxidase “ (Caltag) diluído a 1:1.000 em MDB por 1h na temperatura ambiente. O substrato TMB foi adicionado, como descrito por ELISA indireto. Os valores não-específicos de base foram determinados como ODa5s5 dos poços de controle negativo contendo células bacterianas, conjugado anticorpo secundário e substrato. Estes valores de ODa5s5 foram < 0,2. Os valores da densidade óptica do ODa55 <0,2 foram classificados como negativos e valores ODs55 > 0,2 foram classificados como reações positivas. Para assegurar a consistência de placa para placa da linhagem pylori H. 26.695, as células foram utilizadas como controle positivo. Ensaios não variaram mais de 10%.
Soros derivados de coelhos que foram imunizados com conjugados dLPS-TT mostraram a mais fore reatividade cruzada a todas as linhagens testadas (Tabela 13) usando ELISA indireto de célula integral.
Tabela 13. Reatividade cruzada de soros pós-imune* de coelho no ELISA indireto” em célula integral contra isolados clínicos de H. pylori. nio os 002C | 026C | 027C | 048C | 058C | 101C | 113C | 153C | 217C | 240C
31/43 | LPS-OH- E a aa ' 1 0,21 | 0,29 [0,63 [0,14 [0,56 | 0,38 | 0,62 0,31 [0,77 E se SS NS CS SO 2 0,13 048 10,07 [049 [0,24 [048 [047 [0,24 |063 el Sr LPS-OH- Bs A sa a aaa 1 0,31 | 0,33 | 0,64 [012 [060 [048 [067 [058 [034 |080 ppt 2 0,24 | 0,22 [0,57 011 [0,30 [0,24 [025 [021 [017 [0,36 eae e ee e e LPS-OH- o a rara a aa 7 1 0,21 | 0,35 | 0,49 0,39 | 043 [067 [063 |0,24 [0,71 dd e a e O ' 0,12 | 0,23 | 0,50 [0,10 [0,25 | 0,29 0,24 [0,16 | 0,26 e e e SSI 3 013 | 027 |0,38 | 0,07 [028 [0,355 [037 [034 [015 | 0,38 e re e de e e e dLPS- se a 0,99 | 069 0,28 [0,73 | 1,12 1,14 [044 | 1,02 Sr 0,71 [054 |0,33 0,37 | 0,82 | 0,52 0,27 | 0,69 dd 3 0.77 [0668 [035 0.47 [088 [0.78 [094 [044 |0.79 ed
RP 1 0,83 |1,16 | 0,62 0,87 | 147 [1,80 [1,27 [1,14 [1,24 eee SS SO 2 0,73 [0,42 0,14 [052 [1,22 | 1,413 [063 [051 1,02 Cs EA 3 0,83 [1,16 [065 [0,99 [0,82 | 1,50 | 1,36 |1,25 [1,11 | 1,45 O ss SS SS E
ECN A RREO E ARARAS RAS RR AAA A A A ALII PPS, er EN TT Tien o ASSES a AO 32/43 º Título do soro pós-imune 1:1000 ' ? OD450 > 0,2 + 10%. ' Exemplo 7: Atividade bactericida de anti-soro de coelho. - Um ensaio bactericida usando soros de coelhos pré-ou pós-vacinados (Exemplo 6) foirealizado. Células de H.pylori cultivadas em placas foram colhidas e lavadas com 5 mL de PBS por placa. Em seguida da centrifugação, os “pellets' foram suspensos em 25 mL de PBS. A suspensão final bacteriana foi diluída em salino tamponado em fosfato Dulbeco (DPBS) (Invitrogen, Grand Island, NY) em 4x10º CFU/mL O ensaio bactericida foi realizado emaem uma microplaca de fundo chato (ICN). A diluição serial de dez vezes dos soros pré- ou pós-imune descomplementado (50 uL) foi adicionado a cada poço. A suspensão bacteriana (25 mL) foi então adicionada e pré-incubadas por 15 min a 37 “C, O complemento de coelhos pequenos (Cedarlane Laboratórios, Hornby, ON) foi diluído 1:50 e 25 mL foi adicionado aos poços apropriados. A placa foi incubada por 45 min a 37 ºC e, em seguida, colocada em gelo. Uma alíquota de 10 mL foi plaqueada em triplicata em agar sangue Columbia, cultivadas por 4 dias, e, em seguida, as placas foram contadas para . medir o número de unidades formadoras de colônia (CFU). A placa de controle com bactérias e complemento, mas sem soro foi usada para calcular a porcentagem de 7 aniquilação. A