CN116102651A - 抗gpc3抗体 - Google Patents
抗gpc3抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116102651A CN116102651A CN202310167019.4A CN202310167019A CN116102651A CN 116102651 A CN116102651 A CN 116102651A CN 202310167019 A CN202310167019 A CN 202310167019A CN 116102651 A CN116102651 A CN 116102651A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amino acid
- acid sequence
- seq
- chain
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 347
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 309
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 308
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 284
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 269
- 101001014668 Homo sapiens Glypican-3 Proteins 0.000 claims abstract description 132
- 102100032530 Glypican-3 Human genes 0.000 claims abstract description 118
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 59
- 101150058049 car gene Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 23
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 19
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 18
- 102000048373 human GPC3 Human genes 0.000 claims description 14
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 11
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 claims description 10
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 10
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 claims description 10
- 102000010956 Glypican Human genes 0.000 claims description 9
- 108050001154 Glypican Proteins 0.000 claims description 9
- 108050007237 Glypican-3 Proteins 0.000 claims description 8
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 claims description 8
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 170
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 abstract description 16
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 abstract description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 612
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 227
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 164
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 111
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 83
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 74
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 74
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 65
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 49
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 description 47
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 47
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 45
- 101150068248 CDR1 gene Proteins 0.000 description 42
- 101150107439 CDR3 gene Proteins 0.000 description 42
- 101150013690 Cdr2 gene Proteins 0.000 description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 16
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 15
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 10
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 10
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 8
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 8
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 8
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 7
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 7
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 229940127084 other anti-cancer agent Drugs 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 101000713106 Homo sapiens C-C motif chemokine 19 Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 6
- 102100036842 C-C motif chemokine 19 Human genes 0.000 description 5
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 5
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- -1 cd3ζ Proteins 0.000 description 5
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 4
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 2
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 2
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101100166600 Homo sapiens CD28 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000801234 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 206010041826 Squamous cell carcinoma of lung Diseases 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 102100033728 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Human genes 0.000 description 2
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 2
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 2
- 201000003707 ovarian clear cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 1
- LKJPYSCBVHEWIU-KRWDZBQOSA-N (R)-bicalutamide Chemical compound C([C@@](O)(C)C(=O)NC=1C=C(C(C#N)=CC=1)C(F)(F)F)S(=O)(=O)C1=CC=C(F)C=C1 LKJPYSCBVHEWIU-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 101710197633 Actin-1 Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 1
- 101710148099 Blue fluorescence protein Proteins 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 101150044533 CCL19 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010032795 CD8 receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- PTOAARAWEBMLNO-KVQBGUIXSA-N Cladribine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(Cl)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 PTOAARAWEBMLNO-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N Dansyl Chloride Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(Cl)(=O)=O XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N Dasatinib Chemical compound C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1Cl ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009051 Embryonal Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- SAMRUMKYXPVKPA-VFKOLLTISA-N Enocitabine Chemical compound O=C1N=C(NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SAMRUMKYXPVKPA-VFKOLLTISA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102220473219 Glycodelin_H52A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 1
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 1
- 101100005546 Homo sapiens CCL19 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101100337462 Homo sapiens GPC3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 1
- 101100508566 Homo sapiens IL7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000777628 Homo sapiens Leukocyte antigen CD37 Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 1
- 101000934341 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N Idarubicin Natural products C1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2CC(O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N Idarubicin Chemical compound C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2C[C@@](O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 description 1
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 description 1
- 239000005551 L01XE03 - Erlotinib Substances 0.000 description 1
- 239000002147 L01XE04 - Sunitinib Substances 0.000 description 1
- 239000002067 L01XE06 - Dasatinib Substances 0.000 description 1
- 102100031586 Leukocyte antigen CD37 Human genes 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108010061593 Member 14 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N Pravastatin Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940079156 Proteasome inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100025244 T-cell surface glycoprotein CD5 Human genes 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 102100028785 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Human genes 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 1
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 1
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229960001686 afatinib Drugs 0.000 description 1
- ULXXDDBFHOBEHA-CWDCEQMOSA-N afatinib Chemical compound N1=CN=C2C=C(O[C@@H]3COCC3)C(NC(=O)/C=C/CN(C)C)=CC2=C1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 ULXXDDBFHOBEHA-CWDCEQMOSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002203 alpha-beta t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 229960002707 bendamustine Drugs 0.000 description 1
- YTKUWDBFDASYHO-UHFFFAOYSA-N bendamustine Chemical compound ClCCN(CCCl)C1=CC=C2N(C)C(CCCC(O)=O)=NC2=C1 YTKUWDBFDASYHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 229960000997 bicalutamide Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229960001467 bortezomib Drugs 0.000 description 1
- GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N bortezomib Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)B(O)O)NC(=O)C=1N=CC=NC=1)C1=CC=CC=C1 GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N 0.000 description 1
- 229940046731 calcineurin inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 1
- 190000008236 carboplatin Chemical compound 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960002436 cladribine Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960003901 dacarbazine Drugs 0.000 description 1
- 229960002448 dasatinib Drugs 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229950011487 enocitabine Drugs 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 229960001433 erlotinib Drugs 0.000 description 1
- AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N erlotinib Chemical compound C=12C=C(OCCOC)C(OCCOC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(C#C)=C1 AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 description 1
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000004475 gamma-delta t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960002584 gefitinib Drugs 0.000 description 1
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 1
- 229960000908 idarubicin Drugs 0.000 description 1
- 229960001101 ifosfamide Drugs 0.000 description 1
- HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N ifosfamide Chemical compound ClCCNP1(=O)OCCCN1CCCl HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002411 imatinib Drugs 0.000 description 1
- KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N imatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 1
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 1
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002965 pravastatin Drugs 0.000 description 1
- TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N pravastatin Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@H](CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)[C@H]2[C@@H](OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@H](O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000003207 proteasome inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002910 rare earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960001796 sunitinib Drugs 0.000 description 1
- WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N sunitinib Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=C(C)NC(\C=C/2C3=CC(F)=CC=C3NC\2=O)=C1C WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960001967 tacrolimus Drugs 0.000 description 1
- QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N tacrolimus Natural products CO[C@H]1C[C@H](CC[C@@H]1O)C=C(C)[C@H]2OC(=O)[C@H]3CCCCN3C(=O)C(=O)[C@@]4(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]4C)OC)[C@@H](C[C@H](C)CC(=C[C@@H](CC=C)C(=O)C[C@H](O)[C@H]2C)C)OC QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001174—Proteoglycans, e.g. glypican, brevican or CSPG4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464474—Proteoglycans, e.g. glypican, brevican or CSPG4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5418—IL-7
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/303—Liver or Pancreas
