CN113416247A - 沙门菌鞭毛蛋白抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

沙门菌鞭毛蛋白抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种沙门菌鞭毛蛋白抗体及其制备方法和应用，所述抗体包括重链和轻链，所述轻链包括三个互补决定区。本发明还提供了所述单抗的制备方法及应用。本发明所提供的单克隆抗体具有效价高、特异性强的优势。本发明采用基于沙门菌鞭毛蛋白单抗的阻断ELISA方法可快速准确地检测出多种感染不同血清型沙门菌的血清样品，与现有技术相比，缩短了检测时间、简化了检测步骤、拥有高通量及广谱性，为快速、高效检测多种不同血清型沙门菌提供了可靠的免疫学技术。

Description

沙门菌鞭毛蛋白抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种杂交瘤细胞株，并进一步涉及通过该杂交瘤细胞株制备获得的抗沙门菌鞭毛蛋白检测抗体以及检测方法和应用。
背景技术
沙门菌(Salmonella)是一种重要的人兽共患病原菌，在全球范围内广泛分布，目前已发现2600多种血清型。在过去几十年中由其引发的食物中毒事件屡屡发生，造成了严重的公共卫生问题。根据食品和饲料快速警报系统(RASFF)的报告，沙门菌发病率从2006年到2018年反而一直在逐年增长。引起人类感染的常见沙门菌主要有肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、圣保罗沙门菌、海德堡沙门菌、纽波特沙门菌、德尔卑沙门菌等多种血清型沙门菌。还有一些血清型虽不常见，却有更强的致病性，如猪霍乱沙门菌、都柏林沙门菌等亦能引起严重疾病。因此，对沙门菌采取可靠、高效的检测手段尤为重要。
传统的细菌分离培养实验是检验沙门菌的金标准，但该技术耗时较长，不能满足快速检测需求。基于核酸的分子检测技术耗时较短，灵敏度更高，但容易受到样品种类、模板和引物等多种因素影响，对仪器设备要求较高；且与传统方式一样，只能检测抗原，需要细菌的分离培养。免疫学检测方法以其可以实现血清检测、特异性强及高通量等优势被广泛研究。但目前的沙门菌检测方法，多为针对一种或几种血清型沙门菌，而沙门菌血清型的多样性使检测容易出现假阴性结果，因此，建立可同时检测不同沙门菌血清型的检测方法十分必要。
沙门菌鞭毛蛋白存在于沙门菌属(除鸡白痢/鸡伤寒沙门菌)的所有血清型中，不同血清型沙门菌共有的鞭毛蛋白已被证实是理想的广谱诊断靶标。本发明选用沙门菌鞭毛蛋白作为免疫原，制备识别沙门菌鞭毛蛋白单克隆抗体，建立快速检测沙门菌阻断ELISA检测方法，实现对不同血清型沙门菌的快速、高效检测，对于禽类的生产、有关疾病的防治等均具有重要意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种沙门菌的检测抗体以及检测方法，用于解决现有技术中沙门菌检测耗时长，灵敏度和特异性低的问题，本发明所述的沙门菌鞭毛蛋白抗体及其阻断ELISA方法灵敏度高，并拥有广谱性、高通量，并缩短了检测时间，简化了检测步骤。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种沙门菌鞭毛蛋白抗体，所述抗体包括重链和轻链，所述轻链包括三个互补决定区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示，所述重链包括三个互补决定区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示。
进一步地，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明的另一方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上所述抗体。
进一步地，所述多核苷酸中编码所述轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述多核苷酸中编码所述重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明的另一方面提供了一种重组表达载体，所述表达载体中含有上述多核苷酸。
本发明的另一方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有或者整合有上述重组表达载体。
本发明的另一方面提供了上述抗体、多核苷酸、重组表达载体以及宿主细胞用于检测鸡源沙门菌的应用。
本发明的另一方面提供了一种鸡源沙门菌阻断ELISA检测组合物，所述组合物包括上所述的抗体。
进一步地，所述组合物还包括包被有鞭毛蛋白的固相载体、沙门菌阳性血清和阴性血清、包被液、封闭液。
进一步地，所述组合中还含有稀释液、洗涤液、TMB显色液、反应终止液等本领域人员采用阻断ELISA检测的一般实验材料。
进一步地，所述抗体为酶标抗体，所述酶标抗体为HRP标记的针对沙门菌鞭毛蛋白的IgG抗体。
所述固相载体用于制备酶标板，所述酶标板的制备方法为：采用方阵滴定法，用包被液将制备的里森沙门菌鞭毛蛋白稀释，并加入酶标板各孔进行包被；然后用洗涤液洗涤后每孔加入封闭液进行封闭，再用洗涤液洗涤；然后将板拍干得到包被有肠炎沙门菌鞭毛蛋白的酶标板。
