ES2828982T3

ES2828982T3 - Aplicación humana de células t de receptor de antígeno quimérico (car) diseñadas

Info

Publication number: ES2828982T3
Application number: ES14798046T
Authority: ES
Inventors: Laurence Cooper; Feng Wang-Johanning; Horoki Torikai; Helen Huls; Lenka Hurton; Janani Krishnamurthy; Simon Olivares; Ling Zhang
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2013-05-14
Filing date: 2014-05-14
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2034-05-14
Also published as: KR20160007653A; US20220062396A1; EP2997134B1; CN105408473B9; KR102452767B1; JP6463577B2; JP2019047830A; US20200085929A1; AU2021200029C1; DK2997134T3; HK1222674A1; CN112795594A; CA2911961A1; CN105408473A; CN105408473B; AU2021200029B2; KR102238226B1; US20170224798A1; JP2023063429A; JP7351533B2

Abstract

Una célula diseñada que comprende un receptor de antígeno quimérico (CAR) y una proteína de fusión unida a la membrana que comprende IL-15 e IL-15Rα.

Description

DESCRIPCIÓN

Aplicación humana de células T de receptor de antígeno quimérico (CAR) diseñadas

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. Campo de la Invención

La presente invención se refiere en general a los campos de la medicina, inmunología, biología celular y biología molecular. En ciertos aspectos, el campo de la invención se refiere a la inmunoterapia. Más en particular, se refiere a la fabricación de células T de receptor de antígeno quimérico (CAR) de grado clínico y procedimientos terapéuticos que utilizan tales células.

2. Descripción de la Técnica Relacionada

La potencia de las células T de grado clínico se puede mejorar combinando la terapia génica con inmunoterapia para diseñar un producto biológico con el potencial de (i) reconocimiento superior de antígenos asociados a tumores (TAA), (ii) persistencia después de la infusión, (iii) potencial de migración a los sitios del tumor, y (iv) capacidad para reciclar funciones efectoras dentro del microambiente del tumor. Esta combinación de terapia génica con inmunoterapia puede redirigir la especificidad de las células T para los antígenos del linaje B y los pacientes con neoplasias malignas de células B avanzadas se benefician de la infusión de dichas células T específicas de tumores (Jena y col., 2010; Till y col. , 2008; Porter y col., 2011; Brentjens y col., 2011; Cooper y Bollard, 2012; Kalos y col., 2011; Kochenderfer y col., 2010; Kochenderfer y col., 2012; Brentjens y col., 2013). La mayoría de las estrategias de manipulación genética de células T diseñadas para aplicaciones humanas han utilizado retrovirus y lentivirus para la expresión estable del receptor de antígeno quimérico (CAR) (Jena y col., 2010; Ertl y col., 2011; Kohn y col., 2011) . Esta estrategia, aunque cumple con las buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP), puede ser costosa, ya que se basa en la fabricación y liberación de virus recombinantes de grado clínico desde un número limitado de instalaciones de producción. Se necesitan nuevos procedimientos para generar productos de células T de grado clínico modificados genéticamente con especificidad para neoplasias malignas hematológicas y tumores sólidos.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a:

1. Una célula diseñada que comprende un receptor de antígeno quimérico (CAR) y una proteína de fusión unida a la membrana que comprende IL-15 e IL-15Ra.

2. La célula de 1, donde la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica a SEQ ID NO:6.

3. La célula de 1, donde la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6.

4. La célula de 1, que comprende una secuencia de polinucleótidos al menos 85% idéntica a SEQ ID NO:7.

5. La célula de 1, que comprende una secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO:7.

6. La célula de una cualquiera de 1 a 5, donde la célula comprende además una transposasa tipo Tc1 de tipo salmónido (SB).

7. La célula de 6, donde la transposasa SB se proporciona en un vector de expresión de ADN o como un ARNm.

8. Una célula diseñada según uno cualquiera de 1 a 7 para su uso en proporcionar una respuesta de células T en un sujeto humano que padece una enfermedad, donde se administrará al sujeto una cantidad efectiva de dichas células diseñadas genéticamente.

9. La célula diseñada para su uso según 8, donde la enfermedad es un cáncer y donde el CAR se dirige a un antígeno de célula cancerosa.

10. La célula diseñada para su uso según 9, donde el antígeno de célula cancerosa es CD19, ROR1, CD56, EGFR, CD123, c-met, GD2, CD20, CD22, antígeno carcinoembrionario, alfafetoproteína, CA-125, 5T4, MUC-1, antígeno tumoral epitelial, antígeno prostático específico, antígeno asociado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, HER2/Neu, proteína de unión a folato, glicoproteína de envoltura de VIH-1 gp120, glicoproteína de envoltura de VIH-1 gp41, CD33, CD138, CD23, CD30, mesotelina, GD3, AKT, HER3, CD70, HERV-K, IL-11 Ralfa, cadena kappa, cadena lambda, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, VEGFR2, HER2-HER3 en combinación o HER1-HER2 en combinación.

11. Un polinucleótido que codifica un polipéptido al menos 85% idéntico a SEQ ID NO: 6.

12. El polinucleótido de 11 comprende una secuencia al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 7.

13. Una proteína de fusión IL-15/IL 15Ra que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 6.

14. La proteína de fusión de 13 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

15. Una célula huésped que comprende un polinucleótido según 11 o 12 o una proteína de fusión de 13 o 14.

16. La célula de cualquiera de 1 a 7, la célula para uso según cualquiera de 8 a 10, donde la célula es una célula T, un precursor de células T, una célula NK.

Además, en esta invención se describe un procedimiento para proporcionar una respuesta de células T en un sujeto humano que tiene una enfermedad que comprende obtener una muestra de células del sujeto (que comprende células T o progenitores de células T); transfectar las células con un ácido nucleico que codifica el receptor de células T quimérico (CAR), capaz de integrarse en el genoma de las células, y administrar una cantidad efectiva de las células transgénicas al sujeto para proporcionar una respuesta de células T.

Por tanto, en algunos aspectos, un procedimiento de la presente descripción comprende: (a) obtener una muestra de células del sujeto, comprendiendo la muestra células T o progenitores de células T; (b) transfectar las células con un ADN que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) flanqueado por transposones y una transposasa efectiva para integrar el ADN que codifica el CAR en el genoma de las células, para proporcionar una población de células que expresan CAR transgénicas; (c) opcionalmente, cultivar la población de células CAR transgénicas ex vivo en un medio que mejora selectivamente la proliferación de células T que expresan CAR, donde las células CAR transgénicas se cultivan, si es que se cultivan, no más de 21 días; y (d) administrar una cantidad efectiva de células CAR transgénicas al sujeto para proporcionar una respuesta de células T. Por lo tanto, en algunos aspectos, las células CAR transgénicas se cultivan ex vivo durante menos de 21 días, por ejemplo, durante menos de 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 días o menos. En ciertos aspectos, las células CAR se cultivan ex vivo no más de 3 a 5 días. En aspectos adicionales, las etapas (a)-(d) del procedimiento inmediato (es decir, obtener muestras de células para administrar células T CAR) se completan en no más de 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 días.

En aspectos adicionales, un procedimiento para proporcionar una respuesta de células T en un sujeto humano que tiene una enfermedad según las realizaciones comprende: (a) obtener una muestra de células del sujeto, la muestra que comprende células T o progenitores de células T y tener un volumen inicial de entre aproximadamente 20 y 200 mls cuando se obtiene del sujeto; (b) transfectar las células con un ADN que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) flanqueado por transposón y una transposasa efectiva para integrar el ADN que codifica el CAR en el genoma de las células, para proporcionar una población de células T que expresan CAR transgénicas; (c) opcionalmente, cultivar la población de células CAR transgénicas ex vivo en un medio que mejora selectivamente la proliferación de células T que expresan CAR; y (d) administrar una cantidad efectiva de células T CAR transgénicas al sujeto para proporcionar una respuesta de células T. Por ejemplo, la muestra de células del sujeto puede ser una muestra de menos de aproximadamente 200 mls de sangre periférica o del cordón umbilical. En algunos aspectos, la muestra puede recolectarse por aféresis. Sin embargo, en ciertos aspectos preferidos, la muestra se recolecta mediante un procedimiento que no implica aféresis (porejemplo, por punción venosa). En otros aspectos más, la muestra de células tiene un volumen inicial de menos de aproximadamente 175, 150, 125, 100, 75, 50 o 25 mls (p.ej., la muestra de células tiene un volumen inicial de entre aproximadamente 50 a 200 mls, 50 a 100 mls, o 100 y 200 mls cuando se obtienen del sujeto).

Además, en esta invención se describe una célula transgénica aislada que comprende un CAR expresado dirigido a la proteína de la envoltura de HERV-K. En ciertos aspectos, las células comprenden ADN que codifica el CAR integrado en el genoma de la célula (por ejemplo, ADN de CAR flanqueado por secuencias repetidas de transposones). Por ejemplo, la secuencia de CAR puede comprender las secuencias de CDR (por ejemplo, CDR 1-6) del anticuerpo monoclonal 6H5 o la secuencia scFv del anticuerpo monoclonal 6H5. En algunos aspectos, CAR dirigido a HERV-K es al menos 85% idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (p. ej., una secuencia de al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 4). En ciertos aspectos, una célula de las realizaciones (por ejemplo, una célula de CAR dirigida a HERV-K humano) puede usarse para tratar a un sujeto (o proporcionar una respuesta inmune en un sujeto) que tiene un cáncer que expresa HERV-K.

Además, se describe en esta invención una célula transgénica aislada que comprende un CAR expresado y una IL-15 unida a membrana expresada. Por ejemplo, en algunos aspectos, la IL-15 unida a la membrana comprende una proteína de fusión entre IL-15 e IL-15Ra. En aspectos adicionales, la IL-15 unida a membrana comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 6 (denominada en esta invención mIL15). Como se detalla más en esta invención, en algunos casos, la IL-15 unida a membrana está codificada por un ARN o un ADN (por ejemplo, un vector extra cromosómico o episómico). En ciertos aspectos, la célula comprende ADN que codifica la IL-15 unida a membrana integrada en el genoma de la célula (por ejemplo, ADN codificante flanqueado por secuencias repetidas de transposones). En ciertos aspectos, una célula de la presente descripción (p. ej., célula CAR humana, que expresa una citocina unida a membrana) puede usarse para tratar a un sujeto (o proporcionar una respuesta inmune en un sujeto) que tiene niveles bajos de antígeno diana, como un sujeto con enfermedad residual mínima (como se detalla con más detalle en esta invención).

En algunos aspectos, los procedimientos de la presente descripción se refieren a la transfección de las células con un ADN que codifica un receptor de células T quimérico (CAR) y, en algunos casos, una transposasa. Los procedimientos de transfección de células son bien conocidos en la técnica, pero en ciertos aspectos, se emplean procedimientos de transfección altamente eficientes tales como electroporación. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se pueden introducir en las células usando un aparato de nucleofección. Preferiblemente, la etapa de transfección no implica infectar o transducir las células con virus, lo que puede causar genotoxicidad. y/o conducir a una respuesta inmune a las células que contienen secuencias virales en un sujeto tratado.

Otros aspectos de la presente descripción se refieren a la transfección de células con un vector de expresión que codifica un CAR. Se conoce en la técnica una amplia gama de construcciones de CAR y vectores de expresión para las mismas y se detallan más en esta invención. Por ejemplo, en algunos aspectos, el vector de expresión de CAR es un vector de expresión de ADN como un plásmido, un vector de expresión lineal o un episoma. En algunos aspectos, el vector comprende secuencias adicionales, como la secuencia que facilita la expresión del CAR, como un promotor, potenciador, señal poli-A, y/o uno o más intrones. En aspectos preferidos, la secuencia de codificación de CAR está flanqueada por secuencias de transposones, de manera que la presencia de una transposasa permite que la secuencia de codificación se integre en el genoma de la célula transfectada.

Como se detalló anteriormente, en ciertos aspectos, las células se transfectan adicionalmente con una transposasa que facilita la integración de una secuencia codificante de CAR en el genoma de las células transfectadas. En algunos aspectos, la transposasa se proporciona como vector de expresión de ADN. Sin embargo, en aspectos preferidos, la transposasa se proporciona como un ARN expresable o una proteína de manera que la expresión a largo plazo de la transposasa no se produce en las células transgénicas. Por ejemplo, en algunos aspectos, la transposasa se proporciona como un ARNm (por ejemplo, un ARNm que comprende una cubierta y una cola poli-A). Puede usarse cualquier sistema de transposasa según la presente descripción. Sin embargo, en algunos aspectos, la transposasa es una transposasa tipo Tc1 de tipo salmónido (SB). Por ejemplo, la transposasa puede ser la así llamada transposasa "Bella Durmiente", ver p.ej., Patente U.S. 6.489.458. En ciertos aspectos, la transposasa es una enzima diseñada con mayor actividad enzimática. Algunos ejemplos específicos de transposasas incluyen, sin limitación, la transposasa SB10, SB11 o SB100x (ver, por ejemplo, Mates y col., 2009). Por ejemplo, un procedimiento puede implicar la electroporación de células con un ARNm que codifica una transposasa SB10, SB11 o SB100x.

En otros aspectos más, una célula CAR transgénica de la presente descripción comprende además un vector de expresión para la expresión de una citocina unida a la membrana que estimula la proliferación. y/o supervivencia de las células T. En particular, las células CAR que comprenden dichas citocinas pueden proliferar y/o persisten con poco o ningún cultivo ex vivo con células de activación y propagación (AaPC) o células presentadoras de antígenos artificiales (aAPC) debido a la simulación proporcionada por la expresión de citocinas. Asimismo, tales células CAR pueden proliferar in vivo incluso cuando no están presentes grandes cantidades de antígeno reconocido por el CAR (por ejemplo, como en el caso de un paciente con cáncer en remisión o un paciente con enfermedad residual mínima). En algunos aspectos, las células CAR comprenden un vector de expresión de ADN o ARN para la expresión de una citocina y elementos (por ejemplo, un dominio transmembrana) para proporcionar la expresión en la superficie de la citocina. Por ejemplo, las células CAR pueden comprender versiones unidas a membrana de IL-7, IL-15 o IL-21. En algunos aspectos, la citocina se une a la membrana mediante la fusión de la secuencia codificante de la citocina con el receptor para la citocina. Por ejemplo, una célula puede comprender un vector para la expresión de una proteína de fusión IL-15-IL-15Ra (por ejemplo, una proteína que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6). En otros aspectos más, un vector que codifica una citocina Cy unida a la membrana es un vector de expresión de ADN, tal como un vector integrado en el genoma de las células CAR o un vector extracromosómico (p.ej., y vector episómico). En aspectos adicionales, la expresión de la citocina Cy unida a la membrana está bajo el control de un promotor inducible (p.ej., un promotor inducible por fármacos) de modo que la expresión de la citocina en las células CAR (y por tanto la proliferación de las células CAR ) se puede controlar induciendo o suprimiendo la actividad promotora.

Los aspectos de la presente descripción se refieren a la obtención de una muestra de un paciente que comprende células NK, células NKT, células T o células progenitoras de células T. Por ejemplo, en algunos casos, la muestra es una muestra de sangre de cordón umbilical, una muestra de sangre periférica (por ejemplo, una fracción de células mononucleares) o una muestra del sujeto que comprende células pluripotentes. En algunos aspectos, se puede cultivar una muestra del sujeto para generar células madre pluripotentes inducidas (iPS) y estas células se pueden usar para producir células NK, células NKT o células T. Las muestras de células se pueden cultivar directamente del sujeto o se pueden crioconservar antes de su uso. En algunos aspectos, obtener una muestra celular comprende recolectar una muestra celular. En otros aspectos, la muestra es obtenida por un tercero. En otros aspectos más, se puede tratar una muestra de un sujeto para purificar o enriquecer las células T o los progenitores de células T en la muestra. Por ejemplo, la muestra se puede someter a purificación en gradiente, selección de cultivo celular y/o clasificación de células (por ejemplo, mediante clasificación de células activada por fluorescencia (FACS)).

En algunos aspectos, un procedimiento de la presente descripción comprende además obtener, producir o usar células presentadoras de antígeno. Por ejemplo, las células presentadoras de antígenos pueden ser células dendríticas, células de activación y propagación (AaPC), o células presentadoras de antígenos artificiales inactivadas (por ejemplo, irradiadas) (aAPC). Los procedimientos para producir tales aAPC son conocidos en la técnica y se detallan adicionalmente en esta invención. Por tanto, en algunos aspectos, las células CAR transgénicas se cultivan conjuntamente con aAPC inactivadas ex vivo durante un período de tiempo limitado para expandir la población de células CAR. La etapa de cocultivar células CAR con aAPC se puede realizar en un medio que comprende, por ejemplo, interleucina-21 (IL-21) y/o interleucina-2 (IL-2). En algunos aspectos, el co-cultivo se realiza en una proporción de células CAR a aAPC inactivadas de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:10; de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:5; o de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:3. Por ejemplo, el co-cultivo de células CAR y aAPC puede tener una proporción de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:2 o aproximadamente 1:3.

En algunos aspectos, las células para el cultivo de células CAR, como AaPC o aAPC, están diseñadas para expresar polipéptidos específicos para mejorar el crecimiento de las células CAR. Por ejemplo, las células pueden comprender (i) un antígeno dirigido por el CAR expresado en las células CAR transgénicas; (ii) CD64; (ii) CD86; (iii) CD137L; y/o (v) IL-15 unida a la membrana, expresada en la superficie de las aAPC. En algunos aspectos, las AaPC o las aAPCS comprenden un anticuerpo de unión a CAR o un fragmento del mismo expresado en la superficie de las AaPC o las aAPC. Preferiblemente, las AaPC o las aAPC para su uso en los procedimientos actuales se prueban y se confirma que están libres de material infeccioso. y/o se prueban y se confirma que están inactivadas y no proliferan.

Si bien la expansión en AaPC o aAPC puede aumentar el número o la concentración de células CAR en un cultivo, este procedimiento es laborioso y costoso. Además, en algunos aspectos, un sujeto que necesite terapia debe reinfundirse con células CAR transgénicas en el menor tiempo posible. Por tanto, en algunos aspectos, el cultivo ex vivo de las células CAR transgénicas (c) es para no más de 14 días, no más de 7 días o no más de 3 días. Por ejemplo, el cultivo ex vivo (p.ej., cultivo en presencia de AaPC o aAPC) puede realizarse durante menos de un duplicación de la población de las células CAR transgénicas. En otros aspectos más, las células transgénicas no se cultivan ex vivo en presencia de AaPC o aAPC.

En otros aspectos más, un procedimiento de la presente descripción comprende una etapa para enriquecer la población celular para células T que expresan CAR después de la transfección de las células (etapa (b)) o después de la expansión ex vivo de las células (etapa (c)). Por ejemplo, la etapa de enriquecimiento puede comprender la clasificación de la célula (p.ej., mediante FACS), por ejemplo, usando un antígeno unido por el CAR o un anticuerpo de unión a CAR. En otros aspectos más, la etapa de enriquecimiento comprende el agotamiento de las células que no son T o el agotamiento de las células que carecen de expresión de CAR. Por ejemplo, las células CD56+ pueden agotarse de una población de cultivo. En aspectos adicionales, una muestra de células CAR se conserva (o se mantiene en cultivo) cuando las células se administran al sujeto. Por ejemplo, una muestra puede crioconservarse para su posterior expansión o análisis.

En ciertos aspectos, las células CAR transgénicas de las realizaciones se inactivan para la expresión de un receptor de células T endógeno. y/o HLA endógeno. Por ejemplo, las células T se pueden diseñar para eliminar la expresión de receptor de células T alfa/beta endógeno (TCR). En aspectos específicos de la presente descripción, las células T CAR+ se modifican genéticamente para eliminar la expresión de t Cr . En algunos aspectos, hay una alteración del receptor de células T a/p en células T que expresan CAR usando nucleasas con dedos de zinc (ZFN). En ciertos aspectos, la cadena ap del receptor de células T en células T que expresan CAR se elimina, por ejemplo, mediante el uso de nucleasas con dedos de zinc.

Como se detalla adicionalmente en esta invención, las células CAR de la presente descripción pueden usarse en el tratamiento de una amplia gama de enfermedades y afecciones. Esencialmente, cualquier enfermedad que implique la expresión específica o potenciada de un antígeno particular puede tratarse dirigiendo las células CAR al antígeno.

Por ejemplo, las enfermedades autoinmunes, las infecciones y los cánceres se pueden tratar con procedimientos y/o composiciones de la presente descripción. Estos incluyen cánceres, tales como cánceres primarios, metastásicos, recurrentes, sensibles a la terapia, refractarios a la terapia (porejemplo, cáncer quimiorrefractario). El cáncer puede ser de sangre, pulmón, cerebro, colon, próstata, mama, hígado, riñón, estómago, cuello uterino, ovario, testículos, glándula pituitaria, esófago, bazo, piel, hueso, etc. (p.ej., linfomas de células B o melanomas). En el caso del tratamiento del cáncer, las células CAR normalmente se dirigen a un antígeno de células cancerosas (también conocido como antígeno asociado a tumor (TAA)).

En otros aspectos más, las células CAR transgénicas de la presente descripción pueden usarse en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad residual mínima (p.ej., un sujeto que tiene cantidades muy bajas de antígeno dirigido a CAR presente), tales como pacientes con cáncer que están en remisión aparente. Usando nuevas técnicas de diagnóstico altamente sensibles, los antígenos asociados al cáncer (o células cancerosas) pueden detectarse en pacientes que no presentan síntomas de cáncer evidentes. Dichos pacientes pueden ser tratados mediante los procedimientos descritos en esta invención para eliminar la enfermedad residual mediante el uso de células CAR dirigidas a antígenos. En realizaciones preferidas de la invención, las células CAR transgénicas para el direccionamiento de la enfermedad residual comprenden además la expresión de una citocina proliferativa unida a la membrana, ya que estas células conservarán la capacidad de expandirse in vivo a pesar de la baja cantidad de antígeno diana.

Los procedimientos descritos en esta invención se pueden utilizar para fabricar (p.ej., para ensayos clínicos) de células T CAR+para varios antígenos tumorales (p.ej., c D19, ROR1, c D56, EGFR, Cd 123, c-met, Gd 2). Células T CAR+ generadas con esta tecnología se pueden usar para tratar a pacientes con leucemias (AML, LLA, CML), infecciones y/o tumores sólidos. Por ejemplo, los procedimientos de la presente descripción pueden usarse para tratar enfermedades proliferativas celulares, infecciones fúngicas, virales, bacterianas o parasitarias. Los patógenos que pueden ser alcanzados incluyen, con limitación, Plasmodium, tripanosoma, Aspergillus, Candida, h Sv , RSV, e Bv , CMV, virus JC, virus BK o patógenos de Ébola. Ejemplos adicionales de antígenos que pueden ser dirigidas por células CAR de las realizaciones incluyen, sin limitación, CD19, CD20, antígeno carcinoembrionario, alfafetoproteína, CA-125, 5T4, MUC-1, antígeno tumoral epitelial, antígeno asociado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, HER2/Neu, ERBB2, proteína de unión a folato, gp120 de glucoproteína de envoltura de VIH-1, gp41 de glucoproteína de envoltura de VIH-1, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, meotelina, GD3, HERV-K, IL-11 Ralfa, cadena kappa, cadena lambda, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII o VEGFR2. En ciertos aspectos, el procedimiento de la presente descripción se refiere a la orientación de células que expresan CD19 o HERV-K. Por ejemplo, una célula CAR dirigida a HERV-K puede comprender un CAR que incluye la secuencia scFv de anticuerpo monoclonal 6H5. En otros aspectos más, un CAR de la presente descripción puede conjugarse o fusionarse con una citocina, tal como IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 o una combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, se proporcionan procedimientos para tratar un individuo con una afección médica que comprenden la etapa de proporcionar una cantidad efectiva de células de una población de células descrita en esta invención, incluyendo más de una vez en algunos aspectos, tal como al menos con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más días de diferencia. En aspectos específicos de la descripción, el cáncer es linfoma, leucemia, linfoma no Hodgkin, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crónica, leucemia linfocítica crónica o enfermedades autoinmunes asociadas a células B.

En otro aspecto más de la presente descripción se describe un polipéptido aislado o recombinante que comprende un CAR dirigido a CD19 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 1. En un aspecto relacionado de la presente descripción, se describe una secuencia de polinucleótidos recombinante o aislada que codifica un CAR dirigido a CD19 (p.ej., que codifica una secuencia de aminoácidos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, en algunos aspectos, la secuencia de polinucleótidos es 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 3 (que codifica el CAR dirigido a CD-19) o SEQ ID NO: 4 (que codifica el CAR dirigido a CD-19, secuencias de control de expresión y repeticiones de transposones flanqueantes). En otro aspecto más de la presente descripción se describe una célula huésped que comprende un polipéptido que codifica un CAR dirigido a CD19 y/o un polinucleótido que codifica un CAR dirigido a CD19 de los aspectos de la presente descripción. Por ejemplo, la célula huésped puede ser una célula T o un precursor de células T. Preferiblemente, la célula huésped puede ser una célula humana. Un experto en la materia reconocerá que cualquiera de los polipéptidos, polinucleótidos o células huésped anteriores puede usarse según los procedimientos detallados en esta invención.

En todavía un aspecto adicional de la presente descripción se describe un polipéptido aislado o recombinante que comprende un CAR dirigido a HERV-K que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 4. En un aspecto relacionado de la presente descripción, se describe una secuencia de polinucleótidos recombinante o aislada que codifica un CAR dirigido a HERV-K (p.ej., que codifica una secuencia de aminoácidos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 4). Por ejemplo, en algunos aspectos, la secuencia de polinucleótidos es 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 5 (que codifica el CAR dirigido a HERV-K, secuencias de control de expresión y repeticiones de transposones flanqueantes). En otro aspecto más de la presente, se describe una célula huésped que comprende un polipéptido que codifica un CAR dirigido a HERV-K y/o un polinucleótido que codifica un CAR dirigido a HERV-K de los aspectos de la presente descripción. Por ejemplo, la célula huésped puede ser una célula T o un precursor de células T. Preferiblemente, la célula huésped puede ser una célula humana. Un experto en la materia reconocerá que cualquiera de los polipéptidos, polinucleótidos o células huésped anteriores puede usarse según los procedimientos detallados en esta invención.

En todavía una realización adicional, se proporciona un polipéptido aislado o recombinante que comprende una IL-15 unida a la membrana que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 6. En una realización relacionada, se proporciona una secuencia de polinucleótidos recombinante o aislada que codifica una IL-15 unida a la membrana (p.ej., que codifica una secuencia de aminoácidos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 6). Por ejemplo, en algunos aspectos, la secuencia de polinucleótidos es 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 7 (una IL-15 unida a la membrana, secuencias de control de expresión y repeticiones de transposones flanqueantes). En otra realización más, se proporciona una célula huésped que comprende un polipéptido que codifica una IL-15 unida a la membrana y/o un polinucleótido que codifica una IL-15 unida a la membrana de las realizaciones. Por ejemplo, la célula huésped puede ser una célula T, un precursor de células T o una aAPC. Preferiblemente, la célula huésped puede ser una célula humana. Un experto en la materia reconocerá que cualquiera de los polipéptidos, polinucleótidos o células huésped anteriores puede usarse según los procedimientos detallados en esta invención.

Tal como se usa en esta invención, la especificación "un(una)" o “uno(una)” puede significar uno(a) o más. Tal como se usa en esta invención, en la(s) reivindicación(es), cuando se usa junto con el término "que comprende", la palabra "un(a)" pueden significar uno(a) o más de uno(a).

El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para designar "y/o", a menos que se indique expresamente para referirse solo a alternativas o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la descripción admita una definición que se refiera solo a alternativas y a "y/o". Como se usa en esta invención, "otro" puede significar al menos un segundo o más.

A lo largo de esta solicitud, el término “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo, el procedimiento que se emplea para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos del estudio.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se dan a modo de ilustración solamente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede comprender mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en esta invención.

FIG. 1: Etapas que describen el procedimiento para electroporar y propagar células T CAR+ de PB y UCB.

FIG. 2: Caracterización de células T modificadas genéticamente a partir de PB.(A) Expresión de EGFP en el Día 0 del primer ciclo de estimulación para evaluar la eficiencia de la transferencia de genes. Expresión de CAR específico de CD19 (CD19RCD28) según evaluado por citometría de flujo en células T CD3+, Cd 8+ y CD4+ en (B) aproximadamente 24 horas después de la electroporación y (C) 28 días después del co-cultivo en aAPC. Se observó una expresión similar de CAR con células T derivadas de UCB. (D) Cinética de la expresión de CAR.

FIG. 3: Propagación de células T CAR+ derivadas de PB. Tasa de expansión numérica de células T CD3+ y CAR+ derivadas de PB mediante co-cultivo repetido en aAPC irradiado con y en presencia de IL-2 e IL-21 solubles humanas recombinantes. Las flechas hacia arriba indican las adiciones de aAPC irradiadas con y que marcan el comienzo de cada ciclo de estimulación. Células T CAR+ derivadas de UCB exhiben tasas similares de expansión numérica.

FIG. 4: Esquema del procedimiento de fabricación utilizando sistemas SB y aAPC para modificar genéticamente y propagar células T CAR+ derivadas de PB y UCB. Células T CAR+ específicas de CD19 se generaron mediante electrotransferencia de plásmidos de ADN superenrollados derivados de SB y posterior co cultivo en aAPC derivadas de K562 (clon #4) en presencia de IL-2 e IL-21 solubles humanas recombinantes.

FIG.5: Recogida y caracterización de aAPC.(A, B) Reducción del volumen por Sepax. Clon de aAPC #4 cultivado en bolsas VueLife se recogió usando el kit CS-490.1 en Sepax II. La recogida por Sepax (S, n=4) se comparó con procedimiento manual (M, n=1). Los conteos de células medios pre/post-procesamiento (4,9x108 vs. 5X108) fueron similares utilizando el sistema Sepax. (C) Fenotipo de aAPC (clon #4). Análisis de citometría de flujo que muestra la expresión de CD19, CD64, CD86, CD137L y una versión unida a la membrana de IL-15 (péptido fusionado a la región IgG4 Fc modificada) coexpresada con EGFP (mIL-15-EGFP) en controles parentales K562 aAPC y K562.

FIG. 6: Esquema del procedimiento de generación de células T específicas de CD19 de grado clínico.Se generaron Mc B (PACT) y WCB (MDACC) para aAPC derivada de K562 (clon #4). Para la generación de células T CAR+ , aAPC se expandieron numéricamente en bolsas, se recogieron usando el sistema Sepax II, se irradiaron (100 Gy) y se criopreservaron para su uso posterior. Células T específicas de CD19 se fabricaron como sigue; se aislaron PBMC de productos de aféresis de donantes normales utilizando el sistema Sepax II y se criopreservaron. Posteriormente, las PBMC se descongelaron, se electroporaron con los plásmidos de ADN Sb (transposón CAR CD19RCD28, transposasa SB11) utilizando el sistema Nucleofector, se cocultivaron con aAPC irradiadas descongeladas junto con citocinas (IL-2 e IL-21) durante un período de cultivo de 28 días y se criopreservaron.

FIG. 7: Fenotipo de célula T CAR+ . (A) Expresión de CAR CD19RCD28 en células T el día después de la electroporación (día de cultivo 1) y después de 28 días de co-cultivo en clon#4 de aAPC junto con falta de aAPC CD19+ . (B) Expresión de CAR mediante análisis de Western blot utilizando anticuerpo específico CD3-Z. Los lisados de células completas se procesaron en SDS-PAGE en condiciones reductoras. Marcador de peso molecular (M), células Jurkat Parentales (Carril 1), Células Jurkat CD19RCD28+ (Carril 2), células T primarias de control CARneg (Carril 3) y células T CD19RCD28+ (Carril 4). (C) Porcentaje de expresión de células T CD3+, CD4+CAR+ y CD8+CAR+ con una puerta de linfocitos en cultivos a lo largo del tiempo. Cada símbolo representa un experimento separado; las líneas continuas son la media de los tres experimentos de validación. (D) Inmunofenotipo de marcadores de memoria/sin tratamiento, adhesión, activación, citolíticos y de agotamiento en células T CAR+ al final del co-cultivo (d28).

FIG. 8: Cinética de expansión y especificidad redirigida de células T CAR+ .Se cocultivaron células T genéticamente modificadas con clon #4 de aAPC durante 28 días. Al final de cada ciclo de estimulación (7 días), las células se contaron y se tiñeron para determinar la expresión de CAR y CD3. Se realizaron tres corridas de validación (VI, V2 y V3) y los gráficos representan (A) células T CAR+ inferidas, (B) células T CD3+ inferidas, (C) Células viables totales a lo largo del tiempo. Las flechas indican la adición de aAPC al cultivo. (D) Lisis de dianas CD19+ (Daudip2m, NALM-6, CD19+ EL-4) en comparación con lisis de fondo de CD19neg EL-4 usando un ensayo de liberación de cromo de 4 horas por células T c Ar . Se representa la media ± DE de tres corridas de validación.