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
Abstract
本发明涉及抗GPC3抗体。本发明的课题在于提供:与现有的抗体(例如GC33、GC199)识别不同的表位、并且即使在单链抗体的状态下也可以与局部存在于细胞膜的GPC3特异性结合的抗GPC3抗体;含有所述抗GPC3单链抗体的CAR;表达所述CAR的免疫活性细胞;上述抗GPC3抗体基因或CAR基因;含有所述抗GPC3抗体基因或CAR基因的载体;导入有所述载体的宿主细胞;特异性检测GPC3的方法;以及用于特异性检测GPC3的试剂盒。含有权利要求1中所定义的特定的重链CDR1~3和特定的轻链CDR1~3且与来源于人的GPC3多肽特异性结合的抗体与局部存在于细胞膜的GPC3特异性结合。基于含有所述单链抗体的CAR制作的CAR‑免疫活性细胞在癌症免疫疗法中有用。
Description
本申请是申请日为2018年1月10日、申请号为201880006069.1(国际申请号为PCT/JP2018/000257)、发明名称为“抗GPC3抗体”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及:与GPC3(Glypican-3,磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)特异性结合的抗体(抗GPC3抗体);含有抗GPC3单链抗体、融合于所述抗GPC3单链抗体的羧基(C)末端的跨膜区和融合于所述跨膜区的C末端的免疫活性细胞活化信号转导区的嵌合抗原受体(ChimericAntigen Receptor:以下也称为“CAR”);表达CAR的免疫活性细胞;抗GPC3抗体基因或CAR基因;含有抗GPC3抗体基因或CAR基因的载体;导入有所述载体的宿主细胞;检测GPC3的方法;以及用于检测GPC3的试剂盒。
背景技术
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)在胚胎组织、特别是肝脏和肾脏中表达,是与器官形成相关的细胞外基质蛋白。在成人组织中,在胎盘以外观察不到GPC3的表达,但是在肝细胞癌、黑素瘤、卵巢透明细胞癌、肺鳞状细胞癌等各种癌组织中观察到表达。可见,GPC3与甲胎蛋白(α-fetoprotein;AFP)、癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen;CEA)等蛋白质同样地是在胚胎组织中表达的蛋白质,因此被归类为胚胎性癌抗原。即,GPC3显示出在正常组织细胞中不表达、但在癌细胞中特异性表达的特征,因此作为癌症治疗的靶分子、肿瘤标志物及诊断标志物有用。
GPC3是作为器官形成中的细胞外基质发挥细胞粘附作用、或作为细胞生长因子的受体起作用的蛋白聚糖家族之一。在位于GPC3的羧基(C)末端侧的第560位的丝氨酸上添加有GPI(Glycosylphosphatidylinositol,糖基磷脂酰肌醇)锚。GPI锚担负着与细胞膜脂质形成共价键而使GPC3局部存在于细胞表面上的作用。另外,GPC3的第495位的丝氨酸和第509位的丝氨酸被硫酸乙酰肝素链(HS链)进行了修饰。已知HS链调节Wnt信号、FGF信号、BMP信号等多个生长信号转导途径。已知相关的生长信号转导途径根据癌症种类而有所不同,例如,肝细胞癌(HCC)中,刺激Wnt信号途径而进行细胞增殖。作为磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族共通的特征,在胞外域富含16个半胱氨酸,认为形成多个分子内二硫键而有助于立体结构形成的稳定化。据报道,细胞膜表面的GPC3有可能被弗林蛋白酶转化酶(furinconvertase)在第358位的精氨酸(R)和第359位的丝氨酸(S)之间(R358/S359)切断。但是,GPC3的氨基(N)末端亚基由于通过分子内二硫键发生了交联,因此认为,即使在被弗林蛋白酶转化酶切断为N末端侧亚基及C末端侧亚基这两部分时,可能两者也不解离、而是保持全长型的结构,关于可溶性GPC3的结构尚无定论。可见,局部存在于细胞膜的GPC3的立体结构也包括GPC3的同种型的结构在内,不明之处仍较多。
由于细胞膜上的GPC3的结构复杂,因此认为,在制作针对GPC3的抗体时期望以最简单的结构区域为表位。作为现有的抗GPC3抗体的代表,有BioMosaics,Inc.所销售的单克隆抗体1G12。该抗体为如下得到的抗体:将避开GPC3的复杂结构、局部存在而设计的抗原(GPC3的C末端侧70个残基的多肽)免疫于Balb/c小鼠,制作杂交瘤,通过使用该抗原的筛选而得到。另外,日本国内制药厂家所开发的抗体GC33及GC199也是基于同样的构思而建立的单克隆抗体,是以GPC3的C末端侧部分片段为抗原而得到的抗体(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利第4011100号公报
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于提供:与现有的抗体(例如GC33、GC199)识别不同的表位、并且即使在单链抗体的状态下也可以与局部存在于细胞膜的GPC3特异性结合的抗GPC3抗体;含有所述抗GPC3单链抗体的CAR;表达所述CAR的免疫活性细胞;上述抗GPC3抗体基因或CAR基因;含有所述抗GPC3抗体基因或CAR基因的载体;导入有所述载体的宿主细胞;特异性检测GPC3的方法;以及用于特异性检测GPC3的试剂盒。
用于解决问题的方法
本发明人为了解决上述课题持续进行了深入研究。在该过程中,通过与建立杂交瘤的以往单克隆抗体制作方法不同的、噬菌体展示法制作了新型抗GPC3抗体。具体而言,使用来自用全长的人GPC3进行了免疫的小鼠的B细胞合成抗体基因的免疫文库,将基因重构成至单链抗体(single chain Fv;scFv)文库中,并整合至噬菌体展示,使其在噬菌体表面表达,使用重组全长人GPC3及该GPC3表达细胞株,根据需要进一步使用作为竞争物的上述现有抗体的表位、即GPC3的C末端侧多肽进行生物淘选,从而制作抗GPC3抗体。另外,已确认所制作的抗GPC3抗体在使用表达嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor:CAR)的T细胞(以下有时称为“CAR-T细胞”)的癌症免疫疗法中是有用的。本发明是基于这些见解而完成的。
即,本发明如下所述。
[1]一种抗体(以下有时称为“本申请抗体”),其是与由序列号155所示的氨基酸序列构成的来源于人GPC3(Glypican-3)的多肽特异性结合的抗体,其中,
(1-1)含有:由序列号1所示的氨基酸序列构成的重链互补决定区(CDR)1、由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号3所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号5所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;
(2-1)含有:由序列号11所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号12所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号13所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号14所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号15所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;
(3-1)含有:由序列号21所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号22所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号23所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号24所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号25所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号26所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;
(4-1)含有:由序列号31所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号32所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号33所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号34所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号35所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号36所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;
(5-1)含有:由序列号41所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号42所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号43所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号44所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号45所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号46所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;
(6-1)含有:由序列号51所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号52所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号53所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号54所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号55所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号56所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;
(7-1)含有:由序列号61所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号62所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号63所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号64所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号65所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号66所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;
(8-1)含有:由序列号71所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号72所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号73所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号74所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号75所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号76所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;
(9-1)含有:由序列号81所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号82所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号83所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号84所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号85所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号86所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;
(10-1)含有:由序列号91所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号92所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号93所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号94所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号95所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号96所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;或者
(11-1)含有:由序列号101所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号102所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号103所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号104所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号105所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号106所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3。
[2]根据上述[1]所述的抗体,其中,
(1-2)含有:由与序列号7所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号8所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;
(2-2)含有:由与序列号17所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号18所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;
(3-2)含有:由与序列号27所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号28所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;
(4-2)含有:由与序列号37所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号38所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;
(5-2)含有:由与序列号47所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号48所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;
(6-2)含有:由与序列号57所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号58所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;
(7-2)含有:由与序列号67所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号68所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;
(8-2)含有:由与序列号77所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号78所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;
(9-2)含有:由与序列号87所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号88所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;
(10-2)含有:由与序列号97所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号98所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;或者
(11-2)含有:由与序列号107所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号108所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区。
[3]根据上述[1]或[2]中任一项所述的抗体,其为单链抗体。
[4]根据上述[3]所述的抗体,其中,单链抗体
(1-3)含有与序列号165所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(2-3)含有与序列号166所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(3-3)含有与序列号167所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(4-3)含有与序列号168所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(5-3)含有与序列号169所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(6-3)含有与序列号170所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(7-3)含有与序列号171所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(8-3)含有与序列号172所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(9-3)含有与序列号173所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(10-3)含有与序列号174所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;或者
(11-3)含有与序列号175所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列。
[5]根据上述[3]所述的抗体,其中,单链抗体
(1-3’-1)含有与序列号178所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(1-3’-2)含有与序列号179所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(1-3’-3)含有与序列号180所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(2-3’-1)含有与序列号181所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(2-3’-2)含有与序列号182所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(2-3’-3)含有与序列号183所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;或者
(2-3’-4)含有与序列号184所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列。
[6]根据上述[1]或[2]所述的抗体,其中,
(1-4)含有:由与序列号9所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号10所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;
(2-4)含有:由与序列号19所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号20所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;
(3-4)含有:由与序列号29所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号30所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;
(4-4)含有:由与序列号39所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号40所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;
(5-4)含有:由与序列号49所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号50所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;
(6-4)含有:由与序列号59所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号60所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;
(7-4)含有:由与序列号69所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号70所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;
(8-4)含有:由与序列号79所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号80所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;
(9-4)含有:由与序列号89所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号90所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;
(10-4)含有:由与序列号99所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号100所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;或者
(11-4)含有:由与序列号109所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号110所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链。
[7]一种CAR(以下有时称为“本申请CAR”),其含有上述[3]~[5]中任一项所述的抗体(以下有时称为“本申请单链抗体”)、融合于本申请单链抗体的羧基末端的跨膜区和融合于上述跨膜区的羧基末端的免疫活性细胞活化信号转导区。
[8]根据上述[7]所述的CAR,其含有序列号185~187中的任一者所示的氨基酸序列。
[9]一种免疫活性细胞(以下有时称为“本申请免疫活性细胞”),其表达上述[7]或[8]所述的CAR。
[10]根据上述[9]所述的免疫活性细胞,其还表达白细胞介素7(IL-7)及趋化因子配体19(CCL19)。
[11]一种编码上述[1]~[6]中任一项所述的抗体的抗体基因(以下有时称为“本申请抗体基因”)或者编码上述[7]或[8]所述的CAR的CAR基因(以下有时称为“本申请CAR基因”)。
[12]一种抗体基因,其编码上述[1]~[4]及[6]中任一项所述的抗体。
[13]一种载体(以下有时称为“本申请载体”),其含有启动子和可操作地连接在该启动子的下游的上述[11]所述的抗体基因或上述[11]所述的编码CAR的CAR基因。
[14]一种载体,其含有启动子和可操作地连接在该启动子的下游的上述[12]所述的抗体基因。
[15]一种宿主细胞(以下有时称为“本申请宿主细胞”),其导入有上述[13]或[14]所述的载体。
[16]一种GPC3的检测方法(以下有时称为“本申请检测方法”),其具备:使用上述[1]~[6]中任一项所述的抗体检测GPC3(Glypican-3)的步骤。
[17]一种GPC3(Glypican-3)的检测用试剂盒(以下有时称为“本申请检测用试剂盒”),其含有上述[1]~[6]中任一项所述的抗体或其标记物。
