JP2020074776A - 抗gpc3抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕配列番号155に示されるアミノ酸配列からなるヒトGPC3(Glypican-3)由来のポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、
(1−1)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域(CDR)1、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号3に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号5に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号6に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(2−1)配列番号11に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号12に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号13に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号16に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(3−1)配列番号21に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号22に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号23に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、配列番号24に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号25に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号26に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(4−1)配列番号31に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号32に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号33に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号34に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号35に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号36に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(5−1)配列番号41に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号42に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号43に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号44に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号45に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号46に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(6−1)配列番号51に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号52に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号53に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号54に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号55に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号56に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(7−1)配列番号61に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号62に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号63に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号64に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号65に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号66に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(8−1)配列番号71に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号72に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号73に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号74に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号75に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号76に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(9−1)配列番号81に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号82に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号83に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号84に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号85に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号86に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(10−1)配列番号91に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号92に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号93に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号94に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号95に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号96に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;或いは
(11−1)配列番号101に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号102に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号103に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号104に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号105に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号106に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含む;
前記抗体(以下、「本件抗体」ということがある)。
〔2〕(1−2)配列番号7に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号8に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(2−2)配列番号17に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号18に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(3−2)配列番号27に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号28に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(4−2)配列番号37に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号38に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(5−2)配列番号47に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号48に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(6−2)配列番号57に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号58に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(7−2)配列番号67に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号68に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(8−2)配列番号77に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号78に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(9−2)配列番号87に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号88に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(10−2)配列番号97に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号98に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;或いは
(11−2)配列番号107に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号108に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む;
上記〔1〕に記載の抗体。
〔3〕一本鎖抗体である上記〔1〕又は〔2〕のいずれかに記載の抗体。
〔4〕一本鎖抗体が、
(1−3)配列番号165に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(2−3)配列番号166に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(3−3)配列番号167に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(4−3)配列番号168に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(5−3)配列番号169に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(6−3)配列番号170に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(7−3)配列番号171に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(8−3)配列番号172に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(9−3)配列番号173に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(10−3)配列番号174に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;或いは
(11−3)配列番号175に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
上記〔3〕に記載の抗体。
〔5〕一本鎖抗体が、
(1−3’−1)配列番号178に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(1−3’−2)配列番号179に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(1−3’−3)配列番号180に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(2−3’−1)配列番号181に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(2−3’−2)配列番号182に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(2−3’−3)配列番号183に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;或いは