FIG. 9: Perfil de seguridad asociado al sistema SB.(A) Se midió la longitud de telómeros de células usando un ensayo de citometría de flujo y hibridación in situ de fluorescencia (Flow-FISH). La población predominante de células T en el día 28 (VI y V2, células T CD8+ ; V3, células T CD4+ ) se comparó con el subconjunto de células T purificado en columna miltenyi respectivo desde el día 0. (B) ADN genómico de células T CAR+ en el día 28 se amplificaron usando cebadores y sondas específicas para CAR CD19RCD28. Los análisis de Cantidad Relativa (RQ) del número de copias diana de CD19RCD28 se determinaron usando células Jurkat transducidas con CAR CD19RCD28, que se sabe que tienen una integración de CAR CD19RCD28 por genoma a partir de análisis FISH, como referencia y RNasaP endógeno como normalizador. (C) Análisis de t Cr Vp del día 28 y del día 35 células T CAR+ . Los datos muestran la media ± DE de tres corridas de validación de células T CAR+ en comparación con los controles no manipulados del día 0. (D) PCR genómico que muestra la falta de integración de transposasa SB11. El ADN genómico (20 ng) se amplificó usando cebadores SB 11 o GAPDH. Células T de control CARneg (carril 5) y células T CAR+ (carril 7) se amplificaron usando cebadores SB11; células T de control CARneg (carril 6), células T CAR+ (carril 8) y Jurkat expresando de manera estable SB11 (carril 4) se amplificaron usando cebadores GAPDH. Jurkat expresando de manera estable SB11 (Jurkat/SB11-IRES2-EGFP) (carril 3) y el plásmido linealizado, pKan-CMV-SB11 (carril 2) amplificado usando cebadores SB 11 se utilizaron como control positivo. (E) Cariotipos con bandas G de células T CAR+ de las tres corridas de validación no revelan ninguna alteración estructural o numérica. Se muestra una extensión representativa de la validación 2.

FIG. 10: Generación del transposón CAR CD19RCD28.El vector CD19RCD28mz (CoOp)/pEK que contiene un receptor de antígeno quimérico de codón optimizado (CAR) y el plásmido de ADN SB pT-MNDU3-EGFP (Singhy y col., 2008; Hollis y col., 2006) fueron digeridos con Spel & Nhel y SpeI & Nrul para liberar fragmentos CAR y EGFP respectivamente. El vector pT-MNDU3 con EGFP deletado se ligó a continuación con el fragmento CAR para generar el vector CD19RCD28mz (CoOp)/pT-MNDU3. Además, el gen de resistencia a la kanamicina y el origen de replicación Co1E1 obtenido por digestión AseI & PacI del vector pEK se ligó en el vector CD19RCD28mz (CoOp)pT-MNDU3 digerido por SalI & ZraI para crear Pre-CD19RCD28mz (CoOp)/pSBSO. En la última etapa, el promotor MNDU3 de Pre-CD19RCD28mz(CoOp)/pSBSO fue liberado usando digestión con NheI & NsiI y reemplazado con el fragmento del promotor hEF-1a obtenido del vector pVitro4 usando XhoI & NheI, para generar el vector final CD19RCD29mz(CoOp)/pSBSO.

FIG. 11: Generación de transposasa SB11.El vector de transposasa SB pCMV-SB11 se digirió con PvuII para liberar el fragmento que contenía promotor/potenciador CMV y el gen que codifica la transposasa SB, que se ligó al fragmento que contenía el gen de resistencia a la kanamicina y el origen de replicación de ColE1 del vector pEK para generar el vector pKan-CMV-SB11.

FIG. 12: Esquema del plásmido de expresión CD19, ACD19CoOp-F2A-Neo/pSBSO.El fragmento de ADN que codifica CD19RCD28 CAR del plásmido CoOpCD19RCD28/pSBSO se intercambió con un fragmento de ADN que codifica el gen de resistencia a la neomicina (NeoR) [PCR clonado de pSelect-Neo (InvivoGen)] fusionado a CD19 truncado con codón optimizado (GENEART) (ACD19, [Serrano y col., 2006; Mahmoud y col., 1999]) mediante un enlazador F2A (aminoácido, VKQTLNFDLLKLAGDVe Sn PGP; [Szymczak y col., 2004; Yang y col., 2008; Kim y col., 2011]) para generar ACD19CoOp-F2A-Neo/pSBSO. Promotor EF1a, promotor del factor de alargamiento 1a; NeoR, gen de resistencia a neomicina; bGHpAn, señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino; ColE1, ori; KanR, gen de resistencia a la kanamicina; IR, repeticiones SB-invertida/directa.

FIG. 13: Tasa de expansión numérica de células T CAR+ específicas de CD19.Células T genéticamente modificadas se cultivaron conjuntamente con aAPC en un ciclo de estimulación de 7 días, y se calculó la tasa de expansión semanal de cada corrida de validación al final de cada ciclo de estimulación para las células T totales, c D3+ y CAR+ . Se muestra la tasa de expansión media (n=3).

FIG. 14: Especificidad redirigida de células T CAR+ específicas de CD19.Lisis específica de CD19 de dianas tumorales CD19+ (Daudip2m, NALM-6, CD19+ EL-4) por células T CAR+ generadas en tres corridas de validación (V1, V2, V3) en un ensayo de cromo estándar de 4 horas. La lisis autóloga de fondo contra el control CARneg control fue de 1,5%.

FIG. 15: Seguridad con respecto a la aberración cromosómica.Cariotipos con bandas G de células T CAR+ generados a partir de corridas de validación (V1 y V3) no revelan ninguna alteración estructural o numérica.

FIG. 16: (A) Una imagen representativa de las células tumorales (200X) con intensidad variable (Puntuación 0-3) de expresión de HERV-K (panel superior) en comparación con la tinción de control de isotipo IgG2a (panel inferior). (B) Una imagen de células tumorales (400X) que muestra una tinción de HERV-K punteada y que bordea la membrana celular (flecha sólida) o tinción citoplásmica más difusa (flecha de puntos). (C) Un gráfico de puntos que representa el índice H de cada paciente mostró una diferencia significativa (p < 0,0267) entre los tejidos benignos y tumorales. (D) No se observaron diferencias significativas entre el tumor maligno y el metastásico. Y se observó una diferencia significativa entre el tumor benigno y el tumor maligno o metastásico.

FIG. 17: (A) Plásmido SB que codifica CAR específico de HERV-K. (B) Diagrama de flujo que representa la expresión CAR (Fc) el día 1 y el día 35 de células T CAR+ específicas de HERV-K CD3+ . Los porcentajes de cuadrante de los diagramas de flujo están en la esquina superior derecha. CAR, receptor de antígeno quimérico. (C) No hay diferencia significativa en el crecimiento celular total entre las células T c A r específicas de HERV-K y células T CAR+ CD-19 no específicas. (D) Para el Día 21, todas las células CAR específicas de HERV-K son células T CD3+ . (E) El análisis de integración CAR muestra que las células T CAR+ específicas de HERV-K tienen menos de 2 integraciones por célula. Los datos representan la media de dos experimentos independientes con 3 donantes diferentes realizados por triplicado. (F) El fenotipo de células T CAR+ específicas de HERV-K son células T CD3+CD56+CD45ROhi CD45RAl°CD27+CD62L+ T que producen altos niveles de granzima B. Todos los datos representan el promedio de cuatro donantes.

FIG. 18: (A) Una representación de histograma sobre la expresión del antígeno HERV-K (en rojo) en la superficie de la célula tumoral en comparación con el control de isotipo (en azul). (B) Un CRA estándar de 4 h de dianas de tumores de melanoma con dilución variable de células T CAR+ específicas de HERV-K (en línea continua) en comparación con células T de control sin ADN (en líneas de puntos). Los datos son la media ± DE de cuatro donantes sanos (promedio de mediciones por triplicado para cada donante) que se combinaron a partir de dos experimentos independientes. Se realizó ANOVA bidireccional con post-test de Bonferroni en (B) y (C) entre células T CAR+ específicas de HERV-K y células de control sin ADN. CAR, receptor de antígeno quimérico; CRA, ensayo de liberación de cromo; E:T, relación de efector a diana. (D) Producción de IFN-y por células T CAR+ tras la incubación con dianas. Se utiliza PMA-ionomicina como control positivo.

FIG. 19: Especificidad de células T CAR+ específicas de HERV-K.(A) El histograma de células EL4 que expresan artificialmente el antígeno HERV-K (en negro) se representó junto con la tinción parental (azul) de EL4 de HERV-Kneg y la tinción de control de isotipo (naranja). (B) Un CRA de cuatro horas mostró un aumento significativo (p < 0,001) en la destrucción de células EL4 que expresan el antígeno en comparación con las parentales por las células T CAR+ específicas de HERV-K en proporciones variables E:T. (C) Se realizó un ensayo de inmunotransferencia para mostrar la eliminación mediada por ARNhc específica de env de HERV-K en células A888 en comparación con A888 parental o A888 tratada con ARNhc codificado. El panel inferior muestra la expresión de la proteína actina como control. (D) CRA de células T CAR+ específicas de HERV-K con las células A888 HERV-K Kd , el control A888 parental (A888P) y el control codificado A888 (sueros A888) mostraron una destrucción significativa específica del antígeno por las células T Todos los datos representan la media de dos experimentos independientes de tres donantes realizados por triplicado. Se utilizó ANOVA bidireccional con post test de Bonferroni para (B) para comparar EL4 parental con HERV-K+ EL4 y ANOVA unidireccional con prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls para (C) para comparar A888KD con A888 P y A888 codif.

FIG. 20: Para determinar la actividad de células T CAR+ específicas de HERV-K durante un período de 15 horas se sembraron en placas de células diana y efectoras en proporción 1:5 con Sytox® (Invitrogen, tinción de células muertas) en el medio. Se registraron cincuenta imágenes de cada diana con células efectoras cada 7 min durante este período. (A) Imagen que representa células de melanoma HERV-K+ (A888 y A375) y células de contro1HERV-Kneg (parental HEK293) con células T CAR+ son varios puntos de tiempo. Las células que se volvieron verdes se registraron como células muertas y se midió la intensidad de la fluorescencia. (B, C, D) Representa la intensidad fluorescente media de la célula diana. Las líneas superiores representan las células muertas, mientras que las líneas inferiores representan la intensidad basal de las células vivas. (E) Un gráfico que representa una diferencia significativa (*p < 0,05) en la intensidad fluorescente media a las 15 horas en comparación con las células parentales HEK293. Los datos representan el promedio de 2 experimentos independientes con 50 imágenes cada uno. Se realizó un ANOVA de una vía con postest de Tukey.

FIG. 21: Actividad Antitumoral in vivo de células T CAR+ específicas de HERV-K.(A) Esquema del experimento. (B) Imágenes representativas de ratones desde el día 3 al día 25. (C) BLI derivado de tumor A375-SM mKate+rRLuc+HERV-K+ y (D) análisis post mortem de tejidos hepáticos con puntos rojos que representan focos metastásicos tumorales mKate+. Los datos son medias ± DE (n = 5-6 ratones por grupo). Estadísticas realizadas con ANOVA bidireccional (en D) con las post-tests de Bonferroni y entre ratones tratados y no tratados. **P < 0,01 y ***p < 0,001. ANOVA, análisis de varianza; BLI, imagen bioluminiscente; CAR, receptor de antígeno quimérico; IL, interleucina.

FIG. 22: (A) Se muestran imágenes representativas (200X) de la expresión del antígeno HERV-K en secciones de tejidos de 29 órganos normales. El índice H se calculó como cero ya que no se observó tinción en ninguno de estos tejidos. (B) El índice H de tejido maligno de varios órganos y diferentes pacientes se muestra en un diagrama de puntos.

FIG. 23: (A) Se muestra el crecimiento de células T CD4+ versus CAR+ específicas de HERV-K CD8+ . (B) Análisis de nCounter representando la expresión de varios genes en células T CAR+ específicas de HERV-K versus células de control sin ADN. El rojo indica una expresión alta, mientras que el verde indica niveles bajos de ARNm. (C) Análisis de vía de ingenuidad de genes altamente expresados en células T CAR+ específicas de HERV-K.

FIG. 24: Se realizó un CRA estándar de 4 h con melanoma y dianas tumorales específicas de CD19 y células T CAR+ CD19. Todos los datos representan dos experimentos independientes realizados con un promedio de 6 donantes y analizados usando ANOVA de 2 vías con post-test de Bonferroni.

FIG. 25: Plásmido SB bidireccional que codifica el antígeno HERV-K bajo el promotor hEF-1a y el gen de resistencia a neomicina bajo el promotor CMV.

FIG. 26: Figura que representa el acoplamiento del CAR específico de HERV-K (en verde) con el antígeno de HERV-K (en rojo) en la superficie de la célula tumoral.

FIG. 27: (A) SB Plásmido que codifica myc-ffLuc con gen de resistencia a neomicina. (B) Crecimiento celular total de células T CAR+ específicas de HEr V-K y células T CAR-ffLuc+ específicas de He Rv -K. (C) CRA de cuatro horas de células parentales A375SM y EL4 con células T CAR-ffLuc+ específicas de HERV-K. (D) Imagen de ratón que representa la actividad ffLuc. (E) Plásmido lentiviral que codifica RLuc y mKate para imágenes de células tumorales.

FIG. 28A-B: Esquemas de mIL15. A) La construcción mIL15 flanqueada por repeticiones invertidas que son componentes del plásmido de expresión Bella Durmiente . La muteína mIL15 es una fusión de IL-15 con IL-15Ra de longitud completa mediante un enlazador serina-glicina flexible. B) Un esquema que representa la estructura de la proteína expresada de mIL15.

FIGS. 29A-B: Expresión de CAR y mIL15 en células T modificadas genéticamente después de expansión ex vivo en aAPC después de cinco ciclos de estimulación. A) Expresión de una muestra representativa de cinco donantes. B) Expresión del marcador denotado (CAR y/o mIL15) en células T modificadas genéticamente.

FIG. 30: Validación de la funcionalidad de mIL15 vía Phosflow de pSTAT5. Una incubación de cinco horas de células en suero y condiciones libres de citocinas, a menos que se indique lo contrario, para obtener fosforilación basal y mediada por IL-15. Gráfico representativo (n=6).

FIG. 31: Conteos inferidos de células T CAR+ con o sin coexpresión de mIL15 después de cuatro ciclos de estimulación en aAPC. Células T CAR+ se cultivaron con IL-2 e IL-21 solubles (la condición de cultivo estándar) o IL-15 e IL-21 (el control de citocinas solubles) y células T mIL15+CAR+ con IL-21. Los datos son medias ± DE, n=4.

FIGS.32A-B: Fenotipo y capacidad de lisis específica de células T expandidas ex vivo mIL15+CAR+ . A) Porcentaje de expresión en la superficie de ciertos marcadores de células T, activación y asociados a la diferenciación después de 4 estimulaciones en aAPC. La línea horizontal indica el valor medio *P = 0,047, prueba t pareada, n > 4. B) Células T CAR+ (panel izquierdo) y células T mIL15+CAR+ (panel derecho) lisis específica después de 5 estimulaciones en aAPC de dianas CD19+ o CD19neg de un ensayo de liberación de cromo de cuatro horas. Los datos se representan como medias ± DE, n = 3.

FIG. 33: Persistencia a largo plazo In vitro de células T mIL15+CAR+ que siguen siendo funcionalmente competentes y resistentes a AICD. A) Células T expandidas ex vivo mIL15+/'CAR+ después de cuatro estimulaciones de aAPC se sometieron a la retirada de la reestimulación del antígeno para evaluar la persistencia in vitro a largo plazo y observar la cinética de expansión durante más de 60 días. Las células T mIL15+CAR+ no recibieron ningún soporte de citocinas exógenas, mientras que las células T CAR+ no recibieron citocinas, IL-2 o IL-15. Los datos son logaritmos de la media ± DE, ****P < 0,0001, RM ANOVA, n=3. B) Las células T supervivientes a más de 75 días después de la exposición al antígeno se analizaron para determinar la capacidad de respuesta al antígeno mediante incubación con: sin diana, CD19+/_ EL4, CD19+ Nalm-6, o LAC durante 6 horas. El análisis se realizó mediante citometría de flujo de tinción intracelular de IFNy. Se muestran diagramas de flujo representativos, n=3. C) Las células T supervivientes después de 75 días post-retirada se probaron estimuladas 1:1 con aAPC como se describió anteriormente y el medio se complementó con la citocina (si la hubiera) utilizada durante el mantenimiento del cultivo de retirada más la adición de IL-21. Después de ocho días, las células T se tiñeron con anexina V para determinar la proporción de células vivas frente a apoptóticas/necróticas en el cultivo estimulado. Se muestra un diagrama de flujo representativo, n=3.

FIGS. 34A-C: Células T mIL15+CAR+ persistentes a largo plazo adquieren fenotipos CD45RA+CCR7+/_ dicotómico. A) Diagramas de flujo representativos de poblaciones CD45RA y CCR7 de células T mIL15+CAR+ de la estimulación 4 y las que persisten 75 días después de la última estimulación de antígeno, n=7. B) Frecuencias de subconjuntos de poblaciones de (A). ***P < 0,001 y ****P < 0.0001, RM ANOVA, n=7. C) Un histograma representativo que muestra los niveles de Anexina V en células T CCR7neg y CCR7+ mIL15+CAR+ de la estimulación 4 y las que persisten 75 días después de la última estimulación de antígeno, n=3. Los histogramas se regularon en la población de linfocitos para evitar la tinción de CCR7 inespecífica

FIG. 35A-D: Los gráficos muestran una caracterización adicional de células T mIL15+CAR+ mediante análisis de citometría de flujo. FIG. 35A, Nivel de proliferación homeostática de células T WD-mIL15+CAR+ de tres donantes normales (dilución de PKH 10 días después de la tinción) que han estado en cultivo sin reestimulación de antígeno durante 1-2 años (panel superior) y capacidad proliferativa de estas células tras la reestimulación de antígeno con aAPC (panel inferior). FIG. 35B, Fenotipo de retirada a largo plazo de células T mIL15+CAR+ (expresión superficial de CD3 y mIL15) que se sometieron a cariotipificación. Las células T de retirada fueron reestimuladas en primer lugar con aAPC antes de fenotipificación y sometimiento a cariotipificación. FIG. 35C, Cariotipo normal (bandas G) resultado de células T mIL15+CAR+ que persisten a largo plazo (1,5-2,46 años) in vitro en ausencia de reestimulación de antígeno y citocinas exógenas. Se muestra una propagación en metafase representativa de cuatro donantes normales. FIG. 35D, Cinética de la memoria después de la estimulación de células usando aAPC K562. FIG. 3E, Cinética de la memoria con 1 contra 2 estimulaciones de células T CAR y mIL15+CAR+

FIG. 36: El perfil molecular indica persistencia a largo plazo de células T mL15+CAR+ que exhiben características asociadas con subconjuntos de células T menos diferenciadas. Todos los genes expresados significativamente diferencialmente entre células T mIL15+CAR+ de estimulación cuatro y las que persisten durante las condiciones de retirada se clasifican funcionalmente en categorías amplias basadas en la información de ontología genética.

Los genes dentro de las categorías se dividen en función de la regulación hacia arriba o hacia abajo en la retirada persistente de células T mIL15+CAR+ .

FIG. 37: La validación de factores de transcripción asociados con estados de diferenciación de células T indica persistencia a largo plazo de células T mIL15+CAR+ que exhiben un estado de baja diferenciación. Panel superior: Genes seleccionados expresados diferencialmente (Tcf-7, Blimp-1 y T-bet) se validaron mediante tinción intracelular y se analizaron mediante citometría de flujo. Se muestran diagramas de flujo representativos, n=5. Panel inferior: número de copias de ARNm normalizado de la salida del sistema de análisis nCounter.

FIG. 38: La validación de marcadores de superficie asociados con estados de diferenciación de células T indica persistencia a largo plazo de células T mIL15+CAR+ que exhiben menos diferenciación. Panel superior: Genes seleccionados expresados diferencialmente, IL-7Ra y CCR7, se validaron mediante tinción y se analizaron mediante citometría de flujo. *P = 0,0156 y ***P < 0,001, prueba de intervalo con signo de pares emparejados de Wilcoxon de 1 cola y prueba T de 1 cola emparejada, respectivamente. Se muestran diagramas de flujo representativos, n=5-7. Panel inferior: Número de copias de ARNm normalizado de la salida del sistema de análisis nCounter, n=3.

FIG. 39: Adquisición de capacidad de producción de IL-2 por células T mIL15+CAR+ . A) Histogramas representativos de tinción intracelular de IL-2 de estimulación 4 y retirada de antígeno persistente en células T mIL15+CAR+ (WD-mIL15-CAR) que no se estimularon o se activaron con un cóctel de activación de linfocitos (LAC) durante 6 horas, seguido de tinción intracelular de IL-2 y análisis por citometría de flujo. B) Frecuencia de células T estimuladas con LAC que producen IL-2 a partir de (A). ****p< 0,0001, n=6, prueba t pareada.

FIGS. 40A-D: Persistencia in vivo y actividad antitumoral de células T mIL15+CAR+ en un ambiente con abundante antígeno tumoral. A) Esquema del experimento. B) BLI derivado de células T mIL15+/-CAR+ffluc+ transferidas adoptivamente a ratones después de la introducción del tumor Nalm-6 (n=5). C) Análisis de bazo (panel superior) y médula ósea (panel inferior) el día 14 para detectar la presencia de células T humanas mediante tinción con CD3 humano y detección mediante citometría de flujo. Diagrama de flujo representativo (n=5). D) Análisis de sangre periférica por citometría de flujo para la presencia de células CD3+ y CD19+ . Frecuencias obtenidas después de activar células CD45+ murinas. Los datos representan ratones individuales y media ± DE. ***P < 0,001, ANOVA de 1 vía, n=3-5.

FIGS.41A-E: Modelo in vivo que evalúa persistencia de células T mIL15+CAR+ y eficacia antitumoral en un entorno de bajo antígeno. A) Esquema del experimento. B) Célula T (ffLuc+) BLI de ratones que recibieron transferencia adoptiva de células T CAR+ o células T mIL15+CAR+ seguidas de inyección de tumor Nalm-6 CD19+ después de 6 días de injerto de células T. C) Carga de Nalm-6 de monitorización de BLI longitudinal. Las imágenes representan el flujo de fotones de la actividad de rLuc derivada de células Nalm-6. D) Flujo tumoral (rLuc) a lo largo del tiempo de ratones tratados con células T CAR+ , células T mIL15+CAR+ o sin células T. Los datos son la media ± DE. ****p < 0,0001, ANOVA unidireccional, n = 4-5. E) Análisis de sangre y tejidos recogidos donde las células T humanas (CD3+humanas) y células tumorales Nalm-6 (CD19+humanas) fueron detectadas por citometría de flujo. E) Utilizando el modelo de tumor bajo, se evaluó la supervivencia a largo plazo de los ratones hasta el día 98. Las condiciones experimentales se llevaron a cabo de manera similar a como se describió anteriormente para el modelo de tumor bajo en el que se injertaron ratones con células T mIL15-CAR (n = 7), células T CAR (n = 8), o sin células T (n = 8) seguido de exposición al tumor NALM-6. Las fracciones entre paréntesis representan la proporción de ratones que sobreviven hasta el día 98. *P = 0,045 (tratamiento con células T mIL15-CAr versus CAR T), intervalo logarítmico (Mantel-Cox).

FIGS. 42A-E: Persistencia y función retenida de células T mIL15+CAR+ T independiente de antígeno. A) Esquema del experimento. B) BLI de células T ffLuc+ en ratones tratados con células T CAR+ y mIL15+CAR+ en ausencia de antígeno tumoral. C) Análisis de médula ósea, bazo y sangre periférica en busca de células T CD3+ humanas y células tumorales CD19+, según se detecta mediante citometría de flujo. Se muestran diagramas de flujo representativos (paneles de la izquierda) y las frecuencias de las células T CD3+ humanas (panel derecho). Los datos se representan como media ± DE, n=5. **P=0,0027 (médula ósea), **P=0,0081 (bazo), ns=no significativo, prueba t no apareada. D) Representación longitudinal del flujo de células T (ffluc). La luminiscencia de fondo (sombreada en gris) se definió por el flujo obtenido de ratones que no recibieron células T ffluc+. Los datos se representan como media ± DE, n=5. *P=0,0128, **P+0,00231, prueba t no apareada. E) Las células aisladas del bazo, el hígado o la médula ósea se expandieron ex vivo en aAPC para generar un número de células suficiente para evaluar la producción intracelular de IFNy en respuesta a las dianas CD19- y CD19+ (como se describió anteriormente), n = 7 de tres fuentes de tejido y cuatro ratones. Los histogramas se regularon en CD3.

FIG. 43: Un esquema que muestra un protocolo de ejemplo para la producción de células T CAR usando SB transposasa proporcionada como un ARNm. Se podrían producir cantidades efectivas de células T CAR activas en dos semanas o menos (por ejemplo, 16 días).

FIG.44A-D: FIG. 44A, el gráfico (panel izquierdo) y los histogramas de citometría de flujo (panel derecho) muestran que el porcentaje de células T que expresan de manera estable CAR está aumentando significativamente desde el día 9 (8,3%) al día 16 (66,2%). FIG. 44B, el gráfico muestra que las células T crecen rápidamente y se amplifican 20 veces hasta el día 16 después de la electroporación. FIG. 44C, los gráficos muestran los resultados de los ensayos de liberación de cromo utilizando células T del día 16. La célula T CAR producida proporcionó citotoxicidad específica de CD-19 contra las células diana (panel izquierdo). Esencialmente, no se observó actividad citotóxica para las células T sin modificar (panel derecho). FIG. 44D, Histogramas de citometría de flujo muestran el número de células T de memoria central (Tcm) en el día 9 (panel izquierdo) y el día 17 (panel derecho) después de la electroporación. Las células para estos estudios fueron de un donante designado como #O y se usó ARNm de SB11 en la electroporación.

FIG.45A-B: FIG. 45A, los gráficos muestran los resultados de los ensayos de liberación de cromo utilizando células T del día 9 (paneles superiores) y del día 15 (paneles inferiores). La célula T CAR producida proporcionó citotoxicidad específica de CD-19 contra las células diana (paneles de la izquierda). Esencialmente, no se observó actividad citotóxica para las células T sin modificar (paneles de la derecha). Las células T modificadas destruyen las células diana positivas para CD19 el día 9 y el día 15 con una eficacia similar a pesar del número diferente de células positivas para CAR. FIG. 45B, los gráficos muestran el número de copias de CAR (panel izquierdo) y la expresión de CAR (panel derecho) en celdas electroporadas. Los resultados muestran que el número de copias de ADN de CAR disminuye de 1,5 a 0,9 desde el día 15 al día 22 y se mantiene estable después de ese momento. Las células para estos estudios fueron de un donante designado como #1 y se usó ARNm de SB100x en la electroporación.

FIG. 46: Datos de citometría de flujo muestran la viabilidad celular después de la electroporación. Después de la electroporación con ADN/ARNm el número total de células disminuye primero (día 1 y 2) y a continuación las células comienzan a crecer. Según los conteos del celómetro, el número de células disminuye entre un 59% y un 76% el día 2 después de la electroporación (viabilidad 24-41%).

DESCRIPCIÓN DE ASPECTOS ILUSTRATIVOS DE LA PRESENTE DIVULGACIÓN

Los ensayos clínicos han demostrado efectos antitumorales en pacientes que han recibido células T modificadas genéticamente para tener la especificidad deseada. En esta invención, se detalla una nueva estrategia para la fabricación de células T CAR+ específicas de antígeno que cumplen con cGMP. El sistema emplea un sistema de transfección altamente eficiente junto con una integración de genes CAR del sistema de transposones y transposasas. Estas estrategias no virales tienen ventajas significativas como alternativa a la transducción mediada por virus ya que las células T CAR+ preferiblemente no debe incluir secuencias virales añadidas. Se lograron células T CAR cGMP de alta calidad mediante la electrotransferencia de plásmidos de ADN derivados de un sistema de transposones, como de Bella Durmiente o piggyBac, y la propagación de las células T modificadas genéticamente en aAPC. La estrategia dio como resultado el crecimiento de números clínicamente atractivos de células T CAR+ que demostraron especificidad por su antígeno diana (p.ej., CD19). Es importante destacar que las células cumplieron con los criterios de liberación establecidos por la FDA para su uso en ensayos clínicos. Estos procedimientos evitan la genotoxicidad debida a la transducción mediada por virus y la inmunogenicidad debida al uso de virus.

Un receptor de antígeno quimérico (CAR) reconoce el antígeno asociado a un tumor de la superficie celular independiente del antígeno leucocitario humano (HLA) y emplea una o más moléculas de señalización para activar las células T genéticamente modificadas para matar, proliferar y producir citocinas (Jena y col., 2010). La transferencia adoptiva de células T que expresan c A r se ha mostrado prometedora en múltiples ensayos clínicos. Ahora es posible utilizar una estrategia modular para fabricar células T genéticamente modificadas de grado clínico. En ciertos aspectos de la presente descripción, las tecnologías de plataforma descritas en esta invención comprenden (i) transferencia de genes no virales utilizando un dispositivo de electroporación (por ejemplo, un nucleofector), (ii) transposición (por ejemplo, un transposón SB, ver, Patente EE. UU. 6.489.458), (iii) CAR que señalizan a través de endodomínios (p.ej., CD28/CD3-Z, CD137/CD3-Z, u otras combinaciones), (iv) CAR con longitudes variables de dominios extracelulares que conectan el dominio de reconocimiento de antígenos a la superficie celular y, en algunos casos, (v) células presentadoras de antígenos artificiales (aAPC) derivadas de K562 para poder expandir de manera robusta y numérica las células T CAR+ (Singh y col., 2008; Singh y col., 2011; Huang y col., 2012).

El procedimiento descrito actualmente se puede utilizar para modificar genéticamente las células T derivadas de sangre periférica. y/o sangre del cordón umbilical para expresar CAR que se pueden expandir numéricamente in vitro usando aAPC (Singh y col., 2008; Singh y col., 2011). El procedimiento tiene implicaciones para la terapia celular y génica, debido a la relativa facilidad de producción de plásmidos de ADN, electroporación, uso de aAPC de banco maestro irradiado con y descongelado, y puede transferirse fácilmente a instalaciones que operan de conformidad con las buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP) para ensayos de Fase I/II. El procedimiento divulgado de fabricación de células T es único al menos en que no utiliza (i) transducción viral o (ii) electroporación de ADN desnudo seguida de expansión rápida en una capa de alimentación de PBMC/LCL. Como ejemplo, se describen procedimientos para dirigirse a CD19 a través de la expresión forzada de un CAR que reconoce CD19 independientemente de HLA. Estas células T cumplen los criterios de liberación definidos por esterilidad, fenotipo, viabilidad y número de células. Las pruebas en procedimiento revelaron que las células T electroporadas/propagadas expresan CAR en una población memoria/sin tratar , tienen un cariotipo normal, conservan el repertorio de TCR Vp y son capaces de reconocer y lisar dianas tumorales CD19+ de una manera dependiente de CAR.

La electrotransferencia de plásmidos no virales es una alternativa atractiva a la transducción, ya que las especies de ADN se pueden producir hasta un grado clínico en aproximadamente 1/10° del costo de virus GMP-grado recombinante. Para mejorar la eficiencia de la integración, los inventores adaptaron el transposón y la transposasa Bella Durmiente (SB) para aplicaciones en humanos (Aronovich y col., 2011; Hackett y col., 2010; Izsvak y col., 2010; Kebriaei y col., 2012; Williams, 2008). Además, han utilizado el sistema transposon/transposasa piggyBac para hacer cumplir la expresión de CAR (Manuri y col., 2010). Sistema de SB del inventor utiliza dos plásmidos de ADN que comprenden un transposón que codifica para un gen de interés (p.ej.,transgén CAR específico de CD19 de 2a generación, como CD19RCD28 designado) y una transposasa (por ejemplo, SB11), que inserta el transgén en repeticiones de dinucleótidos TA en el genoma de la célula diana (Geurts y col., 2006; Ivics y col., 1997; Izsvak e Ivics, 1997). Para mejorar el potencial terapéutico, el CAR de 2a generación del inventor (Kowolik y col., 2006) envía señales a través de CD28 y CD3-Z con la expectativa de que esto mantendrá la proliferación de células T y reciclará las funciones efectoras in vivo.Además, CAR con diferentes longitudes extracelulares y diferentes motivos de señalización de endodominio pueden expresarse utilizando el sistema SB.