作为本发明的另一个实施方式,可列举本申请抗体的制造方法,其具备:对非人动物(例如小鼠、大鼠)免疫用于在GPC3的检测中使用的本申请抗体、由序列号157所示的氨基酸序列构成的全长人GPC3的步骤;由来自上述免疫非人动物的B细胞的总RNA通过逆转录反应合成cDNA,扩增抗体基因,制作抗体基因文库的步骤;以及由上述抗体基因文库构建scFv噬菌体文库,使其感染于大肠杆菌并表达scFv,对于所得到的噬菌体文库,使用上述全长人GPC3、该GPC3表达细胞株、根据需要进一步使用作为竞争物的GPC3的C末端侧多肽(由序列号156所示的氨基酸序列构成的来源于人的GPC3多肽)进行生物淘选的步骤。
发明效果
本申请抗体是不仅在IgG型的状态下、在scFv型的状态下也与局部存在于细胞膜的GPC3特异性结合的抗体。另外,使用本申请抗体作为CAR中的scFv的CAR-T细胞具有优良的细胞杀伤活性及IFN-γ产生能力。因此,本申请抗体在癌症免疫疗法中有用。
附图说明
图1是示出由5种系列(A~E系列)构成的生物淘选的各轮(步骤)的图。A系列中,以固定于磁珠的重组GPC3为诱饵进行3轮生物淘选,在第4~5轮中以GPC3表达细胞株为诱饵进行生物淘选(第5轮仅对1413#3实施)。需要说明的是,在第1~4轮中添加现有的抗GPC3抗体(GC33及GC199)作为竞争抗体。B系列中,在A系列的第2轮之后在竞争抗体存在下以GPC3表达细胞为诱饵进行生物淘选。E系列中,在A系列的第3轮之后在无竞争抗体的条件下以固定于磁珠的重组GPC3为诱饵进行生物淘选。C系列中,在不存在竞争抗体的条件下以GPC3表达细胞株为诱饵进行2轮及以固定于磁珠的重组GPC3为诱饵进行2轮,共计进行4轮。D系列中,在不存在竞争抗体的条件下与A系列同样地进行生物淘选。
图2是示出使用18种抗GPC3 scFv克隆(TF1413-02d023、02d028、02d030、02d039、02e003、02e004、02e014、02e030、02e040、03e001、03e004、03e005、03e015、03e016、03e019、03e027、03e034及03e045)及现有的抗GPC3抗体(GC33及GC199)与3种细胞株(GPC3 N末端片段表达细胞株、GPC3 C末端片段表达细胞株及GPC3[全长]表达细胞株)进行流式细胞术(FCM)的结果的图。图中的数值是以将基于FCM的不表达GPC3的细胞株(SK-Hep-1细胞株)的荧光强度设为1时的相对值来示出的。
图3是示出使用由11种scFv克隆(TF1413-02d028、02d039、02e004、02e014、02e030、02e040、03e001、03e004、03e005、03e015及03e034)制作的IgG抗体及现有的抗GPC3抗体(GC33及GC199)与3种细胞株(GPC3 N末端片段表达细胞株、GPC3 C末端片段表达细胞株及GPC3[全长]表达细胞株)进行FCM的结果的图。
图4是示出使用通过3种方法(EDTA、胰蛋白酶及“EDTA+胶原酶”)处理后的GPC3表达细胞株与3种抗体的组合(用APC进行了标记的抗小鼠IgG抗体[以下有时称为“APC抗小鼠IgG抗体”]、以及APC抗小鼠IgG抗体与scFv克隆[TF1413-02d028]抗体的组合)进行FACS(fluorescence activated cell sorting,荧光激活细胞分选)的结果的图。
图5是示出对于来自5种scFv克隆(TF1413-02d028、TF1413-02d039、TF1413-02e014、TF1413-02e030及TF1413-03e005)的GPC3 CAR-T细胞(表达识别GPC3的scFv的CAR的T细胞)分析针对Sk-HEP-1GPC3细胞株的细胞杀伤活性的结果的图。各图表中,右侧的峰表示CD45阳性细胞(GPC3 CAR-T细胞),左侧的峰表示CD45阴性细胞(残存癌细胞[Sk-HEP-1GPC3细胞])。各图表中的纵轴表示细胞数。各图表中的数值表示CD45阳性细胞相对于总细胞数(CD45阳性细胞及CD45阴性细胞)的比例(%)。作为对照,使用不表达GPC3 CAR的T细胞(图中的“未感染”)。
图6是示出图5中的CD45阴性细胞的比例(图6的A)及CD45阴性细胞数(图6的B)的图表。在成对的柱状图中,左侧的柱状图表示“mock(空白对照)”(Sk-HEP-1mock细胞株),右侧的柱状图表示“GPC3”(Sk-HEP-1GPC3细胞株)。
图7是示出对来自5种scFv克隆(TF1413-02d028、TF1413-02d039、TF1413-02e014、TF1413-02e030及TF1413-03e005)的GPC3 CAR-T细胞分析针对Sk-HEP-1GPC3细胞株的IFN-γ产生能力的结果的图。作为对照,使用不表达GPC3 CAR的T细胞(图中的“未感染”)。
具体实施方式
本申请抗体是含有上述(1-1)~(11-1)中的任一重(H)链及轻(L)链的CDR1~3、并且以由序列号155所示的氨基酸序列构成的来源于人的GPC3多肽(由序列号157所示的氨基酸序列构成的来源于人的全长GPC3的第32~471位的氨基酸残基[外显子1~7]所构成的氨基[N]末端侧多肽)的至少一部分(通常在3~30个氨基酸残基的范围内,优选为4~20个氨基酸残基,更优选为5~15个氨基酸残基)为表位进行特异性结合的抗体,并且是不仅在IgG型的状态下、在scFv型的状态下也与局部存在于细胞膜的GPC3特异性结合的抗体,通常包含含有上述(1-1)~(11-1)中的任一H链CDR1~3的H链可变区与含有上述(1-1)~(11-1)中的任一L链CDR1~3的L链可变区。这里,“特异性结合”是指:通过抗原-抗体间的高特异性的识别机制而识别由序列号155所示的氨基酸序列构成的多肽并进行结合的抗体。因此,本申请抗体不是与由序列号156所示的氨基酸序列构成的来源于人的GPC3多肽(由序列号157所示的氨基酸序列构成的来源于人的全长GPC3的第472~580位的氨基酸残基[外显子8~9]所构成的羧基[C]末端侧多肽)特异性结合的抗体。
本申请抗体的来源、种类、分类、形态等没有特别限制,例如本申请抗体中包括:人源抗体;小鼠、大鼠等非人动物源抗体;多克隆抗体、寡克隆抗体(数种~数十种抗体的混合物)、单克隆抗体;将抗体的一部分区域(例如恒定区)置换为来自不同生物种的区域而成的嵌合抗体或人源化抗体、将单克隆抗体用胃蛋白酶消化而得到的F(ab′)2抗体片段、将F(ab′)2抗体片段还原而得到的Fab′抗体片段、将单克隆抗体用木瓜蛋白酶消化而得到的Fab等抗体片段、将抗体重(H)链可变区和抗体轻(H)链可变区通过氨基酸交联而连接的scFv等重组抗体;等。在将本申请抗体作为CAR使用的情况下,优选scFv。
本申请抗体优选为经分离的抗体。这里,“经分离”是指通过人工操作将抗体从原本存在的环境中取出、或者使抗体在与原本所存在的环境不同的环境中表达等,从而抗体以与原本存在的状态不同的状态存在。即,“经分离的抗体”中不包括:作为来自某一个体的抗体的、并且未施加外在操作(人工操作)而包含在该个体的体内或来自体内的组织或者体液(血液、血浆、血清等)中的状态的抗体。另外,本申请抗体优选为通过人工操作而制作的抗体(例如上述重组抗体)。所述“来自通过人工操作而制作的细胞的抗体、由该细胞产生的抗体”中,不包括未实施人工操作的抗体、例如由天然存在的B细胞产生的抗体。
本申请抗体通常在H链及L链的CDR1~3的各区域的N末端及C末端连接有框架区(FR)。作为所述FR中的H链FR,可列举:连接于H链CDR1的N末端的H链FR1、连接于H链CDR1的C末端(H链CDR2的N末端)的H链FR2、连接于H链CDR2的C末端(H链CDR3的N末端)的H链FR3、连接于H链CDR3的C末端的H链FR4。另外,作为上述FR中的L链FR,可列举:连接于L链CDR1的N末端的L链FR1、连接于L链CDR1的C末端(L链CDR2的N末端)的L链FR2、连接于L链CDR2的C末端(L链CDR3的N末端)的L链FR3、连接于L链CDR3的C末端的L链FR4。
作为上述H链FR1,具体可列举:(1-HFR1)由序列号7所示的氨基酸序列的第1~30位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(2-HFR1)由序列号17所示的氨基酸序列的第1~30位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(3-HFR1)由序列号27所示的氨基酸序列的第1~30位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(4-HFR1)由序列号37所示的氨基酸序列的第1~30位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(5-HFR1)由序列号47所示的氨基酸序列的第1~30位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(6-HFR1)由序列号57所示的氨基酸序列的第1~30位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(7-HFR1)由序列号67所示的氨基酸序列的第1~30位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(8-HFR1)由序列号77所示的氨基酸序列的第1~30位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(9-HFR1)由序列号87所示的氨基酸序列的第1~30位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(10-HFR1)由序列号97所示的氨基酸序列的第1~30位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;或者(11-HFR1)由序列号107所示的氨基酸序列的第1~30位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽。
作为上述H链FR2,具体可列举:(1-HFR2)由序列号7所示的氨基酸序列的第36~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(2-HFR2)由序列号17所示的氨基酸序列的第36~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(3-HFR2)由序列号27所示的氨基酸序列的第36~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(4-HFR2)由序列号37所示的氨基酸序列的第36~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(5-HFR2)由序列号47所示的氨基酸序列的第36~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(6-HFR2)由序列号57所示的氨基酸序列的第36~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(7-HFR2)由序列号67所示的氨基酸序列的第36~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(8-HFR2)由序列号77所示的氨基酸序列的第36~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(9-HFR2)由序列号87所示的氨基酸序列的第36~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(10-HFR2)由序列号97所示的氨基酸序列的第36~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;或者(11-HFR2)由序列号107所示的氨基酸序列的第36~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽。
作为上述H链FR3,具体可列举:(1-HFR3)由序列号7所示的氨基酸序列的第67~98位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(2-HFR3)由序列号17所示的氨基酸序列的第67~98位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(3-HFR3)由序列号27所示的氨基酸序列的第67~98位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(4-HFR3)由序列号37所示的氨基酸序列的第67~99位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(5-HFR3)由序列号47所示的氨基酸序列的第67~99位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(6-HFR3)由序列号57所示的氨基酸序列的第67~98位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(7-HFR3)由序列号67所示的氨基酸序列的第67~98位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(8-HFR3)由序列号77所示的氨基酸序列的第67~98位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(9-HFR3)由序列号87所示的氨基酸序列的第67~99位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(10-HFR3)由序列号97所示的氨基酸序列的第67~98位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;或者(11-HFR3)由序列号107所示的氨基酸序列的第67~98位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽。
作为上述H链FR4,具体可列举:(1-HFR4)由序列号7所示的氨基酸序列的第109~118位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(2-HFR4)由序列号17所示的氨基酸序列的第108~117位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(3-HFR4)由序列号27所示的氨基酸序列的第106~115位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(4-HFR4)由序列号37所示的氨基酸序列的第111~120位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(5-HFR4)由序列号47所示的氨基酸序列的第108~117位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(6-HFR4)由序列号57所示的氨基酸序列的第107~116位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(7-HFR4)由序列号67所示的氨基酸序列的第106~115位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(8-HFR4)由序列号77所示的氨基酸序列的第106~115位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(9-HFR4)由序列号87所示的氨基酸序列的第111~120位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(10-HFR4)由序列号97所示的氨基酸序列的第110~119位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;或者(11-HFR4)由序列号107所示的氨基酸序列的第109~118位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽。
作为上述L链FR1,具体可列举:(1-LFR1)由序列号8所示的氨基酸序列的第1~23位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(2-LFR1)由序列号18所示的氨基酸序列的第1~23位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(3-LFR1)由序列号28所示的氨基酸序列的第1~23位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(4-LFR1)由序列号38所示的氨基酸序列的第1~23位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(5-LFR1)由序列号48所示的氨基酸序列的第1~23位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(6-LFR1)由序列号58所示的氨基酸序列的第1~23位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(7-LFR1)由序列号68所示的氨基酸序列的第1~23位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(8-LFR1)由序列号78所示的氨基酸序列的第1~23位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(9-LFR1)由序列号88所示的氨基酸序列的第1~23位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(10-LFR1)由序列号98所示的氨基酸序列的第1~23位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;或者(11-LFR1)由序列号108所示的氨基酸序列的第1~23位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽。
作为上述L链FR2,具体可列举:(1-LFR2)由序列号8所示的氨基酸序列的第35~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(2-LFR2)由序列号18所示的氨基酸序列的第40~54位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(3-LFR2)由序列号28所示的氨基酸序列的第35~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(4-LFR2)由序列号38所示的氨基酸序列的第35~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(5-LFR2)由序列号48所示的氨基酸序列的第41~55位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(6-LFR2)由序列号58所示的氨基酸序列的第35~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(7-LFR2)由序列号68所示的氨基酸序列的第35~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(8-LFR2)由序列号78所示的氨基酸序列的第35~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(9-LFR2)由序列号88所示的氨基酸序列的第35~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(10-LFR2)由序列号98所示的氨基酸序列的第35~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;或者(11-LFR2)由序列号108所示的氨基酸序列的第35~49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽。
作为上述L链FR3,具体可列举:(1-LFR3)由序列号8所示的氨基酸序列的第57~88位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(2-LFR3)由序列号18所示的氨基酸序列的第62~93位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(3-LFR3)由序列号28所示的氨基酸序列的第57~88位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(4-LFR3)由序列号38所示的氨基酸序列的第57~88位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(5-LFR3)由序列号48所示的氨基酸序列的第63~94位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(6-LFR3)由序列号58所示的氨基酸序列的第57~88位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(7-LFR3)由序列号68所示的氨基酸序列的第57~88位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(8-LFR3)由序列号78所示的氨基酸序列的第57~88位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(9-LFR3)由序列号88所示的氨基酸序列的第57~88位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(10-LFR3)由序列号98所示的氨基酸序列的第57~88位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;或者(11-LFR3)由序列号108所示的氨基酸序列的第57~88位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽。
作为上述L链FR4,具体可列举:(1-LFR4)由序列号8所示的氨基酸序列的第98~108位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(2-LFR4)由序列号18所示的氨基酸序列的第103~113位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(3-LFR4)由序列号28所示的氨基酸序列的第97~107位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(4-LFR4)由序列号38所示的氨基酸序列的第98~108位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(5-LFR4)由序列号48所示的氨基酸序列的第104~114位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(6-LFR4)由序列号58所示的氨基酸序列的第98~108位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(7-LFR4)由序列号68所示的氨基酸序列的第98~108位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(8-LFR4)由序列号78所示的氨基酸序列的第98~108位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(9-LFR4)由序列号88所示的氨基酸序列的第98~108位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;(10-LFR4)由序列号98所示的氨基酸序列的第98~108位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽;或者(11-LFR4)由序列号108所示的氨基酸序列的第98~108位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽。
作为本申请抗体的FR,优选为已知的人抗体的FR。作为所述“已知的人抗体的FR”,可列举例如GenBank等公知的序列数据库中所登录的人抗体的FR、选自来自人抗体的各亚群的共有序列(Human Most Homologous Consensus Sequence;Kabat,E.A.等人的Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and HumanServices,1991)的FR等。
本申请抗体中的H链CDR1通常在基于kabat的编号(参照文献“kabat,E.A.et al.,(1991)NIH Publication No.91-3242,sequences of proteins of immunologicalinterest”)中存在于H31~35的位置。另外,本申请抗体中的H链CDR2通常在基于kabat的编号中存在于H50~52、H52A及H53~65的位置。另外,本申请抗体中的H链CDR3通常在基于kabat的编号中存在于H95~100、H100A、H100B、H101及H102的位置。另外,本申请抗体中的L链CDR1通常在基于kabat的编号中存在于L24~34的位置。另外,本申请抗体中的L链CDR2通常在基于kabat的编号中存在于L50~56的位置。另外,本申请抗体中的L链CDR3通常在基于kabat的编号中存在于L89~97的位置。
