CN118063612A

CN118063612A - 抗ror1抗体或其抗原结合片段及其用途

Info

Publication number: CN118063612A
Application number: CN202410465441.2A
Authority: CN
Inventors: 王兴定; 徐俊; 闵皓; 王永辉
Original assignee: Shanghai Hongcheng Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Shanghai Hongcheng Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2024-04-18
Filing date: 2024-04-18
Publication date: 2024-05-24

Abstract

本发明涉及一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段及其用途。本发明提供的抗ROR1抗体或其抗原结合片段对ROR1具有高亲和力，偶联得到的抗体偶联药物表现出良好的抗肿瘤疗效。

Description

抗ROR1抗体或其抗原结合片段及其用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及抗ROR1抗体或其抗原结合片段及其用途。本发明还涉及编码该抗ROR1抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包含该核酸分子的载体、宿主细胞；包含该抗ROR1抗体或其抗原结合片段的抗体-药物偶联物和偶联物。本发明进一步涉及抗ROR1抗体或其抗原结合片段及包含其的药物组合物和抗体-药物偶联物的用途。

背景技术

受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（Receptor tyrosine kinase-like orphanreceptor 1，ROR1），隶属I型RTK（受体酪氨酸激酶）家族，是一类膜受体，家族成员主要包括ROR1和ROR2，主要参与细胞间信号交流、胞内信号传导等过程，调节细胞增殖、分化、转移和存活，与生长因子受体的酪氨酸激酶结构域具有较高的同源性。ROR1的配体为Wnt5a。

人ROR1分子由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区包含一个由免疫球蛋白样结构域（Ig-like）、两个富含半胱氨酸卷曲的结构域（CRD或FZD）和1个KNG（kringle）结构域；胞内区包含一个含有酪氨酸激酶结构域（TKD）、两个富含丝氨酸/苏氨酸的结构域（Ser/ThrD）和一个富含脯氨酸富集结构域（PRD）。

生理条件下，ROR1主要在胚胎发育早期发挥生理功能。Wnt5a通过酪氨酸激酶孤受体（ROR）激活JNK通路，募集c-jun至核因子κB受体。生理状态下，ROR1在早期胚胎和婴儿发育阶段高度表达，在神经、骨骼和血管器官发生中起重要作用，但是ROR1的表达水平在儿童和成人阶段显著下降，在正常成人组织中较少表达。然而，CLIN CANCER RES 2017年发表了一篇文章（Analysis of ROR1 Protein Expression in Human Cancer and NormalTissues，Ashwini Balakrishnan等，Clin Cancer Res，2017 Jun 15; 23(12):3061-3071），研究了人体肿瘤细胞及正常组织表面ROR1表达。该研究认为，对于已公开的抗体，利用免疫组化方法检测细胞表面ROR1缺乏敏感性。因此研究者合成了一种ROR1特异性单克隆抗体（6D4单抗）并评估其在免疫组化中的敏感性及特异性。研究结果表明6D4单抗在免疫组化中检测细胞表明ROR1具有敏感性及特异性。ROR1在卵巢癌、三阴性乳腺癌以及肺腺癌中均表达。与之前研究得到的结果不同的是，该研究发现ROR1在几种正常组织中也有表达，包括甲状旁腺、胰岛以及食管、胃和十二指肠局部。

病理状态下，在多种癌症中发现了高水平的ROR1表达，包括血液病恶性肿瘤（CLL、ALL、NHL、髓系血液癌症）和实体肿瘤（结肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌等）。有文献报道，ROR1在53%的非小细胞肺癌（NSCLC）、33%的乳腺癌、94%的结直肠癌、15%的胰腺癌和61%的卵巢癌中表达。Wnt5a可以诱导ROR1依赖的多种信号通路，促进肿瘤细胞的生长和增殖。在CLL细胞中，Wnt5a/ROR1依赖性信号传导有助于CLL细胞激活NF-κB，进而引起自分泌IL-6诱导的pSTAT3激活，激活NF-κB和STAT3增强CLL细胞的增殖和/或存活。此外，STAT3的激活可提高ROR1的表达，潜在地提供一个正反馈环。在BC细胞中，Wnt5a诱导ROR1与酪蛋白激酶1ε（CK1ε）相互作用，激活PI3K介导的AKT磷酸化和CREB，该信号通路与肿瘤细胞生长有关。在骨肉瘤患者中，Wnt5a和ROR1的高表达与患者的疾病进展和预后相关。Kaplan-Meier生存分析显示，Wnt5a和ROR1阳性表达者的中位生存时间分别为23个月和27个月，明显短于阴性表达者的41个月和42个月（P＜0.05）。高表达的ROR1已被证实会降低卵巢癌、肺腺癌以及乳腺癌患者的总生存率。

因此，开发新一代抗ROR1抗体具有重要的科学和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种结合ROR1的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，并基于该抗体或其片段，提供其用途。本发明所述抗体分子的“片段”涵盖抗体的各种功能性片段，例如其抗原结合部分，如Fab、F(ab')₂或scFV片段等。

本发明提供以下技术方案。

第一方面，本发明提供了靶向ROR1的抗体或其抗原结合片段，预期本发明的抗ROR1抗体对人类受试者具有小的免疫原性，人类受试者对该抗ROR1抗体将会具有良好的耐受性。

本发明提供的特异性结合ROR1的鼠源抗ROR1抗体、嵌合抗体以及人源化的抗ROR1抗体。本发明提供的靶向ROR1的抗体或其抗原结合片段具有以下优点：

（1）高亲和力结合人ROR1以及表达人ROR1的靶细胞；

（2）能够通过内吞作用进入细胞；

（3）能够诱导ROR1的内吞；

（4）适合构建有效治疗的抗体偶联药物。

在一些实施方案中，本发明提供了结合ROR1的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含：

1）如SEQ ID NO: 4所示的重链可变区所包含的3个重链CDR（HCDR1、HCDR2、HCDR3）/或如SEQ ID NO: 8所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR（LCDR1、LCDR2、LCDR3）；

2）如SEQ ID NO: 12所示的重链可变区所包含的3个重链CDR（HCDR1、HCDR2、HCDR3）和/或如SEQ ID NO: 16所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR（LCDR1、LCDR2、LCDR3）；

3）如SEQ ID NO: 20所示的重链可变区所包含的3个重链CDR（HCDR1、HCDR2、HCDR3）和/或如SEQ ID NO: 24所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR（LCDR1、LCDR2、LCDR3）；或

4）如SEQ ID NO: 28所示的重链可变区所包含的3个重链CDR（HCDR1、HCDR2、HCDR3）和/或如SEQ ID NO: 32所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR（LCDR1、LCDR2、LCDR3）。

基于本发明给定抗体或其片段包含的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定其中包含的CDR。例如，根据本发明的具体实施方式，采用Kabat方案、AbM方案、Chothia方案或Contact方案限定可变区氨基酸序列中的CDR。

在一些实施方案中，本发明提供了结合ROR1的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区CDR（HCDR1、HCDR2、HCDR3）和/或轻链可变区CDR（LCDR1、LCDR2、LCDR3），其中：

（1）HCDR1包含如SEQ ID NO: 1所示序列，或相对于SEQ ID NO: 1含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 1组成；HCDR2包含如SEQ ID NO: 2所示序列，或相对于SEQ ID NO: 2含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 2组成；HCDR3包含如SEQ ID NO: 3所示序列，或相对于SEQ ID NO: 3含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 3组成；LCDR1包含如SEQ ID NO: 5所示序列，或相对于SEQ ID NO: 5含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 5组成；LCDR2包含如SEQ IDNO: 6所示序列，或相对于SEQ ID NO: 6含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 6组成；LCDR3包含如SEQ ID NO: 7所示序列，或相对于SEQ ID NO: 7含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 7组成；

（2）HCDR1包含如SEQ ID NO: 9所示序列，或相对于SEQ ID NO: 9含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 9组成；HCDR2包含如SEQ ID NO: 10所示序列，或相对于SEQ ID NO: 10含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 10组成；HCDR3包含如SEQ ID NO: 11所示序列，或相对于SEQ ID NO: 11含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 11组成；LCDR1包含如SEQ ID NO: 13所示序列，或相对于SEQ ID NO: 13含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 13组成；LCDR2包含如SEQ ID NO: 14所示序列，或相对于SEQ ID NO: 14含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 14组成；LCDR3包含如SEQID NO: 15所示序列，或相对于SEQ ID NO: 15含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 15组成；

（3）HCDR1包含如SEQ ID NO: 17所示序列，或相对于SEQ ID NO: 17含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 17组成；HCDR2包含如SEQ ID NO: 18所示序列，或相对于SEQ ID NO: 18含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 18组成；HCDR3包含如SEQ ID NO: 19所示序列，或相对于SEQ ID NO: 19含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 19组成；LCDR1包含如SEQ ID NO: 21所示序列，或相对于SEQ ID NO: 21含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 21组成；LCDR2包含如SEQ ID NO: 22所示序列，或相对于SEQ ID NO: 22含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 22组成；LCDR3包含如SEQID NO: 23所示序列，或相对于SEQ ID NO: 23含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 23组成；

（4）HCDR1包含如SEQ ID NO: 25所示序列，或相对于SEQ ID NO: 25含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 25组成；HCDR2包含如SEQ ID NO: 26所示序列，或相对于SEQ ID NO: 26含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 26组成；HCDR3包含如SEQ ID NO: 27所示序列，或相对于SEQ ID NO: 27含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 27组成；LCDR1包含如SEQ ID NO: 29所示序列，或相对于SEQ ID NO: 29含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 29组成；LCDR2包含如SEQ ID NO: 30所示序列，或相对于SEQ ID NO: 30含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 30组成；LCDR3包含如SEQID NO: 31所示序列，或相对于SEQ ID NO: 31含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 31组成。

在一些实施方案中，本发明提供了结合ROR1的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，其中：

1）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 4含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 4组成；

2）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:12含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 12组成；

3）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 20所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:20含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 20的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 20组成；

4）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 28所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:28含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 28的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 28组成；

5）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 35所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:35含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 35的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 35组成；

6）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 36所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:36含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 36的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 36组成；

7）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:37含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 37的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 37组成；