Para recuperar integrantes de células T que expresan de manera estable el CAR, K562 aAPC (clon #4) se desarrollaron, expresando el antígeno deseado (p.ej., CD19) junto con moléculas coestimuladoras, como CD86, CD137L, una versión unida a membrana de interleucina (IL) -15 (péptido fusionado a la región Fc de IgG4 modificada o péptido de citocina fusionado al receptor alfa de IL-15) y CD64 (receptor 1 de Fc-y), para seleccionar células T in vitro que son capaces de propagación sostenida mediada por CAR. Esta poderosa tecnología ha permitido la fabricación de números clínicamente relevantes (hasta 101°) de células T CAR+ adecuadas para aplicación en humanos. Según sea necesario, se pueden realizar ciclos de estimulación adicionales para generar un mayor número de células T modificadas genéticamente. Además, si se necesitan menos células T CAR+ , la estrategia de electroporación y propagación se puede reducir empleando menos cubetas y llevando adelante solo un subconjunto de las células T expandidas numéricamente para 0, 1 o más rondas de proliferación en aAPC (agregadas al comienzo de cada ciclo de estimulación). Normalmente, al menos el 90% de las células T propagadas expresan CAR y se criopreservan para infusión. Además, esta estrategia puede aprovecharse para generar células T para diversos tipos de tumores emparejando la especificidad del CAR introducido con la expresión del antígeno asociado al tumor (TAA) reconocido por el CAR en la aAPC. La plataforma de expansión ex vivo también se ha adaptado para fabricar células NK, células T NK y células T y§.

La consecuencia de células T CD4+ y CD8+ que expresan el CAR de 2a generación incluyen células con un fenotipo célula madre/memoria/sin tratar y exhiben tres características distintivas de especificidad redirigida. Primero, las células T genéticamente modificadas lisan específicamente dianas CD19+ . En segundo lugar, producen citocinas (p. ej., IFN-y) en respuesta a células estimuladoras de CD19+ . En tercer lugar, proliferan en respuesta a la estimulación de CD19+ , todo de una manera dependiente de CAR (Singh y col., 2011; Singh y col. 2008). La aAPC y el entorno del cultivo de tejidos (p. ej., la adición de IL-21) se han modificado para generar células T específicas de CD19 derivadas del paciente y del donante para su infusión después del trasplante de células madre hematopoyéticas (Singh y col., 2011; Singh y col. 2008). Los inventores pueden producir células T CAR+ de sangre periférica obtenidas simplemente por venopunción, lo que evita el coste, las molestias y los inconvenientes de obtener células mononucleares por aféresis. La capacidad de derivar grandes cantidades de células T CAR+ de pequeñas cantidades de células mononucleares es particularmente atractiva para la infusión de células T después de un trasplante alogénico de sangre de cordón umbilical. El tamaño pequeño y el anonimato del donante neonatal impiden volver a acceder a este individuo en un momento posterior y solo un número limitado de células mononucleares recogidas están disponibles como material de partida para la fabricación de células T para evitar interferir con la hematopoyesis. Otros avances en el procedimiento de fabricación incluyen un dispositivo de electroporación de alto rendimiento acoplado con un biorreactor WAVE completamente cerrado para minimizar la manipulación.

La estrategia actual de fabricación incluye la implementación de sistemas de procesamiento y cultivo para reducir la carga de trabajo y la protección contra una brecha en la esterilidad. Con este fin, los inventores cultivaron conjuntamente células T con aAPC irradiadas con y en biorreactores y/o bolsas en lugar de matraces. Esta transición se produce típicamente después del día 14 después de la electroporación. Además, las aAPC como material de origen se expanden numéricamente en biorreactores y/o bolsas, y los inventores adaptaron el dispositivo Sepax para procesar la aAPC para criopreservación. El procedimiento de recogida por Sepax tiene ventajas adicionales más allá de la automatización cuando se utilizan grandes volúmenes de medios de cultivo. (>900 mL) ya que reduce las etapas de centrifugado adicionales requeridas por el procedimiento manual.

I. Definiciones

El término "receptores de antígenos quiméricos (CAR)", como se usa en esta invención, puede hacer referencia a receptores de células T artificiales, receptores de células T quiméricas o inmunorreceptores quiméricos, por ejemplo, y abarcar receptores diseñados que injertan una especificidad artificial en una célula efectora inmunitaria particular. Los CAR pueden emplearse para impartir la especificidad de un anticuerpo monoclonal sobre una célula T, permitiendo así que se genere un gran número de células T específicas, por ejemplo, para uso en terapia celular adoptiva. En realizaciones específicas, los CAR dirigen la especificidad de la célula a un antígeno asociado a tumor, por ejemplo. En algunas realizaciones, los CAR comprenden un dominio de activación intracelular, un dominio transmembrana y un dominio extracelular que comprende una región de unión a antígeno asociada a tumor. En aspectos particulares, los CAR comprenden fusiones de fragmentos variables monocatenarios (scFv) derivados de anticuerpos monoclonales, fusionados con el dominio transmembrana CD3-zeta y el endodominio. La especificidad de otros diseños de CAR puede derivar de ligandos de receptores (p. ej., péptidos) o de receptores de reconocimiento de patrones, tales como las Dectinas. En realizaciones particulares, uno puede orientarse a células B malignas redirigiendo la especificidad de las células T usando un CAR específico para la molécula de linaje B, CD19. En ciertos casos, el espaciado del dominio de reconocimiento de antígeno puede modificarse para reducir la muerte celular inducida por activación. En ciertos casos, los CAR comprenden dominios para señalización coestimulante adicional, tales como CD3-zeta, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP10 y/u OX40. En algunos casos, las moléculas pueden coexpresarse con el CAR, incluyendo moléculas coestimulantes, genes indicadores para la formación de imágenes (p. ej., para tomografía por emisión de positrones), productos génicos que anulan condicionalmente las células T tras la adición de un profármaco, receptores de alojamiento, quimiocinas, receptores de quimiocinas, citocinas y receptores de citocinas.

El término "receptor de células T (TCR)", como se usa en esta invención, hace referencia a una proteína receptora en células T que está compuesta por un heterodímero de una cadena alfa (a) y beta (p), aunque en algunas células el TCR consiste en cadenas gamma y delta (y/ó). En realizaciones de la descripción, el TCR puede modificarse en cualquier célula que comprenda un TCR, incluyendo una célula T cooperadora, célula T citotóxica, célula T de memoria, célula T reguladora, célula T citolítica natural y célula T gamma-delta, por ejemplo.

Los términos "antígeno asociado a tumor" y "antígeno de células cancerosas" se usan de manera intercambiable en esta invención. En cada caso, los términos hacen referencia a proteínas, glicoproteínas o carbohidratos que son expresados de manera específica o preferente por las células cancerosas.

II. Receptores de Antígenos Quiméricos

Como se usa en esta invención, el término "antígeno" es una molécula capaz unirse a un anticuerpo o receptor de células T. Un antígeno es además capaz de inducir una respuesta inmunitaria humoral y/o una respuesta inmunitaria celular que conduce a la producción de linfocitos B y/o T.

Aspectos de la presente descripción implican ácidos nucleicos, incluyendo ácidos nucleicos que codifican un polipéptido receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de antígeno, incluyendo un CAR que se ha humanizado para reducir la inmunogenicidad (hCAR), que comprende un dominio de señalización intracelular, un dominio transmembrana y un dominio extracelular que comprende uno o más motivos de señalización. En ciertas realizaciones, el CAR puede reconocer un epítopo comprendido en el espacio compartido entre uno o más antígenos. Los receptores de reconocimiento de patrones, tales como Dectina 1, pueden usarse para derivar especificidad a un antígeno de carbohidrato. En ciertas realizaciones, la región de unión puede comprender regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo monoclonal, regiones variables de un anticuerpo monoclonal y/o fragmentos de unión a antígeno del mismo. En otra realización, esa especificidad se deriva de un péptido (p.ej., que se une a un receptor. Una región determinante de la complementariedad (CDR) es una secuencia corta de aminoácidos encontrada en los dominios variables de las proteínas receptoras de antígeno (p.ej., inmunoglobulina y receptor de células T) que complementa un antígeno y, por lo tanto, proporciona al receptor una especificidad para ese antígeno en particular. Cada cadena polipeptídica de un receptor de antígeno contiene tres CDR (CDR1, CDR2 y CDR3). Dado que los receptores de antígeno están compuestos típicamente por dos cadenas polipeptídicas, hay seis CDR por cada receptor de antígeno que pueden entrar en contacto con el antígeno; cada cadena pesada y ligera contiene tres CDR. Debido a que la mayoría de las variaciones de secuencia asociadas con las inmunoglobulinas y los receptores de células T se encuentran en las CDR, se hace referencia a veces a estas regiones como dominios hipervariables. Entre estos, CDR3 muestra la mayor variabilidad ya que está codificada por una recombinación de las regiones VJ (VDJ en el caso de la cadena pesada y la cadena ap de TCR).

Se contempla que los ácidos nucleicos de CAR humanizados derivan de genes humanos para mejorar la inmunoterapia celular para pacientes humanos. En un aspecto específico, en esta invención se describe un ADNc de CAR de longitud completa o región codificante. Las regiones o dominio de unión a antígeno pueden comprender un fragmento de las cadenas Vh y Vl de un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal humano particular, tal como los descritos en la Patente EE. UU. 7.109.304. El fragmento también puede ser cualquier número de diferentes dominios de unión a antígeno de un anticuerpo humano específico de antígeno. En una realización más específica, el fragmento es un scFv específico de antígeno codificado por una secuencia que está optimizada para el uso de codón humano para expresión en células humanas.

La disposición podría ser multimérica, tal como un diacuerpo o multímeros. Lo más probable es que los multímeros se formen mediante el emparejamiento cruzado de la parte variable de las cadenas ligera y pesada en lo que Winters ha denominado diacuerpo. La parte de bisagra de la construcción puede tener múltiples alternativas, desde estar totalmente eliminada a mantener la primera cisteína, a una prolina en lugar de una sustitución de serina, hasta estar truncada hasta la primera cisteína. La porción Fc se puede eliminar. Cualquier proteína que sea estable y/o dimerice puede servir para este propósito. Se podría usar apenas uno de los dominios Fc, p.ej., el dominio CH2 o el CH3 de la inmunoglobulina humana. También se podría usar la región bisagra, CH2 y CH3, de una inmunoglobulina humana que se ha modificado para mejorar la dimerización. También se podría usar solo la porción de bisagra de una inmunoglobulina. También se podrían usar porciones de CD8alfa.

El dominio de señalización intracelular del receptor quimérico descrito en esta invención es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se ha colocado el receptor quimérico. El término "función efectora" hace referencia a una función especializada de una célula diferenciada. La función efectora de una célula T, por ejemplo, puede ser actividad citolítica o actividad auxiliar, incluida la secreción de citocinas. La función efectora en una célula T sin tratar,de memoria o de tipo memoria incluye la proliferación dependiente de antígeno. Por tanto, el término "dominio de señalización intracelular" hace referencia a la porción de una proteína que transduce la señal de la función efectora y dirige la célula a realizar una función especializada. Aunque normalmente se empleará todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no será necesario utilizar el polipéptido intracelular completo. En la medida en que una porción truncada del dominio de señalización intracelular pueda encontrar uso, dicha porción truncada se puede usar en lugar de la cadena intacta siempre que transduzca la señal de la función efectora. Por tanto, el término dominio de señalización intracelular pretende incluir cualquier porción truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de la función efectora. Los ejemplos incluyen la cadena zeta del receptor de células T o cualquiera de sus homólogos (por ejemplo, eta, delta, gamma o épsilon), cadena MB1, B29, Fc RIII, Fc RI y combinaciones de moléculas de señalización, como CD3Z y CD28, CD27, 4-1BB, DAP-10, OX40 y combinaciones de los mismos, así como otras moléculas y fragmentos similares. Se pueden usar porciones de señalización intracelular de otros miembros de las familias de proteínas activadoras, tales como FcyRIII y FcsRI. Ver Gross y col. (1992), Stancovski y col. (1993), Moritz y col. (1994), Hwu y col. (1995), Weijtens y col. (1996) y Hekele y col. (1996) para las descripciones de los cTCR que utilizan estos dominios transmembrana e intracelular alternativos. En el contexto de un aspecto preferido de la presente descripción, se tomó el dominio intracelular de CD3 Z humano para la activación.

El dominio extracelular específico de antígeno y el dominio de señalización intracelular pueden estar ligados por un dominio transmembrana, tal como las regiones de bisagra de IgG4Fc humana y Fc Las alternativas incluyen el dominio transmembrana de CD4 humano, el dominio transmembrana de CD28 humano, el dominio transmembrana de CD3Z humano o un dominio CD3Z humano mutado con cisteína u otros dominios transmembrana de otras proteínas de señalización de transmembrana humanas, tales como CD16 y CD8 y el receptor de eritropoyetina.

En el contexto de algunos aspectos de la presente descripción, el ácido nucleico de CAR comprende una secuencia que codifica otros receptores coestimulantes, tales como un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular de CD28 modificado. Otros receptores coestimulantes incluyen, pero sin limitación, uno o más de CD28, CD27, OX40 (CD134), DAP10 y 4-1BB (CD137). Además de una señal primaria iniciada por CD3 Z, una señal adicional proporcionada por un receptor coestimulante humano insertado en un CAR humano es importante para la activación completa de las células T y podría ayudar a mejorar la persistencia in vivo y el éxito terapéutico de la inmunoterapia adoptiva.

En aspectos particulares, la presente descripción se refiere a segmentos de ácido nucleico aislados y a módulos de expresión que incorporan secuencias de a Dn que codifican el CAR. Los vectores de la presente descripción están diseñados, principalmente, para suministrar genes deseados a células inmunes, preferiblemente células T bajo el control de promotores eucariotas regulados, por ejemplo, promotor MNDU3, promotor CMV, promotor EF1alpha o promotor ubiquitina. Además, los vectores pueden contener un marcador seleccionable, si no es por otra razón, para facilitar su manipulación in vitro.En otras realizaciones, el CAR puede expresarse a partir de ARNm transcrito in vitro a partir de un modelo de ADN.

Las moléculas de receptor de antígeno quimérico son recombinantes y se distinguen por su capacidad tanto para unir antígeno como transducir señales de activación a través de motivos de activación de inmunorreceptores (ITAM) presentes en sus colas citoplasmáticas. Las construcciones de receptores que utilizan una fracción de unión a antígeno (por ejemplo, generado a partir de anticuerpos monocatenarios (scFv)) brindan la ventaja adicional de ser "universales" porque se unen al antígeno nativo en la superficie de la célula diana de forma independiente de HLA. Por ejemplo, varios laboratorios han informado sobre construcciones scFv fusionadas con secuencias que codifican la porción intracelular de la cadena zeta del complejo CD3 (Z), la cadena gamma del receptor Fc y la tirosina quinasa del cielo (Eshhar y col., 1993; Fitzer-Attas y col., 1998). Se han documentado mecanismos efectores de células T redirigidos que incluyen el reconocimiento de tumores y la lisis por CTL en varios sistemas Z scFv: de antígeno murino y humano (Eshhar, 1997; Altenschmidt y col., 1997; Brocker y col., 1998).

Hasta la fecha, las regiones de unión a antígenos no humanos se utilizan típicamente para construir un receptor de antígeno quimérico. Un problema potencial con el uso de regiones de unión a antígenos no humanos, como los anticuerpos monoclonales murinos, es la falta de funcionalidad efectora humana y la incapacidad para penetrar en masas tumorales. En otras palabras, dichos anticuerpos pueden ser incapaces de mediar en la lisis dependiente del complemento o lisar las células diana humanas a través de la toxicidad celular dependiente de anticuerpos o la fagocitosis mediada por el receptor Fc para destruir las células que expresan CAR. Además, los anticuerpos monoclonales no humanos pueden ser reconocidos por el huésped humano como una proteína extraña y, por lo tanto, las inyecciones repetidas de dichos anticuerpos extraños pueden conducir a la inducción de respuestas inmunes que conducen a reacciones de hipersensibilidad nocivas. En el caso de los anticuerpos monoclonales de base murina, esto a menudo se denomina respuesta de anticuerpo anti-ratón humano (HAMA). Por tanto, se prefiere más el uso de anticuerpos humanos porque no provocan una respuesta HAMA tan fuerte como los anticuerpos murinos. El uso de secuencias humanas en el CAR puede evitar el reconocimiento inmunomediado y por lo tanto la eliminación por parte de las células T endógenas que residen en el destinatario y reconocen el antígeno procesado en el contexto de HLA.

En el contexto de algunos aspectos de la presente descripción, el receptor de antígeno quimérico comprende: a) un dominio de señalización intracelular, b) un dominio transmembrana y c) un dominio extracelular que comprende una región de unión a antígeno.

En el contexto de aspectos específicos de la presente descripción, los dominios de señalización del receptor intracelular en el CAR incluyen los del complejo receptor de antígeno de células T, como la cadena zeta de CD3, también dominios de señalización coestimuladores Fcy RIII, CD28 , CD27, DAP10, CD137, OX40, CD2, solos o en serie con CD3zeta, por ejemplo. En el contexto de aspectos específicos de la presente descripción, el dominio intracelular (que puede denominarse dominio citoplásmico) comprende parte o la totalidad de una o más de las cadenas zeta de TCR, CD28, CD27, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcsRIy, ICOS/CD278, IL-2Rbeta/CD122, IL-2Ralpha/CD132, DAP10, DAP12 y CD40. En el contexto de algunos aspectos de la presente divulgación, se emplea cualquier parte del complejo receptor de células T endógeno en el dominio intracelular. Se pueden emplear uno o múltiples dominios citoplasmáticos, ya que los llamados CAR de tercera generación tienen al menos dos o tres dominios de señalización fusionados conjuntos para un efecto aditivo o sinérgico, por ejemplo.

En el contexto de ciertos aspectos de la presente descripción del receptor de antígeno quimérico, la porción específica de antígeno del receptor (que puede denominarse dominio extracelular que comprende una región de unión a antígeno) comprende un antígeno asociado a tumor o un dominio de unión a antígeno específico de patógeno que incluye antígeno de carbohidrato reconocido por receptores de reconocimiento de patrones, como Dectina-1. Un antígeno asociado a tumor puede ser de cualquier tipo, tal como los expresados sobre la superficie celular de células tumorales. Ejemplos de antígenos asociados a tumores incluyen CD19, CD20, antígeno carcinoembrionario, alfafetoproteína, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, c-Met, AKT, Her2, Her3, antígeno tumoral epitelial, antígeno asociado a melanoma, p53 mutado, ras mutado y demás. En el contexto de ciertos aspectos de la presente descripción, el CAR puede coexpresarse con una citocina unida a la membrana para mejorar la persistencia cuando hay una cantidad baja de antígeno asociado al tumor. Por ejemplo, el CAR puede coexpresarse con IL-15 unida a la membrana.

En el contexto de ciertos aspectos de la presente descripción, pueden dirigirse antígenos asociados a tumores intracelulares, tales como HA-1, survivina, WT1 y p53. Esto puede lograrse mediante un CAR expresado en una célula T universal que reconoce el péptido procesado descrito a partir del antígeno asociado al tumor intracelular en el contexto de HLA. Además, una célula T universal puede modificarse genéticamente para expresar un apareamiento a receptor de células T que reconoce el antígeno asociado a tumor procesado intracelular en el contexto de HLA.

El patógeno puede ser de cualquier tipo, pero en realizaciones específicas, el patógeno es un hongo, una bacteria o un virus, por ejemplo. Patógenos víricos ejemplares incluyen los de las familias Adenoviridae, virus de Epstein-Barr (EBV), Citomegalovirus (CMV), Virus sincitial respiratorio (RSV), virus JC, virus BK, HSV, familia de virus HHV, Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Polyomavirus, Rhabdoviridae y Togaviridae. Virus patogénicos ejemplares causan viruela, gripe, paperas, sarampión, varicela, ébola y rubéola. Hongos patógenos ejemplares incluyen Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Pneumocystis, y Stachybotrys.Bacterias patógenas ejemplares incluyen Streptococcus, Pseudomonas, Shigella, Campylobacter, Staphylococcus, Helicobacter, E. coli, Rickettsia, Bacillus, Bordetella, Chlamydia, Spirochetes, y Salmonella. En una realización, el receptor de patógeno Dectina-1 puede usarse para generar un CAR que reconoce la estructura de carbohidratos en la pared celular de hongos. Células T modificadas genéticamente para expresar el CAR basado en la especificidad de Dectina-1 pueden reconocer Aspergillus y dirigirse al crecimiento de hifas. En otra realización, los CAR se pueden elaborar basándose en un anticuerpo que reconoce determinantes virales (p. ej., las glicoproteínas de CMV y Ébola) para interrumpir las infecciones y la patología víricas.

En algunas realizaciones, el antígeno patógeno es un antígeno de carbohidrato Aspergillus para el que el dominio extracelular en el CAR reconoce patrones de carbohidratos de la pared celular fúngica, tales como vía Dectina-1.

Un inmunorreceptor quimérico como se describe en esta invención se puede producir por cualquier medio conocido en la técnica, aunque preferiblemente se produce usando técnicas de ADN recombinante. Una secuencia de ácido nucleico que codifica las diversas regiones del receptor quimérico se puede preparar y ensamblar en una secuencia codificante completa mediante técnicas estándar de clonación molecular (examen de bibliotecas genómicas, PCR, ligadura asistida por cebadores, bibliotecas scFv de levaduras y bacterias, mutagénesis dirigida al sitio, etc.). La región codificante resultante puede insertarse en un vector de expresión y usarse para transformar una línea de células T alogénicas huésped de expresión adecuada.

Tal como se usa en esta invención, se pretende que una construcción de ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico o polinucleótido signifique una molécula de ADN que se puede transformar o introducir en una célula T y transcribirse y traducirse para producir un producto (p.ej., un receptor de antígeno quimérico).

En una construcción de ácido nucleico ejemplar (polinucleótido) usado en la presente invención, el promotor está unido de manera operativa a la secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor quimérico de la presente invención, es decir, están ubicados para que promuevan la transcripción del ARN mensajero del ADN que codifica el receptor quimérico. El promotor puede ser de origen genómico o generarse sintéticamente. En la técnica se conoce una variedad de promotores para usar en las células T (p.ej., (por ejemplo, el promotor CD4 descrito por Marodon y col. (2003)). El promotor puede ser constitutivo o inducible, donde la inducción está asociada con el tipo de célula específica o un nivel específico de maduración. De manera alternativa, también son adecuados una cantidad de promotores virales bien conocidos. Los promotores de interés incluyen el promotor de actina-p, promotores tardíos y tempranos SV40, promotor de inmunoglobulina, promotor de citomegalovirus humano, promotor de retrovirus y el promotor de virus formador de focos en el bazo de Friend. Los promotores pueden o no estar asociados con potenciadores, donde los potenciadores pueden estar naturalmente asociados con el promotor particular o asociados con un promotor diferente.

La secuencia del marco de lectura abierto que codifica el receptor quimérico se puede obtener a partir de una fuente de ADN genómico, una fuente de ADNc o se puede sintetizar (p.ej., vía PCR), o combinaciones de los mismos. Dependiendo del tamaño del ADN genómico y de la cantidad de intrones, puede ser conveniente usar ADNc o una combinación de los mismos, ya que se descubrió que los intrones estabilizan el ARNm o proporcionan la expresión específica de células T (Barthel y Goldfeld (2003) J. Immunol. Además, puede ser ventajoso usar regiones no codificantes exógenas o endógenas para estabilizar el ARNm.

Para la expresión de un receptor de antígeno quimérico según descrito en esta invención, se puede usar la región de iniciación de transcripción de origen natural o endógena de la secuencia de ácido nucleico que codifica el componente de extremo N del receptor quimérico para generar el receptor quimérico en el huésped diana. De manera alternativa, se puede usar una región de iniciación de transcripción exógena, lo que permite la expresión inducible o constitutiva, donde la expresión se puede controlar dependiendo del huésped diana, el nivel de expresión deseado, la naturaleza del huésped diana, y similares.

Asimismo, la secuencia de señal que dirige el receptor quimérico a la membrana de la superficie puede ser la secuencia de señal endógena de componente de extremo N del receptor quimérico. De manera opcional, en algunos aspectos, puede ser beneficioso intercambiar esta secuencia por una secuencia de señal diferente. Sin embargo, la secuencia de señal seleccionada debe ser compatible con la vía secretora de las células T para que el receptor quimérico se presente en la superficie de la célula T.

De manera similar, una región de terminación se puede proporcionar por la región de terminación de transcripción endógena o de origen natural de la secuencia de ácido nucleico que codifica el componente del extremo C del receptor quimérico. De manera alternativa, la región de terminación se puede derivar de una fuente diferente. En su mayoría, la fuente de la región de terminación generalmente no se considera de crucial importancia a la expresión de una proteína recombinante y una amplia variedad de regiones de terminación se pueden utilizar sin afectar negativamente la expresión.

Como apreciará un experto en la técnica, en algunos aspectos, se pueden eliminar algunos aminoácidos en los extremos del dominio de unión al antígeno en el CAR, generalmente no más de 10, más generalmente no más de 5 residuos, por ejemplo. También, puede ser conveniente introducir una pequeña cantidad de aminoácidos en los límites, usualmente no más de 10, más usualmente no más de 5 residuos. La deleción o inserción de aminoácidos puede ser como resultado de las necesidades de la construcción, proporcionando sitios de restricción convenientes, de fácil manipulación, mejora de los niveles de expresión, o similares. Además, el sustituto de uno o más aminoácidos con un aminoácido diferente se puede producir por razones similares, usualmente no sustituyendo más de cinco aminoácidos en cualquier dominio.

La construcción quimérica, que codifica el receptor quimérico según descrito en esta invención se puede preparar de maneras convencionales. Ya que, en su mayoría, se utilizan secuencias naturales, los genes naturales se aíslan y se manipulan, de la manera que sea adecuado para permitir la unión adecuada de los distintos componentes. Por lo tanto, las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de extremo C y extremo N del receptor quimérico se pueden aislar utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando cebadores adecuados que produzcan la deleción de las porciones no deseadas del gen. De manera alternativa, se pueden utilizar digeridos de restricción de genes clonados para generar la construcción quimérica. En cualquier caso, las secuencias se pueden seleccionar para proporcionar sitios de restricción que tienen extremos romo, o tienen superposiciones complementarias.

Las diversas manipulaciones para preparar la construcción quimérica se puede llevar a cabo in vitro y en el contexto de aspectos particulares de la presente invención se introduce la construcción quimérica en los vectores para la clonación y expresión en un huésped adecuado utilizando procedimientos de transfección o transformación estándares. Por lo tanto, después de cada manipulación, se clona la construcción resultante de la unión de las secuencias de ADN, se aísla el vector y la secuencia se analiza para asegurarse que la secuencia codifique el receptor quimérico deseado. Esta secuencia se puede analizar mediante un análisis de restricción, secuenciación o similares.

Las construcciones quiméricas descritas en esta invención encuentran aplicación en sujetos que tienen o se sospecha que tienen cáncer al reducir el tamaño de un tumor o impedir el crecimiento o recrecimiento de un tumor en estos sujetos. En consecuencia, se describe adicionalmente en esta invención un procedimiento para reducir el crecimiento o impedir la formación de tumores en un sujeto mediante la introducción de una construcción quimérica de la presente invención en una célula T aislada del sujeto y reintroducir en el sujeto la célula T transformada, lo que produce respuestas antitumorales para reducir o eliminar tumores en el sujeto. Células T adecuadas que pueden usarse incluyen linfocitos citotóxicos (CTL) o cualquier célula que tenga un receptor de células T que necesite de disrupción. Como es sabido por los expertos en la técnica, existen varios procedimientos disponibles para aislar esas células de un sujeto. Por ejemplo, utilizar la expresión del marcador de superficie celular o utilizar kits comercialmente disponibles (p.ej, ISOCELL™ de Pierce, Rockford, I11).

Está contemplado que la construcción quimérica se puede introducir en las propias células T del sujeto como ADN desnudo o en un vector adecuado. Procedimientos de transfección estable de células T mediante electroporación usando ADN desnudo son conocidos en la técnica. Ver, p.ej., Pat. EE. UU. No. 6,410,319. ADN desnudo se refiere generalmente al ADN que codifica un receptor quimérico de la presente invención contenido en un vector de expresión plásmido en una orientación adecuada para expresión. De manera ventajosa, el uso de ADN desnudo reduce el tiempo necesario para producir células T que expresan el receptor quimérico descrito en esta invención.

De manera alternativa, se puede usar un vector viral (p.ej., un vector retroviral, vector adenovirus, vector viral adenoasociado o vector lentiviral) para introducir la construcción quimérica en las células T. Vectores adecuados para su uso según el procedimiento de la presente invención no se replican en las células T del sujeto. Se conoce una gran cantidad de vectores que están basados en virus, donde el número de copias del virus mantenido en la célula es lo suficientemente bajo como para mantener la viabilidad de la célula. Vectores ilustrativos incluyen vectores pFB-neo (STRATAGENE®) descritos en esta invención, así como también vectores basados en VIH, SV40, EBV, HSV o BPV.

Una vez que está establecido que la célula T transducida o transfectada es capaz de expresar el receptor quimérico como una proteína de membrana de superficie con la regulación deseada y a un nivel deseado, se puede determinar si el receptor quimérico es funcional en la célula huésped para proporcionar la inducción de señal deseada. Posteriormente, las células T se reintroducen o administran al sujeto para activar las respuestas antitumorales en dicho sujeto. Para facilitar la administración, según la invención, las células T transducidas se pueden hacer en composiciones farmacéuticas o implantes adecuados para la administración in vivo, con portadores o diluyentes adecuados, que pueden ser además farmacéuticamente aceptables. Los medios para elaborar dicha composición o un implante se han descrito en la técnica (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed., Mack, ed. (1980)). Cuando corresponda, las células T transducidas se pueden formular en una preparación en forma líquida o semisólida, tal como una cápsula, solución, inyección, inhalador o aerosol, en las maneras convencionales para su vía de administración respectiva. Medios conocidos en la técnica se pueden utilizar para impedir o minimizar la liberación y absorción de la composición hasta que alcance el tejido u órgano diana, o para asegurar la liberación de la composición a lo largo del tiempo. Sin embargo, de manera conveniente, se utiliza una forma farmacéuticamente aceptable que no deja sin efecto las células que expresan el receptor quimérico. Por lo tanto, de manera conveniente, las células T transducidas se pueden hacer en una composición farmacéutica que contiene una solución salina balanceada, preferentemente, una solución salina balanceada de Hanks o una solución salina normal.

III. Procedimientos y Composiciones Relacionados con las Realizaciones

En ciertos aspectos, en esta invención se describe un procedimiento para hacer y/o expandir las células T redirigidas específicas de antígeno que comprende transfectar células T con un vector de expresión que contiene una construcción de ADN que codifica el hCAR, a continuación, opcionalmente, estimular las células con células positivas para antígeno, antígeno recombinante o un anticuerpo para que el receptor haga que las células proliferen.

En otro aspecto, en esta invención se describe un procedimiento para transfectar y redirigir de manera estable células T mediante electroporación u otra transferencia de genes no virales (tal como, pero sin limitarse a, sonoporación) usando ADN desnudo. La mayoría de los investigadores han utilizado vectores virales para transportar genes heterólogos a células T. Mediante el uso de ADN desnudo, se puede reducir el tiempo necesario para producir células T redirigidas. "ADN desnudo" significa ADN que codifica un receptor de células T quimérico (cTCR) contenido en un casete o vector de expresión en la orientación adecuada para expresión. El procedimiento de electroporación como se describe en esta invención produce transfectantes estables que expresan y portan en sus superficies el TCR quimérico (cTCR).

"TCR Quimérico" significa un receptor que se expresa en células T y que comprende dominios de señalización intracelular, transmembrana y extracelular, donde el dominio extracelular es capaz de unirse específicamente de una manera no restringida por CMH a un antígeno que normalmente no está unido a un receptor de células T de esa manera. La estimulación de células T por el antígeno en condiciones apropiadas da como resultado la proliferación (expansión) de las células y/o la producción de IL-2. Los receptores quiméricos específicos de CD19 y HERV-K ejemplares de la presente solicitud son ejemplos de un TCR quimérico. Sin embargo, el procedimiento es aplicable a la transfección con TCR quiméricos que son específicos para otros antígenos diana, como los TCR quiméricos que son específicos para HER2/Neu (Stancovski y col., 1993), ERBB2 (Moritz y col., 1994), proteína de unión a folato (Hwu y col., 1995), carcinoma de células renales (Weitjens y col., 1996), y gp12o y gp41 de glucoproteínas de envoltura de VIH-1 (Roberts y col., 1994). Otros antígenos diana de superficie celular incluyen, pero sin limitación, CD20, antígeno carcinoembrionario, mesotelina, ROR1, c-Met, CD56, GD2, GD3, alfafetoproteína, CD23, CD30, CD123, IL-11 Ralfa, cadena kappa, cadena lambda, CD70, CA-125, MUC-1, EGFR y variantes, antígeno tumoral epitelial y así sucesivamente.