作为本申请抗体中的、含有上述(1-1)的H链及L链的CDR1~3的抗体,可列举含有上述(1-2)的H链及L链的可变(V)区的抗体,具体可列举:上述(1-3)的单链抗体;上述(1-3’-1)的单链抗体、上述(1-3’-2)的单链抗体及上述(1-3’-3)的单链抗体;含有上述(1-4)的H链及L链的抗体。另外,作为含有上述(2-1)的H链及L链的CDR1~3的抗体,可列举含有上述(2-2)的H链及L链的V区的抗体,具体可列举:上述(2-3)的单链抗体;上述(2-3’-1)的单链抗体、上述(2-3’-2)的单链抗体、上述(2-3’-3)的单链抗体及上述(2-3’-4)的单链抗体;含有上述(2-4)的H链及L链的抗体。另外,作为含有上述(3-1)的H链及L链的CDR1~3的抗体,可列举含有上述(3-2)的H链及L链的V区的抗体,具体可列举:上述(3-3)的单链抗体;含有上述(3-4)的H链及L链的抗体。另外,作为含有上述(4-1)的H链及L链的CDR1~3的抗体,可列举含有上述(4-2)的H链及L链的V区的抗体,具体可列举:上述(4-3)的单链抗体;含有上述(4-4)的H链及L链的抗体。另外,作为含有上述(5-1)的H链及L链的CDR1~3的抗体,可列举含有上述(5-2)的H链及L链的V区的抗体,具体可列举:上述(5-3)的单链抗体;含有上述(5-4)的H链及L链的抗体。另外,作为含有上述(6-1)的H链及L链的CDR1~3的抗体,可列举含有上述(6-2)的H链及L链的V区的抗体,具体可列举:上述(6-3)的单链抗体;含有上述(6-4)的H链及L链的抗体。另外,作为含有上述(7-1)的H链及L链的CDR1~3的抗体,可列举含有上述(7-2)的H链及L链的V区的抗体,具体可列举:上述(7-3)的单链抗体;含有上述(7-4)的H链及L链的抗体。另外,作为含有上述(8-1)的H链及L链的CDR1~3的抗体,可列举含有上述(8-2)的H链及L链的V区的抗体,具体可列举:上述(8-3)的单链抗体;含有上述(8-4)的H链及L链的抗体。另外,作为含有上述(9-1)的H链及L链的CDR1~3的抗体,可列举含有上述(9-2)的H链及L链的V区的抗体,具体可列举:上述(9-3)的单链抗体;含有上述(9-4)的H链及L链的抗体。另外,作为含有上述(10-1)的H链及L链的CDR1~3的抗体,可列举含有上述(10-2)的H链及L链的V区的抗体,具体可列举:上述(10-3)的单链抗体;含有上述(10-4)的H链及L链的抗体。另外,作为含有上述(11-1)的H链及L链的CDR1~3的抗体,可列举含有上述(11-2)的H链及L链的V区的抗体,具体可列举:上述(11-3)的单链抗体;含有上述(11-4)的H链及L链的抗体。需要说明的是,单链抗体中的重链可变区及轻链可变区通常借助肽接头而结合。
作为本申请CAR,只要含有本申请单链抗体、融合于本申请单链抗体的C末端的跨膜区和融合于所述跨膜区的C末端的免疫活性细胞活化信号转导区即可,在此,本申请单链抗体与跨膜区之间、以及跨膜区与免疫活性细胞活化信号转导区之间可以借助肽接头或IgG4铰链区而融合。
作为本申请抗体中的肽接头的长度,可列举例如1~100个氨基酸残基、优选10~50个氨基酸残基。另外,作为本申请抗体中的肽接头,具体可列举3个由1~4个甘氨酸和1个丝氨酸构成的氨基酸序列连续地连接而形成的接头。
作为上述跨膜区,只要是能够贯穿细胞膜的肽即可,可列举例如来自CD8、T细胞受体的α、β链、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、EGFR(epidermal growth factor receptor,表皮生长因子受体)或GITR的跨膜区,具体可列举由序列号185所示的氨基酸序列的第1~83位的氨基酸残基构成的人CD8跨膜区。另外,作为上述跨膜区,也可以是能够贯穿细胞膜的肽的C末端侧的1~10个氨基酸残基、优选6~7个氨基酸残基被去除后的肽,可列举例如:由序列号186所示的氨基酸序列的第1~77位的氨基酸残基构成的上述人CD8跨膜区的改造体1、由序列号187所示的氨基酸序列的第1~76位的氨基酸残基构成的上述人CD8跨膜区的改造体2。
作为上述免疫活性细胞活化信号转导区,只要是本申请单链抗体结合到人GPC3上时能够向免疫活性细胞内进行信号转导的区域即可,优选含有选自CD28、4-1BB(CD137)、GITR、CD27,OX40、HVEM、CD3ζ、Fc受体相关γ链(Fc Receptor-associatedγchain)的胞内区的多肽中的至少一种或两种以上,更优选含有CD28、4-1BB及CD3ζ的胞内区的多肽这3种。作为所述CD28的胞内区的多肽,具体可列举由序列号185所示的氨基酸序列的第85~124位的氨基酸残基构成的人CD28的胞内区的多肽。另外,作为上述“4-1BB的胞内区的多肽”,具体可列举由序列号185所示的氨基酸序列的第125~170位的氨基酸残基构成的人4-1BB的胞内区的多肽。另外,作为上述CD3ζ的胞内区的多肽,具体可列举由序列号185所示的氨基酸序列的第172~283位的氨基酸残基构成的人CD3ζ的胞内区的多肽。
需要说明的是,序列号185所示的氨基酸序列的第84位的精氨酸(Arg)、序列号186所示的氨基酸序列的第78位的精氨酸、序列号187所示的氨基酸序列的第77位的精氨酸为上述来自人CD8的跨膜区的多肽与上述人CD28的胞内区的多肽的共有序列。另外,序列号185所示的氨基酸序列的第171位的亮氨酸(Leu)、序列号186所示的氨基酸序列的第165位的亮氨酸、序列号187所示的氨基酸序列的第164位的亮氨酸为上述人4-1BB的胞内区的多肽与上述人CD3ζ的胞内区的多肽的共有序列。
本说明书中,“免疫活性细胞”是指在生物体内担负免疫功能的细胞。作为免疫活性细胞,可列举例如:T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、B细胞等淋巴细胞类细胞;单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等抗原呈递细胞;嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞等粒细胞。具体而言,优选列举来自人、狗、猫、猪、小鼠等哺乳动物的T细胞,优选为来自人的T细胞。另外,T细胞可以由血液、骨髓液等体液以及脾脏、胸腺、淋巴结等组织、或者浸润到原发肿瘤、转移肿瘤、癌性腹水等癌组织的免疫活性细胞中分离、纯化而得到,还可以利用由ES细胞、iPS细胞制作的T细胞。作为所述T细胞,可列举α-βT细胞、γ-δT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、肿瘤浸润T细胞、记忆T细胞、初始T细胞、NKT细胞。需要说明的是,免疫活性细胞的来源和给药对象可以相同也可以不同。进而,当给药对象为人时,作为免疫活性细胞,可以使用采自作为给药对象的患者本人的自体细胞,也可以使用采自他人的异体细胞。即,供体与受体可以一致也可以不一致,优选一致。
作为上述给药对象,可优选列举哺乳动物或哺乳动物细胞,所述哺乳动物中,可更优选列举人、小鼠、狗、大鼠、豚鼠、兔、鸟、绵羊、猪、牛、马、猫、猴、黑猩猩,可特别优选列举人。
本申请CAR优选用于在癌症治疗中在采自癌症患者的免疫活性细胞的细胞表面上进行离体表达。在使用T细胞作为免疫活性细胞的情况下,作为由本申请CAR中的跨膜区和融合于所述跨膜区的C末端的免疫活性细胞活化信号转导区构成的肽,具体可列举由序列号185~187中的任一者所示的氨基酸序列构成的肽。另外,作为本申请CAR,具体可列举:包含选自由上述(1-3)的单链抗体、上述(2-3)的单链抗体、上述(1-3’-1)的单链抗体、上述(1-3’-2)的单链抗体、上述(1-3’-3)的单链抗体、上述(2-3’-1)的单链抗体、上述(2-3’-2)的单链抗体、上述(2-3’-3)的单链抗体和上述(2-3’-4)的单链抗体组成的组中的单链抗体、以及融合于所述单链抗体的C末端的由序列号185~187中的任一者所示的氨基酸序列构成的肽的CAR。
即,作为上述本申请CAR,可列举:
含有上述(1-3)的单链抗体和由序列号185所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(1-3)的单链抗体和由序列号186所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(1-3)的单链抗体和由序列号187所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(1-3’-1)的单链抗体和由序列号185所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(1-3’-1)的单链抗体和由序列号186所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(1-3’-1)的单链抗体和由序列号187所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(1-3’-2)的单链抗体和由序列号185所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(1-3’-2)的单链抗体和由序列号186所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(1-3’-2)的单链抗体和由序列号187所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(1-3’-3)的单链抗体和由序列号185所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(1-3’-3)的单链抗体和由序列号186所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(1-3’-3)的单链抗体和由序列号187所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(2-3)的单链抗体和由序列号185所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(2-3)的单链抗体和由序列号186所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(2-3)的单链抗体和由序列号187所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(2-3’-1)的单链抗体和由序列号185所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(2-3’-1)的单链抗体和由序列号186所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(2-3’-1)的单链抗体和由序列号187所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(2-3’-2)的单链抗体和由序列号185所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(2-3’-2)的单链抗体和由序列号186所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(2-3’-2)的单链抗体和由序列号187所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(2-3’-3)的单链抗体和由序列号185所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(2-3’-3)的单链抗体和由序列号186所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(2-3’-3)的单链抗体和由序列号187所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(2-3’-4)的单链抗体和由序列号185所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(2-3’-4)的单链抗体和由序列号186所示的氨基酸序列构成的肽的CAR;
含有上述(2-3’-4)的单链抗体和由序列号187所示的氨基酸序列构成的肽的CAR。
作为本申请免疫活性细胞,只要是表达CAR的免疫活性细胞即可,由于CAR通常在天然条件下不存在,因此是表达外源性、而非内源性的CAR的免疫活性细胞。作为本申请免疫活性细胞,优选还表达IL-7和/或CCL19。在免疫活性细胞为未见IL-7和/或CCL19的表达的细胞、例如T细胞的情况下或者免疫活性细胞为T细胞以外的IL-7和/或CCL19的表达低的细胞的情况下,作为本申请免疫活性细胞,优选为表达外源性的IL-7和/或CCL19的免疫活性细胞。
本申请免疫活性细胞可以通过将含有本申请CAR基因的本申请载体、含有IL-7和/或CCL19基因的载体导入到免疫活性细胞中来制作。作为导入方法,只要是向哺乳动物细胞中导入DNA的方法即可,可列举例如电穿孔法(Cytotechnology,3,133(1990))、磷酸钙法(日本特开平2-227075号公报)、脂质体转染法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84,7413(1987))、病毒感染法等方法。作为所述病毒感染法,可列举下述方法:将CAR表达载体(国际公开2016/056228号小册子)和包装质粒转染于GP2-293细胞(宝生物公司制)、Plat-GP细胞(Cosmo Bio公司制)、PG13细胞(ATCC CRL-10686)、PA317细胞(ATCC CRL-9078)等包装细胞而制作重组病毒,使所述重组病毒感染于T细胞。
另外,本申请免疫活性细胞也可以通过将编码本申请CAR的核苷酸、编码IL-7和/或CCL19的核苷酸用公知的基因编辑技术按照能够在适当的启动子的控制下表达的方式整合到细胞的基因组中来制造。作为公知的基因编辑技术,可列举使用锌指核酸酶、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeat,成簇的规律间隔的短回文重复序列)-Cas系统等核酸内切酶的技术。
本申请免疫活性细胞可以与其它抗癌剂组合使用。作为其它抗癌剂,可列举:环磷酰胺、苯达莫司汀、异环磷酰胺、达卡巴嗪等烷基化药;喷司他丁、氟达拉滨、克拉屈滨、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、依诺他滨等代谢拮抗药;利妥昔单抗、西妥昔单抗、曲妥珠单抗等分子靶向药;伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、达沙替尼、舒尼替尼、曲美替尼等激酶抑制剂;硼替佐米等蛋白酶体抑制剂;环孢菌素、他克莫司等钙调神经磷酸酶抑制药;伊达比星、多柔比星、丝裂霉素C等抗癌性抗生素;伊立替康、依托泊苷等植物生物碱;顺铂、奥沙利铂、卡铂等铂制剂;他莫昔芬、比卡鲁胺等激素疗法药;干扰素、纳武单抗、派姆单抗等免疫控制药。
作为上述“将本申请免疫活性细胞与其它抗癌剂组合使用”的方法,可列举:使用其它抗癌剂进行处理,然后使用本申请免疫活性细胞的方法;同时使用本申请免疫活性细胞和其它抗癌剂的方法;使用本申请免疫活性细胞进行处理,然后使用其它抗癌剂的方法。另外,在将本申请免疫活性细胞与其它抗癌剂组合使用时,癌的治疗效果进一步提高并且减少各自的给药次数或给药量,由此,能够进一步降低单独使用所带来的副作用。
作为本申请抗体基因,只要为编码本申请抗体的抗体基因(核苷酸)则没有特别限制,可列举例如:
(1-1D)含有:由序列号111所示的核苷酸序列构成的H链V区的第91~105位的核苷酸残基所构成的H链CDR1基因(编码上述(1-1)的H链CDR1的基因)、或该H链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号111所示的核苷酸序列构成的H链V区的第148~198位的核苷酸残基所构成的H链CDR2基因(编码上述(1-1)的H链CDR2的基因)、或该H链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号111所示的核苷酸序列构成的H链V区的第295~324位的核苷酸残基所构成的H链CDR3基因(编码上述(1-1)的H链CDR3的基因)、或该H链CDR3基因的简并密码子改造体;和
由序列号112所示的核苷酸序列构成的L链V区的第70~102位的核苷酸残基所构成的L链CDR1基因(编码上述(1-1)的L链CDR1的基因)、或该L链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号112所示的核苷酸序列构成的L链V区的第148~168位的核苷酸残基所构成的L链CDR2基因(编码上述(1-1)的L链CDR2的基因)、或该L链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号112所示的核苷酸序列构成的L链V区的第265~291位的核苷酸残基所构成的L链CDR3基因(编码上述(1-1)的L链CDR3的基因)、或该L链CDR3基因的简并密码子改造体的抗体基因,
(2-1D)含有:由序列号115所示的核苷酸序列构成的H链V区的第91~105位的核苷酸残基所构成的H链CDR1基因(编码上述(2-1)的H链CDR1的基因)、或该H链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号115所示的核苷酸序列构成的H链V区的第148~198位的核苷酸残基所构成的H链CDR2基因(编码上述(2-1)的H链CDR2的基因)、或该H链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号115所示的核苷酸序列构成的H链V区的第295~321位的核苷酸残基所构成的H链CDR3基因(编码上述(2-1)的H链CDR3的基因)、或该H链CDR3基因的简并密码子改造体;和
由序列号116所示的核苷酸序列构成的L链V区的第70~117位的核苷酸残基所构成的L链CDR1基因(编码上述(2-1)的L链CDR1的基因)、或该L链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号116所示的核苷酸序列构成的L链V区的第163~183位的核苷酸残基所构成的L链CDR2基因(编码上述(2-1)的L链CDR2的基因)、或该L链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号116所示的核苷酸序列构成的L链V区的第280~306位的核苷酸残基所构成的L链CDR3基因(编码上述(2-1)的L链CDR3的基因)、或该L链CDR3基因的简并密码子改造体的抗体基因,
(3-1D)含有:由序列号119所示的核苷酸序列构成的H链V区的第91~105位的核苷酸残基所构成的H链CDR1基因(编码上述(3-1)的H链CDR1的基因)、或该H链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号119所示的核苷酸序列构成的H链V区的第148~198位的核苷酸残基所构成的H链CDR2基因(编码上述(3-1)的H链CDR2的基因)、或该H链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号119所示的核苷酸序列构成的H链V区的第295~315位的核苷酸残基所构成的H链CDR3基因(编码上述(3-1)的H链CDR3的基因)、或该H链CDR3基因的简并密码子改造体;和
由序列号120所示的核苷酸序列构成的L链V区的第70~102位的核苷酸残基所构成的L链CDR1基因(编码上述(3-1)的L链CDR1的基因)、或该L链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号120所示的核苷酸序列构成的L链V区的第148~168位的核苷酸残基所构成的L链CDR2基因(编码上述(3-1)的L链CDR2的基因)、或该L链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号120所示的核苷酸序列构成的L链V区的第265~288位的核苷酸残基所构成的L链CDR3基因(编码上述(3-1)的L链CDR3的基因)、或该L链CDR3基因的简并密码子改造体的抗体基因,
(4-1D)含有:由序列号123所示的核苷酸序列构成的H链V区的第91~105位的核苷酸残基所构成的H链CDR1基因(编码上述(4-1)的H链CDR1的基因)、或该H链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号123所示的核苷酸序列构成的H链V区的第148~198位的核苷酸残基所构成的H链CDR2基因(编码上述(4-1)的H链CDR2的基因)、或该H链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号123所示的核苷酸序列构成的H链V区的第298~330位的核苷酸残基所构成的H链CDR3基因(编码上述(4-1)的H链CDR3的基因)、或该H链CDR3基因的简并密码子改造体;和
由序列号124所示的核苷酸序列构成的L链V区的第70~102位的核苷酸残基所构成的L链CDR1基因(编码上述(4-1)的L链CDR1的基因)、或该L链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号124所示的核苷酸序列构成的L链V区的第148~168位的核苷酸残基所构成的L链CDR2基因(编码上述(4-1)的L链CDR2的基因)、或该L链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号124所示的核苷酸序列构成的L链V区的第265~291位的核苷酸残基所构成的L链CDR3基因(编码上述(4-1)的L链CDR3的基因)、或该L链CDR3基因的简并密码子改造体的抗体基因,
(5-1D)含有:由序列号127所示的核苷酸序列构成的H链V区的第91~105位的核苷酸残基所构成的H链CDR1基因(编码上述(5-1)的H链CDR1的基因)、或该H链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号127所示的核苷酸序列构成的H链V区的第148~198位的核苷酸残基所构成的H链CDR2基因(编码上述(5-1)的H链CDR2的基因)、或该H链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号127所示的核苷酸序列构成的H链V区的第298~321位的核苷酸残基所构成的H链CDR3基因(编码上述(5-1)的H链CDR3的基因)、或该H链CDR3基因的简并密码子改造体;和
由序列号128所示的核苷酸序列构成的L链V区的第70~120位的核苷酸残基所构成的L链CDR1基因(编码上述(5-1)的L链CDR1的基因)、或该L链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号128所示的核苷酸序列构成的L链V区的第166~186位的核苷酸残基所构成的L链CDR2基因(编码上述(5-1)的L链CDR2的基因)、或该L链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号128所示的核苷酸序列构成的L链V区的第283~309位的核苷酸残基所构成的L链CDR3基因(编码上述(5-1)的L链CDR3的基因)、或该L链CDR3基因的简并密码子改造体的抗体基因,
(6-1D)含有:由序列号131所示的核苷酸序列构成的H链V区的第91~105位的核苷酸残基所构成的H链CDR1基因(编码上述(6-1)的H链CDR1的基因)、或该H链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号131所示的核苷酸序列构成的H链V区的第148~198位的核苷酸残基所构成的H链CDR2基因(编码上述(6-1)的H链CDR2的基因)、或该H链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号131所示的核苷酸序列构成的H链V区的第295~318位的核苷酸残基所构成的H链CDR3基因(编码上述(6-1)的H链CDR3的基因)、或该H链CDR3基因的简并密码子改造体;和
由序列号132所示的核苷酸序列构成的L链V区的第70~102位的核苷酸残基所构成的L链CDR1基因(编码上述(6-1)的L链CDR1的基因)、或该L链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号132所示的核苷酸序列构成的L链V区的第148~168位的核苷酸残基所构成的L链CDR2基因(编码上述(6-1)的L链CDR2的基因)、或该L链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号132所示的核苷酸序列构成的L链V区的第265~291位的核苷酸残基所构成的L链CDR3基因(编码上述(6-1)的L链CDR3的基因)、或该L链CDR3基因的简并密码子改造体的抗体基因,
(7-1D)含有:由序列号135所示的核苷酸序列构成的H链V区的第91~105位的核苷酸残基所构成的H链CDR1基因(编码上述(7-1)的H链CDR1的基因)、或该H链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号135所示的核苷酸序列构成的H链V区的第148~198位的核苷酸残基所构成的H链CDR2基因(编码上述(7-1)的H链CDR2的基因)、或该H链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号135所示的核苷酸序列构成的H链V区的第295~315位的核苷酸残基所构成的H链CDR3基因(编码上述(7-1)的H链CDR3的基因)、或该H链CDR3基因的简并密码子改造体;和
由序列号136所示的核苷酸序列构成的L链V区的第70~102位的核苷酸残基所构成的L链CDR1基因(编码上述(7-1)的L链CDR1的基因)、或该L链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号136所示的核苷酸序列构成的L链V区的第148~168位的核苷酸残基所构成的L链CDR2基因(编码上述(7-1)的L链CDR2的基因)、或该L链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号136所示的核苷酸序列构成的L链V区的第265~291位的核苷酸残基所构成的L链CDR3基因(编码上述(7-1)的L链CDR3的基因)、或该L链CDR3基因的简并密码子改造体的抗体基因,
