KR20230135086A - 막 결합된 인터류킨 15를 갖는 종양 침윤성 림프구및 이의 용도 - Google Patents

막 결합된 인터류킨 15를 갖는 종양 침윤성 림프구및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20230135086A
KR20230135086A KR1020237026018A KR20237026018A KR20230135086A KR 20230135086 A KR20230135086 A KR 20230135086A KR 1020237026018 A KR1020237026018 A KR 1020237026018A KR 20237026018 A KR20237026018 A KR 20237026018A KR 20230135086 A KR20230135086 A KR 20230135086A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tils
leu
ser
gly
glu
Prior art date
Application number
KR1020237026018A
Other languages
English (en)
Inventor
카일 페드로
제임스 알렉산더 스토러
뮐렌 얀 테르
레이첼 부르가
미툰 카타르
미쉘 올스
제레미 하템 챠이차
샤암순다르 수브라마니안
Original Assignee
옵시디안 테라퓨틱스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 옵시디안 테라퓨틱스, 인크. filed Critical 옵시디안 테라퓨틱스, 인크.
Publication of KR20230135086A publication Critical patent/KR20230135086A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4635—Cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464436—Cytokines
    • A61K39/46444—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46449—Melanoma antigens
    • A61K39/464491—Melan-A/MART
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46449—Melanoma antigens
    • A61K39/464492—Glycoprotein 100 [Gp100]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/876—Skin, melanoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/30—Coculture with; Conditioned medium produced by tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/99—Coculture with; Conditioned medium produced by genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

막-결합 인터류킨 15(mbIL15)를 발현하도록 조작된 종양 침윤성 림프구(TIL)가 본 명세서에 제공된다. mbIL15 TIL은 외인성 인터류킨 2(IL2)을 사용하지 않고 신속 확장 프로토콜을 사용하여 시험관내에서 확장될 수 있으며, IL2와 같은 외인성 사이토카인을 동시에 사용하지 않고 입양 세포 요법에서 사용될 수 있다. TIL은 mbIL15가 리간드와 DRD의 결합 시 IL15의 존재비 및/또는 활성을 조절할 수 있는 폴리펩타이드인 하나 이상의 약물 반응성 도메인(DRD)에 작동 가능하게 연결되도록 추가로 조작될 수 있다. 또한, 변형된 TIL을 제조하기 위한 성분 및 변형된 TIL을 제조하고 사용하는 방법이 본 명세서에 제공된다.

Description

막 결합된 인터류킨 15를 갖는 종양 침윤성 림프구 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 1월 19일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/139,305호; 2021년 2월 24일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/153,367호; 2021년 7월 27일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/226,114호; 2021년 9월 14일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/244,166호의 우선권을 주장하며, 모든 목적을 위해 이들 기초출원의 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
고형 종양은 효과적인 입양 세포 요법(adoptive cell therapy: ACT)의 개발에 있어 주요 과제를 제시한다. 예를 들어, 단일 종양 항원을 표적으로 하면 항원 손실 또는 보다 공격적인 클론의 재발로 이어질 수 있다. 추가적으로, 치료적 세포가 고형 종양에 침투하는 것은 어려울 수 있으며, 세포가 종양에 침투하더라도 면역 억제성 메커니즘으로 인해 종양 미세환경이 불리할 수 있다. 종양 침윤성 림프구(tumor-infiltrating lymphocyte: TIL)를 사용한 ACT는 적어도 소정의 고형 종양에 대해 이러한 문제를 해결하는 치료 방식으로 제안되었다. 예를 들어, TIL은 여러 T 세포 수용체(T cell receptor: TCR) 클론을 갖는 T 세포를 포함하므로, 여러 종양 항원을 더 잘 인식하여 종양 이질성을 해결할 수 있다. 추가적으로, TIL은 종양-특이적 항원 및 종양 신생항원을 인식하여 주변의 건강한 조직과 항원적으로 구별되는 종양을 표적으로 할 수 있게 한다.
세포 요법으로 사용하기 위해, TIL은 종양 생검 또는 외과적으로 제거된 종양의 샘플을 사용하여 대상체의 종양 부위로부터 제조된다. 그런 다음, TIL은 인터류킨-2(IL2)와 같은 자극제 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 같은 피더 세포의 존재하에 시험관내에서 자극되고 확장된다. 그런 다음, 확장 후, TIL은 IL2의 동시 투여와 함께 환자에게 다시 주입된다. 그러나, IL2는 여러 장기 시스템, 가장 현저하게는 심장, 폐, 신장 및 신경계에서 나타날 수 있는 용량 의존적 독성을 나타낸다. IL2 독성의 가장 흔한 징후는 모세혈관 누출 증후군(capillary leak syndrome)으로, 저혈량 상태 및 혈관외 공간에서의 체액 축적을 초래한다. 상당한 수의 환자가 부가적인 IL2 치료를 견디지 못할 것이므로 TIL 치료에서 제외되어야 한다. TIL을 사용하는 ACT를 안전하고 보다 효과적인 암 치료법으로 만들기 위해서는 현장의 개선이 필요하다.
본 개시내용은 막 결합 인터류킨 15(membrane bound interleukin 15: mbIL15)를 발현하도록 변형된(즉, 조작된) TIL에 관한 것이다. 변형된 TIL은 인터류킨 2(IL2)와 같은 외인성 사이토카인의 부재하에 시험관내 또는 생체내에서 확장될 수 있다. TIL 면역요법과 병용하여 또는 그 이후에 암 환자에게 IL2를 전신 투여하면 종종 이미 의학적으로 허약한 환자에게 독성을 일으킨다. 많은 환자들이 IL2 투여 후 모세혈관 누출 증후군으로 인한 저혈압 및 쇼크를 포함한 심각한 생명을 위협하는 부작용을 겪는다. 저용량의 IL2를 병용하는 TIL 요법은 고용량으로 투여하였을 때보다 덜 효과적이었다. 따라서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 외인성 IL2의 사용을 필요로 하는 현재의 치료 양생법보다 암이 있는 대상체에게 덜 독성인 치료 양생법에 사용될 수 있다.
TIL은 mbIL15가 하나 이상의 약물 반응성 도메인(drug responsive domain: DRD)에 작동 가능하게 연결되도록 추가로 조작될 수 있다. DRD는 리간드와의 결합 시 mbIL15와 같은 페이로드의 존재비 및/또는 활성을 조절할 수 있는 폴리펩타이드이다. 예를 들어, 직렬로 연결된 여러 DRD는 단일 페이로드를 조절할 수 있다. 하나 이상의 DRD는 적절한 조건하에 DRD와 유효량의 리간드의 상호작용이 페이로드의 생물학적 활성을 변형시키도록 mbIL15에 작동 가능하게 연결된다.
또한, 변형된 TIL의 집단이 제공된다. 복수의 TIL은 선택적으로 확장을 겪은 변형된 TIL의 하위집단을 포함한다. 따라서, 선택적으로 DRD에 작동 가능하게 연결된 mbIL15를 발현하도록 조작된 확장된 TIL도 본 명세서에 제공된다. 확장된 TIL의 집단이 또한 본 명세서에 개시된다. 확장 후, TIL의 집단은 외인성 사이토카인이 없는 경우에도 피더 세포가 결여된 배양에서 5일 이상, 10일 이상 또는 15일 이상 생존한다. 유사하게는, TIL의 집단은 외인성 사이토카인 투여 없이 생체내에서 생존한다. IL2와 같은 외인성 사이토카인은 TIL을 더 많이 고갈시키기 때문에, 생체내 및 시험관내에서 변형된 TIL의 확장은 TIL의 더 강력한 집단을 초래한다.
확장된 TIL의 집단은 비확장된 TIL의 대조군 집단에서 CD8+ 세포 및 CD4+ 세포의 비율과 비교하여 더 큰 비율의 CD8+ 세포와 더 낮은 비율의 CD4+ 세포를 갖는다. 따라서, 확장된 TIL의 집단은 비확장된 TIL의 대조군 집단의 CD4:CD8 비보다 낮은 CD4:CD8 비를 갖는다. 추가적으로, 확장된 mbIL15 TIL의 집단은 REP에서 조작 및 확장 이전에 사전-REP TIL에서 CD4 Treg 세포의 비율과 비교하여 더 적은 비율의 CD4 Treg 세포를 갖는다. 확장된 T 세포의 집단은 또한 비확장된 TIL의 대조군 집단에서 PD1+ 세포의 비율과 비교하여 더 적은 비율의 PD1+ 세포를 갖는다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 확장된 TIL의 집단은 또한 비확장된 TIL의 대조군 집단에서 종양 괴사 인자 α(TNFα) 및 인터페론 γ(IFNγ)를 생산하는 TIL의 비율과 비교하여 종양 괴사 인자 α(TNFα) 및 인터페론 γ(IFNγ)를 둘 다 생산하는 더 큰 비율의 세포를 갖는다.
또한, 비변형된 TIL의 하위집단 및 선택적으로 DRD에 작동 가능하게 연결된 mbIL15를 포함하는 변형된 TIL의 하위집단을 포함하는 TIL의 혼합된 집단이 본 명세서에 기재된다. 변형된 TIL의 하위집단은 K562 피더 세포, 41BB 리간드(41BBL) 및 인터류킨 21(IL21, 분비되거나 또는 K562 피더 세포에 막 결합됨)의 존재하에 확장되며, K562 피더 세포, 41BBL 및 IL21의 존재하에 비조작된(즉, 비변형된) TIL의 하위집단보다 더 확장된다. 조작된(즉, 변형된) TIL의 하위집단의 이러한 우선적 확장은 IL2와 같은 외인성 사이토카인이 없을 때 발생한다.
mbIL15를 발현하도록 조작된 TIL을 제조하는 방법은 벡터를 TIL에 형질도입시키는 단계를 포함하며, 벡터는 IL15를 암호화하는 제1 핵산 서열 및 막관통 도메인을 암호화하는 제2 핵산을 포함한다. TIL을 형질도입시키는 데 사용되는 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대, 감마-레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터, 보다 구체적으로, 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus: GALV) 유사형 감마-레트로바이러스 벡터 또는 개코원숭이 내인성 레트로바이러스 외피(baboon endogenous retrovirus envelope: BaEV) 유사형 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 따라서, IL15를 암호화하는 제1 핵산 서열 및 막관통 도메인을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는 GALV 유사형 레트로바이러스 벡터 또는 BaEV 유사형 렌티바이러스 벡터가 본 명세서에 제공된다. 제1 및 제2 핵산의 발현 시, 막관통 도메인은 링커 또는 힌지를 통해 IL15에 선택적으로 연결된 세포막에 또는 세포막 내에 IL15를 고정시키는 역할을 한다.
또한, 본 명세서에 개시된 임의의 TIL 또는 TIL의 집단 및 약제학적 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 임의의 TIL, 임의의 TIL의 집단 또는 이의 임의의 약제학적 조성물은 암을 치료하는 방법으로서 암이 있는 수용 대상체에게 투여하는 데 사용될 수 있다. 방법은 선택적으로 제2 작용제를 수용 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하되, 제2 작용제는 mbIL15에 작동 가능하게 연결된 DRD에 결합하는 리간드이다. 유효량의 리간드의 투여 및 DRD에 대한 리간드의 결합 시, mbIL15의 생물학적 활성이 대상체에서 증가된다. mbIL15에 작동 가능하게 연결된 DRD를 사용하거나 또는 사용하지 않는 치료 방법은 IL2와 같은 외인성 사이토카인이 대상체에게 투여될 필요가 없다. 치료 방법은 선택적으로 종양으로부터 하나 이상의 TIL을 단리하는 단계 및 mbIL15를 발현하는 핵산을 하나 이상의 TIL에 도입하는 단계를 포함한다. TIL은 수용 대상체의 종양 또는 공여 대상체로부터 단리될 수 있되, 공여 대상체는 수용 대상체가 아니다. 공여 대상체의 종양으로부터 단리된 TIL은 공여자로부터 단리된 TIL이 수용 대상체의 종양에 존재하는 하나 이상의 암 항원에 특이적인 T-세포 수용체(TCR)를 포함하도록 선택될 수 있다. 선택적으로, 방법은 수용 대상체에 대해 HLA 일치인 공여 대상체를 선택하는 단계를 더 포함한다. 본 명세서에 개시된 치료 방법에서, 수용 대상체는 선택적으로 TIL의 투여 전 림프구가 고갈된다.
확인된 실시형태는 예시일 뿐이므로 비제한적이다. 본 발명의 하나 이상의 비제한적 실시형태의 세부 사항은 첨부된 도면 및 아래의 설명에 제시되어 있다. 본 발명의 다른 실시형태는 본 개시내용을 고려한 후 당업자에게 명백할 것이다.
도 1은 신선한 종양 분해물에서 그리고 3주의 사전-REP TIL 배양 후 CD45+ 세포(왼쪽) 및 CD45+ 세포(오른쪽) 내의 CD3+ T 세포의 빈도를 보여준다.
도 2는 형질도입 후 제5일에 유세포 분석에 의해 측정된 2명의 흑색종 TIL 공여자(donor)에서의 IL15-293 작제물의 형질도입 효율을 보여준다.
도 3a 내지 도 3b는 mbIL15를 발현하는 TIL의 항원 및 IL2-독립적 확장 및 생존을 보여준다. 도 3a는 구성적 mbIL15 또는 GFP가 형질도입되고, 6000 IU/㎖ IL2와 함께 또는 없이 12일 동안 REP에서 확장된 TIL 공여자 006 세포(TIL 006)를 보여준다. 도 3b는 구성적 mbIL15(REP에서 IL2 없이 확장됨) 또는 GFP(REP에서 6000 IU/㎖ IL2로 확장됨)가 형질도입되고, 6000 IU/㎖ IL2가 있거나 없는 14-일 항원-독립적 생존 검정에서 계수된 TIL 006을 보여준다.
도 4는 신속 확장 프로토콜(REP) 후 항원-독립적 TIL 확장을 보여준다. 사후-REP, 비조작된 TIL 및 mbIL15 조작된 TIL(구성적 또는 조절된 mbIL15)은 외인성 IL2 또는 아세타졸아마이드(ACZ)와 함께 또는 없이 플레이팅되고, 새로운 웰이 세포 계수 및 표현형을 평가하기 위해 3일마다 수거되었다.
도 5는 항원-의존적 환경에서의 TIL 확장을 보여준다. 신속 확장 프로토콜(REP) 후, 비조작된 TIL 및 mbIL15 조작된 TIL은 외인성 IL2, 아세타졸아마이드 또는 비히클(DMSO)이 있거나 없는 TIL:종양 공동 배양 검정에서 HLA-일치 미토마이신 C-처리된 흑색종 세포와 함께 플레이팅되고, 웰은 세포 계수 및 표현형을 평가하기 위해 3일마다 수거되었다.
도 6a 내지 도 6b는 신속 확장 프로토콜(REP) 후 TIL의 종양 반응성을 보여준다. 도 6a는 조절된 mbIL15 및 비조작된 대조군이 형질도입되고 HLA-일치 미토마이신-C 처리된 흑색종 세포와 함께 24-시간 동안 공동 배양된 TIL 006 및 TIL 005를 보여준다. 상청액의 IFNγ는 MSD 검정에 의해 측정되었다. 도 6b는 루시퍼레이스-태깅된 HLA-일치 흑색종 세포주에 의한 발광의 손실에 의해 측정된 공동 배양에서의 TIL의 세포독성을 보여준다.
도 7a 내지 도 7b는 생체내 입양 세포 요법 실험을 위해 동물에게 주입하기 전 TIL 확장 및 형질도입 효율을 보여준다. 도 7a는 비조작된 TIL 및 mbIL15 조작된 TIL의 생체내 입양 세포 전달(ACT)에 사용되는 TIL 공여자 006에 대한 세포 확장을 보여준다. 도 7b는 신속 확장 프로토콜(REP) 후 형질도입 효율을 보여주며; 비조작된 TIL 및 mbIL15 조작된 TIL은 형질도입 효율의 척도로서 IL15 및 IL15RaFc의 발현에 대해 평가되었다.
도 8a 내지 도 8c는 생체내 입양 세포 요법 실험에 대한 TIL 계수 및 IL15 발현의 분석을 보여준다. 도 8a는 말초 혈액 샘플로부터 유세포 분석에 의해 입양 전달된 비조작된 TIL 및 mbIL15 조작된 TIL의 계수를 보여준다. TIL은 턱밑 정맥 혈액 샘플에서 살아있는 인간CD3+뮤린CD45- 세포로 확인되었다. 도 8b 및 도 8c는 ACT 후 14일 또는 53일에 단리된 비장 및 골수 샘플의 TIL 계수(hCD3+mCD45-) 및 IL15 발현(IL15+IL15RaFc+)을 보여준다.
도 9는 IL15 발현의 아세타졸아마이드(ACZ) 조절 및 동결 보존된 조절된 mbIL15 TIL에서의 신호전달이 용량-의존적 방식으로 발생함을 보여준다. 4명의 환자(환자 1 내지 환자 4)로부터의 조절된 mbIL15 TIL은 해동되고, 24시간 동안 ACZ-비함유 배지에서 휴지시킨 다음, 0.1μM, 1μM, 2.5μM, 5μM, 10μM, 25μM, 100μM의 ACZ로 18시간 동안 조절되었다. 그런 다음, 조절된 mbIL15 TIL이 수집되고, 포스포-유세포 분석-기반 검정을 사용하여 IL15 발현 및 신호전달에 대해 분석되었다. 도 9a는 CD3+ 세포의 백분율로서 IL15+ TIL의 빈도를 보여준다. 도 9b 내지 도 9e는 각 환자에 대한 결과를 보여주며: 여기서, 세포는 IL15+로 추가로 게이팅된 다음, 각각의 pSTAT5(열린 사각형) 및 pS6(닫힌 원)에 대한 기하 평균 형광 강도가 계산되었다. 표시된 값은 비히클 대조군과 관련하여 설정된다. N=4 인간 공여자.
도 10은 환자 1 내지 환자 4에서 pSTAT5 및 pS6에 대한 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity: MFI)를 보여준다. 도 10a는 pSTAT5에 대한 MFI를 보여준다. 도 10b는 pS6에 대한 MFI를 보여준다.
도 11은 조절된 mbIL15 TIL의 구성적 mbIL15 발현 및 ACZ 조절이 IL15 신호전달 경로에 관여함을 보여준다. 여기서, 환자 1 내지 환자 3으로부터의 비조작된 TIL 및 조절된 mbIL15 TIL은 해동되고, ACZ-비함유 배지에서 24시간 동안 휴지시킨 다음, IL2 또는 ACZ로 18시간 동안 조절되었다. 그런 다음, 세포가 수집되고, 포스포-유세포 분석-기반 검정을 사용하여 IL15 발현 및 신호전달에 대해 분석되었다. 비조작된 TIL 및 조절된 mbIL15 TIL+비히클은 살아있는 세포에 게이팅된 다음 싱글렛(singlet)에 이어 CD3+에 게이팅되었다. 구성적 IL15 TIL 및 조절된 mbIL15 TIL+ACZ 조건이 IL15+ 염색에 대해 추가로 게이팅되었다. 각 pSTAT5 및 pS6에 대한 기하 평균 형광 강도가 계산되었다. N=3 인간 공여자.
도 12는 외인성 사이토카인이 없는 조절된 mbIL5-변형된 TIL이 비조작된 TIL +IL2보다 더 큰 다작용성을 나타냄을 보여준다. 비조작된 TIL 및 조절된 mbIL15 TIL은 해동되고, ACZ-비함유 배지에서 24시간 동안 휴지시킨 다음; 비조작된 TIL은 다음 농도: 20 IU/㎖, 200 IU/㎖, 1000 IU/㎖ 및 6000 IU/㎖ IL2 또는 비히클로 처리되고; 조절된 mbIL15 TIL은 다음 농도의 ACZ: 0.1μM, 1μM, 5μM, 10μM, 25μM, 100μM ACZ 또는 비히클로 처리되었다. 처리는 18시간 동안 이루어졌다. 세포는 브레펠딘 A 및 모넨신의 존재하에 6시간 동안 PMA 및 이오노마이신으로 자극되었다. 비자극된 TIL은 대조군으로 사용되었다(데이터 미도시). 자극 후, 세포는 유세포 분석-기반 검정을 사용하여 IL15 및 세포내 TNFα 및 IFNγ의 발현에 대해 분석되었다. TIL은 살아있는 세포에 게이팅된 다음 싱글렛에 이어 CD3+에 게이팅되었고, 조절된 mbIL15 TIL은 IL15+에 추가적으로 게이팅되었다. 도 12a는 비조작된 TIL과 IL2 및 조절된 mbIL15 TIL과 ACZ에 대한 TNFα 및 IFNγ 이중 양성 집단을 보여준다. 도 12b는 조절된 mbIL15 TIL 배양에서 IL15 발현을 보여준다. 도 12C는 선택된 IL2(200 IU/㎖) 및 ACZ(25μM) 용량의 비교를 보여준다.
도 13은 환자-유래 이종이식편(PDX) 효능 모델의 결과를 보여준다. 신속 확장 프로토콜(REP)의 종료 시, 비조작된 TIL 및 조절된 mbIL15 TIL(+/- 아세타졸아마이드(ACZ))은 인간 흑색종 PDX를 보유하는 마우스에 입양 전달되었다. 평균 종양 부피가 평가되었다(+/- SEM). 도 13a는 입양 세포 전달(ACT) 후에 주어진 치료에 대한 평균 종양 부피를 보여준다. 도 13b는 TIL이 없는 경우(왼쪽 상단); 비조작된 TIL+IL2(오른쪽 상단); 조절된 mbIL15 TIL + 비히클(왼쪽 하단); 및 조절된 mbIL15 TIL+ACZ(오른쪽 하단)에 대한 ACT 후의 종양 부피를 보여주고. 여기에서, 조절된 mbIL15 TIL+ACZ는 비조작된 TIL+IL2와 비교하여 상당히 우수한 항종양 효능을 보여준다(*p<0.05; Mann U Whitney).
도 14는 SK-MEL-1 이종이식편 암 모델의 결과를 보여준다. 신속 확장 프로토콜(REP)의 종료 시, 비조작된 TIL 및 조절된 mbIL15 TIL(+/- 아세타졸아마이드(ACZ))은 SK-MEL-1 종양을 보유하는 마우스에 입양 전달되었다. 평균 종양 부피가 평가되었다(+/- SEM). 도 14a는 입양 세포 전달(ACT) 후에 주어진 치료에 대한 평균 종양 부피를 보여준다. 도 14b는 TIL이 없는 경우(왼쪽 상단); 비조작된 TIL+IL2(오른쪽 상단); 조절된 mbIL15 TIL+비히클(왼쪽 하단); 및 조절된 mbIL15 TIL+ACZ(오른쪽 하단)에 대한 ACT 후의 종양 부피를 보여준다. 여기에서, 조절된 mbIL15 TIL+ACZ는 비조작된 TIL+IL2와 비교하여 상당히 우수한 항종양 효능을 보여준다(*p<0.05; Mann U Whitney).
도 15는 조절된 mbIL15 TIL이 시험관내에서 흑색종에 대해 향상된 MHC-I-의존적 세포독성을 달성함을 보여준다. 여기에서, 비조작된 TIL 및 조절된 mbIL15 TIL은 신속 확장 프로토콜(REP)의 종료 시 동결 보존되었다. 동결 보존된 TIL은 해동되고, 사이토카인-비함유 조건에서 밤새 휴지시킨 다음, 1:1 및 5:1의 효과기 대 표적(TIL:흑색종) 비로 세포 추적 바이올렛(Cell Trace Violet)-표지된 흑색종 세포(SK-MEL-1)와 함께 공동 배양되었다. MHC-1 의존적 세포독성을 제어하기 위해, 흑색종 세포는 검정 전에 80 ㎍/㎖의 HLA ABC MHC 차단 항체로 2시간 동안 전처리되었다. 3시간의 공동 배양 후, SK-MEL-1 세포는 유세포 분석에 의해 세포내 절단-카스페이스 3(세포 사멸에 대한 비가역적 이행에 대한 마커)의 발현에 대해 평가되었다. 정량화된 절단된 카스페이스 3은 표적 세포 단독의 것(자발적 또는 배경 방출)으로 정규화되었다. 막대 그래프는 6명의 개별 환자로부터의 TIL과 공동 배양되었을 때 표적 종양 세포에서 절단된 카스페이스-3의 발현을 보여준다.
도 16은 mbIL15 TIL(구성적)이 IL21 및 41BBL-매개성 공동 자극 모두와 함께 K562 피더 세포로 생성될 때 REP에서 최대 TIL 확장이 발생함을 보여주는 그래프이다.
도 17은 막-결합 IL21 및 41BBL을 발현하는 풀링된 PBMC 피더 세포 또는 K562 피더 세포로 비조작된 TIL이 생성될 때 REP에서 최대 TIL 확장이 발생함을 보여주는 그래프이다.
도 18은 mbIL15(구성적)를 갖는 TIL이 K562 피더 세포로 생성되고 IL21 및 41BBL-매개성 공동 자극을 모두 받을 때 REP에서 IL15+ TIL의 최대 확장이 발생함을 보여준다. 8일, 11일, 15일 및 18일에 피더 세포에 대한 결과는 왼쪽에서 오른쪽으로 표시된다: PBMC 피더, K562-모 피더, K562+41BBL, 재조합 인간 IL21과 함께 K562+41BBL 피더, K562+mbIL21 피더, K562+41BBL+mbIL21 피더.
도 19는 IL15 발현이 K562 피더 세포로 생성되고 IL21 및 41BBL-매개성 공동 자극을 모두 받은 mbIL15 TIL(구성적)에서 REP 과정을 통해 강화됨을 보여주는 그래프이다.
도 20은 K562 피더 세포로 생성되고 IL21 및 41BBL-매개성 공동 자극 모두 받은 mbIL15를 갖는 확장된 TIL은 REP 전체에 걸쳐 감소된 CD4:CD8 비를 가짐을 보여주는 그래프이다. 따라서, K562 피더 세포의 존재하에 IL21 및 41BBL 자극을 모두 받은 확장된 mbIL15를 갖는 TIL은 풀링된 PBMC 피더, 비변형된 K562 피더 또는 IL21의 부재하에 41BBL을 발현하는 K562 피더로 생성된 mbIL15를 갖는 확장된 TIL과 대조적으로 CD8+ 세포독성 효과기 세포에 대해 풍부하다. CD4:CD8 비는 왼쪽에서 오른쪽으로 8일, 11일, 15일 및 18일에 표시된다: PBMC 피더, K562-모 피더, K562+41BBL, 재조합 인간 IL21과 함께 K562+41BBL 피더, K562+mbIL21 피더, K562+41BBL+mbIL21 피더.
도 21은 PBMC 피더 세포 또는 비변형된 K562 피더 세포로 생성된 mbIL15 TIL과 비교하여 mbIL21 및 41BBL 모두를 발현하는 K562 피더 세포로 생성된 확장된 mbIL15 TIL에서 TNFα+인터페론 γ+ 세포의 더 높은 백분율을 보여주는 그래프이다. TNFα+인터페론 γ+ TIL의 더 높은 백분율은 mbIL21 및 41BBL을 모두 발현하는 K562 피더 세포로 생성된 확장된 mbIL15 TIL에서 향상된 다작용성을 나타낸다.
도 22는 PBMC 피더 세포, 비변형된 K562 피더 세포, mb41BBL만을 발현하는 K562 피더 세포, mbIL21만을 발현하는 K562 피더 세포, 41BBL 및 mbIL21 모두를 발현하는 K562 피더 세포 및 재조합 인간 IL21의 존재하에 41BBL을 발현하는 K562 피더 세포로 생성된 mbIL15 TIL에 대한 10-일 생존 검정의 결과를 보여주는 그래프이다. K562 피더 세포로 생성되고 IL21 및 41BBL-매개성 공동 자극을 모두 받은 확장된 mbIL15TIL은 비변형되거나 또는 mbIL21 또는 41BBL을 독립적으로 발현하도록 변형된 PBMC 피더 세포 또는 K562 피더 세포로 생성된 mbIL15 TIL과 비교하여 개선된 사후-REP 항원-독립적 생존을 보여주었다.
도 23은 비조작된 TIL, 및 PBMC 피더, K562 피더, K562+mbIL21 피더, K562+41BBL 피더, K562+41BBL+mbIL21 피더 또는 K562+41BBL+rhIL21 피더하에 확장된 mbIL15 TIL에서 TCRVβ 서브패밀리의 상대적인 비율을 보여준다. 확장된 mbIL15 TIL 및 비조작된 TIL은 피더 세포 또는 조건에 관계없이 다양한 서브패밀리 분포를 유지한다.
도 24는 비확장된 TIL, 및 PBMC 피더, K562-모 피더, K562+41BBL 피더, 재조합 인간 IL21과 함께 K562+41BBL 피더, K562+mbIL21 피더 및 K562+41BBL+mbIL21 피더로 생성된 확장된 TIL에서 왼쪽에서 오른쪽으로 살아있는 CD3+ 세포에 게이팅된 바와 같이 mbIL15 TIL의 표면 상의 PD1의 발현을 보여준다. PD1 발현은 비확장된 mbIL15 TIL에서 가장 높았으며, 41BBL 및 IL21-매개성 신호전달 둘 다에 의한 mbIL15 TIL의 확장은 PD1의 거의 기준선 발현을 갖는 TIL을 생산한다.
도 25는 사전-REP TIL(실시예 1에 기재된 바와 같음)과 조작된 mbIL15 TIL(실시예 3에 기재된 바와 같음)을 비교하는 표현형 분석을 보여준다. 사전-REP 및 사후-REP TIL은 실시예 13에 기재된 바와 같이 CD3, CD4, CD8 및 PD1에 대한 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 표현형을 결정하였다. 도 25A에 도시된 바와 같이, CD8+ T 세포의 빈도는 더 높고, CD4+ T 세포의 빈도는 동일한 TIL 공여자로부터의 상응하는 사전-REP TIL과 비교하여 사후-REP mbIL15 TIL에 대해 더 낮다. 도 25B에서, 사후-REP mbIL15 TIL은 동일한 TIL 공여자로부터의 상응하는 사전-REP TIL보다 더 낮은 수준의 PD1을 발현한다. 도 25C는 CD4+로 게이팅되고 추가로 CD25 및 FoxP3 이중 양성 세포로 분류되는 CD3+ T 세포로 확인된 mbIL15 TIL에서 조절 T 세포 집단의 백분율을 보여준다. mbIL15 TIL은 조작 단계 전 사전 REP TIL과 비교하여 감소된 비율의 조절 T 세포를 갖는다.
도 26은 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같이 A375 흑색종 세포주 및 환자-유래 이종이식편(PDX) 세포(PDX163A, 실시예 11에 기재된 바와 같음)에서 보존된 흑색종-관련 항원 MART-1 및 gp100의 발현을 보여준다.
도 27은 PDX 163A에 대해 HLA-일치된 4개의 별개의 TIL 공여자로부터 유래된 mbIL15 TIL에서 MART-1-4량체 양성 TIL 및 gp100-4량체 양성 TIL의 백분율을 보여준다. 4량체 양성 집단은 TIL이 HLA:A2:01 유전자좌를 통해 해당 흑색종-관련 항원에 반응하는 세포의 일부를 포함하고 있음을 나타낸다. *로 표시된 공여자는 도 30에 도시된 바와 같이 PDX 효능 연구에 이용되었다.
