ES2937699T3

ES2937699T3 - Composiciones y métodos de inmunoterapia celular

Info

Publication number: ES2937699T3
Application number: ES17833264T
Authority: ES
Inventors: Zonghai Li; Huiping Gao; Peng Wang; Hua Jiang; Huamao Wang
Original assignee: Crage Medical Co Ltd
Current assignee: Crage Medical Co Ltd
Priority date: 2016-04-22
Filing date: 2017-04-21
Publication date: 2023-03-30
Anticipated expiration: 2037-04-21
Also published as: CN109414512A; KR20180134419A; EP3445407A4; US20190151362A1; KR102529012B1; KR20220125378A; EP3445407B1; US11596653B2; EP3445407A1; JP2019515913A; EP4201422A1; WO2018018958A1; JP7145761B2

Abstract

Se proporciona un método para tratar a un sujeto que presenta un tumor sólido que expresa GPC3, que comprende administrar al sujeto células inmunosensibles al receptor de antígeno quimérico anti-GPC3, donde la administración tiene lugar después o al mismo tiempo que somete al sujeto a un tratamiento de reducción de linfocitos. También se proporciona un kit utilizado en el método. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos de inmunoterapia celular

Antecedentes

El cáncer tiene un gran impacto en la sociedad en todo el mundo. En 2016, se estima que se diagnosticarán 1.685.210 nuevos casos de cáncer solo en los Estados Unidos y 595.690 personas morirán a causa de la enfermedad. Para 2020, 18,2 millones de estadounidenses, aproximadamente 1 de cada 19 personas, serán pacientes de cáncer o superviviente de cáncer, frente a los 11,7 millones (1 de cada 26) de 2005, de acuerdo con la Journal of Oncology Practice (Erikson 2007).

Los receptores quiméricos para el antígeno (los CAR, del inglés chimeric antigen receptor) son receptores recombinantes para antígenos, que, en una única molécula, redirigen la especificidad y la función de los linfocitos T y de otras células inmunitarias. Su utilización en la inmunoterapia del cáncer puede ser generar rápidamente linfocitos T dirigidos al tumor sorteando los obstáculos de la inmunización activa. Una vez expresados en las células, la célula modificada con CAR puede ejercer efectos tanto inmediatos como a largo plazo en un sujeto.

La terapia con linfocitos T con receptor quimérico para el antígeno (CAR), que edita los linfocitos T de un paciente con cáncer para reconocer sus tumores, ha demostrado ser eficaz para el tratamiento de las neoplasias hemáticas. En ensayos clínicos recientes, la terapia con linfocitos T CAR ha mejorado drásticamente los resultados de los pacientes con formas avanzadas de leucemia y linfoma no tratables de otro modo. Por el contrario, los linfocitos T CAR enfrentan un conjunto único de retos en el contexto de los tumores sólidos. Entre los retos se incluye la identificación de un antígeno cuya expresión demarque claramente el tejido tumoral del normal y establezca la destrucción eficaz de las células tumorales dentro de un tumor y, por tanto, la reducción del tamaño tumoral.

El documento EP 2 995 682 A1 (CARSGEN THERAPEUTICS LTD) y Gao et al. (Clinical Cancer Research, 2014, 20(24):6418-28) describen el tratamiento de modelos de xenoinjerto de carcinoma hepatocelular con linfocitos T CAR de GPC3.

Sumario de la invención

Existe una necesidad apremiante de un tratamiento alternativo y eficaz para una amplia diversidad de tumores sólidos. La presente invención aborda esta necesidad y proporciona también ventajas relacionadas. Por consiguiente, la presente invención divulga una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de células inmunorreactivas con receptor quimérico para el antígeno (CAR) anti-GPC3 para su uso en el tratamiento de un tumor sólido en un sujeto, en donde el tratamiento comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica después o al mismo tiempo que se somete al sujeto a un tratamiento de reducción de linfocitos, en donde el tratamiento de reducción de linfocitos comprende la administración de ciclofosfamida y fludarabina al sujeto, y en donde las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 son linfocitos T (linfocitos T CAR anti-GPC3). En algunos casos, una administración de linfocitos T CAR anti-GPC3 a un sujeto puede tener lugar después de someter a un sujeto a un tratamiento de reducción de linfocitos. En algunos casos, se pueden administrar a un sujeto al menos aproximadamente 5 x 104 linfocitos T CAR anti-GPC3/kg. En algunos casos, se administran a un sujeto de aproximadamente 5 x 104 a aproximadamente 1 x 1012 linfocitos T CAR anti-GPC3/kg a un sujeto. Una administración puede ser eficaz para reducir el tamaño tumoral en al menos el 30 % según lo medido por tomografía computarizada (TAC). En algunos casos, una administración puede ser eficaz para estabilizar el tamaño tumoral medido por un cambio de menos del 10 % de una medición inicial del diámetro de una lesión tumoral según lo medido por tomografía computarizada (TAC). En algunos casos, administrar linfocitos T CAR anti-GPC3 y someter a un sujeto a un tratamiento de reducción de linfocitos puede aumentar de forma sinérgica el tiempo medio de supervivencia de un sujeto en al menos aproximadamente 6 meses en comparación con la administración de linfocitos T CAR anti-GPC3 solo. En algunos casos, un tumor sólido puede ser cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de tiroides (por ejemplo, carcinoma de tiroides), cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer pancreático, liposarcoma, cáncer testicular de células germinativas no seminomatoso, melanoma, adenoma de la glándula suprarrenal, schwannoma, histiocitoma fibroso maligno o cáncer de esófago. En algunos casos, un receptor quimérico para el antígeno anti-GPC3 puede comprender una unidad de unión a antígeno que puede presentar una unión específica a un extremo C de GPC3. En algunos casos, una unidad de unión a antígeno puede comprender una secuencia que presente al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o hasta aproximadamente el 100 % de homología de secuencia con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. En algunos casos, un CAR anti-GPC3 puede comprender una secuencia que presente al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o hasta aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 30. Un CAR anti-GPC3 puede comprender una secuencia que presente al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o hasta aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 28 a 30. En algunos casos, los linfocitos T CAR anti-GPC3 pueden comprender al menos dos dominios de señalización intracelular. En algunos casos, los linfocitos T CAR anti-GPC3 pueden comprender al menos tres dominios de señalización intracelular. Los dominios de señalización intracelular se pueden seleccionar de un dominio de señalización obtenido de CD3, CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 o ICOS. En algunos casos, un tratamiento de reducción de linfocitos puede comprender reducir una cantidad de linfocitos T reguladores en un sujeto. La reducción de una cantidad de linfocitos T reguladores puede comprender una reducción de al menos el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, el 95 % o superior, de linfocitos T reguladoras medido por análisis de citometría de flujo de linfocitos CD4+ y CD25+ circulantes en un sujeto. En algunos casos, un tratamiento de reducción de linfocitos puede comprender administrar radiación o un agente biológico a un sujeto. Un tratamiento de reducción de linfocitos también puede comprender administrar quimioterapia a un sujeto. Una administración de quimioterapia a un sujeto puede comprender administrar un agente quimioterapéutico seleccionado del grupo que consiste en ciclofosfamida, fludarabina, etopósido, citarabina, metotrexato, vincristina, adriamicina, y cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, se puede administrar un agente quimioterapéutico a un sujeto al menos una vez antes de la administración de linfocitos T CAR anti-GPC3. En algunos casos, un tratamiento de reducción de linfocitos puede reducir una cantidad de linfocitos en al menos el 20 % medido por análisis por hemograma completo (HC).

El tratamiento puede comprender además una segunda administración de linfocitos T CAR anti-GPC3 a un sujeto. En algunos casos, un sujeto puede tener una enfermedad resistente, persistente o progresiva. Los linfocitos T ^cA ^ranti-GPC3 pueden ser autólogos o alógenos para un sujeto.

El tratamiento puede comprender además la administración de al menos un agente inmunoestimulante a un sujeto al mismo tiempo o después de la administración de células inmunorreactivas con receptor quimérico para el antígeno anti-GPC3. Un agente inmunoestimulante se puede seleccionar del grupo que consiste en aldesleucina (IL-2), IL-3, IL-6, IL-11, GM-CSF y cualquier combinación de los mismos. Un agente biológico puede ser un anticuerpo dirigido a un antígeno expresado en un linfocito.

En el presente documento se divulga un kit para administrar células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 a un sujeto que presenta un tumor sólido, que comprende: una cantidad eficaz de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3; un agente quimioterapéutico eficaz para reducir los linfocitos presentes en un sujeto; e instrucciones para administrar células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 después o simultáneamente con un agente quimioterapéutico a un sujeto. En algunos casos, las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 pueden ser linfocitos NK o linfocitos T (linfocitos T CAR anti-GPC3). Un agente quimioterapéutico puede seleccionarse del grupo que consiste en ciclofosfamida, fludarabina, etopósido, citarabina, metotrexato, vincristina, adriamicina, y cualquier combinación de los mismos. Un kit puede comprender además ciclofosfamida a aproximadamente 60 mg/kg a aproximadamente 80 mg/kg o fludarabina a aproximadamente 25 mg/m2 a aproximadamente 35 mg/m2 formuladas para la administración a un sujeto que lo necesite. En algunos casos, un kit puede comprender desde aproximadamente 1 x 104 células a aproximadamente 1 x 1012 linfocitos T CAR anti-GPC3. En algunos casos, las instrucciones pueden proporcionar procedimientos para administrar linfocitos T CAR anti-GPC3 después de administrar un agente quimioterapéutico. En algunos casos, las instrucciones pueden proporcionar procedimientos para administrar linfocitos T CAR anti-GPC3 al menos 12 horas después de administrar un agente quimioterapéutico. En algunos casos, las instrucciones pueden proporcionar procedimientos para administrar linfocitos T CAR anti-GPC3 al menos 24 horas después de administrar un agente quimioterapéutico. Los linfocitos T CAR anti-GPC3 pueden formularse para inyección intravenosa. Los linfocitos T CAR anti-GPC3 pueden formularse para inyección intraarterial en el hígado de un sujeto que puede comprender un tumor sólido.

Breve descripción de los dibujos

Las nuevas características de la divulgación se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la divulgación haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en que se pueden utilizar los principios de la divulgación y los dibujos adjuntos de los cuales:

La FIG. 1 muestra un vector de T-CAR de segunda generación que codifica un receptor quimérico para el antígeno dirigido a GPC3.

La FIG. 2 muestra la relación con el nivel inicial de linfocitos de los individuos H01, H02 o H03 tratados con ciclofosfamida y/o fludarabina.

La FIG. 3 muestra una resonancia magnética nuclear (RMN) pre- y postratamiento de un corte de hígado.

La FIG. 4A muestra un ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® realizado sobre 33-28BBZ, 92-28BBZ y 4-28BBZ cocultivados con células de control, SK-HEP-1 y la FIG. 4B muestra un ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® realizado sobre 33-28Z, 92-28Z, 92-BBZ y 92-28BBZ cocultivados con una segunda línea celular de control, CHO-K1, a una relación efectora:diana de 3:1, 1:1 o 1:3.

La FIG. 5A muestra un ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® realizado sobre 33-28BBZ, 92-28BBZ y 4-28BBZ cocultivados con células de cáncer de hígado positivas para GPC3, Huh-7, o células de control como se muestra en la FIG. 5B, transducidas para expresar GPC3, CHO-K1-GPC3+, a una relación efectora:diana de 3:1, 1:1 o 1:3.

La FIG. 6A muestra un ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® realizado sobre linfocitos T-CAR anti-GPC3, 92-28Z, 92-BBZ, 92-28BBZ, o cocultivo simulado con HepG2 (CHC). La FIG. 6B muestra un ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® realizado sobre linfocitos T-CAR anti-GPC3, 92-28Z, 92-BBZ, 92-28BBZ, o cocultivo simulado con Hep3B (CHC), La FIG. 6C muestra un ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® realizado sobre linfocitos T-CAR anti-GPC3, 92-28Z, 92-BBZ, 92-28BBZ, o cocultivo simulado con o PLC/PRF/5 (Hepatoma).

La FIG. 7A muestra un ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® realizado sobre linfocitos T-CAR anti-GPC3, 33-28Z o 33-28BBZ cocultivados con células Huh-7 a la relación efectora:diana de 3:1, 1:1 o 1:3. La FIG.

7B muestra un ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® realizado sobre linfocitos T-CAR anti-GPC3, 92-28Z o 92-28BBZ cocultivados con células de la línea celular de carcinoma gástrico KATO-III a una relación efectora:diana de 3:1, 1:1 o 1:3.

La FIG.8A muestra que los ratones tratados con 92-28Z, T-CAR de segunda generación, tenían un tamaño tumoral significativamente reducido en comparación con los ratones tratados con 92-28BBZ, T-CAR de tercera generación, o solución salina. La FIG.8B muestra una imagen de tumores que muestra que ratones injertados con células Huh-7 que se trataron con 92-28Z, T-CAR de segunda generación, tenían un tamaño tumoral significativamente reducido en comparación con los ratones tratados con 92-28BBZ, T-CAR de tercera generación, o solución salina. La FIG. 8C muestra ratones tratados con 92-28Z, T-CAR de segunda generación, tenían también un peso tumoral significativamente reducido en comparación con los ratones tratados con 92-28BBZ, T-CAR de tercera generación, o solución salina. La FIG. 8D muestra ratones tratados con 92-28Z, T-CAR de segunda generación, tenían también una inhibición significativamente reducida en comparación con los ratones tratados con 92-28BBZ, T-CAR de tercera generación, o solución salina.

La FIG. 9 muestra los resultados de lisis específica de un ensayo de citotoxicidad no radiactivo cytoTox 96® de diversas construcciones de CAR anti-GPC3 de segunda y tercera generación: 4-28Z, 4-28BBZ, 4-4-28BBZ, 4-14-28BBZ, 4-20-28BBZ, 4-35-28BBZ, 4-42-28BBZ cocultivados con células Huh7 (CHC) a la relación de efectora:diana de 3:1 o 1:1.

La FIG. 10A muestra un ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® realizado sobre linfocitos T-CAR anti-GPC3, 33-28Z, 92-28Z, 92-BBZ, 92-28BBZ, o cocultivo simulado con A431 (neg. para GPC3). La FIG. 10B muestra un ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96®, realizado sobre linfocitos T-CAR anti-GPC3, 33-28Z, 92-28Z, 92-BBZ, 92-28BBZ o cocultivo simulado con Huh-7 (pos. para GPC3). Todos los ensayos CytoTox se realizaron a la relación de efectora:diana de 3:1, 1:1 o 1:3.

La FIG. 11A muestra los resultados de un modelo murino de xenoinjerto donde los ratones tratados con 92-28Z, T-CAR de segunda generación, tenían un volumen tumoral (mm3) significativamente reducido en comparación con los ratones tratados con 92-28BBZ, T CAR de tercera generación, o con simulado. La FIG. 11B muestra que los ratones tratados con 92-28Z, T-CAR de segunda generación, tenían un peso tumoral significativamente reducido en comparación con los ratones tratados con 92-28BBZ, T-CAR de tercera generación, o solución salina. La FIG.

11C muestra una imagen de tumores de ratones tratados con simulado, T-CAR 92-28BBZ o 92-28Z.

Descripción detallada de la divulgación

La siguiente descripción y los ejemplos ilustran realizaciones de la divulgación en detalle. Debe entenderse que la presente divulgación no se limita a las realizaciones particulares descritas en el presente documento, y, como tal, puede variar. A menos que se indique otra cosa, cualquier realización puede combinarse con cualquier otra realización.

Como se usa en el presente documento, a menos que se indique otra cosa, algunas realizaciones de la invención en el presente documento contemplan intervalos numéricos. Se puede presentar una diversidad de aspectos de la divulgación en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la divulgación. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo, como si estuvieran explícitamente escritos. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 ha divulgado específicamente subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5 y 6. Esto es aplicable independientemente de la amplitud del intervalo. Cuando los intervalos están presentes, los intervalos incluyen los puntos extremos del intervalo.

Definiciones

Como se usa en el presente documento, a menos que se indique otra cosa, el artículo "un/una" significa uno o más, a menos que se indique explícitamente otra cosa.

Como se usa en el presente documento, a menos que se indique otra cosa, expresiones tales como "contener", "que contiene", "incluir", "que incluye", y similares significan "que comprende".

El término "activación" y sus equivalentes gramaticales como se usa en el presente documento pueden referirse a un proceso por el cual una célula pasa de un estado de reposo a un estado activo. Este proceso puede comprender una respuesta a un antígeno, migración y/o un cambio fenotípico o genético a un estado funcionalmente activo. Por ejemplo, el término "activación" puede referirse al proceso gradual de activación de linfocitos T. Por ejemplo, un linfocito T puede precisar al menos dos señales para activarse por completo. La primera señal puede producirse después de la interacción de un TCR con el complejo antígeno-MHC, y la segunda señal puede producirse por la interacción de moléculas coestimulantes (Tabla 3). El anti-CD3 puede imitar la primera señal y el anti-CD28 puede imitar la segunda señal in vitro. Por ejemplo, un linfocito T genomodificado puede activarse mediante un CAR expresado. Activación de linfocitos T" o desencadenamiento de linfocitos T, como se usa en el presente documento, puede referirse al estado de un linfocito T que se ha estimulado suficientemente para inducir una proliferación celular detectable, la producción de citocinas y/o una función efectora detectable.

La expresión "unidad de unión a antígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de la molécula de inmunoglobulina, es decir, una molécula que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente ("inmunorreacciona con") a un antígeno. También se incluyen dentro de la expresión "unidad de unión a antígeno" moléculas de inmunoglobulina de una diversidad de orígenes en especies que incluyen invertebrados y vertebrados. Estructuralmente, el anticuerpo de origen natural más simple (por ejemplo, IgG) comprende cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Las inmunoglobulinas representan una gran familia de moléculas que incluyen varios tipos de moléculas, tal como IgD, IgG, IgA, IgM e IgE. La expresión "molécula de inmunoglobulina" incluye, por ejemplo, anticuerpos híbridos, o anticuerpos modificados, y fragmentos de los mismos. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de origen natural. Estos fragmentos se denominan colectivamente "unidades de unión a antígeno". También se incluye dentro la expresión "unidad de unión a antígeno" cualquier estructura molecular que contenga una cadena polipeptídica que tenga una forma específica que se ajuste a un epítopo y lo reconozca, donde una o más interacciones de unión no covalentes estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epítopo.

Una unidad de unión a antígeno "se une específicamente" o es "inmunorreactiva con" un antígeno si se une con mayor afinidad o avidez que la que se une a otros antígenos de referencia, incluidos polipéptidos u otras sustancias.

"Antígeno", como se usa en el presente documento, significa una sustancia a la que reconoce y a la que se une específicamente una unidad de unión a antígeno. Los antígenos pueden incluir péptidos, proteínas, glucoproteínas, polisacáridos y lípidos; porciones de los mismos y combinaciones de los mismos. El antígeno ilustrativo no limitante incluía GPC3 de ser humano, murino y otros homólogos de los mismos. "Antígeno" también puede referirse a una molécula que provoca la respuesta inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria puede implicar la producción de anticuerpos o la activación de células inmunológicamente competentes específicas, o ambos. El experto en la materia entenderá que cualquier macromolécula, incluyendo virtualmente todas las proteínas o péptidos, puede servir como un antígeno.

El término "inmunoglobulina" o "Ig", como se usa en el presente documento puede referirse a una clase de proteínas, que funcionan como anticuerpos. Los anticuerpos que expresan los linfocitos B a veces se denominan receptor quimérico para el antígeno o receptor de antígeno. Los cinco miembros incluidos en esta clase de proteínas son IgA, IgG, IgM, IgD e IgE, de las cuales IgG es el anticuerpo circulante más común. Es la inmunoglobulina más eficaz en la aglutinación, la fijación del complemento y otras respuestas de anticuerpos, y es importante en la defensa contra bacterias y virus. Por ejemplo, un antígeno de células tumorales puede ser reconocido por un CAR.

La expresión "anticuerpo anti-GPC3" puede referirse a un anticuerpo o sitio de unión de anticuerpo que es capaz de unirse a GPC3 con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil para distinguir a GPC3 de otros antígenos expresados por una célula. En una realización, el alcance de la unión de un anticuerpo anti-GPC3 a una proteína no relacionada, distinta de GPC3, es menor de aproximadamente el 10 % de la unión del anticuerpo a GPC3 medida, por ejemplo, mediante radioinmunoensayo (RIA, del inglés radioimmunoassay). En determinadas realizaciones, un anticuerpo que se une a GPC3 puede tener una constante de disociación (Kd) de < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 5 nM, < 4 nM, < 3 nM, < 2 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10 8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M). En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-GPC3 se une a un epítopo de GPC3 que está conservado entre GPC3 de distintas especies.

El término "autólogo" y sus equivalentes gramaticales como se usan en el presente documento pueden referirse a que proceden del mismo ser. Por ejemplo, se puede extraer una muestra (por ejemplo, células), procesarse y devolverse al mismo sujeto (por ejemplo, un paciente) en un momento posterior. Un proceso autólogo se distingue de un proceso alógeno donde el donante y el receptor son sujetos distintos.

"Xenotrasplante" y sus equivalentes gramaticales como se usan en el presente documento pueden abarcar cualquier procedimiento que implique trasplante, implantación o infusión de células, tejidos u órganos en un receptor, donde el receptor y el donante son especies distintos. El trasplante de las células, los órganos y/o tejidos descritos en el presente documento pueden usarse para xenotrasplante en seres humanos. El xenotrasplante incluye, pero no se limita a, xenotrasplante vascularizado, xenotrasplante parcialmente vascularizado, xenotrasplante no vascularizado, xenoapósitos, xenovendas y xenoestructuras.

"Alotrasplante" y sus equivalentes gramaticales (por ejemplo, trasplante alógeno) como se usan en el presente documento pueden abarcar cualquier procedimiento que implique trasplante, implantación o infusión de células, tejidos u órganos en un receptor, donde el receptor y el donante son la misma especie pero individuos distintos. El trasplante de las células, los órganos y/o tejidos descritos en el presente documento pueden usarse para alotrasplante en seres humanos. El alotrasplante incluye, pero no se limita a, alotrasplante vascularizado, alotrasplante parcialmente vascularizado, alotrasplante no vascularizado, aloapósitos, alovendajes y aloestructuras.

"Autotrasplante" y sus equivalentes gramaticales (por ejemplo, trasplante autólogo) como se usan en el presente documento pueden abarcar cualquier procedimiento que implique trasplante, implantación o infusión de células, tejidos u órganos en un receptor, donde el receptor y el donante es el mismo individuo. El trasplante de las células, los órganos y/o tejidos descritos en el presente documento pueden usarse para autotrasplante en seres humanos. El autotrasplante incluye, pero no se limita a, autotrasplante vascularizado, autotrasplante parcialmente vascularizado, autotrasplante no vascularizado, autoapósitos, autovendajes y autoestructuras.

La expresión "receptor quimérico para el antígeno" o "CAR" como se usa en el presente documento se refiere a una molécula genomodificada, que puede expresarse una célula inmunitaria que incluye, pero sin limitación, linfocitos T. El CAR, cuando se expresa en linfocitos T puede redirigir a los linfocitos T para inducir la destrucción de una célula diana con una especificidad dictada por el receptor artificial. El dominio de unión extracelular del CAR puede proceder de un anticuerpo monoclonal murino, humanizado o totalmente humano. Un "CAR anti-GPC3" es un CAR que es capaz de unirse a GPC3.

El término "epítopo" y sus equivalentes gramaticales como se usa en el presente documento pueden referirse a una parte de un antígeno que pueden reconocer anticuerpos, linfocitos B, linfocitos T o células genomodificadas. Por ejemplo, un epítopo puede ser un epítopo de cáncer que es reconocido por un TCR. También se pueden reconocer múltiples epítopos dentro de un antígeno. El epítopo también puede estar mutado.

El término "genomodificado" y sus equivalentes gramaticales como se usa en el presente documento puede referirse a una o más modificaciones de un ácido nucleico, por ejemplo, el ácido nucleico dentro del genoma de un organismo. El término "genomodificado" puede referirse a modificaciones, adiciones y/o deleciones de genes. Una célula genomodificada también puede referirse a una célula con un gen añadido, delecionado y/o modificado.

El término "célula" o "célula genomodificado" y sus equivalentes gramaticales, como se usan en el presente documento, pueden referirse a una célula de origen animal humano o no humano. Una célula genomodificada también puede referirse a una célula que expresa un CAR.

La expresión "prácticas correctas de fabricación" (GMP, del inglés good manufacturing practices) y sus equivalentes gramaticales, como se usan en el presente documento, pueden referirse a productos que son seguros, eficaces o están puros de acuerdo con la FDA. Las GMP también se pueden denominar a veces "cGMP". La "c" significa "curren?" (actuales). Los fabricantes de un producto pueden emplear tecnologías y sistemas actualizados para cumplir con la normativa de los productos GMP. Los productos compatibles con GMP normalmente se utilizan en el entorno clínico en lugar de en el entorno de investigación.