En ciertos aspectos, las células T son células T humanas primarias, como las células T derivadas de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), PBMC recogidas después de la estimulación con G-CSF, médula ósea o sangre del cordón umbilical. Las condiciones incluyen el uso de ARNm y ADN y electroporación. Después de la transfección, las células se pueden infundir inmediatamente o se pueden almacenar. En ciertos aspectos, las células pueden propagarse durante días, semanas o meses ex vivo como una población en bruto al cabo de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 días o más después de la transferencia de genes. En un aspecto adicional, después de la transfección, los transfectantes se clonan y un clon demuestra la presencia de un único casete o plásmido de expresión integrado o mantenido episómicamente, y se expande la expresión del receptor quimérico ex vivo.El clon seleccionado para la expansión demuestra la capacidad de reconocer y lisar específicamente las células diana que expresan CD19. Las células T recombinantes pueden expandirse por estimulación con IL-2 u otras citocinas que se unen a la cadena gamma común (p. ej., IL-7, IL-12, IL-15, IL-21 y otras). Las células T recombinantes pueden expandirse por estimulación con células presentadoras de antígeno artificiales. Las células T recombinantes pueden expandirse en células presentadoras de antígenos artificiales o con un anticuerpo, tal como OKT3, que reticula CD3 sobre la superficie de células T. Se pueden deletar subconjuntos de células T recombinantes en células presentadoras de antígenos artificiales o con un anticuerpo, como Campath, que se une a CD52 en la superficie de las células T. En un aspecto adicional, las células modificadas genéticamente pueden ser crioconservadas.

La propagación (supervivencia) de las células T después de la infusión puede evaluarse mediante: (i) q-PCR utilizando cebadores específicos para el CAR; (ii) citometría de flujo usando un anticuerpo específico para el CAR; y/o (iii) TAA soluble.

Los aspectos de la presente descripción también se refieren al direccionamiento de una neoplasia o trastorno de células B que incluyen células B, siendo el epítopo de la superficie celular específico de CD19 utilizando una célula T inmunitaria redirigida. Las células B malignas son una diana excelente para las células T redirigidas, ya que las células B pueden servir como células presentadoras de antígenos inmunoestimuladores para las células T. Los estudios preclínicos que respaldan la actividad antitumoral de la terapia adoptiva con células T específicas de CD19 derivadas de un donante que portan un CAR humano o humanizado incluyen (i) la eliminación redirigida de dianas CD19+ , (ii) secreción/expresión redirigida de citocinas después de la incubación con células diana/estimuladoras CD19+ , y (iii) proliferación sostenida después de la incubación con células diana/estimuladoras CD19+ .

En ciertos aspectos de la presente invención, las células CAR se administran a un individuo que necesita de las mismas, como un individuo que tiene cáncer o una infección. Las células mejorar a continuación el sistema inmunitario del individuo para atacar el cáncer o las células patogénicas respectivas. En algunos casos, se proporciona al individuo una o más dosis de células T CAR específicas de antígeno. En los casos en que al individuo se le proporcionan dos o más dosis de células T CAR específicas de antígeno, la duración entre las administraciones debería ser suficiente para permitir un tiempo de propagación en el individuo, y en aspectos específicas la duración entre dosis es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más días.

La fuente de las células T alogénicas que se modifican para incluir tanto un receptor de antígeno quimérico como que carece de TCR funcional puede ser de cualquier tipo, pero en aspectos específicos las células se obtienen de un banco de sangre de cordón umbilical, sangre periférica, células madre embrionarias humanas o células madre pluripotentes inducidas, por ejemplo. Dosis adecuadas para un efecto terapéutico serían de al menos 105 o entre aproximadamente 105 y aproximadamente 101° células por dosis, por ejemplo, preferiblemente en una serie de ciclos de dosificación. Un régimen de dosificación ejemplar consiste en cuatro ciclos de dosificación de una semana de dosis crecientes, comenzando al menos en aproximadamente 105 células el día 0, por ejemplo, aumentando gradualmente hasta una dosis diana de aproximadamente 101° células dentro de varias semanas de iniciar un esquema de escalada de dosis intrapaciente. Modos de administración adecuados incluyen inyección intravenosa, subcutánea, intracavitaria (por ejemplo, mediante dispositivo de acceso a depósito), intraperitoneal e inyección directa en una masa tumoral.

Una composición farmacéutica según descrito en esta invención se puede usar sola o en combinación con otros agentes bien establecidos útiles para tratar cáncer. Ya sea que se suministre sola o en combinación con otros agentes, la composición farmacéutica de la presente invención se puede suministrar a través de diversas vías y en diversos sitios en un cuerpo de un mamífero, particularmente humano, para conseguir un efecto particular. Un experto en la materia reconocerá que, aunque se puede usar más de una vía para la administración, una vía particular puede proporcionar una reacción más inmediata y más efectiva que otra vía. Por ejemplo, el suministro intradérmico se puede usar ventajosamente sobre la inhalación para el tratamiento de melanoma. La administración local o sistémica se puede lograr mediante administración que comprende la aplicación o instilación de la formulación en cavidades corporales, la inhalación o insuflación de un aerosol, o la introducción parenteral, que comprende administración intramuscular, intravenosa, intraportal, intrahepática, peritoneal, subcutánea o intradérmica.

Una composición de las realizaciones se puede proporcionar en forma de dosificación unitaria donde cada unidad de dosificación, p.ej, una inyección, contiene una cantidad predeterminada de la composición, sola o en combinación apropiada con otros agentes activos. El término forma de dosificación unitaria como se usa en esta invención se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y animales, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de la composición de la presente invención, sola o en combinación con otros agentes activos, calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado, en asociación con un diluyente, portador o vehículo farmacéuticamente aceptable, donde sea apropiado. Las especificaciones para las formas de dosificación unitaria novedosas de la presente invención dependen de la farmacodinámica particular asociada con la composición farmacéutica en el sujeto particular.

Deseablemente, una cantidad efectiva o un número suficiente de células T transducidas aisladas está presente en la composición y se introduce en el sujeto de manera que se establezcan respuestas antitumorales específicas a largo plazo para reducir el tamaño de un tumor o eliminar el crecimiento o recrecimiento tumoral que de otro modo resultaría en la ausencia de dicho tratamiento. Deseablemente, la cantidad de células reintroducidas en el sujeto causa una disminución del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % en el tamaño del tumor cuando se compara con otras condiciones por lo demás iguales donde las células T no están presentes.

Por consiguiente, la cantidad de células T transducidas administrada debe tener en cuenta la vía de administración y debe ser tal que se introduzca un número suficiente de células T transducidas para lograr la respuesta terapéutica deseada. Además, las cantidades de cada agente activo incluidas en las composiciones descritas en esta invención (p.ej., la cantidad por cada célula a poner en contacto o la cantidad por cierto peso corporal) pueden variar en diferentes aplicaciones. En general, la concentración de células T transducidas deseablemente debería ser suficiente para proporcionar en el sujeto que está siendo tratado al menos de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 * 109 células T transducidas, incluso más deseablemente, de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 5 * 108 células T transducidas, aunque se puede utilizar cualquier cantidad adecuada por encima, por ejemplo, más de 5 x 108 células, o por debajo, por ejemplo, menos de 1 x 107 células. El programa de dosificación puede basarse en terapias basadas en células bien establecidas (ver, p.ej., Topalian y Rosenberg, 1987; Pat. EE. UU. No. 4,690,915), o se puede emplear una estrategia de infusión continua alternativa.

Estos valores proporcionan una guía general de la gama de células T transducidas que utilizará el médico al optimizar el procedimiento descrito para la práctica de los medios y procedimientos descritos en esta invención. La enumeración en esta invención de tales intervalos de ninguna manera descarta el uso de una cantidad más alta o más baja de un componente, como se podría justificar en una aplicación particular. Por ejemplo, la dosis y el programa real pueden variar dependiendo de si las composiciones se administran en combinación con otras composiciones farmacéuticas, o dependiendo de las diferencias interindividuales en la farmacocinética, disposición del fármaco y metabolismo. Un experto en la técnica fácilmente puede realizar cualquier ajuste necesario según las exigencias de la situación particular.

IV. Células T receptoras de antígeno quimérico específicas de CD19 humanas ejemplares

CD19, una glicoproteína de la superficie celular de la superfamilia de las inmunoglobulinas, es una diana potencialmente atractiva para la terapia con anticuerpos de neoplasias malignas asociadas a células B. Este antígeno está ausente en las células madre hematopoyéticas y, en individuos sanos, su presencia está restringida exclusivamente al linaje B y posiblemente a algunas células dendríticas foliculares (Scheuermann y col., 1995). De hecho, está presente en las células B desde las primeras células del linaje B reconocibles durante el desarrollo a blastos de células B, pero se pierde con la maduración en células plasmáticas. Además, el CD19 no se desprende de la superficie celular y rara vez se pierde durante la transformación neoplásica (Scheuermann y col., 1995). La proteína se expresa en la mayoría de las células malignas del linaje B, incluidas las células de pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma no Hodgkin (NHL) y leucemia linfoblástica aguda (LLA) (Uckun y col., 1988). CD19 actúa principalmente como correceptor de células B junto con CD21 y CD81. Tras la activación, la cola citoplasmática de CD19 se fosforila, lo que conduce a la unión de las quinasas de la familia Src y al reclutamiento de la quinasa PI-3.

En un aspecto, las composiciones y los procedimientos descritos en esta invención se refieren al polipéptido del receptor de células T quimérico (o receptor de antígeno quimérico, CAR) específico de CD19 humano (denominado hCD19CAR) que comprende un dominio de señalización intracelular, un dominio transmembrana y un dominio extracelular, comprendiendo el dominio extracelular una región de unión a CD19 humana. En otro aspecto, la región de unión a CD19 es F (ab')2, Fab', Fab, Fv o scFv. La región de unión puede comprender una secuencia de aminoácidos que sea al menos, como máximo o aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntico a la secuencia de aminoácidos de tipo natural. El dominio intracelular puede comprender un dominio de señalización intracelular de CD3Z humano y puede comprender además el segmento intracelular de CD28 humano. En ciertos aspectos, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana CD28.

En un aspecto adicional, las composiciones descritas en esta invención incluyen un ácido nucleico que codifica el polipéptido descrito anteriormente. En ciertos aspectos, la secuencia de ácido nucleico está optimizada para el uso de codones humanos.

En otro aspecto más, las composiciones descritas en esta invención incluyen células que expresan el polipéptido descrito en esta invención. La célula T puede comprender un casete de expresión que codifica el polipéptido hCD19CAR. El casete de expresión puede estar comprendido en un vector no viral, como un transposón, o un transposón humano, o una variante recombinante del mismo. El casete de expresión puede estar comprendido en un vector viral o una variante recombinante del mismo. El casete de expresión puede integrarse genómicamente o mantenerse o expresarse episómicamente a partir de ARNm.

En otro aspecto más, la presente descripción incluye un procedimiento para fabricar una célula T que expresa un CAR específico de CD19 humano que comprende introducir un casete de expresión en la célula, donde el casete de expresión codifica un polipéptido que comprende un dominio de unión a CD19 extracelular humano, un dominio transmembrana y uno o más dominios de señalización intracelular. El procedimiento puede comprender además estimular las células con células CD19+ , CD19 recombinante o un anticuerpo contra el receptor para hacer que las células proliferen, maten, y/o hagan citocinas; por ejemplo, las células pueden ser estimuladas para que proliferen o se expandan con células presentadoras de antígenos artificiales CD19+ .

En ciertos aspectos, la presente descripción incluye procedimientos para tratar una enfermedad humana asociada con una célula que expresa CD19 endógena que comprenden infundir a un paciente una cantidad de una célula recombinante que expresa un CAR específico de CD19 humano suficiente para tratar la enfermedad, donde el CAR específico de CD19 humano comprende un dominio de unión extracelular de CD19 humano, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular. La afección puede ser linfoma, leucemia, linfoma no Hodgkin, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crónica, leucemia linfocítica crónica o enfermedades autoinmunes asociadas a células B, por ejemplo.

En esta invención también se describe la generación de un receptor de antígeno quimérico específico de CD19 humano (hCD19RCD28 o hCAR). En ciertos aspectos, las células recombinantes que expresan hCAR han mejorado la persistencia in vivo y la eficacia antitumoral. El hCAR humano tiene una inmunogenicidad reducida en comparación con el hCAR murino, que comprende un segmento scFv derivado de un anticuerpo monoclonal (mAb) específico de CD19 murino. Los efectos antitumorales pueden aumentarse mediante células modificadas genéticamente, que se vuelven específicas para CD19. Normalmente, la especificidad de las células T se consigue mediante la electrotransferencia de un casete de expresión que codifica hCAR.

El hCAR puede ser un receptor quimérico que comprende uno o más endodominios de activación, tales como un dominio de activación derivado de CD3-Z. Motivos de activación de células T adicionales incluyen, pero no se limitan a, CD28, CD27, OX-40, DAP10 y 4-1BB. En ciertos aspectos, el dominio de activación también puede incluir una transmembrana CD28 y/o dominio de activación. En un aspecto adicional, se incorpora la región codificadora de hCAR y/o el codón del casete de expresión optimizado para la expresión en células y sujetos humanos, p.ej., en un aspecto de la presente descripción, se incorpora la región scFv obtenida a partir de secuencias VH y VL de anticuerpos humanos específicos de CD19 en el segmento de unión de CD19 del hCAR (por ejemplo, ver la Patente EE. UU. No.

7,109,304). En otro aspecto de la presente descripción, el casete de expresión de hCAR se mantiene episómicamente o se integra en el genoma de la célula recombinante. En ciertos aspectos, el casete de expresión está comprendido en un ácido nucleico capaz de integrarse usando un mecanismo de integrasa, un vector viral, como un vector retroviral, o un vector no viral, como un mecanismo de transposón. En otros aspectos de la presente descripción, el casete de expresión se incluye en un ácido nucleico basado en transposones. En una realización particular, el casete de expresión es parte de un sistema de dos componentes Bella Durmiente (SB) o piggyBac que utiliza un transposón y transposasa para mejorar la transferencia de genes no virales.

Células que expresan hCAR recombinante se pueden expandir numéricamente a números clínicamente significativos. Un ejemplo de tal expansión usa células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC). Las células que expresan hCAR recombinante pueden verificarse e identificarse mediante citometría de flujo y análisis de Western blot. Células T que expresan hCAR recombinantes, que expresan un CAR específico de CD19, pueden reconocer y destruir células diana que expresan CD19. En un aspecto adicional, hCAR se puede expresar en células Universales que se pueden infundir a través de las barreras de trasplante para ayudar a impedir la inmunogenicidad. El hCAR se puede utilizar junto con genes humanos para la obtención de imágenes (por ejemplo, mediante tomografía por emisión de positrones, PET) y la ablación condicional de células T, en caso de citotoxicidad. Las células recombinantes descritas en esta invención pueden usarse en terapias celulares específicas de CD19.

V. Células T receptoras de antígeno quimérico dirigidas a HERV ejemplares

Durante el proyecto del genoma humano, se descubrió que un conjunto de retrovirus antiguo denominado retrovirus endógeno humano (HERV) se integraba de forma estable en el genoma humano y formaba el 8,5% del genoma humano total. Entre los HERV, HERV-K se encontró como una variante alélica oncogénica involucrada en melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, teratocarcinoma y cáncer de próstata junto con diversas enfermedades autoinmunes como la esclerosis múltiple y la artritis reumatoide (Buscher y col., 2005; Dreyfus, 2011).; Seifarth y col., 1995). El potencial oncogénico de h Er V-K es contribuido por la envoltura (env) y la proteína GAG (Rec). Estudios recientes han demostrado que la expresión de la proteína env de HERV-K se realiza exclusivamente en la superficie de las células tumorales y no en las células cutáneas normales (Wang-Johanning y col., 2008; Li y col., 2010). Se encontró que la expresión de la proteína env de HERV-K aumenta con melanoma tipo III y tipo IV más agresivo y metastásico que el melanoma tipo I menos agresivo y localizado (Buscher y col., 2005; Hahn y col., 2008; Serafino y col. , 2009). Esta expresión selectiva de la proteína env de HERV-K en células de melanoma se puede aprovechar como estrategia de tratamiento para pacientes con melanoma refractario o metastásico. Los pacientes con melanoma metastásico tienen un pobre pronóstico debido a la resistencia a las terapias convencionales como la quimioterapia, la radiación y la cirugía (Bhatia y col., 2009). Por tanto, se necesitan nuevas estrategias de tratamiento dirigidas para mejorar el resultado terapéutico.

Para generar una terapia con células T para el melanoma, los inventores seleccionaron un TAA derivado de HERV, cuyo genoma se integró de manera estable en los humanos hace millones de años. Para apuntar a HERK-K, las células T se diseñaron para expresar un CAR específico para la proteína env reemplazando el exodominio de unión al antígeno del CAR específico de CD19 con la secuencia de anticuerpo monocatenario (scFv) de un anticuerpo monoclonal específico de env anti-HERV-K. Este nuevo CAR se clonó como un transposón en el sistema SB. Plásmidos de ADN que codifican para la transposasa CAR y SB específica de env de HERV-K se electro-transfirieron a células T humanas primarias y células T CAR+ genéticamente modificadas se propagaron selectivamente en células presentadoras de antígenos artificiales (aAPC) irradiadas que expresan env de HERV-K y moléculas coestimuladoras de células T deseadas. Después de co-cultivo en aAPC irradiadas con y, 95% de células T CD3+ expresaron el CAR y estas células T CAR+ fueron capaces de matar específicamente a h Er V-K env+, paro no a HERV-K env-, dianas tumorales in vitro en contraste con células T CAR+ . Especificidad de estas células T CAR+ se demostró que las células T expresan la proteína env de HERV-K en células de ratón EL4 negativas al antígeno que se sacrificaron preferentemente en comparación con las células parentales de HERV-K env- EL4 y la eliminación de HERV-K mediante ARNhc (direccionamiento específico para el ARN env de HERV-K) en las células A888-mel dieron como resultado una muerte reducida en comparación con las parentales. Las células T CAR+ también tuvieron éxito en la reducción del crecimiento tumoral y la metástasis de las células tumorales A375-supermetastásicas (SM) de los pulmones al hígado in vivo.Los ratones con tumor que reciben las células T CAR+ vivieron más tiempo y parecían más saludables que el grupo de ratones con tumor solo. Por tanto, las células T que se dirigen a un retrovirus activo se pueden utilizar como inmunoterapia para el melanoma, utilizando una estrategia que tiene un atractivo traslacional para los ensayos clínicos.

La evolución clonal de las células del melanoma puede hacer que la terapia con TCR sea inefectiva debido a su dependencia del complejo CMH para el reconocimiento de tumores. Un CAR puede superar esta evolución clonal de células de melanoma mediante la muerte celular mediada de una manera independiente de MHN, a diferencia de la terapia de células T basada en TCR. El antígeno HERV-K se expresa solo en la superficie de la célula tumoral y no en células normales. Por lo tanto, células T CAR+ específicas de HERV-K pueden apuntar específicamente y abolir las células tumorales sin efectos secundarios adversos. Se pueden infundir para tratar neoplasias malignas HERV-K+ en muchas etapas a lo largo del espectro del cáncer, desde la enfermedad mínima residual hasta los tumores masivos hasta la enfermedad refractaria a las terapias convencionales.

HERV-K se expresa en muchos tipos de tumores, incluidos, entre otros, melanoma (Muster y col., 2003; Buscher y col., 2005; Li y col., 2010; Reiche y col., 2010; Serafino y col., 2009), cáncer de mama (Patience y col., 1996; Wang-Johanning y col., 2003; Seifarth y col., 1995), cáncer de ovario (Wang-Johanning y col., 2007), linfoma (Contreras-Galindo y col., 2008), y teratocarcinoma (Bieda y col., 2001; Lower y col., 1993). Además, células infectadas, incluidas las infectadas por VIH (Jones y col., 2012), también expresan HERV-K. Esto brinda una oportunidad atractiva de que un diseño de CAR dirigido a HERV-K pueda usarse para tratar una variedad de cánceres e infecciones.

VI. Células T Receptoras de Antígeno Quimérico que Coexpresan IL-15 Unidas a Membrana Ejemplares para Dirigirse a una Enfermedad Mínimamente Residual

El tratamiento quimioterapéutico de la leucemia linfoblástica aguda (LLA-B) de linaje B en adultos y niños tiene tasas de recaída de la enfermedad del 65% y 20%, respectivamente, debido a la enfermedad residual farmacorresistente. La alta incidencia de recaída de LLA-B, especialmente en grupos de pronóstico desfavorable, ha impulsado el uso de terapias de base inmunitaria mediante el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (TCMH). Esta terapia depende de las células alorreactivas presentes en el injerto del donante para la erradicación de las células leucémicas restantes, o enfermedad residual mínima, para mejorar la supervivencia libre de enfermedad. Las infusiones de linfocitos de donantes se han utilizado para mejorar la capacidad de las células T injertadas para atacar la LLA-B residual después del TCMH alogénico, pero esta estrategia de tratamiento para estos pacientes logra una tasa de remisión inferior al 10% y se asocia con un alto grado de morbilidad y mortalidad de la frecuencia y gravedad de la enfermedad de injerto contra huésped (EICH). Dado que la recaída es un problema común y letal en estas neoplasias malignas refractarias, la terapia adoptiva con células T derivadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) después de un TCMH puede usarse para aumentar el efecto antitumoral o el efecto injerto contra leucemia (GVL), reorientando la especificidad de las células T del donante a un antígeno asociado a tumor (TAA).

Se han desarrollado numerosas formulaciones de CAR específicas para antígenos diana, con CAR específico de CD19 dirigido al antígeno CD19 en la superficie celular de LlA-B. Observar la persistencia a largo plazo de células CAR+ y lograr respuestas duraderas en pacientes a través de diferentes protocolos clínicos sigue siendo un problema crítico que dificulta la eficacia terapéutica de las terapias basadas en CAR.

Actualmente, las células T modificadas con CAR dependen de la obtención de señales de supervivencia a través de CAR, lo que se produce solo al encontrarse con el antígeno tumoral. En situaciones clínicas en las que estas células T modificadas con CAR se infunden en pacientes con enfermedad voluminosa, existe un amplio antígeno tumoral presente para proporcionar suficiente activación y señalización de supervivencia a través de CAR. Sin embargo, los pacientes con LLA-B recidivante a menudo se acondicionan con quimioterapia mieloablativa seguida de TCMH y presentan enfermedad residual mínima (ERM). En este caso, los pacientes tienen una carga tumoral baja y el nivel mínimo de TAA restringe severamente la señalización mediada por CAR necesaria para soportar las células T infundidas comprometiendo consecuentemente el potencial terapéutico. Se anticiparía un medio alternativo independiente de CAR para mejorar la persistencia de las células T para mejorar el injerto de células T modificadas con CAR.

Las citocinas en la familia común de receptores de cadena gamma (yC) son moléculas coestimuladoras importantes para las células T que son críticas para la función linfoide, la supervivencia y la proliferación. IL-15 posee varios atributos que son deseables para la terapia adoptiva. La IL-15 es una citocina homeostática que da soporte a la supervivencia de las células T citotóxicas de memoria de larga duración, promueve la erradicación de tumores establecidos aliviando la supresión funcional de las células residentes en el tumor e inhibe la AICD.

La IL-15 está restringida en los tejidos y solo en condiciones patológicas se observa a cualquier nivel en el suero o sistémicamente. A diferencia de otras citocinas yC que se secretan en el medio circundante, la célula productora transpresenta IL-15 a las células T en el contexto del receptor alfa de IL-15 (IL-15Ra). El mecanismo de entrega único de esta citocina a las células T y otras células que responden: (i) está altamente dirigido y localizado, (ii) aumenta la estabilidad y la vida media de IL-15, y (iii) produce una señalización cualitativamente diferente a la que se logra por IL-15 soluble.

En un aspecto, la presente descripción es un procedimiento para generar células T modificadas con receptor de antígeno quimérico (CAR) con potencial in vivo de larga duración con el fin de tratar, por ejemplo, pacientes con leucemia que presentan enfermedad residual mínima (ERM). En conjunto, este procedimiento describe cómo moléculas solubles como las citocinas pueden fusionarse a la superficie celular para aumentar el potencial terapéutico. El núcleo de este procedimiento se basa en la co-modificación de las células T CAR con una muteína de citocina humana de la interleucina-15 (IL-15), en lo sucesivo denominada mIL15. La proteína de fusión mIL15 está compuesta por una secuencia de ADNc de codón optimizado de IL -15 fusionada al receptor alfa de IL15 de longitud completa a través de un enlazador serina-glicina flexible. Esta muteína de IL-15 se diseñó de tal manera que: (i) restrinja la expresión de mIL15 a la superficie de las células T CAR+ para limitar la difusión de la citocina a entornos in vivo sin diana, mejorando así potencialmente su perfil de seguridad ya que la administración de citocinas solubles exógenas ha conducido a toxicidades; y (ii) presente IL-15 en el contexto de IL-15Ra para imitar la señalización cualitativa y fisiológicamente relevante, así como la estabilización y el reciclaje del complejo IL-15/IL-15Ra para una vida media de citocinas más prolongada. Células T que expresan mIL15 son capaces de señalizar citocinas de soporte continuo, lo cual es fundamental para su supervivencia después de la infusión. Las células T mIL15+CAR+ generadas por la modificación genética del Sistema Bella Durmiente no viral y la posterior expansión ex vivo en una plataforma clínicamente aplicable produjeron un producto de infusión de células T con una persistencia mejorada después de la infusión en modelos murinos con una carga tumoral alta, baja o nula. Además, las células T mIL15+CAR+ también demostraron una eficacia antitumoral mejorada en los modelos de carga tumoral alta o baja.

La persistencia mejorada y la actividad antitumoral de células T mIL15+CAR+ sobre células T CAR+ en el modelo de alta carga tumoral indican que células T mIL15+CAR+ pueden ser más eficaces que las células T CAR+ en el tratamiento de pacientes con leucemia con enfermedad activa en los que prevalece la carga tumoral. Por lo tanto, células T mIL15+CAR+ podrían suplantar las células T CAR+ en terapia adoptiva en la más amplia de las aplicaciones. La capacidad de las células T mIL15+CAR+ para sobrevivir independientemente de la señalización de supervivencia a través del CAR permite que estas células T modificadas persistan después de la infusión a pesar de la falta de antígeno tumoral. En consecuencia, se prevé que esto genere el mayor impacto en la eficacia terapéutica en un entorno de tratamiento de ERM, especialmente en pacientes que han recibido quimioterapia mieloablativa y trasplante de células madre hematopoyéticas. Estos pacientes recibirían transferencia de células T adoptivas con células T mIL15+CAR+ para tratar su ERM e impedir recaídas.

Las citocinas unidas a membranas, como mIL15, tienen amplias implicaciones. Además de la IL-15 unida a la membrana, se prevén otras citocinas unidas a la membrana. Las citocinas unidas a la membrana también pueden extenderse a la expresión de la superficie celular de otras moléculas asociadas con la activación y propagación de células utilizadas para aplicaciones en humanos. Estos incluyen, pero no se limitan a, citocinas, quimiocinas y otras moléculas que contribuyen a la activación y proliferación de células utilizadas para aplicaciones en humanos.

Las citocinas unidas a la membrana, como mIL15, pueden usarse ex vivo para preparar células para aplicaciones humanas y pueden estar en células infundidas (p.ej., células T) usadas para aplicaciones humanas. Por ejemplo, la IL-15 unida a la membrana se puede expresar en células presentadoras de antígenos artificiales (aAPC), como las derivadas de K562, para estimular las células T y las células NK (así como otras células) para su activación y/o proliferación. La población de células T activadas/propagadas por mIL15 en aAPC incluye linfocitos modificados genéticamente, pero también linfocitos infiltrantes de tumores y otras células inmunes. Estas aAPC no se infunden. Por el contrario, mIL15 (y otras moléculas unidas a la membrana) se pueden expresar en células T y otras células que se infunden.

La eficacia terapéutica del tratamiento de la ERM con células T modificadas con CAR se ve obstaculizada por la falta de persistencia después de la transferencia adoptiva de las células T. La capacidad de las células mIL15+CAR+ para sobrevivir a largo plazo in vivo independientemente del antígeno tumoral indica un gran potencial para el tratamiento de pacientes con ERM. En este caso, mIL15 y las células T persistentes que soporta abordarían una necesidad, ya que las estrategias actuales para los pacientes con ERM son insuficientes. La persistencia de las células T y otros linfocitos que se infunden en pacientes con ERM se aplica más allá de las células T CAR+ . Cualquier célula inmunitaria que se utilice para tratar e impedir neoplasias, infecciones o enfermedades autoinmunes debe poder persistir a largo plazo si se quiere lograr un impacto terapéutico continuo. Por tanto, la activación de las células T para su persistencia más allá de la señal derivada del receptor de células T endógeno o un inmunorreceptor introducido es importante para muchos aspectos de la inmunoterapia adoptiva. Por tanto, la expresión de citocinas unidas a la membrana puede usarse para aumentar el potencial terapéutico y la persistencia de las células T y otras células inmunes infundidas para una variedad de afecciones patológicas.

Los inventores han generado una muteína de IL-15 que se expresa como una proteína de fusión unida a la membrana de IL-15 e IL-15Ra (mIL15) en células T CAR+ . La construcción de mIL15 se co-transfirió con un CAR específico de CD19 (en el día 0) a células T humanas primarias como dos plásmidos de transposón de ADN de la Bella Durmiente . Números clínicamente relevantes de células T mIL15+CAR+ se generaron por co-cultivo en células presentadoras de antígeno artificial CD19+ e IL-21 suplementada. La señalización a través del complejo del receptor de IL-15 en las células T modificadas genéticamente se validó mediante la fosforilación de STAt 5 (pSTAT5) y estas células T demostraron una lisis específica redirigida de dianas tumorales CD19+ equivalentes a células T CAR+ . Además, después de la retirada del antígeno, la señalización generada por mIL15 aumentó la prevalencia de células T con un fenotipo menos diferenciado/joven que poseía atributos asociados a la memoria, incluidos marcadores de superficie celular específicos, factores de transcripción y la capacidad de secretar IL-2. Estas características son rasgos deseables en las células T utilizadas en la transferencia adoptiva, ya que están correlacionadas con subconjuntos de células T con capacidad demostrada para persistir a largo plazo in vivo.En ratones NSG inmunodeprimidos que portan una leucemia CD19+ diseminada, las células T mIL15+CAR+ demostraron persistencia y un efecto antitumoral mientras que su contraparte de células T CAR+ no pudo mantener una persistencia significativa a pesar de la presencia de TAA. En un modelo de ratón preventivo (NSG) donde células T mIL15+/_CAR+ se injertaron por primera vez durante seis días, seguida de la introducción de una leucemia CD19+ diseminada, se determinó que solo las células T mIL15+CAR+ persistían y también impedían el injerto tumoral. Para probar si las células T mIL15+CAR+ fueron capaces de persistir independientemente de la estimulación de TAA, células T mIL15+/_CAR+ se transfirieron adoptivamente a ratones NSG sin tumor. Sólo las células mIL15+CAR+ fueron capaces de persistir en este entorno in vivo sin soporte de citocinas exógenas o la presencia de CD19 TAA. Estos datos demuestran que mIL15 se puede coexpresar en células T CAR.+ dando como resultado una mayor persistencia in vivo sin necesidad de TAA o soporte de citocinas exógenas En resumen, esta molécula de fusión de citocinas: (i) proporciona señales estimulantes a través de pSTAT5 que conducen a una mayor persistencia de células T in vivo mientras se mantiene la funcionalidad específica del tumor, (ii) mantiene subconjuntos de células T que promueven un fenotipo similar a la memoria, (iii) elimina la necesidad y el costo de IL-2 de grado clínico para la expansión y persistencia de células T in vitro y in vivo , y (iv) mitiga la necesidad de IL-15 soluble de grado clínico.

VII. Sistema Inmunitario e Inmunoterapia

En algunos aspectos de la presente descripción, un trastorno médico debe tratarse mediante la transferencia de una célula T redirigida que provoca una respuesta inmunitaria específica. En un aspecto de la presente descripción, la malignidad o el trastorno del linaje de células B se trata mediante la transferencia de una célula T redirigida que provoca una respuesta inmunitaria específica. Por tanto, es necesaria una comprensión básica de la respuesta inmunológica.

Las células del sistema inmunitario adaptativo son un tipo de leucocito, llamado linfocito. Las células B y las células T son los principales tipos de linfocitos. Las células B y las células T se derivan de los mismos citoblastos hematopoyéticos pluripotentes, y son indistinguibles entre sí hasta que se activan. Las células B desempeñan un papel importante en la respuesta inmunitaria humoral, mientras que las células T están íntimamente implicadas en las respuestas inmunitarias mediadas por células. Las células T se pueden distinguir de otros tipos de linfocitos, tales como las células B y las células n K, por la presencia de un receptor especial sobre su superficie celular llamado el receptor de células T (TCR). En casi todos los demás vertebrados, las células B y células T son producidas por los citoblastos en la médula ósea. Las células T viajan y se desarrollan en el timo, del cual deriva su nombre. En los seres humanos, se recircula aproximadamente el 1% -2% del conjunto de linfocitos cada hora para optimizar las oportunidades para que los linfocitos específicos de antígeno encuentren su antígeno específico dentro de los tejidos linfoides secundarios.