进一步的，所述包被液可以为pH 9.6的碳酸盐缓冲液；所述洗涤液为pH 7.2的PBST溶液；所述的封闭液为5％脱脂奶粉；所述稀释液为含有1％BSA的PBS溶液；所述的反应终止液为1mol/L的H2SO4溶液。
本发明的另外一个方面提供了一种鸡源沙门菌抗体阻断ELISA检测方法，所述方法包括采用包括上述抗体检测鸡源沙门菌。
进一步地，所述抗体为酶标抗体，所述酶标抗体为HRP标记的针对沙门菌你鞭毛蛋白的IgG抗体。
进一步地，所述方法具体包括以下步骤：
(1)将检测抗原用包被液稀释，用洗涤液洗涤，封闭，洗涤；
(2)加入用封闭液稀释后的沙门菌阴性血清和阳性血清，孵育；
(3)加入用稀释液稀释的HRP标记的针对沙门菌鞭毛蛋白的抗体，孵育，洗涤；
(4)加入显色液，显色后加入终止液，检测OD450值，分析结果。
进一步地，所述方法具体可以为以检测抗原(里森沙门菌鞭毛蛋白)采用方阵滴定法，用包被液将其稀释后，加入酶标板各孔，包被后用洗涤液洗涤；每孔再加入封闭液封闭后用洗涤液洗涤；将用封闭液稀释后的沙门菌阴性血清和阳性血清加入封闭好的酶标板中，孵育；加入稀释液稀释的HRP标记的针对沙门菌鞭毛蛋白抗体，孵育后用洗涤液洗涤；最后加入TMB显色液，避光显色后，向每孔加入反应终止液，用酶标仪读取OD450处的吸光度值；计算阻断率PI＝(1-血清样品的OD450值/空白对照的OD450)×100％，PI≥26.68％为阳性，PI<26.68％为阴性。
进一步的，所述包被液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)；所述洗涤液为pH 7.2的PBST溶液；所述稀释液为含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液；所述的反应终止液为1mol/L的H2SO4溶液。
进一步的，所述抗原包被浓度为2μg/mL；包被时间为12h；所述封闭液为5％脱脂奶粉，封闭时间为2.5h。
进一步的，沙门菌阴性血清和阳性血清的稀释度为1:12；血清阻断时间为1h。
进一步的，HRP标记的沙门菌鞭毛蛋白单抗的稀释倍数为1:4000，孵育时间为0.5h。
进一步的，将用稀释液稀释后的沙门菌阴性血清和阳性血清分别加入封闭后的酶标板中，于37℃孵育1h；加入用稀释液稀释的HRP标记的针对沙门菌鞭毛蛋白的抗体，于37℃孵育，孵育时间为30min；每孔再加入TMB显色液，于37℃孵育，孵育时间为6min。
进一步的，显色时间为6min。
进一步的，分析结果是指计算阻断率PI＝(1-血清样品的OD450/空白对照的OD450)×100％，血清样品的PI≥26.68％时判为阳性；PI<26.68％时判为阴性。
本发明的鸡源沙门菌的检测抗体以及检测方法，具有以下有益效果：
本发明为基于针对沙门菌鞭毛蛋白单抗的阻断ELISA方法。与现有技术相比，本发明所述的沙门菌鞭毛蛋白抗体及其阻断ELISA方法拥有广谱性、高通量，特异性好，灵敏性高，并缩短了检测时间，并简化了检测步骤。因此，本发明为鸡源沙门菌抗体的检测提供了一种灵敏快捷的检测方法，为沙门菌的防控和净化提供了一种重要的检测手段。
附图说明
图1为单抗1F6与鞭毛蛋白反应性鉴定；
图2为单抗1F6与沙门菌特异性鉴定；
图3为ROC曲线分析及敏感性、特异性分析；
图4为阻断ELISA特异性分析结果；
图5为阻断ELISA检测限分析结果。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1：杂交瘤细胞株的获得
1.1动物免疫
具体免疫程序如下：将沙门菌鞭毛蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化后进行对小鼠进行首次免疫，80μg/只，采用腹部皮下多点注射；14天后，进行第二次免疫，80μg/只，将鞭毛蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化后进行腹部皮下多点注射。二免7天后，对小鼠采血检测血清抗体效价。二免14天后，取不加佐剂的鞭毛蛋白腹腔注射小鼠，进行加强免疫。
1.3细胞融合
加强免疫3天后，对小鼠采血，收集血清于-20℃保存，用于后续筛选的阳性对照。按照生物安全方法处死小鼠，酒精浸泡消毒，取脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0以1:5的细胞比例在聚乙二醇PEG50％作用下融合。用ICR小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，将融合好的细胞与饲养细胞用HAT培养基悬浮混匀铺于96孔板中，置于37℃细胞培养箱中培养。5天后补加HAT培养基，9天后换用HT培养基进行培养。
1.4间接ELISA检测方法的建立和阳性克隆的筛选
采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆。具体方法如下：按照方阵试验确定的抗原最适包被浓度包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜；PBST洗涤3次，加入含1％BSA的PBS封闭液，每孔200μL，于37℃孵育2h；封闭结束后，PBST洗涤3遍，加入杂交瘤细胞上清，以SP2/0细胞上清作为阴性对照，免疫鼠多抗血清作为阳性对照，100μL/孔，37℃水浴2h；PBST洗涤5次，加入工作浓度的辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃水浴1h；洗涤7次后，加TMB显色5min，显色终止后，酶标仪检测OD450值，根据以下公式判定实验结果：OD450细胞孔/OD450阴性孔≥2.1判定为阳性孔。将筛选的阳性克隆命名为1F6。
