BR112020022482A2 - composições anti-cd24 e usos das mesmas - Google Patents

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cells
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BR112020022482-0A
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Yang Liu
Pan Zheng
Rhonda Flores
Hung-Yen Chou
Zhihong Xue
Peiying Ye
Martin DEVENPORT
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Oncoimmune, Inc.
Children's Research Institute, Children's National Medical Center
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Abstract

A presente invenção refere-se a anticorpos anti-CD24 que se ligam seletivamente à CD24 humana expressa em células cancerosas, mas não à CD24 humana expressa em células não cancerosas, e o uso de tais anticorpos em terapia contra câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COM- POSIÇÕES ANTI-CD24 E USOS DAS MESMAS". Campo da Invenção
[001] A presente invenção refere-se a anticorpos anti-CD24 que se ligam seletivamente à CD24 humana expressa em células cancero- sas, mas não à CD24 humana expressa em células não cancerosas. Esta invenção também se refere ao uso de tais anticorpos em terapia contra câncer. Antecedentes da Invenção
[002] CD24 é uma proteína da superfície celular ligada ao glico- silfosfatidil-inositol (GPI) semelhante à mucina e fortemente glicosila- da. A CD24 é expressa em níveis mais altos em células hematopoiéti- cas, incluindo células B, células T, neutrófilos, eosinófilos, células den- dríticas, e macrófagos, assim como em células não hematopoiéticas, incluindo células neurais, células ganglionares, células epiteliais, que- ratinócitos, células musculares, células pancreáticas, e células-tronco epiteliais. Em geral, a CD24 tende a ser expressa em níveis mais altos em células progenitoras e células metabolicamente ativas e em menor extensão em células terminalmente diferenciadas. A função da CD24 ainda não está clara na maioria dos tipos de células, mas já foram re- latadas funções imunológicas diversas da CD24.
[003] Embora a CD24 seja encontrada em muitos tecidos e tipos de células normais, a CD24 é superexpressa em quase 70% dos cân- ceres humanos. Altos níveis de expressão de CD24 detectados por imuno-histoquímica já foram encontrados em câncer de ovário epitelial (83%), câncer de mama (85%), câncer de pulmão de não pequenas células (45%), câncer de próstata (48%) e câncer de pâncreas (72%). CD24 é uma das proteínas mais superexpressas em células cancero- sas. A expressão de CD24 é suprarregulada durante a tumorigênese, sugerindo seu papel na progressão do tumor e na metástase. A supe-
rexpressão de CD24 em câncer também já foi identificada como um marcador indicativo de prognóstico pobre e um curso mais agressivo da doença para pacientes com câncer. No câncer de mama, a expres- são de CD24 é significativamente mais alta em carcinoma invasivo do que em lesões benignas ou pré-cancerosas. No câncer de pulmão não-pequenas células, a expressão de CD24 foi identificada como um marcador independente para a sobrevida geral do paciente. Além dis- so, no carcinoma de células escamosas esofágicas, a superexpressão de CD24 é sugestiva de metástase nos linfonodos, baixo grau de tu- mor, assim como tempo de sobrevida reduzido. Observações similares foram encontradas em muitos outros tipos de câncer incluindo câncer de cólon, carcinoma hepatocelular, glioma, câncer de ovário, e câncer de próstata. Embora a CD24 venha sendo amplamente usada como um marcador de prognóstico, ela ainda não foi utilizada como um neo- antígeno que pode ser um alvo potencial para terapia contra câncer devido a sua expressão em tipos de câncer normais e potencial toxici- dade.
[004] CD24 madura é uma sialoglicoproteína pequena e altamen- te glicosilada de 31 aminoácidos com 16 potenciais sítios de O- glicosilação e 2 sítios de N-glicosilação previstos. Glicosilação é uma das modificações pós-translacionais mais complexas das proteínas. Ocorre um desvio da via de glicosilação normal que sabidamente ocor- re em muitas células cancerosas, levando à expressão alterada de gli- canas e resultando em hiperglicosilação ou hipoglicosilação de muitas proteínas celulares. Os padrões de glicosilação alterados encontrados em células cancerosas são resultado de muitos fatores contribuintes que incluem desregulação no nível transcricional, desregulação de proteínas do tipo chaperona durante a glicosilação, e atividades de gli- cosidase e glicotransferase alteradas. Alterações de glicanas associa- das ao tumor incluem ramificação mais comprida ou mais curta de N-
glicanas, densidade mais alta ou mais baixa de O-glicanas, produção de versão truncada de correspondentes normais (antígenos Tn, sTn e T), e produção de formas raras de estruturas terminais com ácido siáli- co e fucose (epítopos sLea e sLex).
[005] Por conseguinte, são necessárias na literatura maneiras melhoradas de identificar e tratar câncer, em particular métodos e composições capazes de diferenciar células cancerosas de células não cancerosas. Sumário da Invenção
[006] A presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal anti-CD24 cuja ligação à CD24 é bloqueada pela glicosilação presente em células normais, mas não em células cancerosas. O anticorpo da mesma pode ligar-se a um epítopo blindado por glicana que fica ex- posto em células cancerosas, mas não em células não cancerosas. O anticorpo pode ligar-se a um epítopo compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 48.
[007] Em um outro aspecto o anticorpo monoclonal pode ligar-se a células cancerosas com reatividade mínima ou nenhuma reatividade para células não cancerosas.
[008] Em um outro aspecto o anticorpo monoclonal pode ligar-se a células tumorais com reatividade mínima ou nenhuma reatividade para células não tumorais.
[009] Em um outro aspecto o anticorpo monoclonal pode ligar-se a células cancerosas circulantes com reatividade mínima ou nenhuma reatividade para células hematopoiéticas.
[0010] Em um outro aspecto o anticorpo monoclonal não pode se ligar à CD24 em células sem padrões de glicosilação específicos para câncer, mas pode ligar-se à CD24 em células com padrões de glicosi- lação específicos para câncer.
[0011] Em um outro aspecto, uma composição, que pode ser uma composição farmacêutica, compreende o anticorpo monoclonal, ou um ou mais fragmentos de ligação a antígenos do mesmo.
[0012] Em um outro aspecto a composição é usada para destruir células cancerosas através de citotoxicidade celular mediada por anti- corpos (ADCC).
[0013] Em um outro aspecto a composição é usada para destruir células cancerosas através de fagocitose celular mediada por anticor- pos (ADCP).
[0014] Em um outro aspecto a composição é usada para destruir células cancerosas através de ADCC e ADCP combinadas.
[0015] Em um outro aspecto a composição compreende uma célu- la T de receptor de antígeno quimérico, que pode ser usada para con- ferir especificidade para células cancerosas às células T.
[0016] Em um outro aspecto a composição compreende o anticor- po monoclonal 3B6.
[0017] Em um outro aspecto a composição compreende um anti- corpo monoclonal compreendendo as sequências apresentadas nas SEQ ID NOS: 1 e 2.
[0018] Em um outro aspecto a composição compreende anticorpos monoclonais derivados por maturação da afinidade do anticorpo mo- noclonal 3B6.
[0019] Em um outro aspecto a composição compreende um anti- corpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada selecionada dentre qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOS: 3-10.
[0020] Em um outro aspecto a composição compreende um anti- corpo monoclonal compreendendo uma cadeia leve selecionada den- tre qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOS: 11-
16.
[0021] Em um outro aspecto a composição compreende o anticor-
po monoclonal PP6373 derivado por maturação da afinidade do anti- corpo monoclonal 3B6.
[0022] Em um outro aspecto a composição compreende um anti- corpo monoclonal compreendendo as sequências apresentadas nas SEQ ID NOS: 6 e 16.
[0023] Em um outro aspecto a composição compreende um anti- corpo monoclonal derivado por humanização do anticorpo monoclonal PP6373.
[0024] Em um outro aspecto a composição compreende um anti- corpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada selecionada dentre qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOS: 29-32.
[0025] Em um outro aspecto a composição compreende um anti- corpo monoclonal compreendendo uma cadeia leve selecionada den- tre qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOS: 33-
36.
[0026] Em um outro aspecto a composição farmacêutica compre- ende o anticorpo monoclonal H2L3 derivado por humanização do anti- corpo monoclonal PP6373.
[0027] Em um outro aspecto a composição farmacêutica compre- ende o anticorpo monoclonal H3L3 derivado por humanização do anti- corpo monoclonal PP6373.
[0028] Em um outro aspecto a composição compreende um anti- corpo monoclonal compreendendo uma sequência variável da cadeia pesada compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 30 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 35.
[0029] Em um outro aspecto a composição compreende um anti- corpo monoclonal compreendendo uma região variável da cadeia pe- sada compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência apre- sentada na SEQ ID NO: 33.
[0030] Em um outro aspecto a composição compreende um anti- corpo monoclonal de cadeia única compreendendo a sequência apre- sentada na SEQ ID NO: 17.
[0031] Em um outro aspecto a composição compreende um anti- corpo biespecífico compreendendo um primeiro domínio de anticorpo compreendendo o anticorpo anti-CD24 ou fragmento de ligação a antí- genos do mesmo, e um segundo domínio de anticorpo compreenden- do um segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo. O anticorpo biespecífico pode ser usado para unir células cancerosas e células T efetoras imunes em um paciente que requer tratamento ou prevenção contra um câncer.
[0032] Em um outro aspecto o domínio do segundo anticorpo pos- sui uma especificidade de ligação diferente do domínio do primeiro an- ticorpo.
[0033] Em um outro aspecto o domínio do segundo anticorpo atrai células T efetoras imunes para as células cancerosas.
[0034] Em um outro aspecto o segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo liga-se à CD3.
[0035] Em um outro aspecto o segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo liga-se à cadeia TCR-α, à cadeia TCR- β, à cadeia TCR-, ou à cadeia TCR-δ.
[0036] Em um outro aspecto o domínio do primeiro anticorpo com- preende um anticorpo compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 17 e o domínio do segundo anticorpo compreende a se- quência apresentada na SEQ ID NO: 18.
[0037] Em um outro aspecto o domínio do primeiro anticorpo com- preende um anticorpo compreendendo qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOS: 23-27 e 37-41.
[0038] Em um outro aspecto a composição compreendendo um anticorpo biespecífico pode ser usada para tratar células cancerosas através de citotoxicidade celular mediada por anticorpos (ADCC).
[0039] Em um outro aspecto a composição compreende um anti- corpo biespecífico com maior atividade de ADCC.
[0040] Em um outro aspecto a composição compreende um anti- corpo biespecífico é usado para tratar células cancerosas através de fagocitose celular mediada por anticorpos (ADCP).
[0041] Em um outro aspecto a composição compreendendo um anticorpo biespecífico tem maior atividade de ADCP.
[0042] Em um outro aspecto a composição compreende um recep- tor de antígeno quimérico para uso em imunoterapia, em que o referi- do receptor compreende um anticorpo de cadeia única compreenden- do qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOS: 1-
36.
[0043] Em um outro aspecto o receptor de antígeno quimérico é usado em imunoterapia, em que o referido receptor compreende um anticorpo de cadeia única compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 28.
[0044] Em um outro aspecto a composição farmacêutica é usada junto com uma segunda terapia anti-câncer.
[0045] Neste pedido é apresentado um método para tratar câncer em um paciente com necessidade do mesmo compreendendo admi- nistrar um ou mais dos anticorpos, anticorpos biespecíficos, receptores de antígeno quimérico, ou composições descrito neste pedido ao paci- ente, onde o câncer é câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer ce- rebral, câncer cervical, câncer de ovário, câncer renal, câncer de testí- culo, câncer de próstata, ou neuroblastoma. O câncer pode ligar-se a uma composição de anticorpos anti-CD24 descrita neste pedido.
[0046] Neste pedido é apresentado ainda um método para diag-
nosticar um tecido maligno ou uma lesão metastática usando a com- posição de anticorpos anti-CD24. A composição de anticorpos anti- CD24 pode ligar o tecido maligno ou a lesão metastática em um nível acima de uma quantidade limítrofe, o que pode ser indicativo de um tecido maligno ou uma lesão metastática.
[0047] Neste pedido também é apresentado um método para iden- tificar células cancerosas circulantes usando a composição de anticor- pos anti-CD24. A composição de anticorpos anti-CD24 pode ligar as células cancerosas circulantes em um nível acima de uma quantidade limítrofe, o que pode ser indicativo de células cancerosas circulantes. Neste pedido é apresentado ainda o uso de uma composição descrita neste pedido para a produção de um medicamento para tratar uma doença ou condição descrita neste pedido. Descrição dos Desenhos
[0048] FIG. 1. Gráfico em barras dos resultados de ELISA indican- do que a ligação do anticorpo monoclonal anti-CD24 3B6 é impedida pela presença de glicana enquanto que a do anticorpo monoclonal an- ti-CD24 ML5 comercialmente disponível não. 3B6 liga-se fortemente à CD24 desprovida de modificações em N-glicana e ácido siálico (N-SA- CD24) e à CD24 desprovida de modificações em N-glicana N-glicana, ácido siálico, e O-glicana (N-SA-O-CD24), mas se liga de forma muito fraca tanto à CD24 desprovida de modificações em N-glicana (N- CD24) ou à CD24 totalmente modificada (modificações em N-glicans + ácido siálico + O-glicana). CD24GST representa uma fusão CD24-GST de controle negativo.
