CN108727478B - 一种ibv特异性多肽抗原、抗体、elisa检测试剂盒及其应用 - Google Patents
一种ibv特异性多肽抗原、抗体、elisa检测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种鸡传染性支气管炎病毒(IBV)特异性多肽抗原，所述IBV特异性多肽抗原具有氨基酸序列如SEQ ID NO：1~9中的任意一条或几条所示，或者具有经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列。本发明还公开了一种IBV特异性多肽抗原组合物。本发明还公开了一种IBV抗体及其制备方法。本发明还公开了一种ELISA检测试剂盒及其检测方法和应用。该抗原表位具有很好的抗体反应性，可以用来特异性检测抗IBV的抗体，具有应用价值。
Description
技术方案
本发明属于生物技术检测技术领域，具体涉及一种IBV特异性多肽抗原、IBV抗体、ELISA检测试剂盒及其应用。
背景技术
鸡传染性支气管炎病毒(IBV)为γ冠状病毒，可引起肉用鸡严重的呼吸道和肾脏病变以及蛋鸡的产蛋下降，同时传播迅速，给养禽生产带来巨大的经济损失。由于冠状病毒特殊的转录机制，导致新的变异株和血清型不断产生，使该病的防制变得十分困难。目前用于检测IBV抗体的方法有IFA、ELISA、HI等方法，后两者适于大规模检测。然而由于所用抗原的差异，常常出现不同的检测结果，常用的商品化ELISA试剂盒是应用提纯的病毒经适当处理，用于抗原包被，也有学者采用基因融合表达蛋白作为包被抗原，但这些方法常因为抗原的纯度问题引起批间差异较大或非特异性。最重要的是IBV由于毒株的血清型不同，交叉反应的能力也不相同，有时因为某几个氨基酸的改变而改变了整个检测的结果，因此常出现试剂盒不能检测不同血清型抗体。
ELISA检测技术的原理：ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体上进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，加入酶标底物后，底物被酶催化成有颜色的产物，产物的量与待检物的量直接相关，故可以用分光光度计(酶标仪)加以测定进行定量或定性的分析，由于酶的催化效率很高，间接放大了免疫反应的结果，使测定方法敏感度大大提高，该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。
发明内容
发明目的：基于上述存在的问题，本发明选取决定传染性支气管炎病毒血清型的S基因的S2片段，选取抗原性、亲水性较好的保守序列进行多肽抗原合成，以合成的多肽为抗原，通过大量不同毒株血清的交叉反应测定，确定了特异性多肽，建立了简单快捷的ELISA方法特异性检测IBV抗体的方法，效果好，成本低。
本发明所要解决的技术问题是提供了一种IBV特异性多肽抗原。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种IBV特异性多肽抗原组合物。
本发明还要要解决的技术问题是提供了一种IBV抗体及其制备方法和检测方法。
本发明还要要解决的技术问题是提供了所述的IBV特异性多肽抗原或所述的IBV特异性多肽抗原组合物在制备IBV检测试剂盒方面的应用。
本发明最后要解决的技术问题是提供了一种ELISA检测试剂盒。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种IBV特异性多肽抗原，所述IBV特异性多肽抗原具有氨基酸序列如SEQ ID NO：1～9中的任意一条或几条所示，或者具有经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列。
作为优选，所述IBV特异性多肽抗原具有氨基酸序列如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示。
本发明内容还包括一种IBV特异性多肽抗原组合物，所述IBV特异性多肽抗原组合物为具有氨基酸序列SEQ ID NO：7的IBV特异性多肽抗原分别和任意一条具有氨基酸序列SEQ ID NO：1～6的IBV特异性多肽抗原的组合，和/或具有氨基酸序列SEQ ID NO：6的IBV特异性多肽抗原分别和任意一条具有氨基酸序列SEQ ID NO：1～5的IBV特异性多肽抗原的组合。