(2−3’−4)配列番号184に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
上記〔3〕に記載の抗体。
〔6〕(1−4)配列番号9に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(2−4)配列番号19に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号20に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(3−4)配列番号29に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号30に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(4−4)配列番号39に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号40に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(5−4)配列番号49に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号50に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(6−4)配列番号59に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号60に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(7−4)配列番号69に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号70に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(8−4)配列番号79に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号80に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(9−4)配列番号89に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号90に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(10−4)配列番号99に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号100に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;或いは
(11−4)配列番号109に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号110に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む;
上記〔1〕又は〔2〕に記載の抗体。
〔7〕上記〔3〕〜〔5〕のいずれかに記載の抗体(以下、「本件一本鎖抗体」ということがある)と、本件一本鎖抗体のカルボキシル末端に融合した細胞膜貫通領域と、前記細胞膜貫通領域のカルボキシル末端に融合した免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域とを含むCAR(以下、「本件CAR」ということがある)。
〔8〕配列番号185〜187のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む上記〔7〕に記載のCAR。
〔9〕上記〔7〕又は〔8〕に記載のCARを発現する免疫担当細胞(以下、「本件免疫担当細胞」ということがある)。
〔10〕さらに、インターロイキン7(IL―7)、及びケモカインリガンド19(CCL19)を発現する上記〔9〕に記載の免疫担当細胞。
〔11〕上記〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の抗体をコードする抗体遺伝子(以下、「本件抗体遺伝子」ということがある)、又は上記〔7〕若しくは〔8〕に記載のCARをコードするCAR遺伝子(以下、「本件CAR遺伝子」ということがある)。
〔12〕上記〔1〕〜〔4〕及び〔6〕のいずれかに記載の抗体をコードする抗体遺伝子。
〔13〕プロモーターと、該プロモーターの下流に作動可能に連結されている上記〔11〕に記載の抗体遺伝子、又は上記〔11〕に記載のCARをコードするCAR遺伝子とを含むベクター(以下、「本件ベクター」ということがある)。
〔14〕プロモーターと、該プロモーターの下流に作動可能に連結されている上記〔12〕に記載の抗体遺伝子とを含むベクター。
〔15〕上記〔13〕又は〔14〕に記載のベクターが導入されている宿主細胞(以下、「本件宿主細胞」ということがある)。
〔16〕上記〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の抗体を用いて、GPC3(Glypican-3)を検出する工程を備えたGPC3の検出方法(以下、「本件検出方法」ということがある)。
〔17〕上記〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の抗体、又はその標識物を含む、GPC3(Glypican-3)の検出用キット(以下、「本件検出用キット」ということがある)。
上記(1−3)の一本鎖抗体と、配列番号185に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(1−3)の一本鎖抗体と、配列番号186に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(1−3)の一本鎖抗体と、配列番号187に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(1−3’−1)の一本鎖抗体と、配列番号185に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(1−3’−1)の一本鎖抗体と、配列番号186に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(1−3’−1)の一本鎖抗体と、配列番号187に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(1−3’−2)の一本鎖抗体と、配列番号185に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(1−3’−2)の一本鎖抗体と、配列番号186に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(1−3’−2)の一本鎖抗体と、配列番号187に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(1−3’−3)の一本鎖抗体と、配列番号185に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(1−3’−3)の一本鎖抗体と、配列番号186に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(1−3’−3)の一本鎖抗体と、配列番号187に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(2−3)の一本鎖抗体と、配列番号185に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(2−3)の一本鎖抗体と、配列番号186に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(2−3)の一本鎖抗体と、配列番号187に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(2−3’−1)の一本鎖抗体と、配列番号185に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(2−3’−1)の一本鎖抗体と、配列番号186に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(2−3’−1)の一本鎖抗体と、配列番号187に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(2−3’−2)の一本鎖抗体と、配列番号185に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(2−3’−2)の一本鎖抗体と、配列番号186に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(2−3’−2)の一本鎖抗体と、配列番号187に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(2−3’−3)の一本鎖抗体と、配列番号185に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(2−3’−3)の一本鎖抗体と、配列番号186に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(2−3’−3)の一本鎖抗体と、配列番号187に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(2−3’−4)の一本鎖抗体と、配列番号185に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(2−3’−4)の一本鎖抗体と、配列番号186に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むものや、
上記(2−3’−4)の一本鎖抗体と、配列番号187に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含むもの、を挙げることができる。
(1−1D)配列番号111に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の91〜105番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR1遺伝子(上記(1−1)のH鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号111に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の148〜198番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR2遺伝子(上記(1−1)のH鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号111に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の295〜324番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR3遺伝子(上記(1−1)のH鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;と、
配列番号112に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の70〜102番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR1遺伝子(上記(1−1)のL鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号112に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の148〜168番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR2遺伝子(上記(1−1)のL鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号112に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の265〜291番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR3遺伝子(上記(1−1)のL鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;とを含むものや、
(2−1D)配列番号115に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の91〜105番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR1遺伝子(上記(2−1)のH鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号115に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の148〜198番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR2遺伝子(上記(2−1)のH鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号115に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の295〜321番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR3遺伝子(上記(2−1)のH鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;と、