[0049] FIGS. 2A-B. Ensaio de ligação indicam que 3B6 a linhagens celulares de neuroblastoma e tumores tipo meduloblastoma. FIG. 2A. Gráficos de afinidade normalizada de anticorpos monoclonais anti- CD24 ML5, 3B6, e SN3 e um anticorpo de controle foram testados contra 6 linhagens celulares de neuroblastoma, IMR32, SK-N-SH, SH-
SY5Y, SK-N-BE(2), SK-N-AS, e SK-N-BE(2)C. Embora 3B6 tenha al- guma afinidade para todas as linhagens celulares de neuroblastoma, à exceção de SK-N-AS, a afinidade de 3B6 foi consideravelmente mais baixa em relação aos anticorpos anti-CD24 ML5 (BD Bioscience Cat#555426) e SN3 (Thermo Fisher Cat#MA5-11833) comercialmente disponíveis. FIG. 2B. Fluorógrafo do tratamento de 3B6 de 4 tumores tipo meduloblastoma. 3B6 ligou-se a 3 dos 4 tumores.
[0050] FIG. 3. Gráfico de ELISA competitivo comparando a capa- cidade de variantes de 3B6 para bloquear a ligação de 3B6 à proteína de fusão CD24-GST. PP6226 possui a mesma região variável que 3B6.
[0051] FIG. 4. Gráfico de ELISA competitivo comparando a capa- cidade de variantes de 3B6 quanto a sua capacidade para bloquear a ligação de 3B6 à proteína de fusão CD24-GST. PP6226 possui a mesma região variável que 3B6.
[0052] FIG. 5. Gráfico de ELISA competitivo comparando a capa- cidade de variantes de 3B6 quanto a sua capacidade para bloquear a ligação de 3B6 à proteína de fusão CD24-GST. PP6226 possui a mesma região variável que 3B6.
[0053] FIG. 6. Gráfico em barras dos resultados de ELISA indican- do a afinidade relativa de anticorpos anti-CD24 quiméricos maturados por afinidade para CD24 expressa por células CHO. Doze dos clones apresentaram maior afinidade e especificidade diferente contra CD24 totalmente glicosilada, N-CD24, SA-CD24, e N-SA-CD24 em relação à 3B6 (PP6226).
[0054] FIG. 7. Ensaio de titulação de vários anticorpos anti-CD24 quiméricos de afinidade maturada testados contra a linhagem celular NCI-H727 de câncer de pulmão (painel à esquerda) e contra a linha- gem celular IMR32 de neuroblastoma (painel à direita). A concentra- ção máxima de anticorpos testada foi de 5µg/ml com um fator de titu-
lação de 2X até uma concentração mínima de 0,01 µg/ml. Um controle negativo não colorido (0 µg/ml) também está mostrado.
[0055] FIG. 8. Comparação quantitativa da ligação entre diferentes glicoformas de CD24 e anticorpos anti-CD24: PP6229 parental vs. PP6373 de afinidade maturada. CD24 de Fc removido foram aplica- das sobre uma placa de ELISA, e foram então tratadas com tampão (CD24), NanA (SA-) ou NanA+N-glicanse (SA-N-) antes da adição de doses dadas de PP6626 (painel à esquerda) ou de PP6373 (painel à direita). A concentração máxima testada foi de 7812,50 ng/ml com um fator de titulação de 5x até uma concentração mínima de 0,02 ng/ml.
[0056] FIG. 9. Mapeamento do sítio de ligação de 3B6 através do ensaio de inibição de peptídios. Dos cinco peptídios CD24 sobrepos- tos testados, apenas um (petídio 4) contém o epítopo antigênico.
[0057] FIG. 10. Mapeamento do sítio de ligação de PP6373 atra- vés do ensaio de inibição de peptídios. Dos cinco peptídios CD24 so- brepostos testados, apenas um (SNSGLAPNT (SEQ ID NO: 46)) con- tém o epítopo antigênico.
[0058] FIG. 11. Mapeamento do epítopo PP6373 com peptídios truncado a partir da sequência de epítopos antigênicos do peptídio 4. Os dados indicam que o epítopo ótimo está contido na sequência SNSGLAPN (SEQ ID NO: 48).
[0059] FIG. 12. Gráfico indicando que PP6373 reduziu o cresci- mento tumoral in vivo em um modelo de camundongo. Camundongos nus com xenoenxerto de câncer de pulmão palpável receberam IgG humana de controle ou PP6373 nos dois instantes indicados pelas se- tas, o crescimento dos tumores foi em seguida medido uma vez por semana.
[0060] FIG. 13. Gráfico indicando que PP6373 induziu citotoxicda- de celular (ADCC) contra a linhagem celular de câncer humano H727. Células H727 co-incubadas com células efetoras PBL com PP6373 e
FC de IgG humana a 5μg/ml induziram ADCC.
[0061] FIG. 14. Gráfico indicando que PP6373 sem fucosilação no núcleo (d6873) induz ADCC mais alta contra a linhagem celular de câncer humano H727 do que PP6373. Células H727 co-incubadas com células efetoras PBL com d6373, PP6373 e FC de IgG humana a 5μg/ml induziram ADCC.
[0062] FIG. 15. Gráficos de citometria de fluxo indicando que a combinação de PP6373-hole e OKT3-knob apresenta maior biespecifi- cidade do que PP6373-knob e OKT3-hole. Células Jurkat foram colori- das com sobrenadantes de cultura de tecidos de células 293T trans- fectadas com PP6373, OKT3, PP6373-knob & OKT3-hole, ou PP6373- hole & OKT3-knob, seguido por incubação com a proteína SA-N-CD24 biotinilada. O sinal de PE-estreptavidina foi medido por citometria de fluxo. Foram realizados três experimentos independentes.
[0063] FIG. 16. Gráficos de citometria de fluxo indicando que PP6373-OKT3 induz atividade biespecífica mais alta que OKT3- PP6373. Células Jurkat foram coloridas com sobrenadantes de cultura de tecidos de células 293T transfectadas com plasmídeo vazio (contro- le negativo), PP6373-OKT3 ou OKT3-PP6373, seguido por incubação com a proteína SA-N-CD24 bio-tinilada. O sinal de PE-estreptavidina foi medido por citometria de fluxo. Foram realizados três experimentos independentes.
[0064] FIG. 17. Gráfico de citometria de fluxo indicando que o anti- corpo biespecífico PP6373-OKT3 tem atividade antitumoral. Células H727 de câncer de pulmão e células T humanas ativadas foram incu- badas 1:5 com sobrenadantes de cultura de tecido de células 293T não tratadas, ou transfectadas com plasmídeo vazio (não transfecta- das), PP6373, OKT3, PP6373-OKT3 por 12 horas. As citocinas (IFNr, TNF, IL10, IL6, IL4 e IL2) no meio de cultura de tecido foram medidas por citometria de fluxo. Foram realizados três experimentos indepen-
dentes.
[0065] FIG. 18. Gráfico de citometria de fluxo indicando que o anti- corpo biespecífico PP6373-OKT3 induziu citotoxicidade de células tu- morais por células T. Células H727 de câncer de pulmão e células T humanas ativadas foram incubadas 1:5 com sobrenadantes de cultura de tecido de células 293T não tratadas, ou transfectadas com plasmí- deo vazio (não transfectadas), PP6373, OKT3, PP6373-OKT3 por 12 horas. Células de câncer de pulmão e células T humanas foram cole- tadas e coloridas com anti-CD45 humana e o reagente Aqua vi- vo/morto. O número de células tumorais foi plotado como duplo nega- tivo de anti-CD45 e Aqua. Foram realizados três experimentos inde- pendentes.
[0066] FIG. 19. Análise por citometria de fluxo de FIT-Ig induziu alta atividade biespecífica. Células Jurkat foram coloridas com controle negativo (sobrenadante de 293T não transfectadas) ou com FIT-Ig, seguido por incubação com a proteína SA-N-CD24 biotinilada. O sinal de PE-estreptavidina foi medido por citometria de fluxo. Foram realiza- dos três experimentos independentes.
[0067] FIG. 20. Análise por citometria de fluxo indica que FIT-Ig tem atividade antitumoral mais alta que PP6373-OKT3 e OKT3- PP6373. Células H727 de câncer de pulmão e células T humanas ati- vadas foram incubadas 1:5 com controle negativo (sobrenadante de 293T não transfectadas), PP6373-OKT3, OKT3-PP6373 ou FIT-Ig por 12 horas. As citocinas (IFNr, TNF, IL10, IL6, IL4 e IL2) no meio de cul- tura de tecido foram medidas por citometria de fluxo. Foram realizados três experimentos independentes.
[0068] FIG. 21. Análise por citometria de fluxo indica que FIT-Ig induz citotoxicidade de células tumorais por células T. Células H727 de câncer de pulmão e células T humanas ativadas foram incubadas 1:5 com controle negativo (sobrenadante de 293T não transfectadas),
PP6373-OKT3, OKT3-PP6373 ou FIT-Ig por 12 horas. Células de cân- cer de pulmão e células T humanas foram coletadas e coloridas com anti-CD45 humana e o reagente Aqua vivo/morto. O número de células tumorais foi plotado como duplo negativo de anti-CD45 e Aqua. Foram realizados três experimentos independentes.
[0069] FIG. 22. Análise por citometria de fluxo indica que FIT-Ig tem maior estabilidade térmica do que PP6373-OKT3 e OKT3- PP6373. Todos os anticorpos biespecíficos PP6373-OKT3, OKT3- PP6373 e FIT-Ig foram incubados à temperatura indicada por 20 minu- tos, e os sobrenadantes depois de centrifugação a 14000g por 5 minu- tos foram usados para colorir células Jurkat. Em seguida, a proteína SA-N-CD24 biotinilada foi incubada com células Jurkat e o sinal de PE-estreptavidina foi medido por citometria de fluxo.
[0070] FIG. 23. Representação esquemática do construto CarT compreendendo anti-CD24-scFv.
[0071] FIG. 24. Gráfico de citotoxicidade induzida por CD24 para a linhagem celular A549 de câncer de pulmão.
[0072] FIG. 25. Gráfico da ativação de CART por linhagem de cé- lulas tumorais segundo demonstrado pela produção de IFNγ.
[0073] FIG. 26. Gráfico em barras da atividade antitumoral de CD24 CART contra vários tipos de tumor. A razão E/T para os dados apresentados é is 5.
[0074] FIG. 27. Diagrama de fita do alinhamento estrutural tridi- mensional de PP6373 quimérico (FR: branco, CDR: cinza claro) e hu- VHv1VLv1 (FR: cinza, CDR: cinza escuro).
[0075] FIG. 28. Gráfico da efetividade relativa de diferentes pares de anticorpos para expressão e ligação à CD24-GST.
[0076] FIG. 29. Gráfico da ligação de H2L3 e de H3L3 às linha- gens celulares de câncer humano NCI-H727 (acima) e IMR32 (abaixo). Os dados mostrados são a intensidade de fluorescência média quando foi usada uma ampla gama de anticorpos.
[0077] FIG. 30. Gráficos de morte celular indicam que à baixa con- centração a HL33 é mais potente que PP6373 em ADCC. A linhagem celular A549 de câncer de pulmão foi usada como alvo, ao passo que PBL humanas foram usadas como efetoras. A dose de anticorpos usada foi de 3 µg/ml (painel superior) ou de 9 µg/ml (painel inferior).
[0078] FIG. 31. Gráficos de morte celular indicam que H3L3 confe- re potente atividade de ADCC a múltiplas linhagens de células tumo- rais, incluindo as linhagens celulares A549 e NCI-H727 de câncer de pulmão e a linhagem celular IMR-32de neuroblastoma. PBMC humana foi usada como células efetoras.
[0079] FIG. 32. Gráficos de morte celular indicam que H3L3 confe- re potente atividade de ADCC a múltiplas linhagens de células tumo- rais, incluindo as linhagens celulares A549 e NCI-H727 de câncer de pulmão e a linhagem celular IMR-32 de neuroblastoma. Células NK purificadas de PBMC humana são usadas como células efetoras.
[0080] FIG. 33. Análise por citometria de fluxo indica que anticor- pos que reconheceram epítopos blindados por glicanas não reconhe- cem células B, glóbulos vermelhos, e interagem pobremente com neu- trófilos. Descrição Detalhada
[0081] O direcionamento de epítopos expressos em câncer é uma abordagem amplamente adotada para o tratamento de câncer. No en- tanto, muitos desses epítopos não constituem bons alvos medicamen- tosos uma vez que eles também são expressos em tecidos normais, o que pode levar a problemas de toxicidade. Um antígeno tumor- específico (TSA) ideal terá larga expressão em câncer, mas expressão mínima ou nenhuma expressão em órgãos hospedeiros essenciais. Atributos de TSAs menos ideais, porém igualmente viáveis são aque- les expressos, porém diferencialmente modificados em tecidos nor-
mais vs. cancerosos, os chamados Antígenos Associados ao Tumor (TAA). Exemplos de antígenos tumorais bem caracterizados são MAGE-A3, MUC-1 e NY-ESO 1.