作为优选，所述IBV特异性多肽抗原组合物SEQ ID NO：6+SEQ ID NO：1组合所示为最佳组合。
同时，本发明也可以用该多肽制备高效价的IBV特异性抗体。本发明内容还包括一种IBV抗体，所述抗体特异性的与所述的IBV特异性多肽抗原结合，和/或与所述的IBV特异性多肽抗原组合物结合。
本发明内容还包括一种IBV抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)将上述优选多肽或多肽组合物与载体蛋白如牛血清白蛋白或血蓝蛋白偶联，再与佐剂混合；
2)免疫小鼠、鸡或其他实验动物；
3)经2-3次免疫后即可产生抗IBV特异性抗体。
本发明的该IBV抗体可以与IBV发生特异性结合。
本发明内容还包括一种IBV抗体的检测方法，包括以下步骤：
1)将所述的多肽抗原或所述的IBV特异性多肽抗原组合物包被酶标板，包被后用兔血清封闭；
2)待检血清稀释后与包被的多肽抗原相互作用；
3)洗涤多次后，加入HRP标记的兔抗鸡二抗共同孵育；
4)再次洗涤多次，加TMB显色液反应；
5)最后用硫酸或0.1％SDS终止反应，以450nm或650nm波长下读取OD值，检测出个体中IBV抗体水平。
本发明内容还包括所述的IBV特异性多肽抗原或所述的IBV特异性多肽抗原组合物在制备IBV检测试剂盒方面的应用。
本发明上述的IBV抗体的检测方法即为一种IBV特异抗体的ELISA检测方法，并可应用于特异性检测IBV抗体的间接ELISA检测试剂盒制备。该试剂盒可以检测出目前商品试剂盒检测不出的IBV抗体。本发明所述的ELISA检测法是指酶联免疫分析，即利用了多肽抗原可以特异性结合待检血清中的IBV抗体，然后加入HRP标记的二抗检测，最后读取波长450nm或650nm的OD值，按照此方法便可检测出个体中IBV抗体水平，在临床上也可以用于免疫鸡群抗体水平的评估。
本发明内容还包括一种ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的IBV特异性多肽抗原或所述的IBV特异性多肽抗原组合物。
其中，所述试剂盒包括以下组分：包被所述的IBV特异性多肽抗原或所述的IBV特异性多肽抗原组合物的酶标板、酶标抗体、底物溶液、终止液、洗涤液、阴性对照和阳性对照。
其中，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgG。
其中，所述底物溶液为柠檬酸溶液和Na2HPO4·12H2O混匀，加入四甲基联苯胺得到的溶液。
具体的，所述底物液配制：100mmol/L的柠檬酸溶液((21g柠檬酸溶于去离子水，定容至1L)24.3mL，200mmol/LNa2HPO4·12H2O(71.6g Na2HPO4·12H2O溶于去离子水，定容至1L)25.7mL混匀，加入50mg的四甲基联苯胺(TMB)，临用前加入50μL的30％H2O2。
终止液1％SDS：分别取蒸馏水100.0mL和1.0g SDS粉混合即可。
洗涤液：1000mL10mmo1/L pH7.4的PBS中加入0.5mL Tween-20；
阴性对照：SPF鸡血清；
阳性对照：SPF鸡抗IBV特异性血清。
有益效果：本发明所使用的多肽抗原为抗原性比较好的IBVS基因S2段多肽特异性的序列合成，经过氨基酸的替换、缺失、增加等方式获得。应用该氨基酸序列设计合成的多肽抗原可以应用于IBV的抗体检测，与其他方法比较，此方法具有快速安全可靠，可操作性高的优点。利用多肽抗原作为抗原检测样本中的特异性抗体，使得试剂盒的制备和样品的检测更加快速简便，在免疫鸡传染性支气管炎病毒疫苗的免疫鸡群中可以用作为评价疫苗水平的指标。应用本发明合成的多肽抗原免疫动物，可以产生相应的特异性单一抗体。本发明选取抗原性、亲水性较好的保守序列进行多肽抗原合成，以合成的多肽为抗原，通过大量不同毒株血清的交叉反应测定，确定了特异性多肽，建立了简单快捷的ELISA方法特异性检测IBV抗体的方法，效果好，成本低。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于申请所附权利要求书所限定的范围。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
