JP6785521B2 - エンドトキシン測定剤の感度の増強方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンに対するエンドトキシン測定剤の感度を増強させる方法に関する。
カブトガニの血中に存在するアメボサイト（amoebocyte）の抽出物（アメボサイト・ライセート。amoebocyte lysate）がエンドトキシンに接触すると、凝固することが知られている。この性質を利用して、アメボサイト・ライセートはエンドトキシンを高感度に検出する試薬として医薬品の品質管理等に広く使用されている。
この試薬は「ライセート試薬」と呼ばれている。またエンドトキシンによって凝固が生じる性質は、最初にリムルス・ポリフェムスで発見されたことから、この試薬は「リムルス試薬」や「LAL（Limulus amoebocyte lysate）試薬」と呼ばれることもある。
カブトガニを保護するため、アメボサイト・ライセート中のタンパク質を組換え技術で人工的に製造し、試薬を作製する思想がある（特許文献１、２）。そして実際に、組換えタンパク質を利用して、PyroGene（登録商標）（ロンザ社）、EndoZyme（登録商標）II(ビオメリュー社)、PyroSmart（登録商標）（生化学工業株式会社）といった製品が上市されている。
棚元らの厚生労働科学研究成果（非特許文献１）、Loverockら（非特許文献２）、Grallertら（非特許文献３）およびBoldenら（非特許文献４）の報告から、組換えタンパク質を利用したエンドトキシン測定剤である「組換え試薬」の性能はライセート試薬と同等であると考えられていた。
国際公開第2012／118226号 国際公開第2014／092079号
厚生労働科学研究成果 「医薬品の微生物学的品質確保のための硬度試験法導入に関する研究」 文献番号２０１４２７０２７Ｂ Loverock, B et al., "A Recombinant Factor C Procedure for the Detection of Gram-Negative Bacteria Endotoxina", Pharmacopeial Forum 36, 321-29, (2010) Grallert, H et al., "EndoLISA: a novel and reliable method for endotoxin detection", Nature Methods, October (2011) Bolden, J. et al., "Application of Recombinant Factor C Reagent for the Detection of Bacteria Endotoxins in Pharmaceutical Products", PDA J Pharm Sci Technol., 2017, Sep-Oct, 71(5), 405-412 (2017)
しかしながら、本発明者らは、エンドトキシン標準品に対するヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンの相対力価を現行の組換え試薬で測定したところ、ライセート試薬で測定したそれより著しく小さいことを知見した。したがって、本発明は、組換えタンパク質を利用したエンドトキシン測定剤において、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンに対する感度を増強させる方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、組換えタンパク質を利用したエンドトキシン測定剤におけるエンドトキシン測定時の（すなわち、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンと共存する）ファクターC組換えタンパク質の含有量を増加させることにより、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンに対する感度を増強できることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づき、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］ ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来のエンドトキシンに対するエンドトキシン測定剤の感度を増強させる方法であって、
前記エンドトキシン測定剤は、カブトガニ由来ファクターC組換えタンパク質を含み、
エンドトキシン測定時の前記ファクターC組換えタンパク質の含有量を増加させることを含む、方法。
［２］ 前記エンドトキシン測定剤が、カブトガニ由来ファクターB組換えタンパク質を含む、［１］に記載の方法。
［３］ 前記エンドトキシン測定剤が、カブトガニ由来プロクロッティングエンザイム組換えタンパク質を含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］ 前記エンドトキシン測定剤が検出用化合物を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］ ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来のエンドトキシンに対するエンドトキシン測定剤の感度が増強されたエンドトキシン測定方法であって、
前記エンドトキシン測定剤と被検体とを含むエンドトキシン測定試料を調製することを含み、
前記エンドトキシン測定剤は、カブトガニ由来ファクターC組換えタンパク質を含み、
前記感度は、前記エンドトキシン測定試料における前記ファクターC組換えタンパク質の濃度を増加させることによって増強される、方法。
［６］ 前記エンドトキシン測定剤が、カブトガニ由来ファクターB組換えタンパク質を含む、［５］に記載の方法。
［７］ 前記エンドトキシン測定剤が、カブトガニ由来プロクロッティングエンザイム組換えタンパク質を含む、［５］または［６］に記載の方法。
［８］ 前記エンドトキシン測定剤が検出用化合物を含む、［５］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来のエンドトキシンに対する感度が増強されたエンドトキシン測定剤。
［１０］ ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来のエンドトキシンに対する感度が増強されたエンドトキシン測定剤の製造方法であって、
前記エンドトキシン測定剤は、カブトガニ由来ファクターC組換えタンパク質を含み、
前記エンドトキシン測定剤における前記ファクターC組換えタンパク質の含有量を増加させることを含む、製造方法。
［１１］ カブトガニ由来ファクターCを含むエンドトキシン測定剤であって、当該カブトガニ由来ファクターCは組換えタンパク質であり、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来のエンドトキシンの相対力価が、ライセート試薬で測定される相対力価の0.1倍以上である、エンドトキシン測定剤。
［１２］ 前記エンドトキシン測定剤が、カブトガニ由来ファクターB組換えタンパク質を含む、［１１］に記載のエンドトキシン測定剤。
［１３］ 前記エンドトキシン測定剤が、カブトガニ由来プロクロッティングエンザイム組換えタンパク質を含む、［１１］または［１２］に記載のエンドトキシン測定剤。
［１４］ 検出用化合物を含む、［１１］〜［１３］のいずれかに記載のエンドトキシン測定剤。
［１５］ カブトガニ由来ファクターC含むエンドトキシン測定剤であって、当該カブトガニ由来ファクターCは組換えタンパク質であり、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来エンドトキシンの相対力価が200（EU/μg）以上である、エンドトキシン測定剤。
［１６］ 前記エンドトキシン測定剤が、カブトガニ由来ファクターB組換えタンパク質を含む、［１５］に記載のエンドトキシン測定剤。
［１７］ 前記エンドトキシン測定剤が、カブトガニ由来プロクロッティングエンザイム組換えタンパク質を含む、［１５］または［１６］に記載のエンドトキシン測定剤。
［１８］ 検出用化合物を含む、［１５］〜［１７］のいずれかに記載のエンドトキシン測定剤。検出用化合物の一態様は、一般式Y-X-Zで表される検出用化合物であって、上記一般式中、Yは水素原子または保護基であり、Xは前記プロクロッティングエンザイム組換えタンパク質の基質となるアミノ酸配列を含むペプチドであり、ZはXから遊離すると光学検出できるようになる標識物質である。検出用化合物の別の一態様は、一般式Y-X-Zで表される検出用化合物であって、上記一般式中、Yは水素原子または保護基であり、Xは前記ファクターB組換えタンパク質の基質となるアミノ酸配列を含むペプチドであり、ZはXから遊離すると光学検出できるようになる標識物質である。検出用化合物の更に別の一態様は、一般式Y-X-Zで表される検出用化合物であって、上記一般式中、Yは水素原子または保護基であり、Xは前記ファクターCの基質となるアミノ酸配列を含むペプチドであり、ZはXから遊離すると光学検出できるようになる標識物質である。
［１９］ ［１１］〜［１８］のいずれかに記載のエンドトキシン測定剤を用いて、被検体中のエンドトキシンを測定する方法。
図１は、反応液中の組換えファクターC濃度とヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価の関係を示す図である。 図２は、反応液中の組換えファクターB濃度とヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価の関係を示す図である。 図３は、反応液中の組換えプロクロッティングエンザイム濃度とヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価の関係を示す図である。
本明細書中で使用する略号およびその意味を説明する。
ファクターC（C因子:FC）
組換えファクターC（rFC）
ファクターB（B因子:FB）
組換えファクターB（rFB）
プロクロッティングエンザイム（凝固酵素前駆体:PCE）
組換えプロクロッティングエンザイム（rPCE）
クロッティングエンザイム（凝固酵素）
本発明によれば、組換えタンパク質を利用したエンドトキシン測定剤において、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンに対する感度を増強させる方法を提供することができる。
本明細書中において、ファクターC、ファクターBおよびプロクロッティングエンザイムを個別にまたは総称して「リムルス因子」ということがある。
以下、本発明について説明する。
＜エンドトキシン測定剤の感度の増強方法＞
本発明の一態様は、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンに対するエンドトキシン測定剤の感度を増強させる方法であって、前記エンドトキシン測定剤は、カブトガニ由来ファクターC組換えタンパク質を含み、エンドトキシン測定時の前記ファクターC組換えタンパク質の含有量を増加させることを含む、方法（以下、「本発明の増強方法」ということがある）に関する。本発明の一実施形態では、エンドトキシン測定時の前記ファクターC組換えタンパク質の含有量を、感度の増強に十分な量に増加させる。
本発明の一態様は、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンに対するエンドトキシン測定剤の反応性を向上させる方法であって、前記エンドトキシン測定剤は、カブトガニ由来ファクターC組換えタンパク質を含み、エンドトキシン測定時の前記ファクターC組換えタンパク質の含有量を増加させることを含む、方法に関する。本発明の更なる一態様は、ヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンに対するカブトガニ由来ファクターC組換えタンパク質の反応性を付与する方法であって、当該エンドトキシンと共存させる前記ファクターC組換えタンパク質の量を増加させることを含む方法、に関する。本発明の一実施形態では、上記反応性は、200 EU/μg以上（例えば、250 EU/μg以上、300 EU/μg以上）の相対力価として表現される。
前述の通り、現行の組換えタンパク質を利用したエンドトキシン測定剤において、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンに対する感度が、ライセート試薬に比べて著しく低いという課題が存することを、本発明者らは見出した。