配列番号116に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の70〜117番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR1遺伝子(上記(2−1)のL鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号116に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の163〜183番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR2遺伝子(上記(2−1)のL鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号116に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の280〜306番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR3遺伝子(上記(2−1)のL鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;とを含むものや、
(3−1D)配列番号119に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の91〜105番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR1遺伝子(上記(3−1)のH鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号119に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の148〜198番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR2遺伝子(上記(3−1)のH鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号119に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の295〜315番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR3遺伝子(上記(3−1)のH鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;と、
配列番号120に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の70〜102番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR1遺伝子(上記(3−1)のL鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号120に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の148〜168番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR2遺伝子(上記(3−1)のL鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号120に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の265〜288番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR3遺伝子(上記(3−1)のL鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;とを含むものや、
(4−1D)配列番号123に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の91〜105番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR1遺伝子(上記(4−1)のH鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号123に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の148〜198番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR2遺伝子(上記(4−1)のH鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号123に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の298〜330番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR3遺伝子(上記(4−1)のH鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;と、
配列番号124に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の70〜102番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR1遺伝子(上記(4−1)のL鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号124に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の148〜168番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR2遺伝子(上記(4−1)のL鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号124に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の265〜291番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR3遺伝子(上記(4−1)のL鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;とを含むものや、
(5−1D)配列番号127に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の91〜105番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR1遺伝子(上記(5−1)のH鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号127に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の148〜198番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR2遺伝子(上記(5−1)のH鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号127に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の298〜321番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR3遺伝子(上記(5−1)のH鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;と、
配列番号128に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の70〜120番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR1遺伝子(上記(5−1)のL鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号128に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の166〜186番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR2遺伝子(上記(5−1)のL鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号128に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の283〜309番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR3遺伝子(上記(5−1)のL鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;とを含むものや、
(6−1D)配列番号131に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の91〜105番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR1遺伝子(上記(6−1)のH鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号131に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の148〜198番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR2遺伝子(上記(6−1)のH鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号131に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の295〜318番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR3遺伝子(上記(6−1)のH鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;と、
配列番号132に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の70〜102番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR1遺伝子(上記(6−1)のL鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号132に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の148〜168番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR2遺伝子(上記(6−1)のL鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号132に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の265〜291番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR3遺伝子(上記(6−1)のL鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;とを含むものや、
(7−1D)配列番号135に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の91〜105番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR1遺伝子(上記(7−1)のH鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号135に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の148〜198番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR2遺伝子(上記(7−1)のH鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号135に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の295〜315番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR3遺伝子(上記(7−1)のH鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;と、
配列番号136に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の70〜102番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR1遺伝子(上記(7−1)のL鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号136に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の148〜168番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR2遺伝子(上記(7−1)のL鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号136に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の265〜291番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR3遺伝子(上記(7−1)のL鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;とを含むものや、