(8-1D)含有:由序列号139所示的核苷酸序列构成的H链V区的第91~105位的核苷酸残基所构成的H链CDR1基因(编码上述(8-1)的H链CDR1的基因)、或该H链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号139所示的核苷酸序列构成的H链V区的第148~198位的核苷酸残基所构成的H链CDR2基因(编码上述(8-1)的H链CDR2的基因)、或该H链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号139所示的核苷酸序列构成的H链V区的第295~315位的核苷酸残基所构成的H链CDR3基因(编码上述(8-1)的H链CDR3的基因)、或该H链CDR3基因的简并密码子改造体;和
由序列号140所示的核苷酸序列构成的L链V区的第70~102位的核苷酸残基所构成的L链CDR1基因(编码上述(8-1)的L链CDR1的基因)、或该L链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号140所示的核苷酸序列构成的L链V区的第148~168位的核苷酸残基所构成的L链CDR2基因(编码上述(8-1)的L链CDR2的基因)、或该L链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号140所示的核苷酸序列构成的L链V区的第265~291位的核苷酸残基所构成的L链CDR3基因(编码上述(8-1)的L链CDR3的基因)、或该L链CDR3基因的简并密码子改造体的抗体基因,
(9-1D)含有:由序列号143所示的核苷酸序列构成的H链V区的第91~105位的核苷酸残基所构成的H链CDR1基因(编码上述(9-1)的H链CDR1的基因)、或该H链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号143所示的核苷酸序列构成的H链V区的第148~198位的核苷酸残基所构成的H链CDR2基因(编码上述(9-1)的H链CDR2的基因)、或该H链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号143所示的核苷酸序列构成的H链V区的第298~330位的核苷酸残基所构成的H链CDR3基因(编码上述(9-1)的H链CDR3的基因)、或该H链CDR3基因的简并密码子改造体;和
由序列号144所示的核苷酸序列构成的L链V区的第70~102位的核苷酸残基所构成的L链CDR1基因(编码上述(9-1)的L链CDR1的基因)、或该L链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号144所示的核苷酸序列构成的L链V区的第148~168位的核苷酸残基所构成的L链CDR2基因(编码上述(9-1)的L链CDR2的基因)、或该L链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号144所示的核苷酸序列构成的L链V区的第265~291位的核苷酸残基所构成的L链CDR3基因(编码上述(9-1)的L链CDR3的基因)、或该L链CDR3基因的简并密码子改造体的抗体基因,
(10-1D)含有:由序列号147所示的核苷酸序列构成的H链V区的第91~105位的核苷酸残基所构成的H链CDR1基因(编码上述(10-1)的H链CDR1的基因)、或该H链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号147所示的核苷酸序列构成的H链V区的第148~198位的核苷酸残基所构成的H链CDR2基因(编码上述(10-1)的H链CDR2的基因)、或该H链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号147所示的核苷酸序列构成的H链V区的第295~327位的核苷酸残基所构成的H链CDR3基因(编码上述(10-1)的H链CDR3的基因)、或该H链CDR3基因的简并密码子改造体;和
由序列号148所示的核苷酸序列构成的L链V区的第70~102位的核苷酸残基所构成的L链CDR1基因(编码上述(10-1)的L链CDR1的基因)、或该L链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号148所示的核苷酸序列构成的L链V区的第148~168位的核苷酸残基所构成的L链CDR2基因(编码上述(10-1)的L链CDR2的基因)、或该L链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号148所示的核苷酸序列构成的L链V区的第265~291位的核苷酸残基所构成的L链CDR3基因(编码上述(10-1)的L链CDR3的基因)、或该L链CDR3基因的简并密码子改造体的抗体基因,
(11-1D)含有:由序列号151所示的核苷酸序列构成的H链V区的第91~105位的核苷酸残基所构成的H链CDR1基因(编码上述(11-1)的H链CDR1的基因)、或该H链CDR1基因的简并密码子改造体;由序列号151所示的核苷酸序列构成的H链V区的第148~198位的核苷酸残基所构成的H链CDR2基因(编码上述(11-1)的H链CDR2的基因)、或该H链CDR2基因的简并密码子改造体;及由序列号151所示的核苷酸序列构成的H链V区的第295~324位的核苷酸残基所构成的H链CDR3基因(编码上述(11-1)的H链CDR3的基因)、或该H链CDR3基因的简并密码子改造体的抗体基因。
进而,作为本申请抗体基因,可列举:
(1-2D)含有:由与序列号111所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链可变区基因(编码由与序列号7所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链可变区的基因)、和由与序列号112所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链可变区基因(编码由与序列号8所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链可变区的基因)的抗体基因;
(2-2D)含有:由与序列号115所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链可变区基因(编码由与序列号17所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链可变区的基因)、和由与序列号116所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链可变区基因(编码由与序列号18所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链可变区的基因)的抗体基因;
(3-2D)含有:由与序列号119所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链可变区基因(编码由与序列号27所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链可变区的基因)、和由与序列号120所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链可变区基因(编码由与序列号28所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链可变区的基因)的抗体基因;
(4-2D)含有:由与序列号123所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链可变区基因(编码由与序列号37所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链可变区的基因)、和由与序列号124所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链可变区基因(编码由与序列号38所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链可变区的基因)的抗体基因;
(5-2D)含有:由与序列号127所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链可变区基因(编码由与序列号47所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链可变区的基因)、和由与序列号128所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链可变区基因(编码由与序列号48所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链可变区的基因)的抗体基因;
(6-2D)含有:由与序列号131所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链可变区基因(编码由与序列号57所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链可变区的基因)、和由与序列号132所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链可变区基因(编码由与序列号58所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链可变区的基因)的抗体基因;
(7-2D)含有:由与序列号135所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链可变区基因(编码由与序列号67所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链可变区的基因)、和由与序列号136所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链可变区基因(编码由与序列号68所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链可变区的基因)的抗体基因;
(8-2D)含有:由与序列号139所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链可变区基因(编码由与序列号77所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链可变区的基因)、和由与序列号140所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链可变区基因(编码由与序列号78所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链可变区的基因)的抗体基因;
(9-2D)含有:由与序列号143所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链可变区基因(编码由与序列号87所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链可变区的基因)、和由与序列号144所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链可变区基因(编码由与序列号88所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链可变区的基因)的抗体基因;
(10-2D)含有:由与序列号147所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链可变区基因(编码由与序列号97所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链可变区的基因)、和由与序列号148所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链可变区基因(编码由与序列号98所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链可变区的基因)的抗体基因;
(11-2D)含有:由与序列号151所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链可变区基因(编码由与序列号107所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链可变区的基因)、和由与序列号152所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链可变区基因(编码由与序列号108所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链可变区的基因)的抗体基因。
特别是,作为本申请抗体基因,具体可列举:
(1-4D)含有:由与序列号113所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链基因(编码由与序列号9所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链的基因)、和由与序列号114所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链基因(编码由与序列号10所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链的基因)的抗体基因;
(2-4D)含有:由与序列号117所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链基因(编码由与序列号19所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链的基因)、和由与序列号118所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链基因(编码由与序列号20所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链的基因)的抗体基因;
(3-4D)含有:由与序列号121所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链基因(编码由与序列号29所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链的基因)、和由与序列号122所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链基因(编码由与序列号30所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链的基因)的抗体基因;
(4-4D)含有:由与序列号125所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链基因(编码由与序列号39所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链的基因)、和由与序列号126所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链基因(编码由与序列号40所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链的基因)的抗体基因;
(5-4D)含有:由与序列号129所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链基因(编码由与序列号49所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链的基因)、和由与序列号130所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链基因(编码由与序列号50所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链的基因)的抗体基因;
(6-4D)含有:由与序列号133所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链基因(编码由与序列号59所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链的基因)、和由与序列号134所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链基因(编码由与序列号60所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链的基因)的抗体基因;
(7-4D)含有:由与序列号137所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链基因(编码由与序列号69所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链的基因)、和由与序列号138所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链基因(编码由与序列号70所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链的基因)的抗体基因;
(8-4D)含有:由与序列号141所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链基因(编码由与序列号79所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链的基因)、和由与序列号142所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链基因(编码由与序列号80所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链的基因)的抗体基因;
(9-4D)含有:由与序列号145所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链基因(编码由与序列号89所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链的基因)、和由与序列号146所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链基因(编码由与序列号90所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链的基因)的抗体基因;
(10-4D)含有:由与序列号149所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链基因(编码由与序列号99所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链的基因)、和由与序列号150所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链基因(编码由与序列号100所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链的基因)的抗体基因;
(11-4D)含有:由与序列号153所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链基因(编码由与序列号109所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链的基因)、和由与序列号154所示的核苷酸序列具有至少80%以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链基因(编码由与序列号110所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链的基因)的抗体基因。
作为本申请CAR基因,只要是编码本申请CAR的基因(核苷酸)则没有特别限制,具体可列举例如:
(1-3D)含有编码上述(1-3)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因;
(2-3D)含有编码上述(2-3)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因;
(3-3D)含有编码上述(3-3)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因;
(4-3D)含有编码上述(4-3)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因;
(5-3D)含有编码上述(5-3)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因;
(6-3D)含有编码上述(6-3)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因;
(7-3D)含有编码上述(7-3)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因;
(8-3D)含有编码上述(8-3)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因;
(9-3D)含有编码上述(9-3)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因;
(10-3D)含有编码上述(10-3)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因;
(11-3D)含有编码上述(11-3)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因;
(1-3’-1D)含有编码上述(1-3’-1)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因;
(1-3’-2D)含有编码上述(1-3’-2)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因;
(1-3’-3D)含有编码上述(1-3’-3)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因;
(2-3’-1D)含有编码上述(2-3’-1)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因;
(2-3’-2D)含有编码上述(2-3’-2)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因;
(2-3’-3D)含有编码上述(2-3’-3)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因;
(2-3’-4D)含有编码上述(2-3’-4)的单链抗体的基因、或该基因的简并密码子改造体的CAR基因。
本说明书中,“至少80%以上的一致性”是指一致性为80%以上,是指优选为85%以上、更优选为88%以上、进一步优选为90%以上、进一步更优选为93%以上、特别是优选为95%以上、特别是更优选为98%以上、最优选为100%的一致性。
本说明书中,术语“一致性”是指多肽或多核苷酸序列近似性的程度(其由查询序列与其它序列、优选同一类型的序列(核酸或者蛋白质序列)的匹配来决定)。作为计算或确定“一致性”的优选的计算机程序法,可列举GCG BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.1990,215:403-410;Altschul et al.,NucleicAcids Res.1997,25:3389-3402;Devereux et al.,Nucleic Acid Res.1984,12:387)、以及BLASTN 2.0(Gish W.,http://blast.wustl.edu,1996-2002)、以及FASTA(Pearson及Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988,85:2444-2448)、以及确定并比对最长重复的一对重叠群的GCG GelMerge(Wibur及Lipman,SIAM J.Appl.Math.1984,44:557-567;Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol.1970,48:443-453),但不限于这些。
本说明书中,“与序列号X所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列”换句话说是“在序列号X所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加0、1或者数个氨基酸残基而成的氨基酸序列”且与序列号X所示的氨基酸具有同等功能。在此,“缺失、置换、插入和/或添加1或者数个氨基酸残基而成的氨基酸序列”是指:缺失、置换、插入和/或添加例如1~30个的范围内、优选为1~20个的范围内、更优选为1~15个的范围内、进一步优选为1~10个的范围内、进一步优选为1~5个的范围内、进一步优选为1~3个的范围内、进一步优选为1~2个的范围内的数量的氨基酸残基而成的氨基酸序列。这些氨基酸残基的突变处理可以通过化学合成、基因工程方法、诱变等本领域技术人员已知的任意方法来进行。
作为本申请载体中的启动子,只要是使位于启动子下游的本申请抗体基因所编码的mRNA的转录开始的区域即可,启动子中通常含有转录起始点(TSS)。