atividade bactericida foi determinada como a maior diluição de soro que —causoumorte de 50%. Os soros da pré-vacinação ou soros obtidos de coelhos imunizados com uma mistura de um portador da proteína e um ou outro de LPS-OH, dLPS, ou dLPS (PJ2) (com um adjuvante) apresentaram níveis nulos ou baixos de atividade bactericida contra o homólogo H. pylori 26695 HP0826::Kan ou linhagens tipo selvagem de 26.695. Os soros —pós-imunes obtidos de coelhos imunizados com LPS-OH-TT-4, dLPS-BSA-2, dLPS-TT e dLPS (PJ2)-TT mostrou atividade funcional significativa contra ambos o mutante 26.695 HPO0826::Kan as correspondentes linhs do tipo selvagem (Tabela 14), com soros de pós- vacinação provenientes de coelhos imunizados com o conjugado dLPS-TT exibindo a maior atividade funcional contra a linhagem estirpe 26.695 do tipo selvagem (Tabela 14). Tabela 14. Atividade bactericida contra as linhagens H. pylori 26695 HP0826::Kan e
26.695 com anti-soros de coelho provocada por conjugados. Imunogênio Soro imune Título do soro bactericida (50% de o PP A o
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EN A O o E a o a e se Pa Lo , º* Cada coelho recebeu 10 ug de CGI por injeção ? Correspondendo a soro pré-imune de coelho Além disso, a atividade bactericida do soro de coelho também foi testada contra selecionados isolados clínicos de H. pylori, ou seja as linhagens 002CL, 0153CL e 058CL (Altman et al., 2008). Esses isolados foram selecionados como representativos de altos, médios e baixos ligantes com base em seus valores de OD.55 em ensaios WCE com anti- a1,6-glucan mAbs: linhagem 002CL-ODa55 1,361, alto ligante; linhagem 153CL-ODaso 0,29, médio ligante; e linhagem O58CL-ODa55 0,162, baixo ligante. É importante enfatizar que somente os soros pós-imune provenientes de coelhos imunizados com dLPS-TT ou conjugado dLPS(PJ2)-TT apresentaram atividade funcional com todos os três isolados clínicos testados (Tabela 15). Tabela 15. Atividade bactericida contra isolados clínicos de H. pylori com anti-soros de coelho provocadas por conjugados. LPS-OH-TT-4 1.131 407
EC CP LPS-BSA-2 864 1.259 66 Br A E A
' dLPS(PJ2) 374 1.738 215 . ? Correspondendo a soro pré-imune de coelho Exemplo 8: Estudos de Proteção pelo conjugado dLPS-TT em ratinhos. O potencial de conjugado dLPS-TT como uma vacina candidata foi avaliada em ratinhos CD-1.
Grupos de 5 ratinhos CD-1 foram vacinados quatro vezes em intervalos semanais, via intranasal com 25 upg/ratinho de conjugado dLPS-TT, complementado com 1 ugiratinho de toxina do cólera (CT; Sigma), 31,5 ugiratinho de sonicado PJ2 livre de células com adjuvante 1 mg/ratinho toxina do cólera (controle), ou salino (controle). Uma semana após a última imunização, amostras da lavagem de soro, fecal e vaginal foram coletadas e analisadas para IgG e IgA H.pylori-específicos. Os níveis séricos de IgG e níveis de anticorpos IgA sérico, fecal e vaginal foram determinados por ELISA padrão. As placas foram revestidas com 1 ug/poço com linhagem H.pylori 26695 HP0826::Kan LPS como aqui descritos. Amostras de soro foram diluídas 1:100 para ensaio de IgG e 1:50 para o ensaio . de IgA. Amostras fecais foram diluídas 1:2 e as amostras vaginais foram diluídas 1:20. Os níveis de anticorpos H.pylori-específicos foram determinados e os dados foram analisados 7 através de análise Mann-Whitney, utilizando o software GraphPad versão 5.0.