利用生物软件分析IBV的S2的氨基酸序列，从亲水性，抗原指数，表面位点指数，以及S2蛋白的保守性确定几段可能的抗原性片段，分别为
NO:1，NCPYVSYGKFCIKPDGSIST
NO:2，CGKKSSYYTTFDNDVVTEQYRPKKSVC
NO:3，CSQQRELATQKINECVKSQSIRC
NO:4，CNLTVTDEYIQTRMDKVQINCLQYICGNSLEC
NO:5，CQQYGPVCDNILSVVNSVGQKEDMELLNFYSSTKPAGC
NO:6，SCPYVSYGRFCIQPDGSIKQ
NO:7，SCPYVSYGRFCIKPDGSIKQ
NO:8，SCPYVSYGRFCIQPDG
NO:9，YVSYGRFCIQPDGSIKQ
将NO：1～NO：9送上海杰肽生物科技有限公司进行多肽抗原合成，采用IBV特异性抗体ELISA检测方法的步骤包被上述多肽抗原，具体包括以下步骤：
1)分别将所述的多肽抗原包被酶标板，包被后用兔血清封闭；
2)待检血清稀释后与包被的多肽抗原相互作用；
3)洗涤多次后，加入HRP标记的兔抗鸡二抗共同孵育；
4)再次洗涤多次，加TMB显色液反应；
5)最后用硫酸或0.1％SDS终止反应，以650nm波长下读取OD值，检测出个体中IBV抗体水平。
检测江苏省预防兽医重点实验室制备并保存的不同基因型IBV的阳性血清及SPF鸡血清，实施例中的所有结果均为OD650的平均值，结果显示如下：
表1
通过该ELISA检测OD值发现选择的五段多肽，NO.1多肽可以与更多基因型的IBV阳性血清抗体反应，说明NO.1的反应最好，NO.1可以和江苏省预防兽医重点实验室制备并保存的M41、CK/CH/2014/FJ14、CK/CH/2014/QL1403、4/91株IBV阳性血清反应，但是与CK/CH/2010/JT1株IBV的阳性血清不反应。而IDEXX进口试剂盒只能检测出经典毒株的阳性抗体。
实施例2
由于ELISA检测OD值发现选择的五段多肽，NO.1多肽的反应最好，可以和M41、CK/CH/2014/FJ14、CK/CH/2014/QL1403、4/91株血清反应，但是与CK/CH/2010/JT1株的血清不反应。因此我们选择CK/CH/2010/JT1株的多肽序列NO:6SCPYVSYGRFCIQPDGSIKQ，并对其中一个氨基酸进行突变得到NO:7SCPYVSYGRFCIKPDGSIKQ，采用同实施例1相同的方法检测不同基因型IBV血清，实施例中的所有结果均为OD650的平均值,结果如下：
表2
应用实施例1的IBV特异性抗体的ELISA检测方法，分别以NO.1、NO:6、NO:7为包被抗原检测江苏省预防兽医重点实验室制备并保存的不同基因型IBV的阳性血清及SPF鸡血清，结果显示，CK/CH/2010/JT1株IBV多肽抗原NO:6及其突变一个氨基酸的多肽抗原NO:7可以与各基因型IBV阳性血清反应。
实施例3
根据实施例2的ELISA检测OD值结果显示，CK/CH/2010/JT1多肽抗原可以与各基因型IBV阳性血清反应，我们将反应性最好的多肽NO:6缩短后面四个氨基酸为NO:8SCPYVSYGRFCIQPDG，缩短前面三个氨基酸为NO:9YVSYGRFCIQPDGSIKQ，与不同毒株IBV的阳性血清反应，实施例中的所有结果均为OD650的平均值，结果如下：
表3
ELISAOD值结果显示多肽NO:6缩短氨基酸后，多肽NO：8和NO：9与不同基因型IBV阳性血清反应性的OD650值均有不同程度的降低，同时与4/91株阳性血清不反应，所以多肽NO：8和NO：9的反应性没有多肽NO：6的反应好。
实施例4
将不同多肽抗原混合包被或与BSA偶联包被，结果发现，多肽抗原NO:6和多肽抗原NO:7与偶联的多肽抗原，或与上述不同多肽混合都能显示出很好的结果。实施例中的所有结果均为OD650的平均值，结果如下：
表4
表5
表6
表4结果显示，NO:7与NO:1～6混合包被酶标板作为抗原，均能与不同基因型IBV阳性血清反应，其中NO:7+NO:1多肽抗原组合，与不同基因型IBV阳性血清反应的OD值最高，所以表明NO:7+NO:1多肽抗原组合反应性最好。
表5结果显示，NO:6与NO:1～5混合包被酶标板作为抗原，均能与不同基因型IBV阳性血清反应，其中NO:6+NO:1多肽抗原组合，与不同基因型IBV阳性血清反应的OD值最高，所以表明NO:6+NO:1多肽抗原组合反应性最好。