本申请载体中的启动子、载体的种类可根据所导入的宿主细胞(或宿主生物)的种类适宜选择。
作为宿主细胞,只要是使本申请抗体基因被转录从而表达本申请抗体、或使本申请CAR基因的mRNA被转录从而表达本申请CAR的宿主细胞即可,在导入“含有本申请抗体基因的载体”作为本申请载体的情况下,可以使用以下的酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞作为宿主细胞,在导入“含有本申请CAR基因的载体”作为本申请载体的情况下,可以使用上述免疫活性细胞作为宿主细胞。
在使用酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces Pombe)等)作为宿主细胞的情况下,作为本申请载体,可列举例如YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)等载体或来自所述载体的载体,作为启动子,可列举例如己糖激酶等糖酵解基因的启动子、PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal1启动子、gal10启动子、热休克蛋白启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等。
另外,在使用哺乳动物细胞(例如来自人的那马瓦(Namalwa)细胞、来自猴的COS细胞、来自中国仓鼠卵巢的CHO细胞、来自人或小鼠等的T细胞等)作为宿主细胞且本申请载体为含有抗体基因的载体时,作为本申请载体,可列举例如pcDNAI、pcDM8(Funakoshi公司制)、pAGE107(日本特开平3-22979号公报;Cytotechnology,3,133,(1990))、pAS3-3(日本特开平2-227075号公报)、pCDM8(Nature,329,840,(1987))、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司制)、pREP4(Invitrogen公司制)、pAGE103(J.Biochemistry,101,1307(1987))、pAGE210等载体或来自所述载体的载体。另一方面,在使用哺乳动物细胞(例如来自人的上述免疫活性细胞等)作为宿主细胞且本申请载体为含有CAR基因的载体时,作为本申请载体,可列举例如pMSGV载体(Tamada k et al.,Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002))、pMSCV载体(宝生物公司制)等逆转录病毒载体或来自所述载体的载体。
作为本申请载体中的启动子,可列举例如巨细胞病毒(CMV)的IE(immediateearly,即刻早期)基因的启动子、SV40的初始启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子、NFAT启动子、HIF启动子等。
另外,在使用昆虫细胞(例如作为草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞的Sf9细胞、Sf21细胞、作为粉纹夜蛾(Trichoplusiani)的卵巢细胞的High5细胞等)作为宿主细胞的情况下,作为本申请载体,可列举例如重组杆状病毒制作法中使用的转移载体,具体而言,可列举pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(均为Invitorogen公司制)等载体或来自所述载体的载体,作为启动子,可以列举例如多角体蛋白启动子、p10启动子等。
另外,在使用植物细胞(例如烟草、马铃薯、番茄、胡萝卜、大豆、油菜籽、苜蓿、水稻、小麦、大麦等)作为宿主细胞时,作为表达载体,可列举例如Ti质粒、烟草花叶病毒载体等载体或来自所述载体的载体,作为启动子,可列举例如花椰菜花叶病毒病毒(CaMV)的35S启动子、水稻肌动蛋白1启动子等。
作为本申请载体,可以为了进一步提高基因表达效率而优选进一步包含增强子区域、核糖体结合区域(RBS;ribosome binding site)的碱基序列,可以为了筛选本申请宿主细胞而优选含有与宿主细胞的种类相应的药剂抗性基因(例如壮观霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、遗传霉素抗性基因等)。增强子区域通常配置在启动子的上游,RBS通常配置在启动子与本申请基因之间。整合到本申请载体中的本申请抗体基因的核苷酸序列可以配合进行表达的宿主细胞来进行密码子序列的优化。本申请载体可以利用基因重组技术通过公知的方法制作。
本申请宿主细胞可以通过将本申请载体利用与宿主细胞的种类相应的方法导入(转染)到宿主细胞中来得到。
在使用上述酵母作为宿主细胞的情况下,作为本申请载体向酵母中导入的方法,只要是将DNA导入到酵母中的方法即可,可列举例如电穿孔法(Methods.Enzymol.,194,182(1990))、原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,84,1929(1978))、乙酸锂法(J.Bacteriology,153,163(1983))等方法。
另外,在使用上述哺乳动物细胞作为宿主细胞的情况下,作为本申请载体向哺乳动物细胞中导入的方法,只要是将DNA导入到哺乳动物细胞中的方法即可,如上所述,可列举例如电穿孔法(Cytotechnology,3,133(1990))、磷酸钙法(日本特开平2-227075号公报)、脂质体转染法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84,7413(1987))、病毒感染法等方法。作为所述病毒感染法,如上所述,可列举将CAR表达载体(国际公开2016/056228号小册子)和包装质粒转染到GP2-293细胞(宝生物公司制)、Plat-GP细胞(Cosmo Bio公司制)、PG13细胞(ATCCCRL-10686)、PA317细胞(ATCCCRL-9078)等包装细胞中而制作重组病毒、并且使所述重组病毒感染于T细胞的方法。
另外,在使用上述昆虫细胞作为宿主细胞的情况下,作为本申请载体向昆虫细胞中导入的方法,可列举例如:按照“Current Protocols in Molecular Biology”、“Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,W.H.Freeman and Company,New York(1992)”、“Bio/Technology,6,47(1988)”等中记载的方法将本申请载体(转移载体)和来自杆状病毒的基因组DNA共转染到上述昆虫细胞中而制作重组杆状病毒的方法。作为所述共转染的方法,可列举例如磷酸钙法(日本特开平2-227075号公报)、脂质体转染法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84,7413(1987)等方法。
另外,在使用上述植物细胞作为宿主细胞的情况下,作为本申请载体向植物细胞中导入的方法,可列举例如:使用农杆菌(Agrobacterium)的方法(日本特开昭59-140885号公报、日本特开昭60-70080号公报)、电穿孔法(日本特开昭60-251887号公报)、使用粒子枪(基因枪)的方法(日本专利第2606856号公报、日本专利第2517813号公报)等方法。
本申请抗体可以通过将由上述方法得到的本申请宿主细胞在与宿主细胞相应的培养液中进行培养而得到。
另外,也可以使用转基因动物制作技术制作整合有本申请抗体基因(本申请载体)的小鼠、牛、山羊、绵羊、鸡、猪等转基因动物,由所述转基因动物的血液、乳汁等中大量产生来自本申请抗体基因的抗体。
进一步地,对非人动物(例如小鼠、大鼠)免疫含有由序列号155所示的氨基酸序列构成的来源于人的GPC3多肽的物质(GPC3多肽抗原),通过噬菌体展示法制作scFv基因的噬菌体文库,通过使用所述GPC3多肽抗原和/或表达所述GPC3多肽抗原的细胞株(优选为不表达内源性GPC3的细胞株)、并且优选进一步使用作为竞争物的由序列号159所示的氨基酸序列构成的GPC3的C末端侧多肽的生物淘选(Biopanning)法,可以得到本申请scFv。另外,还可以由用上述抗原免疫后的非人动物使用细胞融合技术制备产生抗体的杂交瘤,利用使用固定有上述抗原的板的ELISA法进行筛选,从而得到含有本申请抗体的培养上清。可以由所述培养上清使用公知的抗体纯化技术来分离、纯化本申请抗体。
作为本申请检测方法,只要是具备使用本申请抗体检测试样(例如血液、组织、尿等)中的局部存在于细胞膜的(锚定于细胞膜的)GPC3的步骤的方法即可,作为具体的检测方法,可列举使用本申请抗体的免疫荧光染色法、蛋白质印迹法、ELISA等。
作为本申请检测用试剂盒,为限定于“用于检测GPC3”的用途的、含有本申请抗体或其标记物的试剂盒,所述试剂盒中,通常含有这种试剂盒中通常使用的成分、例如载体、pH缓冲剂、稳定剂以及操作说明书、用于检测GPC3的说明书等附属资料。
在本申请检测方法、本申请检测用试剂盒中,检测对象的GPC3的生物种可以是小鼠、大鼠等非人动物,但通常为人。
作为上述本申请抗体的标记物中的标记物质,可列举例如过氧化物酶(例如、辣根过氧化物酶[HRP])、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、青霉素酶、过氧化氢酶、apo-葡萄糖氧化酶、脲酶、荧光素酶或乙酰胆碱酯酶等酶;异硫氰酸荧光素、藻胆蛋白、稀土金属螯合物、丹磺酰氯或四甲基罗丹明异硫氰酸酯等荧光物质;绿色荧光蛋白(Green Fluorescence Protein;GFP)、青色荧光蛋白(Cyan Fluorescence Protein;CFP)、蓝色荧光蛋白(Blue Fluorescence Protein;BFP)、黄色荧光蛋白(Yellow Fluorescence Protein;YFP)、红色荧光蛋白(RedFluorescence Protein;RFP)、荧光素酶(luciferase)等荧光蛋白;3H、14C、125I或者131I等放射性同位素;生物素;亲和素;或化学发光物质。
本说明书中所引用的学术文献、专利、专利申请等参考文献以其整体与分别具体地记载的内容相同的程度作为参考引入本说明书中。另外,本申请基于日本专利申请2017-001732号(2017年1月10日提交)主张优先权,其内容整体作为参考引入本说明书中。
以下,通过实施例更具体地说明本发明,但本发明的技术范围不限于这些例示。
实施例1
1.识别人GPC3的N末端侧多肽的新型抗GPC3抗体的制备
[概要]
作为用于制备抗人GPC3抗体的免疫动物,使用SKG/Jcl小鼠,作为所免疫的抗原,使用全长人GPC3蛋白。SKG/Jcl小鼠是自然罹患类风湿性关节炎的自身免疫疾病模型小鼠,已知会由于年龄增加、饲养环境而对自体成分也作出抗体产生应答。另一方面,GPC3在人和小鼠之间同源性高,通常即使对正常小鼠进行免疫也不易引起抗体产生,因此使用SKG/Jcl小鼠作为免疫动物。由免疫GPC3后的小鼠的B细胞来源的cDNA制作scFv噬菌体文库,应用噬菌体展示法来分离出抗人GPC3抗体。
免疫后的小鼠的抗血清中含有多种抗体,但需要除去产生对GPC3的特异性低的抗体、识别GPC3的C末端侧多肽的抗体的小鼠而选择产生对GPC3的N末端侧多肽具有特异性的抗体的小鼠。因此,使用ELISA和FCM来选择显示产生与GPC3的N末端侧多肽特异性结合的抗体的小鼠个体。具体而言,由来自免疫小鼠的B细胞的总RNA通过逆转录反应合成cDNA,扩增抗体基因而制作抗体基因文库。由抗体基因文库构建scFv噬菌体文库,使其感染于大肠杆菌并表达scFv,对于所得到的噬菌体文库,进行使用重组GPC3、GPC3表达细胞株及GPC3的C末端侧多肽的生物淘选,由此将表达目的scFv、即针对GPC3的N末端侧多肽的抗体的噬菌体富集。进而,对于所得到的scFv,为了分析对细胞中的GPC3、即借助GPI(Glycosylphosphatidylinositol,糖基磷脂酰肌醇)锚局部存在于(结合于)细胞膜的GPC3(膜型GPC3)的结合特异性,使用基于细胞的-ELISA、FCM进行了验证。另外,对具有结合特异性的克隆的H链可变区及L链可变区的核苷酸序列进行了测序,基于所述序列确定来自免疫小鼠的B细胞所产生的抗GPC3抗体的核苷酸序列。最后使用使GPC3的N末端侧多肽片段及C末端侧多肽片段在细胞表面表达的哺乳动物展示法,确认scFv的表位为GPC3的N末端侧多肽片段。以下示出详细的方法及结果。
1-1材料和方法
[细胞培养]
使用JHH7细胞株、HepG2细胞株及强制表达人GPC3全长的SK-Hep-1细胞株(以下有时记作“GPC3表达细胞株”)作为人GPC3表达细胞来进行抗GPC3抗体的生物淘选及筛选。JHH7细胞株为来自肝细胞癌的GPC3表达细胞株,在该细胞中稳定地表达着借助GPI(Glycosylphosphatidylinositol,糖基磷脂酰肌醇)锚与细胞膜结合的GPC3(膜型GPC3)。另一方面,HepG2细胞株与JHH7细胞株同样为来自肝细胞癌的GPC3表达细胞株,但是,其为与膜型GPC3相比、不与细胞膜结合的分泌型GPC3的表达占优势的细胞株。另外,Sk-Hep-1细胞株是未表达GPC3的来自肝细胞癌的细胞株。因此,可以通过强制表达制作仅表达膜型的全长GPC3、或表达部分外显子缺损的部分长度的膜型GPC3的细胞株。
4种细胞株(JHH7细胞株、HepG2细胞株、GPC3表达细胞株及来自人胚胎肾上皮的293T细胞株)的培养在含有10% FBS(Gibco公司制)及1%青霉素-链霉素(Gibco公司制)的DMEM培养液(Sigma-Aldrich公司制)(以下简称为“DMEM培养液”)中在37℃、5%CO2条件下进行。另外,CHO-K1细胞株的培养在含有10% FBS(Gibco公司制)的Ham's F12培养液(Sigma-Aldrich公司制)中在37℃、5%CO2条件下进行。
[免疫抗原]
将C末端添加有6×His标签的重组GPC3(R&D systems公司制)用PBS调整为0.1mg/mL,与人工佐剂TiterMax Gold(TiterMax公司制)或CFA(Freund's Adjuvant Complete,弗氏完全佐剂)(F5881、Sigma-Aldrich公司制)等量混合,制作乳液,将其作为初次免疫抗原使用。第二次以后的免疫抗原使用将重组GPC3用PBS以10~100μg/mL进行浓度调整后的液体。
[GPC3表达细胞株的制作]
将编码由序列号157所示的氨基酸序列构成的全长人GPC3的基因(由序列号160所示的核苷酸序列构成的全长人GPC3基因)插入至pcDNA3.1载体(ThermoFisher Scientific公司制)中,制作GPC3表达载体。将GPC3表达载体按照常规方法转染到SK-Hep-1细胞株中,然后,在含有G418(Roche diagnostics公司制)的DMEM培养液中培养,由此建立稳定表达GPC3全长的SK-Hep-1细胞株(GPC3表达细胞株)。
[小鼠的免疫]
将SKG/jcl小鼠(CLEA Japan,8周龄,雌性,SPF)作为免疫动物,对足垫每周一次免疫重组GPC3,合计免疫4次。从免疫开始起第5周进行采血,按照常规方法制备血清,作为抗体滴度确认用样本。
[使用ELISA的抗血清的血清抗体滴度]
为了确认免疫后的小鼠中的抗GPC3抗体产生应答,使用抗原固定化ELISA测定血清抗体滴度。将0.5或2μg/mL的重组GPC3以50μL/孔添加到96孔微孔板(Nunc公司制)中,在室温下温育1小时或在4℃下温育12小时。然后,以200μL/孔添加2% Block Ace(DS Pharma公司制)进行封闭处理。将来自GPC3免疫小鼠的血清用0.1% Block Ace/PBS溶液从100倍连续稀释至16500倍,以50μL/孔添加各稀释血清样品,在室温下温育2小时,进行抗原抗体反应处理。用含有Tween20的PBS(PBST)溶液洗涤孔后,添加2μg/mL的缀合有过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch laboratories公司制),在室温下温育2小时,进行二次抗体反应处理。用PBST溶液洗涤孔5次后,除去水分,然后以50μL/孔添加TMB底物(Thermo Fisher Scientific公司制),进行显色反应。15分钟后,以50μL/孔添加0.18M硫酸而使显色反应停止,然后,用酶标仪(Bio-Rad公司制)测定450nm和540nm的吸光度。使用由450nm的测定值减去540nm的测定值而得的校正值进行定量。
[使用FCM的抗血清中的抗体的特异性]
对于免疫后的小鼠,为了进一步确认抗血清对膜型GPC3的特异结合性,将100倍稀释的小鼠血清和5×105个细胞的GPC3表达细胞株混合,在冰上温育30分钟。加入FACS缓冲液(1%BSA/PBS溶液)进行离心处理,除去上清后,添加作为二次抗体的1μg/mL的山羊抗小鼠IgG(H+L)Alexa Fluor488(ThermoFisher Scientific公司制)100μL,在冰上温育30分钟,进行二次抗体反应处理。Alexa Fluor488的检测及荧光水平的测定使用流式细胞仪(FACSCanto)(BD Biosciences公司制)来进行。
[scFv噬菌体文库的制作]
对于通过上述[流式细胞仪]的项目中记载的方法而显示出产生了与膜型GPC3结合的抗体的小鼠,按照常规方法提取来自B细胞的总RNA,按照常规方法以总RNA为模板进行RT-PCR,从而制备cDNA。利用PCR扩增抗体H链及L链的可变区基因,将它们用柔性接头连接而形成scFv,将编码该scFv与纤维状噬菌体M13的衣壳蛋白g3p(cp3)的融合蛋白的核苷酸序列插入到pTZ19R噬菌粒载体的多克隆位点,从而制作scFv表达载体。scFv文库尺寸通过大肠杆菌DH12S株(Invitrogen公司制)的转化效率算出。使作为辅助噬菌体的M13KO7(Invitrogen公司制)感染于转化后的DH12S株,从而制作表达scFv的噬菌体文库。
[噬菌体scFv的生物淘选和克隆化]
使用借助6×His标签固定在Dynabeads His-Tag Isolation&Pulldown磁珠(VERITAS公司制)上的重组GPC3与GPC3表达细胞株的组合作为诱饵的噬菌体scFv的生物淘选按照文献“J Mol Biol.1991DeC5;222(3):581-97.”、“J Med Virol.2007Jun;79(6):852-62.”、“ProCNatl Acad Sci U S A.2008 May 20;105(20):7287-92.”、“JOURNAL OFVIROLOGY,Apr.2004,p.3325-3332Vol.78,No.7”等中记载的方法来进行。在由5种系列(A~E系列)构成的生物淘选(参照图1)的各轮(步骤)中,对多克隆的噬菌体抗体的一部分进行取样,为了确认scFv的结合特异性,按照上述[使用ELISA的抗血清的血清抗体滴度]的项目中记载的方法(使用含有噬菌体的大肠杆菌的培养上清来代替血清的方法)进行抗原固定化ELISA,并且按照下述[利用基于细胞的ELISA进行的scFv的筛选]的项目中记载的方法进行基于细胞的ELISA。需要说明的是,在所述生物淘选的各步骤中,通过使作为现有的抗GPC3抗体的GC33(中外制药公司制)和GC199(中外制药公司制)预先与诱饵结合,由此,以使与和现有抗体所识别的GPC3的C末端表位相同的部分结合的scFv噬菌体不被选择的方式进行设计。即,通过该竞争法,能够选择性地淘选出与现有的抗GPC3抗体识别不同的GPC3表位的新型抗体。使通过生物淘选而富集的噬菌体转化至大肠杆菌DH12S,将其播种到LB琼脂糖琼脂培养基中,分离单一菌落。进而,在小规模LB液体培养基中培养大肠杆菌后,提取质粒并纯化。对纯化后的质粒进行DNA测序,确定scFv的H链及L链的可变区的核苷酸序列。
[利用FCM进行的scFv的筛选]
向GPC3表达细胞株(每一样品为5×105个)中加入分泌有scFv噬菌体的培养上清100μL,混合后,在冰上温育30分钟。加入FACS缓冲液(1%BSA/PBS溶液)进行离心洗涤后,加入1μg/mL的作为二次抗体的抗小鼠抗体-alexa488(Thermo Fisher Scientific公司制),在冰上温育30分钟。然后,用流式细胞仪(FACSCanto、BD公司制)测定细胞的荧光染色。
[利用基于细胞的ELISA进行的scFv的筛选]
将每孔粘附有2×105个GPC3表达细胞的96孔微孔板中的DMEM培养液除去后,为了防止scFv对细胞、板的非特异性结合而加入2%BSA-PBS溶液,在冰上温育30分钟。然后,添加分泌有scFv噬菌体的大肠杆菌的培养上清100μL,在冰上温育45分钟后,以每孔100μL添加5μg/mL的针对融合于scFv的C末端侧的cp3的兔抗cp3抗体(MBL公司制),进一步在冰上温育45分钟。以每孔100μL添加作为抗cp3抗体检测用的三次抗体的、5000倍稀释的HRP标记抗兔IgG抗体(MBL公司制),在冰上温育45分钟后,添加作为HRP的底物的邻苯二胺(OPD)及过氧化氢,使其显色。利用从492nm的吸光度中减去作为背景的620nm下的吸光度而得的数值进行定量。需要说明的是,不使用scFv、而是使用已经转变为IgG型抗体的抗体实施基于细胞的ELISA时,上述条件中,作为该IgG型抗体的检测用的二次抗体,使用2000倍稀释的HRP标记抗小鼠IgG抗体(MBL公司制)来代替抗cp3抗体及HRP标记抗兔IgG抗体。
[scFv的可变区基因序列的确定]
对于与膜型GPC3结合的噬菌体scFv的可变区基因序列,使用作为通用引物的T7引物(由序列号176所示的核苷酸序列构成的引物)及cp3R引物(由序列号177所示的核苷酸序列构成的引物)分别作为H链V区(VH)解读用正向引物及L链V区(VL)解读用反向引物,利用测序仪(CEQ2000XL、Beckman Coulter公司制)进行解读。
[抗体表位作图中使用的细胞株的制作]
为了鉴定所克隆的scFv的表位,应用了哺乳动物展示法。将编码由人GPC3的外显子1~7构成的GPC3 N末端片段(由序列号155所示的氨基酸序列构成的多肽)的基因和编码由人GPC3的外显子8~9构成的GPC3 C末端片段(由序列号156所示的氨基酸序列构成的多肽)的基因用PCR扩增,插入到pDisplay表达载体(Thermo Fisher Scientific公司制)的多克隆位点(MSC)。需要说明的是,pDisplay表达载体是能够在目标蛋白的C末端与血小板源生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)的跨膜区融合而展示在任意的哺乳动物细胞的细胞表面的表达载体。另外,pDisplay表达载体按照在目标蛋白的N末端添加HA标签、且在上述PDGFR的C末端添加myc标签的方式构成。将上述表达GPC3 N末端片段及GPC3 C末端片段的pDisplay表达载体向SK-Hep-1细胞株、293T细胞株中进行基因导入,分离出在细胞表面表达GPC3 N末端片段、GPC3 C末端片段的细胞株(GPC3 N末端片段表达细胞株及GPC3 C末端片段表达细胞株),用于scFv的表位作图。
[利用FCM进行的抗体表位作图]
将GPC3 N末端片段表达细胞株、GPC3 C末端片段表达细胞株及GPC3表达细胞株(分别为每一样品5×105个)和分泌有scFv噬菌体的培养上清100μL混合,在冰上温育30分钟。加入FACS缓冲液(1%BSA/PBS溶液)并进行离心洗涤后,加入1μg/mL的作为二次抗体的抗小鼠抗体-alexa488(Thermo Fisher Scientific公司制),在冰上温育30分钟。然后,利用流式细胞仪(FACSCanto、BD公司制)测定细胞的荧光染色。
[重组IgG表达载体的构建]
为了进行从scFv向IgG的转换,使用Mammalian PowerExpress system(Toyobo公司制)的表达载体。在pEH1.1载体的MSC中插入编码scFv的H链可变区与来自小鼠IgG2aH链的恒定区的融合蛋白的核苷酸序列(pEH1.1-H)。另外,在pELX2.2载体的MSC中插入编码scFv的L链可变区与来自小鼠IgG2aL链的恒定区的融合蛋白的核苷酸序列(pEH2.2-L)。然后,用限制酶(BglII及SalI)从pEH2.2-L中切出EF1α启动子至L链基因的多核苷酸片段,连接于用限制酶(BglII及SalI)处理后的pEH1.1-H上,从而构建共表达抗体H链及L链的载体。
[重组IgG的表达]
将通过上述[重组IgG表达载体的构建]中记载的方法制作的抗体H链及L链的共表达载体32.6μg稀释到1.6mL的opti-MEM(Gibco公司制)中,与将Transficient转染试剂(MBL公司制)65μL稀释到1.6mL的opti-MEM而成的液体混合,在室温下温育10分钟。然后,与悬浮在10mL的DMEM培养液中的CHO-K1细胞(1×107个)混合,进行培养。在4小时后添加无血清培养基(Free Style expression CHO media[Gibco公司制]),再培养4~6天,回收含有重组抗体的培养上清。
[抗体的亲和纯化]
向空柱(Bio-Rad公司制)中填充Protein G Sepharose 4Fast Flow(GEhealthcare公司制)或Bipo Resin Protein L(Protein Express公司制)柱,达到1mL柱床体积后,用10倍柱床体积量的PBS洗涤柱树脂。将用0.22微米过滤器过滤后的培养上清添加到柱中,将抗体捕获到柱内的蛋白G或蛋白L后,将柱用10倍柱床体积量的PBS洗涤,从而洗去非特异性吸附的杂质。使用100mM甘氨酸-HCl(pH2.7)溶液洗脱抗体,将洗脱液用1MTris-HCl(pH8.5)中和pH。用吸光度计nanoDrop(Thermo fisher scientific公司制)测定280nm的吸光度,算出抗体浓度。对于作为竞争抗体使用的GC33抗体及GC199抗体,也通过同样的方法设计、制作表达载体。
1-2结果
[免疫后的小鼠的抗血清评价]
从用重组GPC3免疫了4次的SKG/jcl小鼠中采血,确认血清中是否产生了针对GPC3的抗体,结果,通过针对重组GPC3的ELIS和针对GPC3表达细胞的FCM的实验检测到对GPC3具有结合性的抗体。将其中2只抗体滴度特别高的小鼠(个体编号1413#2、1413#3)作为抗体文库制作源。
[噬菌体文库的构建]