(8−1D)配列番号139に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の91〜105番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR1遺伝子(上記(8−1)のH鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号139に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の148〜198番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR2遺伝子(上記(8−1)のH鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号139に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の295〜315番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR3遺伝子(上記(8−1)のH鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;と、配列番号140に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の70〜102番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR1遺伝子(上記(8−1)のL鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号140に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の148〜168番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR2遺伝子(上記(8−1)のL鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号140に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の265〜291番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR3遺伝子(上記(8−1)のL鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;とを含むものや、
(9−1D)配列番号143に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の91〜105番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR1遺伝子(上記(9−1)のH鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号143に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の148〜198番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR2遺伝子(上記(9−1)のH鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号143に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の298〜330番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR3遺伝子(上記(9−1)のH鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;と、
配列番号144に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の70〜102番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR1遺伝子(上記(9−1)のL鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号144に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の148〜168番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR2遺伝子(上記(9−1)のL鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号144に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の265〜291番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR3遺伝子(上記(9−1)のL鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;とを含むものや、
(10−1D)配列番号147に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の91〜105番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR1遺伝子(上記(10−1)のH鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号147に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の148〜198番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR2遺伝子(上記(10−1)のH鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号147に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の295〜327番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR3遺伝子(上記(10−1)のH鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;と、
配列番号148に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の70〜102番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR1遺伝子(上記(10−1)のL鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号148に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の148〜168番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR2遺伝子(上記(10−1)のL鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号148に示されるヌクレオチド配列からなるL鎖V領域の265〜291番目のヌクレオチド残基からなるL鎖CDR3遺伝子(上記(10−1)のL鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該L鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;とを含むものや、
(11−1D)配列番号151に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の91〜105番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR1遺伝子(上記(11−1)のH鎖CDR1をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR1遺伝子の縮重コドン改変体;配列番号151に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の148〜198番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR2遺伝子(上記(11−1)のH鎖CDR2をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR2遺伝子の縮重コドン改変体;及び配列番号151に示されるヌクレオチド配列からなるH鎖V領域の295〜324番目のヌクレオチド残基からなるH鎖CDR3遺伝子(上記(11−1)のH鎖CDR3をコードする遺伝子)、又は当該H鎖CDR3遺伝子の縮重コドン改変体;とを含むものを挙げることができる。
(1−2D)配列番号111に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖可変領域遺伝子(配列番号7に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖可変領域をコードする遺伝子)と、配列番号112に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖可変領域遺伝子(配列番号8に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖可変領域をコードする遺伝子)とを含むものや、
(2−2D)配列番号115に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖可変領域遺伝子(配列番号17に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖可変領域をコードする遺伝子)と、配列番号116に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖可変領域遺伝子(配列番号18に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖可変領域をコードする遺伝子)とを含むものや、
(3−2D)配列番号119に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖可変領域遺伝子(配列番号27に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖可変領域をコードする遺伝子)と、配列番号120に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖可変領域遺伝子(配列番号28に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖可変領域をコードする遺伝子)とを含むものや、
(4−2D)配列番号123に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖可変領域遺伝子(配列番号37に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖可変領域をコードする遺伝子)と、配列番号124に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖可変領域遺伝子(配列番号38に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖可変領域をコードする遺伝子)とを含むものや、
(5−2D)配列番号127に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖可変領域遺伝子(配列番号47に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖可変領域をコードする遺伝子)と、配列番号128に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖可変領域遺伝子(配列番号48に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖可変領域をコードする遺伝子)とを含むものや、
(6−2D)配列番号131に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖可変領域遺伝子(配列番号57に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖可変領域をコードする遺伝子)と、配列番号132に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖可変領域遺伝子(配列番号58に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖可変領域をコードする遺伝子)とを含むものや、
(7−2D)配列番号135に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖可変領域遺伝子(配列番号67に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖可変領域をコードする遺伝子)と、配列番号136に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖可変領域遺伝子(配列番号68に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖可変領域をコードする遺伝子)とを含むものや、
(8−2D)配列番号139に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖可変領域遺伝子(配列番号77に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖可変領域をコードする遺伝子)と、配列番号140に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖可変領域遺伝子(配列番号78に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖可変領域をコードする遺伝子)とを含むものや、
(9−2D)配列番号143に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖可変領域遺伝子(配列番号87に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖可変領域をコードする遺伝子)と、配列番号144に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖可変領域遺伝子(配列番号88に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖可変領域をコードする遺伝子)とを含むものや、