本発明の増強方法では、組換えタンパク質を利用したエンドトキシン測定剤である組換え試薬を使用したエンドトキシン測定において、エンドトキシン測定時のファクターC組換えタンパク質の含有量を増加させることで、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンに対するエンドトキシン測定剤の感度を増強させることを可能としたものである。すなわち、基準であるエンドトキシン標準品に対するヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンの相対力価を向上させることができる。より具体的には、エンドトキシン測定剤と被検体とを含むエンドトキシン測定試料中のファクターC組換えタンパク質の濃度を増加させることで、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンに対するエンドトキシン測定剤の感度を増強させることができる。ここで、後記実施例に示される通り、エンドトキシン測定試料中のファクターC組換えタンパク質以外のリムルス因子の濃度を増加させても、エンドトキシン標準品に対するヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンの相対力価を向上できない、あるいは、バックグラウンドが上昇し、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンに対するエンドトキシン測定剤の感度を増強できないことを、本発明者らは知見している。
本発明の増強方法において、エンドトキシン測定時のファクターC組換えタンパク質のエンドトキシン測定剤の感度の増強に十分な含有量としては、目的とする相対力価、測定系、ファクターC組換えタンパク質の宿主等に応じ変更でき、限定されないが、組換えタンパク質を利用したエンドトキシン測定剤で測定したエンドトキシン標準品に対するヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンの相対力価が、ライセート試薬で測定した相対力価の0.1倍以上、0.2倍以上、0.3倍以上、0.4倍以上、0.5倍以上、0.6倍以上、0.7倍以上、0.8倍以上、0.9倍以上または1.0倍以上となるように、ファクターC組換えタンパク質の含有量を増加させることができる。
ここで、ライセート試薬とは、カブトガニ血リンパ液から、通常の方法（例えば、J. Biochem., 80, 1011-1021(1976)参照）により調製した血球抽出物を挙げることができる。また、これらの抽出物にファクターCの活性化に有効な二価金属塩、クロッティングエンザイムの基質（例えば、後記の合成基質）、pH調整剤等を必要に応じて添加したものであってもよい。さらに、ライセート試薬としては、市販のものも使用することができる。ライセート試薬としては、限定されないが、例えば、Endospecy（登録商標）ES-50M（生化学工業株式会社）が挙げられる。
また、組換えタンパク質を利用したエンドトキシン測定剤を用いたヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの相対力価の測定は、エンドトキシン標準品を基準として求められ、例えば、検出用化合物を用いた実施例に記載の方法で行うことができる。測定方法は、エンドポイント測定またはカイネティクス測定のいずれであってもよい。
相対力価の測定は、具体的には、例えば、(i)エンドトキシン測定試料の吸光度を測定し、単位時間当たりの吸光度変化率（mAbs/min）を算出する。(ii)次いで、エンドトキシン標準品で作成した検量線より、エンドトキシン測定試料のエンドトキシン活性（EU/mL）を算出し、(iii)この値をエンドトキシン測定試料に含まれるエンドトキシンの濃度（μg/mL）で除し、エンドトキシンの相対力価（EU/μg）を算出する。吸光度の時間変化を利用した方法は、3因子系でのエンドトキシンの相対力価の測定（ファクターC、ファクターBおよびプロクロッティングエンザイムを含む反応系）に特に適している。一実施形態では、ヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの相対力価の測定は、吸光度の時間変化を利用した方法により3因子系で行われる。
相対力価の測定は、例えば、蛍光強度測定に基づいた方法により行ってもよい。より具体的には、（i）エンドトキシン測定剤を用いて、カスケード反応の進行に伴うエンドトキシン測定試料の相対蛍光強度の変化を測定し、（ii）エンドトキシン標準品で作成した検量線より、エンドトキシン測定試料のエンドトキシン活性（EU/mL）を算出し、(iii) この値をエンドトキシン測定試料に含まれるエンドトキシンの濃度（μg/mL）で除し、エンドトキシンの相対力価（EU/μg）を算出する。蛍光強度の時間変化を利用した方法は、1因子系での相対力価の測定（ファクターCを含み、ファクターBまたはプロクロッティングエンザイムを含まない反応系）および2因子系での相対力価の測定（ファクターCおよびファクターBを含み、プロクロッティングエンザイムを含まない反応系）に特に適している。一実施形態では、ヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの相対力価の測定は、蛍光強度の時間変化を利用した方法により1因子系または2因子系で行われる。
ここで、相対力価の測定に用いられるヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの量は、エンドトキシン標準品で作成した検量線よりエンドトキシン測定試料（すなわち、ヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンを含有する試料）のエンドトキシン活性（EU/mL）を算出できる量であれば特に制限されず、相対力価の測定方法の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。相対力価の測定に用いられるヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの量は、測定系における濃度として、例えば、0.25〜25 ng/mLであってもよく、具体的には、0.25 ng/mL、5 ng/mL、または25 ng/mLであってもよい。相対力価の測定に用いられるヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの量は、特に、1因子系で相対力価の測定が実施される場合に、測定系における濃度として、0.25〜25 ng/mLであってもよく、具体的には、0.25 ng/mL、5 ng/mL、または25 ng/mLであってもよい。また、相対力価の測定に用いられるヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの量は、特に、2因子系または3因子系で相対力価の測定が実施される場合に、測定系における濃度として、0.25 ng/mLであってもよい。
ここで、エンドトキシン標準品としては、例えば、日本薬局方エンドトキシン標準品、米国薬局方エンドトキシン標準品または欧州薬局方エンドトキシン標準品が挙げられる。
例えば、後記実施例に使用した市販組換え試薬Aを用いた場合、ヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの相対力価は、147.3 EU/μgである（表１）。他方、市販ライセート試薬Aやライセート試薬Bを用いた場合、ヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの相対力価は、約2000 EU/μgである。哺乳類細胞により発現させたファクターC組換えタンパク質を用いて3因子系でエンドトキシンを測定する場合、エンドトキシン測定時の（すなわち、エンドトキシン測定時における測定試料中の）ファクターC組換えタンパク質の含有量を162 ng/mL以上とすると、0.25 ng/mLのヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの相対力価が、ライセート試薬で測定した相対力価の0.1倍以上である200 EU/μg以上を達成することができる（表２）。この場合、エンドトキシン測定時における測定試料中のファクターC組換えタンパク質の含有量を162 ng/mL以上に増加させることで、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンに対するエンドトキシン測定剤の感度を増強させることができる。なお、表１における市販組換え試薬Aのエンドトキシン測定時のファクターC組換えタンパク質の含有量は162 ng/mL未満である。
エンドトキシン測定時における測定試料中のファクターC組換えタンパク質の含有量は、目的とする相対力価、測定系、ファクターC組換えタンパク質の宿主等に応じ変更できる。測定系が３因子系の場合、限定されないが、エンドトキシン測定時における測定試料中のファクターC組換えタンパク質の含有量を140 ng/mL以上、162 ng/mL以上、180 ng/mL以上、200 ng/mL以上、250 ng/mL以上、300 ng/mL以上、400 ng/mL以上、500 ng/mL以上、600 ng/mL以上または700 ng/mL以上とすることができる。測定系が２因子系の場合、限定されないが、エンドトキシン測定時における測定試料中のファクターC組換えタンパク質の含有量を235 ng/mL以上、250 ng/mL以上、300 ng/mL以上または350 ng/mL以上となる量に設定することができる。測定系が１因子系の場合、限定されないが、エンドトキシン測定時における測定試料中のファクターC組換えタンパク質の含有量を10 ng/mL以上、20 ng/mL以上、30 ng/mL以上、40 ng/mL以上、50 ng/mL以上、60 ng/mL以上、70 ng/mL以上、100 ng/mL以上、500 ng/mL以上または800 ng/mL以上とすることができる。
エンドトキシン測定時における測定試料中のファクターC組換えタンパク質の含有量の上限は特に制限されないが、例えば10 mg/mL以下、生産効率の観点から好ましくは10 μg/mL未満（例えば5 μg/mL以下、2 μg/mL以下）である。
なお、本明細書において、ファクターC組換えタンパク質の含有量は、実施例に記載のELISA法により算出した値である。
リムルス試薬によるエンドトキシンの測定方法は、アメボサイト・ライセートに含まれるセリンプロテアーゼ前駆体（例えば、ファクターC、ファクターBおよびプロクロッティングエンザイム）がエンドトキシンと接触した際に、逐次活性化されて進行するカスケード反応を利用する方法である。
本発明の増強方法が適用されるエンドトキシン測定方法は、エンドトキシンと接触したファクターCが自己触媒的に活性型（活性型ファクターC）に変化し、活性型ファクターCのプロテアーゼ活性を利用して、測定を行うものであってよい（1因子系）。また、本発明において適用されるエンドトキシン測定方法は、エンドトキシンと接触したファクターCが自己触媒的に活性型（活性型ファクターC）に変化し、活性型ファクターCのプロテアーゼ活性によりファクターBが切断されて活性型ファクターBに変化する反応を利用して、測定を行うものであってよい（2因子系）。また、本発明において適用されるエンドトキシン測定方法は、当該一連の反応に加えて、活性型ファクターBのプロテアーゼ活性によりプロクロッティングエンザイムが切断されてクロッティングエンザイムに変化する反応をも含む一連の反応を利用して、測定を行うものであってよい（3因子系）。本明細書における「カスケード反応」は、上記1因子系、2因子系および3因子系の反応を含む。
本発明の増強方法が適用されるエンドトキシン測定方法は、ファクターC組換えタンパク質を利用したエンドトキシン測定剤である組換え試薬を用いたエンドトキシン測定方法であれば、特に限定されず適用できる。組換え試薬は、市販の組換え試薬、または、公知の方法により製造されたリムルス因子によって構成される試薬であってよい。
上記組換え試薬において、ファクターCは、遺伝子工学的手法によって調製されたリムルス因子の組換えタンパク質である。
上記組換え試薬において、ファクターBおよびプロクロッティングエンザイムは、それぞれ独立して、カブトガニから得られる天然のリムルス因子であってもよく、遺伝子工学的手法によって調製されたリムルス因子の組換えタンパク質であってもよく、天然のリムルス因子とリムルス因子の組換えタンパク質を任意の割合で含む混合物であってもよい。好ましくは、ファクターBおよびプロクロッティングエンザイムはリムルス因子の組換えタンパク質である。
天然のリムルス因子は、カブトガニの血球を原料とし、常法に従って取得されたライセートを適宜精製して分取されたものであってもよい。リムルス因子の分取は、例えば、文献（Nakamura, T., Horiuchi, T., Morita, T., Iwanaga, S. (1986) J. Biochem. 99, 847-57）に記載された方法を参照して行うことができる。