El término "transfección", como se usa en el presente documento, se refiere a la introducción de ácido nucleico extraño en células eucariotas. La transfección puede lograrse mediante una diversidad de medios conocidos en la técnica, que incluyen la coprecipitación de ADN con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por polibreno, electroporación, microinyección, fusión de liposomas, lipofección, fusión de protoplastos, infección retrovírica y biolística.

La expresión "transfección estable" o "transfectado de manera estable" se refiere a la introducción e integración de ácido nucleico extraño, ADN o ARN, en el genoma de la célula transfectada. La expresión "transfectante estable" se refiere a una célula que ha integrado de manera estable ADN extraño en el ADN genómico.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "molécula de ácido nucleico que codifica", "secuencia de ADN que codifica", y "ADN que codifica" se refieren al orden o secuencia de desoxirribonucleótidos a lo largo de una cadena de ácido desoxirribonucleico. El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de los aminoácidos a lo largo de la cadena polipeptídica (proteína). La secuencia de ácido nucleico codifica así la secuencia de aminoácidos.

El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier animal, por ejemplo, un mamífero o marsupial. Los sujetos de la presente invención incluyen, entre otros, seres humanos, primates no humanos (por ejemplo, macacos de la India u otros tipos de macacos), ratones, cerdos, caballos, burros, vacas, ovejas, ratas y aves de cualquier tipo.

El término "receptor" y sus equivalentes gramaticales, como se usa en el presente documento, pueden referirse a un animal humano o no humano que recibe una terapia o tratamiento.

La expresión "linfocitos de sangre periférica" (LSP) y sus equivalentes gramaticales como se usa en el presente documento pueden referirse a linfocitos que circulan en la sangre (por ejemplo, sangre periférica). Linfocitos de sangre periférica puede referirse a linfocitos que no están localizados en órganos. Los linfocitos de sangre periférica pueden comprender linfocitos T, células NK, linfocitos B o cualquier combinación de los mismos.

El término "célula inmunorreactiva" puede referirse a una célula que puede suscitar una respuesta inmunitaria, incluyendo, pero sin limitación, linfocitos T, linfocitos B y linfocitos T ⁿK, sus respectivas células precursoras y progenie de las mismas. Una célula inmunorreactiva también puede referirse a una célula de un linaje linfoide o mieloide.

La expresión "linfocito T" y sus equivalentes gramaticales como se usa en el presente documento pueden referirse a un linfocito T de cualquier origen. Por ejemplo, un linfocito T puede ser un linfocito T primario, por ejemplo, un linfocito T autólogo, una línea celular, etc. El linfocito T también puede ser humano o no humana.

La expresión "activación de linfocitos T" o "desencadenamiento de linfocitos T" y sus equivalentes gramaticales, como se usan en el presente documento, pueden referirse al estado de un linfocito T que ha sido suficientemente estimulado para inducir una proliferación celular detectable, la producción de citocinas y/o una función efectora detectable. En algunos casos, la "activación completa de linfocitos T" puede ser similar a desencadenar la citotoxicidad de los linfocitos T. La activación de los linfocitos T se puede medir usando diversos ensayos conocidos en la técnica. Dichos ensayos pueden ser un ELISA para medir la secreción de citocinas, un ELISPOT, ensayos de citometría de flujo para medir la expresión de citocinas intracelulares (CD 107), ensayos de citometría de flujo para medir proliferación y ensayos de citotoxicidad (ensayo de liberación de 51Cr) para determinar la eliminación de células diana. Dichos ensayos utilizan normalmente controles (células no genomodificadas) para compararlos con células genomodificadas (T CAR) para determinar la activación relativa de una célula genomodificada en comparación con un control. Adicionalmente, dichos ensayos pueden comparar células genomodificadas incubadas o puestas en contacto con una célula diana que no expresa el antígeno diana. Por ejemplo, dicha comparación puede ser un linfocito T CAR para CD19 incubado con una célula diana que no expresa CD19.

El término "secuencia" y sus equivalentes gramaticales cuando se usan para referirse a una secuencia de nucleótidos, pueden abarcar ADN o ARN; y puede ser monocatenaria o bicatenaria. Una secuencia de ácido nucleico puede estar mutada. Una secuencia de ácido nucleico puede tener cualquier longitud, por ejemplo, entre 2 y 1.000.000 o más de nucleótidos de longitud (o cualquier valor entero entre o por encima), por ejemplo, entre aproximadamente 100 y aproximadamente 10.000 nucleótidos, o entre aproximadamente 200 y aproximadamente 500 nucleótidos.

Métodos de uso

En un aspecto, en el presente documento se divulgan composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento para su uso en métodos de tratamiento de un sujeto que presenta un tumor sólido que expresa Glipicano 3 (GPC3). El método comprende la etapa de administrar linfocitos T con receptor quimérico para el antígeno anti-GPC3 a un sujeto, en donde la administración tiene lugar después o al mismo tiempo que se somete al sujeto a un tratamiento de reducción de linfocitos.

Los sujetos tratados por los métodos divulgados en el presente documento pueden presentar un cáncer o un tumor sólido. A menudo, las células cancerosas o las células de tumores sólidos expresan uno o más antígenos tumorales. Normalmente, el antígeno tumoral es Glipicano 3 (GPC3). Puede denominarse que un sujeto que presenta un cáncer o tumor sólido que expresa GPC-3 presenta un cáncer positivo para GPC3.

Los cánceres que expresan GPC3 incluyen, pero sin limitación, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer pancreático, liposarcoma, cáncer testicular de células germinativas no seminoma, melanoma, adenoma, cáncer suprarrenal, schwannoma, histioquitoma fibroso maligno o cualquier combinación de los mismos. Los métodos objeto son aplicables para el tratamiento del carcinoma de células escamosas o el adenocarcinoma, el carcinoma neuroendocrino de un tracto GI, o cualquier otro cáncer divulgado en "Glypican-3 expression in gastrointestinal and pancreatic epithelial neoplasms. (2013) 44, 542-550 Human Pathology". Además, las células inmunorreactivas divulgadas en el presente documento, tales como un T-CAR anti-GPC3 divulgado en el presente documento, se pueden utilizar para dirigirse el carcinoma de ovario, colangiocarcinoma, mesotelioma, cáncer de mama, carcinoma de células escamosas de pulmón, neoplasia intraepitelial del cuello uterino, carcinoma de células escamosas del cuello uterino, cáncer intrahepático y extrahepático, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma ductal invasivo, carcinoma de células claras, oncocitoma, carcinoma papilar, adenocarcinoma, carcinoma papilar y carcinoma lobulillar y medular de mama. Las dianas adicionales para la terapia anti-GPC3 pueden incluir los que se encuentran en, "Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues. (2008) 129:899-906 Am J ClinPathol".

En algunos casos, una célula cancerosa o tumoral puede evaluarse en cuanto a la expresión de GPC3 mediante citometría de flujo o inmunohistoquímica. Un nivel de GPC3 en una célula cancerosa o tumoral se puede clasificar como bajo, medio, o alto.

En algunos casos, una célula cancerosa o tumoral puede expresar GPC3 en la superficie celular. Se puede determinar la expresión de GPC3 en una superficie celular, por ejemplo, usando anticuerpos para GPC3 en un método tal como inmunohistoquímica o análisis de citometría de flujo. De manera alternativa, se puede considerar que la expresión de ARNm de GPC3 se correlaciona con la expresión de GPC3 en una superficie celular y se puede determinar mediante un método seleccionado de hibridación in situ y RT-PCR.

En algunos casos, la GPC3 está codificada por un gen que comprende la secuencia de ácido nucleico que presenta al menos el 50 % de identidad de secuencia con el gen al que se hace referencia en la Tabla 2. La GPC3 puede estar codificada por un gen que comprende la secuencia de ácido nucleico que presenta al menos aproximadamente el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o hasta aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia con el gen al que se hace referencia en la Tabla 2.

En algunas realizaciones, se administran células inmunorreactivas con receptor quimérico para el antígeno anti-GPC3 a un sujeto que presenta un tumor sólido que expresa GPC3 después o al mismo tiempo que se somete al sujeto a un tratamiento de reducción de linfocitos.

Un receptor quimérico para el antígeno (CAR) anti-GPC3 objeto normalmente comprende una región de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y una región de señalización intracelular que controla la activación de las células inmunorreactivas. En algunos casos, el CAR anti-GPC3 comprende además una bisagra o espaciador. En algunos casos, el CAR anti-GPC3 comprende además uno o más dominios coestimulantes.

Un receptor quimérico para el antígeno normalmente comprende una región de unión a antígeno extracelular. En una realización, la región de unión a antígeno extracelular puede ser completamente humana. En otros casos, la región de unión a antígeno extracelular puede ser completamente humanizada. En otros casos, la región de unión a antígeno extracelular puede ser murina o una quimérica en la región de unión a antígeno extracelular que se compone de secuencias de aminoácidos procedentes de al menos dos especies animales distintas. En algunos casos, la región de unión a antígeno extracelular puede ser no humana. Se puede diseñar una diversidad de regiones de unión a antígeno para dirigirse a GPC3. Los ejemplos no limitantes incluyen fragmentos variables monocatenarios (los scFv) obtenidos de anticuerpos, un fragmento de región de unión a antígeno (Fab) seleccionado de bibliotecas, un fragmento de un solo dominio o ligandos naturales que interaccionan con su receptor afín. Una región de unión a antígeno extracelular puede abarcar un scFv, un Fab o un ligando natural, así como cualquiera de sus derivados. Una región de unión a antígeno extracelular puede referirse a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que puede comprender una porción de un anticuerpo intacto y que puede unirse a un antígeno al que se une un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo pueden incluir, pero sin limitación, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab') 2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Una región de unión a antígeno extracelular, por ejemplo el scFv, Fab, o ligando natural, puede ser una porción de un CAR que determina la especificidad de antígeno. Una región de unión a antígeno extracelular puede unirse a cualquier diana complementaria. Una región de unión a antígeno extracelular puede proceder de un anticuerpo para el que se conocen las secuencias de una región variable. Una región de unión a antígeno extracelular puede proceder de una secuencia de anticuerpo obtenida de un hibridoma de ratón disponible. De manera alternativa, se puede obtener una región de unión a antígeno extracelular a partir de la secuenciación exómica completa de una célula tumoral o célula primaria, tal como un linfocito de infiltración tumoral (TIL, tumor infiltrating lymphocyte).

En algunos casos, la especificidad de unión de una región de unión a antígeno extracelular puede determinarse mediante regiones determinantes de complementariedad, o las CDR, tales como las CDR de cadena ligera o las CDR de cadena pesada. En muchos casos, la especificidad de unión puede determinarse mediante las CDR de cadena ligera y las CDR de cadena pesada. Una combinación determinada de los CDR de cadena pesada y los CDR de cadena ligera puede proporcionar un bolsillo de unión determinado que puede conferir una mayor afinidad y/o especificidad hacia un antígeno, tal como GPC3, en comparación con otros antígenos de referencia. Por ejemplo, una CDR específica para glipicano 3 puede expresarse en una región de unión extracelular de un CAR de tal manera que el CAR que se dirige a GPC3 puede dirigir la célula inmunorreactiva a una célula tumoral que expresa GPC3.

En algunos aspectos de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, una región de unión a antígeno extracelular, tal como un scFv, puede comprender una CDR de cadena ligera específica para GPC3. Una CDR de cadena ligera puede ser una región determinante de complementariedad de una cadena ligera de una unidad de unión a antígeno, tal como un scFv de un CAR. Una CDR de cadena ligera puede comprender una secuencia continua de restos de aminoácidos, o dos o más secuencias contiguas de restos de aminoácidos separados por, y opcionalmente flanqueados por, regiones determinantes de complementariedad, tales como regiones marco conservadas. En algunos casos, una CDR de cadena ligera puede comprender dos o más CDR de cadena ligera, que se pueden denominar CDR-1, CDR-2, y así sucesivamente, de cadena ligera. En algunos casos, una CDR de cadena ligera puede comprender tres CDR de cadena ligera, que se pueden denominar CDR-1 de cadena ligera, CDR-2 de cadena ligera y CDR-3 de cadena ligera, respectivamente. En algunos ejemplos, un grupo de CDR presentes en una cadena ligera común puede denominarse colectivamente las CDR de cadena ligera.

En algunos aspectos de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, la región de unión a antígeno extracelular, tal como un scFv, puede comprender una CDR de cadena pesada específica para GPC3. Una CDR de cadena pesada puede ser una región determinante de complementariedad de una cadena pesada de una unidad de unión a antígeno tal como un scFv. Una CDR de cadena pesada puede comprender una secuencia continua de restos de aminoácidos, o dos o más secuencias contiguas de restos de aminoácidos separados por, y opcionalmente flanqueados por, regiones determinantes de complementariedad, tales como regiones marco conservadas. En algunos casos, una CDR de cadena pesada puede comprender dos o más CDR de cadena pesada, que se pueden denominar CDR-1, CDR-2, y así sucesivamente, de cadena pesada. En algunos casos, una CDR de cadena pesada puede comprender tres CDR de cadena pesada, que se pueden denominar CDR-1 de cadena pesada, CDR-2 de cadena pesada y CDR-3 de cadena pesada, respectivamente. En algunos casos, un grupo de CDR presentes en una cadena pesada común puede denominarse colectivamente las CDR de cadena pesada.

En algunos casos, una célula inmunorreactiva con CAR anti-GPC3 puede expresar una región de unión a antígeno extracelular dirigida a GPC3. En algunos casos, las CDR, la cadena ligera y/o la cadena pesada que se unen a un antígeno GPC3, pueden estar comprendidas dentro de una región de unión a antígeno extracelular de una célula inmunorreactiva con CAR, tales como los linfocitos T CAR. En algunos casos, las CDR anti-GPC3 modificadas se pueden expresar en una región de unión a antígeno extracelular de una célula inmunorreactiva con CAR y tienen de aproximadamente el 50 % de homología a aproximadamente el 100 % de homología con las CDR anti-GPC3 originales. En algunos casos, una CDR anti-GPC3 modificada puede comprender desde aproximadamente el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o hasta aproximadamente el 100 % de homología con una CDR anti-GPC3 no modificada.

En algunos casos, un scFv dirigido a GPC3 puede expresarse mediante una célula inmunorreactiva con CAR anti-GPC3. En algunos casos, las CDR, la cadena ligera y/o la cadena pesada que se unen a un antígeno GPC3, pueden expresarse en un scFv de una célula inmunorreactiva con CAR, tales como los linfocitos T CAR. En algunos casos, las CDR anti-GPC3 modificadas se pueden expresar en un scFv de una célula inmunorreactiva con CAR, tales como los linfocitos T CAR, y tienen de aproximadamente el 50 % de homología a aproximadamente el 100 % de homología con las CDR anti-GPC3 originales. En algunos casos, una CDR anti-GPC3 modificada puede comprender desde aproximadamente el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o hasta aproximadamente el 100 % de homología con una CDR anti-GPC3 no modificada.

Tabla 1: Ejemplos de regiones de unión a antígeno extracelulares anti-GPC3:

T SEQ ID NO: | 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 |

La región de unión a antígeno extracelular reconoce específicamente a GPC3. La GPC3 puede comprender una secuencia que muestre al menos el 80 % de identidad con un gen de GPC3 referenciado en la Tabla 2. Algunos casos, la región de unión a antígeno extracelular puede dirigirse a un extremo N, un extremo C o a cualquier porción desde un extremo N hasta un extremo C de GPC3. Un extremo C de una GPC3 puede estar unido a una membrana celular de forma covalente a través de un ancla de glucosilfosfatidilinositol (GPI). En algunos casos, un extremo C puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 800 bases. Un extremo C puede comprender de aproximadamente 1, 50, 100, 150, 300, 500, 600 a aproximadamente 800 bases desde un extremo C. En algunos casos, una región de unión a antígeno extracelular puede dirigirse al anclaje de GPI de la GPC3.

Tabla 2: GPC3

Mediante el uso de la ingeniería genética, una región de unión a antígeno extracelular puede modificarse en una diversidad de formas. En algunos casos, una región de unión a antígeno extracelular puede estar mutada, de modo que la región de unión a antígeno extracelular pueda seleccionarse por su mayor afinidad para su diana. En algunos casos, la afinidad de la región de unión al antígeno extracelular para su diana puede optimizarse para dianas que pueden expresarse a niveles bajos en tejidos normales. Esta optimización se puede realizar para minimizar las posibles toxicidades. En otros casos, la clonación de una región de unión a antígeno extracelular que tiene una mayor afinidad por la forma unida a la membrana de una diana puede ser preferible a su contraparte en forma soluble. Esta modificación se puede realizar porque algunas dianas también se pueden detectar en forma soluble a distintos niveles y tenerlas como diana puede provocar una toxicidad no deseada.

En algunos casos, una región de unión a antígeno extracelular puede ser de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 100 % similar en homología a cualquiera de la S^eQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. En algunos casos, una región de unión a antígeno extracelular puede comprender aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o hasta aproximadamente el 100 % de homología con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. En algunos casos, la región de unión a antígeno extracelular puede ser murina, humanizada o completamente humana. Una región de unión a antígeno extracelular puede ser de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 100 % humana. En algunos casos, una región de unión a antígeno extracelular puede ser de aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o hasta aproximadamente el 100 % humana.

En algunos casos, una región de unión a antígeno extracelular comprende una bisagra o espaciador. Los términos bisagra y espaciador se pueden usar indistintamente. Una bisagra puede considerarse una parte de un CAR que se utiliza para proporcionar flexibilidad a una región de unión a antígeno extracelular. En algunos casos, se puede usar una bisagra para detectar un CAR en la superficie celular de una célula, particularmente cuando los anticuerpos para detectar la región de unión al antígeno extracelular no son funcionales o no están disponibles. Por ejemplo, la longitud de la bisagra procedente de una inmunoglobulina puede precisar una optimización dependiendo de la ubicación del epítopo en la diana al que se dirige la región de unión a antígeno extracelular.

En algunos casos, una bisagra puede no pertenecer a una inmunoglobulina sino a otra molécula, tal como la bisagra nativa de una molécula CD8 alfa. Una bisagra de CD8 alfa puede contener restos de cisteína y prolina que se sabe que desempeñan un papel en la interacción de un correceptor CD8 y una molécula de MHC. Dichos restos de cisteína y prolina pueden influir en el rendimiento de dicho CAR.

Una bisagra de CAR puede ajustarse en tamaño y puede compensar hasta cierto punto la normalización de la distancia de sinapsis ortogonal entre la célula inmunorreactiva con CAR y una célula diana. Esta topografía de la sinapsis inmunológica entre una célula inmunorreactiva y una célula diana también define una distancia que no puede salvarse funcionalmente mediante un CAR debido a un epítopo distal de membrana en una molécula diana de la superficie celular que, incluso con un CAR de bisagra corta, no puede acercar la distancia de la sinapsis a una aproximación para la señalización. Asimismo, se han descrito epítopos de antígeno diana del CAR proximales a la membrana para los que los resultados de la señalización solo se observan en el contexto de una bisagra de CAR larga. Se puede ajustar una bisagra de acuerdo con la región de unión a antígeno extracelular que se utilice. Una bisagra puede ser de cualquier longitud.

Un dominio transmembrana puede anclar un CAR a la membrana plasmática de una célula. En un CAR se puede usar una porción transmembrana nativa de CD28. En otros casos, una porción transmembrana nativa de CD8 alfa también puede usarse en el CAR. Por "CD8" puede entenderse una proteína que tiene al menos el 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el n.° de referencia del NCBI: NP_001759 o un fragmento del mismo que tiene actividad estimulante. Por "molécula de ácido nucleico de CD8" puede entenderse un polinucleótido que codifica un polipéptido CD8. En algunos casos, una región transmembrana puede ser una porción transmembrana nativa de CD28. Por "CD28" puede entenderse una proteína que tiene al menos el 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con el n.° de referencia del NCBI: NP_006130 o un fragmento del mismo que tiene actividad estimulante. Por "molécula de ácido nucleico de CD28" puede entenderse un polinucleótido que codifica un polipéptido CD28. En algunos casos, la porción transmembrana puede comprender la región CD8a.

Una región de señalización intracelular de un CAR puede ser responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras de la célula inmunorreactiva en la que se ha colocado el CAR. Un CAR puede inducir la función efectora de un linfocito T, por ejemplo, que puede ser actividad citolítica o actividad auxiliar que incluye la secreción de citocinas. Por tanto, el término región de señalización intracelular se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de función efectora y dirige a la célula para que realice una función especializada. Si bien habitualmente se puede emplear toda la región de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario usar toda la cadena de un dominio de señalización. En algunos casos, se usa una porción truncada de la región de señalización intracelular. En algunos casos, por tanto, la expresión región de señalización intracelular pretende incluir cualquier porción truncada de la región de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de la función efectora.

Los ejemplos preferidos de dominios de señalización para usar en un CAR pueden incluir una secuencia citoplásmica del receptor de linfocitos T (TCR) y correceptores que actúan en conjunto para iniciar la transducción de señales luego de la interacción receptor-diana, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional.

En algunos casos, dicha región de señalización intracelular puede contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptores (los ITAM, del inglés immunoreceptor tyrosinebased activation motifs). Los ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplásmicas incluyen los procedentes de zeta del TCR, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. Sin embargo, en realizaciones preferidas, el dominio de señalización intracelular procede de la cadena zeta del CD3.

Un ejemplo de un dominio de señalización de linfocitos T que contiene uno o más motivos ITAM es el dominio zeta del CD3, también conocido como cadena zeta T3 del receptor de linfocitos T o CD247. Este dominio es parte del complejo receptor de linfocitos T-CD3 y desempeña un papel importante en el acoplamiento del reconocimiento de antígenos a varias rutas de transducción de señales intracelulares con la activación del efector primario del linfocito T. Como se usa en el presente documento, zeta del CD3 está dirigido principalmente a zeta del CD3 humano y sus isoformas como se sabe por la entrada P20963 de Swissprot, incluyendo proteínas que tienen una secuencia sustancialmente idéntica. Como parte del receptor quimérico para el antígeno, de nuevo, no se precisa la cadena zeta T3 del receptor de linfocitos T completa y cualquier derivado de la misma que comprenda el dominio de señalización de la cadena zeta T3 del receptor de linfocitos T es adecuado, incluyendo cualquier equivalente funcional del mismo.

Un dominio de señalización intracelular se puede seleccionar de uno cualquiera de los dominios de la Tabla 3. En algunos casos, un dominio puede modificarse de manera que la homología con uno cualquiera de los dominios referenciados pueda ser de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 100 %. Cualquiera de los dominios de la Tabla 3 puede modificarse de modo que una versión modificada pueda comprender desde aproximadamente el 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o hasta aproximadamente el 100 % de homología.

Una región de señalización intracelular de un CAR puede comprender además uno o más dominios coestimulantes. Una región de señalización intracelular puede comprender un solo dominio coestimulante, por ejemplo una cadena zeta (CAR de 1' generación), o CD28 o 4-1BB (CAR de 2' generación). En otros ejemplos, una región de señalización intracelular puede comprender dos dominios coestimulantes, tales como CD28/OX40 o CD28/4-1BB (3' generación).

Junto con los dominios de señalización intracelular tal como CD8, estos dominios coestimulantes pueden producir la activación aguas abajo de las rutas de la cinasa, que sustentan la transcripción de genes y las respuestas celulares funcionales. Los dominios coestimulantes de los CAR pueden activar proteínas de señalización proximales relacionadas con las rutas de CD28 (fosfatidilinositol-4, 5-bisfosfato 3-cinasa) o 4-1BB/OX40 (proteínas adaptadoras del factor asociado al receptor de TNF), y la activación de MAPK y Akt.

En algunos casos, las señales generadas a través del CAR pueden formar un complejo con señales secundarias o coestimulantes. Con respecto al dominio de señalización coestimulante, el complejo similar al receptor quimérico para el antígeno puede diseñarse para que comprenda varios dominios de señalización coestimulantes posibles. Como se conoce bien en la técnica, en los linfocitos T vírgenes, la mera interacción del receptor del linfocito T no es suficiente para inducir la activación completa de los linfocitos T en linfocitos T citotóxicos. La activación completa y productiva de los linfocitos T precisa una segunda señal coestimulante. Varios receptores que se ha notificado que proporcionan coestimulación para la activación de los linfocitos T, incluyen, pero no se limitan a CD28, OX40, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BBL, MyD88 y 4-1BB. Las rutas de señalización utilizadas por estas moléculas coestimulantes comparten la propiedad común de actuar en sinergia con la señal de activación del receptor de linfocitos T primarios. Estas regiones de señalización coestimulantes proporcionan una señal que puede ser sinérgica con la señal de activación del efector primario que se origina en uno o más motivos ITAM, por ejemplo, un dominio de señalización de zeta del CD3, y puede completar los requisitos para la activación del linfocito T.