8）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 38所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:38含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 38的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 38组成；或

9）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 39所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:39含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 39的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 39组成。

在一个实施方案中，本发明提供了结合ROR1的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，其中：

1）所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 8含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 8的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 8组成；

2）所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:16含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 16组成；

3）所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:24含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 24的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 24组成；

4）所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 32所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:32含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 32的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 32组成；

5）所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 40所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:40含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 40的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 40组成；

6）所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 41所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:41含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 41的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 41组成；

7）所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 42所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:42含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 42的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 42组成；

8）所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 43所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:43含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 43的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 43组成；

9）所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 44所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:44含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 44的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 44组成；

10）所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 45所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:45含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 45的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 45组成；或

11）所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 46所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:46含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 46的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 46组成。

在一些实施方案中，本发明提供了结合ROR1的抗ROR1抗体或其抗原结合片段包含的重链可变区和/或轻链可变区选自以下的组合：

1）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 4含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 4组成；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 8含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 8的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 8组成；

2）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:12含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 12组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 16含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 16组成；

3）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 20所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:20含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 20的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 20组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 24含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 24的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 24组成；

4）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 28所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:28含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 28的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 28组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 32所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 32含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 32的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 32组成；

5）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 35所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:35含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 35的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 35组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 40所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 40含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 40的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 40组成；

6）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 35所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:35含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 35的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 35组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 41所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 41含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 41的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 41组成；

7）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 35所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:35含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 35的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 35组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 42所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 42含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 42的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 42组成；

8）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 35所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:35含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 35的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 35组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 46所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 46含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 46的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 46组成；

9）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 36所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:36含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 36的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 36组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 40所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 40含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 40的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 40组成；

10）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 36所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:36含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 36的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 36组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 41所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 41含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 41的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 41组成；

11）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 36所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:36含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 36的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 36组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 42所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 42含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 42的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 42组成；

12）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 36所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:36含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 36的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 36组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 46所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 46含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 46的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 46组成；

13）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:37含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 37的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 37组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 40所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 40含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 40的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 40组成；

14）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:37含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 37的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 37组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 41所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 41含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 41的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 41组成；

15）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:37含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 37的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 37组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 42所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 42含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 42的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 42组成；

16）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:37含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 37的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 37组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 46所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 46含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 46的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 46组成；

17）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:37含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 37的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 37组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 43所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 43含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 43的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 43组成；

18）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:37含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 37的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 37组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 44所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 44含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 44的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 44组成；

19）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:37含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 37的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 37组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 45所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 45含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 45的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 45组成；

20）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 38所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:38含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 38的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 38组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 42所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 42含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 42的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 42组成；

21）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 38所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:38含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 38的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 38组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 43所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 43含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 43的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 43组成；

22）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 38所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:38含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 38的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 38组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 44所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 44含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 44的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 44组成；

23）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 38所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:38含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 38的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 38组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 45所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 45含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 45的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 45组成；

24）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 39所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:39含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 39的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 39组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 46所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 46含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 46的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 46组成；

25）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 39所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:39含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 39的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 39组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 43所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 43含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 43的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 43组成；

26）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 39所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:39含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 39的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 39组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 44所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 44含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 44的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 44组成；或

27）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 39所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:39含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 39的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 39组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 45所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 45含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 45的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 45组成。

在一些实施方案中，本发明提供了结合ROR1的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，其中：

1）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列或由其组成；

2）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列或由其组成；

3）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 20所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列或由其组成；

4）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 28所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 32所示氨基酸序列或由其组成；

5）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 35所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 40所示氨基酸序列或由其组成；

6）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 35所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 41所示氨基酸序列或由其组成；

7）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 35所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 42所示氨基酸序列或由其组成；

8）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 35所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 46所示氨基酸序列或由其组成；

9）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 36所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 40所示氨基酸序列或由其组成；

10）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 36所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 41所示氨基酸序列或由其组成；

11）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 36所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 42所示氨基酸序列或由其组成；

12）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 36所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 46所示氨基酸序列或由其组成；

13）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 40所示氨基酸序列或由其组成；

14）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 41所示氨基酸序列或由其组成；

15）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 42所示氨基酸序列或由其组成；

16）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 46所示氨基酸序列或由其组成；

17）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 43所示氨基酸序列或由其组成；

18）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 44所示氨基酸序列或由其组成；

19）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 45所示氨基酸序列或由其组成；

20）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 38所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 42所示氨基酸序列或由其组成；

21）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 38所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 43所示氨基酸序列或由其组成；

22）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 38所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 44所示氨基酸序列或由其组成；

23）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 38所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 45所示氨基酸序列或由其组成；

24）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 39所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 46所示氨基酸序列或由其组成；

25）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 39所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 43所示氨基酸序列或由其组成；

26）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 39所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 44所示氨基酸序列或由其组成；或

27）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 39所示氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 45所示氨基酸序列或由其组成。

特别地，本发明的抗体或其抗原结合片段至少包含重链可变区和轻链可变区，二者均包括上述CDR以及间隔的框架区（frame work，FR），各个结构域的排列方式为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。进一步可选地，所述“至少90%同一性”导致的氨基酸序列上的至多10%差异可存在于重链可变区或轻链可变区中的任意框架区中，或者存在于本发明的抗体或其片段中重链可变区和轻链可变区以外的任意结构域或序列中。所述差异可以由任何位置的氨基酸取代、缺失或插入产生。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包含人或鼠源的恒定区，优选包含人或鼠源的重链恒定区和/或轻链恒定区；优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包含来自人抗体胚系共有序列的重链和/或轻链恒定区序列。在一些实施方案中，所述的重链恒定区优选来自人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的恒定区序列。在一个具体实施方案中，所述重链恒定区包含或由SEQ IDNO: 33所示氨基酸序列，或由其组成。在一个具体实施方案中，所述轻链恒定区包含或由SEQ ID NO: 34所示氨基酸序列，或由其组成。

应当理解，也可以使用这些恒定区结构域的序列变体，例如包含一个或多个氨基酸修饰，其中氨基酸位点是Kabat等人的 (1991) EU索引系统标识。

在一个具体实施方案中，本发明提供了结合ROR1的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含重链和/或轻链，其中：

1）所述重链包含如SEQ ID NO: 47氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 47含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ IDNO: 47所示氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 47组成；所述轻链包含如SEQ ID NO: 48氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 48含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 48所示氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 48组成；或

2）所述重链包含如SEQ ID NO: 49所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 49含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQID NO: 49的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 49组成，所述轻链包含如SEQ ID NO: 50所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 50含有一个或多个氨基酸的取代（例如保守性取代）、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 50的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 50组成。

在前述任一项的抗体的某些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体、单链抗体、双功能抗体、单域抗体、纳米抗体、完全或部分人源化的抗体或者嵌合抗体等任意形式。在一个具体实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一个优选实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。在另一个更优选的实施方案中，所述抗体是人源化抗体。

在前述任一项的抗体的某些实施方案中，该抗体是全长抗体。

在一些实施方案中，本发明的抗ROR1抗体是完整抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4抗体。在另一个实施方案中，本发明的抗ROR1抗体仅涵盖其抗原结合部分，例如：Fab、Fab'、Fab'-SH、(Fab')₂、Fv、scFv、BsFv、dsFv或(dsFv)₂片段。

在一些实施方案中，所述抗原结合片段为抗体或半抗体的抗原结合片段，例如Fab、Fab'、Fab'-SH、(Fab')₂、Fv、scFv、BsFv、dsFv或(dsFv)₂片段；更优选地，所述抗体为IgG。

第二方面，本发明提供了一种生物材料，其包括：

（i）核酸分子，其编码本发明所述的抗体或其抗原结合片段；

（ii）载体，其包含（i）所述的核酸分子；和/或

（iii）宿主细胞，其包含（i）所述的核酸分子和/或（ii）所述的载体，或者所述宿主细胞被（i）所述的核酸分子和/或（ii）所述的载体转化或转染。

在一些实施方案中，所述核酸分子可以是分离的核酸分子。

本发明的核酸分子可以被克隆到载体中，进而转化或转染宿主细胞。因此本发明还提供了载体，其包含（i）所述的核酸分子。在一个实施方案中，所述载体是表达载体，例如真核表达载体、原核表达载体、人工染色体及噬菌体载体等。

本发明的载体或核酸分子可以用于转化或转染宿主细胞，用于保存或抗体表达等目的。因此，本发明还提供了宿主细胞，其包含（ii）所述的载体或（i）所述的核酸分子，或者所述宿主细胞被本发明的核酸分子和/或载体转化或转染。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。在一些实施方案中，该宿主细胞是原核的，例如大肠杆菌。在其它实施方案中，该宿主细胞是真核的，例如293细胞，CHO细胞，酵母细胞，或植物细胞。在一些实施方案中，该宿主细胞是适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。

本发明提供的抗体或其抗原结合片段可以利用本领域已知的任何方法获得。例如，可以先由本发明提供的核酸分子获得所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区，或者获得所述抗体的重链和/或轻链，然后与所述抗体的任选其他结构域组装成抗体。或者，第三方面，本发明提供了制备本文所述的抗ROR1抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适合于所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下在本文所述的宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合片段，并从所述宿主细胞回收所表达的抗体或其抗原结合片段。

第四方面，本发明提供一种抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugate，ADC），其包含本发明第一方面的抗体或其抗原结合片段，至少一种治疗活性物质或药物活性成分，以及连接子，所述接头将本发明第一方面的抗体或其抗原结合片段与治疗活性物质或药物活性成分连接。

本发明提供的抗体-药物偶联物具有以下优点：

（1）结合表达人ROR1的靶细胞，与其具有高亲和力；

（2）能够通过内吞作用进入细胞，杀伤靶细胞；在一些实施方案中，本发明的ADC具有高内吞效率；

（3）治疗、改善受试者与ROR1异常功能或表达相关的病症 (例如癌症，诸如卵巢癌、三阴性乳腺癌、子宫内膜癌、腹膜癌和肺癌)，或治疗、改善所述疾病的一或多种症状；

（4）减少或抑制受试者 (其具有表达ROR1的肿瘤) 中肿瘤生长或进展；

（5）在表达ROR1的细胞中发挥细胞毒性活性。

在一个实施方案中，本发明提供了包含第一方面所述抗ROR1抗体的缀合物。在一个具体的实施方案中，可以与抗ROR1抗体缀合的分子例如是细胞毒性剂、免疫调节剂、显像剂、荧光蛋白、分子标志物、治疗性蛋白质、生物聚合物及寡核苷酸等。