[0082] Identificação de novos TSAs e TAAs é um fator limitante no desenvolvimento de terapias contra câncer novas ou mais eficazes, particularmente para aqueles cânceres para os quais não existem atu- almente antígenos tumorais. CD24 é um bom alvo para câncer pelos seguintes motivos: ela é amplamente superexpressa em mais de 70% de todos os cânceres humanos e é glicosilada de forma diferencial em câncer, ela parece ser oncogênica e está associada a prognósticos ruins em vários cânceres e sobrevida significativamente mais curta do paciente, e ela é um marcador para células-tronco cancerígenas que podem causar reincidência e metástase dando origem a novos tumo- res. Os inventores descobriram anticorpos anti-CD24 cuja ligação à CD24 é bloqueada pela glicosilação que ocorre em células normais, mas não em células cancerosas. Como resultado, os anticorpos se ligam a linhagens de células cancerosas e tecidos cancerosos, porém com reatividade mínima para uma variedade de tecidos normais e cé- lulas hematopoiéticas.
[0083] Neste pedido são apresentados anticorpos e fragmentos de ligação a antígenos dos mesmos. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal, um anticorpo humano, um anticorpo quimérico ou um an- ticorpo humanizado. O anticorpo pode ser monoespecífico, biespecífi- co, triespecífico ou multiespecífico. O fragmento de ligação a antíge- nos do anticorpo pode ligar-se imunoespecificamente à CD24, e em particular CD24 humana, preferivelmente expressa na superfície de uma célula viva em uma concentração endógena ou transfectada. O fragmento de ligação a antígenos pode ligar-se à CD24. O anticorpo pode ser marcado de forma detectável ou pode compreender uma to- xina conjugada, um fármaco, um receptor, uma enzima, ou um ligante de receptor.
[0084] Além do direcionamento direto ao tumor, o sistema imuno- lógico tem a capacidade de reconhecer e eliminar cânceres em siste- mas modelos experimentais e em pacientes. Como resultado, imunote- rapias contra câncer estão surgindo como uma das áreas mais pro- missoras de terapia contra câncer. Imunoterapias contra câncer ativo envolvem agentes que amplificam as respostas imunológicas naturais (incluindo anticorpos contra PD-1, PD-L1 ou CTLA-4); moléculas bies- pecíficas tais como anticorpos que unem células cancerosas e células T efetoras imunes; ou, transferência de células adotivas (ACT) usando linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) estimulados ex vivo, células ex- terminadoras (NK) naturais ativadas, ou células T geneticamente modi- ficadas (receptores de antígeno quimérico (CARs) e células T modifi- cadas com receptor de células T (TCR)). Muitas destas tecnologias exigem um componente direcionador de tumor para especificidade e eficácia.
1. Definições
[0085] A terminologia usada neste pedido tem apenas a finalidade de descrever modalidades particulares e não se destina a ser limitati- va. Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações ane- xas, as formas no singular "um", "uma" e "o/a" incluem seus corres- pondentes no plural, a menos que nitidamente indicado em contrário pelo contexto. A palavra "cerca de" associada a um valor numérico de- nota uma aproximação razoável daquele valor. Em certos casos, "cer- ca de" pode ser interpretado como dentro da faixa de mais ou menos 10% do valor específico ao qual ele está associado. Por exemplo, a frase "cerca de 100" abrangeria qualquer valor entre 90 e 110.
[0086] Para detalhamento das faixas numéricas deste pedido, todo número contido naquele intervalo com o mesmo grau de precisão é explicitamente contemplado. Por exemplo, para a faixa de 6-9, são contemplados os números 7 e 8 além de 6 e 9, e para a faixa 6,0-7,0, são explicitamente contemplados os números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, e 7,0.
[0087] "Tratamento" ou "tratar", quando se referindo à proteção de um animal contra uma doença, significa prevenir, suprimir, reprimir, ou eliminar completamente a doença. Prevenir a doença envolve a admi- nistração de uma composição da invenção a um animal antes do início da doença. Suprimir a doença envolve a administração de uma com- posição da invenção a um animal depois da indução da doença, porém antes de sua manifestação clínica. Reprimir a doença envolve a admi- nistração de uma composição da invenção a um animal depois da ma- nifestação clínica da doença.
[0088] Conforme usado neste pedido, o termo "anticorpo" destina- se a indicar uma molécula de imunoglobulina que possui um sítio de reconhecimento de antígeno de "região variável". O termo "região va- riável" destina-se a diferenciar tal domínio da imunoglobulina de outros domínios que são bastante compartilhados por anticorpos (tal como o domínio Fc de um anticorpo). A região variável compreende uma "re- gião hipervariável" cujos resíduos são responsáveis pela ligação a an- tígenos. A região hipervariável compreende resíduos aminoacídicos de uma "Região Determinante de Complementaridade" ou "CDR" (i.e., tipicamente nos resíduos aproximadamente 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável da cadeia leve e nos resíduos aproxi- madamente 27-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada) e/ou aqueles resíduos de uma "alça hipervariável" (i.e., os resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variá- vel da cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada). Resíduos da "Região de Esqueleto" ou "FR" são os resíduos do domínio variável diferentes dos resíduos da região hipervariável definidos neste relatório. O termo anticorpo inclui anticorpos monoclonais, anticorpos multiespecíficos, anticorpos huma- nos, anticorpos humanizados, anticorpos sintéticos, anticorpos quimé- ricos, anticorpos camelídeos, anticorpos de cadeia única, Fvs ligados a dissulfeto Fvs (sdFv), intracorpos, e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id e anti-anti-Id para os anti- corpos da invenção). Em particular, tais anticorpos incluem moléculas de imunoglobulina de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse.
[0089] Conforme usado neste pedido, o termo "fragmento de liga- ção a antígenos" de um anticorpo refere-se a uma ou mais porções de um anticorpo que contêm a CDR do anticorpo e opcionalmente os re- síduos de esqueleto que compreendem o sítio de reconhecimento de antígenos da "região variável" do anticorpo, e apresentam capacidade para ligar imunoespecificamente o antígeno. Tais fragmentos incluem Fab', F(ab')2, Fv, cadeia única (ScFv), e mutantes dos mesmos, varian- tes de ocorrência natural, e proteínas de fusão compreendendo o sítio de reconhecimento de antígenos da "região variável" do anticorpo e uma proteína heteróloga (por exemplo, uma toxina, um sítio de reco- nhecimento de antígenos para um antígeno diferente, uma enzima, um receptor ou ligante de receptor, etc.). Conforme usado neste pedido, o termo "fragmento" refere-se a um peptídio ou polipeptídio compreen- dendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 5 resíduos ami- noacídicos contíguos, pelo menos 10 resíduos aminoacídicos contí- guos, pelo menos 15 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 20 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 25 resíduos amino- acídicos contíguos, pelo menos 40 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 50 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 60 resí- duos aminoacídicos contíguos, pelo menos 70 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 80 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo me-
nos 90 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 100 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 125 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 150 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 175 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 200 resí- duos aminoacídicos contíguos, ou pelo menos 250 resíduos aminoací- dicos contíguos.
[0090] Anticorpos humanos, quiméricos ou humanizados são par- ticularmente preferidos para uso in vivo em seres humanos, no entan- to, anticorpos murinos ou anticorpos de outras espécies podem ser vantajosamente usados para muitos usos (por exemplo, ensaios de detecção, in vitro ou in situ, uso agudo in vivo, etc.).
[0091] Um "anticorpo quimérico" é uma molécula na qual porções diferentes do anticorpo são derivadas de diferentes moléculas de imu- noglobulina tal como anticorpos tendo uma região variável derivada de um anticorpo não humano e uma região constante de imunoglobulina humana. Anticorpos quiméricos compreendendo uma ou mais CDRs de uma espécie não humana e regiões de esqueleto de uma molécula de imunoglobulina humana podem ser produzidos por várias técnicas conhecidas na literatura incluindo, por exemplo, enxertia de CDR (EP 239,400; Publicação Internacional N° WO 91/09967; e Patente US N°s 5,225,539, 5,530,101, e 5,585,089, cuja íntegra de cada uma delas encontra-se aqui incorporada a título de referência), revestimento ou recapamento (EP 592,106; EP 519,596, o conteúdo de cada uma de- las estando aqui incorporado a título de referência), e embaralhamento de cadeias (Patente US N° 5,565,332, cujo conteúdo está aqui incor- porado a título de referência).
[0092] Conforme usado neste pedido, o termo "anticorpo humani- zado" refere-se a uma imunoglobulina compreendendo uma região de esqueleto humana e uma ou mais CDRs de uma imunoglobulina não humana (usualmente de camundongo ou rato). A imunoglobulina não humana que fornece as CDRs é chamada de "doador" e a imunoglobu- lina humana que fornece o esqueleto é chamada de "aceptor". Não é necessária a presença de regiões constantes, mas se elas estiverem presentes, elas devem substancialmente idênticas a regiões constan- tes da imunoglobulina humana, i.e., pelo menos cerca de 85-90%, de preferência cerca de 95% ou mais idênticas.
Logo, todas as partes de uma imunoglobulina humanizada, exceto possivelmente as CDRs, são substancialmente idênticas às partes correspondentes de sequências de imunoglobulina humana natural.
Um anticorpo humanizado é um anticorpo compreendendo uma imunoglobulina de imunoglobulina de cadeia leve humanizada e uma imunoglobulina de cadeia pesada hu- manizada.
Por exemplo, um anticorpo humanizado não abrangeria um anticorpo quimérico típico porque, por exemplo, toda a região variável de um anticorpo quimérico é não humana.
O anticorpo doador pode ser indicado como tendo sido "humanizado" pelo processo de "huma- nização", porque se espera que o anticorpo humanizado resultante se ligue ao mesmo antígeno que o anticorpo doador que fornece as CDRs.
Em sua maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobuli- nas humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos da região hiper- variável do receptor são substituídos por resíduos da região hipervari- ável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camun- dongo, rato, coelho ou um primata não humano tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas.
Em alguns casos, resíduos da regi- ão de esqueleto (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes.
Além disso, anticorpos hu- manizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador.
Estas modificações são fei- tas para melhorar ainda mais o desempenho do anticorpo.
Em geral, o anticorpo humanizado vai compreender pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todos os FRs são aqueles de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humaniza- do também vai compreender opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana que se liga imunoespecificamente a um polipeptídio FcγRIIB, que fora alterado pela introdução de substi- tuições, deleções ou adições (i.e., mutações) de resíduos aminoacídi- cos.
2. Composições de anticorpos anti-CD24
[0093] Neste pedido está descrito um anticorpo anti-CD24 que po- de direcionar especificamente uma glicoforma câncer-específica de CD24. O anticorpo anti-CD24 pode ser usado para desenvolver terapi- as contra câncer que incluem, porém sem limitação: conjugados anti- corpo-fármaco, anticorpos terapêuticos com ADCC melhorada, anti- corpos biespecíficos, terapias com CAR-T e terapias com TCR. Espe- cificamente, o anticorpo anti-CD24 ou fragmento de ligação a antíge- nos do mesmo pode ligar-se a um epítopo blindado com glicana que fica exposta em células cancerosas, mas não em células não cancero- sas. E, em particular, o anticorpo anti-CD24 ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo pode ligar-se a um peptídio CD24 compreenden- do a sequência de aminoácidos SNSGLAPN (SEQ ID NO: 48).
[0094] O anticorpo anti-CD24 pode ser 3B6, que pode compreen- der uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequên- cia apresentada na SEQ ID NO: 1 e uma região variável da cadeia le- ve compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2. O an- ticorpo anti-CD24 ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo po- de ser uma versão de afinidade maturada de 3B6, e pode compreen- der uma região variável da cadeia pesada compreendendo qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOS: 3-10, e uma re-
gião variável da cadeia leve compreendendo qualquer uma das se- quências apresentadas nas SEQ ID NOS: 11-16. O anticorpo anti- CD24 ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo pode ser PP6373, que pode compreender uma região variável da cadeia pesa- da compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência apresen- tada na SEQ ID NO: 16. Para aplicações terapêuticas em seres huma- nos, o anticorpo anti-CD24 ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo pode ser uma versão humanizada de PP6373 e pode compre- ender uma região variável da cadeia pesada compreendendo qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOS: 29-32, e uma região variável da cadeia leve compreendendo qualquer uma das se- quências apresentadas nas SEQ ID NOS: 33-36. Em particular, o anti- corpo anti-CD24 humanizado ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo pode ser H2L3, que pode compreender uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 30, e uma região variável da cadeia leve compreendendo a se- quência apresentada na SEQ ID NO: 35; ou pode ser H3L3, que pode compreender uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 31, e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO:
35.