リムルス因子の組換えタンパク質は、リムルス因子のポリペプチドをコードする核酸を導入した細胞に当該リムルス因子を生成させることで取得することができる。リムルス因子をコードする核酸の塩基配列は、NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）等の公知のデータベースから取得できる。なお、リムルス因子をコードする核酸の塩基配列は、コドンの組み合わせが宿主細胞での発現に最適化されたDNAのバリアントであってもよい。
各リムルス因子の由来となるカブトガニの種類は特に限定されない。カブトガニとしては、タキプレウス属、リムルス属、またはカルシノスコルピウス属に属するものが例示できる。より具体的には、タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）、リムルス・ポリフェムス（Limulus polyphemus）、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Carcinoscorpius rotundicauda）、タキプレウス・ギガス（Tachypleus gigas）の４種が知られている。これらのカブトガニを、リムルス因子の由来となるカブトガニとして例示できる。また、これらのカブトガニの中でも、タキプレウス・トリデンタツス、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ、またはリムルス・ポリフェムスであることが好ましく、タキプレウス・トリデンタツスであることがより好ましい。
リムルス因子のポリペプチドとして、具体的には、後述する＜エンドトキシンの測定方法＞に記載の（１）〜（８）のポリペプチドが例示される。リムルス因子をコードする核酸として、具体的には、後述する＜エンドトキシンの測定方法＞に記載の〔１〕〜〔７〕のポリペプチドをコードする塩基配列が例示される。
細胞によるリムルス因子の生成は、公知の手法により行うことができ、具体的には、後述する＜実施例２＞等に記載の哺乳類細胞または非哺乳類細胞（例えば、昆虫細胞、酵母、リーシュマニア等の寄生性原生動物等）を用いる方法が例示される。また、細胞によるリムルス因子の生成は、例えば、文献（国際公開第2018/074498号）に記載された方法を参照して行うこともできる。
本発明の増強方法においては、エンドトキシン測定時のファクターC組換えタンパク質の含有量を、例えば感度の増強に十分な量に、増加させる以外は、公知のエンドトキシン測定の条件で行うことができる。測定の条件としては、限定されないが、例えば、反応液のpHとしては、5〜10、好ましくは7〜8.5を採用できる。反応温度としては、10 ℃〜80 ℃、好ましくは20 ℃〜50 ℃、さらに好ましくは30 ℃〜40 ℃を採用することができる。反応温度としては、例えば、37 ℃が例示される。反応時間も特に限定されず、諸条件に応じて適宜設定すればよい。反応時間は、例えば、5分〜2時間、好ましくは15分〜90分、より好ましくは30分〜40分であってよい。
＜エンドトキシンの測定方法＞
本発明のさらなる一態様は、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンに対するエンドトキシン測定剤の感度が増強されたエンドトキシン測定方法であって、前記エンドトキシン測定剤と被検体とを含むエンドトキシン測定試料を調製することを含み、前記エンドトキシン測定剤は、カブトガニ由来ファクターC組換えタンパク質を含み、前記感度の増強は、前記エンドトキシン測定試料における前記ファクターC組換えタンパク質の濃度を増加させることによってされる、方法（以下、「本発明の測定方法」ということがある）に関する。本発明の別の実施形態は、エンドトキシンを測定する方法であって、エンドトキシン測定剤と被検体とを含むエンドトキシン測定試料を調製することを含み、前記エンドトキシン測定剤は、カブトガニ由来ファクターC組換えタンパク質を含み、前記エンドトキシン測定試料における前記ファクターC組換えタンパク質の濃度が、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンに対する前記エンドトキシン測定剤の感度の増強に十分な量に増加されている、方法に関する。
本発明において、測定は、検出、検知、および定量を含む総称として用いられる。よって、本発明の測定方法は、例えば、エンドトキシンの検出方法、エンドトキシンの検知方法、またはエンドトキシンの定量方法であってもよい。
本発明の測定方法は、エンドトキシン測定試料におけるファクターC組換えタンパク質の濃度を増加させることによって、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンに対するエンドトキシン測定剤の感度が増強された、エンドトキシンの測定方法である。本発明の測定方法においては、エンドトキシン測定試料におけるファクターC組換えタンパク質の濃度を増加させる以外は、公知のエンドトキシン測定の条件で行うことができる。エンドトキシン測定試料におけるファクターC組換えタンパク質の濃度の、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンに対するエンドトキシン測定剤の感度の増強に十分な量の態様は、上記＜エンドトキシン測定剤の感度の増強方法＞におけるファクターC組換えタンパク質の含有量の態様と同じである。
以下、測定方法の詳細について説明する。
本発明の測定方法は、例えば、下記（Ａ）および（Ｂ）の工程を含む、エンドトキシンの測定方法である。
（Ａ）カブトガニ由来ファクターC組換えタンパク質、および被験体を混合する工程。
（Ｂ）リムルス因子のプロテアーゼ活性を測定する工程。
上記（Ａ）の工程は、カブトガニ由来ファクターC組換えタンパク質および被験体を混合する工程である。被験体がエンドトキシンを含有する試料である場合、当該エンドトキシンと接触したファクターCが活性型ファクターCに変化する。
上記（Ａ）の工程においては、ファクターC組換えタンパク質および被験体を混合する操作を含んでいる限り、さらに他の物質を混合する操作を含んでいてもよい。ここにいう「他の物質」としては、ファクターB、プロクロッティングエンザイム、検出用化合物（検出用基質）等が例示される。上記（Ａ）の工程がファクターC組換えタンパク質、ファクターB、プロクロッティングエンザイムおよび被験体を混合する工程であり、かつ、被験体がエンドトキシンを含有する試料である場合、当該エンドトキシンと接触したファクターCが活性型ファクターCに変化し、ファクターBが活性型ファクターBに変化し、プロクロッティングエンザイムがクロッティングエンザイムに変化するカスケード反応が進行する。
本発明において「ファクターC」は、カブトガニファクターCの機能を有するファクターCである限り特に限定されない。ここにいう「カブトガニ」の定義は、前記＜エンドトキシン測定剤の感度の増強方法＞における記載の通りである。「カブトガニファクターCの機能」とは、カブトガニのファクターCが有するプロテアーゼ前駆体としての機能を意味する。「カブトガニファクターCの機能」とは、具体的には、エンドトキシンの共存下で活性型（活性型ファクターC）に変化し、プロテアーゼ活性を発現する機能を意味する。カブトガニファクターCの機能は、例えば、エンドトキシンの共存下で活性型（活性型ファクターC）に変化し、ファクターBを切断して活性型（活性型ファクターB）に変化させる機能である。また、カブトガニファクターCの機能は、例えば、エンドトキシンの共存下で活性型（活性型ファクターC）に変化し、活性型ファクターCの基質となる検出用化合物を切断して標識物質を遊離させる機能である。ここにいう検出用化合物としては、例えば、後述する態様を好適に用いることができる。
本発明において「ファクターB」は、カブトガニファクターBの機能を有するファクターBである限り特に限定されない。ここにいう「カブトガニ」の定義は、前記＜エンドトキシン測定剤の感度の増強方法＞における記載の通りである。「カブトガニファクターBの機能」とは、具体的には、活性型ファクターCと接触して活性型（活性型ファクターB）に変化し、プロテアーゼ活性を発現する機能を意味する。カブトガニファクターBの機能は、例えば、活性型ファクターCと接触して活性型（活性型ファクターB）に変化し、プロクロッティングエンザイムを切断してクロッティングエンザイムに変化させる機能である。また、カブトガニファクターBの機能は、例えば、活性型ファクターCと接触して活性型（活性型ファクターB）に変化し、活性型ファクターBの基質となる検出用化合物を切断して標識物質を遊離させる機能である。ここにいう検出用化合物としては、例えば、後述する態様を好適に用いることができる。
本発明において「プロクロッティングエンザイム」は、カブトガニプロクロッティングエンザイムの機能を有するプロクロッティングエンザイムである限り特に限定されない。ここにいう「カブトガニ」の定義は、前記＜エンドトキシン測定剤の感度の増強方法＞における記載の通りである。「カブトガニプロクロッティングエンザイムの機能」とは、カブトガニのプロクロッティングエンザイムが有するプロテアーゼ前駆体としての機能を意味する。「カブトガニプロクロッティングエンザイムの機能」とは、具体的には、活性型ファクターBの共存下で活性型（クロッティングエンザイム）に変化し、プロテアーゼ活性を発現する機能を意味する。カブトガニプロクロッティングエンザイムの機能は、例えば、活性型ファクターBの共存下で活性型（クロッティングエンザイム）に変化し、コアギュローゲンを切断してコアギュリンゲルを形成させる機能である。また、カブトガニプロクロッティングエンザイムの機能は、例えば、活性型ファクターBの共存下で活性型（クロッティングエンザイム）に変化し、クロッティングエンザイムの基質となる検出用化合物を切断して標識物質を遊離させる機能である。ここにいう検出用化合物としては、例えば、後述する態様を好適に用いることができる。
本発明におけるファクターCとしては、具体的には、下記（１）〜（４）のいずれかに示されるポリペプチドが例示される。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（３）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつカブトガニファクターCの機能を有するポリペプチド。
本発明におけるファクターBとしては、具体的には、下記（５）または（６）のいずれかに示されるポリペプチドが例示される。
（５）配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（６）上記（５）に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつカブトガニファクターBの機能を有するポリペプチド。
本発明におけるプロクロッティングエンザイムとしては、具体的には、下記（７）または（８）のいずれかに示されるポリペプチドが例示される。
（７）配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（８）上記（７）に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつカブトガニプロクロッティングエンザイムの機能を有するポリペプチド。
上記（４）、（６）および（８）においていう「複数個」とは、置換、欠失、挿入、および／または付加してもポリペプチドがリムルス因子の機能を失わない程度のアミノ酸残基の数（総数）を意味する。「複数個」とは、例えば、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の総数に対して、好ましくは10%以下、より好ましくは5%以下、さらに好ましくは2%以下、特に好ましくは1%以下、最も好ましくは0.5%以下の数であってよい。
よって、例えば上記（４）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列の場合、アミノ酸残基の総数が1019個であるので、「複数個」とは、好ましくは2〜100個、より好ましくは2〜50個、さらに好ましくは2〜20個、特に好ましくは2〜10個、最も好ましくは2〜5個であってよい。上記（４）、（６）および（８）において「複数個」とは、具体的な個々の数としては、2個、3個、4個、5個等の整数であってよい。
