WO2004022739A1 - Gpc3の血中可溶化ｎ端ペプチドまたはｃ端ペプチドに対する抗体 - Google Patents

Gpc3の血中可溶化ｎ端ペプチドまたはｃ端ペプチドに対する抗体 Download PDF

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Yutaka Midorikawa
Kiyotaka Nakano
Iwao Ohizumi
Yukio Ito
Susumu Tokita
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Definitions

  • the present invention relates to antibodies against the N-terminal peptide or C-terminal peptide of GPC3. Specifically, it relates to an antibody against the GPC3 N-terminal peptide of about 40 kDa found in the soluble GPC3 core protein. The present invention also relates to an antibody against a GPC3 C-terminal peptide of about 30 kDa found in a soluble GPC3 core protein.
  • the glypican family has been reported as a new family of heparan sulfate proteodaricans on the cell surface. To date, five glypicans have been reported to exist as members of the glypican family (glypican 1, glypican 2, glypican 3, dalipican 4, and dalibican 5). Members of this family have a uniform size (approximately 60 kDa) of core protein, share a specific, well-retained sequence of cysteines, and have glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchors. Is bound to the cell membrane.
  • GPI glycosylphosphatidylinositol
  • Glypican 3 (GPC3) is known to be closely involved in the control of cell division and its pattern in development. It is also known that the GPC3 gene is highly expressed in hepatocellular carcinoma cells, and that the GPC3 gene may be used as a hepatocellular carcinoma marker.
  • GPC3 is a membrane-bound protein, and the existence of a secreted PGC3 protein has not been reported, and use of the GPC3 protein itself as a cancer marker in blood has not been studied. Disclosure of the invention
  • GPC3 glypican 3
  • Glucosylcholine 3 was cleaved at the amino acid position 58 or 374, or in the vicinity thereof, and secreted soluble GPC3 into the blood of liver cancer patients.
  • GPC3 sandwich ELISA system clarified the presence of secreted GPC3 in the culture supernatant of human hepatoma cells HepG2, which highly expresses GPC3.
  • soluble GPC3 was successfully measured not only in HepG2-transplanted mouse plasma but also in serum from human liver cancer patients. Since GPC3 has a gene expression in liver cancer earlier than AFP, a liver cancer marker, the detection of GPC3 was considered to be useful as a cancer diagnosis.
  • GPC3 has been confirmed to be expressed not only in liver cancer cell lines but also in cancer cell lines such as lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, kidney cancer, and lymphoma, so it may be applicable to diagnosis other than liver cancer. .
  • the present invention is an antibody against the N-terminal peptide of GPC3.
  • the present invention is the above-mentioned antibody, wherein the N-terminal peptide of GPC3 is a solubilized peptide in blood.
  • N-terminal peptide of GPC3 is a peptide consisting of the first amino acid to the 374th amino acid or a peptide consisting of the first amino acid to the 358th amino acid of GPC3.
  • the present invention is the aforementioned antibody, which is a monoclonal antibody.
  • the present invention is the above antibody, which is fixed to an insoluble support.
  • the present invention is the above antibody, which is characterized by being labeled with a labeling substance. Furthermore, the present invention is an antibody against the C-terminal peptide of GPC3.
  • the above antibody wherein the C-terminal peptide of GPC3 is a peptide consisting of the 359th amino acid to the 580th amino acid of GPC3 or a peptide consisting of the 375th amino acid to the 580th amino acid.
  • the present invention is the above antibody, which is a monoclonal antibody.
  • the present invention is the above antibody, which is a chimeric antibody.
  • the present invention is the above antibody, which is a cytotoxic antibody.
  • the present invention is a cell disruption agent comprising the above antibody.
  • the present invention is the above-mentioned cell-disrupting agent, wherein the cell is a cancer cell.
  • the present invention is an anticancer agent comprising the above-mentioned antibody.
  • the present invention is a method for causing cell damage, which comprises contacting the above antibody with a cell.
  • the present invention is the above method, wherein the cell is a cancer cell.
  • the present invention will be described in detail.
  • the present invention is an antibody against solubilized GPC3 that can detect solubilized glypican 3 (GPC3) in a test sample.
  • GPC3 solubilized glypican 3
  • Detection includes quantitative or non-quantitative detection.
  • non-quantitative detection simply measures whether or not GPC3 protein is present, and whether or not GPC3 protein is present in a certain amount or more. Measurement, comparing the amount of GPC3 protein with another sample (for example, a control sample).
  • Quantitative detection includes measurement of GPC3 protein concentration, GPC3 3 Measurement of the amount of protein and the like.
  • test sample is not particularly limited as long as it is a sample that may contain the GPC3 protein, but is preferably a sample collected from a living body such as a mammal, and more preferably a sample collected from a human. is there.
  • test samples include, for example, blood, interstitial fluid, plasma, extravascular fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, pleural fluid, serum, lymph, saliva Examples thereof include liquid, urine, etc., and preferred are blood, serum, and plasma. Samples obtained from test samples, such as cultures of cells collected from the body of an organism, are also included in the test samples of the present invention.
  • the cancer diagnosed using the antibody against the N-terminal peptide of GPC3 of the present invention is not particularly limited, and specifically includes liver cancer, knee cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, leukemia, lymphoma, and the like. Preferred is liver cancer.
  • the antibody against the C-terminal peptide of GPC3 of the present invention has high cytotoxic activity, and thus can be used for destruction of cancer cells, that is, treatment of cancer.
  • the cancer that can be treated using the antibody is not particularly limited, and specific examples thereof include liver cancer, knee cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, leukemia, lymphoma, and the like. Is liver cancer.
  • GenBank: Z37987 can be used.
  • the anti-GPC3 N-terminal peptide antibody and the anti-GPC3 C-terminal peptide antibody used in the present invention may specifically bind to the N-terminal peptide of GPC3 protein and the C-terminal peptide of GPC3 protein, respectively.
  • Its origin, type (monoclonal, polyclonal) and its shape are irrelevant.
  • known antibodies such as a mouse antibody, a rat antibody, a human antibody, a chimeric antibody, and a humanized antibody can be used.
  • GPC3 When GPC3 is cleaved at the cleavage point, it becomes about 40 kDa peptide and about 30 kDa peptide, about 40 kDa on the N-terminal side and about 30 kDa on the C-terminal side.
  • the GPC3 cleavage point is cleaved at the amino acid position at position 358 or the amino acid position at position 374, or in the vicinity thereof.
  • the major breakpoint is thought to be the 358th amino acid site.
  • the N-terminal peptide of GPC3 is a GPC3 N-terminal peptide of about 40 kDa found in the soluble GPC3 core protein. From the above cleavage point, the N-terminal peptide preferably comprises an amino acid sequence from the first amino acid at Met to Lys at 374 amino acids, or an amino acid sequence from the first Met at amino acid to Arg at 358 amino acids. Peptide, and the major breakpoint is predicted to be amino acid position 358 And more preferably a peptide comprising an amino acid sequence from Met at amino acid 1 to Arg at amino acid 358. In the present invention, fragments of these N-terminal peptides may also be used. In the present specification, the N-terminal peptide is also referred to as an N-terminal fragment or an N-terminal peptide fragment.
  • the antibody against the N-terminal peptide of GPC3 of the present invention is an antibody that recognizes an epitope that is present in the N-terminal peptide of the GPC3 protein, and the site of the epitope that is recognized is not limited.
  • the GPC3 C-terminal peptide is a GPC3 C-terminal peptide of about 30 kDa found in the soluble GPC3 core protein. From the above cleavage point, the C-terminal peptide preferably comprises an amino acid sequence from Ser at amino acid 359 to His at amino acid 580, or an amino acid sequence from Val at 375 to His at amino acid number 580. Since the main cleavage point is predicted to be the 358th amino acid site, it is more preferable to use a peptide consisting of an amino acid sequence from Ser at amino acid 359 to His at amino acid 580. is there. In the present invention, fragments of these C-terminal peptides may also be used. In the present specification, the C-terminal peptide is also referred to as a C-terminal fragment or a C-terminal peptide fragment.
  • the antibody against the C-terminal peptide of GPC3 of the present invention is an antibody that recognizes an epitope that is present in the C-terminal peptide of the GPC3 protein, and the site of the epitope that is recognized is not limited.
  • the antibody may be a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • the anti-GPC3 N-terminal peptide antibody or anti-GPC3 C-terminal peptide antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a mammal-derived monoclonal antibody is particularly preferable.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced in hybridomas and those produced in hosts transformed with expression vectors containing the antibody gene by genetic engineering techniques.
  • the monoclonal antibody-producing hybridoma is basically constructed using a known technique. It can be manufactured as follows. That is, GPC3 is used as a sensitizing antigen, immunized according to a normal immunization method, and the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and are then screened by a normal screening method. It can be produced by screening monoclonal antibody-producing cells.
  • a monoclonal antibody may be prepared as follows.
  • GPC3 used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody was expressed by expressing the GPC3 (MXR7) gene Z amino acid sequence disclosed in Lü, H. et al., Gene 188 (1997), 151-156. obtain. That is, after inserting the gene sequence encoding GPC3 into a known expression vector system and transforming an appropriate host cell, the target human GPC3 protein is known from the host cell or culture supernatant. Purify by method.
  • natural GPC3 can be purified and used.
  • this purified GPC3 protein is used as a sensitizing antigen.
  • the entire GPC3 protein may be used as the sensitizing antigen.
  • antibodies to the N-terminal peptide and C-terminal peptide of the GPC3 protein are induced, and the GPC3 protein N
  • An antibody to the terminal peptide and an antibody to the C-terminal peptide may be selected separately.
  • a partial peptide at the N-terminal side of GPC3 or a partial peptide at the C-terminal side of GPC3 can be used as a sensitizing antigen.
  • the partial peptide can be obtained by chemical synthesis from the amino acid sequence of human GPC3, or can be obtained by incorporating a part of the GPC gene into an expression vector. Can also be obtained by decomposition.
  • the part of GPC3 used as a partial peptide is the N-terminal peptide of GPC3, and a smaller peptide fragment containing the epitope of this part can also be used.
  • the C-terminal peptide of GPC3 may be used as a partial peptide, or a smaller peptide fragment containing the peptide of this portion may be used.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion.
  • rodents Animals for example, mice, rats, hamsters, or egrets, sals, and the like are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted and suspended in an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buff fered Saline), physiological saline, or the like, and then mixed with an appropriate amount of a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if desired. After emulsification, the mammal is administered several times every 4 to 21 days.
  • a suitable carrier can be used during immunization of the sensitizing antigen.
  • a carrier protein such as albumin or keyhole linditol
  • a carrier protein such as mosinein.
  • immunocytes are collected from the mammal and subjected to cell fusion. Splenocytes.
  • Mammalian myeloma cells are used as the other parent cells fused with the immune cells.
  • the myeloma cells are known cell lines, for example, P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milste in, C. Eur. J. I. Translation 1. (1976) 6, 511-519), MPC-
  • Cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Koehler and Milstein et al. (KoMer. G. and Milstein, C.,
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ), and the like are used.
  • PEG polyethylene glycol
  • HVJ Sendai virus
  • an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used.
  • the ratio of the use of the immune cells and the myeloma cells can be arbitrarily set. For example, it is preferable that the number of immune cells be ⁇ to 10 times that of myeloma cells.
  • Examples of the culture solution used for the cell fusion include, for example,
  • RPMI 1640 culture solution MEM culture solution, and other normal culture solutions used for this type of cell culture can be used, and a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can also be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution, and a PEG solution (for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000), which has been heated to about 37 ° C. in advance, is usually 30 to 60% (w / v) is added and mixed to form the desired fused cells (hybridomas).
  • a PEG solution for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000
  • w / v average molecular weight of about 1000 to 6000
  • an appropriate culture solution is added successively, and the operation of removing the supernatant by centrifugation is repeated to remove cell fusion agents and the like that are unfavorable for the growth of the hybridoma.
  • the hybridoma thus obtained is selected by culturing it in a normal selective culture medium, for example, a HAT medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine).
  • a HAT medium a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine.
  • the culturing in the HAT culture medium is continued for a time (usually several days to several weeks) sufficient for cells other than the desired hybridoma (non-fused cells) to die.
  • the usual limiting dilution method is performed, and screening and single cloning of hybridomas producing the desired antibody are performed.
  • the screening and single cloning of the target antibody may be performed by a screening method based on a known antigen-antibody reaction.
  • the antigen is bound to a carrier such as beads made of polystyrene or a commercially available 96-well microplate, reacted with the culture supernatant of the hybridoma, and the carrier is washed, followed by enzyme-labeled secondary antibody.
  • the reaction can be performed to determine whether the culture supernatant contains the target antibody that reacts with the sensitizing antigen.
  • Hybridomas producing the desired antibody can be cloned by limiting dilution or the like.
  • the N-terminal peptide of GPC3 or a fragment thereof or the C-terminal peptide of GPC3 or a fragment thereof may be used as an antigen for screening.
  • human lymphocytes are sensitized to GPC3 in vitro, and the sensitized lymphocytes are derived from a human-derived myeloma capable of permanent division.
  • a desired human antibody having a binding activity to GPC3 N-terminal peptide or GPC3 C-terminal peptide can also be obtained (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • GPC3 which serves as an antigen, is administered to transgenic animals having the entire repertoire of human antibody genes to obtain anti-GPC3 N-terminal peptide antibody-producing cells or anti-GPC3 C-terminal peptide antibody-producing cells and immortalize them.
  • a human antibody against the GPC3 N-terminal peptide or a human antibody against the GPC3 C-terminal peptide may be obtained from the cells thus allowed to be obtained (International Patent Application Publication Nos. WO94 / 25585, WO93 / 12227, WO92 / 03918). Gazette, WO 94/02602).
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution, and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • a method for obtaining ascites is used.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating the antibody gene into an appropriate vector, introducing this into a host, and using a gene recombination technique is used.
  • Vandae, AM et al., Eur. J. Biocliem. (1990) 192, 767-775, 1990 See, for example, Vandae, AM et al., Eur. J. Biocliem. (1990) 192, 767-775, 1990).
  • variable (V) region of an anti-GPC3 N-terminal peptide antibody or an anti-GPC3 C-terminal peptide antibody is encoded.
  • mRNA can be isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), the AGPC method (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) to prepare total RNA.
  • Purification Kit Purification Kit
  • mRNA can be directly prepared using the QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • cDNA for the antibody V region is synthesized using reverse transcriptase.
  • cDNA synthesis is performed using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Seikagaku Corporation).
  • AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit manufactured by Seikagaku Corporation.
  • 5'-RACE method using 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and PGR (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) and the like.
  • the target DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated to vector DNA. Furthermore, a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector. Then, the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, the dideoxynucleotide chain termination method.
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or promoter.
  • an expression control region for example, an enhancer or promoter.
  • host cells are transformed with the expression vector to express the antibody.
  • Expression of the antibody gene may be performed by separately transforming the DNA encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) into an expression vector and co-transforming the host cell, or The host cell may be transformed by incorporating the DNA encoding the L chain into a single expression vector (see WO 94/11523).
  • an antibody gene is inserted into the middle of a gene encoding a protein (eg, goat j3 casein) that is specifically produced in milk. Prepare as a joint gene. A DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • a protein eg, goat j3 casein
  • artificially modified recombinant antibodies for example, chimeric antibodies (humanized antibodies, etc.) can be used. These modified antibodies can be produced using known methods.
  • the antibody of the present invention is used as a therapeutic antibody, it is preferable to use a recombinant antibody.
  • the chimeric antibody is obtained by linking the A encoding the antibody V region obtained as described above with the MA encoding the C region of the human antibody, incorporating this into an expression vector, introducing it into a host, and producing it. Can be Using this known method, chimeric antibodies useful in the present invention can be obtained.
  • Humanized antibodies are also referred to as reshaped human antibodies, which are used to replace the complementarity determining regions (CDRs) of non-human mammals, such as mouse antibodies, with those of human antibodies.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the gene has been transplanted into a cell, and its general genetic recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, W 96/02576).
  • a DNA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody to the framework region (FR) of a human antibody is designed to have a portion that overlaps with both CDR and FR terminal regions.
  • the oligonucleotides are synthesized by the PCR method (see the method described in W098 / 13388).
  • the framework region of the human antibody to be linked via CDR is selected so that the complementarity determining region forms a favorable antigen-binding site. If necessary, the amino acids of the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al. al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • C region of the chimeric antibody and the humanized antibody those of a human antibody are used.
  • CT1, Ca2, Ca3, and Cr4 are used for the H chain, and C ;, ( ⁇ is used for the L chain.
  • the C region of the human antibody may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • the chimeric antibody preferably contains a sequence of an antibody derived from a non-human mammal in the variable region and a sequence derived from a human antibody in the constant region.
  • a humanized antibody consists of a complementarity determining region of a non-human mammal-derived antibody, a framework region and a C region derived from a human antibody. Chimeric antibodies such as humanized antibodies have reduced antigenicity in the human body and are therefore useful as active ingredients of the therapeutic agent of the present invention.
  • the antibody used in the present invention is not limited to the whole antibody molecule, and may be an antibody fragment or a modified product thereof, and may be a bivalent antibody as long as it binds to the GPC3N-terminal peptide or GPC3C-terminal peptide.
  • multivalent antibodies include Fab, F (at) ') 2, Fv, Fab / c having one Fab and complete Fc, or Fv of H chain or L chain linked by an appropriate linker.
  • Single chain Fv (scFv) Single chain Fv (scFv).
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector.
  • scFv can be obtained by linking the H chain V region and L chain V region of the antibody.
  • the H chain V region and L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883).
  • the H chain V region and L chain V region in the scFv may be from any of the antibodies described herein.
  • the peptide linker connecting the V regions for example, any single-chain peptide consisting of 12 to 19 amino acid residues is used.
  • the DNA encoding the scFv may be any of the DNAs encoding the H chain or H chain V region and the DNA encoding the L chain or L chain V region of the antibody, or all or a desired amino acid sequence thereof. Is amplified by PCR using a pair of primers that define both ends of the DNA, and then the DNA encoding the peptide linker, and both ends are linked to the H and L chains, respectively. It is obtained by combining and amplifying primer pairs that are defined as follows.
  • DNAs encoding scFv are prepared, expression vectors containing them and a host transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method.
  • scFv can be obtained according to a conventional method.
  • antibody fragments can be obtained and expressed in the same manner as described above, and produced by a host.
  • the “antibody” in the present invention also includes fragments of these antibodies.
  • an anti-glypican antibody bound to various molecules such as a labeling substance, a toxin, and a radioactive substance can also be used.
  • the “antibody” in the present invention also includes these modified antibodies.