(10−2D)配列番号147に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖可変領域遺伝子(配列番号97に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖可変領域をコードする遺伝子)と、配列番号148に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖可変領域遺伝子(配列番号98に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖可変領域をコードする遺伝子)とを含むものや、
(11−2D)配列番号151に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖可変領域遺伝子(配列番号107に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖可変領域をコードする遺伝子)と、配列番号152に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖可変領域遺伝子(配列番号108に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖可変領域をコードする遺伝子)とを含むものを挙げることができる。
(1−4D)配列番号113に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖遺伝子(配列番号9に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖をコードする遺伝子)と、配列番号114に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖遺伝子(配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖をコードする遺伝子)とを含むものや、
(2−4D)配列番号117に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖遺伝子(配列番号19に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖をコードする遺伝子)と、配列番号118に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖遺伝子(配列番号20に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖をコードする遺伝子)とを含むものや、
(3−4D)配列番号121に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖遺伝子(配列番号29に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖をコードする遺伝子)と、配列番号122に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖遺伝子(配列番号30に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖をコードする遺伝子)とを含むものや、
(4−4D)配列番号125に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖遺伝子(配列番号39に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖をコードする遺伝子)と、配列番号126に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖遺伝子(配列番号40に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖をコードする遺伝子)とを含むものや、
(5−4D)配列番号129に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖遺伝子(配列番号49に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖をコードする遺伝子)と、配列番号130に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖遺伝子(配列番号50に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖をコードする遺伝子)とを含むものや、
(6−4D)配列番号133に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖遺伝子(配列番号59に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖をコードする遺伝子)と、配列番号134に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖遺伝子(配列番号60に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖をコードする遺伝子)とを含むものや、
(7−4D)配列番号137に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖遺伝子(配列番号69に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖をコードする遺伝子)と、配列番号138に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖遺伝子(配列番号70に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖をコードする遺伝子)とを含むものや、
(8−4D)配列番号141に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖遺伝子(配列番号79に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖をコードする遺伝子)と、配列番号142に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖遺伝子(配列番号80に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖をコードする遺伝子)とを含むものや、
(9−4D)配列番号145に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖遺伝子(配列番号89に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖をコードする遺伝子)と、配列番号146に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖遺伝子(配列番号90に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖をコードする遺伝子)とを含むものや、
(10−4D)配列番号149に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖遺伝子(配列番号99に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖をコードする遺伝子)と、配列番号150に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖遺伝子(配列番号100に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖をコードする遺伝子)とを含むものや、
(11−4D)配列番号153に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるH鎖遺伝子(配列番号109に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖をコードする遺伝子)と、配列番号154に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列からなるL鎖遺伝子(配列番号110に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるL鎖をコードする遺伝子)とを含むものを具体的に挙げることができる。
(1−3D)上記(1−3)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものや、
(2−3D)上記(2−3)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものや、
(3−3D)上記(3−3)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものや、
(4−3D)上記(4−3)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものや、
(5−3D)上記(5−3)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものや、
(6−3D)上記(6−3)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものや、
(7−3D)上記(7−3)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものや、
(8−3D)上記(8−3)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものや、
(9−3D)上記(9−3)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものや、
(10−3D)上記(10−3)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものや、
(11−3D)上記(11−3)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものや、
(1−3’−1D)上記(1−3’−1)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものや、
(1−3’−2D)上記(1−3’−2)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものや、
(1−3’−3D)上記(1−3’−3)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものや、
(2−3’−1D)上記(2−3’−1)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものや、
(2−3’−2D)上記(2−3’−2)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものや、
(2−3’−3D)上記(2−3’−3)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものや、
(2−3’−4D)上記(2−3’−4)の一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は当該遺伝子の縮重コドン改変体を含むものを具体的に挙げることができる。
[概要]
抗ヒトGPC3抗体を調製するための免疫動物としてSKG/Jclマウスを使用し、免疫する抗原として全長ヒトGPC3タンパク質を使用した。SKG/Jclマウスは、関節リウマチを自然発症する自己免疫疾患モデルマウスであり、加齢や飼育環境によって、自己成分に対しても抗体産生応答することが知られている。一方、GPC3は、ヒト及びマウスの間で相同性が高く、通常は正常マウスに免疫しても抗体産生産生が起こりにくいため、SKG/Jclマウスを免疫動物として使用した。GPC3を免疫したマウスのB細胞由来cDNAからscFvファージライブラリーを作製し、ファージディスプレイ法を応用して、抗ヒトGPC3抗体を単離した。
[細胞培養]
ヒトGPC3発現細胞として、JHH7細胞株、HepG2細胞株、及びヒトGPC3全長を強制発現させたSK−Hep−1細胞株(以下、「GPC3発現細胞株」ということがある)を用いて、抗GPC3抗体のバイオパンニング及びスクリーニングを行った。JHH7細胞株は、肝細胞がん由来のGPC3発現細胞株であり、当該細胞中には、GPI(Glycosylphosphatidylinositol)アンカーを介して細胞膜に結合するGPC3(膜型GPC3)が恒常的に発現している。一方、HepG2細胞株は、JHH7細胞株と同様に、肝細胞がん由来のGPC3発現細胞株であるが、膜型GPC3よりも、細胞膜に結合していない分泌型GPC3の発現が優勢な細胞株である。また、Sk−Hep−1細胞株は、GPC3未発現の肝細胞がん由来の細胞株である。このため、強制発現により膜型の全長GPC3のみや、一部のエクソンが欠損した部分長の膜型GPC3を発現する細胞株を作製することができる。
6×HisタグがC末端に付加した組換えGPC3(R& D systems社製)をPBSにて0.1mg/mLに調整し、人工アジュバントTiterMaxGold(TiterMax社製)又はCFA(Freund'sAdjuvant Complete)(F5881、Sigma-Aldrich社製)と等量混合してエマルジョンを作製したものを初回の免疫抗原として用いた。2回目以降の免疫抗原は、組換えGPC3をPBSにて10〜100μg/mLで濃度調整したものを用いた。
配列番号157で示されるアミノ酸配列からなる全長ヒトGPC3をコードする遺伝子(配列番号160で示されるヌクレオチド配列からなる全長ヒトGPC3遺伝子)を、pcDNA3.1ベクター(ThermoFisher Scientific社製)に挿入してGPC3発現ベクターを作製した。GPC3発現ベクターを、SK−Hep−1細胞株に定法にしたがってトランスフェクションした後、G418(Roche diagnostics社製)を含むDMEM培養液中で培養することにより、GPC3全長が安定に発現するSK−Hep−1細胞株(GPC3発現細胞株)の樹立を行った。