上記（４）、（６）および（８）においていう「置換、欠失、挿入、および／または付加」は、例えば、保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合にはPhe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合にはLeu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合にはGln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合にはLys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合にはAsp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合にはSer、Thr間で、お互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSerまたはThrへの置換、ArgからGln、HisまたはLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、HisまたはAspへの置換、AspからAsn、GluまたはGlnへの置換、CysからSerまたはAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、AspまたはArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、LysまたはAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、ArgまたはTyrへの置換、IleからLeu、Met、ValまたはPheへの置換、LeuからIle、Met、ValまたはPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、HisまたはArgへの置換、MetからIle、Leu、ValまたはPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、IleまたはLeuへの置換、SerからThrまたはAlaへの置換、ThrからSerまたはAlaへの置換、TrpからPheまたはTyrへの置換、TyrからHis、PheまたはTrpへの置換、および、ValからMet、IleまたはLeuへの置換が例示される。
上記（４）、（６）および（８）に示されるポリペプチドは、例えば、それぞれ上記（１）、（２）、（３）、（５）および（７）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列に対して、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは99％以上の類似性を有し、かつリムルス因子の機能を有するポリペプチドであってもよい。なお、ここにいう「類似性」（similarity）は「同一性」（identity）を含む概念であるので、類似性を同一性と読み替えて当該ポリペプチドの好適態様に適用することができる。
上記ポリペプチドは、本明細書の記載に基づいて、公知の手法により調製することができる。例えば、上記ポリペプチドは、遺伝子工学的手法により調製することができる。具体的には、上記ポリペプチドをコードするDNAを人工的に宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。
上記ポリペプチドをコードするDNAとしては、例えば以下のものが挙げられる。
〔１〕配列番号１に示される塩基配列を有するDNA。
〔２〕配列番号３に示される塩基配列を有するDNA。
〔３〕配列番号５に示される塩基配列を有するDNA。
〔４〕配列番号７に示される塩基配列を有するDNA。
〔５〕配列番号９に示される塩基配列を有するDNA。
〔６〕配列番号１０に示される塩基配列を有するDNA。
〔７〕配列番号１１に示される塩基配列を有するDNA。
上記ポリペプチドは、例えば、細胞を培養して得られる培養液そのものとして調製されたものであってもよいし、培養液を所望の程度に精製した画分として調製されたものであってもよい。
本発明において「検出用化合物」は、活性化したリムルス因子の有無やその量、カスケード反応の進行を測定するために用いられる基質である。検出用化合物は、活性型ファクターCを測定するための基質であってもよく、活性型ファクターBを測定するための基質であってもよく、クロッティングエンザイムを測定するための基質であってもよい。検出用化合物は、活性化したリムルス因子の基質となる限り特に限定されない。検出用化合物は、例えば、タンパク質、ペプチド、またはこれらの誘導体であってよい。
上記タンパク質は、天然のタンパク質であってもよく、組換えのタンパク質であってもよい。上記タンパク質としては、クロッティングエンザイムの基質であるコアギュローゲンが例示される。例えば、天然のコアギュローゲンは、ライセートから分取して調製することができる。また、例えば、組換えのコアギュローゲンは、文献（宮田ら、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.29; P30-43; 1986）に記載された方法を参照して調製することができる。
上記ペプチドは、例えば、化学的に合成された合成基質であってよい。合成基質は、活性化したリムルス因子の有無やその量、カスケード反応の進行を測定するのに好適な基質である限り特に制限されない。合成基質は、ペプチドの誘導体であることが好ましい。
合成基質としては、一般式Y-X-Z（式中、Yは存在しても存在しなくてもよく、Yが存在する場合はYは保護基であり（すなわち、Yは水素原子または保護基であり）、Xはペプチドであり、Zは標識物質である。）で表される基質が例示される。このような合成基質は、活性化されたリムルス因子によってX-Z間の共有結合が切断され、標識物質Zが遊離する性質を有していればよい。前記一般式において、Yは、ペプチドのN末端のアミノ基に対する保護基であることが好ましい。前記一般式において、Y-X間の結合は、保護基のカルボキシ基とペプチドのＮ末端のαアミノ基との間に形成されるアミド結合であることが好ましい。また、前記一般式において、X-Z間の結合は、ペプチドのC末端のカルボキシ基と標識物質Zのアミノ基との間に形成されるアミド結合であることが好ましい。
Yとして用いられる保護基は特に制限されず、ペプチドの保護に適用可能な公知の保護基を用いることができる。保護基としては、tert-ブトキシカルボニル基（Boc）、ベンジルオキシカルボニル基（Cbz）、ベンジル基（Bzl）、ベンゾイル基（Bz）、アセチル基（Ac）が例示される。
ペプチド（X）は、活性化されたリムルス因子の基質となるアミノ酸配列を有するペプチドである限り、特に限定されない。ペプチドは、セリンプロテアーゼの測定に好適な基質であることが好ましく、Arg（R）残基をC末端に有するペプチドであることが好ましい。
活性化されたリムルス因子がファクターCである場合、ペプチドは一般式X-Pro-Arg（式中、Xは任意のアミノ酸である。）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。具体的には、活性化されたリムルス因子がファクターCである場合、ペプチドはVal-Pro-Arg（VPR）またはAsp-Pro-Arg（DPR）で示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。
活性化されたリムルス因子がファクターBである場合、ペプチドは一般式X-Thr-Arg（式中、Xは任意のアミノ酸である。）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。具体的には、活性化されたリムルス因子がファクターBである場合、ペプチドはLeu-Thr-Arg（LTR）またはMet-Thr-Arg（MTR）で示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。
活性化されたリムルス因子がプロクロッティングエンザイムである場合、ペプチドは一般式X-Gly-Arg（式中、Xは任意のアミノ酸である。）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。具体的には、活性化されたリムルス因子がプロクロッティングエンザイムである場合、ペプチドはLeu-Gly-Arg（LGR）またはGlu-Gly-Arg（EGR）で示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。
標識物質（Z）は特に制限されず、プロテアーゼ活性の測定に適用可能な公知の標識物質を用いることができる。標識物質としては、例えば、ペプチドから遊離すると光学検出（発色、蛍光、発光等として）できるようになる化合物を用いることができる。そのような標識物質としては、パラニトロアニリン（pNA）、7-メトキシクマリン-4-酢酸、2,4-ジニトロアニリン（DNP）、7-アミノ-4-メチルクマリン（AMC）、および7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリンが例示される。また、標識物質としては、例えば、ペプチドから遊離すると電気化学測定法（ボルタンメトリー、アンペロメトリー等）によって検出できるようになる化合物を用いることができる。そのような標識物質としては、p-アミノフェノール（pAP）、p-メトキシアニリン（pMA）、N-メチル-p-フェニレンジアミン（MPDD）、N，N‘-ジメチル-p-フェニレンジアミン（DMPD）が例示される。
上記本発明の測定方法における（Ａ）の工程においてリムルス因子、被験体、検出用化合物および他の物質（緩衝剤等）は、任意の順序で添加して混合されてよい。例えば、上記（Ａ）の工程において被験体は、リムルス因子、検出用化合物、他の物質の混合物に対して添加して混合されてよい。また、例えば、上記（Ａ）の工程において被験体は、リムルス因子、検出用化合物、他の物質の混合物を添加して混合されてよい。上記（Ａ）の工程において混合は、例えば、一端に開口を有する容器（試験管、バイアル等）の内部（容器内）で行われてよい。上記被験体は、エンドトキシンの検出が必要な試料である限りにおいて、特に限定されず、注射用水、医薬品、輸液、血液製剤、医療機器（医療用具）、医薬部外品、化粧品などのほか、食品、水、空気、河川、土壌などの環境試料、天然のタンパク質や遺伝子組換えタンパク質、核酸、酵素、糖質、電解質に加え、血液、体液、組織などの生体成分等を挙げることができる。
上記（Ｂ）の工程は、本発明に用いるポリペプチドのプロテアーゼ活性を測定する工程である。当該工程は、例えば、検出用化合物から遊離した標識物質を測定する工程である。当該工程では、活性型リムルス因子のプロテアーゼ活性（全活性）に応じた量（モル数）の標識物質が検出用化合物から遊離されるため、検出用化合物から遊離した標識物質を測定することにより本発明に用いるポリペプチドのプロテアーゼ活性を測定することができる。検出用化合物から遊離した標識物質は、例えば、分光光度計や蛍光光度計等の光学的機器によって測定することができる。また、検出用化合物から遊離した標識物質は、例えば、ボルタンメトリー計やアンペロメトリー計等の電気化学的測定機器によって測定することができる。例えば、当該工程において示される測定値をブランク値（エンドトキシンフリーの被験体を測定対象とした場合の測定値）と比較することにより、被験体中のエンドトキシンの有無を判定することができる。また、本発明の測定方法は、例えば、混合液のゲル化の有無を判定することにより、被験体中のエンドトキシンの有無を判定する工程であってもよい。
本発明の測定方法は、上記（Ａ）および（Ｂ）の工程に加えて、さらに他の工程を含んでいてもよい。本発明の測定方法は、例えば、上記（Ｂ）の工程において得られる測定値をブランク値と比較することにより、被験体中のエンドトキシンの有無を判定する工程を含んでいてもよい。さらに、本発明の測定方法は、例えば、上記（Ｂ）の工程において得られる測定値を他の値に変換する工程を含んでいてもよい。測定値を他の値に変換する工程としては、例えば、測定値に基づき、エンドトキシンの量を算出する工程が例示される。そのような工程は、具体的には、例えば、被験体を濃度既知の標準物質に置き換えて測定した時に得られる測定値と標準物質の濃度との関係（標準曲線）に基づき、被験体を測定した時に得られる測定値をエンドトキシンの量に変換する工程である。
本発明の測定方法においてリムルス反応は、水性溶媒中で行われることが好ましい。
＜エンドトキシン測定剤＞
本発明の別の側面では、カブトガニ由来ファクターCを含むエンドトキシン測定剤を提供する。本発明に係るエンドトキシン測定剤に含まれるカブトガニ由来ファクターCは下記（ａ）であり、さらに（ｂ）および／または（ｃ）を含んでもよく、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンの相対力価が、ライセート試薬で測定される相対力価の0.1倍以上である、エンドトキシン測定剤の態様も含みうる。
（ａ）カブトガニ由来ファクターC組換えタンパク質
（ｂ）カブトガニ由来ファクターB組換えタンパク質
（ｃ）カブトガニ由来プロクロッティングエンザイム組換えタンパク質
ここで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のリムルス因子の組換えタンパク質の態様は、前記＜エンドトキシンの測定方法＞における態様と同じである。
