JP7222511B2 - ペプチド及びその利用 - Google Patents
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項1.配列番号1で表されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基数が33以下である、ペプチド。
項2.配列番号1で表されるアミノ酸配列が、次の(1)~(6)の少なくとも1つの特徴を有する、項1に記載のペプチド、
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から1番目のXaaが、アスパラギンまたはセリン、
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から2番目のXaaが、アスパラギン、セリンまたはプロリン、
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から3番目のXaaが、トレオニン、グルタミン酸またはアラニン、
(4)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から4番目のXaaが、グルタミンまたはリシン、
(5)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から5番目のXaaが、アスパラギンまたはアラニン、
(6)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から6番目のXaaが、リシンまたはバリン。
項3.配列番号1で表されるアミノ酸配列が、前記(1)~(6)の特徴を有する、項1または2に記載のペプチド。
項4.配列番号1で表されるアミノ酸配列が、次の(1’)~(6’)または(1’’)~(6’’)の特徴を有する、項1~3のいずれかに記載のペプチド、
(1’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から1番目のXaaがアスパラギン、
(2’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から2番目のXaaが、アスパラギンまたはセリン、
(3’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から3番目のXaaが、トレオニン、グルタミン酸またはアラニン、
(4’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から4番目のXaaが、グルタミンまたはリシン、
(5’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から5番目のXaaが、アスパラギン、及び
(6’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から6番目のXaaが、リシン、
(1’’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から1番目のXaaが、アスパラギンまたはセリン、
(2’’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から2番目のXaaが、プロリン、
(3’’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から3番目のXaaが、グルタミン酸、
(4’’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から4番目のXaaが、グルタミン、
(5’’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から5番目のXaaが、アラニン、及び
(6’’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から6番目のXaaが、バリン。
項5.配列番号1で表されるアミノ酸配列が、配列番号2~7からなる群より選択される少なくとも1種で表されるアミノ酸配列からなる、項1~4のいずれかに記載のペプチド。
項6.配列番号8~12からなる群より選択される少なくとも1種で表されるアミノ酸配列を含む、項1~5のいずれかに記載のペプチド。
項7.項1~6のいずれかに記載するペプチドを含有する、血清中または尿中の抗ピロリ菌抗体検出または定量用組成物。
項8.項1~6のいずれかに記載するペプチドを含有する、血清中または尿中の抗ピロリ菌抗体検出または定量用キット。
項9.採取された血清または尿と項1~6のいずれかに記載するペプチドとを接触させる工程を含む、血清中または尿中の抗ピロリ菌抗体を検出または定量する方法。
Xaa-Xaa-Xaa-Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala-Xaa-Val-Xaa-Lys-Lys-Xaa
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から1番目のXaaが、アスパラギンまたはセリン、
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から2番目のXaaが、アスパラギン、セリンまたはプロリン、
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から3番目のXaaが、トレオニン、グルタミン酸またはアラニン、
(4)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から4番目のXaaが、グルタミンまたはリシン、
(5)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から5番目のXaaが、アスパラギンまたはアラニン、
(6)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から6番目のXaaが、リシンまたはバリン。
(1’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から1番目のXaaがアスパラギン、
(2’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から2番目のXaaが、アスパラギンまたはセリン、
(3’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から3番目のXaaが、トレオニン、グルタミン酸またはアラニン、
(4’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から4番目のXaaが、グルタミンまたはリシン、
(5’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から5番目のXaaが、アスパラギン、及び
(6’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から6番目のXaaが、リシン;