En algunos casos, la adición de dominios coestimulantes a un complejo similar a un receptor quimérico para el antígeno puede potenciar la eficacia y la durabilidad de las células genomodificadas. En otra realización, el dominio de señalización de linfocitos T y el dominio coestimulante se fusionan entre sí, componiendo así la región de señalización.

Tabla 3. Dominios coestimulantes

continuación

En algunos casos, un CAR objeto puede comprender una secuencia o porción de la misma que presenta de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia con una cualquiera de la SEQ ID NO: 9 a la SEQ ID NO: 13, Tabla 4. En algunos casos, un CAR objeto puede comprender una secuencia que presente aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o hasta aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia con una cualquiera de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 13.

Tabla 4: Dominios de T-CAR que abarcan dominios bisagra, transmembrana e intracelulares ilustrativos:

T SEQ ID NO: | 9, 10, 11, 12, 13 ~~|

En algunos casos, un CAR objeto puede comprender una secuencia que presenta de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia con una cualquiera de la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 30 (Tabla 5). En algunos casos, un CAR objeto puede comprender una secuencia que presente aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o hasta aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia con una cualquiera de la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 30.

Tabla 5: CAR anti-GPC3 ilustrativos

En algunos casos, el CAR anti-GPC3 puede tener al menos una o más de las siguientes características, en cualquier combinación: a) se une a GPC3 humana recombinante; b) se une a GPC3 de macaco cangrejero recombinante; c) se une a GPC3 endógena en la superficie de las células HepG2; d) se une a GPC3 de macaco cangrejero expresada en la superficie de células 293; e) se une a GPC3 endógena en la superficie de una célula cancerosa; f) se une a GPC3 endógena en la superficie de una célula de carcinoma hepatocelular; g) se une a GPC3 endógena en la superficie de las células de una línea celular seleccionada de HepG2, Hep3B, Huh7 y JHH-7; h) se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 25 a 137 de la GPC3 humana; i) se une a un epítopo que abarca el sitio de escisión de furina en los aminoácidos R358/S359 de la GPC3 humana; j) se une a GPC3 humana madura de longitud completa, pero no se une a un fragmento del extremo N de GPC3 humana o a un fragmento del extremo C de la GPC3 humana k) se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 420 a 470 de GPC3 humana; l) se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 470 a 509 de la GPC3 humana; m) compite por la unión a GPC3 humana con el anticuerpo 7H1; n) compite por la unión a GPC3 humana con el anticuerpo 4G7; o) compite por la unión a GPC3 humana con el anticuerpo 15G1; se une a un fragmento del extremo C de la GPC3 humana; y/o p) compite por la unión a GPC3 humana con el anticuerpo 4A11.

Un transgén que codifica un CAR anti-GPC3 objeto puede incorporarse en una célula. Por ejemplo, un transgén se puede incorporar en una célula inmunorreactiva, tal como un linfocito T. Cuando se inserta en una célula, un transgén puede ser un segmento de ADN complementario (ADNc), que es una copia del ARN mensajero (ARNm), o un gen que reside en su región original del ADN genómico (con o sin intrones).

Un ácido nucleico, por ejemplo, ADN, que codifica una secuencia transgénica puede insertarse aleatoriamente en un cromosoma de una célula. Una integración aleatoria puede ser el resultado de cualquier método de introducción de un ácido nucleico, por ejemplo, ADN, en una célula. Por ejemplo, el método puede ser, pero no se limita a, electroporación, sonoporación, uso de un cañón de genes, lipotransfección, transfección con fosfato de calcio, uso de dendrímeros, microinyección y uso de vectores víricos, incluidos vectores adenovíricos, VAA y retrovíricos, y/o ribozimas del grupo II.

Un ADN que codifica un transgén puede introducirse en una célula mediante electroporación. También se puede introducir un ADN en una célula a través de una lipofección, infección o transformación. Para transfectar células primarias puede usarse electroporación y/o lipofección. Para transfectar células hematopoyéticas primarias puede usarse electroporación y/o lipofección. También se puede introducir un ADN en un genoma celular sin el uso de recombinación homóloga. En algunos casos, un ADN puede estar flanqueado por sitios genomodificados que son complementarios a la región de rotura bicatenaria diana en un genoma. En algunos casos, un ADN puede extraerse de un ácido polinucleico para que pueda insertarse en una región de rotura bicatenaria sin recombinación homóloga.

Un transgén que se va a insertar puede estar flanqueado por sitios genomodificados de forma análoga a un sitio de rotura bicatenaria diana en el genoma para extraer el transgén de un ácido polinucleico para que pueda insertarse en la región de rotura bicatenaria.

Un ADN que codifica un transgén también puede diseñarse para incluir un gen indicador de manera que la presencia de un transgén o su producto de expresión pueda detectarse mediante la activación del gen indicador. Se puede utilizar cualquier gen indicador, tales como los divulgados anteriormente. Seleccionando en un cultivo celular las células en las que se ha activado un gen indicador, se pueden seleccionar células que contienen un transgén.

La expresión de un CAR se puede verificar mediante un ensayo de expresión, por ejemplo, qPCR o midiendo los niveles de ARN. El nivel de expresión también puede ser indicativo del número de copias. Por ejemplo, si los niveles de expresión son extremadamente altos, esto puede indicar que se integró más de una copia de un CAR en un genoma. De manera alternativa, una alta expresión puede indicar que un transgén se integró en un área altamente transcrita, por ejemplo, cerca de un promotor altamente expresado. La expresión también se puede verificar midiendo los niveles de proteína, tales como a través de transferencia de Western.

Un linfocito T CAR anti-GPC3 objeto puede comprender uno o más transgenes. Uno o más transgenes pueden expresar una proteína CAR que reconoce y se une a al menos un epítopo (por ejemplo, GPC3) en un antígeno o se une a un epítopo mutado en un antígeno. Un linfocito T CAR anti-GPC3 objeto también puede comprender uno o más CAR, o puede comprender un solo CAR y un receptor genomodificado secundario.

Un transgén puede codificar un gen suicida. Como se evidencia en muchos tratamientos eficaces en pacientes con cáncer, las regresiones tumorales objetivo en respuesta a las células inmunorreactivas con ^cA^rpueden ir acompañadas de toxicidades. En algunos casos, una célula inmunorreactiva con CAR puede ser incapaz de distinguir entre los tejidos tumorales y los normales cuando el antígeno diana se comparte entre ellos (toxicidad "colateral/inespecífica"). En otros casos, puede producirse una perturbación sistémica del sistema inmunitario, conocido como síndrome de liberación de citocinas (SLC). Dicho SLC puede comprender un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica o tormenta de citocinas, que puede ser la consecuencia de la rápida expansión in vivo de las células inmunorreactivas con CAR. El SLC es una condición caracterizada por fiebre e hipotensión que, en casos graves, puede conducir a una insuficiencia orgánica. En la mayoría de los casos, dicha toxicidad se correlaciona con la expansión in vivo de células inmunorreactivas con CAR infundidas, que puede provocar una perturbación general del sistema inmunitario y la liberación de altos niveles de citocinas proinflamatorias, tales como TNF alfa e IL-6.

En algunos casos, se pueden generar células inmunorreactivas con CAR dirigidas a antígenos compartidos con tejidos normales de modo que expresen transitoriamente CAR, por ejemplo, después de la electroporación del ARNm que codifica el receptor. Además, hay esfuerzos considerables en genomodificar adicionalmente células inmunorreactivas con CAR mediante la inclusión de interruptores de seguridad que puedan permitir la eliminación drástica de células inmunorreactivas con CAR en caso de toxicidad grave en la diana. Los vectores que codifican un CAR se pueden combinar con interruptores de seguridad, tales como el gen inducible de la caspasa-9 (activado por un inductor químico de dimerización) o una forma truncada del receptor de EGF R (activado por el anticuerpo monoclonal cetuximab) o RQR8.

Una célula inmunorreactiva con CAR anti-GPC3 objeto puede codificar un transgén de gen suicida. Dicho transgén también puede comprender un receptor CAR u otro receptor similar. Un gen suicida puede inducir la eliminación de células inmunorreactivas a CAR. Un gen suicida puede ser cualquier gen que induzca la apoptosis en dicha célula inmunorreactiva con CAR. Un gen suicida puede estar codificado dentro de un vector vírico junto con un CAR anti-GPC3.

Uno o más transgenes pueden ser de distintas especies. Por ejemplo, uno o más transgenes pueden comprender un gen humano, un gen de ratón, un gen de rata, un gen de cerdo, un gen bovino, un gen de perro, un gen de gato, un gen de mono, un gen de chimpancé o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, un transgén puede ser de un ser humano, con una secuencia genética humana. Uno o más transgenes pueden comprender genes humanos.

En algunos casos, uno o más transgenes no son genes adenovíricos.

Un transgén puede estar insertado en el genoma de una célula inmunorreactiva de manera aleatoria o específica del sitio, como se describe anteriormente. Por ejemplo, se puede insertar un transgén en un locus aleatorio en un genoma de una célula inmunorreactiva. Estos transgenes pueden ser funcionales, por ejemplo, completamente funcionales si se insertan en cualquier parte de un genoma. Por ejemplo, un transgén puede codificar su propio promotor o puede insertarse en una posición en la que esté bajo el control de un promotor endógeno. De manera alternativa, un transgén se puede insertar en un gen, tal como un intrón de un gen o un exón de un gen, un promotor o una región no codificante. Se puede insertar un transgén de manera que la inserción interrumpa un gen, por ejemplo, un punto de control inmunitario endógeno.

A veces, se puede insertar más de una copia de un transgén en más de un locus aleatorio en un genoma. Por ejemplo, se pueden insertar múltiples copias en un locus aleatorio en un genoma. Esto puede conducir a una expresión general aumentada que si un transgén se insertara aleatoriamente una vez. De manera alternativa, una copia de un transgén se puede insertar en un gen y otra copia de un transgén se puede insertar en un gen distinto. Un transgén puede dirigirse de manera que pueda insertarse en un locus específico en un genoma de una célula inmunorreactiva.

En algunos casos, un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un CAR anti-GPC3 objeto, puede tomar la forma de un vector plasmídico. Un vector plasmídico puede comprender un promotor. En algunos casos, un promotor puede ser constitutivo. En algunos casos, un promotor puede ser inducible. Un promotor puede ser o puede proceder de CMV, U6, MND o EF1a. En algunos casos, un promotor puede estar adyacente a una secuencia de CAR. En algunos casos, un vector plasmídico comprende además un aceptor de corte y empalme. En algunos casos, un aceptor de corte y empalme puede estar adyacente a una secuencia de CAR. Una secuencia promotora puede ser un promotor PKG o MND. Un promotor MND puede ser un promotor sintético que contiene una región U3 de un LTR del MoMuLV modificado con un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo.

En algunos casos, un ácido polinucleico, que codifica un CAR anti-GPC3 objeto, puede diseñarse para suministrarlo a una célula mediante técnicas no víricas. En algunos casos, un ácido polinucleico puede ser un reactivo compatible con las prácticas correctas de fabricación (GMP).

La expresión de un ácido polinucleico que codifica para un CAR anti-GPC3 objeto puede controlarse mediante uno o más promotores. Un promotor puede ser ubicuo, constitutivo (promotor no regulado que permite la transcripción continua de un gen asociado), específico de un tejido o inducible. Puede regularse la expresión de un transgén que se inserta adyacente o cerca de un promotor. Por ejemplo, un transgén se puede insertar cerca o junto a un promotor ubicuo. Algunos promotores ubicuos pueden ser un promotor CAGGS, un promotor de hCMV, un promotor de PGK, un promotor de SV40 o un promotor de ROSA26.

Un promotor puede ser endógeno o exógeno. Por ejemplo, uno o más transgenes pueden insertarse adyacentes o cerca de un promotor de ROSA26 endógeno o exógeno. Además, un promotor puede ser específico para una célula inmunorreactiva. Por ejemplo, uno o más transgenes pueden insertarse adyacentes o cerca de un promotor de ROSA26 porcino.

Se pueden usar promotores específicos de tejido o promotores específicos de células para controlar la ubicación de la expresión. Por ejemplo, uno o más transgenes pueden insertarse adyacentes o cerca de un promotor específico de tejido. Los promotores específicos de tejido pueden ser un promotor ^fA ^bP, un promotor Lck, un promotor CamKII, un promotor de CD 19, un promotor de queratina, un promotor de albúmina, un promotor aP2, un promotor de insulina, un promotor MCK, un promotor MyHC, un promotor WAP o un promotor Col2A.

Se pueden usar promotores específicos de tejido o promotores específicos de células para controlar la ubicación de la expresión. Por ejemplo, uno o más transgenes pueden insertarse adyacentes o cerca de un promotor específico de tejido. Los promotores específicos de tejido pueden ser un promotor fA b P, un promotor Lck, un promotor CamKII, un promotor de CD 19, un promotor de queratina, un promotor de albúmina, un promotor aP2, un promotor de insulina, un promotor MCK, un promotor MyHC, un promotor WAP o un promotor Col2A.

También se pueden usar promotores inducibles. Estos promotores inducibles se pueden activar y desactivar cuando se desee, añadiendo o eliminando un agente inductor. Se contempla que un promotor inducible puede ser, pero no se limita a, uno Lac, tac, trc, trp, araBAD, phoA, recA, proU, cst-1, tetA, cadA, nar, PL, cspA, T7, VHB, Mx y/o Trex.

Adicionalmente, aunque no se precisa para la expresión, la secuencia transgénica puede incluir también secuencias reguladoras transcripcionales o traduccionales, por ejemplo, promotores, potenciadores, aislantes, sitios de entrada al ribosoma internos, secuencias que codifican péptidos 2A y/o señales de poliadenilación.

En algunos casos, un transgén codifica un CAR anti-GPC3 objeto en donde el transgén se inserta en un puerto seguro de manera que se expresa un CAR anti-GPC3. En algunos casos, el transgén se inserta en un locus de PD1 y/o CTLA-4. En otros casos, un transgén se suministra a la célula en un lentivirus para la inserción aleatoria, mientras que las nucleasas específicas de PD1 o CTLA-4 se pueden suministrar como ARNm. En algunos casos, el transgén se entrega a través de un sistema de vector vírico tal como un retrovirus, un VAA o un adenovirus junto con ARNm que codifica nucleasas específicas para un puerto seguro (por ejemplo, AAVS1, CCR5, albúmina o HPRT). Las células también se pueden tratar con ARNm que codifican nucleasas específicas de PD1 y/o CTLA-4. En algunos casos, el polinucleótido que codifica un CAR se suministra a través de un sistema de administración vírica junto con ARNm que codifica nucleasas específicas de HPRT y nucleasas específicas de PD 1 o CTLA-4. Los CAR que se pueden usar con los métodos y composiciones divulgados en el presente documento pueden incluir todos los tipos de estas proteínas quiméricas, incluyendo diseños de primera, segunda y tercera generación. Se pueden aplicar otros agentes tales como CCR2 o ARNip para reducir la expresión de PD-1.

En algunos casos, se puede emplear un vector retrovírico (ya sea gamma-retrovírico o lentivírico) para la introducción del transgén en una célula inmunorreactiva. Por ejemplo, un transgén que codifica un CAR (por ejemplo, CAR anti-GPC3), o cualquier receptor que se una a un antígeno GPC3, o una variante, o un fragmento del mismo, puede clonarse en un vector retrovírico y la expresión puede dirigirse mediante su promotor endógeno, a partir de la repetición terminal larga retrovírica, o de un promotor específico para un tipo de célula diana de interés. También se pueden usar vectores no víricos. Los sistemas de suministro de vectores no víricos incluyen plásmidos de ADN, ácido nucleico desnudo y ácido nucleico en forma de complejo con un vehículo de suministro tal como un liposoma o un poloxámero.

Se han desarrollado varios sistemas basados en virus para la transferencia de genes a células de mamíferos. Por ejemplo, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente para los sistemas de suministro de genes. Un gen seleccionado puede insertarse en un vector y empaquetarse en partículas retrovíricos utilizando técnicas conocidas en la técnica. Los vectores derivados de retrovirus tales como el lentivirus son herramientas adecuadas para lograr la transferencia de genes a largo plazo, ya que permiten la transferencia de genes a largo plazo, la integración estable de un transgén y su propagación en células hijas. Los vectores lentivíricos tienen la ventaja añadida sobre los vectores procedentes de onco-retrovirus, tales como los virus de la leucemia murina, de que pueden transducir células que no proliferan. También tienen la ventaja añadida de una baja inmunogenicidad. Los vectores adenovíricos tienen la ventaja de que no se integran en el genoma de la célula diana, sorteando así los sucesos negativos relacionados con la integración.

Una célula se puede transfectar con un transgén que codifica un CAR. Una concentración de transgén puede ser de aproximadamente 100 picogramos a aproximadamente 50 microgramos. En algunos casos, la cantidad de ácido nucleico (por ejemplo, ADNmc, ADNbc, ARN) que puede introducirse en una célula puede variarse para optimizar la eficacia de la transfección y/o la viabilidad celular. Por ejemplo, para electroporación se puede añadir 1 microgramo de ADNbc a cada muestra de células. En algunos casos, la cantidad de ácido nucleico (por ejemplo, ADNbc) necesaria para una eficacia de transfección y/o viabilidad celular óptimas puede ser específica para el tipo celular. En algunos casos, la cantidad de ácido nucleico (por ejemplo, ADNbc) utilizada para cada muestra puede corresponder directamente a la eficacia de transfección y/o la viabilidad celular. Por ejemplo, un intervalo de concentraciones de transfecciones. Un transgén codificado por un vector puede integrarse en un genoma celular. En algunos casos, la integración de un transgén codificado por un vector está en la dirección directa. En otros casos, la integración de un transgén codificado por un vector está en la dirección inversa.

En algunos casos, la densidad celular inicial para la modificación celular, tal como el suministro vírico de un CAR, puede variarse para optimizar la eficacia de la transfección y/o la viabilidad celular. En algunos casos, la densidad celular inicial para la transfección o transducción de células con un vector vírico puede ser inferior a aproximadamente 1 x105 células. En algunos casos, la densidad celular inicial para la modificación celular con un vector vírico puede ser de al menos aproximadamente 1x105 células a al menos aproximadamente 5x107 células. En algunos casos, la densidad celular inicial para una eficacia de transfección y/o viabilidad celular óptimas puede ser específica del tipo celular. Por ejemplo, una densidad celular inicial de 1,5x106 células puede ser óptima (por ejemplo, proporcionar la mayor viabilidad y/o eficacia de transfección) para macrófagos. En otro ejemplo, una densidad celular inicial de 5x106 células puede ser óptima (por ejemplo, proporcionar la mayor viabilidad y/o eficacia de transfección) para células humanas. En algunos casos, un intervalo de densidades celulares iniciales puede ser óptimo para un tipo celular dado. Por ejemplo, una densidad celular inicial de entre 5,6x106 y 5x107 células puede ser óptima (por ejemplo, proporcionar la mayor viabilidad y/o eficacia de transfección) para células humanas tales como linfocitos T.

La eficacia de integración de una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR en el genoma de una célula con, por ejemplo, un sistema vírico, puede ser de o puede ser de aproximadamente 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o más del 99,9 %. En algunos casos, la detección de un CAR en una membrana celular de una célula modificada puede ser de o puede ser de aproximadamente el 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o más del 99,9 % medido por citometría de flujo.

En algunos casos, el linfocito T puede ser un linfocito T^scmde memoria madre compuesto por CD45RO (-), CCR7(+), CD45RA (+), CD62L+ (L-selectina), CD27+, CD28+ y/o IL-7Ra+, dichas células madre de memoria también pueden expresar CD95, IL-2Rp, CXCR3 y LFA-1, y presentan numerosos atributos funcionales distintivos de las células madre de memoria. De manera alternativa, el linfocito T también puede ser linfocitos T^cmde memoria central que comprenden L-selectina y CCR7, donde las células de memoria central pueden secretar, por ejemplo, IL-2, pero no IFN^yo IL-4.

Los linfocitos T también pueden ser linfocitos T^emde memoria efectora que comprenden L-selectina o CCR7 y produzcan, por ejemplo, citocinas efectoras tales como IFN^ye IL-4.

Los vectores se suministran a las células ex vivo tal como células explantadas de un paciente individual (por ejemplo, linfocitos, linfocitos T, aspirados de médula ósea, biopsia de tejido), seguido de reimplantación de las células en un paciente, generalmente después de la selección de células que han incorporado el vector. Antes o después de la selección, las células se pueden expandir.

Un linfocito T adecuado para expresar un CAR anti-GPC3 puede ser una célula que puede ser autóloga o no autóloga para un sujeto que la necesite.

Se puede obtener una fuente de linfocitos T adecuados de un sujeto. En algunos casos se pueden obtener linfocitos T. Dichos linfocitos T se pueden obtener de varias fuentes, incluyendo los CMSP, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo y tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En determinados casos, Los linfocitos T pueden obtenerse de una unidad de sangre extraída de un sujeto utilizando cualquier técnica conocida para el experto, tal como la separación con Ficoll™. En una realización, las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen por aféresis. El producto de aféresis normalmente contiene linfocitos, incluyendo linfocitos T, monocitos, granulocitos, linfocitos B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En una realización, las células recogidas por aféresis se pueden lavar para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para etapas de procesamiento posteriores.

De manera alternativa, una célula puede obtenerse de un donante sano, de un paciente al que se le ha diagnosticado cáncer o de un paciente al que se la ha diagnosticado una infección. En otra realización, una célula puede formar parte de una población mixta de células que presentan distintas características fenotípicas. También se puede obtener una línea celular a partir de un linfocito T transformado de acuerdo con el método descrito anteriormente. También se puede obtener una célula de un banco de terapia celular. Las células modificadas resistentes a un tratamiento inmunosupresor pueden obtenerse mediante cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. También se puede seleccionar una población celular conveniente antes de la modificación. También se puede seleccionar una población de células genomodificadas después de la modificación. Se puede utilizar una célula genomodificada en trasplante autólogo. De manera alternativa, una célula se puede utilizar en trasplante alógeno. En algunos casos, se administra una célula al mismo paciente cuya muestra se utilizó para identificar la secuencia diana relacionada con el cáncer. En otros casos, se administra una célula a un paciente distinto del paciente cuya muestra se utilizó para identificar la secuencia diana relacionada con el cáncer.

En algunos casos, el linfocito T puede ser un linfocito T primario, una célula madre o una célula progenitora. Una célula progenitora puede ser una célula progenitora hematopoyética. Una célula de la presente invención puede ser una célula humana. Las células adecuadas se pueden expandir ex vivo. Una célula adecuada también puede ser CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L(+), CD27(+), CD28(+), IL-7Ra(+) o combinaciones de las mismas.

En algunos casos, los linfocitos T primarios adecuados incluyen células mononucleares de sangre periférica (CMSP), linfocitos de sangre periférica (LSP) o cualquier linfocito T, tal como las células infiltrantes de tumores (las TIL), tales como linfocitos T c D3+, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ o cualquier otro tipo de linfocito T. El linfocito T también puede incluir linfocitos T de memoria, linfocitos T madre de memoria o linfocitos T efectores. Los linfocitos T también se pueden seleccionar a partir de una población total, por ejemplo, seleccionar linfocitos T de sangre completa. Los linfocitos T también se pueden expandir a partir de una población total. Los linfocitos T también pueden orientarse hacia poblaciones y fenotipos particulares. Por ejemplo, los linfocitos T pueden orientarse para comprender fenotípicamente, CD45RO (-), CCR7 (+), CD45RA (+), CD62L (+), CD27 (+), CD28 (+) y/o IL-7Ra (+). Se pueden seleccionar células adecuadas que comprenden uno o más marcadores seleccionados de un listado que comprende: CD45RO (-), CCR7 (+), CD45RA (+), CD62L (+), CD27 (+), CD28 (+) y/o IL-7Ra (+). Los linfocitos T adecuados pueden comprender cualquier número de células primarias, tales como las células humanas, células no humanas y/o células de ratón. Las células adecuadas pueden ser células progenitoras. Las células adecuadas se pueden obtener del sujeto a tratar (por ejemplo, un paciente). Las células adecuadas pueden se pueden obtener de un donante humano. Las células adecuadas pueden ser linfocito T^scmde memoria madre compuestos por CD45RO (-), CCR7(+), CD45RA (+), CD62L+ (L-selectina), CD27+, CD28+ y IL-7Ra+, dichas células madre de memoria también pueden expresar CD95, IL-2Rp, CXCR3 y LFA-1, y presentan numerosos atributos funcionales distintivos de dichas células madre de memoria. Las células adecuadas pueden ser linfocitos T^cmde memoria central que comprenden L-selectina y CCR7, dichas células de memoria central pueden secretar, por ejemplo, IL-2, pero no IFN^yo IL-4. Las células adecuadas también pueden ser linfocitos T^emde memoria efectora que comprenden L-selectina o CCR7 y produzcan, por ejemplo, citocinas efectoras tales como IFN^ye IL-4.

