JP6778365B2 - 抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
従って、ペプチドYYと交差反応せず、マウス膵ポリペプチドに特異的な抗体は存在せず、かかるモノクローナル抗体の開発が望まれていた。
〔2〕(1)ELISAにより膵ポリペプチドと結合するが、ペプチドYYと結合せず、(2)ウエスタンブロットにより膵ポリペプチドは検出するが、ペプチドYYを検出せず、(3)免疫組織化学において膵ポリペプチド含有組織を検出するが、膵ポリペプチド非含有組織を検出しない〔1〕記載の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメント。
〔3〕配列番号1で示されるアミノ酸配列を認識するものである〔1〕又は〔2〕記載の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメント。
〔4〕受託番号NITE P−02175で寄託されているハイブリドーマが産生する、〔1〕又は〔2〕に記載の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメント。
〔5〕免疫抗原として配列番号1で示される配列を有するポリペプチドでPpy欠損非ヒト動物を免疫する工程を含む〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体の作製方法。
〔6〕〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメントを含有する、膵ポリペプチド又は膵ポリペプチド含有組織の検出用試薬。
〔7〕〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメントを用いることを特徴とする膵ポリペプチド又は膵ポリペプチド含有組織の検出方法。
〔8〕前記抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメントが標識物質によって標識されている、〔7〕に記載の膵ポリペプチド又は膵ポリペプチド含有組織の検出方法
〔9〕〔1〕又は〔2〕に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
〔10〕受託番号NITE P−02175で寄託されている、〔9〕に記載のハイブリドーマ。
すなわち、本発明の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体は、例えば、Ppy欠損非ヒト動物に配列番号1で示されるポリペプチドを免疫して得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させて得られたハイブリドーマを培養することにより得ることができる。
本発明の抗体の標識体としては、酵素、放射性同位元素のいずれでもよい。液相中の膵ポリペプチドの検出には、ELISAやウエスタンブロットが挙げられ、組織中の膵ポリペプチドの検出には免疫組織化学が挙げられる。
免疫組織化学手段としては、例えば蛍光抗体法、酵素抗体法等が用いられる。
(1)Ppy遺伝子欠損マウスの作製
マウスPPペプチドをコードするマウスPpy遺伝子は、第11番染色体に存在する。まず、Ppy遺伝子のコーディング配列をcre配列に置換したPpy−creノックインマウス(Ppycre/+)を作製した。このマウスは内因性のPpy遺伝子が発現する代わりに、creが発現する。したがって、ノックインアレルは機能的にはPpyのヌルアレルとなる。Ppy遺伝子座にcre配列をノックインする方法はZFN(Zinc finger nuclease)を用いたゲノム編集(Geurts et al.Science.2009;325:433.)を用いた。内因性Ppy遺伝子のコード領域に対し、PPペプチドの第一番目のメチオニンをcre遺伝子の第一番目のメチオニンと一致して置換させるようなターゲティングコンストラクトを準備した。
1細胞期の受精卵に対し、デザインされたZFNとターゲティングコンストラクトをインジェクションし、その受精卵を偽妊娠マウスの子宮に戻し、産仔を得た。数十匹の仔の中からそのゲノム遺伝子のPpy遺伝子座を解析することにより、目的のPpy遺伝子のコード配列にcre配列が正しくノックインされたマウス(Ppycre/+)を1ライン同定した。さらに、このマウスを交配することによりPpycre/creマウスを得た。このマウスがPpy遺伝子を欠損していることを、Ppy遺伝子mRNAを検出するin situ hybridizationにより確認した。
KLH−mPPペプチド結合物(mPPペプチドのN末端にCysを有するペプチドにKLHを結合)溶液とフロイントコンプリートアジュバントを体積比約1:2で混合し、エマルジョンを作製した。前述のPPYノックアウトマウス(PPYcre/cre)5匹に対してKLH−ペプチド溶液(2.5mg/mL)を0.05mL/匹の割合で尾に免疫した。
さらにKLH−mPPペプチド結合物溶液0.05mL/匹(濃度:2.5mg/mL)を使用して尾の基部に追加免疫した。
1)SP2細胞(マウスミエローマ)の回収
スクレーパーを用いてSP2細胞を回収し、遠心(1000rpm、5分)後、上清を吸引してダルベッコ改変イーグル培養液(D−MEM)(無血清)を20mL加え、細胞数を計測した。