  • Such a modified antibody can be obtained by subjecting the obtained antibody to chemical modification. Methods for modifying antibodies have already been established in this field.
  • the antibody used in the present invention may be a bispecific antibody (Mspecific antibody).
  • the bispecific antibody may be a bispecific antibody having an antigen-binding site that recognizes a different epitope on the GPC3 N-terminal peptide or GPC3 C-terminal peptide, or one of the antigen-binding sites may be a GPC3 N-terminal peptide or GPC3 C
  • the terminal peptide may be recognized, and the other antigen binding site may recognize a labeling substance or the like.
  • Bispecific antibodies can be made by combining the HL pairs of two antibodies, or they can be different monoclonal antibodies.
  • a hybrid antibody producing a bispecific antibody can be produced by fusing a hybridoma producing a 1318 lonal antibody.
  • bispecific antibodies can be produced by genetic engineering techniques.
  • an antibody having a modified sugar chain can be used for the purpose of enhancing the cytotoxic activity and the like.
  • Techniques for modifying the sugar chain of an antibody are already known (for example, WO 00/61739, WO 02/31140, etc.).
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed and obtained by a known method.
  • expression can be achieved by operably linking a useful promoter commonly used, an antibody gene to be expressed, and a polyA signal downstream of the 3 ′ side thereof.
  • a useful promoter commonly used, an antibody gene to be expressed, and a polyA signal downstream of the 3 ′ side thereof.
  • the human cytomegalovirus early promoter Zenno, human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer can be used as a promoter.
  • virus promoters / enhancers such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, simian virus 40 (SV40), or Promoters derived from mammalian cells, such as the hylongation factor la (HEFla), can be mentioned.
  • SV40 Promoter Use the method of Muligan et al. (Nature (1979) 277, 108) when using the Z enhancer, and use the method of Mizusliima et al. (Nucleic Acids when using the HEFla promoter Z enhancer). Res. (1990) 18, 5322) allows easy gene expression.
  • a useful promoter commonly used, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed can be functionally linked to express the gene.
  • the promoter include the laccz promoter and the araB promoter.
  • the lacz promoter the method of Ward et al. (Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) is used, or when the araB promoter is used, Better et al. It can be expressed by the method (Science (1988) 240, 1041-1043).
  • the pelB signal sequence Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379
  • the antibody structure is appropriately refolded and used.
  • markers can include aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthinguanine phospholiposyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene and the like.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • Eukaryotic cells include, for example, established mammalian cell lines, insect cell lines, animal cells such as filamentous fungal cells and yeast cells, and prokaryotic cells include bacterial cells such as E. coli cells. No.
  • the antibodies used in the present invention are expressed in mammalian cells, such as CH0, COS, myeloma, BHK, Vero, HeLa cells.
  • the transformed host cells are cultured in vitro or in vivo to produce the desired antibody.
  • Culture of the host cell is performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM can be used as a culture solution, and a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • Antibodies expressed and produced as described above can be separated from cells and host animals and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be carried out using an affinity column.
  • affinity column For example, columns using a protein A column include Hyper D, P0R0S, Sepharose FF (Pharmacia) and the like.
  • separation and purification methods used for ordinary proteins may be used, and there is no limitation.
  • antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatographic columns other than the above-mentioned affinity columns, filters, ultrafiltration, salting-out, dialysis, etc. (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • GPC3 in a test sample can be detected using an antibody against the GPC3 N-terminal peptide of the present invention.
  • GPC3 detected using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be full-length GPC3 or a fragment thereof. When detecting a GPC3 fragment, it is preferable to detect an N-terminal peptide fragment.
  • the method for detecting the GPC3 protein contained in the test sample is not particularly limited, but is preferably detected by an immunological method using the anti-GPC3 N-terminal peptide antibody of the present invention.
  • Immunological methods include, for example, radioimmunoassay, enzymimmunoassay, fluorescent immunoassay, luminescent immunoassay, immunoprecipitation, immunoturbidimetry, estamplot, immunostaining, immunodiffusion, etc.
  • Enzymimnoassay is preferred, and particularly preferred is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (eg, sandwich ELISA). .
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the above-mentioned immunological methods such as ELISA can be performed by methods known to those skilled in the art.
  • an anti-GPC3 N-terminal peptide antibody is immobilized on a support, a test sample is added thereto, and the mixture is incubated.
  • a method of detecting the GPC3 protein in the test sample by washing after binding the GPC3 protein and detecting the GPC3 protein bound to the support via the anti-GPC3 N-terminal peptide antibody can be mentioned.
  • the support used in the present invention include insoluble polysaccharides such as agarose and cellulose; synthetic resins such as silicone resin, polystyrene resin, polyacrylamide resin, nylon resin, and polycarbonate resin; and insoluble resins such as glass. Support.
  • These supports can be used in the form of beads or plates.
  • a column filled with these Can can be used.
  • a multiwell plate eg, a 96-well multiwell plate
  • a biosensor chip can be used.
  • the binding between the anti-GPC3 N-terminal peptide antibody and the support can be performed by a commonly used method such as chemical bonding or physical adsorption. All of these supports can be used commercially.
  • the binding between the anti-GPC3 N-terminal peptide antibody and the GPC3 protein is usually performed in a buffer.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a Tris buffer, a citrate buffer, a borate buffer, a carbonate buffer, and the like are used.
  • Incubation is performed under conditions that are already commonly used, for example, incubation at 4 ° C to room temperature for 1 hour to 24 hours. Washing after the incubation may be any as long as it does not hinder the binding between the GPC3 protein and the anti-GPC3 antibody.
  • a buffer containing a surfactant such as Tween20 is used.
  • a control sample may be provided in addition to the test sample from which the GPC3 protein is to be detected.
  • Control samples include a negative control sample containing no GPC3 protein and a positive control sample containing GPC3 protein.
  • the GPC3 protein in the test sample was determined. It is possible to detect.
  • a series of control samples in which the concentration is changed stepwise is prepared, the detection results for each control sample are obtained as numerical values, a standard curve is created, and the test values are determined from the numerical values of the test samples based on the standard curve. It is also possible to quantitatively detect the GPC3 protein contained in the sample.
  • a preferred embodiment for detecting a GPC3 protein bound to a support via an anti-GPC3 N-terminal peptide antibody is a method using an anti-GPC3 N-terminal peptide antibody labeled with a labeling substance.
  • a test sample is brought into contact with an anti-GPC3 antibody immobilized on a support, washed, and then detected using a labeled antibody that specifically recognizes a GPC3 protein.
  • the antibody is labeled with an anti-GPC3 N-terminal peptide antibody immobilized on the support and a labeling substance.
  • the anti-GPC3 N-terminal peptide C antibody may recognize the same epitope of the GPC3 molecule, but preferably recognizes a different epitope.
  • Labeling of the anti-GPC3 N-terminal peptide antibody can be performed by a generally known method.
  • the labeling substance it is possible to use a labeling substance known to those skilled in the art, such as a fluorescent dye, an enzyme, a coenzyme, a chemiluminescent substance, and a radioactive substance.
  • radioisotope P "C , I25L3 ⁇ 4 , 131 1, etc.), fluorescein, rhodamine, dansylcotide lid, umbelliferone, luciferase, peroxidase, alkaline phosphatase, jS-galactosidase, j3-dalcosidase, ho thradish peroxidase, dalcoamylase,
  • lyotine is used as the c- labeled substance, such as lysozyme, saccharide oxidase, Mike's mouth peroxidase, and biotin, add a biotin-labeled antibody, and then add avidin to which an enzyme such as alkaline phosphatase is bound.
  • the binding of the labeled substance and the anti-GPC3 antibody can be used Dal glutaraldehyde method, maleimide blade method, pyridyl disulfate Huy blade method, periodic acid method, a known method such as.
  • a solution containing an anti-GPC3 N-terminal peptide antibody is added to a support such as a plate to fix the anti-GPC3 N-terminal peptide antibody. After washing the plate, block with, for example, BSA to prevent nonspecific binding of proteins. Wash again and add the test sample to the plate. After incubation, wash and add labeled anti-GPC3 antibody. After a suitable incubation, wash the plate and detect the remaining labeled anti-GPC3 antibody on the plate. Detection can be performed by a method known to those skilled in the art. For example, in the case of labeling with a radioactive substance, detection can be performed by liquid scintillation or the RIA method.
  • a substrate is added, and enzymatic change of the substrate, for example, color development can be detected by an absorbance meter.
  • the substrate include 2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), 1,2-phenylenediamine (ortho-phenylenediamine), 3,3 3, 5, 5'-tetramethylbenzidine (TME) and the like.
  • ABTS 2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt
  • TME 3,3 3, 5, 5'-tetramethylbenzidine
  • a fluorescent substance it can be detected by a fluorometer.
  • the t Specifically method can be exemplified using labeled anti GPC3N terminal peptide antibody and avidin Piochin, play a solution containing anti-GPC3 N-terminal peptide antibody In addition to a support such as a mouse, an anti-GPC3 N-terminal peptide antibody is immobilized. After washing the plate, block with, for example, BSA to prevent non-specific binding of proteins. Wash again and add the test sample to the plate. After incubation, wash and add a biotin-labeled anti-GPC3 antibody.
  • inventions for detecting a GPC3 protein of the present invention include a method using a primary antibody that specifically recognizes a GPC3 protein and a method using a secondary antibody that specifically recognizes the primary antibody.
  • a test sample is contacted with an anti-GPC3 N-terminal peptide antibody immobilized on a support, incubated, washed, and after washing, the bound GPC3 protein is converted to a primary anti-GPC3 antibody and the primary antibody.
  • the secondary antibody is preferably labeled with a labeling substance.
  • a solution containing an anti-GPC3N-terminal peptide antibody is added to a support such as a plate to immobilize the anti-GPC3N-terminal peptide antibody. After washing the plate, block with, for example, BSA to prevent nonspecific binding of proteins. Wash again and add the test sample to the plate. After incubation, wash and add primary anti-GPC3 antibody. After an appropriate incubation, the plate is washed, and then a secondary antibody that specifically recognizes the primary antibody is added. After appropriate incubation, wash and detect any remaining secondary antibody on the plate. Detection of the secondary antibody can be performed by the method described above.
  • Another embodiment of the method for detecting a GPC3 protein of the present invention includes a detection method utilizing an agglutination reaction.
  • GPC3 can be detected using a carrier sensitized with an anti-GPC3 N-terminal peptide antibody.
  • a carrier to sensitize antibodies Any carrier can be used as long as it is insoluble, does not cause nonspecific reaction, and is stable.
  • latex particles, bentonite, collodion, kaolin, fixed sheep erythrocytes and the like can be used, but it is preferable to use latex particles.
  • the latex particles for example, polystyrene latex particles, styrene-butadiene copolymer latex particles, Polyvinyl toluene latex particles, and the like can be used, and it is preferable to use polystyrene latex particles.
  • the higher the concentration of the GPC3 antibody in the sample the greater the degree of particle aggregation.
  • GPC3 can be detected by visual inspection of the aggregation. it can. Further, the turbidity due to aggregation can be detected by measuring with a spectrophotometer or the like.
  • Another embodiment of the method for detecting a GPC3 protein of the present invention includes, for example, a method using a biosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon.
  • Biosensors using surface plasmon resonance can observe protein-protein interactions in real time as surface plasmon resonance signals using a small amount of protein and without labeling.
  • a biosensor such as BIAcore (Pharmacia).
  • a test sample is brought into contact with a sensor chip on which an anti-GPC3 N-terminal peptide antibody is immobilized, and GPC3 protein binding to the anti-GPC3 N-terminal peptide antibody can be detected as a change in resonance signal.
  • the detection method of the present invention can be automated using various automatic inspection devices, and it is possible to inspect a large number of samples at once.
  • the present invention also aims at providing a diagnostic agent or kit for detecting GPC3 protein in a test sample for cancer diagnosis, wherein the diagnostic agent or kit comprises at least an anti-GPC3 N-terminal peptide.
  • the diagnostic agent or kit may contain a carrier for immobilizing the antibody, or the antibody may be bound to the carrier in advance.
  • the diagnostic agent or kit may contain a carrier to which an antibody is adsorbed.
  • the kit may be appropriately It may contain a locking solution, a reaction solution, a reaction stop solution, a reagent for treating a sample, and the like.
  • Antibodies binding activity of the antibodies used in the present invention (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), and ligand-drecept binding activity (Harada, A. et al. , International Immunology (1993) 5, 681-690) can be performed by a known method.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescence can be used to measure the antigen-binding activity of the anti-GPC3 C-terminal peptide antibody used in the present invention.
  • An antibody method can be used. For example, when using an enzyme immunoassay, a sample containing an anti-GPC3 C-terminal peptide antibody, such as a culture supernatant of an anti-GPC3 C-terminal peptide antibody-producing cell or purified, is added to a plate coated with a GPC3C-terminal peptide. Add antibody.
  • a secondary antibody labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase incubate the plate, wash the plate, add an enzyme substrate such as p-diethyl phenyl phosphate, and measure the absorbance to determine the antigen-binding activity. Can be evaluated.
  • an enzyme such as alkaline phosphatase
  • the neutralizing activity of the anti-GPC3 C-terminal peptide antibody is measured.
  • the antibodies used in the present invention preferably have ADCC activity or CDC activity as cytotoxic activity.
  • ADCC activity can be measured by mixing effector cells, target cells and an anti-GPC3 C-terminal peptide antibody, and examining the degree of ADCC.
  • mouse spleen cells, mononuclear cells isolated from human peripheral blood or bone marrow, etc. can be used as effector cells.
  • a human cell line such as a human hepatocyte cell line HuH-7 can be used.
  • the target cells were labeled in advance by 5 1 Cr, which the perform anti GPC3 C terminal peptide antibody was added Lee Nkyubesho down, then performs I Nkyubesho down added effector cells at a suitable ratio to the target cells.
  • ADCC activity can be measured by collecting the supernatant after incubation and counting the radioactivity in the supernatant.
  • the CDC activity is measured by mixing the labeled target cells described above and the anti-GPC3C-terminal peptide antibody, adding complement, incubating, and counting the radioactivity in the supernatant after culturing. be able to.
  • the Fc portion is necessary for the antibody to exert its cytotoxic activity, if the cell growth inhibitor of the present invention utilizes the cytotoxic activity of the antibody, the anti-GPC3 antibody used in the present invention may be used.
  • the C-terminal peptide antibody contains an Fc portion.
  • the anti-GPC3 C-terminal peptide antibody of the present invention can also be used for cell destruction, particularly for breaking down cancer cells. Further, the anti-GPC3 C-terminal peptide antibody of the present invention can be used as an anticancer agent.
  • the cancer to be treated or prevented by the antibody of the present invention is not particularly limited, and can be used for liver cancer, lung cancer, colorectal cancer, breast cancer, prostate cancer, kidney cancer, lymphoma, and the like, with liver cancer being preferred.
  • the cell disrupting agent or anticancer agent of the present invention is used for the treatment or improvement of diseases based on abnormal proliferation of cells, particularly cancer.
  • the effective dose is selected in the range of 0.001 mg / kg to 100 mg / kg body weight at a time. Alternatively, a dosage of 0.01 to 100000 mg / body per patient can be chosen. However, the dose of the therapeutic agent containing the anti-GPC3 C-terminal peptide antibody of the present invention is not limited to these doses. It can be administered before or after shearing.
  • a therapeutic agent containing the anti-GPC3 C-terminal peptide antibody of the present invention as an active ingredient can be formulated according to a conventional method (Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USA), which may contain pharmaceutically acceptable carriers and additives.
  • Such carriers and pharmaceutical excipients include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, carboxymethyl cell mouth, sodium, Sodium polyacrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, carboxymethyl starch sodium, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol , Diglycerin, glycerin, propylene glycol, vaseline, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin (HSA), mannitol, sorbitol, lactose, acceptable as a pharmaceutical additive Surfactants etc. Is mentioned.
  • a purified anti-GPC3 C-terminal peptide antibody of the present invention is dissolved in a solvent, for example, a physiological saline solution, a buffer solution, a glucose solution, or the like, and an anti-adsorption agent, for example, Tween80, Tween20, gelatin, human serum albumin and the like can be used.
  • a solvent for example, a physiological saline solution, a buffer solution, a glucose solution, or the like
  • an anti-adsorption agent for example, Tween80, Tween20, gelatin, human serum albumin and the like
  • it may be freeze-dried to give a dosage form that is dissolved and reconstituted before use.
  • FIG. 1 shows the results of GPC3 mRNA expression analysis using Gene Chi.
  • FIG. 1B shows the expression of alpha phytoprotein (AFP).
  • NL, CH, LC, WD, MD and PD on the horizontal axis indicate normal liver, liver inflammation site, cirrhosis site, well differentiated cancer, moderately differentiated cancer and poorly differentiated cancer, respectively.
  • FIG. 2 is a diagram showing CBB-stained images of purified heparan sulfate-added GPC3 and GPC3 core protein.
  • FIG. 3 is a diagram showing the expression of GPC3 gene in human liver cancer.
  • FIG. 4 shows the results of Western blotting of a soluble core protein performed using an anti-GPC3 antibody.
  • FIG. 5 is a diagram showing the principle of sandwich ELISA using an anti-GPC3 antibody.
  • FIG. 6 is a diagram showing a standard curve of a GPC3 sandwich ELISA using M6B1 and M18D4.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing the structure of GPC3.
  • FIG. 8 is a diagram showing combinations of anti-GPC3 antibodies in ELISA.
  • FIG. 9 is a diagram showing a standard curve of a GPC3 sandwich ELISA system using various combinations of anti-GPC3 antibodies.
  • FIG. 10 shows the results of measuring the ADCC activity of an anti-GPC3C-terminal peptide antibody.
  • FIG. 11 shows the results of measuring the CDC activity of an anti-GPC3 C-terminal peptide antibody.
  • pCXND2 and PCXND3 As expression vectors for soluble GPC3 and soluble GPC3 core proteins, pCXND2 and PCXND3 in which DHFR gene and neomycin resistance gene were incorporated into pCAGGS were used.
  • DXB11 cells purchased from ATCC were used, and 5% FBS (GIBC0 BRL CAT # 10099-141, L0T # A0275242) / Minifflum Essential Medium Alpha medium (MEM (+)) (GIBCO BRL CAT # 1257) was used for culture. / 1% Penicillin- Streptomycin (GIBCO BRL CAT * 15140-122) was used.
  • HepG2 was cultured from cells purchased from ATCC using 10% FBS / Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (GIBCO BRL CAT # 11995-065) / PS.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • the hybridoma was cultured with 10% FBS / thigh 1640/1 ⁇ HAT media supplement (SIGMA CA T # H-0262) /0.5 ⁇ BM-Condimed HI Hybridoma cloning supplement (Roche CA T # 1088947).