Cinco semanas após a primeira imunização, os ratinhos sofreram alimentação forçada oral dia sim, dia não com — 10º cfu linhagem H. pylori PJ2 (Altman et al., 2003). Quatro semanas mais tarde, os ratinhos foram sacrificados e as bactérias viáveis de seus estômagos foram contadas e os dados foram analisados pelo teste de Mann Whitney, utilizando o software GraphPad versão 5.0.
A imunização intranasal com conjugado dLPS-TT mais CT provocou uma muito forte resposta IgG de H. pylori 26695 HP0826::Kan LPS-específica como medida por ELISA e moderado IgA sérico de H. pylori 26695 HP0826::Kan LPS-específico foi também detectado (Tabelas 16 e 17, fig. 7). Além disso, as respostas IgA de H. pylori 26695 HPO0826::Kan LPS-específica nas amiostras vaginal ou fecal foram também detectadas (p <0,01) (Tabela 17, Figura 7.).
Tabela 16. Níveis séricos de IgG de H.pylori LPS-específicos medidos por ELISA contra LPS de 26.695 HP0826::Kan. Soros foram coletados em uma semana após a última imunização e antes da provocação bacteriana com linhagem H. pylori PJ2.
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Tabela 17. Níveis séricos IgA, fecal e vaginal de H. pylori LPS-específicos medidos ' por ELISA contra LPS de 26.695 HP0826::Kan.
As amostras foram coletadas em uma ' semana após a última imunização e antes da provocação bacteriana om linhagem H. pylori : PJ2. O esmo ssa js — E AAA a nm Todos os grupos de ratinhos foram sequencialmente inoculados por via orogástrica com linhagem ratinho-colonizadora H.pylori não tipável PJ2 previamente mostrada conter um a1,6-glucano longo (Altman et al., 2003). A proteção é definida como uma redução estatisticamente significativa da carga bacteriana nos grupos vacinados em comparação com grupos de controle.
Os dados de colonização para grupos de ratinhos imunizados por via intranasal com conjugado dLPS-TT mais CT foi estatisticamente significativa (p <0,05) ' (Fig. 8). Além disso, estes dados sugerem que as respostas séricas de IgA específicas de LPS de H. pylori 26,695 HP0826::Kan sozinhas podem não ser suficientes para a proteção " contra a provocação bacteriana e que as respostas séricas de IgG específicas de LPS podem também contribuir para uma aumentada proteção.
Exemplo 9: Preparação e caracterização de conjugado Dextran-BSA e estudos da atividade de imunogenicidade e funcional O. conjugado Dextran-BSA foi preparada dissolvendo 10 mg Dextran T5 (5 MW KDa, Pharmacosmos A/S, Holbaek, Dinamarca) em 250 ul de tampão borato 0,2 M, pH 9,0; isto foi adicionado a uma solução (250 uL) contendo 1,8-diamino-3,6-dioxaoctano (25 uL) e cianoboroidreto de sódio (10 mg) em tampão borato 0,2M, pH 9,0 (como descrito por Roy et al., 1984). A reação foi realizada durante 5 dias a 55 ºC.
O produto da reação foi purificado como descrito acima para a preparação de conjugados de base LPS.
Esta reação resulta na introdução de um espaçador.
O grupo amina da molécula espaçadora foi ainda derivado por reação com éster N-hidroxisuccinimida de ácido 3- —maleimidopropiônico, como descrito para conjugados de base LPS (ver Exemplo 5). Os glicoconjugado foi obtido através da tiolação de uma proteina portadora e adição da proteína tiolada ao Dextran T5 maleimido-funcionalizado.
A relação molar de Destran relativamente a BSA no conjugado foi de 20:1, e o rendimento foi de 32%, com base no conteúdo de carboidratos.
Estudos de reatividade cruzada foram realizados com soros pós-imune de coelhos imunizados com Dextran-BSA contra LPS de linhagens H. pylori representativas de diversos glicotipos LPS e linhagens mutantes selecionadas (Tabela 18).
Tabela 18. Respostas” de anticorpos de coelhoº a LPS de H.pylori purificado ' eliciado por conjugado Dextran-BSA“º Es fe E ag [STR TRE gr ? Cada coelho recebeu 10 ug de carboidratos por injeção. P Título do soro pós-imune 1:100. º ODaso + 10% ' A reatividade sérica pós-imune obtidas de coelhos que foram imunizados com Dextran-BSA foi indicativa da necessidade da presença de a1,6-glucano uma vez que não ' foi observada reatividade cruzada foi obtida com linhagens glucano-negativas SS1 e SS1 HPO0826::Kan.