SKG/jclマウス(日本クレア、8週齢雌、SPF)を免疫動物として、組換えGPC3を、フットパットに1週間毎に合計4回免疫した。免疫開始から5週目に採血し、定法にしたがって血清を調製し、抗体価の確認用検体とした。
免疫したマウスにおける抗GPC3抗体産生応答を確認するため、抗原固定化ELISAを用いて血清抗体価を測定した。0.5又は2μg/mLの組換えGPC3を、96ウェルマイクロプレート(Nunc社製)に50μL/ウェルずつ添加して室温で1時間、又は4℃で12時間インキュベートした。その後に、2% ブロックエース(DSファーマ社製)を、200μL/ウェルずつ添加してブロッキング処理を行った。GPC3免疫マウス由来の血清を、100倍〜16500倍まで0.1%ブロックエース/PBS溶液にて段階希釈し、各希釈血清サンプルを50μL/ウェルずつ添加して、2時間、室温にてインキュベートし、抗原抗体反応処理を行った。Tween20含有PBS(PBST)溶液でウェルを洗浄した後、2μg/mL ペルオキシダーゼがコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgG(JacksonImmunoResearch laboratories社製)を添加して2時間、室温にてインキュベートし、2次抗体反応処理を行った。PBST溶液で5回ウェルを洗浄後、水分を除去した後にTMB基質(Thermo Fisher Scientific社製)を50μL/ウェルずつ添加し、発色反応を行った。15分後に0.18M硫酸を50μL/ウェルずつ添加して、発色反応を停止させた後、450nmと540nmの吸光度をプレートリーダー(Bio-Rad社製)で測定した。450nmの測定値から、540nmの測定値を差し引いた補正値を用いて定量を行った。
免疫したマウスについて、さらに、膜型GPC3に対する抗血清の特異的結合性を確認するため、100倍希釈したマウス血清と、GPC3発現細胞株5×105個の細胞とを混合し、氷上で30分インキュベートした。FACSbuffer(1%BSA/PBS溶液)を加えて遠心処理し、上清を除いた後、2次抗体であるヤギ抗マウスIgG(H+L)Alexa Fluor488(ThermoFisherScientific社製)1μg/mLを100μL添加し、氷上で30分インキュベートして2次抗体反応処理を行った。Alexa Fluor488の検出及び蛍光レベルの測定は、フローサイトメーター(FACSCanto)(BD Biosciences社製)を用いて行った。
上記[フローサイトメーター]の項目に記載の方法により、膜型GPC3に結合する抗体が産生されたことが示されたマウスについて、B細胞由来の全RNAを定法に従って抽出し、全RNAをテンプレートとしたRT−PCRを定法に従って行い、cDNAを調製した。抗体H鎖及びL鎖の可変領域遺伝子をPCRにより増幅し、それらをフレキシブルリンカーで連結したscFvと、繊維状バクテリオファージM13のコートタンパク質g3p(cp3)との融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、pTZ19Rファージミドベクターのマルチクローニングサイトに挿入し、scFv発現ベクターを作製した。scFvライブラリーサイズは、大腸菌DH12S株(Invitrogen社製)の形質転換効率により算出した。形質転換したDH12S株にヘルパーファージであるM13KO7(Invitrogen社製)を感染させて、scFvを発現するファージライブラリーを作製した。
Dynabeads His-Tag Isolation & Pulldown磁性ビーズ(VERITAS社製)に、6×Hisタグを介して固定化した組換えGPC3と、GPC3発現細胞株とを組み合わせたものをベイトして用いたファージscFvのバイオパンニングは、文献「J Mol Biol. 1991 Dec5;222(3):581-97.」、「JMedVirol. 2007 Jun;79(6):852-62.」、「Proc Natl Acad SciU SA. 2008 May 20;105(20):7287-92.」、「JOURNAL OFVIROLOGY,Apr. 2004, p. 3325-3332 Vol. 78, No. 7」等に記載の方法にしたがって行った。5種類のシリーズ(A〜Eシリーズ)からなるバイオパンニング(図1参照)の各ラウンド(工程)において、ポリクローナルなファージ抗体の一部をサンプリングし、scFvの結合特異性を確認するために、抗原固定化ELISAを、上記[ELISAを用いた抗血清の血清抗体価]の項目に記載の方法(血清に代えてファージを含む大腸菌の培養上清を用いた方法)にしたがって行うとともに、Cell based-ELISAを、下記[Cell-based ELISAによるscFvのスクリーニング]の項目に記載の方法にしたがって行った。なお、かかるバイオパンニングの各工程において、既存の抗GPC3抗体であるGC33(中外製薬社製)とGC199(中外製薬社製)を、ベイトにあらかじめ結合させておくことにより、既存抗体が認識するGPC3のC末端エピトープと同じ部分に結合するscFvファージが選択されないように工夫した。すなわち、この競合法により、既存の抗GPC3抗体と異なるGPC3エピトープを認識する新規抗体を選択的にパンニングすることが可能となる。バイオパンニングにより濃縮したファージを大腸菌DH12Sにトランスフォームし、LBアガロース寒天培地に播種し、シングルコロニーを分離した。さらに小スケールLB液体培地中で大腸菌を培養した後、プラスミドを抽出及び精製した。精製したプラスミドのDNAシーケンスを行い、scFvのH鎖及びL鎖の可変領域のヌクレオチド配列を決定した。
GPC3発現細胞株(1サンプルあたり5×105個)に、scFvファージが分泌されている培養上清100μLを加え、混合した後、氷上で30分インキュベートした。FACS buffer(1%BSA/PBS溶液)を加えて遠心洗浄した後、2次抗体である抗マウス抗体-alexa488(Thermo Fisher Scientific社製)を1μg/mL加え、氷上で30分インキュベートした。その後、フローサイトメーター(FACSCanto、BD社製)にて細胞の蛍光染色を測定した。
1ウェルあたり2×105個のGPC3発現細胞が接着した96ウェルマイクロプレートのDMEM培養液を除いた後、scFvの、細胞やプレートへの非特異的な結合を防ぐ目的で、2%BSA−PBS溶液を加え、氷上で30分間インキュベートした。次に、scFvファージが分泌されている大腸菌の培養上清100μLを添加し、氷上で45分間インキュベートした後、scFvのC末端側に融合したcp3に対するウサギ抗cp3抗体(MBL社製)を5μg/mLにて1ウェルあたり100μL添加し、さらに氷上で45分間インキュベートした。抗cp3抗体検出用の3次抗体として5000倍希釈したHRP標識抗ウサギIgG抗体(MBL社製)を1ウェルあたり100μL添加し、氷上で45分間インキュベートした後、HRPの基質としてo−フェニレンジアミン(OPD)及び過酸化水素を添加して発色させた。492nmの吸光度からバックグラウンドとして620nmでの吸光度を差し引いた数値にて定量を行った。なお、scFvではなく、IgG型抗体に変換済みの抗体を用いてcell-based ELISAを実施したときは、上記条件のうち、抗cp3抗体及びHRP標識抗ウサギIgG抗体に代えて、当該IgG型抗体の検出用の2次抗体として2000倍希釈したHRP標識抗マウスIgG抗体(MBL社製)を用いた。
膜型GPC3に結合するファージscFvの可変領域遺伝子配列は、ユニバーサルプライマーであるT7プライマー(配列番号176に示されるヌクレオチド配列からなるプライマー)及びcp3Rプライマー(配列番号177に示されるヌクレオチド配列からなるプライマー)を、それぞれH鎖V領域(VH)解読用フォワードプライマー及びL鎖V領域(VL)解読用リバースプライマーとして用い、シーケンサー(CEQ2000XL、ベックマンコールター社製)にて解読した。
クローングしたscFvのエピトープを同定するために哺乳動物ディスプレイ法を応用した。ヒトGPC3のエクソン1〜7からなるGPC3N末断片(配列番号155に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド)をコードする遺伝子と、ヒトGPC3のエクソン8〜9からなるGPC3C末断片(配列番号156に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド)をコードする遺伝子とを、PCRにて増幅し、pDisplay発現ベクター(Thermo Fisher Scientific社製)のマルチクローニングサイト(MSC)に挿入した。なお、pDisplay発現ベクターは、目的タンパク質のC末端に、platelet-derivedgrowthfactor receptor(PDGFR)の膜貫通領域と融合させて任意の哺乳動物細胞の細胞表面にディスプレイ可能な発現ベクターである。また、pDisplay発現ベクターは、目的タンパク質のN末端に、HAタグが付加され、上記PDGFRのC末端には、mycタグが付加されるように構成されている。上記GPC3N末断片及びGPC3C末断片を発現するpDisplay発現ベクターを、SK−Hep−1細胞株や293T細胞株に遺伝子導入し、GPC3N末断片やGPC3C末断片が細胞表面に発現する細胞株(GPC3N末断片発現細胞株、及びGPC3C末断片発現細胞株)を単離し、scFvのエピトープマッピングに使用した。
GPC3N末断片発現細胞株、GPC3C末断片発現細胞株、及びGPC3発現細胞株(それぞれ、1サンプルあたり5×105個)と、scFvファージが分泌されている培養上清100μLとを混合し、氷上で30分インキュベートした。FACS buffer(1%BSA/PBS溶液)を加えて遠心洗浄した後、2次抗体である抗マウス抗体-alexa488(Thermo Fisher Scientific社製)を1μg/mL加え、氷上で30分インキュベートした。その後、フローサイトメーター(FACSCanto、BD社製)にて細胞の蛍光染色を測定した。
scFvからIgGへの変換を行うために、Mammalian PowerExpress system(Toyobo
社製)の発現ベクターを用いた。pEH1.1ベクターのMSCに、scFvのH鎖可変領域と、マウスIgG2aH鎖由来の定常領域との融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を挿入した(pEH1.1−H)。また、pELX2.2ベクターのMSCに、scFvのL鎖可変領域と、マウスIgG2aL鎖由来の定常領域との融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を挿入した(pEH2.2−L)。次に、pEH2.2−LからEF1αプロモーターからL鎖遺伝子までのポリヌクレオチド断片を、制限酵素(BglII及びSalI)で切り出し、制限酵素(BglII及びSalI)で処理したpEH1.1−Hにライゲーションし、抗体H鎖及びL鎖が共発現するベクターを構築した。
上記[組換えIgG発現ベクターの構築]に記載の方法にて作製した抗体H鎖及びL鎖の共発現ベクター32.6μgを、1.6mLのopti−MEM(Gibco社製)に希釈し、TransficientTransfectionReagent(MBL社製)65μLを、1.6mLのopti−MEMに希釈したものと混合し、室温で10分間インキュベートした。その後、10mLのDMEM培養液に懸濁したCHO−K1細胞(1×107個)と混合し、培養した。4時間後に無血清培地(Free Styleexpression CHO media[Gibco社製])を添加し、さらに4〜6日培養して組換え抗体を含む培養上清を回収した。
Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE healthcare社製)又はBipo Resin Protein L(Protein Express社製)カラムを、エンプティーカラム(Bio-Rad社製)に1mL bed volumeに充填した後、10倍bed volume量のPBSでカラム樹脂を洗浄した。0.22ミクロンフィルターろ過した培養上清をカラムに添加して、抗体をカラム内のProteinG又はProtein Lにトラップした後、カラムを10倍bedvolume量のPBSで洗浄して非特異的に吸着した夾雑物を洗浄した。100mMグリシン−HCl(pH2.7)溶液を用いて抗体を溶出し、溶出液は1MTris−HCl(pH8.5)にてpHを中和した。吸光度計nanoDrop(Thermofisher scientific社製)により280nmの吸光度を測定し、抗体濃度を算出した。競合抗体として用いたGC33抗体及びGC199抗体についても、同様の方法により発現ベクターをデザインし、作製した。
[免疫したマウスの抗血清評価]
組換えGPC3を4回免疫したSKG/jclマウスから採血し、血清中にGPC3に対する抗体が産生されているか確認したところ、組換えGPC3に対するELISと、GPC3発現細胞に対するFCMとの実験により、GPC3に対して結合性を有する抗体が検出された。このうち、抗体価の特に高かったマウス2匹(個体番号1413#2、1413#3)を抗体ライブラリー作製のソースとして用いた。
形質転換効率から計算して見積もられたscFvライブラリー数は、マウス1413#2で5.8×107、マウス1413#3で4.3×108であった。本実施例で作製した免疫グロブリンライブラリーは、抗原であるGPC3を免疫して目的抗原に対する抗体応答が認められたマウスから作製したライブラリーであるため、ライブラリーサイズが小さい場合でも目的の抗体遺伝子が含まれる可能性が高いことが特徴である。また、ランダムな合成抗体ライブラリーに比べ、生体内で正しい立体構造を形成する抗体が含まれていることも有利な特徴である。
ピックアップしたモノクローナルscFvのDNA配列解析を行い、重複を除いてクローン分類を行った。その結果、マウス1413#2ライブラリーのDシリーズから7種類、Eシリーズから5種類、マウス1413#3ライブラリーのDシリーズから3種類、及びEシリーズから9種類の候補クローンが同定された。それら候補クローンの重鎖及び軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を解析し、重複する同一クローンを除いた結果、マウス1413#2ライブラリー由来の9種類のscFv、及びマウス1413#3ライブラリー由来の9種類のscFvの合計18種類のscFvが同定された。