ライセート試薬としては、例えば、上記＜エンドトキシン測定剤の感度の増強方法＞に前述したものであってよい。
上記エンドトキシン測定剤は、本発明の測定方法を行うために好適に用いることができる。
前述の通り、エンドトキシン測定剤を用いて測定されるヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの相対力価が所望の力価にない場合、エンドトキシン測定時のファクターC組換えタンパク質の含有量を増加させることで、ヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの相対力価を向上させることができる。
別の態様として、本発明は、上記（ａ）を少なくとも含み、さらに（ｂ）および／または（ｃ）を含んでもよく、ヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの（比色法、蛍光法等で測定される）相対力価が200（EU/μg）以上、好ましくは250（EU/μg）以上、より好ましくは300（EU/μg）以上である、エンドトキシン測定剤とすることができる。
ここで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のリムルス因子の組換えタンパク質の態様は、前記＜エンドトキシンの測定方法＞における態様と同じである。
ヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの相対力価は、例えば200（EU/μg）以上3000（EU/μg）以下、250（EU/μg）以上2500（EU/μg）以下、または300（EU/μg）以上2000（EU/μg）以下であってもよい。一実施形態では、エンドトキシン測定剤は、上記相対活性となる量のファクターC組換えタンパク質を含有する。ヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの相対力価は、定量下限以上の濃度のヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンを含む測定試料を用いて測定された値である。
なお、本態様は、上記ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンの相対力価が、ライセート試薬で測定される相対力価の0.1倍以上である態様の具体例であってもよい。
上記エンドトキシン測定剤は、上記成分を構成成分として含む限り、他の構成をさらに含んでいてよい。ここにいう他の構成としては、例えば、検出用化合物、製品情報を記載した添付文書等が例示される。添付文書は、エンドトキシン測定剤のヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンの相対力価が所望の力価にない場合、エンドトキシン測定時のファクターC組換えタンパク質の含有量を感度の増強に十分な量に増加させることが表示されたものとすることができる。
一実施形態では、エンドトキシン測定剤は3因子系であり、上記一般式Y-X-Z（式中、Yは水素原子または保護基であり、Xはプロクロッティングエンザイムの基質となるアミノ酸配列を含むペプチドであり、ZはXから遊離すると光学検出できるようになる標識物質である。）で表される検出用化合物を含む。Zはパラニトロアニリン、7-メトキシクマリン-4-酢酸、7-アミノ-4-メチルクマリン、および7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン等が例示できる。具体的な一実施形態では、ZはXから遊離すると発色として検出できるようになる標識物質であり、好ましくはパラニトロアニリンである。
一実施形態では、エンドトキシン測定剤は2因子系であり、上記一般式Y-X-Z（式中、Yは水素原子または保護基であり、XはファクターBの基質となるアミノ酸配列を含むペプチドであり、ZはXから遊離すると光学検出できるようになる標識物質である。）で表される検出用化合物を含む。Zはパラニトロアニリン、7-メトキシクマリン-4-酢酸、7-アミノ-4-メチルクマリン、および7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン等が例示できる。具体的な一実施形態では、ZはXから遊離すると蛍光として検出できるようになる標識物質であり、好ましくは7-メトキシクマリン-4-酢酸、7-アミノ-4-メチルクマリン、または7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリンである。
一実施形態では、エンドトキシン測定剤は1因子系であり、上記一般式Y-X-Z（式中、Yは水素原子または保護基であり、XはファクターCの基質となるアミノ酸配列を含むペプチドであり、ZはXから遊離すると光学検出できるようになる標識物質である。）で表される検出用化合物を含む。Zはパラニトロアニリン、7-メトキシクマリン-4-酢酸、7-アミノ-4-メチルクマリン、および7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン等が例示できる。具体的な一実施形態では、ZはXから遊離すると蛍光として検出できるようになる標識物質であり、好ましくは7-メトキシクマリン-4-酢酸、7-アミノ-4-メチルクマリン、または7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリンである。なお、1因子系の場合、2因子系や3因子系と比較して、少ない量のファクターC組換えタンパク質であっても、ヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの相対力価200 EU/μg以上を達成できる。
上記エンドトキシン測定剤のリムルス因子は、凍結乾燥品として提供されることが好ましい。
本発明の一態様は、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来のエンドトキシンに対する感度が増強されたエンドトキシン測定剤に関する。
本発明のさらなる一態様は、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンに対する感度が増強されたエンドトキシン測定剤の製造方法であって、前記エンドトキシン測定剤は、カブトガニ由来ファクターC組換えタンパク質を含み、前記エンドトキシン測定剤における前記ファクターC組換えタンパク質の含有量を増加させることを含む、製造方法（以下、「本発明の製造方法」ということがある）に関する。本発明の一実施形態では、エンドトキシン測定剤における前記ファクターC組換えタンパク質の含有量を、感度の増強に十分な量に増加させる。
エンドトキシン測定剤における前記ファクターC組換えタンパク質の含有量の感度の増強に十分な量の態様としては、例えば、上記＜エンドトキシン測定剤の感度の増強方法＞に記載のエンドトキシン測定時における測定試料中のファクターC組換えタンパク質の含有量の態様となるように設定できる。具体的には、目的とする相対力価、測定系、ファクターC組換えタンパク質の宿主等に応じ変更できる。測定系が３因子系の場合、限定されないが、エンドトキシン測定剤（1回使用分）におけるファクターC組換えタンパク質の含有量を、エンドトキシン測定時における測定試料中の濃度として、140 ng/mL以上、162 ng/mL以上、180 ng/mL以上、200 ng/mL以上、250 ng/mL以上、300 ng/mL以上、400 ng/mL以上、500 ng/mL以上、600 ng/mL以上または700 ng/mL以上となる量に設定することができる。測定系が２因子系の場合、限定されないが、エンドトキシン測定剤（1回使用分）におけるファクターC組換えタンパク質の含有量を、エンドトキシン測定時における測定試料中の濃度として、235 ng/mL以上、250 ng/mL以上、300 ng/mL以上または350 ng/mL以上となる量に設定することができる。測定系が１因子系の場合、限定されないが、エンドトキシン測定剤（1回使用分）におけるファクターC組換えタンパク質の含有量を、エンドトキシン測定時における測定試料中の濃度として、10 ng/mL以上、20 ng/mL以上、30 ng/mL以上、40 ng/mL以上、50 ng/mL以上、60 ng/mL以上、70 ng/mL以上、100 ng/mL以上、500 ng/mL以上または800 ng/mL以上となる量に設定することができる。
エンドトキシン測定時における測定試料中のファクターC組換えタンパク質の含有量の上限は特に制限されないが、例えば10 mg/mL以下、生産効率の観点から好ましくは10 μg/mL未満（例えば5 μg/mL以下、2 μg/mL以下）である。
本発明の測定剤および本発明の製造方法により製造されるエンドトキシン測定剤は、本発明の測定方法を行うために好適に用いることができる。
本発明の測定剤および本発明の製造方法により製造されるエンドトキシン測定剤は、ファクターC組換えタンパク質の含有量を増加させることで、エンドトキシン測定剤を用いて測定されるヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの相対力価が増強されている。
本発明の測定剤および本発明の製造方法により製造されるエンドトキシン測定剤は、ファクターC組換えタンパク質を構成成分として含む限り、他の構成をさらに含んでいてよい。ここにいう他の構成としては、例えば、ファクターB、プロクロッティングエンザイム、検出用化合物、製品情報を記載した添付文書等が例示される。ファクターC組換えタンパク質および上記他の構成成分の態様は、上記＜エンドトキシン測定剤の感度の増強方法＞、および＜エンドトキシンの測定方法＞におけるファクターC組換えタンパク質および他の構成の態様と同じである。一実施形態では、エンドトキシン測定剤は、界面活性剤を実質的に含まない。
本発明の製造方法は、エンドトキシン測定剤におけるファクターC組換えタンパク質の含有量を増加させる以外は、公知の組換え試薬の製造方法により製造することができる。すなわち、ファクターC組換えタンパク質および上記他の構成成分を組み合わせて、エンドトキシン測定剤を製造することができる。
＜エンドトキシン測定用キット＞
さらに本発明は、上記エンドトキシン測定剤を構成品として含むことを特徴とするエンドトキシン測定用キットの態様も含みうる。
上記キットは、本発明の測定方法を行うために好適に用いることができる。
上記キットは、上記エンドトキシン測定剤を構成品として含む限り、他の構成品をさらに含んでいてよい。ここにいう他の構成品としては、例えば、検出用化合物、緩衝剤、蒸留水、エンドトキシン標準品、マイクロプレート、製品情報を記載した添付文書等が例示される。
上記キットは、各構成品をそれぞれ別個に含んでいてもよいし、各構成品を任意に組み合わせてなる混合物として含んでいてもよい。上記キットは、例えば、各リムルス因子を別個に含んでいてもよいし、予め混合された態様として含んでいてもよいし、さらに検出用化合物も予め混合された態様として含んでいてもよい。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の例示であり、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
＜実施例１： エンドトキシンに対する感度の試薬間比較＞
組換え試薬およびライセート試薬を用いて、由来が異なるエンドトキシンに対する感度の相違を比較した。
以下のエンドトキシン測定剤を準備した。なお、「組換え試薬」とは遺伝子組換え技術により生産されたファクターCを含む製剤であり、「ライセート試薬」とはカブトガニの血球抽出成分から調製された天然のファクターCを含む製剤である。
（１）組換えファクターC（rFC）、組換えファクターB（rFB）および組換えプロクロッティングエンザイム（rPCE）、検出用化合物（合成基質 Boc-LGR-pNA；ペプチド研究所）ならびにPyroSmart（登録商標）の添加剤を含む製剤：市販組換え試薬A
（２）PyroGene（ロンザ社）：市販組換え試薬B
（３）EndoZyme（登録商標）II（ビオメリュー社）：市販組換え試薬C
（４）Endospecy（登録商標）ES-50M（生化学工業株式会社）：市販ライセート試薬A
（５）Kinetic QCL（ロンザ社）：市販ライセート試薬B
測定するエンドトキシンとして、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）CA2（エルピーエス研究所）、およびサルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）R595Re（List Biological Laboratories社）の2種に由来するものを用いた。また、大腸菌（Escherichia coli）O113:H10由来のエンドトキシン標準品（Reference Standard Endotoxin、RSE）として、日本薬局方（医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス財団）または米国薬局方エンドトキシン標準品（生化学工業株式会社）を使用した。