在一个实施方案中，本发明提供的抗体偶联药物具有Ab-(L-D)n的结构，其中：Ab为如本发明第一方面所述的结合ROR1的抗体或其抗原结合片段；L为连接子；D为治疗活性物质或药物活性成分，n表示1-8，例如1、2、3、4、5、6、7、8或其范围内的任意值。

在本发明的一个实施方案中，n表示偶联在一个单独的抗体(Ab)上的药物-连接体(L-D)部分的数目，n优选为1至8的整数，例如1、2、3、4、5、6、7或8。在此情况下，单独的ADC偶联物也可称为ADC化合物。在任何本文的实施方式中，在根据本发明的ADC化合物上，可以有1、2、3、4、5、6、7或8个药物连接体部分偶联到一个单独的抗体上。

在本发明的另一个实施方案中，n表示制备的偶联物组合物的平均DAR。在此情况下，n可以例如为在1.0至约8.0、1.0至约7.0、1.0至约6.6、2.0至约8.0、2.0至约7.5、2.0至6.5、或2.0至约6.0的范围内的整数或小数，例如3.0-4.0，4.0-5.0，7.0-8.0或其范围内的任意值。在一些实施方案中，n表示约3的平均DAR。在另一些实施方案中，n表示约4的平均DAR。在另一些实施方案中，n表示约5的平均DAR。在另一些实施方案中，n表示约6的平均DAR。

在另一些实施方案中，n表示约7的平均DAR。在另一些实施方案中，n表示约8的平均DAR。

IgG1型抗体具有16对半胱氨酸残基，其中以12个链内和4个链间二硫键的形式存在。链间二硫键具有溶剂可及性，可以被还原剂还原形成八个巯基，进而成为偶联目标。在本发明的一个实施方案中，连接子与抗ROR1抗体上半胱氨酸的巯基缀合。

在一个具体的实施方案中，所述治疗活性物质或药物活性成分是细胞毒素、植物毒素、小分子毒素、放射性同位素、美登木素生物碱等。在一个具体实施方案中，所述细胞毒素是海兔毒素（dolastatin）及其auristatin类衍生物，例如monomethyl auristatin E（MMAE）。在另一个具体实施方案中，所述细胞毒素是拓扑异构酶I抑制剂，例如喜树碱衍生物。在一个优选的实施方案中，所述细胞毒素是DXD。在另一个实施方案中，所述治疗活性物质或药物活性成分是MMAE或DXD。

在一个实施方案中，细胞毒素以非位点特异性方式或者位点特异性方式直接或者借助连接子与抗ROR1抗体或其抗原结合片段共价连接。

在一个实施方案中，所述连接子是蛋白酶可切割的肽连接子，在一个具体的实施方案中，所述肽连接子包含蛋白酶可切割的肽片段，例如甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸（GGFG）。在一个具体的实施方案中，肽连接子还可以包含例如与抗体半胱氨酸残基偶联的马来酰亚胺。

在一个实施方案中，连接子L与活性物质D组成Deruxtecan。

在一个具体的实施方案中，本发明所述的抗体偶联药物具有如下结构：

，其中，n=1-8。

在另一个具体的实施方案中，本发明所述的抗体偶联药物具有如下结构：

，其中，n=1-8。

第五方面，本发明提供一种偶联物，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段和偶联部分，偶联部分为另一种分子；优选地，偶联部分为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶等。

本发明提供的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体、宿主细胞和/或偶联物可以被包含在药物组合物中，更特别地被包含在药物制剂中，从而根据实际需要用于各种目的。因此，第六方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明第一方面的抗体或其抗原结合片段或本发明的生物材料（包括核酸分子、载体、宿主细胞）、抗体-药物偶联物、偶联物以及可药用载体。在本发明的一些实施方案中，所述药物组合物还包含第二治疗剂和/或任选地药用辅料，第二治疗剂选自细胞因子、抗体、化学治疗剂和小分子药物。

第七方面，本发明提供了本发明抗ROR1抗体或其抗原结合片段或本发明的生物材料（包括核酸分子、载体、宿主细胞）、抗体-药物偶联物、偶联物或药物组合物在制备如下任一所示的产品中的用途：

（a）检测ROR1的产品；

（b）刺激或提高免疫应答的产品；

（c）预防和/或治疗受试者所罹患疾病的产品。

在一个实施方案中，第一方面所述的任一抗体或其抗原结合片段或第四方面所述的抗体-药物偶联物用于治疗自身免疫性疾病或癌症。进一步地，所述疾病为ROR1阳性自身免疫性疾病或ROR1阳性癌症。在一个实施方案中，所述癌症为血液瘤、乳腺肿瘤、卵巢癌、多发性骨髓瘤（MM）、非小细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌、胰腺癌中的至少一种。

第八方面，本发明提供了一种在有需要的受试者中预防和/或治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明所述的抗体或其抗原结合片段或本发明的生物材料（包括核酸分子、载体、宿主细胞）、抗体-药物偶联物、偶联物、药物组合物等。所述疾病包括肿瘤或自身免疫性疾病；优选地，所述受试者为哺乳动物；更优选地，所述受试者为人。

在一些实施方案中，所述疾病包括肿瘤或自身免疫性疾病。进一步地，所述疾病为ROR1阳性自身免疫性疾病或ROR1阳性癌症。在一个实施方案中，所述癌症为血液瘤、乳腺肿瘤、卵巢癌、多发性骨髓瘤（MM）、非小细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌、胰腺癌中的至少一种。

第九方面，本发明提供了用作药物的本发明公开的抗体或其抗原结合片段或本发明的生物材料（包括核酸分子、载体、宿主细胞）、抗体-药物偶联物、偶联物或药物组合物。

第十方面，本发明提供了用于治疗的本发明公开的抗体或其抗原结合片段或本发明的生物材料（包括核酸分子、载体、宿主细胞）、抗体-药物偶联物、偶联物或药物组合物。

第十一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段或偶联物。

第十二方面，本发明提供了检测ROR1在样品中的存在或其水平的方法，其包括使本发明的抗体或其抗原结合片段或偶联物与样品接触，并检测所述抗体或其抗原结合片段或偶联物是否与ROR1形成复合物的步骤。

在下面的附图和具体实施方案中进一步说明本发明。然而，这些附图和具体实施方案不应被认为限制本发明的范围，并且本领域技术人员容易想到的改变将包括在本发明的精神和所附权利要求的保护范围内。

附图说明

图1显示了抗ROR1嵌合抗体与人ROR1胞外结构域蛋白结合活性。其中，图1A显示ch2C11G7和ch4G11H9与人ROR1胞外结构域蛋白结合活性，图1B显示ch11A2E4和ch17G11H9与人ROR1胞外结构域蛋白结合活性。

图2显示了抗ROR1嵌合抗体与人乳腺癌细胞HCC1187结合活性。

图3显示了抗ROR1嵌合抗体与人乳腺癌细胞MDA-MB-231结合活性。

图4显示了αhFc-CL-MMAE和αHFc-CL-DX8951与抗ROR1嵌合抗体诱导的细胞毒性。其中，图4A为抗ROR1嵌合抗体使用二抗MMAE偶联物对人乳腺癌细胞HCC1187的杀伤曲线；图4B为抗ROR1嵌合抗体使用二抗DX8951偶联物对人乳腺癌细胞HCC1187的杀伤曲线。

图5显示了抗ROR1嵌合抗体与人ROR2胞外结构域蛋白非特异性结合活性。

图6显示了抗ROR1嵌合抗体与鼠ROR1胞外结构域蛋白交叉反应结合活性。

图7显示了抗ROR1人源化抗体与人乳腺癌细胞MDA-MB-231结合活性。

图8显示了抗ROR1人源化抗体与人卵巢畸胎瘤细胞PA-1结合活性。

图9显示了抗ROR1人源化抗体与DXD和MMAE偶联制备的ADC在M-NSG小鼠MDA-MB-231人乳腺癌模型中的药效。其中，图9A显示了抗ROR1人源化抗体的ADC治疗不影响小鼠体重的变化，图9B显示了抗ROR1人源化抗体的ADC治疗抑制肿瘤生长。

具体实施方式

本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。

定义

除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学（包括重组技术）、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5%的下限和比指定数字数值大5%的上限的范围内的数字数值。

术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项的组合。

如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。

术语“抗体”在本文中以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质。

术语“免疫球蛋白”指具有天然存在抗体的结构的蛋白质，在本申请中通常可以与术语“抗体”互换使用。IgG类免疫球蛋白是由二硫键键合的两条轻链和两条重链组成的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条免疫球蛋白重链具有一个重链可变区（VH），也称作重链可变结构域，随后是三个重链恒定结构域（CH1、CH2和CH3）。类似地，从N端至C端，每条免疫球蛋白轻链具有一个轻链可变区（VL），也称作轻链可变结构域，随后是一个轻链恒定结构域（CL）。在IgG分子中，通常重链的VH-CH1与轻链的VL-CL配对形成特异性结合抗原的Fab片段。因此，一个IgG免疫球蛋白基本上由借助免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和两个二聚化的Fc区组成。免疫球蛋白的重链可以基于其恒定区的类型，归属5个类别之一，称作α(IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG)或μ (IgM)，其中某些类别可以进一步划分成亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链也可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ和λ。

“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”，是抗体可变结构域中在序列上高度可变并且形成在结构上确定的环（“超变环”）和/或含有抗原接触残基（“抗原接触点”）的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。

本领域公知多种用于在一个给定的VH或VL氨基酸序列中确定其CDR序列的方案：Kabat互补决定区（CDR）是基于序列变异性确定的并且是最常用的(Kabat等人, Sequencesof Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md. (1991)), 而Chothia指的是结构环的位置(Chothia等人, (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917；Chothia等人(1989) Nature 342:877-883), AbM CDR是Kabat CDR和Chothia结构环之间的折中，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用，“接触性”(Contact) CDR基于对可获得的复杂晶体结构的分析。根据不同的CDR确定方案，这些CDR中的每一个的残基如下所述。