도 28은 PDX에 대해 반응성인 TIL 공여자를 정확하게 예측하기 위한 TIL:종양 세포 공동 배양 후 인터페론 감마(IFNγ) 생산을 보여준다. 이 시험관내 검정은 TIL 공여자 006, 39A 및 41A가 PDX에 반응하여 가장 많은 양의 IFNγ를 생산한 공여자임을 보여주며, 따라서 실시예 15에 기재된 바와 같이 생체내 효능을 시험하기 위한 공여자로서의 이들의 후보성을 뒷받침한다.
도 29는 CA2 DRD 및 CA2 리간드 ACZ에 작동 가능하게 연결된 mbIL15를 발현하는 확장된 TIL로 처리된 예시적인 흑색종 환자-유래 이종이식편 모델을 보여주는 개략도이다.
도 30은 도 29에 도시된 치료 패러다임에 따른 환자-유래 이종이식편 모델의 처리가 비조작된 TIL 및 부수적인 IL2 처리를 사용한 치료와 비교하여 우수한 항종양 효능을 나타냄을 보여준다. 신속 확장 프로토콜(REP) 종료 시, 비조작된 TIL 및 조절된 mbIL15 TIL(+/- 아세타졸아마이드(ACZ))은 인간 흑색종 PDX를 보유하는 마우스에 입양 전달되었다. 평균 종양 부피가 계산되었다(+/- SEM).
도 31a 내지 도 31b는 CA2 DRD에 작동 가능하게 연결된 mbIL15를 발현하는 TIL이 비조작된 TIL+IL2보다 상당히 더 종양내 침윤을 나타낸다는 것을 보여준다. 도 31a는 인간 CD3에 대해 면역조직화학적으로 염색된 종양 절편의 현미경 사진이며, 비조작된 TIL 및 IL2로 처리된 동물, CA2 리간드 ACZ의 존재 및 부재하에 CA2 DRD에 작동 가능하게 연결된 mbIL15를 발현하는 TIL로 처리된 동물에서 TIL의 종양내 침윤을 보여준다. 도 31b는 기질(stroma)+종양, 기질 단독 및 종양 단독에서의 TIL의 수를 보여주는 그래프이다.
TIL을 확장시키는 현재 방법은 인터류킨 2(IL2)-기반 TIL 확장(사전 신속 확장 프로토콜 또는 사전-REP)에 이어 신속 확장 프로토콜(REP)을 필요로 한다. 사전-REP 단계 동안, TIL은 절제된 종양 조직의 덩어리에서 외인성 IL2 및 종양 항원의 존재하에 배양된다. 따라서, 사전-REP는 피더 세포가 없는 경우 IL2를 필요로 한다. REP 단계는 전형적으로 빠른 TIL 확장을 지원하기 위해 피더 세포의 첨가를 필요로 한다. REP 피더 세포 및 TIL 자극은 전형적으로 방사선 조사된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 고용량의 IL2 및 선택적으로 항-CD3 항체(OKT3)이다. 그러나, REP 동안의 IL2는 TIL을 고갈시키는 경향이 있어, 덜 강력한 TIL 산물을 생성한다. 현재 방법을 사용하여 생체외 REP 후, 확장된 TIL은 IL2와 함께 환자에게 투여되며, 이는 TIL 투여 전, 동안 및/또는 후에 제공될 수 있으며, 이는 TIL을 다시 고갈시킨다. TIL 요법에 대한 현재의 일반 프로토콜은 TIL 주입 후 같은 날 또는 당일부터 시작되는 고용량 IL2 투여를 필요로 한다. 예로서, 고용량 IL2 양생법은 최대 14회 투여, 9일 휴약 및 추가 14회 투여의 반복 동안 용인될 때까지 매 8시간마다 볼루스 정맥내 주입으로 구성될 수 있다. 다른 IL2 양생법은 최대 4주기 동안 28일마다 반복되는 IL2 투여의 4일 주기 또는 최대 21일까지 지속되는 PEG화된 IL2 양생법으로 구성될 수 있다.
TIL의 고갈을 촉진하는 것 외에도, 고용량의 IL2는 암 환자에게 심각한 부작용을 일으킬 수 있으며, 종종 ACT를 필요로 하는 환자가 견딜 수 없다. 본 발명의 조성물 및 방법은 TIL의 투여 전, 동안 또는 후에 IL2와 같은 인터류킨과 같은 외인성 사이토카인 투여를 선택적으로 필요로 하지 않는 TIL 요법을 제공한다. 달리 말하면, 본 발명의 방법을 사용하면, TIL 주입에 수반되는 인터류킨 요법이 필요하지 않다. 예를 들어, 선택적으로 대상체는 TIL 주입 전, 또는 TIL 주입 후 5일, 7일, 10일, 14일, 21일 또는 28일 동안 외인성 IL2의 투여를 필요로 하지 않는다. 유사하게는, 본 발명의 방법은 변형된 IL2 또는 다른 변형된 사이토카인(예컨대, 변형된 IL7 또는 IL15)의 주입에 대한 필요성을 제거한다. 예로서, 변형된 인터류킨은 IL2, IL7 또는 IL15의 하나 이상의 기능을 유지하지만 (예를 들어, 감소된 친화성을 가짐으로써) CD4+ Treg 세포 증식을 촉진할 수 있는 수용체와 같은 소정의 수용체에 대한 감소된 결합 친화성을 갖는 IL2, IL7 또는 IL15의 돌연변이체 또는 단편일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 확장은 수 또는 양의 증가를 지칭한다. 용어 확장이 본 명세서에서 TIL의 집단 또는 하위 집단과 관련하여 사용될 때, 해당 용어는 REP 후의 세포 집단을 지칭한다. 확장된 집단의 크기(즉, REP 후 TIL의 수)는 비확장된 집단(즉, 사전-REP의 TIL의 수 또는 실패한 REP 후 세포의 기능적 확장이 없는 TIL의 수)보다 더 크다. 확장된 TIL과 같은 세포와 관련하여 사용될 때, 이는 TIL 집단의 기능적 확장을 초래한 REP(즉, 피더 세포 및 선택된 자극 인자를 사용한 배양)를 겪었으며 이의 산물 또는 결과인 세포이다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 확장된 TIL은 기능적 확장을 초래하는 REP하에 배양된 TIL(예를 들어, mbIL15를 발현하도록 변형된 변형된 TIL)의 자손이다. 유사하게는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 비확장된 TIL은 REP에서 기능적 확장을 겪지 않은 TIL을 지칭한다. 그러나, 이러한 비확장된 TIL은 초기 IL2 사전-REP 단계 또는 실패한 REP를 거치면서 세포의 기능적 확장이 없을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 확장은 더 많이 확장하다, 덜 확장하다, 더 큰 확장, 덜한 확장 등과 같이 정량적으로 사용될 수 있다. 이러한 상대적인 용어는 일반적으로 다른 집단 또는 하위 집단과 비교하여 집단 또는 하위 집단에서 TIL 수의 더 큰 배수에서 더 적은 배수 증가(예를 들어, 비변형된 TIL의 확장과 비교하여 변형된 TIL의 확장)를 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 비변형된 TIL과 비교하여 변형된 TIL의 하위 집단의 더 큰 확장은 비변형된 TIL과 비교하여 변형된 TIL의 1.25-배 증가와 비교하여 1.5-배 증가, 1.5-배 증가와 비교하여 2-배 증가, 2-배 증가와 비교하여 5-배 증가, 5-배 증가와 비교하여 10-배 증가, 10-배 증가와 비교하여 40-배 증가 등과 같은 더 큰 배수의 증가를 의미한다.
변형된 종양 침윤성 림프구(TIL)
본 명세서에 기재된 TIL은 mbIL15를 발현하도록 조작된다. 따라서, TIL은 IL15를 암호화하는 외인성 핵산 서열, 막관통 도메인을 암호화하는 외인성 핵산 및 선택적으로 링커, 힌지 및/또는 리더 서열을 암호화하는 외인성 핵산을 포함한다. IL15는 일반적으로 막 결합 분자로 발현되지 않으므로, mbIL15를 발현하기 위해, IL15는 막관통 도메인, 예를 들어, 막관통 단백질 또는 막관통 단백질의 일부와 회합되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 IL15는 IL15 폴리펩타이드(예를 들어, UniProtKB - P40933(IL15_인간))를 지칭한다. 일 실시형태에서, IL15 페이로드는 표 2에 제공된 아미노산 서열(서열번호 12) 또는 하나 이상의 IL15 기능(예를 들어, 생체내에서 변형된 TIL의 확장을 촉진, T 세포 및 NK 세포의 세포독성 촉진)을 유지하는 서열번호 12와 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
IL15를 막에 테더링하는 데 사용하기 위해 막관통 도메인 및/또는 힌지 영역이 선택될 수 있는 예시적인 막관통 단백질은 MHC1, CD8, B7-1, CD4, CD28, CTLA-4, PD-1, 인간 IgG4 또는 IL15 수용체 서브유닛(예를 들어, IL15αR)을 포함한다. IL15는 막관통 도메인에 직접 연결될 수 있거나 또는 링커 및/또는 힌지를 통해 연결될 수 있다.
수많은 링커 서열(링커)이 당업계에 공지되어 있다. 링커는 제한 없이 GS 링커, GSG 링커 및 GGSG 링커를 포함한다. 이들 링커는 1회 이상의 서브유닛의 반복부이다. 따라서, GS 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 숫자인 GSn 링커이다. 유사하게는, GSG 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 숫자인 GSn 링커이다. GGSG 링커는 n이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 숫자인 GGSGn 링커이다. 링커 선택 또는 링커 길이는 IL15 페이로드(즉, 리간드가 없는 경우의 기초 활성)의 활성 수준에 영향을 미칠 수 있으며, 특정 링커 및 길이는 기초 활성 수준 및 리간드(예를 들어, 약물) 반응성을 유지하면서 온-상태(on state)(예를 들어, 최대 활성 수준)를 최대화하도록 선택될 수 있다.
또 다른 예로서, 특정 힌지는 구조적 변화를 허용할 수 있으므로 리간드 반응성에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 목적하는 범위의 페이로드 존재비 및 생물학적 활성(즉, 0 또는 최소에서 최대 포화까지의 리간드의 변화에 상응하는 허용 가능한 페이로드 활성 범위)을 얻기에 충분한 동적 범위를 생성하도록 선택된다.
힌지 서열은 연결된 구성요소 사이의 유연성을 용이하게 하는 아미노산의 짧은 서열이다. 힌지 서열은 임의의 적합한 분자로부터 유래되거나 또는 얻어진 임의의 적합한 서열일 수 있다. 힌지 서열은 면역글로불린(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 힌지 영역, 즉, 면역글로불린(예를 들어, IgG4 Fc 힌지)의 CH1 및 CH2 도메인 사이에 있는 서열, 또는 야생형 서열 또는 이의 유도체일 수 있는 CD8α CD4, CD28 및 CD7과 같은 유형 1 막 단백질의 세포외 영역의 전부 또는 일부로부터 유래될 수 있다. 일부 힌지 영역은 면역글로불린 CH3 도메인 또는 CH3 도메인과 CH2 도메인 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지는 막관통 도메인으로부터 유래된다.
본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 선택적으로 세포내/세포질 또는 막관통 꼬리를 암호화하는 외인성 핵산 서열을 추가로 포함한다. 선택적으로, 세포내/세포질 또는 막관통 꼬리는 B7.1, CD8, CD40L, LIGHT 또는 NKG2C 세포내 꼬리이다.
본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 선택적으로 신호 서열(리더 서열)을 암호화하는 외인성 핵산 서열을 추가로 포함한다. 예시적인 리더 서열은 MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC(서열번호 10), MDWTWILFLVAAATRVHS(IgEss; 서열번호 58), MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEA(천연 IL15 LS; 서열번호 59), MGLVRRGARAGPRMPRGWTALCLLSLLPSGFMA(CD34: 서열번호 60)를 포함한다.
추가적으로, 소정의 TIL은 DRD를 암호화하는 외인성 핵산 서열을 추가로 포함한다. IL15는 T 세포 및 NK 세포 증식에 중요하지만, 높은 수준의 IL15에 대한 지속적인 노출은 생체내에서 이러한 세포의 고갈을 야기하여 IL15 발현 TIL의 효능이 감소할 수 있다. 따라서, 소정의 실시형태에서, DRD는 mbIL15에 작동 가능하게 연결되어 TIL 면역요법 동안 IL15 활성의 조절을 제공한다.
약물 반응성 도메인(DRD)은 페이로드의 발현 또는 활성 수준을 조절하는 폴리펩타이드이다. 약물 반응성 도메인으로 지칭되지만, DRD가 반응하는 리간드는 승인된 소분자 또는 생물학적 "약물"일 필요는 없다. 보다 구체적으로, DRD는 리간드와 상호작용하여 DRD가 페이로드에 작동 가능하게 연결될 때 페이로드 특성(예를 들어, 활성 또는 존재비)의 리간드-의존적 가역적 조절을 부여한다. 각각의 전체 내용이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 특허 제9,487,787호 및 제10,137,180호, 미국 공개 제2019/0192691호; 제2020/0101142호; 제2020/0172879호; 제2021/0069248호 및 미국 특허 제17,251,635호; 및 제17/288,373호는 본 개시내용에 따른 DRD(및 이들의 쌍을 이룬 리간드)의 예를 제공한다. 본 개시내용에 따라 사용하기에 적합한 소정의 이들 및 다른 예시적인 DRD가 또한 본 명세서의 다른 곳에 제공된다. 예로서, DRD는 FKBP(서열번호 4), ecDHFR(서열번호 1), hDHFR(서열번호 2), ER(서열번호 9), 전장 PDE5(서열번호 6), PDE5 리간드 결합 도메인(서열번호 5) 및 CA2(서열번호 7) 또는 DRD 기능을 유지하는 임의의 전술한 것의 일부 또는 서열번호 1, 2, 4, 5, 6, 7 또는 9와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 이의 DRD 기능 부분으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, FKBP, ecDHFR, hDHFR, ER, PDE5 및 CA2의 아미노산 서열에서 하나 이상의 돌연변이(절단, 치환 및 결실 포함)는 DRD를 추가로 불안정화시키는 데 유리할 수 있다. 불안정화 도메인 또는 리간드 결합 도메인으로 지칭될 수 있는 적합한 DRD는 또한 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 각각의 전체 내용이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 WO2018/161000; WO2018/231759; WO2019/241315; US8,173,792; US8,530,636; WO2018/237323; WO2017/181119; US2017/0114346; US2019/0300864; WO2017/156238; 문헌[Miyazaki et al., J Am Chem Soc, 134:3942 (2012); Banaszynski et al. (2006) Cell 126:995-1004; Stankunas, K. et al. (2003) Mol. Cell 12:1615-1624; Banaszynski et al. (2008) Nat. Med. 14:1123-1127; Iwamoto et al. (2010) Chem. Biol. 17:981-988; Armstrong et al. (2007) Nat. Methods 4:1007-1009; Madeira da Silva et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:7583-7588; Pruett-Miller et al. (2009) PLoS Genet. 5:e1000376; 및 Feng et al. (2015) Elife 4:e10606]을 참조한다.
이론에 얽매이지 않고, DRD는 상응하는 안정화 리간드(쌍을 이룬 리간드 또는 리간드로도 지칭됨)가 없을 때 분해되지만, 그 안정성은 안정화 리간드에 결합함으로써 구제되는 불안정한 폴리펩타이드인 것으로 생각된다. DRD에 대한 리간드의 결합은 가역적이기 때문에, 나중에 리간드를 제거하면 DRD가 펼쳐지고, 불안정해지며, 궁극적으로 유비퀴틴-프로테아솜 시스템(ubiquitin-proteasome system: "UPS")에 의한 분해에 대한 태그가 지정된다. 따라서, DRD가 mbIL15와 같은 페이로드에 작동 가능하게 연결되면, 전체 구성(즉, DRD와 IL15) 자체가 불안정해지고 UPS에 의해 성능이 저하되는 것으로 여겨진다. 그러나, 쌍을 이룬 리간드의 존재하에, 구성은 안정화되고, mbIL15 페이로드는 계속 이용 가능하다. 또한, DRD 안정성의 조건부 특성은 안정적인 단백질에서 불안정한 UPS 기질로 신속하고 교란되지 않는 전환을 가능하게 하며 페이로드 활성 수준의 조절(regulation 또는 modulation) 및/또는 페이로드의 활성 수준의 조절을 용이하게 할 수 있는 것으로 여겨진다.
페이로드의 존재비 및 이용 가능성은 페이로드의 활성과 관련이 있기 때문에, 본 개시내용의 목적을 위해, 용어 존재비, 이용 가능성, 활성 및 상 존재비 및/또는 활성(및 유사하게는 존재비의 수준, 이용 가능성의 수준, 활성의 수준 및 존재비 및/또는 활성의 수준)은 본 개시내용 전반에 걸쳐 상호교환적으로 사용되며, 달리 명시적으로 언급되지 않거나 또는 문맥상 무의미하지 않는 한 일반적으로 활성으로 지칭된다. 또한, 존재비 또는 이용 가능성의 측정값은 활성 수준에 대한 대용물(proxy)로 사용되며, 본 명세서에서 활성 수준을 반영하기 위해 사용될 수 있다. 결과적으로, 리간드의 부재시와 비교하여 유효량의 리간드의 존재하에 페이로드의 존재비 또는 이용 가능성의 변화는 선택적으로 활성 수준의 변화를 측정하기 위한 대용물의 역할을 한다.
다수의 DRD가 본 명세서에 기재되어 있지만, 당업자라면 추가적인 DRD를 식별할 수 있다. 예로서, DRD는 리간드의 부재 시에 충분한 불안정성을 갖고 리간드의 존재 시에 충분한 안정성을 갖는 최적의 DRD 변이체를 선택하기 위해 라이브러리 스크리닝 및 구조-유도 공학을 사용하여 식별될 수 있다. 변이체 라이브러리는 돌연변이체 DRD 후보를 세포(예를 들어, Jurkat 세포)에 형질도입하는 것에 의한 무작위 돌연변이유발 스크리닝을 사용하여 생성될 수 있다. 풍부한 라이브러리를 생성하기 위해, 이어서 리간드의 농도 범위에 걸쳐 리포터 유전자의 발현을 테스트함으로써 목적하는 특성(낮은 기초 활성/발현 및 높은 동적 범위)을 갖는 세포가 선택된다. 그런 다음, 단일 세포 클론이 생성되고 특성화되어 후보 DRD가 식별된다. DRD는 작동 가능하게 연결된 페이로드의 특성, 예를 들어, 존재비 또는 활성 수준에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 하나 이상의 DRD는 리간드와 상호작용하여 페이로드 특성의 리간드-의존적 가역적 조절을 제공한다. 본 명세서에 기재된 DRD는 쌍을 이룬 리간드에 반응한다. 선택적으로, DRD는 FDA 승인된 소분자와 같은 소분자 약물인 쌍을 이룬 리간드에 반응한다. 그러나, 당업자는 시스템의 특정 요구를 충족시키기 위해 DRD 및 이의 쌍을 이룬 리간드를 선택할 수 있다. 안정화 리간드의 예 및 본 명세서에 기재된 특정 DRD에 대한 이의 용도는 표 1 및 2012년 3월 33일자로 출원된 미국 특허 제9,487,787호, 2013년 9월 6일자로 출원된 미국 특허 제10,137,180호, 2018년 6월 12일자로 출원된 PCT 출원 제PCT/US2018/037005호, 2019년 6월 12일자로 출원된 PCT 출원 제PCT/US2019/036654호, 2019년 10월 23일자로 출원된 PCT 출원 제PCT/US2019/057698호, 2020년 3월 6일자로 출원된 PCT 출원 제PCT/US2020/021596호 및 2019년 9월 2일자로 출원된 미국 출원 제16/558,224호에 나타나 있으며, 앞서 언급된 모든 출원의 개시내용은 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
선택적으로, 본 개시내용의 DRD는 금속효소의 슈퍼패밀리인 탄산 탈수효소의 구성원인 인간 탄산 탈수효소 2(human carbonic anhydrase 2: hCA2)로부터 유래될 수 있다. 본 개시내용의 DRD는 CA2(Uniprot ID: P00918)의 1번 내지 260번 아미노산(서열번호 7)으로부터 유래될 수 있다. 선택적으로, DRD는 모 CA2 서열의 2번 내지 260번 아미노산을 포함하는 CA2(예를 들어, 2번 내지 260번 아미노산)로부터 유래된다. 이는 본 명세서에서 CA2 M1del 돌연변이(CA2; 서열번호 55)로 지칭된다. 선택적으로, 본 개시내용의 DRD는 인간 탄산 탈수효소 2의 영역 또는 전체를 포함하고, M1del, L156H 및 S56N로부터 선택되는 전장 서열에 대해 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 선택적으로, DRD는 서열번호 7, 26, 55, 56 및 57로 이루어진 군으로부터 선택된다.
예로서, 변형된 TIL은 IL15 폴리펩타이드 구성요소에 대해 C-말단인 막관통 도메인 및 막관통 도메인에 대해 C-말단인 세포내 꼬리를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
변형된 TIL에 대한 작제물 및 작제물 구성요소의 비제한적인 예는 표 2에 나타나 있다. OT-IL15-292로 명명된 작제물은 N 말단으로부터 신호 서열, IL15, (GS)15 링커, 힌지 영역, 막관통 영역 및 세포내 꼬리를 포함한다. OT-IL15-293으로 명명된 작제물은 C 말단에 DRD(구체적으로, CA2 DRD(M1del, L156H))를 포함한다.
충분한 동적 범위(즉, 0에서 최대 포화까지의 리간드 변화에 상응하는 허용 가능한 활성 범위)로 조절될 수 있는 DRD에 작동 가능하게 연결된 IL15와 같은 막-테더링된 사이토카인을 생성하기 위해, 폴리펩타이드는 선택적으로 N-말단으로부터 페이로드(IL15), 링커, 힌지, 막관통 영역, 꼬리 및 DRD를 포함한다. 꼬리 및/또는 링커 및 꼬리와 링커 길이는 리간드의 부재 시 활성 수준에 영향을 미칠 수 있으며, 일부 실시형태에서, 특정 꼬리 및/또는 링커 및 길이는 낮은 기초 활성 수준 및 리간드 반응성을 유지하면서 온-상태(예를 들어, 최대 활성 수준)를 최대화하도록 선택된다. 특정 힌지는 형태 변화를 가능하게 할 수 있으므로, 충분한 동적 범위에 걸쳐 리간드 반응성에 영향을 줄 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 mbIL15를 발현하는 변형된 TIL은 많은 이점을 갖는다. 첫째, 변형된 TIL은 피더 세포(예컨대, 41BBL 및 IL21(선택적으로, mbIL21)을 발현하는 K562 피더 세포)의 존재하에 시험관내에서 확장될 수 있다. 중요하게는, 사전-REP 단계 이후에 변형된 TIL은 외인성 사이토카인의 부재하에 시험관내에서 확장될 수 있고, 확장된 TIL은 활성화되고 IL2와 같은 외인성 사이토카인의 투입 없이 생체내에서 추가로 확장될 수 있다.
복수의 변형된 TIL을 포함하는 TIL의 집단은 확장(즉, 피더 세포와 IL21 및 41BBL과 같은 자극 분자를 사용한 REP)을 겪은 TIL의 하위 집단을 포함할 수 있다. 확장된 TIL은 많은 이점을 보여준다. 예를 들어, REP를 겪은 확장된 TIL은 피더 세포가 부족한 배양에서 생존할 수 있다. 보다 구체적으로, mbIL15를 발현하도록 조작된 TIL은 외인성 사이토카인, 예를 들어, IL2와 같은 인터류킨의 부재하에 비조작된 세포보다 더 오래 생존할 수 있다. DRD에 작동 가능하게 연결된 mbIL15를 발현하도록 조작된 TIL은 비조작된 TIL보다 리간드가 존재하지만 외인성 사이토카인의 부재하에 더 잘 생존한다. 추가적으로, 확장된 TIL의 집단은 소정의 TIL의 우선적 확장을 보여주므로, 비확장된 TIL의 대조군 집단과 비교하여 TIL의 하위유형이 더 적거나 또는 더 많다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 비확장된 TIL의 대조군 집단은 확장된 TIL과 유사하게 변형되지만 REP를 겪지 않은 TIL을 지칭한다.
예를 들어, 확장된 TIL의 집단은 비확장된 TIL의 대조군 집단과 비교하여 더 큰 비율의 CD8+ 세포, 더 적은 비율의 CD4+ 세포 및 더 낮은 CD4+:CD8+ 비를 갖는다. CD8+ TIL은 세포독성 분자 및 사이토카인을 방출함으로써 암세포를 죽이는 핵심 역할로 간주되며, 종양에서 CD4+ TIL(즉, CD4+:CD8+ 비)의 수와 비교한 CD8+ TIL의 수는 양성 결과와 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다.
추가적으로, 소정의 실시형태에서, 확장된 TIL의 집단은 비확장된 TIL의 대조군 집단에서의 Treg 세포의 비율에 비해 더 적은 비율의 CD4 Treg 세포를 갖는다. CD4 Treg 세포는 면역 반응을 억제함으로써 면역학적 관용 및 면역 항상성에 역할을 한다. 따라서, TIL을 사용한 ACT와 같은 면역요법에서는 더 낮은 비율의 Treg 세포가 바람직하다.
확장된 TIL의 집단은 또한 고갈된 TIL이 더 적고 다작용성 TIL이 더 많다. 확장된 TIL의 집단은 비확장된 TIL의 대조군 집단에서 PD1+ 세포의 비율과 비교하여 PD1+ 세포의 비율이 더 적다. 추가적으로, 확장된 TIL의 집단은 비확장된 TIL의 대조군 집단에서 종양 괴사 인자 α(TNFα) 및 인터페론 γ(IFNγ)를 모두 생산하는 TIL의 비율과 비교하여 TNFα 및 IFNγ를 모두 생산하는 세포의 비율이 더 크다.
비변형된 TIL의 하위 집단 및 선택적으로 DRD에 작동 가능하게 연결된 mbIL15를 포함하는 변형된 TIL의 하위 집단을 포함하는 혼합된 TIL의 집단이 본 명세서에 제공된다. 변형된 TIL의 하위 집단은 41BBL 및 IL21(예를 들어, mbIL21)을 발현하는 K562 피더 세포의 존재하에 확장된다. 변형된 TIL의 하위 집단은 41BBL 및 IL21을 발현하는 K562 피더 세포의 존재하에 비조작된 TIL의 하위 집단보다 더 많이 확장된다. 변형된 TIL의 이러한 우선적 확장은 REP 동안 외인성 IL2의 부재하에 발생한다.
변형된 종양 침윤성 림프구(TIL)의 제조 방법
TIL은 당업계에 공지되어 있는 방법을 사용하여 종양 또는 이의 생검으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 종양 조각(예를 들어, 1㎜ 내지 5㎜ 크기)은 효소적 소화(예를 들어, 콜라게네이스(0.5 ㎎/㎖ 내지 5 ㎎/㎖), DNAse 또는 하이알루로니데이스) 또는 기계적 해리를 거친다. 해리된 세포는 다른 세포보다 TIL의 증식을 유리하게 하는 조건하에(즉, IL2의 존재하에) 세포 배양 배지에서 인큐베이션된다. 이 단계는 사전-REP 단계이다. 사전-REP 단계에서, 세포는 2000 IU/㎖ 내지 8000 IU/㎖의 IL2(예를 들어, 6000 IU/㎖)의 존재하에, 그리고 선택적으로 불활성화된 인간 AB 혈청의 존재하에 배양될 수 있다(예를 들어, 3일 내지 28일). 일부 실시형태에서, 세포는 며칠 동안, 일반적으로 3일 내지 28일 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 이러한 사전-REP 세포 집단은 7일 내지 21일의 기간 동안 배양된다.
사전-REP TIL은 동결 보존될 수 있다. 동결 보존된 세포는 해동되고, 활성화 전에 휴지된다. 세포는, 예를 들어, 플레이트 결합 OKT3, 가용성 OKT3, 공동자극 항체(예를 들어, CD28 또는 41BB에 대한 항체) +OKT3, 비드 또는 단편에 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체 등을 사용하여 활성화될 수 있다. 활성화 단계는 1일 내지 2일 또는 그 이상일 수 있다. 활성화 후, 하나 이상의 TIL은 이어서 IL15를 암호화하는 제1 핵산 서열 및 막관통 도메인을 암호화하는 제2 핵산 서열을 갖는 벡터로 하나 이상의 TIL을 형질도입함으로써 막-결합 인터류킨 15(mbIL15)를 발현하도록 조작된다. 선택적으로, 벡터는 신호 펩타이드, 링커, 힌지, 세포내 꼬리 또는 DRD를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 추가로 포함한다. 벡터는 목적하는 mbIL15를 달성하기 위해 여러 임의의 수의 방식으로 구성될 수 있다. 예시적인 핵산 작제물은 DRD 존재 여부에 관계없이 각각 OT-IL15-293 및 OT-IL15-292를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 벡터는 선택적으로 서열번호 29, 31, 53 또는 54를 포함한다. 벡터는 프로모터 서열 및 기타 조절 요소(인핸서, 번역 제어 요소(예를 들어, IRES) 및 대조군 반감기를 제어하는 요소)와 같은 추가적인 요소를 포함하거나 또는 암호화한다. 벡터는 선택적으로 번역을 제어하는 요소(예를 들어, IRES, WPRE 등)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 포함할 수 있다.
벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드, 코스미드 및 인공 염색체로부터 선택될 수 있다. 예로서, 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터일 수 있다. 예로서, 바이러스 벡터는 IL15를 암호화하는 핵산 및 막관통 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는, 개코원숭이 외피 유사형 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 발현 시, IL15는 막관통 도메인과 회합되며, 이는 막관통 도메인에 의해 결합된 막이다.
벡터는 선택적으로 바늘, 전기천공법, 초음파천공법, 유체천공법, 화학적 운반체(예컨대, 무기 입자(예를 들어, 칼슘 포스페이트, 실리카, 금))와 같은 비바이러스 방법 및/또는 화학적 방법에 의해 세포에 전달된다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질, 지질 나노 에멀션, 나노입자, 펩타이드-기반 벡터 또는 중합체-기반 벡터와 같은 합성 또는 천연 생분해성 작용제가 전달을 위해 사용된다.
