JPWO2019189874A1

JPWO2019189874A1 - Ｄｕｐａｎ−２抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体およびその製造方法。

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Publication number: JPWO2019189874A1
Application number: JP2020509349A
Authority: JP
Inventors: 知啓三浦; 宮崎　修; 修宮崎
Original assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2021-04-22
Also published as: EP3778637A4; US20210017263A1; CN112292398A; CN110317273A; EP3778637A1

Abstract

【課題】腫瘍マーカーとして使用される糖鎖抗原を認識する抗体の抗原特異性は十分ではなく、このような抗体を用いた腫瘍マーカーの検出では、検出特異性が低下し、癌診断の正確性が低下する問題があった。【解決手段】上記課題を解決するため、本発明は、腫瘍マーカーとして利用されるＤＵＰＡＮ−２抗原の糖鎖に特異的に反応する抗体およびその製造方法を提供する。

Description

本発明は、ＤＵＰＡＮ−２抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体およびその製造方法に関する。

近年、腫瘍マーカーとして使用される糖鎖抗原に対する抗体が多数報告されている。ヒト膵癌培養細胞ＨＰＡＦ−１を免疫抗原として作製したモノクローナル抗体ＤＵＰＡＮ−２は、膵腺癌細胞より高率に産生されるムチン様タンパク質と反応することが知られており、その抗原決定基にはシアル酸が関係していると考えられている（非特許文献１、２）。当該抗原は、ＤＵＰＡＮ−２抗原と呼ばれ、特に膵癌、胆道系癌などの消化器系癌のマーカーとして用いられている。

また、食道癌組織を認識する抗体が認識するＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原はシアル酸を含む糖鎖抗原であり、胃癌、肺癌、乳癌、膵癌などで上昇することが知られている（非特許文献３）。

一方、これらの腫瘍マーカーとして使用される糖鎖抗原を認識する抗体は、一般的に特定の癌細胞全体を抗原として認識するものとして単離されたものであり、その抗原特異性は十分ではなく、複数の糖鎖抗原と反応し得る。このような抗体を用いた腫瘍マーカーの検出では、検出特異性が低下し、癌診断の正確性が低下する問題があった。

したがって、腫瘍マーカーを利用した、より正確な診断を行うためには、特定の糖鎖抗原に特異的に反応する抗体を得ることが必要とされていた。

臨床病理、１９８６年，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．６，ｐｐ．７０５−７１０癌と化学療法、１９８６年，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．１１，ｐｐ．３２０７−３２１４ＧＡＮＮＪａｐａｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、１９８４年，Ｖｏｌ．７５，Ｎｏ．６，ｐｐ．４８５−４８８

本発明は、腫瘍マーカーとして利用されるＤＵＰＡＮ−２抗原の糖鎖に特異的に反応する抗体およびその製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、ＤＵＰＡＮ−２抗原の糖鎖自体を抗原として使用し、これを特異的に認識する抗体を得ることに成功した。当該方法で得られた抗体は、各種腫瘍マーカーとして用いられるムチン抗原の中でも、ＤＵＰＡＮ−２抗原を高度に特異的に認識し、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９等の他の腫瘍マーカー抗原と反応しない。

すなわち、本発明は一態様において以下のものを提供する。
[１]下記糖鎖構造を有するＤＵＰＡＮ−２抗原

と反応し、かつ
下記糖鎖構造を有するＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原

と反応しない抗体およびその抗原結合フラグメント。
[２]ＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原に対する反応性が、ＤＵＰＡＮ−２抗原に対する反応性の１０％未満である、[１]に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
[３]ＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原に対する反応性が、ＤＵＰＡＮ−２抗原に対する反応性の１％未満である、[１]に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
[４]ラット抗体である、[１]〜[３]のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
[５]前記[１]〜[４]のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを製造する方法であって、
前記ＤＵＰＡＮ−２抗原を結合した高分子化合物を動物に免疫する工程を含む、前記方法。
[６]前記[１]〜[４]のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する細胞を製造する方法であって、
前記ＤＵＰＡＮ−２抗原を結合した高分子化合物を動物に免疫する工程を含む、前記方法。
[７]前記ＤＵＰＡＮ−２抗原と結合した高分子化合物が、ＤＵＰＡＮ−２抗原結合ペプチドのペプチド部分を含まない、前記[５]または[６]に記載の方法。
[８]前記[１]〜[３]のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを用いることを特徴とする、免疫測定方法。
[９]前記[１]〜[３]のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、免疫測定試薬。