在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案（例如不同的指派系统规则或组合）而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。

本发明抗体的CDR可以根据本领域的任何方案或其组合人工地评估确定边界。除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。

术语“抗原结合位点”与“抗原结合结构域”可以互换使用，表示抗体分子中与抗原实际结合的区域。抗原结合位点包括但不限于Fv、Fab片段、Fab'、Fab'-SH，F(ab')₂、单链抗体分子（例如scFv）、VHH等形式。

术语抗体的“可变区”或“可变结构域”指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。抗体的可变区可以进一步再划分为超变区（即，互补决定区（CDR））和间插在超变区之间的较为保守的区域（即，框架区（FR））。在IgG类免疫球蛋白的情况下，重链可变区或轻链可变区从N端至C端依次分别包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在重链抗体（在本文中也称作纳米抗体）的情况下，例如来自骆驼科重链抗体，抗原结合位点由单个VH结构域（即，“VHH”结构域）组成。天然重链抗体的VHH与天然的IgG抗体的重链可变区一样，具有相似的结构，即包含四个保守的框架区（FR）和三个互补决定区（CDR）。

“重链恒定区结构域”或“重链恒定区”指来自或获自或衍生自免疫球蛋白重链的恒定区结构域，包括从N端至C端顺序共价连接的重链恒定区CH1，CH2，CH3，和任选地重链恒定区CH4。在大多数情况下，重链恒定区CH1和CH2之间通过重链铰链区连接，但在适宜时，也可以通过柔性接头连接。

术语“EC₅₀”，也被称为“半数有效浓度”，是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50%的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。

如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）或本领域已知的常规结合测定法测定。

“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的内在结合能力。分子X对其结合配偶体Y的亲和力可以由平衡解离常数（KD）表示，平衡解离常数是解离速率常数和结合速率常数（分别是k_dis和k_on）的比值。结合亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。

氨基酸突变可以是氨基酸取代、缺失、插入和/或添加。在一些实施方案中，氨基酸突变是一个或者多个氨基酸的取代，例如单个氨基酸取代或多个氨基酸取代的组合。氨基酸缺失和插入包括在多肽序列的氨基和/或羧基末端的缺失和插入，也包括在多肽序列内部的缺失和插入。本发明的氨基酸取代任选地包括氨基酸的保守取代。

氨基酸序列的“同一性百分数（%）”是指将候选序列与本说明书中所示的具体氨基酸序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与本说明书中所示的具体氨基酸序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数。在一些实施方案中，本发明考虑本发明抗体分子的变体，所述变体相对于在本文中具体公开的抗体分子及其序列而言具有相当程度的同一性，例如同一性为至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%或更高。所述变体可以包含保守性修饰。

对于多肽序列，“保守性修饰”包括对多肽序列的置换、缺失或添加，它们导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。这类保守性修饰的变体相对于本发明的多态性变体、物种间同源物和等位基因而言是附加的并且不排斥它们。以下8组含有互为保守替换的氨基酸：1）丙氨酸（A）、甘氨酸（G）；2）天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）；3）天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q）；4）精氨酸（R）、赖氨酸（K）；5）异亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、甲硫氨酸（M）、缬氨酸（V）；6）苯丙氨酸（F）、酪氨酸（Y）、色氨酸（W）；7）丝氨酸（S）、苏氨酸（T）；和8）半胱氨酸（C）、甲硫氨酸（M）（参阅例如，Creighton, Proteins(1984)）。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。

本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗肿瘤，例如癌症中有效的任何物质，包括化疗剂、细胞因子、血管生成抑制剂、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂（例如免疫抑制剂）。

术语“抗体偶联药物”或“ADC”是指以共价键偶联治疗活性物质或活性药物成分的抗体或抗体片段，从而使得治疗活性物质或活性药物成分靶向至抗体的结合靶标以表现出其药理学功能。治疗活性物质或活性药物成分可以是能够杀死ADC靶向的细胞（优选癌细胞）的细胞毒素。治疗活性物质、活性药物成分或细胞毒素的共价连接可以以非位点特异性方式利用连接子进行，或者以位点特异性方式进行。

术语“位点特异性偶联”是指将治疗活性物质或活性药物成分特异性连接到抗体的特定位点的连接方式。在一个实施方式中，所述偶联借助连接子完成。

术语“细胞毒性剂”可以和“细胞毒素”互换使用，在本发明中指抑制或破坏细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。在一个实施方案中，细胞毒性剂可以包括但不限于细菌毒素、植物毒素、小分子毒素、放射性同位素等。

本发明的任何抗体偶联药物均可用海兔毒素（dolastatin）及其auristatin类衍生物与抗体偶联制备。海兔毒素及其auristatin类衍生物是抗体偶联药物中使用的重要细胞毒素，其干扰微管动力学、细胞分裂等，具有抗肿瘤、抗真菌活性。在一个方面中，海兔毒素及其auristatin类衍生物例如可为monomethyl auristatin D (MMAD)、monomethylauristatin E (MMAE)、monomethyl auristatin F (MMAF)及其他auristatin（例如美国公开案第20130129753号中所述的auristatin）等。

Monomethyl auristatin (MMAE) 即去甲基-auristatin E，是auristatin化合物家族成员中著名的一员，其结构式如下：

MMAE通过连接子与单克隆抗体偶联形成ADC。一般而言，连接子在该ADC进入肿瘤细胞后被裂解，从而释放MMAE，使其发挥细胞毒作用，杀伤肿瘤细胞。

DXD作为Exatecan的衍生物，是一种有效的DNA拓扑异构酶 I，先广泛应用于ADC领域，其通过可切割的四肽连接子（GGFG）借助于马来酰亚胺与抗体上的半胱氨酸残基相连。目前，由马来酰亚胺-GGFG-DXD组成的Deruxtecan作为一种ADC药物连接体可通过商业销售获得，且具有如下结构：

术语“接头”和“连接子”在本申请中可以互换使用，指使抗体与ADC中的治疗活性物质或活性药物成分共价连接的化学模块。在一个实施方案中，接头可以包含将抗原与有效载荷连接的氨基酸残基。氨基酸残基可以形成二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。氨基酸残基包括天然存在的那些以及非天然存在的氨基酸类似物，例如瓜氨酸或β-氨基酸，例如β-丙氨酸，或ω-氨基酸如4-氨基-丁酸。

根据性质分类，适用于本发明的接头可以是蛋白酶可降解的接头、不可断裂接头、酸敏接头、硅脂结构的接头、disulfide-carbamate接头、MC-GGFG接头、TRX接头、含半乳糖苷的接头、焦磷酸酯接头、近红外敏感的接头、紫外敏感的接头等。

本发明的接头还可以是一种或多种接头的组合，例如组织蛋白酶降解的接头可以与其它类型的接头组合，构成新的接头。因此，本发明所述的“接头”涵盖单个类型的接头，或不同类型接头的组合，只要其能够将本发明的抗体与药物偶联起来即可。

术语“负载”或“药物负载”或“有效负载”指在ADC分子内每个抗体的平均有效负载数（在本文中“有效负载”可与“治疗活性物质或活性药物成分”互换使用）。药物负载的范围可以为每个抗体1-20个治疗活性物质或活性药物成分。

术语“药物/抗体比”或“DAR”是指偶联于抗体的治疗活性物质或活性药物成分（D）与抗体的比例。本文中所述ADC通常具有1-8的DAR，在某些具体实施方案中具有1-8、2-8、2-6、2-5、3-8、4-6和2-4的DAR。代表性DAR值例如是1、2、3、4、5、6、7、8，通常表示为字母D或DAR和数字的组合，其中数字表示DAR的数值，例如D2/DAR2表示DAR值为2的药物/抗体比。在一些实施方案中，DAR是平均DAR，即通过检测方法 (例如通过常规方法如UV/可见光光谱法、质谱法、ELISA测定、电泳和/或HPLC) 测得的产品中偶联于本文所述的Ab部分的小分子药物部分（D）与Ab部分的总体比例。

DAR可能受限于抗体上的连结位点数目。例如，在连结位点是半胱氨酸硫醇的情形下，抗体可能只有一或几个半胱氨酸硫醇基或可能只有一或几个具有充分反应性的硫醇基(通过此硫醇基可连结连接单元)。

在一些实施方案中，本发明偶联物的平均DAR值是0至8，例如3.0-4.0，4.0-5.0，7.0-8.0，例如以这些数值中的两个作为端点的范围。

术语“个体”或“受试者”可互换地使用，是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物（例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马）、灵长类（例如，人和非人灵长类如猴）、兔和啮齿类（例如，小鼠和大鼠）。特别地，个体是人。

术语“治疗”指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体分子用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。

术语“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。

术语“有效量”指本发明的抗体或组合物的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；体重、年龄和一般健康状况；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。

术语“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。抗体或抗体片段或组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数至少约20%、更优选地至少约40%、甚至更优选地至少约50%、60%或70%和仍更优选地至少约80%或90%。

术语“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。

术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。所述药物组合物，包括但不限于：载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂、分散剂、温敏材料、温度调节剂、黏附剂、稳定剂、助悬剂等。

生物材料（核酸分子、载体和宿主细胞）

本发明提供编码以上任何抗体分子或其抗原结合片段的核酸分子。可以采用本领域熟知的方法，通过从头固相DNA合成或通过基因工程方法产生编码本发明抗体分子或其抗原结合片段的多核苷酸序列。此外，本发明的多核苷酸和核酸可以包含编码分泌信号肽的区段，并与编码本发明抗体分子或其抗原结合片段的区段可操作连接，从而可以指导本发明抗体分子或其抗原结合片段的分泌性表达。

本发明也提供包含本发明核酸分子的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体和原核表达载体。“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒（例如，裸的或包含在脂质体中）和病毒（例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒）。

本发明还提供包含所述核酸分子或所述载体的原核和真核宿主细胞。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。适用于复制并支持本发明抗体分子或其抗原结合片段表达的宿主细胞是本领域中公知的。可以用特定的表达载体转染或转导这类细胞，并且可以生长大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐，从而获得充足量的抗体分子。