Os soros pós-imunes obtidos de coelhos imunizados com Dextran-BSA mostrou atividade funcional tanto contra mutante 26.695 HP0826::Kan e a correspondente linhagem do tipo selvagem (Tabela 19).
Tabela 19. Atividade bactericida contra as linhagens H. pylori 26695 HP0826::Kan e
26.695 com anti-soros de coelho induzidas por conjugado Dextran-BSA.
Imunogênio Soro imune Título do soro bactericida (50% de fe JO a a aa [EP a º Cada coelho recebeu 10 ug de carboidratos por injeção ? Correspondendo a soro pré-imune de coelho A capacidade de soros pós-imune de coelho a reconhecer linhagens heterólogas tipáveis e não-tipáveis e de induzir anticorpos bactericidas indica a possibilidade de que um conjugado consistindo de Dextran, um polímero contendo uma cadeia estrutural principal de unidades de repetição glicose a1,6-ligadas, ou de um conjugado compreendendo : consecutivos resíduos glicose a1,6-ligados, e uma adequada proteina portadora podem ser suficientes para conferir proteção contra infecção por H. pylori. . Exemplo 10: Estudos de Especificidade de mAbs anti-alucano Anticorpos monocionais específicos para linhagem H. pylori 0:3 HP0826::Kan foram produzidos e suas especificidades estudadas Hibridomas foram produzidos conforme descrito anteriormente (Altman et al., 2005). Seis ratinhos BALB/c (Charles River Laboratories, St Constant, QC) foram injetados via intraperitoneal (ip) com 10º células (200 uL) células fixadas em formalina de linhagem de H.
pyloriO:3 HPO0826:Kan 5 durante 82 dias para alcançar títulos significativos. A injeção intravenosa final (i.v) foi dada e foi acompanhada 3 dias após por fusão. As células do baço de dois ratinhos foram fundidas com uma linhagem de células plasmacitoma Sp2/O de acordo com Kohler e Milstein (1975). Os sobrenadantes da fusão inicial provenientes de 368 poços foram classificados por ensaio de imunoabsorção articulado por enzima (ELISA).
Para triagem de hibridomas por ELISA, placas de microtitulação (ICN, Costa Mesa, CA) foram revestidas com 10 ug/mL correspondentes a LPS H.pylori 0:3 HP0826::Kan em . tampão 50 mM carbonato, pH 9,8, por 3 horas a 37 ºC. Após a lavagem com PBS, as placas foram bloqueadas com 5% (p/v) de albumina de soro bovino (BSA) em PBS. Os 7 sobrenadantes esgotados foram adicionados, e as placas foram incubadas por 3 h em temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS e o segundo anticorpo, um conjugado “goat anti-mouse IgG+IgM horseradish peroxidase” (Caltag, So. San Francisco, CA) foi adicionado por 1 h em temperatura ambiente. Depois de uma etapa de lavagem final, substrato 3,3',5,9'-tetrametilbenzideno (TMB) (KPL, Gaithersburg, MD) foi adicionado e a reação foi interrompida com ácido fosfórico 1 M. A absorbância foi determinada a 450 nm usando um leitor de placa de microtitulação (Dynatech, Chantilly, VA). Após esta etapa, o procedimento de ELISA indireto foi seguido como descrito no Exemplo 6.
Dois hibridomas estáveis foram obtidos após a clonagem de diluição limitada. Um clone, um C4F9, um IgM, foi selecionado para uma melhor caracterização. Líquido ascítico foi cultivado em ratinhos BALB/c, e anticorpo monoclonal 1C4F9 (mAb) foi purificada do líquido ascítico usando uma coluna de afinidade IgM-específica (Pierce, Rockford, IL), de acordo com o protocolo do fabricante.