Los linfocitos T surgen de las células madre hematopoyéticas en la médula ósea, y típicamente migran a la glándula del timo para madurar. Las células T expresan un receptor de unión a antígeno único sobre su membrana (receptor de células T), que solo puede reconocer el antígeno en asociación con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) sobre la superficie de otras células. Existen al menos dos poblaciones de células T, conocidas como células T cooperadoras y células T citotóxicas. Las células T cooperadoras y las células T citotóxicas se distinguen principalmente por su exhibición de las glicoproteínas unidas a membrana CD4 y CD8, respectivamente. Las células T cooperadoras secretan diversas linfocinas que son cruciales para la activación de las células B, las células T citotóxicas, los macrófagos y otras células del sistema inmunitario. En contraste, las células T citotóxicas que reconocen un complejo antígeno-CMH proliferan y se diferencian en células efectoras llamadas linfocitos T citotóxicos (LTC). Los LTC eliminan las células del cuerpo que exhiben el antígeno, tales como las células infectadas por virus y las células tumorales, al producir sustancias que dan como resultado la lisis celular. Las células citolíticas naturales (o células NK) son un tipo de linfocitos citotóxicos que constituyen un componente importante del sistema inmunitario innato. Las células n K desempeñan un papel importante en el rechazo de tumores y células infectadas por virus. Las células matan al liberarse pequeños gránulos citoplasmáticos de proteínas llamadas perforina y granzima, que causan que la célula diana muera por apoptosis.

Las células presentadoras de antígenos, que incluyen macrófagos, linfocitos B y células dendríticas, se distinguen por su expresión de una molécula de CMH particular. Las APC internalizan el antígeno y reexpresan una parte de ese antígeno, junto con la molécula de CMH, sobre su membrana celular externa. El complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) es un gran complejo genético con múltiples loci. Los loci del CMH codifican dos clases principales de moléculas de membrana de CMH, a las que se hace referencia como CMH de clase I y clase II. Los linfocitos T cooperadores generalmente reconocen el antígeno asociado con las moléculas de CMH de clase II, y los linfocitos T citotóxicos reconocen el antígeno asociado con las moléculas de CMH de clase I. En seres humanos, se hace referencia al CMH como el complejo HLA y en los ratones como el complejo H-2.

El receptor de células T, o TCR, es una molécula encontrada sobre la superficie de los linfocitos T (o células T) que generalmente es responsable de reconocer los antígenos unidos a las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Es un heterodímero que consiste en una cadena alfa y beta en el 95% de las células T, mientras que el 5% de las células T tienen TCR que consisten en cadenas gamma y delta. El acoplamiento del TCR con el antígeno y el CMH da como resultado la activación de sus linfocitos T a través de una serie de eventos bioquímicos mediados por enzimas asociadas, correceptores y moléculas accesorias especializadas. En inmunología, el antígeno CD3 (CD significa cluster de diferenciación) es un complejo proteico compuesto por cuatro cadenas distintas (CD3y, CD36 y dos veces CD3s) en mamíferos, que se asocian con moléculas conocidas como receptor de células T (TCR) y la cadena Z para generar una señal de activación en los linfocitos T. Las moléculas de TCR, cadena Z y CD3 juntas comprenden el complejo TCR. Las cadenas CD3y, CD36 y CD3s son proteínas de la superficie celular muy relacionadas de la superfamilia de inmunoglobulinas que contienen un único dominio de inmunoglobulina extracelular. La región transmembrana de las cadenas CD3 está cargada negativamente, una característica que permite que estas cadenas se asocien con las cadenas TCR cargadas positivamente (TCRa y TCRp). Las colas intracelulares de las moléculas de CD3 contienen un único motivo conservado conocido como motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina o ITAM para abreviar, que es esencial para la capacidad de señalización del TCR.

CD28 es una de las moléculas expresadas en las células T que proporcionan señales coestimuladoras, que son necesarias para la activación de las células T. CD28 es el receptor para B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86). Cuando se activa por ligandos de receptor tipo Toll, la expresión de B7.1 se regula al alza en las células presentadoras de antígeno (APC). La expresión de b7.2 en células presentadoras de antígeno es constitutiva. CD28 es el único receptor B7 expresado constitutivamente en células T sin tratar. La estimulación a través de CD28 además del TCR puede proporcionar una potente señal coestimuladora a las células T para la producción de diversas interleucinas (IL-2 e IL-6 en particular).

La estrategia de aislar y expandir células T específicas de antígeno como una intervención terapéutica para enfermedad humana ha sido validada en ensayos clínicos (Riddell y col., 1992; Walter y col., 1995; Heslop y col., 1996).

Las células B malignas parecen ser una diana excelente para las células T redirigidas, ya que las células B pueden servir como células presentadoras de antígenos inmunoestimuladores para las células T (Glimcher y col., 1982). El linfoma, en virtud de su tropismo de los ganglios linfáticos, está anatómicamente idealmente situado para el reconocimiento y la eliminación mediados por células T. La localización de células T infundidas en los ganglios linfáticos en grandes cantidades se ha documentado en pacientes con VIH que reciben infusiones de clones CTL CD8+ específicos de VIH. En estos pacientes, la evaluación del material de biopsia de los ganglios linfáticos reveló que los clones infundidos constituían aproximadamente 2%-8% de células CD8+ de los ganglios linfáticos. La localización de los ganglios linfáticos podría mejorarse aún más mediante la cotransfección de células T con una construcción de ADNc que codifica la molécula de selección L bajo un promotor constitutivo, ya que esta molécula de adhesión dirige las células T circulantes de regreso a los ganglios linfáticos y se regula a la baja mediante la expansión in vitro (Chao y col., 1997). En esta invención también se describe un procedimiento para tratar una enfermedad humana asociada con una célula que expresa CD19 endógeno que comprende infundir a un paciente una dosis terapéuticamente efectiva de la célula que expresa CAR específica de CD19 humano recombinante como se describió anteriormente. La condición de enfermedad humana asociada con una célula que expresa CD19 endógeno puede seleccionarse del grupo que consiste en linfoma, leucemia, linfoma no Hodgkin, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crónica, leucemia linfocítica crónica y enfermedades autoinmunes asociadas a células B.

La leucemia es un cáncer de la sangre o la médula ósea y se caracteriza por una proliferación anormal (producción por multiplicación) de glóbulos, generalmente glóbulos blancos (leucocitos). Es parte del amplio grupo de enfermedades llamadas neoplasias hematológicas. La leucemia es un término amplio que cubre un espectro de enfermedades. La leucemia se divide clínica y patológicamente en sus formas aguda y crónica.

La leucemia aguda se caracteriza por la rápida proliferación de células sanguíneas inmaduras. Este apiñamiento hace que la médula ósea no pueda producir células sanguíneas sanas. Las formas agudas de leucemia pueden producirse en niños y adultos jóvenes. De hecho, es una causa de muerte más común para los niños en los EE. UU. que cualquier otro tipo de enfermedad maligna. Se requiere tratamiento inmediato en la leucemia aguda debido a la rápida progresión y acumulación de las células malignas, que a continuación se derraman en el torrente sanguíneo y se diseminan a otros órganos del cuerpo. La afectación del sistema nervioso central (SNC) es poco común, aunque en ocasiones la enfermedad puede causar parálisis de nervios craneales. La leucemia crónica se distingue por la acumulación excesiva de células sanguíneas relativamente maduras, pero aún anormales. Normalmente, las células tardan meses o años en progresar, y se producen a un ritmo mucho más alto que las células normales, lo que da como resultado muchos glóbulos blancos anormales en la sangre. La leucemia crónica se produce principalmente en personas mayores, pero teóricamente puede producirse en cualquier grupo de edad. Mientras que la leucemia aguda debe tratarse de inmediato, las formas crónicas a veces se controlan durante algún tiempo antes del tratamiento para garantizar la máxima eficacia de la terapia.

Además, las enfermedades se clasifican en linfocíticas o linfoblásticas, que indican que el cambio canceroso tuvo lugar en un tipo de célula de la médula ósea que normalmente pasa a formar linfocitos, y mielógenas o mieloides, que indican que el cambio canceroso tuvo lugar en un tipo de célula de la médula ósea que normalmente pasa a formar glóbulos rojos, algunos tipos de glóbulos blancos y plaquetas (consultar células linfoides frente a células mieloides).

La leucemia linfocítica aguda (también conocida como leucemia linfoblástica aguda o LLA) es el tipo más común de leucemia en los niños pequeños. Esta enfermedad también afecta a los adultos, especialmente a los mayores de 65 años. La leucemia linfocítica crónica (CLL) afecta con mayor frecuencia a adultos mayores de 55 años. A veces se produce en adultos más jóvenes, pero casi nunca afecta a los niños. La leucemia mielógena aguda (también conocida como leucemia mieloide aguda o LMA) se produce con más frecuencia en adultos que en niños. Este tipo de leucemia se denominaba anteriormente "leucemia no linfocítica aguda". La leucemia mielógena crónica (LMC) se presenta principalmente en adultos. Un número muy reducido de niños también desarrolla esta enfermedad.

El linfoma es un tipo de cáncer que se origina en los linfocitos (un tipo de glóbulo blanco en el sistema inmunológico de los vertebrados). Hay muchos tipos de linfomas. Según los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., los linfomas representan aproximadamente el cinco por ciento de todos los casos de cáncer en los Estados Unidos, y el linfoma de Hodgkin en particular representa menos del uno por ciento de todos los casos de cáncer en los Estados Unidos. Debido a que el sistema linfático es parte del sistema inmunológico del cuerpo, los pacientes con un sistema inmunológico debilitado, como por una infección por VIH o por ciertos fármacos o medicamentos, también tienen una mayor incidencia de linfoma.

En los siglos 19 y 20 la aflicción se llamaba Enfermedad de Hodgkin, como fue descubierta por Thomas Hodgkin en 1832. Coloquialmente, el linfoma se clasifica ampliamente como linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin (todos los demás tipos de linfoma). La clasificación científica de los tipos de linfoma es más detallada. Aunque las clasificaciones más antiguas se referían a los linfomas histiocíticos, estos se reconocen en clasificaciones más nuevas como de linaje de células B, T o NK.

La enfermedad autoinmune, o autoinmunidad, es la incapacidad de un organismo para reconocer sus mismas partes constituyentes (hasta los niveles submoleculares) como "propias", lo que da como resultado una respuesta inmunitaria contra sus mismas células y tejidos Cualquier enfermedad que dé como resultado tal respuesta inmunitaria aberrante se denomina enfermedad autoinmune. Ejemplos destacados incluyen enfermedad celíaca, diabetes mellitus tipo 1 (IDDM), lupus eritematoso sistémico (LES), síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple (EM), tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, púrpura trombocitopénica idiopática y artritis reumatoide (AR).

Las enfermedades inflamatorias, incluidas las enfermedades autoinmunes, también son una clase de enfermedades asociadas con los trastornos de las células B. Ejemplos de enfermedades autoinmunes incluyen, pero sin limitación, púrpura trombocitopénica idiopática aguda, púrpura trombocitopénica idiopática crónica, dermatomiositis, corea de Sydenham, miastenia grave, lupus eritematoso sistémico, nefritis por lupus, fiebre reumática, síndromes poliglandulares, penfigoide ampolloso, diabetes mellitus, púrpura de Henoch-Schonlein, nefritis postestreptocócica, eritema nodoso, arteritis de Takayasu, enfermedad de Addison, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, sarcoidosis, colitis ulcerosa; eritema multiforme, nefropatía por IgA, poliarteritis nodosa, espondilitis anquilosante, síndrome de Goodpasture, tromboangitis obliterante, síndrome de Sjogren, cirrosis biliar primaria, tiroiditis de Hashimoto, tirotoxicosis, esclerodermia, hepatitis activa crónica, polimiositis/dermatomiositis, policondritis, pénfigo vulgar, granulomatosis de Wegener, nefropatía membranosa, esclerosis lateral amiotrófica, tabes dorsal, arteritis de células gigantes/polimialgia, anemia perniciosa, glomerulonefritis progresiva rápida, psoriasis y alveolitis fibrosante. Los tratamientos más habituales son los corticosteroides y los fármacos citotóxicos, que pueden resultar muy tóxicos. Estos fármacos también inhiben todo el sistema inmunológico, pueden provocar una infección grave y tener efectos adversos en la médula ósea, el hígado y los riñones. Otras terapias que se han utilizado para tratar enfermedades autoinmunes de Clase III hasta la fecha se han dirigido contra las células T y los macrófagos. Existe la necesidad de procedimientos más efectivos para tratar enfermedades autoinmunes, particularmente enfermedades autoinmunes de Clase III.

VIII. Células Presentadoras de Antígeno Artificial

En algunos casos, las aAPC son útiles para preparar composiciones terapéuticas y productos de terapia celular conforme descrito en esta invención. Para obtener una guía general sobre la preparación y el uso de sistemas presentadores de antígeno, ver, p.ej., Pat. EE. UU. Nos. 6.225.042, 6.355.479, 6.362.001 y 6.790.662; Publicación de Solicitud de Patente EE. UU. Nos. 2009/0017000 y 2009/0004142; y Publicación Internacional No. WO2007/103009).

Las aAPC se incuban típicamente con un péptido de una longitud óptima que permite la unión directa del péptido a la molécula de CMH sin procesamiento adicional. Alternativamente, las células pueden expresar un antígeno de interés (es decir, en el caso de reconocimiento de antígeno independiente de CMH). Además de las moléculas de péptido-CMH o antígenos de interés, los sistemas de aAPC también pueden comprender al menos una molécula auxiliar exógena. Se puede emplear cualquier número y combinación adecuados de moléculas auxiliares. La molécula auxiliar se puede seleccionar de entre moléculas auxiliares tales como moléculas coestimulantes y moléculas de adhesión. Moléculas coestimulantes ejemplares incluyen CD70 y B7.1 (B7.1 se conocía anteriormente como B7 y también se conocía como CD80) que, entre otras cosas, se unen a las moléculas CD28 y/o CTLA-4 sobre la superficie de células T, afectando así, por ejemplo, a la expansión de células T, la diferenciación de Th1, la supervivencia a corto plazo de células T y la secreción de citocinas tales como la interleucina (IL)-2 (ver Kim y col., 2004, Nature, Vol. 22(4), pp. 403 410). Moléculas de adhesión pueden incluir glicoproteínas de unión a carbohidratos tales como selectinas, glicoproteínas de unión a transmembrana tales como integrinas, proteínas dependientes de calcio tales como cadherinas, y proteínas de la superfamilia de inmunoglobulina (Ig) transmembrana de un solo paso, tales como moléculas de adhesión intercelular (ICAM) que promueven, por ejemplo, el contacto célula a célula o célula a matriz. Moléculas de adhesión ejemplares incluyen LFA-3 e ICAM tales como ICAM-1. Técnicas, procedimientos y reactivos útiles para la selección, clonación, preparación y expresión de moléculas auxiliares ejemplares, incluyendo moléculas coestimulantes y moléculas de adhesión, se ejemplifican en, p.ej., Pat. EE. UU. Nos. 6.225.042, 6.355.479, y 6.362.001.

Células seleccionadas para convertirse en aAPC artificiales tienen preferiblemente deficiencias en el procesamiento intracelular de antígenos, el tráfico intracelular de péptidos y/o la carga intracelular de péptidos en moléculas de CMH de clase I o clase II, o son poiquilotérmicas (es decir., menos sensibles a la exposición a temperatura que las líneas celulares de mamíferos), o poseen tanto deficiencias como propiedades poiquilotérmicas. Preferiblemente, las células seleccionadas para convertirse en aAPC también carecen de la capacidad de expresar al menos una contrapartida endógena (p.ej., molécula de CMH de clase I o clase II endógena y/o moléculas auxiliares endógenas como se describió anteriormente) de la molécula de CMH de clase I o clase II exógena y componentes moleculares auxiliares que se introducen en las células. Además, aAPC, preferiblemente, retienen las deficiencias y las propiedades poiquilotérmicas que poseían las células antes de su modificación para generar las aAPC. aAPC ejemplares constituyen o se derivan de un transportador asociado con una línea celular deficiente de (TAP) en el procesamiento de antígenos, tal como una línea celular de insecto. Una línea de células de insecto poiquilotérmicas ejemplar es una línea celular de Drosophila, tal como una línea celular Schneider 2 (ver, p.ej. Schneider, J. Embryol. Exp. Morph. 1972 Vol 27, pp. 353-365). Se proporcionan procedimientos ilustrativos para la preparación, el crecimiento y el cultivo de células de Schneider 2 en las Pat. EE. UU. Nos. 6.225.042, 6.355.479, y 6.362.001.

En el contexto de un aspecto de la presente descripción, las aAPC también se someten a un ciclo de congelacióndescongelación. En un ciclo ejemplar de congelación y descongelación, las aAPC se pueden congelar al poner en contacto un recipiente adecuado que contenga las aAPC con una cantidad apropiada de nitrógeno líquido, dióxido de carbono sólido (es decir., hielo seco) o material similar a baja temperatura, de tal modo que se produzca la congelación rápidamente. Se descongelan a continuación las aAPC congeladas, ya sea retirando las aAPC del material a baja temperatura y exponiéndolas a condiciones de temperatura ambiente, o mediante un procedimiento de descongelación facilitado en el que se emplea un baño de agua tibia o una mano cálida para facilitar un menor tiempo de descongelación. Además, las aAPC pueden congelarse y almacenarse durante un período prolongado de tiempo antes de la descongelación. Las aAPC congeladas también pueden descongelarse y a continuación liofilizarse antes de su uso posterior. Preferiblemente, los conservantes que podrían afectar negativamente los procedimientos de congelación y descongelación, tales como el dimetilsulfóxido (DMSO), los polietilenglicoles (PEG) y otros conservantes, están ausentes en los medios que contienen aAPC que experimentan el ciclo de congelación y descongelación, o se retiran esencialmente, por ejemplo, mediante la transferencia de aAPC a medios que carecen esencialmente de tales conservantes.

En el contexto de otros aspectos preferidos de la presente descripción, el ácido nucleico xenogénico y el ácido nucleico endógeno a la aAPC pueden inactivarse por reticulación, de modo que esencialmente no se produce crecimiento celular, replicación o expresión de ácido nucleico después de la inactivación. En el contexto de un aspecto de esta descripción, las aAPC se inactivan en un punto posterior a la expresión de CMH y moléculas auxiliares exógenas, la presentación de tales moléculas sobre la superficie de las aAPCs y la carga de las moléculas de CMH presentadas con péptido o péptidos seleccionados. Por consiguiente, tales aAPC cargadas con péptidos inactivadas y seleccionadas, aunque se vuelven esencialmente incapaces de proliferar o replicarse, retienen la función de presentación del péptido seleccionado. Preferiblemente, la reticulación también produce aAPC que están esencialmente libres de microorganismos contaminantes, tales como bacterias y virus, sin disminuir sustancialmente la función de la célula presentadora de antígeno de las aAPC. Por tanto, la reticulación mantiene las importantes funciones de APC de las aAPC al tiempo que ayuda a aliviar las preocupaciones sobre la seguridad de un producto de terapia celular desarrollado utilizando las aAPC. Para procedimientos relacionados con reticulación y aAPC, ver por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente EE. UU. No. 20090017000.

IX. Kits como se describen y divulgan en esta invención

Cualquiera de las composiciones descritas en esta invención puede estar comprendida en un kit. En el contexto de algunos aspectos de la presente descripción, se proporcionan células T CAR alogénicas en el kit, que también puede incluir reactivos adecuados para expandir las células, tales como medios, aAPC, factores de crecimiento, anticuerpos (p.ej., para clasificar o caracterizar células T CAR) y/o plásmidos que codifican CAR o transposasa.

En un ejemplo no limitante, una construcción de expresión del receptor quimérico, uno o más reactivos para generar una construcción de expresión del receptor quimérico, células para la transfección de la construcción de expresión y/o uno o más instrumentos para obtener células alogénicas para la transfección de la construcción de expresión (tal instrumento puede ser una jeringa, pipeta, pinzas y/o cualquier aparato médicamente aprobado).

En el contexto de algunos aspectos de la presente descripción, una construcción de expresión para eliminar la expresión de TCR a/p endógeno, uno o más reactivos para generar la construcción, y/o células T CAR+ se proporcionan en el kit. En el contexto de algunos aspectos de la presente descripción, se incluyen construcciones de expresión que codifican nucleasa(s) con dedos de zinc.

En algunos aspectos, el kit comprende reactivos o aparatos para la electroporación de células.

Los kits pueden comprender una o más composiciones en alícuotas adecuadas como se describe en esta invención o reactivos para generar composiciones como se describe en esta invención. Los componentes de los kits pueden empaquetarse en medios acuosos o en forma liofilizada. Los medios de envase de los kits pueden incluir al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa u otro medio de envase en el que se pueda colocar un componente, y preferiblemente, una alícuota adecuada. Cuando hay más de un componente en el kit, el kit contendrá también generalmente un segundo, tercer u otro envase adicional en el que los componentes adicionales pueden colocarse por separado. Sin embargo, un vial puede contener varias combinaciones de componentes. Los kits como se describen en esta invención también incluirán típicamente un medio para contener la construcción del receptor quimérico y cualquier otro recipiente de reactivo en un confinamiento cerrado para la venta comercial. Tales envases pueden incluir envases de plástico moldeados por inyección o soplado en los que se retienen los viales deseados, por ejemplo.

X. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Se debe apreciar por aquellos expertos en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan las técnicas descubiertas por el inventor para funcionar correctamente en la práctica de la invención, y por lo tanto, se puede considera que constituyen los modos preferidos para su práctica.

Ejemplo 1 - Aplicación clínica de la Bella Durmiente y células presentadoras de antígenos artificiales para modificar genéticamente las células T de sangre periférica y del cordón umbilical - Materiales y Procedimientos

Aislamiento de Células Mononucleares (MNC) de PB y UCB. El Día 0 o antes, diluir PB con un volumen igual y UCB con cuatro volúmenes de PBS-EDTA. Lentamente, colocar una capa de sangre diluida (25 mL) en Ficoll (12 mL) en un tubo(s) de centrífuga de 50 mL y centrifugar a 400 x g durante 30-40 min (sin freno). Recoger y transferir la fracción de células mononucleares (interfaz) con una pipeta de transferencia a un tubo de centrífuga de 50 mL nuevo. Llevar el volumen hasta 50 mL con PBS-EDTA y centrifugar a 450 x g durante 10 min. Aspirar el sobrenadante y re suspender suavemente los sedimentos celulares en 50 mL de Medio de Cultivo Completo (CCM). Centrifugar a 400 x g durante 10 min. Re-suspender suavemente y agrupar los sedimentos celulares en CCM y realizar un conteo de células utilizando exclusión con azul tripán (Celómetro, programa PBMC). MNC se puede utilizar para electroporación (Nucleofección) o criopreservarse para uso futuro.

Preparación de Células T para Electroporación el Día 0. Si usa MNC criopreservadas, descongelar rápidamente suficientes células para una electroporación a escala completa (2 x 108 agregando ~20% para tener en cuenta la pérdida de células durante la centrifugación y 2 horas de incubación) en un baño de agua a 37°C. Re-suspender suavemente y transferir las células a un tubo de centrífuga de tamaño adecuado que contenga medio de cultivo RPMI completo sin fenol (PF-RPMI) precalentado, centrifugar a 200 x g durante 10 min (sin freno) y aspirar el sobrenadante. A continuación, y si se utilizan MNC recién aisladas, re-suspender la MNC en PF-RPMI, realizar un conteo de células (Celómetro) y transferir las células a un recipiente de cultivo celular de tamaño adecuado a una concentración de 106 células/ml. Incubar las células en una incubadora a 37°C/5% de CO2 humidificada durante 2 h ± 30 min. Transferir la MNC a un tubo de centrífuga estéril, girar a 200 x g durante 5 min (sin frenos), aspirar el sobrenadante y re-suspender suavemente y combinar los sedimentos celulares en PF-RPMI. Realizar un conteo celular (Celómetro) y calcular el volumen de suspensión celular requerido (2 x 108 MNC). Transferir el volumen calculado a un tubo de centrífuga estéril de 50 mL y centrifugar a 200 x g durante 10 min (sin freno). Aspirar el sobrenadante para que no queden restos de medio y re-suspender suavemente golpeando el lado del tubo.

Electroporación (Nucleofección) de MNC (Procedimiento a Escala Completa Usando 10 Cubetas) en el Día 0.

Incubar previamente una placa estéril de 12 pocillos con 10 pocillos que contienen 4 mL de PF-RPMI caliente en una incubadora a 37°C/5% de CO2. Preparar y precalentar el kit de células T humanas en Solución Nucleofector de Lonza (reconstituida según las instrucciones del fabricante, www.lonza.com) a temperatura ambiente en una Cabina de Bioseguridad (BSC). Preparar mezcla maestra de solución Nucleofector/ADN agregando 100 pL de solución Nucleofector suplementada, 15 pg de transposón (plásmido de ADN superenrollado designado como CD19RCD28/psBsO), y 5 pg de transposasa (plásmido de ADN superenrollado designado como pCMV-SB11) por reacción/cubeta. Dispersar el sedimento de células MCN golpeando suavemente el lateral del tubo de centrífuga y re suspender en mezcla maestra de solución de Nucleofección /ADN a una concentración celular final de 2 x 107 células/100 pL. Transferir con cuidado 100 pL de la suspensión celular a cada una de las diez cubetas de Nucleofección de Lonza, teniendo cuidado de evitar burbujas. Golpear ligeramente la cubeta una vez y electroporar usando el programa U-014 (para células T no estimuladas). Transferir las cubetas y la placa de 12 pocillos al BSC. Recoger las células electroporadas de cada cubeta usando una pipeta de transferencia de punta fina Amaxa agregando ~500 pL del medio de cultivo precalentado del pocillo correspondiente y devolver la placa a una incubadora a 37°C/5% de CO2 durante 2 h ± 30 min. Después de la incubación de 2 horas, recoger y transferir las células de todos los pozos a un tubo de centrífuga estéril. Lavar las células por centrifugación a 140 x g durante 8 min, temperatura ambiente, sin freno y aspirar y desechar el sobrenadante para que ningún medio residual cubra el sedimento celular. Dispersar el sedimento celular golpeando suavemente el lateral del tubo de centrífuga y re-suspender suavemente en CCM para lograr una suspensión de una sola célula. Realizar el conteo celular y ajustar la concentración celular a 106 células/mL en CCM. Transferir la suspensión celular a los matraces de cultivo celular y colocarla en la incubadora durante la noche. El mismo procedimiento se puede utilizar para controlar las células transfectadas con EGFP (5 x 106 células/cubeta con 5 pg de plásmido superenrollado EGFP de control de Amaxa, pmaxGFP).

Análisis de la Expresión de CAR por Citometría de Flujo en el Día 1 del 1° y Posteriores Ciclos de Estimulación.

Recoger las células electroporadas y realizar un conteo de células usando exclusión con azul tripán (Hemocitómetro). Teñir las células (1-2 x 106) con anticuerpos específicos para CD3, CD4, CD8 e IgG F^cyhumana como medida de la expresión de CAR. Adquirir células en FACS Calibur y analice los datos utilizando el software FCS Express para calcular la expresión de CAR. Calcular células CAR+ en cultivo por la fórmula: (No. de células viables totales) x (% de células CAR+) = No. de células CAR+.

Preparación de aAPC (clon #4) el Día 1 del 1° y Posteriores Ciclos de Estimulación. aAPC (clon #4) se derivó de células K562 (línea parental obtenida de American Type Culture Collection) para coexpresar la molécula coestimuladora de células T deseada. Descongelar una alícuota de aAPC irradiada con 100 Gy en un baño de agua a 37°C. Las células se lavaron dos veces mediante centrifugación a 400 x g, 10 min en CCM y se contaron usando un Celómetro (exclusión con azul tripán). Calcular el número de aAPC viables necesarias para estimulación: (No. de células CAR+) x 2 = No. de aAPC irradiadas requeridas

Estimulación mediada con aAPC de células T CAR+ en el Día 1 al comienzo del 1° y Posteriores Ciclos de Estimulación. Mezclar las células electroporadas (que expresan CAR) y la aAPC irradiada con y (clon #4) en un recipiente estéril en una proporción de 1:2 (Célula CAR+ : aAPC viable) en CCM. Tener en cuenta que la proporción de aAPC se ajusta para la expresión de CAR en función de la citometría de flujo el día después de la electroporación. Agregar IL-21 (30 ng/mL) a la suspensión celular. Alícuota en matraz(ces) T-75 cm2 y/o Bolsas de cultivo VueLife a una concentración de 106 células/mL y volver a la incubadora.

Cultivo Continuado de células T CAR+ en los Días 3 y 5. Realizar un cambio de mitad del medio, reponer IL-21 y mantener las células T a una concentración de 106 células/mL.

Fin del Primer Ciclo de Estimulación Mediada por aAPC el Día 7. Recoger células, contar y teñir para CD3, CD4, CD8 y Fcy (CAR).

Agotamiento de Células CD56+ entre 7 y 14 días después de la electroporación. Realizar un agotamiento de CD56 utilizando perlas paramagnéticas si linfocitos CD56+CD3neg >10%.

Adición Recursiva de aAPC para Propagar Células T a números clínicamente suficientes durante los ciclos de estimulación #2, #3, & #4 Correspondientes a los Días 8 ^ 14, Días 15 ^ 21, & Días 22 ^ 28. Repetir el procedimiento de estimulación hasta 4 veces. Agregar IL-2 (50 U/mL) a los cultivos a partir de los días 7, 14 y 21, y a continuación en cada cambio de medio (tres veces por semana, en un cronograna de lunes-miércoles-viernes). Criopreservar (archivo) el exceso de células T según sea necesario utilizando un congelador de velocidad controlada para la prueba de liberación y la infusión.

Ejemplo 2 - Aplicación clínica de la Bella Durmiente y células presentadoras de antígenos artificiales para modificar genéticamente las células T de sangre periférica y del cordón umbilical-Resultados

La electrotransferencia de plásmidos de ADN y la propagación de células T en aAPC irradiadas con y pueden usarse para generar números clínicamente atractivos de células T derivadas de PB y UCB para aplicaciones humanas. Estas células T modificadas genéticamente expresan un CAR introducido que reconoce el TAA CD19, independientemente del complejo principal de histocompatibilidad. Los plásmidos de ADN derivados de SB para expresar el (i) transposón, un CAR de 2a generación (CD19RCD28) que envía señales a través de CD28 y CD3-s14, y (ii) transposasa, SB11 (Jin y col., 2011), han sido descritos anteriormente (Singh y col., 2011; Davies y col., 2010; Kebriaei y col., 2012). Los plásmidos utilizados en el estudio actual fueron producidos comercialmente por Waisman Clinical Biomanufacturing Facility (Madison, WI). La aAPC (clon #4), derivada de células K562 (línea parental obtenida de American Type Culture Collection), coexpresa las moléculas coestimuladoras de células T deseadas (cada molécula introducida al 90% en la superficie celular de aAPC), como se describió anteriormente (Manuri y col., 2010) . Aquí, las células T específicas de CD19 podrían generarse a partir de células mononucleares (MNC) derivadas de PB o UCB utilizando la transposición SB para introducir el CAR seguido de la adición de aAPC para expandir numéricamente las células T de una manera dependiente de CAR (FIGs. 1 y 4) (Singh y col., 2011; Singh y col., 2008). Diez cubetas (2x107 MNC/cubeta) fueron electroporadas para cada receptor usando 15 pg de plásmido de ADN (CD19RCD28/pSBSO) que codifica el transposón (CAR) y 5 pg de plásmido de ADN (pCMV-SB11) que codifica la transposasa (SB11). El número de cubetas se puede reducir si las MNC están limitando o reduciendo el trabajo de laboratorio. El día de la electroporación se define como el "Día 0" del ciclo de estimulación #1. Como controles para la citometría de flujo y las condiciones de cultivo, las células T autólogas se someten a electroporación simulada (sin plásmido de ADN) y se expanden numéricamente en aAPC irradiada con y (clon #4) que se había precargado con OKT3 para reticular c D3 para mantener la proliferación de células T. La eficacia de la electrotransferencia y la viabilidad de las células T el día después de la electroporación se evaluó de forma rutinaria (FIG. 2B). La expresión de EGFP del plásmido de ADN de control (designado pmaxGFP) y CAR en este punto de tiempo inicial refleja la expresión de proteínas del plásmido integrado y episomal. Típicamente, la expresión de EGFP se midió al 60% el día después de la electroporación y la expresión de CAR a ~40% (FIG. 2A) con la viabilidad de las células T entre 40%-50%. Las adiciones recursivas de aAPC irradiadas con y en presencia de IL-2 e IL-21 humanas recombinantes solubles recuperan células T que expresan de forma estable CAR (CD19RCD28). Células NK CD3negCD56+ se agotan del cultivo utilizando perlas paramagnéticas específicas de CD56 si el porcentaje de estas células NK es > 10% y especialmente si el porcentaje de CAR expresado en las células T es bajo. Este agotamiento impide el rápido crecimiento excesivo de células NK que interfiere con la capacidad de aAPC para sostener la proliferación de células T CAR+ . En ocasiones, el agotamiento de las células NK de células T CAR+ se toman durante los dos últimos ciclos de estimulación, pero esto introduce una pérdida de las células deseadas debido a la coexpresión de CD56 en algunas células T CAR+ . Las células T se cultivaron en un sistema funcionalmente cerrado utilizando bolsas de cultivo VueLife después Del día 14. Un subconjunto de las células T propagadas y modificadas genéticamente se criopreserva típicamente el Día 14 o el Día 21 (final de los ciclos de estimulación #2 o #3) de co-cultivo en aAPC para que sirva como fuente de material archivado para análisis futuros y para ser descongelado si posteriormente se producen problemas imprevistos durante el procedimiento de fabricación. Las células T se recogieron típicamente en o alrededor del Día 28 de cultivo (FIG. 3) que expresan rutineramente >90% CAR y son >80% viables (FIGs. 2C, D). Después de cuatro semanas de co-cultivo en aAPC, la tasa de expansión promedio de células T CD3+ es 19.800 ± 11.313 con expresión de CAR+ siendo 90% ± 7,5% (Singh y col., 2011). Estas células T se criopreservan y se someten a pruebas de liberación y en procedimiento que informan sobre la seguridad y el potencial terapéutico del producto fabricado. Las pruebas de liberación se llevan a cabo de conformidad con las enmiendas de mejora del laboratorio clínico (CLIA) para generar un certificado de análisis antes de la infusión en los receptores de los ensayos clínicos.