ヘリコバクター・ピロリCA2由来のエンドトキシンは、注射用水（大塚製薬工場）で1 mg/mLとなるように溶解した。サルモネラ・ミネソタR595Re由来のエンドトキシンは、0.1（v/v）%トリエチルアミン（富士フイルム和光純薬株式会社）で1 mg/mLとなるように溶解後、トリス緩衝液（富士フイルム和光純薬株式会社）で中和した。これらエンドトキシンの原液を、エンドトキシン濃度が各試薬の添付文書に記載される定量範囲に入るように注射用水で希釈し、エンドトキシン希釈液を得た。
市販組換え試薬Aを用いた測定では、注射用水（ブランク）またはエンドトキシン希釈液と製剤とをマイクロプレート内で混合し、測定試料を調製した。このアッセイ系では、エンドトキシンによりファクターC（FC）が活性化されて活性型FCが生成し、活性型FCによりファクターB（FB）が活性化されて活性型FBが生成し、活性型FBによりプロクロッティングエンザイム（PCE）が活性化されてクロッティングエンザイムが生成し、クロッティングエンザイムが合成基質Boc-LGR-pNAを切断して、パラニトロアニリンが遊離する。吸光マイクロプレートリーダーを用いて測定試料の吸光度を測定し（主波長405 nm、副波長492 nmで15秒おき、37 ℃、30分間）、単位時間（1分間）当たりの吸光度変化率（mAbs/min）を算出した。次いで、RSEで作成した検量線より、各濃度のエンドトキシン希釈液のエンドトキシン活性（EU/mL）を算出し、それらをエンドトキシン希釈液の各濃度で除し、エンドトキシンの各濃度における相対力価（EU/μg）を算出した。これらの相対力価のうち、RSEの検量範囲に含まれる値を平均し、エンドトキシンの相対力価を決定した（表１）。
その他の組換え試薬（市販組換え試薬B、市販組換え試薬C）およびライセート試薬（市販ライセート試薬A、市販ライセート試薬B）についても、添付文書に従って測定した結果に基づき、市販組換え試薬Aと同様の方法で相対力価を決定した（表１）。
その結果、市販組換え試薬A、BおよびCで得られたヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価は、それぞれ、147.3、3.21および0.07 EU/μgであった。これは、ライセート試薬で得られた相対力価（約2000 EU/μg）と比較して著しく小さく、その差は14倍以上であった（表１）。すなわち、市販の組換え試薬とライセート試薬との間で、ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンに対する感度に大きな乖離が見られた。一方で、サルモネラ・ミネソタR595Reに由来するエンドトキシンの相対力価は、市販の組換え試薬とライセート試薬との間で、大きな差は見られなかった（表１）。
なお、大腸菌（Escherichia coli）O55:B5およびサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimulium）由来のエンドトキシンを用いて同様の試験を行ったが、これらのエンドトキシンの相対力価についても、市販の組換え試薬とライセート試薬との間で大きな差は見られなかった。
＜実施例２： rFC含有量がヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンに対する感度に与える影響＞
Ａ． 組換えタンパク質の調製
Mizumura H, Ogura N, Aketagawa J, Aizawa M, Kobayashi Y, Kawabata SI, Oda T. Innate Immun. 2017 Feb;23(2):136-146.または、「リムルス属由来の組換え蛋白質及びこれをコードするＤＮＡ」（WO 2018/074498 A1）に従い、タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus、T.t.）由来のrFC、rFBおよびrPCEを下記の通り発現させ、各種酵素液を得た。なお、T.t.由来のFCをコードするDNAとして配列番号１を、T.t.由来のFBをコードするDNAとして配列番号５または９を、T.t.由来のPCEをコードするDNAとして配列番号７を用いた。
（１） 哺乳類細胞（CHO DG44細胞）によるrFCの安定発現
チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（CHO DG44細胞）を宿主として用いて、以下の手順により、rFC酵素液を調製した。
T.t.由来のFCをコードするDNA（配列番号１）を発現ベクター（pCI-neo；Promega製）のEcoRIとXbaI認識部位の間に挿入し、FC発現プラスミドを作製した。FC発現プラスミドとジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）発現プラスミドを、リポフェクション試薬（Lipofectamine LTX；Life Technologies Corporation）を用いてCHO DG44細胞に導入した。細胞を37 ℃、5（v/v）% CO2供給下で静置培養し、発現プラスミドがゲノム上に導入された細胞をジェネティシン（Invitrogen）で選択し、rFC高発現細胞株をポリクローンで取得した。5 μMメトトレキサート（MTX）を含む培地に馴化したポリクローン細胞群からrFC高発現細胞株をモノクローン化した。細胞株（モノクローン）を無血清完全合成培地への馴化を経て浮遊化させた。37 ℃、5（v/v）% CO2供給下で対数増殖後期まで生育させた浮遊培養液から、遠心分離（3,000xg、30分、4 ℃）により培養上清を得て、rFC酵素液を調製した。
（２） 昆虫細胞（Sf9細胞）によるrFCの安定発現
昆虫細胞（Sf9細胞）を宿主細胞として用いて、以下の手順により、rFC酵素液を調製した。
T.t.由来のFCをコードするDNA（配列番号１）を発現ベクター（pIZ-V5；Life Technologies Corporation）のEcoRVとMluI認識部位の間に挿入し、FC発現プラスミドを作製した。FC発現プラスミドを、セルフェクチン試薬（Life Technologies Corporation）を用いてSf9細胞に導入した。細胞を28 ℃で静置培養し、発現プラスミドがゲノム上に導入された細胞をゼオシン（Invitrogen）で選択した。その後、ファクターC遺伝子を安定発現している候補をクローニングシリンダー法で単離し、ファクターC高発現Sf9細胞株を選抜した。rFC高発現Sf9細胞株を、1ｘペニシリン/ストレプトマイシン（Life Technologies Corporation）と50 μg/mLゼオシンとを含んだSf900III培地で対数増殖期後半（6-8x106cells/mL）まで浮遊培養（28 ℃）した。培養液を遠心分離（3,000xg、30分、4 ℃）して培養上清を得て、rFC酵素液を調製した。
（３） 昆虫細胞（Sf9細胞）によるrFBおよびrPCEの安定発現
昆虫細胞（Sf9細胞）を宿主として用いて、以下の手順により、rFBおよびrPCE酵素液を調製した。
T.t.由来のFBおよびPCEをコードするDNA（配列番号７，９）を発現ベクター（pIZ-V5;Life Technologies Corporation)のEcoRVとMluI認識部位の間に挿入し、FB発現プラスミドおよびPCE発現プラスミドをそれぞれ作製した。なお、配列番号９に示す塩基配列は、配列番号５に示す塩基配列が、昆虫細胞での発現に最適化された塩基配列である。FCの場合と同様の方法により、rFBおよびrPCE酵素液を調製した。rFBおよびrPCE酵素液中のタンパク濃度は、プロテインアッセイキット（Bio-Rad Laboratories）により測定した。
（４） Expi CHO Expression SystemによるrFCの一過性発現
Expi CHO Expression System（Thermo Fisher Scientific）を用いて、添付の説明書に従い、rFC酵素液を調製した。
T.t.由来のFCをコードするDNA（配列番号１）を発現用ベクター（pCI-neo；Promega）のEcoRIとXbaI認識部位の間に挿入し、FC発現プラスミドを作製した。ExpiFectamin CHOと混合したFC発現プラスミドをExpi CHO Expression medium共存下で、Expi CHO‐S細胞に導入した。細胞を無血清完全合成培地で37 ℃、8（v/v）% CO2供給下で生育させた。浮遊培養液を遠心分離（3,000xg、30分、4 ℃）して培養上清を得て、rFC酵素液を調製した。
Ｂ． rFC濃度の測定
試料中のrFC濃度は、Kobayashi Y, Shiga T, Shibata T, Sako M, Maenaka K, Koshiba T, Mizumura H, Oda T, Kawabata S. J Biol Chem. 2014 Sep 12;289(37):25987-95.を参考に、抗FC抗体を用いたELISA法により算出した。具体的には、捕捉抗体として抗FC抗体である2C12モノクローナル抗体（マウス）を、検出抗体として抗FCポリクローナル抗体（ウサギ）を、二次抗体としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識抗ウサギIgGポリクローナル抗体（ヤギ）（Bio-Rad Laboratories）を用いた。TMB One Component HRP Microwell Substrate(SURMODICS)を用いて450 nm（対照630 nm）の吸光度を測定した。試料中のrFC濃度は、精製FCであらかじめ作成した検量線により算出した。なお、市販組換え試薬Aを用いた試験において、エンドトキシン測定時のrFC濃度は162 ng/mL未満であった。
Ｃ． ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価の測定
ライセート試薬を用いた場合、ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価は約2000 EU/μgであった（表１）。このことから、組換え試薬を用いた場合のヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシン相対力価は、200 EU/μg以上であることが望ましい（菊池裕・他 医薬品医療機器レギュラトリーサイエンスVol.48 (2017), No.4, P252-260）。
（１） CHO DG44細胞で作製したrFCを含むエンドトキシン測定剤（3因子系）
CHO DG44細胞で作製したrFCとrFBおよびrPCEを含む3因子系でのヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価を求めた。
rFC、rFB、rPCEおよび検出用化合物（合成基質 Boc-LGR-pNA；ペプチド研究所）を、トリス緩衝液に加えてエンドトキシン測定剤を調製した。各エンドトキシン測定剤のrFC濃度は、rFC酵素液の添加量を変えることにより調整した。注射用水（ブランク）またはエンドトキシン希釈液と測定剤とをマイクロプレート内で混合し、測定試料を調製した。なお、RSEおよびヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの測定試料中の濃度は、それぞれ0.025 EU/mLおよび0.25 ng/mLとなるよう調製した。相対力価の測定は、実施例１（市販組換え試薬A）に準じて行った。なお、rFBおよびrPCEは、測定試料間で同一濃度となるように調製した。
ブランクとRSEとの2点間で検量線を作成し、ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの吸光度変化率からエンドトキシン活性を求めた。各エンドトキシン測定剤を用いた場合のヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価（EU/μg）は、上記で得られたエンドトキシン活性（EU/mL）の値をヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの濃度で除すことで求めた。rFC濃度と相対力価とをプロットして解析した結果、測定試料中のrFC濃度が162 ng/mL以上のとき、ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価が200 EU/μg以上となった。すなわち、測定試料中のrFC濃度を増やすことで、感度が増強されることが判明した（表２、図１）。なお、測定試料中のrFC濃度を高くしても、ブランクの吸光度変化率は上昇しなかった。