本発明の抗体は、腫瘍マーカーとして用いられるムチン抗原の中でも、ＤＵＰＡＮ−２抗原を高度に特異的に認識し、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９等の他の腫瘍マーカー抗原と反応しない。したがって、ＤＵＰＡＮ−２抗原を発現する癌細胞、例えば膵癌細胞などを特異的に検出することが可能であり、より正確ながん診断を可能とする。

また、本発明の腫瘍マーカーとして用いられるムチン抗原を特異的に認識する抗体の作製方法を利用することにより、特定の腫瘍マーカーに高度に特異的に反応する抗体を取得することが可能となる。

図１は、ＤＵＰＡＮ−２抗原と特異的に反応する抗体の作製方法の概略を示す図である。図２は、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の試験結果を示す図である。図３は、本発明のモノクローナル抗体のエピトープ分析の結果を示す図である。図４は、本発明のモノクローナル抗体の特異性分析の結果を示す図である。図５ａは、本発明のモノクローナル抗体のＤＵＰＡＮ−２２標準品に対する反応性を示す図である。図５ｂは、癌患者血清を用いた試験における、本発明のモノクローナル抗体を使用して測定した場合の吸光度と、既存ＥＬＩＳＡキットで測定したＤＵＰＡＮ−２の値の相関を示す図である。

以下、本発明の実施形態について説明する。以下の説明は単なる例示であり、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。

（定義）
特に指示がない場合、本明細書に用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解される意味を有する。

本明細書において、複数の数値の範囲が示された場合、それら複数の範囲の任意の下限値および上限値の組み合わせからなる範囲も同様に意味する。

本明細書において、抗体とある化合物が「反応する」、「反応性を示す」、「反応性を有する」、「結合する」、あるいは抗体がある化合物を「認識する」と表現する場合、本発明の分野で通常使用される意味を含み、いずれも同義で用いる。抗体とある化合物とが「反応する」か否かの確認は、当業者に周知の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などにより行うことができるほか、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の原理を利用した方法（ＳＰＲ法）などにより行うことができる。ＳＰＲ法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の名称で市販されている、装置、センサー、試薬類を使用して行うことができる。

本明細書において、本発明の抗体と、ある化合物が「反応しない」とは、本発明の抗体とある化合物とが実質的に反応しないことをいう。「実質的に反応しない」とは、例えば、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において、当該化合物の添加によって、抗体と固相化抗原の結合が実質的に影響を受けないことを意味する。上記抗原固相化ＥＬＩＳＡ法以外の当業者に周知の方法・手段によっても「実質的に反応しない」ことを確認できる。

本明細書において、抗体が「特異的に反応する」こと、または抗体の「特異性」は、抗体が検出可能に抗原上に提示されたエピトープに反応する能力であって、一方でその他の抗原との検出可能な反応性が比較的小さいか実質的に反応性が検出されないことをいう。例えば、抗体が特定の抗原に「特異的に反応する」場合、当該抗体は当該抗原に反応する一方、他の抗原には反応しない。好ましい態様において、抗体が特定の抗原に「特異的に反応する」場合、例えば抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において固定化された当該抗原と当該抗体の相互作用が遊離の当該抗原によって阻害される一方で、他の遊離抗原によっては阻害されない。例えば、上記抗原固相化ＥＬＩＳＡ法による阻害を遊離抗原のＩＣ_５０で表した場合、当該特異的な抗原のＩＣ_５０に対して、非特異的な抗原のＩＣ_５０は、１０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、１００００倍であってもよい。また、特異的な抗原のＩＣ_５０が他の抗原の１／Ｘである場合、当該特異的な抗原の反応性を、他の抗原に対する反応性のＸ倍であると表現することもできる。好ましくは、他の抗原の反応性は、特異的な抗原に対して２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％未満である。本発明の好ましい態様において、本発明の抗体は、ＤＵＰＡＮ−２抗原に反応し、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原に反応しない。