3. Composições de conjugados anticorpo-fármaco
[0095] Um anticorpo direcionado para tumores pode ser usado pa- ra prevenir ou limitar o crescimento de tumores diretamente afetando a biologia do tumor. Por exemplo, o anticorpo monoclonal anti-VEGF humanizado (bevacizumab; Avastina) bloqueia o crescimento de tumo- res impedindo a vascularização do tumor induzida pelo VEGF. Outros anticorpos direcionados para tumores são usados para inibir o cresci- mento de células tumorais ou destruir células cancerosas através de modificação do próprio anticorpo. Por exemplo, imunoconjugados dire- cionados para tumores consistem em um anticorpo e uma porção efe- tora ligados um ao outro por reticulações covalentes ou por fusão ge- nética. A porção efetora pode ser um fármaco citotóxico (um conjuga- do anticorpo-fármaco), uma toxina proteica (uma imunotoxina), ou um radionuclídeo (um radioimunoconjugado). Um exemplo de um conju- gado anticorpo-fármaco é brentuximab vedotina (ADCETRIS®, Seattle Genetics), que consiste no anticorpo monoclonal quimérico brentuxi- mab (cAC10, que direciona a proteína da membrana celular CD30) ligada a três a cinco unidades do agente antimitótico monometil auris- tatina E (MMAE, refletido pela 'vedotina' no nome do fármaco).
[0096] O anticorpo anti-CD24 ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo pode ser incluído em conjugados anticorpo-fármaco, imu- notoxinas ou radioimunoconjugados. O componente de direcionamen- to anti-CD24 de tais composições pode possibilitar a distribuição espe- cífica do conjugado para células e tecidos cancerosos, ao mesmo tempo em que limita a exposição de células e tecidos normais e dessa forma previne a toxicidade fora do alvo.
4. Composições de anticorpos de ADCC
[0097] O anticorpo anti-CD24 ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo, ou uma composição de anticorpo compreendendo um dos anticorpos acima, pode ser usado par estimular a morte de células cancerosas através de uma de citotoxicidade celular mediada por anti- corpos (ADCC) e fagocitose celular mediada por anticorpos (ADCP). ADCC é um mecanismo de defesa imune no qual um grupo específico de células imunes (células efetoras) do corpo atraem e lisam ativa- mente uma célula alvo (por exemplo, patógeno). ADCC foi identificado como uma importante resposta imunológica inata mediada por células e funciona como a primeira linha de defesa do corpo contra patógenos e age para limitar e conter infecções. O processo de ADCC é dese-
nhado para destruir a célula alvo recoberta por anticorpos através de um processo não fagocítico, e é caracterizado pela liberação direcio- nada de grânulos citotóxicos ou pela expressão de moléculas induto- ras de morte celular. O ADCC é tipicamente iniciado quando anticor- pos específicos (principalmente classes de IgG) do hospedeiro reco- nhecem e ligam os antígenos da superfície da membrana das células alvo e simultaneamente atraem os receptores de Fc (FcR) na superfí- cie de células efetoras. As células efetoras mais comuns que medeiam a ADCC são as células exterminadoras (NK) naturais, embora monóci- tos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e células dendríticas também sejam capazes de mediar uma resposta de ADCC. Embora a ADCC seja uma resposta bastante rápida, a eficácia varia dependendo de diversos parâmetros tais como a densidade do antígeno na superfície das células alvo e a afinidade da interação antígeno-anticorpo assim características dos fragmentos Fc que determinam interações do anti- corpo com vários membros da família de receptores de Fc.
[0098] A ligação do anticorpo aos receptores de superfície celular específicos nas células alvo, um processo denominado opsonização, é o evento fundamental do processo de ADCC. O processo de opsoni- zação atrai fagócitos para a célula alvo e pode iniciar a fagocitose. A ligação da região Fc do anticorpo aos FcRs nos fagócitos também faci- lita a formação de C3b, um produto clivado do componente 3 do com- plemento, que é uma proteína importante que inicia o engolfamento da célula alvo opsonizada pelo anticorpo. A fagocitose mediada por anti- corpos também é com frequência chamada de fagocitose mediada por células dependentes de anticorpos (ADCP). No entanto, para ADCC, o patógeno não precisa ser fagocitosado para ser destruído. Como ob- servado acima, o FcR na superfície de células efetoras citotóxicas é fundamental para provocar a ADCC. Nos seres humanos, as classes mais importantes de FcR que são capazes de provocar ADCC são
FcγRI (CD64), FcγRIIa e FcγRIIc (CD32), e o FcγRIIIa (CD16). No en- tanto, o receptor de FcγRIIb suprime a resposta de ADCC. Dessa for- ma, o equilíbrio entre sinais ativadores e inibitórios provenientes dos FcγRs é um determinante importante para a amplitude da resposta de ADCC. Após reconhecimento do alvo, grânulos intracelulares especia- lizados (também denominados lipossomas secretores) são liberados pelas células efetoras citotóxicas em um processo exocitótico polari- zado dependente de cálcio. Perforina, citolisina, e granzima B são os componentes fundamentais que são liberados a partir dos grânulos. A perforina insere e forma um poro no interior da membrana da célula alvo. Este processo requer cálcio. A granzima B causa fragmentação do DNA da célula alvo. Um exemplo de um anticorpo terapêutico que funciona por ADCC é o trastuzumab (Herceptin, Genentech). O tras- tuzumab direciona o HER2, que é expresso emm níveis anormalmente altos em um grande número de cânceres de mama e geralmente são chamados de cânceres de mama HER2-positivos, e inibe o crescimen- to de cânceres de mama HER2-positivos induzindo ADCC no hospe- deiro.
[0099] Os anticorpos usados para atividade mediada por ADCC usualmente requerem algum tipo de modificação para aumentar sua atividade de ADCC. Existem inúmeras tecnologias disponíveis para isto, as quais envolvem tipicamente a modificação genética do anticor- po para que os oligossacarídeos na região Fc do anticorpo não te- nham unidades do açúcar fucose, o que aumenta a ligação ao receptor de FcγIIIa. Anticorpos afucosilados apresentam maior citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Por exemplo, a tecnologia POTELLIGENT® da Biowa utiliza uma linhagem de células CHO no- cauteadas para o gene FUT8 para produzir anticorpos 100% afucosi- lados. FUT8 é o único gene que codifica a a1,6-Fucosiltransferase que catalisa a transferência de fucose da GDP-Fucose para GlcNAc em uma ligação a1,6 do oligossacarídeo tipo complexo. A Probiogen de- senvolveu uma linhagem de CHO que é geneticamente modificada pa- ra produzir níveis mais baixos de glicanas fucosiladas em MAbs, ape- sar de não ser através do nocaute de FUT. O sistema da Probiogen induz uma enzima bacteriana que redireciona a via da síntese de fuco- se de-novo para um açúcar nucleotídeo que não pode ser metaboliza- do para a célula. Como uma abordagem alternativa, a Seattle Genetics tem um sistema de alimentação exclusivo que produzirá níveis mais baixos de glicanas fucosiladas em MAbs produzidos em linhagens de células CHO (e talvez em outras linhagens celulares). A Xencor de- senvolveu uma tecnologia de domínio XmAb Fc que é desenhada para aumentar a eliminação de tumor e de outras células patológicas do sistema imunológico. Este domínio Fc tem duas alterações aminoací- dicas, resultando em uma afinidade 40 vezes maior para FcγRIIIa. Ele também aumenta a afinidade para FcγRIIa, com potencial para recru- tamento de outras células efetoras tais como macrófagos, que desem- penham um papel na imunidade por engolfamento e digestão de mate- rial estranho.
[0100] O anticorpo anti-CD24 ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo pode se incorporado em anticorpos destruidores de câncer mediados por ADCC. O componente de direcionamento anti-CD24 de tais composições pode possibilitar o direcionamento de distribuição específica das células cancerosas para destruição mediada por ADCC poupando, ao mesmo tempo, as células e tecidos normais. A atividade de ADCC do anticorpo anti-CD24 ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo pode ser aumentada por uma ou mais das modificações descritas neste pedido.
5. Composições de anticorpos biespecíficos
[0101] Esta invenção apresenta ainda um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro domínio de anticorpo compreendendo um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo unido a um segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo. O domínio do primeiro anticorpo pode compreender um anti- corpo anti-CD24 ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo des- crito neste pedido, e o segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo pode ligar-se a outras moléculas imunoestimula- doras. Em uma modalidade específica, o domínio do segundo anticor- po compreende um anticorpo anti-CD3 ou fragmento de ligação a antí- genos do mesmo. Neste caso, o anticorpo biespecífico pode direcionar especificamente células tumorais expressando a glicoforma específica de câncer da CD24, ligando-se simultaneamente à CD3 em células T citotóxicas, dessa forma atraindo as células T para o sítio do tumor com o que as células T se infiltrariam no tumor e levariam à citoxicida- de do tumor. Outros exemplos de anticorpos parceiros para uso em um anticorpo biespecífico com a finalidade de atrair células T citotóxi- cas ou outras células efetoras para o sítio do tumor são conhecidos na literatura.
[0102] O segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo pode direcionar uma via ou mecanismo antitumoral com- plementar. O domínio do segundo anticorpo pode compreender um anticorpo para imunoterapia contra câncer ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo que amplifica respostas imunológicas naturais. Exemplos de tais anticorpos para imunoterapia contra câncer incluem anti-PD-1, anti-B7-H1, anti-B7-H3, anti-B7-H4, anti-LIGHT, anti-LAG3, anti-TIM3, anti-TIM4 anti-CD40, anti-OX40, anti-GITR, anti-BTLA, anti- CD27, anti-ICOS ou anti-4-1BB. Tais anticorpos podem ser usados para tratar câncer. O segundo anticorpo ou fragmento de ligação a an- tígenos do mesmo pode ligar a cadeia TCR-α, a cadeia TCR-β, a ca- deia TCR-, ou a cadeia TCR-δ.
[0103] O anticorpo biespecífico pode compreender as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 17 e 18, ou qualquer uma das se- quências apresentadas nas SEQ ID NOs: 23-27 e 37-41.
[0104] Existem muitas tecnologias de anticorpos biespecíficos dife- rentes conhecidas na literatura. A maioria delas requer que os anticor- pos de 2 componentes estejam no formato de cadeia única para que as duas partes possam ser expressas em um único construto. Um mé- todo preferido é expressar os anticorpos como um fragmento variável de cadeia única (scFv). Exemplos não limitativos de tecnologias de anticorpos biespecíficos incluem BiTE (de "Bi-specific T-cell Engager"), DART (de "Dual-Affinity Re-Targeting"), imunoglobulina Fabs-in- tandem (FIT-Ig), e knobs-into-holes. Estes anticorpos biespecíficos compreendendo o anticorpo anti-CD24 ou fragmento de ligação a antí- genos do mesmo estão especificamente contemplados neste pedido.
6. Composições para terapia com CAR-T
[0105] Terapia com células T do receptor de antígeno químérico (CAR), ou terapia com CAR-T, é um tipo de tratamento celular no qual células T de um paciente com câncer são geneticamente modificadas ex vivo para expressar uma proteína CAR de modo que elas ataquem células cancerosas. Especificamente, células T são retiradas do san- gue de um paciente, que em particular pode ser o sangue do próprio paciente (autólogo), e são transfectadas com um construto gênico que expressa o receptor CAR recombinante. Grandes números de células T CAR são então desenvolvidas no laboratório e reintroduzidas no pa- ciente onde elas visam e destroem as células cancerosas do paciente. As células T também podem ser alogênicas de um doador compatível ou de uma linhagem de células T universal, ou "off-the-shelf", onde um ou mais dos genes de TCR e os locos de HLA classe I loci das células T alogênicas são rompidos e as células T resultantes não são capazes de reconhecer antígenos alogênicos.
[0106] Construtos de proteína CAR têm estruturas modulares compreendendo tipicamente os seguintes componentes de núcleo: um fragmento variável de cadeia única extracelular (scFv) derivado de um anticorpo, preso a um peptídio de dobradiça/espaçador e um domínio transmembranar, que está ainda ligado aos domínios de sinalização de células T intracelulares do receptor de células T. O scFv é o ele- mento de direcionamento e é expresso na superfície de uma células T CAR para especificidade para antígenos. O espaçador conecta o ele- mento de direcionamento extracelular ao domínio transmembranar e afeta a função do CAR e a flexibilidade do scFv. O domíndio trans- membranar atravessa a membrana celular, ancora o CAR à superfície da célula, e conecta o domínio extracelular ao domínio de sinalização intracelular, impactando assim a expressão do CAR na superfície da célula. O domínio coestimulador é derivado dos domínios de sinaliza- ção intracelulares, tais como CD28 e 4-1BB, que aumentam a produ- ção de citocinas. O domínio zeta de CD3 é derivado da porção de si- nalização intracelular do receptor de células T, que medeia a sinaliza- ção a jusante durante a ativação de células T. Exemplos de terapias com CAR-T aquelas que direcionam os antígenos da superfície de cé- lulas B CD19 (tais como JCAR017 e JCAR014 [Juno Therapeutics]), CTL019 (tisagenlecleucel-T (Kymriah™) [Novartis]) e KTE-C19 (axica- btagene ciloleucel (Yescarta®) [Kite Pharma]), e CD22 (JCAR014 [Ju- no Therapeutics]). Outros exemplos de terapias com CAR-T incluem aquelas que direcionam L1-CAM (JCAR023 [Juno Therapeutics]), ROR-1 (JCAR024 [Juno Therapeutics]) e MUC16 (JCAR020 [Juno Therapeutics]).