2)免疫動物にイソフルランを過剰吸入させて安楽死させた。消毒用アルコールを全体にかけ、手術台に固定した。
3)マウスを開腹し、後腹膜とその周辺の脂肪組織をピンセットで切り開き、左右一対の腸骨リンパ節を回収した。
4)網を用いて、リンパ節を裏ごしした。最終的に30mLとなるように、D−MEM(無血清)で洗いながら、チューブにリンパ球を回収した。
5)細胞融合
リンパ球:SP2細胞=5:1の細胞比となるように4)のリンパ球のチューブにSP2細胞を加えた。遠心(1280rpm、10分)後、上清を吸引し、37℃で2分間保温した。その後ポリエチレングリコール1mLを1分かけて滴下した。37℃で2分間反応させた。D−MEM4.5mLを3分かけて滴下した。D−MEM4.5mLを2分かけて滴下した。遠心(1000rpm、5分)後、上清を吸引した。
6)HAT培養液中で融合細胞を懸濁し、96ウェルプレートに播種し、培養してハイブリドーマを選択した。
i)ELISAによる一次スクリーニング
固相化抗原としては、ポジティブプレート用にBSA−マウスPPペプチド、ネガティブプレート用にBSA−マウスPYYペプチドを用いた。ここでマウスPYYペプチドのアミノ酸配列を配列番号2に示す。
1)アッセイ用プレートに抗原(3μg/mL)を10mMリン酸緩衝液(pH.7)を用いて固相化した。
2)37℃で60分(もしくは、4℃で一晩)保温した。
3)抗原溶液を除去し、ブロッキング溶液(1%BSA/PBS)を100μL/ウェル添加した。
4)4℃で一晩(もしくは、室温で30分)保温した。
5)1次抗体(培養上清)にブロッキング溶液を加えて、100μL/ウェル添加した。
6)室温で1時間保温した。
7)2次抗体*)をブロッキング溶液で各20,000倍に希釈し、50μL/ウェル添加した。
8)室温で30分保温した。
9)発色剤(TMBZを基質とした発色剤)を50μL/ウェル添加した。
10)吸光度を(450nm)測定し、候補となるウェルを3種類選択した。
上記一次スクリーニングで得られた候補抗体を用いて、以下の二次スクリーニングを行ない、これらの条件を満たすモノクローナル抗体を3種類得た。すなわち、(1)ウエスタンブロットによりPPは検出するが、PYYを検出せず;(2)免疫組織化学において野生型マウス膵島のPPを検出するが、Ppy欠損マウスの膵島とは交差反応しない。得られたハイブリドーマの一つを特許微生物寄託センターにNITE P−02175として寄託した。
得られたモノクローナル抗体の特性
(1)ELISA
Ppy遺伝子欠損マウスの免疫に用いた合成ペプチドとキャリアタンパク質のペプチドコンジュゲーションのSDS−PAGEによる確認結果を図1に示す。(方法:MBS法、キャリアタンパク質:KLH(免疫用)/BSA(コンシュゲーション確認用))
得られたモノクローナル抗体はELISAにおいて、BSA−mPPに反応するが、BSA−mPYYには反応しなかった。
(2)ウエスタンブロット
ELISAスクリーニングに用いたBSA−mPPペプチド結合物およびネガティブコントロールとしてBSA−mPYYペプチド結合物を用いたウエスタンブロットにより、得られたモノクローナル抗体は、mPPは検出するが、mPYYを検出しない抗体であった(図2)。
(3)免疫組織化学
得られたモノクローナル抗体を用いると、野生型マウス(Ppy+/+)の膵組織切片では、膵島内に陽性細胞が認められるが、Ppy欠損マウス(Ppycre/cre)の膵組織切片では陽性細胞が認められなかった(図3)。
Claims (6)
- (1)ELISAによりマウス膵ポリペプチドと結合するが、マウスペプチドYYと結合せず、(2)ウエスタンブロットによりマウス膵ポリペプチドは検出するが、マウスペプチドYYを検出せず、(3)免疫組織化学においてマウス膵ポリペプチド含有組織を検出するが、マウス膵ポリペプチド非含有組織を検出せず、(4)配列番号1で示されるアミノ酸配列を認識し、受託番号NITE P−02175で寄託されているハイブリドーマが産生する、抗マウス膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメント。
- 免疫抗原として配列番号1で示される配列を有するポリペプチドでPpy欠損マウスを免疫する工程を含む請求項1に記載の抗マウス膵ポリペプチドモノクローナル抗体の作製方法。
- 請求項1に記載の抗マウス膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメントを含有する、マウス膵ポリペプチド又はマウス膵ポリペプチド含有組織の検出用試薬。
- 請求項1に記載の抗マウス膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメントを用いることを特徴とするマウス膵ポリペプチド又はマウス膵ポリペプチド含有組織の検出方法。
- 前記抗マウス膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメントが標識物質によって標識されている、請求項4に記載の膵ポリペプチド又は膵ポリペプチド含有組織の検出方法。
- 受託番号NITE P−02175で寄託されている、請求項1に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
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