表6结果显示，BSA-NO:1单独或与NO:6、NO:7混合包被酶标板作为抗原，均能与不同基因型IBV阳性血清反应，其中NO:6+BSA-NO:1多肽抗原组合，与不同基因型IBV阳性血清反应的OD值最高，所以表明NO:6+BSA-NO:1多肽抗原组合反应性最好。
综合比较表4、表5、表6结果，NO:6+NO:1多肽抗原组合，与不同基因型IBV阳性血清均有反应，且反应的OD值最高，所以表明NO:6+NO:1多肽抗原组合反应性最好。
实施例5多肽抗原组建试剂盒
以上述反应性好的多肽抗原NO:6或NO:7组建试剂盒，组成如下：
1、包被多肽抗原的酶标板
2、酶标抗体：辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgG
3、底物液配制：100mmol/L的柠檬酸溶液((21g柠檬酸溶于去离子水，定容至1L)24.3mL，200mmol/LNa2HPO4·12H2O(71.6g Na2HPO4·12H2O溶于去离子水，定容至1L)25.7mL混匀，加入50mg的四甲基联苯胺(TMB)，临用前加入50μL的30％H2O2。
4、终止液1％SDS：分别取蒸馏水100.0mL和1.0g SDS粉混和即可。
5、洗涤液：1000mL10mmo1/L pH7.4的PBS中加入0.5mL Tween-20；
6、阴性对照(SPF鸡血清)和阳性对照(SPF鸡抗IBV阳性血清)。
实施例6
将多肽抗原NO:6包被，应用实施例1的IBV特异性抗体ELISA检测方法，检测M41、CK/CH/2014/FJ14、CK/CH/2014/QL1403株IBV人工感染后不同日龄鸡血清，实施例中的所有结果均为OD650的平均值，检测结果如下：
表7
应用多肽抗原NO:6组建的IBV特异性抗体ELISA检测试剂盒，检测M41株、CK/CH/2014/FJ14株、QL14O3株IBV攻毒14日龄SPF鸡后不同时间点采集的鸡血清，结果显示，在M41株IBV攻毒21天后的血清中，可以检测到IBV特异性抗体，CK/CHL/2014/CK/CH/2014/FJ14株IBV攻毒14天后的血清中，可以检测到IBV特异性抗体，CK/CH/2014/CK/CH/2014/QL1403株IBV攻毒7天后的血清中，可以检测到IBV特异性抗体。
实施例7
将多肽抗原NO:7包被，应用实施例1的IBV特异性抗体ELISA检测方法，检测M41、CK/CH/2014/FJ14、CK/CH/2014/QL1403株IBV人工感染后不同日龄鸡血清，实施例中的所有结果均为OD650的平均值，检测结果如下：
表8
应用多肽抗原NO:7组建的IBV特异性抗体ELISA检测试剂盒，检测M41株、CK/CH/2014/FJ14株、QL14O3株IBV攻毒14日龄SPF鸡后不同时间点采集的鸡血清，结果显示，在M41株IBV攻毒21天后的血清中，可以检测到IBV特异性抗体，CK/CHL/2014/CK/CH/2014/FJ14株IBV攻毒14天后的血清中，可以检测到IBV特异性抗体，CK/CH/2014/CK/CH/2014/QL1403株IBV攻毒7天后的血清中，可以检测到IBV特异性抗体。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种IBV特异性多肽抗原、其抗体、ELISA检测试剂盒及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asn Cys Pro Tyr Val Ser Tyr Gly Lys Phe Cys Ile Lys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Ser Ile Ser Thr
20
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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1 5 10 15
Thr Glu Gln Tyr Arg Pro Lys Lys Ser Val Cys
20 25
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Cys Ser Gln Gln Arg Glu Leu Ala Thr Gln Lys Ile Asn Glu Cys Val