IL15를 암호화하는 핵산은 게놈 또는 비게놈 핵산일 수 있다. 즉, IL15 암호화 핵산을 전달하는 데 사용되는 전달 시스템은 TIL의 게놈에 통합될 수 있거나, 또는 통합되지 않을 수 있거나(즉, 에피솜) 또는 RNA 벡터를 사용하여 RNA로서 세포질로 전달될 수 있다.
mbIL15를 포함하는 TIL은 REP 단계(예를 들어, 7일 내지 14일을 포함하여 5일 내지 21일 또는 그 사이의 임의의 양)에서 확장된다. 실시예에서 추가로 기재되는 바와 같이, IL15를 발현하도록 변형된 TIL은 K562 피더 세포뿐만 아니라 41BBL 및 IL21의 존재하에 확장된다. 소정의 실시형태에서, K562 피더 세포는 41BBL 및 막 결합 IL21(mbIL21)일 수 있는 IL21을 발현하도록 조작된다. mbIL15 TIL을 확장하는 이러한 방법은 REP 동안 IL2, IL7 또는 IL15와 같은 외인성 사이토카인의 필요성을 감소시키거나 또는 제거한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 mbIL21 및 41BBL을 발현하도록 변형된 K562 세포와 함께 1:1 내지 100:1, 1:1 내지 50:1, 1:1 내지 20:1, 1:1 내지 10:1 또는 2:1 내지 5:1(TIL: 피더 세포)의 비로 배양된다.
피더 세포는 본 발명의 방법에 사용되기 전에 먼저 복제 불능이 된다. 피더 세포를 처리하는 다양한 수단은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 조사(예를 들어, 감마선 또는 X-선 사용), 미토마이신-C 치료, 전기 펄스, 약한 화학적 고정(예를 들어, 폼알데하이드 또는 글루타르알데하이드 사용) 또는 자살 유전자를 사용한 피더 세포의 형질도입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 피더 세포는 인간 세포이다. 예로서, 조사는, 예를 들어, 세슘 공급원 또는 X-선 공급원에 의해 전달되는 25Gy 내지 300Gy일 수 있다.
피더 세포에서의 확장 후, TIL은 선택적으로 피더 세포로부터 단리된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 단리는 TIL에 피더 세포와 같은 다른 구성요소가 전혀 없음을 시사하는 것이 아니라 단지 TIL에 피더 세포가 상대적으로 없음을 시사하는 것을 의미한다.
mbIL15를 포함하는 TIL, TIL의 집단 또는 TIL의 하위 집단을 제조하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 또한, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 mbIL15를 암호화하는 핵산 서열, mbIL15를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터, 41BBL 및 IL21을 발현하도록 변형된 복제 불능 K562 피더 세포 및 TIL이 제공된다.
약제학적 조성물
ACT에 사용하기에 적합한 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다. 약제학적 조성물은 확장된 TIL과 같은 TIL 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물 내 TIL의 집단은 선택적으로 변형된 TIL(예를 들어, IL15를 발현하도록 조작된 TIL) 및 비변형된 TIL(즉, 비형질도입되거나 또는 비조작된 TIL)의 하위 집단을 포함하는 혼합된 집단이다.
용어 담체는 화합물 또는 세포와 조합될 때 의도된 용도 또는 목적을 위한 화합물 또는 세포의 제조, 보관, 투여, 전달, 유효성, 선택성 또는 임의의 다른 특징을 보조하거나 또는 용이하게 하는 화합물, 조성물, 물질 또는 구조를 의미한다. 예를 들어, 담체는 TIL의 임의의 열화를 최소화하고 대상체에서 임의의 유해 부작용을 최소화하도록 선택될 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 완충 식염수, 인공 뇌척수액, 덱스트로스 및 물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 멸균 생체적합성 약제학적 담체를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한은 생물학적이지 않거나 또는 달리 바람직하지 않은 물질을 의미하며, 이는 허용할 수 없는 생물학적 효과를 일으키거나 또는 TIL과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 TIL 또는 TIL 집단과 함께 개체에게 투여될 수 있다.
선택적으로, 약제학적 조성물은 동결보호제(동결보존제)를 추가로 포함한다. 이러한 동결보호제는 TIL이 향후 사용을 위해 동결되는 경우 허용할 수 없는 세포 용해 또는 손상을 방지하는 역할을 한다. 동결보호제는 당업계에 공지되어 있다. 이러한 동결보호제는 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 다이메틸설폭사이드(DMSO) 중에서 선택될 수 있다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 선택적으로 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제(예를 들어, 인간 혈청 알부민 또는 중합체성 물질(예를 들어, PEG))를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 조성물은 전달에 적합한 임의의 방식으로 제형화될 수 있다. TIL은 나노입자, 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA) 마이크로스피어, 리피도이드, 리포플렉스, 리포솜, 중합체, 탄수화물(단순 당 포함), 양이온성 지질 또는 이들의 조합으로 투여될 수 있다
본 명세서에 제공된 약제학적 조성물의 설명이 인간에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 당업자는 이러한 조성물이 일반적으로 임의의 다른 동물, 예를 들어, 비인간 포유동물에 투여하기에 적합하다는 것을 이해할 것이다. 약제학적 조성물의 투여가 상정되는 대상체는 농업 동물, 예컨대, 소, 말, 닭 및 돼지; 가축, 예컨대, 고양이, 개; 또는 연구 동물, 예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 개 및 비인간 영장류를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
치료 방법
mbIL15를 발현하는 변형된 TIL 또는 확장된 TIL의 집단 또는 하위집단을 포함하는 이의 집단을 대상체(즉, 수용 대상체)에게 투여함으로써 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 암은 흑색종, 포도막(안구) 흑색종, 자궁경부암, 난소암, 두경부암, 비소세포 폐 암(NSCLC), 방광암, 유방암, 신세포 암종, 췌장암, 전립선암, 신경계의 암, 위장관암(예를 들어, 결장직장암)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
현재까지의 TIL 요법은 TIL의 투여와 동시에 또는 그 이후에 고용량의 IL2의 동시 투여를 필요로 하였다. 그러나, TIL을 사용한 통상적인 치료와 달리, 본 발명의 방법은 IL2의 투여를 필요로 하지 않는다. 오히려 mbIL15를 발현시킴으로써 변형된 TIL은 TIL의 증식 및 활성을 자극하기에 충분한 사이토카인의 공급원을 제공한다.
암을 치료하는 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이 종양으로부터 하나 이상의 TIL을 단리하는 단계 및 하나 이상의 TIL에 mbIL15를 발현하는 핵산 서열을 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다. TIL은 수용 대상체(자가조직 공급원)의 종양으로부터 단리될 수 있다. TIL이 단리되는 종양은 원발성 종양 또는 전이성 종양일 수 있다. 따라서, 생검 또는 원발성 종양의 일부로부터의 TIL이 동결 보존되는 경우, 이들은 해동되어 차후에 생성된 전이성 종양 또는 상이한 원발성 종양의 치료에 사용될 수 있다. 대안적으로, TIL은 공여자(동종이계 공급원)의 종양으로부터 단리될 수 있되, 공여 대상체는 수용 대상체가 아니다. 치료될 동일한 종양으로부터 단리된 TIL은 종양과 동일한 신생항원 및 이종성을 갖는다는 이점이 있다. 동일한 대상체의 상이한 종양 또는 공여 대상체의 종양으로부터 단리되는 TIL은 TCR의 4량체 염색과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 수용 대상체의 종양에 존재하는 암 항원과의 반응성에 대해 선택될 수 있다. TIL이 공여 대상체로부터 단리되는 경우, 방법은 이식편 대 숙주 반응을 감소시키기 위해 수용 대상체에 대해 HLA가 일치하는 공여 대상체를 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
TIL은 초기 단계로서 종양 샘플 외과적 절제, 조직 생검, 바늘 생검 또는 다른 수단으로부터 얻을 수 있다. 그런 다음, TIL은 본 명세서에 기재된 바와 같이 형질도입된 다음, ACT에 대한 더 큰 세포 집단을 제공하기 위해 생체외에서 확장된다.
변형된 TIL의 투여는 약 1000개 세포/주입 내지 최대 약 100억개 세포/주입, 예컨대, 주입당 2×1011, 1×1011, 1×1010, 1×109, 1×108, 1×107, 5×107, 1×106, 5×106, 1×105, 5×105, 1×104, 5×104, 1×103 또는 5×103개의 세포 또는 끝점을 포함하여 임의의 두 숫자 사이의 임의의 범위의 양을 포함할 수 있다. 선택적으로, 1×108 내지 1×1011개의 세포가 대상체에게 투여된다.
본 개시내용의 TIL은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL은 정맥내 주입, 동맥내 주입, 복강내, 경막내, 림프내로 투여된다. 일부 실시형태에서, TIL은 정맥내 또는 동맥내 주입에 의해 투여된다. 선택적으로, TIL은 국부로, 예를 들어, 종양 또는 종양을 공급하는 혈관에 직접 투여된다.
TIL은 단일 용량으로 투여될 수 있지만, 소정의 경우에 다중 용량으로 투여될 수 있다.
치료 방법은 TIL의 투여 전 수용 대상체의 림프구 제거(lymphodepletion)를 더 포함할 수 있다. 흑색종의 인간 및 뮤린 모델에서의 조사는 림프구 제거가 T 세포 증식을 억제할 수 있는 조절 T 세포(Treg 세포) 및 말초 골수-유래 억제 세포를 포함하는 음성 조절 세포를 고갈시키는 것을 시사한다. 따라서, 림프구 제거는 입양 전달된 TIL의 증식을 돕는다. 림프구 제거 조건부 양생법(Lymphodepleting conditioning regimen)은, 예를 들어, TIL의 입양 전달 전 전신 방사선 조사 또는 림프구 제거제를 사용한 수용 대상체의 전처리를 포함한다. 이러한 전처리는 Treg 세포를 제거하고 정상 세포가 새로 주입된 TIL과 경쟁함으로써 잠재적 사이토카인 흡수원(sink)을 제거하여 TIL이 확장되도록 한다.
림프구 제거제의 일례는 플루다라빈(예를 들어, 0.5 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖의 용량)이다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈은 TIL 투여 전 1일 내지 7일 동안 일일 1 ㎍/㎖의 농도로 투여된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈은 10 ㎎/㎏/일, 15 ㎎/㎏/일, 20 ㎎/㎏/일, 25 ㎎/㎏/일, 30 ㎎/㎏/일, 35 ㎎/㎏/일, 40 ㎎/㎏/일 또는 45 ㎎/㎏/일의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈 치료제는 35 ㎎/㎏/일로 2일 내지 7일 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈 치료제는 35 ㎎/㎏/일로 4일 내지 5일 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 플루다라빈 치료제는 25 ㎎/㎏/일로 4일 내지 5일 동안 투여된다.
일부 실시형태에서, 사이클로포스파마이드는 이의 활성 형태인 포스파마이드를 제공하기 위해 0.5 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖의 농도로 투여된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파마이드는 포스파마이드를 제공하기 위해 TIL 투여 전 1일 내지 7일 동안 일일 1 ㎍/㎖의 농도로 투여된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파마이드는 50 ㎎/㎡/일, 75 ㎎/㎡/일, 100 ㎎/㎡/일, 150 ㎎/㎡/일, 175 ㎎/㎡/일, 200 ㎎/㎡/일, 225 ㎎/㎡/일, 250 ㎎/㎡/일, 275 ㎎/㎡/일 또는 300 ㎎/㎡/일의 투여량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파마이드는 정맥내로(i.v.) 투여된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파마이드 치료제는 35 ㎎/㎏/일로 i.v.로 2일 내지 7일 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파마이드 치료제는 250 ㎎/㎡/일로 i.v.로 4일 내지 5일 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파마이드 치료제는 250 ㎎/㎡/일로 i.v.로 4일 동안 투여된다.
소정의 실시형태에서, 림프구 제거는 2일 동안 60 ㎎/㎏의 사이클로포스파마이드 및 5일 동안 25 ㎎/㎡의 플루다라빈 또는 4일 동안 250 ㎎/㎡/일의 사이클로포스파마이드 및 4일 동안 25 ㎎/㎡의 플루다라빈과 같은 림프구 제거제의 병용 투여를 포함한다.
TIL에 의해 발현된 IL15가 DRD에 작동 가능하게 연결된 경우, 방법은 TIL의 IL15 활성을 증가시키기에 효과적인 양으로 DRD에 결합하는 제2 작용제(리간드)를 수용 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 리간드는 대상체에게 선택된 양의 IL15 활성을 제공하는 투여 양생법을 사용하여 투여될 수 있다. 리간드는 대상체에서 연속적 또는 간헐적 IL15 활성을 달성하기 위해 전달될 수 있다. 대상체에 대한 투여 빈도 또는 기간을 결정하는 것은, 예를 들어, IL15의 더 많은 활성이 요구되는 경우 리간드의 더 높은 용량 또는 더 긴 투여 기간을 제공하고 더 적은 활성이 요구되는 경우 리간드 투여를 감소시키거나 또는 제거하는 것을 고려함으로써 당업자에 의해 결정된다. 리간드 투여의 용량 및 기간 및 이에 따른 IL15의 활성이 또한 대상체에서 허용할 수 없는 부작용 또는 독성을 피하기 위해 선택된다. 따라서, 대상체는 유효량의 IL15를 달성하기 위해 유효량의 리간드가 투여된다. 용어 유효량은 목적하는 생리학적 반응을 생성하는 데 필요한 임의의 양으로 정의된다. 리간드를 투여하기 위한 유효량 및 스케줄은 생성된 IL15의 양, IL15의 활성에 기초하거나 또는 IL15 활성의 효과의 하나 이상의 징후에 기초하여 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 리간드의 투여 범위는 0에서 포화 용량의 범위이며, 이에 따른 IL15 활성은 리간드의 부재 시 기초 수준에서 포화량의 리간드가 존재 시 최대 수준까지의 범위이다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포를 선택된 양의 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하되, 선택된 양의 리간드는 IL15 페이로드의 선택된 활성 수준을 초래한다. 소정의 실시형태에서, 방법은 대안적으로 기초 수준에서 최대 수준까지 범위의 선택된 활성 수준을 달성하기 위해 세포를 다양한 선택된 양의 리간드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 선택적으로, 리간드에 대한 목적하는 용량-반응 및 페이로드에 대해 수반되는 활성 범위를 허용하는 충분한 동적 범위(예를 들어, 주어진 리간드 및 페이로드에 대해, 오프-상태 및 최대 페이로드 활성의 차이 범위는 리간드의 적어도 10-배 범위를 초래함)가 있다. 이러한 충분한 동적 범위는 미세 조정 및 허용할 수 없을 정도로 가파르지 않은 용량 반응 곡선을 가능하게 한다.
리간드는 연속적 또는 간헐적 IL15 페이로드 활성을 달성하기 위해 전달될 수 있다. 연속적 페이로드 활성은 실질적으로 일관된 수준의 활성일 수 있거나 또는 활성의 수준이 조절될 수 있다. 오프-상태와 온-상태 사이의 간헐적 활성은 오프-상태와 실질적으로 일관된 온-상태 사이 또는 오프-상태와 다양한 온-상태 활성 수준 사이의 활성을 조절하는 것을 포함한다. IL15 페이로드의 더 많은 활성이 요구될 때 더 높은 용량 또는 더 긴 투여 기간의 리간드가 투여되고, 더 적은 활성이 요구될 때 리간드 용량의 감소 또는 제거가 선택된다. 리간드의 투여 용량 또는 빈도 및 이에 따른 IL15 페이로드의 양 및 활성은 허용할 수 없는 해로운 부작용을 일으킬 정도로 커서는 안되며, 환자의 연령, 환자의 일반적인 상태, 성별, 치료 중인 암의 유형, 암의 정도 및 다른 치료제가 치료 양생법에 포함되는지 여부에 따라 다를 것이다. 주어진 클래스의 리간드에 대한 적절한 투여량에 대한 지침은 문헌에서 찾을 수 있다.
일부 실시형태에서, mbIL15 또는 조절 가능한(즉, DRD에 작동 가능하게 연결된) mbIL15로 변형된 TIL은 하나 이상의 면역 관문 조절제와 병용하여 투여될 수 있다. 관문 저해제는 니볼루맙(BMS-936558, 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb); Opdivo®), 펨브롤리주맙(람브롤리주맙, MK03475 또는 MK-3475, 머크(Merck); Keytruda®), 인간화된 항-PD-1 항체 JS001(상하이 준시(ShangHai JunShi)), 단일클론 항-PD-1 항체 TSR-042(테사로, 인크.(Tesaro, Inc.)), 피딜리주맙(항-PD-1 mAb CT-011, 메디베이션(Medivation)), 항-PD-1 단일클론 항체 BGB-A317(베이진(BeiGene)) 및/또는 항-PD-1 항체 SHR-1210(상하이 헹루이(ShangHai HengRui)), 인간 단일클론 항체 REGN2810(리제네론(Regeneron)), 인간 단일클론 항체 MDX-1106(브리스톨-마이어스 스큅) 및/또는 인간화된 항-PD-1 IgG4 항체 PDR001(노바티스(Novartis))을 포함하지만 이에 제한되지 않는 PD-1을 표적으로 하거나 또는 PD-L1에 대한 PD-1의 결합을 저해하는 항체를 포함한다.
대상체는 선택적으로 치료 결과에 대해 모니터링된다. 따라서, 예를 들어, 샘플에서 악성 세포의 수, 샘플에서의 순환하는 종양 DNA 또는 영상화 시 고형 종양의 크기가 검출될 수 있다. 목적하는 종점이 달성되면(예를 들어, 암의 성공적인 치료를 나타내는 경우), IL15를 감소시키거나 또는 제거하기 위해 리간드는 감소되거나 또는 중단될 수 있다. 유사하게는, 대상체가 사이토카인 폭풍, 알레르기 반응 또는 IL15로 인한 다른 해로운 효과를 나타내면, 리간드는 감소되거나 또는 중단될 수 있다.
정의
양, 농도, 용량, 시간, 온도, 활성, 수준, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 중량, 위치, 길이 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭하기 위해 사용될 때 용어 약 및 근사는 지정된 양, 농도, 용량, 시간, 온도, 활성, 수준, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 중량, 위치, 길이 등의 ±15%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0.5% 또는 심지어 ±0.1%의 변동을 포함할 수 있는 실험 오류로 인한 변동을 설명하기 위한 것이다. 모든 측정값 또는 숫자는 약이라는 단어에 의해 측정값 또는 숫자가 명시적으로 수정되지 않더라도 암시적으로 약이라는 단어로 수정되는 것으로 이해된다. 용어 약 및 근사는 참조 폴리펩타이드 내 영역의 장소 또는 위치와 관련하여 사용되는 경우, 이러한 용어는 ± 최대 20개의 아미노산 잔기, ± 최대 15개의 아미노산 잔기, ± 최대 10개의 아미노산 잔기, ± 최대 5개의 아미노산 잔기, ± 최대 4개의 아미노산 잔기, ± 최대 3개의 아미노산 잔기, ± 최대 2개의 아미노산 잔기 또는 심지어 ± 1개의 아미노산 잔기의 변동을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 작동 가능하게 연결된은 쌍을 이룬 리간드가 존재하는 경우, DRD가 IL15의 측정 가능한 특성을 변경(예를 들어, 쌍을 이룬 리간드가 없는 경우의 활성 수준과 비교하여 IL15의 활성 수준을 변경)하기 위해 직접 또는 간접적으로 IL15에 연결되는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, IL15의 양 및/또는 활성의 측정된 수준은 리간드가 없는 경우의 발현 또는 활성의 측정된 수준과 비교하여 유효량의 리간드가 존재하는 경우 증가한다. 리간드의 유효량은 IL15의 양 또는 활성의 척도에서 증가를 확인하는 데 필요한 리간드의 양을 의미한다. 일부 실시형태에서, 유효량은 허용할 수 없는 독성 또는 표적외 효과를 생성할 만큼 크지 않다. 선택적으로, 측정 가능한 특성은 치료 결과, 샘플 내 페이로드의 양 또는 페이로드의 생물학적 활성 수준(페이로드 양의 측정은 대용물의 역할을 할 수 있음)이다.
연결된 또는 결합된 등의 어구가 사용되는 곳마다, 달리 명시적으로 언급되지 않거나 또는 문맥상 무의미하지 않는 한 해당 어구는 직접 또는 간접적으로 뒤따르는 것으로 이해된다. 따라서, mbIL15에 연결된, 결합된 또는 회합된 DRD에 대한 언급은 각 경우에 DRD가 mbIL15에 직접 또는 간접적으로 연결됨을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 TIL의 생존 및 TIL의 지속성은 상호교환적으로 사용된다. TIL의 지속적인 효과에 기초하여 결정된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 확장은 기능적 REP 동안 발생하는 세포 수의 기능적 증가를 지칭하기 위해 사용된다. 기능적 REP는 치료용으로 충분한 세포 수를 제공하는 확장된 세포 집단을 초래한다. 반면에, 실패한 REP는 세포 수의 기능적 배수 증가를 초래하지 않을 것이다. 비확장된 세포는 사전-REP 세포 및 확장된 세포 집단과 비교하여 REP에서 기능적 확장을 겪지 않는 세포를 포함한다. 비기능적 확장은 확장된 세포 집단의 10% 이하의 확장을 포함한다. 예를 들어, 주어진 기간 내에 100-배 확장된 TIL 집단은 10-배 이하만 확장된 비확장된 집단과 비교될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 확장된 세포 또는 확장된 세포 집단은 기능적 REP를 겪은 세포 또는 세포 집단을 지칭한다. 비확장된 세포 또는 세포 집단은 사전-REP 또는 REP 이후에 세포 집단의 기능적 확장을 초래하지 못한 세포 또는 세포 집단을 지칭한다. 예로서, 소정의 변형된 TIL은 변형된 K562 피더 세포에서 확장될 것이지만, PBMC의 배수 확장은 변형된 K562 피더 세포에서의 배수 확장의 10% 미만일 것이다. 따라서, 비확장된 TIL은 사전-REP의 변형된 TIL 또는 PBMC에서 REP 후 변형된 TIL일 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같은 용어 동일성은 서열을 비교함으로써 결정되는 바와 같이 2개 이상의 서열 사이의 관계를 지칭한다. 당업계에서, 동일성은 또한 2개 이상의 잔기(아미노산 또는 핵산)의 스트링 사이의 일치의 수에 의해 결정되는 바와 같이 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. 동일성은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, 알고리즘)에 의해 처리되는 갭 정렬(있는 경우)을 사용하여 2개 이상의 서열 사이에 동일한 일치의 퍼센트를 측정한다. 관련 서열의 동일성은 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 이러한 방법은 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)]에 기술되어 있는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 본 개시내용의 특정 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 변이체는 본 명세서에 기재되고 당업자에게 공지된 서열 정렬 프로그램 및 매개변수에 의해 결정되는 바와 같이 특정 참조 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 그러나 100% 미만의 서열 동일성을 가질 것이다. 정렬을 위한 이러한 도구는 BLAST 제품군의 도구를 포함한다(Stephen F. Altschul, Thomas L. Madren, Alejandro A. , Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)
본 명세서에서 사용되는 용어 피더 세포는 세포 배양으로 분비되거나 또는 피더 세포 막 성장 또는 생존 인자 상에 제시됨으로써 배양에서 TIL의 확장을 지원하는 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 피더 세포는 성장이 정지(즉, 복제 불능)된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 대상체 및 환자는 상호교환적으로 사용되며, 인간 대상체 또는 환자로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 치료는 암의 하나 이상의 징후 또는 증상의 감소 또는 지연을 지칭한다. 예로서, 질환의 측정 가능한 매개변수에서 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 이상의 유리한 변화는 효과적인 치료를 나타낼 수 있다. 따라서, 질환의 치료 또는 개선의 효능은, 예를 들어, 질환 진행, 질환 관해, 증상 중증도, 통증의 감소, 삶의 질, 치료 효과를 지속시키는 데 필요한 약물의 용량, 질환 마커의 수준 또는 치료 중이거나 또는 치료를 위해 표적화된 주어진 질환에 적합한 임의의 다른 측정 가능한 매개변수를 측정함으로써 평가될 수 있다. 본 개시내용의 조성물의 투여와 관련하여, 암의 치료를 위한 유효량은 임상적으로 적절한 방식으로의 투여가 증상의 개선, 치유, 질환 부하의 감소, 종양 질량 또는 세포 수의 감소, 수명의 연장, 삶의 질의 개선 또는 특정 유형의 암을 치료하는 데 익숙한 의사가 일반적으로 긍정적으로 인정하는 기타 효과와 같은 환자의 적어도 통계적으로 유의미한 부분에 유익한 효과를 초래함을 나타낸다.
범위가 주어지는 경우, 종점이 포함된다. 또한, 달리 나타내지 않거나 또는 문맥 및 당업자의 이해로부터 달리 명백하지 않는 한, 범위로 표현된 값은 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 본 개시내용의 상이한 실시형태에서 범위의 하한 단위의 10분의 1까지 명시된 범위 내의 임의의 특정 값 또는 하위 범위를 가정할 수 있음을 이해하여야 한다.
본 개시내용의 하나 이상의 실시형태의 세부사항은 설명 및 첨부된 도면에 제시되어 있다. 다른 실시형태가 사용될 수 있으며, 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않고 구조적 또는 프로세스 변경이 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다. 즉, 예시적인 실시형태 및 양태가 기술된다. 그러나, 이러한 임의의 실제 실시형태의 개발에서, 구현마다 다를 수 있는 임상적으로 관련된 제약조건의 준수와 같은 개발자의 특정 목표를 달성하기 위해 수많은 구현-특이적 결정이 내려질 수 있음을 이해할 것이다. 더욱이, 이러한 개발 노력은 복잡하고 시간이 많이 소요될 수 있지만, 그럼에도 불구하고 본 개시내용의 이점을 갖는 당업자에게는 일상적인 작업이 될 것임을 이해할 것이다.
본 명세서에 인용된 간행물 및 이들이 인용된 자료는 전체가 참조에 의해 본 명세서에 구체적으로 원용된다.
아래 실시예는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 소정의 양태를 추가로 예시하기 위한 것이며, 청구범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 환자 종양 샘플로부터 TIL의 단리 및 확장(사전-REP 배양)
흑색종 및 두경부 종양 샘플을 협동 인간 조직 네트워크(Cooperative Human Tissue Network)로부터 얻었다. 종양 샘플을 행크의 평형 염용액(Hanks' Balanced Salt Solution: HBSS) 완충액에서 1㎜ 내지 3㎜ 조각으로 절단하고, 조각을 6000 IU/㎖ IL2(페프로텍(Peprotech)) 및 0.1 ㎎/㎖ 노르모신(인비보젠(InvivoGen))을 포함하는 2㎖의 TIL 배양 배지(GlutaMAX(써모 피셔(Thermo Fisher)), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1mM 소듐 피루베이트, 1% HEPES, 50μM 2-머캅토에탄올(인비트로젠(Invitrogen)) 및 10% 열-불활성화 인간 AB 혈청(밸리 바이오(Valley Bio))가 보충된 RPMI-1640)에서 1개 조각/웰로 다중-웰 플레이트에 넣었다. 배지의 절반을 5일째부터 IL2를 포함하는 새로운 배지로 교체하고, 세포가 3주 동안 컨플루언트 해지면서 여러 웰 또는 플라스크로 분할하였다. 이러한 배양 과정은 사전 신속 확장 프로토콜(사전-REP)로 지칭된다. 사전-REP 후, TIL을 분취하고, 세포 동결 배지(불독 바이오(Bulldog Bio)의 Bambanker 또는 스템셀 테크놀로지스(STEMCELL Technologies)의 Cryostor-10)에 동결시키고, 액체 질소에서 장기간 보관하였다.
사전-REP 배양 전 및 후의 T 세포의 빈도의 변화를 결정하기 위해, 종양 조각의 일부를 콜라게네이스 및 DNase I로 소화시켜 사전-REP 배양 전에 단일 세포 현탁액을 생성하고, 사전-REP 배양 후 얻은 세포와 비교하였다. T 세포의 빈도를 형광색소 접합된 항-CD45 및 항-CD3 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 분석하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 전-배양 종양 세포 현탁액에서 세포(44.29±21.67%)의 거의 절반이 CD45+였으며, 이들 중 대략 40%(약 39.85±23.69%)만이 CD3+ T 세포였다. IL2의 존재하에 3주 동안 배양한 후(사전-REP), 대부분의 세포는 조혈 세포의 농축을 나타내는 CD45+(90.35±7.28%), T 세포의 농축을 나타내는 CD3+(80.64±15.19%)였다.
흑색종 종양 및 유방, 폐, 신장, 자궁내막, 간, 췌장 및 난소로부터의 악성 종양을 포함하는 여러 인간 종양 유형으로부터의 TIL을 위에 기재된 바와 동일한 방식으로 단리하였다.
실시예 2: 막-결합 IL21 및 4-1BBL을 발현하는 K562 세포의 생성
막-결합 IL21 및 4-1BBL 벡터 작제물 어셈블리
IL21-41BBL-001 삽입체는 리더 서열, 막-결합 IL21(mbIL21), P2A 서열 및 4-1BBL을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. mbIL21 핵산 서열은 순서대로 IL21 서열, IgG 힌지, IgG4 사슬, CD4 막관통 도메인 및 글리신-세린(GS) 링커를 암호화한다(표 3 참조). IL21-41BBL-001 삽입체를 포함하는 OT-IL21-41BBL-001을 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 pELNS 벡터(3세대 자가-불활성화 렌티바이러스 발현 벡터)에 구성하였다. 유전자 단편(Gblocks)을 pELNS 벡터에 삽입하고, Gibson 어셈블리(네빌더 하이파이(NEBuilder Hifi))를 사용하여 EF1a 프로모터의 제어하에 두었다. 조립된 플라스미드를 증폭을 위해 대장균(NEB 안정적)에 형질전환시키고, 바이러스 생산을 진행하기 전에 서열을 확인하였다.
표 3은 본 명세서에 개시된 mbIL21-41BBL 작제물의 도메인에 대한 핵산 및 아미노산 서열을 제시한다. OT-IL12-(241-262) 및 OT-CD19-IL12-(297-316, 319-332) 플라스미드를 각각 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 pELNS 벡터(3세대 자가-불활성화 렌티바이러스 발현 벡터)에 구성하였다. IL12, 글리신-세린 링커, 다양한 힌지, 막관통 도메인 및 세포질 꼬리를 암호화하는 유전자 단편(Gblocks 또는 스트링 DNA)을 인터그레이티드 디엔에이 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies) 또는 써모-피셔 사이언티픽(Thermo-fisher scientific)으로부터 구입하였다. 유전자 단편을 pELNS 벡터에 삽입하고, Gibson 어셈블리(네빌더 하이파이)를 사용하여 EF1a 프로모터의 제어하에 두었다. 조립된 플라스미드를 증폭을 위해 대장균(NEB 안정적)에 형질전환시키고, 바이러스 생산을 진행하기 전에 서열을 확인하였다.
OTLV-IL21-41BBL-001 렌티바이러스 생산
형질감염 당일에, HEK293T 세포를 총 부피 20㎖의 성장 배지(둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle 배지: DMEM), 5% 소태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 15×106개 세포/플라스크로 콜라겐-코팅된 조직 배양 플라스크에 시딩하였다. 형질감염 1시간 전, 성장 배지를 가온시킨 SFM4Transfx-293으로 교체하였다. 세포를 Opti-MEM 배지에서 Lipofectamine 3000 형질감염 시약 및 P3000 인핸서 시약을 사용하여 OT-IL21-41BBL-001 및 패키징 플라스미드 pRSV.Rev, pMDLg/pRRE 및 pMD2.G(Addgene #122590)로 형질감염시켰다. SFM4Transfx-293 형질감염 후 6시간 내지 8시간(시)에 배지를 교체하였다. OTLV-IL21-41BBL-001을 포함하는 상청액을 형질감염 24시간 후 수거하고, 새로운 배지를 첨가하고, 형질감염 48시간 후 다시 상청액을 수거하였다. 바이러스 상청액을 여과하여 찌꺼기를 제거하고, 4℃에서 2시간 동안 25,000g에서 초원심분리하여 농축시켰다. OTLV-IL21-41BBL-001 렌티바이러스를 현탁시키고, 분취하여 -80℃에서 보관하였다.