上記[モノクローナルscFvの配列解析によるクローンの分類]の項目に記載の方法にしたがって同定された18種類のscFvを用いて、3種類の細胞株(GPC3N末断片発現細胞株、GPC3C末断片発現細胞株、及びGPC3発現細胞株)の各種GPC3との結合を、FCMにて解析した。その結果、18種類のscFvクローンのうち、14種類(TF1413-02d028、02d030、02d039、02e004、02e014、02e030、02e040、03e001、03e004、03e005、03e015、03e019、03e027、及び03e034)については、全長のGPC3及びGPC3N末断片(配列番号155に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド)に結合するのに対して、GPC3C末断片(配列番号156に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド)には結合しなかった(図2参照)。一方、既存の抗GPC3抗体であるGC33(中外製薬社製)やGC199(中外製薬社製)は、全長のGPC3及びGPC3C末断片に結合するのに対して、GPC3N末断片には結合しなかった。
以上の結果から、既存の抗GPC3抗体(GC33及びGC199)のGPC3C末端側のエピトープとは異なり、GPC3N末側のエピトープを認識する上記14種類の新規scFvが同定された。
選択した上記11種類のscFvクローンについて、H鎖及びL鎖可変部領域を、マウスIgGの定常領域に結合し、組換えIgG発現用ベクターにて完全長の組換え抗体として発現させ、アフィニティー精製を行った。これらIgG抗体と、GPC3N末断片との結合能を、GPC3N末断片発現細胞株を用いて解析したところ、9種類のIgGクローン(TF1413-02d028、02d039、02e004、02e014、02e030、02e040、03e004、03e005、及び03e034)は、GPC3N末断片と結合性は維持されていたものの、残りの2種類のIgGクローン(TF1413-03e001、及び03e015)は、GPC3N末断片と結合性が消失した(図3参照)。また、上記9種類のIgGクローンは、GPC3C末断片には結合しなかった(図3参照)。
以上の結果は、11種類のscFvクローンのうち、9種類(TF1413-02d028、02d039、02e004、02e014、02e030、02e040、03e004、03e005、及び03e034)については、IgG型に変換可能なものであることを示している。表4には、上記11種類のIgGクローンのH鎖及びL鎖と、配列番号との対応を示す。
[EDTA又はトリプシン処理した細胞の調製]
GPC3を強制発現させたSK−Hep−1細胞株を、2つのT−75フラスコで培養した。各フラスコの培養上清を吸引し、PBS 3mLで洗浄後、各フラスコに、0.02%のEDTA/PBS溶液(以下、単に「EDTA」という)3mL、又は0.05%のトリプシン溶液(以下、単に「トリプシン」という)を加え、37℃でそれぞれ5分間(EDTA)又は2分30秒間(トリプシン)インキュベートし、細胞をフラスコから剥離した。その後、各フラスコに7mLのDMEM培養液を加え、ピペッティングした後、細胞懸濁液を50mLコニカルチューブに回収した。さらに10mLのDMEM培養液で各フラスコを洗浄後、回収した洗浄液も各細胞懸濁液の入った50mLコニカルチューブにそれぞれ回収して遠心(1,500rpm、4℃、4分間)した。コニカルチューブから上清を吸引後、ペレットに10mLのDMEM培養液を加え、EDTA又はトリプシンで剥離した細胞数をそれぞれ計測した。
上記のようにEDTAで剥離した1×106個の細胞を、50mLコニカルチューブに入れ、遠心(1,500rpm、4℃、4分間)して上清を吸引し、細胞塊(ペレット)を調製した。ペレットに5mLのコラゲナーゼP溶液を加え、30分間、37℃でインキュベートし、細胞懸濁液を調製後、30mLのDMEM培養液で洗浄しながら、100μmセルストレーナーに通した。細胞懸濁液を再度100μmセルストレーナーに通し、遠心(300g、4℃、10分間)して上清を吸引し、PBS 20mLを加えて洗浄後、遠心(300g、4℃、5分間)して上清を吸引した。5mLのDMEM培養液を加え懸濁した後、細胞数を計測し、2×105個/チューブの細胞を、FACS(EC800)解析した。FACS解析には、EDTA又はトリプシン処理をした細胞と同様に、3種類の抗体(APCで蛍光標識した抗マウスIgG抗体[5μg/チューブ:Biolejend社製]、GC33抗体[1.0μg/チューブ:MBLライフサイエンス社製]、及び上記scFvクローン[TF1413-02d028]抗体[1.0μg/チューブ])を使用した。結果を図4に示す。なお、図4において、横軸の右側にピークがある場合、GC33抗体又はscFvクローン[TF1413-02d028]抗体が、GPC3タンパク質に結合していることを示す。
図4に示すように、トリプシン処理やコラゲナーゼ処理したGPC3タンパク質に対する本発明の抗体(TF1413-02d028)の結合性は、著しく減少していた。これらの結果は、本発明の抗体は、GPC3タンパク質の立体構造を特異的に認識することを示しており、本発明の抗体は、生体における特異性が高いと考えられる。
[概要]
GPC3は、成人では胎盤以外には発現が認められない一方、肝細胞がん、メラノーマ、卵巣明細胞がん、肺扁平上皮がんなど様々ながん組織で発現している細胞表面分子であり、キメラ抗原受容体(Chimeric Antigen Receptor;CAR)を利用したCAR−T細胞療法の標的分子となりうる。そこで、実施例1で調製した11種類のscFvクローンを利用したGPC3CAR−T細胞を作製し、がん細胞傷害活性やインターフェロンγ(IFN−γ)産生能について解析した。
実施例1で調製した11種類のscFvクローン(TF1413-02d028、02d039、02e004、02e014、02e030、02e040、03e001、03e004、03e005、03e015、及び03e034)について、それぞれのVH及びVLのアミノ酸配列に基づき、VH−リンカー−VL配列のscFvをデザインした(表5参照)。リンカーは、ポリペプチド「GGGGS」を3回繰り返した15アミノ酸残基からなるものを使用した。また、VHのN末端には、配列番号188に示されるアミノ酸配列からなるヒトイムノグロブリンH鎖由来シグナルシーケンスを付加した。
上記11種類のscFvクローンに由来するGPC3 CARベクターを、各々GP2パッケージング細胞に一過性導入してレトロウイルスベクターを作製し、それらをT細胞に感染させて遺伝子導入し、GPC3CAR−T細胞を誘導した。遺伝子導入T細胞におけるGPC3CARを発現する細胞の割合は、5.3〜39.2%とばらつきがあった。そこで、当該割合が25%以上を示す5種類のscFvクローン(TF1413-02d028、TF1413-02d039、TF1413-02e014、TF1413-02e030、及びTF1413-03e005)に由来するGPC3 CAR−T細胞を用いて、以下の機能アッセイを実施した。
GPC3 CAR−T細胞のがん細胞に対する傷害活性を検討するため、GPC3 CAR−T細胞と、GPC3発現細胞株、すなわち、肝細胞がん由来の細胞株であるSk−HEP−1に、GPC3を発現させた細胞株(Sk−HEP−1GPC3細胞株)や、GPC3を発現しない細胞株(Sk−HEP−1mock細胞株)との共培養アッセイを実施した。GPC3 CAR−T細胞と、標的がん細胞(Sk−HEP−1GPC3細胞株、又はSk−HEP−1 mock細胞株)を、1:1(1×105/ウェルずつ)にて混合し、24ウェルプレートで培養した。48時間後に細胞を回収し、抗CD45抗体で染色し、CD45陽性細胞をGPC3CAR−T細胞として、CD45陰性細胞は、残存がん細胞[Sk−HEP−1GPC3細胞]としてFCMにて解析した。その結果、上記5種類のscFvクローンに由来するGPC3CAR−T細胞は、いずれもSk−HEP−1 GPC3細胞を、ほぼ完全に傷害させる一方、Sk−HEP−1mock細胞に対しては傷害活性を示さなかった(図5及び6参照)。GPC3CAR−T細胞に対するネガティブコントロールとして、ウイルスベクターを感染させていない細胞(遺伝子非導入細胞[図5及び6中の「Non infection」])を用いた場合には、Sk−HEP−1 GPC3細胞、及びSk−HEP−1 mock細胞のいずれにも傷害活性を示さなかった。
GPC3発現(陽性)がん細胞に対する傷害活性に加えて、GPC3 CAR−T細胞のIFN-γ産生能について解析した。GPC3CAR−T細胞と、標的がん細胞(Sk−HEP−1GPC3細胞株、又はSk−HEP−1 mock細胞株)を、1:1(1×105/ウェルずつ)にて混合し、24ウェルプレートで48時間培養し、培養上清中に産生されるIFN−γの濃度をELISAにて測定した。その結果、上記5種類のscFvクローンに由来するGPC3CAR−T細胞は、いずれもGPC3の発現依存的なIFN−γの産生能を示し、特にクローンTF1413-02d028に由来するGPC3CAR−T細胞は、最も高いIFN−γ産生能を示した(図7参照)。
実施例1で調製した2種類のscFvクローン(TF1413-02d028及び02d039)をベースに、scFvヒト化抗体をデザインした(表6参照)。リンカーは、ポリペプチド「GGGGS」を3回繰り返した15アミノ酸残基からなるものを使用した。また、VHのN末端には、配列番号188に示されるアミノ酸配列からなるヒトイムノグロブリンH鎖由来シグナルシーケンスを付加した。
Claims (17)
- 配列番号155に示されるアミノ酸配列からなるヒトGPC3(Glypican-3)由来のポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、
(1−1)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域(CDR)1、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号3に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号5に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号6に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(2−1)配列番号11に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号12に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号13に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号16に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(3−1)配列番号21に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号22に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号23に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号24に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号25に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号26に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(4−1)配列番号31に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号32に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号33に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号34に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号35に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号36に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(5−1)配列番号41に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号42に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号43に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号44に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号45に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号46に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(6−1)配列番号51に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号52に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号53に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号54に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号55に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号56に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(7−1)配列番号61に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号62に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号63に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号64に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号65に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号66に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(8−1)配列番号71に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号72に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号73に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号74に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号75に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号76に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(9−1)配列番号81に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号82に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号83に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号84に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号85に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号86に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;