本明細書において、「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合で相互に連結された２つの重鎖（Ｈ）と２つの軽鎖（Ｌ）を含む免疫グロブリン分子を意味する。各重鎖は、重鎖の変更可能領域（「ＨＣＶＲ」又は「ＶＨ」）及び重鎖の定常領域（ＣＨ_１、ＣＨ_２及びＣＨ_３ドメインを含む）を含む。各軽鎖は、軽鎖の変更可能領域（「ＬＣＶＲ」又は「ＶＬ」）及び軽鎖の定常領域（ＣＬ）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、更に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と命名される超変異性の領域に分割され、フレームワーク（ＦＲ）と命名される多く保存できる領域に散在され得る。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲを含み、アミン末端からカルボキシ末端に次の順で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の変更可能領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。用語「抗体」は、また、抗体の全ての遺伝子組替え体、例えば、原核生物で発現する抗体、グリコシル化されていない抗体を含む。

また、Ｐａｄｌａｎ（１９９５ＦＡＳＥＢＪ．９：１３３−１３９）、Ｖａｊｄｏｓｅｔａｌ．２００２ＪＭｏｌＢｉｏｌ３２０：４１５−４２８に示されるように、実際にはＣＤＲ残基の一部のみが抗原に接触することが知られており、抗原に接触しないＣＤＲ残基は、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの外側に存在するＫａｂａｔのＣＤＲの領域から、分子モデリングにより、または経験的に特定できる。ＣＤＲ又はその一つ又は複数の残基が除去される場合、それは、普通は、別のヒト抗体配列又はそのような配列のコンセンサスにおいて対応する位置を占めるアミノ酸で置換される。ＣＤＲ及びアミノ酸内で置換する位置は、また、経験的に選択できる。経験的置換は保存的又は非保存的置換であってもよい。

本明細書において、抗体の「抗原結合フラグメント」は、抗原（例えば、ＤＵＰＡＮ−２）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又はそれ以上のフラグメントを意味する。抗体の「抗原結合フラグメント」内に包含される結合フラグメントの非限定的な例は：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨドメインより成る１価のフラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド橋により結合された２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントである、Ｆ（ａｂ′）_２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨドメインより成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインより成るＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインより成るｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄｅｔａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；及び（ｖｉｉ）合成リンカーで、場合により、結合されてもよい２つ又はそれ以上の単離されたＣＤＲの組合せ；を含む。また、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られるように、遺伝子組み換え法を用いて、合成リンカーによりＶＬ及びＶＨ領域を対に形成する単一タンパク質鎖として作ることもできる（Ｂｉｒｄｅｔａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６；ａｎｄＨｕｓｔｏｎｅｔａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３）。また、「抗原結合フラグメント」は、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合された結合ドメインポリペプチド；（ｉｉ）ヒンジ領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域；を含む結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質であってもよい。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて得られる。

本発明に使用可能な抗体又はその抗原結合フラグメントは、鳥、哺乳類を含むいかなる動物起源であってもよい。好ましくは、抗体又はフラグメントは、ヒト、チンパンジ、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、又はウサギ）、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ、又はイヌ起源である。本発明の抗体は、ある種から誘導された抗体の定常領域が、他種から誘導された抗原結合サイトと組み合わされたキメラ分子を含む。更に、本発明の抗体は、非ヒト種（例えば、マウス起源）から誘導された抗体の抗原結合サイトと、ヒト起源の定常領域とフレームワーク領域を組合せたヒト化分子を含む。

本発明の抗体は、当該抗体を発現するハイブリドーマ、または、遺伝子組み換えにより当該抗体を発現するホスト細胞から得ることができる。ホスト細胞として、例えば、ＣＨＯ細胞、リンパ球細胞、大腸菌などの細菌細胞、及び酵母などの真菌細胞を用いることができる。