  • SIGMA CA T # H-0262 10% FBS / thigh 1640/1 ⁇ HAT media supplement
  • BM-Condimed HI Hybridoma cloning supplement (Roche CA T # 1088947).
  • GPC3 Cloning of full-length cDNA encoding human daribican 3 (hereinafter GPC3)
  • the 1st strand cDNA prepared from the colorectal cancer cell line Caco2 by a standard method was used as type II, and the Advantage2 kit (CL0NTECH Cat.No. 8430-
  • Amplification was performed by PCR reaction using 1).
  • sequence represented by SEQ ID NO: 3 represents the nucleotide sequence of the human GPC3 gene
  • sequence represented by SEQ ID NO: 4 represents the amino acid sequence of the human GPC3 protein.
  • Sequence number 1 GATATC-ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT
  • liver cancer well differentiated cancer :!
  • moderately differentiated cancer MD
  • poorly differentiated cancer PD
  • non-cancerous liver cancer hepatitis: CH
  • cirrhosis LC
  • 8 Example of normal liver mRNA expression analysis in NL (obtained informed consent, obtained at the University of Tokyo School of Medicine and Saitama Cancer Center) was performed using GeneChip TM UG-95A Target (Aiiymetryx). That is, after preparing total RNA from each tissue using IS0GEN (Nippon Gene), gene expression analysis was performed using 15 zg of total RNA according to Expression Analysis Technical Manual (Aiiymetryx). .
  • the human GPC3 gene (Probe Set ID: 39350-at) showed significantly higher mRNA expression levels in many cases than normal liver tissues, regardless of the degree of liver cancer differentiation. confirmed. Furthermore, compared to the mRNA expression of alpha phytoprotein (Probe Set ID: 40114_at), which is currently most frequently used as a diagnostic marker for liver cancer, high differentiation with little expression of alpha phetoprotein mRNA GPC3 also showed sufficient enhancement of mRNA expression in cancer, and it was clarified that the rate of enhanced mRNA expression was high in GPC3. Based on the above, GPC3 detection is considered to be useful as an early diagnostic method for liver cancer.
  • Example 2 Preparation of anti-GPC 3 antibody
  • a soluble GPC3 protein lacking a C-terminal hydrophobic region was prepared.
  • a soluble GPC3 cDNA expression plasmid DNA was constructed using plasmid DNA containing full-length human GPC3 cDNA provided by the UIST.
  • Downstream primer (5'-ATA GAA TTC CAC CAT designed to remove the C-terminal hydrophobic region (564-580 amino acids)
  • Soluble GPC3 highly expressing CH0 strain was obtained by selection with 500 / mL Genetic in. Using a 1700 cm 2 bottle bottle, a large amount of soluble GPC3 expressing CHO strain was cultured, and the culture supernatant was recovered and purified. The culture supernatant was charged into DEAE sepharose Fast Flow (Amersham CAT # 17-0709-01), washed, and then eluted with a buffer containing 500 mM NaCl. Next, affinity purification was performed using Ant i-Flag M2 agarose affinity gel (SIGMA CAT # A-2220). Elution was performed with 200 g / mL FLAG peptide.
  • cDNA in which Sers at positions 495 and 509 were replaced with Ala was prepared by assembly PCR.
  • primers were designed so that a His tag was added to the C-terminus, and the obtained cDNA was cloned into the PCXND3 vector.
  • the resulting expression plasmid DNA was introduced into the DXB11 strain, and selection with 500 g / mL Geneticin was performed to obtain a soluble GPC3 core protein highly expressing CH0 strain.
  • Mass culture was performed using a 1700 cm 2 roller bottle, and the culture supernatant was collected and purified.
  • the culture supernatant was charged into Q sepharose Fast Flow (Amersham CAT # 17-0510-01), washed, and eluted with phosphate buffer containing 500 mM NaCl.
  • affinity purification was carried out using Chelating Sepharose Fast Flow (Amersham CAT # 17-0575-01). Gradient elution was performed with 10-150 mM imidazole. Finally, the mixture was concentrated using Q Sepharose Fast Flow, and eluted with a phosphate buffer containing 500 mM NaCl.
  • GPC3 is a 69 kDa proteodarican having a heparan sulfate addition sequence at the C-terminal.
  • the smearing band was considered to be GPC3 modified with heparan sulfate.
  • the band of about 40 kDa originated from the N-terminal fragment of GPC3 as a result of the amino acid sequence. It was expected to have been severed.
  • a soluble GPC3 core protein in which Ser 495th and 509th of the heparan sulfate addition signal sequence were substituted with Ala was prepared.
  • a CH0 high expression strain was constructed, and affinity purification was performed on the culture supernatant using a His tag.
  • SDS polyacrylamide gel electrophoresis three bands of 70 kDa, 40 kDa, and 30 kDa were obtained. Amino acid sequencing revealed that the 30 kDa band was a C-terminal fragment of GPC3.
  • the C-terminal fragment started from serine at position 359 or valine at position 375 and was expected to have undergone some enzymatic cleavage.
  • the absence of this 30 kDa band in heparan sulfate-added GPC3 is probably due to the smear band due to the addition of heparan sulfate.
  • the fact that GPC3 undergoes enzymatic cleavage at specific amino acid sequences is new and has not been revealed for its biological significance.
  • GPC3 on the membrane would be cleaved even in liver cancer patients, and that GPC3 would be secreted into the blood as a soluble form.
  • GPC3 was found to have higher gene expression in patients with early-stage liver cancer than AFP, a hepatocellular carcinoma tumor marker (Fig. 1), and could be a new tumor marker with higher clinical utility than AFP.
  • a sandwich ELISA system was constructed as described in Example 2 and thereafter.
  • MRL / lpr Mice were used as immunized animals.
  • Five MRL / lpr mice (CRL) were immunized with soluble GPC3.
  • the immune protein was prepared to be 100 g / animal, and emulsified using FCA (complete Freund's adjuvant (H37 Ra), Difco (3113-60), Becton Dickinson (cat # 231131)) The compound was administered subcutaneously.
  • the FIA Fluorescence-activated adjuvant
  • Difco 0639-60
  • vector Dickinson vector Dickinson
  • the cells were diluted in PBS so as to be 50 / zg / animal and administered into the tail vein.
  • the murine myeloma cells P3U1 and mouse spleen cells were mixed, and PEG1500 (Roche's diagnostic, cat # 783 641) to perform cell fusion.
  • the seeds were inoculated on a 96-well culture plate, selected on a HAT medium from the next day, and then the culture supernatant was screened by ELISA. Positive clones were subjected to monocloning by the limiting dilution method, then expanded, and the culture supernatant was collected. Screening by ELISA was performed using the binding activity to the GPC3 core protein as an index, and six clones of anti-GPC3 antibodies having strong binding ability were obtained.
  • the antibody was purified using Hi Trap Protein in G HP (Amersham CAT # 17-0404-01). Charge the hybridoma culture supernatant directly onto the column, wash with binding buffer (20 mM sodium phosphate (PH 7.0)), and elute with elution buffer (0.1 M glycine-HC1 (pH 2.7)) did. Elution was performed in a tube to which a neutralization buffer (1M Tris-HCl (pH 9.0)) was added, and the mixture was immediately neutralized. After pooling the antibody fractions, dialysis was performed overnight with 0.05% Tween20 / PBS to replace the buffer. The purified antibody was stored in 4 after adding NaN 3 so that it became 0.02%. Analysis of anti-GPC3 antibody
  • Antibody concentrations were mouse IgG sandwich ELISA using goat anti-mouse IgG (gamma) (ZYMED CAT * 62-6600) and alkaline phosphatase-goat anti-mouse IgG (ga married a) (ZYMED CAT # 62-6622). Quantification was performed using a commercially available purified mouse IgGl antibody (ZYMED CAT # 02-6100) as a standard.
  • the anti-GPC3 antibody was isotyped using ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit II (PIERCE CAT # 37502), and the method was in accordance with the attached manual. All were of IgGl type as a result of isotyping.
  • Epitope classification of anti-GPC3 antibodies was performed by Western blotting using the GPC3 core protein.
  • 100 ng / lane soluble GPC3 core protein Charge 10% SDS-PAGE mini (TEFCO CAT # 01-075), and after electrophoresis (60V 30min, 120V 90min), Trans-Blot SD Semi-Dry Elec trophoretic transfer Cell (BIO-RAD) Then, it was transferred to Immobilon-P (Millipore CAT # IPVH R8510) (15 V, 60 min). The membrane was lightly washed with TBS-T (0.05 Tween20, TBS), and then shaken with TBS-T containing 5% skim milk for 1 hour (room temperature) or overnight (4 ° C).
  • each anti-GPC3 antibody diluted to 0.1 to 10 xg / mL with TBS-T containing 1% skim milk was added and shaken for 1 hour. Wash with TBS-T (10 minutes x 3 times), shake for 1 hour with HRP-anti-mouse IgG antibody (Amersham CAT # NA931) diluted to 1.1000 with TBS-T containing 1% skim milk, and wash with TBS-T. (10 minutes x 3 times).
  • the color was developed using ECL-Plus (Amersham RPN2132) and developed using Hyperfil ECL (Amersham CAT # RPN2103K).
  • Figure 4 shows the results of Western plot analysis.
  • Antibodies that react with the 40 kDa band have an epitope at the N-terminus, and antibodies that react with the 30 kDa band have an epitope at the C-terminus, and were classified.
  • M6B1, M18D4, M19B1 and M3C11, M13B3, and M3B8 were obtained as antibodies that recognize the KC terminal side as antibodies that recognize the N-terminal side.
  • the KD value of each antibody was 0.2 to 17.6 nM.
  • Subcutaneous subcutaneous human liver cancer of 6-week-old female SCID mice (Fox CHASE C. B-17 / Icr-scid Jc K Nippon Clea Co., Ltd.) and nude mice (BALB / cA Jc l-nu, Nippon Clea Co., Ltd.)
  • Three million HepG2 cells were transplanted. 53 days after the tumor was fully formed, whole blood was collected from the posterior vena cava of HepG2-transplanted SCID mice # 1, 3, and 4 in the presence of EDTA_2Na and abrotinin (diproneotube vacuum blood collection tube, NIPR0, NT-EA0205) Plasma was prepared and stored at -20 ° C until the day of measurement.
  • the HepG2-transplanted SCID mouse # 2 was subjected to whole blood collection from the posterior vena cava 62 days after HepG2 transplantation, and the HepG2-transplanted nude mice # 1 and 2 66 days after transplantation.
  • plasma was prepared from normal SCID mice of the same age by the same procedure.
  • Tsuchi ELISA To detect soluble GPC3 in blood, a sandwich ELISA system for GPC3 was constructed. M6B1 was used as the antibody coated on the 96-well plate, and M18D4 labeled with biotin was used as the antibody for detecting GPC3 bound to M6B1. For color development, DAK0 AMPAK was used to achieve high detection sensitivity.
  • FIG. 5 shows the principle of the sandwich ELISA of this embodiment.
  • FIG. 6 shows the standard curve of GPC3 sandwich ELISA using M6B1 and M18D4.
  • M6B1 and M18D4 the standard curve of GPC3 sandwich ELISA using M6B1 and M18D4.
  • soluble GPC3 was below the detection limit, whereas HepG2 culture supernatant and human hepatoma HepG2 cells were transplanted. Soluble GPC3 was detected in the serum of the mouse.
  • concentration of purified soluble GPC3 it was 1.2 ig / mL for HepG2 culture supernatant and 23-90 ng / niL for mouse serum (Table 1).
  • Antibodies that bind to human GPC3 Human GPC3-C-terminal recognition antibodies: M3C11, M1E07, human GPC
  • 3-N-terminal recognition antibody A hybrid that produces M19B11, M18D04, M5B09, M10D02) Amplification was performed by RT-PCR using Total RNA extracted from the yeast. Total RNA was extracted from hybrids of 1 ⁇ 10 7 cells using RNeasy Plant Mini Kits (manufactured by QIAGEN). Using 1 g of total RNA, SMART RACE cDNA Amplif ication
  • a synthetic oligonucleotide MHC-IgGl (SEQ ID NO: 7) complementary to the mouse IgGl constant region sequence or a synthetic oligonucleotide kappa (SEQ ID NO: complementary to the mouse / chain constant region base sequence) : 8) was used to amplify the 5 'terminal gene fragment.
  • the reverse transcription reaction was performed at 42 ° C for 1 hour and 30 minutes.
  • PCR solution 50 1 is 5
  • the H chain and L chain variable region sequences of each antibody were ligated to the human H chain and human L chain constant region sequences.
  • PCR was performed using a synthetic oligonucleotide complementary to the 5 'terminal base sequence of the H chain variable region of each antibody and having a Kozak sequence and a synthetic oligonucleotide complementary to the 3' terminal base sequence having an Nhel site.
  • the obtained PCR product was cloned into a pB-CH vector in which the human IgGl constant region was inserted into a pBluescript KS + vector (manufactured by Toyobo).
  • the Nhel site, mouse H chain variable region and human H chain (T l chain) constant region are linked.
  • the prepared ⁇ chain gene fragment was cloned into the expression vector PCXND3.
  • the flow of construction of this vector PCXND3 is described below.
  • the vector obtained by cloning the HFR gene expression site of pCHOI into the restriction enzyme Hindlll site of pCXN was named PCXND3.
  • the nucleotide sequence of the H chain of the anti-GPC3 mouse-human chimeric antibody (M3C1K M1E07, M19B1L M18D04) contained in this plasmid is represented by SEQ ID NO: 9, 11, 11, 13 and 15, respectively. , 12, 14, and 16.
  • PCR was performed using synthetic oligonucleotides complementary to the 5 'terminal nucleotide sequence of the L chain variable region of each antibody and having a Kozak sequence and synthetic oligonucleotides complementary to the 3' terminal nucleotide sequence having a BsiWI site.
  • the resulting PCR product was cloned into a pB-CL vector in which the human kappa chain constant region was inserted into a pBiuescript KS + vector (Toyobo).
  • the BsiWI site connects the human L chain variable region and the constant region.
  • the prepared L chain gene fragment was subjected to expression vector pUCAG cloning.
  • This vector pUCAG ligates a 2.6 kbp fragment obtained by digesting pCXN (Niwa et al., Gene 1991; 108: 193-200) with the restriction enzyme BamHI to the restriction enzyme BamHI site of the pUC19 vector (Toyobo). And the cloned vector.
  • the nucleotide sequence of the L chain of the anti-GPC3 mouse-human chimeric antibody (M3C11, M1E07, M19B1K M18D04) contained in this plasmid is represented by SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, and 23, respectively. Shown in 18, 20, 22, 24.
  • the HUC gene was used to digest the pUCAG vector into which the L chain gene fragment was inserted with the restriction enzyme Hindlll (Takara Shuzo). It was ligated to the restriction site Hindlll restriction site of the inserted PCXND3 and cloned.
  • This plasmid expresses the neomycin resistance gene, DHFR gene, and anti-GPC3 mouse-human chimeric antibody gene in animal cells.
  • Preparation of a cell line stably expressing using the CH0 cell was performed as follows.
  • the gene was transfected by electro-boration method using Gene Pulserll (manufactured by Bio Rad).
  • 25 g each anti-GPC3 mouse - a mixture of 0.75ml of human chimeric antibody expression vector and CH0 cells suspended in PBS (lxl O 7 cells Zm l) was cooled on ice for 10 min, 1.5 kV after transfer to a cuvette Pulsed at a capacity of 25 FD.
  • the electroporated cells were transferred to HT Suspension was suspended in 40 mL of a CHO-S-SFMII medium (manufactured by Invitrogen) containing a 1-fold concentration of supplement (manufactured by Invitrogen).
  • a 50-fold diluted solution was prepared in the same medium and dispensed to a 96-well culture plate at 100/1 / well.
  • C0 2 incubator 5% C0 2
  • Geneticin the (Invitrogen Corporation) was added to the culture for 2 weeks so that 0.5 mg / mL.
  • the amount of IgG in the culture supernatant of the wells in which colonies of transformed cells showing Geneticin resistance were observed was measured by the following concentration determination method. High-producing cell lines were sequentially expanded and cultured to obtain anti-GPC3 mouse-human chimeric antibody stably expressing cell lines, which were subjected to large-scale culture to obtain culture supernatants.
  • the IgG concentration in the culture supernatant was measured by performing a human IgG sandwich ELISA using Goat Ant i-Human IgG (manufactured by BI0S0RCE) and Goat Ant i-Human IgG Alkaline Phosphatase conjugated (manufactured by BI0S0RCE). It was quantified by comparison with purified human IgG (Cappel).
  • Notl-BamHI adaptor (Takara Shuzo) was cloned. This vector was named pCHOI. Furthermore, the DHFR gene expression site of PCH0I was removed, and HEF-VH-g
  • Preparation of a full-length human GPC3 stably expressing cell line was performed as follows. A 10 / Zg full-length human GPC3 gene expression vector and 60 / xL SuperFect (manufactured by QIAGEN) are mixed to form a complex, which is then added to the DX011 strain of CH0 cells for gene transfer. Was. After 24 hours at C0 2 incubator (5% C0 2), the final concentration of 0.5mg / mL Geneticin (Invitrogen Corp.) and 10% FBS (GIBCO BRL Co.) using ⁇ (GIBCO BRL Co.) containing , Started the selection.
  • Geneticin Invitrogen Corp.
  • FBS GIBCO BRL Co.
  • the resulting Geneticin-resistant colonies were collected, and cells were cloned by the limiting dilution method. Each cell clone was solubilized, and the expression of full-length human GPC3 was confirmed by Western blot using an anti-GPC3 antibody, and a stable expression cell line was obtained.
  • Peripheral blood obtained by adding heparin from a healthy subject was diluted 2-fold with PBS (-), and layered on Ficol® PaQU TM Plus (Amersham Pharmacia Biotech AB). After centrifugation (500Xg, 30 minutes, 20 ° C), the intermediate layer, which is a mononuclear cell fraction, was collected. After washing three times, the cells were suspended in 10% FBS / RPMI to obtain a human PBMC solution.
  • A is the average value of radioactivity (cpm) in each well
  • B is 100 L of 2% NP-40 aqueous solution (Nonidet P-40, Code No. 252-23, Nacalai Tesque, Inc.) in target cells, 10% FBS
  • C is the average value of the radioactivity (cpm) in the wells to which 150 L of 10% FBS / RPMI medium was added to the target cells.
  • the test was performed in triplicate, and the average value and standard error of ADCC activity (%) were calculated.