En algunos casos, un método puede incluir el enriquecimiento de linfocitos T cultivados en cuanto a linfocitos T CD8+ antes de la rápida expansión de las células. Después del cultivo de los linfocitos T en IL-2, los linfocitos T se pueden empobrecer en cuanto a células CD4+ y enriquecer en cuanto a células CD8+ utilizando, por ejemplo, una separación con microperlas de CD8 (por ejemplo, usando un sistema de microesferas de CD8 CliniMACsplus (Miltenyi Biotec)). Sin pretender quedar vinculado a teoría particular alguna, se puede pensar que los linfocitos T reguladores CD4+, CD25+ pueden impedir las respuestas antitumorales. Por consiguiente, se puede pensar que enriquecer los linfocitos T cultivados en cuanto a linfocitos T CD8+ y reducir o eliminar los linfocitos T CD4+ puede mejorar el impacto de las células CD8+ antitumorales transferidas adoptivamente, mejorar las tasas de respuesta en los pacientes y/o reducir las toxicidades observadas por la producción de citocinas por células CD4+. Adicionalmente, se puede pensar que los linfocitos CD8+ "jóvenes" enriquecidos se comportan de forma más fiable y predecible en expansiones rápidas a escala clínica que los linfocitos T totales.

Una célula puede ser un reactivo compatible con las prácticas correctas de fabricación (GMP). Una célula puede ser parte de una terapia combinada para tratar el cáncer, infecciones, trastornos autoinmunitarios o la enfermedad del injerto contra el hospedador (EICH) en un sujeto que lo necesite. En algunos casos, una célula descrita en el presente documento puede administrarse a un sujeto que lo necesite como monoterapia.

En algunos casos, las células que expresan un CAR objeto incluyen poblaciones heterogéneas de linfocitos T. En algunos casos, las células utilizadas pueden estar compuestas en gran medida por una proporción heterogénea de linfocitos T CD4 y CD8. Dichas células CD4 y CD8 pueden tener características fenotípicas de linfocitos T efectores circulantes. Dichas células CD4 y CD8 también pueden tener una característica fenotípica de células efectoras de memoria. En otra realización, las células pueden ser células de memoria central.

Las células adecuadas que se pueden aislar de un donante pueden estar en cualquier fase de desarrollo, incluyendo, pero sin limitación, fetal, neonatal, del joven y el adulto. Por ejemplo, las células inmunorreactivas de donante se pueden aislar de humanos adultos. El donante de células inmunorresistentes humanas puede tener menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 año de edad. Por ejemplo, las células inmunorreactivas se pueden aislar de un ser humano de menor de 6 años. Las células inmunorreactivas se pueden aislar también de un ser humano de menor de 3 años. Un donante puede ser mayor de 10 años.

Un método para obtener células adecuadas puede comprender la selección basándose en un marcador dado. Por ejemplo, dicho marcador puede comprender GFP, un gen de resistencia, un marcador de superficie celular o una etiqueta endógena. Las células se pueden seleccionar utilizando cualquier marcador endógeno. Las técnicas de selección de células aplicables incluyen citometría de flujo y/o columnas magnéticas. Posteriormente, las células seleccionadas se pueden infundir en un sujeto. Las células seleccionadas también pueden expandirse a grandes cantidades. Las células seleccionadas se pueden expandir antes de la infusión.

La cantidad de células necesarias para ser terapéuticamente eficaces en un paciente puede variar dependiendo de la viabilidad de las células y la eficacia con la que se han modificado genéticamente las células (por ejemplo, la eficacia con la que se ha integrado un transgén en una o más células, o un nivel de expresión de una proteína codificada por el transgén). En algunos casos, el producto (por ejemplo, multiplicación) de la viabilidad de las células después de la modificación genética y la eficacia de la integración de un transgén puede corresponder a la parte alícuota terapéutica de células disponibles para la administración a un sujeto. En algunos casos, un aumento en la viabilidad de las células después de la modificación genética puede corresponder a una disminución en la cantidad de células que son necesarias para que la administración sea terapéuticamente eficaz en un paciente. En algunos casos, un aumento en la eficacia con la que se ha integrado un transgén en una o más células puede corresponder a una disminución en la cantidad de células necesarias para que la administración sea terapéuticamente eficaz en un paciente. En algunos casos, determinar una cantidad de células que son necesarias para ser terapéuticamente eficaces puede comprender determinar una función correspondiente a un cambio en la viabilidad de las células a lo largo del tiempo. En algunos casos, determinar una cantidad de células que son necesarias para ser terapéuticamente eficaces puede comprender determinar una función correspondiente a un cambio en la eficacia con la que un transgén puede integrarse en una o más células con respecto a variables dependientes del tiempo (por ejemplo, tiempo de cultivo celular, tiempo de electroporación, tiempo de estimulación celular). En algunos casos, las células terapéuticamente eficaces pueden ser una población de células que comprenden de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 100 % de expresión de un CAR anti-GPC3 en una superficie celular. En algunos casos, las células terapéuticamente eficaces pueden expresar un CAR anti-GPC3 en una superficie celular de aproximadamente el 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, a más de aproximadamente el 99,9 %, medido por citometría de flujo.

Se puede usar una diversidad de células para expresar el CAR objeto, como se describe anteriormente. El CAR anti-GPC3 puede estar presente en la membrana plasmática de una célula eucariota, por ejemplo, una célula de mamífero, en que las células de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limita a, una célula citotóxica, un linfocito T, una célula madre, la descendencia de una célula madre, una célula progenitora, la descendencia de una célula progenitora y una célula NK.

Cuando se encuentra presente en la membrana plasmática de una célula eucariota, un CAR puede ser activo en presencia de su diana de unión. Por ejemplo, un CAR anti-GPC3 puede ser activo en presencia de GPC3. Una diana, tal como GPC3, puede expresarse en una membrana. Una diana también puede ser soluble (por ejemplo, no estar unida a una célula). Una diana puede estar presente en la superficie de una célula, tal como una célula diana. Una diana puede presentarse en una superficie sólida tal como una bicapa lipídica; y similares. Una diana puede ser soluble, tal como un antígeno soluble. Una diana puede ser un antígeno. Un antígeno puede estar presente en la superficie de una célula, tal como una célula diana. Un antígeno puede presentarse en una superficie sólida tal como una bicapa lipídica; y similares. En algunos casos, una diana puede ser un epítopo de un antígeno. En los métodos divulgados en el presente documento, el antígeno es normalmente GPC3 y la célula diana que expresa GPC3 es una célula cancerosa o tumoral.

En algunos casos, un CAR, cuando está presente en la membrana plasmática de una célula, y cuando se activa al unirse a su diana, puede dar lugar a una actividad citotóxica de la célula hacia una diana que exprese en su superficie celular un antígeno al que se una el dominio de unión del CAR. Por ejemplo, en algunos casos una célula puede ser una célula citotóxica (por ejemplo, un linfocito NK o un linfocito T citotóxico), un CAR de la presente divulgación, cuando está presente en la membrana plasmática de una célula y cuando se activa al unirse a su diana, puede aumentar la actividad citotóxica de una célula citotóxica hacia una célula diana que expresa en su superficie celular un antígeno al que se une el dominio de unión de un CAR. Por ejemplo, en algunos casos, una célula puede ser un linfocito NK o un linfocito T, un CAR de la presente divulgación, cuando está presente en la membrana plasmática de una célula, y cuando se activa por la unión de su diana, puede aumentar la actividad citotóxica de una célula en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 75 %, al menos 2 veces, al menos 2,5 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o más de 10 veces, en comparación con la actividad citotóxica de la célula en ausencia de la diana de unión.

En algunos casos, un CAR, cuando se activa mediante la unión a su diana, puede dar como resultado otros sucesos relacionados con la activación del CAR, tales como proliferación y expansión (ya sea debida a una división celular aumentada o a respuestas antiapoptóticas). La proliferación celular se puede medir visualmente mediante la observación de la formación de agregados celulares como se observa al microscopio. La expansión celular se puede medir mediante una medición en hemocitómetro. En algunos casos, una célula T-CAR puede tener una proliferación y expansión celular aumentadas en comparación con un linfocito T comparable, un linfocito T sin CAR. La expansión celular aumentada puede ser de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 20 veces superior a la de una célula comparable. El aumento de la expansión celular puede ser de aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 16 veces, 17 veces, 18 veces, 19 veces o hasta 20 veces más que una célula comparable. La expansión celular se puede medir durante un período de tiempo. Por ejemplo, la expansión celular puede tener lugar desde la adquisición celular hasta el momento de la infusión en un sujeto. En otros casos, la expansión celular puede tener lugar de aproximadamente 1 día a aproximadamente 30 días después de la adquisición. La expansión celular puede tener lugar de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o a 30 días después de la adquisición. En algunos casos, se puede utilizar un protocolo de expansión rápida (PER) para expandir las células antes de la infusión en un sujeto. Un PER puede tener lugar durante un período de aproximadamente 14 días en algunos casos.

En algunos casos, un CAR, cuando se activa mediante la unión a su diana, puede dar como resultado otros sucesos relacionados con la activación del CAR, tales como modulación de la señalización intracelular, diferenciación celular o muerte celular. En algunos casos, la expresión de un CAR en una célula puede modificar la señalización intracelular de una célula. En otros casos, la expresión de un CAR puede modificar la diferenciación celular.

Los linfocitos T CAR anti-GPC3 del sujeto pueden administrarse a un sujeto que presente un cáncer o tumor que exprese GPC3 al mismo tiempo o después de un tratamiento de reducción de linfocitos.

En algunos aspectos, los linfocitos T CAR anti-GPC3 se administran después de un tratamiento de reducción de linfocitos. El tratamiento puede reducir los linfocitos circulantes en un sujeto tratado, o empobrecer sustancialmente los linfocitos de los linfocitos circulantes (es decir, reducción de linfocitos). Por ejemplo, los linfocitos T CAR anti-GPC3 se pueden administrar al menos 1 hora a al menos 1 semana después de un tratamiento de reducción de linfocitos. Por ejemplo, los linfocitos T CAR anti-GPC3 se pueden administrar al menos 1 hora, 2 horas, 4, horas, 6, horas, 8 horas, 10 horas, 12, horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días o más después del tratamiento de reducción de linfocitos. En algunos casos, los T-CAR se puede administrar aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 semanas o más después de un tratamiento de reducción de linfocitos.

En algunos casos, la linfopenia del hospedador puede facilitar la expansión de los linfocitos T CAR anti-GPC3, tales como los linfocitos T CAR. Por un lado, la linfopenia puede crear "espacio" para las células transferidas adoptivamente y, por otro, puede inducir su expansión homeostática. Este último efecto probablemente puede estar mediado por la ablación quimioterapéutica de los linfocitos T reguladores endógenos, que normalmente pueden secretar citocinas inhibidoras (por ejemplo, TGF-p e IL-10), que pueden limitar la expansión de las células efectoras, tales como los linfocitos T CAR. En algunos casos, un tratamiento de reducción de linfocitos puede mejorar la expansión de los linfocitos T CAR anti-GPC3 in vivo en aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 16 veces, 17 veces, 18 veces, 19 veces o hasta 20 veces más que el tratamiento con linfocitos T CAR anti-GPC3 sin un tratamiento de reducción de linfocitos.

Adicionalmente, las citocinas homeostáticas de crecimiento de linfocitos T, tales como IL-7 y IL-15, que normalmente pueden existir en cantidades limitadas, pueden volverse fácilmente disponible debido a la menor competencia y la producción aumentada por parte de las células estromales linfopoyéticas. Por tanto, la inducción de la reducción de linfocitos antes de la infusión de linfocitos T CAR anti-GPC3 se realiza para aumentar la eficacia de las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 en el tratamiento de un sujeto. En algunos casos, un tratamiento de reducción de linfocitos puede mejorar la eficacia antitumoral medida por la reducción del tumor o el control en aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 100 % con respecto al tratamiento sin un tratamiento de reducción de linfocitos. Por ejemplo, un tratamiento de reducción de linfocitos puede mejorar la eficacia antitumoral en aproximadamente el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o hasta el 100 % más que el tratamiento sin un tratamiento de reducción de linfocitos.

Se realiza una reducción de linfocitos administrando ciclofosfamida y fludarabina. Aunque estas modalidades pueden estar destinadas a empobrecer el compartimento linfoide de un receptor, también pueden facilitar la presentación de antígenos tumorales al desencadenar la muerte de células tumorales y la liberación de antígeno. Posteriormente, estos antígenos pueden ser captados y presentados por las células presentadoras de antígenos (las CPA) para potenciar la activación de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3.

La irradiación y/o la quimioterapia pueden conducir a la activación de las células hospedadoras, dando como resultado la liberación de citocinas proinflamatorias, tales como TNF-a, IL-1 e IL-4, y la regulación al alza de moléculas coestimulantes, tales como CD80. En algunos casos, un tratamiento de reducción de linfocitos puede mejorar la terapia con células inmunorreactiva con CAR anti-GPC3 mediante la activación de las células hospedadoras. En algunos casos, un tratamiento de reducción de linfocitos puede mejorar la terapia con células inmunorreactiva con CAR anti-GPC3 mediante la regulación al alza de moléculas coestimulantes. Además de la función y disponibilidad potenciadas de las APC, un régimen de preacondicionamiento puede dañar la integridad de las barreras mucosas a través de la apoptosis inducida por radiación de las células que recubren estos órganos. El daño infligido en el tracto intestinal podría permitir la translocación de productos bacterianos, tal como LPS, a la circulación sistémica. El LPS puede, a su vez, activar células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 in vivo y podría potenciar la respuesta antitumoral. Por tanto, las citocinas proinflamatorias y los productos microbianos proporcionan "señales de peligro" cruciales para la activación y maduración de las CD, potenciando así el tratamiento tumoral mediado por células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3.

En algunos casos, un tratamiento de reducción de linfocitos puede empobrecer selectivamente las células que expresan CD25 en seres humanos, incluyendo anti-Tac humanizado (anti-CD25) y ONTAK™ (IL-2 conjugada con toxina diftérica).

En algunos casos, se puede administrar un agente quimioterapéutico para efectuar la reducción de linfocitos en un sujeto. En algunos casos, un sujeto puede recibir quimioterapia de linforreducción no mieloablativa. Una quimioterapia de linforreducción no mieloablativa puede ser cualquier terapia adecuada, la cual puede administrarse por cualquier vía adecuada. Los regímenes quimioterapéuticos pueden incluir el uso de agentes alquilantes individuales tales como la ciclofosfamida o el clorambucilo, o combinaciones tales como CVP (ciclofosfamida, vincristina y prednisona), CHOP (CVP y doxorrubicina), C-MOPP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona y procarbacina), CAP-BOP (CHOP más procarbacina y bleomicina), m-BACOD (CHOP más metotrexato, bleomicina y leucovorina), ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido y leucovorina más MOPP convencional), ProMACE-CytaBOM (prednisona, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, citarabina, bleomicina, vincristina, metotrexato y leucovorina) y MACOP-B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, dosis fija de prednisona, bleomicina y leucovorina).

Una quimioterapia de linforreducción no mieloablativa puede comprender, por ejemplo, la administración de ciclofosfamida y fludarabina, particularmente si un cáncer es positivo para GPC3, que pueda ser metastásico. Una vía preferida de administración de ciclofosfamida y fludarabina puede ser por vía intravenosa. Asimismo, se puede administrar cualquier dosis adecuada de ciclofosfamida y fludarabina. Preferentemente, pueden administrarse aproximadamente 60 mg/kg de ciclofosfamida durante dos días, después de lo cual se puede administrar fludarabina a alrededor de 25 mg/m2 durante unos cinco días.

En algunos casos, la reducción de linfocitos se puede realizar para minimizar el rechazo de origen inmunitario de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3. Por ejemplo, un sujeto puede tratarse con ciclofosfamida (Cy) seguido de un tratamiento de reducción de linfocitos con fludarabina (Flu). Una dosis de un agente quimioterapéutico tal como Cy puede ser de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg. Una dosis de Cy puede ser de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 787980, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o hasta aproximadamente 200 mg/kg de un sujeto.

De manera alternativa, una dosis y un régimen ilustrativos para el tratamiento con Cy pueden ser de aproximadamente 0,5~5 g/m2/día, preferentemente de 0,6~3 g/m2/d, más preferentemente de 1~2 g/m2/día, durante 1-3 días, preferentemente 1-2 días;

Una dosis de Flu puede ser de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 787980, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o hasta aproximadamente 200 mg/m2 de un sujeto.

De manera alternativa, una dosis y un régimen ilustrativos para el tratamiento con fludarabina pueden ser de aproximadamente 20~80 mg/m2/día, preferentemente de 25~70 mg/m2/día o 25~30 mg/m2/ día, durante 2-10, 3-8 o 4, 5, 6 o 7 días;

En algunos casos, se puede aplicar el uso combinado de Cy y Flu. Por ejemplo, la dosis inicial de Flu en el intervalo de aproximadamente 10~60 mg/m2/ día o de 15~50 mg/m2/ día o de 20~30 mg/m2/ día durante 2~8 días o 3~6 días, va seguida de Cy en la cantidad de aproximadamente 0,2~1 mg/m2/ día o de 0,3~0,8 mg/m2/ día o de 0,4~0,6 g/m2/ día durante 1-5 o 2-3 días.

En algunos casos, un sujeto puede ser tratado con Cy y Flu a Cy 60 mg/kg x 1 administración y Flu 25 mg/m2 x 3 a 5 administraciones antes de la infusión de las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3. Un sujeto puede recibir de aproximadamente 0 a aproximadamente 20 administraciones de un linfoempobrecedor antes de una infusión de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3. Un sujeto puede recibir de aproximadamente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, hasta aproximadamente 20 administraciones de un linfoempobrecedor, tal como Cy o Flu, antes de la infusión de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3. En otros casos, a un sujeto se le puede coadministrar un linfoempobrecedor, tal como Cy y/o Flu, al mismo tiempo que la infusión de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3. En otros casos, a un sujeto se le puede administrar un linfoempobrecedor, tal como Cy y/o Flu, después de la administración de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3. En otros casos, a un sujeto se le puede administrar un linfoempobrecedor antes, al mismo tiempo y/o después de una administración de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3. En algunos casos un sujeto puede no recibir un tratamiento de reducción de linfocitos. En algunos casos, se pueden usar distintas dosis de linfoempobrecedores durante el curso de un régimen. Por ejemplo, un sujeto puede recibir 60 mg/kg de Cy antes de las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3, seguido de una dosis de 40 mg/kg de Cy al mismo tiempo que las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3. Se puede realizar un hemograma completo (HC) para determinar el grado de reducción de linfocitos y si se precisan administraciones adicionales. En algunos casos, la Cy se puede administrar sola. En otros casos, la Flu se puede administrar sola. En algunos casos, la Cy y la Flu pueden alternarse durante un régimen.

La reducción de linfocitos puede mejorar la expansión de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3. La reducción de linfocitos puede mejorar la persistencia en la sangre de las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3. La expansión y persistencia de las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 se pueden detectar mediante análisis de citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-CAR. La persistencia de las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 también se puede medir evaluando el número de copias de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 mediante qPCR.

En algunos casos, podría reducirse en un sujeto la dosis de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 si el sujeto se somete a un tratamiento de reducción de linfocitos en comparación con un sujeto que podría no haber recibido un tratamiento de reducción de linfocitos.

En algunos casos, se puede administrar un tratamiento de reducción de linfocitos durante un período de tiempo. Por ejemplo, se puede administrar un tratamiento de reducción de linfocitos en el transcurso de 1 min hasta aproximadamente 24 horas. Un tratamiento de reducción de linfocitos se puede realizar desde 1 min, 15 min, 45 min, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas o hasta aproximadamente 24 horas. Los agentes de linforreducción se pueden coadministrar con agentes adicionales tales como diluyentes, uroprotectores, excipientes, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, el 2-mercaptoetanosulfonato de sodio (Mesna) puede incluirse en un tratamiento de reducción de linfocitos. En algunos casos, a un sujeto se le puede administrar ciclofosfamida 60 mg/kg/día durante aproximadamente 2 días i.v. en 250 ml de disolución glucosada al 5 % con Mesna 15 mg/kg/día durante 2 días a lo largo de 1 hora. El Mesna se puede coadministrar con un linfoempobrecedor a diversas dosis. Por ejemplo, el Mesna se puede administrar de aproximadamente 1 mg/kg/día a aproximadamente 50 mg/kg/día. El Mesna se puede administrar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o hasta aproximadamente 50 mg/kg/día. En algunos casos, para sujetos obesos o pediátricos, la dosificación del fármaco se puede calcular utilizando el peso práctico. El peso práctico puede ser un promedio de un peso real y un peso corporal ideal. Por ejemplo, el peso corporal ideal se puede calcular para un hombre = 50 kg 2,3 (número de centímetro sobre 152,4 centímetros (60 pulgadas)). Un peso corporal ideal se puede calcular para una mujer = 45,5 kg 2,3 (número de centímetro sobre 152,4 centímetros (60 pulgadas)). En algunos casos, una administración de Flu puede ser de 25 mg/m2/día intravenoso diariamente a lo largo de 30 minutos durante 5 días. En algunos casos, una administración de Flu puede tener lugar antes de una administración de Cy. En algunos casos, una administración de Flu se puede realizar al mismo tiempo que la Cy. En algunos casos, una administración de Flu se puede realizar después de una administración de Cy. En algunos casos, la fludarabina se puede iniciar aproximadamente 1 a 2 horas después de Cy y de mesna.

La irradiación corporal total puede ser una forma de radioterapia. Como su nombre implica, la ICT puede implicar la irradiación de todo el cuerpo, aunque en la práctica moderna los pulmones pueden protegerse parcialmente para reducir el riesgo de lesión pulmonar inducida por la radiación. La irradiación corporal total se puede administrar en diversas dosis. Por ejemplo, la irradiación corporal total se puede administrar con de aproximadamente 10 a aproximadamente 12 Gy. En algunos casos, la irradiación corporal total puede fraccionarse, con dosis más pequeñas suministradas en varias sesiones, en lugar de administrar la dosis completa a la vez. En algunos casos, se pueden administrar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o hasta 10 dosis distintas de irradiación.

El valor Do informado (la cantidad de radiación ionizante necesaria para erradicar un tipo de célula particular) de las células madre hematopoyéticas puede ser de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,4 Gy, mientras que los de las líneas celulares de leucemia humana pueden ser de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 1,5 Gy, lo que indica que ambas células son radiosensibles. El programa de dosificación ideal puede depender de la edad del paciente, la enfermedad y el tipo de tratamiento previsto. La ICT mieloablativa puede ser de aproximadamente 12 a aproximadamente 15 Gy proporcionadas en aproximadamente 8 a aproximadamente 12 fracciones a lo largo de aproximadamente 4 días, con aproximadamente 2 a aproximadamente 3 tratamientos diarios. En algunos casos, la

ICT mieloablativa puede ser de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 Gy. La ICT mieloablativa puede ser de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, a aproximadamente 20 Gy. En algunos casos, la ⁱC^tmieloablativa se puede proporcionar en aproximadamente 5 a aproximadamente 20 fracciones. La ICT mieloablativa se puede proporcionar en aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, a aproximadamente 20 fracciones. La terapia mieloablativa se puede proporcionar durante aproximadamente 1 a aproximadamente 10 días. La terapia mieloablática se puede proporcionar durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6,

7, 8, 9 o hasta aproximadamente 10 días.

En algunos casos, una dosis baja de ICT puede incluir dosis de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 Gy administradas en aproximadamente 1 a aproximadamente 4 fracciones. En algunos casos, una ICT de baja dosis puede incluir dosis de aproximadamente 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 o de hasta aproximadamente 8 Gy. Se puede administrar una dosis baja de ICT a un sujeto que no tolere la mieloablación debido a la edad o la comorbilidad.

La ICT se puede administrar usando pares paralelos opuestos de haces de fotones de alta energía de aproximadamente 4 a aproximadamente 18 MV para la ICT. En algunos casos, los haces de fotones pueden ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 MV para la ICT. Los haces de fotones pueden ser de aproximadamente

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o hasta aproximadamente 25 MV. La

ICT se puede realizar utilizando equipos tales como Varian Clinac iX o Siemens Artiste.

En algunos casos, una tasa de administración puede ser de aproximadamente 5 cGy/min a aproximadamente

100 cGy/min. Una tasa de administración puede ser de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 1 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 4 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 787980,

81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95 o hasta 100 cGy/min.

En algunos casos, determinados órganos pueden protegerse durante la irradiación. Por ejemplo, un hígado, pulmón, cerebro, corazón o una combinación de los mismos, puede protegerse durante la irradiación corporal total.

Agentes biológicos

En algunos casos, se puede utilizar un agente biológico tal como un anticuerpo para empobrecer las células inmunitarias. Los anticuerpos monoclonales (los mAb, del inglés monoclonal antibodies) que son citolíticos para los linfocitos pueden ser un medio alternativo para obtener la reducción de linfocitos. En algunos casos, un anticuerpo para la reducción de linfocitos T que se puede administrar antes de la infusión de células inmunorreactivas con ^cA ^ranti-GPC3 debe ser eficaz pero de corta vida in vivo, para permitir una infusión y repoblación rápidas con las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 infundidas. Los anticuerpos utilizados pueden dirigirse a marcadores expresados en la superficie de una célula, tal como un linfocito. En algunos casos, los anticuerpos de linforreducción pueden ser anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD45, anti-CD25, anti-CD52 y cualquier combinación de los mismos.