Estudos sobre a especificidade do anticorpo-glucano-específico foram realizados usando uma serie de oligossacarídeos lineares consistindo de consecutivos resíduos glicose a1,6-ligados Glc — [a (1 — 6) Glclh=1. e seletivo LPS H.pylori purificado. Para inibição por ELISA, uma série de diluições de oligossacarídeos lineares contendo glicose a1,6-ligada provenientes d series [Glca1 — (6Glca1—) n-1.6 ] (USBiologicals, Swampscott, MS) ou H. pylori 26.695, 0:3 e inibidores LPS PJ2 foram preparados e misturados com diluições previamente preparadas de 1C4F9 purificado que produziu um ODaso=1. Em seguida da ' incubação, (22 ºC, 15 min), essa mistura foi transferida para a placa original de microtitulação bloqueada com antígeno LPS adsorvido, onde foi incubada por mais 2h a 37 . ºC.
Após essa etapa, o procedimento de ELISA indireto foi seguido como descrito no Exemplo6.A inibição percentual foi calculada através da seguinte fórmula: % inibição = 100 x [((OD com inibidor-OD sem inibidor/OD sem inibidor] As cuvras de inibição versus log da concentração foram plotadas para cada inibidor, e as concentrações exigidas para a metade da concentração máxima inibitória (ICso) foram determinadas a partir das curvas de extrapolação.
As propriedades inibidoras otimizadas quando da utilização de isomaltohexaose (n = 5) e isomaitoheptaose (n = 6) (Tabela 20). LPS de H. pylori PJ2 mostrou previamente conter em média entre seis e oito resíduos na cadeia glucano (Altman et al., 2003) foi o inibidor mais eficaz (Tabela 20). Tabela 20. Inibição de ELISA com uma série de oligossacarídeos linear contendo —glicoseal,6-ligada e LPS de linhagens H. pylori 26.695, 0:3 e PJ2. Inibidor 1C5o . somaltose Gloc1 SGlcor1->) rr o : Isomatltotriase Gloa 1 HEGloa > )n=2" Isomaltotetraose 10.000 Glea1-ASGlco1—>)n=2 Isomaltopentaose Glica 1 -(6Glca1>)=a 1.600 Isomaltohexaose Glea 1 -(6Glca1->)=s Isomaltoheptaose 460 Glca 1 -A6Glcal>)-5 26695 LPS (n=3-4) O:3LPS (n=5-6) 290 PJ2 LPS (n=6-8) 210 170 52 0,29 ? Número de resíduos glicose a1,6-ligada º Concentração do oligossacarídeo ou de LPS (ug/mL) necessária para uma inibição de 50%. Exemplo 11: Estudos de Acessibilidade e ensaios bactericidas usando mAbs anti- glucano mAbs anti-glucano foram prontamente acessíveis na superfície de bactérias vivas de linhagens H. pylori representativas, como demonstrado por estudos de microscopia de IF ' indireta (Tabela 21). Ambos a1,6-glucano e CagA podem ser diferenciados sobre a ' superfície bacteriana simultaneamente. . Para determinar a atividade bactericida do anticorpo monocional, uma diluição serial de dez vezes do 1C4F9 mAb de ascite descomplementados (50 uL) foi acrescentado a cada poço seguido de suspensão bacteriana (25 mL) e pré-incubadas por 15 min a 37 ºC. Após esta etapa, o procedimento foi seguido como descrito no Exemplo 7. A ligação de superfície celular de 1C4F9 correlacionou com a atividade funcional conforme determinado por ensaios bacterícidas contra linhagens do tipo selvagem e mutante de H. pylori (Tabela 21). Tabela 21. Caracterização de mAbs C4F9 ligante a a1,6-glucano de linhagens de H. pylori por ensaios WCE, aderência IF, e ensaios bactericidas. [EESTI Tr ea
E TA — ss Tr e me) PELA RAS -—— Ee e E sm FE e º Símbolos: ++++, fortemente positivo; -, negativo. ? Títulos bactericidas (BCs,5 ) são representados como os recíprocos da diluição do —anti-soro que reduziu a contagem de células viáveis em 50%. º* de Monteiro, 2001. º* de Logan et al., 2000. * de Altman et al., 2003. º* Não determinado.
Embora as modalidades preferidas da invenção tenham sido descritas acima, será entendido por aqueles usualmente versados na técnica que várias modificações podem ser feitas aqui, e as reivindicações anexas se destinam a cobrir todas essas modificações que possam se inserir no espírito e âmbito da invenção.