组合物

本发明提供了包含本发明抗体分子或其抗原结合片段的组合物或其ADC分子的组合物。优选地，所述组合物为药物组合物。

本发明的组合物还包含药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂。在一个实施方案中，组合物 (例如，药物组合物) 包含本发明的抗ROR1抗体或其ADC分子，以及一种或多种其它治疗剂的组合。

如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。

对于药用辅料的使用及其用途，亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”,第八版, R.C.Rowe, P.J.Seskey和S.C. Owen, Pharmaceutical Press,London, Chicago。

本发明的组合物可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如散剂或混悬剂、液态溶液剂 (例如，可注射用溶液剂和可输注溶液剂)、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。

本发明组合物的施用途径是根据已知方法，例如，经口、静脉内、腹膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内或病灶内途径；通过持续释放系统或通过植入装置。在某些实施方案中，组合物可通过弹丸注射或通过连续输注或通过植入装置施用。

受试者可以是哺乳动物，例如，灵长类，例如，人类（例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的风险的个体）。在一个实施方案中，受试者患有本文所述疾病（例如，癌症）或具有患有本文所述疾病的风险。在某些实施方案中，受试者接受或已经接受过其它治疗，例如化疗治疗和/或放射疗法。在一些实施方案中，受试者之前已经接受过或正在接受免疫疗法。

可以通过将具有所需纯度的本发明的抗ROR1抗体或其ADC分子与一种或多种任选的药用辅料混合来制备包含本文所述的抗体的药物，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。

本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它治疗剂，包括化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂（例如免疫检查点抑制剂或激动剂）等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

制备本发明的抗体和抗体-药物偶联物

在一个实施方案中，本发明提供了制备抗ROR1抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达编码所述抗ROR1抗体的核酸的条件下培养包含编码抗ROR1抗体的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，以及任选地分离所述抗ROR1抗体。在某个实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞 (或宿主细胞培养基) 回收抗ROR1抗体。

为了重组产生本发明的抗ROR1抗体，首先分离编码本发明抗ROR1抗体的核酸，并将所述核酸插入载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序，例如通过使用能够与编码本发明抗ROR1抗体的核酸特异性结合的寡核苷酸探针进行。

如本文所述制备的本发明的抗ROR1抗体可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗ROR1抗体的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。

抗体-药物偶联物的生成可以通过本领域的技术人员已知的任何技术来完成。在一些方面，通过与抗体的氨基酸残基反应来完成药物-连接体与抗体的偶联。在一些实施方案中，应用带离去基团的杂芳基连接体L，将药物D偶联到抗体的半胱氨酸残基上，以制备本发明式I的偶联物。在一些实施方案中，可以通过控制以还原剂例如三(2-羟乙基)膦(TCEP)处理抗体的条件，破坏抗体的链间二硫键并暴露自由巯基用于与杂芳基连接体-药物偶联。对于IgG1型抗体，至多可以还原四个链接二硫键，从而生成至多8个反应性巯基基团用于偶联。通过此方法制备的偶联物可以在每个抗体分子中含有零个、一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个药物。

在制备的偶联物是具有不同药物偶联位点和/或个数的偶联物的组合物时，偶联物的载药量由平均DAR表示，其为平均每抗体的药物分子数。可以通过常规手段，例如质谱、ELISA测定和HPLC，表征制备产生的抗体-药物偶联物组合物的平均每抗体的药物数。在另一些实施方案中，也可以确定抗体-药物偶联物以n表示的定量分布。可以通过如反相HPLC或电泳等手段实现其中n为某一值的同质抗体-药物偶联物与具有其它载药量的抗体-药物偶联物的分离、纯化和表征。

实施例

以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以说明而非限定的方式来描述，并且本领域技术人员可以进行多种修改。

除非明确指明相反，否则本发明的实施将采用本领域内的常规化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的方法。所述及的实验方法，如无特殊说明，均为本领域采用默认参数、步骤等的常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为市售产品。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照相应产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

实施例1：产生抗人ROR1的小鼠杂交瘤

本实施例采用ROR1-Fc融合蛋白对小鼠进行免疫，以获得抗人ROR1的抗体。即采用人ROR1 (UniProtKB: Q01973) 蛋白胞外片段作为免疫原对小鼠进行免疫。具体方法如下：

动物免疫

将人ROR1蛋白胞外片段作为免疫原，将抗原稀释到1 mg/ml与等体积弗氏佐剂CFA（Sigma，F5881）或弗氏不完全佐剂IFA（Sigma，F5506）（初次免疫采用CFA，后续免疫均采用IFA）混合，对Balb/c雌性小鼠进行蛋白质免疫，初次免疫为50 μg/小鼠，后续免疫均为25 μg/小鼠，以2周的时间间隔反复进行免疫3次以上，最后一次免疫14天后，腹腔注射ROR1蛋白进行冲击免疫，3天后取小鼠脾脏进行细胞融合。

细胞融合

将小鼠脾细胞与SP2/0细胞（ATCC No.CRL-1581）按2:1比例电融合（BTX电融合仪：ECM2001⁺），在96孔培养板中以HAT(Sigma，货号：H0262)培养基培养，10天后进行杂交瘤细胞上清抗体筛选。

阳性克隆筛选

将培养的细胞上清收集并进行ELISA或FACS结合实验，挑选细胞培养上清阳性孔在96孔培养板用HT（Sigma-Aldrich, 货号：H0137）培养基进行克隆化培养，7-10天后，出现肉眼可见的克隆，取上清作抗体检测；在倒置显微镜下观察，挑选只有单个克隆生长的阳性孔，扩大培养并冻存，用无血清培养基(SFM，Thermo，12045076)培养后收集上清并纯化以待后续检测。

FACS结合实验：将表达人ROR1 (293T-hROR1，吉满生物科技(上海)有限公司构建)(Q01973)的细胞分别按2×10⁶/mL密度，50 μL/孔铺于96孔U型检测板。加入50 μL杂交瘤细胞培养上清于4℃孵育1小时。用FACS buffer (含有1%FBS的PBS溶液) 300 g离心洗涤细胞2次。每孔加入100 μL二抗（Invitrogen，A31571）稀释液重悬细胞，4℃孵育约1小时。FACSbuffer洗三次后，每孔加100 μL FACS buffer重悬细胞，流式细胞仪（BECKMAN COULTERcytoFLEX或BD FACSCelesta™）读取平均荧光强度（Median Fluorescence Intensity，MFI），结果如表1所示。

ELISA结合实验：包板蛋白为ROR1-his（Acro,RO1-H522y），1 μg/ml，50 μL /孔，4℃包板过夜；150 μL /孔2%BSA室温孵育1h；200 μL /孔PBST洗三遍；加入50 μL杂交瘤细胞培养上清于4℃孵育1小时；200 μL /孔PBST洗三遍；加入二抗（Anti-Mouse IgG，Sigma，A0168），37℃孵育30分钟。PBST洗三遍，拍干后，加入100 μL TMB（英创生物，EL0009），显色15分钟后每孔加入50 μL硫酸终止反应。酶标仪上读取OD值，表1中示出相应克隆。

表1 与人ROR1过表达293T细胞和ROR1胞外结构域蛋白结合的阳性杂交瘤克隆

<b>克隆号</b>	<b>293T-hROR1</b><b>（平均荧光强度）</b>	<b>ROR1-his</b><b>（</b><b>OD450</b><b>）</b>
			2C11G7	154393	3.356
4G11H9	180145.5	3.169
			11A2E4	168721.7	3.346
17G11H9	124261.9	3.204

实施例2：抗人ROR1的鼠源单克隆抗体的制备、纯化和功能鉴定

按照常规方法，将表1中与人ROR1具有结合活性的杂交瘤细胞用无血清培养基培养，10天后收集培养上清液，用Protein A柱（博格隆（上海）生物技术有限公司，货号：AA0272）纯化鼠源抗人ROR1单克隆抗体，获得纯化的单克隆抗体（按照杂交瘤的名称命名）。之后检测纯化的抗人ROR1抗体的活性和功能。

2.1 检测抗人ROR1的杂交瘤单克隆抗体与MDA-MB-231细胞结合活性

抗ROR1抗体与表达ROR1的MDA-MB-231细胞结合实验：将MDA-MB-231（科佰，CBP60382）细胞调整细胞浓度至2×10⁶细胞/mL，50 μL/孔置于96孔U底孔板，离心后舍弃上清。FACS buffer（含1%FBS的PBS溶液) 将抗ROR1抗体、对照抗体（抗人ROR1抗体，UC-961-mIgG，其将UC-961可变区序列构建到鼠恒定区上），阴性对照（mIgG, mouse IgG isotypecontrol, Invitrogen 31903）稀释至起始工作浓度，再用FACS buffer溶液进行梯度稀释。将梯度稀释的抗体50 μL/孔重悬细胞，吹打混匀，4℃孵育1小时。孵育后细胞经离心，用FACS buffer溶液清洗三次。每孔加入100 μL FACS buffer（含1% FBS的PBS溶液）稀释的二抗（Invitrogen，货号：A31571）稀释液重悬细胞团块，吹打混匀，于4℃孵育约45分钟。孵育后细胞经离心，清洗三次后，FACS buffer 100 μL/孔重悬细胞。流式细胞仪 (BECKMANCOULTER cytoFLEX)读取平均荧光强度（Median Fluorescence Intensity，MFI），利用Graphpad Prism 8.0软件分析试验数据，以抗体浓度对数为x轴，对应的MFI值为y轴，选用四参数方程回归模型，拟合抗体剂量效应曲线，计算出EC₅₀。