Se pueden utilizar anticuerpos tales como Alemtuzumab (Campath-1H), Bortezomib, timoglobulina (ATG de conejo, Genzyme), ATGAM (ATG equino, Pfizer) y alemtuzumab (Campath-1H). También se puede utilizar como agente reductor de linfocitos rituximab (IDEC-C2B8), GA101, una IgG1 humanizada para CD20, XmAb5574, un anticuerpo con Fc genomodificado para CD19, alefacept (LFA3-Ig), fingolimod (FTY720), globulina antitimocito (ATG), anticuerpos anti-CD4, anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD8. En algunos casos, puede utilizarse la Cladribina (2-CdA, Leustatin®), un análogo de la purina similar a la fludarabina. En algunos casos, un tratamiento de reducción de linfocitos con anticuerpos puede incluir un solo anticuerpo tal como alemtuzumab (anti-CD52). En otros casos, un tratamiento de reducción de linfocitos basado en anticuerpos puede incluir al menos dos anticuerpos, tales como alemtuzumab y anti-CD45. En algunos casos, un tratamiento de reducción de linfocitos puede incluir múltiples modalidades de reducción de linfocitos, tales como radiación combinada con una terapia de anticuerpos o una quimioterapia combinada con radiación. La quimioterapia y la terapia con anticuerpos también se pueden usar en combinación.

Durante un tratamiento de reducción de linfocitos pueden administrarse a los sujetos antibióticos, antifúngicos y antivirales como profilaxis. Por ejemplo, una profilaxis puede incluir Altrex 500 mg al día, Bactrium DS un comprimido cada lunes, miércoles y viernes, y Fluconazol 200 mg al día. La duración de la medicación es hasta que el recuento absoluto de linfocitos (RAL) y el recuento absoluto de neutrófilos (RAN) puedan volver al valor inicial previo a la medicación. Un agente biológico también puede ser la adriamicina.

Se pueden introducir una o más citocinas con las células. Las citocinas se pueden utilizar para reforzar las células transferidas (incluidas las células específicas de tumor transferidas adoptivamente) para expandirse dentro de un microambiente tumoral. En algunos casos, puede usarse IL-2 para facilitar la expansión de las células descritas en el presente documento. También se pueden emplear citocinas tales como IL-15. También se pueden utilizar otras citocinas de interés en el campo de la inmunoterapia, tales como IL-2, IL-7, IL-12, y, L-21 o cualquier combinación de las mismas. En algunos casos, se utilizan citocinas recombinantes.

En algunos casos, se puede administrar un factor de crecimiento de linfocitos T. Un factor de crecimiento puede administrarse por cualquier vía adecuada. Si se administra más de un factor de crecimiento de linfocitos T, pueden administrarse de forma simultánea o secuencial, en cualquier orden, y por la misma vía o distintas vías. Un factor de crecimiento de linfocitos T, tal como Aldesleucina (IL-2), se puede administrar por vía intravenosa como una inyección en embolada. Una dosificación de un factor de crecimiento de linfocitos T, tal como IL-2, es lo que los expertos en la materia consideran alta. Preferentemente, se puede administrar una dosis de aproximadamente 720.000 UI/kg de IL-2 tres veces al día hasta la tolerabilidad. En algunos casos, se administran aproximadamente 5 a aproximadamente 15 dosis de IL-2, con un promedio de alrededor de 9 dosis. Una dosis de un factor de crecimiento de linfocitos T puede ser de aproximadamente 0 a aproximadamente 20. Se puede administrar un factor de crecimiento de linfocitos T 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o hasta aproximadamente 20 veces.

La IL-2 se puede administrar a una dosis de 720.000 UI/kg (basado en el peso corporal total) como una inyección en embolada intravenosa. En algunos casos, La IL-2 se puede administrar durante un período de 15 minutos. En algunos casos, La IL-2 se puede administrar durante un período de 20 minutos. La IL-2 se puede administrar mediante inyección inmediata. En algunos casos se puede administrar IL-2 a lo largo de 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 1 horas, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, o hasta un periodo de 6 horas.

En algunos casos, la IL-2 se puede administrar comenzando dentro de las 24 horas posteriores a la infusión celular y continuando durante hasta aproximadamente 4 días (máximo 12 dosis). En algunos casos, la IL-2 se puede administrar durante hasta aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 días después de una administración inicial.

Las dosis de IL-2 se pueden administrar cada ocho horas. En algunos casos, la IL-2 se puede administrar desde aproximadamente cada 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 horas después de una administración inicial. En algunos casos, la dosificación de IL-2 se puede detener si se detectan toxicidades. En algunos casos, las dosis se pueden retrasar o detener si los pacientes alcanzan una toxicidad de Grado 3 o 4 debido a la aldesleucina, excepto por las toxicidades reversibles de Grado 3 comunes para la aldesleucina, tales como diarrea, náuseas, vómitos, hipotensión, cambios en la piel, anorexia, mucositis, disfagia, o síntomas constitucionales y cambios de laboratorio. En algunos casos, si estas toxicidades pueden revertirse fácilmente en 24 horas con medidas de apoyo, entonces se pueden suministrar dosis adicionales. Además, la dosificación puede suspenderse o detenerse a criterio del médico responsable.

En algunos casos, una célula inmunorreactiva que expresa un CAR anti-GPC3 puede tener una eficacia antitumoral aumentada en comparación con una célula inmunorreactiva comparable que no expresa el CAR anti-GPC3.

En algunos casos, eficacia antitumoral puede referirse a la actividad citotóxica. En otros casos, eficacia antitumoral puede referirse a la persistencia. Eficacia antitumoral también puede referirse a la capacidad de una célula para atacar un tumor. La eficacia antitumoral se puede medir usando diversos ensayos in vitro. Por ejemplo, la capacidad citotóxica se puede medir mediante un ELISA que mide la liberación de interleucina 2 (IL-2) o interferón ^y( ⁱFN^y). La actividad citotóxica se puede medir mediante un ensayo de destrucción, tal como un ensayo de liberación de cromo 51 o un ensayo de cocultivo. En algunos casos, las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 pueden tener una eficacia y capacidad antitumorales aumentadas en comparación con células comparables.

La eficacia de un tratamiento con CAR anti-GPC3 se puede evaluar utilizando múltiples modalidades. Eficacia puede referirse a la eficacia antitumoral, que es la medida en que un tumor, tal como un tumor positivo para GPC3, se controla, reduce o elimina. Eficacia del tratamiento también puede referirse a la expansión, la persistencia, el direccionamiento al tumor y cualquier combinación de los mismos, de las inmunorreactivas con CAR.

Un sujeto al que se le puede administrar una terapia celular inmunorreactiva de CAR anti-GPC3, tal como la terapia de linfocitos T CAR anti-GPC3, se puede evaluar durante una infusión, inmediatamente después de una infusión o hasta años después de una infusión. Por ejemplo, un sujeto tratado puede volver a una clínica para evaluación durante un período de aproximadamente 1 día hasta el final de la vida del sujeto. Un sujeto tratado puede evaluarse de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80 o hasta 90 años después de una administración inicial de las células inmunorreactivas con CAR objeto. En algunos casos, un programa de evaluación puede incluir un seguimiento diario, un seguimiento semanal, un seguimiento mensual o un seguimiento anual. En algunos casos, un sujeto puede ser visto con más frecuencia según esté clínicamente indicado. Una evaluación puede incluir un examen físico, una evaluación química, un hemograma completo, pruebas tiroideas, evaluación de la toxicidad, tomografía computarizada (TC) de un área corporal, aféresis y cualquier combinación de los mismos.

En algunos casos, la aféresis se puede realizar antes y entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 semanas después de la administración de una infusión de células inmunorreactivas con CAR objeto. En otros momentos, los linfocitos de sangre periférica (LSP) de un sujeto se pueden obtener a partir de sangre completa mediante purificación usando centrifugación en un gradiente de Ficoll. Se pueden crioconservar partes alícuota de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) para el control inmunológico de la función celular. En algunos casos, se puede usar una diversidad de pruebas pueden incluir la evaluación de la lisis específica y la liberación de citocinas, estudios metabolómicos y bioenergéticos (usando Seahorse), FACS intracelular de producción de citocinas, ELISA-spot y análisis de subconjuntos de linfocitos para evaluar los correlatos inmunológicos de un tratamiento de células inmunorreactivas con CAR objeto. En general, las diferencias de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 veces en estos ensayos pueden ser indicativas de verdaderas diferencias biológicas. En algunos casos, una diferencia de aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, hasta aproximadamente 5 veces en los ensayos in vitro, después de la terapia con células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3, puede ser indicativo de la eficacia del tratamiento.

En algunos casos, un tratamiento con células inmunorreactivas con CAR objeto puede reducir el tamaño tumoral en al menos el 30 %, medido por tomografía computarizada (TC) o una resonancia magnética. Un tratamiento con células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 puede reducir el tamaño tumoral en al menos el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o hasta aproximadamente el 100 %. Un tratamiento con T-CAR puede eliminar un tumor según lo medido por una TC. En algunos casos, un tratamiento con células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 puede estabilizar un tamaño tumoral medido por un cambio de menos del 10 % de una medición inicial del diámetro de una lesión tumoral según lo medido por tomografía computarizada (TAC). Por ejemplo, un tumor puede no expandirse en tamaño después de la administración de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3. En algunos casos, la estabilización puede considerarse inferior al 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de cambio en el tamaño tumoral en comparación con una medición pretratamiento.

En algunos casos, la eficacia de las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 puede considerarse en términos del tiempo de supervivencia del sujeto. Por ejemplo, un sujeto que se trata con células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3, tales como unos linfocitos T CAR anti-GPC3, puede sobrevivir más tiempo que un sujeto no tratado o un sujeto tratado con una terapia distinta.

En algunos casos, la eficacia de las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 se puede mejorar mediante la adición de un tratamiento secundario, tal como un tratamiento de reducción de linfocitos. Un tratamiento secundario puede presentar sinergia con una terapia celular inmunorreactiva de CAR anti-GPC3. En algunos casos, un tratamiento secundario puede producir efectos aditivos de la terapia celular inmunorreactiva de CAR anti-GPC3. Un tratamiento secundario puede ser la reducción de linfocitos, así como formas adicionales de terapia celular, terapia con anticuerpos, quimioterapia, radioterapia, cirugía, terapia antiangiogénica y cualquier combinación de las mismas.

La respuesta al tratamiento se puede evaluar utilizando los criterios internacionales propuestos por la guía revisada de Criterios de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST, del inglés Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) (Versión 1.1). Los cambios en el diámetro más grande (medida unidimensional) de una lesión tumoral y el diámetro más corto en el caso de los ganglios linfáticos malignos se pueden utilizar en los criterios RECIST. Por ejemplo, las lesiones medibles pueden ser las que se pueden medir con precisión en al menos una dimensión (diámetro más largo a registrar) como > 20 mm mediante radiografía de tórax, como >10 mm con TC o >10 mm con compases calibradores por examen clínico. Para ser considerado patológicamente agrandado y medible, un ganglio linfático puede tener >15 mm en el eje corto cuando se evalúa mediante TC. Todas las demás lesiones (o sitios de enfermedad), incluyendo las lesiones pequeñas (diámetro más largo <10 mm o ganglios linfáticos patológicos con >10 a <15 mm de eje corto), pueden considerarse una enfermedad no medible. Las lesiones óseas, la enfermedad leptomeníngea, la ascitis, los derrames pleurales/pericárdicos, la linfangitis cutánea/neumonitis, la enfermedad inflamatoria de las mamas, pueden considerarse como no medible.

Todas las lesiones medibles hasta un máximo de 2 lesiones por órgano y 5 lesiones en total, representativas de todos los órganos implicados, deben identificarse como lesiones diana y registrarse y medirse al inicio. Las lesiones diana se deben seleccionar en función de su tamaño (lesiones con el diámetro más largo), ser representativas de todos los órganos implicados, pero además deben ser las que se prestan a mediciones repetidas reproducibles. Puede ser el caso que, en ocasiones, la lesión más grande no se presta a una medición reproducible, en cuyo caso debe seleccionarse la siguiente lesión más grande que se puede medir de forma reproducible. Una suma de los diámetros (el más largo para las lesiones no ganglionares, el eje corto para las lesiones ganglionares) para todas las lesiones diana se calcula y se informa como la suma de los diámetros en la situación inicial. Si los ganglios linfáticos deben incluirse en la suma, entonces solo se puede añadir el eje corto a la suma. Se utilizará como referencia un diámetro sumatorio inicial para caracterizar adicionalmente cualquier regresión tumoral objetiva en la dimensión medible de la enfermedad.

En algunos casos, una lesión clínica se puede considerar medible cuando puede ser superficial (por ejemplo, nódulos cutáneos y ganglios linfáticos palpables) y de unos 10 mm de diámetro evaluados con compases calibradores (por ejemplo, nódulos cutáneos). En los casos en que no se puede usar un compás calibrador para medir una lesión, también se puede usar una TC o una RMN. En algunos casos, una TC puede producir cortes de tejido de aproximadamente 5 mm o menos. En algunos casos una TC puede tener 5 mm, 4 mm, 3 mm, 2 mm, 1 mm o 0,5 mm de grosor. Si una TC tiene un grosor de corte superior a 5 mm, un tamaño mínimo para una lesión medible puede ser del doble del grosor del corte. En algunos casos, también se puede realizar una RMN para evaluar a un sujeto. Idealmente, se debe usar el mismo tipo de escáner y se debe seguir el protocolo de adquisición de imágenes lo más cerca posible de las exploraciones anteriores al determinar la eficacia del tratamiento. Las exploraciones corporales deben realizarse con técnicas de exploración en apnea inspiratoria, en caso de que fuese posible. En algunos casos, para medir la eficacia del tratamiento se puede utilizar una tomografía por emisión de positrones (TEP) con fluorodesoxiglucosa (FDG).

Una vez que se ha evaluado un tema, las lesiones diana se pueden agrupar en enfermedad estable (EE), enfermedad progresiva (EP), respuesta parcial (RP) y/o una respuesta completa (RC). Una EE no puede considerarse ni una reducción del volumen suficiente para calificar como una RP ni un aumento suficiente para calificar como una EP, tomando como referencia la suma más pequeña de diámetros. Se puede considerar EP al menos el 20 % de aumento en la suma de los diámetros de las lesiones diana, tomando como referencia la suma más pequeña (esto puede incluir la suma en la situación inicial si es que es la más pequeña). En algunos casos, además de un aumento relativo de aproximadamente el 20 %, una suma también debe demostrar un aumento absoluto de al menos unos 5 mm. Una RP puede ser una disminución de al menos el 30 % en la suma de los diámetros de las lesiones diana, tomando como referencia la suma de los diámetros de la situación inicial. Una RC puede ser la eliminación de las lesiones diana.

En algunos casos, la administración de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3, tales como los linfocitos T CAR anti-GPC3, y un tratamiento de reducción de linfocitos pueden aumentar de forma sinérgica el tiempo de supervivencia medio de un sujeto en al menos unos 6 meses en comparación con la administración de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 solas, Tabla 6. En algunos casos, una combinación de una terapia con células inmunorreactiva con CAR anti-GPC3 y un tratamiento de reducción de linfocitos puede aumentar de forma sinérgica el tiempo de supervivencia de un sujeto en al menos aproximadamente 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años, 6 años, 7 años, 8 años, 9 años, 10 años o hasta aproximadamente 25 años en comparación con la administración de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 solas.

Tabla 6: Com aración de construcciones

Las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 objeto pueden formularse en un medicamento farmacéutico y utilizarse para tratar a un ser humano o mamífero, que lo necesite, al que se ha diagnosticado una enfermedad, por ejemplo, cáncer. Estos medicamentos farmacéuticos pueden coadministrarse a un ser humano o mamífero, junto con uno o más agentes quimioterapéuticos o compuestos quimioterapéuticos.

Las poblaciones de células inmunorreactivas con CAR objeto, tales como los linfocitos T CAR, puede formularse para la administración a un sujeto usando técnicas conocidas por el experto en la materia. Las formulaciones que comprenden poblaciones de células CAR inmunorreactivas pueden incluir un excipiente (o excipientes) farmacéuticamente aceptable. Los excipientes incluidos en las formulaciones tendrán distintos fines dependiendo, por ejemplo, de la subpoblación de linfocitos T usada y el modo de administración. Los ejemplos de excipientes de uso general incluyeron, sin limitación: solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua para inyección, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos, agentes estabilizantes, agentes solubilizantes y tensioactivos, tampones y conservantes, agentes de tonicidad, agentes formadores de masa y agentes lubricantes. Las formulaciones que comprenden poblaciones de células inmunorreactivas con CAR normalmente se habrán preparado y cultivado en ausencia de cualquier componente no humano, tal como suero animal. Una formulación puede incluir una población de células inmunorreactivas con CAR, o más de una, tal como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más poblaciones de células inmunorreactivas con CAR. Por ejemplo, una formulación puede incluir una población de linfocitos T CAR, o más de una, tal como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más poblaciones de linfocitos T CAR.

Las formulaciones que comprenden una población (o poblaciones) de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 pueden administrarse a un sujeto usando modos y técnicas conocidas por el experto en la materia. Los modos ilustrativos incluyen, pero no se limita a, inyección intravenosa. Otros modos incluyen, sin limitación, intratumoral, intradérmica, subcutánea (S.C., s.c., subcut., hipo), intramuscular (i.m.), intraperitoneal (i.p.), intraarterial, intramedular, intracardiaca, intraarticular (articulación), intrasinovial (área de líquido articular), intracraneal, intrarraquídea e intratecal (líquido cefalorraquídeo). Para efectuar tal administración puede usarse cualquier dispositivo conocido útil para inyección parenteral de infusión de las formulaciones.

Las formulaciones que comprenden una población (o poblaciones) de células inmunorreactivas con CAR que se administran a un sujeto comprenden varias células inmunorreactivas con CAR que son eficaces para el tratamiento y/o la profilaxis de la afección o enfermedad específica. Por tanto, pueden administrarse a los sujetos poblaciones terapéuticamente eficaces de células inmunorreactivas con CAR. En general, se administran formulaciones que comprenden entre aproximadamente 1 x 104 y aproximadamente 1 x 1010 células inmunorreactivas con CAR. En la mayoría de los casos, la formulación comprenderá entre aproximadamente 1 x 105 y aproximadamente 1 x 109 células inmunorreactivas con CAR, de aproximadamente 5 x 105 a aproximadamente 5 x 108 células inmunorreactivas con CAR, o de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 107 células inmunorreactivas con CAR. Sin embargo, el número de células inmunorreactivas con CAR administradas a un sujeto variará entre amplios límites, dependiendo de la ubicación, fuente, identidad, extensión y gravedad del cáncer, la edad y el estado del individuo a tratar, etc. Un médico determinará en última instancia las dosis adecuadas que deben utilizarse.

Las moléculas dirigidas a tumores se administran a un sujeto antes, al mismo tiempo que o después de la administración de las células inmunorreactivas con CAR. Las moléculas dirigidas a tumores se unen a las células diana del sujeto mediante asociación con un antígeno asociado a tumor o un antígeno específico de tumor. Las moléculas dirigidas a tumores pueden formularse para la administración a un sujeto usando técnicas conocidas por el experto en la materia. Las formulaciones de moléculas dirigidas a tumores pueden incluir un excipiente (o excipientes) farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de excipientes de uso general incluyen, sin limitación: solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua para inyección, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos, agentes estabilizantes, agentes solubilizantes y tensioactivos, tampones y conservantes, agentes de tonicidad, agentes formadores de masa y agentes lubricantes.

Las moléculas dirigidas a tumores pueden administrarse a un sujeto usando modos y técnicas conocidas por el experto en la materia. Los modos ilustrativos incluyen, pero no se limita a, inyección intravenosa, intraperitoneal e intratumoral. Otros modos incluyen, sin limitación, intradérmica, subcutánea (S.C., s.c., subcut., hipo), intramuscular (i.m.), intraarterial, intramedular, intracardiaca, intraarticular (articulación), intrasinovial (área de líquido articular), intracraneal, intrarraquídea e intratecal (líquido cefalorraquídeo). En algunos casos, un T-CAR puede administrarse localmente en una lesión tumoral, tal como una lesión hepática. Para efectuar tal administración puede usarse cualquier dispositivo conocido útil para inyección parenteral o infusión de las formulaciones.

Las formulaciones que comprenden las moléculas dirigidas a tumores se administran a un sujeto en una cantidad que es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis de la afección o enfermedad específica. En general, las formulaciones que comprenden al menos aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de las moléculas dirigidas a tumores se administran a un sujeto que necesita tratamiento. En la mayoría de los casos, la dosificación es de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de las proteínas etiquetadas al día, teniendo en cuenta las vías de administración, los síntomas, etc. Un médico determinará las dosificaciones apropiadas que se utilizarán.

En una realización, se utiliza un receptor quimérico para el antígeno para estimular una respuesta inmunitaria mediada por células inmunorreactivas. Por ejemplo, una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T es una respuesta inmunitaria que implica la activación de linfocitos T. Los linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno activados pueden inducir la apoptosis en células diana que presenten epítopos de antígenos extraños en su superficie, tal como, por ejemplo, células cancerosas que presenten antígenos tumorales. En otra realización, se usa un receptor quimérico para el antígeno para proporcionar inmunidad antitumoral en el mamífero. Debido a una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T, el sujeto desarrollará una inmunidad antitumoral.

En determinados casos, los métodos para tratar a un sujeto que tiene cáncer pueden implicar administrar a un sujeto que necesita tratamiento una o más formulaciones de moléculas dirigidas a tumores, en donde estas moléculas se unen a una célula cancerosa, y administrar una o más poblaciones terapéuticamente eficaces de células inmunorreactivas con CAR objeto, en donde las células inmunorreactivas con CAR pueden unirse a las moléculas dirigidas a tumores e inducir la muerte de las células cancerosas. Otra realización puede referirse a métodos de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer que comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento una o más poblaciones terapéuticamente eficaces de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 objeto, en donde las células inmunorreactivas con CAR se unen a una célula cancerosa, induciendo así la muerte de las células cancerosas.

Las frecuencias de administración de ambas formulaciones que comprenden células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 y células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 en combinación con moléculas dirigidas a tumores variarán dependiendo de factores que incluyen la enfermedad que se está tratando, los elementos que comprenden las células inmunorreactivas con CAR y las moléculas dirigidas a tumores, y los modos de administración. Cada formulación se puede administrar independientemente 4, 3, 2 o una vez al día, cada dos días, cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días, cada seis días, una vez a la semana, cada ocho días, cada nueve días, cada diez días, quincenalmente, cada mes y cada dos meses.

Un "agente quimioterapéutico" o "compuesto quimioterapéutica" y sus equivalentes gramaticales como se usa en el presente documento, puede ser un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los agentes quimioterapéuticos contra el cáncer que se pueden usar en combinación con la célula inmunorreactiva con CAR divulgada incluyen, pero no se limita a, inhibidores mitóticos (alcaloides de la vinca). Estos incluyen vincristina, vinblastina, vindesina y Navelbine™ (vinorelbina, 5'-noranhidroblastina). Aún en otras realizaciones, los agentes quimioterapéuticos contra el cáncer incluyen inhibidores de la topoisomerasa I, tales como los compuestos de camptotecina. Como se usa en el presente documento, "compuestos de camptotecina" incluyen Camptosar™ (irinotecán HCL), Hycamtin™ (topotecán HCL) y otros compuestos derivados de la camptotecina y sus análogos. Otra categoría de agentes quimioterapéuticos contra el cáncer que se pueden usar en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento son los derivados de podofilotoxina, tales como etopósido, tenipósido y mitopodocida. La presente divulgación abarca además otros agentes quimioterapéuticos contra el cáncer conocidos como agentes alquilantes, que alquilan el material genético en las células tumorales. Estos incluyen, entre otros, cisplatino, ciclofosfamida, mostaza nitrogenada, trimetilentiofosforamida, carmustina, busulfán, clorambucilo, belustina, mostaza de uracilo, clomafacina y dacarbacina. La divulgación abarca antimetabolitos como agentes quimioterapéuticos. Los ejemplos de estos tipos de agentes incluyen arabinósido de citosina, fluorouracilo, metotrexato, mercaptopurina, azatioprima y procarbacina. Una categoría adicional de agentes quimioterapéuticos contra el cáncer que se pueden usar en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluye antibióticos. Los ejemplos incluyen, sin limitación, doxorrubicina, bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, mitramicina, mitomicina, mitomicina C y daunomicina. Existen numerosas formulaciones liposómicas disponibles en el mercado para estos compuestos. La presente divulgación abarca además otros agentes quimioterapéuticos contra el cáncer que incluyen, sin limitación, anticuerpos antitumorales, dacarbacina, azacitidina, amsacrina, melfalán, ifosfamida y mitoxantrona.