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Claims (26)

REIVINDICAÇÕES
1. Composto de Helicobacter pylori contendo a1,6-glucano, CARACTERIZADO pe- lo fato de que compreende a estrutura de Fórmula |: K H G F E Cc B A a-Glc-4-B-Gal-7-a-DDHep-2-a-Hep-3-a-Hep7 PEtN-5-a-Kdo-6-B-GlcN*-6-0-GIcN*-1PEtN || |2 - R em que R é um a-DDHep-3-a-L-Fuc-3-B-GIcNAc trissacarídeo substituído por um a1,6-glucano ligado a um a1,3-DD-heptano, em que o último resíduo de DD-Hep do a1,3- DD-heptano é tamponado com resíduo de B-GIcNAc.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o glucano compreende de 3 a 12 resíduos de glicose a1,6-ligados.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que onde a porção de heptano compreende de 2 a 6 resíduos de heptose a1,3-ligados.
4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R compreende heptano glucano B-GIcNAc-2-a-DDHep-3-[a-DDHep-3-],-a-DDHep-3-a-DDHep-3-a-Glc-[-6-0-Glc-],-6-a-Glc- 6- w P T Y x V Q Z -a-DDHep-3-a-L-Fuc-3-B-GIcNAc
N M L em que o resíduo L de B-GIcNAc é ligado a O-2 de Hep G, n= 1a 11,em=0ad4.
5. Composto, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que n=9
6. Composto, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, CARACTERIZADO pelo fato de quem=2,
7. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a estrutura de Fórmula | adicionalmente compreende uma porção do !lipídeo A covalentemente ligada ao resíduo C do Kdo.
8. Composto, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula do lipídeo A é O-deacilado ou é separada por meio da hidrólise da ligação ceto- sídica do resíduo do Kdo.
9. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, —CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é isolado ou purificado da linhagem do H. Pylori HPO826::Kan.
10. Conjugado, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a composto subs-
da proteína, ou uma combinação destes.
11. Conjugado, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto substancialmente linear contendo a1,6-glucano é o composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, em que a estrutura de Fórmula | é conjugada àmolécula ligadora, portador da proteína, ou combinação destes.
12. Conjugado, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto substancialmente linear contendo a1,6-glucano é Dextrana.
13. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o portador da proteína é toxóide do tétano, albumina de — soro bovino, CRM, ou CRM197.
14. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um ou mais do que um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9€/ouo conjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 10 a 13.
15. Anticorpo, CARACTERIZADO pelo fato de que reconhece o composto conten- dooepítopo do a1,6-glucano conforme definido na reivindicação 1.
16. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é o anticorpo monoclonal 1CA4F9,
17. Uso do anticorpo monoclonal, conforme definido na reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de causar a bacteriólise mediada pelo complemento das linha- gensdo H. pyloriexpressando o a1,6-glucano em um indivíduo com necessidade de tal! tra- tamento.
18. Uso do anticorpo monoclonal, conforme definido na reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para indução de bacteriólise mediada pelo complemento das linhagens do H. pylori expressando o a1,6- —glucano.
19. Uso de uma quantidade eficaz da composição, conforme definida na reivindica- ção 14, para a indução de uma resposta imune contra o H. pylori em um indivíduo.
20. Uso da composição conforme definida na reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para indução de uma resposta imune contraoH.pyloriem um indivíduo.
21. Uso, de acordo com a reivindicação 19 ou método, de acordo com a reivindica- ção 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é conjugado a uma proteína porta- dora adequada.
22. Uso, de acordo com a reivindicação 19 ou método, de acordo com a reivindica- — ção20, CARACTERIZADO pelo fato de que onde a composição é conjugada a uma proteí- na portadora adequada através de um ácido 2-ceto-3-deoxi-octulossônico (Kdo) do lipopo-
23. Anti-soro imune, CARACTERIZADO pelo fato de ser produzido por meio da imunização de um mamífero com a composição imunogênica, conforme definido na reivindi- cação 14.
24. Anti-soro imune, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fa- todequeoanti-soro compreende uma IgG reconhecendo um epítopo de glucano ligado ao a1,6- no mutante tipável e não tipável homólogo e heterólogo e linhagens tipo selvagem do H. pylori.
25. Anti-soro imune, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fa- to de que a IgG causa a bacteriólise mediada pelo complemento do mutante e das linhagens tipo selvagem do H. pylori expressando o a1,6-glucano.
26. Linhagem de célula do hidridoma, CARACTERIZADA por ser 1C4F9.
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