(10−1)配列番号91に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号92に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号93に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号94に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号95に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号96に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含むか;或いは
(11−1)配列番号101に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号102に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号103に示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号104に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号105に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号106に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3とを含む;
前記抗体。 - (1−2)配列番号7に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号8に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(2−2)配列番号17に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号18に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(3−2)配列番号27に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号28に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(4−2)配列番号37に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号38に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(5−2)配列番号47に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号48に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(6−2)配列番号57に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号58に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(7−2)配列番号67に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号68に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(8−2)配列番号77に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号78に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(9−2)配列番号87に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号88に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;
(10−2)配列番号97に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号98に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むか;或いは
(11−2)配列番号107に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号108に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む;
請求項1に記載の抗体。 - 一本鎖抗体である請求項1又は2のいずれかに記載の抗体。
- 一本鎖抗体が、
(1−3)配列番号165に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(2−3)配列番号166に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(3−3)配列番号167に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(4−3)配列番号168に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(5−3)配列番号169に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(6−3)配列番号170に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(7−3)配列番号171に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(8−3)配列番号172に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(9−3)配列番号173に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(10−3)配列番号174に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;或いは
(11−3)配列番号175に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
請求項3に記載の抗体。 - 一本鎖抗体が、
(1−3’−1)配列番号178に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(1−3’−2)配列番号179に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(1−3’−3)配列番号180に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(2−3’−1)配列番号181に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(2−3’−2)配列番号182に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;
(2−3’−3)配列番号183に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;或いは
(2−3’−4)配列番号184に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
請求項3に記載の抗体。 - (1−4)配列番号9に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(2−4)配列番号19に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号20に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(3−4)配列番号29に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号30に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(4−4)配列番号39に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号40に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(5−4)配列番号49に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号50に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(6−4)配列番号59に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号60に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(7−4)配列番号69に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号70に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(8−4)配列番号79に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号80に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(9−4)配列番号89に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号90に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;
(10−4)配列番号99に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号100に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むか;或いは
(11−4)配列番号109に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号110に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む;
請求項1又は2に記載の抗体。 - 請求項3〜5のいずれかに記載の抗体と、該抗体のカルボキシル末端に融合した細胞膜貫通領域と、該細胞膜貫通領域のカルボキシル末端に融合した免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域とを含むキメラ抗原受容体(CAR)。
- 配列番号185〜187のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む請求項7に記載のCAR。
- 請求項7又は8に記載のCARを発現する免疫担当細胞。
- さらに、インターロイキン7(IL―7)、及びケモカインリガンド19(CCL19)を発現する請求項9に記載の免疫担当細胞。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の抗体をコードする抗体遺伝子、又は請求項7若しくは8に記載のCARをコードするCAR遺伝子。
- 請求項1〜4、及び6のいずれかに記載の抗体をコードする抗体遺伝子。
- プロモーターと、該プロモーターの下流に作動可能に連結されている請求項11に記載の抗体遺伝子、又は請求項11に記載のCARをコードするCAR遺伝子とを含むベクター。
- プロモーターと、該プロモーターの下流に作動可能に連結されている請求項12に記載の抗体遺伝子とを含むベクター。
- 請求項13又は14に記載のベクターが導入されている宿主細胞。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の抗体を用いて、GPC3(Glypican-3)を検出する工程を備えたGPC3の検出方法。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の抗体、又はその標識物を含む、GPC3(Glypican-3)の検出用キット。
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