Las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC objeto se pueden administrar en combinación con otros agentes antitumorales, incluyendo agentes citotóxicos/antineoplásicos y agentes antiangiogénicos. Los agentes citotóxicos/antineoplásicos pueden definirse como agentes que atacan y destruyen las células cancerosas. Algunos agentes citotóxicos/antineoplásicos pueden ser agentes alquilantes, que alquilan el material genético en las células tumorales, por ejemplo, cisplatino, ciclofosfamida, mostaza nitrogenada, trimetilentiofosforamida, carmustina, busulfán, clorambucilo, belustina, mostaza de uracilo, clomafacina y dacabacina. Otros agentes citotóxicos/antineoplásicos pueden ser antimetabolitos para células tumorales, por ejemplo, arabinósido de citosina, fluorouracilo, metotrexato, mercaptopurinas, azatioprima y procarbacina. Otros agentes citotóxicos/antineoplásicos pueden ser antibióticos, por ejemplo, doxorrubicina, bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, mitramicina, mitomicina, mitomicina C y daunomicina. Existen numerosas formulaciones liposómicas disponibles en el mercado para estos compuestos. Otros agentes citotóxicos/antineoplásicos pueden ser inhibidores mitóticos (alcaloides de la vinca). Estos incluyen vincristina, vinblastina y etopósido. Los agentes citotóxicos/antineoplásicos variados incluyen taxol y sus derivados, L-asparaginasa, anticuerpos antitumorales, dacarbacina, azacitidina, amsacrina, melfalán, VM-26, ifosfamida, mitoxantrona y vindesina.

También se pueden utilizar agentes antiangiogénicos. Los agentes antiangiogénicos adecuados para su uso en los métodos y composiciones divulgados incluyen anticuerpos anti-VEGF, incluyendo anticuerpos humanizados y quiméricos, aptámeros anti-VEGF y oligonucleótidos antisentido. Otros inhibidores de la angiogénesis incluyen angiostatina, endostatina, interferones, interleucina 1 (incluyendo a y p) interleucina 12, ácido retinoico e inhibidores tisulares de metaloproteinasa 1 y 2. (TIMP-1 y -2). Las moléculas pequeñas, incluyendo topoisomerasas tales como razoxano, un inhibidor de la topoisomerasa II con actividad antiangiogénica, también pueden usarse.

Otros agentes antineoplásicos que se pueden usar en combinación con las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 objeto incluyen, pero no se limita a: acivicina; aclarrubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa; asperlina; avastina; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar sódico; bropirimina; busulfán; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetímero; carboplatino; carmustina; clorhidrato de carrubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucilo; cirolemicina; cisplatino; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbacina; dactinomicina; clorhidrato de daunorrubicina; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diazicuona; docetaxel; doxorrubicina; clorhidrato de doxorrubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflornitina; elsamitrucina; enloplatino; enpromato; epipropidina; clorhidrato de epirrubicina; erbulozol; clorhidrato de esorrubicina; estramustina; fosfato sódico de estramustina; etanidazol; etopósido; fosfato de etopósido; etoprina; clorhidrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sódica; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; hidroxiurea; clorhidrato de idarrubicina; ifosfamida; ilmofosina; interleucina II (incluyendo la interleucina II recombinante o rIL2), interferón alfa-2a; interferón alfa-2b; interferón alfa-nl; interferón alfa-n3; interferón beta-I; interferón gamma-I b; iproplatino; clorhidrato de irinotecán; acetato de lanreótido; letrozol; acetato de leuprolida; clorhidrato de liarozol; lometrexol sódico; lomustina; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; maytansina; clorhidrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalán; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sódico; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatino; oxisurán; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobromano; piposulfán; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfímero sódico; porfiromicina; prednimustina; clorhidrato de procarbacina; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurina; riboprina; rogletimida; safingol; clorhidrato de safingol; semustina; simtrazeno; esparfosato sódico; esparsomicina; clorhidrato de espirogermanio; espiromustina; espiroplatino; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalán sódico; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfina; tenipósido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorelina; clorhidrato de tubulozol; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfin; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatino; zinostatina; clorhidrato de zorubicina. Otros fármacos antineoplásicos incluyen, pero no se limita a: 20-epi-1,25-dihidroxivitamina D3; 5-etiniluracilo; abiraterona; aclarrubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas de ALL-TK; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevulínico; amrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrografolida; inhibidores de la angiogénesis; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína morfogenética anti-dorsalizante 1; antiandrógeno, carcinoma de próstata; antiestrógeno; antineoplastón; oligonucleótidos antisentido; glicinato de afidicolina; moduladores de genes de la apoptosis; reguladores de la apoptosis; ácido apurínico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina desaminasa; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetrón; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas de CAR/ABL; benzoclorinas; benzoilestaurosporina; derivados de beta lactama; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulínico; inhibidor de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilespermina; bisnafida; bistrateno A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotriol; calfostina C; derivados de camptotecina; IL-2 de viruela aviar; capecitabina; carboxamida-aminotriazol; carboximidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivado de cartílago; carzelesina; inhibidores de caseína cinasa (ICOS); castanoespermina; cecropina B; cetrorelix; clorinas; cloroquinoxalina sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cipemicina; ocfosfato de citarabina; factor citolítico; citostatina; dacliximab; decitabina; deshidrodidemnina B; deslorelina; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamilo; diazicuona; didemnina B; didox; dietil norespermina; dihidro-5-azacitidina; dihidrotaxol, 9-; dioxamicina; difenil-espiromustina; docetaxel; docosanol; dolasetrón; doxifluridina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebseleno; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; elemeno; emitefur; epirrubicina; epristerida; análogo de estramustina; agonistas de estrógenos; antagonistas de estrógenos; etanidazol; fosfato de etopósido; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; clorhidrato de fluorodaunorrubicina; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; texafirina de gadolinio; nitrato de galio; galocitabina; ganirelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabina; inhibidores de glutatión; hepsulfam; herregulina; bisacetamida de hexametileno; hipericina; ácido ibandrónico; idarrubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; péptidos inmunoestimulantes; inhibidor del factor de crecimiento 1 de tipo insulínico; agonistas del interferón; interferones; interleucinas; iobenguano; yododoxorrubicina; ipomeanol, 4-; iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetrón; jasplaquinolida; kahalalida F; triacetato de lamelarina N; lanreotida; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinano; leptolstatina; letrozol; factor inhibidor de leucemia; interferón alfa de leucocitos; leuprolida+estrógeno+progesterona; leuprorelina; levamisol; liarozol; análogo de poliamina lineal; péptido de disacárido lipófilo; compuestos de platino lipófilos; lisoclinamida 7; lobaplatino; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; lovastatina; loxoribina; lurtotecán; texafirina de lutecio; lisofilina; péptidos líticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspina; inhibidores de matrilisina; inhibidores de metaloproteinasa de matriz; menogaril; merbarona; meterelina; metioninasa; metoclopramida; inhibidor de MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; ARN bicatenario desemparejado; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; mitotoxina de factor de crecimiento de fibroblastos-saporina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; anticuerpo monoclonal, gonadotrofina coriónica humana; monofosforil lípido A sk de pared celular de miobacteria; mopidamol; inhibidor del gen de resistencia a múltiples fármacos; terapia basada en el supresor 1 de tumores múltiples; agente anticanceroso de mostaza; micaperóxido B; extracto de pared celular micobacteriana; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas N-sustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxona+pentazocina; napavina; nafterpina; nartograstim; nedaplatino; nemorrubicina; acido neidrónico; endopeptidasa neutra; nilutamida; nisamicina; moduladores del óxido nítrico; antioxidante de nitróxido; nitrulina; O6-bencilguanina; octreotida; okicenona; oligonucleótidos; onapristona; ondansetrón; ondansetrón; oracina; inductor de citocinas oral; ormaplatino; osaterona; oxaliplatino; oxaunomicina; paclitaxel; análogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoilrizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargasa; peldesina; polisulfato sódico de pentosano; pentostatina; pentrozol; perflubron; perfosfamida; alcohol perilílico; fenazinomicina; acetato de fenilo; inhibidores de fosfatasa; picibanilo; clorhidrato de pilocarpina; pirarrubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inhibidor activador de plasminógeno; complejo de platino; compuestos de platino; complejo de platino-triamina; porfímero sódico; porfiromicina; prednisona; propil-bis-acridona; prostaglandina J2; inhibidores de proteasoma; inmunomodulador basado en proteína A; inhibidor de la proteína cinasa C; inhibidores de la proteína cinasa C, microalgal; inhibidores de la proteína tirosina fosfatasa; inhibidores de purina nucleósido fosforilasa; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado de polioxietileno-hemoglobina piridoxilada; antagonistas de raf; raltitrexed; ramosetrón; inhibidores de ras farnesil proteína transferasa; inhibidores de ras; inhibidores de ras-GAP; reteliptina desmetilada; etidronato de renio Re 186; rizoxina; ribozimas; retinamida RII; rogletimida; rohitucina; romurtida; roquinimex; rubiginona B1; ruboxil; safingol; saintopina; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; miméticos de Sdi 1; semustina; inhibidor 1 derivado de la senescencia; oligonucleótidos sentido; inhibidores de la transducción de señales; moduladores de la transducción de señales; proteína de unión al antígeno de cadena sencilla; sizofirano; sobuzoxano; borocaptato sódico; fenilacetato sódico; solverol; proteína de unión a somatomedina; sonermina; ácido esparfósico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; escualamina; inhibidor de células madre; inhibidores de la división de células madre; estipiamida; inhibidores de estromelisina; sulfinosina; antagonista del péptido intestinal vasoactivo superactivo; suradista; suramina; swainsonina; glucosaminoglucanos sintéticos; talimustina; metyoduro de tamoxifeno; tauromustina; tazaroteno; tecogalán sódico; tegafur; telurapirilio; inhibidores de la telomerasa; temoporfina; temozolomida; tenipósido; tetraclorodecaóxido; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoyetina; mimético de trombopoyetina; timafalsina; agonista del receptor de timopoyetina; timotrinano; hormona estimulante tiroidea; etiopurpurina de etilo y estaño; tirapazamina; bicloruro de titanoceno; topsentina; toremifeno; factor de células madre totipotentes; inhibidores de la transducción; tretinoína; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tropisetrón; turosterida; inhibidores de tirosina cinasa; tirfostinas; inhibidores de UBC; ubenimex; factor inhibidor de crecimiento derivado del seno urogenital; antagonistas del receptor de urocinasa; vapreotida; variolina B; sistema de vector, terapia génica eritrocítica; velaresol; veramina; verdinas; verteporfin; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatino; zilascorb; y estimalámero de zinostatina. En una realización, el fármaco antineoplásico es el 5-fluorouracilo, taxol o leucovorina.

En algunos casos, la célula inmunorreactiva con CAR anti-GPC3 objeto se puede introducir mediante inyección, un catéter o similares. En algunos casos, también se pueden incluir agentes inmunoestimulantes, incluidos, pero sin limitación, interleucinas, por ejemplo, IL-2, IL-3, IL-6 y IL-11, así como las otras interleucinas, los factores estimulantes de colonias, tal como G-, M- y GM-CSF, interferones, por ejemplo, gamma-interferón y eritropoyetina. En algunos casos, un sujeto puede ser tratado con un T-CAR, un inmunoempobrecedor y un inmunoestimulante. Un sujeto puede tratarse con IL-2 para reforzar el rendimiento de un producto celular T-CAR. En algunos casos, un inmunoestimulante puede ser una proteína recombinante. Un inmunoestimulante también puede comprender una porción activa de una proteína. En algunos casos, un inmunoestimulante solo puede comprender una porción de una proteína. Una porción de una proteína puede ser de aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o hasta aproximadamente el 100 % de una proteína.

Las composiciones que comprenden células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 objeto, tales como los linfocitos T CAR, se pueden proporcionar convenientemente como preparaciones líquidas estériles, por ejemplo, soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones, dispersiones o composiciones viscosas, que se pueden tamponar a un pH seleccionado. Las preparaciones líquidas son normalmente más fáciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas y composiciones sólidas. Adicionalmente, las composiciones líquidas son algo más cómodas de administrar, especialmente por inyección. Las composiciones viscosas, por otro lado, se pueden formular dentro del intervalo de viscosidad apropiado para proporcionar períodos de contacto más largos con tejidos específicos. Las composiciones líquidas o viscosas pueden comprender transportadores, que pueden ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando células inmunorreactivas con CAR genéticamente modificadas utilizadas en la práctica de la presente invención en una cantidad necesaria del disolvente apropiado con diversas cantidades de los demás ingredientes, según se desee. Tales composiciones pueden mezclarse con un transportador, diluyente o excipiente adecuado, tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa o similares. Las composiciones también se pueden liofilizar. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes, dispersantes o emulsionantes (por ejemplo, metilcelulosa), agentes tamponadores del pH, aditivos gelificantes o potenciadores de viscosidad, conservantes, aromatizantes, colores, y similares, dependiendo de la vía de administración y la preparación deseada. Pueden consultarse textos convencionales, tales como "REMINGTON'S PHARMAC^eU^tI^cA^lSCIENCE", 17a edición, 1985, para preparar los preparados adecuados, sin excesiva experimentación. Pueden añadirse diversos aditivos que pueden potenciar la estabilidad y esterilidad de las composiciones, incluyendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. Se puede garantizar la prevención de la acción de microorganismos mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede producirse mediante el uso de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. De acuerdo con la presente invención, sin embargo, cualquier vehículo, diluyente o aditivo utilizado tendría que ser compatible con las células inmunorreactivas con CAR genéticamente modificadas o sus progenitoras.

En algunos casos, las composiciones pueden ser isotónicas, es decir, pueden tener la misma presión osmótica que la sangre y el líquido lagrimal. La isotonicidad deseada de las composiciones de la presente invención se puede lograr usando cloruro de sodio u otros agentes farmacéuticamente aceptables tales como dextrosa, ácido bórico, tartrato de sodio, propilenglicol u otros solutos inorgánicos u orgánicos. El cloruro de sodio se prefiere particularmente para tampones que contienen iones de sodio. La viscosidad de las composiciones, si se desea, puede mantenerse al nivel seleccionado usando un agente espesante farmacéuticamente aceptable. Se prefiere la metilcelulosa porque está disponible fácil y económicamente y es fácil de trabajar. Otros agentes espesantes adecuados incluyen, por ejemplo, goma xantana, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carbómero y similares. La concentración preferida del agente espesante dependerá del agente seleccionado. El punto importante es usar una cantidad que logre la viscosidad seleccionada. Evidentemente, la elección de transportadores y otros aditivos adecuados dependerá de la vía exacta de administración y la naturaleza de la forma farmacéutica particular, por ejemplo, forma farmacéutica líquida (por ejemplo, si la composición se va a formular en una solución, una suspensión, gel u otra forma líquida, tal como una forma de liberación temporizada o una forma rellena de líquido).

En algunos casos, por ejemplo, en las composiciones, formulaciones y métodos de tratamiento del cáncer, la dosificación unitaria de la composición o formulación administrada puede ser de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 mg. En algunos casos, la cantidad total de la composición o formulación administrada puede ser de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 g.

En algunos casos, una composición farmacéutica que comprende una célula inmunorreactiva con CAR anti-GPC3 objeto, tal como un linfocito T CAR, puede administrarse sola o junto con un transportador o excipiente farmacéuticamente aceptable, por cualquier vía, y tal administración puede llevarse a cabo en dosificaciones individuales y múltiples. De manera más particular, la composición farmacéutica se puede combinar con diversos transportadores inertes farmacéuticamente aceptables en forma de comprimidos, cápsulas, pastillas para chupar, trociscos, caramelos de mano, polvos, pulverizaciones, suspensiones acuosas, soluciones inyectables, elixires, jarabes y similares. Dichos transportadores incluyen diluyentes sólidos o cargas, medios acuosos estériles y diversos disolventes orgánicos no tóxicos, etc. Además, dichas formulaciones farmacéuticas orales pueden endulzarse y/o aromatizarse adecuadamente por medio de diversos agentes del tipo habitualmente empleado para tales fines.

Por ejemplo, las células pueden administrarse a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después de) cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo, pero sin limitación, el tratamiento con agentes tales como terapia antivírica, cidofovir e interleucina 2, o citarabina (también conocida como ARA-C). En algunos casos, las células genomodificadas se pueden usar en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tal como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias de anticuerpos, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micoplienólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. La composición de células genomodificadas también se puede administrar a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) de un trasplante de médula ósea, terapia ablativa de linfocitos T que utiliza agentes de quimioterapia, tales como, fludarabina, radioterapia externa (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos, tales como OKT3 o CAMPATH. En algunos casos, las composiciones de células genomodificadas se pueden administrar después de la terapia de ablación de linfocitos B, tales como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxán. Por ejemplo, los sujetos pueden someterse a un tratamiento convencional con dosis altas de quimioterapia seguida de trasplante de células madre de sangre periférica. En determinadas realizaciones, después del trasplante, los sujetos pueden recibir una infusión de las células genomodificadas, por ejemplo, células genomodificadas expandidas. Adicionalmente, las células genomodificadas expandidas se pueden administrar antes o después de la cirugía. Las células genomodificadas obtenidas mediante uno cualquiera de los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para tratar a pacientes que lo necesitan contra el rechazo del hospedador contra el injerto (Hcl) y la enfermedad del injerto contra el hospedador (EIcH). Por lo tanto, se puede contemplar un método de tratamiento de pacientes que lo necesiten contra el rechazo del hospedador contra el injerto (Hcl) y la enfermedad del injerto contra el hospedador (EIcH) que comprende tratar a dicho paciente mediante la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de células genomodificadas que comprenden genes de TCR alfa y/o TCR beta inactivados.

Kits

En el presente documento se divulgan kits que comprenden composiciones. En el presente documento también se divulgan kits para el tratamiento o la prevención de un cáncer, infección por patógenos, trastorno inmunitario o trasplante alógeno. En una realización, un kit puede incluir una composición terapéutica o profiláctica que contiene una cantidad eficaz de una célula que comprende uno o más CAR anti-GPC3 en forma de dosificación unitaria. En algunas realizaciones, un kit comprende un recipiente estéril que puede contener una vacuna terapéutica o profiláctica; tales recipientes pueden ser cajas, ampollas, frascos, viales, tubos, bolsas, bolsitas, envases de tipo blíster u otras formas de recipiente adecuado conocidas en la técnica. Dichos envases pueden estar hechos de plástico, vidrio, papel laminado, lámina metálica u otros materiales adecuados para contener medicamentos. En algunos casos, una célula inmunorreactiva anti-GPC3 CAR objeto, tal como un linfocito T CAR, puede proporcionarse junto con instrucciones para administrar la célula inmunorreactiva con CAR a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar un cáncer, infección por patógenos, trastorno inmunitario o trasplante alógeno. Las instrucciones generalmente incluirán información sobre el uso de la composición para el tratamiento o prevención de un cáncer, infección por patógenos, trastorno inmunitario o trasplante alógeno. En algunos casos, un kit puede incluir de aproximadamente 1 x 104 células a aproximadamente 1 x 1012 células. En algunos casos, un kit puede incluir al menos aproximadamente 1x105 células, al menos aproximadamente 1x106 células, al menos aproximadamente 1x107 células, al menos aproximadamente 4x107 células, al menos aproximadamente 5x107 células, al menos aproximadamente 6x107 células, al menos aproximadamente 6x107 células, al menos aproximadamente 8x107 células, al menos aproximadamente 9x107 células, al menos aproximadamente 1x108 células, al menos aproximadamente 2x108 células, al menos aproximadamente 3x108 células, al menos aproximadamente 4x108 células, al menos aproximadamente 5x108 células, al menos aproximadamente 6x 108 células, al menos aproximadamente 6x 108 células, al menos aproximadamente 8x 108 células, al menos aproximadamente 9x 108 células, al menos aproximadamente 1x109 células, al menos aproximadamente 2x109 células, al menos aproximadamente 3x109 células, al menos aproximadamente 4x109 células, al menos aproximadamente 5x109 células, al menos aproximadamente 6x109 células, al menos aproximadamente 6x109 células, al menos aproximadamente 8x109 células, al menos aproximadamente 9x109 células, al menos aproximadamente 1 x1010 células, al menos aproximadamente 2x1010 células, al menos aproximadamente 3x1010 células, al menos aproximadamente 4x1010 células, al menos aproximadamente 5x1010 células, al menos aproximadamente 6x1010 células, al menos aproximadamente 6x1010 células, al menos aproximadamente 8x1010 células, al menos aproximadamente 9x1010 células, al menos aproximadamente 1x1c11 células, al menos aproximadamente 2x1011 células, al menos aproximadamente 3x1011 células, al menos aproximadamente 4x1011 células, al menos aproximadamente 5x1011 células, al menos aproximadamente 6x1011 células, al menos aproximadamente 6x1011 células, al menos aproximadamente 8x1011 células, al menos aproximadamente 9x1011 células o al menos aproximadamente 1x1012 células. Por ejemplo, pueden estar incluidas en un kit aproximadamente 5x1010 las células. En otro ejemplo, un kit puede incluir 3x106 células; las células se pueden expandir a aproximadamente 5x1010 células y se administra a un sujeto.

En algunos casos, un kit puede incluir células alógenas. En algunos casos, un kit puede incluir células que pueden comprender una modificación genómica. En algunos casos, un equipo puede comprender células "listas para usar". En algunos casos, un kit puede incluir células que pueden expandirse para uso clínico. En algunos casos, un kit puede contener contenidos con fines de investigación.

En algunos casos, las instrucciones incluyen al menos uno de los siguientes: descripción del agente terapéutico; pauta posológica y administración para el tratamiento o la prevención de una neoplasia, infección por patógenos, trastorno inmunitario o trasplante alógeno o síntomas de los mismos; precauciones; advertencias; indicaciones; contraindicaciones; información sobre sobredosis; reacciones adversas; farmacología animal; estudios clínicos; y/o referencias. Las instrucciones pueden estar impresas directamente en el envase (cuando esté presente), o como una etiqueta aplicada al envase, o como una hoja, folleto, tarjeta u hoja separada suministrada en o con el envase. En algunos casos, las instrucciones proporcionan procedimientos para administrar las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3, tales como linfocitos T CAR anti-GPC3, después de administrar un agente quimioterapéutico. En algunos casos, las instrucciones proporcionan procedimientos para la administración de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 antes de administrar un agente quimioterapéutico. En algunos casos, las instrucciones proporcionan procedimientos para la administración de células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 al mismo tiempo que la administración de un agente quimioterapéutico. En algunos casos, las instrucciones proporcionan procedimientos para administrar linfocitos inmunorreactivos con CAR anti-GPC3 al menos 12 horas después de administrar un agente quimioterapéutico. En algunos casos, las instrucciones proporcionan procedimientos para administrar células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o hasta 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días después de administrar un agente quimioterapéutico. En algunos casos, las instrucciones proporcionan procedimientos para administrar linfocitos inmunorreactivos con CAR anti-GPC3 al menos 24 horas después de administrar un agente quimioterapéutico. Los linfocitos inmunorreactivos con CAR anti-GPC3 pueden formularse para inyección intravenosa. Los linfocitos inmunorreactivos con CAR anti-GPC3 pueden formularse para inyección intraarterial en el hígado de un sujeto que puede comprender un tumor sólido.

En algunos casos, un kit puede contener ciclofosfamida y/o fludarabina, formuladas para la administración a un sujeto que lo necesite a aproximadamente 60 mg/kg a aproximadamente 80 mg/kg y a aproximadamente a 25 mg/m2 a aproximadamente 35 mg/m2, respectivamente. En algunos casos, un kit puede contener productos en una dosis pediátrica.

Los métodos recombinantes son bien conocidos en la técnica. La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que se encuentran entre las capacidades de la técnica. Dichas técnicas se explican con detalle en las referencias, tales como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (Wei & Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller y Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); y "Current Protocols in Immunology" (Coligan et al., eds., 1991). Estas técnicas son aplicables a la producción de los polinucleótidos y polipéptidos, y, como tales, pueden tenerse en cuenta a la hora de fabricar y poner en práctica la invención. Las técnicas particularmente útiles se discuten en los apartados que siguen.

APLICACIONES ADICIONALES

Las inmunoterapias basadas en la transferencia de células adoptivas (ACT, del inglés adoptive cell transfer-based immunotherapies) eficaces pueden ser útiles para tratar pacientes con cáncer (por ejemplo, cáncer metastásico). Por ejemplo, los linfocitos de sangre periférica (LSP) autólogos pueden modificarse utilizando métodos víricos o no víricos divulgados en el presente documento para expresar un receptor quimérico para el antígeno (CAR) anti-GPC3 que reconoce a GPC3 en células cancerosas o tumorales y puede utilizarse en los métodos y kits divulgados. La presente divulgación puede estar dirigida a composiciones y métodos para inmunoterapia, incluyendo, pero sin limitación, cáncer, usando un receptor quimérico para el antígeno humano o humanizado después o al mismo tiempo que un tratamiento de reducción de linfocitos en un sujeto. Este receptor quimérico para el antígeno hace uso de construcciones de receptor quimérico para el antígeno humano o humanizado después o al mismo tiempo que un tratamiento de reducción de linfocitos en un sujeto.