（２） CHO DG44細胞で作製したrFCを含むエンドトキシン測定剤（2因子系）
CHO DG44細胞で作製したrFCおよびrFBを含む（rPCEを含まない）2因子系でのヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価を求めた。
rFC、rFBおよび検出用化合物（合成基質 Boc-LTR-MCA（すなわち、Bocペプチド化AMC）；ペプチド研究所）を、トリス緩衝液に加えてエンドトキシン測定剤を調製した。各エンドトキシン測定剤のrFC濃度は、rFC酵素液の添加量を変えることにより調整した。注射用水（ブランク）またはエンドトキシン希釈液と測定剤とをマイクロプレート内で混合し、測定試料を調製した。なお、RSEおよびヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの測定試料中の濃度は、それぞれ0.025 EU/mLおよび0.25 ng/mLとなるよう調製した。なお、rFBは、測定試料間で同一濃度となるように調製した。蛍光マイクロプレートリーダーを用いて測定試料の相対蛍光強度（RFU0）を測定（励起波長380 nm、蛍光波長445 nm）した。その後、測定試料を37 ℃で90分間加温し、再度相対蛍光強度（RFU90）を測定した。RFU90からRFU0（バックグラウンド）を差し引き、ΔRFUを算出した。RSEおよびブランクのΔRFUから、それぞれブランクのΔRFUを差し引き、補正ΔRFURSE（Blanked ΔRFURSE）と補正ΔRFUblank（BlankedΔRFUblank）とを求めた。ブランクの補正ΔRFUblank（つまり０）と補正ΔRFURSEとの2点間で検量線を作成した。次に、ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンのΔRFUからブランクのΔRFUを差し引いて補正ΔRFUHpyを求め、上記検量線からエンドトキシン活性（EU/mL）を求めた。各エンドトキシン測定剤を用いた場合について、ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価（EU/μg）を実施例２Ｃ．（１）に準じて求めた。
その結果、測定試料中のrFC濃度が235 ng/mL以上のとき、ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価が200 EU/μg以上となった。すなわち、測定試料中のrFC濃度を増やすことで、感度が増強されることが判明した（表３）。なお、測定試料中のrFC濃度を高くしても、ブランクのΔRFUはほとんど上昇しなかった。
（３） CHO DG44細胞で作製したrFCを含むエンドトキシン測定剤（1因子系）
CHO DG44細胞で作製したrFCを含む（rFBまたはrPCEを含まない）１因子系でのヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価を求めた。
rFCおよび検出用化合物（合成基質 Boc-VPR-MCA（すなわち、Bocペプチド化AMC）；ペプチド研究所）を、トリス緩衝液に加えてエンドトキシン測定剤を調製した。各エンドトキシン測定剤のrFC濃度は、rFC酵素液の添加量を変えることにより調整した。注射用水（ブランク）またはエンドトキシン希釈液と測定剤とをマイクロプレート内で混合し、測定試料を調製した。なお、RSEおよびヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの測定試料中の濃度は、それぞれ5 EU/mLおよび25 ng/mLとなるよう調製した。各エンドトキシン測定剤を用いた場合のヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価（EU/μg）を、実施例２Ｃ．（２）に準じて求めた。
その結果、測定試料中のrFC濃度が13 ng/mL以上のとき、ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価が200 EU/μg以上となった。すなわち、測定試料中のrFC濃度を増やすことで、感度が増強されることが判明した（表４）。なお、測定試料中のrFC濃度を高くしても、ブランクのΔRFUはほとんど上昇しなかった。
（４） Expi CHO Expression Systemで作製したrFCを含むエンドトキシン測定剤（3因子系）
Expi CHO Expression System（一過性発現系）で作製したrFCとrFBおよびrPCEを含む3因子系でのヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価を求めた。
実施例２Ｃ．（１）に準じてヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価を求めた。その結果、測定試料中のrFC濃度が743 ng/mL以上のとき、相対力価が200 EU/μg以上となった。すなわち、測定試料中のrFC濃度を増やすことで、感度が増強されることが判明した（表５）。なお、測定試料中のrFC濃度を高くしても、ブランクの吸光度変化率は上昇しなかった。
（５） Expi CHO Expression Systemで作製したrFCを含むエンドトキシン測定剤（1因子系）
Expi CHO Expression System（一過性発現系）で作製したrFCを含む（rFBまたはrPCEを含まない）１因子系でのヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価を求めた。
実施例２Ｃ．（３）に準じてヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価を求めた。その結果、測定試料中のrFC濃度が77 ng/mL以上のとき、相対力価が200 EU/μg以上となった。すなわち、測定試料中のrFC濃度を増やすことで、感度が増強されることが判明した（表６）。なお、測定試料中のrFC濃度を高くしても、ブランクのΔRFUはほとんど上昇しなかった。
（６） Sf9細胞で作製したrFCを含むエンドトキシン測定剤（3因子系）
Sf9細胞で作製したrFC、rFBおよびrPCEを含む3因子系でのヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価を求めた。
実施例２Ｃ．（１）に準じてヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価を求めた。その結果、測定試料中のrFC濃度が394 ng/mL以上のとき、相対力価が200 EU/μg以上となった。すなわち、測定試料中のrFC濃度を増やすことで、感度が増強されることが判明した（表７）。なお、測定試料中のrFC濃度を高くしても、ブランクの吸光度変化率は上昇しなかった。
（７） Sf9細胞で作製したrFCを含むエンドトキシン測定剤（1因子系）
Sf9細胞で作製したrFCを含む（rFBまたはrPCEを含まない）１因子系でのヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価を求めた。
実施例２Ｃ．（３）に準じてヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価を求めた。ただし、RSEおよびヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの測定試料中の濃度は、それぞれ0.25 EU/mLおよび0.25 ng/mLとなるよう調製した。その結果、測定試料中のrFC濃度が93 ng/mL以上のとき、相対力価が200 EU/μg以上となった。すなわち、測定試料中のrFC濃度を増やすことで、感度が増強されることが判明した（表８）。なお、測定試料中のrFC濃度を高くしても、ブランクのΔRFUはほとんど上昇しなかった。
＜実施例３： rFC含有量がヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンに対する感度に与える影響＞
Ａ． 組換えタンパク質の調製
実施例２Ａ．（１）に準じて、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（CHO DG44細胞）を宿主として、リムルス・ポリフェムス（Limulus Polyphemus、L.p.）由来rFCを発現させ、L.p. rFC酵素液を得た。なお、L.p.由来のFCをコードするDNAとしては、配列番号１１のものを用いた。
Ｂ． L.p. rFC濃度の測定
実施例２Ｂ．に準じて試料中のL.p. rFC濃度を測定した。試料中のL.p. rFC濃度は、精製したL.p. rFCであらかじめ作成した検量線により算出した。
Ｃ． ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価の測定
（１） CHO DG44細胞で作製したL.p. rFCを含むエンドトキシン測定剤（1因子系）
CHO DG44細胞で作製したL.p. rFCを含む（rFBまたはrPCEを含まない）１因子系でのヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価を求めた。なお、RSEおよびヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの測定試料中の濃度は、それぞれ5 EU/mLおよび25 ng/mLとなるよう調製した。
ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価（EU/μg）は、実施例２Ｃ．（３）に準じて求めた。反応液中のL.p. rFC濃度を45.8 ng/mLから457.9 ng/mLまで段階的に増やしたとき、ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価（EU/μg）は、33 EU/μgから917 EU/μgまで増加した。rFC濃度と相対力価とをプロットして解析した結果、測定試料中のL.p. rFC濃度が133 ng/mL以上のとき、ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価が200 EU/μg以上となった。すなわち、L.p. rFCを用いた一因子系の測定においても、測定試料中のL.p. rFC濃度を増やすことで、感度が増強されることが判明した。
＜実施例４： rFC含有量がヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンに対する感度に与える影響＞
rFCとして市販組換え試薬B（PyroGene、ロンザ社）に含まれるrFC Enzyme Solutionを用いた。
Ａ． rFC Enzyme Solution中のrFC濃度の測定
実施例２Ｂ．に準じて試料中のrFC濃度を測定した。試料中のrFC濃度は、精製したカルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Carcinoscorpius rotundicauda、C.r.）rFCであらかじめ作成した検量線により算出した。
Ｂ． ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価の測定
（１） rFCを含むエンドトキシン測定剤（1因子系）
rFC Enzyme Solution（rFBまたはrPCEを含まない）を用いて、１因子系でのヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価を求めた。なお、RSEおよびヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの測定試料中の濃度は、それぞれ0.025 EU/mLおよび5 ng/mLとなるよう調製した。
ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価（EU/μg）は、実施例２Ｃ．（３）に準じて求めた。反応液中のrFC濃度を203.7 ng/mLから1426 ng/mLまで段階的に増やしたとき、ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価（EU/μg）は、9.09 EU/μgから440 EU/μgまで増加した。rFC濃度と相対力価とをプロットして解析した結果、測定試料中のrFC濃度が858 ng/mL以上のとき、ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価が200EU/μg以上となった。すなわち、市販組換え試薬を用いた場合も、測定試料中のrFC濃度を増やすことで、感度が増強されることが判明した。
＜参考例１： rFB含有量がヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンに対する感度に与える影響＞