1.6阳性杂交瘤细胞的克隆化
采用有限稀释法对筛选到的阳性细胞克隆1F6进行3次亚克隆并进行保存。
实施例2：沙门菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备
2.1单抗腹水制备及纯化
采用体内诱生腹水法。9-12周龄健康BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7-10天后，分别腹腔接种经PBS稀释的培养至对数期生长的杂交瘤细胞1F6，2×105个细胞/只；7-10天后，收集腹水，离心收集上清，-70℃保存。
将制备的腹水使用Protein A亲和层析方法进行纯化，使用HRP进行标记，于-70℃保存。
实施例3：单克隆抗体特性检测
3.1单抗亚类的鉴定
使用单克隆抗体亚类试剂盒进行单抗亚类的鉴定。在预先包被好抗原的ELISA酶标板中分别加入杂交瘤细胞培养上清，100μL/孔，37℃孵育2h；PBST洗涤3遍；分别加入用PBS按1:1000稀释的羊抗鼠IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM，100μL/孔，室温放置30min，PBST洗涤3遍；加入用PBS 1:5000稀释的HRP-兔抗羊IgG酶标抗体，100μL/孔，室温孵育15min；PBST洗涤5遍；加入TMB显色液，100μL/孔，室温放置5min；加入2M H2S04终止反应，50μL/孔，酶标仪检测OD450，根据OD450判定单抗的亚类。
结果显示，单抗1F6亚类为IgG2a。
经鉴定，结果表明，单克隆抗体轻链可变区互补决定区1(CDR1)氨基酸序列如SEQID NO.1所示，具体为：RSSHTIVHTNGNTYLE。
轻链可变区互补决定区2(CDR2)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
KVSNRFS。
轻链可变区互补决定区3(CDR3)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：
FQGSRVPYT。
重链可变区互补决定区1(CDR1)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：
NYMIE。
重链可变区互补决定区2(CDR2)氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：
VINPGSGGTNYNEKFKA。
重链可变区互补决定区3(CDR3)氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：
GGLAFDY。
轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示：
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVLMTQTPLSLPVTLGDQASISCRSSHTIVHTNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSRVPYTFGGGTKLEIK。
编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCACTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCACACCATTGTACATACTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACGTGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA。
重链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示：
MEWSRVFIFLLSVTAGVHSQVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYMIEWIK QRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKAKTTLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCGR GGLAFDYWGQGTTLTVSS。
编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示：
ATGGAATGGAGCAGAGTCTTCATCTTTCTCCTATCAGTAACTGCAGGTGTTCACTCCCAGGTCCAGTTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACGCCTTCACTAATTACATGATAGAGTGGATAAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGGGTGATTAATCCTGGAAGTGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGCCAAGACAACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGATGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGGAAGGGGAGGACTGGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA。