Estas composiciones y métodos pueden proporcionar una terapia contra el cáncer con muchas ventajas. En algunos casos, un método puede incluir la modificación de células inmunorreactivas para hacer que las células inmunorreactivas sean sustancialmente no dependientes de la presencia o actividad de un complejo principal de histocompatibilidad (MHC). En algunos casos, un ácido polinucleico descrito en el presente documento puede codificar un receptor quimérico para el antígeno. También se divulgan métodos para fabricar células inmunorreactivas que expresan receptores quiméricos para el antígeno, tal como un CAR anti-GPC3. También se puede divulgar un método de tratamiento en el que a los pacientes con cáncer o enfermedad se les pueden administrar células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3.

En el presente documento se describe un método de tratamiento de una enfermedad (por ejemplo, cáncer) en un receptor, que comprende trasplantar al receptor una o más células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 objeto después o al mismo tiempo que el tratamiento de reducción de linfocitos.

La infusión de linfocitos autólogos se puede utilizar en un tratamiento. Los monocitos de sangre periférica (los CMSP) autólogos pueden recolectarse de un paciente que necesita tratamiento y pueden activarse y expandirse los linfocitos T usando métodos descritos en el presente documento y conocidos en la técnica, y luego infundirse nuevamente al paciente. En otros casos, se pueden usar células alógenas para tratar a un paciente. Se pueden formular poblaciones de células inmunorreactivas con CAR objeto para su administración; y en donde la administración a un sujeto usando técnicas conocidas por el experto en la materia. Luego, las células expandidas se pueden cultivar en condiciones similares a las de las células no modificadas, por lo que las células modificadas se pueden expandir y usar para una diversidad de fines.

El método descrito en el presente documento puede comprender el trasplante. T rasplante puede referirse al trasplante adoptivo de un producto celular. El trasplante puede ser autotrasplante, alotrasplante, xenotrasplante o cualquier otro trasplante. Por ejemplo, el trasplante puede ser xenotrasplante. El trasplante también puede ser alotrasplante.

En algunos casos, aproximadamente 5x1010 células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 objeto se administran a un sujeto. En algunas realizaciones, aproximadamente 5x1010 células representa una cantidad mediana de células administradas a un sujeto. En algunas realizaciones, aproximadamente 5x1010 células son necesarias para efectuar una respuesta terapéutica en un sujeto. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente al menos aproximadamente 1 x107 células, al menos aproximadamente 2x107 células, al menos aproximadamente 3x107 células, al menos aproximadamente 4x107 células, al menos aproximadamente 5x107 células, al menos aproximadamente 6x107 células, al menos aproximadamente 6x107 células, al menos aproximadamente 8x107 células, al menos aproximadamente 9x107 células, al menos aproximadamente 1 x108 células, al menos aproximadamente 2x108 células, al menos aproximadamente 3x108 células, al menos aproximadamente 4x108 células, al menos aproximadamente 5x108 células, al menos aproximadamente 6x108 células, al menos aproximadamente 6x108 células, al menos aproximadamente 8x108 células, al menos aproximadamente 9x108 células, al menos aproximadamente 1x109 células, al menos aproximadamente 2x109 células, al menos aproximadamente 3x109 células, al menos aproximadamente 4x 109 células, al menos aproximadamente 5x 109 células, al menos aproximadamente 6x 109 células, al menos aproximadamente 6x 109 células, al menos aproximadamente 8x109 células, al menos aproximadamente 9x109 células, al menos aproximadamente 1 x1010 células, al menos aproximadamente 2x1010 células, al menos aproximadamente 3x1010 células, al menos aproximadamente 4x1010 células, al menos aproximadamente 5x1010 células, al menos aproximadamente 6x1010 células, al menos aproximadamente 6x1010 células, al menos aproximadamente 8x1010 células, al menos aproximadamente 9x1010 células, al menos aproximadamente 1x1011 células, al menos aproximadamente 2x1011 células, al menos aproximadamente 3x1011 células, al menos aproximadamente 4x1011 células, al menos aproximadamente 5x1011 células, al menos aproximadamente 6X1011 células, al menos aproximadamente 6X1011 células, al menos aproximadamente 8x1011 células, al menos aproximadamente 9x1011 células o al menos aproximadamente 1 x1012 células. Por ejemplo, se pueden administrar aproximadamente 5x1010 células a un sujeto. En otro ejemplo, comenzando con 3x106 células, las células se pueden expandir a aproximadamente 5x1010 células y se administra a un sujeto. En algunos casos, las células se expanden a un número suficiente para la terapia. Por ejemplo, 5 x107 células pueden experimentar una rápida expansión para generar un número suficiente para el uso terapéutico. En algunos casos, los números suficientes para el uso terapéutico pueden ser de 5x1010. Se puede infundir cualquier número de células para el uso terapéutico. Por ejemplo, a un sujeto se le puede infundir un número de células entre 1x106 a 5x1012 inclusive. A un paciente se le puede infundir tantas células como se puedan generar para él. En algunos casos, no todas las células que se infunden en un paciente están genomodificadas. Por ejemplo, al menos el 90 % de las células que se infunden en un paciente pueden estar genomodificadas. En otros casos, al menos el 40 % de las células que se infunden en un paciente pueden estar genomodificadas. En algunas realizaciones, un método puede comprender calcular y/o administrar a un sujeto una cantidad de células genomodificadas necesaria para afectar una respuesta terapéutica en el sujeto. En algunas realizaciones, el cálculo de la cantidad de células genomodificadas necesarias para afectar una respuesta terapéutica comprende la viabilidad de las células y/o la eficacia con la que se ha integrado un transgén de un CAR anti-GPC3 en el genoma de una célula. En algunas realizaciones, con el fin de afectar a una respuesta terapéutica en un sujeto, las células administradas al sujeto pueden ser células viables. En algunas realizaciones, con el fin de efectuar a una respuesta terapéutica en un sujeto, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 10 % de las células son células viables. En algunas realizaciones, con el fin de afectar a una respuesta terapéutica en un sujeto, las células administradas a un sujeto pueden ser células a las que se les ha integrado satisfactoriamente uno o más transgenes en el genoma de la célula. En algunas realizaciones, con el fin de efectuar a una respuesta terapéutica en un sujeto, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 10 % de las células se han integrado uno o más transgenes de CAR satisfactoriamente en el genoma de una célula.

En algunos casos, a un sujeto se le pueden administrar células inmunorreactivas anti-GPC3 CAR objeto, en donde las células inmunorreactivas con CAR que se pueden administrar pueden tener entre 1 y 35 días. Por ejemplo, las células administradas pueden tener 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o hasta aproximadamente 40 días. La edad de una célula inmunorreactiva con CAR puede considerarse a partir del momento de la estimulación. La edad de una célula inmunorreactiva con CAR puede considerarse a partir del momento de la aféresis. La edad de una célula inmunorreactiva con CAR puede considerarse a partir del momento de la transducción. En algunas realizaciones, las células inmunorreactivas con CAR que se pueden administrar a un sujeto tienen aproximadamente 10 a aproximadamente 14, o aproximadamente 20 días. En algunos casos, una "edad" de una célula inmunorreactiva con c A r puede determinarse por la longitud de un telómero. Por ejemplo, una célula inmunorreactiva con CAR "joven" puede tener una longitud de telómeros más larga que una célula inmunorreactiva con CAR "agotada" o "vieja". Sin pretender quedar vinculado a teoría particular alguna, se puede creer que las células inmunorreactivas pierden una longitud de telómero estimada de aproximadamente 0,8 kb por semana en cultivo, y que los cultivos de células inmunorreactivas con CAR jóvenes pueden tener telómeros que son aproximadamente 1,4 kb más largos que las células inmunorreactivas que tienen aproximadamente 44 días. Sin pretender quedar vinculado a teoría particular alguna, se cree que las longitudes más largas de los telómeros se pueden asociar con respuestas clínicas objetivo positivas en los pacientes y la persistencia de las células in vivo.

En algunos casos, las células se aíslan del organismo objeto, se transfectan con un ácido nucleico (por ejemplo, gen o ADNc) y se reinfunden de nuevo en el organismo objeto (por ejemplo, paciente).

Las células (por ejemplo, células genomodificadas o linfocitos T primarios genomodificados) pueden ser funcionales antes, después y/o durante el trasplante. Por ejemplo, las células trasplantadas pueden ser funcionales durante al menos o al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 6, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 días después del trasplante. Las células trasplantadas pueden ser funcionales durante al menos o al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses después del trasplante. Las células trasplantadas pueden ser funcionales durante al menos o al menos aproximadamente 1, 2, 3,

4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o 30 años después del trasplante. En algunos casos, las células trasplantadas pueden

ser funcionales durante toda la vida del receptor.

Además, las células trasplantadas pueden funcionar al 100 % de su función normal prevista. Las células trasplantadas

también pueden funcionar el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,

27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65,

66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o hasta aproximadamente el 100 % de su función normal previst

Las células trasplantadas también pueden funcionar por encima del 100 % de su función normal prevista. Por ejemplo, las células trasplantadas pueden funcionar al 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400, 500,

600, 700, 800, 900, 1000 o hasta aproximadamente el 5000 % de su función normal prevista.

El trasplante puede ser por cualquier tipo de trasplante. Los sitios pueden incluir, pero sin limitación, el espacio subcapsular hepático, el espacio subcapsular esplénico, el espacio subcapsular renal, el epiplón, la submucosa gástrica o intestinal, el segmento vascular del intestino delgado, el saco venoso, los testículos, el cerebro, el bazo o la córnea. Por ejemplo, el trasplante puede ser trasplante subcapsular. El trasplante también puede ser un trasplante intramuscular. El trasplante puede ser un trasplante intraportal.

Después del tratamiento (por ejemplo, cualquiera de los tratamientos divulgados en el presente documento), el rechazo

del trasplante se puede mejorar en comparación con cuando se trasplantan una o más células de tipo silvestre a un receptor. Por ejemplo, el rechazo del trasplante puede ser un rechazo hiperagudo. El rechazo del trasplante también

puede ser un rechazo agudo. Otros tipos de rechazo pueden incluir el rechazo crónico. El rechazo del trasplante

también puede ser rechazo mediado por células o rechazo mediado por linfocitos T. El rechazo del trasplante también

puede ser un rechazo mediado por linfocitos citolíticos naturales.

Mejorar el trasplante puede significar disminuir el rechazo hiperagudo, lo que puede abarcar una disminución, reducción o aminoración de un efecto o síntoma indeseable. Trasplante puede referirse al trasplante adoptivo de un producto celular.

Otro indicio de un trasplante satisfactorio pueden ser los días que un receptor no precisa una terapia inmunosupresora.

Por ejemplo, después del tratamiento (por ejemplo, trasplante) proporcionado en el presente documento, un receptor puede no precisar terapia inmunosupresora durante al menos o al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10

o más días. Esto puede indicar que el trasplante fue satisfactorio. Esto también puede indicar que no hay rechazo de

las células, tejidos y/u órganos trasplantados.

En algunos casos, un receptor puede no precisar terapia inmunosupresora durante al menos 1 día. Un receptor también puede no precisar terapia inmunosupresora durante al menos 7 días. Un receptor puede no precisar terapia inmunosupresora durante al menos 14 días. Un receptor puede no precisar terapia inmunosupresora durante al menos

21 días. Un receptor puede no precisar terapia inmunosupresora durante al menos 28 días. Un receptor puede no precisar terapia inmunosupresora durante al menos 60 días. Adicionalmente, un receptor puede no precisar terapia inmunosupresora durante al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más años.

Otro indicio de un trasplante satisfactorio pueden ser los días que un receptor precise una terapia inmunosupresora reducida. Por ejemplo, después de dicho tratamiento proporcionado en el presente documento, un receptor puede precisar terapia inmunosupresora reducida durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más días. Esto puede indicar que el trasplante fue satisfactorio. Esto también puede indicar que no hay rechazo de las células, tejidos y/u órganos trasplantados o que éste es mínimo.

Por ejemplo, un receptor puede precisar terapia inmunosupresora reducida durante al menos 1 día. Un receptor puede precisar terapia inmunosupresora reducida durante al menos 7 días. Un receptor puede precisar terapia inmunosupresora reducida durante al menos 14 días. Un receptor puede precisar terapia inmunosupresora reducida

durante al menos 21 días. Un receptor puede precisar terapia inmunosupresora reducida durante al menos 28 días.

Un receptor puede precisar terapia inmunosupresora reducida durante al menos 60 días. Adicionalmente, un receptor puede precisar terapia inmunosupresora reducida durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más años.

Terapia inmunosupresora reducida puede referirse a una terapia menos inmunosupresora en comparación con una

terapia inmunosupresora necesaria cuando se trasplantan una o más células de tipo silvestre a un receptor.

La terapia inmunosupresora puede comprender cualquier tratamiento que suprima el sistema inmunitario. La terapia inmunosupresora puede ayudar a aliviar, minimizar o eliminar el rechazo del trasplante en un receptor. Por ejemplo, la terapia inmunosupresora puede comprender fármacos inmunosupresores. Fármacos inmunosupresores que se

pueden usar antes, durante y/o después del trasplante, pero no se limita a, MMF (micofenolato de mofetilo (Cellcept)),

ATG (globulina anti-timocito), anti-CD 154 (CD4OL), anti-CD40 (2C10, ASKP1240, CCFZ533X2201), alemtuzumab (Campath), anti-CD20 (rituximab), anticuerpo anti-IL-6R (tocilizumab, Actemra), anticuerpo anti-IL-6 (sarilumab, olokizumab), Ig para CTLA4 (Abatacept/Orencia), belatacept (LEA29Y), sirólimus (Rapimune), everolimus, tacrólimus (Prograf), daclizumab (Ze-napax), basiliximab (Simulect), infliximab (Remicade), ciclosporina, desoxiespergualina, receptor del complemento soluble 1, factor de veneno de cobra, compstatina, anticuerpo anti C5 (eculizumab/Soliris), metilprednisolona, FTY720, everolimus, leflunomida, Ac anti-IL-2R, rapamicina, anticuerpo anti-CXCR3, anticuerpos anti-ICOS, anticuerpo anti-OX40 y anticuerpo anti-CD 122. Adicionalmente, uno o más agentes/fármacos inmunosupresores pueden usarse juntos o secuencialmente. Para el tratamiento de inducción o de mantenimiento pueden utilizarse uno o más de un agente inmunosupresor. Durante las fases de inducción y mantenimiento pueden utilizarse los mismos fármacos o fármacos distintos. En algunos casos, daclizumab (Zenapax) se puede usar para la terapia de inducción y tacrólimus (Prograf) y sirólimus (Rapimune) se pueden usar para la terapia de mantenimiento. Daclizumab (Zenapax) también se puede usar para la terapia de inducción y se pueden usar dosis bajas de tacrólimus (Prograf) y sirólimus (Rapimune) para la terapia de mantenimiento. La inmunosupresión también se puede lograr usando regímenes no farmacológicos que incluyen, pero sin limitación, irradiación cuerpo completo, irradiación tímica y esplenectomía total y/o parcial. Estas técnicas también se pueden utilizar en combinación con uno o más fármacos inmunosupresores.

Ejemplos

La divulgación se describe adicionalmente en detalle con referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan solo con fines ilustrativos y no se pretende que sean limitantes, a menos que se especifique otra cosa. Por tanto, la divulgación no debe interpretarse de ninguna manera como limitada a los siguientes ejemplos, sino que, en cambio, debe interpretarse que abarca todas y cada una de las variaciones que se hagan evidentes como resultado de la enseñanza proporcionada en el presente documento.

Ejemplo 1: Construcción del vector del CAR anti-GPC3

Se construyó un vector plasmídico lentivírico ilustrativo utilizando un sistema de vector lentivírico autoinactivante de tercera generación. El sistema contiene el plásmido de empaquetamiento pMDLg RRE que codifica Gag/Pol (Addgene), el plásmido de empaquetamiento pRSV-REV que codifica Rev (Addgene), el plásmido de envoltura pCMV-VSV-G que codifica VSV-G (Addgene), y un vector de expresión recombinante que codifica un gen de CAR basado en un vector vacío pRRLSIN-cPPT.PGK-GFP.WPRE (Addgene). El sistema puede reducir de forma eficaz el riesgo de formar partículas de lentivirus con capacidad de replicación (LCR).

El vector vacío pRRLSIN-cPPT.PGK-GFP.WPRE contiene un promotor del factor de elongación-1 a (EF-1a) y un sitio de escisión Mlu/ de insertos entre el promotor y el péptido señal CD8asp. De manera específica, el vector pWPT-EGFP (Addgene) fue doblemente digerido con Clal/SalI (NEB) para recuperar fragmentos de ADN de 1,1 Kb, que luego se ligaron con T4 ADN ligasa a pRRLSIN-cPPT.PGK-GFP.WPRE que se digirió dos veces con Clal/SalI. A continuación, la mezcla de ligación se transformó en células hospedadoras TOP10. Los clones positivos se identificaron mediante PCR de colonias y se confirmaron mediante secuenciación, dando lugar al plásmido recombinante pRRLSIN-cPPT.EF-1a-EGFP.WPRE. El promotor de EF-1a (SEQ ID NO: 33, incluido el sitio de escisión Mlu I) del dominio señal de CD8a (también conocido como Fragmento 1,442 pb) se amplificó con el cebador secuencia arriba 5'-gcaggggaaagaatagtagaca-3' (SEQ ID NO: 31), el cebador secuencia abajo 5'-CGGCCTGGCGGCGTGGAG-3' (SEQ ID NO: 32), y pRRLSIN-cPPT.EF-1 a-EGFP.wPRE como molde, y la amplificación se realizó en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94 °C durante 4 min; desnaturalización a 94 °C durante 30 s, apareamiento a 53 °C durante 30 s y extensión a 68 °C durante 30 s; y después de 25 ciclos, extensión a 68 °C durante 10 min. Se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa que la banda amplificada tenía el tamaño de fragmento esperado.

El anticuerpo humanizado 35 se ha descrito en la solicitud de patente china n.° CN201510481235.1, que es capaz de reconocer específicamente la proteína GPC3 humanizada. Para construir el plásmido lentivírico de 35-CAR, se usaron los siguientes en la amplificación para proporcionar un fragmento de dominio variable de cadena pesada: fragmento que contiene el dominio variable de cadena pesada 35 (SEQ ID NO: 80 en el documento CN201510481235.1) como molde, cebador secuencia arriba 5'-ctccacgccgccaggccggaggtgcagctggtgcag-3' (SEQ ID NO: 34), y cebador secuencia abajo 5'-GCGGTGTCCTCGCTCCGCAGGCTGCTCAGCTCCATGTAGGCGGTG-3' (SEQ ID NO: 35); se usaron los siguientes para proporcionar un fragmento de dominio variable de cadena ligera: fragmento que contiene el dominio variable de cadena ligera de 35 (SEQ ID NO: 79, documento CN201510481235.1 como molde, cebador cadena arriba 5'-GCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTTCTACAGCTAC-3' (SEQ ID NO: 36) y cebador cadena abajo 5'-CGGCGCTGGCGTCGTGGTACG TTTGATCTCCAGCTTGGTG-3' (SEQ ID NO: 37). Los cebadores de dominio variable de cadena pesada y cadena ligera se amplificaron con PCR puente para proporcionar el fragmento scFv de 35 (SEQ ID NO: 38, también conocido como Fragmento 2, 765 pb), que comprende una secuencia repetitiva del péptido señal de CD8a corriente arriba y la región bisagra corriente abajo. La amplificación por PCR se realizó en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94 °C durante 4 min; desnaturalización a 94 °C durante 40 s, hibridación a 58 °C durante 40 s; extensión a 68 °C durante 40 s; y después de 25 ciclos, una extensión a 68 °C durante 10 min. Se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa que la banda amplificada tenía el tamaño de fragmento esperado.

Se usaron el cebador corriente arriba 5'-accacgacgccagcgccg-3' (SEQ ID NO: 39) y el cebador corriente abajo 5'-aatccagaggttgattgtcgacctagcgagggggcagggcctgc-3' (SEQ ID NO: 40), con pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z como molde (véase la solicitud de patente china CN 104140974 A), para amplificar Bisagra-28Z (SEQ ID NO: 41, Fragmento 3, 703 pb) (con el sitio de escisión Sal I interno). La amplificación por PCR se realizó en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94 °C durante 4 min; desnaturalización a 94 °C durante 30 s; hibridación a 60 °C durante 30 s; extensión a 68 °C durante 30 s; y después de 25 ciclos, extensión final a 68 °C durante 10 min. Se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa que la banda amplificada tenía el tamaño de fragmento esperado. Una cantidad equimolar (aproximadamente 50 ng) del Fragmento 1, el fragmento 2 y el fragmento 3 se amplificó mediante PCR solapante en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94 °C durante 4 min; desnaturalización a 94 °C durante 40 s; hibridación a 60 °C durante 40 s; extensión a 68 °C durante 140 s; y después de 5 ciclos, extensión final a 68 °C durante 10 min. A continuación se suplementaron ADN polimerasa, el cebador corriente arriba 5'-gcaggggaaagaatagtagaca-3' (SEQ ID NO: 31) y el cebador corriente abajo 5'-aatccagaggttgattgtcgacctagcgagggggcagggcctgc-3' (SEQ ID NO: 40) a la mezcla y se amplificó durante 25 ciclos en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94 °C durante 4 min; desnaturalización a 94 °C durante 40 s; hibridación a 60 °C durante 40 s; extensión a 68 °C durante 140 s; y extensión final a 68 °C durante 10 min. El tamaño teórico del 35-28Z resultante (SEQ ID NO: 41) fue de 1874 pb. El producto amplificado se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa y tenía el tamaño de fragmento esperado y la secuencia que se muestra como la SEQ ID NO: 23.

El vector pRRLSIN-cPPT.EF-1 a-EGFP.WPRE y el vector 35-28Z se digirieron con Mlu/ y Sal/, y luego se ligaron con ligasa T4 y se transformaron en TOP10. Los clones positivos se identificaron con PCR de colonias y se secuenciaron mediante Invitrogen para confirmar que se obtuvo pRRL-EF-1a-35-28Z.

Ejemplo 2: Empaquetamiento de lentivirus con CAR anti-GPC3

Se preparó una solución madre (0,75 l) de lentivirus con CAR anti-GPC3 utilizando células renales embrionarias 293 T (ATCC: CRL-11268). De manera específica, se sembraron células 293T a 1,17x104/cm2 en un cellstack de 5 capas (Corning). El día de la transfección se preparó la solución A comprendiendo 133,2 |jg del plásmido de empaquetamiento pRSV-Rev, 133,2 jg de pMDLg/pRRE, 51,56 jg de pCMV-VSV-G y 111,7 jg de pRRL-EF-1a-35-28Z, disolviendo 966 jg de todo el plásmido en 17 ml de medio basal DMEM y mezclándolo suavemente. Se preparó la solución B disolviendo 2,9 mg de PEI (Polysciences) en 17 ml de medio basal DMEM, y la solución se mezcló suavemente y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se introdujo la solución A en la solución B, se mezcló homogéneamente y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 20 min a 25 min. A continuación, la solución de cultivo de 293 T se transfirió de un Cellstack a un matraz de 1 litro. La solución combinada comprendiendo plásmido y PEI se introdujo luego en la solución de cultivo y se mezcló suavemente. Luego, la solución resultante se transfirió a un Cellstack y se incubó durante 5 h a 37 °C, CO2 al 5 % antes de que el medio se cambiara a medio de crecimiento DMEM recién preparado complementado con SFB al 10 % (Life Technology). A continuación, el cultivo se incubó a 37 °C, CO2 al 5 % durante 48 h. A continuación, la solución de reserva lentivírica se recuperó, se filtró con un filtro de 0,45 jm (Millipore), se concentró y se purificó con el sistema de filtración de flujo tangencial KrosFlo® IIi (Spectrum), se lavó con AIM-V (tecnología Life) y se almacenó. La titulación del virus se realizó de acuerdo con el método descrito en el documento CN104140974A. El título del virus se calculó en aproximadamente 1 x108/ml. El virus se envasó a 1 x 108/vial y se almacenó a -80 °C para su uso posterior.