また、本発明の抗体は、遺伝子組み換え技術を用いて遺伝子導入された非ヒト動物又は植物において製造することができる。

本発明における抗体として、例えばハイブリドーマＳ１９２０１Ｒが産生するモノクローナル抗体が好ましい。上記ハイブリドーマＳ１９２０１Ｒは下記のようにブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター、寄託機関の住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８１２２号室（郵便番号２９２−０８１８）、受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−０２７２１、寄託日：２０１８年５月１７日。

本明細書において、「アルキル又はアルキル基」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜２０個（Ｃ１〜２０）、炭素数１〜１５個（Ｃ１〜１５）、炭素数１〜１０個（Ｃ１〜１０）であり得る。

アルキル基は任意の置換基を１個以上有していてもよい。例えば、Ｃ１〜８アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等が含まれる。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。

本明細書中において、「アルキレン」とは、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素からなる二価の基を意味する。

本明細書において、ある官能基について「置換されていてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。

本明細書において、「ＤＵＰＡＮ−２抗原」は、ＤＵＰＡＮ−２抗体が認識すると報告されている（Ｋａｗａ．Ｓ．ｅｔ．ａｌ．Ｐａｎｃｒｅａｓ（１９９４），９（６）：６９２−６９７））下記の構造を有する糖鎖を意味する。

本明細書において、「ＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原」は、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗体が認識すると報告されている（Ｋｕｍａｍｏｔｏ．Ｋ．ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９８），２４７（２）：５１４−１７）下記の構造を有する糖鎖を意味する。

本明細書において、「ＤＵＰＡＮ−２抗原結合ペプチド」とは、生体内の腫瘍細胞などで発見される、ＤＵＰＡＮ−２抗原が結合したペプチドを意味する

（ＤＵＰＡＮ−２抗原と特異的に反応する抗体の作製方法）
本発明のＤＵＰＡＮ−２抗原を特異的に認識する抗体は、図１に概要を示す方法で取得される。具体的には、従来の腫瘍マーカー反応性抗体が、腫瘍細胞自体を抗原として単離されたものであったのに対して（図１Ａ）、本発明によるＤＵＰＡＮ−２抗原と特異的に反応する抗体を作製する方法では（図１Ｂ）、ＤＵＰＡＮ−２抗原を構成する糖鎖を、リンカーを介して高分子化合物に担持させ、これをマウス等の哺乳動物に免疫する。Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８８））などに記載される既知の方法により、当該動物の脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を摘出し、ミエローマ細胞と細胞融合させることによりハイブリドーマを作製する。作製したハイブリドーマ細胞集団から、癌細胞と特異的に反応する抗体を産生するものを単離する。
従来の方法では、最終的に抗体が取得されてからエピトープを解析する必要があったのに対して、本件発明の方法では免疫原とエピトープが一致しているため効率的に抗体作製可能であり、特定の糖鎖抗原と特異的に反応する抗体を取得することができる。但し、糖鎖合成において高度な技術を必要とする。

リンカーの構造は特に限定されないが、例えば、Ｃ１〜Ｃ１２の置換されてもよいアルキル基、アルキレン基、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチドなどを用いることができる。

高分子化合物は特に限定されないが、例えば、アルブミン、オボアルブミン、緑膿菌外毒素、破傷風毒素、リシン毒素、ジフテリア毒素、コレラ毒素、易熱性エンテロトキシン、キーホールリンペットヘモシアニン、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフェリン、血小板由来増殖因子、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−グルタミンなどのタンパク質を用いることができる。

本発明のＤＵＰＡＮ−２抗原が結合した高分子化合物は、ＤＵＰＡＮ−２抗原結合ペプチドの一部を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。好ましい態様において、本発明のＤＵＰＡＮ−２抗原が結合した高分子化合物は、ＤＵＰＡＮ−２抗原結合ペプチド部分を含まない。

ハイブリドーマの作製は、当該分野で公知の方法に従って行うことができ、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などを採用することができる。得られたハイブリドーマは、公知の方法に従って増殖させることができ、産生される抗体の性質を確認しつつ所望のハイブリドーマを選択することができる。ハイブリドーマのクローニングは、例えば限界希釈法や軟寒天法などの公知の方法により行うことが可能である。