(1’’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から1番目のXaaが、アスパラギンまたはセリン、
(2’’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から2番目のXaaが、プロリン、
(3’’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から3番目のXaaが、グルタミン酸、
(4’’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から4番目のXaaが、グルタミン、
(5’’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から5番目のXaaが、アラニン、及び
(6’’)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から6番目のXaaが、バリン。
1.ペプチドの作製
ペプチドの合成を外注することにより、合計87種のペプチド(各ペプチドのアミノ酸残基数19~20)を合成した。
2-1.ペプチド及び検量線用抗体の準備
合成したペプチドを1nmol/μLの濃度でDMSO(Dimethyl sulfoxide)に溶解後、9倍量のPBSを添加して、ペプチド濃度100pmol/μLとなるように希釈し、ペプチドストック液として凍結保存した。PBSの組成は次の通りである。0.35g NaH2PO4、1.28g Na2HPO4及び8g NaCl含有の1L水溶液(pH7.4)。
本試験例では試料として血清を用いた。具体的には、倫理審査を経て、同一被験者から胃内視鏡下で採取された胃生検試料を用いて、ピロリ菌の培養と組織染色を行った。培養下でピロリ菌株の分離ができたか組織染色下でピロリ菌が確認されたか、または、これらの両方が可能であった場合にHp(+)(Positive試料)とした。どちらも出来なかった場合をHp(-)とした。最終的に、Hp(+)ヒト血清62試料、Hp(-)ヒト血清128試料を本試験において用いた(合計190試料)。
前述のようにして調製したペプチドストック液を、50mM炭酸緩衝液(Na2CO3-NaHCO3 buffer (pH 9.6))にて10倍希釈し(0.1pmol/μL)、得られた溶液を、96ウエルのELISAプレート(Immobilizer-Amino Plate & Modules (Nunc Cat.#436013))にそれぞれ100μLずつ分注した(10pmol/ウエル)。抗体検出の検量線用には、同様に対照ペプチド(0.1pmol/μL)を6ウエルに分注した。陰性コントロールとしてBSA50μg/wellを、2次抗体の陽性コントロールとして、ヒトIgG抗体10pmol/ウエルを分注した。分注後、ELISAプレートを遮光し、4℃にて一晩振盪しながら、ペプチドをプレートに固定させた。
前記2-3においてペプチドを固定したプレートの溶液を捨て、300μLの0.1%Tween20添加PBS(PBS-0.1T)にて各ウエルを3回洗浄した。各ウエルに100μLマスキング溶液(100mMエタノールアミンを50mM炭酸緩衝液に溶解)を添加し、室温で1時間緩やかに振盪してマスキングを行った。300μL PBS-0.1Tにて各ウエルを3回洗浄後、100μLブロッキング溶液(2%牛血清アルブミンをPBSに溶解)を各ウエルに添加して、1時間振盪した。次に、ブロッキング溶液を捨て、各ウェルに100μL血清液(前述のようにして準備した血清をブロッキング液で200倍希釈)を加え、5分間強く振盪した後、2時間室温にて緩やかに振盪した。続いて血清液を捨て、300μL PBS-0.1Tにて5回洗浄後、100μL二次抗体液(西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体をブロッキング液にて4000倍希釈)を添加し、1時間緩やかに振盪した。二次抗体を捨て、300μL PBS-0.1Tにて5回洗浄後、ペルオキシダーゼ基質であるTMB溶液を各ウエルに100μLずつ添加し、暗下で5分間反応させて青色に発色させた後、1規定塩酸を100μL添加して、反応を停止させた。黄色の反応液はプレートリーダーを用い、450nmの波長で抗体量を測定し、検量線と照らし合わせて定量した。
3-1.代表的な血清を用いた全ペプチドELISAの結果
前述のように分類した3つのグループ(Negative試料、Positive試料、Eradicated試料)において、まず各グループのうち9~10個の血清を用いて、全ペプチドに対するELISA解析を行った。その結果、Negative試料に対しPositive試料で有意に(p<0.01)高い反応が17種のペプチドで認められた。また、Positive試料に対し、Eradicated試料で有意に(p<0.01)低い反応が11種のペプチドで認められた。
前記3-1において最も高い反応が認められた3種ペプチド(それぞれ配列番号8、9及び14のペプチド)について、全ての血清(Positive 62試料、Negative 57試料、Eradicate 71試料)を用いたELISA解析を行った。
1.手順
前記試験例1において得られた配列番号8、9のペプチドにおいて、共通する配列が認められた。そこで、これらのアミノ酸配列のどの部分が抗体との反応に重要であるのかについて検討した。具体的には、前記配列番号8、9のペプチドのアミノ酸配列に基づいて、更に複数種のペプチドを作製した。これらのペプチドの作製は、前記試験例と同様に外注した。作製したペプチドについて、前述と同様の手順にて、抗原抗体反応を行った。
結果を表1に示す。
AGQATSPEEPIYAQVAKKV(配列番号9)
NNEEPIYAKVNKKK(配列番号4)
NNEEPIYAQVNKKK(配列番号5)
SPEEPIYAQVAKKV(配列番号6)
NPEEPIYAQVAKKV(配列番号7)
NGLKNNTEPIYAQVNKKKA(配列番号10)
SPEEPIYAQVAKKVSAKID(配列番号11)
Claims (4)
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基数が33以下であって、次の(1)又は(2)に記載する特徴を有するペプチド:
(1)前記配列番号1で表されるアミノ酸配列が、配列番号6もしくは7で表されるアミノ酸配列からなる、
(2)前記ペプチドが、配列番号8~12からなる群より選択される少なくとも1種で表されるアミノ酸配列を含む。 - 請求項1に記載するペプチドを含有する、血清中または尿中の抗ピロリ菌抗体検出または定量用組成物。
- 請求項1に記載するペプチドを含有する、血清中または尿中の抗ピロリ菌抗体検出または定量用キット。
- 採取された血清または尿と請求項1に記載するペプチドとを接触させる工程を含む、血清中または尿中の抗ピロリ菌抗体を検出または定量する方法。
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Judith Lind,PLOS One,2014年,9(5) ,e96488 |
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