结果如表2所示。

2.2 检测抗人ROR1的杂交瘤单克隆抗体与人ROR1蛋白的结合活性

抗ROR1抗体与人ROR1-his结合实验: 包板蛋白为hROR1-his，1 μL/ml，50 μL/孔，4℃ 包板过夜；150 μL/孔2% BSA室温孵育1小时；200 μL/孔PBST洗三遍；样品、阳性抗体（抗人ROR1抗体，UC-961-mIgG，其将UC-961可变区序列构建到鼠恒定区上）配制300 μL 10μg /ml的母液；稀释倍数为3.16（100 μL母液+216 μL封闭液），共11个梯度；50 μL /孔样品或阳性抗体，加入等体积mIgG（mouse IgG isotype control, Invitrogen 31903）作为阴性对照，室温孵育1小时；200 μL /孔PBST洗三遍；每孔加入二抗（Anti-Mouse IgG，Sigma，A0168），37℃孵育30分钟。PBST洗三遍，每孔加入100 μL TMB（英创生物，EL0009），显色15分钟后每孔加入50 μL硫酸终止反应。酶标仪上读取OD450值。利用Graphpad Prism 8.0软件分析试验数据，以抗体浓度对数为x轴，对应的OD450值为y轴，选用四参数方程回归模型，拟合抗体剂量效应曲线，计算出EC₅₀。

结果如表2所示。

2.3 检测抗人ROR1的杂交瘤单克隆抗体与过表达人ROR1 293T细胞的结合活性

抗ROR1抗体与过表达人ROR1 293T 细胞结合实验：将人ROR1 293T细胞调整细胞浓度至2×10⁶细胞/mL，50 μL /孔置于96孔U底孔板，离心后舍弃上清。FACS buffer（含1%FBS的PBS溶液）将抗ROR1抗体、阳性对照抗体 (抗人ROR1抗体，UC-961- mIgG，其将UC-961可变区序列构建到鼠恒定区上) ，阴性对照mIgG（mouse IgG isotype control,Invitrogen 31903）稀释至起始工作浓度，再用FACS buffer溶液进行梯度稀释。将梯度稀释的抗体50 μL /孔重悬细胞，吹打混匀，4℃孵育1小时。孵育后细胞经离心，用FACSbuffer溶液清洗三次。每孔加入100 μL稀释的二抗（Invitrogen，货号：A31571）稀释液重悬细胞团块，吹打混匀，于4℃孵育约45分钟。孵育后细胞经离心，清洗三次后，FACS buffer100 μL/孔重悬细胞。流式细胞仪（BECKMAN COULTER cytoFLEX）读取平均荧光强度（MedianFluorescence Intensity，MFI），利用Graphpad Prism 8.0软件分析试验数据，以抗体浓度对数为x轴，对应的MFI值为y轴，选用四参数方程回归模型，拟合抗体剂量效应曲线，计算出EC₅₀。

结果如表2所示。

11A2E4杂交瘤抗体对MDA-MB-231、293T-ROR1、人ROR1-his具有强结合活性，EC₅₀分别为0.01520 μg/ml、0.269 μg/ml、0.01194 μg/ml，其活性与UC-961-mIgG类似或优于UC-961-mIgG。

表2 抗ROR1抗体与MDA-MB-231, 人ROR1蛋白以及与过表达人ROR1 293T细胞的结合活性

表2中的结果为多次实验的平均值，其中，NT：没有检测。N/A：不适用，没有得到有效的EC₅₀。

实施例3：构建、表达和纯化抗ROR1抗体的嵌合抗体和功能鉴定

3.1抗ROR1抗体测序、表达和纯化

将上述杂交瘤阳性克隆测序，序列见表3。将测序得到的轻、重链可变区（表3）构建到人源恒定区（IgG1/K，表4）上，构建相应的嵌合抗体，并经测序验证序列。嵌合抗体在相应杂交瘤克隆编号上加前缀ch对其进行命名。例如采用杂交瘤克隆2C11G7通过本实施例获得的嵌合抗体命名为ch2C11G7，用于体外功能鉴定或体内药效研究。

表3 抗ROR1抗体的CDR序列以及可变区序列（根据Kabat方案确定）

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表4 嵌合抗体及人源化抗体的恒定区序列

将编码抗体的相应核酸转染Expi293细胞(ThermoFisher)，进行抗体表达，并使用Protein A柱进行纯化，具体方法如下：Expi293细胞表达抗体：在转染前一天，将Expi293细胞密度稀释到1.5×10⁶细胞/mL，放于37℃，8% CO₂摇床中120 rpm进行培养。第二天，测定活细胞密度和存活率，细胞转染密度应在3×10⁶细胞/mL，细胞活率大于95%。制备PEI/质粒复合物：将PEI（1 mg/mL，polysciences，货号：24765-1）颠倒混匀。用OPM-293 CD05 Medium（奥浦迈，货号：81075-001）稀释包含编码核酸的质粒，质粒总量为1 μg/mL，稀释质粒的培养基的体积为转染体积的1/20，轻轻混匀，轻重链比例为1：1.5。用OPM-293 CD05 Medium稀释PEI试剂，稀释PEI的培养基的体积为转染体积的1/20，轻轻颠倒混匀，在室温下孵育5分钟。将稀释的PEI试剂加入到稀释的质粒中，轻轻颠倒混匀。将PEI/质粒复合物在室温下孵育15分钟，然后将溶液缓慢滴加到转移摇瓶中，在加入过程中轻轻旋转摇瓶。转染完毕后将摇瓶放于37℃，8% CO₂的摇床中120rpm培养。在转染后第二天(转染后24小时)，在摇瓶中加入10% OPM-293 ProFeed（奥浦迈，货号：F081918），在加入过程中轻轻旋转烧瓶，之后将摇瓶放回摇床中继续培养5-7天，收获上清。

Protein A柱纯化抗体：准备重力层析柱，打开重力层析柱上盖，将垫片置于重力柱底部，压紧。准备填料Protein A（Cytiva，货号：17549801），由目标填料体积和填料的悬浊比例精确计算出所需填料悬浊液体积，所需填料悬浊液体积=目标填料体积/填料的悬浊比例。将填料充分涡旋震荡，确保填料完全悬浮。填料悬浊液加入重力层析柱底部。添加至少10 CV的平衡缓冲液PBS到重力层析柱，平衡结束后，检测出口pH。如未至目标pH，继续加入平衡缓冲液直至平衡至目标pH。缓慢加入一定体积的样品至重力层析柱中。添加至少10CV的淋洗缓冲液到重力层析柱。缓慢加入5CV的洗脱缓冲液（10-50 mM NaAc，pH3.0-pH3.5）到重力层析柱，孵育3-5分钟对洗脱液进行收集。根据需要重复洗脱步骤。用中和缓冲液（1M Tris）调节洗脱液的pH至目标pH。用Nanodrop测定蛋白质浓度。通过超滤换液将保存抗体的缓冲液置换成PBS。

3.2 抗人ROR1嵌合抗体的结合活性

采用实施例2中公开的方法检测抗ROR1嵌合抗体与人ROR1胞外结构域蛋白的结合活性，结果如图1A和1B所示。

与高表达人ROR1的HCC1187结合活性如图2所示，与高表达人ROR1的MDA-MB-231结合活性如图3所示。将人乳腺癌细胞HCC1187（科佰，CBP60369）、MDA-MB-231以100 μL每孔加入96孔U底孔板中，离心弃上清。每孔加入100 μL FACS buffer（含1%FBS的PBS溶液）配制的抗体浓度梯度稀释液，4℃孵育约1小时。FACS buffer洗三次，每孔加入100 μL FACSbuffer稀释的二抗（Invitrogen，货号：A21445），4℃孵育约1小时。FACS buffer洗三次，每孔加入100 μL FACS buffer重悬细胞。流式细胞仪读取MFI，利用Graphpad Prism 8.0软件分析数据，以抗体浓度对数为x轴，对应的MFI值为y轴，选用四参数方程回归模型，拟合抗体剂量效应曲线，计算出EC₅₀。

结果如图1-3和表5所示，嵌合抗体ch2C11G7、ch4G11H9、ch11A2E4和ch17G11H9与ROR1蛋白、人癌细胞HCC187、人癌细胞MDA-MB-231具有强的结合活性，与阳性对照UC-961相当或优于阳性对照UC-961。

表5 抗ROR1嵌合抗体与人ROR1的结合活性

N/A：不适用，没有得到有效的EC₅₀；hIgG1为阴性对照抗体(Anti-HEL Human IgG1-Kappa Isotype control（abinvivo，货号：B117901）。

3.3 αhFc-CL-MMAE和αHFc-CL-DX8951与ROR1抗体诱导细胞毒性

Anti-Human IgG Fc-MMAE Antibody with Cleavable Linker（αHFc-CL-MMAE（Moradec，AH-102AE）是通过可切割linker偶联MMAE的抗人IgG Fc特异性抗体。αHFc-CL-MMAE通过识别抗人ROR1嵌合抗体的Fc端，在表达ROR1的细胞上导致内吞并在细胞内释放MMAE杀死细胞。胰酶消化得到HCC1187细胞，离心调整细胞密度至4×10⁴细胞/mL。向白色底透96孔板中每孔加入25 μL培养基稀释的抗体浓度梯度稀释液（起始终浓度为20 nM，4倍稀释）及50 μL细胞悬液。孵育10分钟后，每孔加入用培养基配制的25 μL αHFc-CL-MMAE工作液（Moradec, AH-102AE-50），将96孔板放入培养箱37℃，5 % CO₂培养。3天后，每孔加入50μL CTG（Adamas Life，RA-GL11-A），用酶标仪读取荧光相对光单位，利用四参数模型对RLU进行拟合，计算各抗体的IC₅₀值。

Anti-Human IgG Fc-DX8951 Antibody with Cleavable Linker αHFc-CL-DX8951（Moradec，AH-107DX）是通过可切割linker偶联exatecan mesylate (DX8951)的抗人IgG Fc特异性抗体。αHFc-CL-DX8951通过识别抗人ROR1嵌合抗体的Fc端，在表达ROR1的细胞上导致内吞并在细胞内释放DX8951杀死细胞。胰酶消化得到HCC1187细胞，离心调整细胞密度至4×10⁴细胞/mL。向白色底透96孔板中每孔加入25 μL培养基稀释的抗体浓度梯度稀释液（起始终浓度为20 nM，4倍稀释）及50 μL细胞悬液。孵育10分钟后，每孔加入用培养基配制的25 μL αHFc-CL- DX8951工作液（Moradec, AH-107DX-50），将96孔板放入培养箱37 ℃，5 % CO₂培养。3天后，每孔加入50 μL CTG（Adamas Life，RA-GL11-A），用酶标仪读取荧光相对光单位，利用四参数模型对RLU进行拟合，计算各抗体的IC₅₀值，