得られた抗体は、上記ハイブリドーマから直接産生する以外に、遺伝子組み換えにより当該抗体を発現するホスト細胞を調製し、当該ホスト細胞から得ることができる。ホスト細胞として、例えば、ＣＨＯ細胞、リンパ球細胞、大腸菌などの細菌細胞、及び酵母などの真菌細胞を用いることができる。

なお、上記抗体の作製方法は、ＤＵＰＡＮ−２抗原に限定されず、他の公知の糖鎖タンパク質の糖鎖抗原に対して特異的な抗体を作製するために用いることができる。例えば、同様の方法により、上記ＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体を作製することができた。

（本発明の抗体の用途）
本発明の抗体は、腫瘍マーカーの検出として、生体試料中のＤＵＰＡＮ−２抗原を検出するための免疫測定方法に用いることができる。具体的には、抗体を用いて生体試料中のムチン腫瘍マーカーを検出するための様々な公知の方法を利用することができ、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光測定法、免疫沈降法、平衡透析、免疫拡散法およびその他の技法をもちいることができるが、これらに限定されない（例えばＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８６，ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ参照）。一つの態様において、本発明の抗体は、不溶性担体上に固定された固定（固相）化抗体や、標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。このような固定化抗体や標識抗体はいずれも本発明の範囲に包含される。例えば、不溶性担体に本発明の抗体を物理的に吸着させ、あるいは化学的に結合（適当なスペーサーを介してもよい）させることにより固定化抗体を製造することができる。不溶性担体としては、ポリスチレン樹脂などの高分子基材、ガラスなどの無機基材、セルロースやアガロースなどの多糖類基材などからなる不溶性担体を用いることがでる。その形状は特に限定されず、板状（例えば、マイクロプレートやメンブレン）、ビーズあるいは微粒子状（例えば、ラテックス粒子や磁性粒子）、筒状（例えば、試験管）など任意の形状を選択できる。

標識抗体を製造するための標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、又は放射性同位体、金コロイド粒子、着色ラテックスなどが挙げられる。標識物質と抗体との結合法としては、当業者に利用可能なグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、又は過ヨウ素酸法などの方法を用いることができる。固定化抗体や標識抗体の種類、及びそれらの製造方法は特に限定されることはなく、例えば、パーオキシダーゼやアルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰということがある）などの酵素を標識物質として用いることができる。この場合、当該酵素の特異的基質（酵素が西洋ワサビパーオキシダーゼ（以下、ＨＲＰということがある）の場合には、例えば１，２−フェニレンジアミン（以下、ＯＰＤということがある）あるいは３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＡＬＰの場合には、ｐ−ニトロフェニルホスフェートなど）を用いて酵素活性を測定することができる。ビオチンを標識物質として用いる場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的である。

本発明の抗体は、上記免疫測定方法に用いるための免疫測定試薬として提供され得る。当該試薬は、本発明の抗体に加えて、当該免疫測定方法の実施に必要な他の構成要素、例えば、緩衝液、保存剤等を含んでもよい。

一態様において、例えば本発明の抗体が酵素を標識物質として含む場合には、その特異的基質を含む試薬と共に、キットの形態で提供されてもよい。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

〔試験例１〕ＤＵＰＡＮ−２抗原特異的なモノクローナル抗体の製造
１．材料
（１）ＤＵＰＡＮ−２修飾マレイミド、各種糖鎖関連化合物
（２）フロインド完全アジュバント：和光純薬工業社製，０１４−０９５４１
（３）ミエローマ細胞（ＳＰ２／Ｏ）
（４）ＲＰＭＩ１６４０，ＧｌｕｔａＭＡＸ：ＧＩＢＣＯ社製，６１８７０−０３６
（５）ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ（ＦＢＳ）：ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ社製，０４−００１−１Ａ
（６）ＨＡＴ培地：コスモバイオ社製，１６２１３００８
（７）９６穴プレート：ＮＵＮＣ，１６７００８
（８）ＨＲＰ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体：ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製，３０５０−０５
（９）「デタミナー（登録商標）ＤＵＰＡＮ−２」（既存ＥＬＩＳＡキット；協和メデックス社製）：構成試薬としてＨＲＰ標識ＤＵＰＡＮ−２抗体（ＨＲＰ標識既存抗体）およびＤＵＰＡＮ−２標準品を含む。