[0107] A porção scFv do CAR é um componente crítico e garante a especificidade para células cancerosas ao mesmo tempo em que previne a atividade contra células normais, que está associada à toxi- cidade fora do alvo. Portanto, a porção scFv é tipicamente derivada da porção de um anticorpo que reconhece uma proteína alvo especifica-
mente expressa em células cancerosas, porém com frequência muito mais baixa, ou de forma ideal não expressa, em outras células e teci- dos. Por conseguinte, um fragmento scFv derivado de qualquer um dos anticorpos anti-CD24 descritos neste pedido pode ser usado como componente de direcionamento para câncer de uma proteína CAR re- combinante. Em particular, a proteína scFv pode compreender a se- quência apresentada na SEQ ID NO: 28.
[0108] Células T CAR demonstraram efeitos impressionantes con- tra tumores hematológicos tais como leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfoblástica aguda de células B, leucemia mieloide do adulto, (AML), linfoma de células B grandes e difusas (DLBCL), linfo- ma não-Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma pri- mário de células B do mediastino (PMBCL), linfoma de células do manto (MCL), e mieloma múltiplo (MM). No entanto, até hoje as terapi- as com CAR-T apresentaram apenas efeitos limitados contra tumores sólidos. Devido ao padrão de expressão característico da CD24 em tumores e tecidos normais, os dados gerados com o uso de uma CD24 CAR-T demonstraram que os tipos de câncer que podem ser direcio- nados incluem, porém sem limitação, tumores cerebrais, câncer de cabeça e pescoço, sarcoma, câncer de pulmão, câncer gastrointesti- nal, câncer de mama, câncer de testículo, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado ou malignidades hematológicas.
7. Composições para terapia com TCR
[0109] Similarmente à terapia com CAR-T, terapia com receptores de células T geneticamente modificadas (TCR) é um tipo de tratamen- to celular no qual as células T de um paciente com câncer são geneti- camente modificadas ex vivo para expressar um TCR modificado para aumentar a capacidade dos receptores de células T para reconhecer e atacar antígenos de células antigênicas específicas quando são rein-
troduzidos no paciente. No entanto, ao contrário das células T CAR que reconhecem proteínas expressas na superfície, as imunoterapias com células T com usam TCRs de gene modificado foram mais direci- onadas para tumores sólidos. Os TCRs podem reconhecer proteínas específicas para tumor no interior das células. Quando as proteínas específicas para tumor são quebradas em fragmentos, elas aparecem na superfície celular com uma outra proteína denominada complexo de histocompatibilidade maior, ou MHC. Os TCRs são geneticamente manipulados para reconhecer uma combinação de fragmento de prote- ína específica para tumor/MHC. Exemplos de alvos para células T mo- dificadas com TCR incluem aquelas que direcionam MAGE-A3, tal como KITE-718 (Kite Pharma), antígeno 1 do tumor de Wilms (WT-1), tal como JTCR016 (Juno Therapeutics), e NY-ESO 1.
[0110] O TCR é um heterodímero que consiste em duas subuni- dades, TCRα e TCRβ. Cada subunidade contém uma região constante que se situa próxima à membrana de células T e ancora o receptor à membrana celular, e uma região hipervariável que funciona no reco- nhecimento de antígenos. Por conseguinte, um fragmento scFv deri- vado de qualquer um dos anticorpos anti-CD24 descritos neste pedido pode ser usado como um componente de direcionamento para câncer de uma proteína TCR recombinante. Em particular, a proteína scFv pode compreender a sequência apresentada na SEQ ID NO: 28.
8. Composições peptídicas
[0111] O anticorpo anti-CD24 descrito neste pedido, ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo, pode ligar-se a um epítopo blindado com glicana que fica exposta em células cancerosas, mas não em cé- lulas não cancerosas. Especificamente, o anticorpo anti-CD24 ou fra- gmento de ligação a antígenos do mesmo pode ligar-se a um peptídio CD24 compreendendo a sequência de aminoácidos SNSGLAPN (SEQ ID NO: 48). Por conseguinte, peptídios compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 48 podem ser usados para neutralizar anticorpos anti-CD24 que se ligam e epítopos compreendendo a se- quência de núcleo da sequência apresentada na SEQ ID NO: 48. Esta poderia ser usada em ensaios de anticorpos anti-fármacos para detec- tar anticorpos neutralizantes. Peptídios compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 48 podem ser usados para inibir os po- tenciais efeitos adversos associados a anticorpos que se ligam a epí- topos compreendendo o núcleo da sequência apresentada na SEQ ID NO: 48. O peptídio pode ser modificado para melhor estabilidade para uso IN VIVO por meio de métodos conhecidos no estado na técnica, incluindo, porém sem limitação, o uso de D-aminoácidos, substituição de O por S em uma ou mais ligações peptídicas, adição de uma se- quência de fusão para aumentar a solubilidade ou a meia-vida (por exemplo, fusões com albumina). Em ainda uma outra modalidade, uma molécula compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 48 pode ser usada como vacina para o tratamento e a profilaxia de câncer.
9. Métodos de tratamento
[0112] As composições de anticorpo anti-CD24, terapias celulares compreendendo tais como composições de anticorpo descritas neste pedido, podem ser usadas para tratar ou prevenir câncer ou outra do- ença proliferativa anormal. Neste pedido é apresentado um método de tal uso em um paciente com necessidade do mesmo, que pode com- preender administrar o anticorpo anti-CD24 ou um fragmento de liga- ção a antígenos do mesmo, ou uma composição farmacêutica com- preendendo o anticorpo acima, ao paciente. Tais moléculas e compo- sições farmacêuticas podem ser usadas na produção de um medica- mento para tratar ou prevenir câncer ou outra doença proliferativa anormal. Conforme usado neste pedido, o termo "câncer" refere-se a um neoplasma ou tumor resultante do crescimento descontrolado e anormal de células. Conforme usado neste pedido, câncer inclui expli- citamente leucemia e linfomas. O termo refere-se a uma doença que envolve células que têm o potencial de metastatizar para sítios distais. O paciente pode ser um ser humano.
[0113] O câncer ou outra doença proliferativa anormal pode ser (porém sem limitação) um ou mais dos seguintes: carcinoma, incluindo carcinoma de bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, pân- creas, estômago, cérvice, tireoide e pele; incluindo carcinoma de célu- las escamosas; tumores hematopoiéticos da linhagem linfoide, incluin- do, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Burkett; tumores hematopoiéticos da linhagem mieloide, incluindo leucemia mielogênica aguda e crônica e leucemia promielocítica; tumores de origem mesen- quimatosa, incluindo fibrosarcoma e rabdomiossarcoma; outros tumo- res, incluindo melanoma, seminoma, tetratocarcinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma, e schwannomas; tumores de ori- gem mesenquimatosa, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xenoderma pigmentoso, ceratoactantoma, seminoma, câncer folicular de tireoide e teratocarcinoma. Também é contemplado que cânceres causados por aberrações na apoptose também seriam tratados pelos métodos e composições da invenção. Tais cânceres podem incluir, porém sem limitação, linfomas foliculares, carcinomas com mutações p53, tumores de mama, próstata e ovário hormônio-dependentes, e lesões pré- cancerosas tal como polipose adenomatosa familiar, e síndromes mi- elodisplásicas. Em modalidades específicas, a malignidade ou altera- ções disproliferativas (tal como metaplasias e displasias), ou distúrbios hiperproliferativos, são tratados ou prevenidos pelos métodos e com- posições da invenção no ovário, bexiga, mama, cólon, pulmão, pele,
pâncreas ou útero. O câncer também pode ser sarcoma, melanoma ou leucemia.
[0114] O anticorpo anti-CD24 ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo pode ser usado em combinação com uma ou mais outras terapias antitumorais, incluindo, porém sem limitação, as quimioterapi- as tradicionais e experimentais atuais, terapias hormonais, terapias biológicas, imunoterapias, radioterapias ou cirurgia. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo anti-CD24 ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo pode ser administrado em combinação com uma quantida- de terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um ou mais agen- tes, anticorpos terapêuticos ou outros agentes conhecidos pelos espe- cialistas na técnica para o tratamento e/ou a prevenção de câncer, do- enças autoimunes, doenças infecciosas ou intoxicação. Tais agentes incluem, por exemplo, qualquer um dos modificadores da resposta bio- lógica discutidos acima, citotoxinas, antimetabólitos, agentes alquilan- tes, antibióticos, ou agentes antimitóticos, assim como imunoterápicos.
[0115] O anticorpo anti-CD24 ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo pode ser usado em combinação com uma ou mais imunote- rapias antitumorais. A imunoterapia antitumoral pode envolver molécu- las que rompem ou melhoram vias imunomoduladoras alternativas (tais como TIM3, TIM4, OX40, CD40, GITR, 4-1-BB, B7-H1, PD-1, B7- H3, B7-H4, LIGHT, BTLA, ICOS, CD27 ou LAG3) ou modulam a ativi- dade de moléculas efetoras tais como citocinas (por exemplo, IL-4, IL- 7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, GF-beta, IFNg, Flt3, BLys) e quimiocinas (por exemplo, CCL21) para aumentar os efeitos imunomoduladores. Modalidades específicas incluem um anticorpo biespecífico compreen- dendo o anticorpo anti-CD24 ou fragmento de ligação a anticorpos do mesmo e anti-PD-1 (pembrolizumab (Keytruda®) ou nivolumab (Opdi- vo®)), anti-B7-H1 (atezolizumab (Tecentriq®) ou durvalumab), anti-B7- H3, anti-B7-H4, anti-LIGHT, anti-LAG3, anti-TIM3, anti-TIM4 anti-
CD40, anti-OX40, anti-GITR, anti-BTLA, anti-CD27, anti-ICOS ou anti- 4-1BB. Em ainda uma outra modalidade, o anticorpo anti-CD24 ou fra- gmento de ligação a antígenos do mesmo pode ser administrado em combinação com moléculas que ativam diferentes estágios ou aspec- tos da resposta imunológica para obter uma resposta imunológica mais ampla. Em uma modalidade mais preferida, o anticorpo anti- CD24 ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo pode ser com- binado com anticorpos anti-PD-1 ou anti-4-1BB, sem exacerbar efeitos colaterais autoimunes.
10. Produção
[0116] O anticorpo anti-CD24 ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo pode ser preparado usando um sistema de expressão eu- cariótico. O sistema de expressão pode impor a expressão de um ve- tor em células de mamífero, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO). O sistema também pode ser um vetor viral, tal como um vetor retroviral de replicação defeituosa que pode ser usado para in- fectar células eucarióticas. O anticorpo anti-CD24 ou fragmento de li- gação a antígenos do mesmo também pode ser produzido a partir de uma linhagem celular estável que expressa o anticorpo a partir de um vetor ou uma porção de um vetor que fora integrado no genoma celu- lar. A linhagem celular estável pode expressar o anticorpo de um vetor retroviral de replicação defeituosa integrado. O sistema de expressão pode ser GPExTM.
[0117] O anticorpo anti-CD24 ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo pode ser purificado por, por exemplo, métodos cromatográ- ficos, tais como cromatografia por afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrófoba, troca de íons DEAE, fil- tração em gel, e cromatografia de hidroxiapatita. Em algumas modali- dades, é possível projetar proteínas de fusão para conter um domínio adicionado contendo uma sequência de aminoácidos que permita que os polipeptídios sejam capturados em uma matriz de afinidade. Por exemplo, os anticorpos descritos neste pedido compreendendo a regi- ão Fc de um domínio de imunoglobulina podem ser isolados do sobre- nadante da cultura de células ou de um extrato citoplasmático usando uma coluna de proteína A. Além disso, um marcador tal como c-myc, hemaglutinina, poli-histidina, ou Flag™ (Kodak) pode ser usado para auxiliar a purificação de polipeptídios. Tais marcadores podem ser in- seridos em qualquer parte do polipeptídio, incluindo o terminal carboxi- la ou amino. Outras fusões que podem ser úteis incluem enzimas que auxiliam na detecção do polipeptídio, tal como fosfatase alcalina, cro- matografia por imunoafinidade também pode ser usada para purificar polipeptídios. Vacinas
[0118] Este pedido apresenta um método para tratamento de cân- cer ou para profilaxia de um câncer, descrito neste pedido, em um pa- ciente. O método pode vacinar o paciente contra câncer. O método pode compreender administrar uma composição compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 48 a um paciente com neces- sidade da mesma. A composição também pode ser a um paciente com necessidade de tratar efeitos adversos associados a uma terapia que compreende o uso de um anticorpo anti-CD24 ou células expressando receptores ligando a CD24. A composição também pode ser usada na produção de um medicamento para tratamento de câncer ou profilaxia de câncer.