OTLV-IL21-41BBL-001 렌티바이러스를 사용한 K562 세포의 형질도입
K562 세포를 2mM L-글루타민 및 10% FBS(완전 RPMI, 써모 피셔)가 포함된 RPMI-1640을 포함하는 성장 배지에서 배양하였다. 형질감염 당일에, K562 세포를 500㎕의 K562 세포 성장 배지에 1.5×105개 세포/웰로 다중-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포에 OTLV-IL21-41BBL-001 렌티바이러스를 형질도입한 다음, 32℃에서 1시간 동안 800g에서 원심분리하였다. 세포를 24시간 내지 48시간 동안 인큐베이션한 다음, 항체 eFluor 780(써모 피셔, 1:1000), 4-1BBL 피코에리트린(1:50) 및 IL21 알로피코사이아닌(1:50)을 사용하여 유세포 분석에 의해 생존력 및 IL21 및 4-1BBL의 발현에 대해 평가하였다. 형질도입된 K562 세포를 17일 동안 완전 RPMI에서 확장시킨 후, 분취하고, 세포 동결 배지(Bambanker, 불독 바이오)를 사용하여 동결시키고, 액체 질소에 장기간 보관하였다. 이러한 형질도입된 K562는 이 문서에서 K562-IL21-41BBL로 지칭될 것이다.
K562-IL21-41BBL 세포를 TIL REP 과정에서 피더 세포로 사용하기 전에 방사선 조사하거나 또는 미토마이신 C로 처리하였다. 방사선 조사를 위해, 새로운 세포 배양물로부터 K562-IL21-41BBL 세포를 취하고, 원심분리하고, 완전 RPMI에 5-20×106개 세포/㎖로 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 X-선 조사기에서 50Gy 내지 200Gy에 노출시킨 후, 세포를 세척하고, REP 과정에서 즉시 사용하기 위해 3×106 세포/㎖로 재현탁시켰다. 미토마이신 C 처리를 위해, 세포를 해동시키고, 원심분리하고, TIL 배지에 5×106개 세포/㎖로 재현탁시켰다. 10 ㎍/㎖ 미토마이신-C를 세포에 첨가하고, 세포를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포를 50㎖ TIL 배지로 3회 세척하고, REP 과정에서 즉시 사용하기 위해 3×106개 세포/㎖로 재현탁시켰다.
실시예 3. 렌티바이러스 벡터를 사용한 TIL의 형질도입
IL15 벡터 작제물 어셈블리
OT-IL15-292 및 OT-IL15-293(아래 서열)을 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 pELNS 벡터(3세대 자가-불활성화 렌티바이러스 발현 벡터)에 각각 구성하였다. 코돈-최적화된 IL15, GS 링커, B7-1 힌지, 막관통 도메인 및 세포질 꼬리를 암호화하는 유전자 단편(Gblocks)을 인터그레이티드 디엔에이 테크놀로지스, 인크.(IDT, 아이오와주 코랄빌 소재)로부터 구입하였다. 유전자 단편을 pELNS 벡터에 삽입하고, Gibson 어셈블리(네빌더 하이파이)를 사용하여 EF1a 프로모터의 제어하에 두었다. 조립된 플라스미드를 증폭을 위해 대장균(NEB 안정적)에 형질전환시키고, 바이러스 생산을 진행하기 전에 서열을 확인하였다.
표 1 및 표 2(위에 제공됨)는 본 명세서에 개시된 구성적 mbIL15 작제물(OT-IL15-292) 및 ACZ-조절된 mbIL15 작제물(OT-IL15-293)의 구성요소에 대한 핵산 및 아미노산 서열을 제시한다. 작제물 OT-IL15-293은 표 1에서 CA2(M1del, L156H)로 표지된 불안정한 도메인을 포함한다.
표 2(위에 제공됨)는 또한 본 명세서에 개시된 구성적 IL15(IL15-292) 및 ACZ-조절된 IL15(IL15-293) 작제물의 핵산 및 아미노산 서열을 제시한다.
BaEV-유사형 렌티바이러스 생산
HEK293T 세포를 70% 컨플루언트할 때까지 콜라겐 코팅된 조직 배양 플레이트에 시딩하였다. 세포를 Opti-MEM 배지(써모 피셔)에서 Lipofectamine 3000 형질감염 시약 및 P3000 인핸서 시약(써모 피셔)을 사용하여 구성적(IL15-292) 또는 조절된(IL15-293) IL15 작제물뿐만 아니라 패키징 플라스미드 pRSV.Rev(Addgene #12253), pMDLg/pRRE(Addgene #12251) 및 OT-BaEVg-002(서열번호 XX)를 운반하는 pELNS 전달 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염 후 6시간 내지 8시간(시)에 배지를 무혈청 배지(SFM4Transfx-293, 사이티바(Cytiva))로 교체하였다. 바이러스를 포함하는 상청액을 형질감염 24시간 후에 수거하고, 새로운 배지를 첨가하고, 형질감염 48시간 후에 상청액을 다시 수거하였다. 바이러스 상청액을 여과하여 찌꺼기를 제거하고, 저속 초원심분리에 의해 농축시켰다. 바이러스를 재현탁시키고, 분취하고, -80℃에서 보관하였다.
신속 확장 프로토콜(REP) 및 BaEV-유사형 렌티바이러스 벡터를 사용한 TIL의 형질도입
실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 두경부 종양 샘플로부터 생성된 TIL을 사전-REP 배양에서 3주 후에 조작하였다. TIL을 해동시키고, 6000 IU/㎖ 인간 IL2와 함께 TIL 배지에 밤새 두었다. 그런 다음, TIL을 3:1 비드 대 TIL 비의 항-CD3/CD28 비드(Dynabead, 써모 피셔) 또는 3 ㎍/㎖(Ultra-LEAF 정제 항-인간 CD3 항체, 바이오레전드(Biolegend))의 플레이트-결합 OKT3 및 6000 IU/㎖의 인간 IL2와 함께 24-웰 플레이트에서 24시간 동안 활성화하였다. 레트로넥틴(RetroNectin)(30 ㎍/㎖)을 사용하여 코팅되지 않은 96-웰 세포 배양 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음날, 레트로넥틴을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 2% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단한 다음, 플레이트를 PBS로 세척하였다. 위에 기재된 바와 같이 제조된 BaEV-유사형 렌티바이러스 상청액을 TIL 배지로 희석하고, 1-4 TU/세포의 MOI에 대해 웰당 100 내지 200㎕의 총 부피로 첨가하였다. 바이러스 벡터를 포함하는 플레이트를 32℃에서 2시간 동안 1400g에서 원심분리한 다음, 상청액을 제거하였다. 상청액 제거 후, 1.5×105개의 활성화된 TIL을 웰당 0 IU/㎖ 내지 6000 IU/㎖ IL2로 전달하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 바이러스 첨가 없이 유사하게 처리하고, 음성 대조군("비조작된")으로 사용하였다. 형질도입 24시간 후, TIL을 총 16㎖ 내지 40㎖의 TIL 배지(GlutaMAX(써모 피셔), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1mM 소듐 피루베이트, 1% HEPES, 50μM 2-머캅토에탄올(인비트로젠) 및 10% 열-불활성화 인간 AB 혈청(밸리 바이오)이 보충된 RPMI-1640)가 있는 6M GREX 웰 플레이트(윌슨 울프(Wilson Wolf))로 옮겼다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 41BBL 및 mbIL21가 형질도입된 방사선 조사된 또는 미토마이신-C 처리된 K562 피더 세포를 2:1 또는 5:1 K562 대 TIL의 비로 배양물에 첨가하였다. 조절된 mbIL15 작제물이 형질도입된 TIL에 25μM 아세타졸아마이드(셀렉캠(SelleckChem))를 첨가하고, 형질도입되지 않은 TIL에 6000 IU/㎖ IL2를 첨가하였다. 세포를 "신속 확장 프로토콜" 또는 REP를 위해 GREX 플레이트에서 14일 동안 성장시키고, 필요에 따라 배지를 추가하거나 또는 교체하였다. 확장 동안, 각각의 GREX 웰을 재현탁시키고, 완전히 혼합시키고, 세포 계수(Cellaca 세포 계수기, 넥셀롬(Nexcelom)) 및 유세포 분석 염색을 위해 분취량을 취하였다. 샘플을 항체 CD3-BUV395(BD), CD56-BV711(바이오레전드), CD4-BV605(바이오레전드), CD8-Alexa Fluor 700(바이오레전드), IL15-DyL650(레이크파마(LakePharma), 사내(in-house) 접합), 2차 스트렙타비딘-BV421(바이오레전드)이 포함된 IL15RaFc-바이오틴(아크로 바이오시스템즈(ACRO Biosystems)), 및 정착성 생존도 지시염료(fixable viability dye) eFluor 780(써모 피셔)를 사용하여 염색하였다. BD Fortessa 유세포 분석기에서 샘플을 실행하고, Flow Jo V10.7.1을 사용하여 분석을 수행하였다. 형질도입 효율은 살아있는 CD3 양성 세포 집단 내에서 IL15-DyL650 및 IL15RaFc-바이오틴에 대해 이중 양성으로 염색된 세포의 퍼센트로 결정하였다(도 2).
본 명세서에 기재된 바와 같은 mbIL15를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스가 형질도입된 TIL은 후속 예에서 "mbIL15 TIL"로 지칭될 수 있다. OT-IL15-293과 같은 조절된 mbIL15를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스가 형질도입된 TIL은 또한 후속 예에서 "조절된 mbIL15 TIL"로 지칭될 수 있다. OT-IL15-292와 같은 구성적 mbIL15를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스가 형질도입된 TIL은 또한 후속 예에서 "구성적 mbIL15 TIL"로 지칭될 수 있다.
실시예 4. 신속 확장 프로토콜에서의 TIL 확장
TIL 및 피더 세포를 위의 실시예 1 내지 실시예 3에 기재된 바와 같이 생성하였다. 간략하게는, 사전-REP 배양에서 3주 후, 동결 보존된 TIL을 해동시키고, 6000 IU/㎖의 인간 IL2와 함께 밤새 두었다. 그런 다음, TIL을 항-CD3/CD28 Dynabead로 또는 OKT3-코팅된 다중-웰 플레이트에서 24시간 동안 활성화한 후, 이 시점에서 구성적 mbIL15(OT-IL15-292) 또는 GFP(OT-EGFP-001) 렌티바이러스 벡터를 형질도입하거나 또는 비조작된 조건으로 변형시키지 않았다. 형질도입 24시간 후, TIL을 비조작된 TIL뿐만 아니라 실험적 "+IL2" 조건에 첨가된 6000 IU/㎖ I-2와 함께 GREX 6M 웰 플레이트(윌슨 울프)에서 K562-IL21-41BBL 피더 세포(2:1 비의피더 세포:TIL)로 확장하였다. 세포를 "신속 확장 프로토콜" 또는 REP를 위해 GREX 플레이트에서 12일 동안 성장시키고, 필요에 따라 배지를 첨가하거나 또는 교체하였다. 형질도입 후 제5일, 제8일 및 제12일에, 각각의 GREX 웰을 재현탁시켰다. 항체 CD3-BUV395(BD), CD56-BV711(바이오레전드), CD4-BV605(바이오레전드), CD8-Alexa Fluor 700(바이오레전드), IL15-DyL650(레이크파마, 사내 접합), 2차 스트렙타비딘-BV421(바이오레전드)이 포함된 IL15RaFc-바이오틴(아크로 바이오시스템즈), 및 정착성 생존도 지시염료 eFluor 780(써모 피셔)을 사용하여 실시예 3에 기재된 바와 같이 IL15+ 또는 GFP+ 세포의 수를 정량화하기 위해 유세포 분석 염색을 위한 분취량을 취하였다. GFP-발현 TIL은 REP에서 확장을 위해 외인성 IL2를 필요로 하는 반면, 구성적 mb-IL15-발현 TIL은 IL2의 부재하에 확장된다(도 3a).
실시예 5. 항원-독립적 환경에서의 확장 및 생존
다음으로, 시험관내 항원-독립적 생존 검정의 맥락에서 지속 또는 확장하는 능력에 대해 평가하기 위한 사후-REP TIL. REP 확장 12일 후, 사이토카인 없이 확장된 mbIL15 형질도입된 세포 및 6000 IU/㎖ IL2로 확장된 GFP 세포에서 비드를 제거하고, 세척하고, 사이토카인 없이 밤새 두었다. 다음날, IL2(6000 IU/㎖, 페프로텍)를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 TIL을 48-웰 플레이트에 TIL 배지 중 5×105개 세포/웰로 플레이팅하였다. 총 10일 동안 2일마다 세포를 분할하거나 또는 배지를 첨가하였다. 또한, 2일마다 유세포 분석 염색을 위해 분취량을 취하고, IL15+ 또는 GFP+ 세포의 수를 실시예 3에 기재된 바와 같이 정량화하였다. 구성적 mbIL15 TIL은 외인성 IL2의 존재 유무에 관계없이 14-일 생존 검정 동안 확장된 반면, GFP TIL은 확장을 위해 IL2가 필요하였다(도 3b).
조절된 mbIL15 발현 TIL이 포함된 새로운 연구에서, TIL 및 피더 세포를 위의 실시예 1 내지 실시예 3에 기재된 바와 같이 생성하였다. 간략하게는, 사전-REP 배양에서 3주 후, 동결 보존된 TIL을 해동시키고, 6000 IU/㎖의 인간 IL2와 함께 밤새 두었다. 그런 다음, TIL을 항-CD3/CD28 Dynabead로 또는 OKT3-코팅된 다중-웰 플레이트에서 24시간 동안 활성화한 후, 이 시점에서 구성적 mbIL15(OT-IL15-292) 또는 조절된 mbIL15(OT-IL15-293) 렌티바이러스 벡터를 형질도입하거나 또는 조작하지 않았다. 형질도입 24시간 후, TIL을 GREX 6M 웰 플레이트(윌슨 울프)에서 6000 IU/㎖ IL2를 UT TIL에 첨가하고 25μM 아세타졸아마이드(셀렉캠)를 조절된 mbIL15 TIL에 첨가하여 K562-IL21-41BBL 피더 세포(5:1 비의 피더 세포:TIL)로 확장시켰다. 확장 14일 후, TIL을 단리하고, IL2(200IU/㎖, 페프로텍) 또는 아세타졸아마이드(25μM, 셀렉캠)를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 TIL 배지 중 5×105개 세포/웰로 다중-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포 수(Celleca 세포 계수기, 넥셀롬)에 의한 세포 확장 및 유세포 분석(비디 포르테사)에 의한 표현형의 분석을 위해 전체 웰을 수거하고, 새로운 사이토카인/리간드를 3일마다 첨가하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 이 검정의 15일 동안, 비조작된 TIL은 임의의 외인성 사이토카인이 없이는 확장되지 않았지만(0.07±0.03-배 확장), 외인성 IL2(200 IU/㎖)를 사용하면 20-배 이상 확장할 수 있었다(27.8±0.25-배 확장). 대조적으로, 변형된 TIL은 임의의 외인성 사이토카인의 첨가 없이 상당히 확장되었고; 15일 후, 구성적 mbIL15 TIL은 확장된 8-배(8.28±1.9-배 확장) 확장되었으며, 조절된 mbIL15 TIL은 25μM 아세타졸아마이드로 17-배 확장되었다(17.3±0.82-배 확장). 아세타졸아마이드의 첨가 없이, 조절된 mbIL15 TIL은 리간드보다 4-배 더 낮게 확장되었고(4.52±0.48-배 확장), 이는 조절된 mbIL15 TIL의 생존을 조절하는 아세타졸아마이드의 역할을 강조한다.
실시예 6. 항원-의존적 환경에서의 확장 및 생존
TIL 및 피더 세포를 위의 실시예 1 내지 실시예 3에 기재된 바와 같이 생성하였다. 간략하게는, 사전-REP 배양에서 3주 후, 동결 보존된 TIL을 해동시키고, 6000 IU/㎖의 인간 IL2와 함께 밤새 두었다. 그런 다음, TIL을 항-CD3/CD28 Dynabead로 또는 OKT3-코팅된 다중-웰 플레이트에서 24시간 동안 활성화한 후, 이 시점에서 조절된 mbIL15(OT-IL15-293) 렌티바이러스 벡터를 형질도입하거나 또는 조작하지 않았다. 형질도입 24시간 후, TIL을 GREX 6M 웰 플레이트(윌슨 울프)에서 6000 IU/㎖ IL2를 UT TIL에 첨가하고 25μM 아세타졸아마이드(셀렉캠)를 조절된 mbIL15 TIL에 첨가하여 K562-IL21-41BBL 피더 세포(5:1 비의 피더 세포:TIL)로 확장시켰다. 확장 14일 후, TIL을 Bambanker 동결 배지(불독 바이오)에 동결 보존하였다. 나중에, 동결 보존된 TIL을 해동시키고, 200IU/㎖ IL2가 포함된 TIL 배지(비조작된 TIL) 또는 25μM 아세타졸아마이드가 포함된 TIL 배지(조절된 mbIL15 TIL)에서 밤새 두었다. 밤새 놔둔 후, TIL을 IL2(200IU/㎖, 페프로텍) 또는 아세타졸아마이드(25μM, 셀렉캠)가 첨가되거나 첨가되지 않은 TIL 배지에서의 TIL:종양 공동 배양 검정에서 미토마이신 C-처리된 흑색종 세포와 1:1 비로 다중-웰 플레이트에 플레이팅하고, 검정은 총 27일 동안 지속하였다. 비히클 대조군 그룹에 동일한 부피의 DMSO가 포함된 비히클-단독 대조군을 아세타졸아마이드에 포함시켰다. 흑색종 세포는 퓨로마이신-의존적 루시퍼레이스 벡터로 변형된 A375 세포주(ATCC)로부터 유래되었으며, 위(실시예 3)에 기재된 바와 같이 10 ㎍/㎖ 미토마이신 C로 처리하여 이들 종양 세포의 증식을 방지하였다. 3일마다, 이 공동 배양 검정의 웰을 혼합하고, 세포 수(Celleca 세포 계수기, 넥셀롬)에 의한 세포 확장 및 유세포 분석(비디 포르테사)에 의한 표현형의 분석을 위해 분취량을 단리하였다. 새로운 미토마이신 C-처리된 A375 흑색종 세포뿐만 아니라 TIL 배지 중 새로운 사이토카인/리간드를 3일마다 첨가하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 아세타졸아마이드로 조절된 조절된 mbIL15 TIL은 안정적인 확장 동역학을 확립하고, 오랜 자극이 TIL을 빠르게 고갈시키고 세포 수를 감소시켜야 하는 이러한 항원-의존적 환경에서도 형질도입된 TIL은 지속되었다. 검정을 통해, 비조작된 TIL은 임의의 외인성 사이토카인 없이는 확장되지 않지만(1일에서 27일까지 0.46±0.02-배 확장), 외인성 IL2(200 IU/㎖)를 사용하면 25-배 이상 확장할 수 있었다(1일에서 27일까지 25.4±4.06-배 확장). 대조적으로, 임의의 외인성 사이토카인의 첨가 없이 확장된 변형된 TIL 및 25μM 아세타졸아마이드가 주어진 현저하게 조절된 mbIL15 TIL은 12-배 확장되었다(1일에서 27일까지 12.2±0.10-배 확장). 아세타졸아마이드의 첨가 없이(비히클 대조군만 있음), 조절된 mbIL15 TIL은 리간드보다 4-배 더 낮게 확장되었으며(2.68±0.42-배 확장 1일에서 27일까지), 이는 조절된 mbIL15 TIL의 생존을 조절하는 데 있어 아세타졸아마이드의 역할을 강조한다.
실시예 7. 새로운 사후-REP TIL의 종양 반응성
2명의 흑색종 공여자로부터의 TIL을 실시예 1 내지 실시예 3에 기재된 바와 같이 생성하였다. 간략하게는, 사전-REP 배양에서 3주 후, 동결 보존된 TIL을 해동시키고, 6000 IU/㎖의 인간 IL2와 함께 밤새 두었다. 그런 다음, TIL을 항-CD3/CD28 Dynabead로 또는 OKT3-코팅된 다중-웰 플레이트에서 24시간 동안 활성화한 후, 이 시점에서 조절된 mbIL15(OT-IL15-293) 렌티바이러스 벡터를 형질도입하거나 또는 조작하지 않았다. 형질도입 24시간 후, TIL을 GREX 6M 웰 플레이트(윌슨 울프)에서 6000 IU/㎖ IL2를 비조작된 TIL에 첨가하고 25μM 아세타졸아마이드(셀렉캠)를 조절된 mbIL15 TIL에 첨가하여 K562-IL21-41BBL 피더 세포(5:1 비의 피더 세포:TIL)로 확장시켰다. 확장 14일 후, TIL을 수거하고, 비드를 제거하고, IL2 및 아세타졸아마이드와 함께 또는 없이 밤새 두었다. 루시퍼레이스를 발현하는 흑색종 세포주인 A375-FLuc-Puro(ATCC)를 TIL 배지에 5×106개 세포/㎖로 재현탁시켰다. 10 ㎍/㎖ 미토마이신-C를 세포에 첨가한 다음, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포를 50㎖ TIL 배지로 3회 세척하였다. 웰당 1×105개의 A375 세포를 96-웰 플랫 버텀 조직-배양 처리된 플레이트에 첨가하였다. 일부 웰에서, 80 ㎍/㎖ HLA-ABC(바이오레전드) 차단 항체를 첨가하여 표적 세포에서 MHC 클래스 I을 차단하였다. 밤새 놔둔 TIL을 웰당 200㎕의 총 부피에 대해 TIL:A375의 1:1 또는 3:1 비로 첨가하였다. 48-시간 시점에서, 각 웰로부터 상청액을 회수하고, IFNγ의 농도를 MSD로 검정하였다. 종양 세포의 용해를 제조업체의 프로토콜에 따라 CellTiterGlo 발광 세포 생존력 검정(프로메가(Promega))을 사용하여 분석하였다. 용해 백분율은 배경 형광을 뺀 공동 배양 웰에서의 발광을 배경 형광을 뺀 A375-단독 대조군 웰에서의 발광으로 나눈 것으로 계산하였다. IL2와 함께 배양한 형질도입되지 않은 TIL 및 IL2의 부재하에 REP에서 확장된 조절된 mbIL15 TIL은 모두 TIL 단독에 비해 A375 흑색종 세포주와의 공동 배양에서 IFNγ 생산을 증가시켰다(도 6a). 추가적으로, 표적 세포주의 감소된 발광에 의해 측정된 공동 배양 조건에서 종양 세포의 특이적 용해가 있었다(도 6b). 특이적 용해 백분율 및 IFNγ 생산은 모두 MHC 클래스 I 차단 항체와의 공동 배양 조건에서 감소하였으며, 이는 이 종양 세포주에 대한 TIL의 세포독성이 MHC 클래스 I 의존적임을 나타낸다. 이 결과는 2명의 흑색종 공여자에서 반복되었다.
실시예 8. mbIL15 TIL은 IL2 없이 생체에서 장기간 지속된다
1명의 공여자로부터의 TIL 및 피더 세포를 위의 실시예 1 내지 실시예 3에 기재된 바와 같이 생성하였다. 간략하게는, 사전-REP 배양에서 3주 후, 동결 보존된 TIL을 해동시키고, 6000 IU/㎖의 인간 IL2와 함께 밤새 두었다. 그런 다음, TIL을 항-CD3/CD28 Dynabead로 24시간 동안 활성화한 후, 이 시점에서 구성적 mbIL15(OT-IL15-292) 또는 조절된 mbIL15(OT-IL15-293) 렌티바이러스 벡터를 형질도입하거나 또는 조작하지 않았다. 형질도입 24시간 후, TIL을 GREX 6M 웰 플레이트(윌슨 울프)에서 6000 IU/㎖ IL2를 비조작된 TIL을 첨가하고 25μM 아세타졸아마이드(셀렉캠)를 조절된 mbIL15 TIL에 첨가하여 K562-IL21-41BBL 피더 세포(5:1 비의 피더 세포:TIL)로 확장시켰다. 확장 14일 후, TIL을 수거하고, 비드를 제거하고, 입양 세포 전달을 위해 준비하였다. 비조작된 TIL은 612-배 확장되었고, 구성적 mbIL5 TIL은 1080-배 확장되었으며, 조절된 mbIL15 TIL은 450-배 확장되었다(도 7a).
NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) 마우스를 잭슨 래보래토리즈(Jackson Laboratories)로부터 구입하였다. 6주령 내지 8주령 암컷 마우스에 표 4에 기재된 바와 같이 외인성 IL2(Proleukin) 또는 임상 등급의 아세타졸아마이드 또는 비히클을 포함하거나 또는 포함하지 않고 10×106개 TIL/마우스를 전신으로 주입하였다.
TIL을 입양 세포 요법 당일에 IL15 발현에 대해 평가하였으며, 구성적 mbIL15 형질도입된 TIL은 조절된 mbIL15 형질도입된 TIL(23.6±1.1% IL15+IL15RaFc+)보다 약간 더 높은 수준의 mbIL15 형질도입(30.2±0.46% IL15+IL15RaFc+)을 나타내었지만, 형질도입된 두 집단은 모두 입양 세포 전달에 허용 가능하였다(도 7b). IL15 발현 또는 형질도입 효율을 유세포 분석에 의해 평가하였으며; 세포를 Fc 블록과 함께 인큐베이션하고, 먼저 DyL650에 접합된 IL15(레이크 파마, 사내 접합) 및 바이오티닐화된 IL15RaFc(아크로바이오시스템즈)로 염색하였다. 실온에서 25분 동안 암실에서 인큐베이션한 후, 세포를 FACS 완충액으로 세척하고, 원심분리하고, BV421에 접합된 스트렙타비딘(바이오레전드)을 포함하는FACS 완충액에 재현탁시켰다. 4℃에서 20분 동안 암실에서 인큐베이션한 후, 세포를 FACS 완충액으로 세척하고, 원심분리하고, FACS 완충액에 재현탁시키고, BD Fortessa 유세포 분석기에서 샘플을 실행시켰다. 분석은 FlowJo V10.7.1에서 이루어졌다.
입양 세포 요법 후 제7일, 제14일, 제21일, 제32일, 제39일, 제46일 및 제53일에, EDTA-함유 튜브에 턱밑 정맥 혈액채취(collection)를 통해 75㎕의 전신 혈액을 단리하고, TIL의 계수를 위해 처리하였다. 혈액 샘플에 1㎖ 내지 3㎖의 ACK 용해 완충액(깁코(Gibco))을 넣고, 10분 내지 20분 동안 인큐베이션하여 적혈구(RBC)를 용해시켰다. RBC 용해 후, 샘플을 70㎛ 세포 여과기를 통해 여과하고, 원심분리하고, FACS 완충액에 재현탁시켰다. 각 샘플의 분취량을 세포 수(Celleca 세포 계수기, 넥셀롬)의 분석을 위해 단리하고, 나머지는 유세포 분석(비디 포르테사)에 의한 표현형 평가를 위해 사용하였다. 표현형 평가를 위해, 혈액 샘플을 CD3(BD), 마우스 CD45, CD25(BD), FoxP3, CD4, CD8, IL15(레이크 파마, 사내 접합), KLRG1, CD127, CD45RA, CD45RO, CD95, CD69, CCR7, CD56 및 바이오티닐화된 IL15RaFc(아크로바이오시스템즈)에 특이적인 항체로 염색하였다. 항체를 FITC, PE, PE-Cy5, PE-Cy7, PerCP-Cy5.5, DyL650, APC-Cy7, BUV395, BUV737, BV421, BV510, BV605, BV711 또는 BV786(항-인간 항체, 달리 확인되지 않는 한 모두 바이오레전드)에 접합시켰다. 또한, 모든 샘플에 대해 생존력 염료(e780 정착성 생존도 지시염료, 인비트로젠)를 포함시켰다. BD Fortessa 유세포 분석기에서 샘플을 실행하고, Flow Jo V10.7.1을 사용하여 분석을 수행하였다. 연구 전반에 걸쳐 TIL을 계수하기 위해, TIL을 세포로 게이팅한 후, 림프구에 이어 인간 CD3+ 및 마우스 CD45- 세포로 게이팅하였다. 도 8a에서 볼 수 있는 바와 같이, 비조작된 TIL은 생체내에서 급격히 감소하여, 주입 후 53일까지 검출할 수 없는 수준에 도달하였다. 정량화된 TIL이 0.64±0.17%인 주입 후 53일까지 지속성은 낮았지만, 외인성 IL2가 첨가되는 비조작된 TIL은 더 나은 결과를 보였다. 대조적으로, 주입 후 53일까지, 형질도입된 TIL은 5.73±1.2%의 구성적 mbI15 TIL 및 10.2±2.0%의 조절된 mbIL15 TIL+ACZ와 함께 전신적으로 검출 가능한 수준으로 유지된다는 것이 분명하였다. 아세타졸아마이드의 생체내 조절 효과는 주입 후 53일까지 조절된 mbIL15 TIL+비히클이 2.94±0.36%로 거의 검출 불가능하였기 때문에 분명하였다.
입양 세포 요법 후 제14일 및 제53일에, 실험 그룹당 5마리의 동물 코호트를 말단 혈액채취를 위해 희생시켰다. 이 동물들로부터, 심장 천자를 통해 200㎕의 전신 혈액을 채취하고, 비장을 단리하였을 뿐만 아니라 1개의 대퇴골로부터 골수를 추출하였다. 위에 기재된 바와 같이 혈액을 처리하였다. 70㎛ 세포 여과기를 통해 비장을 기계적으로 파쇄하고, 3분 동안 ACK 용해를 통해 RBC를 용해시키고, 다시 70㎛ 세포 여과기를 통해 수집하였다. 하나의 대퇴골을 통해 골수(BM)를 플러싱하고, 70㎛ 세포 여과기를 통해 수집하였다. 각각의 처리된 조직 현탁액의 분취량을 세포 수(Celleca 세포 계수기, 넥셀롬)의 분석을 위해 단리하고, 나머지를 유세포 분석(비디 포르테사)에 의한 표현형 평가를 위해 사용하였다. 표현형 평가를 위해, 샘플을 CD3(BD), 마우스 CD45, CD25(BD), FoxP3, CD4, CD8, IL15(레이크 파마), KLRG1, CD127, CD45RA, CD45RO, CD95, CD69, CCR7, CD56 및 바이오티닐화된 IL15RaFc(아크로바이오시스템즈)에 특이적인 항체로 염색하였다. 항체를 FITC, PE, PE-Cy5, PE-Cy7, PerCP-Cy5.5, DyL650, APC-Cy7, BUV395, BUV737, BV421, BV510, BV605, BV711 또는 BV786(항-인간 항체, 달리 확인되지 않는 한 모두 바이오레전드)에 접합시켰다. 또한, 모든 샘플에 대해 생존력 염료(e780 정착성 생존도 지시염료, 인비트로젠)를 포함시켰다. BD Fortessa 유세포 분석기에서 샘플을 실행시키고, Flow Jo V10.7.1을 사용하여 분석을 수행하였다. 연구 전반에 걸쳐 TIL을 계수하기 위해, TIL을 살아있는 세포로 게이팅한 후, 림프구에 이어 인간 CD3+ 및 마우스 CD45- 세포로 게이팅하였다. 도 8b 및 도 8c에 도시된 바와 같이, 형질도입된 TIL은 주입 후 14일뿐만 아니라 53일에 말초 림프 기관에서 높은 수준으로 확인되었고, ACZ-처리된 조절된 mbIL15 TIL은 비히클-처리된 대응물보다 상당히 더 높은 지속성을 보여주었다(p<0.005).