２．免疫原用ＤＵＰＡＮ−２修飾マレイミド架橋タンパク質の調製
糖鎖修飾マレイミドの架橋は、ヒトトランスフェリンを還元し、還元されたヒトトランスフェリンと糖鎖マレイミドとを重量比４：１にてＰＢＳ中で混合し、室温で２時間反応させ、４℃で一晩放置した。その後、透析によりバッファーをＰＢＳに置換し、免疫用コンジュゲート液とした。

３．抗ＤＵＰＡＮ−２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
（３−１）動物への免疫
前記免疫用コンジュゲート液（０．２〜２ｍｇ／ｍｌ）とフロインド完全アジュバンドを等量ずつ混合して調製したエマルジョンを用い、Ｆ３４４ラットに１匹あたり１０〜４０μｇを注射した。さらに、１週間の間隔で７〜８回、該エマルジョンの注射を繰り返した。尾部静脈より採血して得た抗血清中の抗体価を、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法にて測定した。

（３−２）１次スクリーニング（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法）
前記免疫動物抗血清中の抗ＤＵＰＡＮ−２抗体の存在を、免疫用コンジュゲート液と同様の方法で作製した、ＤＵＰＡＮ−２とＢＳＡとのコンジュゲート液を固相化したＥＬＩＳＡ法（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法）で確認した。抗原固相化ＥＬＩＳＡ法を以下の通り行った

（３−２−１）抗原固相化ＥＬＩＳＡ用プレートの作製
ＤＵＰＡＮ−２とＢＳＡとのコンジュゲート液を１μｇ／ｍＬになるよう、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳという）に溶解し、該溶解液５０μＬを９６穴マイクロプレートの各ウエルに分注して、室温で２時間又は４℃で一晩静置した。

前記各ウエルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴという）４００μＬで３回洗浄した後、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳＴという）１００μＬを加え、室温で１時間又は４℃で一晩ブロッキングを行った。これをＥＬＩＳＡ用プレートとした。

（３−２−２）抗原固相化ＥＬＩＳＡ法
前記ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１５００倍から１３５００倍に希釈した免疫動物抗血清及び非免疫動物血清５０μＬを前記各ウエルに添加し、室温で１時間静置した。前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで５０００倍希釈したＨＲＰ標識ラットＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）を５０μＬ前記各ウエルに分注し、室温で１時間静置した。前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。

（３−２−３）抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の試験結果
結果を図２に示す。非免疫動物血清と比較して免疫動物抗血清は何れも希釈倍率が低いほど、高い吸光度を示した。この測定系では、吸光度は動物の血清中に含まれるＤＵＰＡＮ−２に対する抗体濃度に依存する。つまり、前述の結果は、免疫動物抗血清には非免疫動物の血清と比較して、より高い濃度のＤＵＰＡＮ−２に対する抗体を含み、抗体価が高いということを示している。測定の結果、抗体価の高かったラットから、脾臓もしくはリンパ節を摘出して、脾臓由来細胞もしくはリンパ節由来細胞を調製し、細胞融合に用いた。

（３−３）細胞融合
前記脾臓由来細胞もしくはリンパ節由来細胞のいずれかとミエローマ細胞を細胞数で１対１の割合で混合し、電気融合した。該融合させた細胞をＨＡＴ培地に懸濁し、ＣＯ_２インキュベータ内で３７℃、５％ＣＯ_２にて８日間培養して、融合細胞（ハイブリドーマ）を得た。

（３−４）ハイブリドーマの選別（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法）
上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において、免疫動物抗血清の代わりに融合細胞の培養上清を用いた以外は、同様の方法を行った。測定の結果、吸光度の高いウエルを抗ＤＵＰＡＮ−２抗体産生ハイブリドーマの存在するウエル（陽性ウエル）として選択した。