3.2单抗腹水效价的测定
使用包被缓冲液将鞭毛蛋白以最佳包被浓度包被96孔ELISA板，4℃过夜；洗涤3次，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育2h；使用PBST洗涤3遍，加入倍比稀释的单抗腹水，以同样倍数稀释SP2/0腹水作为阴性对照，37℃孵育2h；PBST洗涤5遍；加入工作浓度的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤后，加入TMB显色液显色，100μL/孔，37℃孵育5min；加入2M H2SO4终止反应，酶标仪检测OD450值，以P/N≥2.1为判定标准，测定单抗腹水效价。
结果显示，单抗1F6的效价为1:32768000。单抗1F6具有很高的效价，表示利用其建立检测方法能产生高的灵敏性。
3.3单抗免疫反应性鉴定
将肠炎沙门菌鞭毛蛋白和里森沙门菌鞭毛蛋白分别加入SDS缓冲液，恒温金属浴10min，进行SDS-PAGE电泳。然后使用快速转印仪对胶体转印10min，使用含5％脱脂奶粉的PBST进行封闭，室温震荡封闭1h，使用PBST洗涤3遍；加入含工作浓度的单抗1F6，室温作用2h，PBST洗涤5遍；加入工作浓度的HRP-羊抗鼠酶标抗体，室温作用1h，PBST洗涤7遍；ECL显色1min，使用超灵敏多功能成像仪进行拍照。
结果如图1所示，1F6单抗与沙门菌鞭毛蛋白反应性良好。
3.6单抗特异性分析
采用Western blot分析单抗特异性。取鼠伤寒沙门菌(S.Typhimurium)、婴儿沙门菌(S.Infantis)、伦敦沙门菌(S.London)、印第安纳沙门菌(S.Indiana)、科瓦利斯沙门菌(S.Corvallis)、都柏林沙门菌(S.Dublin)、肠炎沙门菌(S.Enteritidis)、德尔卑沙门菌(S.Derby)、肯塔基沙门菌(S.Kentucky)、鸡白痢沙门菌(S.Pullorum)、宋内志贺菌(Sh.sonnei)、单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、空肠弯曲菌(C.jejuni)、大肠杆菌(E.coli)等沙门菌和非沙门菌裂解液上清，等量浓度分别加入SDS缓冲液，金属浴10min，进行SDS-PAGE电泳实验；之后，利用快速转印仪对胶体转印10min，用5％脱脂奶粉进行封闭，室温颠倒孵育1h；PBST洗涤3遍；将硝酸纤维素膜(NC膜)在蛋白Marker 70kDa位置分为两部分，将NC膜的上半部分加入工作浓度的DnaK抗体，下半部分加入工作浓度的单抗1F6，分别室温颠倒孵育2h；PBST洗涤5遍，分别加入工作浓度的HRP-羊抗鼠IgG酶标抗体，室温颠倒孵育1h；PBST洗涤7遍；加入ECL显色液显色，使用超灵敏多功能成像仪进行拍照。
结果显示(图2)，单抗1F6特异性识别含鞭毛沙门菌，与不含鞭毛沙门菌及非沙门菌不反应，特异性良好；不同沙门菌鞭毛蛋白的表达量及蛋白大小存在差异。
3.7单抗反应谱分析
采用全菌包板的间接ELISA方法鉴定单抗的特异性。用5％戊二醛溶液处理酶标板；取上述2.8.7的10株沙门菌以及如下其余21株沙门菌与9株非沙门菌：里森沙门菌(S.Rissen)、布伦登沙门菌(S.Braenderup)、阿尔巴尼沙门菌(S.Albany)、维尔肖沙门菌(S.Virchow)、阿贡纳沙门菌(S.Agona)、、纽波特沙门菌(S.Newport)、汤普森沙门菌(S.Thompson)、蒙得维的亚沙门菌(S.Montevideo)、山夫登堡沙门菌(S.Senftenberg)、猪霍乱沙门菌(S.Choleraesuis)、圣地亚哥沙门菌(S.Sandiego)、鸭沙门菌(S.Anatum)、哈达尔沙门菌(S.Hadar)、波摩纳沙门菌(S.Pomona)、姆班达卡沙门菌(S.Mbandaka)、马流产沙门菌(S.Abortusequi)、查理沙门菌(S.Chailey)、病牛沙门菌(S.Bovismorbificans)、依麦克沙门菌(S.Emek)、奥拉宁堡沙门菌(S.Oranienburg)、明斯特沙门菌(S.Muenster)、大肠杆菌(E.coli)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、宋内志贺菌(Sh.sonnei)、产酸克雷伯菌(K.oxytoca)、吉奥加利菌(L.jeotgali)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、空肠弯曲菌(C.jejuni)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌液包被戊二醛处理后的酶标板，50μL/孔，置于56℃烘箱烘干，取出后用无水甲醇(100μL/孔)室温作用约15min，洗涤3次，拍干酶标板，加入含1％BSA的PBS溶液进行封闭，200μL/孔，37℃水浴2h；PBST洗涤3遍，将单抗1F6进行梯度稀释，分别加入酶标板中，37℃水浴2h；PBST洗涤5遍。加入工作浓度的HRP-羊抗鼠IgG酶标二抗，100μL/孔，37℃水浴1h；PBST洗涤7遍；加入TMB显色液，100μL/孔，37℃水浴3min；加入2M H2SO4终止反应，50μL/孔，酶标仪检测OD450值。