11. Composições farmacêuticas
[0119] Este pedido apresenta uma composição farmacêutica com- preendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos anticorpos anti-CD24, terapias celulares, ou composições peptídi- cas descritas acima, e um carreador ou excipiente fisiologicamente aceitável. A composição farmacêutica pode compreender uma quanti-
dade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do anticorpo anti- CD24 ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0120] Em uma modalidade específica, o termo "farmaceuticamen- te aceitável" significa aprovado pela agência reguladora do governo federal ou estadual ou incluído na Farmacopeia Americana ou outra farmacopeia comumente conhecida para uso em animais, e mais par- ticularmente em seres humanos. O termo "carreador" refere-se a um diluente, adjuvante (por exemplo, adjuvante de Freund (completo e incompleto), excipiente, ou veículo com o qual o terápico é administra- do. Tais carreadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de origem petrolífera, animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim entre outros. Água é um carreador preferido quando a composição farmacêutica é administrada por via intraveno- sa. Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol tam- bém podem ser usadas como carreadores líquidos, em particular para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, polvilho, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno, glicol, água, eta- nol, entre outros. A composição farmacêutica, se desejado, também pode conter pequenas quantidades de agentes umectantes ou emulsi- ficantes, ou agentes tamponantes de pH. Estas composições também adquirir a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação sistemática, entre ou- tras.
[0121] Em geral, os ingredientes da composição farmacêutica po- dem ser apresentados separados ou misturados um com o outro em uma forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou como um concentrado livre de água em um recipiente herme- ticamente fechado tal como uma ampola ou sachê indicando a quanti- dade de agente ativo. Quando a composição farmacêutica é para ser administrada por infusão, ela pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água estéril de grau farmacêutico ou solução salina. Quando a composição farmacêutica é para ser administrada por inje- ção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina deve ser fornecida para que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.
[0122] A composição farmacêutica pode ser formulada como for- mas neutras ou salinas. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém sem limitação, aqueles formados com ânions tais como deriva- dos de ácido clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico etc., e aqueles formados com cátions tais como aqueles derivados de hidró- xido de sódio, de potássio, de amônio, de cálcio, férrico, isopropilami- na, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
12. Métodos de administração
[0123] Métodos de administração das composições e composições farmacêuticas das mesmas incluem, porém sem limitação, administra- ção parenteral (por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperito- neal, intravenosa e subcutânea), epidural, e mucosa (por exemplo, vi- as intranasal e oral). Em uma modalidade específica, a composição é administrada por via intramuscular, intravenosa ou subcutânea. A composição pode ser administrada por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção de bolo, por absorção através do re- vestimento epitelial ou mucocutâneo (por exemplo, mucosa oral, mu- cosa retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada junto com um ou mais outros agentes biologicamente ativos. A administração pode se sistêmica ou local.
EXEMPLOS
[0124] A invenção apresenta múltiplos aspectos, ilustrados pelos exemplos não limitativos a seguir. Exemplo 1 Produção de anticorpos monoclonais contra CD24 hipoglicosilada
[0125] Superexpressão de NEU1 e CD24 em tumores sugere a desregulação da glicosidase. A desregulação da glicosidase sugere que a CD24, similarmente à MUC1, pode ser hipoglicosilada em tumo- res. A ligação do anticorpo, 3B6, à CD24 é impedida por ácido siálico glicanas (Fig. 1). Em relação ao anticorpo anti-CD24 comercialmente disponível, ML5 (BD bioscience), 3B6 liga-se fortemente à N-SA-CD24 e à N-SA-O-CD24, mas apenas fracamente à N-CD24 ou à CD24 to- talmente glicosilada, segundo detectado por ELISA. Isto sugeriu que os epítopos aos quais o 3B6 se liga são de fato a espinha dorsal da proteína e que a ligação do 3B6 é impedida pela glicosilação do epíto- po.
[0126] Os resultados da separação de células ativadas por fluo- rescência (FACS) e da coloração para imunofluorescência (IFA) mos- tram que o 3B6 se liga a múltiplas linhagens de células de câncer, in- cluindo neuroblastoma e medulloblastoma (Figs. 2A-B). O 3B6 liga-se às linhagens de células de neuroblastoma IMR32, SK-N-SH, SH- SY5Y, SK-N-BE(2), e SK-N-BE(2)C, mas não à SK-N-AS (Fig. 2A). O 3B6 também se liga a 3 dos 4 tumores do tipo meduloblastoma obtidos dos pacientes, segundo avaliação por coloração IFA (Fig. 2B). Estes dados sugerem que o 3B6 é capaz de se ligar a linhagens de células cancerosas e tumores. Exemplo 2 Maturação da afinidade
[0127] A afinidade de ligação do 3B6 para CD24 foi consideravel- mente mais baixa em relação aos anticorpos comerciais ML5 (BD Bioscience) e SN3 (Thermo Fisher). Para aumentar a afinidade e a especificidade da ligação do 3B6 ao seu antígeno, foi realizada matu- ração da afinidade de 3B6. Primeiro, clonamos a cadeia pesada (IgH) e a cadeia leve (IgL) do anticorpo 3B6, e identificamos a sequência da região variável da Ig como sendo: 3B6 IgH (SEQ ID NO: 1, as CDRs estão sublinhadas e em negrito)
EVKFEESGGGLVQPGGSIKLSCAASGVTFSEAWMDWVRQSPEKGL EWVAEIRDKTKNYVTYYAESVKGRFTISRDDSKSRVYLQMNNLRTED
TGIYYCTGAMDYWGQGTSVTVSS 3B6 IgL (SEQ ID NO: 2, as CDRs estão sublinhadas e em negrito)
DIVMTQTPLSLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSNGKTYLNWLQQRPGQ SPKRLIYQVSKLDPGIPDRFSGSGSETDFTLKISRVEAEDLGIYYCLQG TSYPWTFGGGTKLEIK
[0128] Os fragmentos VH e VL do anticorpo 3B6 parental foram convertidos para o formato scFv e clonados em um vetor de exposição em fagos. O scFv foi apresentado monovalentemente no fado, permi- tindo assim a seleção de clones de fagos com afinidades mais altas. Para verificar o nível de exposição de scFv, o scFv foi fusionado com o marcador de detecção Flag-6xHis. ELISA para fagos foi realizado para validar a ligação do anticorpo parental ao antígeno no formato de ex- posição em fagos. O sinal de ligação proveniente do sobrenadante de fagos foi significativo, e assim o projeto prosseguiu para a construção de bibliotecas.
[0129] Foram realizadas três rodadas de seleção e rastreamento. Concentrações decrescentes do antígeno CD24-GST e CD24-GST biotinilado foram usadas no rastreamento para selecionar os clones de ligação mais alta. 48 clones de cada biblioteca de mutagênese de CDR foram coletados, cultivados, analisados quanto à ligação e se- quenciados. Uma vez confirmadas as sequências dos clones de scFv de afinidade maturada, o scFv dos clones de afinidade maturada foi reformatado para os genes do anticorpo de comprimento integral e transitoriamente expresso em células de mamífero. Todos os anticor- pos de afinidade maturada foram submetidos à produção em pequena escala de 0,01 litro. O anticorpo parental também teve a produção am- pliada para comparação direta. Plasmídeos para as cadeias pesadas e leves indicadas (Tabela 1) foram transfectados em células HEK293 em suspensão usando um meio quimicamente definido na ausência de soro para fazer os anticorpos. Cinco dias depois da transfecção, o meio condicionado foi coletado e clarificado. Anticorpos inteiros no meio condicionado foram purificados usando o meio MabSelect SuRe Protein A (GE Healthcare). Tabela 1. Anticorpos produzidos em células HEK293 por transfecção transitória e purificação com IgG1 Parental Afinidade maturada painel 1 Afinidade maturada painel 2 PP6226- anti- PP6228 – P3050.H1.A4 PP6368 – P3050.Com H4040+L4040 CD24 H4041+L4040 H4069+L4069 F1.A11 PP6230 – P3050.H2.A7 PP6369 – P3050.Com H4042+L4040 H4070+L4069 F1.H4 PP6231 – P3050.H2.B11 PP6370 – P3050.Com H4043+L4040 H4071+L4069 F1.2F4 PP6232 – P3050.L3.B9 P6371 – P3050.Com H4040+L4041 H4072+L4070 F1.2F5 PP6233 – P3050.L3.C7 PP6372 – P3050.Com H4040+L4042 H4073+L4071 F1.C9 PP6234 – P3050.L3.D8 PP6373 – P3050.Com H4040+L4043 H4069+L4071 F1.2H1 PP6235 – P3050.H1.A4.L PP6387 – P3050.Com H4041+L4042 3.C7 H4071+L4071 F2.B1 PP6236 – P3050.H2.B11. PP6388 – P3050.Com H4043+L4042 L3.C7 H4072+L4069 F2.A5 Tabela: Lista da transfecção transitória e purificação feitas para obter a IgG. H40xx indica o construto da cadeia pesada e L40xx o construto da cadeia leve. P3050.xx indica o clone original obtido da garimpagem de fagos. Todas as IgG apresentaram boa expressão. Os números PP são códigos seriais usados para distinguir as proteínas produzidas.
[0130] Anticorpos de afinidade maturada purificados e o anticorpo parental foram avaliados quanto a sua afinidade para o antígeno por
ELISA competitivo. O anticorpo PP6226 (regiões variáveis parentais de 3B6) foi aplicado sobre placas a 2 µg/mL. Anticorpos de afinidade maturada foram primeiro incubados com CD24-GST, e depois incuba- dos com a placa, seguido por incubação secundária do anticorpo para detecção. Como mostrado nas Figs. 3-5, produzimos 16 anticorpos com capacidade variável para competirem com seus clones parentais. As sequências de aminoácidos das cadeias pesadas e leves desses anticorpos são as SEQ ID NOS: 3-10 (cadeias pesadas) e SEQ ID NOS: 11-16 (cadeias leves).
[0131] Para determinar se os clones de afinidade maturada apre- sentavam ligação mais forte à CD24 e se as interações são reguladas por glicanas, tratamos o CD24 com N-glicanase (N-CD24), sialidase NanA (SA-CD24) ou ambas (N-SA-CD24). Os 16 clones descritos nas Figs. 3-5 foram testados por ELISA. Como mostrado na Fig. 6, apesar da significativa afinidade para CD24-GST, PP6231 e PP6230 não se ligaram à CD24 expressa por células de mamífero independente da glicosilação. Por outro lado, a maioria dos outros clones manteve a ligação preferencial para CD24 que são tratadas com sialidase e N- glicanase. Contudo, como o impacto relativo da sialidase e da N- glicanase na ligação ao anticorpo varia consideravelmente entre clo- nes diferentes, cada clone deve ser testado individualmente para de- terminar sua suscetibilidade bloqueio das glicanas.
[0132] Escolhemos 6 clones com forte ligação à SA-N-CD24, mas que apresentam ligação mínima à CD24, e testamos os mesmos quan- to à ligação à duas linhagens de células de câncer, a linhagem celular H727 de câncer de pulmão e a linhagem celular IMR32 de neuroblas- toma. Como mostrado na Fig. 7, apesar de sua ligação semelhante à SA-N-CD24, os 6 clones apresentaram ligação significativamente dife- rente a células cancerosas. O importante é que PP6373 apresenta li- gação significativamente mais forte a ambas as linhagens de células de câncer testadas. Portanto, este clone foi escolhido para estudo adi- cional. A sequência da cadeia pesada para PP6373 está mostrada na SEQ ID NO: 6 e a sequência da cadeia leve está mostrada na SEQ ID No.16. Em relação à sequência parental, a cadeia pesada tem três mutações na CDR2, ao passo que a cadeia leve tem uma mutação na CDR3 da cadeia leve. Como mostrado na Fig. 8, estas mutações não só aumentaram a ligação à SA-N-CD24 em quase 100 vezes, como também deixaram a interação regulada de forma mais rigorosa pela dessialilação. Também cabe observar que PP6373 adquiriu a capaci- dade de se ligar à CD24 mesmo sem desglicosilação no nível de 1/1000 daquele para SA-N-CD24. No entanto, como se sabe as célu- las CHO possuem glicosilação incompleta, é provável que a ligação reflita a sensibilidade mais alta do anticorpo para detectar a glicoforma menor na CD24 recombinante preparada a partir de células CHO. Exemplo 3 Epítopo antigênico reconhecido pelo 3B6 e pelo PP6373
[0133] Para determinar o epítopo antigênico reconhecido pelo 3B6 e pelo clone de afinidade maturada PP6373, sintetizamos peptídios sobrepostos cobrindo a sequência de aminoácidos da CD24 madura (Seq ID No 42), e pré-incubamos os mesmos com o anticorpo 3B6 an- tes da adição do 3B6 a placas pré-revestidas com a proteína N-O- CD24 (CD24Fc pré-tratada sequencialmente com N-glicosidase, NanA e O-glicosidase). Como mostrado na Fig. 9, dos 5 peptídios testados (SEQ ID NOS: 43-47), apenas o peptídio 4 (SEQ ID NO: 46) demons- trou bloqueio signficativo da interação 3B6-CD24, o que sugere que o epítopo de ligação à CD24 está contido nesta sequência. Para confir- mar que o PP6373 reconhece o mesmo epítopo, titulamos os cinco peptídios em uma ampla faixa de doses. Como mostrado na Fig. 10, apenas o peptídio 4 mostrou inibição dose-dependente da ligação de PP6373 à SA-N-CD24.