  • MgCl 2 -6H 20 (special grade, Junsei Chemical Co., Ltd.) was dissolved in 50 mL milli-Q water to 0.1 mol / L to prepare an MgCl 2 solution.
  • HAVB 0.5 g of glucose (D (+)-glucose, anhydrous glucose, special grade, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in 0.1 g and 0.5 g in Milli-Q water to make 500 mL. This was designated as HAVB. After filtration sterilization, Stored at a set temperature of 5 ° C.
  • the CH0 cells expressing GPC3 on the cell membrane prepared in Example 4 were cultured in ⁇ -MEM nucleic acid (+) medium (GIBC0) supplemented with 10% FBS and 0.5 mg / mL Geneticin (GIBCO).
  • the dishes were detached using a detachment buffer (Invitrogen Corp), dispensed into each well of a 96-well flat bottom plate (Falcon) at 1 ⁇ 10 4 cells / well, and cultured for 3 days. After the culture, 5.55 MB (i of Chromium-51 was added, and the cells were cultured at 37 ° C for 1 hour in a 5% carbon dioxide incubator. The cells were washed twice with HAVB, and 50 L of HAVB was added to obtain target cells.
  • GIBC0 ⁇ -MEM nucleic acid (+) medium
  • FBS 0.5 mg / mL Geneticin
  • Each chimeric antibody was diluted with HAVB to obtain an antibody solution of 40_ig / mL.
  • the antibody solution was added to the target cells in 50 portions, and left on ice for 15 minutes.
  • juvenile heron complement (Cedarlane) diluted with HAVB was added to each well at a final concentration of 30% in 100 portions (final antibody concentration: g / mL), and placed in a 5% CO 2 incubator. For 90 minutes. After centrifuging the plate, the supernatant was collected from each well by IOOL, and the radioactivity was measured with a gamma counter.
  • the specific chromium release rate was determined by the following equation.
  • A radioactivity (cpm) in each well; B: 100% 2% NP-40 aqueous solution (Nonidet P-40, Code No. 252-23, Nacalai Tesque, Inc.) and 50 zL HAVB added to target cells. Shows the average value of the radioactivity (cpm) in the column, and C shows the average value of the radioactivity (cpm) in the well where 150 L of HAVB was added to the target cells.
  • the test was performed by triplicate, and the average value and standard error of the CDC activity (%) were calculated. The results are shown in FIG.
  • the C-terminal recognition antibodies ch.M3Cll and cli.MlE07 showed CDC activity
  • the N-terminal recognition antibodies ch.M19B11, c.M18D04, Both ch. M5E09 and cli. M10D02 showed low CDC activity.
  • the above results indicate that the CDC activity of the chimeric antibody differs depending on the recognition site of the antibody.
  • the antibody recognizing the C-terminal side from the cleavage point showed CDC activity, the GPC3 C-terminal It was expected to be useful in clinical applications.
  • GPC3 highly expressed in liver cancer cells may be present in blood as a partially secreted form. Because GPC3 has gene expression in cancers earlier than AFP, which is a major hepatocellular carcinoma, GPC3 detection is considered to be useful as a cancer diagnosis. GPC3 has been confirmed to be expressed not only in liver cancer cell lines but also in cancer cell lines such as lung cancer, colorectal cancer, breast cancer, prostate cancer, knee cancer, and lymphoma. is there.
  • solubilized GPC3 in blood is approximately 40 kDa found in the soluble GPC3 core protein.
  • N-terminal fragment might be dominant. This suggests that an antibody recognizing the N-terminal fragment is useful as a diagnostic antibody.
  • a C-terminal fragment-recognizing antibody is used as a therapeutic antibody for liver cancer that has ADCC activity and CDC activity, it can efficiently reach liver cancer cells without being trapped by secreted GPC3 in the blood. It is useful as a cancer cell destruction agent and an anticancer agent.

Abstract

被検試料中の可溶化グリピカン３(GPC3)を検出することができる、可溶化GPC3に対する抗体である。被検試料中の可溶化GPC3をin vitro で検出することにより被検体が癌、特に肝臓癌に罹患しているか否かを診断することができる。さらに、細胞、特に癌細胞を破壊することができるGPCに対する抗体であり、該抗体を含む細胞破壊剤または抗癌剤である。

Description

. 明細書
GPC3の血中可溶化 N端ペプチドまたは C端ペプチドに対する抗体 技術分野
本発明は GPC3の N端ペプチドまたは C端べプチドに対する抗体に関する。 具体 的には、 可溶型 GPC3コアタンパク質に見られる約 40kDaの GPC3N端べプチドに対 する抗体に関する。 また、 可溶型 GPC3コアタンパク質に見られる約 30kDaの GPC3 C端べプチドに対する抗体に関する。 背景技術
細胞表面上に存在するへパラン硫酸プロテオダリカンの新しいファミリ一とし てグリピカンファミリーの存在が報告されている。 現在までのところ、 グリピ力 ンファミリーのメンバーとして、 5種類のグリピカン （グリピカン 1、 グリピ力 ン 2、 グリピカン 3、 ダリピカン 4およびダリビカン 5 ) が存在することが報告 されている。 このファミリ一のメンバ一は、 均一なサイズ （約 60kDa) のコア夕 ンパク質を持ち、 特異的でよく保持されたシスティンの配列を共有しており、 グ リコシルフォスファチジルイノシトール （GPI) アンカーにより細胞膜に結合し ている。
グリピカン 3 (GPC3)は、 発生における細胞分裂やそのパターンの制御に深く関 わっていることが知られている。 又、 GPC3遺伝子が肝癌細胞において高発現して おり、 GPC3遺伝子が肝細胞癌マーカ一として利用できる可能性があること知られ ている。
以前、 本発明者らは抗 GPC3抗体が ADCC活性及び CDC活性を有しており肝癌の治 療に有用であることを見出し、 特許出願を行った （特願 2001-189443) 。
しかしながら、 GPC3は膜結合タンパク質であり分泌型の PGC3タンパク質が存在 することは報告されておらず、 GPC3タンパク質自体を血中の癌マ一カーとして用 いることは検討されていなかった。 発明の開示
本発明者らは、 グリピカン 3 (GPC3) 力 58番目のアミノ酸部位、 若しくは 374 番目のアミノ酸部位、 若しくはそれらの近傍領域で切断される事実を見出し、 可 溶型 GPC3が肝癌患者の血中に分泌されるという仮説を立て、 GPC3サンドイッチ ELISA系を確立し、 GPC3高発現であるヒト肝癌細胞 HepG2の培養上清中に分泌型 GPC3の存在を明らかにした。 さらに、 HepG2を移植したマウス血漿中のみならず ヒト肝癌患者血清中の可溶型 GPC3測定にも成功した。 GPC3は肝癌マ一カーである AFPよりも早期の肝癌で遺伝子発現が認められるので、 GPC3の検出は癌の診断と して有用であると考えられた。 また可溶型 GPC3は C末端ペプチド断片側を認識す る抗 GPC3抗体では検出しにくい傾向にあることから、 分泌型 GPC3は N端ペプチド 断片優位と推定された。 従って、 分泌型 GPC3の検出には、 N端を認識する抗 GPC3 抗体を用いるのが好ましいと考え、 GPC 3の N端ペプチドを認識する抗体を開発す ることを試み、 本発明を完成させるに至った。 さらに、 GPC3の C末端に対する抗 体が高い細胞傷害活性を有することを見出し、 癌細胞の破壊、 すなわち癌の治療 には、 C末端を認識する抗 GPC3抗体を用いるのが好ましいと考え、 GPC3の C端べ プチドを認識する抗体を開発することを試み、 本発明を完成させるに至った。
GPC3は肝癌細胞株以外に、 肺癌、 大腸癌、 乳癌、 前立腺癌、 塍臓癌、 リンパ腫 などの癌細胞株においても発現が確認されているので、 肝癌以外の診断にも適用 できる可能性がある。
すなわち、 本発明は GPC3の N端ペプチドに対する抗体である。
また、 本発明は GPC3の N端ペプチドが血中可溶化ペプチドである前記抗体であ る。
さらに、 GPC3の N端べプチドが GPC3の第 1番目のアミノ酸から第 374番目のァ ミノ酸からなるペプチド又は第 1番目のアミノ酸から第 358番目のアミノ酸から なるペプチドである前記抗体である。
さらに、 本発明はモノクローナル抗体である前記抗体である。
さらに、 本発明は不溶性支持体に固定されていることを特徴とする前記抗体で ある。
さらに、 本発明は標識物質で標識されていることを特徴とする前記抗体である。 さらにまた、 本発明は GPC3の C端ペプチドに対する抗体である。
さらに、 GPC3の C端ペプチドが GPC3の第 359番目のアミノ酸から第 580番目のァ ミノ酸からなるペプチド又は第 375番目のアミノ酸から第 580番目のアミノ酸から なるペプチドである前記抗体である。
さらに、 本発明はモノクローナル抗体である上記抗体である。
さらに、 本発明はキメラ抗体である上記抗体である。
さらに、 本発明は細胞傷害抗体である上記抗体である。
さらに、 本発明は上記の抗体を含む細胞破壌剤である。
さらに、 本発明は細胞が癌細胞である上記細胞破壊剤である。
さらに、 本発明は上記の抗体を含む抗癌剤である。
さらに、 本発明は上記の抗体を細胞と接触させることを含む、 細胞傷害を引き 起こす方法である。
さらに、 本発明は細胞が癌細胞である上記方法である。 以下、 本発明について詳細に説明する。
本発明は、 被検試料中の可溶化グリピカン 3 (GPC3)を検出することができる可 溶化 GPC3に対する抗体である。 被検試料中の可溶化 GPC3を in vi t ro で検出する ことにより被検体が癌、 特に肝臓癌に罹患しているか否かを診断することができ る。
検出とは、 定量的又は非定量的な検出を含み、 例えば、 非定量的な検出として は、 単に GPC3タンパク質が存在するか否かの測定、 GPC3タンパク質が一定の量以 上存在するか否かの測定、 GPC3タンパク質の量を他の試料 （例えば、 コント口一 ル試料など） と比較する測定などを挙げることができ、 定量的な検出としては、 GP C 3タンパク質の濃度の測定、 GP C 3タンパク質の量の測定などを挙げることがで きる。
被検試料とは、 GPC3タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限 されないが、 哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、 さらに好ま しくはヒ卜から採取された試料である。 被検試料の具体的な例としては、 例えば、 血液、 間質液、 血漿、 血管外液、 脳脊髄液、 滑液、 胸膜液、 血清、 リンパ液、 唾 液、 尿などを挙げることができるが、 好ましいのは血液、 血清、 血漿である。 又， 生物の体から採取された細胞の培養液などの、 被検試料から得られる試料も本発 明の被検試料に含まれる。
本発明の GPC3の N端ペプチドに対する抗体を用いて診断される癌は、 特に制限 されず、 具体的には、 肝癌、 膝臓癌、 肺癌、 大腸癌、 乳癌、 前立腺癌、 白血病、 リンパ腫などを挙げることができるが、 好ましいのは肝癌である。
また、 本発明の GPC3の C端ペプチドに対する抗体は、 高い細胞傷害活性を有す るので、 癌細胞の破壊、 すなわち癌の治療に用いることができる。 該抗体を用い て治療し得る癌は、 特に制限されず、 具体的には、 肝癌、 膝臓癌、 肺癌、 大腸癌、 乳癌、 前立腺癌、 白血病、 リンパ腫などを挙げることができるが、 好ましいのは 肝癌である。
1 . 抗 GPC3N端べプチド抗体または抗 GPC3の C端べプチド抗体の作製
GPC3のアミノ酸配列及び塩基配列は Lage, H. et al. , Gene 188 ( 1997) ， 151-
156、 又は GenBank: Z37987を用いることができる。
本発明で用いられる抗 GPC3 N端べプチド抗体および抗 GPC3の C端ペプチド抗 体はそれぞれ GPC3夕ンパク質の N端ペプチドおよび GPC3夕ンパク質の C端べプチ ドに特異的に結合すればよく、 その由来、 種類 （モノクローナル、 ポリクローナ ル） および形状を問わない。 具体的には、 マウス抗体、 ラット抗体、 ヒト抗体、 キメラ抗体、 ヒト型化抗体などの公知の抗体を用いることができる。
GPC3が切断点において切断された場合、 約 40kDaのぺプチドと約 30kDaのべプチ ドとなり、 N端側が約 40kDa、 C端側が約 30kDaとなる。 GPC3切断点は 358番目のァ ミノ酸部位、 若しくは 374番目のアミノ酸部位、 若しくはそれらの近傍領域で切 断される。 主な切断点は 358番目のアミン酸部位であると考えられる。
GPC3の N端べプチドは、 可溶型 GPC3コアタンパク質に見られる約 40kDaの GPC3 N端ペプチドである。 上記切断点から、 N端ペプチドは好ましくはアミノ酸 1番 目の Metからアミノ酸 374番目の Lysまでのアミノ酸配列からなるぺプチドまたは アミノ酸 1番目の Metからアミノ酸 358番目の Argまでのアミノ酸配列からなるぺ プチドであり、 さらに、 主な切断点が 358番目のアミノ酸部位と予測されること から、 より好ましくはアミノ酸 1番目の Metからアミノ酸 358番目の Argまでのァ ミノ酸配列からなるペプチドである。 また本発明においては、 それら N端べプチ ドの断片でもよい。 本明細書において N端ペプチドは、 N端断片、 N端ペプチド 断片ともいう。
すなわち、 本発明の GPC3の N端ペプチドに対する抗体は、 GPC3タンパク質の N 端ペプチドに存在するェピトープを認識する抗体であり、 その認識するェピトー プの部位は限定されない。
GPC3の C端べプチドは、 可溶型 GPC3コアタンパク質に見られる約 30kDaの GPC3 C端ペプチドである。 上記切断点から、 C端ペプチドは好ましくはアミノ酸 359 番目の Serからアミノ酸 580番目の Hisまでのアミノ酸配列からなるぺプチドまた は 375番目の Valからアミノ酸番号 580番目の Hisまでのアミノ酸配列からなるぺプ チドであり、 さらに、 主な切断点が 358番目のアミン酸部位と予測されることか ら、 より好ましくはアミノ酸 359番目の Serからアミノ酸 580番目の Hisまでのアミ ノ酸配列からなるペプチドである。 また本発明においては、 それら C端ペプチド の断片でもよい。 本明細書において C端ペプチドは、 C端断片、 C端ペプチド断 片ともいう。
すなわち、 本発明の GPC3の C端ペプチドに対する抗体は、 GPC3タンパク質の C 端ペプチドに存在するェピトープを認識する抗体であり、 その認識するェピトー プの部位は限定されない。
抗体はポリク口一ナル抗体でもよいがモノクローナル抗体であることが好まし い。
さらに、 本発明で使用される抗 GPC3 N端ペプチド抗体または抗 GPC 3 C端べプチ ド抗体は、 公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として 得ることができる。 本発明で使用される抗 GPC3抗体として、 特に哺乳動物由来の モノクローナル抗体が好ましい。 哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、 ハイブ リドーマに産生されるもの、 および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発 現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
モノクローナル抗体産生ハイプリドーマは、 基本的には公知技術を使用し、 以 下のようにして作製できる。 すなわち、 GPC3を感作抗原として使用して、 これを 通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によ つて公知の親細胞と融合させ、 通常のスクリーニング法により、 モノクローナル な抗体産生細胞をスクリーニングすることによつて作製できる。
具体的には、 モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、 抗体取得の感作抗原として使用される GPC3を、 Lage， H. e t al.， Gene 188 ( 1997) ， 151-156に開示された GPC3 (MXR 7 ) 遺伝子 Zアミノ酸配列を発現 することによって得る。 すなわち、 GPC3をコードする遺伝子配列を公知の発現べ クタ一系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中または 培養上清中から目的のヒ卜 GPC3タンパク質を公知の方法で精製する。
また、 天然の GPC3を精製して用いることもできる。
次に、 この精製 GPC3タンパク質を感作抗原として用いる。 GPC3タンパク質の全 体を感作抗原として用いてもよく、 この場合は GPC3タンパク質の N端べプチドに 対する抗体も C端べプチドに対する抗体も誘起されるので、 その中から GPC3タン パク質の N端べプチドに対する抗体および C端べプチドに対する抗体を別々に選 択すればよい。 あるいは、 GPC3の N端側の部分ペプチドまたは GPC3の C端側の部 分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。 この際、 部分ペプチドはヒ ト GPC3のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、 GPC遺伝子の一 部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、 さらに天然の GPC3を夕ンパク質分 解酵素により分解することによつても得ることができる。 部分ペプチドとして用 いる GPC3の部分は GPC3の N端ペプチドであり、 この部分のェピトープを含むより 小さいペプチド断片を用いることもできる。 さらに、 部分ペプチドとして GPC3の C端ぺプチドを用いればよいし、 この部分のェピトープを含むより小さいぺプチ ド断片を用いることもできる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細 胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、 一般的に はげつ歯類の動物、 例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター、 あるいはゥサギ、 サ ル等が使用される。 感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われる。 例えば、 一般的方法として、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することによ り行われる。 具体的には、 感作抗原を PBS (Phosphate-Buf fered Sal ine) や生理 食塩水等で適当量に希釈、 懸濁したものに所望により通常のアジュバント、 例え ばフロイント完全アジュバントを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4〜21日毎に 数回投与する。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。 特 に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、 アルブミン、 キーホールリンぺッ卜へモシァニン等の担体タンパク質と結合させて免疫するこ とが望ましい。
このように哺乳動物を免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認 した後に、 哺乳動物から免疫細胞を採取し、 細胞融合に付されるが、 好ましい免 疫細胞としては、 特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、 哺乳動物のミエローマ細胞を 用いる。 このミエローマ細胞は、 公知の種々の細胞株、 例えば、 P3 ( P3x63Ag8. 653 ) ( J. Immnol. ( 1979 ) 123, 1548-1550 ) 、 P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology ( 1978) 81, 1-7) 、 NS-1 (Kohler. G. and Mi lste in, C. Eur. J. I讓翻 1. (1976) 6, 511-519) 、 MPC-
11 (Margul ies. D. H. et al. , Ce l l ( 1976) 8, 405-415) 、 SP2/0 (Sliulman, M. et al. , Nature ( 1978) 276, 269-270) 、 F0 (de St. Groth, S. F. e t al. , J.
Immunol. Me thods ( 1980) 35, 1-21) 、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. ( 1978) 148, 313-323) 、 R210 (Gal f re, G. et al. , Nature ( 1979) 277, 131-
133) 等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、 基本的には公知の方法、 たと えば、 ケーラーとミルスティンらの方法 （KoMer. G. and Mi l s te in, C. 、
Methods Enzymol. ( 1981) 73, 3-46) 等に準じて行うことができる。
より具体的には、 前記細胞融合は、 例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄 養培養液中で実施される。 融合促進剤としては、 例えばポリエチレングリコール (PEG) 、 センダイウィルス （HVJ) 等が使用され、 更に所望により融合効率を高 めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。 例えば、 ミエローマ細胞に対して免疫細胞を ί〜10倍とするのが好ましい。 前記細胞融合 に用いる培養液としては、 例えば、 前記ミエ口一マ細胞株の増殖に好適な
RPMI 1640培養液、 MEM培養液、 その他、 この種の細胞培養に用いられる通常の培 養液が使用可能であり、 さらに、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補液を併用するこ ともできる。
細胞融合は、 前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく 混合し、 予め 37°C程度に加温した PEG溶液 （例えば平均分子量 1000〜6000程度） を通常 30〜60 % (w/v) の濃度で添加し、 混合することによって目的とする融合 細胞 （ハイプリドーマ） を形成する。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠心 して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリド一マの生育に好ましく ない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイプリドーマは、 通常の選択培養液、 例えば HAT培 養液 （ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液） で培養す ることにより選択される。 上記 HAT培養液での培養は、 目的とするハイプリ ドー マ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十分な時間 （通常、 数日〜数週間） 継続する。 ついで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイ ブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、 公知の抗原抗体 反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。 例えば、 ポリスチレン等ででき たビーズや市販の 96ゥエルのマイクロ夕イタ一プレート等の担体に抗原を結合さ せ、 ハイプリドーマの培養上清と反応させ、 担体を洗浄した後に酵素標識第 2次 抗体等を反応させることにより、 培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗 体が含まれるかどうか決定できる。 目的とする抗体を産生するハイプリドーマを 限界希釈法等によりクロ—ニングすることができる。 この際、 抗原としては、 GPC3の N端べプチドもしくはその断片または GPC3の C端べプチドもしくはその断 片をスクリーニング用抗原として用いればよい。 また、 ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、 ヒト リンパ球を in vi t roで GPC3に感作し、 感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有 するミエローマ細胞と融合させ、 GPC3 N端ペプチドまたは GPC3 C端べプチドへの 結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる （特公平 1-59878号公報参 照） 。 さらに、 ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニッ ク動物に抗原となる GPC3を投与して抗 GPC3 N端ペプチド抗体産生細胞または抗 GPC3 C端ペプチド抗体産生細胞を取得し、 これを不死化させた細胞から GPC3N端 ぺプチドに対するヒト抗体または GPC3 C端べプチドに対するヒト抗体を取得して もよい （国際特許出願公開番号 W0 94/25585 号公報、 W 93/12227 号公報、 W0 92/03918 号公報、 W0 94/02602 号公報参照） 。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、 通常の培養液中で継代培養することが可能であり、 また、 液体窒素中で長期保存 することが可能である。
当該ハイプリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、 当該ハイプリド 一マを通常の方法に従い培養し、 その培養上清として得る方法、 あるいはハイブ リドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、 その腹水として得 る方法などが採用される。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
本発明では、 モノクローナル抗体として、 抗体遺伝子をハイプリ ドーマからク ローニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し、 遺伝子組換 え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる （例えば、 Vanda丽 e, A. M. e t al. , Eur. J. Biocliem. ( 1990) 192, 767-775, 1990参照） 。 具体的には、 抗 GPC3N端ペプチド抗体を産生するハイプリド一マまたは抗 GPC3 C 端ペプチド抗体を産生するハイブリ ドーマから、 抗 GPC3N端ペプチド抗体または 抗 GPC3 C端ペプチド抗体の可変 （V) 領域をコードする mRNAを単離する。 mRNAの 単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジン超遠心法 （Chi rgwin, J. M. et al. , Biochemi s t ry (1979) 18, 5294-5299) 、 AGPC法 (Chomczynski, P. et al.， Anal. Biochem. ( 1987 ) 162, 156-159 ) 等により行って全 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia製） 等を使用して目的の mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製） を用いることにより mRNAを 直接調製することもできる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDNAの合 成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学 工業社製） 等を用いて行う。 また、 cDNAの合成および増幅を行うには、 5'- Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製) および PGRを用いた 5' -RACE法 (Frohman, M. A. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002、 Belyavsky, A. et al.， Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) 等を使用することができる。 得られた PCR産物から目的とする DNA断片を精製し、 ベクター DNAと連結する。 さらに、 これより組換えベクターを作製し、 大腸菌等に導入してコロニーを選択 して所望の組換えベクターを調製する。 そして、 目的とする DNAの塩基配列を公 知の方法、 例えば、 ジデォキシヌクレオチドチェインターミネーシヨン法等によ り確認する。
目的とする抗 GPC3N端ペプチド抗体または抗 GPC3C端ペプチド抗体の V領域を コードする DNAを得たのち、 これを、 所望の抗体定常領域 （C領域） をコードする DNAを含有する発現ベクターへ組み込む。
本発明で使用される抗 GPC3N端ペプチド抗体または抗 GPC3C端ペプチド抗体を 製造するには、 抗体遺伝子を発現制御領域、 例えば、 ェンハンサー、 プロモー夕 一の制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。 次に、 この発現べクタ 一により、 宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、 抗体重鎖 （H鎖） または軽鎖 （L鎖） をコードする DNAを 別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、 ある いは H鎖および L鎖をコードする DNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞 を形質転換させてもよい （W0 94/11523 号公報参照） 。
また、 組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、 トランスジェニッ ク動物を使用することができる。 例えば、 抗体遺伝子を、 乳汁中に固有に産生さ れるタンパク質 （ャギ j3カゼインなど） をコードする遺伝子の途中に挿入して融 合遺伝子として調製する。 抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含む DNA断片を ャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ導入する。 胚を受容したャギから生まれ るトランスジエニックャギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る c また、 トランスジエニックャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加さ せるために、 適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよい （Ebert, K. M. et al. , Bio/Technology ( 1994) 12, 699-702) 。
本発明では、 上記抗体のほかに、 人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例え ば、 キメラ抗体 （ヒト化 （Humanized) 抗体、 など） を使用できる。 これらの改 変抗体は、 既知の方法を用いて製造することができる。 本発明の抗体を治療用抗 体として使用する場合には、 遺伝子組換え型抗体を用いることが好ましい。
キメラ抗体は、 前記のようにして得た抗体 V領域をコードする丽 Aをヒト抗体 C 領域をコードする MAと連結し、 これを発現べクタ一に組み込んで宿主に導入し 産生させることにより得られる。 この既知の方法を用いて、 本発明に有用なキメ ラ抗体を得ることができる。
ヒト化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒト抗体とも称され、 これは、 ヒト以外の 哺乳動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR; complementar i ty determining region) をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その 一般的な遺伝子組換え手法も知られている （欧州特許出願公開番号 EP 125023号 公報、 W 96/02576 号公報参照） 。
具体的には、 マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域 （f ramework region； FR) とを連結するように設計した DNA配列を、 CDR及び FR両方の末端領域 にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドを プライマーとして用いて PCR法により合成する（W098/13388号公報に記載の方法を
CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、 相補性決定領域が 良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒ卜抗体 の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、 抗体の可変領域にお けるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい （Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 53, 851-856) 。
キメラ抗体及びヒト化抗体の C領域には、 ヒト抗体のものが使用され、 例えば H鎖では、 C T 1、 Cァ 2、 Cァ 3、 C r 4を、 L鎖では C ；、 （ λを使用する ことができる。 また、 抗体またはその産生の安定性を改善するために、 ヒト抗体 C領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、 可変領域にヒト以外の哺乳動物由来抗体の配列を含み、 定常領 域にヒト抗体由来の配列を含むことが好ましい。
ヒト化抗体は、 ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、 ヒト抗体由 来のフレームワーク領域および C領域とからなる。 ヒト化抗体などのキメラ抗体 はヒト体内における抗原性が低下されているため、 本発明の治療剤の有効成分と して有用である。
本発明で使用される抗体は、 抗体の全体分子に限られず、 GPC3N端ペプチドま たは GPC3C端ペプチドに結合する限り、 抗体の断片又はその修飾物であってもよ く、 二価抗体も一価抗体も含まれる。 例えば、 抗体の断片としては、 Fab、 F (at)') 2、 Fv、 1個の Fabと完全な Fcを有する Fab/c、 または H鎖若しくは L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチェイン Fv (scFv) が挙げられる。 具 体的には、 抗体を酵素、 例えばパパイン、 ペプシンで処理し抗体断片を生成させ るか、 または、 これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、 これを発現べクタ 一に導入した後、 適当な宿主細胞で発現させる （例えば、 Co， M. S. et al.， J. Immunol. ( 1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology ( 1989) 178, 476-496, .Academic Press, Inc.、 Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology ( 1989) 178, 476-496, Academic Press, In 、 Lamoyi, E. , Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663、 Rousseaux, J. et al. , Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669, Bird, R. E. et al. , TIBTECH (1991) 9, 132 - 137参照） 。
scFvは、 抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域とを連結することにより得られる。 この scFvにおいて、 H鎖 V領域と L鎖 V領域は、 リンカ一、 好ましくはペプチドリンカ一 を介して連結される （Huston, J. S. et al.、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883) 。 scFvにおける H鎖 V領域および L鎖 V領域は、 本明細書 に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。 V領域を連結する ペプチドリンカ一としては、 例えばアミノ酸 12~ 19残基からなる任意の一本鎖べ プチドが用いられる。
scFvをコードする DNAは、 前記抗体の H鎖または H鎖 V領域をコードする DNA、 お よび L鎖または L鎖 V領域をコードする DNAのうち、 それらの配列のうちの全部又は 所望のアミノ酸配列をコードする DNA部分を銬型とし、 その両端を規定するブラ イマ一対を用いて PCR法により増幅し、 次いで、 さらにペプチドリンカ一部分を コードする DNA、 およびその両端が各々 H鎖、 L鎖と連結されるように規定するプ ライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、 一旦 scFvをコードする DNAが作製されると、 それらを含有する発現べク ター、 および該発現べクタ一により形質転換された宿主を常法に従って得ること ができ、 また、 その宿主を用いることにより、 常法に従って scFvを得ることがで きる。
これら抗体の断片は、 前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、 宿主に より産生させることができる。 本発明における 「抗体」 にはこれらの抗体の断片 も包含される。
抗体の修飾物として、 標識物質、 トキシン、 放射性物質等の各種分子と結合し た抗グリピカン抗体を使用することもできる。 本発明における 「抗体」 にはこれ らの抗体修飾物も包含される。 このような抗体修飾物は、 得られた抗体に化学的 な修飾を施すことによって得ることができる。 なお、 抗体の修飾方法はこの分野 においてすでに確立されている。
さ らに、 本発明で使用される抗体は、 二重特異性抗体 （Mspeci f ic ant ibody) であってもよい。 二重特異性抗体は GPC3N端ペプチドまたは GPC3 C端 ペプチド上の異なるェピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体 であってもよいし、 一方の抗原結合部位が GPC3N端ペプチドまたは GPC3 C端ぺプ チドを認識し、 他方の抗原結合部位が標識物質等を認識してもよい。 二重特異性 抗体は 2種類の抗体の HL対を結合させて作製することもできるし、 異なるモノク 1318 ローナル抗体を産生するハイプリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細 胞を作製し、 得ることもできる。 さらに、 遺伝子工学的手法により二重特異性抗 体を作製することも可能である。
さらに、 本発明においては、 細胞傷害活性を増強する目的などで、 糖鎖を改変 した抗体などを用いることも可能である。 抗体の糖鎖改変技術は既に知られてい る （例えば、 WO00/61739, WO 02/31140など) 。
前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ、 取得するこ とができる。 哺乳類細胞の場合、 常用される有用なプロモーター、 発現させる抗 体遺伝子、 その 3'側下流にポリ Aシグナルを機能的に結合させて発現させること ができる。 例えばプロモー夕一 Zェンハンサ一としては、 ヒ卜サイトメガロウイ ルス前期プロモーター Zェンノ、ンサ一 ( human cytomegalovirus immed i ate early promoter/enhancer) を拳レ了ることができる。
また、 その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモータ一 Zェン ハンサ一として、 レトロウイルス、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 シミ アンウィルス 40 (SV40) 等のウィルスプロモーター/ェンハンサ一、 あるいはヒ トェロンゲーシヨンファクター la (HEFla) などの哺乳類細胞由来のプロモー夕 一 Zェンハンサ一等が挙げられる。
SV40プロモ一ター Zェンハンサーを使用する場合は Mul l iganらの方法 （Nature ( 1979) 277, 108) により、 また、 HEFlaプロモーター Zェンハンサ一を使用す る場合は Mizusliimaらの方法 (Nuc leic Ac ids Res. ( 1990) 18, 5322) により、 容易に遺伝子発現を行うことができる。
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモーター、 抗体分泌のためのシグナル配 列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させること ができる。 プロモーターとしては、 例えば l aczプロモーター、 araBプロモーター を挙げることができる。 laczプロモーターを使用する場合は Wardらの方法 (Nature ( 1098) 341, 544-546 ； FASEB J. ( 1992) 6， 2422-2427) により、 あ るいは araBプロモーターを使用する場合は Bet terらの方法 （Sc ience (1988) 240, 1041-1043) により発現することができる。 抗体分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のペリブラズムに産生させる 場合、 pelBシグナル配列 （Le i， S. P. e t al J. Bacter iol. ( 1987 ) 169, 4379) を使用すればよい。 そして、 ペリブラズムに産生された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切に組み直して （refold) 使用する。
複製起源としては、 SV40、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 ゥシパピ口 一マウィルス （BPV) 等の由来のものを用いることができ、 さらに、 宿主細胞系 で遺伝子コピー数増幅のため、 発現ベクターは、 選択マ一カーとしてアミノグリ コシドトランスフェラーゼ （APH) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大 腸菌キサンチングァニンホスホリポシルトランスフェラーゼ （Ecogpt) 遺伝子、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （dhf r) 遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の発現系、 例えば真核細胞又は 原核細胞系を使用することができる。 真核細胞としては、 例えば樹立された晡乳 類細胞系、 昆虫細胞系、 真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げら れ、 原核細胞としては、 例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、 本発明で使用される抗体は、 哺乳類細胞、 例えば CH0、 COS, ミエ ローマ、 BHK、 Vero、 HeLa細胞中で発現される。
次に、 形質転換された宿主細胞を in vi t roまたは in vivoで培養して目的とす る抗体を産生させる。 宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液 として、 DMEM、 MEM、 RPMI 1640, IMDMを使用することができ、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補液を併用することもできる。
前記のように発現、 産生された抗体は、 細胞、 宿主動物から分離し均一にまで 精製することができる。 本発明で使用される抗体の分離、 精製はァフィ二ティー カラムを用いて行うことができる。 例えば、 プロテイン Aカラムを用いたカラム として、 Hyper D、 P0R0S、 Sepharose F. F. (Pharmac ia製） 等が挙げられる。 そ の他、 通常のタンパク質で使用されている分離、 精製方法を使用すればよく、 何 ら限定されるものではない。 例えば、 上記ァフィ二ティーカラム以外のクロマト グラフィーカラム、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組み合わ せることにより、 抗体を分離、 精製することができる （Ant ibod ies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 。
2 . GPC3の検出
本発明の GPC3N端側ペプチドに対する抗体を用いて、 被検試料中の GPC3を検出 することができる。
本発明の抗体を用いて検出する GPC3は、 特に限定されず、 全長 GPC3でも、 その 断片でもよい。 GPC3断片を検出する場合には、 N端ペプチド断片を検出すること が好ましい。
被検試料に含まれる GPC3タンパク質の検出方法は特に限定されないが、 本発明 の抗 GPC3N端ペプチド抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。 免疫学的方法としては、 例えば、 ラジオィムノアツセィ、 ェンザィムィムノアツ セィ、 蛍光ィムノアツセィ、 発光ィムノアツセィ、 免疫沈降法、 免疫比濁法、 ゥ エスタンプロット、 免疫染色、 免疫拡散法などを挙げることができるが、 好まし くはェンザィムィムノアッセィであり、 特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量 法（enzyme- l inked immunosorbent assay： ELISA) (例えは、 sandwich EL ISA) で ある。 ELISAなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うこと が可能である。
抗 GPC3N端ペプチド抗体を用いた一般的な検出方法としては、 例えば、 抗 GPC3 N端ペプチド抗体を支持体に固定し、 ここに被検試料を加え、 インキュベートを 行い抗 GPC3 N端ぺプチド抗体と GPC3タンパク質を結合させた後に洗浄して、 抗 GPC3N端ペプチド抗体を介して支持体に結合した GPC3タンパク質を検出すること により、 被検試料中の GPC3タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。 本発明において用いられる支持体としては、 例えば、 ァガロース、 セルロース などの不溶性の多糖類、 シリコン樹脂、 ポリスチレン樹脂、 ポリアクリルアミド 樹脂、 ナイロン樹脂、 ポリカーポネイト樹脂などの合成樹脂や、 ガラスなどの不 溶性の支持体を挙げることができる。 これらの支持体は、 ビーズやプレートの形 状で用いることが可能である。 ビーズの場合、 これらが充填されたカラムなどを 用いることができる。 プレートの場合、 マルチウエルプレート （96穴マルチゥェ ルプレート等） 、 やバイオセンサ一チップなどを用いることができる。 抗 GPC3N 端ペプチド抗体と支持体との結合は、 化学結合や物理的な吸着などの通常用いら れる方法により結合することができる。 これらの支持体はすべて市販のものを用 いることができる。
抗 GPC3N端ペプチド抗体と GPC3タンパク質との結合は、 通常、 緩衝液中で行わ れる。 緩衝液としては、 例えば、 リン酸緩衝液、 Tris緩衝液、 クェン酸緩衝液、 ホウ酸塩緩衝液、 炭酸塩緩衝液、 などが使用される。 また、 インキュベーション の条件としては、 すでによく用いられている条件、 例えば、 4 °C〜室温にて 1時 間〜 24時間のインキュベーションが行われる。 インキュベート後の洗浄は、 GPC3 タンパク質と抗 GPC3抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、 例えば、 Tween20等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
本発明の GPC3タンパク質検出方法においては、 GPC3タンパク質を検出したい被 検試料の他に、 コントロール試料を設置してもよい。 コントロール試料としては、 GPC3タンパク質を含まない陰性コントロール試料や GPC3タンパク質を含む陽性コ ントロール試料などがある。 この場合、 GPC3タンパク質を含まない陰性コント口 ール試料で得られた結果、 GPC3タンパク質を含む陽性コントロ一ル試料で得られ た結果と比較することにより、 被検試料中の GPC3夕ンパク質を検出することが可 能である。 また、 濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、 各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、 標準曲線を作成し、 被 検試料の数値から標準曲線に基づいて、 被検試料に含まれる GPC3タンパク質を定 量的に検出することも可能である。
抗 GPC3N端ペプチド抗体を介して支持体に結合した GPC3タンパク質の検出の好 ましい態様として、 標識物質で標識された抗 GPC3 N端ペプチド抗体を用いる方 法を挙げることができる。
例えば、 支持体に固定された抗 GPC3抗体に被検試料を接触させ、 洗浄後に、 GPC3タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
この際、 支持体に固定される抗 GPC3N端ペプチド抗体と標識物質で標識される 抗 GPC3N端べプチド C抗体は GPC3分子の同じェピトープを認識してもよいが、 異 なるェピトープを認識することが好ましい。
抗 GPC3N端ペプチド抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能 である。 標識物質としては、 蛍光色素、 酵素、 補酵素、 化学発光物質、 放射性物 質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、 具体的な例として は、 ラジオアイソトープ P、 "C、 I25L ¾、 1311など）、 フルォレセイン、 ローダ ミン、 ダンシルク口リ ド、 ゥンベリフエロン、 ルシフェラ一ゼ、 ペルォキシダー ゼ、 アルカリホスファターゼ、 jS -ガラクトシダーゼ、 j3 -ダルコシダーゼ、 ホー スラディッシュパーォキシダーゼ、 ダルコアミラーゼ、 リゾチーム、 サッカリド ォキシダーゼ、 マイク口ペルォキシダーゼ、 ピオチンなどを挙げることができる c 標識物質としてピオチンを用いる場合には、 ピオチン標識抗体を添加後に、 アル カリホスファ夕ーゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好 ましい。 標識物質と抗 GPC3抗体との結合には、 ダルタルアルデヒド法、 マレイミ ド法、 ピリジルジスルフイ ド法、 過ヨウ素酸法、 などの公知の方法を用いること ができる。
具体的には、 抗 GPC3N端ペプチド抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加 え、 抗 GPC3N端ペプチド抗体を固定する。 プレートを洗浄後、 タンパク質の非特 異的な結合を防ぐため、 例えば BSAなどでブロッキングする。 再び洗浄し、 被検 試料をプレートに加える。 インキュベートの後、 洗浄し、 標識抗 GPC3抗体を加え る。 適度なインキュベーションの後、 プレートを洗浄し、 プレートに残った標識 抗 GPC3抗体を検出する。 検出は当業者に公知の方法により行うことができ、 例え ば、 放射性物質による標識の場合には液体シンチレーシヨンや RIA法により検出 することができる。 酵素による標識の場合には基質を加え、 基質の酵素的変化、 例えば発色を吸光度計により検出することができる。 基質の具体的な例としては、 2， 2 -アジノビス （3-ェチルベンゾチアゾリン- 6 -スルホン酸） ジアンモニゥム塩 (ABTS) 、 1， 2-フエ二レンジァミン （オルソ-フエ二レンジァミン） 、 3, 3，， 5， 5'- テトラメチルベンジジン (TME) などを挙げることができる。 蛍光物質の場合に は蛍光光度計により検出することができる。 本発明の GPC3タンパク質検出方法の特に好ましい態様として、 ピオチンで標識 された抗 GPC3N端ペプチド抗体及びアビジンを用いる方法を挙げることができる t 具体的には、 抗 GPC3 N端ペプチド抗体を含む溶液をプレー卜などの支持体に 加え、 抗 GPC3N端ペプチド抗体を固定する。 プレートを洗浄後、 タンパク質の非 特異的な結合を防ぐため、 例えば BSAなどでブロッキングする。 再び洗浄し、 被 検試料をプレートに加える。 インキュベートの後、 洗浄し、 ピオチン標識抗 GPC3 抗体を加える。 適度なインキュベーションの後、 プレートを洗浄し、 アルカリホ スファタ一ゼ、 ペルォキシダ一ゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。 イン キュベーシヨン後、 プレートを洗浄し、 アビジンに結合している酵素に対応した 基質を加え、 基質の酵素的変化などを指標に GPC3タンパク質を検出する。
本発明の GPC3タンパク質検出方法の他の態様として、 GPC3タンパク質を特異的 に認識する一次抗体、 及び該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を用いる方法 を挙げることができる。
例えば、 支持体に固定された抗 GPC3 N端ペプチド抗体に被検試料を接触させ、 インキュベーションした後、 洗浄し、 洗浄後に結合している GPC3タンパク質を、 一次抗 GPC3抗体及び該一次抗体を特異的に認識する二次抗体により検出する。 こ の場合、 二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
具体的には、 抗 GPC3N端べプチド抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加 え、 抗 GPC3N端ペプチド抗体を固定する。 プレートを洗浄後、 タンパク質の非特 異的な結合を防ぐため、 例えば BSAなどでブロッキングする。 再び洗浄し、 被検 試料をプレートに加える。 インキュベートの後、 洗浄し、 一次抗 GPC3抗体を加え る。 適度なインキュベーションの後、 プレートを洗浄し、 次いで一次抗体を特異 的に認識する二次抗体を加える。 適度なインキュベーションの後、 洗浄して、 プ レートに残った二次抗体を検出する。 二次抗体の検出は前述の方法により行うこ とができる。
本発明の GPC3タンパク質の検出方法の他の態様としては、 凝集反応を利用した 検出方法を挙げることができる。 該方法においては、 抗 GPC3N端ペプチド抗体を 感作した担体を用いて GPC3を検出することができる。 抗体を感作する担体として は、 不溶性で、 非特異的な反応を起こさず、 かつ安定である限り、 いかなる担体 を使用してもよい。 例えば、 ラテックス粒子、 ベントナイト、 コロジオン、 カオ リン、 固定羊赤血球等を使用することができるが、 ラテックス粒子を使用するの が好ましい。 ラテックス粒子としては、 例えば、 ポリスチレンラテックス粒子、 スチレン-ブタジエン共重合体ラテックス粒子、 ポリビエルトルエンラテックス 粒子等を使用することができるが、 ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが 好ましい。 感作した粒子を試料を混合し、 一定時間攪拌した後に、 試料中に GPC3 抗体が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、 凝集を肉眼でみる ことにより GPC3を検出することができる。 また、 凝集による濁度を分光光度計等 により測定することによつても検出することが可能である。
本発明の GPC3タンパク質の検出方法の他の態様としては、 例えば、 表面プラズ モン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。 表 面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質一タンパク質間の 相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、 表面プラズモン共 鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。 例えば、 BIAcore (Pharmacia製） 等のバイオセンサ一を用いることにより GPC3タンパク質と抗 GPC3N端ペプチド抗体の結合を検出することが可能である。 具体的には、 抗 GPC3 N端ペプチド抗体を固定化したセンサーチップに、 被検試料を接触させ、 抗 GPC3 N端ペプチド抗体に結合する GPC3タンパク質を共鳴シグナルの変化として検出す ることができる。
本発明の検出方法は、 種々の自動検查装置を用いて自動化することもでき、 一 度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
本発明は、 癌の診断のための被検試料中の GPC3夕ンパク質を検出するための診 断薬またはキットの提供をも目的とするが、 該診断薬またはキッ卜は少なくとも 抗 GPC3N端ペプチド抗体を含む。 該診断薬またはキッ卜が EIA法に基づく場合は、 抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、 抗体があらかじめ担体に結合してい てもよい。 該診断薬またはキッ卜がラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく 場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。 また、 該キットは、 適宜、 プロ ッキング溶液、 反応溶液、 反応停止液、 試料を処理するための試薬等を含んでい てもよい。
3. 抗 GPC3C端ペプチド抗体を用いた癌細胞の破壊および癌の治療
( 1 ) 抗体の活性の確認
本 発 明 で使用 さ れ る 抗体 の 抗 原 結 合活性 （ Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 、 リガン ドレセプ夕一結合阻害活性 （Harada, A. et al. , International Immunology ( 1993 ) 5, 681-690 ) の測定に は公知の手段を使用することができる。
本発明で使用される抗 GPC3 C端ペプチド抗体の抗原結合活性を測 定する方法として、 ELISA (酵素結合免疫吸着検定法） 、 EIA (酵素 免疫測定法） 、 RIA (放射免疫測定法） あるいは蛍光抗体法を用いる ことができる。 例えば、 酵素免疫測定法を用いる場合、 GPC3C端べ プチ ドをコ一ティ ングしたプレー 卜に、 抗 GPC3 C端ペプチド抗体を 含む試料、 例えば、 抗 GPC3C端ペプチド抗体産生細胞の培養上清や 精製抗体を加える。 アルカリ フォスファターゼ等の酵素で標識した 二次抗体を添加し、 プレー トをイ ンキュベー ト し、 洗浄した後、 p - 二 卜口フエニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定する こと で抗原結合活性を評価することができる。
本発明で使用される抗体の活性を確認するには、 抗 GPC3 C端ぺプ チド抗体の中和活性を測定する。
( 2 ) 細胞傷害活性
治療目的の場合、 本発明に使用する抗体は、 細胞傷害活性として、 ADCC活性または CDC活性を有することが好ましい。
ADCC活性は、 エフェクター細胞と標的細胞と抗 GPC3 C端ペプチ ド 抗体を混合し、 ADCCの程度を調べる ことにより測定する ことができ る。 エフェク夕一細胞として例えば、 マウス脾細胞やヒ ト末梢血や 骨髄から分離した単核球等を利用することができ、 標的細胞として はヒ ト肝細胞株 HuH- 7等のヒ ト株化細胞を用いることができる。 標的 細胞をあらかじめ 5 1 Crにより標識し、 これに抗 GPC3 C端ペプチ ド抗 体を加えイ ンキュベーショ ンを行い、 その後、 標的細胞に対し適切 な比のエフェクター細胞を加えィ ンキュベーショ ンを行う。 ィ ンキ ュベーシヨ ン後上清を採取し、 上清中の放射活性をカウン トする こ とにより ADCC活性を測定することができる。
また、 CDC活性は、 上述の標識標的細胞と抗 GPC3C端ペプチド抗体 を混合し、 その後補体を添加してイ ンキュベーショ ンを行い、 培養 後に上清中の放射活性をカウン 卜することにより測定することがで きる。
抗体が細胞傷害活性を発揮するには、 Fc部分が必要であるので、 本発明の細胞増殖阻害剤が、 抗体の細胞傷害活性を利用したもので ある場合には、 本発明に使用する抗 GPC3 C端ペプチド抗体は Fc部分 を含んでいることが好ましい。
( 3 ) 細胞の破壊
本発明の抗 GPC3 C端ペプチド抗体を細胞破壊、 特に癌細胞の破壌 に用いることもできる。 さ らに本発明の抗 GPC3 C端ペプチ ド抗体を 抗癌剤として用いることもできる。 本発明の抗体によ り治療 ' 予防 させる癌は特に限定されず、 肝癌、 肺癌、 大腸癌、 乳癌、 前立腺癌、 塍臓 癌、 リンパ腫などに用いることができるが、 肝癌が好ましい。
( 4 ) 投与方法および製剤
本発明の細胞破壊剤または抗癌剤は、 細胞の異常増殖に基づく疾患、 特に癌に対する治療又は改善を目的として使用される。
有効投与量は、 一回につき体重 lkgあたり 0. OOlmg から lOOOmgの範 囲で選ばれる。 あるいは、 患者あたり 0.01〜 100000mg/bodyの投与量 を選ぶことができる。 しかしながら、 本発明の抗 GPC3C端ペプチド 抗体を含有する治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない また、 本発明の治療剤の投与時期としては、 疾患の臨床症状が生 ずる前後を問わず投与することができる。
本発明の抗本発明の抗 GPC3 C端ペプチ ド抗体を抗体を有効成分と して含有する治療剤は、 常法にしたがって製剤化する こ とができ ( Remington' s Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton,米国） 、 医薬的に許容される担体や添 加物を共に含むものであってもよい。
このような担体および医薬添加物の例として、 水、 医薬的に許容 される有機溶剤、 コラーゲン、 ポリ ビニルアルコール、 ポリ ビニル ピロリ ドン、 カルボキシビニルポリ マー、 カルポキシメチルセル口 —スナ ト リ ウム、 ポリアクリル酸ナ ト リ ウム、 アルギン酸ナ ト リ ウ ム、 水溶性デキス トラン、 カルボキシメチルスターチナ ト リ ゥム、 ぺクチン、 メチルセルロース、 ェチルセルロース、 キサンタンガム、 アラビアゴム、 カゼイン、 寒天、 ポリエチレングリ コール、 ジグリ セリ ン、 グリセリ ン、 プロピレングリ コール、 ワセリ ン、 パラフィ ン、 ステア リルアルコール、 ステア リ ン酸、 ヒ ト血清アルブミ ン (HSA) 、 マンニトール、 ソルビトール、 ラク トース、 医薬添加物と して許容される界面活性剤等が挙げられる。
実際の添加物は、 本発明治療剤の剤型に応じて上記の中から単独 で又は適宜組み合わせて選ばれるが、 もちろんこれらに限定するも のではない。 例えば、 注射用製剤として使用する場合、 精製された 抗本発明の抗 GPC3 C端ペプチド抗体を抗体を溶剤、 例えば生理食塩 水、 緩衝液、 ブドウ糖溶液等に溶解し、 これに吸着防止剤、 例えば Tween80、 Tween20、 ゼラチン、 ヒ ト血清アルブミ ン等を加えたもの を使用する ことができる。 あるいは、 使用前に溶解再構成する剤形 とするために凍結乾燥したものであってもよく、 凍結乾燥のための 賦形剤としては、 例えば、 マンニ トール、 ブドウ糖等の糖アルコー ルゃ糖類を使用することができる。 図面の簡単な説明 JP2003/011318 図 1は、 Gene Chi を用いた GPC3mRNAの発現解析の結果を示す図であり、 図 1
Aは GPC3の発現を、 図 1Bはアルファフエトプロテイン （AFP) の発現を示す。 横 軸の NL、 CH、 LC, WD、 MDおよび PDはそれぞれ正常肝臓、 肝炎症部位、 肝硬変部位、 高分化癌、 中分化癌および低分化癌を示す。
図 2は、 精製へパラン硫酸付加型の GPC3及び GPC3コアタンパク質の CBB染色像 を示す図である。
図 3は、 ヒト肝臓癌における GPC3遺伝子の発現を示す図である。
図 4は、 抗 GPC3抗体を用いて行った可溶型コアタンパク質のウエスタンブロッ ティングの結果を示す図である。
図 5は、 抗 GPC3抗体を用いたサンドィツチ ELISAの原理を示す図である。
図 6は、 M6B1および M18D4を用いた GPC3サンドィツチ ELISAのスタンダ一ドカー ブを示す図である。
図 7は、 GPC3の構造を示す模式図である。
図 8は、 ELISAにおける抗 GPC3抗体の組み合わせを示す図である。
図 9は、 様々な組み合わせの抗 GPC3抗体を用いた GPC3サンドィツチ ELISA系の スタンダードカーブを示す図である。
図 1 0は、 抗 GPC3C末端ペプチド抗体の ADCC活性測定の結果を示す図である。 図 1 1は、 抗 GPC3C末端ペプチド抗体の CDC活性測定の結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により、 本発明を具体的に説明する。 但し、 本発明はこれらの 実施例に限定されるものではない。
本願明細書記載の実施例において、 以下の材料を用いた。
可溶型 GPC3、 可溶型 GPC3コアタンパク質の発現ベクターとして、 pCAGGSに DHFR 遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだ pCXND2、 PCXND3を用いた。
DXB11は ATCCより購入した細胞を用い、 培養には 5%FBS(GIBC0 BRL CAT# 10099- 141, L0T# A0275242)/ Minifflum Essential Medium Alpha medium ( MEM (+) ) (GIBCO BRL CAT# 1257卜 071)/ 1% Penicillin- Streptomycin (GIBCO BRL CAT* 15140- 122)を用いた。 DXB11を用いた発現株の選抜には、 500 xg/mL Geneticin (GIBCO BRL CAT* 10131-027)/ 5% FBS/ MEM without ribo騰 leosides and deoxyribonucleosides (GIBCO BRL CAT* 12561-056) ( aMEM (- ) ) / PSあるいは同 培地に終濃度 25nMとなるように MTXを加えたものを用いた。
HepG2は ATCCより購入した細胞を用い、 10% FBS /ダルベッコの改変イーグル培 地（Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM) (GIBCO BRL CAT# 11995-065)/ PSで培養を行った。
ハイプリドーマは 10%FBS / 腿 1640 / 1 X HAT media supplement (SIGMA CA T# H - 0262) / 0.5 x BM-Condimed HI Hybridoma cloning supplement (Roche CA T# 1088947)で培養した。 実施例 1 ヒト GPC3 (GPC3) cDNAのクローニングおよび発現解析
ヒ卜ダリビカン 3 (以下 GPC3) をコードする全長 cDNAのクローニング
ヒト GPC3をコードする全長 cDNAは、 大腸癌細胞株 Caco2より常法により調製し た 1st strand cDNAを銬型とし、 Advantage2 kit (CL0NTECH社 Cat. No. 8430-
1) を用いた PCR反応により増幅した。 すなわち、 xlの Caco2由来 cDNA、 1/iW センスプライマ一 （配列番号 1) 、 のアンチセンスプライマー （配列番号
2) 、 5 1の Ad vantage 2 lOxPCR buffer, 8 xlの dNTP mix (1.25 mM)、 1· 0μ1の Advantage polymerase Mixを含む 50 1の反応液を、 94 で 1分、 63 °Cで 30秒、 68 °Cで 3分からなるサイクルを 35回行った。 PCR反応による増幅産物は （pGEM - T Easy Vector System I (Promega社 Cat. No. A1360) を用いて TAベクタ一 pGEM-T easyに挿入した） ABI3100 DNAシーケンサーを用い配列の確認を行った結果、 ヒ ト GPC3の全長をコードする cDNAを単離した。 配列番号 3で表される配列はヒト GPC3遺伝子の塩基配列を、 配列番号 4で表される配列はヒト GPC3タンパク質のァ ミノ酸配列を示す。 配列番号 1 ： GATATC- ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT
配列番号 2 ： GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC GeneChipを用いたヒト GPC3 mRNA発現解析
24例の肝臓癌腫瘍部 （高分化癌:！)、 中分化癌: MD、 低分化癌： PD) 、 16例の肝 臓癌非癌部 （肝炎部位： CH、 肝硬変部位: LC) 、 8例の正常肝臓: NL (インフォーム ドコンセント取得済み、 東京大学医学部及び埼玉癌センターにおいて入手） にお ける mRNA発現解析を GeneChip™ UG-95A Targe t (Aiiymetryx社） を用いて行った。 すなわち、 上記各組織より IS0GEN (日本ジーン社） を用いてトータル RNAを調製 した後、 それぞれ 15 z gの total RNA を使用し、 Express ion Analysis Technical Manual (Aiiymetryx社） に準じて遺伝子発現解析を行った。
その結果、 図 1に示すようにヒト GPC3遺伝子 （Probe Set ID： 39350— at) は肝 癌の分化の程度に関わらず多くの症例において mRNAの発現量が正常肝組織に比べ 明らかに高いことが確認された。 さらに、 現在最もよく肝癌の診断マーカーとし て使用されているアルファフエトプロテイン（Probe Set ID： 40114_at)の mRNA発 現と比較した結果、 アルファフエトプロティンの mRNA発現がほとんどみられな い高分化癌においても GPC3は十分な mRNAの発現の亢進が認められ、 かつ mRNA発現 亢進している割合が GPC3において高いことが明らかとなった。 以上のことより、 GPC3の検出は肝癌の早期診断法として有用と考えられる。 実施例 2 抗 GPC 3抗体の作製
可溶型ヒ卜 GPC3の作製
抗 GPC3抗体作製のための材料として、 C末端側の疎水性領域を欠損させた可溶 型 GPC3タンパク質を作製した。
東大先端研より供与された完全長ヒト GPC3 cDNAを含むプラスミド DNAを用い、 可溶型 GPC3 cDNA発現プラスミド DNAを構築した。 C末端側の疎水領域 （564 - 580 アミノ酸） を除くように設計した下流プライマー （5' - ATA GAA TTC CAC CAT
GGC CGG GAC CGT GCG C -3' (配列番号 5 ) ) と EcoRI認識配列、 Kozak配列を加 えた上流プライマー （5' - ATA GGA TCC CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTT C - 3'
(配列番号 6 ) を用いて PCRを行った。 得られた PCR断片（1711bp)を PCXND2- Flag にクローニングした。 作製された発現プラスミド DNAを CH0細胞 DXB11株へ導入し、
500 /mL Genet ic in での選抜により、 可溶型 GPC3高発現 CH0株を得た。 1700 cm2口一ラーボトルを用い可溶型 GPC3高発現 CHO株の大量培養を行い、 培 養上清を回収し精製を行った。 培養上清を DEAE sepharose Fas t Flow (Amersham CAT# 17- 0709- 01)にチャージし、 洗浄後、 500mM NaClを含むバッファ一により溶 出した。 次に、 Ant i-Flag M2 agarose aff ini ty ge l (SIGMA CAT#A-2220) を用 いてァフィ二ティ一精製を行つた。 溶出は 200 g/mLの FLAGぺプチドにより行つ た。 Centriprep- 10 (Mi l i ipore CAT#4304) による濃縮後、 Superdex 200 HR 10/30 (Amersham CAT! 17-1088- 01)によるゲルろ過を行い FLAGペプチドを除去し た。 最後に DEAE sepharose Fas t Flowカラムを用いて濃縮し、 同時に Tween20を 含まない PBS (500ηιΜの NaClを含む） で溶出を行うことによりバッファー置換を行 た。
可溶型ヒト GPC3コアタンパク質の作製
上記野生型ヒト GPC3 cDNAをテンプレートとし、 アッセンプリ一 PCR法によって 495番目と 509番目の Serを Alaに置換させた cDNAを作製した。 この際、 C末端に His タグが付加されるようにプライマーを設計し、 得られた cDNAを PCXND3ベクターに クローニングした。 作製された発現プラスミド DNAを DXB11株へ導入し、 500 g/mL Genet icin での選抜により、 可溶型 GPC3コアタンパク質高発現 CH0株を得た。
1700 cm2ローラーボトルを用い大量培養を行い、 培養上清を回収し精製を行つ た。 培養上清を Q sepharose Fast Flow (Amersham CAT# 17- 0510- 01)にチャージ し、 洗浄後、 500mM NaClを含むリン酸バッファ一により溶出した。 次に、 Chelat ing sepharose Fast Flow (Amersham CAT# 17- 0575- 01)を用いてァフィ二 ティー精製を行った。 10〜 150 mMのイミダゾールでグラジェント溶出を行った。 最後に Q sepharose Fas t Flow を用いて濃縮し、 500mM NaClを含むリン酸バッフ ァ一により溶出した。
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、 50〜300kDaのスメァなバンドと、 約 40kDaのバンドが得られた。 図 2に電気泳動の結果を示す。 GPC3は 69kDaの C末 端にへパラン硫酸付加配列を有するプロテオダリカンである。 スメァなパンドは へパラン硫酸修飾を受けた GPC3であると考えられた。 約 40kDaのバンドはァミノ 酸シークェンスの結果、 GPC3の N末端側断片を起点としており、 GPC3は何らかの 切断を受けていることが予想された。
以下のハイプリドーマのスクリーニングにおいてへパラン硫酸に対する抗体を 排除するため、 へパラン硫酸付加シグナル配列である 495番目と 509番目の Serを Al aに置換させた可溶型 GPC3コアタンパク質を作製した。 同様に CH0高発現株を構 築し、 培養上清より Hi sタグを利用したァフィ二ティー精製を行った。 SDSポリア クリルアミドゲル電気泳動の結果、 70kDa、 40kDa、 30kDaの 3つのバンドが得られ た。 アミノ酸シークェンスの結果、 30kDaのバンドは GPC3の C末端側断片である ことが判明した。 C末端断片は、 359番目のセリン、 もしくは 375番目のバリンよ り開始しており、 何らかの酵素的な切断を受けている事が予想された。 へパラン 硫酸付加型 GPC3でこの 30kDaのバンドが見られなかったのは、 へパラン硫酸が付 加しているためスメァなバンドになっていたためと思われる。 GPC3が特定のァミ ノ酸配列で酵素的な切断を受けることは新しい知見であり、 生物学的意義に関し ては明らかにされていない。
本発明者らは、 この結果より肝癌患者においても膜上の GPC3が切断を受け、 可 溶型として GPC3が血中に分泌されるという仮説を立てた。 GPC3は肝癌腫瘍マーカ 一である AFPと比較してより早期肝癌患者で遺伝子の発現が高値であることを見 出した （図 1 ) ので、 AFPより臨床的有用性の高い新しい腫瘍マーカーとしての 可能性について検討するため、 実施例 2以降に記載のように、 抗 GPC3抗体を作製 し、 サンドイッチ ELISA系を構築した。
抗 GPC3抗体の作製
ヒト GPC3とマウス GPC3のホモロジ一はアミノ酸レベルで 94%の高い相同性を示 すため、 通常のマウスに免疫しても抗 GPC3抗体を得難い可能性を考え、 自己免疫 疾患マウスである MRL/lprマウスを免疫動物として用いた。 MRL/lprマウス（CRL) 5 匹に可溶型 GPC3を免疫した。 初回免疫には免疫タンパク質を 100 g/匹となるよ うに調製し、 FCA (フロイント完全アジュバント （H37 Ra) 、 Di fco (3113-60) 、 べクトンディッキンソン (cat#231 131) ) を用いてェマルジョン化したものを皮 下に投与した。 2週間後に 匹となるように調製したものを FIA (フロイント 不完全アジュバン ト、 Di fco ( 0639-60 ) 、 べク ト ンディ ッキンソ ン (cat #263910) ) でェマルジヨン化したものを皮下に投与した。 以降 1週間間隔 で追加免疫を合計 5回行った。 最終免疫については 50 /z g/匹となるように PBSに希 釈し尾静脈内に投与した。 GPC3コアタンパク質をコートしたィムノプレートを用 いた ELISAにより GPC3に対する血清中の抗体価が飽和しているのを確認後、 マウ スミエローマ細胞 P3U1とマウス脾臓細胞を混合し、 PEG1500 (ロシュ 'ダイァグ ノスティック、 cat#783 641) により細胞融合を行った。 96穴培養プレートに播 種し、 翌日より HAT培地で選択後培養上清を ELISAでスクリーニングした。 陽性ク ローンについては限界希釈法によりモノクローン化した後、 拡大培養を行い培養 上清を回収した。 ELISAによるスクリーニングは、 GPC3コアタンパク質との結合 活性を指標に行い、 強い結合能を有する抗 GPC3抗体を 6クローン得た。
抗体の精製は Hi Trap Prote inG HP (Amersham CAT# 17- 0404- 01)を用いて行った。 ハイプリ ドーマ培養上清を直接カラムにチャージし、 結合バッファ一 （20mM リ ン酸ナトリウム （PH7. 0) ) にて洗净後、 溶出バッファー （0. 1M グリシン- HC1 (pH2. 7) ) で溶出した。 溶出は中和バッファ一 （1M Tri s- HC 1 (pH9. 0) ) を加えた チューブに行い直ちに中和した。 抗体画分をプールした後、 0. 05 %Tween20/PBS で一昼夜透析を行いバッファー置換した。 精製された抗体は 0. 02%となるように NaN3を添加した後、 4 で保管した。 抗 GPC3抗体の解析
抗体濃度はャギ抗マウス IgG (gamma) (ZYMED CAT* 62- 6600)とアルカリフォ スファハターゼ -ャギ抗マウス IgG (ga匪 a) (ZYMED CAT# 62- 6622)を用いたマ ウス IgGサンドイッチ ELISAを行い、 市販の精製マウス IgGl抗体 （ZYMED CAT#02- 6100) をスタンダードとして定量した。
抗 GPC3抗体のァイソタイ ピングは、 ImmunoPure Monoclonal Ant ibody I so typing Ki t I I (PIERCE CAT# 37502)を用い、 方法は添付のマニュアルに従つ た。 ァイソタイピングの結果全て IgGlタイプであった。
GPC3コアタンパク質を用いたウエスタンブロッテイングにより抗 GPC3抗体のェ ピトープ分類を行った。 100ng/レーンとなるように可溶型 GPC3コアタンパク質を 10%SDS - PAGE mini (TEFCO CAT#01- 075)にチャージし、 電気泳動 ( 60V 30min, 120V 90min ) 後、 Trans-Blot SD Semi-Dry Elec t rophore t ic Transfer Ce l l (BIO-RAD)を用いてィモビロン- P (Mi l l ipore CAT#IPVH R85 10) へトランスフ ァ一した（15V 60min)。 membraneを TBS- T (0. 05¾ Tween20, TBS) で軽く洗った後、 5%スキムミルク入り TBS- Tで 1時間 （室温） あるいは一晩 （4°C ) 振とうした。 TBS- Tで約 10分間振とうした後、 1%スキムミルク入り TBS- Tで 0. l~ 10 x g/mLに希 釈した各抗 GPC3抗体を加え 1時間振とうした。 TBS- Tで洗い （10分間 x3回） 、 1% スキムミルク入り TBS-Tで 1. 1000に希釈した HRP-抗マウス IgG抗体 （Amersham CAT#NA931 ) で 1時間振とう後、 TBS- Tで洗った （10分 x3回） 。 発色は ECL- Plus (Amersham RPN2132)を用いて行い、 Hyperf i lm ECL (Amersham CAT# RPN2103K) を用いて現像した。 図 4にウェスタンプロット解析の結果を示す。 40kDaのバン ドに反応する抗体は N末端にェピトープを有し、 30kDaのバンドに反応する抗体 は C末端にェピトープを有すると判断し分類した。 N末端側を認識する抗体とし て M6B1、 M18D4、 M19B1 K C末端側を認識する抗体として M3C 11、 M13B3、 M3B8を 得た。 BIAC0REを用いた解析の結果、 各抗体の KD値は 0. 2〜17. 6nMであった。 実施例 3 可溶性 GPC3の検出
マウス異種移植 （xenograf t) モデル
6週令雌性の SCIDマウス （Fox CHASE C. B-17/Icr-scid Jc K 日本クレア株式会 社） およびヌードマウス （BALB/cA Jc l-nu, 日本クレア株式会社） の腹部皮下へ ヒト肝癌 HepG2細胞を 300万個移植した。 腫瘤が充分に形成された 53日後に HepG2 移植 SCIDマウス # 1, 3, 4の後大静脈より全採血し、 EDTA_2Naとアブロチニン存在下 (二プロネオチューブ真空採血管、 NIPR0、 NT- EA0205)で血漿を調製し、 測定日 まで- 20°Cで保管した。 なお、 HepG2移植 SCIDマウス #2は HepG2移植 62日後に、 HepG2移植ヌードマウス #1, 2は移植 66日後に後大静脈より全採血した。 対照とし て、 同週令の正常 SCIDマウスから同様の操作で血漿を調製した。 ツチ ELISA 血中の可溶型 GPC3を検出するため、 GPC3のサンドィツチ ELISA系を構築した。 96ゥエルプレートにコートする抗体には M6B1を、 M6B1に結合した GPC3を検出する 抗体としてピオチンで標識した M18D4を用いた。 発色には高い検出感度を達成す るため DAK0社の AMPAKを用いた。
96ゥェルイムノプレー卜に 10 g/mLとなるように抗 GPC3抗体をコーティングバ ッファー （0. 1M NaHC03 (pH9. 6) , 0. 02% (w/v) NaN3) で希釈したものをコートし、 4°Cでー晚ィンキュペートした。 翌日 300 L/wel lの洗浄バッファ一（0. 05% (v/v) Tween20, PBS)で 3回洗浄後、 200 Lの希釈バッファー（50mM Tris - HC1 (pH8. 1) , ΙπιΜ MgCl2) 150mM NaCl, 0. 05¾ (v/v) Tween20, 0. 02% (w/v) NaN3, 1% (w/v) BSA) を加えブロッキングを行った。 室温で数時間後、 あるいは 4°Cで一晩保管後、 マ ウス血漿、 あるいは培養上清を希釈バッファーで適当に希釈したものを加え 1時 間室温でインキュベートした。 300 L/ゥエルの RBで 3回洗浄後、 希釈バッファー で 10 / g/mLとなるように希釈したピオチン標識した抗 GPC3抗体を加え 1時間室温 でインキュベートした。 300 L/ゥエルの RBで 3回洗浄後、 希釈バッファーで 1Z 1000に希釈した AP-ストレプトアビジン （ZYMED) を加え、 1時間室温でインキュ ベー卜した。 300 L/wel lの洗浄バッファ一で 5回洗浄した後、 添付のプロトコ一 ルに従い AMPAK (DAKO CAT#K6200) を用いて発色させ、 マイクロプレートリーダ 一で吸光度を測定した。
抗体のビォチン化には Roche社の Biot in Label ing Ki t (CAT# 1 418 165)を用 いた。 また、 サンプル中の可溶型 GPC3濃度の換算には、 表計算ソフト GlaphPad PRISM (GlaphPad sof tware Inc. ver. 3. 0)を用いて解析した。 図 5に本実施例の サンドィツチ ELISAの原理を示す。
精製可溶型 GPC3を用いてスタンダードカーブを作製した結果、 検出限界が数 ng/mLの系を構築することができた。 図 6に M6B1および M18D4を用いた GPC3サンド イッチ ELISAのスタンダードカーブを示した。 この系を用い、 前述の HepG2の培養 上清、 及びヒト肝癌 HepG2細胞を移植したマウス血清中の分泌型 GPC3の検出を試 みた。 コントロールの培地、 及びコント口一ルマウス血清では可溶型 GPC3は検出 限界以下であつたのに対し、 HepG2の培養上清、 及びヒト肝癌 HepG2細胞を移植し たマウス血清中に可溶型 GPC3が検出された。 精製可溶型 GPC3の濃度に換算すると. HepG2培養上清では 1. 2 i g/mL、 マウス血清でも 23〜90ng/niLであった （表 1 ) 。
HepG2移植マウス plasma中の可溶型 GPC3濃度の測定（ng/mL)