Ejemplo 3 - Fabricación de células T específicas de CD19 de grado clínico que expresan de manera estable el receptor de antígeno quimérico usando la Bella Durmiente y células presentadoras de antígeno artificiales -Materiales y Procedimientos

Generación de plásmidos de ADN de grado clínico.El transposón SB, CoOpCD19RCD28/pSBSO, expresa el codón humano optimizado (CoOp) 2a generación CoOpCD19RCD28 CAR (SEQ ID NO: 1) bajo promotor compuesto híbrido EF-1/HTLV (InvivoGen) compuesto por Factor de Alargamiento-la (EF-1a) (Kim y col., 1990) y región no traducida 5' del Virus de la Leucemia de Células T Humanas (HTLV) (Singh y col., 2011; Davies y col., 2010). La derivación de este plásmido de ADN se describe en la FIG. 10.La transposasa SB, SB11, bajo el promotor del citomegalovirus (CMV) se expresó en cis a partir del plásmido de ADN pCMV-SB11 (Singh y col., 2011). La derivación de este plásmido de ADN se describe en la FIG. 11.Ambos plásmidos fueron secuenciados en su totalidad y fabricados por Waisman Clinical Biomanufacturing Facility (Madison, WI) utilizando kanamicina para la selección de la cepa bacteriana E. coli DH5a. Los criterios de liberación de los plásmidos de ADN se muestran en la Tabla 1.CD19 se expresó utilizando el plásmido de ADN ACD19C0Op-F2A-Neo/pSBSO (FIG. 12).

Tabla 1: Criterios de liberación para los plásmidos de ADN que codifican el transposón la transposasa SB.

Conteo de células. La exclusión con azul tripán se utilizó para distinguir las células vivas de las muertas y se contó con el Celómetro (Nexecelom Bioscience) (Singh y col., 2011).

Aislamiento de PBMC. Los productos de leucocitaféresis de dos donantes sanos voluntarios masculinos se compraron de Key Biologics LLC (Memphis, TN). Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron adaptando el sistema Biosafe Sepax (Eysins, Suiza) para trabajar según cGMP. Brevemente, después de cerrar todas las pinzas del kit CS-900, se transfirieron asépticamente 100 mL de Ficoll (GE Healthcare) mediante jeringas de 60 mL a una bolsa de medios de gradiente de densidad ("bolsa de ficoll") mediante un conector Luer-lock y el tubo se calentó sellado con un sellador manual (Sebra, modelo n° 2380). El kit se conectó con espigas a una bolsa de 1.000 mL que contenía tampón CliniMACS (PBS/EDTA, Miltenyi, Cat#70026) con 20 mL de albúmina de suero humano (HSA) al 25% (Baxter) (2% v/v, tampón de lavado) para lavados, una bolsa de producto final [Paquete de Transferencia de 300 mL con Acoplador (Baxter/Fenwal 4R2014)] y una bolsa de reactivo/sangre. Utilizando el protocolo de separación basado en gradiente de densidad (v126), se cargó el pistón de la jeringa en la cámara de la centrífuga y se cerró la tapa del conjunto Sepax. La bolsa de reactivo/sangre y las bolsas de producto se colgaron y todas las llaves de paso se colocaron en los pasadores giratorios en la posición "T". Después de conectar la línea del sensor de presión, el kit se validó mediante una prueba automática de un solo uso y a continuación se cebó manualmente mediante flujo por gravedad. Una vez completado el ciclo, el producto final se transfirió asépticamente a un tubo de centrífuga y se lavó una vez con tampón de lavado y solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 400 g durante 10 minutos. Después del conteo, las células fueron criopreservadas usando medio de criopreservación (50% HSA, 40% Plasmalyte, 10% DMSO) en bolsas CryoMACS Freeze (Miltenyi) y viales (Nunc) usando el programa BM5 (4°C a -4°C a una velocidad de -2°C/min, -4°C a -60°C a una velocidad de -35°C/min, -60°C a -20°C a una velocidad de 8°C/min, -20°C a -45°C a una velocidad de -2,5°C/min, -45°C a -80°C a una velocidad de -10°C/min) en un congelador de velocidad controlada (Planer Kryo 750).

Fabricación de bancos de células maestras y de trabajo aAPC (clon #4). K562 fueron transducidos por lentivirus en la Universidad de Pennsylvania para generar aAPC (clon #4, designado CJK64.86.41BBL.GFP.IL-15.CD19) que coexpresan (i) CD19, (ii) c D64, (iii) CD86, (iv) CD137L, y (v) IL-15 unida a membrana (mIL15) como un vector bicistrónico con EGFP. Las aAPC se expandieron numéricamente en HyQ RPMI 1640 (Hyclone) que contenía un 10% de FBS definido inactivado por calor (Hyclone) y medio de cultivo (CM) de Glutamax-1 (Life Technologies-Invitrogen) 2 mM, manteniendo las células a 5x105 células/mL. Se produjo un banco de células maestras (MCB) de 320 viales mediante Asistencia a la producción de terapias celulares (PACT) (Tabla 2). A continuación, se generó un banco de células de trabajo (WCB) de 200 viales del Clon 4 aAPC derivado del MCB en MDACC y se probó (Tabla 3).

Tabla 2: Criterios de liberación para banco de células maestras aAPC derivadas de K562 clon#4 .

Tabla 3: Criterios de liberación para banco de células de trabao aAPC derivadas de K562 clon#4 .

aAPC (clon #4) para propagar selectivamente células T CAR+. Las aAPC irradiadas con y se utilizaron para expandir numéricamente las células T modificadas genéticamente. Las aAPC descongeladas de WCB se propagaron en CM durante hasta 60 días en bolsas de cultivo celular VueLife y se recogieron usando el procedimiento de recogida Biosafe Sepax II. En resumen, se conectó un kit CS-490.1 a una bolsa de salida de 300 mL (paquete de transferencia) a través de una conexión Luer Lock. La cámara de separación se instaló en el pozo y la tubería se insertó en el sensor óptico y las llaves de paso se alinearon en la posición T. Después de conectar la línea del sensor de presión, la bolsa de producto y las bolsas de sobrenadante/plasma se colgaron en el soporte. El protocolo modificado PBSCv302 se seleccionó de entre el menú de Sepax y el volumen de producto de entrada a procesar (volumen inicial) se estableció en <840 mL. Después de la validación y prueba del kit, se inició el procedimiento. Una vez completado, se retiraron las bolsas, se cerraron las pinzas y se retiró el kit. Las células de la bolsa de producto final se retiraron asépticamente, se lavaron dos veces con medio de lavado (HSA al 10% en Plasmalyte) y se contaron. aAPC se irradiaron (100 Gy) utilizando un radiador CIS BIO International (IBL-437 C#09433) y se criopreservaron para su uso posterior en medios de criopreservación utilizando un congelador de velocidad controlada (Planer Kryo 750).

Carga de aAPC con OKT3. Las aAPC cargadas con OKT3 (a través de CD64) (clon #4) se utilizaron para propagar células T de control autólogas de control (CARneg) que no habían sufrido modificación genética. Las aAPC, obtenidas del cultivo, se incubaron durante la noche en X-Vivo 15 sin suero (n° de cat. 04-744Q, Lonza) que contenía acetilcisteína al 0,2% (Acetadote, Cumberland Pharmaceuticals) denominado Medio de Carga (LM). Al día siguiente, las células se lavaron, se irradiaron (100 Gy) usando un radiador Gamma Cell 1000 Elite Cs-137 (MDS Nordion), se resuspendieron en LM a una concentración de 106 células/mL junto con 1 pg/106 células de anti-CD3 humano purificado de grado funcional (clon-OKT3, 16-0037-85, eBioscience) y se incubaron con agitación suave en un rotador 3-D (Lab-Line) a 4°C durante 30 minutos. Después de tres lavados con LM, las células se usaron en experimentos o se congelaron en alícuotas en nitrógeno líquido en la capa de vapor para su uso posterior.

Fabricación de células T CAR+. Las PBMC descongeladas se resuspendieron en (i) kit de células T humanas (cat # VPA-1002, Lonza; 100 pL para 2 x 107 células en una cubeta), con (ii) el plásmido de Ad N (CoOpCD19RCD28/pSBSO) que codifica para transposón CD19RCD28 CAR (15 pg superenrollado de ADN por 2 * 107 PBMC por cubeta), y (iii) el plásmido de ADN (pCMV-SB11) que codifica SB11 transposasa (5 pg superenrollado de ADN por 2 * 107 p BMc por cubeta) . Esta mezcla se transfirió inmediatamente a una cubeta (Lonza), se electroporó (definiendo el día de cultivo 0) utilizando Nucleofector II (Amaxa/Lonza), reposó en medio completo RPMI al 10% durante 2 a 3 horas, y después de un cambio de semi-medio, se incubó durante la noche a 37°C, 5% CO2. Al día siguiente, las células se recogieron, contaron, fenotiparon mediante citometría de flujo y se cocultivaron con aAPC irradiada con y en una proporción de 1:2 (Células T CAR+ :aAPC), que marcó el día 1 de cultivo y el comienzo de un ciclo de estimulación de 7 días. IL-21 (cat # AF-200-21, PeproTech) e IL-2 (cat. # NDC 65483-116-07, Novartis) se agregaron en un cronograma lunes-miércoles-viernes a partir del día 1 y el día 7, respectivamente. Las células NK pueden impedir la expansión numérica de células T CAR+ , especialmente si su crecimiento excesivo se produce al principio del procedimiento de cultivo de tejidos. Por lo tanto, se realizó agotamiento de CD56 si células CD3negCD56+ >10% usando perlas CD56 (cat #70206, Miltenyi Biotech, 20 pL perlas/107 células) en columnas LS (cat. #130-042- 401, Miltenyi Biotech) en tampón CliniMACS que contiene 25% de HSA (80 pL/107 células). Las células T se crioconservaron como copia de seguridad en cultura el día 21 después de la electroporación y el final del 3er ciclo de estimulación utilizando un congelador a velocidad controlada (Planer Kryo 750) como se describió anteriormente, y se almacenaron en nitrógeno líquido (vapor-capa). Los conteos de células para las células T totales, CD3+, y CAR+ se representaron gráficamente a lo largo del tiempo y se determinaron las pendientes usando regresión lineal. Los resultados de la tasa de expansión se compararon usando una prueba t de Student. Se calcularon las proporciones CD4/CD8 para cada punto de tiempo y se realizaron pruebas de validación y se promediaron.

Generación de células T de control CARneg . Como control, 5x106 PBMC simuladas transfectadas se cocultivaron con clon de aAPC derivado de K562 irradiado y cargado con anti-CD3 (OKT3) #4 en una proporción de 1:1 en un ciclo de estimulación de 7 días. Todos los cultivos se complementaron con IL-21 (30 ng/mL) desde el día 1 de cultivo en adelante, e IL-2 (50 U/mL) comenzando 7 días después del inicio del cultivo. Todas las citocinas se agregaron posteriormente en un cronograma de lunes-miércoles-viernes.

Líneas Celulares. CD19+ Daudip2m [Linfoma de Burkitt, co-expresando p2 microglobulina, (Rabinovich y col., 2008)] y CD19+ NALM-6 (célula pre-B) fueron cultivadas según se describió anteriormente (Singh y col., 2011). Las células EL-4 (línea de linfoma de células T de ratón) de ATCC se modificaron para expresar CD19 usando la construcción ACD19CoOp-F2A-Neo/pSBSO. Brevemente, 5x106 células EL-4 se resuspendieron en 100 pL de células T de ratón Amaxa kit Nucleofector (Catálogo #VPA-1006) con transposón SB (ACD19CoOp-F2A-Neo/pSBSO, 3 pg) y transposasa SB (pCMV-SB11, 1 pg) y electroporada (programa X-001) usando Nucleofector II (Lonza). Los transfectantes se cultivaron en una concentración citocida de G418 (0,8 mg/mL) y se sometieron a clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para la expresión homogénea de CD19 para obtener un clon (clon n° 17). Las células Jurkat se obtuvieron de ATCc y se electroporaron (Programa T-14, Nucleofector II, Lonza) con CoOpCD19RCD28mz (CoOp)/pSBSO utilizando la Solución de nucleofector Amaxa/Lonza (Kit V). Dos semanas después de la electroporación, las células Jurkat que expresan de manera estable CAR se sometieron a FACS para una expresión homogénea de CAR para obtener un clon (clon #12) (Maiti y col., 2013). Las líneas celulares se mantuvieron en HyQ RPMI 1640 (Hyclone) suplementado con Glutamax-1 2 mM (Invitrogen) y suero de ternero fetal (FCS) inactivado por calor al 10% (Hyclone; RPMI al 10%). Todas las líneas celulares se validaron utilizando perfiles de STR o cariotipo según la política institucional de autenticación de líneas celulares.

Inmunofenotipo de células. Células fueron teñidas usando anticuerpos (Tabla 4) en 100 pL de Tampón FACS (2% FBS, 0,1% Azida de sodio) por 30 minutos a 4°C. Para tinción intracelular, después fijación/permeabilización durante 20 minutos, las células se tiñeron en tampón de lavado permanente con los anticuerpos apropiados durante 30 minutos a 4°C. La adquisición se realizó usando FACSCalibur (BD Bioscience) y se analizó usando Cell Quest BD Bioscience) o FCS Express 3.00.0612 (De Novo Software, Thornhill, Ontario, Canadá).

Tabla 4: Anticuerpos utilizados para citometría de fluo.

Western Blot. Se evaluó la expresión proteica del CD3-Z quimérico (73-kDa) derivado de CD19RCD28 como se describió anteriormente (Singh y col., 2008). Brevemente, los lisados de proteínas se transfirieron usando iBlot Dry Blotting System (Invitrogen) a una membrana de nitrocelulosa, incubados con anticuerpo monoclonal CD3- Z anti humano de ratón (cat # 551033, 0.5 pg/mL, BD Biosciences, CA) seguido de IgG anti-ratón de cabra conjugado a (HRP) con peroxidasa de rábano picante (cat # 1858413, 1: 10,000; Pierce, IL), desarrollado usando el sustrato SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity (Pierce, IL) y quimioluminiscencia capturada usando el sistema de documentación en gel VersaDocTM 4000 (BioRad, CA).

Análisis de longitud de telómeros mediante hibridación por fluorescencia in situ y citometría de flujo (Flow-FISH). La longitud de los telómeros de las células T se midió utilizando el kit PNA de Telómeros/FITC para Citometría de Flujo (DAKO) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, células aisladas (CD4 o CD8) y células de control (cat # 85112105, línea celular CEM-1301; ECACC) se mezclaron en igual medida en solución de hibridación con o sin sonda de PNA de telómero marcada con FITC durante 10 minutos a 82°C; hibridado durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente; se lavó dos veces con una solución de lavado a 40°C; se resuspendido en PBS conteniendo 2% FCS y yoduro de propidio (1 pg/mL); y se analizó en un FACSCalibur (BD Biosciences). Se usaron perlas de calibración fluorescentes marcadas con FITC (cat # 824A, Quantum™ FITC MESF, Bangs Laboratories) para la calibración de la máquina de citometría de flujo. La longitud relativa de los telómeros (RTL) se determinó comparando las células T con una línea celular CEM-1301 según:

RTL

(Media células de muestra F U con sonda — Media células de muestra F U sin sonda) x2x100

Media células de referencia FL1 con sonda — Media células de referencia FL1 sin sonda Ensayo de Liberación de Cromo. Se evaluó la citotoxicidad de las células T en un ensayo estándar de liberación de cromo de 4 horas utilizando células diana marcadas con 51Cr. Las células T se cultivaron en placa por triplicado a 1x105, 0,5x105, 0,25x105, 0,125x105 y 0,0625x105 células/pocillo con 5x103 células diana en una placa de fondo en V de 96 pocillos (Costar). Después de la incubación, se recolectaron 50 pL de sobrenadante en un LumaPlate (Perkin Elmer), se leyó en TopCount NXT (Perkin Elmer) y se calculó el porcentaje de lisis específica por:

51Cr experimental liberado —51 Cr espontáneo liberado

51 Cr máximo liberado — 51Cr espontáneo liberado ^{x 100}

Se determinó la liberación espontánea y máxima midiendo el cromo en el sobrenadante acondicionado de las células diana incubadas con CM o Triton X-100 (Sigma) al 0,1%, respectivamente.

Pruebas de Endotoxinas. El nivel de endotoxinas en los productos finales se determinó utilizando el sistema de prueba portátil Endosafe®-PTS (Charles River Laboratories) según las pautas del fabricante. La prueba tiene un límite de detección de 0,01-10 EU/mL, que se puede convertir a EU/peso del paciente.

Pruebas de Micoplasma. La detección de micoplasma por PCR se realizó utilizando el kit de detección de micoplasma TaKaRa (Clontech) según las instrucciones del fabricante.

Repertorio Vp del receptor de células T. Receptor de células T (TCR) -Vp uso del cultivo día 28 y día 35. Células T CAR+ se determinaron usando un panel de 24 mAb específicos de TCR Vp (cat. # IM3497, IO TEST Beta Mark TCR-Vp repertorio kit, Beckman Coulter) usado en asociación con mAb específico de CD3 (cat. # 340949, BD Biosciences, 10 pL) y mAbs de control de isotipo coincidente (cat. # 552834, BD Biosciences).

PCR en tiempo real para determinar el número de copias del CAR integrado. Para determinar el número de copias de CAR CD19RCD28 integrado en células T modificadas genéticamente, 50-100 ng de ADN genómico (cat. # 80204, AllPrep DNA/ARN Mini Kit, Qiagen) se amplificó utilizando el sistema de PCR en tiempo real Steponeplus (Applied Biosystems) en una reacción de PCR (2 min a 50°C, 10 min a 95°C, seguido de 40 ciclos de 15 s a 95°C y 1 min a 60°C) usando los siguientes cebadores: directo (5'-CAGCGACGGCAGCTTCTT-3'; SEQ ID NO: 8), inverso (5'-TGCATCACGGAGCTAAA-3'; SEQ ID NO: 9) y sonda (5'-AGAGCCGGTGGCAGG-3'; SEQ ID NO: 10). Cebadores (Cat # 4316844, Applied Biosystems) para el gen de la ARNasa P se utilizó como control interno. ADN genómico diluido en serie de una célula Jurkat modificada genéticamente (clon # 12) que contiene 1 copia de CAR de CD19RCD28mz (CoOp)/pSBSO se utilizó un plásmido de ADN para generar una curva estándar (Maiti y col., 2013). Todos los cebadores, sondas y TaqMan Gene Expression Master Mix se adquirieron de Applied Biosystems.

PCR para transposasa SB11. ADN (20 ng) (AllPrep ADN/ARN Mini Kit, Qiagen) aislado de células T CAR+ se amplificó usando un termociclador (PTC-200, DNA Engine, BioRad) usando cebadores directo (5'-ATGGGAAAATCAAAAGAAATC-3'; SEQ ID NO: 11) e inverso (5'-CTAGTATTTGGTAGCATTGC-3'; SEQ ID NO: 12) en una reacción de PCR (95°C durante 5 min; 25 ciclos de 95°C durante 15 s, 58°C durante 40 s, 72°C durante 60 s; seguido de una extensión final a 72°C durante 7 min). Se usó GAPDH como gen de mantenimiento y se amplificó en la misma reacción de PCR usando los cebadores, directo (5'-TCTCCAGAACATCATCCCTGCCAC-3 '; Se Q ID NO: 13) e inverso (5'-TGGGCCATGAGGTCCACCACCCTG-3'; SEQ ID NO: 14). El ADN plasmídico linealizado pCMV-SB11 (1 ng) y el ADN genómico (20 ng) de células Jurkat modificadas genéticamente que expresan de manera estable SB11 y EGFP (expresadas a partir del plásmido de ADN SB11-IRES2-EGFP) (Maiti y col., 2013) se utilizaron como un control positivo. Como control negativo se utilizaron células T electroporadas simuladas (sin ADN) y propagadas con OKT3-aAPC.

Ensayo para evaluar el crecimiento de células T autónomas no deseadas. Para monitorear el crecimiento aberrante de células T, 2x105 células T CAR+ , recogidas después de 4 ciclos de estimulación mediados por aAPC (28 días después de la electroporación) se cultivaron por triplicado en una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos durante 18 días adicionales. (i) Control positivo: la presencia de aAPC y citocinas (50 U/mL IL-2 y 30 ng/mL IL-21). (ii) Prueba: ausencia de aAPC y citocinas. Las células T genéticamente modificadas pasaron el ensayo cuando el total de células viables en el día 18 fue (i) >2x105 células para células T CAR+ cultivadas con aAPC y citocinas y (ii) < 2x104 células para células T CAR+ cultivadas sin aAPC y citocinas.

Cariotipado de Banda G.Células T CAR+ se recogieron al final del co-cultivo y los portaobjetos se tiñeron usando tinción de Giemsa usando un procedimiento estándar. Se analizaron un total de 20 metafases con bandas G.

Ejemplo 4 - Fabricación de células T específicas de CD19 de grado clínico que expresan de manera estable el receptor de antígeno quimérico utilizando la Bella Durmiente y células presentadoras de antígeno artificiales - Resultados

aAPC (clon #4).K562 funcionando como aAPC (clon #4) fueron empleados para propagar selectivamente células T CAR+ . Las aAPC cultivadas se recogieron de las bolsas VueLife mediante un dispositivo Sepax II utilizando el procedimiento de reducción de volumen, que requirió ~40 minutos. El volumen medio de preprocesamiento y los conteos de aAPC fueron 575 mL (intervalo 500-700 mL) y 4,9x108 (intervalo 3,2x108 a 7,7x108), respectivamente. Después del procesamiento con Sepax II, la recuperación media de células fue del 108% (intervalo de 75% a 136%), con un volumen de salida de 125 mL (intervalo de 50 a 200 mL), lo que resultó en una reducción del volumen medio del 78,3% (intervalo de 60% a 91,6%). %, FIGs. 5A, B).La recuperación celular automatizada fue similar a un procedimiento de reducción de volumen manual (82%), lo que tomó 45 minutos de tiempo de operación sostenido y resultó en una reducción de volumen del 91%. aAPC fueron monitoreados regularmente por citometría de flujo para >80% expresión de los transgenes introducidos que codifican CD19, CD64, CD86, CD137L y EGFP (como marcador para la expresión de mIL15). La inmunofenotipificación se realizó tras generar MCB y WCB y tras cada adición de aAPC irradiada con y a cultivos de células T (que marcó el comienzo de cada ciclo de estimulación, FIG.

5C). MCB y WCB para el Clon 4 aAPC dieron negativo en esterilidad y micoplasma en células y sobrenadante celular. En las pruebas de bioseguridad, no se detectó ningún virus mediante pruebas de virus adventicios, pruebas de retrovirus competentes para la replicación y detección de una variedad de virus patógenos humanos. Las pruebas validaron que la aAPC (clon #4) se derivó de K562 basado en huellas dactilares (Tabla 5).

Tabla 5: Huellas dactilares STR de K562 aAPC Clon #4.

Fabricación de células T CAR+ . Se llevaron a cabo estudios de validación para la producción a gran escala de células T CAR+ específicas de CD19 para establecer que las PBMC se pueden electroporar y propagar a números clínicamente significativos (Huls y col., 2013) (FIG. 6) y cumplir con los criterios de liberación preestablecidos (Tabla 6). Se procesaron dos productos de aféresis de donantes normales para aislar células mononucleares (MNC) utilizando el sistema de procesamiento de células Sepax. Los productos de aféresis 201 mL (donante 1) y 202 mL (donante 2) se procesaron en dos lotes (~100 mL/lote) generando un producto de salida de 50 mL. Los conteos de preprocesamiento fueron similares a los conteos de posprocesamiento de los productos de aféresis. Un total de 5,3x109 y 7,1x109 células fueron aisladas conteniendo 40,5% y 51% de células CD3+ respectivamente del donante 1 y del donante 2. Las células fueron a continuación criopreservadas en alícuotas (4x107 células/mL) en bolsas de congelamiento CryoMACS (10 mL) y crioviales de referencia (1 mL) para uso posterior. Se realizaron tres experimentos de validación separados que se resumen en la Tabla 6. Para las pruebas de validación 1 y 2 (V1, V2) se utilizaron células del donante 1 y para la validación 3 (V3) células del donante 2. Para cada corrida, se sometieron a electroporación PBMC recién descongeladas y se expandieron numéricamente ex vivo en procedimientos de cultivo separados (Tabla 7 ). En el día de cultivo 0, 3x108 (VI) y 8x108 (V2, V3) células fueron descongeladas (viabilidad, 88,9% a 97.6%) y reposaron por 2 horas antes de la electroporación. 2 a 3x108 células (VI = 2x108; V2 y V3 = 3x108) fueron electroporadas a 2x107 células por cubeta con plásmidos de ADN CD19RCD28mz(CoOp)/pSBSO transposon y pCMV-SB11 transposasa y al día siguiente (día de cultivo 1) co-cultivadas con clon #4 de aAPC en base a la expresión de CAR. La eficiencia de la electroporación para las tres corridas de validación se evaluó el día 1 de cultivo medido por la expresión de CAR (33,7%, 25,5% y 47,1%). La expresión de CAR al final del co-cultivo (día de cultivo 28) fue del 92%, 99,2% y 96,7%, y los cultivos contenían una media del 95% ± 5,3% de células T CD3+ con cantidades insignificantes de células CD19+ contaminantes (media = 0,7% ± 0,15%) y CD32+ aAPC (media = 0,6% ± 0,6%, FIG.

7A, Tabla 6). Los inventores confirmaron además la expresión de CAR mediante Western blot de lisados de células completas de células T electroporadas/propagadas que usan mAb específico de la cadena CD3-Z que revela una cadena Z quimérica esperada de 73 kDa (Singh y col., 2008) (FIG.7B). Tras la inspección de la cinética del crecimiento de células T en aAPC, los inventores observaron una tasa acelerada de propagación de células T al final de la segunda semana de cultivo (final del ciclo de estimulación 2), lo cual es consistente con una mayor expansión de veces de células T totales (p = 0,01) y CD3+ (p = 0,01) en comparación con la tasa de expansión en la primera semana de estimulación. La tasa de expansión semanal al final de la tercera y cuarta semana para las células T totales (p = 0,01, p < 0,001), CD3+ (p = 0,03, p < 0,001), CAR+ (p = 0,02, p < 0,001) fue consistentemente más alta que la de la semana uno, respectivamente (FIG. 13).

Tabla 6: Criterios de aceptación para la liberación de células T electroporadas propa adas

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Los inventores observaron una expansión semanal similar para células T CD3+ y CAR+ pasada la primera semana de estimulación. Después de 4 semanas de co-cultivo en aAPC irradiado con y, hubo una expansión numérica promedio de 545 veces de células T CD3+ con una expansión de 1.111 veces de células T CAR+ . La expansión ex vivo (día de cultivo 28) dio como resultado un promedio de 2,86x101° células T CD3+ , casi todas siendo CAR+ (2,65x101°). La cinética de propagación de las células T totales (p = 0,18), CD3+ (p = 0,17) y CAR+ (p = 0,2) T para las tres corridas de validación fueron similares (FIGs. 8A, B, C).Estos datos apoyan la adición recursiva de aAPC para el crecimiento selectivo de células T específicas de CD19.

Inmunofenotipo de células T CAR+ electroporadas y propagadas.Dos de las tres corridas de validación dieron como resultado un crecimiento preferencial de células T CD8+CAR+ (media 76% ± 22%) en comparación con células T CD4+CAR+ (media 16% ± 24%) (FIG. 7C) que se predijo por inclusión de IL-21 (Singh y col., 2011). La media de proporciones CD4/CD8 para células T CAR+ moduladas durante el transcurso del co-cultivo, ya que había un predominio de células T CD4+CAR+ al inicio del co-cultivo en aAPC (día de cultivo 1, proporción = 3,3) llevando a cantidades iguales de células T CD4+CAR+ y CD8+CAR+ el día de cultivo 14 (proporción = 0,9), después de lo cual la proporción disminuyó (día 21 de cultivo, proporción = 0,4; día de cultivo 28, proporción = 0,3). La proporción total CD4/CD8 siguió una tendencia similar y disminuyó con el tiempo (Tabla 7). Las células T CAR+ al final del período de propagación (día de cultivo 28) se activaron (expresión de CD69, media 43,6%; expresión de HLA-DR, media 61,2%), capaces de citólisis (expresión de Granzima B, media 92,3%) y expresaron marcadores de células T de memoria/sin tratar (expresión de CD62L, media 45,6%; expresión de CD28, media 66,4%; expresión de CD27, media 77,5%, expresión de CD45RA, media 99,7%). Los inventores no pudieron detectar marcadores de agotamiento/senescencia en la superficie celular (expresión de PD-1, media 2,7%; expresión de CD57, media 3,3%) (FIG. 7D). Estos datos son consistentes con la aAPC que respalda el crecimiento de una población heterogénea de células T CAR+ .

Especificidad redirigida de células T CAR+ .Células T generadas a partir de las tres corridas de validación pudieron lisar específicamente dianas tumorales CD19+ . Un promedio de 57% ± 4% (media ± DE, intervalo, 61,2% a 53,8%) Daudip2m y 49% ± 7% (media ± DE, intervalo, 41% a 54%) NALM-6 se lisó en un efector para proporción final de 20: 1. La destrucción específica de CD19 se demostró mediante una tasa de destrucción promedio 6,2 ± 2,6 (media ± DE) mayor de EL-4 CD19+ (intervalo, 4,2 a 9,2 veces) en comparación con las células EL-4 parentales CD19neg con una proporción efector/diana de 20:1 con una lisis de fondo específica de CD19 de 1,4 ± 1 (media ± DE) por controles CARneg neg (electroporación simulada) (FIGs. 8D, 14). Esto implica que el CAR en las células T electroporadas y propagadas redirigió la muerte a CD19.

Falta de proliferación autónoma no deseada por células T propagadas y modificadas genéticamente.Los inventores evaluaron el crecimiento de células T CAR+ en presencia/ausencia de K562 aAPC y citocinas (IL-2 e IL-21) para descartar el crecimiento aberrante de células T debido a la potencial genotoxicidad causada por la transposición de SB. Al final de los 18 días de cultivo, los inventores observaron <2 x 104 células (promedio 2.800, intervalo 0,0-5,6 x 103) en las células T genéticamente modificadas que no recibieron citocinas y aAPC, mientras que el grupo de control que recibió citocinas y aAPC se expandió numéricamente a un promedio de 7,6 x 107 células, intervalo 4,12 x 107 a 12.8 x 107 (Tabla 8). Estos datos indican que las células T CAR+ no pueden mantener la proliferación tras la retirada de factores de crecimiento y estimulación antigénica.

T l : F l r imi n l l r n m r l l T m ifi n i m n .

Tabla 9: Pruebas en rocedimiento ara células T electro oradas ro a adas.

Longitud de telómeros en células T CAR+. La longitud de los telómeros es una medida importante de la diferenciación celular y la progresión a la senescencia. Por lo tanto, para evaluar el efecto de la transposición de SB y la expansión numérica ex vivo de Células T CAR+ en la longitud de los telómeros, los inventores compararon las longitudes de los telómeros de Células T CAR+ (día de cultivo 28) a sus respectivos controles no manipulados emparejados (antes de la electroporación) utilizando el ensayo Flow-FISH. Debido a la generación predominantemente de células T CD8+ CAR+ Ten V1 y V2 y células T CD4+ CAR+ en V3, los inventores compararon la longitud de los telómeros de células T CD8+ para V 1 y V2 y células T CD4+ para V3 a células T CD8+ y CD4+ , respectivamente, desde antes de la propagación (FIG. 9A). La longitud media de los telómeros de las células T después de la expansión numérica ex vivo (día de cultivo 28, 8,93% ± 1,33%) fue similar a la de las células T de control no manipuladas (día 0, 7,77% ± 1,21%). Estos resultados indican que la electroporación y propagación de las células T CAR+ no da como resultado la erosión de la longitud de los telómeros.