[0134] Para definir o sítio de ligação mínima do PP6373, um ami- noácido por vez foi truncado no peptídio 4 e comparamos sua inibição da ligação do PP6373 à SA-N-CD24. Como mostrado na Fig. 11, en- quanto que a deleção de 3 aminoácidos do C-terminal anulava a inibi- ção, a deleção de um ou dois aminoácidos aumentava significativa- mente a inibição (painel à esquerda). Além disso, a deleção de qual- quer aminoácido do N-terminal do peptídio 4 também anulada a inibi- ção (painel à direita). Estes dados identificam a SNSGLAPN (SEQ ID NO: 48) como o epítopo ótimo reconhecido pelo PP6373.
[0135] A identificação do epítopo antigênico permite a produção de anticorpos adicionais com propriedades similares. Em uma modalida- de, é possível produzir novos anticorpos usando o peptídio sintético compreendendo a sequência SNSGLAPN (SEQ ID NO: 48). O peptí- dio pode ser acoplado a um outro carreador proteico imunogênico, ou usado junto com adjuvantes. Em uma modalidade, poder-se-ia usar o peptídio para identificar outros mAbs anti-CD24 que reconhecem o mesmo epítopo para produzir anticorpos específicos para câncer para o diagnóstico e o tratamento de câncer. Em ainda uma outra modali- dade, o peptídio antigênico pode ser usado para neutralizar ou inibir os potenciais efeitos adversos associados aos anticorpos que se ligam a epítopo compreendendo a sequência de núcleo de SEQ ID NO: 48. O peptídio pode ser modificado para melhor estabilidade para uso in vivo por meio de métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo, po- rém sem limitação, o uso de D-aminoácidos, substituição de O por S em uma ou mais ligações peptídicas, adição, de uma sequência de fusão para aumentar a solubilidade ou a meia-vida (por exemplo, fusão com albumina). Em ainda uma outra modalidade, uma molécula com- preendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 48 pode ser usada como uma vacina para o tratamento e a profilaxia de vacina contra câncer.
Exemplo 4 Expressão do epítopo antigênico em tecidos normais versus tecidos malignos
[0136] Para determinar se o epítopo reconhecido pelo PP6373 é preferencialmente apresentado em tecidos cancerosos vs. tecidos normais, analisamos a ligação do tecido por imunofluorescência usan- do PP6373 biotinilado. Os dados dos tecidos normais estão resumidos na Tabela 2, ao passo que aqueles dos tecidos cancerosos estão re- sumidos na Tabela 3. Além disso, avaliamos a ligação do anticorpo ao câncer cerebral normal ou benigno e maligno. Os dados estão resu- midos na Tabela 4. Tabela 2. Coloração de PP6373 para imunofluorescência mostrou li- gação mínima a tecidos normais. Órgão +/- Padrão de coloração Estômago normal - Duodeno normal - Intestino delgado normal - Cólon normal - Glândula parótica normal - Glândula tireoide normal - Pâncreas normal + Superfície celular fraca, in- tracelular? Próstata normal - Aorta normal - Testículo normal - Omento maior normal - Mama normal - Linfonodo normal - Pele normal - Medula oblonga normal Baço normal - Pouco positivo, superfície celular?
Órgão +/- Padrão de coloração Útero normal - Vagina normal - Bexiga normal - Nervo normal - Tabela 3. Reatividade do PP6373 a tecidos malignos Órgão Percentagem de Padrão de coloração positivos Cólon maligno 0/1 Esôfago maligno 0/1 Estômago maligno 0/2 Ovário maligno 16/25 superfície celular Tecido mole maligno 0/1 Rim maligno 1/1 superfície fraca Fígado maligno 14/19 superfície celular Mama maligna 12/20 superfície celular Pele maligna 1/1 superfície celular Testículo maligno 1/1 Superfície intracelu- lar/celular Pulmão maligno 11/39 superfície celular Tabela 4. Ligação do PP6373 a tumores cerebrais normais ou benig- nos e malignos Patologia Superfície ce- Intracelular Negativo lular Astrocitoma 2/24 (8%) 17/24 (71%) 5/24 (21%) Glioblastoma 3/8 (38%) 2/8 (25%) 5/8 (37%) Oligodendroglioma 4/8 (50%) 3/8 (38%) 1/8 (12%) Ependimoma 5/8 (63%) 0/8 (0%) 3/8 (37%) Meduloblastoma 7/10 (70%) 0/10 (0%) 3/10 (30%) Meningioma benigno 0/22 (0%) 15/22 (68%) 7/22 (32%) Tecido normal do SNC 0/16 (0%) 0/16 (0%) 16/16 (100%)
[0137] Como mostrado na Tabela 2, à exceção do pâncreas e tal- vez do baço, o PP6373 não coloriu tecidos normais. Cabe observar que a maior parte da coloração no pâncreas parecia intracelular. No baço, um número excelente de células apresentou coloração. Em con- traste, como mostrado na Tabela 3, a maioria dos cânceres testados apresentaram forte ligação ao PP6373. Como mostrado na Tabela 4, embora tecidos normais do SNC sejam destituídos de CD24, meningi- oma benigna presenta coloração na superfície intracelular embora não na superfície celular. O que é importante é que tumores cerebrais ma- lignos, incluindo astrocitoma, glioblastoma e oligodendroglioma apre- sentam coloração na superfície celular em um índice que varia de 8- 70%, além disso, alguns tecidos cancerosos apresentaram coloração intracelular.
[0138] Em uma modalidade, o PP6373 pode ser usado para dife- renciar tumor cerebral maligno de tumor cerebral normal ou benigno. Em uma outra modalidade, PP6367 pode ser usado para identificar tecidos cancerosos em órgãos sólidos, tais como fígado, pulmão, ma- ma e ovário. Exemplo 5 PP6373 retarda o crescimento de câncer de pulmão in vivo
[0139] Para testar se o PP6373 pode retardar o crescimento do tumor in vivo, desafiamos camundongos nus com a linhagem celular H727 câncer de pulmão humano por via subcutânea. Depois que o tumor ficou palpável, os camundongos portadores de tumor receberam duas injeções de PP6373 5 mg/kg (14 e 21 dias após a inoculação com H727). Como mostrado na Fig. 12, em relação ao controle com IgG, o tumor tratado com PP6373 cresceu a uma taxa substancialmen- te reduzida. Estes dados demonstram que o PP6373 não modificado é capaz de apresentar atividade antitumoral in vivo.
[0140] Consistente com o retardamento do tumor in vivo, os estu- dos in vitro demonstram que o PP6367 medeia a potente citotoxicida- de celular dependente de anticorpos, como demonstrado na Fig. 13.
[0141] Como a ADCC é afetada pela glicosilção, especialmente pela fucosilação, foi usada engenharia genética de anticorpos para produzir PP6373 sem fucosilação FC do núcleo (d6373). Como mos- trado na Fig. 14, a fucosilação aumentou a atividade de ADCC do PP6373.
[0142] Os dados demonstram que o PP6373 pode ser usado para tratar câncer. Em uma modalidade, PP6373 WT IgG1 pode ser usado como anticorpos terapêuticos contra câncer, para serem administrados a pacientes com câncer. Em uma outra modalidade, o anticorpo pode ser glicosilado seja quimicamente ou produzido em uma linhagem ce- lular que não possua fucosil transferase. Exemplo 6 Anticorpos biespecíficos baseados na sequência do PP6373 e do OKT3
[0143] Para armar anticorpos anti-CD24, produzimos anticorpos biespecíficos que se ligam tanto à CD24 quanto à CD3. Em uma mo- dalidade, anticorpos anti-CD24 e anti-CD3 (OKT3) são convertidos em anticorpos de cadeia única com reatividade para CD24 e CD3, respec- tivamente, e ligados pela sequência ligante flexível GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 49). A sequência do anticorpo de cadeia única PP6373 está mostrada na SEQ ID NO:17, enquanto que a sequência da cadeia única do OKT3 está mostrada como SEQ ID NO: 18.
[0144] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico é gerado através da tecnologia "knob into hole" na qual os dois participantes da molécula biespecífica possuem mutações complementares na região Fc para criar "knobs" e "holes" para facilitar a formação de heterodíme- ros biespecíficos. As sequências das variantes "knobs" e "holes" do PP6373 e do OKT3 estão mostradas nas SEQ ID NOS:19-22. Para avaliar a biespecificidade das configurações "knob into hole", desen-
volvemos um ensaio que consiste em colorir células Jurkat com o pro- duto da cotransfecção de diferentes produtos tipo "knob-hole". Em su- ma, células Jurkat CD3+ foram primeiro coloridas com os sobrenadan- tes da cultura de tecido das células 293T transfectadas. Depois da re- moção dos anticorpos não ligados, as células foram incubadas com SA-N-CD24 biotinilada. As quantidades de SA-N-CD24 nas células Jurkat foram detectadas por PE-estreptavidina. Como mostrado na Fig. 15, a combinação de PP6373-hole e OKT3-knob produz a ligação mais alta de CD24 a células Jurkat, o que indicou que o pareamento PP6373-hole e OKT3-knob é mais adequado para a estratégia do "knob-hole".
[0145] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico é gera- do por repetição em tandem de dois motivos de ligação de cadeia úni- ca. Mais uma vez, comparamos a atividade de duas configurações com os motivos de ligação diferentes em ordens opostas, PP6373- OKT3 e OKT3-PP6373, como mostrado nas Seq ID-23 e 24, respecti- vamente. Como mostrado na Fig. 16, o construto com a cadeia única de PP6373 na extremidade N-terminal (PP6373-OKT3; SEQ ID NO:23) apresenta maior atividade biespecífica.
[0146] Para determinar se o anticorpo biespecífico tem atividade celular antitumoral, co-incubamos a linhagem celular H727 de câncer de pulmão com células T que haviam sido ativadas com anti-CD3 e anti-CD28 por 2 dias. Primeiro testamos se a célula cancerosa poderia desencadear especificamente a produção de citocinas. Como mostra- do na Fig. 17, citocinas significativas são induzidas pelo anticorpo bi- específico, mas não pelo OKT3-Fc de PP6373-Fc. O que é mais im- portante, o anticorpo biespecífico não induz a produção de citocinas, a não ser que tanto células T quanto células tumorais estejam presentes ao mesmo tempo. Estes dados demonstram que os anticorpos biespe- cíficos desencadeiam a ativação de células T atraindo tanto células T como células tumorais.
[0147] Paralelamente ao ensaio de liberação de citocinas, também avaliamos a citotoxicidade em células tumorais baseada na contagem baseada nas contas de células tumorais vivas marcadas com corante. Como mostrado na Fig. 18, os anticorpos biespecíficos causam perda de células tumorais se, e somente se, células T estiverem presentes.
[0148] Como ainda uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico pode ser produzido por uma tecnologia de FIT-Ig. Em suma, o anti- corpo biespecífico é formado por coexpressão de três construtos codi- ficando VL6373-CL-VHOKT3-CH1-Fc (SEQ ID NO: 25), VH6373-CH1 (SEQ ID NO: 26), e VLOKT3-CL (SEQ ID NO: 27), respectivamente. Como mostrado na Fig. 19, o anticorpo FIT-Ig apresentou boas atividades de ligação biespecífica tanto para o OKT3 quanto para o SA-N-CD24. Além da ligação, também descobrimos que este anticorpo biespecífico induzia resposta de citocina significativa (Fig. 20) e citotoxicidade para células tumorais (Fig. 21). Adicionalmente, este anticorpo biespecífico (FIT-Ig) apresentou maior estabilidade térmica em relação aos anticor- pos biespecíficos anteriores PP6373-OKT3 e OKT3-PP6373 (Fig. 22). Exemplo 7 Uso de PP6373 para células T modificadas com receptor de antígeno quimérico (CAR) (CAR-T) para terapia contra câncer
[0149] Os anticorpos anti-CD24 reagem com um amplo espectro de células cancerosas e podem ser usados para produzir um receptor de antígeno quimérico para conferir atividade anticâncer às células T. Em uma modalidade, a sequência do Fv de cadeia única do PP6373 (SEQ ID NO:28) ou outra cadeia única de mAb anti-CD24 (al- phaCD24SC) é inserida em um vetor CAR-T conhecido na literatura, representado na Fig. 23. O construto é então inserido em vetores gê- nicos conhecidos na literatura, incluindo aqueles derivados de retroví- rus, lentivírus, vírus adeno-associado ou vetores adenovirais.