표 5는 본 명세서에 기재된 다양한 작제물에 대한 바이러스 벡터 서열을 보여준다.
실시예 9. TIL의 레트로바이러스 형질감염을 사용한 신속 확장 프로토콜
사전-REP TIL을 실시예 1의 것과 유사하게 제조하였다. 간략하게는, 흑색종 및 두경부 종양 샘플을 협동 인간 조직 네트워크로부터 얻었다. 종양 샘플을 행크의 평형 염용액(HBSS) 완충액에서 1㎜ 내지 3㎜ 조각으로 절단하고, 조각을 6000 IU/㎖ IL2(페프로텍), 10 ㎍/㎖ 41BB 항체(크리에이티브 바이오랩스(Creative BioLabs)), 30ng/㎖의 CD3 항체(OKT3, 바이오레전드) 및 0.1 ㎎/㎖ 노르모신(인비보젠)을 포함하는 TIL 배양 배지(GlutaMAX(써모 피셔), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1mM 소듐 피루베이트, 1% HEPES, 50μM 2-머캅토에탄올(인비트로젠) 및 10% 열-불활성화 인간 AB 혈청(밸리 바이오)이 보충된 RPMI-1640)에서 1개 내지 10개 조각/플라스크로 Grex 용기에 넣었다. 영양소 고갈이 확인되었을 때, 용기를 대략 3일 내지 4일마다 일상적으로 공급하였다. 이러한 배양 과정을 사전 신속 확장 프로토콜(사전-REP)로 지칭한다. 사전-REP 후, TIL을 분취하고, 세포 동결 배지(불독 바이오의 Bambanker 또는 스템셀 테크놀로지스의 Cryostor-10)에서 동결시키고, 액체 질소에 장기간 보관하였다.
이러한 사전-REP TIL을 해동시키고, 6000 IU/㎖ 인간 IL2와 함께 TIL 배지에서 밤새 두었다. 그런 다음, TIL을 3 ㎍/㎖의 OKT3(Ultra-LEAF 정제 항-인간 CD3 항체, 바이오레전드) 및 6000 IU/㎖ 인간 IL2로 코팅된 24-웰 플레이트에서 24시간 동안 활성화하였다. 레트로넥틴(30 ㎍/㎖)을 사용하여 24-웰 비조직 배양 세포 배양 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음날, 레트로넥틴을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 2% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단한 다음, 플레이트를 PBS로 세척하였다. 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GALV) 유사형 감마 레트로바이러스 벡터(mbIL15-CA2 DRD 발현이 뮤린 백혈병 바이러스 LTR로부터 유래된 프로모터의 제어하에 있음) 상청액을 안정적인 생산자 세포주로부터 제조하였다. 레트로바이러스 벡터 상청액을 TIL 배지에 희석하고, 웰당 총 부피 500㎕을 첨가하여 대략 16 내지 80의 MOI를 생성하였다. 바이러스 벡터를 포함하는 플레이트를 32℃에서 2시간 동안 1400Хg에서 원심분리한 다음, 상청액을 제거하였다. 상청액 제거 후, 1.0×106개의 활성화된 TIL을 웰당 100 IU/㎖ IL2로 옮기고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 바이러스 첨가 없이 유사하게 처리하고, 음성 대조군("비조작된")으로 사용하였다. 형질도입 24시간 후, 5×105개의 TIL을 웰당 총 60㎖의 TIL 배지(GlutaMAX(써모 피셔), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1mM 소듐 피루베이트, 1% HEPES, 50μM 2-머캅토에탄올(인비트로젠) 및 10% 열-불활성화 인간 AB 혈청(밸리 바이오메드(Valley Biomed))가 보충된 RPMI-1640)에서 6M GREX 웰 플레이트(윌슨 울프)의 각 웰로 옮겼다. 방사선 조사된 K562 피더 세포(4-1BBL 및 mbIL21이 형질도입되고 100Gy에서 방사선 조사됨) 또는 방사선 조사된 PBMC 피더 세포(25Gy에서 방사선 조사됨)를 해동시키고, 각각 50:1 K562:TIL 또는 200:1 PBMC:TIL의 비로 배양물에 첨가하였다. 조절된 mbIL15 작제물이 형질도입된 TIL에 25μM 아세타졸아마이드(셀렉캠)를 첨가하였고, 형질도입되지 않은 TIL에는 6000 IU/㎖ IL2를 첨가하였다. 세포를 "신속 확장 프로토콜" 또는 REP를 위해 GREX 플레이트에서 14일 동안 성장시켰으며, 필요에 따라 배지를 첨가하거나 또는 교체하였다.
실시예 10. 조절된 mbIL15 변형된 TIL: 신호전달 및 다작용성
ACZ는 용량-의존적 방식으로 조절된 mbIL15 TIL에서 IL15 발현 및 신호전달을 조절한다.
사전-REP TIL은 실시예 1 내지 실시예 3 및 실시예 9의 방법과 유사하게 제조하였으며, 비조작된 및 mbIL15 TIL은 실시예 1 내지 실시예 3 및 실시예 9에 기재된 바와 같이 생성하였다. IL15 신호전달 경로의 관여는 전사 인자 단백질 STAT5 및 리보솜 단백질 S6을 포함하는 신호 변환기 하류의 인산화를 초래한다. ACZ-조절된 mbIL15 발현이 조절된 mbIL15 TIL에서 IL15 신호전달을 초래함을 입증하기 위해, 포스포-유세포 분석-기반 검정을 다음과 같이 사용하였다: 동결 보존된 조절된 mbIL15 TIL을 4명의 인간 공여자(환자 1 내지 환자 4)로부터 얻고, 해동시킨 다음, 24시간 동안 ACZ-비함유 배지에 두었다. 다음으로, 조절된 mbIL15 TIL을 0.1μM, 1μM, 2.5μM, 5μM, 10μM, 25μM, 100μM뿐만 아니라 비히클 대조군을 포함하는 ACZ의 농도 범위의 존재하에 18시간 동안 조절하였다. 그런 다음, 조절된 mbIL15 TIL을 염색 및 FACS 분석을 위해 수집하였다.
간략하게는, 세포를 CD3, CD4, CD8, IL15 및 생/사멸 마커(Live/Dead marker)에 대한 항체를 사용하여 염색하였다. 그런 다음, 세포를 2% 폼알데하이드(비디 사이토픽스(BD Cytofix))로 고정시키고, 메탄올-기반 완충액(BD Phospho Perm III 완충액)을 사용하여 투과화한 후, 인산화된 STAT5(바이오레전드) 및 S6(셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology))에 특이적인 항체로 염색하였다. 세포를 비디 심포니(BD Symphony)에서 획득하고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
ACZ의 농도가 증가함에 따라, mbIL15의 발현도 또한 증가하여 약 10μM 내지 25μM의 ACZ에서 안정 상태를 유지한다. 도 9a. 유사하게는, pSTAT5 및 pS6의 염색 강도는 조절된 mbIL15 TIL에서 ACZ의 농도가 높을수록 증가하였으며, 이는 IL15 신호전달의 정도가 더 큼을 나타낸다. 이러한 결과는 ACZ 및 IL15의 발현과 신호전달 사이의 용량-의존적 관계를 보여준다. 도 9b 내지 도 9e 및 도 10.
조절된 mbIL15 TIL의 구성적 mbIL15 발현 및 ACZ 조절은 IL15 신호전달 경로에 관여한다
IL15 발현에 대한 상이한 전략을 비교하기 위해, mbIL15 및 조절된 mbIL15 TIL을 구성적으로 발현하는 TIL을 이용하였다. 3명의 인간 공여자로부터의 동결 보존된 비조작된 TIL, 구성적 mbIL15 TIL 및 조절된 mbIL15 TIL을 해동시킨 다음, 24시간 동안 ACZ-비함유 배지에 두었다. 다음으로, 전술한 TIL을 다음과 같이 18시간 동안 배양 배지에서 조절하였다: (1) 비조작된 TIL에 200 IU/㎖의 IL2(페프로텍)를 첨가하고; 그리고 (2) 25μM ACZ를 조절된 mbIL15 TIL 배양물에 첨가하였다. 비히클을 대조군 조건에 첨가하였다. 18-시간 처리 후, 세포를 CD3, CD4, CD8, IL15 및 생/사멸 마커에 대한 항체를 사용하여 염색하였다. 그런 다음, 세포를 2% 폼알데하이드(비디 사이토픽스)로 고정시키고, 메탄올-기반 완충액(BD 포스포 Perm III 완충액)을 사용하여 투과화한 후, 인산화된 STAT5(바이오레전드) 및 S6(셀 시그널링 테크놀로지)에 특이적인 항체로 염색하였다. 세포를 비디 포르테사에서 획득하고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
도 11에 도시된 바와 같이, IL2는 STAT5 및 S6을 통한 신호전달을 포함하여 IL15와 중첩되는 신호전달 경로를 공유한다. IL2와 함께 배양된 비조작된 TIL은 상응하는 비히클 조건에 비해 신호전달 경로의 참여의 증가를 보여주었다. 도 11. 유사하게는, 구성적 mbIL15 발현 및 조절된 mbIL15 TIL+ACZ 모두는 조절된 mbIL15 TIL+비히클 대조군과 비교하여 STAT5 및 S6의 증가된 인산화를 나타내었다. 도 11.
조절된 mbIL15 TIL은 비조작된 TIL+IL2보다 더 큰 다작용성을 나타낸다
다작용성 T 세포는 자극에 반응하여 다중 효과기 분자를 동시에 생산하는 능력을 갖고 있다. 추가적으로, 다작용성은 T 세포 효능과 상관관계가 있다. 비조작된 TIL의 다작용성을 조절된 mbIL15 TIL과 비교하기 위해, 동결 보존된 세포를 해동시키고, 24시간 동안 IL2-함유 및 ACZ-비함유 배지에 두었다. 다음으로, 세포의 조절은 다음과 같이 발생하였다: 비조작된 TIL을 IL2의 농도 범위(20 IU/㎖, 200 IU/㎖, 1000 IU/㎖ 및 6000 IU/㎖ 또는 비히클)의 존재하에 18시간 동안 조절하고; 조절된 mbIL15 TIL을 ACZ(0.1μM, 1μM, 5μM, 10μM, 25μM, 100μM ACZ 또는 비히클)의 존재하에 18시간 동안 조절하였다. 그런 다음, 세포를 브레펠딘 A(바이오레전드) 및 모넨신(라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corporation))의 존재하에 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) 및 이오노마이신(바이오레전드)으로 6시간 동안 자극하였다. 비자극된 비조작된 TIL 및 비자극된 조절된 mbIL15 TIL을 대조군으로 사용하였다. 자극 후, 세포를 염색 및 FACS 분석을 위해 수집하였다.
간략하게는, 세포를 CD3, CD4, CD8, IL15에 대한 항체 및 생존력 염료를 사용하여 염색하였다. 그런 다음, 세포를 폼알데하이드로 고정시키고, 투과화(BD Cytofix/Cytoperm 키트)한 다음, TNFα 및 IFNγ(바이오레전드)에 대한 항체를 사용하여 염색하였다. 세포를 비디 포르테사로부터 획득하고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. TNFα 및 IFNγ의 발현에 대해 이중 양성인 세포는 다작용성으로 간주된다.
도 12에 도시된 바와 같이, 모든 배양 조건이 일부 다작용성 집단을 포함하는 반면, 조절된 mbIL15 TIL의 다작용성은 더 높은 농도의 ACZ로 증가하였다. 도 12a, 도 12b. 추가적으로, 조절된 mbIL15 TIL은 동일한 공여자로부터의 비조작된 TIL+IL2보다 더 다작용성이었다. 도 12a, 도 12C. mbIL15를 발현하는 조절된 mbIL15 TIL의 퍼센트는 또한 ACZ 용량과 용량-반응 관계를 나타내었다.
실시예 11. 조절된 IL15 TIL의 생체내 효능
PDX163A 효능
환자-유래 이종이식편(PDX) 모델은 종양 은행(협동 인간 조직 네트워크: CHTN)으로부터 얻은 새로운 원발성 흑색종 샘플(환자 종양 번호 M1200163A)로부터 생성하였다. NSG 암컷 마우스(잭슨 래보래토리(Jackson Laboratory); 카탈로그 번호 000557)를 사용하여 마우스 모델을 확립하였다. 일단 모델이 확립되면, 종양의 동결 보존된 절편을 아이소플루레인-마취된 면역 저하 마우스(NSG 암컷 마우스; 잭슨 래보래토리; 카탈로그 번호 000557)에게 무균적으로 이식하였다. 종양을 대략 1000㎣ 내지 2000㎣까지 성장시킨 다음, 마우스를 안락사시켰다. 종양을 무균적으로 수집하고, 약 100㎎ 절편으로 절단한 다음, 더 큰 코호트의 마우스에 이식하여 13일 동안 성장시켰다. 13일 후, 종양을 측정하고, 각각의 처리 그룹으로 무작위 배정하였다(50㎣ 내지 100㎣). 다음날, 1000만(10M)개의 TIL을 정맥내로 주사하였다. TIL을 위에 기술된 신속 확장 프로토콜(REP)에 따라 생성하였다.
처리 그룹은 다음과 같았다: (1) IL2와 함께 투여된 비조작된 TIL; 및 (2) 아세타졸아마이드(ACZ)와 함께 투여된 조절된 mbIL15 TIL. 비조작된 TIL을 투여받은 마우스에 5일 동안 IL2의 50,000 국제 단위(International Unit: IU)를 일일 2회 투여하였다. 조절된 mbIL15 TIL로 처리한 마우스에 전체 연구 동안 비히클 또는 200 ㎎/㎏의 아세타졸아마이드(ACZ)를 매일 투여하였다. 종양 및 체중을 매주 2회 수집하였다.
도 13은 환자-유래 이종이식편(PDX) 모델의 결과를 보여준다. 신속 확장 프로토콜(REP)의 종료 시, 비조작된 TIL 및 조절된 mbIL15 TIL(+/- 아세타졸아마이드(ACZ))을 인간 흑색종 PDX를 보유하는 마우스에 입양 전달하였다. 평균 종양 부피를 평가하였다(+/- SEM). 도 13a는 입양 세포 전달(ACT) 후에 주어진 치료에 대한 평균 종양 부피를 보여준다. 도 13b는 ACT 후의 TIL이 없는 경우(왼쪽 상단); 비조작된 TIL+IL2(오른쪽 상단); 조절된 mbIL15 TIL+비히클(왼쪽 하단); 및 조절된 mbIL15 TIL +ACZ(오른쪽 하단)의 경우의 종양 부피를 보여준다. 도 13에 도시된 바와 같이, 조절된 mbIL15 TIL+ACZ가 비조작된 TIL+IL2에 비해 항종양 효능이 상당히 우수하다.
SK-MEL-1 효능
본 발명의 조절된 mbIL15 TIL을 평가하기 위해 SK-MEL-1 이종이식편 암 모델을 생성하였다. 광범위하고 빠르게 진행되는 악성 흑색종(ATCC 카탈로그 번호 HTB-67)이 있는 환자의 흉관에서 얻은 세포를 사용하여 모델을 생성하였다. NSG 암컷 마우스(잭슨 래보래토리; 카탈로그 번호 000557)가 암세포를 투여하는 데 사용한 마우스였다. 간략하게는, 낮은 계대 세포를 해동시키고, 생존 가능한 하위-컨플루언트 배양을 유지하는 규모로 성장시켰다. 주입 당일에, 세포를 계수하고, 세척하고, 멸균 PBS에 30×106개 세포/㎖(100㎕의 주입당 36개의 세포)의 농도로 재현탁시켰다. 각 마우스에게 27 게이지 ½ 인치 바늘이 들어 있는 BD 투베르쿨린 주사기를 사용하여 털을 깎은 오른쪽 옆구리에 피하로 100㎕의 세포를 투여하였다. 종양을 9일 동안 성장시킨 다음, 측정하고, 이들을 각각 처리 그룹으로 무작위 배정(50㎣ 내지 100㎣)하였다. 다음날, 1000만(10M)개의 TIL을 정맥내로 주사하였다. 위에 기술된 신속 확장 프로토콜(REP)에 따라 TIL을 생성하였다.
처리 그룹은 다음과 같았다: (1) IL2와 함께 투여된 비조작된 TIL; 및 (2) 아세타졸아마이드(ACZ)와 함께 투여된 조절된 mbIL15 TIL. 비조작된 TIL을 투여받은 마우스에 5일 동안 IL2의 50,000 국제 단위(IU)를 일일 2회 투여하였다. 조절된 mbIL15 TIL로 처리된 마우스에 전체 연구 동안 비히클 또는 200 ㎎/㎏의 아세타졸아마이드(ACZ)를 매일 투여하였다. 종양 및 체중을 매주 2회 수집하였다.
도 14는 SK-MEL-1 이종이식편 암 모델의 결과를 보여준다. 신속 확장 프로토콜(REP)의 종료 시, 비조작된 TIL 및 조절된 mbIL15 TIL(+/- 아세타졸아마이드(ACZ))을 SK-MEL-1 종양을 보유하는 마우스에 입양 전달하였다. 평균 종양 부피를 평가하였다(+/- SEM). 도 14a는 입양 세포 전달(ACT) 후 주어진 치료에 대한 평균 종양 부피를 보여준다. 도 14b는 ACT 후 TIL이 없는 경우(왼쪽 상단); 비조작된 TIL+IL2(오른쪽 상단); 조절된 mbIL15 TIL+비히클(왼쪽 하단); 및 조절된 mbIL15 TIL+ACZ(오른쪽 하단)의 경우의 종양 부피를 보여준다. 도 14에 도시된 바와 같이, 결과는 조절된 mbIL15 TIL+ACZ가 비조작된 TIL+IL2에 비해 상당히 우수한 항종양 효능을 나타냄을 보여준다.
실시예 12. 조절된 mbIL15 TIL을 사용한 시험관내 세포독성
사전-REP TIL을 실시예 1 내지 실시예 3 및 실시예 9의 방법과 유사하게 제조하고, 비조작된 및 mbIL15 TIL을 실시예 1 내지 실시예 3 및 실시예 9의 방법에 따라 생성하였다. 조절된 mbIL15 TIL의 항종양 세포독성 잠재성을 평가하기 위해, HLA-일치 종양 세포주 SK-MEL-1(ATCC) 및 6명의 상이한 환자 TIL 샘플을 사용하여 종양-TIL 공동 배양 검정을 수행하였다. 또한, PDX 세포를 사용하여 동일한 실험을 설정하였다. 평가된 환자 TIL 샘플은 확장된 비조작된 TIL 또는 확장된 조절된 mbIL15 TIL이었다. 조절된 mbIL15 TIL을 위에 기재된(실시예 1 내지 실시예 9) REP 프로토콜에 따라 생성한 다음, 동결 보존하였다. 그런 다음, 6명의 환자로부터의 비조작된 TIL 및 조절된 mbIL15 TIL을 해동시키고, 계수하고, 비조작된 TIL 또는 비히클(DMSO)의 경우 +/- 6000 IU/㎖ IL2; 또는 조절된 mbIL15 TIL의 경우 25μM ACZ가 보충된 배양 배지에 7.5×105개 세포/㎖의 밀도로 24시간 동안 두었다. 다음날, HLA-일치 SK-MEL-1 세포를 시험관내 배양물로부터 수거하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 Cell Trace Far Red로 표지하였다. 추가적으로, PDX 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 새로운 또는 동결 보존된 덩어리로부터 얻고, GentleMAC(밀테니(Miltenyi))로 소화시켰다.
그런 다음, TIL을 MHC 클래스 I 차단 시약(TIL과의 공동 배양 전 2시간 동안 80 ㎍/㎖의 항-인간 HLA ABC와 함께 배양된 종양 세포 단독)을 포함하거나 또는 포함하지 않는 위에 열거된 동일하게 보충된 IL2 또는 ACZ 조건에서 표지된 흑색종 세포와 5:1 및 1:1(TIL 효과기:종양 표적)의 비로 공동 배양하였다. 공동 배양 시스템에서 배경 카스페이스-3 활성을 평가하기 위해 표지되지 않은 그리고 표지된 흑색종 세포 단독의 추가적인 대조군을 포함시켰다. 이러한 TIL-종양 세포 공동 배양물을 3시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 고정시키고, 투과화하고, 세포내 절단된 카스페이스-3(종양 세포 내에서 세포 사멸에 대한 비가역적 이행에 대한 마커)에 대해 염색하였다.
샘플을 BD Fortessa 유세포 분석기에서 획득하고, Flow Jo V10.7.1을 사용하여 분석을 수행하였으며, 여기서 세포독성은 살아있는 Cell Trace Far Red 양성 세포 집단 내에서 절단된 카스페이스-3에 대해 양성으로 염색된 세포의 백분율(배경 카스페이스-3 양성을 뺌)에 의해 결정하였다.
도 15에 도시된 바와 같이, TIL-종양 쌍의 항종양 세포독성의 이 평가에서, 조절된 mbIL15 TIL은 비조작된 TIL+IL2에 비해 모든 6명의 공여자에 걸쳐 우수한 항종양 세포독성 활성을 나타내었다. 도 15.
실시예 13: 별개의 피더 세포를 사용한 비조작된 TIL 및 mbIL15 TIL의 생성
종양 샘플로부터 생성된 사전-REP TIL을 실시예 1 및 실시예 9에 기재된 바와 같이 제조하였다. 사전-REP TIL을 해동시키고, 6000 IU/㎖ 인간 IL2(페프로텍)가 포함된 TIL 배지(GlutaMAX(써모 피셔), 1% HEPES, 50μM 2-머캅토에탄올(인비트로젠) 및 10% 열-불활성화 인간 AB 혈청(밸리 바이오)이 보충된 RPMI-1640)에 48-시간 동안 두었다. 그런 다음, TIL을 항-CD3(OKT3, 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))로 코팅된 24-웰 NUNC 플레이트에서 3 ㎍/ 및 6000 IU/㎖의 가용성 인간 IL2로 24시간 동안 활성화하였다. 레트로넥틴(30 ㎍/㎖)을 사용하여 코팅되지 않은 24-웰 세포 배양 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음날, 레트로넥틴을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 2.5% 인간 혈청 알부민(HSA)으로 차단한 다음, 플레이트를 PBS로 세척하였다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 제조된 BaEV-유사형 렌티바이러스 상청액을 TIL 배지로 희석하고, 각 웰에 첨가하여 0.01 내지 0.6의 MOI를 달성하였다. 바이러스 벡터를 포함하는 플레이트를 32℃에서 2시간 동안 1400g에서 원심분리한 다음, 상청액을 제거하였다. 상청액의 제거 후, 1×106개의 활성화된 TIL을 웰당 0 내지 100 IU/㎖ IL2로 옮기고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 TIL 배지에 바이러스를 첨가하지 않고 유사하게 처리하였으며, 이를 음성 대조군("비조작된")으로 사용하였다. 형질도입 24시간 후, TIL을 6M GREX 플라스크(윌슨 울프)의 총 40㎖의 TIL REP 배지(위에 기재된 바와 같은 50% TIL 배지, 50% AIM-V 배지(깁코))로 옮겼다. 증식 장애가 있는(방사선 조사된 또는 미토마이신-C 처리된) 피더 세포(풀링된 PBMC, 비변형된 K562 피더, 막-결합 IL21을 발현하도록 변형된 K562, 41BBL을 발현하도록 변형된 K562, 41BBL 및 막-결합 IL21을 발현하도록 변형된 K562)를 50:1의 K562 대 TIL의 비로 배양물에 첨가하였다. 외인성 IL21을 투여받도록 지정된 그룹에 50 ng/㎖의 재조합 인간 IL21을 투여하였다. 조절된 mbIL15 작제물이 형질도입된 TIL에 25μM 아세타졸아마이드(히크마(Hikma))를 첨가하고, 비조작된 TIL에 3000 IU/㎖ IL2를 첨가하였다. 세포를 "신속 확장 프로토콜" 또는 REP를 위해 GREX 플레이트에서 14일 동안 성장시키고, 필요에 따라 배지를 첨가하였다.
REP에서 TIL 확장의 평가
확장 동안 주기적으로, 각 GREX 웰을 재현탁시키고, 완전히 혼합하고, 아크리딘 오렌지/프로피듐 아이오다이드 생존력 염료(Cellaca 세포 계수기, 넥셀롬)를 사용하는 세포 계수 및 유세포 분석 염색을 위해 분취량을 취하였다. 샘플을 항체 CD3-BUV395(BD), CD56-BV711(바이오레전드), CD4-BV605(바이오레전드), CD8-Alexa Fluor 700(바이오레전드), 2차 스트렙타비딘-BV421(바이오레전드)가 포함된 IL15RaFc-바이오틴(아크로 바이오시스템즈), 및 정착성 생존도 지시염료 eFluor 780(써모 피셔)을 사용하여 염색하였다. 비디 심포니 유세포 분석기에서 샘플을 실행시키고, Flow Jo V10.7.1을 사용하여 분석을 수행하였다.
총 TIL 확장은 REP 전반에 걸쳐 특정 시점에서 총 생존 세포 수를 얻음으로써 결정하였다. 도 16은, mbIL15 TIL의 경우, K562 피더 세포의 사용 및 IL-21 및 41BBL-매개성 공동 자극을 모두 받는 것이 REP 및 PBMC 피더 세포뿐만 아니라 41BBL이 없는 K562 피더 세포에서 최대 세포 확장을 초래하였으며 REP에서 TIL 확장의 차선의 수준만을 지원하였음을 보여준다. 대조적으로, 비조작된 TIL은 임의의 피더 세포를 사용하여 IL2의 존재하에 확장되었지만, PBMC 피더 세포는 REP에서 조작되지 않은 TIL의 최대 확장을 촉진하였다.
IL15 발현은 살아있는 CD3 양성, CD56 음성 세포 집단 내에서 BV421-스트렙타비딘에 대해 양성으로 염색된 세포의 퍼센트로 결정하였다. K562 피더 세포로 생성되고 IL-21 및 41BBL-매개성 공동 자극을 모두 받은 mbIL15 TIL에서, mbIL15+ TIL의 빈도는 REP 과정을 통해 증가하였으며, 이는 조작된 TIL 세포 배양물 내에서 mbIL15-형질도입된 서브세트의 강화를 시사한다(도 18). 마찬가지로, REP에서 mbIL15+ TIL의 최대 확장은 구성적 또는 조절된 mbIL15+ TIL이 IL-21 및 41BBL-매개성 공동 자극과 함께 K562 피더 세포를 사용하여 생성될 때 발생하였다(도 19).
CD4:CD8 비는 CD4에 대해 양성으로 염색된 세포(살아있는, CD3 양성, CD56 음성 세포)의 퍼센트 대 CD8에 대해 양성으로 염색된 세포(살아있는 CD3 양성, CD56 음성 세포)의 퍼센트의 비에 의해 결정하였다. K562 피더 세포로 생성되고 IL-21 및 41BBL-매개성 공동 자극을 모두 받은 확장된 mbIL15 TIL은 REP 전반에 걸쳐 감소된 CD4:CD8 비에 의해 나타난 바와 같이 CD8+ 세포독성 효과기 세포에 대해 농축되었다(도 20). 대조적으로, 풀링된 PBMC 피더, 비변형된 K562 피더 또는 41BBL만을 발현하는 K562 피더로 생성된 mbIL15 TIL의 CD4:CD8 비는 REP 동안 감소하지 않았다.
다작용성의 평가를 위해, REP의 종료 시 비조작된 TIL 및 mbIL15 TIL을 96-웰 조직 배양 처리된 둥근 바닥 플레이트에서 제조업체의 프로토콜에 따라 Immunocult CD3/CD28 자극(스템 셀 테크놀로지스)과 함께 공동 배양하였다. 1시간의 인큐베이션 후, 1000x 수송 저해제(이바이오사이언시스(eBiosciences)의 모넨신, 바이오레전드의 브레펠딘 A)를 첨가하고, 공동 배양물을 37℃에서 추가로 5시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 위에 기재된 항체를 사용하여 염색한 다음, 고정시키고, Cytofix/Cytoperm 시약(비디 사이언시스)을 사용하여 투과화하였다. IL2-BV737(BD), IFNγ-FITC(바이오레전드), Perforin-PerCPCy5.5(바이오레전드), TNFα-PECF594(바이오레전드), granzymeB-Alexa Fluor 700(바이오레전드)에 대한 항체로 세포내 염색을 수행하였다. 비디 심포니 유세포 분석기에서 샘플을 실행시키고, Flow Jo V10.7.1을 사용하여 분석을 수행하였다. 살아있는 림프구의 TNFα 및 IFNγ 이중 양성 세포의 퍼센트로서 다작용성을 결정하였다. 막-결합 IL-21과 41BBL을 모두 발현하는 K562 피더 세포로 생성된 mbIL15 TIL은 PBMC 피더 세포 또는 비변형된 K562 피더 세포로 생성된 mbIL15 TIL과 비교하여 REP의 종료 시 향상된 다작용성을 나타내었다(도 21).