（３−５）クローニング
上述の１次スクリーニング及び２次スクリーニングで選択された抗ＤＵＰＡＮ−２抗体産生株ハイブリドーマを用いて、ハイブリドーマの単クローン化とモノクローナル抗体の精製を行った。
単クローン化は定法（限界希釈法）で行い、上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法と同様の方法で陽性ウエルを選別し、最終的に１種の抗ＤＵＰＡＮ−２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。当該ハイブリドーマＳ１９２０１Ｒが産生するモノクローナル抗体を、Ｓ１９２０１Ｒ抗体と呼ぶ。

〔試験例２〕本発明のモノクローナル抗体のエピトープ分析
１．試験方法
Ｓ１９２０１Ｒ抗体と反応するＤＵＰＡＮ−２のエピトープが、既存のＤＵＰＡＮ−２抗体と近似であるかについて、以下に記述する競合ＥＬＩＳＡにより確認した。先ず、上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法と同様の方法でＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。また、ＢＳＡ−ＰＢＳＴを溶媒として、２倍希釈したＨＲＰ標識既存抗体と２−８倍希釈したＳ１９２０１Ｒ抗体産生ハイブリドーマ培養上清及びＤＵＰＡＮ−２に反応しないコントロール抗体を産生するハイブリドーマ培養上清を混合した。これらを混合液とする。ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、上述の混合液をそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。

次いで、前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間静置後、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
２．試験結果
結果を図３に示す。コントロール抗体とＨＲＰ標識既存抗体を混合した場合には、吸光度の減少が観察されなかった。一方、Ｓ１９２０１Ｒ抗体とＨＲＰ標識既存抗体を混合した場合には、吸光度の減少が観察された。この測定系では、吸光度は、プレートに固相化したＤＵＰＡＮ−２とＢＳＡとのコンジュゲートに結合したＨＲＰ標識既存抗体の量に依存する。つまり、Ｓ１９２０１Ｒ抗体の添加により吸光度が減少するということは、溶液中のＳ１９２０１Ｒ抗体が、ＨＲＰ標識既存抗体とコンジュゲートとの結合部位近傍に結合し、ＨＲＰ標識既存抗体とコンジュゲートとの結合を阻害していることを示す。従って、Ｓ１９２０１Ｒ抗体は、既存のＤＵＰＡＮ−２抗体と近似のエピトープを認識することがわかった。

〔試験例３〕本発明のモノクローナル抗体の特異性分析
１．試験方法
Ｓ１９２０１Ｒ抗体の特異性を、以下に記述する競合ＥＬＩＳＡにより確認した。先ず、上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法と同様の方法でＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。また、ＢＳＡ−ＰＢＳＴを溶媒として、８倍希釈したＳ１９２０１Ｒ抗体産生ハイブリドーマ培養上清及び２倍希釈したＨＲＰ標識既存抗体を、０．１−１０μｇ／ｍＬに調製したＮＣＣ−ＳＴ−４３９の糖ペプチドとＢＳＡのコンジュゲート、ＤＵＰＡＮ−２の糖マレイミドとＢＳＡのコンジュゲート及び精製糖鎖ＳｉａｌｙｌＬｅｗｉｓＸ（ｓＬｅｘ）と混合した。これらを混合液とする。ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、上述、Ｓ１９２０１Ｒ抗体産生ハイブリドーマ培養上清と各糖鎖関連化合物の混合液をそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。その他のウエルにはＢＳＡ−ＰＢＳＴを５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。前記各ウエルのうちＳ１９２０１Ｒ抗体産生ハイブリドーマ培養上清と各糖鎖関連化合物の混合液を分注したウエルはＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで５０００倍希釈したＨＲＰ標識ラットＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。前記各ウエルのうち、ＢＳＡ−ＰＢＳＴを５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注したウエルにはＨＲＰ標識ＤＵＰＡＮ−２抗体と各糖鎖関連化合物の混合液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。

次いで、前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間静置後、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。