Ejemplo 3: Preparación de linfocitos T CAR anti-GPC3 y ensayo antitumoral in vitro contra células de cáncer de hígado

Los linfocitos T CAR se prepararon en un laboratorio de preparación de células inmunitarias siguiendo las normas de cGMP. De manera específica, la sangre periférica de sujetos o sangre enriquecida en glóbulos blancos obtenida utilizando un separador de componentes sanguíneos COBE Spectra se separó mediante centrifugación en gradiente de densidad para obtener células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humanas. Las CMSP se mezclaron con perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (Life technology) en una relación de CMSP con respectos a las perlas magnéticas de 1:3, se estimuló con IL-2 humana recombinante a una concentración final de 300 U/ml (Shanghai Hua Xin High Biotechnology Co., Ltd.) y se cultivó durante 48 h. Posteriormente, el lentivirus antes mencionado se usó para transducir los linfocitos T activados a una MOI de aproximadamente 5, mejorándose la eficacia de transducción mediante RetroNectin (Takara). 24 h y 48 h después de la transducción, los virus libres se eliminaron mediante cambio del medio mediante centrifugación a baja velocidad (100 g x 10 min). 72 h después de la transducción, se retiraron las perlas magnéticas. Se repitió la centrifugación antes mencionada y se obtuvo un subcultivo a una densidad de 5x105/ml. Posteriormente, las células se subcultivaron cada dos días a una densidad de aproximadamente 3x105/ml al tiempo que se añadía IL-2 humana recombinante al medio de cultivo de linfocitos a una concentración final de 300 U/ml.

Los linfocitos T CAR transducidos se analizaron en cuanto a la expresión del CAR mediante citometría de flujo después del cultivo in vitro durante 10 a 12 días. Es decir, se analizaron las tasas de transducción positiva de los linfocitos T CAR y se muestran en la Tabla 7. Además, se realizó un ensayo in vitro antitumoral mediante coincubación con células de cáncer de hígado que expresan GPC3 alta Huh-7, PLC/p Rf/5 de baja expresión de GPC3 y SK-HEP-1 negativas para GPC3 durante 18 h a una relación de efectora con respecto a la diana de 3:1, 1:1 y 1:3. Para un procedimiento detallado, consúltese el documento CN104140974A. Los resultados de la actividad antitumoral in vitro a la relación efectora con respecto a la diana de 1:1 se presentan en la Tabla 8.

Los resultados muestran que los linfocitos T con CAR anti-GPC3 expresaron un CAR que varía de aproximadamente el 40 % y aproximadamente el 80 %. Adicionalmente, los linfocitos T CAR anti-GPC3 destruyeron específicamente a las Huh-3 y las PLC/PRF/5 positivas para GPC3 con un efecto dependiente de la dosis en la relación efectora-diana, al tiempo que no tuvieron un efecto destructor sobre las SK-HEP-1 negativas para GPC3 (Tabla 8), lo que indica que los linfocitos T CAR anti-GPC3 preparados a partir de los sujetos en la presente divulgación tienen excelentes efectos de destrucción dirigida.

Tabla 7: Sumario de la tasa de transducción positiva de linfocitos T CAR anti-GPC3 de los sujetos y régimen de administración

 Ejemplo 4: Cambio de los linfocitos después de la reducción de linfocitos

Después de la confirmación de que no se produjo ninguna anomalía durante la preparación de linfocitos T CAR anti-GPC3 procedentes de sujetos tratados, los sujetos se sometieron a una evaluación exhaustiva de diversas condiciones físicas para determinar si los sujetos eran adecuados para la reducción de linfocitos in vivo. Se diseñó un protocolo de reducción primaria de linfocitos para la administración a sujetos adecuados.

Se diseñaron los siguientes dos protocolos de reducción de linfocitos: Protocolo 1: protocolo de reducción de linfocitos por ciclofosfamida (CTX) como único agente, a una dosis de 1 g/m2/día x 1 día. Protocolo 2: protocolo combinado de reducción de linfocitos con fludarabina (FLU) ciclofosfamida, a una dosis de fludarabina 20~30 mg/m2/día x 4 días ciclofosfamida 500 mg/m2/día x 2 días.

El protocolo se implementó con ajustes para incluir las siguientes condiciones: el cálculo de la superficie humana se realizó de acuerdo con la fórmula de Stevenson (Chinese Journal of Physiology, 12:327,1937). Es decir, superficie (m2) = 0,0061 x altura (cm) 0,0128 x peso (kg) - 0,1529. Por ejemplo, un adulto de 170 cm de altura y 60 kg de peso tiene una superficie de 1,6521 m2. Los sujetos no aptos para la reducción de linfocitos debido a las condiciones físicas existentes o por su propia voluntad se asignaron a un segundo turno. Se realizaron distintos tratamientos de reducción de linfocitos en un total de tres sujetos (H01, H02 y H03). Un sujeto (H04) no se sometió a ablación debido a las condiciones físicas y su voluntad. Los protocolos se presentan en la Tabla 9.

H011 indica una administración inicial de terapia de linfocitos T CAR anti-GPC3 al sujeto H01; H012 indica una segunda administración de terapia de linfocitos T CAR anti-GPC3 al sujeto H01; y D0 se definió como el día en que se realizó la administración de linfocitos T CAR anti-GPC3. Tras la implementación de los protocolos de reducción de linfocitos antes mencionados, se produjeron diversos cambios en los valores absolutos de linfocitos en los sujetos. Como resultado del tratamiento de reducción de linfocitos de ciclofosfamida como agente único, los linfocitos disminuyeron en aproximadamente el 40 % y aproximadamente el 72 %. La combinación de reducción de linfocitos con fludarabina y ciclofosfamida produjo una diferencia más significativa en la reducción de linfocitos, de aproximadamente el 82 % a aproximadamente el 96,5 %, en comparación con la administración de un único agente de ciclofosfamida. Específicamente, la Figura 2 demuestra el cambio de la relación del número absoluto de linfocitos con respecto la situación inicial en cada punto de tiempo controlado antes y después de la administración del tratamiento de reducción de linfocitos. Los resultados antes mencionados demuestran que la combinación de fludarabina y ciclofosfamida da como resultado una reducción de linfocitos superior en comparación con el protocolo de reducción de ciclofosfamida como único agente.

Ejemplo 5: Respuesta clínica de los sujetos después de la ablación

Aproximadamente 2 días después de la implementación de la reducción de linfocitos, a los sujetos se les administró un tratamiento con linfocitos T CAR anti-GPC3 por administración intravenosa. Las dosis de los linfocitos T CAR anti-GPC3 administrados se presentan en Tabla 7. Las respuestas clínicas de los sujetos después del tratamiento se resumen en la Tabla 10. Los resultados demuestran que hasta el momento los tres sujetos que se sometieron a la reducción de linfocitos tienen enfermedad estable (EE) o enfermedad parcial (RP) después del tratamiento con linfocitos T CAR anti-GPC3. Por el contrario, el sujeto H04, que no se sometió al tratamiento de reducción de linfocitos, muestra enfermedad progresiva mediante RMN 4 semanas después del tratamiento con los linfocitos T CAR anti-GPC3.

En cuanto a los resultados de la AFP, no se pudo evaluar el pronóstico del sujeto H02 a partir del marcador tumoral debido a la insensibilidad a la AFP. Para otros dos sujetos, sus niveles de AFP disminuyeron un poco, como se observa en la Tabla 10. Cabe señalar que el sujeto H03, después de la reducción de linfocitos utilizando fludarabina y ciclofosfamida combinadas, mostraron una reducción del 87 % de la AFP en comparación con la situación inicial antes del tratamiento. Entretanto, técnicas de imagen muestran que el sitio diana tiene una respuesta clínica parcial. La Fig.

3 muestra los resultados de la RMN del sujeto H03 antes del tratamiento frente a 10 semanas postratamiento.

Tabla 10: Sumario de la respuesta clínica de los sujetos después del tratamiento con linfocitos T CAR anti-GPC3

Nota: | indica nivel de AFP disminuido; f indica nivel de AFP aumentado; EP indica enfermedad progresiva; RC indica respuesta completa; y RP indica respuesta parcial. Los datos de seguridad y la observación clínica mostraron que después del tratamiento con linfocitos T CAR anti-GPC3, ningún sujeto desarrolla efectos secundarios o tóxicos intolerables. Todos los sujetos tenían algún grado de fiebre y aumento de GRP. Los sujetos H01 y H04 tuvieron escalofríos después de la administración. El sujeto H03 tuvo una disminución de la albúmina provocada por la fiebre. Al tomar nutrientes exógenos y albúmina, el sujeto tenía albúmina normal después de que desapareció la fiebre (Tabla 11).

Tabla 11: Sumario de efectos tóxicos o secundarios en los sujetos después de la administración de linfocitos T CAR anti-GPC3 des ués de la tera ia de reducción de linfocitos.

Además, el síndrome de liberación de citocinas, que a menudo se produce durante el tratamiento de cánceres hemáticos usando células CAR T, no se observó en este estudio clínico, lo que indica que los linfocitos T CAR anti-GPC3 son seguros.

En resumen, los resultados de los estudios clínicos utilizando linfocitos T CAR-GPC para tratar el cáncer hepatocelular positivo para GPC3 demuestran que los sujetos con una reducción eficaz de linfocitos obtuvieron determinados beneficios clínicos mediante el tratamiento con linfocitos T CAR anti-GPC3, mientras que a los sujetos sin terapia de reducción de linfocitos no obtuvieron ningún beneficio clínico. Además, ninguno de los sujetos con y sin reducción de linfocitos presentó efectos secundarios o tóxicos intolerables, y ambos casos tienen determinadas respuestas adversas, tales como fiebre y aumento de PCR, indicando que la reducción de linfocitos podría no haber empeorado la respuesta adversa de los sujetos. Además, con respecto al efecto de la terapia de reducción de linfocitos y el beneficio para los sujetos, el protocolo combinado de reducción de linfocitos con fludarabina y ciclofosfamida puede ser superior al protocolo de reducción de linfocitos con ciclofosfamida como único agente. En resumen, el tratamiento con linfocitos T CAR anti-GPC3 después de la implementación de una reducción de linfocitos eficaz puede proporcionar una solución terapéutica eficaz para el tratamiento clínico del carcinoma hepatocelular positivo para GPC3.

Ejemplo 6: Análisis fenotípico

La expresión de las moléculas de la superficie celular se determina mediante citometría de flujo usando metodología convencional. Se utilizan los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados con ficoeritrina, isotiocianato de fluoresceína y/o proteína clorofila-peridinina: CD3, CD4, CD8, CD30, ^cC^r4, CD45RA, CD45RO, CCR7, CD62L, CD56, receptor de linfocito Tap (B^dBiosciences PharMingen). La expresión del CAR por linfocitos T se detecta utilizando un anticuerpo anti-CAR. Las muestras se analizan utilizando un FACSCalibur (BD Biosciences PharMingen) y los datos se analizan con el programa informático CellQuest Pro (BD Biosciences, San Jose, CA). Se miden al menos 10.000 sucesos positivos para cada muestra.

Ejemplo 7: Ensayo de citotoxicidad: Cáncer de hígado

Para evaluar el posible efecto citotóxico de los linfocitos T transducidos con T-CAR de segunda o tercera generación, se realizó un ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega). Brevemente, se cocultivaron linfocitos T-CAR anti-GPC3, 33-28BBZ, 92-28BBZ y 4-28BBZ con células de control, SK-HEP-1 (FIG. 4A) y CHO-K1 (FIG. 4B), a la relación de efectora:diana de 3:1, 1:1 o 1:3 con células diana a 10.000/pocillo e incubadas durante 18 horas a 37 °C. Los datos de absorbancia de longitud de onda visible se recogieron utilizando un lector de placas de 96 pocillos convencional posincubación.

Para evaluar la citotoxicidad antitumoral de los linfocitos T-CAR, 33-28BBZ, 92-28BBZ y 4-28BBZ, se cocultivaron con células de cáncer de hígado positivas para GPC3, Huh-7, o células de control transducidas para expresar GPC3, CHO-K1-GPC3+, a la relación efectora:diana de 3:1, 1:1 o 1:3 con las células diana a 10.000/pocillo, e incubadas durante 18 horas a 37 °C, FIG. 5A y FIG. 5B respectivamente. Los datos de absorbancia de longitud de onda visible se recogieron utilizando un lector de placas de 96 pocillos convencional después de la incubación.

Para todas las relaciones de efectora:diana, la citotoxicidad se obtuvo como el valor promedio de 5 pocillos repetidos.

Resultados

Los datos de citotoxicidad muestran que las construcciones de T CAR 33-28BBZ, 92-28BBZ y 4-28BBZ tuvieron citotoxicidad contra líneas celulares tumorales que expresaban GPC3, mientras que no tuvieron citotoxicidad para las líneas de control que no expresaban GPC3 a 3:1, 1:1 y 1:3.

Ejemplo 8: Ensayo de citotoxicidad: Panel de cáncer de hígado

Para evaluar el posible efecto citotóxico de los linfocitos T transducidos con T-CAR de segunda o tercera generación, se realizó un ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega). Brevemente, linfocitos T-CAR anti-GPC3, 92-28Z, 92-BBZ, 92-28BBZ, o control simulado, se cocultivaron con HepG2 (CHC) (FIG. 6A), Hep3B (CHC) (FIG. 6B) o PLC/PRF/5 (hepatoma) (FIG. 6C) a la relación de efectora:diana 3:1, 1:1 o 1:3 con las células diana a 10.000/pocillo e incubadas durante 18 horas a 37 °C. Para evaluar el efecto citotóxico de T-CAR de segunda y tercera generación, se realizó un ensayo CytoTox 96® similar usando 92-28Z, 92-BBZ, 92-28BBZ, o control simulado cocultivadas con células de cáncer de hígado que expresan GPC3 alto, Huh-7, FIG. 7A. Los datos de absorbancia de longitud de onda visible se recogieron utilizando un lector de placas de 96 pocillos convencional después de la incubación.

Resultados

Los datos de citotoxicidad muestran que las construcciones de segunda y tercera generación tenían una citotoxicidad comparable en todos los paneles de cáncer de hígado, incluidas las líneas de células tumorales de CHC y hepatoma en 3:1, 1:1 y 1:3. Las construcciones de segunda y tercera generación pudieron dirigirse a células tumorales de niveles variables de expresión de GPC3, revelando una amplia gama de potencial de direccionamiento tumoral.

Ejemplo 9: Ensayo de citotoxicidad: Carcinoma gástrico

Para evaluar el posible efecto citotóxico de los linfocitos T transducidos con T-CAR de segunda o tercera generación en un contexto tumoral de carcinoma gástrico, se realizó un ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega). Brevemente, linfocitos T-CAR anti-GPC3, 92-28Z, 92-28BBZ o simulado se cocultivaron con KATO-III a relaciones de efectora a diana de 1:3, 1:1 y 3:1 a 10.000/pocillo, y se incubaron durante 18 horas a 37 °C.

Resultados

Los datos de citotoxicidad muestran que las construcciones de segunda y tercera generación tenían una citotoxicidad comparable contra la línea tumoral de carcinoma gástrico, KATO-III, FIG. 7B, en que las células transducidas simuladas no tenían actividad. Los datos sugieren que los linfocitos T-CAR son específicos para su diana tumoral y no muestran reactividad para tejidos que no expresan el antígeno GPC3.

Ejemplo 10: Comparación de scFv 33 frente a scFv 92

Para comparar T-CAR con distintos scFv para GPC3, se usaron linfocitos T transducidos con T-CAR de segunda o tercera generación en un ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega). Brevemente, linfocitos T-CAR anti-GPC3, 33-28Z, 92-28Z, 92-BBZ, 92-28BBZ o control simulado se cocultivaron con células Huh-7 o células de control, A431 (neg. para GPC3), a la relación de efectora:diana de 3:1, 1:1 o 1:3 con células diana a 10.000/pocillo e incubadas durante 18 horas a 37 °C. Los datos de absorbancia de longitud de onda visible se recogieron utilizando un lector de placas de 96 pocillos convencional posincubación.

Resultados

Los datos de citotoxicidad muestran que las construcciones con el scFv 92 tenían una citotoxicidad aumentada en comparación con las construcciones con scFv 33 en las relaciones de efectora con respecto a la diana de 3:1, 1:1 y 1:3, FIG. 10B. La citotoxicidad fue específica para el antígeno ya que no se detectó citotoxicidad en el cocultivo con la línea de células tumorales A431 neg. para ^gP^c3, FIG. 10A.

Ejemplo 11: Comparación de T-CAR de segunda y tercera generación

Para comparar T-CAR de segunda y tercera generación, se utilizaron linfocitos T transducidos con T-CAR en un ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega). Brevemente, linfocitos T-CAR anti-GPC3, 4-28Z, 4-28BBZ, 4-4-28BBZ, 4-14-28BBZ, 4-20-28BBZ, 4-35-28BBZ, 4-42-28BBZ o transducidas de forma simulada se cocultivaron con células Huh7 (CHC) a la relación de efectora:diana de 3:1 o 1:1 con las células diana a 10.000/pocillo, e incubadas durante 18 horas a 37 °C. Los datos de absorbancia de longitud de onda visible se recogieron utilizando un lector de placas de 96 pocillos convencional después de la incubación.

Resultados

Los datos de citotoxicidad muestran que las construcciones de segunda y tercera generación tuvieron citotoxicidad con 4-20-28BBZ, 4-35-28BBZ y 4-42-28BBZ, que tienen mayor citotoxicidad medida por aumento de la lisis, FIG. 9.

Ejemplo 12: Ensayo de proliferación

La proliferación de T-CAR anti-GPC3 después de la exposición a células diana (Huh-7, GPC3+) o células de control (SK-HEP-1, GPC3-) se determina mediante ensayos de dilución de carboxifluoresceína succinimidil éster.

Una semana después de la transducción, los linfocitos T de control y los linfocitos T-CAR anti-GPC3 se marcan con carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster 1,5 pmol/l (CFSE; Invitrogen) y se siembran en placas con dianas tumorales irradiadas (líneas positivas para GPC3 y negativas para GPC3) en una relación de efectora con respecto a diana (E:D) de 5:1. La dilución de CFSE se mide en linfocitos T CD4+ y CD8+ por citometría de flujo el día 4 de cocultivo.

Ejemplo 13: Modelo murino de injerto tumoral obtenido de pacientes y reducción de linfocitos

Se implantaron tumores de cáncer de pulmón de 2x2x2 mm en ratones NOD/SCID. Aproximadamente en el día 27 después de la implantación o cuando el tamaño tumoral alcanzó los 220 mm3, se les administró a los ratones ciclofosfamida por vía intravenosa y 1x107 de control simulado, células T-CAR hu92-28Z o hu92-28BBZ, por vía intraperitoneal. Una segunda administración siguió el día 34. El volumen tumoral se midió usando la medición de un compás calibrador aproximadamente cada 3-7 días hasta el día 52 posinoculación del tumor.

Resultados

En el día 51 posinoculación tumoral, los ratones tratados con 92-28Z, T-CAR de segunda generación, tenían un tamaño tumoral significativamente reducido en comparación con los ratones tratados con 92-28BBZ, T-CAR de tercera generación, o solución salina, FIG. 8A y FIG. 8B. Los ratones tratados con 92-28Z, T-CAR de segunda generación, tenían también un peso tumoral significativamente reducido en comparación con los ratones tratados con 92-28BBZ, T-CAR de tercera generación, o solución salina, FIG. 8C. Los ratones tratados con 92-28Z, T-CAR de segunda generación, tenían también una inhibición significativamente reducida en comparación con los ratones tratados con 92-28BBZ, T-CAR de tercera generación, o solución salina, FIG. 8D.

Ejemplo 14: Modelo murino de xenoinjerto CHC

Se implantaron 0,5x106 células tumorales Huh-7 en el costado izquierdo de ratones NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wj1/SzJ (NSG) de 8 a 12 semanas (Bar Harbor, ME). 7 días después de la inoculación del tumor, los ratones se trataron con 1 x107 linfocitos T transducidos de forma simulada, con hu92-28Z o con hu92-28BBZ, mediante inyección en la vena de la cola. Después del tratamiento, los ratones se controlaron mediante medición con compás calibre al menos una vez a la semana durante 35 días posinoculación de células tumorales.

Resultados

El tratamiento con hu92-28Z y hu92-28BBZ tuvo una actividad antitumoral significativa en comparación con los ratones tratados con linfocitos T transducidos de forma simulada. La FIG. 11A muestra que los ratones tratados con hu92-28Z o hu92-28BBZ habían reducido significativamente el volumen tumoral el día 35 después de la inoculación de células tumorales. FIG. 11B muestra que los ratones tratados con hu92-28Z o hu92-28BBZ tenían tumores significativamente más pequeños, como lo demuestran las mediciones de pesos reducidos en comparación con los ratones tratados con células transducidas de forma simulada. La FIG. 11C muestra imágenes de los tumores de xenoinjerto.

Ejemplo 15: Expansión clínica de linfocitos T CAR anti-GPC3

Para generar una gran cantidad de linfocitos T transducidos, las células se inducen a proliferar utilizando un protocolo de expansión rápida (PER). Antes utilizarlos en los PER, los linfocitos T se ponen en cultivo con anti-CD3, anti-CD28 e IL-2, y se transducen el segundo día después del inicio del cultivo como se detalla anteriormente. Las células se cultivan en un matraz de 75 cm2 a 37 °C y CO2 al 5 %. Las células se cuentan y suspenden a una concentración de 0,5x106 células/ml en medio de linfocitos T recién preparado con 300 Ul/ml de lL-2 cada dos días durante el resto del tiempo que se mantendrán en cultivo.

Ejemplo 16: Ensayo clínico

Se somete a aféresis a pacientes con cáncer de hígado evaluable para aislar células mononucleares de sangre periférica. Los linfocitos se aíslan, se transducen con virus con un CAR anti-GPC3, se expanden y se toman parte alícuota para pruebas inmunológicas. En los días -7 y -6 antes de la administración de T-CAR, los pacientes se someten a un régimen preparatorio de ciclofosfamida a 60 mg/kg/día x 2 días i.v. durante 1 hora. En los días -7 y -3 antes de la administración de T-CAR, los pacientes se someten a un régimen preparatorio de fludarabina 25 mg/m2/día intravenoso al día durante 30 minutos durante 5 días. Durante el régimen preparatorio, los pacientes se someten a pruebas diarias de hemograma completo (HC).

En la primera parte de un estudio de fase I, se inicia un aumento de la dosis utilizando un paciente por grupo a partir de 109 T-CAR anti-GPC3 por paciente. Los pacientes individuales se tratan con incrementos de medio logaritmo. Por tanto, se utilizarán las siguientes dosis: 109, 3x109 células, 1010 células, 3 x 1010 células, y hasta 1x1011 células. Los T-CAR anti-GPC3 autólogos se administran por vía intravenosa durante 20 a 30 minutos a través de un tubo sin filtro. Todos los pacientes regresan a la clínica para una evaluación 6 semanas después de la administración del producto de linfocitos T-CAR.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de células inmunorreactivas con receptor quimérico para el antígeno (CAR) anti-GPC3 para su uso en el tratamiento de un tumor sólido en un sujeto, en donde el tratamiento comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica después o al mismo tiempo que se somete al sujeto a un tratamiento de reducción de linfocitos, en donde el tratamiento de reducción de linfocitos comprende la administración de ciclofosfamida y fludarabina al sujeto y en donde las células inmunorreactivas con CAR anti-GPC3 son linfocitos T (linfocitos T CAR anti-GPC3).

2. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde la administración de los linfocitos T CAR anti-GPC3 al sujeto tiene lugar después de someter al sujeto al tratamiento de reducción de linfocitos.

3. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde el tratamiento es eficaz para reducir el tamaño tumoral en al menos el 30 % medido por tomografía computarizada (TC) y/o para estabilizar el tamaño tumoral medido por un cambio de menos del 10 % en una medición inicial de un diámetro de la lesión tumoral medido por tomografía computarizada (TC).

4. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde el tumor sólido es cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de tiroides, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer pancreático, liposarcoma, cáncer testicular de células germinativas no seminomatoso, melanoma, adenoma de la glándula suprarrenal, schwannoma, histiocitoma fibroso maligno o cáncer de esófago.

5. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde el CAR anti-GPC3 comprende una unidad de unión a antígeno que presenta unión específica al extremo C de GPC3.

6. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 5, en donde la unidad de unión a antígeno comprende una secuencia que presenta al menos el 90 % de homología de secuencia con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

7. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde el CAR anti-GPC3 comprende una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, S^eQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 30.

8. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde el tratamiento de reducción de linfocitos comprende reducir una cantidad de linfocitos T reguladores en el sujeto.

9. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde el tratamiento de reducción de linfocitos comprende además la administración de radiación o una terapia de anticuerpos al sujeto.

10. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde el tratamiento de reducción de linfocitos reduce una cantidad de linfocitos en al menos aproximadamente el 20 % medido por un análisis de hemograma completo (HC).

11. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde los linfocitos T CAR anti-GPC3 son autólogos o alógenos para el sujeto.

12. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, que comprende además administrar al menos un agente inmunoestimulante al sujeto al mismo tiempo o después de la administración de los linfocitos T CAR anti-GPC3.

13. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 12, en donde el agente inmunoestimulante se selecciona del grupo que consiste en aldesleucina (IL-2), IL-3, IL-6, IL-11, GM-CSF y cualquier combinación de los mismos.