항원-독립적 생존 검정에서 시험관내 TIL 지속성의 평가
사후-REP TIL을 항원-독립적 생존 검정에서 시험관내 지속성에 대해 평가하였다. REP의 종료 시, 비조작된 TIL 및 mbIL15 TIL을 보충제-비함유 조건에 24시간 동안 두었다. 다음날, 비조작된 세포를 사이토카인 지원 없이 또는 6000 IU/㎖ IL2와 함께 24-웰 GREX 플레이트에서 1×106개 세포/웰로 이중으로 배양하였고, mbIL15 TIL을 25μM ACZ 또는 동일한 부피의 비히클(DMSO)과 함께 동일한 밀도로 배양하였다. 제0일에, TIL 계수 및 표현형 특성화를 위해 각 웰의 100㎕를 샘플링하고, 이를 위에 기재된 바와 같이 세포 계수 및 항체를 사용한 염색으로 수행하였다. 제4일에, 세포를 재현탁시키고, 500㎕의 세포를 제거하고, 500㎕의 배지+치료제를 각 웰에 첨가하여 배양 부피를 최대 1000㎕로 만들었다. 제6일에, 세포를 재현탁시키고, 100㎕의 분취량을 샘플링하고 표현형을 분석하고, 400㎕의 세포를 제거하고, 500㎕의 배지+치료제를 각 웰에 첨가하여 배양 부피를 최대 1000㎕로 만들었다. 제8일에, 세포를 재현탁시키고, 500㎕의 세포를 제거하고, 500㎕의 배지+치료제를 각 웰에 첨가하여 배양 부피를 최대 1000㎕로 만들었다. 제10일에, 세포를 재현탁시키고, 100㎕의 분취량을 샘플링하고 표현형을 분석한 다음 배양을 종료하였다. 비디 심포니 유세포 분석기에서 샘플을 실행시키고, Flow Jo V10.7.1을 사용하여 분석을 수행하였다. K562 피더 세포로 생성되고 IL-21 및 41BBL-매개성 공동 자극을 모두 받은 확장된 mbIL15 TIL은 비변형되거나 또는 mbIL-21 및 41BBL을 독립적으로 발현하는 PBMC 피더 세포 또는 K562 피더 세포로 생성된 mbIL15 TIL과 비교하여 10-일 생존 검정에서 개선된 지속성을 나타내었다(도 22).
TCR 다양성의 평가
TCRVβ 서브패밀리의 다양성을 측정하기 위해, REP의 종료 시 비조작된 TIL 및 mbIL15 TIL을 Beta Mark TCR Vbeta 레퍼토리 키트(벡크만 쿨터(Beckman Coulter))를 사용하여 유세포 분석을 위해 염색하였다. 비디 심포니 유세포 분석기에서 샘플을 실행시키고, Flow Jo V10.7.1을 사용하여 분석을 수행하고, TCRVβ 서브패밀리 분포를 각 서브패밀리에 대한 양성 퍼센트를 평가하고, 데이터를 포함된 모든 서브패밀리의 집계로 데이터를 표시하였다. 비조작된 TIL 및 mbIL15 TIL은 둘 다 REP에서의 확장을 위한 피더 세포에 관계없이 다양한 TCRVβ 서브패밀리 분포를 유지하였다(도 23).
41BBL 및 IL21-매개성 신호전달을 모두 갖는 mbIL15 TIL에서 PD1의 발현
TIL 고갈의 수준을 평가하기 위해, PD1 발현을 결정하였다. 샘플을 항체 CD3-BUV395(BD), CD56-BV711(바이오레전드), CD4-BV605(바이오레전드), CD8-Alexa Fluor 700(바이오레전드), PD1-PECy7(바이오레전드), CD25-BUV737(바이오레전드), 2차 스트렙타비딘-BV421(바이오레전드)이 포함된 IL15RaFc-바이오틴(아크로 바이오시스템즈), 및 정착성 생존도 지시염료 eFluor 780(써모 피셔)을 사용하여 염색하였다. 세포내 염색을 위해, 먼저 위에 열거된 표면 항체로 세포를 염색한 다음, 세포를 고정시키고, BD Cytofix/Cytoperm 제조업체의 프로토콜을 사용하여 투과화하였다. 그런 다음, 투과화된 세포를 항체 FoxP3-FITC(바이오레전드)를 사용하여 염색하고, 비디 심포니 유세포 분석기에서 샘플을 실행시키고, Flow Jo V10.7.1을 사용하여 분석을 수행하였다. PD1 발현을 살아있는 CD3 양성, CD56 음성 세포 집단 내에서 PD1에 대해 양성으로 염색된 세포의 퍼센트로 결정하였다. 도 25에 도시된 바와 같이, PD1 발현은 비확장된 mbIL15 TIL에서 가장 높으며, 41BBL 및 IL21-매개성 신호전달 모두를 사용한 mbIL15 TIL의 확장은 PD1의 거의 기준선 발현을 갖는 TIL을 생성한다.
실시예 14: 사전-REP TIL과 비교하여 조작 및 확장 동안 mbIL15 TIL의 표현형 변화(CD8+, CD4+, PD1+ 및 조절 T 세포의 빈도)
사전-REP TIL(실시예 1에 기재된 바와 같음)과 조작된 mbIL15 TIL(a실시예 3에 기재된 바와 같음)을 비교하기 위해 표현형 분석을 수행하였다. 사전-REP 및 사후-REP TIL을 실시예 13에 기재된 바와 같이 CD3, CD4, CD8 및 PD1에 대한 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 표현형을 분석하였다. 도 25A에 도시된 바와 같이, 동일한 TIL 공여자로부터의 상응하는 사전-REP TIL과 비교하여 CD8+ T 세포의 빈도는 더 높고, CD4+ T 세포의 빈도는 사후-REP mbIL15 TIL에 대해 더 낮았으며, 이는 실시예 13의 도 20에 도시된 결과와 일치한다. CD8+ T 세포의 이러한 증가는 실시예 13에서 논의되고 평가된 바와 같이 세포독성 효과기 세포의 증가를 반영한다. 마찬가지로, 도 25B에 도시된 바와 같이, 사후-REP mbIL15 TIL은 동일한 TIL 공여자로부터의 상응하는 사전-REP TIL보다 더 낮은 수준의 PD1을 발현하며, 이는 실시예 13의 도 24에 도시된 결과와 일치한다.
확장된 TIL의 집단에서 조절 T 세포(Treg 세포)를 검출하기 위해, 샘플을 항체 CD3-BUV395(BD), CD56-BV711(바이오레전드), CD4-BV605(바이오레전드), CD8-Alexa Fluor 700(바이오레전드), PD1-PECy7(바이오레전드), CD25-BUV737(바이오레전드), 2차 스트렙타비딘-BV421(바이오레전드)이 포함된 IL15RaFc-바이오틴(아크로 바이오시스템즈), 및 정착성 생존도 지시염료 eFluor 780(써모 피셔)를 사용하여 염색하였다. 세포내 염색을 위해, 먼저 위에 열거된 표면 항체로 세포를 염색한 다음, 세포를 고정시키고, BD Cytofix/Cytoperm 제조업체의 프로토콜을 사용하여 투과화하였다. 그런 다음, 투과화된 세포를 항체 FoxP3-FITC(바이오레전드)를 사용하여 염색하고, BD Fortessa 유세포 분석기에서 샘플을 실행시키고, Flow Jo V10.7.1을 사용하여 분석을 수행하였다. 조절 T 세포를 CD4+로 게이팅된 CD3+ T 세포로 확인하고, CD25 및 FoxP3 이중 양성 세포로 추가로 분류하였다. 도 25C에 도시된 바와 같이, 확장된 mbIL15 TIL은 조작 단계 이전의 사전-REP TIL과 비교하여 감소된 비율의 조절 T 세포를 갖는다.
실시예 15: 환자-유래 이종이식편(PDX) 모델 및 조작된 TIL을 사용한 치료
환자-유래 이종이식편(PDX) 모델의 확립
환자-유래 이종이식편(PDX) 모델(PDX 163A)을 실시예 11에 기재된 바와 같이 종양 은행으로부터 획득한 새로운 1차 흑색종 샘플로부터 생성하였다. 일단 모델이 확립되면, 종양의 동결 보존된 절편을 아이소플루레인-마취된 면역 저하 마우스에 무균적으로 이식하였다. 마우스를 안락사시켰을 때 종양은 대략 1000㎣ 내지 2000㎣으로 성장하였으며, PDX 종양 성장을 유지하고 효능 연구(아래 기재된 바와 같음)를 위한 동물 코호트를 구축하기 위해 종양을 후속 동물로 연속적으로 계대하였다.
종양-보유 동물로부터 절제한 PDX163A 종양을 또한 유세포 분석을 사용하여 공유된 흑색종 종양 항원의 발현에 대해 평가하였다. 흑색종 세포 상에 보존된 흑색종 항원의 수준을 평가하기 위해, 본 명세서에 기재된 흑색종 세포주 A375 및 흑색종 PDX를 유세포 분석에 의해 검정하였다. 실시예 11에 기재된 바와 같은 흑색종 PDX로부터의 종양 덩어리(들)를 새롭게 얻거나 또는 동결보존으로부터 얻고, 생존 가능한 단일 세포 현탁액 샘플을 얻기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 GentleMAC(밀테니)로 소화시키고, Fc 차단 시약으로 차단하고, MART-1(바이오레전드), gp100(바이오레전드) 및 정착성 생존도 지시염료 eFluor 780(써모 피셔)에 대한 항체를 사용하여 염색하였다. 비디 심포니 유세포 분석기에서 샘플을 실행시키고, Flow Jo V10.7.1을 사용하여 분석을 수행하였다. 흑색종-관련 항원-발현 종양 세포의 빈도는 살아있는 세포 집단 내에서 MART-1 또는 gp100에 대해 양성으로 염색된 세포의 퍼센트로 결정하였다. 도 26은 보존된 흑색종-관련 항원 MART-1 및 gp100은 모두 이 실시예에 기재된 바와 같은 TIL 효능 모델링을 위해 선택된 PDX 종양에서 발현되었음을 보여준다(아래).
동종이계 효능 모델링을 위한 공여자의 선택
8명의 흑색종 공여자로부터의 TIL을 실시예 1 내지 실시예 3 또는 실시예 9에 기재된 바와 같이 생성하였다. 간략하게는, 사전-REP 배양에서 3주 후, 동결 보존된 TIL을 해동시키고, 6000 IU/㎖의 인간 IL2와 함께 밤새 두었다. 그런 다음, TIL을 항-CD3/CD28 Dynabead로 또는 OKT3-코팅된 다중-웰 플레이트에서 24시간 동안 활성화한 후, 이 시점에서 조절된 mbIL15 벡터를 형질도입하거나 또는 조작하지 않았다. 형질도입 24시간 후, TIL을 GREX 6M 웰 플레이트(윌슨 울프)에서 6000 IU/㎖ IL2를 비조작된 TIL에 첨가하거나 및 25μM 아세타졸아마이드(셀렉캠 또는 히크마)를 조절된 mbIL15 TIL을 첨가하여 K562-IL21-41BBL 피더 세포로 확장시켰다. 확장 14일 후, TIL을 수거하고, 비드를 제거하고, IL2 및 아세타졸아마이드와 함께 또는 없이 밤새 두었다.
4량체 염색을 사용하여 TIL 공여자가 공유된 흑색종 항원, MART-1 및 gp100에 반응하는지 결정하였다. 항원-반응성 TIL의 수준을 평가하기 위해, 유세포 분석을 수행하여 4량체-반응성 세포의 빈도를 검사하였다. Fc 차단 시약으로 샘플을 차단하고, 항체 CD3-BUV395(BD), CD4-BV605(바이오레전드), CD8-Alexa Fluor 700(바이오레전드), HLA-A2:01-MART-1 4량체(엠비엘 인터내셔널(MBL International)), HLA-A2:01-gp100(엠비엘 인터내셔널), 2차 스트렙타비딘-BV421(바이오레전드)이 포함된 IL15RaFc-바이오틴(아크로 바이오시스템즈), 및 정착성 생존도 지시염료 eFluor 780(써모 피셔)을 사용하여 염색하였다. 비디 심포니 유세포 분석기에서 샘플을 실행시키고, Flow Jo V10.7.1을 사용하여 분석을 수행하였다. 항원-반응성 TIL이 빈도는 살아있는 CD3 양성, CD8 양성 세포 집단 내에서 독립적으로 2개의 4량체 각각에 대해 양성으로 염색된 세포의 퍼센트로 결정하였다. 도 27에 도시된 바와 같이, 테스트된 4개의 공여자 모두 MART-1 항원에 반응성을 나타내었고, 테스트된 4개의 공여자 중 3개는 gp100 항원에 반응성을 나타내었다. 4량체 양성 집단은 TIL이 HLA:A2:01 유전자좌를 통해 해당 흑색종-관련 항원에 반응하는 세포의 일부를 포함함을 나타낸다. 도 27에서, *로 표시된 공여자는 이 실시예에 기술된 바와 같이 PDX 효능 연구에 사용하였다(아래).
실시예 11에 기재된 바와 같은 흑색종 PDX로부터의 종양 덩어리(들)를 새롭게 얻거나 또는 동결보존으로부터 얻고, 생존 가능한 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 GentleMAC(밀테니)로 소화시켰다. 그런 다음, PDX 세포를 TIL 배지에 5×106개 세포/㎖로 재현탁시켰다. 10 ㎍/㎖의 미토마이신-C를 세포에 첨가한 다음, 이를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포를 50㎖ TIL 배지로 3회 세척하였다. 웰당 1×105개의 PDX 세포를 96-웰 플랫 버텀 조직-배양 처리된 플레이트에 첨가하였다. 일부 웰에서, 80 ㎍/㎖ HLA-ABC(바이오레전드) 차단 항체를 첨가하여 표적 세포 상의 MHC 클래스 I을 차단하였다. 밤새 놔둔 TIL을 TIL:PDX의 1:1 비로 웰당 200㎕의 총 부피로 첨가하였다. 양성 대조군으로서, TIL을 PMA/이오노마이신과 1:1000로 공동 배양하였으며, 이는 최대 IFNγ 분비를 유도하였다. 음성 대조군으로서, TIL을 임의의 추가적인 시약 또는 세포 없이 공동 배양하였으며, "비자극된" TIL로 확인하였다. 24-시간 시점에서, 각 웰로부터 상청액을 회수하고, IFNγ의 농도를 MSD로 검정하였다.
도 28은 TIL:종양 세포 공동 배양 후 인터페론 감마(IFNγ) 생산이 PDX 종양에 반응성인 TIL 공여자를 예측하는 데 사용될 수 있음을 보여준다. 이러한 시험관내 검정은 TIL 공여자 006, 39A 및 41A가 PDX에 반응하여 생산된 최고량의 IFNγ를 가진 공여자임을 보여주므로, 이는 이 실시예에 기재된 바와 같이 생체내 효능을 조사하기 위한 공여자로서의 이들의 후보성을 뒷받침한다(아래).
TIL 효능 연구를 위한 환자-유래 이종이식편(PDX) 모델의 사용
PDx-종양-보유 마우스로부터의 종양(위에 기재된 바와 같이 계대됨)을 무균적으로 수집하고, 약 100㎎ 절편으로 절단한 다음, 13일 동안 성장시킨 더 큰 마우스 코호트에 이식한 후 이를 측정하고, 각각의 처리 그룹으로 무작위 배정(50㎣ 내지 100㎣)하였다. 다음날, 10M TIL을 정맥내로 주사하였다. 비조작된 TIL을 투여받은 마우스에 4일 동안 600,000 국제 단위(IU) IL2를 매일 투여하였다. mbIL15가 CA2에 작동 가능하게 연결된 mbIL15 생성물을 투여받은 마우스에 전체 연구 동안 200 ㎎/㎏ 아세타졸아마이드(ACZ)를 매일 투여하였다. 종양 및 체중을 매주 2회 수집하였다. 치료 패러다임은 도 29에 도시되어 있다. 도 30에 도시된 바와 같이, 조작된 TIL+ACZ는 비조작된 TIL+IL2와 비교하여 우수한 항종양 효과를 보여주었다. 추가적으로, 특히 ACZ의 존재하에 조작된 TIL은, 도 31a에 도시된 바와 같이 더 나은 종양 침윤을 나타내었고, 도 31b에 도시된 바와 같이 기질 구획 및 종양 구획 둘 다에서 더 많은 수를 나타내었다.
SEQUENCE LISTING <110> Obsidian Therapeutics, Inc. <120> Tumor Infiltrating Lymphocytes With Membrane Bound Interleukin 15 And Uses Thereof <130> 108407-1291325 (022WO1) <150> 63/153,367 <151> 2021-02-24 <150> 63/139,305 <151> 2021-01-19 <150> 63/226,114 <151> 2021-07-27 <150> 63/244,166 <151> 2021-09-14 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 159 <212> PRT <213> E. coli <400> 1 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Cys Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg 145 150 155 <210> 2 <211> 187 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Val Gly Ser Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly 1 5 10 15 Ile Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Phe 20 25 30 Arg Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln 35 40 45 Asn Leu Val Ile Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys 50 55 60 Asn Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ile Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu 65 70 75 80 Lys Glu Pro Pro Gln Gly Ala His Phe Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp 85 90 95 Ala Leu Lys Leu Thr Glu Gln Pro Glu Leu Ala Asn Lys Val Asp Met 100 105 110 Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His 115 120 125 Pro Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Asp Phe Glu 130 135 140 Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu 145 150 155 160 Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile 165 170 175 Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp 180 185 <210> 3 <211> 3919 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 3 agtcccagac agaacctact atgtgcggcg gcagctgggg cgggaaggcg ggagctgggg 60 gcgctggggg cgctgcggcc gctgcggccg ctgcagccgc tgcagcgcca gggtccacct 120 ggtcggctgc acctgtggag gaggaggtgg atttcaggct tcccgtagac tggaagaatc 180 ggctcaaaac cgcttgcctc gcaggggctg agctggaggc agcgaggccg cccgacgcag 240 gcttccggcg agacatggca gggcaaggat ggcagcccgg cggcagggcc tggcgaggag 300 cgcgagcccg cggccgcagt tcccaggcgt ctgcgggcgc gagcacgccg cgaccctgcg 360 tgcgccgggg cgggggggcg gggcctcgcc tgcacaaatg gggacgaggg gggcggggcg 420 gccacaattt cgcgccaaac ttgaccgcgc gttctgctgt aacgagcggg ctcggaggtc 480 ctcccgctgc tgtcatggtt ggttcgctaa actgcatcgt cgctgtgtcc cagaacatgg 540 gcatcggcaa gaacggggac ctgccctggc caccgctcag gaatgaattc agatatttcc 600 agagaatgac cacaacctct tcagtagaag gtaaacagaa tctggtgatt atgggtaaga 660 agacctggtt ctccattcct gagaagaatc gacctttaaa gggtagaatt aatttagttc 720 tcagcagaga actcaaggaa cctccacaag gagctcattt tctttccaga agtctagatg 780 atgccttaaa acttactgaa caaccagaat tagcaaataa agtagacatg gtctggatag 840 ttggtggcag ttctgtttat aaggaagcca tgaatcaccc aggccatctt aaactatttg 900 tgacaaggat catgcaagac tttgaaagtg acacgttttt tccagaaatt gatttggaga 960 aatataaact tctgccagaa tacccaggtg ttctctctga tgtccaggag gagaaaggca 1020 ttaagtacaa atttgaagta tatgagaaga atgattaata tgaaggtgtt ttctagttta 1080 agttgttccc cctccctctg aaaaaagtat gtatttttac attagaaaag gttttttgtt 1140 gactttagat ctataattat ttctaagcaa ctagttttta ttccccacta ctcttgtctc 1200 tatcagatac catttatgag acattcttgc tataactaag tgcttctcca agaccccaac 1260 tgagtcccca gcacctgcta cagtgagctg ccattccaca cccatcacat gtggcactct 1320 tgccagtcct tgacattgtc gggcttttca catgttggta atatttatta aagatgaaga 1380 tccacatacc cttcaactga gcagtttcac tagtggaaat accaaaagct tcctacgtgt 1440 atatccagag gtttgtagat aaatgttgcc accttgtttg taacagtgaa aaattgaaaa 1500 caacctggaa gtccagtgat gggaaaatga gtatgtttct gtcttagatt ggggaaccca 1560 aagcagattg caagactgaa atttcagtga aagcagtgta tttgctaggt cataccagaa 1620 atcatcaatt gaggtacgga gaaactgaac tgagaaggta agaaaagcaa tttaaagtca 1680 gcgagcaggt tctcattgat aacaagctcc atactgctga gatacaggga aatggagggg 1740 ggaaagctgg agtattgatc ccgcccccct ccttggttgt cagctccctg tcctgtgtgt 1800 gggcggaaca tagtccagct gctctatagc aagtctcagg tgtttgcagt aagaagctgc 1860 tggcatgcac gggaacagtg aatgccaaac acttaaagca attcgatgtt taagtatgta 1920 agttcttttt tttttagaca gcgtttcgct cttgttgccc aggctagcat gcaatggtgt 1980 gacctcggct tactgcaacc tccgccttcc cagattcaag cgattctcct gcctcaggct 2040 cccaagtagc taggaccagg tgcgcgccac cacgcccggc taatttttgt attttgtatt 2100 tttagtagag atggggtttc accatgttgg tcaggctagt ctcgaactcg tgaccgcaag 2160 cgattcaccc acctcagcct cccaaagtgc tgggattacc ggcttgagcc accacacccg 2220 gcacatcttc attcttttta tgtagtaaaa agtataaggc cacacatggt ttatttgaag 2280 tattttataa tttaaaaaaa tacagaagca ggaaaaccaa ttataagttc aagtgaggga 2340 tgatggttgc ttgaaccaaa gggttgcatg tagtaagaaa ttgtgattta agatatattt 2400 taaagttata agtagcagga tattctgatg gagtttgact ttggttttgg gcccagggag 2460 tttcagatgc ctttgagaaa tgaatgaagt agagagaaaa taaaagaaaa accagccagg 2520 cacagtggct cacacctgta atcccagcgc tttgggaggc taaggcaggc agatcacttg 2580 agaccagctt gggcaacatg gcaaagcccc atctctacaa aaaacacaaa aattagctgg 2640 gcattgtggc gcacacctgt attcccatct agtcaggaag ctgagatgga agaattaatt 2700 gagcccacga gttcaaggct gcagtgagtc gtgattgtgc cactgcactc cagccggggt 2760 gacagaagag accttgtctc gaaaaggaat ctgaaaacaa tggaaccatg ccttcataat 2820 tctagaaagt tattttcaac tgataaatct atattcaccc aaataatcaa gggtgaaggt 2880 aaaataatac atttttagac aagcaaagac tcaggggtta cctccatgtg ccctttttag 2940 ggaagctgtt ggagaaaata ctccagcaaa atgaaggagt acacaaacca gagaatgaca 3000 tgaatccagc aaataggatc caacacaggc aatattccag ctatggagct agctttaaaa 3060 aggaacagta aaaatattaa tcggttagct gggtggaatg gcccatgcct gtagtcccag 3120 ctactcagga ggctcagcag caggacgact tgagcccaag agttccagac cagcctggcc 3180 accttagtga gatcccttct cttaaaaata ataacttatt gccagatttg gggcatttgg 3240 aaagaagttc attgaagata aagcaaaagt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa caaggggaaa 3300 gggttggtta ggcaatcatt ctagggcaga aagaagtaca ggataggaag agcataatac 3360 actgtttttc tcaacaagga gcagtatgta cacagtcata atgatgtgac tgcttagccc 3420 ctaaatatgg taactactct gggacaatat gggaggaaaa gtgaagattg tgatggtgta 3480 agagctaaat cctcatctgt catatccaga aatcactata taatatataa taatgaaatg 3540 actaagttat gtgaggaaaa aaacagaaga cattgctaaa agagttaaaa gtcattgctc 3600 tggagaatta ggagggatgg ggcaggggac tgttaggatg cattataaac tgaaaagcct 3660 ttttaaaatt ttatgtatta atatatgcat tcacttgaaa aactaaaaaa aaacaataat 3720 ttggaaaaac ccatgaaggt aactaacgga aggaaaaact aagagaatga aaagtatttg 3780 cctctggaaa gaacaactgg caggactgtt gttttcattg taagactttt ggagccattt 3840 aattgtactt aaccattttc atctatttct ttaataagaa caattccatc ttaataaaga 3900 gttacacttg ttaataagt 3919 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 4 Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro 1 5 10 15 Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp 20 25 30 Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe 35 40 45 Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala 50 55 60 Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr 65 70 75 80 Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr 85 90 95 Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu 100 105 <210> 5 <211> 327 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 5 Met Glu Glu Thr Arg Glu Leu Gln Ser Leu Ala Ala Ala Val Val Pro 1 5 10 15 Ser Ala Gln Thr Leu Lys Ile Thr Asp Phe Ser Phe Ser Asp Phe Glu 20 25 30 Leu Ser Asp Leu Glu Thr Ala Leu Cys Thr Ile Arg Met Phe Thr Asp 35 40 45 Leu Asn Leu Val Gln Asn Phe Gln Met Lys His Glu Val Leu Cys Arg 50 55 60 Trp Ile Leu Ser Val Lys Lys Asn Tyr Arg Lys Asn Val Ala Tyr His 65 70 75 80 Asn Trp Arg His Ala Phe Asn Thr Ala Gln Cys Met Phe Ala Ala Leu 85 90 95 Lys Ala Gly Lys Ile Gln Asn Lys Leu Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala 100 105 110 Leu Leu Ile Ala Ala Leu Ser His Asp Leu Asp His Arg Gly Val Asn 115 120 125 Asn Ser Tyr Ile Gln Arg Ser Glu His Pro Leu Ala Gln Leu Tyr Cys 130 135 140 His Ser Ile Met Glu His His His Phe Asp Gln Cys Leu Met Ile Leu 145 150 155 160 Asn Ser Pro Gly Asn Gln Ile Leu Ser Gly Leu Ser Ile Glu Glu Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Leu Lys Ile Ile Lys Gln Ala Ile Leu Ala Thr Asp Leu 180 185 190 Ala Leu Tyr Ile Lys Arg Arg Gly Glu Phe Phe Glu Leu Ile Arg Lys 195 200 205 Asn Gln Phe Asn Leu Glu Asp Pro His Gln Lys Glu Leu Phe Leu Ala 210 215 220 Met Leu Met Thr Ala Cys Asp Leu Ser Ala Ile Thr Lys Pro Trp Pro 225 230 235 240 Ile Gln Gln Arg Ile Ala Glu Leu Val Ala Thr Glu Phe Phe Asp Gln 245 250 255 Gly Asp Arg Glu Arg Lys Glu Leu Asn Ile Glu Pro Thr Asp Leu Met 260 265 270 Asn Arg Glu Lys Lys Asn Lys Ile Pro Ser Met Gln Val Gly Phe Ile 275 280 285 Asp Ala Ile Cys Leu Gln Leu Tyr Glu Ala Leu Thr His Val Ser Glu 290 295 300 Asp Cys Phe Pro Leu Leu Asp Gly Cys Arg Lys Asn Arg Gln Lys Trp 305 310 315 320 Gln Ala Leu Ala Glu Gln Gln 325 <210> 6 <211> 875 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 6 Met Glu Arg Ala Gly Pro Ser Phe Gly Gln Gln Arg Gln Gln Gln Gln 1 5 10 15 Pro Gln Gln Gln Lys Gln Gln Gln Arg Asp Gln Asp Ser Val Glu Ala 20 25 30 Trp Leu Asp Asp His Trp Asp Phe Thr Phe Ser Tyr Phe Val Arg Lys 35 40 45 Ala Thr Arg Glu Met Val Asn Ala Trp Phe Ala Glu Arg Val His Thr 50 55 60 Ile Pro Val Cys Lys Glu Gly Ile Arg Gly His Thr Glu Ser Cys Ser 65 70 75 80 Cys Pro Leu Gln Gln Ser Pro Arg Ala Asp Asn Ser Ala Pro Gly Thr 85 90 95 Pro Thr Arg Lys Ile Ser Ala Ser Glu Phe Asp Arg Pro Leu Arg Pro 100 105 110 Ile Val Val Lys Asp Ser Glu Gly Thr Val Ser Phe Leu Ser Asp Ser 115 120 125 Glu Lys Lys Glu Gln Met Pro Leu Thr Pro Pro Arg Phe Asp His Asp 130 135 140 Glu Gly Asp Gln Cys Ser Arg Leu Leu Glu Leu Val Lys Asp Ile Ser 145 150 155 160 Ser His Leu Asp Val Thr Ala Leu Cys His Lys Ile Phe Leu His Ile 165 170 175 His Gly Leu Ile Ser Ala Asp Arg Tyr Ser Leu Phe Leu Val Cys Glu 180 185 190 Asp Ser Ser Asn Asp Lys Phe Leu Ile Ser Arg Leu Phe Asp Val Ala 195 200 205 Glu Gly Ser Thr Leu Glu Glu Val Ser Asn Asn Cys Ile Arg Leu Glu 210 215 220 Trp Asn Lys Gly Ile Val Gly His Val Ala Ala Leu Gly Glu Pro Leu 225 230 235 240 Asn Ile Lys Asp Ala Tyr Glu Asp Pro Arg Phe Asn Ala Glu Val Asp 245 250 255 Gln Ile Thr Gly Tyr Lys Thr Gln Ser Ile Leu Cys Met Pro Ile Lys 260 265 270 Asn His Arg Glu Glu Val Val Gly Val Ala Gln Ala Ile Asn Lys Lys 275 280 285 Ser Gly Asn Gly Gly Thr Phe Thr Glu Lys Asp Glu Lys Asp Phe Ala 290 295 300 Ala Tyr Leu Ala Phe Cys Gly Ile Val Leu His Asn Ala Gln Leu Tyr 305 310 315 320 Glu Thr Ser Leu Leu Glu Asn Lys Arg Asn Gln Val Leu Leu Asp Leu 325 330 335 Ala Ser Leu Ile Phe Glu Glu Gln Gln Ser Leu Glu Val Ile Leu Lys 340 345 350 Lys Ile Ala Ala Thr Ile Ile Ser Phe Met Gln Val Gln Lys Cys Thr 355 360 365 Ile Phe Ile Val Asp Glu Asp Cys Ser Asp Ser Phe Ser Ser Val Phe 370 375 380 His Met Glu Cys Glu Glu Leu Glu Lys Ser Ser Asp Thr Leu Thr Arg 385 390 395 400 Glu His Asp Ala Asn Lys Ile Asn Tyr Met Tyr Ala Gln Tyr Val Lys 405 410 415 Asn Thr Met Glu Pro Leu Asn Ile Pro Asp Val Ser Lys Asp Lys Arg 420 425 430 Phe Pro Trp Thr Thr Glu Asn Thr Gly Asn Val Asn Gln Gln Cys Ile 435 440 445 Arg Ser Leu Leu Cys Thr Pro Ile Lys Asn Gly Lys Lys Asn Lys Val 450 455 460 Ile Gly Val Cys Gln Leu Val Asn Lys Met Glu Glu Asn Thr Gly Lys 465 470 475 480 Val Lys Pro Phe Asn Arg Asn Asp Glu Gln Phe Leu Glu Ala Phe Val 485 490 495 Ile Phe Cys Gly Leu Gly Ile Gln Asn Thr Gln Met Tyr Glu Ala Val 500 505 510 Glu Arg Ala Met Ala Lys Gln Met Val Thr Leu Glu Val Leu Ser Tyr 515 520 525 His Ala Ser Ala Ala Glu Glu Glu Thr Arg Glu Leu Gln Ser Leu Ala 530 535 540 Ala Ala Val Val Pro Ser Ala Gln Thr Leu Lys Ile Thr Asp Phe Ser 545 550 555 560 Phe Ser Asp Phe Glu Leu Ser Asp Leu Glu Thr Ala Leu Cys Thr Ile 565 570 575 Arg Met Phe Thr Asp Leu Asn Leu Val Gln Asn Phe Gln Met Lys His 580 585 590 Glu Val Leu Cys Arg Trp Ile Leu Ser Val Lys Lys Asn Tyr Arg Lys 595 600 605 Asn Val Ala Tyr His Asn Trp Arg His Ala Phe Asn Thr Ala Gln Cys 610 615 620 Met Phe Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys Ile Gln Asn Lys Leu Thr Asp 625 630 635 640 Leu Glu Ile Leu Ala Leu Leu Ile Ala Ala Leu Ser His Asp Leu Asp 645 650 655 His Arg Gly Val Asn Asn Ser Tyr Ile Gln Arg Ser Glu His Pro Leu 660 665 670 Ala Gln Leu Tyr Cys His Ser Ile Met Glu His His His Phe Asp Gln 675 680 685 Cys Leu Met Ile Leu Asn Ser Pro Gly Asn Gln Ile Leu Ser Gly Leu 690 695 700 Ser Ile Glu Glu Tyr Lys Thr Thr Leu Lys Ile Ile Lys Gln Ala Ile 705 710 715 720 Leu Ala Thr Asp Leu Ala Leu Tyr Ile Lys Arg Arg Gly Glu Phe Phe 725 730 735 Glu Leu Ile Arg Lys Asn Gln Phe Asn Leu Glu Asp Pro His Gln Lys 740 745 750 Glu Leu Phe Leu Ala Met Leu Met Thr Ala Cys Asp Leu Ser Ala Ile 755 760 765 Thr Lys Pro Trp Pro Ile Gln Gln Arg Ile Ala Glu Leu Val Ala Thr 770 775 780 Glu Phe Phe Asp Gln Gly Asp Arg Glu Arg Lys Glu Leu Asn Ile Glu 785 790 795 800 Pro Thr Asp Leu Met Asn Arg Glu Lys Lys Asn Lys Ile Pro Ser Met 805 810 815 Gln Val Gly Phe Ile Asp Ala Ile Cys Leu Gln Leu Tyr Glu Ala Leu 820 825 830 Thr His Val Ser Glu Asp Cys Phe Pro Leu Leu Asp Gly Cys Arg Lys 835 840 845 Asn Arg Gln Lys Trp Gln Ala Leu Ala Glu Gln Gln Glu Lys Met Leu 850 855 860 Ile Asn Gly Glu Ser Gly Gln Ala Lys Arg Asn 865 870 875 <210> 7 <211> 260 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 7 Met Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp 1 5 10 15 His Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp 20 25 30 Ile Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser 35 40 45 Val Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His 50 55 60 Ala Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys 65 70 75 80 Gly Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His 85 90 95 Trp Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys 100 105 110 Lys Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly 115 120 125 Asp Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly 130 135 140 Ile Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val 145 150 155 160 Asp Val Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr 165 170 175 Asn Phe Asp Pro Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr 180 185 190 Tyr Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp 195 200 205 Ile Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys 210 215 220 Phe Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met 225 230 235 240 Val Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys 245 250 255 Ala Ser Phe Lys 260 <210> 8 <211> 1492 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 8 acacagtgca ggcgcccaag ccgccgccgc cagatcggtg ccgattcctg ccctgccccg 60 accgccagcg cgaccatgtc ccatcactgg gggtacggca aacacaacgg acctgagcac 120 tggcataagg acttccccat cccctgtctg tttcctatga tcaagcaact tccctgagga 180 tcctcaacaa tggtcatgct ttcaacgtgg agtttgatga ctctcaggac aaagcagtgc 240 tcaagggagg acccctggat ggcacttaca gattgattca gtttcacttt cactggggtt 300 cacttgatgg acaaggttca gagcatactg tggataaaaa gaaatatgct gcagaacttc 360 acttggttca ctggaacacc aaatatgggg attttgggaa agctgtgcag caacctgatg 420 gactggccgt tctaggtatt tttttgaagg ttggcagcgc taaaccgggc cttcagaaag 480 ttgttgatgt gctggattcc attaaaacaa agggcaagag tgctgacttc actaacttcg 540 atcctcgtgg cctccttcct gaatccttgg attactggac ctacccaggc tcactgacca 600 cccctcctct tctggaatgt gtgacctgga ttgtgctcaa ggaacccatc agcgtcagca 660 gcgagcaggt gttgaaattc cgtaaactta acttcaatgg ggagggtgaa cccgaagaac 720 tgatggtgga caactggcgc ccagctcagc cactgaagaa caggcaaatc aaagcttcct 780 tcaaataaga tggtcccata gtctgtatcc aaataatgaa tcttcgggtg tttcccttta 840 gctaagcaca gatctacctt ggtgatttgg accctggttg ctttgtgtct agttttctag 900 acccttcatc tcttacttga tagacttact aataaaatgt gaagactaga ccaattgtca 960 tgcttgacac aactgctgtg gctggttggt gctttgttta tggtagtagt ttttctgtaa 1020 cacagaatat aggataagaa ataagaataa agtaccttga ctttgttcac agcatgtagg 1080 gtgatgagca ctcacaattg ttgactaaaa tgctgctttt aaaacatagg aaagtagaat 1140 ggttgagtgc aaatccatag cacaagataa attgagctag ttaaggcaaa tcaggtaaaa 1200 tagtcatgat tctatgtaat gtaaaccaga aaaaataaat gttcatgatt tcaagatgtt 1260 atattaaaga aaaactttaa aaattattat atatttatag caaagttatc ttaaatatga 1320 attctgttgt aatttaatga cttttgaatt acagagatat aaatgaagta ttatctgtaa 1380 aaattgttat aattagagtt gtgatacaga gtatatttcc attcagacaa tatatcataa 1440 cttaataaat attgtatttt agatatattc tctaataaaa ttcagaattc ta 1492 <210> 9 <211> 595 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 9 Met Thr Met Thr Leu His Thr Lys Ala Ser Gly Met Ala Leu Leu His 1 5 10 15 Gln Ile Gln Gly Asn Glu Leu Glu Pro Leu Asn Arg Pro Gln Leu Lys 20 25 30 Ile Pro Leu Glu Arg Pro Leu Gly Glu Val Tyr Leu Asp Ser Ser Lys 35 40 45 Pro Ala Val Tyr Asn Tyr Pro Glu Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Asn Ala 50 55 60 Ala Ala Ala Ala Asn Ala Gln Val Tyr Gly Gln Thr Gly Leu Pro Tyr 65 70 75 80 Gly Pro Gly Ser Glu Ala Ala Ala Phe Gly Ser Asn Gly Leu Gly Gly 85 90 95 Phe Pro Pro Leu Asn Ser Val Ser Pro Ser Pro Leu Met Leu Leu His 100 105 110 Pro Pro Pro Gln Leu Ser Pro Phe Leu Gln Pro His Gly Gln Gln Val 115 120 125 Pro Tyr Tyr Leu Glu Asn Glu Pro Ser Gly Tyr Thr Val Arg Glu Ala 130 135 140 Gly Pro Pro Ala Phe Tyr Arg Pro Asn Ser Asp Asn Arg Arg Gln Gly 145 150 155 160 Gly Arg Glu Arg Leu Ala Ser Thr Asn Asp Lys Gly Ser Met Ala Met 165 170 175 Glu Ser Ala Lys Glu Thr Arg Tyr Cys Ala Val Cys Asn Asp Tyr Ala 180 185 190 Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly Cys Lys Ala Phe 195 200 205 Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Met Cys Pro Ala Thr 210 215 220 Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg Arg Lys Ser Cys Gln Ala Cys 225 230 235 240 Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys Gly Gly Ile Arg 245 250 255 Lys Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg Gln Arg Asp 260 265 270 Asp Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala 275 280 285 Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys Asn 290 295 300 Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu 305 310 315 320 Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro 325 330 335 Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg 340 345 350 Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val 355 360 365 Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu 370 375 380 Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly 385 390 395 400 Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys 405 410 415 Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser 420 425 430 Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu 435 440 445 Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser 450 455 460 Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp 465 470 475 480 Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr 485 490 495 Leu Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser 500 505 510 His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly Met Glu His Leu Tyr Ser Met 515 520 525 Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu 530 535 540 Asp Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser Arg Gly Gly Ala Ser Val 545 550 555 560 Glu Glu Thr Asp Gln Ser His Leu Ala Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ser 565 570 575 His Ser Leu Gln Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ala Glu Gly Phe Pro 580 585 590 Ala Thr Val 595 <210> 10 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ala Arg Cys 20 <210> 11 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 atggacatgc gggtgcctgc acaacttctg ggcctgctgt tgttgtggct gtctggagcc 60 cggtgt 66 <210> 12 <211> 114 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 12 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser <210> 13 <211> 342 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 13 aattgggtaa atgttatcag tgatctcaag aagatagagg atctcatcca gtccatgcat 60 attgatgcca cgctgtacac agaaagcgat gtgcatccta gctgtaaggt gacagcgatg 120 aagtgttttc ttttggagct gcaggtaatt agtcttgagt ccggcgatgc cagcattcat 180 gataccgtag aaaacttgat tatcctggcc aacaattctc tgtcctcaaa cggaaacgta 240 accgagagcg gttgtaaaga atgtgaagaa ctggaagaaa agaacatcaa ggagtttctg 300 caatcattcg ttcacatcgt acaaatgttc ataaatacgt ca 342 <210> 14 <211> 30 <212> PRT <213> ARtificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 20 25 30 <210> 15 <211> 90 <212> DNA <213> ARtificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 ggatctggtt ctggttccgg aagtggatct ggttcagggt ccggtagtgg atctgggtca 60 ggaagtggaa gcggtagtgg gtctggatct 90 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> ARtificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn 1 5 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> ARtificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 aaacaagagc actttcctga taac 24 <210> 18 <211> 21 <212> PRT <213> ARtificial SEquence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe 1 5 10 15 Val Ile Cys Cys Leu 20 <210> 19 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 ctgttgccga gctgggcgat tacgcttatc agtgtaaacg gcatctttgt aatatgctgt 60 ctg 63 <210> 20 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg 1 5 10 15 Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val 20 25 <210> 21 <211> 75 <212> DNA <213> ARtificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 acctactgct tcgcaccaag gtgccgggag agaaggagaa atgaaagact gagaagggag 60 agcgtgagac ctgtg 75 <210> 22 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Ala Arg Asn Glu Arg 1 5 10 15 Leu Arg Arg Glu Thr Val Arg Pro Val 20 25 <210> 23 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 acctactgct tcgcaccaag gtgccgggag agagcaagaa atgaaagact gagaagggag 60 accgtgagac ctgtg 75 <210> 24 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial SEquence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Gly Ser 1 <210> 25 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 ggatcc 6 <210> 26 <211> 208 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp His 1 5 10 15 Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp Ile 20 25 30 Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser Val 35 40 45 Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His Ala 50 55 60 Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys Gly 65 70 75 80 Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His Trp 85 90 95 Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys Asp 100 105 110 Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr Asn Phe Asp Pro 115 120 125 Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr Tyr Pro Gly Ser 130 135 140 Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp Ile Val Leu Lys 145 150 155 160 Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys Phe Arg Lys Leu 165 170 175 Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met Val Asp Asn Trp 180 185 190 Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys Ala Ser Phe Lys 195 200 205 <210> 27 <211> 777 <212> DNA <213> ARtificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 tcccatcact gggggtacgg caaacacaac ggacctgagc actggcataa ggacttcccc 60 attgccaagg gagagcgcca gtcccctgtt gacatcgaca ctcatacagc caagtatgac 120 ccttccctga agcccctgtc tgtttcctat gatcaagcaa cttccctgag aatcctcaac 180 aatggtcatg ctttcaacgt ggagtttgat gactctcagg acaaagcagt gctcaaggga 240 ggacccctgg atggcactta cagattgatt cagtttcact ttcactgggg ttcacttgat 300 ggacaaggtt cagagcatac tgtggataaa aagaaatatg ctgcagaact tcacttggtt 360 cactggaaca ccaaatatgg ggattttggg aaagctgtgc agcaacctga tggactggcc 420 gttctaggta tttttttgaa ggttggcagc gctaaaccgg gccatcagaa agttgttgat 480 gtgctggatt ccattaaaac aaagggcaag agtgctgact tcactaactt cgatcctcgt 540 ggcctccttc ctgaatccct ggattactgg acctacccag gctcactgac cacccctcct 600 cttctggaat gtgtgacctg gattgtgctc aaggaaccca tcagcgtcag cagcgagcag 660 gtgttgaaat tccgtaaact taacttcaat ggggagggtg aacccgaaga actgatggtg 720 gacaactggc gcccagctca gccactgaag aacaggcaaa tcaaagcttc cttcaaa 777 <210> 28 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys 20 25 30 Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr 35 40 45 Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys 50 55 60 Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser 65 70 75 80 Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu 85 90 95 Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu 100 105 110 Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile 115 120 125 Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 145 150 155 160 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Leu Leu 165 170 175 Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile 180 185 190 Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg 195 200 205 Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val Gly Ser 210 215 220 <210> 29 <211> 666 <212> DNA <213> ARtificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 atggacatgc gggtgcctgc acaacttctg ggcctgctgt tgttgtggct gtctggagcc 60 cggtgtaatt gggtaaatgt tatcagtgat ctcaagaaga tagaggatct catccagtcc 120 atgcatattg atgccacgct gtacacagaa agcgatgtgc atcctagctg taaggtgaca 180 gcgatgaagt gttttctttt ggagctgcag gtaattagtc ttgagtccgg cgatgccagc 240 attcatgata ccgtagaaaa cttgattatc ctggccaaca attctctgtc ctcaaacgga 300 aacgtaaccg agagcggttg