２．試験結果
結果を図４に示す。ＮＣＣ−ＳＴ−４３９及びＤＵＰＡＮ−２のコンジュゲートを混合し、Ｓ１９２０１Ｒ抗体を用いた場合には、ＤＵＰＡＮ−２のみで吸光度の減少が観察された（図４）。この測定系では、吸光度は、プレートに固相化したＤＵＰＡＮ−２とＢＳＡとのコンジュゲートに結合した抗体の量に依存する。つまり、各糖鎖関連化合物の添加により吸光度が減少するということは、溶液中の遊離の糖鎖関連化合物が、溶液中の抗体と反応し、抗体と固相化したコンジュゲートとの結合を阻害することを示している。

〔試験例４〕検体及び標準品に対する反応性
１．材料
１．ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製、２１１２６）

２．試験方法
Ｓ１９２０１Ｒ抗体を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡにより、血清検体中に含まれるＤＵＰＡＮ−２を測定できるか試験した。サンドウィッチＥＬＩＳＡの詳細は以下である。
（２−１）サンドウィッチＥＬＩＳＡ用プレートの作製
Ｓ１９２０１Ｒ抗体含有液を５μｇ／ｍＬになるよう、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳという）に溶解し、該溶解液５０μＬを９６穴マイクロプレートの各ウエルに分注して、室温で２時間静置した。
前記各ウエルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴという）４００μＬで３回洗浄した後、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳＴという）１００μＬを加え、室温で１時間ブロッキングを行った。これをＥＬＩＳＡ用プレートとした。

（２−２）サンドウィッチＥＬＩＳＡ法
前記ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで６倍または１２倍に希釈した１２例の癌患者血清５０μＬ及びＢＳＡ−ＰＢＳＴで段階希釈したＤＵＰＡＮ−２標準品を前記各ウエルに添加し、室温で１時間静置した。前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで２μｇ／ｍＬに希釈したビオチン標識したＳ１９２０１Ｒを５０μＬ前記各ウエルに分注し、室温で１時間静置した。前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで０．２μｇ／ｍＬに希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジンを５０μＬ前記各ウエルに分注し、室温で１時間静置した。前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。癌患者血清を用いた場合には、標準品を用いて測定した吸光度を検量線として、ＤＵＰＡＮ−２濃度を測定した。

３．試験結果
結果を図５ａ，ｂに示す。Ｓ１９２０１Ｒ抗体を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡにより、標準品の濃度依存的な吸光度の増大が確認された（図５ａ）。つまりこのことは、Ｓ１９２０１Ｒ抗体が標準品内のＤＵＰＡＮ−２抗原と反応していることを示す。更に、既存のＥＬＩＳＡキットで測定した癌患者血清中のＤＵＰＡＮ−２濃度とＳ１９２０１Ｒ抗体を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡで測定した癌患者血清中のＤＵＰＡＮ−２濃度の近似直線の相関係数は０．９９以上であった（図５ｂ）。つまり、Ｓ１９２０１Ｒ抗体は既存のＤＵＰＡＮ−２抗体同様に癌患者血清中のＤＵＰＡＮ−２を測定できることが示された。

以上具体例を用いて本発明を説明したが、本発明の範囲は上記具体例に限定されるものではない。当業者は本発明の要旨を逸脱することなくその他種々の構成を採り得ることを理解する。

Claims

下記糖鎖構造を有するＤＵＰＡＮ−２抗原

と反応し、かつ
下記構造を有するＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原

と反応しない抗体およびその抗原結合フラグメント。
ＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原に対する反応性が、ＤＵＰＡＮ−２抗原に対する反応性の１０％未満である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
ＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原に対する反応性が、ＤＵＰＡＮ−２抗原に対する反応性の１％未満である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
ラット抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを製造する方法であって、
前記ＤＵＰＡＮ−２抗原を結合した高分子化合物を動物に免疫する工程を含む、前記方法。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する細胞を製造する方法であって、
前記ＤＵＰＡＮ−２抗原を結合した高分子化合物を動物に免疫する工程を含む、前記方法。
前記ＤＵＰＡＮ−２抗原と結合した高分子化合物が、ＤＵＰＡＮ−２抗原結合ペプチドのペプチド部分を含まない、請求項５または６に記載の方法。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを用いることを特徴とする、免疫測定方法。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、免疫測定試薬。