1 5 10 15
Lys Ser Gln Ser Ile Arg Cys
20
<210> 4
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Cys Asn Leu Thr Val Thr Asp Glu Tyr Ile Gln Thr Arg Met Asp Lys
1 5 10 15
Val Gln Ile Asn Cys Leu Gln Tyr Ile Cys Gly Asn Ser Leu Glu Cys
20 25 30
<210> 5
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Cys Gln Gln Tyr Gly Pro Val Cys Asp Asn Ile Leu Ser Val Val Asn
1 5 10 15
Ser Val Gly Gln Lys Glu Asp Met Glu Leu Leu Asn Phe Tyr Ser Ser
20 25 30
Thr Lys Pro Ala Gly Cys
35
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 7
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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20
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Tyr Val Ser Tyr Gly Arg Phe Cys Ile Gln Pro Asp Gly Ser Ile Lys
1 5 10 15
Gln
Claims (7)
1.一种IBV特异性多肽抗原，其特征在于，所述IBV特异性多肽抗原氨基酸序列如SEQID NO：6或SEQ ID NO：7所示。
2.一种IBV特异性多肽抗原组合物，其特征在于，所述IBV特异性多肽抗原组合物为氨基酸序列SEQ ID NO：7的IBV特异性多肽抗原分别和任意一条氨基酸序列SEQ ID NO：1~6的IBV特异性多肽抗原的组合，和/或氨基酸序列SEQ ID NO：6的IBV特异性多肽抗原分别和任意一条氨基酸序列SEQ ID NO：1~5的IBV特异性多肽抗原的组合。
3.权利要求1所述的IBV特异性多肽抗原或权利要求2所述的IBV特异性多肽抗原组合物在制备IBV检测试剂盒方面的应用。
4.一种ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述ELISA检测试剂盒包括权利要求1所述的IBV特异性多肽抗原或权利要求2所述的IBV特异性多肽抗原组合物。
5.根据权利要求4所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述ELISA检测试剂盒包括以下组分：包被权利要求1所述的IBV特异性多肽抗原或权利要求2所述的IBV特异性多肽抗原组合物的酶标板、酶标抗体、底物溶液、终止液、洗涤液、阴性对照和阳性对照。
6.根据权利要求5所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgG。
7.根据权利要求6所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述底物溶液为柠檬酸溶液和Na2HPO4·12H2O混匀，加入四甲基联苯胺得到的溶液。
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| Identification of previously unknown antigenic epitopes on the S and N proteins of avian infectious bronchitis virus;J. Ignjatovic et al;《Arch Virol》;20050502;1813-1831 * |
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