taaagaatgt gaagaactgg aagaaaagaa catcaaggag 360 tttctgcaat cattcgttca catcgtacaa atgttcataa atacgtcagg atctggttct 420 ggttccggaa gtggatctgg ttcagggtcc ggtagtggat ctgggtcagg aagtggaagc 480 ggtagtgggt ctggatctaa acaagagcac tttcctgata acctgttgcc gagctgggcg 540 attacgctta tcagtgtaaa cggcatcttt gtaatatgct gtctgaccta ctgcttcgca 600 ccaaggtgcc gggagagaag gagaaatgaa agactgagaa gggagagcgt gagacctgtg 660 ggatcc 666 <210> 30 <211> 430 <212> PRT <213> ARtificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys 20 25 30 Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr 35 40 45 Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys 50 55 60 Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser 65 70 75 80 Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu 85 90 95 Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu 100 105 110 Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile 115 120 125 Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 145 150 155 160 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Leu Leu 165 170 175 Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile 180 185 190 Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg 195 200 205 Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val Gly Ser Ser His 210 215 220 His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp His Lys Asp 225 230 235 240 Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp Ile Asp Thr 245 250 255 His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser Val Ser Tyr 260 265 270 Asp Gln Ala Thr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His Ala Phe Asn 275 280 285 Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys Gly Gly Pro 290 295 300 Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His Trp Gly Ser 305 310 315 320 Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys Asp Ser Ile 325 330 335 Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr Asn Phe Asp Pro Arg Gly 340 345 350 Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr Tyr Pro Gly Ser Leu Thr 355 360 365 Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp Ile Val Leu Lys Glu Pro 370 375 380 Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys Phe Arg Lys Leu Asn Phe 385 390 395 400 Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met Val Asp Asn Trp Arg Pro 405 410 415 Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys Ala Ser Phe Lys 420 425 430 <210> 31 <211> 1443 <212> DNA <213> ARtificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 atggacatgc gggtgcctgc acaacttctg ggcctgctgt tgttgtggct gtctggagcc 60 cggtgtaatt gggtaaatgt tatcagtgat ctcaagaaga tagaggatct catccagtcc 120 atgcatattg atgccacgct gtacacagaa agcgatgtgc atcctagctg taaggtgaca 180 gcgatgaagt gttttctttt ggagctgcag gtaattagtc ttgagtccgg cgatgccagc 240 attcatgata ccgtagaaaa cttgattatc ctggccaaca attctctgtc ctcaaacgga 300 aacgtaaccg agagcggttg taaagaatgt gaagaactgg aagaaaagaa catcaaggag 360 tttctgcaat cattcgttca catcgtacaa atgttcataa atacgtcagg atctggttct 420 ggttccggaa gtggatctgg ttcagggtcc ggtagtggat ctgggtcagg aagtggaagc 480 ggtagtgggt ctggatctaa acaagagcac tttcctgata acctgttgcc gagctgggcg 540 attacgctta tcagtgtaaa cggcatcttt gtaatatgct gtctgaccta ctgcttcgca 600 ccaaggtgcc gggagagaag gagaaatgaa agactgagaa gggagagcgt gagacctgtg 660 ggatcctccc atcactgggg gtacggcaaa cacaacggac ctgagcactg gcataaggac 720 ttccccattg ccaagggaga gcgccagtcc cctgttgaca tcgacactca tacagccaag 780 tatgaccctt ccctgaagcc cctgtctgtt tcctatgatc aagcaacttc cctgagaatc 840 ctcaacaatg gtcatgcttt caacgtggag tttgatgact ctcaggacaa agcagtgctc 900 aagggaggac ccctggatgg cacttacaga ttgattcagt ttcactttca ctggggttca 960 cttgatggac aaggttcaga gcatactgtg gataaaaaga aatatgctgc agaacttcac 1020 ttggttcact ggaacaccaa atatggggat tttgggaaag ctgtgcagca acctgatgga 1080 ctggccgttc taggtatttt tttgaaggtt ggcagcgcta aaccgggcca tcagaaagtt 1140 gttgatgtgc tggattccat taaaacaaag ggcaagagtg ctgacttcac taacttcgat 1200 cctcgtggcc tccttcctga atccctggat tactggacct acccaggctc actgaccacc 1260 cctcctcttc tggaatgtgt gacctggatt gtgctcaagg aacccatcag cgtcagcagc 1320 gagcaggtgt tgaaattccg taaacttaac ttcaatgggg agggtgaacc cgaagaactg 1380 atggtggaca actggcgccc agctcagcca ctgaagaaca ggcaaatcaa agcttccttc 1440 aaa 1443 <210> 32 <211> 51 <212> DNA <213> ARtificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 atgtggctgc agtctctgct cctcttgggg actgtcgcct gttctatttc a 51 <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser <210> 34 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 caaggacagg atcgacatat gattcggatg cgccaactga tagatatagt cgatcaactc 60 aagaattatg tgaatgactt ggtccctgag tttctgccgg ctccagagga cgttgaaaca 120 aactgtgaat ggtcagcgtt ttcatgtttt caaaaggcac agctcaagtc cgccaataca 180 ggcaataacg agcggattat aaatgtctca attaaaaagc tcaagcgcaa acccccttca 240 acgaatgctg gtcgccgcca gaaacacagg ttgacctgtc cctcctgtga ctcatacgag 300 aagaaacctc ccaaggaatt tctcgaacgc tttaagtcac tcttgcagaa gatgattcat 360 cagcacttga gtagccggac acatggttca gaggatagt 399 <210> 35 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile 1 5 10 15 Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu 20 25 30 Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser 35 40 45 Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu 50 55 60 Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser 65 70 75 80 Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys 85 90 95 Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys 100 105 110 Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His 115 120 125 Gly Ser Glu Asp Ser 130 <210> 36 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 gagtctaagt atggcccacc gtgtcccccc tgccca 36 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 37 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 38 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 gcacctgagt tcctcggagg cccctctgta ttcctgtttc ccccaaagcc caaggatact 60 cttatgatct cacgcactcc ggaagtaacc tgcgtggtgg tggatgtgag tcaggaagac 120 cccgaagtcc agtttaattg gtacgtggac ggggttgagg tacataacgc caaaacgaaa 180 cctcgggagg agcaattcaa ttccacttac cgggttgtat cagtcctgac tgtactgcat 240 caagattggc tcaacgggaa agagtacaag tgtaaggtta gtaataaagg gctgccgtct 300 agtattgaga aaacgatcag taaggctaaa gggcagccaa gagagccaca agtatatacc 360 ctgccaccct ctcaggagga gatgactaaa aaccaagtgt cactgacctg ccttgttaag 420 ggtttttacc catctgatat agcagtagag tgggaatcca atggacagcc agagaacaat 480 tataagacta cacctcccgt ccttgatagt gacggctcct tcttcttgta ttctcgactt 540 acagttgata agtcccgctg gcaggagggt aatgtcttta gctgcagtgt aatgcacgaa 600 gctcttcata atcactacac acaaaaatca ttgagcctgt ctctgggaaa g 651 <210> 39 <211> 217 <212> PRT <213> ARtificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 <210> 40 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 atggccttga ttgtgctcgg cggagttgca ggcctgctcc tttttattgg actcggaata 60 tttttc 66 <210> 41 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 41 Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile 1 5 10 15 Gly Leu Gly Ile Phe Phe 20 <210> 42 <211> 9 <212> DNA <213> ARtificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 42 ggatctgga 9 <210> 43 <211> 3 <212> PRT <213> ARtificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 43 Gly Ser Gly 1 <210> 44 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 44 gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct 57 <210> 45 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 45 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 46 <211> 762 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 46 atggagtacg ctagtgatgc gtccttggac cccgaggcgc catggccacc ggccccgcga 60 gctcgagcct gtcgagtgct gccatgggct ctggtcgctg ggttgctcct ccttctgctt 120 ttggccgcgg cttgtgcagt gtttcttgct tgcccgtggg cagttagcgg tgctcgcgca 180 tctcccggaa gcgcggcgag tcctcgactc agggaaggtc cggagctgag cccagatgac 240 cccgccggtt tgctggacct ccgccaagga atgttcgctc aactcgttgc gcaaaacgta 300 cttcttatag acggccctct tagttggtac agtgacccag gattggctgg cgttagtttg 360 acaggcggac tcagttacaa ggaggatact aaggaactgg tagtcgctaa ggctggggta 420 tactacgtgt tctttcaact cgaactgaga agggtggttg cgggagaagg atctggaagt 480 gtatctctcg ccctgcacct ccaacccctc agaagtgccg ccggagcggc cgcccttgcc 540 cttactgtcg acctgccccc ggcttcttca gaagcgcgaa atagtgcatt cggcttccag 600 gggcgccttt tgcacttgag cgctggacag cgcctcgggg tccacctcca cacggaagcg 660 cgggcgaggc acgcttggca actcacacaa ggtgcgacgg ttctcggctt gtttagggtt 720 acgcctgaga taccggctgg cctcccatct ccaagatccg ag 762 <210> 47 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 47 Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro 1 5 10 15 Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe 35 40 45 Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser 50 55 60 Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp 65 70 75 80 Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val 85 90 95 Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp 100 105 110 Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu 115 120 125 Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe 130 135 140 Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser 145 150 155 160 Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala 165 170 175 Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala 180 185 190 Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala 195 200 205 Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His 210 215 220 Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val 225 230 235 240 Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 245 250 <210> 48 <211> 3 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 48 taa 3 <210> 49 <211> 2040 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 49 atgtggctgc agtctctgct cctcttgggg actgtcgcct gttctatttc acaaggacag 60 gatcgacata tgattcggat gcgccaactg atagatatag tcgatcaact caagaattat 120 gtgaatgact tggtccctga gtttctgccg gctccagagg acgttgaaac aaactgtgaa 180 tggtcagcgt tttcatgttt tcaaaaggca cagctcaagt ccgccaatac aggcaataac 240 gagcggatta taaatgtctc aattaaaaag ctcaagcgca aacccccttc aacgaatgct 300 ggtcgccgcc agaaacacag gttgacctgt ccctcctgtg actcatacga gaagaaacct 360 cccaaggaat ttctcgaacg ctttaagtca ctcttgcaga agatgattca tcagcacttg 420 agtagccgga cacatggttc agaggatagt gagtctaagt atggcccacc gtgtcccccc 480 tgcccagcac ctgagttcct cggaggcccc tctgtattcc tgtttccccc aaagcccaag 540 gatactctta tgatctcacg cactccggaa gtaacctgcg tggtggtgga tgtgagtcag 600 gaagaccccg aagtccagtt taattggtac gtggacgggg ttgaggtaca taacgccaaa 660 acgaaacctc gggaggagca attcaattcc acttaccggg ttgtatcagt cctgactgta 720 ctgcatcaag attggctcaa cgggaaagag tacaagtgta aggttagtaa taaagggctg 780 ccgtctagta ttgagaaaac gatcagtaag gctaaagggc agccaagaga gccacaagta 840 tataccctgc caccctctca ggaggagatg actaaaaacc aagtgtcact gacctgcctt 900 gttaagggtt tttacccatc tgatatagca gtagagtggg aatccaatgg acagccagag 960 aacaattata agactacacc tcccgtcctt gatagtgacg gctccttctt cttgtattct 1020 cgacttacag ttgataagtc ccgctggcag gagggtaatg tctttagctg cagtgtaatg 1080 cacgaagctc ttcataatca ctacacacaa aaatcattga gcctgtctct gggaaagatg 1140 gccttgattg tgctcggcgg agttgcaggc ctgctccttt ttattggact cggaatattt 1200 ttcggatctg gagctactaa cttcagcctg ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac 1260 cctggaccta tggagtacgc tagtgatgcg tccttggacc ccgaggcgcc atggccaccg 1320 gccccgcgag ctcgagcctg tcgagtgctg ccatgggctc tggtcgctgg gttgctcctc 1380 cttctgcttt tggccgcggc ttgtgcagtg tttcttgctt gcccgtgggc agttagcggt 1440 gctcgcgcat ctcccggaag cgcggcgagt cctcgactca gggaaggtcc ggagctgagc 1500 ccagatgacc ccgccggttt gctggacctc cgccaaggaa tgttcgctca actcgttgcg 1560 caaaacgtac ttcttataga cggccctctt agttggtaca gtgacccagg attggctggc 1620 gttagtttga caggcggact cagttacaag gaggatacta aggaactggt agtcgctaag 1680 gctggggtat actacgtgtt ctttcaactc gaactgagaa gggtggttgc gggagaagga 1740 tctggaagtg tatctctcgc cctgcacctc caacccctca gaagtgccgc cggagcggcc 1800 gcccttgccc ttactgtcga cctgcccccg gcttcttcag aagcgcgaaa tagtgcattc 1860 ggcttccagg ggcgcctttt gcacttgagc gctggacagc gcctcggggt ccacctccac 1920 acggaagcgc gggcgaggca cgcttggcaa ctcacacaag gtgcgacggt tctcggcttg 1980 tttagggtta cgcctgagat accggctggc ctcccatctc caagatccga gggatcctaa 2040 <210> 50 <211> 679 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 50 Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp 20 25 30 Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe 35 40 45 Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe 50 55 60 Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn 65 70 75 80 Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro 85 90 95 Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser 100 105 110 Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe 115 120 125 Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr 130 135 140 His Gly Ser Glu Asp Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro 145 150 155 160 Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 165 170 175 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 180 185 190 Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 195 200 205 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 210 215 220 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 225 230 235 240 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 245 250 255 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 260 265 270 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 275 280 285 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 290 295 300 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 305 310 315 320 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 325 330 335 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 340 345 350 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 355 360 365 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Ala Leu Ile Val 370 375 380 Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe 385 390 395 400 Phe Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp 405 410 415 Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu 420 425 430 Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg 435 440 445 Val Leu Pro Trp Ala Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 450 455 460 Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly 465 470 475 480 Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly 485 490 495 Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln 500 505 510 Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly 515 520 525 Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr 530 535 540 Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys 545 550 555 560 Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val 565 570 575 Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro 580 585 590 Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu 595 600 605 Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly 610 615 620 Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His 625 630 635 640 Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr 645 650 655 Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro 660 665 670 Ser Pro Arg Ser Glu Gly Ser 675 <210> 51 <211> 9772 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 51 gcgcgctcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa 60 cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc 120 accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc 180 ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc 240 gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt 300 ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac 360 ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag 420 acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa 480 actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg 540 atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac 600 aaaatattaa cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 660 tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 720 aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 780 ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 840 aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 900 acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 960 ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 1020 gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 1080 atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 1140 acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 1200 tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 1260 ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 1320 aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 1380 aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 1440 ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 1500 atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 1560 aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 1620 accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 1680 tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 1740 tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 1800 tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 1860 cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 1920 caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 1980 cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 2040 cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 2100 gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 2160 acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 2220 atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 2280 cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 2340 gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 2400 tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 2460 tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg 2520 agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc 2580 ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg 2640 gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac 2700 actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag 2760 gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa 2820 agctggagct gcaagcttaa tgtagtctta tgcaatactc ttgtagtctt gcaacatggt 2880 aacgatgagt tagcaacatg ccttacaagg agagaaaaag caccgtgcat gccgattggt 2940 ggaagtaagg tggtacgatc gtgccttatt aggaaggcaa cagacgggtc tgacatggat 3000 tggacgaacc actgaattgc cgcattgcag agatattgta tttaagtgcc tagctcgata 3060 cataaacggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg 3120 gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg 3180 tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat 3240 ctctagcagt ggcgcccgaa cagggacttg aaagcgaaag ggaaaccaga ggagctctct 3300 cgacgcagga ctcggcttgc tgaagcgcgc acggcaagag gcgaggggcg gcgactggtg 3360 agtacgccaa aaattttgac tagcggaggc tagaaggaga gagatgggtg cgagagcgtc 3420 agtattaagc gggggagaat tagatcgcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga 3480 aagaaaaaat ataaattaaa acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca 3540 gttaatcctg gcctgttaga aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa 3600 ccatcccttc agacaggatc agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc 3660 tattgtgtgc atcaaaggat agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag 3720 gaagagcaaa acaaaagtaa gaccaccgca cagcaagcgg ccgctgatct tcagacctgg 3780 aggaggagat atgagggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat 3840 tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag 3900 agcagtggga ataggagctt tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg 3960 cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca 4020 gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg 4080 gggcatcaag cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca 4140 gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa 4200 tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca gatttggaat cacacgacct ggatggagtg 4260 ggacagagaa attaacaatt acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa 4320 ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa 4380 ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg 4440 cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg 4500 atattcacca ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg aggggacccg acaggcccga 4560 aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg 4620 atctcgacgg tatcgattag actgtagccc aggaatatgg cagctagatt gtacacattt 4680 agaaggaaaa gttatcttgg tagcagttca tgtagccagt ggatatatag aagcagaagt 4740 aattccagca gagacagggc aagaaacagc atacttcctc ttaaaattag caggaagatg 4800 gccagtaaaa acagtacata cagacaatgg cagcaatttc accagtacta cagttaaggc 4860 cgcctgttgg tgggcgggga tcaagcagga atttggcatt ccctacaatc cccaaagtca 4920 aggagtaata gaatctatga ataaagaatt aaagaaaatt ataggacagg taagagatca 4980 ggctgaacat cttaagacag cagtacaaat ggcagtattc atccacaatt ttaaaagaaa 5040 aggggggatt ggggggtaca gtgcagggga aagaatagta gacataatag caacagacat 5100 acaaactaaa gaattacaaa aacaaattac aaaaattcaa aattttcggg tttattacag 5160 ggacagcaga gatccagttt ggctgcattg atcacgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg 5220 gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc 5280 ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc 5340 ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt 5400 tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct 5460 ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacctg gctgcagtac 5520 gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct 5580 taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc 5640 gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt 5700 taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg 5760 ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt 5820 gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga 5880 cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc 5940 gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg 6000 ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg 6060 gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt 6120 gactccactg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt agttctcgag cttttggagt 6180 acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg 6240 gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt 6300 tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag tggttcaaag tttttttctt 6360 ccatttcagg tgtcgtgatc tagaggatca ctagtaccat gtggctgcag tctctgctcc 6420 tcttggggac tgtcgcctgt tctatttcac aaggacagga tcgacatatg attcggatgc 6480 gccaactgat agatatagtc gatcaactca agaattatgt gaatgacttg gtccctgagt 6540 ttctgccggc tccagaggac gttgaaacaa actgtgaatg gtcagcgttt tcatgttttc 6600 aaaaggcaca gctcaagtcc gccaatacag gcaataacga gcggattata aatgtctcaa 6660 ttaaaaagct caagcgcaaa cccccttcaa cgaatgctgg tcgccgccag aaacacaggt 6720 tgacctgtcc ctcctgtgac tcatacgaga agaaacctcc caaggaattt ctcgaacgct 6780 ttaagtcact cttgcagaag atgattcatc agcacttgag tagccggaca catggttcag 6840 aggatagtga gtctaagtat ggcccaccgt gtcccccctg cccagcacct gagttcctcg 6900 gaggcccctc tgtattcctg tttcccccaa agcccaagga tactcttatg atctcacgca 6960 ctccggaagt aacctgcgtg gtggtggatg tgagtcagga agaccccgaa gtccagttta 7020 attggtacgt ggacggggtt gaggtacata acgccaaaac gaaacctcgg gaggagcaat 7080 tcaattccac ttaccgggtt gtatcagtcc tgactgtact gcatcaagat tggctcaacg 7140 ggaaagagta caagtgtaag gttagtaata aagggctgcc gtctagtatt gagaaaacga 7200 tcagtaaggc taaagggcag ccaagagagc cacaagtata taccctgcca ccctctcagg 7260 aggagatgac taaaaaccaa gtgtcactga cctgccttgt taagggtttt tacccatctg 7320 atatagcagt agagtgggaa tccaatggac agccagagaa caattataag actacacctc 7380 ccgtccttga tagtgacggc tccttcttct tgtattctcg acttacagtt gataagtccc 7440 gctggcagga gggtaatgtc tttagctgca gtgtaatgca cgaagctctt cataatcact 7500 acacacaaaa atcattgagc ctgtctctgg gaaagatggc cttgattgtg ctcggcggag 7560 ttgcaggcct gctccttttt attggactcg gaatattttt cggatctgga gctactaact 7620 tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg gagtacgcta 7680 gtgatgcgtc cttggacccc gaggcgccat ggccaccggc cccgcgagct cgagcctgtc 7740 gagtgctgcc atgggctctg gtcgctgggt tgctcctcct tctgcttttg gccgcggctt 7800 gtgcagtgtt tcttgcttgc ccgtgggcag ttagcggtgc tcgcgcatct cccggaagcg 7860 cggcgagtcc tcgactcagg gaaggtccgg agctgagccc agatgacccc gccggtttgc 7920 tggacctccg ccaaggaatg ttcgctcaac tcgttgcgca aaacgtactt cttatagacg 7980 gccctcttag ttggtacagt gacccaggat tggctggcgt tagtttgaca ggcggactca 8040 gttacaagga ggatactaag gaactggtag tcgctaaggc tggggtatac tacgtgttct 8100 ttcaactcga actgagaagg gtggttgcgg gagaaggatc tggaagtgta tctctcgccc 8160 tgcacctcca acccctcaga agtgccgccg gagcggccgc ccttgccctt actgtcgacc 8220 tgcccccggc ttcttcagaa gcgcgaaata gtgcattcgg cttccagggg cgccttttgc 8280 acttgagcgc tggacagcgc ctcggggtcc acctccacac ggaagcgcgg gcgaggcacg 8340 cttggcaact cacacaaggt gcgacggttc tcggcttgtt tagggttacg cctgagatac 8400 cggctggcct cccatctcca agatccgagg gatcctaaat cgggctagcg tcgacaatca 8460 acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg ttgctccttt 8520 tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc 8580 tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc 8640 cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg 8700 gggcattgcc accacctgtc agctcctttc cgggactttc gctttccccc tccctattgc 8760 cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg 8820 cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa gctgacgtcc tttccatggc tgctcgcctg 8880 tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc 8940 agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct 9000 tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcctggaa ttcgagctcg 9060 gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggca gctgtagatc ttagccactt tttaaaagaa 9120 aaggggggac tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt 9180 actgggtctc tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac 9240 ccactgctta agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg 9300 ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct 9360 agcagtagta gttcatgtca tcttattatt cagtatttat aacttgcaaa gaaatgaata 9420 tcagagagtg agaggaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc 9480 atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa 9540 ctcatcaatg tatcttatca tgtctggctc tagctatccc gcccctaact ccgcccatcc 9600 cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta 9660 tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct 9720 tttttggagg cctagggacg tacccaattc gccctatagt gagtcgtatt ac 9772 <210> 52 <211> 8436 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 52 gcgcgctcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa 60 cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc 120 accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc 180 ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc 240 gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt 300 ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac 360 ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag 420 acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa 480 actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg 540 atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac 600 aaaatattaa cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 660 tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 720 aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 780 ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 840 aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 900 acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 960 ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 1020 gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 1080 atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 1140 acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 1200 tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 1260 ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 1320 aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 1380 aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 1440 ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 1500 atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 1560 aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 1620 accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 1680 tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 1740 tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 1800 tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 1860 cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 1920 caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 1980 cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 2040 cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 2100 gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 2160 acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 2220 atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 2280 cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 2340 gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 2400 tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 2460 tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg 2520 agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc 2580 ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg 2640 gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac 2700 actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag 2760 gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa 2820 agctggagct gcaagcttaa tgtagtctta tgcaatactc ttgtagtctt gcaacatggt 2880 aacgatgagt tagcaacatg ccttacaagg agagaaaaag caccgtgcat gccgattggt 2940 ggaagtaagg tggtacgatc gtgccttatt aggaaggcaa cagacgggtc tgacatggat 3000 tggacgaacc actgaattgc cgcattgcag agatattgta tttaagtgcc tagctcgata 3060 cataaacggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg 3120 gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg 3180 tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat 3240 ctctagcagt ggcgcccgaa cagggacttg aaagcgaaag ggaaaccaga ggagctctct 3300 cgacgcagga ctcggcttgc tgaagcgcgc acggcaagag gcgaggggcg gcgactggtg 3360 agtacgccaa aaattttgac tagcggaggc tagaaggaga gagatgggtg cgagagcgtc 3420 agtattaagc gggggagaat tagatcgcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga 3480 aagaaaaaat ataaattaaa acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca 3540 gttaatcctg gcctgttaga aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa 3600 ccatcccttc agacaggatc agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc 3660 tattgtgtgc atcaaaggat agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag 3720 gaagagcaaa acaaaagtaa gaccaccgca cagcaagcgg ccgctgatct tcagacctgg 3780 aggaggagat atgagggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat 3840 tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag 3900 agcagtggga ataggagctt tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg 3960 cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca 4020 gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg 4080 gggcatcaag cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca 4140 gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa 4200 tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca gatttggaat cacacgacct ggatggagtg 4260 ggacagagaa attaacaatt acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa 4320 ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa 4380 ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg 4440 cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg 4500 atattcacca ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg aggggacccg acaggcccga 4560 aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg 4620 atctcgacgg tatcgattag actgtagccc aggaatatgg cagctagatt gtacacattt 4680 agaaggaaaa gttatcttgg tagcagttca tgtagccagt ggatatatag aagcagaagt 4740 aattccagca gagacagggc aagaaacagc atacttcctc ttaaaattag caggaagatg 4800 gccagtaaaa acagtacata cagacaatgg cagcaatttc accagtacta cagttaaggc 4860 cgcctgttgg tgggcgggga tcaagcagga atttggcatt ccctacaatc cccaaagtca 4920 aggagtaata gaatctatga ataaagaatt aaagaaaatt ataggacagg taagagatca 4980 ggctgaacat cttaagacag cagtacaaat ggcagtattc atccacaatt ttaaaagaaa 5040 aggggggatt ggggggtaca gtgcagggga aagaatagta