结果表明，在全菌包板间接ELISA试验中，单抗1F6与所有30株含有鞭毛的沙门菌反应，与不含鞭毛蛋白的鸡白痢沙门菌和其他种属的非沙门菌均不反应，具体结果如下(表1)，说明此杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体特异性良好。
表1单抗1F6反应谱分析结果
Figure BDA0003091833110000091
注：+表示阳性结果；－表示阴性结果；x表示不具有沙门菌1相鞭毛(具有2相鞭毛)；/表示不含沙门菌鞭毛蛋白
实施例4：ELISA反应最佳条件的确立与诊断方法的建立
采用方阵实验确定里森沙门菌鞭毛蛋白的最佳包被浓度为2μg/mL、酶标抗体1F6的最适反应浓度为267ng/mL。经过最适封闭液、最适封闭时间、血清最适孵育时间、血清最适稀释倍数、底物最适作用时间等条件优化，确立了最终的操作程序为，以含5％的脱脂奶的PBS作为最适封闭液，封闭最佳包被浓度包被好的酶标板2.5h；洗涤3遍，加入以1:12稀释的血清，孵育1h；洗涤5遍，加入最适方法浓度的酶标抗体，孵育30min；洗涤7遍，加入TMB显色6min；加入1M的H2SO4终止反应，酶标仪OD450进行读数。
取经商品化试剂盒Salmonella enteritidis antibody test kit(IDEXX)验证及本实验室研制的H:g竞争ELISA方法验证的背景明晰的73份阴性血清(鸡白痢沙门菌血清和SPF鸡血清)和84份阳性血清(肠炎沙门菌血清和德尔卑沙门菌血清)，用以上建立的阻断ELISA方法进行检测，对其PI值进行分析，利用GraphPad Prism软件绘制ROC曲线(图3-A)，并计算Youden index、敏感度和特异性。结果如图3所示，在cut-off为26.68％时，此时该方法的敏感度和特异性最高分别为为93.98％和98.65％(图3-B)。
实施例5：阻断ELISA方法特异性检测
用建立的竞争ELISA方法分别检测鼠伤寒沙门菌、德尔卑沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、婴儿沙门菌、肠炎沙门菌、传染性法氏囊病毒、新城疫病毒、禽流感病毒和变形奇异杆菌等常见禽类病原的阳性血清。根据判定的阈值，检测该方法是否存在交叉反应。结果如图4所示，肠炎沙门菌感染血清、鼠伤寒沙门菌感染血清、德尔卑沙门菌感染血清、婴儿沙门菌感染血清的PI高于阈值，其余血清的PI均低于阈值，显示建立的阻断ELISA方法特异性良好。
实施例6：阻断ELISA方法检测限测定
将采用之前建立的间接ELISA方法测定为1:164000血清效价的肠炎沙门菌鸡血清进行1:10、1:50、1:100、1:200、1:400的梯度稀释，用建立的阻断ELISA方法测定各血清稀释度的PI值。绘制PI值与血清效价的反应曲线，通过公式计算其检测限。将效价为1:164000的阳性鸡血清进行梯度稀释，稀释后对应的血清效价依次为1:16400、1:3280、1:1640、1:820、1:410。绘制反应曲线(图5)，通过公式计算，当抗体效价大于1:660时，检测结果为阳性，反之则为阴性。
实施例7：沙门菌鞭毛蛋白单抗阻断ELISA的初步应用
取经商品化试剂盒Salmonella enteritidis antibody test kit(IDEXX)验证的肠炎沙门菌感染血清87份、鸡白痢沙门菌感染血清15份、SPF鸡血清79份；经间接ELISA方法验证德尔卑沙门菌感染血清10份、鼠伤寒沙门菌感染血清10份，用建立的阻断ELISA方法对以上201份血清进行检测。结果显示，194份样品检测结果均与背景吻合，总体符合率为96.5％(表4)。
表4阻断ELISA检测鸡血清样品
Figure BDA0003091833110000111
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 沙门菌鞭毛蛋白抗体及其制备方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Ser Ser His Thr Ile Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Phe Gln Gly Ser Arg Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asn Tyr Met Ile Glu
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ala
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Gly Leu Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 7
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Thr Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser His Thr Ile
35 40 45
Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Phe Gln Gly Ser Arg Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 8
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60
gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcactc ttggagatca agcctccatc 120
tcttgcagat ctagtcacac cattgtacat actaatggaa acacctattt agaatggtac 180
ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240
ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300
agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcacg tgttccgtac 360
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 393
<210> 9
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Glu Trp Ser Arg Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Met Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Ala Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Gly Arg Gly Gly Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 10
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggaatgga gcagagtctt catctttctc ctatcagtaa ctgcaggtgt tcactcccag 60
gtccagttgc agcagtctgg agctgagctg gtaaggcctg ggacttcagt gaaggtgtcc 120
tgcaaggctt ctggatacgc cttcactaat tacatgatag agtggataaa gcagaggcct 180
ggacagggcc ttgagtggat tggggtgatt aatcctggaa gtggtggtac taactacaat 240
gagaagttca aggccaagac aacactgact gcagacaaat cctccagcac tgcctacatg 300
cagctcagca gcctgacatc tgatgactct gcggtctatt tctgtggaag gggaggactg 360
gcctttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 405

Claims (10)

1.一种沙门菌鞭毛蛋白抗体，其特征在于，所述抗体包括重链和轻链，所述轻链包括三个互补决定区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示，所述重链包括三个互补决定区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
3.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-2任一项所述抗体。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸中编码所述轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述多核苷酸中编码所述轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求3或4所述多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有或者整合有权利要求5所述重组表达载体。
7.权利要求1或2所述抗体、权利要求3或4所述多核苷酸、权利要求5所述重组表达载体、或权利要求6所述宿主细胞在检测含鞭毛蛋白沙门菌中的应用。
8.一种用于沙门菌鞭毛蛋白阻断ELISA检测组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1或2所述抗体。
9.根据权利要求8所述组合物，其特征在于，所试组合物还包括包被有鞭毛蛋白的固相载体、沙门菌阳性血清/阴性血清、包被液、封闭液、稀释液、PBST、TMB显色液、或反应终止液中的任一种或几种；所述抗体为酶标抗体，所述酶标抗体为HRP标记的针对沙门菌鞭毛蛋白的IgG抗体。
10.一种沙门菌抗体的阻断ELISA检测方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1或2所述抗体检测沙门菌。
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