[0150] Para testar a atividade do CAR, PBMCs de doadores sau- dáveis foram enriquecidas por células T usando o kit de isolamento de células T pan, humanas (Miltenyl Biotec) (Dia 0). As células T pan hu- manas foram estimuladas com anti-CD3 e anti-CD28 por 24 horas e cultivadas com IL-2 por 2 dias. Células T ativadas foram pseudo- tratadas (T de controle) ou infectadas com lentivírus portador de CD24-CAR (Dia 2). Para testar a atividade antitumoral das CAR-T, cé- lulas T de controle ou células CD24 CAR-T foram co-cultivadas com células tumorais marcadas com CellTrace Violet (Thermo Fisher) por uma noite. A lise das células tumorais foi medida por coloração com o corante de viabilidade fixável Dye eFluor™ 660 (eBioscience) e calcu- lada pela fórmula: Lise % = (mortas% - autólise %) / (1-autólise%)
[0151] Como mostrado na Fig. 24, ao longo de uma ampla gama de razões de efetoras para alvo (E/T), as CD24 CAR-T apresentaram potente citotoxicidade para a linhagem celular A549 de câncer de pul- mão.
[0152] Para testar se a CAR-T é ativada por células cancerosas, incubamos 4x104 células CAR-T ou células T de controle com células tumorais A549 por uma noite e medimos o IFNγ nos sobrenadantes. Como mostrado na Fig. 25, as células CAR-T, mas não as células T de controle, produziram IFNγ em resposta à estimulação de células tumo- rais A549. Uma vez que a CD24 é largamente expressa entre múltiplas linhagens de tipos de câncer. Como mostrado na Fig. 26, CD24 CAR-T apresenta ampla citotoxicidade contra muitos tipos de câncer, incluin- do câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de próstata, câncer cervical, neuroblastoma e glioma.
[0153] Juntos, os dados demonstram que uma CD24 CAR-T, ba- seada em nosso anticorpo, tem grande potencial no tratamento de câncer. Os tipos de câncer que podem ser tratados incluem, porém sem limitação, tumores cerebrais, câncer de cabeça e pescoço, sar- coma, câncer de pulmão, câncer gastrointestinal, câncer de mama, câncer de testículo, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de fígado ou malignidades hematológicas. Exemplo 8 Humanização do PP6373 para terapia contra câncer
[0154] Foi construído um modelo de homologia de Fv de PP6373 usando a estrutura de pdb 4PB0 como a estrutura modelo. A VH e a VL compartilham >90% de homologia com aquelas do 4PB0. Ao con- sultar um banco de dados de Ig humana, a sequência da região V IGHV3-73*01 e a sequência da região J IGHJ4*01 da linhagem germi- nativa humana foram identificadas como estruturas adequadas e foram usadas como o esqueleto do aceptor humano para as regiões CDR da cadeia pesada (Onc-1 VH). A sequência da região V IGKV2-29*02 e a sequência da região J IGKJ4*01 da linhagem germinativa humana fo- ram aplicadas como o esqueleto do aceptor humano para as regiões CDR da cadeia leve (Onc-1 VL). Foram desenhadas quatro sequên- cias de VH e quatro sequências de VL (SEQ ID NOS: 29-36). Os no- vos produtos melhoraram os escores de humanização de 73% para >83% na VH e de 80% para >83% na VL. O alinhamento estrutural do Fv de PP6373 murino, e do Fv de uma versão humanizada de PP6373 (hu-VHv1VLv1; SEQ ID NOS: 29 e 33) demonstrou um alto grau de semelhança (Fig. 27).
[0155] Para selecionar a melhor combinação funcional de HuVH e HuVL para ligação à CD24, diferentes combinações foram cotransfec- tadas em células 293 por 72 horas. Dois ELISAs foram então realiza- dos com meio de expressão. ELISA 1: uma placa de 96 poços foi re- vestida com IgG policlonal de cabra-anti-humana purifcada (GAH) e, depois do bloqueio, foi acrescentado meio de expressão ou IgGs de controle purificadas, e IgG-HRP de cabra-anti-humana foi usada como o anticorpo de detecção. ELISA 2: uma placa de 96 poços foi revestida com a proteína CD24-GST e, depois do bloqueio, foi acrescentado meio de expressão ou IgGs de controle purificadas, e IgG-HRP de ca- bra-anti-humana foi usada como o anticorpo de detecção. Se a ligação do anticorpo PP6373 quimérico for considerada igual a 100% nos dois ELISAs, as várias combinações de VH e VL apresentando diferentes graus de ligação serão comparadas com aquela do anticorpo quiméri- co e classificadas por ligação relativa (as guias selecionadas a partir do pré-rastreamento serão novamente comparadas depois da purifica- ção). Os dados da primeira rodada de pré-rastreamento estão resumi- dos na Fig. 28 e os dados deste experimento sugeriram que, a) L3 apresentou alta capacidade de ligação por unidade de proteína que fez de L3 uma guia; e b) H1L3 (SEQ ID NOS: 29 e 35), H2L3 (SEQ ID NOS: 30 e 35), H3L3 (SEQ ID NOS 31 e 35) e H4L3 (SEQ ID NOS: 32 e 35) são as quatro guias de humanização para PP6373.
[0156] Para testar se os anticorpos guias H2L3 e H3L3 conservam sua capacidade de se ligarem a células tumorais, biotinilamos os anti- corpos humanizados junto com o PP6373. Como mostrado na Fig. 29, embora o PP6373 tenha ligação melhor às duas células de câncer tes- tadas, tanto o H2L3 quanto o H3L3 apresentam forte ligação com IC50 na faixa nM.
[0157] Realizamos ensaios de ADCC usando PBL (Fig. 30, Fig. 31) ou células NK purificadas (Fig. 32) de PBL de efetores, e células A549 como células alvo. Surpreendentemente, embora H2L3 e H3L3 não se liguem tão bem a células tumorais (Fig. 29), elas são efetores mais potentes na ADCC quando se usa baixa concentração de anti- corpo (Fig. 30). Como esperado, o PP6373 desfucosilado (d6373) é mais potente na ADCC (Fig. 31, Fig. 32).
[0158] Juntos, os dados demonstram que clones humanizados de PP6373 apresentam ligação significativa a células cancerosas huma-
nas e atividade de ADCC surpreendentemente potente. Em uma mo- dalidade, os anticorpos podem ser usados para tratar câncer. Em uma outra modalidade, o anticorpo humanizado pode ser usado como um componente fundamental de um anticorpo biespecífico. Para explorar esta atividade, geramos dois construtos contendo H3 e L3 para produ- zir anticorpos biespecíficos baseados na tecnologia FIT-Ig. As sequên- cias para os anticorpos FIT-Ig humanizados estão mostradas na Seq ID-37 e 38, e são usados junto com a SEQ ID NO: 27. Adicionalmente, também fizemos algumas mutações para otimizar as sequências de FIT-Ig humanizados e elas estão mostradas na Seq ID-39-41. Especi- ficamente, todas as três sequências compreendem uma sequência- sinal na extremidade N-terminal para purificação e síntese de proteí- nas; na Seq ID-39: uma mutação (D para A) foi introduzida na região Fc para prevenir ADCC; na Seq ID-27, há um R extra entre VLOKT3 e CL que foi induzido pelo sítio da enzima de restrição durante a cons- trução e na Seq ID-41, o R extra foi deletado.
[0159] Em ainda uma outra modalidade, anticorpos humanizados podem ser usados como um componente fundamental de CAR-T para terapia contra câncer, usando métodos conhecidos na literatura. Exemplo 9 Anticorpos anti-CD24 com epítopos blindados com glicana não se li- gam a células normais com alta expressão de CD24
[0160] Uma exigência fundamental da imunoterapia baseada em anticorpos é a reatividade mínima para tecidos normais. Como a CD24 é expressa em abundância em células hematopoiéticas, principalmen- te em granulócitos, células B, parte dos glóbulos vermelhos e parte dos monócitos, comparamos o PP6373 e seus dois clones humaniza- dos, H2L3 e H3L3, com o mAb anti-CD24 convencional, ML5. Como mostrado na Fig. 33, embora o ML5 apresenta forte ligação a células que normalmente expressam níveis altos de CD24, o H2L3 e o H3L3 não se ligam a células B e a glóbulos vermelhos, e mal de ligam a gra- nulócitos.
Este resultado demonstra ligação mínima a outros tipos de células tais como macrófagos, e uma fração de linfócitos não B.

Claims (32)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição compreendendo um anticorpo, caracteriza- da pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo que é blindado por glicana em células não cancerosas, porém exposto em células cancerosas.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que o anticorpo se liga à CD24.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que o anticorpo se liga a um peptídio compreenden- do a sequência apresentada na SEQ ID NO: 48.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1, e uma região variável da cadeia leve compreendendo a se- quência apresentada na SEQ ID NO: 2.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo qualquer uma das sequências apre- sentadas nas SEQ ID NOS: 3-10, e uma região variável da cadeia leve compreendendo qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOS: 11-16.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracteri- zada pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequên- cia apresentada na SEQ ID NO: 16.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo qualquer uma das sequências apre- sentadas nas SEQ ID NOS: 29-32, e uma região variável da cadeia leve compreendendo qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOS: 33-36.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracteri- zada pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 30 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a se- quência apresentada na SEQ ID NO: 35.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracteri- zada pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a se- quência apresentada na SEQ ID NO: 35.
10. Anticorpo biespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro domínio de anticorpo compreendendo a composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e um segundo domínio de anticorpo compreendendo um segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo.
11. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o domínio do segundo anticorpo atrai células T efetoras imunes para as células cancerosas para imu- noterapia contra câncer.
12. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo se liga à CD3.
13. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende as sequências apre- sentadas nas SEQ ID NOS: 17 e 18.
14. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende qualquer uma das se- quências apresentadas nas SEQ ID NOS: 23-27 e 37-41.
15. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo se liga à cadeia TCR-α, à cadeia TCR- β, à cadeia TCR-, ou à cadeia TCR-δ.
16. Anticorpo ou anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que apresenta atividade de citotoxicidade celular mediada por anticorpos (ADCC).
17. Anticorpo ou anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que é modificado para apresentar atividade de ADCC aumentada.
18. Anticorpo ou anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que apresenta atividade de fagocitose celular mediada por anticorpos (ADCP).
19. Anticorpo ou anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que é modificado para apresentar atividade de ADCP aumentada.
20. Receptor de antígeno quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo de cadeia única compreendendo a composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 9.
21. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com a rei- vindicação 0, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 28.
22. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de o anticorpo, o anticorpo biespecífico, ou o receptor de antígeno quimérico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 0, e uma segunda terapia contra câncer.
23. Método para o tratamento de câncer em um paciente com necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compre-
ende administrar o anticorpo, o anticorpo biespecífico, o receptor de antígeno quimérico, ou a composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 0 ao paciente.
24. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de pulmão, câncer de ovário, cân- cer de mama, câncer de fígado, câncer cerebral, câncer cervical, cân- cer renal, câncer de testículo, câncer de próstata, ou neuroblastoma.
25. Método para o tratamento de efeitos adversos associa- dos a uma terapia compreendendo anticorpos anti-CD24 ou células expressando receptores de ligação à CD24 em um paciente com ne- cessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende ad- ministrar uma composição compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 48 ao paciente.
26. Método para o tratamento ou a profilaxia de câncer em um paciente com necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma composição compreendendo SEQ ID NO: 48 ao paciente.
27. Método para diagnóstico de tecidos malignos ou lesões metastáticas, caracterizado pelo fato de que compreende o uso do an- ticorpo, como definido na reivindicação 1.
28. Método para identificação de células cancerosas circu- lantes, caracterizado pelo fato de que compreende o uso do anticorpo, como definido na reivindicação 1.
29. Uso do anticorpo, do anticorpo biespecífico, do receptor de antígeno quimérico, ou da composição, como definidos em qual- quer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizados pelo fato de que são para a fabricação de um medicamento para o tratamento de cân- cer.
30. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de pulmão, câncer de ovário, cân-
cer de mama, câncer de fígado, câncer cerebral, câncer cervical, cân- cer de ovário, câncer renal, câncer de testículo, câncer de próstata, ou neuroblastoma.
31. Uso de uma composição compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 48, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar efeitos adversos associa- dos ao uso terapêutico de anticorpos anti-CD24 ou células expressan- do receptores de ligação à CD24.
32. Uso de uma composição compreendendo a SEQ ID NO: 48, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um me- dicamento para o tratamento ou a profilaxia de câncer.
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