根据转化效率计算而预估的scFv文库数在小鼠1413#2的情况下为5.8×107、在小鼠1413#3的情况下为4.3×108。本实施例中制作的免疫球蛋白文库是由用作为抗原的GPC3进行免疫、观察到针对目标抗原的抗体应答的小鼠制作的文库,因此特征是,具有即使在文库尺寸小的情况下,包含目标抗体基因的可能性也高。另外,与随机的合成抗体文库相比,包含在生物体内形成正确的立体结构的抗体这一点也是有利特征。
[利用单克隆scFv的序列分析进行的克隆分类]
对抽取的单克隆scFv进行DNA序列分析,除去重复,进行克隆分类。结果,从小鼠1413#2文库的D系列鉴定出7种候补克隆、从E系列鉴定出5种候补克隆,从小鼠1413#3文库的D系列鉴定出3种候补克隆及从E系列鉴定出9种候补克隆。对这些候补克隆的重链及轻链可变区的核苷酸序列进行分析,除去重复的相同克隆,结果鉴定出来自小鼠1413#2文库的9种scFv及来自小鼠1413#3文库的9种scFv合计18种scFv。
[抗GPC3 scFv克隆的表位作图分析]
使用按照上述[利用单克隆scFv的序列分析进行的克隆分类]的项目中记载的方法鉴定出的18种scFv,利用FCM对3种细胞株(GPC3 N末端片段表达细胞株、GPC3 C末端片段表达细胞株及GPC3表达细胞株)的与各种GPC3的结合进行分析。其结果是,18种scFv克隆中的14种(TF1413-02d028、02d030、02d039、02e004、02e014、02e030、02e040、03e001、03e004、03e005、03e015、03e019、03e027及03e034)与全长的GPC3及GPC3 N末端片段(由序列号155所示的氨基酸序列构成的多肽)结合,但不与GPC3 C末端片段(由序列号156所示的氨基酸序列构成的多肽)结合(参照图2)。另一方面,作为现有的抗GPC3抗体的GC33(中外制药公司制)、GC199(中外制药公司制)与全长的GPC3及GPC3 C末端片段结合,但不与GPC3 N末端片段结合。
根据以上的结果,鉴定出与现有的抗GPC3抗体(GC33及GC199)的GPC3 C末端侧的表位不同、识别GPC3 N末侧的表位的上述14种新型scFv。
从所鉴定的14种scFv克隆中,选择结合力特别高的前11种scFv克隆(TF1413-02d028、02d039、02e004、02e014、02e030、02e040、03e001、03e004、03e005、03e015及03e034)。表1中示出所述11种scFv克隆的H链及L链V区与序列号的对应,表2中示出所述11种scFv克隆的H链CDR1~3与序列号的对应,表3中示出所述11种scFv克隆的L链CDR1~3与序列号的对应。
[表1]
[表2]
[表3]
[抗GPC3 scFv抗体的IgG化及其结合能力]
对于所选择的上述11种scFv克隆,使H链及L链可变区与小鼠IgG的恒定区结合,通过重组IgG表达用载体以全长的重组抗体的形式表达,进行亲和纯化。使用GPC3 N末端片段表达细胞株对这些IgG抗体与GPC3 N末端片段的结合能力进行分析,结果,9种IgG克隆(TF1413-02d028、02d039、02e004、02e014、02e030、02e040、03e004、03e005及03e034)维持了与GPC3 N末端片段的结合性,但剩余的两种IgG克隆(TF1413-03e001及03e015)与GPC3 N末端片段的结合性消失(参照图3)。另外,上述9种IgG克隆不与GPC3 C末端片段结合(参照图3)。
以上的结果表明,11种scFv克隆中,9种(TF1413-02d028、02d039、02e004、02e014、02e030、02e040、03e004、03e005及03e034)能够转换为IgG型。表4中示出上述11种IgG克隆的H链及L链与序列号的对应。
[表4]
实施例2
2.新型抗GPC3抗体对经EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸)、胰蛋白酶或胶原酶处理后的GPC3的结合性
[经EDTA或胰蛋白酶处理后的细胞的制备]
将强制表达GPC3的SK-Hep-1细胞株在2个T-75烧瓶中进行培养。吸去各烧瓶的培养上清,用PBS 3mL洗涤,然后向各烧瓶中加入0.02%的EDTA/PBS溶液(以下简称为“EDTA”)3mL或0.05%的胰蛋白酶溶液(以下简称为“胰蛋白酶”),在37℃下分别温育5分钟(EDTA)或2分30秒(胰蛋白酶),从而将细胞从烧瓶剥离。然后,向各烧瓶中加入7mL的DMEM培养液,吹打后,将细胞悬浮液回收到50mL锥形管中。再用10mL的DMEM培养液洗涤各烧瓶后,将回收的洗涤液也分别回收到装有各细胞悬浮液的50mL锥形管中,离心(1500rpm、4℃、4分钟)。从锥形管中吸去上清后,向团块中加入10mL的DMEM培养液,分别计测用EDTA或胰蛋白酶剥离出来的细胞数。
将经EDTA或胰蛋白酶处理后的细胞调整为细胞数分别达到2×105个/管,进行FACS(EC800)分析。FACS分析中,使用3种抗体(用APC进行了荧光标记的抗小鼠IgG抗体[5μg/管:Biolejend公司制]、GC33抗体[1.0μg/管:MBL Life Science公司制]及上述scFv克隆[TF1413-02d028]抗体[1.0μg/管])。
[经胶原酶处理后的细胞的制备]
将如上所述用EDTA剥离出来的1×106个细胞加入到50mL锥形管中,离心(1500rpm、4℃、4分钟),吸去上清而制备细胞块(团块)。向团块中加入5mL的胶原酶P溶液,在37℃下温育30分钟,制备细胞悬浮液后,边用30mL的DMEM培养液洗涤,边通过100μm细胞过滤网。使细胞悬浮液再次通过100μm细胞过滤网,离心(300g、4℃、10分钟),吸去上清,加入PBS 20mL而洗涤后,离心(300g、4℃、5分钟),吸去上清。加入5mL的DMEM培养液而悬浮后,计测细胞数,对2×105个/管的细胞进行FACS(EC800)分析。FACS分析中,与经EDTA或胰蛋白酶处理后的细胞同样地,使用3种抗体(用APC进行了荧光标记的抗小鼠IgG抗体[5μg/管:Biolejend公司制]、GC33抗体[1.0μg/管:MBL Life Science公司制]及上述scFv克隆[TF1413-02d028]抗体[1.0μg/管])。将结果示于图4。需要说明的是,图4中,横轴的右侧存在峰时,表示GC33抗体或scFv克隆[TF1413-02d028]抗体结合到GPC3蛋白上。
[结果]
如图4所示,对于经胰蛋白酶处理、胶原酶处理后的GPC3蛋白,本发明的抗体(TF1413-02d028)的结合性显著降低。这些结果表示,本发明的抗体特异性识别GPC3蛋白的立体结构,可认为本发明的抗体在生物体中的特异性高。
实施例3
3.利用新型抗GPC3抗体的GPC3 CAR-T细胞的开发
[概要]
GPC3是在成人中在胎盘以外观察不到表达、但在肝细胞癌、黑素瘤、卵巢透明细胞癌、肺鳞状细胞癌等各种癌组织中表达的细胞表面分子,可成为利用嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor;CAR)的CAR-T细胞疗法的靶分子。因此,制作利用实施例1中制备的11种scFv克隆的GPC3 CAR-T细胞,对癌细胞杀伤活性、干扰素γ(IFN-γ)产生能力进行分析。
[GPC3 CAR载体的制作]
对于实施例1中制备的11种scFv克隆(TF1413-02d028、02d039、02e004、02e014、02e030、02e040、03e001、03e004、03e005、03e015及03e034),基于各自的VH及VL的氨基酸序列来设计VH-接头-VL序列的scFv(参照表5)。作为接头,使用由使多肽“GGGGS”重复3次而成的15个氨基酸残基构成的接头。另外,在VH的N末端添加了由序列号188所示的氨基酸序列构成的来自人免疫球蛋白H链的信号序列。
[表5-1]
[表5-2]
表中,双线框表示接头,单下划线表示VH,双下划线表示VL。
对于编码表5的抗GPC3 scFv的核苷酸序列,合成优化为人密码子的序列,插入到CAR表达载体中。所使用的CAR基因中,在scFv的下游具有编码由来自人CD8的跨膜区及来自人CD28/4-1BB/CD3zeta的免疫活性细胞活化信号转导区构成的融合肽(由序列号185所示的氨基酸序列构成的肽)的基因与2A自切断序列、人IL-7基因、2A自切断序列、人CCL19基因、2A自切断序列及HSV-TK基因,并且整体整合到MSGV1逆转录病毒载体中(参照国际公开2016/056228号小册子)。
[GPC3 CAR-T细胞的制作]
将来自上述11种scFv克隆的GPC3 CAR载体瞬时导入至各GP2包装细胞中,制作逆转录病毒载体,使它们感染于T细胞而进行基因导入,诱导GPC3 CAR-T细胞。基因导入T细胞中的表达GPC3 CAR的细胞的比例为5.3~39.2%,存在偏差。因此,使用来自该比例为25%以上的5种scFv克隆(TF1413-02d028、TF1413-02d039、TF1413-02e014、TF1413-02e030及TF1413-03e005)的GPC3 CAR-T细胞,实施以下的功能测试。
[GPC3 CAR-T细胞对GPC3表达细胞株的杀伤活性]
为了研究GPC3 CAR-T细胞对癌细胞的杀伤活性,实施GPC3CAR-T细胞与GPC3表达细胞株、即在来自肝细胞癌的细胞株Sk-HEP-1中表达GPC3的细胞株(Sk-HEP-1GPC3细胞株)或不表达GPC3的细胞株(Sk-HEP-1mock细胞株)的共培养测试。将GPC3 CAR-T细胞与靶标癌细胞(Sk-HEP-1GPC3细胞株、或Sk-HEP-1mock细胞株)以1:1(1×105/孔)混合,在24孔板中培养。48小时后回收细胞,用抗CD45抗体染色,将CD45阳性细胞作为GPC3 CAR-T细胞、将CD45阴性细胞作为残存癌细胞[Sk-HEP-1GPC3细胞]而进行FCM分析。其结果是,来自上述5种scFv克隆的GPC3 CAR-T细胞均几乎完全杀伤Sk-HEP-1GPC3细胞,但另一方面,对于Sk-HEP-1mock细胞则不显示杀伤活性(参照图5及6)。在使用没有感染病毒载体的细胞(基因非导入细胞[图5及6中的“未感染”])作为针对GPC3 CAR-T细胞的阴性对照时,对于Sk-HEP-1GPC3细胞及Sk-HEP-1mock细胞均未显示出杀伤活性。
以上的结果表明,来自所选择的5种抗GPC3 scFv克隆(TF1413-02d028、TF1413-02d039、TF1413-02e014、TF1413-02e030及TF1413-03e005)的GPC3 CAR-T细胞对表达GPC3的癌细胞发挥特异性细胞杀伤活性。
[GPC3 CAR-T细胞的、基于GPC3表达细胞识别的IFN-γ产生能力]
除了对GPC3表达(阳性)癌细胞的杀伤活性以外,还分析了GPC3CAR-T细胞的IFN-γ产生能力。将GPC3 CAR-T细胞与靶标癌细胞(Sk-HEP-1GPC3细胞株、或Sk-HEP-1mock细胞株)以1:1(1×105/孔)混合,在24孔板中培养48小时,通过ELISA测定培养上清中所产生的IFN-γ的浓度。其结果是,来自上述5种scFv克隆的GPC3 CAR-T细胞均显示出GPC3的表达依赖性的IFN-γ产生能力,特别是来自克隆TF1413-02d028的GPC3 CAR-T细胞,显示出最高的IFN-γ产生能力(参照图7)。
实施例4
4.人源化抗体的制作
基于实施例1中制备的2种scFv克隆(TF1413-02d028及02d039)设计scFv人源化抗体(参照表6)。作为接头,使用由使多肽“GGGGS”重复3次而成的15个氨基酸残基构成的接头。另外,在VH的N末端添加了由序列号188所示的氨基酸序列构成的来自人免疫球蛋白H链的信号序列。
[表6-1]
[表6-2]
表中,双线框表示接头,单下划线表示VH,双下划线表示VL。
产业上的可利用性
本发明有助于癌症免疫疗法的领域。
Claims (17)
1.一种抗体,其是与由序列号155所示的氨基酸序列构成的来源于人GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)的多肽特异性结合的抗体,其中,
(2-1)含有:由序列号11所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号12所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号13所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号14所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号15所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;
(3-1)含有:由序列号21所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号22所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号23所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号24所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号25所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号26所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;
(4-1)含有:由序列号31所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号32所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号33所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号34所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号35所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号36所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;
(5-1)含有:由序列号41所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号42所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号43所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号44所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号45所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号46所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;
(6-1)含有:由序列号51所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号52所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号53所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号54所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号55所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号56所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;
(7-1)含有:由序列号61所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号62所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号63所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号64所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号65所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号66所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;
(8-1)含有:由序列号71所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号72所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号73所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号74所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号75所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号76所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;
(9-1)含有:由序列号81所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号82所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号83所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号84所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号85所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号86所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;
(10-1)含有:由序列号91所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号92所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号93所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号94所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号95所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号96所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3;或者
(11-1)含有:由序列号101所示的氨基酸序列构成的重链CDR1、由序列号102所示的氨基酸序列构成的重链CDR2及由序列号103所示的氨基酸序列构成的重链CDR3、和
由序列号104所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号105所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2及由序列号106所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体,其中,
(2-2)含有:由与序列号17所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号18所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;
(3-2)含有:由与序列号27所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号28所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;
(4-2)含有:由与序列号37所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号38所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;
(5-2)含有:由与序列号47所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号48所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;
(6-2)含有:由与序列号57所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号58所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;
(7-2)含有:由与序列号67所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号68所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;
(8-2)含有:由与序列号77所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号78所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;
(9-2)含有:由与序列号87所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号88所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;
(10-2)含有:由与序列号97所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号98所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区;或者
(11-2)含有:由与序列号107所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、和由与序列号108所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的抗体,其为单链抗体。
4.根据权利要求3所述的抗体,其中,单链抗体
(2-3)含有与序列号166所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(3-3)含有与序列号167所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(4-3)含有与序列号168所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(5-3)含有与序列号169所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(6-3)含有与序列号170所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(7-3)含有与序列号171所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(8-3)含有与序列号172所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(9-3)含有与序列号173所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(10-3)含有与序列号174所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;或者
(11-3)含有与序列号175所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列。
5.根据权利要求3所述的抗体,其中,单链抗体
(2-3’-1)含有与序列号181所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(2-3’-2)含有与序列号182所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;
(2-3’-3)含有与序列号183所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列;或者
(2-3’-4)含有与序列号184所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1或2所述的抗体,其中,
(2-4)含有:由与序列号19所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号20所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;
(3-4)含有:由与序列号29所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号30所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;
(4-4)含有:由与序列号39所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号40所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;
(5-4)含有:由与序列号49所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号50所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;
(6-4)含有:由与序列号59所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号60所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;