结果如图4A、4B和表6所示，嵌合抗体ch11A2E4均导致较强的杀伤活性，其活性与阳性对照UC-961相当或优于UC-961。

表6 αhFc-CL-MMAE和αHFc-CL-DX8951与抗ROR1嵌合抗体诱导的细胞毒性

3.4 抗人ROR1嵌合抗体与人ROR2结合活性

抗ROR1嵌合抗体与human ROR2-his胞外结构域蛋白结合实验：包板蛋白为hROR2-his(Acro,RO2-H52E5)，1 μL/ml，50 μL/孔，4℃包板过夜；150 μL/孔 2% BSA室温孵育1小时；200 μL/孔PBST洗三遍；样品、阳性抗体（UC-961）、阴性对照抗体hIgG1 (Anti-HELHuman IgG1-Kappa Isotype control（上海百英生物科技股份有限公司产品，货号：B117901）配制300 μL 10 μg /ml的母液；稀释倍数为3.16（100 μL母液+216 μL封闭液），共11个梯度，室温孵育1小时；200 μL /孔PBST洗三遍；加入二抗，37℃孵育30分钟。PBST洗三遍，每孔加入100 μL TMB（英创生物，EL0009），显色15 分钟后每孔加入50 μL硫酸终止反应。酶标仪上读取OD450值。利用Graphpad Prism 8.0软件分析试验数据，以抗体浓度对数为x轴，对应的OD450值为y轴，选用四参数方程回归模型，拟合抗体剂量效应曲线，计算出EC₅₀。

结果如图5所示，嵌合抗体ch11A2E4与人ROR2没有结合活性。

3.5 抗人ROR1嵌合抗体与鼠ROR1结合活性

抗ROR1嵌合抗体与鼠ROR1-his结合实验：包板蛋白为鼠ROR1-his(Acro,RO1-M5221)，1 μL/ml，50 μL/孔，4℃包板过夜；150 μL/孔2% BSA室温孵育1小时；200 μL/孔PBST洗三遍；样品，阳性抗体，阴性对照抗体hIgG1 (Anti-HEL Human IgG1-Kappa Isotypecontrol（abinvivo，货号：B117901）配制300 μL 10 μg /ml的母液；稀释倍数为3.16（100 μL母液+216 μL封闭液），共11个梯度；50 μL /孔样品，室温孵育1小时；200 μL /孔PBST洗三遍；加入二抗，37℃孵育30分钟。PBST洗三遍，每孔加入100 μL TMB（英创生物，EL0009），显色15分钟后每孔加入50 μL硫酸终止反应。酶标仪上读取OD450值。利用Graphpad Prism8.0软件分析试验数据，以抗体浓度对数为x轴，对应的OD450值为y轴，选用四参数方程回归模型，拟合抗体剂量效应曲线，计算出EC₅₀。

结果如图6所示，嵌合抗体ch11A2E4与鼠ROR1具有结合活性。

3.6 抗人ROR1嵌合抗体亲和力检测

将识别人IgG传感器探针置于Octet Red96e预湿板中。将抗体用0.02% PBST，0.1%BSA稀释至5000 ng/mL，每孔200 μL依次加入黑色不透明板中。将人ROR1蛋白用0.02%PBST，0.1%BSA稀释至400nM（8800ng/ml），再按2倍系列稀释得到梯度稀释的人ROR1蛋白，然后每孔200 μL依次加入黑色不透明板中。用Octet Red96e编辑实验方法进行运行，读取相结合信号数值。利用Octet分析软件Data Analysis分析试验数据，计算出动力学各种参数。

结果如表7所示，嵌合抗体ch2C11G7、ch4G11H9、ch11A2E4和ch17G11H9与ROR1蛋白的亲和力K_D值分别为0.9 nM，1.8 nM，0.349 nM和4.41 nM，阳性对照UC-961抗体亲和力K_D值为6.6 nM。

表7 抗ROR1嵌合抗体的亲和力结果

实施例4：抗人ROR1抗体人源化及人源化抗体的表达纯化

采用Kabat编号确定CDR，选择与鼠源序列同源性最高的人源种系基因作为受体框架，将鼠源序列的CDR移植至人源框架中。根据氨基酸重要性，进行回复突变，即将移植后框架区部分关键氨基酸回复突变成相对应的鼠源氨基酸，重、轻链分别设计数个变体。

4.1 抗ROR1抗体11A2E4人源化

分析鼠源抗体11A2E4序列，与IMGT的人胚系（germline）基因比对，确定IGKV1-33*01 和 IGKV5-2的框架区序列为轻链的人源化构架序列，IGHV3-23*04和IGHV3-69*1的框架区序列为重链的人源化构架序列。通过CDR-grafting (CDR采用KABAT编码法确定)，将重链和轻链的CDR分别并置于选择的人源化构架序列，同时，对构架区上的关键位点进行回复突变设计，获得到若干人源化抗体可变区，示于表8。将重轻链可变区序列，分别与人IgG1恒定区 (IMGT, human IGHG1*01)和人kappa恒定区组合（表4所示的序列），得到人源化抗体。具体获得的11A2E4人源化抗体的重轻链可变区序列组合如表9所示。

表8抗ROR1抗体11A2E4人源化重链可变区和轻链可变区序列

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表9 构建的人源化抗体对应的重链可变区序列和轻链可变区序列及其序列编号

4.2 抗ROR1人源化抗体的表达纯化

将表8中人源化抗体的轻、重链可变区按照表9中的组合分别构建到人源恒定区（hIgG1/K，表4）上，进行基因合成，测序确定与设计序列一致。采用实施例3中的方法在Expi293细胞中进行表达，并使用Protein A柱进行纯化。

4.3 抗ROR1人源化抗体结合实验

采用实施例3中公开的方法检测抗ROR1人源化抗体与人ROR1结合实验。收集MDA-MB-231/PA-1细胞（科佰，CBP60800），以100 μL每孔加入96孔U底孔板中，离心弃上清。每孔加入100 μL FACS buffer（含1%FBS的PBS溶液）配制的抗体浓度梯度稀释液，4℃孵育约1小时。FACS buffer洗三次，每孔加入100 μL FACS buffer稀释的二抗（Invitrogen，货号：A21445），4℃孵育约1小时。FACS buffer洗三次，每孔加入100 μL FACS buffer重悬细胞。流式细胞仪读取MFI，利用Graphpad Prism 8.0软件分析数据，以抗体浓度对数为x轴，对应的MFI值为y轴，选用四参数方程回归模型，拟合抗体剂量效应曲线，计算出EC₅₀。

如图7和表10所示，大部分检测的人源化抗体与高表达人ROR1的MDA-MB-231细胞具有较强的结合活性，其中hz11A2E4-H4L3的结合活性与亲本嵌合抗体ch11A2E4的活性相当。如图8和表10所示，所有检测的人源化抗体与高表达人ROR1的PA-1细胞具有较强的结合活性，其中hz11A2E4-H6L6的结合活性优于亲本嵌合抗体ch11A2E4。

表10 人源化抗体与高表达人ROR1的MDA-MB-231和PA-1细胞的结合活性

NT：没有检测

实施例5：抗人ROR1抗体ADC在小鼠模型中抑制肿瘤的生长

5.1抗人ROR1抗体与DXD偶联物的制备

在PBS缓冲液里加入抗体，使抗体反应浓度为1.0 mg/mL。加入500 mM的EDTA（沪试，10009617），使EDTA终浓度为2 mM。在反应液里加入TCEP溶液（Thermo，20490），混合均匀（摩尔比TCEP：mAb = 6：1），在37℃、600 rpm条件下反应2小时，以还原抗体的链间二硫键。待反应完成后，将反应液降温至4℃，在反应溶液中加入DMSO溶解的Deruxtecan溶液（MCE，HY-13631E），混合均匀（药物：mAb的摩尔比= 15:1），在4℃、600 rpm条件下反应1小时。按照同样方法制备阴性对照hIgG1-DXD。反应结束后，将反应液加入到30 KDa超滤管，用10 mM，pH 6.0的组氨酸盐酸溶液替换溶液6-8倍体积，浓缩到合适体积后，加入到平衡好的脱盐柱，离心得到纯化后的产品ADC。分别通过采用Nanodrop微量分光光度计检测ADC的最终浓度、SEC-HPLC检测ADC的纯度和通过RP-HPLC/HIC-HPLC检测ADC的DAR值，结果如表11所示。抗人ROR1抗体与DXD偶联物结构如下所示。

5.2 抗人ROR1抗体与MMAE偶联物的制备

加入一定量的抗体及PBS缓冲液，使抗体在反应混合液的浓度在1 mg/mL左右，加入一定量的EDTA溶液，使混合液的EDTA浓度在2 mM左右，加入1M Tris盐溶液，使反应体系的pH在6.6-7.5之间，加入2-6当量的TCEP还原，混匀仪上37℃，轻微震荡1-3小时，然后调节混匀仪温度在4℃左右，冷却反应液，加入5-10当量的DMSO溶解的Vc-MMAE (MCE，HY-15575)，4℃反应1-2小时，最后将反应液加入到30K的超滤管，用10mM，pH 6.0的组氨酸盐酸溶液换液6-8次，浓缩到合适体积，加入到平衡好的脱盐柱，离心得到纯化后的ADC产品，检测浓度和DAR值。ADC样品浓度和DAR值检测结果如表11所示。抗人ROR1抗体与MMAE偶联物结构如下所示。