Número de copia de transgén de CAR. El número de copias de los transgenes CD19RCD28 integrados se determinó usando el clon #12 de células Jurkat CD19RCD28+ como referencia y P RNasa endógena como normalizador (Maiti y col., 2013). La copia de transgén promedio por células T generadas en las corridas de validación fue de 0,96 ± 0,09 (intervalo, 0,75 a 1,07, FIG. 9B). Estos datos indican que la transposición de SB dio como resultado aproximadamente una copia integrada de CAR por genoma de células T.

Uso de TCR Vp. La electroporación y propagación de células T puede conducir a la aparición de una población oligoclonal o clonal de células T que podría ser indicativa de crecimiento preferencial y, por tanto, un indicador de un evento genotóxico. Por lo tanto, los inventores evaluaron el uso de TCR Vp mediante citometría de flujo como un medio para evaluar la diversidad del repertorio. Las 24 familias de TCR Vp ensayadas se conservaron en células T después de 28 días de co-cultivo en aAPC y de forma similar al repertorio de pre-electroporación. Además, las familias de TCR Vp se conservaron al prolongar el tiempo de cultivo (día de cultivo 35, FIG. 9C). Estos datos sugieren el mantenimiento de una amplia diversidad de TCR en cultivos de células T CAR+ y no revelan un desequilibrio en el uso de secuencias de TCR.

Falta de transposasa SB11 en células T CAR+. La expresión continua de la transposasa SB11 puede conducir a la removilización del transgén CAR integrado. Por lo tanto, los inventores realizaron una PCR genómica para descartar recombinación homóloga ilegítima del plásmido de ADN que codifica SB11 en células T CAR+ . Dentro de los límites del ensayo, los inventores no pudieron detectar una banda (~1 kb) en reacciones de PCR que contienen ADN de células T CAR+ cultivadas durante 28 días y amplificadas usando cebadores específicos de SB11 (FIG. 9D). Estos datos indican una falta de integración de la transposasa SB 11 en las células T electroporadas y propagadas.

Cariotipo de células T CAR+. Se evaluó la integridad de la estructura cromosómica para descartar la genotoxicidad global asociada con la transposición de SB. Banda G de células T CAR+ (recogidas 28 días después de la electroporación) de las tres corridas de validación revelaron un cariotipo normal (masculino) en todas las extensiones de metafase analizadas (FIGs. 9E, 15).

Ejemplo 5 - Dirigirse a un antiguo retrovirus expresado en cánceres e infecciones utilizando células T adoptivas diseñadas para expresar receptor de antígeno quimérico - Procedimientos

Inmunohistoquímica. Micromatriz de tejido (#ME1004a, ME2082b, FDA998t) obtenido de U.S. Biomax (Rockville, MD) se hidrató con DiH2O. Se realizó la recuperación de antígeno usando tampón citrato pH 6 sin EDTA. Portaobjetos se bloquearon con 3% de peróxido de hidrógeno (Biocare Medical, Concord, CA), avidina (Biocare Medical), biotina (Biocare Medical) y un suero completo polivalente (Biocare Medical). Los portaobjetos se incubaron durante 30 minutos cada uno con mAb HERV-K (0,6 mg/ml) a una dilución 1:20 seguido de IgG anti-ratón biotinilado (Biocare Medical) y estrepavidina-HRP (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) y se visualizaron con una contratinción de Hematoxilina de Mayer (Sigma-Aldrich). Se realizaron procedimientos de tinción similares en los portaobjetos con anticuerpo IgG2a de ratón de control de isotipo (0,25 mg/ml) (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ).

Plásmidos. La secuencia scFv (del clon de mAb 6H5) contra la proteína de la envoltura de HERV-K se optimizó en el codón (CoOp) (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se clonó en el transposón SB bajo el control del promotor del factor-Ia de elongación humano (hEF-1a), flanqueado por repeticiones invertidas de SB formando CoOp6H5CD28/pSBSO.

El antígeno HERV-K se expresó a partir del plásmido SB que contenía los promotores bidireccionales hEF-1a y citomegalovirus (CMV). La secuencia de antígeno de longitud completa optimizada por codones con el dominio de transmembrana viral se clonó bajo el control del promotor hEF-1a y el gen de neomicina se transcribió bajo el control del promotor de CMV en un vector bidireccional. La transposasa (SB11) se expresó en cis a partir del plásmido pCMV-SB11 (Davies y col., 2010).

Para generar el plásmido SB de formación de imágenes in vivo para células T, se fusionó luciferasa de luciérnaga de codón optimizado con una etiqueta myc y se expresó bajo el control del promotor de CMV. Se usó un vector lentiviral que codifica luciferasa de mKate-renilla bajo el control del promotor eEF1a como vector de formación de imágenes para células tumorales de melanoma in vivo.

Líneas celulares y su propagación.A375-mel y A888-mel fueron un amable regalo del Dr. Lazlo Radvanyi, del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas (Houston, TX). A624-mel y EL4 parental se obtuvieron de American Type Culture Collection (Rockville, MD). A375-SM (línea celular de melanoma supermetastásico) se recibió de la instalación central de CCGS en el MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas (Houston, TX). Todas las líneas celulares se cultivaron en RPMI (Thermo Scientific, Rockford, IL) con FBS al 10% (Thermo Scientific) y 5% glutamax (Gibco Life Technologies, Grand Island, NY). Todas las líneas celulares fueron verificadas por morfología, huella digital celular y/o citometría de flujo. Fueron probadas para Micoplasma y conservadas en bancos de células de investigación.

Generación y expansión de células T que expresan CAR específicas de HERV-K.PBMC de donantes sanos se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ) y se electroporaron con el transposón HERV-K SB y transposasa SB 11 utilizando el sistema de electroporación Amaxa. Brevemente, se lavaron 2x107 células PBMC y se incubaron en RPMI completo complementado con suero bovino fetal al 10% (Thermo Scientific) y 1% glutamax (Gibco Life Technologies) durante 2 h. Estas células a continuación se resuspendieron en 100 pl de solución de Nucleofector Amaxa (Kit de células T humanas), junto con el transposón CAR HEr V-K (6H5CD28/pSBSO, 15 pg) y transposasa SB (pCMV-SB11, 5 pg), transferidos a una única cubeta y electroporados usando el programa U-14 en el electroporador Amaxa (Lonza, EE.UU.). Las células T electroporadas se incubaron durante 4 horas a 37°C en RPMI completo sin fenol (Thermo Scientific), después de lo cual se realizó un cambio de la mitad del medio.

K562 expresa el antígeno HERV-K endógeno y, por lo tanto, sirve como aAPC para propagar células T CAR+ específicas de HERV-K. Las células T electroporadas cultivadas en RPMI que contenían FBS al 10% se suplementaron con K562-aAPC irradiado con y (100 Gy) a una proporción 1:2 células T:aAPC. Se añadieron aAPC irradiadas al final de cada semana para la estimulación de las células T en la misma proporción. Citocinas solubles IL-21 (eBioscience) e IL-2 (Chiron) se suplementaron a una concentración de 30 ng/ml y 50 U/ml, respectivamente, para completar el medio RPMI cada dos días en el cultivo después de la electroporación. Células T sin control de ADN transfectadas de forma simulada cultivadas en presencia de células K562 cargadas con OKT3 sirvieron como control negativo. Células T CD19CAR+ electroporadas con CoOpCD19CARCD28/pSBSO y transposasa SB11 se cultivaron en las mismas condiciones de cultivo que en células T CAR+ y sirvieron como un control de células T CAR+ inespecíficas.

Cada semana, los cultivos de células T se controlaron para detectar la presencia de células CD3negCD56+ y se agotaron si la población excedía el 10% de la población total. Este agotamiento se produjo generalmente entre 10 y 14 días de co-cultivo inicial con aAPC. El agotamiento se llevó a cabo usando perlas CD56 (Miltenyi Biotech Inc, Auburn, CA) en Automax (Miltenyi Biotech) usando la selección positiva "possel" según las instrucciones del fabricante.

La viabilidad de las células T se evaluó basándose en la exclusión con azul tripán usando un contador celular automatizado Celómetro (Auto T4 Cell Counter, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). La viabilidad se analizó mediante el programa "PBMC_human_frozen" y "célula T activada", durante el período de electroporación y co-cultivo. La tasa de expansión (en comparación con el día 1) de células totales, CD3+, CD4+, CD8+ y CAR+ al final de 7, 14, 28, 32 días del co-cultivo para donantes individuales fue calculada y el promedio de 3 donantes se comparó entre las células T CD19CAR+ y células de control sin ADN mediante una prueba t de Student.

Citometría de flujo. Todos los reactivos se obtuvieron de BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) a menos que se indique lo contrario. Un millón de células se tiñeron con anticuerpo conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), proteína clorofila de peridinina conjugada con colorante de cianina (PerCPCy5.5) o aloficocianina (APC). Los anticuerpos usados incluyen anti-CD3 F iTc (5 pl), anti-CD3 PerCPCy5.5 (2.5 pl), anti-CD3 PE (2 pl) anti-CD4 APC (2.5 pl), anti-CD8 PerCPCy5.5 (4 pl), anti-CD56 APC (2.5 pl), AnnexinV (5 pl), anti-CD32 FITC (5 pl), anti-CD45RA FITC (5 pl), anti-CD45RO APC (2.5 pl), anti-Granzyme B FITC (5 pl), anti-CD62L APC (2.5 pl), anti-IFN-y APC (2 pl), anti-CD27 PE (2 pl), anti-apTCR FITC (5 pl), anti-Y5TCR PE (2 pl), y anti-CCR7 PerCPCy5.5 (2.5 pl, Biolegend). Se usó el fragmento F(ab')2 conjugado con FITC (3 pl, Invitrogen) y conjugado con PE (2,5 pl, Invitrogen) de Fcy antihumano de cabra para detectar la expresión en la superficie celular del CAR específico de HERV-K. El bloqueo de la unión inespecífica del anticuerpo se logró usando tampón de lavado FACS (2% de FBS y 0,1% de azida sódica en PBS). La adquisición de datos se realizó en un FACSCalibur (BD Biosciences) utilizando CellQuest versión 3.3 (BD Biosciences). Los análisis y el cálculo de la intensidad de fluorescencia media (MFI) se llevaron a cabo utilizando FlowJo versión 7.5.5.

Sistema de análisis de expresión génica digital nCounter.La diferencia en la expresión génica entre células T CAR+ específicas de HERV-K y las células T de control sin ADN se evaluaron utilizando el Sistema de Análisis nCounter (modelo n° NCT-SYs T-120, NanoString Technologies; Geiss y col., 2008). Brevemente, 104 células TCAR+ específicas de HERV-K o células T sin ADN se lisaron en tampón de lisis RNeasy (RLT; 5 pl, Qiagen, Gaithersburg, MD) y el ARNm se hibridó con un conjunto de códigos informado y un conjunto de códigos de captura diseñado a medida utilizando el kit de Ensayo de Expresión Génica nCounter para 12 h a 65°C. Se utilizó una estación de preparación nCounter para los procedimientos posteriores a la hibridación. Se utilizó el software Nanomir para normalizar los niveles de ARNm con un control interno. Se utilizaron el programa R, la vista de árbol y la vista de grupo para generar los datos con análisis estadístico. Los resultados normalizados se expresaron como el nivel relativo de ARNm. Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, www.ingenuity.com) se realizó en genes estadísticamente significativos para comprender su interacción biológica basándose en una base de datos derivada de fuentes bibliográficas.

Análisis de Integración.ADN genómico de células T CAR+ específicas de HERV-K se aislaron usando un mini kit de ADN QIAamp (Qiagen) y se realizó una PCR en tiempo real como se describió anteriormente (Maiti y col., 2013). ADN genómico de células Jurkat (clon #14) que lleva una sola integración de la copia CAR descrita anteriormente se utilizó como control positivo (Maiti y col., 2013). El experimento se realizó por triplicado con 100 ng de ADN genómico mezclado con 10 pl de TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), 1 pl (1x sonda a 250 nM y 1x cebador a 900 nM) de 20x FAM- conjunto de cebadores de sonda TaqMan específicos para CAR marcados específicos para IgG4Fc [directos (5'-GAGGGCAACGTCTTTAGCTG-3 '; SEQ ID NO: 15) y cebadores inversos (5'-GATGATGAAGGCCACTGTCA-3'; SEQ ID NO: 16) y sonda marcada con carboxifluoresceína (FAM) (5'-AGATGTTCTGGGTGCTGGTC-3'; SEQ ID NO: 17)] y 1 pl (1x cebador a 900 nM y 1x sonda a 250 nM) de 20x juego de cebadores de sonda TaqMan RNaseP marcado con VIC (Applied Biosystems) en un volumen de reacción total de 20 pl. La hibridación del cebador se produjo en la porción de IgGFc4 del CAR. El ciclo de amplificación incluyó 2 minutos a 50°C, 10 minutos a 95°C y cuarenta ciclos de 15 segundos a 95°C y 1 minuto a 60°C. La detección se realizó con un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems). El gen autosómico RNaseP, presente en 2 copias por célula diploide, se utilizó como referencia endógena para la normalización (Jin y col., 2011). Se utilizó el procedimiento AACt (Applied Biosystems, CA) para calcular el número de integraciones con referencia a RNaseP y Clon Jurkat como controles de normalización.

Ensayo de liberación de cromo (CRA).El CRA se realizó como se describió anteriormente (Maiti y col., 2013; Jin y col., 2011). Brevemente, dianas HERV-K+ve se trataron con 51Cr durante 2 h y se incubaron con células T CAR+ específicas de HERV-K del día 35 o células T de control sin ADN y el porcentaje de liberación de 51Cr se calculó mediante la siguiente fórmula:

^ Liberación experimental — Liberación de fondo

% lib e ra c ió n de 51 C r = -------------------------------------------------------------------- x 100 Liberación máxima — Liberación de fondo

Obtención de Bio-imágenes por Lapso de Tiempo.(A) Para visualizar el acoplamiento de CAR con el antígeno en las células tumorales, se realizó obtención de imágenes por lapso de tiempo utilizando un sistema BioStation IM CellS1/Cell-S1-P (Nikon, Melville, NY). Células parentales K562 se tiñeron con anticuerpo anti-HERV-K APC (1 pg) y las células CAR+ específicas de HERV-K se tiñeron para la expresión de la superficie de CAR usando el fragmento F(ab')2 marcado con FITC de anticuerpo Fcy anti-humano de cabra (5 pl, BD Biosciences). Las células T y las células diana se mezclaron en una proporción de 5:1 y se sembraron en medio de cultivo RPMI completo sobre una placa de fondo de vidrio T-35 mm (Fisher Scientific, Hampton, NH). Se tomaron imágenes de las células inmediatamente cada 2 minutos a 37°C durante un máximo de 8 h. Cada imagen se registró a 1600 * 1200 píxeles con un objetivo de 20X, utilizando contraste de fase, canal de fluorescencia 2 para observar células T CAR+ específicas de HERV-K verdes, y canal de fluorescencia 3 para observar células K562 rojas con un tiempo de exposición de 1/125 y 1/5 seg, respectivamente. El acoplamiento de CAR con el antígeno se observó cuando el antígeno marcado con APC se superpuso con el CAR marcado en verde.

(B) Para visualizar y cuantificar el tiempo necesario para que células T CAR+ específicas de HERV-K maten una célula tumoral, las células tumorales se colocaron en placas con células T CAR+ específicas de HERV-K en una placa con fondo de vidrio T-35 mm con RPMI completo conteniendo 1 ng/mg Sytox® (Invitrogen). La muerte de las células tumorales se registró como el momento en que se perfora la pared de la célula tumoral y las células se vuelven verdes utilizando el sistema BiostationlM cell-Sl-P (Nikon). La intensidad de la fluorescencia verde en cada célula tumoral se registró utilizando software de imágenes de células vivas (Nikon) durante un período de 15 h.

Ensayo de liberación de IFN-y intracelular. Células T CAR+ específicas de HERV-K se cocultivaron con células tumorales a una proporción 1:10 en una placa de 96 pocillos de fondo redondo con 200 pl de medio de cultivo RPMI completo. Se añadió inhibidor del transporte de proteínas (BD Golgi Plug conteniendo Brefeldin A) en todos los pocillos para atrapar el IFN-y dentro de la célula. El co-cultivo se incubó durante 4 h a 37°C y a continuación se tiñó para la expresión de CAR específica de HERV-K durante 20 min a 4°C. A continuación, las células se lavaron, fijaron y permeabilizaron con 100 pl de tampón Cytofix/Cytoperm (n° de catálogo 555028) durante 20 min a 4°C. Las células permeabilizadas se tiñeron a continuación para la citocina con anticuerpo conjugado anti-IFN-y APC. Las células se lavaron y analizaron mediante FACSCalibur. Se utilizaron células T tratadas con PMA (forbol 12 miristato 13 acetato) e ionomicina (BD Biosciences) como controles positivos para este ensayo. Se realizaron ensayos similares con células T de control sin ADN.

Desarrollo de línea celular EL4 HERV-K+ve . Se suspendieron dos millones de células EL4 en solución de nuclofector de células T de ratón AMAXA (Amaxa, EE. UU.) con transposón SB que expresa el antígeno HERV-K y transposasa SB11 (2 pg de ADN total) hasta un volumen final de 100 ml . Esta suspensión se transfirió a una sola cubeta y se electroporó usando el programa C-09 en el electroporador Amexa. Las células se incubaron durante 4 h a 37°C en medio de electroporación suministrado con el kit complementado con FBS al 10% (Thermo Scientific Pierce). A continuación, las células se transfirieron a DMEM, FBS al 10% (Thermo Scientific Pierce) y 5% glutamax (Gibco Life Technologies). A continuación, estas células se cultivaron en presencia de 0,8 mg/ml de G418 y células EL4 HERVK+ve ve resistentes a neomicina se clasificaron usando anticuerpo HERV-K y se cultivaron para obtener una población pura de células.

Eliminación de HERV-K en células A888-mel mediada por ARNhc. Se cultivaron células A888-mel hasta una confluencia del 90% en una placa de 6 pocillos. Posteriormente, el medio se reemplazó con 100 pl de ARNhc específico de HERV-K o de lentivirus y polibreno ARNhc codificados (5 pg/ml) y se transdujo durante 4 h a 37°C y a continuación se reemplazó con medio RPMI regular. A continuación, las células se clasificaron basándose en la expresión de GFP y se cultivaron. Como control se utilizaron células A888-mel transducidas con ARNhc codificado. Se realizó un ensayo de inmunotransferencia de los lisados de la línea celular para determinar el grado de caída de HERV-K. El anticuerpo 6H5 HERV-K se utilizó para detectar la expresión del antígeno HERV-K en células A888-mel con ARNhc de HERV-K o ARNhc codificado o células parentales. Se lisaron diez millones de células con tampón RIPA que contenía inhibidor de proteasa (Roche Applied Science, San Francisco, CA). Se realizó un ensayo de BCA para detectar la concentración de proteínas (Thermo Scientific Pierce). Se usó gel de gradiente 4%-20% (Biorad, Hercules, CA) para procesar 10 pg de proteína hervida en tampón de carga SDS. A continuación, la proteína se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se bloqueó con 5% de leche en PBST y se incubó con anticuerpo 6H5 HERV-K (mg/ml). La unión se detectó mediante Fc-HRP de cabra anti-ratón (Sigma-Aldrich) y se desarrolló utilizando sustrato ECL Westfemto™ (Thermo Scientific Pierce). Se obtuvieron imágenes de la transferencia usando el software Versa doc Quantityone™ (Biorad) y se cuantificó la transferencia usando el software Image J.

Análisis in vivo. Modelo de melanoma metastásico: Ratones hembra de 5 semanas de edad NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtmiwji/SzJ (NSG) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) se inyectaron por vía intravenosa con 106 células A375-SM en el Día 0. Células A375-SM fueron previamente transducidas de forma estable con mKate-rRLuc y clasificadas por célula para población homogénea. Ratones en las cohortes de tratamiento (n = 7) comenzaron a recibir 2x106 células T CAR-FfLuc+ específicas de HERV-K a partir de los días 7, 14 y 21. IL-2 (600 U; eBioscience) se inyectó por vía intraperitoneal (i.p.) tres veces por semana durante el período de tratamiento. Una cohorte de ratones (n = 6) portadores del tumor no recibieron tratamiento mientras que un grupo de control de ratones (n = 3) sin tumor recibió un número similar de células T CAR+ como en el grupo de tratamiento.

Cuantificación de flujo: Se realizaron imágenes de bioluminiscencia (BLI) cada semana para obtener imágenes del tumor y la actividad de las células T in vivo.Los ratones fueron anestesiados y colocados en posición anteroposterior para BLI usando un sistema de la serie Xeno IVIS 100 (Caliper Life Sciences) como se describió previamente (Singh y col., 2007). Para obtener imágenes de la actividad de las células T CAR-ffLuc+ específicas de HERV-K, se inyectaron 150 pl (200 pg/ratón) de sal de potasio de D-luciferina (Caliper Life Sciences) intraperitonealmente (i.p.). Diez minutos después de la inyección, los fotones emitidos se cuantificaron usando el programa Living Image 2.50.1 (Caliper Life Sciences). Para obtener imágenes de la actividad de las células tumorales, se inyectaron i.p. 100 pl de Endurina (Promega, Fitchburg, WA) Veinte minutos después de la inyección, la actividad tumoral se cuantificó de forma similar a ffLuc. Se realizaron pruebas t de Student para datos no apareados para establecer la significación estadística del flujo.

Análisis Estadístico.Para analizar las diferencias estadísticas en la expresión de antígenos entre varios grados y etapas de melanoma y tejido normal, se utilizaron pruebas t de Student y ANOVA. Para analizar las diferencias entre el control, la expansión de células T CAR+ específicas de HERV-K, el análisis de fenotipo y los ensayos funcionales, se calcularon pruebas t de Student, medias, desviaciones estándar e intervalos de confianza (IC) del 95%. Para el modelo de melanoma metastásico, in vivo, se utilizaron pruebas t de Student para analizar la importancia de los datos de flujo entre el tumor y el grupo de tratamiento. Todas las pruebas estadísticas fueron bilaterales y se realizaron utilizando el software Graph Pad Prism (GraphPad Software Inc, San Diego, CA). Un valor de P de menos de 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Ejemplo 6 - Dirigirse a un antiguo retrovirus expresado en cánceres e infecciones utilizando células T adoptivas diseñadas para expresar receptor de antígeno quimérico - Resultados

Expression de HERV-K en muestras de pacientes con melanoma.Para dilucidar la relevancia fisiológica de HERV-K durante la invasión del melanoma y la metástasis in vivo, los inventores buscaron evaluar la expresión de la proteína de la envoltura del antígeno tumoral HERV-K en biopsias obtenidas de pacientes con diversas etapas de melanoma. Se analizaron mediante IHC tejidos de tumores malignos de doscientos sesenta y ocho pacientes y tejido benigno de piel y mama de cuarenta pacientes. La tinción del tejido tumoral se clasificó en función del porcentaje de células tumorales positivas para HERV-K y la intensidad de la tinción, y se calculó su producto para obtener el índice H. Los tejidos tumorales mostraron un nivel variado de intensidad de tinción y se puntuaron con 0, 1,2 o 3 (FIG. 16A) cuando se compararon con la tinción de control de isotipo en el mismo tejido. El antígeno se expresó en las células en forma de puntos a lo largo de la superficie celular como se muestra con una flecha sólida o como tinción citoplásmica difusa como se muestra con una flecha de puntos (FIG. 16B). Esto puede sugerir la circulación y acumulación del antígeno en la superficie celular con el fin de eliminar la proteína viral (REF). Las células tumorales expresan un índice H de antígeno de HERV-K significativamente más alto en comparación con el tumor benigno (FIG. 16C). Aunque no hay diferencia en el índice H entre el tumor maligno y metastásico, se puede ver una diferencia significativa entre los tumores en la etapa I y II en comparación con los tumores en la etapa III y IV (FIGS. 16D, E). Para mostrar más la especificidad de la expresión de HERV-K en células tumorales y no en células normales, se analizaron tejidos de treinta y tres tipos de órganos normales obtenidos cada uno de tres donantes normales. No se observó expresión significativa de HERV-K en ninguno de los tejidos de órganos normales (FIG. 22). Estos resultados sugieren que la regulación positiva de HERV-K específicamente en células tumorales puede servir como un marcador diana único para la inmunoterapia.

Propagación y caracterización de células T CAR+ específicas de HERV-K.El anticuerpo monoclonal (mAb) específico de env de HERV-K se desarrolló en ratón y el clon de mAb 6H5 resultó ser el más sensible para detectar antígenos in vitro (Wang-Johanning y col., 2003). La secuencia scFv del clon de mAb 6H5 se utilizó para construir el CAR. El casete scFv se fusionó con la región IgG4Fc mediante un enlazador flexible, seguido por la transmembrana CD28 y los dominios intracelulares CD28 y CD3z. A continuación, se clonó en el vector de transposón SB (FIG. 17A).

Para generar células T CAR+ específicas del antígeno env de HERV-K, los inventores electroporaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con transposón SB junto con transposasa SB11 y propagaron las células en K562 aAPC HERV-K+ve derivado endógenamente. Para propagar selectivamente las células T con expresión estable de CAR, estas aAPC, que expresan endógenamente el antígeno HERV-K, se modificaron genéticamente para coexpresar las moléculas coestimuladoras de células T deseadas CD86, 4-1BBL e IL-15 unida a la membrana (coexpresadas con proteína fluorescente verde mejorada, EGFP) (Singh y col., 2008). Las PBMC sin ningún transposón sometidas a electroporación, cultivadas en aAPC cargadas con OKT3 en las mismas condiciones de cultivo, sirvieron como control negativo sin ADN.

La expresión de CAR se detectó usando un anticuerpo policlonal Fc específico para la región IgG4Fc. Células T CAR+ se tiñeron con anticuerpo Fc cada siete días antes de complementar el cultivo con aAPC irradiadas. Los datos de flujo revelaron que el 95% de las células T expresan CAR en su superficie, lo que podría detectarse hasta durante 35 días de cultivo (FIG. 17B). No se observaron diferencias significativas en la cinética de crecimiento de células T CAR+ específicas de HERV-K en comparación con células de control sin ADN y todas las células T CAR+ específicas de h Er V-K eran células T CD3+ el día 14 de cultivo (FIGs. 17C, D). El porcentaje promedio de CD4 CAR+ aumenta mientras las células CD8 CAR+ disminuyen a lo largo del período de cultivo (FIG. 23A). Análisis de PCR en tiempo real sobre el ADN genómico de células T CAR+ específicas de HERV-K en comparación con células de control sin ADN mostraron que hay menos de dos integraciones del CAR en el genoma de las células T CAR+ (FIG. 17D). Las células T CAR+ cultivadas tienen un fenotipo de memoria efectora, que incluye células CD3+CD56+CD45RO+TCRap+CD27negCCR7neg con potencial lítico sustancial observado por los niveles de Granzima B (FIG. 17F).

Los niveles de ARNm de células T CAR+ específicas de HERV-K de tres donantes normales se midieron y se compararon con los niveles de ARNm de células T de control sin ADN el Día 28 de cultivo usando análisis nCounter. Células T CAR+ específicas de HERV-K tenían niveles significativamente más altos de quimioatrayentes, reguladores transcripcionales y activadores. Niveles elevados de Perforina1 y Granzima H en células T CAR+ muestran el mayor potencial lítico de estas células (FIG. 23B). Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (p <0,05) sugirió que varios de estos genes regulados positivamente en células T CAR+ específicas de HERV-K estaban implicados en la activación de NF-kB. El quimioatrayente y las citocinas estaban involucradas en la regulación de IL-10, IFN-y e IL-12 (FIG. 23C). Estos datos refuerzan la observación anterior de que células T CAR+ específicas de HERV-K tienen un fenotipo efector central.

Caracterización de funcionalidad de células T CAR+ HERV-K.La expresión de antígeno en líneas celulares de melanoma, tales como A888, A375, A375-SM, A624 se analizó usando el anticuerpo monoclonal 6H5 dirigido contra la proteína env de HERV-K (FIG. 18A). La expresión del antígeno HERV-K en células de melanoma se comparó con el control de isotipo (IgG2a de ratón). Para analizar la funcionalidad de células T CAR+ específicas de HERV-K, células tumorales HERV-K+ se pulsaron con cromo radiactivo y se cultivaron con proporciones variables de células T CAR+ específicas de HERV-K. CRA se realizó con control sin ADN como control negativo. Se observaron niveles significativamente más altos de lisis de células tumorales HERV-K+ con células T CAR+ específicas de HERV-K cuando se comparan con células T de control sin ADN (FIG. 18B). Un CAR no relacionado, como células T CAR+ específico de CD19 también se usaron para realizar CRA y se observaron niveles basales de destrucción no específica con células tumorales positivas al antígeno HERV-K en comparación con células tumorales positivas al antígeno CD19, tales como células EL-4 portadoras del antígeno CD19 (FIG. 24A).

Para demostrar aún más la funcionalidad de estas células T CAR+ específicas de HERV-K , se realizó una liberación de IFN-y de cuatro horas. Dianas de tumores de melanoma se cultivaron conjuntamente con células T CAR+ específicas de HERV-K o células T de control sin ADN en una proporción de 1:10 y niveles de citocinas intracelulares se analizaron mediante citometría de flujo. Células T cultivadas con PMA-Ionomicina sirvieron como control positivo. Las células T CAR+ específicas de HERV-K mostraron niveles más altos de liberación de IFN-y en comparación con células T de control sin ADN (FIG. 18C) y este resultado se correlaciona con el CRA.

Especificidad de células T CAR+ específicas de HERV-K.Para mostrar la especificidad de las células EL-4 CAR, HERV-Kneg específicas de HER-K, se sometieron a electroporación con vector SB bidireccional que codifica el antígeno HERV-K bajo el promotor hEF-1a y resistencia a neomicina bajo el promotor CMV (FIG. 25A ). Las células EL-4 HERV-K+ve a continuación se clasificaron y se cultivaron en una sola célula en presencia de un marcador de selección de mamíferos, neomicina, para obtener una población que expresa env de HERV-K puro. Curiosamente, estas células perdieron la expresión del antígeno HERV-K dentro de los diez días posteriores al cultivo debido a la modificación postraduccional y la escisión proteolítica. Se realizó un CRA de cuatro horas en estas células EL-4 HERV-K+ve dentro de los diez días posteriores a la clasificación. Células EL-4 HERV-K+ve pulsadas con cromo y células parentales EL4 HERV-Kneg se cocultivaron con concentraciones variables de células T CAR+ específicas de HERV-K y lisis específica de tumor graduada se observaron de una manera específica de antígeno (FIG. 19B).

Para demostrar aún más la especificidad, se eliminó el antígeno env de HERV-K en células de melanoma A888 utilizando lentivirus de ARNhc. Un análisis de inmunotransferencia mostró una eliminación de aproximadamente 50% en el nivel de proteína HERV-K en comparación con el ARNhc codificado parental y control A888 (FIG. 19C). Un CRA de células T CAR+ específicas de HERV-K con las células eliminadas de HERV-K, A888 parental y A888-con ARNhc codificado mostraron una reducción significativa en la destrucción con eliminación de HERV-K en comparación con las células tumorales parentales y de control (FIG. 19D).

Se obtuvieron imágenes de lapso de tiempo para visualizar y cuantificar el tiempo necesario para que células T CAR+ destruyan el tumor diana y el número de células tumorales destruidas durante un período de 15 h. Las células tumorales y las células T se cultivaron en una proporción de 1:5 en presencia de Sytox®, que hace que las células se vuelvan verdes cuando se daña la membrana celular. Como la diana del melanoma, las células A888 y A375 fueron destruidas por las células T CAR+ específicas de HERV-K, un pico en la fluorescencia verde fue reportado alrededor de las 5 h, que aumentó gradualmente durante un período de tiempo de 15 h. No se observó destrucción con dianas parentales HEK293.de HERVK-Kneg . Aproximadamente el 30% de las células A888 y el 35% de las células A375 fueron destruidas por células T CAR+ durante un período de 15 h. Para visualizar el acoplamiento de CAR específico de antígeno, las células K562 se tiñeron positivas para el antígeno HERV-K en rojo y CAR específico de HERV-K se tiñó para Fc en verde. El solapamiento de CAR y antígeno se observó durante un período de 5 h, después de lo cual las células internalizaron el antígeno unido al anticuerpo y el CAR (FIG. 26A).

Capacidad de destrucción de tumores de células T CAR+ específicas de HERV-K in vivo. Las PBMC se sometieron a electroporación doble con vectores SB que codifican CAR específico de HERV-K y myc-FFLuc con transpsosasa SB11. El vector SB con el gen myc-ffLuc tiene un gen de resistencia a neomicina unido a través de un enlazador (FIG. 27A). Estas células T CAR-ffLuc+ específicas de HERV-K tenían una cinética de crecimiento similar a las células CAR+ específicas de HERV-K y su capacidad y especificidad de destrucción de tumores fueron comparables (FIGs. 27b , C).