rFB含有量が異なる測定試料を調製し、実施例２Ｃ．（１）に準じてヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価を求めた。なお、測定試料間のrFCおよびrPCEは同一濃度になるよう調製した。
その結果、測定試料中のｒFBの濃度を増加すると、ブランクおよびRSEの吸光度変化率は上昇したが、ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの吸光度変化率はほとんど変化しなかった。つまり、測定試料中のrFBを増加させても、ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンに対する感度は増強されなかった（図２）。
＜参考例２： rPCE含有量がヘリコバクター・ピロリ由来CA2エンドトキシンに対する感度に与える影響＞
rPCE含有量が異なる測定試料を調製し、実施例２Ｃ．（１）に準じてヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの相対力価を求めた。なお、測定試料間のrFCおよびrFBは同一濃度になるよう調製した。
その結果、測定試料中のrPCEの濃度を増加すると、ブランク、RSEおよびヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンの吸光度変化率が同時に上昇した。すなわち、測定試料中のrPCEを増加させても、ヘリコバクター・ピロリCA2由来エンドトキシンに対する感度は増強されなかった（図３）。
本発明によれば、組換えタンパク質を利用したエンドトキシン測定剤において、ヘリコバクター・ピロリ由来のエンドトキシンに対する感度を増強させる方法を提供することができる。よって、本発明は、エンドトキシンの由来の違いによる影響が低減された、組換えタンパク質を利用したエンドトキシン測定剤を用いたエンドトキシン測定方法を提供するものである。
＜配列表の説明＞
配列番号１：タキプレウス・トリデンタツスのファクターCのcDNAの塩基配列
配列番号２：タキプレウス・トリデンタツスのファクターCのアミノ酸配列
配列番号３：カルシノスコルピウス・ロツンディカウダのファクターCのcDNAの塩基配列
配列番号４：カルシノスコルピウス・ロツンディカウダのファクターCのアミノ酸配列
配列番号５：タキプレウス・トリデンタツスのファクターBのcDNAの塩基配列
配列番号６：タキプレウス・トリデンタツスのファクターBのアミノ酸配列
配列番号７：タキプレウス・トリデンタツスのプロクロッティングエンザイムのcDNAの塩基配列
配列番号８：タキプレウス・トリデンタツスのプロクロッティングエンザイムのアミノ酸配列
配列番号９：昆虫細胞での発現にコドンを最適化した、タキプレウス・トリデンタツスのファクターBのcDNAの塩基配列
配列番号１０：リムルス・ポリフェムスのファクターCのcDNAの塩基配列
配列番号１１：CHO細胞での発現にコドンを最適化した、リムルス・ポリフェムスのファクターCのcDNAの塩基配列
配列番号１２：リムルス・ポリフェムスのファクターCのアミノ酸配列
本出願は、２０１８年１０月３日付で日本国特許庁に出願された特願２０１８−１８８５８７号に基づく優先権を主張し、その内容は参照によって全体として本出願に組み込まれる。

Claims (13)

  1. ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来のエンドトキシンに対するエン
    ドトキシン測定剤の感度を増強させる方法であって、
    前記エンドトキシン測定剤は、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母、及び寄生性原生動物からなる群から選択される培養細胞を宿主とするカブトガニ由来ファクターC組換えタンパク
    質を含み、
    エンドトキシン測定時の前記ファクターC組換えタンパク質の含有量を、日本薬局方エ
    ンドトキシン標準品（大腸菌O113:H10由来のエンドトキシン）に対するヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの相対力価が200（EU/μg）以上となるのに十分な量に調整す
    ることを含む、方法。
  2. 前記エンドトキシン測定剤が、カブトガニ由来ファクターB組換えタンパク質を含む、
    請求項１に記載の方法。
  3. 前記エンドトキシン測定剤が、カブトガニ由来プロクロッティングエンザイム組換えタンパク質を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記エンドトキシン測定剤が検出用化合物を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来のエンドトキシンに対するエン
    ドトキシン測定剤の感度が増強されたエンドトキシン測定方法であって、
    前記エンドトキシン測定剤と被検体とを含むエンドトキシン測定試料を調製することを含み、
    前記エンドトキシン測定剤は、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母、及び寄生性原生動物からなる群から選択される培養細胞を宿主とするカブトガニ由来ファクターC組換えタンパク
    質を含み、
    前記感度は、前記エンドトキシン測定試料における前記ファクターC組換えタンパク質
    の濃度を、日本薬局方エンドトキシン標準品（大腸菌O113:H10由来のエンドトキシン）に対するヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの相対力価が200（EU/μg）以上とな
    るのに十分な量に調整することによって増強される、方法。
  6. 前記エンドトキシン測定剤が、カブトガニ由来ファクターB組換えタンパク質を含む、
    請求項５に記載の方法。
  7. 前記エンドトキシン測定剤が、カブトガニ由来プロクロッティングエンザイム組換えタンパク質を含む、請求項５または６に記載の方法。
  8. 前記エンドトキシン測定剤が検出用化合物を含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来のエンドトキシンに対する感度
    が増強されたエンドトキシン測定剤の製造方法であって、
    前記エンドトキシン測定剤は、カブトガニ由来ファクターC組換えタンパク質を含み、
    前記エンドトキシン測定剤における前記ファクターC組換えタンパク質の含有量を、日
    本薬局方エンドトキシン標準品（大腸菌O113:H10由来のエンドトキシン）に対するヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの相対力価が200（EU/μg）以上となるのに十分な
    量に調整することを含む、製造方法。
  10. カブトガニ由来ファクターCを含むエンドトキシン測定剤であって、
    当該カブトガニ由来ファクターCは、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母、及び寄生性原生動
    物からなる群から選択される培養細胞を宿主とする組換えタンパク質であり、
    日本薬局方エンドトキシン標準品（大腸菌O113:H10由来のエンドトキシン）に対するヘリコバクター・ピロリ由来エンドトキシンの相対力価が200（EU/μg）以上となるのに十
    分な量の前記カブトガニ由来ファクターCを含む、エンドトキシン測定剤。
  11. カブトガニ由来ファクターB組換えタンパク質、カブトガニ由来プロクロッティングエ
    ンザイム組換えタンパク質、および一般式Y-X-Zで表される検出用化合物を含む、請求項
    １０に記載のエンドトキシン測定剤：
    ただし、上記一般式中、Yは水素原子または保護基であり、Xは前記プロクロッティングエンザイム組換えタンパク質の基質となるアミノ酸配列を含むペプチドであり、ZはXから遊離すると光学検出できるようになる標識物質である。
  12. カブトガニ由来ファクターB組換えタンパク質、および一般式Y-X-Zで表される検出用化合物を含む、請求項１０に記載のエンドトキシン測定剤：
    ただし、上記一般式中、Yは水素原子または保護基であり、Xは前記ファクターB組換え
    タンパク質の基質となるアミノ酸配列を含むペプチドであり、ZはXから遊離すると光学検出できるようになる標識物質である。
  13. 一般式Y-X-Zで表される検出用化合物を含む、請求項１０に記載のエンドトキシン測定
    剤：
    ただし、上記一般式中、Yは水素原子または保護基であり、Xは前記ファクターCの基質
    となるアミノ酸配列を含むペプチドであり、ZはXから遊離すると光学検出できるようになる標識物質である。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20230145390A (ko) * 2021-02-12 2023-10-17 찰스리버레보레토리스,인코포레이티드 하이브리드 아메보사이트 용해물 및 그의 용도
CN114292896B (zh) * 2021-12-24 2023-08-22 四川大学华西医院 一种幽门螺杆菌药敏检测方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6645724B1 (en) * 1997-09-19 2003-11-11 National University Of Singapore Assays for endotoxin
WO2001027289A2 (en) * 1999-10-15 2001-04-19 National University Of Singapore Recombinant proteins and peptides for endotoxin biosensors, endotoxin removal, and anti-microbial and anti-endotoxin therapeutics
WO2002066631A1 (fr) * 2001-02-21 2002-08-29 Denka Seiken Co., Ltd. Anticorps capables de reconnaitre helicobacter pylori et procede de detection de helicobacter pylori
MX2012001312A (es) * 2009-07-31 2012-06-01 Nat Research Council Epitope externo de nucleo de lipopolisacarido de helicobacter pylori.
EP3273244B1 (en) 2011-02-28 2019-09-25 Seikagaku Corporation An agent for measuring endotoxin
US9205171B2 (en) 2012-07-24 2015-12-08 Zimmer, Inc. Hydrogen out gas of porous metal scaffold
EP2740791A1 (en) * 2012-12-05 2014-06-11 MicroCoat Biotechnologie GmbH Method for recombinant production of horseshoe crab Factor C protein in protozoa
SG11201504564TA (en) 2012-12-10 2015-08-28 Seikagaku Kogyo Co Ltd Novel recombinant factor c and method for producing the same, and method for measuring endotoxin
CN105866080B (zh) * 2016-04-05 2019-11-12 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 重组鲎三因子试剂及其检测内毒素的方法
EP3530670B1 (en) * 2016-10-18 2024-02-28 Seikagaku Corporation Method for producing endotoxin detecting agent comprising recombinant limulus factor c and use thereof
EP3591049B1 (en) * 2017-03-01 2023-11-22 Seikagaku Corporation Horseshoe crab factor b variant
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