表11 抗人ROR1抗体与DXD和MMAE偶联物表征分析结果

5.3 抗人ROR1人源化抗体与DXD和MMAE偶联制备的ADC在M-NSG小鼠MDA-MB-231人乳腺癌模型中的药效

在免疫缺陷M-NSG小鼠（上海南方模式生物科技股份有限公司）建立MDA-MB-231人乳腺癌动物模型，并评估ROR1-ADC（Dxd毒素）的抗肿瘤药效。将MDA-MB-231细胞用无血清培养基（RPMI 1640）稀释，再加入相应体积的Matrigel（货号：354234，BD，RPMI 1640培养基：Matrigel=7：3），和细胞液混匀，按照5×10⁶个细胞/mL 200 μl/只接种于M-NSG小鼠右侧斜肋部皮下。当平均肿瘤体积接近150 mm³时，对小鼠分组给药（方案详见表12），小鼠按照10ml/kg标准，尾静脉注射给药（i.v.），一周一次连续2周（Qw*2）。之后观察小鼠生存状况到给药后第55天，期间收集入组小鼠体重和肿瘤体积数据。小鼠肿瘤体积测量：用数显游标卡尺（500-151-30，Mitutoyo三丰）测量小鼠肿瘤长径和宽径，按照肿瘤计算公式：TV=1/2*L*W2mm³（TV：肿瘤体积；L：肿瘤长径，W：肿瘤宽径）。

表12 小鼠分组及给药方案

如图9A所示，在实验观察期内，荷瘤小鼠体重整体增长，表明荷瘤小鼠对该剂量条件下的抗人ROR1抗体与DXD或MMAE偶联物具有良好的耐受性。M-NSG小鼠给药后（i.v., Qw*2）小鼠肿瘤体积数据变化如图9B所示。在给药第2针后，小鼠肿瘤体积开始出现部分消退现象（自给药后第12天开始），之后不同给药组别消退程度出现分化，以G2组（hz11A2E4-H6L6-DXD7.7 10mg/kg，第31天TGI：98% vs. 溶媒组PBS），G3组（hz11A2E4-H6L6-DXD7.7 5 mg/kg，第31天TGI：96% vs.溶媒组 PBS）和G5组（hz11A2E4-H6L6-DXD3.8 10mg/kg，第27天TGI：87 % vs.溶媒组 PBS）最为显著。G6组（hz11A2E4-H6L6-MMAE4.3）也有抗肿瘤效应，其药效劣于DXD给药组。

序列信息：

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Claims

1.一种结合ROR1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：

（1）HCDR1包含如SEQ ID NO: 1所示序列，或相对于SEQ ID NO: 1含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 1组成；HCDR2包含如SEQ IDNO: 2所示序列，或相对于SEQ ID NO: 2含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 2组成；HCDR3包含如SEQ ID NO: 3所示序列，或相对于SEQID NO: 3含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ IDNO: 3组成；LCDR1包含如SEQ ID NO: 5所示序列，或相对于SEQ ID NO: 5含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 5组成；LCDR2包含如SEQID NO: 6所示序列，或相对于SEQ ID NO: 6含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 6组成；LCDR3包含如SEQ ID NO: 7所示序列，或相对于SEQ ID NO: 7含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQID NO: 7组成；

（2）HCDR1包含如SEQ ID NO: 9所示序列，或相对于SEQ ID NO: 9含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 9组成；HCDR2包含如SEQ IDNO: 10所示序列，或相对于SEQ ID NO: 10含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 10组成；HCDR3包含如SEQ ID NO: 11所示序列，或相对于SEQ ID NO: 11含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 11组成；LCDR1包含如SEQ ID NO: 13所示序列，或相对于SEQ ID NO: 13含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 13组成；LCDR2包含如SEQ ID NO: 14所示序列，或相对于SEQ ID NO: 14含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 14组成；LCDR3包含如SEQ ID NO:15所示序列，或相对于SEQ ID NO: 15含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 15组成；

（3）HCDR1包含如SEQ ID NO: 17所示序列，或相对于SEQ ID NO: 17含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 17组成；HCDR2包含如SEQID NO: 18所示序列，或相对于SEQ ID NO: 18含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 18组成；HCDR3包含如SEQ ID NO: 19所示序列，或相对于SEQ ID NO: 19含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 19组成；LCDR1包含如SEQ ID NO: 21所示序列，或相对于SEQ ID NO: 21含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 21组成；LCDR2包含如SEQ ID NO: 22所示序列，或相对于SEQ ID NO: 22含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 22组成；LCDR3包含如SEQ ID NO:23所示序列，或相对于SEQ ID NO: 23含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 23组成；或者

（4）HCDR1包含如SEQ ID NO: 25所示序列，或相对于SEQ ID NO: 25含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 25组成；HCDR2包含如SEQID NO: 26所示序列，或相对于SEQ ID NO: 26含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 26组成；HCDR3包含如SEQ ID NO: 27所示序列，或相对于SEQ ID NO: 27含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 27组成；LCDR1包含如SEQ ID NO: 29所示序列，或相对于SEQ ID NO: 29含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 29组成；LCDR2包含如SEQ ID NO: 30所示序列，或相对于SEQ ID NO: 30含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 30组成；LCDR3包含如SEQ ID NO:31所示序列，或相对于SEQ ID NO: 31含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或由SEQ ID NO: 31组成。

2.根据权利要求1所述的结合ROR1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，其中：

1）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 4含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 4组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 8含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 8的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 8组成；

2）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 12含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 12组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 16含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 16组成；

3）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 20所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 20含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 20的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 20组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 24含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 24的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 24组成；

4）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 28所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 28含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 28的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 28组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 32所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 32含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 32的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 32组成；

5）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 35所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 35含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 35的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 35组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 40所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 40含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 40的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 40组成；

6）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 35所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 35含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 35的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 35组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 41所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 41含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 41的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 41组成；

7）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 35所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 35含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 35的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 35组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 42所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 42含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 42的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 42组成；

8）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 35所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 35含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 35的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 35组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 46所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 46含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 46的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 46组成；

9）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 36所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 36含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 36的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 36组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 40所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 40含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 40的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 40组成；

10）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 36所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 36含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 36的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 36组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 41所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 41含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 41的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 41组成；

11）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 36所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 36含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 36的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 36组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 42所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 42含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 42的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 42组成；

12）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 36所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 36含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 36的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 36组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 46所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 46含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 46的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 46组成；

13）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 37含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 37的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 37组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 40所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 40含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 40的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 40组成；

14）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 37含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 37的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 37组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 41所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 41含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 41的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 41组成；

15）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 37含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 37的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 37组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 42所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 42含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 42的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 42组成；

16）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 37含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 37的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 37组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 46所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 46含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 46的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 46组成；

17）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 37含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 37的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 37组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 43所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 43含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 43的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 43组成；

18）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 37含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 37的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 37组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 44所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 44含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 44的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 44组成；

19）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 37含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 37的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 37组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 45所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 45含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 45的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 45组成；

20）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 38所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 38含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 38的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 38组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 42所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 42含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 42的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 42组成；

21）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 38所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 38含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 38的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 38组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 43所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 43含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 43的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 43组成；

22）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 38所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 38含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 38的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 38组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 44所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 44含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 44的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 44组成；

23）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 38所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 38含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 38的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 38组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 45所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 45含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 45的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 45组成；

24）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 39所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 39含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 39的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 39组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 46所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 46含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 46的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 46组成；

25）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 39所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 39含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 39的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 39组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 43所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 43含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 43的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 43组成；

26）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 39所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 39含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 39的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 39组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 44所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 44含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 44的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 44组成；或

27）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 39所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 39含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 39的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 39组成；和/或所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 45所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 45含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 45的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 45组成。

3.根据权利要求1或2所述的结合ROR1的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为单克隆抗体、单链抗体、双功能抗体、单域抗体、纳米抗体、完全或部分人源化的抗体或者嵌合抗体等任意形式；和/或

所述抗原结合片段为抗体或半抗体的抗原结合片段，例如Fab、Fab'、Fab'-SH、(Fab')₂、Fv、scFv、BsFv、dsFv或(dsFv)₂片段。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的结合ROR1的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段还包含人或鼠源的恒定区，优选包含人或鼠源的重链恒定区和/或轻链恒定区；

更优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的结合ROR1的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为单克隆抗体，优选为鼠、嵌合或人源化的单克隆抗体；优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型；

更优选地，所述重链恒定区包含或由SEQ ID NO: 33所示的序列组成；和/或所述轻链恒定区包含或由SEQ ID NO: 34所示的序列组成。

6. 根据权利要求1-5中任一项所述的结合ROR1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链和/或轻链，其中：

1）所述重链包含如SEQ ID NO: 47所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 47含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 47的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 47组成，所述轻链包含如SEQ ID NO:48所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 48含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 48的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 48组成；或

2）所述重链包含如SEQ ID NO: 49所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 49含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 49的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 49组成，所述轻链包含如SEQ ID NO:50所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO: 50含有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入或其任意组合的序列，或与SEQ ID NO: 50的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 50组成。

7.一种生物材料，其包括：

（i）核酸分子，其编码权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；

（ii）载体，其包含（i）所述的核酸分子；和/或

（iii）宿主细胞，其包含（i）所述的核酸分子和/或（ii）所述的载体，或者所述宿主细胞被（i）所述的核酸分子和/或（ii）所述的载体转化或转染；

其中，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选地，所述宿主细胞选自酵母细胞、CHO细胞、293细胞、植物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。

8.一种抗体-药物偶联物，其包含权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、至少一种治疗活性物质或药物活性成分，以及连接子；

优选地，所述治疗活性物质或药物活性成分选自细胞毒素、植物毒素、小分子毒素、放射性同位素、美登木素生物碱中的至少一种；

优选地，所述连接子为可切割连接子；

优选地，所述抗体-药物偶联物具有如下结构：

，其中，n为1-8；或

，其中，n为1-8。

9.一种药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求7所述的生物材料或权利要求8所述的抗体-药物偶联物以及可药用载体；

优选地，所述药物组合物还包含第二治疗剂和/或任选地药用辅料，所述第二治疗剂选自细胞因子、抗体、化学治疗剂和小分子药物。

10.权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求7所述的生物材料、权利要求8所述的抗体-药物偶联物或权利要求9所述的药物组合物在制备如下任一所示的产品中的用途：

（a）检测ROR1的产品；

（b）刺激或提高免疫应答的产品；

（c）预防和/或治疗受试者所罹患疾病的产品；

优选地，所述疾病为癌症或自身免疫性疾病；

更优选地，所述癌症为血液瘤、乳腺肿瘤、卵巢癌、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌中的至少一种。