Se desarrolló un modelo de melanoma metastásico en el que se infundió la línea celular A375-supermetastásica (A375-SM) a través de la vena de la cola de ratones NSG. Estas células se injertaron en los pulmones y hicieron metástasis en el hígado. Para visualizar la reducción de la masa tumoral de forma no invasiva, las células tumorales se transdujeron con un vector lentiviral que porta el gen mKate-rRLuc y se clasificaron usando el marcador mKate para obtener una población pura de las células (FIG. 21A). Después de una semana de injerto de células tumorales, 20 millones de células T CAR+ se infundieron por vía intravenosa los días 8, 15 y 22 junto con IL-2 (i.p.) dos veces por semana durante tres semanas. Se utilizaron imágenes de bioluminiscencia (BLI) para evaluar la actividad rRLuc en cada grupo de ratones. El grupo de ratones con células tumorales solas tuvo una actividad de luciferasa significativamente mayor el día 25 en comparación con el grupo de ratones con células tumorales que recibieron las células T CAR+ HERV-K (FIGs. 21A, b ). También los ratones con tumor solo se volvieron moribundos el día 28 debido a la alta metástasis del tumor al hígado, mientras que el grupo de ratones que recibió las células T CAR+ exhibieron un apetito y una actividad saludables.La obtención de imágenes ex vivo de mKate en células tumorales mostró que los ratones con tumor solo tenían sustancialmente más colonias tumorales en el hígado que el grupo de tratamiento (FIG. 21C). El examen patológico demostró esta observación en la que el grupo de tumores tenía colonias metastásicas en el hígado significativamente más altas en comparación con el grupo de tratamiento, lo que sugiere el papel de las células T CAR+ HERV-K para reducir el crecimiento tumoral y la metástasis (FIG. 21D).

Discusión. Estos resultados muestran que las células CAR+ específicas de HERV-K pudieron apuntar con éxito a una glicoproteína viral y matar células tumorales HERV-K+ de una manera específica de antígeno in vitro y reducen el crecimiento del tumor del melanoma y la metástasis in vivo.

HERV-K env es marcadamente regulado positivamente durante la metástasis del melanoma y está presente exclusivamente en las células tumorales y no en los melanocitos normales adyacentes. En el melanoma, la proteína env de HERV-K está asociada con la activación de la vía MEK-ERK y p16INK4A-CDK4 relacionada con la progresión del tumor (Li y col., 2010). El mimetismo molecular de HERV-K también da como resultado niveles reducidos de glutatión peroxidasa, lo que da como resultado un aumento de las especies reactivas de oxígeno en el tejido que conduce a la melanomogénesis (Krone y col., 2005). Los niveles anormales de expresión de env de HERV-K parecen ser un factor desencadenante involucrado en la aparición del melanoma que resulta en modificaciones morfológicas y celulares que dan como resultado la progresión del tumor (Serafino y col., 2009). La modulación de la transcripción viral de HERV-K resultó en un aumento de la inflamación y diferenciación morfológica en las células de melanoma (Sciamanna y col., 2005). La micromatriz de tejido representa niveles aumentados de expresión de antígeno que se correlacionan con la progresión del melanoma, mientras que el tejido humano normal tiene un nivel basal o una ausencia de expresión de HERV-K.

La naturaleza inmunogénica del melanoma lo convierte en un modelo atractivo y una diana para desarrollar una potente terapia basada en células T. Una de las principales limitaciones de la terapia basada en células T es la restricción basada en HLA en TCR, que limita el reconocimiento de antígenos (Garrido y col., 1997. La modificación genética de las células T para expresar un receptor específico de antígeno tumoral elude esta restricción y confiere un reconocimiento de antígeno no basado en h La (Gross y col., 1989). Las modificaciones de las células T pueden producirse mediante el uso de vectores virales o no virales. El vector Bella Durmiente es una estrategia no viral para introducir genes en las células T. Una de las principales ventajas del sistema Bella Durmiente sobre otros procedimientos de transducción viral es que es genéticamente seguro, eficiente y menos costoso que la transducción retroviral (Maiti y col., 2013). Cultivando estas células T CAR+ con IL-2 e IL-21 se producen suficientes células para fines de infusión. Esto ha llevado a ensayos clínicos preliminares con células T CAR+ CD19 contra neoplasias malignas del linaje B. Células T CAR+ específicas de HERV-K se cultivaron de manera similar a las células T CAR+ CD19 de grado clínico. Estas células T c Ar específicas de HERV-K eran principalmente de un fenotipo de memoria efectora, que están bien adaptadas para atacar y destruir células tumorales.

Se sabe que múltiples factores, como citocinas, hormonas y sustancias químicas, regulan los niveles de HERV-K durante el cáncer (Taruscio y Mantovani, 2004). Se sabe que el antígeno env de HERV-K circula entre la membrana celular y el citoplasma y también se desprende de la superficie celular en ciertas condiciones tumorales. Por lo tanto, el uso de la terapia con células T adoptivas puede ser una estrategia de tratamiento favorable que solo requiere la expresión transitoria del antígeno en la superficie celular.

El antígeno env de HERV-K también se encuentra asociado con cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, linfoma, teratocarcinoma, enfermedades autoinmunes, como la esclerosis múltiple, y enfermedades infecciosas, como el VIH (Wang-Johanning y col., 2003; Contreras-Galindo y col., 2008; Jones y col., 2012; Ono, 1986; Wang-Johanning y col., 2007). Por tanto, dirigirse al antígeno env usando terapia adoptiva de células T puede ser una opción de tratamiento para múltiples enfermedades. Según esta hipótesis, HERV-K env puede ser dirigido de manera exitosa y selectiva por células T CAR+ HERV-K. La infusión de estas células T CAR+ modificadas genéticamente in vivo fue asociada con la regresión tumoral y la reducción de la metástasis que muestra la actividad antitumoral de estas células.

Ejemplo 7: Uso de citocinas unidas a la membrana para generar células T con potencial in vivo de larga duración para su uso en inmunoterapia de enfermedad residual mínima

Generación y expresión de mIL15. La construcción mIL15 (FIG. 28) fusiona la secuencia de ADNc de IL-15 (NM_000585.4) al IL-15Ra de longitud completa (NM_002189.3) con un enlazador de serina-glicina. Se omitieron los péptidos de señal para IL-15 e IL-15Ra y el péptido de señal IgE (gb|AAB59424.1) se utilizó para la construcción mIL15. Esta construcción producirá una IL-15 que está unida a la membrana, pero también se presenta en el contexto de IL-15Ra, que es similar al modelo de transpresentación descrito anteriormente. Los plásmidos de ADN fueron sintetizados por GeneArt (Regensburg, Alemania) y posteriormente subclonados en un plásmido Bella Durmiente (un procedimiento de transferencia de genes no viral). Se co-electroporaron células T humanas primarias con un plásmido CAR (específico para CD19), con o sin el plásmido mIL15, y el transposón SB-11. La propagación y expansión de las células T modificadas genéticamente se logró mediante estimulación semanal de un antígeno artificial K562 CD19+ presentando la variante celular (aAPC) que expresa moléculas coestimuladoras de 41BBL y CD86. El CAR utilizado es un CAR de 2a generación que contiene dominios citoplásmicos de señalización CD3Z y CD28. La presencia de CD19 en la aAPC permite el crecimiento selectivo de células T específicas de antígeno mientras que las moléculas coestimuladoras mejoran la expansión in vitro . La molécula de mIL15 se puede coexpresar de forma estable con el CAR por las células T modificadas y las células T que coexpresan representan la mayor parte de la población (FIG.

29). Además, la expresión de CAR total en las células T modificadas alcanza más del 90% para las células T modificadas con mIL15-CAR (FIG. 29).

Funcionalidad de mIL15. La señalización del complejo receptor de IL-15 induce principalmente la fosforilación del transductor de señal y el activador de la transcripción 5. Observando STAT5 fosforilado (pSTAT5) usando Phosflow, se puede determinar si mIL15 es capaz de inducir la vía de señalización de citocinas. Los niveles de pSTAT5 estaban elevados en células T CAR+ que han recibido suplementación con citocinas con estos niveles abrogados por inanición de suero y citocinas. En condiciones de inanición, los niveles de pSTAT5 en células T mIL15+CAR+ fueron mantenidos(FIG. 30). Estos datos demuestran que mIL15 es funcional y activa la porción pSTAT5 de la vía de señalización de citocinas.

Propagación de números clínicamente significativos de células T mIL15+CAR+. Al redirigir la especificidad de las células T con el CAR, el foco en la expansión ex vivo está en conducir la población de células T CAR+ , en este caso CAR con o sin mIL15. Células CAR+ estándar se cultivan con IL-2 e IL-21 solubles mientras que a células T mIL15+CAR+ se les administró IL-21 soluble para aprovechar una sinergia informada entre IL-15 e IL-21. Las células mIL15+CAR+ suplementadas con IL-21 demostraron una expansión comparable a la de las células T CAR+ estándar, así como las células T CAR+ de control a las que se les administra IL-15 e IL-21 (P = 0,53, ANOVA de 2 vías; FIG. 31). La expansión ex vivo de células T mIL15+CAR+ producen un número de células clínicamente significativo.

Evaluación del fenotipo y la funcionalidad de células T mIL15+CAR+. El fenotipo de las células T mIL15 + CAR+ expandidas ex vivo es muy similar al de las células T CAR+ excepto para la expresión de IL-7Ra. El fenotipo general de las células, que en este momento representa el producto de infusión, son predominantemente células T CD8+ (citotóxicas) con expresión de moderada a alta de los marcadores de activación CD45RO y CD25. Hubo niveles variables de bajos a moderados de la expresión de marcadores asociados con la memoria de las células T (CD62L, CCR7, CD27 y CD28) (FIG. 32A) para ambos grupos de células T. Después de la expansión ex vivo de las células T modificadas, es necesario que las células T retengan su especificidad de células T redirigidas y su función lítica. Se realizó un ensayo de liberación de cromo para evaluar la función de las células T en el producto de expansión. Dianas EL-4 CD19+ y CD19' se sembraron en placas con las células T modificadas en proporciones variables de efector a diana. Lisis específica de dianas tumorales CD19+ se demostraron en todas las proporciones de efector a diana tanto por células T mIL15+CAR+ y células T CAR+ (P < 0,001, ANOVA de 2 vías, n=3) y no diferían entre sí (P > 0,05, ANOVA de 2 vías). Lisis de diana CD19+ por células T mIL15+CAR+ fue específica y significativamente diferente de lisis de fondo de dianas CD19' (P < 0,001, ANOVA de 2 vías) (FIG. 32B). Las células T mIL15+CAR+ retuvieron su especificidad redirigida y su capacidad lítica.

Subconjuntos de células T mIL15+CAR+ específicas persisten a largo plazo in vitro y siguen siendo funcionales.

Para evaluar la persistencia in vitro a largo plazo, la estimulación de cuatro aAPC expandió células T mIL15+/_CAR+ que se cultivaron a largo plazo sin más reestimulación del antígeno. Células T CAR+ recibieron IL-2, IL-15 o ningún suplemento de citocinas mientras que células T mIL15+CAR+ no recibieron citocinas exógenas. Como se anticipó, células T CAR+ que no recibieron ningún suplemento de citocinas no persistieron. Las células mIL15+CAR+ así como células T CAR+ que recibieron IL-2 o IL-15 tuvieron una expansión relativa significativamente mayor que las células T CAR+ sin suplementar (P < 0,0001, ANOVA de medidas repetidas, n=3; FIG. 33A). El mantenimiento de la expansión relativa de las células T mIL15+CAR+ cercana a cero también sugiere que estas células modificadas no están creciendo sin restricciones. Para ser un beneficio para la aplicación clínica, células T CAR+ deben seguir respondiendo al antígeno. Por lo tanto, estas células T a más de 75 días desde el encuentro con el antígeno fueron expuestas: sin diana, EL-4 CD19- , EL-4 CD19+ , Nalm-6 CD19+ (una línea celular de leucemia humana) o la producción de un cóctel activador de linfocitos (LAC) e interferón y (IFNg) se evaluaron mediante tinción de citocinas intracelulares después de 6 horas de incubación con las dianas. Similar a las células T CAR+ que reciben IL-2 o IL-15, las células T mIL15+CAR+ también produjeron IFNg en respuesta a dianas CD19+ y el LAC (FIG. 33B). En otro ensayo, estas células T con retirada de 75 días se estimularon con aAPC y se suplementaron con IL-21. Por lo tanto, células T CAR+ cultivadas con IL-2 ahora tenían IL-2 e IL-21 proporcionadas, las células T cultivadas con IL-15 a continuación recibieron IL-15 e IL-21, y las células T mIL15+CAR+ se complementaron con IL-21 únicamente. La viabilidad de las células T se evaluó mediante tinción con Anexina V ocho días después de la estimulación con aAPC. Se demostró que las células T mIL15+CAR+ tienen la mayor población de células vivas (Anexina V neg) (FIG. 33C) e indica una resistencia a la muerte celular inducida por activación.

Células T mIL15+CAR+ persistentes poseen rasgos de células T menos diferenciadas. Al caracterizar las células T mIL15+CAR+ persistentes a largo plazo, los inventores plantearon la hipótesis de que células T mIL15+CAR+ persistentes exhibirían características asociadas con subconjuntos de células T menos diferenciadas, ya que estos subconjuntos de células son conocidos por su potencial de larga duración. Con la presencia constitutiva, y por lo tanto la posible señalización constitutiva, durante el cultivo ex vivo de las células T mIL15+CAR+ , los inventores evaluaron si estas células T tenían una programación molecular para un estado menos diferenciado que produciría células con una ventaja de persistencia. El análisis del perfil de genes digital multiplexado utilizando el sistema de análisis nCounter se realizó en células T CAR+ y mIL15+CAR+ de la estimulación 4 (entrada de células T del ensayo de retirada). El análisis de los conteos de ARNm normalizados utilizó un programa estadístico basado en distribución binomial negativa (Lohse y col., Nucleic Acids Res. (2012) 40, W622-7). Los genes se consideraron expresados significativamente diferencialmente si eran mayores que el doble de conteos de ARNm diferencial, P < 0,05, FDR q < 0,05. Sólo cinco genes se consideraron expresados diferencialmente utilizando estos criterios, lo que indica que no hay ninguna ventaja de programación molecular o de cultivo proporcionada por mIL15.

Los inventores a continuación caracterizaron las células T mIL15+CAR+ persistentes a largo plazo. En primer lugar, se evaluó su fenotipo utilizando marcadores CD45RA y CCR7 para describir fenotípicamente su estado de diferenciación. Estos marcadores caracterizan el estado de diferenciación de las células T como CD45RA+CCR7+ < CD45RA'CCR7+ < CD45RA'CCR7‘ < CD45RA+CCR7' representando células desde el estado menos diferenciado al más diferenciado. Al comparar las células T mIL15+CAR+ extraídas el dia 75 a sus contrapartes al inicio del experimento (las células T mIL15+CAR+ Stim 4), se observó que el cultivo de células T mIL15+CAR+ persistente tiene una mayor proporción de subconjuntos de células CD45RA+CCR7+ y CD45RA+CCR7' (***p < 0,001, A n OVA 2-direccional de medidas repetidas, n=7; FIG. 34). La expresión de CCR7 mejoró significativamente en las células T mIL15+CAR+ retiradas en relación con las células T CAR. La viabilidad de los subconjuntos CCR7neg y CCR7+ se evaluó mediante tinción con Anexina V de células T mIL15+CAR+ , células T CAR+ recibiendo IL-2 (50U/ml), y células T CAR+ recibiendo IL-15 soluble (5ng/ml) después de la retirada del antígeno. Se encontró que, independientemente del tipo de estimulación de citocinas (IL-2, complejo IL-15 o mIL15), células T CCR7neg mostraron frecuencias iguales de células vivas. Por el contrario, las células T CCR7+ expuestas a mIL15 tenían una viabilidad significativamente mayor que las células T CAR que reciben el complejo IL-2 o IL-15 (ambos P <0,05; FIG. 34). Estos datos sugieren que mIL15 es suficiente para respaldar el fenotipo CCR7+ que contribuye así a mantener el subconjunto de células T CD45RA+CCR7+ menos diferenciado. La capacidad de las células T mIL15+CAR+ para promover la persistencia de células T menos diferenciadas es un fenotipo deseado para la terapia adoptiva y parece corroborar otros estudios que informan que los subconjuntos de células T de vida larga poseen un fenotipo menos diferenciado. Además, también se observó la supervivencia de un subconjunto altamente diferenciado, posiblemente respaldado por la señalización constitutiva de IL-15.

Células T mIL15+CAR+ persistentes de larga duración muestran algunos marcadores moleculares asociados con subconjuntos de células T menos diferenciados. Se analizaron los patrones de expresión génica de las células T utilizando el sistema de análisis nCounter y se produjo un mapa de calor agrupado jerárquicamente de genes expresados diferencialmente entre las células T mIL15+CAR+ de la estimulación 4 y las que sobrevivieron hasta el día 75 de la retirada (> corte 2 veces , P < 0,05, FDR q < 0,05). Estos estudios identificaron 108 genes expresados significativamente diferencialmente (> corte 2 veces, P < 0,05, FDR q < 0,05). La clasificación de Gene Ontology se evaluó mediante la anotación funcional DAVID. La clasificación funcional de los genes expresados diferencialmente se puede agrupar en categorías amplias: activación, diferenciación, proliferación y apoptosis de células T. Es decir, hubo un mayor número de genes en células T mIL15+CAR+ que estaban reguladas negativamente en la regulación positiva de la diferenciación, regulación de la apoptosis e inducción de la apoptosis. Mayor número de genes en células T mIL15+CAR+ se regularon positivamente en la regulación negativa de la diferenciación y la vía de señalización Wnt (FIG. 36). Esto sugiere que la firma molecular de células T mIL15+CAR+ persistentes está menos diferenciada que las células T mIL15+CAR+ en la estimulación 4 (células T al inicio del experimento).

La expresión de genes seleccionados se validó mediante citometría de flujo. Expresión de factores de transcripción asociados con un estado menos diferenciado (Tcf-7) y adquisición de estado función/diferenciado efector (Blimp-1 y Tbet) indican que células T mIL15+CAR+ persistentes exhiben un equilibrio de factores de transcripción asociado con células menos diferenciadas. Esto se caracteriza por una mayor expresión de Tcf-7 y una menor expresión de Blimp-1 y Tbet (FIG. 37). La evaluación de los marcadores de superficie celular IL-7Ra y CCR7 se realizó, ya que se expresan de forma característica por subconjuntos de células T menos diferenciadas. Las células T mIL15+CAR+ persistentes tienen una mayor expresión de estos marcadores asociados con subconjuntos de células T de vida larga (FIG. 38). Una medida adicional para distinguir el nivel de diferenciación de las células T es la capacidad de las células T menos diferenciadas para producir IL-2. Las células T mIL15+CAR+ de los cultivos de estimulación 4 o de retirada de 75 días se trataron de forma simulada o se trataron con LAC durante 6 horas y a continuación se evaluaron para determinar la producción de IL-2 mediante tinción de citocinas intracelulares. Las células T de estimulación 4 fueron incapaces de producir IL-2 mientras que las células T de retirada de 75 días persistentes adquirieron la capacidad de producir IL-2 (FIG. 39). Estos resultados sugieren colectivamente que si bien no existe una diferencia identificable entre células T CAR + expandidas ex vivo o células T mIL15+CAR+ , las células T mIL15+CAR+ persistentes a largo plazo resultantes presentan características asociadas con subconjuntos de células T menos diferenciadas que demuestran una supervivencia a largo plazo in vivo. in vivo.

Persistencia In vivo y eficacia antitumoral de células T mIL15+CAR+ en un modelo de alta carga tumoral. Para evaluar la persistencia in vivo , células T mIL15+CAR+ y células T CAR+ se modificaron conjuntamente para expresar luciferasa de luciérnaga (ffLuc) para permitir la monitorización longitudinal de células T in vivo utilizando imágenes de bioluminiscencia (BLI). Estas células T modificadas se transfirieron adoptivamente, utilizando una infusión de células T de 20 x 106 células T CAR+ , en ratones NSG que portan tumor maligno Nalm-6 (CD19+) diseminado con un grupo de control sin tratamiento. Después de 14 días, los ratones fueron sacrificados. Al tiempo que las células T CAR+ no se mostraron persistentes, se observó mediante BLI que las células T mIL15+CAR+ persistían durante el período de formación de imágenes de 11 días (FIG. 40B). La médula ósea, el bazo y la sangre periférica se recogieron y evaluaron mediante citometría de flujo para determinar la presencia de células T humanas utilizando CD3 humano como marcador y eliminando linfocitos murinos. Los ratones infundidos con células T mIL15+CAR+ tenían células T CD3+ significativas detectadas en la médula ósea (0,49-2,17%, P = 0,0001, prueba fno apareada, n = 5), bazo (1,15-12,38%, P < 0,0001, prueba fno apareada, n = 5) y sangre periférica (58,39-92,60%, P < 0,0001, prueba t no apareada, n = 5) (FIG. 40C). No hubo células CD3+ detectadas en muestras del grupo tratado con células T CAR+ (FIG. 40C) y el grupo sin tratamiento (solo tumor) en cualquiera de los tejidos evaluados. En este modelo, células T mIL15+CAR+ demostraron el control del tumor en la sangre periférica (FIG. 40D), pero no se observó una eliminación completa del tumor. Estos datos indican que a pesar de la prevalencia del antígeno tumoral, células T CAR+ tuvieron una persistencia in vivo insuficiente mientras que células T mIL15+CAR+ estaban presentes en niveles significativos en todo el cuerpo.

Persistencia In vivo y eficacia antitumoral de células T mIL15+CAR+ en un modelo de baja carga tumoral. A continuación, los inventores evaluaron el injerto de células T y la actividad antitumoral en un modelo preventivo con una carga tumoral baja. Las células T modificadas (mIL15+/'CAR+ffLuc+) se infundieron en los ratones NSG sin citocinas exógenas y se dejaron injertar durante seis días antes de una infusión de Nalm-6 modificado con luciferasa de renilla (rLuc). Los ratones se sometieron a BLI en el transcurso de 30 días. En este modelo preventivo, se observó que las células T mIL15+CAR+ persistían durante toda la duración del experimento y evitaban el injerto tumoral, que fue un efecto antitumoral significativo en comparación con los grupos de tratamiento con células T CAR+ y sin células T (P < 0,0001, ANOVA unidireccional, n = 4-5) (FIG. 41C-D). El análisis de los órganos y la sangre periférica mediante citometría de flujo detectó células T CD3+ humanas en el grupo de gtratamiento con células T mIL15+CAR+ , pero, curiosamente, las células T solo se encontraron en la médula ósea (FIG. 41E) y pueden indicar un retorno o supervivencia preferencial después del encuentro con el tumor. En un experimento similar, se probó la supervivencia y los ratones tratados con células T mIL15+CAR+ exhibieron una supervivencia significativamente mejorada en comparación con los ratones sin tratamiento con células T o tratados con células T CAR+ [P = 0,045 (células T mIL15+CAR+ frente a células T CAR+ , Prueba de Mantel-Cox de intervalo logarítmico, n = 7-8; FIG. 41).

Persistencia In vivo de células T mIL15+CAR+ en ausencia de activación de CAR. Para evaluar si células T mIL15+CAR+ pueden persistir a largo plazo in vivo sin la necesidad de señalización CAR, células T modificadas (mIL15+/'CAR+ffLuc+) se infundieron en ratones (sin tumor o citocinas exógenas) y se monitorizaron durante hasta 47 días. Probar las células T de esta manera también aclarará si las células T persistentes demuestran un crecimiento sin restricciones o si mantienen su población de una manera similar a la homeostática. Se observó que células T sin CAR+ persistían, mientras que la presencia de células T mIL15+CAR+ exhibió una persistencia sostenida en ausencia de citocinas exógenas y antígeno (FIG. 42B). Esto se confirmó además mediante citometría de flujo de células teñidas con CD3 aisladas de la médula ósea, el bazo y la sangre periférica (figura 43C). Al evaluar la persistencia longitudinal de células T, los valores de flujo indican que los niveles de células T mIL15+CAR+ parecieron estabilizarse con el tiempo o disminuir lentamente, pero no indicaron la aparición de expansión incontrolada (FIG. 42D). Estas células T persistentes se recogieron y expandieron ex vivo de la misma manera que se describió previamente para la expansión ex vivo de células T modificadas genéticamente. Estas células fueron capaces de activación específica de antígeno según se ensayó mediante la producción de interferón-Y (FIG. 42E). Estos datos in vivo demuestran una mayor persistencia de células T mIL15+CAR+ de forma independiente de CAR y similar a la homeostática, al tiempo que retienen su capacidad de respuesta específica de antígeno.

Proliferación celular y cinética de memoria en células T mIL15+CAR+. Se utilizaron análisis de citometría de flujo para caracterizar aún más células T mIL15+CAR+ (resultados mostrados en la FIG. 35). Células T mIL15+CAR+ persistentes a largo plazo se mantienen en cultivo con bajas tasas de recambio, como lo indica la dilución mínima de PKH durante 10 días en muestras que han estado en cultivo constante durante más de un año. Además, las células en división parecían ser predominantemente CCR7-. Dichos datos indican que las células T se mantienen homeostáticamente en oposición a la proliferación o crecimiento autónomo sin restricciones (FIG. 35A). Las células T mIL15+CAR+ en cultivo continuo a largo plazo (1,5 a 2,45 años) se activaron con aAPC, se fenotiparon y se sometieron a cariotipo. La fenotipificación mostró que estas células T expresaban mIL15 y los resultados de la cariotipificación para todos los donantes presentados mostraron extensiones en metafase normales (FIG. 35B-C). La FIG. 35D muestra la cinética de la memoria después de la estimulación de las células usando aAPC K562: Condiciones Stim 1- CAR versus mIL15+CAR durante la retirada: Para estos estudios, las células T CAR solo obtuvieron IL-21 durante los primeros 9 días de la estimulación y a continuación solo IL2 durante las condiciones de retirada de Ag; células T mIL5+CAR recibieron IL-21 durante los primeros 9 días y a continuación sin citocinas exógenas durante las condiciones de retirada. Los resultados indican que no hay diferencia en la expresión de CCR7 e IL-7Ra en el día 19 post-Stiml entre células T CAR y mIL15+CAR. La expresión de CCR7 e IL-7Ra aumenta con el tiempo fuera de la exposición al antígeno (día 29 frente al día 19) solo para las células T modificadas con mIL15. La expresión de CAR aumenta a ~ 80% sin exposición al antígeno (PB522 fue del 51% y PB273 fue del 53% 9 días después de Stim1. La FIG. 35E, muestra la cinética de memoria 1 frente a 2 estimulaciones de células T CAR y mIL15+CAR. Condiciones durante la retirada: Las células T con CAR sólo recibieron IL2 durante la retirada de Ag, que se inició 10 días después de la estimulación; células T mIL15+CAR no recibieron citocinas exógenas durante la retirada. La comparación de la expresión de CCR7 e IL-7Ra en instantes de tiempo similares después de 1 Stim y 2 Stims indicó que no hay diferencia de memoria entre CAR vs mIL15+CAR con el 1 Stim a los 19 días. En Stim 2, en un instante de tiempo equivalente a Stim 1, las células T CAR que tienen 2 Stims tienen mucho menos CCR7 y casi nada de IL-7Ra en comparación con las contrapartes de Stim 1. Células T mIL15+CAR que tienen 2 Stims también tienen menos memoria, pero retienen más "memoria" que las células T CAR solas con células T mIL15+CAR teniendo algo de CCR7 que quedó (pero IL-7Ra casi ha desaparecido).

Ejemplo 8 - Generación de células T mínimamente manipuladas usando ARNm que codifica la transposasa SB

Se llevaron a cabo estudios para determinar si el uso de una transposasa SB proporcionada como un ARNm para la electroporación podría mejorar aún más la producción de células T CAR utilizando un sistema de transposasa SB. Para estos estudios, las células se sometieron a electroporación como se detalló anteriormente usando un plásmido que codifica un CAR flanqueado por repeticiones de transposones y un ARNm que codifica la transposasa (por ejemplo, SB11 o 100x). El ARNm para los estudios estaba protegido con m7GTP e incluía una cola poli-A. En la FIG. 43 se muestra un esquema que muestra un protocolo para la producción de células T CAR usando una transposasa de SB proporcionada como ARNm. Para estos estudios, células de donantes #O fueron electroporadas con el ARNm de SB11, mientras que los estudios de células de donantes #1 se electroporaron con el ARNm 100x.

Célula producida a partir de un donante #O se caracterizó por análisis de citometría de flujo para la expresión de CAR y la proliferación celular. Como se muestra en la FIG. 44A, el porcentaje de células T que expresan CAR de forma estable aumenta significativamente desde el día 9 (8,3%) al día 16 (66,2%). Las células T crecen rápidamente y se amplifican 20 veces hasta el día 16 después de la electroporación (FIG. 44B). Estudios adicionales mostrados en la FIG. 44D se usaron para evaluar el número de células T de memoria central (Tcm) en el día 9 (panel izquierdo) y el día 17 (panel derecho) después de la electroporación. Estos resultados muestran que aunque el número de células T de memoria central (Tcm) menos diferenciadas disminuye entre el día 9 y el día 17, sigue siendo relativamente alto. (27%). A continuación, se utilizaron ensayos de liberación de cromo para determinar la actividad citotóxica de las células. Como se muestra en la FIG. 44C la célula T CAR producida proporcionó citotoxicidad específica de CD-19 contra las células diana, mientras que esencialmente no se observó actividad citotóxica para las células T no modificadas.

Célula producida a partir de un donante #1 también fue estudiada. Como se muestra en la FIG. 45A, la célula T CAR producida a partir de este donante también proporcionó citotoxicidad específica de CD-19 contra las células diana y esencialmente no se observó actividad citotóxica para las células T no modificadas (paneles de la derecha). Además, las células T modificadas destruyen las células diana positivas para CD19 el día 9 y el día 15 con una eficacia similar a pesar del número diferente de células positivas para CAR. En la FIG. 45B se muestran los resultados de los estudios para evaluar el número y la expresión de copias de CAR. Estos resultados indican que el número de copias de ADN de CAR disminuye de 1,5 a 0,9 del día 15 al día 22 y se mantiene estable después de ese momento.

Finalmente, se utilizó citometría de flujo para evaluar la viabilidad celular después de la electroporación. Como se muestra en la FIG. 46, después de la electroporación con ADN/ARNm el número total de células disminuye primero (día 1 y 2) y a continuación las células comienzan a crecer. Según los conteos del celómetro, el número de células disminuye entre un 59% y un 76% el día 2 después de la electroporación (viabilidad 24-41%).

Por lo tanto, los datos anteriores demostraron que mediante el uso de técnicas de producción de CAR que emplean ARNm que codifica una transposasa, se puede producir un número efectivo de células T citotóxicas específicas de la diana en un período de tiempo extremadamente corto y con una manipulación mínima. Aunque la eficacia de la electroporación del ARNm depende del donante, parece que la transposasa SB100x puede ser más eficaz en la producción de CAR. Curiosamente, aunque antes después de la electroporación (día 9) el porcentaje más bajo de células expresan CAR, la población total de células mata las células tumorales diana casi tan eficientemente como una de la etapa posterior (días 15-16) y contiene más memoria central (menos células diferenciadas). También se confirmó que el ARNm que codifica SB11 y SB100x proporciona integración de aproximadamente una copia del gen que codifica CAR por genoma celular en las condiciones probadas.

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Claims

REIVINDICACIONES

2. La célula de la reivindicación 1, donde la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 85% idéntica a SEQ ID NO:6.

3. La célula de la reivindicación 1, donde la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

4. La célula de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de polinucleótidos al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 7.

5. La célula de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 7.

6. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la célula comprende además una transposasa semejante a Tc1 (SB) de tipo salmónido.

7. La célula de la reivindicación 6, donde la transposasa SB se proporciona en un vector de expresión de ADN o como un ARNm.

8. Una célula diseñada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en la provisión de una respuesta de células T en un sujeto humano que padece una enfermedad, donde se administrará al sujeto una cantidad efectiva de dichas células diseñadas.

9. La célula diseñada para su uso según la reivindicación 8, donde la enfermedad es un cáncer y donde el CAR se dirige a un antígeno de célula cancerosa.

10. La célula diseñada para su uso según la reivindicación 9, donde el antígeno de la célula cancerosa es CD19, ROR1, CD56, EGFR, CD123, c-met, GD2, CD20, CD22, antígeno carcinoembrionario, alfafetoproteína, CA-125, 5T4, MUC-1, antígeno tumoral epitelial, antígeno prostático específico, antígeno asociado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, HER2/Neu, proteína de unión a folato, glicoproteína de la envoltura del VIH-1 gp120, glicoproteína de la envoltura del VIH-1 gp41, CD33, CD138, CD23, CD30, mesotelina, GD3, AKT, HER3, CD70, HERV-K, IL-11 Ralfa, cadena kappa, cadena lambda, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, VEGFR2, HER2-HER3 en combinación o HER1-HER2 en combinación.

12. El polinucleótido de la reivindicación 11 que comprende una secuencia al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 7.

13. Una proteína de fusión IL-15/IL-15Ra que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 6.

14. La proteína de fusión de la reivindicación 13 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

15. Una célula huésped que comprende un polinucleótido según la reivindicación 11 o 12 o una proteína de fusión de las reivindicaciones 13 o 14.

16. La célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 15, o la célula para uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde la célula es una célula T, un precursor de célula T o una célula NK.