(7-4)含有:由与序列号69所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号70所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;
(8-4)含有:由与序列号79所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号80所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;
(9-4)含有:由与序列号89所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号90所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;
(10-4)含有:由与序列号99所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号100所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链;或者
(11-4)含有:由与序列号109所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链、和由与序列号110所示的氨基酸序列具有至少80%以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链。
7.一种嵌合抗原受体(CAR),其含有权利要求3~5中任一项所述的抗体、融合于该抗体的羧基末端的跨膜区和融合于该跨膜区的羧基末端的免疫活性细胞活化信号转导区。
8.根据权利要求7所述的CAR,其含有序列号185~187中的任一者所示的氨基酸序列。
9.一种免疫活性细胞,其表达权利要求7或8所述的CAR。
10.根据权利要求9所述的免疫活性细胞,其还表达白细胞介素7(IL-7)及趋化因子配体19(CCL19)。
11.一种编码权利要求1~6中任一项所述的抗体的抗体基因、或者编码权利要求7或8所述的CAR的CAR基因。
12.一种抗体基因,其编码权利要求1~4及6中任一项所述的抗体。
13.一种载体,其含有启动子和可操作地连接在该启动子的下游的权利要求11所述的抗体基因或权利要求11所述的编码CAR的CAR基因。
14.一种载体,其含有启动子和可操作地连接在该启动子的下游的权利要求12所述的抗体基因。
15.一种宿主细胞,其导入有权利要求13或14所述的载体。
16.一种GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)的检测方法,其具备:使用权利要求1~6中任一项所述的抗体检测GPC3的步骤。
17.一种GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)的检测用试剂盒,其含有权利要求1~6中任一项所述的抗体或其标记物。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017-001732 | 2017-01-10 | ||
JP2017001732 | 2017-01-10 | ||
PCT/JP2018/000257 WO2018131586A1 (ja) | 2017-01-10 | 2018-01-10 | 抗gpc3抗体 |
CN201880006069.1A CN110177876B (zh) | 2017-01-10 | 2018-01-10 | 抗gpc3抗体 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201880006069.1A Division CN110177876B (zh) | 2017-01-10 | 2018-01-10 | 抗gpc3抗体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116102651A true CN116102651A (zh) | 2023-05-12 |
Family
ID=62839598
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201880006069.1A Active CN110177876B (zh) | 2017-01-10 | 2018-01-10 | 抗gpc3抗体 |
CN202310167019.4A Pending CN116102651A (zh) | 2017-01-10 | 2018-01-10 | 抗gpc3抗体 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201880006069.1A Active CN110177876B (zh) | 2017-01-10 | 2018-01-10 | 抗gpc3抗体 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US11718663B2 (zh) |
EP (1) | EP3569709A4 (zh) |
JP (4) | JP6579640B2 (zh) |
KR (1) | KR102564097B1 (zh) |
CN (2) | CN110177876B (zh) |
AU (1) | AU2018208191A1 (zh) |
BR (1) | BR112019013947A2 (zh) |
CA (1) | CA3049189A1 (zh) |
EA (1) | EA201991385A1 (zh) |
IL (2) | IL300270A (zh) |
MA (1) | MA47268A (zh) |
MX (1) | MX2019008221A (zh) |
TW (2) | TWI780102B (zh) |
WO (1) | WO2018131586A1 (zh) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA3049189A1 (en) * | 2017-01-10 | 2018-07-19 | Yamaguchi University | Anti-gpc3 antibody |
CN112368298A (zh) | 2018-06-22 | 2021-02-12 | 凯德药业股份有限公司 | 嵌合跨膜蛋白及其用途 |
JPWO2020017479A1 (ja) * | 2018-07-17 | 2021-08-02 | ノイルイミューン・バイオテック株式会社 | 抗gpc3一本鎖抗体を含むcar |
CA3115059A1 (en) * | 2018-10-01 | 2020-04-09 | Adicet Bio Inc. | Compositions and methods regarding engineered and non-engineered .gamma..delta.-t cells for treatment of solid tumors |
CN111040036B (zh) * | 2018-10-12 | 2023-10-20 | 上海卡智生物技术有限公司 | 抗gpc3单克隆抗体、由其修饰的免疫效应细胞及其应用 |
CN109504660B (zh) * | 2018-11-02 | 2021-08-06 | 温州启星生物技术有限公司 | 一种第四代car-t细胞及其构建方法和应用 |
CN112574297B (zh) * | 2019-09-27 | 2022-06-24 | 上海生物制品研究所有限责任公司 | 抗神经氨酸酶的单克隆抗体及其应用 |
WO2021110095A1 (zh) * | 2019-12-05 | 2021-06-10 | 上海翰森生物医药科技有限公司 | 抗gpc3抗体、其抗原结合片段及其医药用途 |
IL295774A (en) * | 2020-02-27 | 2022-10-01 | Nanjing Legend Biotech Co Ltd | Antibodies and chimeric antigen receptors directed against glypican-3 (gpc3) and methods of using them |
WO2021186395A1 (en) * | 2020-03-18 | 2021-09-23 | Eutilex Co., Ltd. | Gpc3 car- t cells secreting il-18 and methods of making and using the same |
EP4121516A4 (en) * | 2020-03-18 | 2024-06-05 | Eutilex Co., Ltd. | GPC3 CAR T CELL COMPOSITIONS AND METHODS OF MANUFACTURE AND USE THEREOF |
AU2021381768A1 (en) * | 2020-11-18 | 2023-06-22 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Anti-gpa33 multi-specific antibodies and uses thereof |
KR20220080381A (ko) * | 2020-12-07 | 2022-06-14 | (주)이노베이션바이오 | Gpc3에 특이적인 항체 및 이의 용도 |
CN113072643B (zh) * | 2021-03-22 | 2021-10-15 | 南京医科大学 | 抗Glypican-3耐酸性全人源抗体、其免疫毒素、其嵌合抗原受体细胞及应用 |
IL307175A (en) * | 2021-03-28 | 2023-11-01 | Immunome Inc | IL-38 specific antibodies |
AU2022291365A1 (en) * | 2021-06-08 | 2024-01-18 | Kite Pharma, Inc. | Gpc3 binding molecules |
WO2022268196A1 (zh) * | 2021-06-25 | 2022-12-29 | 天辰生物医药(苏州)有限公司 | 靶向gpc3的抗原结合蛋白 |
CN113527500B (zh) * | 2021-07-16 | 2022-09-20 | 蒋小滔 | 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体、其嵌合抗原受体及应用 |
TW202307009A (zh) * | 2021-07-16 | 2023-02-16 | 日商諾伊爾免疫生物科技股份有限公司 | 嵌合抗原受體、表現前述受體之細胞、含有前述細胞之醫藥組成物、前述細胞之製造方法、及含有編碼前述嵌合抗原受體之鹼基序列之聚核苷酸或載體 |
WO2024118866A1 (en) * | 2022-12-01 | 2024-06-06 | Modernatx, Inc. | Gpc3-specific antibodies, binding domains, and related proteins and uses thereof |
CN118063612A (zh) * | 2024-04-18 | 2024-05-24 | 上海宏成药业有限公司 | 抗ror1抗体或其抗原结合片段及其用途 |
Family Cites Families (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3382838T2 (de) | 1983-01-13 | 2004-04-15 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Transgene dicotyledone Pflanzenzellen und Pflanzen |
NL8300698A (nl) | 1983-02-24 | 1984-09-17 | Univ Leiden | Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten. |
EP0429093B1 (de) | 1984-05-11 | 2001-08-08 | Syngenta Participations AG | Transformation von Pflanzenerbgut |
JPS62275650A (ja) | 1986-05-23 | 1987-11-30 | Hatsuho Seika Kk | 膨張菓子の製造方法 |
IL84459A (en) | 1986-12-05 | 1993-07-08 | Agracetus | Apparatus and method for the injection of carrier particles carrying genetic material into living cells |
JP2928287B2 (ja) | 1988-09-29 | 1999-08-03 | 協和醗酵工業株式会社 | 新規ポリペプチド |
JPH0322979A (ja) | 1989-06-19 | 1991-01-31 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 新規プラスミノーゲン活性化因子 |
US5204253A (en) | 1990-05-29 | 1993-04-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method and apparatus for introducing biological substances into living cells |
WO2004022597A1 (ja) * | 2002-09-04 | 2004-03-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Gpc3の血中可溶化n端ペプチドに対する抗体 |
AU2002330482A1 (en) * | 2002-09-04 | 2004-03-29 | Perseus Proteomics Inc. | Method of diagnosing cancer by detecting gpc3 |
MY145073A (en) | 2004-07-09 | 2011-12-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-glypican 3 antibody |
US9206257B2 (en) | 2011-04-19 | 2015-12-08 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Human monoclonal antibodies specific for glypican-3 and use thereof |
WO2013070468A1 (en) * | 2011-11-08 | 2013-05-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Glypican-3-specific antibody and uses thereof |
CN104520331B (zh) | 2012-06-01 | 2018-09-07 | 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) | 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的高亲和力单克隆抗体及其用途 |
TWI693073B (zh) | 2012-12-21 | 2020-05-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | 對gpc3標的治療劑療法為有效之患者投與的gpc3標的治療劑 |
CN107460201A (zh) | 2013-05-08 | 2017-12-12 | 科济生物医药(上海)有限公司 | 编码gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞 |
EP3088890B1 (en) * | 2013-12-24 | 2020-09-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for measuring soluble gpc3 protein |
MX2016015162A (es) * | 2014-05-22 | 2017-03-03 | Genentech Inc | Anticuerpos anti - gpc3 e inmunoconjugados. |
WO2016036973A1 (en) | 2014-09-04 | 2016-03-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Glypican-3 antibody and uses thereof |
ES2851123T1 (es) | 2014-09-26 | 2021-09-03 | Baylor College Medicine | Receptores quiméricos de antígeno específicos de glipicano-3 para inmunoterapia adoptiva |
US10316102B2 (en) | 2014-10-09 | 2019-06-11 | Yamaguchi University | Car expression vector and car-expressing T cells |
JP6558091B2 (ja) | 2015-06-15 | 2019-08-14 | 大日本印刷株式会社 | 注出口組合体、注出口組合体付容器、及び充填体 |
CA3049189A1 (en) * | 2017-01-10 | 2018-07-19 | Yamaguchi University | Anti-gpc3 antibody |
-
2018
- 2018-01-10 CA CA3049189A patent/CA3049189A1/en active Pending
- 2018-01-10 KR KR1020197019505A patent/KR102564097B1/ko active IP Right Grant
- 2018-01-10 MA MA047268A patent/MA47268A/fr unknown
- 2018-01-10 AU AU2018208191A patent/AU2018208191A1/en active Pending
- 2018-01-10 CN CN201880006069.1A patent/CN110177876B/zh active Active
- 2018-01-10 US US16/472,356 patent/US11718663B2/en active Active
- 2018-01-10 BR BR112019013947-8A patent/BR112019013947A2/pt unknown
- 2018-01-10 TW TW107100996A patent/TWI780102B/zh active
- 2018-01-10 JP JP2018561377A patent/JP6579640B2/ja active Active
- 2018-01-10 EA EA201991385A patent/EA201991385A1/ru unknown
- 2018-01-10 CN CN202310167019.4A patent/CN116102651A/zh active Pending
- 2018-01-10 TW TW111134012A patent/TWI831365B/zh active
- 2018-01-10 IL IL300270A patent/IL300270A/en unknown
- 2018-01-10 MX MX2019008221A patent/MX2019008221A/es unknown
- 2018-01-10 WO PCT/JP2018/000257 patent/WO2018131586A1/ja unknown
- 2018-01-10 EP EP18738824.4A patent/EP3569709A4/en active Pending
-
2019
- 2019-07-02 IL IL267797A patent/IL267797B2/en unknown
- 2019-08-21 US US16/546,787 patent/US10781249B2/en active Active
- 2019-08-22 JP JP2019151869A patent/JP6647675B2/ja active Active
- 2019-12-27 JP JP2019237695A patent/JP2020074776A/ja active Pending
-
2022
- 2022-10-03 JP JP2022159364A patent/JP7389424B2/ja active Active
-
2023
- 2023-06-15 US US18/335,477 patent/US20240018224A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR102564097B1 (ko) | 2023-08-04 |
US10781249B2 (en) | 2020-09-22 |
TWI780102B (zh) | 2022-10-11 |
IL267797B1 (en) | 2023-03-01 |
IL267797B2 (en) | 2023-07-01 |
JP2019216739A (ja) | 2019-12-26 |
TW202309098A (zh) | 2023-03-01 |
CN110177876A (zh) | 2019-08-27 |
CA3049189A1 (en) | 2018-07-19 |
US11718663B2 (en) | 2023-08-08 |
EP3569709A4 (en) | 2020-08-19 |
AU2018208191A1 (en) | 2019-07-04 |
TW201831516A (zh) | 2018-09-01 |
BR112019013947A2 (pt) | 2020-02-11 |
US20190359698A1 (en) | 2019-11-28 |
CN110177876B (zh) | 2023-03-31 |
IL267797A (en) | 2019-10-31 |
JPWO2018131586A1 (ja) | 2019-11-07 |
MX2019008221A (es) | 2019-12-09 |
JP2022191318A (ja) | 2022-12-27 |
WO2018131586A1 (ja) | 2018-07-19 |
EP3569709A1 (en) | 2019-11-20 |
TWI831365B (zh) | 2024-02-01 |
MA47268A (fr) | 2019-11-20 |
US20190367634A1 (en) | 2019-12-05 |
KR20190101989A (ko) | 2019-09-02 |
JP6579640B2 (ja) | 2019-09-25 |
EA201991385A1 (ru) | 2019-12-30 |
US20240018224A1 (en) | 2024-01-18 |
JP7389424B2 (ja) | 2023-11-30 |
JP2020074776A (ja) | 2020-05-21 |
IL300270A (en) | 2023-04-01 |
JP6647675B2 (ja) | 2020-02-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110177876B (zh) | 抗gpc3抗体 | |
US11919970B2 (en) | Antibodies and chimeric antigen receptors specific for ROR1 | |
CN117098561A (zh) | Ccr8抗体及其应用 | |
CN111848800B (zh) | Pd-l1单结构域抗体及其用途 | |
CN101541834A (zh) | 癌症的预防和/或治疗剂 | |
TW201920657A (zh) | 藉由細胞表現之調控生物活性的抗體 | |
WO2022007543A1 (zh) | 一种抗fgl1抗体及其应用 | |
CN115947854A (zh) | 抗人cd40蛋白单克隆抗体、制备方法及其应用 | |
NZ795720A (en) | Anti-gpc3 antibody | |
EA043515B1 (ru) | Анти-gpc3-антитело | |
EP4059962A1 (en) | Pd-l1 binding molecule | |
WO2024114244A1 (zh) | 抗cd100抗体及其用途 | |
US20240018262A1 (en) | Antibody specific for gpc3 and uses thereof | |
WO2024044779A2 (en) | Antibodies and chimeric antigen receptors specific for delta-like ligand 3 (dll3) | |
CN115667310A (zh) | Cd22特异性抗体及其用途 | |
AU2021395061A1 (en) | Antibody specifically binding to strep-tag ii tag and use thereof | |
CN117586399A (zh) | 抗cd28抗体及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |