KR20210008487A - 항-cd24 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

종양 세포에서 발현된 인간 CD24와는 선택적으로 결합하지만 비-종양 세포에서 발현된 인간 CD24와는 결합하지 않는 항-CD24 항체, 및 종양 치료에 이러한 항체를 사용하는 용도가 본원에 의하여 제공된다.

Description

항-CD24 조성물 및 이의 용도
본 발명은 종양 세포에서 발현된 인간 CD24와는 선택적으로 결합하지만 비-종양 세포에서 발현된 인간 CD24와는 결합하지 않는 항-CD24 항체에 관한 것이다, 또한, 본 발명은 종양 치료에 이러한 항체를 사용하는 용도에 관한 것이다.
CD24는 작은 심하게 글리코실화된 뮤신-유사 글리코실포스파티딜-이노시톨(glycosylphosphatidyl-inositol)(GPI) 링크된 세포 표면 단백질이다. CD24는 B 세포, T 세포, 호중구, 호산구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하는 조혈 세포뿐만 아니라 신경 세포, 신경절 세포, 상피 세포, 각질 세포, 근육 세포, 췌장 세포 및 상피 줄기세포를 포함하는 비-조혈 세포상에서 더 높은 수준으로 발현된다. 일반적으로, CD24는 전구 세포 및 대사적으로 활성인 세포에서 더 높은 수준으로 발현되고, 종말에 분화된 세포에서 더 적게 확장된다. CD24의 기능은 대부분의 세포 유형에서는 불명확하지만, 다양한 CD24의 면역학적 기능이 보고되었다.
CD24가 많은 정상 조직 및 세포 유형에서 발견되었지만, CD24는 인간 종양의 거의 70%에서 과발현된다. 면역조직화학에 의해 높은 수준의 CD24 발현이 상피 난소암(83%), 유방암(85%), 비소세포 폐암(45%), 전립선암(48%) 및 췌장암(72%)에서 발견되었다. CD24는 종양 세포에서 최고로 과발현된 단백질 중 하나이다. CD24 발현은 종양형성 동안 상향조절되어 종양 진행 및 전이에 대한 역할을 암시한다. 종양에서 CD24의 과발현은 또한 빈약한 예후 및 종양 환자에 대한 질병의 더 공격적인 전개를 나타내는 마커(marker)로서 확인되었다. 유방암에서, CD24의 발현은 양성 또는 전암성 병변보다 침습성 암종에서 상당히 더 높다. 비소세포 폐암에서, CD24 발현은 환자의 전체 생존을 위한 독립적인 마커로서 확인되었다. 또한, 식도 편평 세포 암종에서, CD24 과발현은 종양 림프절 전이, 불량한 종양 등급뿐만 아니라 감소된 생존 시간을 암시한다. 유사한 관찰은 결장암, 간세포암, 신경교종, 난소암 및 전립선암을 포함하는 많은 다른 종양에서 발견되었다. CD24는 종양에 대한 예후 마커로서 많이 사용되어 왔지만, 정상 세포 유형 및 잠재적인 독성에 대한 그의 발현으로 인해 종양 치료를 위한 잠재적 표적일 수 있는 신생항원으로서 사용되지 않았다.
성숙한 CD24는 16개의 잠재적인 O-글리코실화 부위 및 2개의 예측된 N-글리코실화 부위를 갖는 31개의 아미노산의 작은 고도로 글리코실화된 시알로당단백질이다. 글리코실화는 단백질의 가장 복잡한 전사 후(post-translational) 변형 중 하나이다. 정상적인 글리코실화 경로로부터의 시프트는 많은 종양 세포에서 일어나는 것으로 알려져 있으며, 이는 변형된 글리칸 발현을 유도하여 많은 세포 단백질의 하이퍼-글리코실화 또는 하이포-글리코실화를 초래한다. 종양 세포에서 발견되는 변형된 글리코실화 패턴은 전사 수준에서 기능장애, 글리코실화 동안 샤페론(chaperone) 단백질의 기능장애, 및 변형된 글리코시다아제 및 글리코실트랜스퍼라아제 활성을 비롯한 다수의 기여 인자의 결과이다. 종양-관련 글리칸 변화는 N-글리칸의 더 긴 또는 더 짧은 분지, O-글리칸의 더 높은 또는 더 낮은 밀도, 정상적인 대응물의 절단된 버전의 생성(Tn, sTn, 및 T 항원), 및 시알산 및 푸코스를 갖는 특이적인 형태의 말단 구조의 생성(sLea 및 sLex 에피토프(epitope))을 포함한다.
따라서, 종양을 식별하고 치료하는 개선된 방법에 대한, 특히 비-종양 세포로부터 종양성(cancerous)을 구별할 수 있는 방법 및 조성물에 대한, 필요성이 당업계에 존재한다.
본 발명의 요약
단일 클론(monoclonal) 항-CD24 항체의 CD24에 대한 결합이 종양 세포가 아닌 정상 세포에서 존재하는 글리코실화에 의해 차단되는 단일 클론 항-CD24 항체가 본원에 제공된다. 이의 항체는 비-종양 세포가 아닌 종양 세포에 노출되는 글리칸-차폐된 에피토프에 결합할 수 있다. 항체는 서열 식별 번호 48에 표시된 서열을 포함하는 펩타이드에 결합할 수 있다.
또 다른 양태에서, 단일 클론 항체는 비-종양 세포에 대한 반응성이 아주 작거나 전혀 없는 종양 세포에 결합할 수 있다.
또 다른 양태에서, 단일 클론 항체는 비-종양 세포에 대한 반응성이 아주 작거나 전혀 없는 종양 세포에 결합할 수 있다.
또 다른 양태에서, 단일 클론 항체는 조혈 세포에 대한 반응성이 아주 작거나 전혀 없이 순환 종양 세포에 결합할 수 있다.
또 다른 양태에서, 단일 클론 항체는 종양-특이적 글리코실화 패턴이 결여된 세포상에서 CD24에 결합할 수 없지만, 종양-특이적 글리코실화 패턴을 갖는 세포상에서 CD24에 결합할 수 있다.
또 다른 양태에서, 약학적 조성물일 수 있는 조성물은 단일 클론 항체, 또는 이의 하나 이상의 항원 결합 단편(fragment)을 포함한다.
또 다른 양태에서, 조성물은 항체-매개된 세포 독성(ADCC: antibody-mediated cellular cytotoxicity)을 통해 종양 세포를 사멸시키는데 사용된다.
또 다른 양태에서, 조성물은 항체-매개된 세포 식작용(ADCP: antibody-mediated cellular phagocytosis)을 통해 종양 세포를 사멸시키는데 사용된다.
또 다른 양태에서, 조성물은 조합된 ADCC 및 ADCP를 통해 종양 세포를 사멸시키는데 사용된다.
또 다른 양태에서, 조성물은 T 세포에 종양 세포-특이성을 부여하는데 사용될 수 있는 키메라 항원 수용체 T 세포를 포함한다.
또 다른 양태에서, 조성물은 단일 클론 항체 3B6을 포함한다.
또 다른 양태에서, 조성물은 서열 식별 번호 1 및 2에 표시된 서열을 포함하는 단일 클론 항체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 조성물은 단일 클론 항체 3B6의 친화도 성숙에 의해 유도된 단일 클론 항체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 조성물은 서열 식별 번호 3-10에 표시된 서열 중 어느 하나로부터 선택된 중쇄를 포함하는 단일 클론 항체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 조성물은 서열 식별 번호 11-16에 표시된 서열 중 어느 하나로부터 선택된 경쇄를 포함하는 단일 클론 항체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 조성물은 단일 클론 항체 3B6의 친화도 성숙에 의해 유도된 단일 클론 항체 PP6373을 포함한다.
또 다른 양태에서, 조성물은 서열 식별 번호 6 및 16에 표시된 서열을 포함하는 단일 클론 항체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 조성물은 인간화 단일 클론 항체 PP6373에 의해 유도된 단일 클론 항체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 조성물은 서열 식별 번호 29-32에 표시된 서열 중 어느 하나로부터 선택된 중쇄를 포함하는 단일 클론 항체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 조성물은 서열 식별 번호 33-36에 표시된 서열 중 어느 하나로부터 선택된 경쇄를 포함하는 단일 클론 항체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 약학적 조성물은 인간화 단일 클론 항체 PP6373에 의해 유도된 단일 클론 항체 H2L3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 약학적 조성물은 인간화 단일 클론 항체 PP6373에 의해 유도된 단일 클론 항체 H3L3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 조성물은 서열 식별 번호 30에 표시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 서열 및 서열 식별 번호 35에 표시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일 클론 항체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 조성물은 서열 식별 번호 31에 표시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호 33에 표시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일 클론 항체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 조성물은 서열 식별 번호 17에 표시된 서열을 포함하는 단일 사슬 단일 클론 항체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 조성물은 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 제 1 항체 도메인, 및 제 2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 제 2 항체 도메인을 포함하는 이중-특이적(bi-specific) 항체를 포함한다. 상기 이중-특이적 항체는 종양의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 종양 및 면역 이펙터 T 세포를 브리지(bridge)하는데 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 제 2 항체 도메인은 제 1 항체 도메인과 상이한 결합 특이성을 갖는다.
또 다른 양태에서, 제 2 항체 도메인은 면역 이펙터 T-세포를 종양 세포로 유인한다.
또 다른 양태에서, 제 2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD3에 결합한다.
또 다른 양태에서, 제 2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TCR-α 사슬, TCR-β 사슬, TCR-γ 사슬, 또는 TCR-δ 사슬에 결합한다.
또 다른 양태에서, 제 1 항체 도메인은 서열 식별 번호 17에 표시된 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 제 2 항체 도메인은 서열 식별 번호 18에 표시된 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 제 1 항체 도메인은 서열 식별 번호 23-27 및 37-41에 표시된 서열 중 어느 하나를 포함하는 항체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 이중-특이적 항체를 포함하는 조성물은 항체-매개된 세포 독성(ADCC)을 통해 종양 세포를 치료하는데 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 조성물은 향상된 ADCC 활성을 갖는 이중-특이적 항체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 이중-특이적 항체를 포함하는 조성물은 항체-매개된 세포 식작용(ADCP)을 통해 종양 세포를 치료하는데 사용된다.
또 다른 양태에서, 이중-특이적 항체를 포함하는 조성물은 향상된 ADCP 활성을 갖는다.
또 다른 양태에서, 조성물은 면역치료에 사용하기 위한 키메라 항원 수용체를 포함하며, 상기 수용체는 서열 식별 번호 1-36에 표시된 서열 중 어느 하나를 포함하는 단일 사슬 항체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 키메라 항원 수용체는 면역치료에 사용되며, 상기 수용체는 서열 식별 번호 28에 표시된 서열을 포함하는 단일 사슬 항체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 약학적 조성물은 제 2 항종양 치료와 함께 사용된다.
하나 이상의 항체, 이중-특이적 항체, 키메라 항원 수용체, 또는 본원에 기재된 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 종양은 폐암, 간암, 뇌암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 고환암, 전립선암, 또는 신경아세포종이다. 상기 종양은 본원에 기술된 항-CD24 항체 조성물에 결합할 수 있다.
또한, 항-CD24 항체 조성물을 사용하여 악성 조직 또는 전이성 병변을 진단하는 방법이 본원에 제공된다. 항-CD24 항체 조성물은 악성 조직 또는 전이성 병변을 나타낼 수 있는, 임계 양 이상의 수준으로 악성 조직 또는 전이성 병변을 결합할 수 있다.
또한, 항-CD24 항체 조성물을 사용하여 순환 종양 세포를 확인하는 방법이 본원에 제공된다. 항-CD24 항체 조성물은 순환 종양 세포를 나타낼 수 있는, 임계 양 이상의 수준으로 순환 종양 세포를 결합할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 질병 또는 병태를 치료하기 위한 의약의 제조에서 본원에 기재된 조성물의 용도가 본원에 제공된다.
도 1. 항-CD24 단일 클론 항체 3B6의 결합이 글리칸의 존재에 의해 방해되는 반면, 상업적으로 입수 가능한 항-CD24 단일 클론 항체 ML5는 그렇지 않음을 나타내는 ELISA 결과의 바 플롯(bar plot)이다. 3B6은 N-글리칸 및 시알산 변형이 제거된(stripped) CD24(N-SA-CD24)와 N-글리칸, 시알산, 및 O-글리칸 변형이 제거된 CD24(N-SA-0-CD24)에 강하게 결합하지만, N-글리칸 변형이 제거된 CD24(N-CD24) 또는 완전히 변형된(N-글리칸 + 시알산 + O-글리칸 변형) CD24 양쪽 모두에 매우 약하게 결합한다. CD24GST는 음성 대조군 CD24-GST 융합을 나타낸다.
도 2A-B. 결합 분석은 3B6이 신경아세포종 세포주 및 수아세포종 종양에 결합함을 나타낸다. 도 2A. 항-CD24 단일 클론 항체 ML5, 3B6 및 SN3, 및 대조군 항체를 6개의 신경아세포종 세포주, IMR32, SK-N-SH, SH-SY5Y, SK-N-BE(2), SK-N-AS 및 SK-N-BE(2)C에 대해 시험한 것의 정규화된 친화도 플롯. 비록 3B6이 SK-N-AS를 제외한 모든 신경아세포종 세포주에 대해 약간의 친화도를 갖지만, 3B6의 친화도는 상업적으로 입수 가능한 항-CD24 항체 ML5(BD Bioscience Cat# 555426) 및 SN3(Thermo Fisher Cat# MA5-11833)에 비해 상당히 낮다. 도 2B. 4개의 수아세포종 종양에 대한 3B6 치료의 플루오로그래프. 3B6은 4개의 종양 중 3개를 결합했다.
도 3. CD24-GST 융합 단백질에 대한 3B6 결합을 차단하는 3B6의 변이체의 능력을 비교하는 경쟁적 ELISA의 플롯. PP6226은 3B6과 동일한 가변 영역을 갖는다.
도 4. CD24-GST 융합 단백질에 대한 3B6 결합을 차단하는 능력에 대한 3B6의 변이체의 능력을 비교하는 경쟁적 ELISA의 플롯이다. PP6226은 3B6과 동일한 가변 영역을 갖는다.
도 5. CD24-GST 융합 단백질에 대한 3B6 결합을 차단하는 능력에 대한 3B6의 변이체의 능력을 비교하는 경쟁적 ELISA의 플롯이다. PP6226은 3B6과 동일한 가변 영역을 갖는다.
도 6. CHO 세포에 의해 발현된 CD24에 대한 친화도-성숙한 키메라 항-CD24 항체의 상대적인 친화도를 나타내는 ELISA 결과의 바 플롯이다. 12개의 클론은 3B6(PP6226)에 비해 완전히 글리코실화된 CD24, N-CD24, SA-CD24, 및 N-SA-CD24에 대해 증가된 친화도 및 상이한 특이성을 나타내었다.
도 7. 폐암 세포주 NCI-H727(좌측 패널) 및 신경아세포종 세포주 IMR32(우측 패널)에 대해 시험된 다양한 친화도-성숙한 키메라 항-CD24 항체의 적정 분석. 시험된 최대 항체 농도는 최소 농도 0.01㎍/㎖에 대해 2X의 적정 인자로 5㎍/㎖이다. 염색되지 않은(0㎍/ml) 음성 대조군이 또한 도시되어 있다.
도 8. 상이한 CD24 글리코폼(glycoform) 및 항-CD24 항체 사이의 결합의 정량적 비교: 모(parental) PP6229 대 친화도 성숙된 PP6373. Fc 제거된 CD24를 ELISA 플레이트 상에 코팅하고, 이어서 주어진 용량의 PP6626(좌측 패널) 또는 PP6373(우측 패널)을 첨가하기 전에 완충제(CD24), NanA(SA-) 또는 NanA+N-글리칸스(glycanses)(SA-N-)로 처리하였다. 시험된 최대 농도는 최소 농도 0.02ng/ml에 대해 5x의 적정 인자로 7812.50ng/ml이었다.
도 9. 펩타이드 억제 분석을 통해 3B6 결합 부위를 맵핑. 시험된 5개의 중첩 CD24 펩타이드 중 단 하나(펩타이드 4)만이 항원성 에피토프를 함유한다.
도 10. 펩타이드 억제 분석을 통해 PP6373 결합 부위를 맵핑. 시험된 5개의 중첩 CD24 펩타이드 중 단 하나(SNSGLAPNT(서열 식별 번호 46))만이 항원성 에피토프를 함유한다.
도 11. 펩타이드 4 항원성 에피토프 서열로부터 절단된 펩타이드로 PP6373 에피토프를 맵핑. 데이터는 최적 에피토프가 서열 SNSGLAPN(서열 식별 번호 48) 내에 함유된다는 것을 나타낸다.
도 12. PP6373이 마우스 모델에서 생체 내(in vivo) 종양 생장을 감소시키는 것을 나타내는 플롯. 화살표로 표시된 2개의 시점에서 대조군 인간 IgG 또는 PP6373을 받은 촉진 가능한 폐암 이종이식편을 갖는 누드 마우스. 종양의 생장이 후속적으로 매주 측정되었다.
도 13. PP6373이 인간 종양 세포주 H727에 대한 세포 독성(ADCC)을 유도하는 것을 나타내는 플롯. H727 세포는 5㎍/ml로 PP6373 및 인간 IgG FC를 갖는 이펙터 세포 PBL과 공동 배양되어 ADCC를 유도했다.
도 14. 코어 푸코실화(core fucosylation)(d6873) 없는 PP6373이 PP6373보다 인간 종양 세포주 H727에 대한 더 높은 ADCC를 유도하는 것을 나타내는 플롯. H727 세포는 5㎍/ml로 d6373, PP6373 및 인간 IgG FC를 갖는 이펙터 세포 PBL과 공동 배양되어 ADCC를 유도했다.
도 15. PP6373-홀(hole) 및 OKT3-노브(knob) 조합이 PP6373-노브 및 OKT3-홀보다 더 높은 이중 특이성을 보이는 것을 나타내는 유동 세포 분석법(flow cytometry) 플롯이다. 저캇 세포(Jurkat cell)를 PP6373, OKT3, PP6373-노브 및 OKT3-홀, 또는 PP6373-홀 및 OKT3-노브로 형질감염된 293T 세포의 조직 배양 상청액으로 염색한 후, 비오티닐화된 SA-N-CD24 단백질과 배양하였다. PE-Steptavidin 신호는 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 3개의 독립적인 실험을 수행하였다.
도 16. PP633-OKT3이 OKT3-PP6373보다 더 높은 이중 특이적 활성을 유도함을 나타내는 유동 세포 분석 플롯. 저캇 세포를 플라스미드 결여(empty plasmid)(음성 대조군), PP6373-OKT3 또는 OKT3-PP6373으로 형질감염된 293T 세포의 조직 배양 상층액으로 염색한 후, 비오티닐화된 SA-N-CD24 단백질과 배양하였다. PE-Steptavidin 신호는 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 3개의 독립적인 실험을 수행하였다.
도 17. 이중 특이적 항체 PP633-OKT3이 항-종양 활성을 가짐을 나타내는 유동 세포 분석 플롯. 폐암 세포 H727 및 활성화된 인간 T 세포를 비-치료된 또는 플라스미드 결여(비-형질감염된), PP6373, OKT3, PP633-OKT3으로 형질감염된 293T 세포의 조직 배양 상층액과 1:5로 12시간 동안 배양시켰다. 조직 배양 배지에서 사이토카인(IFNr, TNF, IL10, IL6, IL4 및 IL2)을 유동 세포 분석법에 의해 측정하였다. 3개의 독립적인 실험을 수행하였다.
도 18. 이중 특이적 항체 PP633-OKT3이 T 세포에 의한 종양 세포의 세포 독성을 유도했음을 나타내는 유동 세포 분석 플롯이다. 폐암 세포 H727 및 활성화된 인간 T 세포를 비-처리된 또는 플라스미드 결여(비-형질감염된), PP6373, OKT3, PP633-OKT3으로 형질감염된 293T 세포의 조직 배양 상층액과 1:5로 12시간 동안 배양시켰다. 폐암 세포 및 인간 T 세포를 수집하고 항-인간 CD45 및 리브/데드(live/dead) 시약 아쿠아(Aqua)로 염색하였다. 종양 세포 수는 항-CD45 및 아쿠아의 이중 음수로 플롯팅 되었다. 3개의 독립적인 실험을 수행하였다.
도 19. FIT-Ig 유도된 높은 이중 특이적 활성의 유동 세포법 분석. 저캇 세포를 음성 대조군(비-형질감염된 293T 상등액) 또는 FIT-Ig로 염색한 후, 비오티닐화된 SA-N-CD24 단백질과 배양하였다. PE-Steptavidin 신호는 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다. 3개의 독립적인 실험을 수행하였다.
도 20. 유동 세포 분석법은 FIT-Ig가 PP633-OKT3 및 OKT3-PP6373보다 높은 항-종양 활성을 가짐을 나타낸다. 폐암 세포 H727 및 활성화된 인간 T 세포를 음성 대조군(비-형질감염된 293T 상청액), PP633-OKT3, OKT3-PP6373 또는 FIT-Ig와 함께 1:5로 12시간 동안 배양하였다. 조직 배양 배지에서 사이토카인(IFNr, TNF, IL10, IL6, IL4 및 IL2)을 유동 세포 분석법에 의해 측정하였다. 3개의 독립적인 실험을 수행하였다.
도 21. 유동 세포 분석법은 FIT-Ig가 T 세포에 의한 종양 세포의 세포독성을 유도함을 나타낸다. 폐암 세포 H727 및 활성화된 인간 T 세포를 음성 대조군(비-형질감염된 293T 상청액), PP633-OKT3, OKT3-PP6373 또는 FIT-Ig와 함께 1:5로 12시간 동안 배양하였다. 폐암 세포 및 인간 T 세포를 수집하고 항-인간 CD45 및 리브/데드 시약 아쿠아(Aqua)로 염색하였다. 종양 세포 수는 항-CD45 및 아쿠아(Aqua)의 이중 음수로 플롯팅 되었다. 3개의 독립적인 실험을 수행하였다.
도 22. 유동 세포 분석법은 FIT-Ig가 PP633-OKT3 및 OKT3-PP6373보다 높은 열 안정성을 가짐을 나타낸다. 모든 이중 특이적 항체 PP633-OKT3, OKT3-PP6373 및 FIT-Ig를 지시된 온도에서 20분 동안 배양하고, 5분 동안 l4000g으로 회전한 후 상층액을 저캇 세포 염색을 위해 사용하였다. 이어서 비오티닐화 SA-N-CD24 단백질을 저캇 세포와 함께 배양하고 PE-Steptavidin 신호를 유동 세포 분석법에 의해 측정하였다.
도 23. 항-CD24-scFv를 포함하는 CarT 구조체의 개략도.
도 24. 폐암 세포주 A549에 대한 CD24 CART 유도된 세포 독성의 플롯.
도 25. IFNγ의 생성에 의해 입증된 바와 같이 종양 세포주에 의한 CART 활성화의 플롯.
도 26. 다양한 종양 유형에 대한 CD24 CART의 항-종양 활성의 바 플롯. 제시된 데이터에 대한 E/T 비는 5이다.
도 27. 키메라 PP6373(FR:백색, CDR:밝은 회색) 및 VHv1VLv1(FR:회색, CDR:어두운 회색)의 3차원 구조적 정렬의 리본 다이어그램.
도 28. CD24-GST에 대한 발현 및 결합에 대한 상이한 항체 쌍의 상대적 효능의 플롯.
도 29. 인간 종양 세포주 NCI-H727(상부) 및 IMR32(바닥)에 대한 H2L3 및 H3L3 결합의 플롯. 도시된 데이터는 넓은 범위의 항체가 사용될 때 평균 형광 강도이다.
도 30. 세포사(cell death) 플롯은 저농도 HL33이 ADCC에서 PP6373보다 더 강력하다는 것을 나타낸다. 폐암 세포주 A549를 표적으로 사용하였고, 인간 PBL을 이펙터(effector)로 사용하였다. 사용된 항체의 용량은 3㎍/ml(상부 패널) 또는 9㎍/ml(바닥 패널)이었다.
도 31. 세포사 플롯은 H3L3이 폐암 세포주 A549 및 NCI-H727 및 신경아세포종 세포주 IMR-32를 포함하는 다수의 종양 세포주에 강력한 ADCC 활성을 부여함을 나타낸다. 인간 PBMC는 이펙터 세포로서 사용되었다.
도 32. 세포사 플롯은 H3L3이 폐암 세포주 A549 및 NCI-H727 및 신경아세포종 세포주 IMR-32를 포함하는 다수의 종양 세포주에 강력한 ADCC 활성을 부여함을 나타낸다. 인간 PBMC로부터 정제된 NK 세포는 이펙터 세포로서 사용되었다.
도 33. 유동 세포 분석법 분석은 인식된 글리칸 차폐된 에피토프가 B 세포, 적혈구 세포를 인식하지 않고 호중구와 저조하게 상호작용하는 항체를 나타낸다.
종양 발현된 에피토프의 표적화는 종양의 치료에 널리 채택되고 있는 접근법이다. 그러나 많은 이러한 에피토프는 정상적인 조직에서도 발현되기 때문에 우수한 약물 표적을 만들지 못하는데, 이는 독성 문제를 야기할 수 있기 때문에다. 이상적인 종양-특이적 항원(Tumor-Specific Antigen)(TSA)은 종양에서 광범위한 발현을 갖지만, 필수적인 숙주 기관에서는 최소 또는 전혀 발현되지 않을 것이다. 덜 이상적이지만 동일하게 작업할 수 있는 TSAs의 속성은 정상 대 종양 조직, 소위 종양-관련 항원(Tumor-Associated Antigen)(TAA)에서 발현되지만 차별적으로 변형된 것이다. 잘 특성화된 종양 항원의 예는 MAGE-A3, MUC-L 및 NY-ESO 1이다.
신규한 TSAs 및 TAAs의 동정(idenfication)은 특히 종양 항원이 현재 존재하지 않는 종양에 대한 새로운 또는 보다 효과적인 종양 치료의 개발에 있어서 제한 인자이다. CD24는 다음과 같은 이유로 우수한 종양 표적이다: 그것은 모든 인간 종양의 70% 이상에서 광범위하게 과-발현되어 종양에서 차등적으로 글리코실화되고, 그것은 종양원성으로 나타나서 다양한 종양에서 불량한 예후 및 상당히 더 짧은 환자 생존과 관련되며, 그것은 새로운 종양을 발생시킴으로써 재발 및 전이를 일으킬 수 있는 종양 줄기세포에 대한 마커이다. 본 발명자들은 CD24에 대한 결합이 정상 세포에서 발생하지만 종양 세포에서는 발생하지 않는 글리코실화에 의해 차단되는 항-CD24 항체를 발견하였다. 그 결과, 항체는 종양 세포주 및 종양 조직에 결합하지만, 다양한 정상 조직 및 조혈 세포에 대한 최소 반응성을 갖는다.
항체 및 이의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment)이 본원에 제공된다. 항체는 단일 클론 항체, 인간 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체일 수 있다. 항체는 단일 특이적, 이중 특이적, 삼중 특이적 또는 다중 특이적 항체일 수 있다. 항체의 항원-결합 단편은 CD24, 및 특히 인간 CD24에 면역특이적으로 결합할 수 있으며, 바람직하게는 내인성 또는 형질감염된 농도에서 살아있는 세포의 표면에서 발현된다. 항원-결합 단편은 CD24에 결합할 수 있다. 항체는 검출 가능하게 표지되거나, 또는 결합(conjugated) 독소, 약물, 수용체, 효소 또는 수용체 리간드를 포함할 수 있다.
유도 종양 표적화에 부가하여, 면역 시스템은 실험 모델 시스템 및 환자에서 종양을 인식하고 제거하는 능력을 갖는다. 결과적으로, 종양 면역치료는 종양 치료의 가장 유망한 영역 중 하나로서 출현하고 있다. 활성 종양 면역치료는 (PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4에 대한 항체를 포함하는) 자연 면역 반응을 증폭시키는 제제; 종양 및 면역 이펙터 T 세포를 브리지(bridge) 하는 항체와 같은 이중-특이적 분자; 또는 생체 외(ex vivo) 자극된 종양 침투 림프구(TILs), 활성화된 내추널 킬러(natural killer)(NK) 세포, 또는 유전적으로-조작된 T 세포(키메라 항원 수용체(CARs) 및 T 세포 수용체(TCR) 변형된 T 세포)를 사용하는 채택 가능한 세포 전달(adoptive cell transfer)(ACT)을 포함한다. 이들 기술 중 다수는 특이성 및 효능에 대한 종양 표적화 성분을 필요로 한다.
1. 정의
본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시 양태를 설명하기 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "한(a)", "한(an)" 및 "그(the)"는 문맥상 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 숫자 값과 연관되어 있는 단어 "약"은 그 값의 합리적인 근사를 나타낸다. 어떤 경우에는, "약"은 관련된 특정 값의 10% 이내인 것으로 해석될 수 있다. 예를 들어, 어구 "약 100"은 90과 110 사이의 임의의 값을 포함할 것이다.
여기서 수치 범위를 인용하기 위해, 동일한 정도의 정밀도로 사이에 개재되는 각각의 사이에 있는 숫자가 명시적으로 고려된다. 예를 들어, 6-9의 범위에 대해, 6 및 9와 함께 숫자 7 및 8이 고려되며, 6.0-7.0의 범위에 대해, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명시적으로 고려된다.
질병으로부터 동물을 보호하는 것을 참조할 때, "치료" 또는 "치료하는"은 질병의 예방, 억제, 억압, 또는 완전히 제거하는 것을 의미한다. 질병을 예방하는 것은 본 발명의 조성물을 질병의 발병 전에 동물에게 투여하는 것을 포함한다. 질병을 억제하는 것은 본 발명의 조성물을 질병의 유도 후 그러나 이의 임상적 출현 전에 동물에게 투여하는 것을 포함한다. 질병의 억압은 본 발명의 조성물을 질병의 임상적 출현 후에 동물에게 투여하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 "가변 영역" 항원 인식 부위를 갖는 면역글로불린 분자를 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "가변 영역"은 (항체 Fc 도메인과 같은) 항체에 의해 광범위하게 공유되는 도메인으로부터 면역글로불린의 도메인을 구별하도록 의도된다. 가변 영역은 그 잔기가 항원 결합을 담당하는 "초가변 영역"을 포함한다. 초가변 영역은 경쇄 가변 도메인에서 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(즉, 전형적으로 경쇄 가변 도메인에서 대략 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 대략 잔기 27-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3), 및 중쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3))를 포함한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 용어 항체는 단일 클론 항체, 다중-특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 카멜리드(camelid) 항체, 단일 사슬 항체, 이황화물-결합된 Fvs(sdFv), 세포 내 항체(intrabody) 및 항-이디오타입(항-id)항체(예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 및 항-항-Id 항체를 포함함)를 포함한다. 특히, 이러한 항체는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역글로불린 분자를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 항체의 "항원 결합 단편"이라는 용어는 항체의 CDR 및 선택적으로 항체의 "가변 영역" 항원 인식 부위를 포함하는 프레임워크 잔기를 함유하는 항체의 하나 이상의 부분을 지칭하며, 항원에 면역특이적으로 결합하는 능력을 나타낸다. 이러한 단편은 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 체인(ScFv), 및 이의 돌연변이체, 자연 발생 변이체, 및 항체의 "가변 영역" 항원 인식 부위 및 이종 단백질(예를 들어, 독소, 상이한 항원에 대한 항원 인식 부위, 효소, 수용체 또는 수용체 리간드 등)을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단편"은 적어도 5개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 10개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 15개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 25개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 40개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 50개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 60개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 70개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 80개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 90개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 100개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 125개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 150개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 175개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 200개의 인접한 아미노산 잔기, 또는 적어도 250개의 인접한 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다.
인간, 키메라 또는 인간화 항체는 인간에서 생체 내(in vivo ) 사용에 특히 바람직하지만, 쥣과(murine) 항체 또는 다른 종의 항체는 많은 용도(예를 들어, 시험관 내(in vitro) 또는 원 위치(in situ) 검출 분석, 생체 내 사용 등)에 유리하게 사용될 수 있다.
"키메라 항체"는 항체의 상이한 부분이 비-인간 항체 및 인간 면역글로불린 불변 영역으로부터 유도된 가변 영역을 갖는 항체와 같은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유도되는 분자이다. 비-인간 종으로부터 하나 이상의 CDRs 및 인간 면역글로불린 분자로부터 프레임워크 영역을 포함하는 키메라 항체는, 예를 들어, CDR-그래프팅(grafting)(EP 239,400; 국제 공개 번호. WO 91/09967호; 및 미국 특허번호 제5,225,539호, 제5,530,101호, 및 제5,585,089호, 이들 각각의 내용은 본원에 전적으로 포함됨), 버니어링(veneering) 또는 리서페이싱(resurfacing)(EP 592,106; EP 519,596, 이들 각각의 내용은 본원에 참고로 포함됨), 및 사슬 셔플링(chain shuffling)(미국 특허번호 제5,565,332호, 이들 각각의 내용이 본원에 참고로 포함됨)을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간화 항체"는 인간 프레임워크 영역 및 비-인간(일반적으로 마우스 또는 쥐) 면역글로불린으로부터 하나 이상의 CDRs을 포함하는 면역글로불린을 지칭한다. CDRs을 제공하는 비-인간 면역글로불린은 "도너(donor)"라 불리고, 프레임워크를 제공하는 인간 면역글로불린은 "억셉터(acceptor)"라 불린다. "불변 영역"은 존재할 필요는 없지만, 이들이 존재하는 경우, 이들은 인간 면역글로불린 불변 영역과 실질적으로 동일, 즉 적어도 약 85-90%, 바람직하게는 약 95% 이상 동일해야만 한다. 따라서, 아마 CDRs를 제외한, 인간화 면역글로블린의 모든 부분은 자연 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 부분과 실질적으로 동일하다. 인간화 항체는 인간화 경쇄 및 인간화 중쇄 면역글로불린을 포함하는 항체이다. 예를 들어, 인간화 항체는, 예를 들어, 키메라 항체의 전체 가변 영역은 비-인간이기 때문에, 통상의 키메라 항체를 포함하지 않을 것이다. 도너 항체는, 결과적인 인간화 항체가 CDRs를 제공하는 도너 항체와 동일한 항원에 결합할 것으로 예상되기 때문에, "인간화"의 과정에 의해 "인간화된" 것으로 지칭될 수 있다. 대부분, 인간화 항체는, 수용체의 초가변 영역 잔기가 마우스, 쥐, 토끼 또는 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종(도너 항체)으로부터의 초가변 영역 잔기로 대체되는, 인간 면역글로불린(수용체 항체)이다. 일부 경우에는, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용체 항체 또는 도너 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하도록 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모든 하나 이상의, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FRs는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 면역글로블린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 것이며, 전형적으로는 FcγRIIB 폴리펩타이드에 면역특이적으로 결합하고, 아미노산 잔기 치환, 삭제 또는 첨가(즉, 돌연변이)의 도입에 의해 변경된 인간 면역글로불린의 것이다.
2. 항-CD24 항체 조성물
CD24의 종양-특이적 글리코폼을 특이적으로 표적할 수 있는 항-CD24 항체가 본원에 기재된다. 항-CD24 항체는 항체-약물 접합체(conjugate), ADCC-강화 치료 항체, 이중-특이적 항체, CAR-T 치료 및 TCR 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 종양-치료를 개발하는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종양 세포에 노출되지만 비-종양 세포에는 노출되지 않는 글리칸-차폐된 에피토프에 결합할 수 있다. 그리고 특히, 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아미노산 서열 SNSGLAPN(서열 식별 번호 48)을 포함하는 CD24 펩타이드에 결합할 수 있다.
항-CD24 항체는 서열 식별 번호 1에 표시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호 2에 표시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있는 3B6일 수 있다. 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 3B6의 친화도 성숙된 버전일 수 있고, 서열 식별 번호 3-10에 표시된 서열 중 어느 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호 11-16에 표시된 서열 중 어느 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 식별 번호 6에 표시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호 16에 표시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있는 PP6373일 수 있다. 인간에서 치료적 적용을 위해, 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PP6373의 인간화 버전일 수 있고, 서열 식별 번호 29-32에 표시된 서열 중 어느 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호 33-36에 표시된 서열 중 어느 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 특히, 인간화된 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 식별 번호 30에 표시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 식별 번호 35에 표시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있는 H2L3일 수 있거나; 서열 식별 번호 31에 표시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호 35에 표시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 포함할 수 있는 H3L3일 수 있다.
3. 항체-약물 접합체 조성물
종양 표적화 항체는 종양의 생활 현상(biology)에 영향을 미치는 것에 의해 종양들의 생장을 직접적으로 방지하거나 제한하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간화 항-VEGF 단일 클론 항체(베바시주맙(bevacizumab); 아바스틴(Avastin))는 VEGF-유도된 종양 혈관형성을 방지함으로써 종양 생장을 차단한다. 다른 종양 표적화 항체는 항체 자체의 변형을 통해 종양 세포 생장을 억제 또는 종양 세포를 죽이는 데 사용된다. 예를 들어, 종양-표적화된 면역접합체는 공유 가교-결합 또는 유전적 융합에 의해 함께 결합된 항체 및 이펙터 모이어티(moiety)로 구성된다. 이펙터 모이어티는 세포독성 약물(항체-약물 접합체), 단백질 독소(면역독소), 또는 방사성 핵종(방사성 면역접합체)일 수 있다. 항체-약물 접합체의 예는 브렌튜시맙 베도틴(brentuximab vedotin)(ADCETRIS®, Seattle Genetics)이며, 이는 3 내지 5단위의 세포 분열 저지제 모노메틸 아우리스타틴 E(mononmethyl auristatin E)(MMAE, 약물 명칭에서 'vedotin'에 의해 반영됨)에 결합된 키메라 단일 클론 항체 브렌튜시맙(cAClO, 이는 세포-막 단백질 CD30을 표적화 한다)으로 구성된다.
항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 약물 접합체, 면역독소 또는 방사성 면역접합체에 포함될 수 있다. 이러한 조성물의 항-CD24 표적화 성분은 정상 세포 및 조직의 노출을 제한하면서 종양 세포 및 조직에 대한 접합체의 특이적 전달을 가능하게 할 수 있고, 따라서 표적 독성을 방지한다.
4. ADCC 항체 조성물
항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 중 하나를 포함하는 항체 조성물은 항체-매개된 세포 독성(ADCC) 및 항체-매개된 세포 식세포(ADCP) 중 적어도 하나를 통해 종양 세포 사멸을 자극하는 데 사용될 수 있다. ADCC는 신체의 면역 세포(이펙터 세포)의 특정 세트가 표적 세포(예를 들어, 병원체)를 능동적으로 결합하여 용해[분리] 시키는 면역 방어 메커니즘이다. ADCC는 중요한 세포-매개된 선천성 면역 반응으로서 확인되었고 병원체에 대한 인체의 제일선 방어로 기능하며 감염을 제한 및 함유하도록 작용한다. ADCC 과정은 비-식작용 과정을 통해 항체-코팅된 표적 세포를 사멸하도록 설계되며, 세포 독성 과립의 표적화된 방출 또는 세포사-유도 분자의 발현에 의해 특징지어진다. ADCC는 전형적으로 숙주 세포의 특이적 항체(대부분 IgG 클래스)가 표적 세포의 막-표면 항원을 인식하여 결합하고, 동시에 이펙터 세포 표면상의 Fc 수용체(FcR)와 결합할 때 개시된다. ADCC를 매개하는 가장 일반적인 이펙터 세포는 내추럴 킬러(NK) 세포이지만, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구 및 수지상 세포는 또한 ADCC 반응을 매개할 수 있다. 비록 ADCC가 다소 빠른 반응이지만, 효능은 표적 세포의 표면상의 항원 밀도 및 항원-항체 상호작용의 친화도 뿐만 아니라 Fc 수용체 패밀리의 가변적 구성원과의 항체 상호작용을 결정하는 Fc 단편의 특성에 따라 달라진다.
표적 세포상의 특정 세포 표면 수용체에 대한 항체의 결합, 옵소닌화(opsonization) 이라고 하는 과정은 ADCC 과정의 핵심 이벤트이다. 옵소닌화 과정은 식세포를 표적 세포로 유인하고 식작용을 개시할 수 있다. 또한, 식세포상의 FcRs에 대한 항체 Fc 영역의 결합은 C3b, 즉 보체 성분 3의 절단된 산물의 형성을 용이하게 하며, 이는 표적 세포를 옵소닌화 한 항체의 흡입(engulfment)을 개시하는 중요한 단백질이다. 항체 매개된 식작용은 또한 종종 항체-의존성 세포-매개된 식작용(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis)(ADCP)으로 불린다. 그러나 ADCC의 경우, 병원체는 파괴되도록 식균 될 필요가 없다. 전술한 바와 같이, 세포독성 이펙터 세포의 표면상의 FcR은 ADCC를 유도하기 위한 키(key)이다. 인간에서, ADCC를 유도할 수 있는 가장 중요한 FcR 클래스는 FcγRI(CD64), FcγRIIa 및 FcγRIIc(CD32), 및 FcγRIIIa(CD16)이다. 그러나 FcγRIIb 수용체는 ADCC 반응을 억제한다. 따라서 FcγRs로부터의 활성화 신호와 억제 신호 사이의 균형은 ADCC 반응의 크기에 대한 중요한 결정기이다. 표적의 인식시에, 특수화된 세포 내 과립(또한, 분비 리소좀으로 명명됨)은 칼슘-의존성 분극된 엑소세포적(exocytotic) 과정에서 세포독성 이펙터 세포에 의해 방출된다. 퍼포린(perforin), 싸이토라이신(cytolysin) 및 그랜자임 B(granzyme B)는 과립으로부터 방출되는 주요 성분이다. 퍼포린이 삽입되어 표적 세포막 내에 공극을 형성한다. 이 과정은 칼슘을 필요로 한다. 그랜자임 B는 표적 세포 DNA의 단편화를 야기한다. ADCC에 의해 작용하는 치료 항체의 예는 트랜스튜쥬맙(transtuzumab)(Herceptin, Genentech)이다. 트랜스튜주맙 HER2를 표적하며, 이는 보다 많은 수의 유방암에서 비정상적으로 높은 수준으로 발현되며, 종종 HER2 양성 유방암이라고 불리며, 숙주에서 ADCC를 유도함으로써 HER2-양성 유방암의 생장을 억제한다.
ADCC 매개된 활성을 위해 사용되는 항체는 일반적으로 이들의 ADCC 활성을 강화시키기 위해 몇몇 종류의 변형을 필요로 한다. 항체의 Fc 영역에서의 올리고당이 임의의 푸코오스 당 단위를 갖지 않도록 항체를 조작(engineering)하는 것을 통상적으로 포함하는 가용할 수 있는 다수의 기술이 있으며, 이는 FcγIIIa 수용체에 대한 결합을 개선시킨다. 아푸코실화된(Afucosylated) 항체는 증가된 항체-의존성 세포 독성(ADCC)을 나타낸다. 예를 들어, Biowa's Potelligent® 기술은 100% 아푸코오실화 항체를 생산하기 위해 FUT8 유전자 녹아웃(knockout) CHO 세포주를 사용한다. FUT8은 GDP-푸코오스로부터 복합형 올리고당의 a1, 6-결합(linkage)에서의 GlcNAc로의 푸코오스의 전달을 촉매하는 a1, 6-푸코실트랜스퍼라아제(a1, 6-Fucosyltransferase)를 코딩하는 유일한 유전자이다. 프로바이오젠(Probiogen)은 FUT 녹아웃을 통하지는 않지만, MAbs상에 더 낮은 수준의 푸코실화된 글리칸을 생성하도록 조작되는 CHO 세포주를 개발하였다. 프로바이오젠 시스템은 데-노보(de-novo) 푸코오스 합성 경로를 세포에 의해 대사될 수 없는 당-뉴클레오티드로 재배향시키는 박테리아 효소를 도입한다. 대안적인 접근법으로서, 시애틀 제네틱스(Seattle Genetics)는 CHO(및 아마도 다른) 세포주에서 생산된 MAbs상에 더 낮은 수준의 푸코실화된 글리칸을 생산할 수 하는 독점 공급 시스템을 갖는다. 젠코르(Xencor)는 종양 및 다른 병적 세포의 면역계의 제거를 개선하도록 설계된 XmAb Fc 도메인 기술을 개발했다. 이 Fc 도메인은 2개의 아미노산 변화를 가지며, 이는 FcγRIIIa에 대해 40배 더 큰 친화도를 초래한다. 이는 또한 대식세포와 같은 다른 이펙터 세포의 모집을 위한 잠재력을 가지며, FcγRIIa에 대한 친화도를 증가시키고, 이는 이물질을 흡입(engulfing) 및 소화(digesting)함으로써 면역성의 역할을 한다.
항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ADCC-매개된 종양 킬링 항체에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물의 항-CD24 표적화 성분은 정상 세포 및 조직을 할애하면서 ADCC-매개된 파괴를 위한 종양 세포의 특이적 전달 표적화를 허용할 수 있다. 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 ADCC 활성은 본원에 기술된 하나 이상의 변형에 의해 향상될 수 있다.
5. 이중-특이적 항체 조성물
또한, 제 2 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 브리지된 제 1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 제 1 항체 도메인을 포함하는 이중-특이적 항체가 본원에 제공된다. 제 1 항체 도메인은 본원에 기재된 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있으며, 제 2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다른 면역-자극 분자에 결합할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 제 2 항체 도메인은 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 이 경우, 이중-특이적 항체는 CD24의 종양-특이적 글리코폼을 발현하는 종양 세포를 특이적으로 표적화할 수 있는 반면, 세포독성 T 세포상에서 CD3에 동시에 결합함으로써, T 세포가 종양을 침투하여 종양 세포독성을 유도하는 종양 부위로 T 세포를 유인한다. 세포독성 T 세포 또는 다른 이펙터 세포를 종양 부위로 유인하기 위한 목적으로 이중-특이적 항체에 사용하기 위한 파트너 항체의 다른 예는 당업계에 공지되어 있다.
제 2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상보적인 항-종양 경로 또는 메커니즘을 표적화 할 수 있다. 제 2 항체 도메인은 자연 면역 반응을 증폭시키는 종양 면역치료 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 이러한 종양 면역치료 항체의 예는 항-PD-1, 항-B7-H1, 항-B7-H3, 항-B7-H4, 항-LIGHT, 항-LAG3, 항-TIM3, 항-TIM4 항-CD40, 항-OX40, 항-GITR, 항-BTLA, 항-CD27, 항-ICOS 또는 항-4-1BB를 포함한다. 이러한 항체는 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 제 2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TCR-α 사슬, TCR-β 사슬, TCR-γ 사슬, 또는 TCR-δ 사슬에 결합할 수 있다.
이중-특이적 항체는 서열 식별 번호 17 및 18에 표시된 서열, 또는 서열 식별 번호 23-27 및 37-41에 표시된 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
당업계에 공지된 많은 상이한 이중-특이적 항체 기술이 있다. 이들 대부분은 2개의 성분 항체가 단일 사슬 형태로 존재하여 2개의 부분이 단일 구조로 발현될 수 있는 것을 요구한다. 바람직한 방법은 항체를 단일-사슬 가변 단편(scFv)으로서 발현시키는 것이다. 이중-특이적 항체 기술의 비-제한적 예는 BiTE(Bi-specific T-cell Engager: 이중-특이적 T-세포 인게이저용), DART(Dual-Affinity Re-Targeting: 이중 친화도 재-표적화용), Fabs-인-탠덤 면역글로불린(Fabs-in-tandem immunoglobulin)(FIT-Ig), 및 노브-인투-홀(knobs-into-holes)을 포함한다. 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이러한 이중-특이적 항체는 본원에서 구체적으로 고려된다.
6. CAR-T 치료 조성물
키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor)(CAR) T-세포 치료, 또는 CAR-T 치료는 종양 환자의 T 세포가 생체 외에서 유전적으로 변형되어 CAR 단백질을 발현하여 종양 세포를 공격할 수 있는 세포 치료의 한 유형이다. 특히, T 세포는 환자의 혈액으로부터 취해지고, 이는 특히 환자 자신의 혈액(자가유래)일 수 있고, 재조합 CAR 수용체를 발현하는 유전자 구조물로 형질감염된다. 그 후, 많은 수의 CAR T 세포를 실험실에서 성장시키고, 환자의 종양 세포를 표적화하고 파괴할 수 있는 환자에게 다시 주입시킨다. 또한, T 세포는 매치된 도너로부터 또는 만능, 또는 "기성 제품" T 세포주로부터의 동종이형(allogeneic)일 수 있으며, 여기서 동종이형 T 세포의 TCR 유전자 및 HLA 클래스 I 유전자좌 중 하나 이상은 파괴되어, 그 결과 T 세포는 동종 항원을 인식할 수 없다.
CAR 단백질 구조물은 전형적으로 다음의 코어 구성요소를 포함하는 모듈형 구조를 갖는다: 항체로부터 유도되고, 힌지/스페이서 펩타이드에 결합된 세포 외 단일-사슬 가변 단편(scFv) 및 T 세포 수용체의 세포 내 T 세포 시그널링 도메인에 추가로 연결된, 막횡단 도메인(transmembrane domain)을 포함한다. scFv는 표적화 요소이고 CAR T 세포의 표면상에서 발현되어 항원 특이성을 부여한다. 스페이서는 세포 외 표적화 요소를 막횡단 도메인에 연결시키고 CAR 기능 및 scFv 유연성에 영향을 미친다. 막횡단 도메인은 세포막을 횡단하고, CAR을 세포 표면에 고정시키고,세포 외 도메인을 세포 내 시그널링 도메인에 연결시켜, 세포 표면상의 CAR의 발현에 영향을 미친다. 공동 자극성 도메인은 CD28 및 4-1BB와 같은 공동 자극성 단백질의 세포 내 시그널링 도메인으로부터 유도되어, 사이토카인 생산을 향상시킨다. CD3 제타(zeta) 도메인은 T 세포 수용체의 세포 내 시그널링 부분으로부터 유도되고, 이는 T 세포 활성화 동안 하류 시그널링(downstream signaling)을 매개한다. CAR-T 치료의 예는 B 세포 표면 항원 CD19(예를 들어, JCAR017 및 JCAR014 [Juno Therapeutics]), CTL019(tisagenlecleucel-T(KymriahTM) [Novartis]) 및 KTE-C19(axiabtagene Ciloleucel(Yescarta®) [Kite Pharma]), 및 CD22(JCAR014 [Juno Therapeutics])를 표적화하는 것을 포함한다. CAR-T 치료의 다른 예는 L1-CAM(JCAR023 [Juno Therapeutics]), ROR-1(JCAR024 [Juno Therapeutics]) 및 MUC16(JCAR020 [Juno Therapeutics])를 표적화하는 것을 포함한다.
CAR의 scFv 부분은 중요한 성분이고, 벗어난 표적 독성과 관련된 정상 세포에 대한 활성을 방지하면서 종양 세포에 대한 특이성을 보장한다. 따라서, scFv 부분은 전형적으로 종양 세포상에서 특이적으로 발현되는 표적 단백질을 인식하는 항체의 부분으로부터 유도되지만, 다른 세포 및 조직에서는 덜 빈번하게, 이상적으로는 전혀 발현되지 않는다. 따라서, 본원에 기재된 항-CD24 항체 중 임의의 것으로부터 유도된 scFv 단편은 재조합 CAR 단백질의 종양 표적화 성분으로서 사용될 수 있다. 특히, scFv 단백질은 서열 식별 번호 28에 표시된 서열을 포함할 수 있다.
CAR T 세포는 급성 림프모세포성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia)(ALL), B-세포 급성 림프모세포성 백혈병(B-cell Acute Lymphoblastic Leukemia), 성인 골수성 백혈병(adult myeloid leukemia)(AML), 확산 큰 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma)(DLBCL), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin Lymphoma)(NHL), 만성 림프구성 백혈병(Chronic Lymphocytic Leukemia )(CLL), 1차 종격 B-세포 림프종(primary mediastinal B-cell lymphoma)(PMBCL), 맨틀 세포 림프종(mantle cell lymphoma)(MCL), 및 다발성 골수종(multiple myeloma)(MM)과 같은 혈액학적 종양에 대한 인상적인 효과를 입증하였다. 그러나 CAR-T 치료는 지금까지 고형 종양에 대한 제한된 효과만을 입증하였다. 종양 및 정상 조직에서 CD24의 특징적인 발현 패턴으로 인해, CD24 CAR-T를 사용하여 생성된 데이터는 표적화 될 수 있는 종양의 유형이 뇌종양, 두경부암, 육종, 폐암, 위장암, 유방암, 고환암, 전립선암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암 또는 혈액학적 악성종양을 포함하지만 이에 한정되지 않는 것으로 입증되었다.
7. TCR 치료 조성물
CAR-T 치료와 유사하게, 유전적으로 변형된 T 세포 수용체 치료(TCR)는 종양 환자의 T 세포가 생체 외에서 유전적으로 변형되어 변형된 TCR을 발현하여 T 세포 수용체의 능력을 향상시켜 T 세포 수용체가 환자에게 다시 주입될 때 특이적 항원성 세포 항원을 인식하고 공격하는 세포 치료의 한 유형이다. 그러나 표면에서 발현되는 단백질을 인식하는 CAR T 세포와 달리, 유전자-변형된 TCRs를 사용하는 T 세포 면역치료는 고형 종양을 향해 더욱 표적화 되었다. TCRs는 세포 내부의 종양-특이적 단백질을 인식할 수 있다. 종양-특이적 단백질이 단편으로 파괴될 때, 이들은 세포 표면상에서 주요 조직적합성 복합체 또는 MHC라고 불리는 다른 단백질로 나타난다. TCRs는 종양-특이적 단백질 단편/MHC 조합물을 인식하도록 조작된다. TCR 변형된 T 세포에 대한 표적의 예는 KITE-718(Kite Pharma)과 같은 MAGE-A3, JTCR016(Juno Therapeutics)와 같은 Wilms tumor antigen 1(WT-1), 및 NY-ESO　1을 표적화하는 것을 포함한다.
TCR은 2개의 서브유닛, TCRα 및 TCRβ로 이루어진 이종이량체(heterodimer)이다. 각 서브유닛은 T-세포막 옆에 놓여 수용체를 세포막에 고정시키는 불변 영역, 및 항원 인식에서 기능하는 초가변 영역을 함유한다. 따라서, 본원에 기재된 임의의 항-CD24 항체로부터 유도된 scFv 단편은 재조합 TCR 단백질의 종양 표적화 요소로서 사용될 수 있다. 특히, scFv 단백질은 서열 식별 번호 28에 표시된 서열을 포함할 수 있다.
8. 펩타이드 조성물
본원에 기재된 항-CD24 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 종양 세포에서 노출되지만 비-종양 세포에는 노출되지 않는 글리칸 차폐된 에피토프에 결합할 수 있다. 구체적으로, 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아미노산 서열 SNSGLAPN(서열 식별 번호 48)을 포함하는 CD24 펩타이드에 결합할 수 있다. 따라서, 서열 식별 번호 48에 표시된 서열을 포함하는 펩타이드는 서열 식별 번호 48에 표시된 서열 세트의 코어 서열을 포함하는 에피토프에 결합하는 항-CD24 항체를 중화시키는데 사용될 수 있다. 이는 중화 항체를 검출하기 위한 항-약물 항체 분석에서 사용될 수 있다. 서열 식별 번호 48에 표시된 서열 세트를 포함하는 펩타이드는 서열 식별 번호 48에 표시된 서열의 코어를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체와 관련된 잠재적인 부작용을 억제하는데 사용될 수 있다. 펩타이드는 D-아미노산의 사용, 하나 이상의 펩타이드-결합에서 O를 S로 치환, 용해도 또는 반감기를 개선시키기 위한 융합 서열의 첨가(예를 들어, 알부민 융합체)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 사용 방법을 사용하여 생체 내 사용에 대해 더욱 안정성을 위해 변형될 수 있다, 또 다른 실시 양태에서, 서열 식별 번호 48에 표시된 서열을 포함하는 분자는 종양의 치료 및 예방을 위한 백신으로서 사용될 수 있다.
9. 치료 방법
본원에 기술된 이러한 항체 조성물을 포함하는 항-CD24 항체 조성물 또는 세포 치료는 종양 또는 다른 비정상적인 증식성 질병을 치료 또는 방지하는데 사용될 수 있다. 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 것을 포함하는 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있는, 이를 필요로 하는 환자에 이러한 용도의 방법이 본원에 제공된다. 이러한 분자 및 약학적 조성물은 또한 종양 또는 다른 비정상적인 증식성 질병을 치료 또는 방지하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "종양"은 세포의 비정상적인 제어되지 않은 생장으로 인한 신생물 또는 종양을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 종양은 백혈병 및 림프종을 명시적으로 포함한다. 상기 용어는 말단 부위에 전이하기 위한 잠재력을 갖는 세포를 포함하는 질병을 의미한다. 환자는 인간일 수 있다.
종양 또는 다른 비정상적인 증식성 질병은 다음의 하나 이상의 (그러나 이에 제한되지 않는) 것일 수 있다: 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 신장, 위, 경부, 갑상선 및 피부의 것을 포함하는 암종; 편평 세포 암종; 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 버켓(Burkett) 림프종을 포함하는 림프계 계통의 조혈 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병 및 전골수종 백혈병을 포함하는 골수성 계통의 조혈 종양; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 흑색종, 생식 세포종, 기형 암종, 신경아세포종 및 신경교종을 포함하는 다른 종양; 성상세포종, 신경아세포종, 신경교종 및 신경집종을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 종양; 섬유육종, 횡문근육종 및 골육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 및 흑색종, 색소성 건피증, 각질극 세포종, 생식 세포종, 갑상선 모낭 암 및 기형 암종을 포함하는 다른 종양. 또한, 아포톱시스(apoptosis)의 일탈(aberration)에 의해 야기되는 종양도 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 처리될 수 있음이 고려된다. 이러한 종양은 모낭 림프종, p53 돌연변이를 갖는 암종, 유방, 전립선 및 난소, 및 가족성 선종 폴립증과 같은 전암성 병변의 호르몬 의존성 종양, 및 골수이형성 증후군을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 난소, 방광, 유방, 결장, 폐, 피부, 췌장, 또는 자궁에서 악성종양 또는 이상 증식성 변화(변질 형성 및 형성 장애), 또는 과증식성 질병이 치료 또는 방지된다. 종양은 또한 육종, 흑색종 또는 백혈병일 수 있다.
항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 현재 표준 및 실험적 화학 치료, 호르몬 치료, 생물학적 치료, 면역치료, 방사선 치료, 또는 수술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 다른 항-종양 치료와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종양, 자가면역 질병, 감염성 질병 또는 중독의 치료 및/또는 방지를 위해 당업자에게 공지된 하나 이상의 제제, 치료 항체 또는 다른 제제의 치료적 또는 예방적 유효량과 조합하여 투여될 수 있다. 이러한 제제는, 예를 들어, 전술한 생물학적 반응 개질제, 세포 독소, 항대사물질, 알킬화제, 항생제, 또는 항-유사분열제, 및 면역치료제를 포함한다.
항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 항-종양 면역치료와 조합하여 사용될 수 있다. 항-종양 면역치료는 대안적인 면역조절 경로(예를 들어, TIM3, TIM4, OX40, CD40, GITR, 4-1-BB, B7-H1, PD-1, B7-H3, B7-H4, LIGHT, BTLA, ICOS, CD27 또는 LAG3)를 파괴 또는 강화시키는, 또는 사이토카인(예를 들어, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, GF-beta, IFNg, Flt3, BLys) 및 케모카인(예를 들어, CCL21)과 같은 이펙터 분자의 활성을 조절하여 면역조절 효과를 향상시키는 분자를 포함할 수 있다. 구체적인 실시 양태는 항-CD24 항체 또는 이의 항체 결합 단편 및 항-PD-1(pembrolizumab(Keytruda®) 또는 nivolumab(Opdivo®)), 항-B7-H1(atezolizumab(Tecentriq®) 또는 durvalumab), 항-B7-H3, 항-B7-H4, 항-LIGHT, 항-LAG3, 항-TIM3, 항-TIM4 항-CD40, 항-OX40, 항-GITR, 항-BTLA, 항-CD27, 항-ICOS 또는 항-4-1BB를 포함하는 이중-특이적 항체를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 더 광범위한 면역 반응을 달성하기 위해 면역 반응의 상이한 단계 또는 양태를 활성화시키는 분자와 함께 투여될 수 있다. 더욱 바람직한 실시 양태에서, 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 자가면역 부작용을 악화시키지 않으면서 항-PD-1 또는 항-4-1BB 항체와 조합될 수 있다.
10. 생산
항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 진핵 발현 시스템을 사용하여 제조될 수 있다. 발현 시스템은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유동물 세포에서 벡터로부터의 발현을 수반할 수 있다. 시스템은 또한 진핵 세포를 감염시키는데 사용될 수 있는 복제-결손 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터일 수 있다. 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 세포 게놈에 통합된 벡터의 일부 또는 벡터로부터 항체를 발현하는 안정 세포주로부터 생성될 수 있다. 안정 세포주는 통합된 복제-결손 레트로바이러스 벡터로부터 항체를 발현할 수 있다. 상기 발현 시스템은 GPExTM일 수 있다.
항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, DEAE 이온 교환, 겔 여과 및 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피(chromatography) 방법을 사용하여 정제될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 융합 단백질은 폴리펩타이드가 친화성 매트릭스 상에 포획되도록 하는 아미노산 서열을 함유하는 추가의 도메인을 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 도메인의 Fc 영역을 포함하는 본원에 기재된 항체는 단백질 A 컬럼을 사용하여 세포 배양 상층액 또는 세포질 추출물로부터 단리될 수 있다. 또한, c-myc, 헤마글루티닌, 폴리히스티딘, 또는 FlagTM(Kodak)과 같은 태그를 사용하여 폴리펩타이드 정제를 도울 수 있다. 이러한 태그는 카르복실 또는 아미노 말단을 포함하는 폴리펩타이드 내의 어느 곳에나 삽입될 수 있다. 유용할 수 있는 다른 융합은 알칼리 인산염와 같은 폴리펩타이드의 검출을 돕는 효소를 포함한다. 또한, 면역친화성 크로마토그래피를 사용하여 폴리펩타이드를 정제할 수 있다.
백신
본원에 기재된 종양의 치료 또는 예방을 환자에게 제공하는 방법이 제공된다. 이 방법은 환자에게 종양 백신 접종할 수 있다. 상기 방법은 서열 식별 번호 48에 표시된 서열을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 조성물은 CD24를 결합하는 항-CD24 항체 또는 세포 발현 수용체를 사용하는 것을 포함하는 치료와 관련된 부작용을 치료할 필요가 있는 환자에게 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 종양의 치료 또는 종양의 예방을 제공하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.
11. 약학적 조성물
상기 기술된 항-CD24 항체, 세포 치료, 또는 펩타이드 조성물 중 어느 하나, 및 생리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제의 치료적 유효량을 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다. 상기 약학적 조성물은 예방적 또는 치료적 유효량의 항-CD24 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나, 미국 약전 또는 동물, 및 보다 구체적으로는 인간에 사용하기 위한 다른 일반적으로 인정된 약전에 열거된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 희석제, 보조제(예를 들어, 프로인드(Freund) 보조제(완전 및 불완전), 부형제, 또는 치료제가 투여되는 비히클(vehicle))을 의미한다. 이와 같은 약학적 담체는 석유, 동물, 식물성 또는 합성 기원, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등의 것들을 포함하는, 물 및 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물은 약학적 조성물이 정맥 내로 투여되는 경우 바람직한 담체이다. 식염수 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 액체 담체로서, 특히 주사 용액에 사용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 포도당, 젖당, 자당, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악(chalk), 실리카 겔, 스테아르산 나트륨이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 필요한 경우, 약학적 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 지효성(susined-release) 제제 등의 형태를 취할 수 있다.
일반적으로, 약학적 조성물의 성분들은 개별적으로 또는 단위 투여 형태로 함께, 예를 들어, 활성 제제의 양을 나타내는 앰플 또는 사쉐(sachette)와 같은 밀폐 밀봉된 용기 내의 건조 동결건조된 분말 또는 물 없는(water free) 농축물로서 공급될 수 있다. 약학적 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균 제약 등급 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 약학적 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사 또는 식염수를 위한 살균수의 앰플이 제공되어, 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있다.
약학적 조성물은 중성 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것과 같은 음이온으로 형성된 것들, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 제 2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것과 같은 양이온으로 형성된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
12. 투여 방법
조성물을 투여하는 방법 및 이의 약학적 조성물은 비경구 투여(예를 들어, 피부 내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 및 피하), 경막 외, 및 점막(예를 들어, 비강 내 및 경구 경로)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 실시 양태에서, 조성물은 근육 내로 투여되고, 정맥 내 또는 피하로 투여된다. 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를 들어 주입 또는 볼루스(bolus) 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내벽(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 하나 이상의 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다.
실시예
본 개시는 다음의 비-제한적인 실시예들에 의해 예시된, 다수의 양태를 갖는다.
실시예 1
저글리코실화된 ( hypoglycosylated ) CD24 에 대한 단일 클론 항체의 생성
종양에서 NEU1 및 CD24의 과발현은 글리코시다아제(glycosidase)의 조절장애(dysregulation)를 시사한다. 글리코시다아제의 조절 장애는 MUC1과 유사한 CD24가 종양에서 저글리코실화(하이포를리코실화) 될 수 있다는 것을 시사한다. CD24에 대한 항체 3B6의 결합은 시알산 글리칸에 의해 방해된다(도 1). 상업적으로 입수 가능한 항-CD24 항체, ML5(BD bioscience)에 비해, 3B6은 N-SA-CD24 및 N-SA-0-CD24에 강하게 결합하지만, ELISA에 의해 검출되는 바와 같이 단지 N-CD24 또는 완전히 글리코실화된 CD24에만 약하게 결합한다. 이는 3B6이 결합하는 에피토프가 실제로 단백질 백본(backbone)이고, 3B6의 결합이 에피토프의 글리코실화에 의해 방해되는 것을 시사한다.
형광 활성화 세포 분류(Fluorescence activated cell sorting)(FACS) 및 면역형광(immunofluorescence)(IFA) 염색 결과는 3B6이 신경아세포종 및 수모세포종을 비롯한 다수의 종양 세포주에 결합한다는 것을 보여준다(도 2A-B). 3B6은 신경아세포종 세포주 IMR32, SK-N-SH, SH-SY5Y, SK-N-BE(2), 및 SK-N-BE(2)C에 결합하지만, SK-N-AS는 결합하지 않는다(도 2A). 또한, 3B6은 IFA 염색에 의해 평가되는 바와 같이 환자로부터 얻은 4개의 수모세포종 종양 중 3개에 결합한다(도 2B). 이러한 데이터는 3B6이 종양 세포주 및 종양에 결합할 수 있음을 시사한다.
실시예 2
친화도 성숙
CD24에 대한 3B6의 결합 친화도는 상업적 항체 ML5(BD Bioscience) 및 SN3(Thermo Fisher)에 비해 상당히 더 낮았다. 3B6의 항원에 대한 결합의 친화도 및 특이성을 증가시키기 위해, 3B6의 친화도 성숙이 수행되었다. 먼저, 3B6 항체의 중쇄(IgH) 및 경쇄(IgL) 사슬을 복제하고, Ig 가변 영역 서열을 다음과 같이 확인하였다:
3B6 IgH(서열 식별 번호 1, CDRs는 밑줄 및 굵은 체)
EVKFEESGGGLVQPGGSIKLSCAAS GVTFSEAW MDWVRQSPEKGLEWVAE IRDKTKN
YVT YYAESVKGRFTISRDDSKSRVYLQMNNLRTEDTGIYYCT GAMDY WGQGTSVTVSS
3B6 IgL(서열 식별 번호 2, CDRs는 밑줄 및 굵은 체)
DIVMTQTPLSLSVTIGQPASISCKSS QSLLYSNGKTY LNWLQQRPGQSPKRLIY QVS KLD
PGIPDRFSGSGSETDFTLKISRVEAEDLGIYYC LQGTSYPWT FGGGTKLEIK
모(parental) 3B6 항체로부터 VH 및 VL 단편을 scFv 포맷으로 전환시키고 파지 디스플레이 벡터에 복제하였다. scFv는 파지상에 1가로 표시되었고, 따라서 더 높은 친화도를 갖는 파지 클론의 선택을 가능하게 하였다. scFv 디스플레이 수준을 검증하기 위해, scFv를 Flag-6xHis 검출 태그로 융합시켰다. 파지 ELISA를 수행하여 파지 디스플레이 포맷에서 항원에 대한 모 항체의 결합을 입증하였다. 파지 상층액으로부터 결합 신호는 현저하였고, 따라서 프로젝트는 라이브러리 구조로 진행되었다.
선택 및 스크리닝의 3라운드를 수행하였다. 항원 CD24-GST 및 비오티닐화된 CD24-GST의 농도를 감소시키는 것은 더 높은 바인더 클론을 선택하기 위해 스크리닝에 사용되었다. 각 CDR 돌연변이유발 라이브러리로부터의 48개의 클론을 택하고, 배양하고, 결합에 대해 분석을 하고, 서열 결정 과정을 거쳤다. 일단 친화도 성숙된 scFv 클론의 서열이 확인되면, 친화도 성숙된 클론의 scFv를 전장(full-length) 항체 유전자로 재-포맷하고 포유동물 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 모든 친화도 성숙된 항체는 0.01 리터 소규모 생산을 겪었다. 또한, 모 항체는 직접 비교를 위해 정율-증가(scaled-up) 되었다. 지시된 중쇄 및 경쇄(표 1)에 대한 플라스미드를 혈청의 부재하에 화학적으로 한정된 배지를 사용하여 현탁 HEK293 세포에 형질감염시켜 항체를 제조하였다. 형질감염 5일 후에, 조정 배지(conditioned media)를 수집하고 정화하였다. 조정 배지에서 전체 항체는 MabSelect SuRe Protein A 배지(GE Healthcare)를 사용하여 정제하였다.
표 1 일시적인 형질감염을 통해 HEK293 세포에서 생산되고 IgG1로 정제된 항체
모(Parental) 친화도 성숙된 패널 1 친화도 성숙된 패널 2
PP6226 - H4040+L4040 anti-CD24 PP6228 - H4041+L4040 P3050.H1.A4 PP6368 - H4069+L4069 P3050.ComF1.A11
PP6230 - H4042+L4040 P3050.H2.A7 PP6369 - H4070+L4069 P3050.ComF1.H4
PP6231 - H4043+L4040 P3050.H2.B11 PP6370 - H4071+L4069 P3050.ComF1.2F4
PP6232 - H4040+L4041 P3050.L3.B9 P6371 - H4072+L4070 P3050.ComF1.2F5
PP6233 - H4040+L4042 P3050.L3.C7 PP6372 - H4073+L4071 P3050.ComF1.C9
PP6234 - H4040+L4043 P3050.L3.D8 PP6373 - H4069+L4071 P3050.ComF1.2H1
PP6235 - H4041+L4042 P3050.H1.A4.L3.C7 PP6387 - H4071+L4071 P3050.ComF2.B1
PP6236 - H4043+L4042 P3050.H2.B11.L3.C7 PP6388 - H4072+L4069 P3050.ComF2.A5
표: IgG를 얻기 위해 행한 일시적인 형질감염 및 정제의 리스트. H40xx는 중쇄 구조물 및 L40xx는 경쇄 구조물을 나타낸다. P3050.xx는 파지 패닝으로부터 얻은 오리지널 클론을 나타낸다.
모든 IgG는 잘 발현되었다. PP 넘버들은 생산된 단백질들을 구별하기 위해 사용된 일련 부호.
정제된 친화도 성숙된 항체 및 모 항체는 항원에 대한 그들의 친화도를 위해 경쟁 ELISA에 의해 평가하였다. 항체 PP6226(3B6 모 가변 영역)을 2㎍/mL로 플레이트 상에 코팅하였다. 친화도 성숙된 항체를 CD24-GST와 먼저 배양한 다음, 플레이트와 함께 배양한 후, 2차 검출 항체 배양을 수행하였다. 도 3-5에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 그의 모 클론과 경쟁하는 다양한 능력을 갖는 16개의 항체를 생성하였다. 이들 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 서열 식별 번호 3-10(중쇄) 및 서열 식별 번호 11-16(경쇄)이다.
친화도-성숙된 클론이 CD24에 더 강한 결합을 갖고, 상호작용이 글리칸-조절되는지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 N-글리카나아제(N-CD24), 시알리다아제 NanA(SA-CD24) 또는 둘 모두(N-SA-CD24)로 CD24를 치료하였다. 도 3-5에 기술된 16개의 클론을 ELISA를 사용하여 시험하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, CD24-GST에 대한 상당한 친화도에도 불구하고, PP6231 및 PP6230은 글리코실화에 관계없이 포유동물 세포에 의해 발현된 CD24에 결합하지 못하였다. 한편, 대부분의 다른 클론은 시알리다제 및/N-글리카나아제로 치료된 CD24에 우선적인 결합을 유지하였다. 그럼에도 불구하고, 항체 결합에 대한 시알리다아제 및 N-글리카나아제의 상대적 영향은 상이한 클론들 사이에서 상당히 다양하기 때문에, 각각의 클론은 글리칸 방해에 대한 그들의 민감성을 결정하기 위해 개별적으로 시험되어야 한다.
본 발명자들은 강한 결합 SA-N-CD24를 갖지만, CD24에 대한 최소 결합을 나타내는 6개의 클론을 선택하여, 2개의 종양 세포주, 폐암 세포주 H727 및 신경아세포종 세포주 IMR32에 결합에 대해 이들을 시험하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, SA-N-CD24에 대한 이들의 유사한 결합에도 불구하고, 6개의 클론은 종양 세포에 상당히 상이한 결합을 나타내었다. 중요하게는, PP6373은 시험된 두 종양 세포주 모두에 상당히 더 강한 결합을 나타낸다. 따라서, 이 클론은 추가 연구를 위해 선택된다. PP6373에 대한 중쇄 서열은 서열 식별 번호 6에 나열되고 경쇄 서열은 서열 식별 번호 16에 나열된다. 모 서열과 비교하여, 중쇄는 CDR2에 3개의 돌연변이를 갖는 반면, 경쇄는 경쇄의 CDR3에 하나의 돌연변이를 갖는다. 도 8에 도시된 바와 같이, 이들 돌연변이는 거의 lOO-배로 SA-N-CD24에 대한 결합을 증가시킬 뿐만 아니라, 바람직하게는 탈시알리화(desialylation)에 의해 보다 엄격하게 조절된 상호작용을 한다. 또한, PP6373은 SA-N-CD24에 대한 1/1000 수준으로 탈글리코실화(deglycosylation) 없이 CD24에 결합할 수 있는 능력을 얻었음을 주목한다. 그러나 CHO 세포는 불완전한 글리코실화를 갖는 것으로 알려져 있기 때문에, 결합은 CHO 세포로부터 제조된 재조합 CD24에서 작은 글리코폼을 검출하기 위해 항체의 더 높은 민감도를 반영할 것이다.
실시예 3
3B6 및 PP6373에 의해 인식되는 항원성 에피토프
3B6 및 친화도 성숙된 클론 PP6373에 의해 인식되는 항원성 에피토프를 결정하기 위해, 성숙한 CD24 아미노산 서열(서열 식별 번호 42)을 커버링하는 중첩(overlapping) 펩타이드를 합성하고, 3B6을 N-O- CD24 단백질(N-글리코시다아제, NanA 및 O-글리코시다아제로 순차적으로 전처리된 CD24Fc)로 전(pre)-코팅된 플레이트에 첨가하기 전에 3B6 항체와 함께 전-배양하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 시험된 5개 펩타이드(서열 식별 번호 43-47) 중 펩타이드 4(서열 식별 번호 46)만이 3B6-CD24 상호작용의 상당한 차단을 나타내며, 이는 CD24 결합 에피토프가 이 서열에 포함된다는 것을 시사한다. PP6373이 동일한 에피토프를 인식한다는 것을 확인하기 위해, 본 발명자들은 큰 용량 범위에 걸쳐 5개의 펩타이드를 적정하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 펩타이드 4만이 SA-N-CD24에 결합하는 PP6373의 용량-의존적 억제를 나타내었다.
최소 PP6373 결합 부위를 정의하기 위해, 본 발명자들은 한번에 하나의 아미노산으로 펩타이드 4를 절단하였고, SA-N-CD24에 결합하는 그들의 PP6373의 억제와 비교하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, C-말단으로부터 3개의 아미노산의 삭제는 억제를 무효화시키는 반면, 1개 또는 2개의 아미노산의 삭제는 억제를 상당히 개선시켰다(좌측 패널). 또한, 펩타이드 4의 N-말단으로부터 임의의 아미노산의 삭제는 또한 억제를 무효화시켰다(우측 패널). 이들 데이터는 PP6373에 의해 인식되는 최적 에피토프로서 SNSGLAPN(서열 식별 번호 48)을 식별한다.
항원성 에피토프의 식별은 유사한 특성을 갖는 추가의 항체를 생성하는 것을 가능하게 한다. 일 실시 양태에서, 서열 SNSGLAPN(서열 식별 번호 48)를 포함하는 합성 펩타이드를 사용하여 새로운 항체를 생성할 수 있다. 펩타이드는 다른 면역원성 단백질 담체에 결합될 수 있거나, 또는 보조제와 함께 사용될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 동일한 에피토프를 인식하는 다른 항-CD24mAbs를 식별하기 위해 펩타이드를 사용하여 종양의 진단 및 치료를 위한 종양-특이적 항체를 생성할 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 항원성 펩타이드는 서열 식별 번호 48의 코어 서열을 포함하는 에피토프에 결합하는 항체와 관련된 잠재적인 부작용을 중화 또는 억제하는데 사용될 수 있다. 펩타이드는 D-아미노산을 사용하는 것, 하나 이상의 펩타이드-결합에서 O를 S로 치환하는 것, 용해도 또는 반감기를 개선하기 위한 융합 서열의 첨가(예를 들어, 알부민 융합체)를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생체 내에서 사용하기에 더 나은 안정성을 위해 변형될 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 서열 식별 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 분자는 종양 백신의 치료 및 예방을 위한 백신으로서 사용될 수 있다.
실시예 4
정상 대 악성 조직에서 항원성 에피토프의 발현
PP6373에 의해 인식되는 에피토프가 종양 대 정상 조직에 우선적으로 표현되는지 여부를 결정하기 위해, 비오티닐화된 PP6373을 사용하여 면역형광에 의해 조직 결합을 분석하였다. 정상 조직에 대한 데이터는 표 2에 요약된 반면, 종양 조직의 데이터는 표 3에 요약되어 있다. 또한, 본 발명자들은 정상적인 양성 및 악성 뇌암에 대한 항체의 결합을 평가한다. 그 데이터는 표 4에 요약되어 있다.
표 2 PP6373의 면역형광 염색은 정상 조직에 대한 최소 결합을 나타내었다.
장기 +/- 염색 패턴
정상 위 - 　
정상 십이지장 - 　
정상 소장 - 　
정상 결장 - 　
정상 이하선 - 　
정상 갑상선 - 　
정상 췌장 + 연약한 세포 표면, 세포 내?
정상 전립선 - 　
정상 대동맥 - 　
정상 고환 - 　
정상 대망 - 　
정상 유방 - 　
정상 림프절 - 　
정상 피부 - 　
정상 연수 　
정상 비장 - 약간 양성, 세포 표면?
정상 자궁 - 　
정상 질 - 　
정상 방광 - 　
정상 신경 - 　
표 3 악성 조직에 대한 PP6373의 반응성
장기 퍼센트 양성 염색 패턴
악성 결장 0/1 　
악성 식도 0/1 　
악성 위 0/2 　
악성 난소 16/25 세포 표면
악성 연 조직 0/1 　
악성 신장 1/1 연약한 표면
악성 간 14/19 세포 표면
악성 유방 12/20 세포 표면
악성 피부 1/1 세포 표면
악성 고환 1/1 세포 내/세포 표면
악성 폐 11/39 세포 표면
표 4 정상 양성 및 악성 뇌종양에 대한 PP6373 결합
병리 세포 표면 세포 내 음성
성상 세포종 2/24 (8%) 17/24 (71%) 5/24 (21%)
교모 세포종 3/8 (38%) 2/8 (25%) 5/8 (37%)
희소돌기아교세포종 4/8 (50%) 3/8 (38%) 1/8 (12%)
상의 세포종 5/8 (63%) 0/8 (0%) 3/8 (37%)
수아 세포종 7/10 (70%) 0/10 (0%) 3/10 (30%)
수막종 양성 0/22 (0%) 15/22 (68%) 7/22 (32%)
정상 CNS 조직 0/16 (0%) 0/16 (0%) 16/16 (100%)
표 2에 나타낸 바와 같이, 췌장 및 아마도 비장을 제외하고, PP6373은 정상 조직을 염색하지 않았다. 췌장에서 대부분의 염색이 세포 내에 나타나는 것에 주목한다. 비장에서, 희귀한 수의 세포들은 염색을 나타내었다. 대조적으로, 표 3에 나타낸 바와 같이, 시험된 대부분의 종양은 PP6373에 강한 결합을 나타낸다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 정상 CNS 조직은 CD24가 결여되었지만, 양성 수막종은 세포 표면 염색이 아닐지라도 세포 내 염색을 나타낸다. 중요하게는, 성상 세포종, 교모 세포종 및 희소돌기아교세포종을 포함하는 악성 뇌종양은 8-70% 범위의 비율로 세포 표면 염색을 나타내고, 또한 일부 종양 조직은 세포 내 염색을 나타내었다.
일 실시 양태서, PP6373은 정상 또는 양성 뇌 조직으로부터 악성 뇌종양을 구별하는데 사용될 수 있다. 다른 실시 양태에서, PP6367은 간, 폐, 유방 및 난소 등의 고형 장기에서 종양 조직을 식별하는데 사용될 수 있다.
실시예 5
PP6373은 생체 내에서 폐암 생장을 지연시킨다
PP6373이 생체 내에서 종양 생장을 지연시킬 수 있는지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 인간 폐암 세포주 H727로 누드 마우스를 피하로 공격하였다. 종양이 촉진될 때, 종양 보유 마우스는 5mg/kg의 PP6373의 2회 주사(H727 접종 후 14 및 21일)를 수용하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, IgG 대조군과 비교하여, PP6373-치료된 종양은 실질적으로 감소된 속도로 생장한다. 이들 데이터는 비-변형된 PP6373 이 생체 내에서 항-종양 활성을 나타낼 수 있음을 입증한다.
생체 내 종양-지연과 일치하여, 본 발명자들의 시험관 내 연구는 PP6367이 도 13에 나타낸 바와 같이, 강력한 항체-의존성 세포 독성을 매개한다는 것을 입증한다.
ADCC는 글리코실화, 특히 푸코실화에 의해 영향을 받기 때문에, 본 발명자들은 코어 FC 푸코실화(d6373) 없이 PP6373을 생성하기 위해 항체 공학을 사용하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, 푸코실화는 PP6373의 ADCC 활성을 증가시켰다.
본 발명자들의 데이터는 PP6373이 종양을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 일 실시 양태에서, PP6373 WT IgG1은 종양 환자에게 투여되도록 종양 치료 항체로서 사용될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 항체는 화학적으로 글리코조작될(glycoengineered) 수 있거나, 또는 푸코실 트랜스퍼라아제가 없는 세포주에서 생산될 수 있다.
실시예 6
PP6373 및 OKT3 서열에 기초한 이중-특이적 항체
항-CD24 항체를 무장화(weaponize) 하기 위해, 본 발명자들은 CD24 및 CD3 모두에 결합하는 이중 특이적 항체를 생산하였다. 일 실시 양태에서, 항-CD24 및 항-CD3(OKT3) 항체는 CD24 및 CD3에 대한 반응성을 갖는 단일 사슬 항체로 전환되고, 각각 가요성 링커 서열 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 식별 번호 49)에 의해 연결된다. PP6373 단일 사슬 항체의 서열은 서열 식별 번호 17에 나열되어 있는 반면, OKT3 단일 사슬 서열은 서열 식별 번호 18에 나열되어 있다.
일 실시 양태에서, 이중 특이적 항체는 이중 특이적 분자의 두 파트너가 Fc 영역에서 상보적 돌연변이를 가져서 이중 특이적 이종이량체의 형성을 용이하게 하는 노브 및 홀을 생성하는 노브 및 홀 기술을 통해 생성된다. PP6373 및 OKT3의 노브 및 홀 변이체의 서열은 서열 식별 번호 19-22에 나열되어 있다. 상이한 노브 및 홀 구성의 이중 특이성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 상이한 노브-홀 생산물의 공동-형질감염(co-transfection)의 생성물로 저캇 세포를 염색하는 것으로 이루어진 분석을 개발하였다. 간략하게, CD3+ 저캇 세포를 먼저 형질감염된 293T 세포로부터 조직 배양 상청액으로 염색하였다. 결합되지 않은 항체를 세척한 후, 세포를 비오티닐화 SA-N-CD24와 함께 배양하였다. 저캇 세포에서 SA-N-CD24의 양은 PE-Streptavidin에 의해 검출되었다. 도 15에 도시된 바와 같이, PP6373-홀과 OKT3-노브의 조합은 저캇 세포들에 대해 가장 높은 CD24 결합을 초래했고, 이는 PP6373-홀 및 OKT3-노브 페어링이 노브-홀 전략에 가장 적합하다는 것을 나타낸다.
또 다른 실시 양태에서, 이중 특이적 항체는 2개의 단일-사슬 결합 모티브(motif)의 탠덤 반복(tandem repeat)을 통해 생성된다. 다시, 본 발명자들은 각각 서열 식별 번호 23 및 24에 나열된 바와 같이, 반대 순서로 상이한 결합 모티프, PP633-OKT3 및 OKT3-PP6373을 갖는 2가지 구성의 활성을 비교하였다. 도 16에 도시된 바와 같이, N 말단(PP6373-OKT3; 서열 식별 번호 23)에서 PP6373 단일 사슬을 갖는 구성물은 보다 높은 이중 특이적 활성을 나타낸다.
2일 동안 항-CD3 및 항-CD28로 활성화된 T 세포와 함께 폐암 세포주 H727을 공동-배양하였다. 본 발명자들은 종양 세포가 사이토카인의 생산을 특이적으로 촉발할 수 있는지를 먼저 시험하였다. 도 17에 도시된 바와 같이, 상당한 사이토카인은 이중 특이적 항체에 의해 유도되지만, PP6373-Fc의 OKT3-Fc에 의해서는 유도되지 않는다. 보다 중요하게는, 이중 특이적 항체는 T 세포 및 종양 세포 모두가 함께 존재하지 않는 한 사이토카인 생산을 유도하지 않는다. 이들 데이터는 이중 특이적 항체가 T 세포 및 종양 세포를 모두 결합시킴으로써 T 세포 활성화를 촉발하는 것을 입증한다.
사이토카인 방출 분석과 동시에, 본 발명자들은 또한 유동 세포 분석법에 의해 살아있는 염료-표지된 종양 세포의 비드-기반 카운팅(bead-based counting)에 기초하여 종양 세포에 대한 세포독성을 평가하였다. 도 18에 도시된 바와 같이, 이중 특이적 항체는 T 세포가 존재 및 단지 존재한다면 종양 세포의 손실을 유발한다.
또 다른 실시 양태에서, 이중 특이적 항체는 FIT-Ig 기술에 의해 생산될 수 있다. 간략하게, 이중 특이적 항체는 VL6373-CL-VHOKT3-CH1-Fc(서열 식별 번호 25), VH6373-CH1(서열 식별 번호 26), 및 VLOKT3-CL(서열 식별 번호 27)을 각각 인코딩하는 3개의 구성물의 공동-발현에 의해 형성된다. 도 19에 도시된 바와 같이, FIT-Ig 항체는 OKT3 및 SA-N-CD24 모두에 대해 우수한 이중 특이적 결합 활성을 나타내었다. 결합 이외에, 본 발명자들은 이러한 이중 특이적 항체가 종양 세포에 대하여 상당한 사이토카인 반응(도 20) 및 세포독성(도 21)을 유도한다는 것을 발견하였다. 또한, 이러한 이중 특이적 항체(FIT-Ig)는 이전의 이중 특이적 항체 PP633-OKT3 및 OKT3-PP6373과 비교하여 더 높은 열 안정성을 나타내었다(도 22).
실시예 7
종양 치료를 위한 키메라 항원 수용체(CAR)-변형된 T 세포(CAR-T)에 대한 PP6373의 용도
항-CD24 항체는 종양 세포의 광범위한-스펙트럼과 반응하고, T 세포에 항-종양 활성을 부여하는 키메라 항원 수용체를 생산하는데 사용될 수 있다. 일 실시 양태에서, PP6373 단일 사슬 Fv 서열(서열 식별 번호 28) 또는 다른 항-CD24mAb 단일 사슬(alphaCD24SC)는 도 23에 도시된 바와 같이, 당업계에 공지된 CAR-T 벡터에 삽입된다. 그 다음, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 아데노바이러스 벡터로부터 유도된 것을 포함하는, 당해 분야에 공지된 유전자 벡터에 그구조물을 삽입한다.
CAR의 활성을 시험하기 위해, 건강한 도너로부터의 PBMCs는 Pan T 세포 분리 키트, 인간(Miltenyl Biotec)(Day 0)을 사용하여 T 세포를 농축시켰다. 인간 pan T 세포를 항-CD3 및 항-CD28로 24시간 동안 자극하고 IL-2로 2일 동안 배양시켰다. 활성화된 T 세포는 모의 처리(대조군 T)되거나 또는 CD24-CAR을 운반하는 렌티-바이러스로 감염시켰다(Day 2). CAR-T의 항-종양 활성을 시험하기 위해, 대조군 T 세포 또는 CD24 CAR-T 세포를 셀트레이스 바이올렛(CellTrace Violet)(Thermo Fisher) 표지된 종양 세포와 밤새 공동-배양시켰다. 종양 세포의 용해는 Fixable Viability Dye eFluorTM 660(eBioscience)으로 염색하여 측정하고 하기 식으로 계산하였다:
용해 %=(사망 %-자가 용해 %)/(l-자가 용해 %)
도 24에 도시된 바와 같이, 광범위한 이펙터 대 표적 비율(E/T)에 걸쳐, CD24 CAR-T는 폐암 세포주 A549에 비해 강력한 세포독성을 나타낸다.
CAR-T가 종양 세포에 의해 활성화되는 지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 4x104 CAR-T 또는 대조군 T 세포를 A549 종양 세포와 함께 밤새 배양하여 상층액에서 IFNγ를 측정하였다. 도 25에 도시된 바와 같이, 대조군 T 세포는 아니지만 CAR-T는 A549 종양 세포 자극에 반응하여 IFNγ를 생산했다. CD24는 종양 유형의 다수의 계통 중에서 광범위하게 발현되기 때문이다. 도 26에 도시된 바와 같이, CD24 CAR-T는 폐암, 유방암, 전립선암, 자궁경부암, 신경아세포종 및 신경교종을 포함하는 많은 종양 유형에 대해 광범위한 세포독성을 나타낸다.
종합하면, 이 데이터는 본 발명의 항체에 기초한 CD24 CAR-T가 종양 치료에서 큰 잠재력을 갖는다는 것을 입증한다. 표적화될 수 있는 종양의 유형은 뇌종양, 두경부암, 육종, 폐암, 위장암, 유방암, 고환암, 전립선암, 췌장암, 간암 또는 혈액학적 악성종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
실시예 8
종양 치료 를 위한 PP6373의 인간화
PP6373 Fv 상동성 모델은 모델 구조로서 pdb 4PB0의 구조를 사용하여 구축되었다. VH 및 VL은 모두 4PB0의 것과 >90% 상동성을 공유한다. 인간 Ig 데이터베이스에 질의할 때, 인간 생식선(germline) V 영역 서열 IGHV3-73*01 및 J 영역 서열 IGHJ4*01은 적합한 구조로서 동정 되었고, 중쇄(Onc-l VH)의 CDR 영역에 대한 인간 억셉터 프레임워크로서 사용되었다. 인간 생식선 V 영역 IGKV2-29*02 및 J 영역 서열 IGKJ4*0l은 경쇄(Onc-l VL)의 CDR 영역에 대한 인간 수용체 프레임워크로서 적용되었다. 4개의 VH 및 4개의 VL 서열이 설계되었다(서열 식별 번호 29-36). 새로운 생산품은 VH에서 73% 내지 >83% 및 VL에서 80% 내지 >83%의 인간화 스코어를 개선한다. PP6373 뮤린 Fv의 구조적 정렬 및 인간화 버전 PP6373(hu-VHv1VLv1; 서열 식별 번호 29 및 33)의 Fv는 높은 정도의 유사성을 나타내었다(도 27).
CD24 결합에 대한 HuVH 및 HuVL의 최상의 작업 조합을 선택하기 위해, 상이한 조합이 72시간 동안 293 세포 내로 공동-형질감염 되었다. 이어서, 2개의 ELISA를 발현 배지로 수행한다. ELISA 1:96 웰 플레이트를 정제된 염소-항-인간 다클론 IgG(GAH)로 코팅하고, 차단 후, 발현 배지 또는 정제된 대조군 IgGs를 첨가하고, 염소 항-인간 IgG-HRP를 검출 항체로서 사용하였다. ELISA 2:96 웰 플레이트를 CD24-GST 단백질로 코팅하고, 차단 후, 발현 배지 또는 정제된 대조군 IgGs를 첨가하고, 염소-항-인간 IgG-HRP를 검출 항체로서 사용하였다. 키메라 PP6373 항체의 결합이 양 ELISA 모두에서 100%인 것으로 간주될 경우, 상이한 결합 정도를 나타내는 다양한 VH 및 VL 조합은 키메라 항체와 비교되어 상대적인 결합에 의해 순위가 매겨질 것이다(사전-스크린(pre-screen)으로부터 선택된 리드(lead)는 정제 후에 다시 비교될 것이다). 제 1 라운드 사전-스크리닝 데이터는 도 28에서 요약되고, 이 실험의 데이터는, a) L3은 L3를 리드로 제조된 단위 단백질당 높은 결합 능력을 나타내고; b) H1L3(서열 식별 번호 29 및 35), H2L3(서열 식별 번호 30 및 35), H3L3(서열 식별 번호 32 및 35) 및 H4L3(서열 식별 번호 32 및 35)는 PP6373에 대한 4개의 인간화 리드이다.
리드 항체 H2L3 및 H3L3가 종양 세포에 결합하는 능력을 보유하는지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 PP6373과 함께 인간화 항체를 비오티닐화 시켰다. 도 29에 도시된 바와 같이, PP6373이 시험된 2개의 인간 종양 세포에 더 잘 결합하였지만, H2L3 및 H3L3 모두는 nM 범위에서 IC50과 강한 결합을 나타낸다.
본 발명자들은 PBL(도 30, 도 31) 또는 정제된 NK 세포(도 32)를 PBL을 이펙터로, A549 세포를 표적 세포로서 사용하여 ADCC 분석을 수행하였다. 놀랍게도, H2L3 및 H3L3이 종양 세포에 잘 결합 않지만(도 29), 낮은 농도의 항체가 사용될 때 ADCC에서 보다 강력한 이펙터이다(도 30). 예상한 바와 같이, 탈푸코실화된(defucosylated) PP6373(d6373)은 ADCC에서 보다 강력하다(도 31, 도 32).
종합하면, 본 발명자들의 데이터는 PP6373의 인간화 클론이 인간 종양 세포에 대한 유의적인 결합 및 놀랍게도 강력한 ADCC 활성을 나타낸다는 것을 입증하였다. 일 실시 양태에서, 항체는 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 인간화 항체는 이중 특이적 항체의 주요 성분으로서 사용될 수 있다. 이러한 활성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 H3 및 L3을 함유하는 2개의 구조물을 생성하여 FIT-Ig 기술 기반 이중 특이적 항체를 생성하였다. 인간화 FIT-Ig 항체에 대한 서열은 서열 식별 번호 37 및 38에 열거되어 있으며, 서열 식별 번호27과 함께 사용된다. 추가로, 본 발명자들은 또한 인간화 FIT-Ig 서열을 최적화하기 위한 일부 돌연변이를 만들었고, 이들은 서열 식별 번호 39-41에 나열되어 있다. 구체적으로, 모든 3개의 서열은 단백질 정제 및 합성을 위해 N 말단상에 신호 서열을 포함한다; 서열 식별 번호 39: 돌연변이(D부터 A까지)를 Fc 영역에 도입하여 ADCC를 방지하였다; 서열 식별 번호 27에서, 구성 동안 제한 효소 부위에 의해 유도된 VLOKT3 및 CL 사이에 하나의 여분의 R이 존재하고, 서열 식별 번호 41에서, 여분의 R이 삭제되었다.
또 다른 실시 양태에서, 인간화 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 종양 치료를 위한 CAR-T의 주요 성분으로서 사용될 수 있다.
실시예 9
글리칸 -차폐된 에피토프를 갖는 항-CD24 항체는 CD24의 높은 발현을 갖는 정상 세포에 결합하지 않는다
항체-기반 면역치료의 중요한 요건은 정상 조직에 대한 최소 반응성이다. CD24는 조혈 세포, 특히 과립구, B 세포, 적혈구 및 단핵구의 일부상에서 풍부하게 발현되기 때문에, 본 발명자들은 종래의 항-CD24mAb, ML5와 함께 PP6373 및 이의 2개의 인간화 클론, H2L3 및 H3L3을 비교하였다. 도 33에 도시된 바와 같이, ML5는 정상적으로 높은 수준의 CD24를 발현하는 세포에 대한 강한 결합을 나타내지만, H2L3 및 H3L3은 B 세포 및 적혈구 세포에 결합하지 않으며, 과립구에 저조하게 결합한다. 이 결과는 대식세포와 같은 다른 세포 유형에 대한 최소 결합 및 비-B 림프구의 분율(fraction)을 입증한다.
SEQUENCE LISTING <110> ONCOIMMUNE INC. CHILDREN'S RESEARCH INSTITUTE, CHILDREN'S NATIONAL MEDICAL CENTER Liu, Yang Zheng, Pan Flores, Rhonda Chou, Hung-Yen Devenport, Martin Xue, Zhihong Ye, Peiying <120> ANTI-CD24 COMPOSITIONS AND USES THEREOF <130> 060275.0800.01PC00 <150> 62/671,193 <151> 2018-05-14 <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 3B6 heavy chain 4040 <400> 1 Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Glu Val Lys Phe Glu Glu Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Ile Lys Leu Ser Cys Ala Ala 35 40 45 Ser Gly Val Thr Phe Ser Glu Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser 50 55 60 Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Asp Lys Thr Lys 65 70 75 80 Asn Tyr Val Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu 100 105 110 Arg Thr Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Gly Ala Met Asp Tyr 115 120 125 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Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn 1 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mapping peptide 2 <400> 44 Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr 1 5 10 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mapping peptide 3 <400> 45 Ser Ser Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gly Leu 1 5 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mapping peptide 4 <400> 46 Ser Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr 1 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mapping peptide 5 <400> 47 Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys 1 5 10 <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal binding peptide <400> 48 Ser Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn 1 5 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 49 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (32)

  1. 비-종양 세포상에서 글리칸-차폐되지만 종양 세포상에서 노출되는 에피토프(epitope)에 결합하는 항체를 포함하는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 CD24에 결합하는, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 서열 식별 번호 48에 표시된 서열을 포함하는 펩타이드에 결합하는, 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 서열 식별 번호 1에 표시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 식별 번호 2에 표시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 서열 식별 번호 3-10에 표시된 서열 중 어느 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 식별 번호 11-16에 표시된 서열 중 어느 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 항체는 서열 식별 번호 6에 표시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호 16에 표시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 서열 식별 번호 29-32에 표시된 서열 중 어느 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 식별 번호 33-36에 표시된 서열 중 어느 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 항체는 서열 식별 번호 30에 표시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호 35에 표시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 조성물.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 항체는 서열 식별 번호 31에 표시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호 35에 표시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 제 1 항체 도메인, 및 제 2 항체 또는 이의 항원 결합 단편(fragment)을 포함하는 제 2 항체 도메인을 포함하는, 이중-특이적(bi-specific) 항체.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 제 2 항체 도메인은 종양 면역치료를 위해 면역 이펙터 T 세포를 종양 세포로 유인하는, 이중-특이적 항체.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 제 2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD3에 결합하는, 이중-특이적 항체.
  13. 제 10항에 있어서,
    서열 식별 번호 17 및 18에 표시된 서열을 포함하는, 이중-특이적 항체.
  14. 제 10항에 있어서,
    서열 식별 번호 23-27 및 37-41에 표시된 서열 중 어느 하나를 포함하는, 이중-특이적 항체.
  15. 제 10항에 있어서,
    상기 제 2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TCR-α 사슬, TCR-β 사슬, TCR-γ 사슬, 또는 TCR-δ 사슬을 결합하는, 이중-특이적 항체.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 상기 이중-특이적 항체는 항체-매개된 세포 독성(antibody-medicated cellular cytotoxicity)(ADCC) 활성을 갖는, 항체 또는 이중-특이적 항체.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 항체 또는 상기 이중-특이적 항체는 강화된 ADCC 활성을 갖도록 조작되는, 항체 또는 이중-특이적 항체.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 상기 이중-특이적 항체는 항체-매개된 세포 식작용(antibody-medicated cellular phagocytosis)(ADCP) 활성을 갖는 항체 또는 이중-특이적 항체.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 항체 또는 상기 이중-특이적 항체가 강화된 ADCP 활성을 갖도록 조작되는, 항체 또는 이중-특이적 항체.
  20. 제 4항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 단일 사슬 항체를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  21. 제 20항에 있어서,
    서열 식별 번호 28에 표시된 서열을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 항체, 이중-특이적 항체, 또는 키메라 항원 수용체, 및 제 2 항종양 치료를 포함하는, 조성물.
  23. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항의 항체, 이중-특이적 항체, 키메라 항원 수용체, 또는 조성물을 그것을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 치료 방법.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 종양은 폐암, 난소암, 유방암, 간암, 뇌암, 자궁경부암, 신장암, 고환암, 전립선암, 또는 신경아세포종인, 종양 치료 방법.
  25. 서열 식별 번호 48에 표시된 서열을 포함하는 조성물을 그것을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 항-CD24 항체 또는 CD24-결합 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 치료와 관련된 부작용을 치료하는 방법.
  26. 서열 식별 번호 48을 포함하는 조성물을 그것을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양의 치료 또는 예방 방법.
  27. 제 1항의 항체의 용도를 포함하는, 악성 조직 또는 전이성 병변의 진단 방법.
  28. 제 1항의 항체의 용도를 포함하는, 순환 종양 세포를 확인하는 방법.
  29. 종양 치료를 위한 약제의 제조에서 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항의 항체, 이중-특이적 항체, 키메라 항원 수용체, 또는 조성물의 용도.
  30. 제 29항에 있어서,
    상기 종양은 폐암, 난소암, 유방암, 간암, 뇌암, 자궁경부암, 난소암, 신장암,고환암, 전립선암, 또는 신경아세포종인, 방법.
  31. 항-CD24 항체 또는 CD24-결합 수용체를 발현하는 세포의 치료적 용도와 관련된 부작용을 치료하기 위한 약제의 제조에서 서열 식별 번호 48에 표시된 서열을 포함하는 조성물의 용도.
  32. 종양의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서 서열 식별 번호 48을 포함하는 조성물의 용도.
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