Figure imgf000033_0001
分泌型 GPC3の構造
先に立てた仮説通り、 血中可溶化 GPC3が N末端断片の構造をとつているかにつ いて検討を行った。 分泌型 GPC3が N末端断片であった場合、 N末端認識抗体と C 末端認識抗体の組み合わせのサンドイッチ ELISAでは検出できないと考えられる。 N末端断片を認識する抗体及び C末端側断片を認識する抗体それぞれ 3種ずつを用 いて、 様々な組み合わせのサンドイッチ ELISA系を構築した。 図 7に分泌可溶化 型 GPC3の構造を、 図 8に抗体の組み合わせを示す。 図 9にこのサンドイッチ ELI SAのスタンダードカーブを示す。 表 1に測定結果を示すが、 表 1に示すよう に HepG2の培養上清、 及びヒト肝癌 HepG2細胞を移植したマウス血清中の分泌型 GPC3の検出は N末端側断片認識抗体同士の組み合わせでは高い値を示し、 C末端 断片認識抗体を含む系では多くのマウスで検出限界以下であった。 このことから、 今回明らかになつた分泌型 GPC3は N末端断片が優位であることが予想された。 す なわち、 GPC3のアミノ酸第 1番目から第 374番目のアミノ酸配列に対する抗体を用 いる事により、 血中可溶化 GPC3の検出が高感度に行われる可能性が考えられた。 実施例 4 抗 GPC3マウス -ヒトキメラ抗体の作製
ヒト GPC3に結合する抗体 （ヒト GPC3- C末端認識抗体： M3C11、 M1E07、 ヒト GPC
3 - N末端認識抗体： M19B 11、 M18D04, M5B09、 M10D02) を産生するハイプリ ドー マより抽出した Total RNAを用いて、 RT-PCR法によって増幅した。 Tot al RNAは、 RNeasy Pl ant Mini Ki t s (QIAGEN社製） を用いて 1 X 107細胞のハイブリ ド一マ より抽出した。 1 gの Total RNAを使用して、 SMART RACE cDNA Ampl i f icat ion
Ki t (CLONTECH社製） 、 マウス IgGl定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオ チド MHC-IgGl (配列番号： 7 ) またはマウス/ 鎖定常領域塩基配列に相補的な合 成オリゴヌクレオチド kappa (配列番号： 8 ) を用い、 5 '末端側遺伝子断片を 増幅した。 逆転写反応は 42°Cで 1時間 30分間反応した。 PCR溶液 50 1は、 5
1の lO XAdvant age 2 PCR Buf fer、 5 Lの lO XUniversal Primer A Mix、 0. 2m M dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 、 1 の Advantage 2 Polymerase Mix (以上 、 CLONTECH社製） 、 2· 5 Lの逆転写反応産物、 lOpmoleの合成オリゴヌクレオチ ド腿 C_ I gG 1または kapp aを含有し、 94°Cの初期温度にて 30秒間そして 94°Cにて 5 秒間、 72 にて 3分間のサイクルを 5回反復し、 94°Cにて 5秒間、 70°Cにて 10秒 間、 にて 3分間のサイクルを 5回反復し、 さらに 94でにて 5秒間、 68°Cにて 10秒間、 72°Cにて 3分間のサイクルを 25回反復した。 最後に反応産物を 72°Cで 7 分間加熱した。 各 PCR産物は QIAQuick Ge l Ext ract ion Ki t (QIAGEN社製) を用い て、 ァガロースゲルから精製した後、 pGEM-T Easyベクター （Promega社製） へク ローニングし、 塩基配列を決定した。
次に各抗体の H鎖および L鎖可変領域配列をヒト H鎖およびヒト L鎖定常領域 配列に連結した。 各抗体の H鎖可変領域の 5 '末端側塩基配列に相補的でコザッ ク配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよび Nhel部位を有する 3 '末端側塩基 配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて PCRを行い、 得られた PCR産物を ヒト IgGl定常領域が pBluescript KS +ベクター （東洋紡社製） に挿入されている pB - CHベクターにクローニングした。 Nhel部位により、 マウス H鎖可変領域とヒ ト H鎖 （T l鎖） 定常領域が連結している。 作製された Η鎖遺伝子断片を発現べ クタ一 PCXND3にクローニングした。 本ベクター PCXND3の構築の流れについて、 以 下に述べる。 DHFR- Δ Ε-rvH- ΡΜ卜 f (W092/19759参照） の抗体 H鎖遺伝子とベクタ 一を分割するために、 制限酵素 EcoRI/Smal部位で消化し、 ベクター側のみ回収し た後に、 EcoRI- Not l- BamHI adaptor (宝酒造社製） をクローニングした。 このべ クタ一を pCHOIと命名した。 pCHOIの]) HFR遺伝子発現部位を pCXN (Niwaら、 Gene 1991;108:193-200) の制限酵素 Hindlll部位にクローニングしたベクターを PCXND3と命名した。 本プラスミ ドに含まれる抗 GPC3マウス-ヒトキメラ抗体 (M3C1K M1E07, M19B1L M18D04) の H鎖の塩基配列をそれぞれ配列番号： 9、 1 1、 1 3、 1 5にアミノ酸配列をそれぞれ配列番号： 1 0、 1 2、 14、 1 6 に示す。 また、 各抗体の L鎖可変領域の 5 '末端側塩基配列に相補的でコザック 配列を有する合成ォリゴヌクレオチドおよび BsiWI部位を有する 3 '末端側塩基 配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて PCRを行い、 得られた PCR産物を ヒト kappa鎖定常領域が pBiuescript KS +ベクター (東洋紡社製） に挿入されて いる pB-CLベクターにクローニングした。 BsiWI部位により、 ヒト L鎖可変領域と 定常領域が連結している。 作製された L鎖遺伝子断片を発現べクター pUCAGク口 一二ングした。 本べクタ一 pUCAGは、 pCXN (Niwaら、 Gene 1991;108:193-200) を 制限酵素 BamHIで消化して得られる 2.6kbpの断片を pUC19ベクター （東洋紡社製） の制限酵素 BamHI部位に連結し、 クローニングしたべクタ一である。 本プラスミ ドに含まれる抗 GPC3マウス-ヒトキメラ抗体 （M3C11、 M1E07, M19B1K M18D04) の L鎖の塩基配列をそれぞれ配列番号： 1 7、 1 9、 2 1、 2 3にアミノ酸配列 をそれぞれ配列番号： 1 8、 20、 22、 24に示す。
抗 GPC3マウス-ヒトキメラ抗体発現ベクターを作製するために、 L鎖遺伝子断 片が揷入された pUCAGベクタ一を制限酵素 Hindlll (宝酒造社製） で消化して得ら れる遺伝子断片を H鎖遺伝子が挿入された PCXND3の制限酵素 Hindlll切断部位に 連結し、 クローニングした。 本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝 子、 DHFR遺伝子、 抗 GPC3マウス-ヒトキメラ抗体遺伝子を発現する。
CH0細胞 （DG44株） を用いた安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。 Gene Pulserll (Bio Rad社製） を用いたエレクトロボレ一シヨン法により遺伝子 導入した。 25 gの各抗 GPC3マウス-ヒトキメラ抗体発現ベクターと PBSに懸濁し た CH0細胞 （lxl O 7細胞 Zm l ) の 0.75mlを混合したものを氷上で 10分間冷却 し、 キュベットに移した後に 1.5kV、 25 FDの容量にてパルスを与えた。 室温に て 10分間の回復期間の後、 エレク トロボレ一シヨン処理された細胞を、 HT supplement (Invitrogen社製） を 1倍濃度で含む CHO- S- SFMII培地 (Invitrogen 社製） 40mLに懸濁した。 同様の培地で 50倍希釈溶液を作製し、 96ゥエル培養用プ レートに lOO/ 1 /ゥエルで分注した。 C02インキュベーター ( 5 %C02) で 24時 間培養後、 Geneticin (Invitrogen社製） を 0.5mg/mLになるように添加して 2週 間培養した。 Geneticin耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたゥエル の培養上清中の IgG量について以下に示す濃度定量法で測定した。 高産生細胞株 を順次拡大培養し、 抗 GPC3マウス-ヒトキメラ抗体安定発現細胞株を取得し、 大 量培養を行い、 培養上清を得た。
培養上清中の IgG濃度の測定は、 Goat Ant i -Human IgG (BI0S0RCE社製） と Goat Ant i -Human IgG Alkaline Phosphatase conjugated (BI0S0RCE社製) を用いたヒ ト IgGサンドイッチ ELISAを行い、 市販の精製ヒト IgG (Cappel社製） との比較に より定量した。
各抗 GPC3マウス-ヒトキメラ抗体の精製は、 Hi Trap ProteinG HP (Amersham社 製） を用いて行った。 抗 GPC3マウス-ヒトキメラ抗体産生 CH0細胞株の培養上清を 直接カラムにチャージし、 結合バッファー （0.1Mグリシン- HC1 (pH2.7) ) で溶 出した。 中和バッファー （1M Tris- HC1 (pH9.0) ) を加えたチューブに溶出し、 直ちに中和した。 抗体画分をプールした後、 0.05%Tween20/PBSで一昼夜透析を 行い、 バッファーを置換した。 精製された抗体は 0.02%となるように NaN3を添加 した後、 4 °Cで保管した。 実施例 5 抗 GPC3マウス-ヒトキメラ抗体の作製
全長ヒト GPC3 cDNAがクローニングされた pGEM- T Easyベクターを制限酵素
EcoRI (宝酒造社製） で消化して得られるヒト GPC3 cDNAを発現ベクター pC0S2にク ローニングした。 本ベクター PC0S2の構築の流れについて、 以下に述べる。 DHFR -
ΔΕ-rvH-PMl-f (W092/19759参照） の抗体 H鎖遺伝子とベクターを分割するため に、 制限酵素 EcoRI/Smal部位で消化し、 ベクタ一側のみ回収した後に、 EcoRI-
Notl-BamHI adaptor (宝酒造社製） をクローニングした。 このベクターを pCHOI と命名した。 さらに、 PCH0Iの DHFR遺伝子発現部位を除去し、 HEF- VH-g了 1
(Sato Kら、 Mol. I匪 unol.1994:31:37卜 381) の Neomycin耐性遺伝子発現部位を 挿入した。 このベクターを pC0S2と命名した
全長ヒト GPC3安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。 10/Z gの全長ヒ ト GPC3遺伝子発現ベクターと 60/xLの SuperFect (QIAGEN社製） を混合し、 複合 体を形成させた後に、 CH0細胞 DXB11株に添加することにより、 遺伝子導入を行つ た。 C02インキュベーター ( 5 %C02) で 24時間培養後、 終濃度 0.5mg/mLの Geneticin (Invitrogen社製） および 10% FBS (GIBCO BRL社製） を含む αΜΕΜ (GIBCO BRL社製） を用いて、 選抜を開始した。 得られた Geneticin耐性コロニー を集め、 限界希釈法により細胞のクローニングを行った。 それぞれの細胞クロー ンを可溶化し、 抗 GPC3抗体を用いたウェスタンブロットにより全長ヒト GPC3の発 現を確認し、 安定発現細胞株を取得した。
実施例 6 ヒト末梢血由来 PBMCを用いた ADCC活性の測定
(1) ヒト PBMC溶液の調製
健常人よりへパリン加採血した末梢血を、 PBS (-)で 2倍に希釈し、 Ficol卜 PaQU eTMPLUS(Amersham Pharmacia Biotech AB)に重層した。 これを遠心 （500Xg、 30 分間、 20°C) した後、 単核球画分である中間層を分取した。 3回洗浄後、 10% FBS /RPMIに懸濁し、 ヒト PBMC溶液とした。
( 2 ) 標的細胞の調製
10 85 1 11640培地で培養した116 62細胞を、 トリプシン- EDTA (Invitrogen C orp)を用いてディッシュから剥離し、 96ゥエル U字底プレー卜（Falcon)の各ゥェ ルに 1X104細胞/ゥエルで分注し、 2日間培養した。 培養後、 5.55MBQの Chromium- Siを加え、 5%炭酸ガスインキュベータ中 37°C1時間培養し、 この細胞を培地で 1回 洗浄し、 50 Lの 10%FBS/RPMI1640培地を加え標的細胞とした。
(3) クロム遊離試験 （ADCC活性）
標的細胞に各濃度に調製した抗体溶液 50 /Lを添加し、 氷上で 15分反応させた 後に、 ヒト PBMC溶液 100 iL ( 5 X 105 細胞/ゥエル） を加え、 5%炭酸ガスインキ ュべ一夕中 37°C4時間培養し、 培養後、 プレートを遠心分離し、 培養上清 100 zL 中の放射活性をガンマカウンタ—で測定した。 下式により特異的クロム遊離率を 求めた。 2003/011318 特異的クロム遊離率（%) = (A-C) X100/ (B-C)
Aは各ゥエルにおける放射活性（cpm)の平均値、 Bは標的細胞に 2% NP- 40水溶液 (Nonidet P- 40、 Code No.252-23 , ナカライテスク株式会社）を 100 L、 10%FBS/RPMI培地を 50 添加したゥエルにおける放射活性（cpm)の平均値、 Cは 標的細胞に 10%FBS/RPMI培地を 150 L添加したゥエルにおける放射活性（cpm)の 平均値を示す。 試験は triplicateにて行い、 ADCC活性 （％) について平均値及び 標準誤差を算出した。
その結果を第 1 0図に示した。 6種類の抗 GPC3キメラ抗体のうち、 C末端認識抗 体である di.M3Cllと ch.MlE07が ADCC活性を示したのに対して、 N末端認識抗体で ある ch.M19Bll， ch.M18D04, ch. M5E09, cli. M10D02はほとんど ADCC活性を示さな かった。 以上の結果はキメラ抗体の ADCC活性は抗体の認識部位によって異なるこ とを示しており、 さらに、 切断点より C末端側を認識する抗体が ADCC活性を示し たことから、 GPC3の C末端認識抗体は臨床応用上有用であることが予想された。 実施例 7 補体依存性細胞障害活性（CDC活性）の測定
( 1 ) Human Albumin Veronal Buffer (HAVB) の作製
NaCl (特級、 和光純薬工業株式会社） 12.75 g、 Na- barbital (特級、 和光純薬 工業株式会社） 0.5625 g、 barbital (特級、 和光純薬工業株式会社） 0.8625 gを ミリ Q水に溶解し 200 inLとした後、 オートクレープ処理 （121°C、 20分間） した。 オートクレープ処理した 100 mLの温ミリ Q水を加え、 PH7.43を確認した （推奨 pH7.5) 。 これを 5XVeronal Bufferとした。 Can2'2H20 (特級、 純正化学株式会 社） 0.2205 gを 50 mLミリ Q水に溶解し 0.03 mol/Lとし、 CaCl2溶液とした。
MgCl2-6H20 (特級、 純正化学株式会社） 1.0165 gを 50 mLミリ Q水に溶解し 0.1 mol/Lとし、 MgCl2溶液とした。 5xVeronal Buffer 100 mL、 ヒト血清アルブミン
(ブミネート ®25%、 ヒト血清アルブミン濃度 250 mg/mL、 バクスター株式会社）
4 mL、 CaCl2溶液 2.5 mL、 MgCl2溶液 2.5 mL、 KC1 (特級、 純正化学株式会社）
0.1 g、 glucose (D(+)-グルコース、 ブドウ糖無水、 特級、 和光純薬工業株式会 社） 0.5 gをミリ Q水に溶解し 500 mLとした。 これを HAVBとした。 ろ過滅菌後、 設定温度 5°Cにて保存した。
( 2) 標的細胞の調製
実施例 4で作製された GPC3を細胞膜上に発現させた CH0細胞は、 10%FBSと 0.5m g/mL Geneticin(GIBCO)を添加した〈- MEM核酸 （+ ) 培地 （GIBC0) で培養し、 細胞剥離緩衝液（Invitrogen Corp)を用いてディッシュから剥離して、 96ゥエル 平底プレート（Falcon)の各ゥエルに 1 x 104細胞/ゥエルで分注し、 3日間培養した。 培養後、 5.55MB(iの Chromium- 51を加え、 5%炭酸ガスインキュベータ中 37°C 1時間 培養し、 この細胞を HAVBで 2回洗浄し、 50 Lの HAVBを加え標的細胞とした。
(3) クロム遊離試験 （CDC活性）
各キメラ抗体を HAVBで希釈して 40 _i g/mLの抗体溶液とした。 標的細胞に抗体溶 液を 50 ずつ添加し、 氷上にて 15分間静置した。 続いて、 各ゥエルに HAVBにて 希釈した幼若ゥサギ補体（Cedarlane)を終濃度 30%になるよう 100 ずつ添加し (抗体の終濃度 g/mL) 、 5%炭酸ガスインキュベータ一中に 37 で 90分間静 置した。 プレートを遠心分離後、 各ゥエルより上清を IOO Lずつ回収し、 ガンマ カウンタ一にて放射活性を測定した。 下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率 （« = (A-C) X100/ (B-C)
Aは各ゥエルにおける放射活性 （cpm) 、 Bは標的細胞に 2% NP-40水溶液 (Nonidet P- 40、 Code No.252-23, ナカライテスク株式会社） を 100 、 HAVB を 50 zL添加したゥエルにおける放射活性 （cpm) の平均値、 Cは標的細胞に HAVB を 150 L添加したゥエルにおける放射活性 （cpm) の平均値を示す。 試験は triplicateにて行い、 CDC活性 （％) について平均値及び標準誤差を算出した。 その結果を第 1 1図に示した。 6種類の抗 GPC3キメラ抗体のうち、 C末端認識抗 体である ch.M3Cllと cli.MlE07が CDC活性を示したのに対して、 N末端認識抗体であ る ch. M19B11, c .M18D04, ch. M5E09, cli. M10D02はいずれも低い CDC活性しか示さ なかった。 以上の結果はキメラ抗体の CDC活性は抗体の認識部位によって異なる ことを示しており、 さらに、 切断点より C末端側を認識する抗体が CDC活性を示 したことから、 GPC3の C末端認識抗体は臨床応用上有用であることが予想された。 産業上の利用可能性 実施例に示したように、 肝癌細胞で高発現している GPC3は一部分泌型として血 液中に存在する可能性が示された。 GPC3は肝癌マ一力一である AFPよりも早期の 癌で遺伝子発現が認められるので、 GPC3の検出は癌の診断として有用であると考 えられる。 GPC 3は肝癌細胞株以外に、 肺癌、 大腸癌、 乳癌、 前立腺癌、 膝臓癌、 リンパ腫などの癌細胞株においても発現が確認されているので、 肝癌以外の診断 にも適用できる可能性がある。
また、 血中可溶化 GPC3は、 可溶型 GPC3コアタンパク質で認められた約 40kDaの
N末端断片が優位である可能性が示された。 このことから診断用抗体としては N 末端断片認識抗体が有用と考えられる。 また、 ADCC活性及び CDC活性を有する肝 癌治療用抗体としては C末端断片認識抗体を用いれば、 血中の分泌型 GPC3にトラ ップされること無く効率的に肝癌細胞に到達することが可能であり、 癌細胞破壌 剤、 抗癌剤として有用である。
本明細書に引用されたすベての刊行物は、 その内容の全体を本明細書に取 り込むものとする。 また、 添付の請求の範囲に記載される技術思想および発 明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能である ことは当業者には容易に理解されるであろう。 本発明はこのような変形およ び変更をも包含することを意図している。

Claims

請求の範囲
I . GPC3の N端ペプチドに対する抗体。
2 . GPC3の N端べプチドが血中可溶化べプチドである請求項 1記載の抗体。
3 . GPC3の N端ペプチドが GPC3の第 1番目のアミノ酸から第 374番目のアミノ酸 からなるペプチド又は第 1番目のアミノ酸から第 358番目のアミノ酸からなるぺ プチドである請求項 2記載の抗体。
4 . GPC3の N端ペプチドが GPC3の第 1番目のアミノ酸から第 358番目のアミノ酸か らなるペプチドである請求項 3記載の抗体。
5 . モノクローナル抗体である請求項 1から 4のいずれか 1項に記載の抗体。
6 . 不溶性支持体に固定されていることを特徴とする請求項 1記載の抗体。
7 . 標識物質で標識されていることを特徴とする請求項 1記載の抗体。
8 . GPC3の C端ペプチドに対する抗体。
9 . GPC3の C端ペプチドが GPC3の第 359番目のアミノ酸から第 580番目のアミノ酸 からなるペプチド又は第 375番目のアミノ酸から第 580番目のアミノ酸からなるぺ プチドである請求項 8記載の抗体。
1 0 . GPC3の C端ペプチドが GPC3の第 359番目のアミノ酸から第 580番目のァミノ 酸からなるぺプチドである請求項 9記載の抗体。
I I . モノクローナル抗体である請求項 8から 1 0いずれかに記載の抗体。
12. キメラ抗体である請求項 8〜 1 0のいずれか 1項に記載の抗体。
13. 細胞傷害抗体である請求項 7から 1 2のいずれか 1項に記載の抗体。
14. 請求項 7から 1 3のいずれか 1項に記載の抗体を含む細胞破壊剤。
1 5. 細胞が癌細胞である請求項 14記載の細胞破壊剤。
16. 請求項 8から 1 3のいずれか 1項に記載の抗体を含む抗癌剤。
17. 請求項 8から 1 3のいずれか 1項に記載の抗体を細胞と接触させることを 含む、 細胞傷害を引き起こす方法。
18. 細胞が癌細胞である請求項 17記載の方法。
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