gacataatag caacagacat 5100 acaaactaaa gaattacaaa aacaaattac aaaaattcaa aattttcggg tttattacag 5160 ggacagcaga gatccagttt ggctgcattg atcacgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg 5220 gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc 5280 ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc 5340 ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt 5400 tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct 5460 ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacctg gctgcagtac 5520 gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct 5580 taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc 5640 gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt 5700 taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg 5760 ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt 5820 gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga 5880 cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc 5940 gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg 6000 ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg 6060 gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt 6120 gactccactg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt agttctcgag cttttggagt 6180 acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg 6240 gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt 6300 tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag tggttcaaag tttttttctt 6360 ccatttcagg tgtcgtgatc tagaggatcc accatggtga gcaagggcga ggagctgttc 6420 accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc 6480 gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc 6540 accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg 6600 cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg 6660 cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc 6720 cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc 6780 gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac 6840 aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc 6900 cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc 6960 ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc 7020 aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg 7080 atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taagtcgaca atcaacctct ggattacaaa 7140 atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac 7200 gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc 7260 ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt 7320 ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc 7380 tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc 7440 gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg 7500 gtgttgtcgg ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt 7560 ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc 7620 cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt 7680 cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct ggaattcgag ctcggtacct ttaagaccaa 7740 tgacttacaa ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag 7800 ggctaattca ctcccaacga agacaagatc tgctttttgc ttgtactggg tctctctggt 7860 tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc 7920 aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta 7980 actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt agtagttcat 8040 gtcatcttat tattcagtat ttataacttg caaagaaatg aatatcagag agtgagagga 8100 acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 8160 ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 8220 atcatgtctg gctctagcta tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc 8280 cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga 8340 ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg 8400 gacgtaccca attcgcccta tagtgagtcg tattac 8436 <210> 53 <211> 8384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 53 tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 60 gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 120 taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 180 aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 240 atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 300 tacgccaagc gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggagct gcaagcttaa 360 tgtagtctta tgcaatactc ttgtagtctt gcaacatggt aacgatgagt tagcaacatg 420 ccttacaagg agagaaaaag caccgtgcat gccgattggt ggaagtaagg tggtacgatc 480 gtgccttatt aggaaggcaa cagacgggtc tgacatggat tggacgaacc actgaattgc 540 cgcattgcag agatattgta tttaagtgcc tagctcgata caataaacgg gtctctctgg 600 ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 660 caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 720 aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 780 acagggacct gaaagcgaaa gggaaaccag agctctctcg acgcaggact cggcttgctg 840 aagcgcgcac ggcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa attttgacta 900 gcggaggcta gaaggagaga gatgggtgcg agagcgtcag tattaagcgg gggagaatta 960 gatcgcgatg ggaaaaaatt cggttaaggc cagggggaaa gaaaaaatat aaattaaaac 1020 atatagtatg ggcaagcagg gagctagaac gattcgcagt taatcctggc ctgttagaaa 1080 catcagaagg ctgtagacaa atactgggac agctacaacc atcccttcag acaggatcag 1140 aagaacttag atcattatat aatacagtag caaccctcta ttgtgtgcat caaaggatag 1200 agataaaaga caccaaggaa gctttagaca agatagagga agagcaaaac aaaagtaaga 1260 ccaccgcaca gcaagcggcc gctgatcttc agacctggag gaggagatat gagggacaat 1320 tggagaagtg aattatataa atataaagta gtaaaaattg aaccattagg agtagcaccc 1380 accaaggcaa agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg 1440 ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcctcaat gacgctgacg 1500 gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct 1560 attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca 1620 agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc 1680 tctggaaaac tcatttgcac cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag taataaatct 1740 ctggaacaga ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 1800 caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 1860 aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 1920 tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 1980 ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 2040 cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag 2100 agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc tcgacggtat cgattagact 2160 gtagcccagg aatatggcag ctagattgta cacatttaga aggaaaagtt atcttggtag 2220 cagttcatgt agccagtgga tatatagaag cagaagtaat tccagcagag acagggcaag 2280 aaacagcata cttcctctta aaattagcag gaagatggcc agtaaaaaca gtacatacag 2340 acaatggcag caatttcacc agtactacag ttaaggccgc ctgttggtgg gcggggatca 2400 agcaggaatt tggcattccc tacaatcccc aaagtcaagg agtaatagaa tctatgaata 2460 aagaattaaa gaaaattata ggacaggtaa gagatcaggc tgaacatctt aagacagcag 2520 tacaaatggc agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg 2580 caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac 2640 aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga cagcagagat ccagtttggc 2700 tgcatacgcg tcgtgaggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt 2760 ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg 2820 ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga 2880 accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag 2940 aacacaggta agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc 3000 ttgcgtgcct tgaattactt ccacctggct gcagtacgtg attcttgatc ccgagcttcg 3060 ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa ggagcccctt cgcctcgtgc 3120 ttgagttgag gcctggcctg ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt ggcaccttcg 3180 cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa aatttttgat gacctgctgc 3240 gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc caagatctgc acactggtat 3300 ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc 3360 gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc aagctggccg 3420 gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct 3480 ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc ctgctgcagg 3540 gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag 3600 gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac tccactgagt accgggcgcc 3660 gtccaggcac ctcgattagt tctcgtgctt ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga 3720 ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc 3780 ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt gagtttggat cttggttcat 3840 tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt cgtgagctag 3900 actagtacca tggacatgcg ggtgcctgca caacttctgg gcctgctgtt gttgtggctg 3960 tctggagccc ggtgtaattg ggtaaatgtt atcagtgatc tcaagaagat agaggatctc 4020 atccagtcca tgcatattga tgccacgctg tacacagaaa gcgatgtgca tcctagctgt 4080 aaggtgacag cgatgaagtg ttttcttttg gagctgcagg taattagtct tgagtccggc 4140 gatgccagca ttcatgatac cgtagaaaac ttgattatcc tggccaacaa ttctctgtcc 4200 tcaaacggaa acgtaaccga gagcggttgt aaagaatgtg aagaactgga agaaaagaac 4260 atcaaggagt ttctgcaatc attcgttcac atcgtacaaa tgttcataaa tacgtcagga 4320 tctggttctg gttccggaag tggatctggt tcagggtccg gtagtggatc tgggtcagga 4380 agtggaagcg gtagtgggtc tggatctaaa caagagcact ttcctgataa cctgttgccg 4440 agctgggcga ttacgcttat cagtgtaaac ggcatctttg taatatgctg tctgacctac 4500 tgcttcgcac caaggtgccg ggagagaagg agaaatgaaa gactgagaag ggagagcgtg 4560 agacctgtgg gatcctaagc tagcgtcggc aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa 4620 agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta 4680 atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa 4740 tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg 4800 tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc 4860 ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc 4920 cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg 4980 gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg 5040 acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg 5100 ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc 5160 ctttgggccg cctccccgcc tggaattcga gctcggtacc tttaagacca atgacttaca 5220 aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc 5280 actcccaacg aagacaagat ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg ttagaccaga 5340 tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct 5400 tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat 5460 ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tagtagttca tgtcatctta 5520 ttattcagta tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga gagtgagagg aacttgttta 5580 ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 5640 ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 5700 ggctctagct atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg 5760 actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa 5820 gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcgtc gagacgtacc caattcgccc 5880 tatagtgagt cgtattacgc gcgctcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa 5940 aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt 6000 aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa 6060 tggcgcgacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc 6120 gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt 6180 ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc 6240 cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt 6300 agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt 6360 aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt 6420 gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa 6480 aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa tttcccaggt ggcacttttc 6540 ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 6600 cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 6660 gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 6720 ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 6780 tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 6840 aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta 6900 ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 6960 agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 7020 gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 7080 gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 7140 gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 7200 tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 7260 ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 7320 cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 7380 gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 7440 cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 7500 tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 7560 aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 7620 aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 7680 gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 7740 cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 7800 ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc 7860 accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 7920 tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 7980 cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 8040 gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 8100 ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 8160 cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 8220 tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 8280 ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 8340 ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcc 8384 <210> 54 <211> 9161 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 54 tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 60 gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 120 taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 180 aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 240 atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 300 tacgccaagc gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggagct gcaagcttaa 360 tgtagtctta tgcaatactc ttgtagtctt gcaacatggt aacgatgagt tagcaacatg 420 ccttacaagg agagaaaaag caccgtgcat gccgattggt ggaagtaagg tggtacgatc 480 gtgccttatt aggaaggcaa cagacgggtc tgacatggat tggacgaacc actgaattgc 540 cgcattgcag agatattgta tttaagtgcc tagctcgata caataaacgg gtctctctgg 600 ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 660 caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 720 aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 780 acagggacct gaaagcgaaa gggaaaccag agctctctcg acgcaggact cggcttgctg 840 aagcgcgcac ggcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa attttgacta 900 gcggaggcta gaaggagaga gatgggtgcg agagcgtcag tattaagcgg gggagaatta 960 gatcgcgatg ggaaaaaatt cggttaaggc cagggggaaa gaaaaaatat aaattaaaac 1020 atatagtatg ggcaagcagg gagctagaac gattcgcagt taatcctggc ctgttagaaa 1080 catcagaagg ctgtagacaa atactgggac agctacaacc atcccttcag acaggatcag 1140 aagaacttag atcattatat aatacagtag caaccctcta ttgtgtgcat caaaggatag 1200 agataaaaga caccaaggaa gctttagaca agatagagga agagcaaaac aaaagtaaga 1260 ccaccgcaca gcaagcggcc gctgatcttc agacctggag gaggagatat gagggacaat 1320 tggagaagtg aattatataa atataaagta gtaaaaattg aaccattagg agtagcaccc 1380 accaaggcaa agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg 1440 ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcctcaat gacgctgacg 1500 gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct 1560 attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca 1620 agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc 1680 tctggaaaac tcatttgcac cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag taataaatct 1740 ctggaacaga ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 1800 caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 1860 aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 1920 tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 1980 ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 2040 cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag 2100 agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc tcgacggtat cgattagact 2160 gtagcccagg aatatggcag ctagattgta cacatttaga aggaaaagtt atcttggtag 2220 cagttcatgt agccagtgga tatatagaag cagaagtaat tccagcagag acagggcaag 2280 aaacagcata cttcctctta aaattagcag gaagatggcc agtaaaaaca gtacatacag 2340 acaatggcag caatttcacc agtactacag ttaaggccgc ctgttggtgg gcggggatca 2400 agcaggaatt tggcattccc tacaatcccc aaagtcaagg agtaatagaa tctatgaata 2460 aagaattaaa gaaaattata ggacaggtaa gagatcaggc tgaacatctt aagacagcag 2520 tacaaatggc agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg 2580 caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac 2640 aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga cagcagagat ccagtttggc 2700 tgcatacgcg tcgtgaggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt 2760 ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg 2820 ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga 2880 accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag 2940 aacacaggta agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc 3000 ttgcgtgcct tgaattactt ccacctggct gcagtacgtg attcttgatc ccgagcttcg 3060 ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa ggagcccctt cgcctcgtgc 3120 ttgagttgag gcctggcctg ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt ggcaccttcg 3180 cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa aatttttgat gacctgctgc 3240 gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc caagatctgc acactggtat 3300 ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc 3360 gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc aagctggccg 3420 gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct 3480 ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc ctgctgcagg 3540 gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag 3600 gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac tccactgagt accgggcgcc 3660 gtccaggcac ctcgattagt tctcgtgctt ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga 3720 ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc 3780 ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt gagtttggat cttggttcat 3840 tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt cgtgagctag 3900 actagtacca tggacatgcg ggtgcctgca caacttctgg gcctgctgtt gttgtggctg 3960 tctggagccc ggtgtaattg ggtaaatgtt atcagtgatc tcaagaagat agaggatctc 4020 atccagtcca tgcatattga tgccacgctg tacacagaaa gcgatgtgca tcctagctgt 4080 aaggtgacag cgatgaagtg ttttcttttg gagctgcagg taattagtct tgagtccggc 4140 gatgccagca ttcatgatac cgtagaaaac ttgattatcc tggccaacaa ttctctgtcc 4200 tcaaacggaa acgtaaccga gagcggttgt aaagaatgtg aagaactgga agaaaagaac 4260 atcaaggagt ttctgcaatc attcgttcac atcgtacaaa tgttcataaa tacgtcagga 4320 tctggttctg gttccggaag tggatctggt tcagggtccg gtagtggatc tgggtcagga 4380 agtggaagcg gtagtgggtc tggatctaaa caagagcact ttcctgataa cctgttgccg 4440 agctgggcga ttacgcttat cagtgtaaac ggcatctttg taatatgctg tctgacctac 4500 tgcttcgcac caaggtgccg ggagagaagg agaaatgaaa gactgagaag ggagagcgtg 4560 agacctgtgg gatcctccca tcactggggg tacggcaaac acaacggacc tgagcactgg 4620 cataaggact tccccattgc caagggagag cgccagtccc ctgttgacat cgacactcat 4680 acagccaagt atgacccttc cctgaagccc ctgtctgttt cctatgatca agcaacttcc 4740 ctgagaatcc tcaacaatgg tcatgctttc aacgtggagt ttgatgactc tcaggacaaa 4800 gcagtgctca agggaggacc cctggatggc acttacagat tgattcagtt tcactttcac 4860 tggggttcac ttgatggaca aggttcagag catactgtgg ataaaaagaa atatgctgca 4920 gaacttcact tggttcactg gaacaccaaa tatggggatt ttgggaaagc tgtgcagcaa 4980 cctgatggac tggccgttct aggtattttt ttgaaggttg gcagcgctaa accgggccat 5040 cagaaagttg ttgatgtgct ggattccatt aaaacaaagg gcaagagtgc tgacttcact 5100 aacttcgatc ctcgtggcct ccttcctgaa tccctggatt actggaccta cccaggctca 5160 ctgaccaccc ctcctcttct ggaatgtgtg acctggattg tgctcaagga acccatcagc 5220 gtcagcagcg agcaggtgtt gaaattccgt aaacttaact tcaatgggga gggtgaaccc 5280 gaagaactga tggtggacaa ctggcgccca gctcagccac tgaagaacag gcaaatcaaa 5340 gcttccttca aataagctag cgtcgacaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga 5400 ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg 5460 cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc 5520 tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc 5580 actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt 5640 tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt 5700 gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg 5760 aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg 5820 tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg 5880 ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt 5940 tgggccgcct ccccgcctgg aattcgagct cggtaccttt aagaccaatg acttacaagg 6000 cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact 6060 cccaacgaag acaagatctg ctttttgctt gtactgggtc tctctggtta gaccagatct 6120 gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc 6180 cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc 6240 tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag tagttcatgt catcttatta 6300 ttcagtattt ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag tgagaggaac ttgtttattg 6360 cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 6420 tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctggc 6480 tctagctatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact 6540 aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta 6600 gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcgtcgag acgtacccaa ttcgccctat 6660 agtgagtcgt attacgcgcg ctcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac 6720 cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat 6780 agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg 6840 cgcgacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg 6900 accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc 6960 gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga 7020 tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt 7080 gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat 7140 agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat 7200 ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 7260 tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt cccaggtggc acttttcggg 7320 gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 7380 tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta 7440 ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg 7500 ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg 7560 gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac 7620 gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg 7680 acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt 7740 actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg 7800 ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac 7860 cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt 7920 gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag 7980 caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc 8040 aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc 8100 ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta 8160 tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg 8220 ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 8280 ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 8340 ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 8400 tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 8460 cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 8520 taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 8580 gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc 8640 acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 8700 ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 8760 ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 8820 cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 8880 aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 8940 gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 9000 gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 9060 gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc 9120 ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc c 9161 <210> 55 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 55 Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp His 1 5 10 15 Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp Ile 20 25 30 Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser Val 35 40 45 Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His Ala 50 55 60 Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys Gly 65 70 75 80 Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His Trp 85 90 95 Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys Lys 100 105 110 Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly Asp 115 120 125 Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly Ile 130 135 140 Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val Asp 145 150 155 160 Val Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr Asn 165 170 175 Phe Asp Pro Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr Tyr 180 185 190 Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp Ile 195 200 205 Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys Phe 210 215 220 Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met Val 225 230 235 240 Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys Ala 245 250 255 Ser Phe Lys <210> 56 <211> 260 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 56 Met Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp 1 5 10 15 His Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp 20 25 30 Ile Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser 35 40 45 Val Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Asn Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His 50 55 60 Ala Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys 65 70 75 80 Gly Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His 85 90 95 Trp Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys 100 105 110 Lys Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly 115 120 125 Asp Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly 130 135 140 Ile Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val 145 150 155 160 Asp Val Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr 165 170 175 Asn Phe Asp Pro Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr 180 185 190 Tyr Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp 195 200 205 Ile Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys 210 215 220 Phe Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met 225 230 235 240 Val Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys 245 250 255 Ala Ser Phe Lys 260 <210> 57 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 57 Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp His 1 5 10 15 Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp Ile 20 25 30 Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser Val 35 40 45 Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Asn Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His Ala 50 55 60 Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys Gly 65 70 75 80 Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His Trp 85 90 95 Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys Lys 100 105 110 Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly Asp 115 120 125 Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly Ile 130 135 140 Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val Asp 145 150 155 160 Val Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr Asn 165 170 175 Phe Asp Pro Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr Tyr 180 185 190 Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp Ile 195 200 205 Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys Phe 210 215 220 Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met Val 225 230 235 240 Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys Ala 245 250 255 Ser Phe Lys <210> 58 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 58 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser <210> 59 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 59 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 <210> 60 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 60 Met Gly Leu Val Arg Arg Gly Ala Arg Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg 1 5 10 15 Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser Gly Phe Met 20 25 30 Ala

Claims (37)

  1. 막-결합 인터류킨 15(membrane-bound interleukin 15: mbIL15)를 발현하도록 조작된 종양 침윤성 림프구(tumor-infiltrating lymphocyte: TIL).
  2. 제1항에 있어서, 상기 mbIL15는 약물 반응성 도메인에 작동 가능하게 연결된, TIL.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 TIL은 외인성 사이토카인의 부재하에 확장될 수 있는, TIL.
  4. 제3항에 있어서, 상기 외인성 사이토카인은 IL2인, TIL.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 복수의 TIL을 포함하는 TIL의 집단.
  6. 제5항에 있어서, 적어도 상기 TIL의 하위집단은 확장을 겪은, TIL의 집단.
  7. 막-결합 인터류킨 15(mbIL15)를 발현하도록 조작된 확장된 종양 침윤성 림프구(TIL).
  8. 제7항에 있어서, 상기 mbIL15는 약물 반응성 도메인(drug responsive domain: DRD)에 작동 가능하게 연결된, 확장된 TIL.
  9. 제7항 또는 제8항의 복수의 TIL을 포함하는 확장된 TIL의 집단.
  10. 제9항에 있어서, 상기 확장된 TIL의 집단은 비확장된 TIL의 대조군 집단에서 CD8+ 세포의 비율과 비교하여 더 큰 비율의 CD8+ 세포를 갖는, 확장된 TIL의 집단.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 확장된 TIL의 집단은 비확장된 TIL의 대조군 집단에서 CD4+ 세포의 비율과 비교하여 더 적은 비율의 CD4+ 세포를 갖는, 확장된 TIL의 집단.
  12. 제9항에 있어서, 상기 확장된 TIL의 집단은 비확장된 TIL의 대조군 집단의 CD8:CD4 비보다 더 큰 CD8:CD4 비를 갖는, 확장된 TIL의 집단.
  13. 제9항에 있어서, 상기 확장된 TIL의 집단은 비확장된 TIL의 대조군 집단에서 PD1+ 세포의 비율과 비교하여 더 적은 비율의 PD1+ 세포를 갖는, 확장된 TIL의 집단.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 확장된 TIL의 집단은 비확장된 TIL의 대조군 집단에서 종양 괴사 인자 α(TNFα) 및 인터페론 γ(IFNγ) 둘 다를 생산하는 TIL의 비율과 비교하여 종양 괴사 인자 α(TNFα) 및 인터페론 γ(IFNγ) 둘 다를 생산하는 더 큰 비율의 세포를 갖는, 확장된 TIL의 집단.
  15. 혼합된 TIL의 집단으로서,
    (a) 비변형된 TIL의 하위집단, 및
    (b) 막 결합 IL15(mbIL15)를 포함하는 변형된 TIL의 하위집단
    을 포함하는, 혼합된 TIL의 집단.
  16. 제15항에 있어서, 상기 mbIL15는 약물 반응성 도메인에 작동 가능하게 연결된, 혼합된 TIL의 집단.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 변형된 TIL의 하위집단은 K562 피더 세포, 41BBL 및 IL21의 존재하에 확장되는, 혼합된 TIL의 집단.
  18. 제17항에 있어서, 상기 변형된 TIL의 하위집단은 K562 피더 세포, 41BBL 및 IL21의 존재하에 비형질전환된 TIL의 하위집단보다 더 많이 확장되는, 혼합된 TIL의 집단.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 변형된 TIL의 하위집단의 확장은 인터류킨 2(IL2)의 부재하에 발생하는, 혼합된 TIL의 집단.
  20. 막-결합 인터류킨 15(mbIL15)을 발현하도록 조작된 종양 침윤성 림프구(TIL)를 제조하는 방법으로서, 벡터를 TIL에 형질도입시키는 단계를 포함하되, 상기 벡터는 IL15를 암호화하는 제1 핵산 서열 및 막관통 도메인을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터는 개코원숭이 내인성 레트로바이러스 외피(baboon endogenous retroviral envelope: BaEV) 유사형 렌티바이러스 벡터인, 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터는 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus: GALV) 외피 유사형 감마-레트로바이러스 벡터인, 방법.
  26. IL15를 암호화하는 제1 핵산 서열 및 막관통 도메인을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는 개코원숭이 내인성 레트로바이러스 외피(BaEV) 유사형 렌티바이러스 벡터.
  27. IL15를 암호화하는 제1 핵산 서열 및 막관통 도메인을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GALV) 외피 유사형 감마-레트로바이러스 벡터.
  28. 약제학적 조성물로서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 TIL, 제5항 또는 제6항의 TIL의 집단, 제7항 또는 제8항의 확장된 TIL, 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항의 확장된 TIL의 집단 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항의 혼합된 TIL의 집단을 포함하는, 약제학적 조성물.
  29. 암이 있는 수용 대상체(recipient subject)를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 TIL, 제5항 또는 제6항의 TIL의 집단, 제7항 또는 제8항의 확장된 TIL, 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항의 확장된 TIL의 집단, 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항의 혼합된 TIL의 집단 또는 제28항의 약제학적 조성물을 상기 수용 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 리간드를 상기 수용 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하되, 상기 리간드는 mbIL15에 작동 가능하게 연결된 약물 반응성 도메인(DRD)에 결합하는, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 수용 대상체에게 IL2는 투여되지 않는, 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 종양으로부터 하나 이상의 TIL을 단리하는 단계 및 IL15를 발현하는 핵산을 하나 이상의 TIL에 도입하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 TIL은 상기 수용 대상체의 종양으로부터 단리된, 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 TIL은 공여 대상체로부터의 종양으로부터 단리되되, 상기 공여 대상체는 상기 수용 대상체가 아닌, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 공여 대상체의 상기 종양으로부터 단리된 TIL은 상기 수용 대상체의 상기 종양에 존재하는 암 항원에 특이적인 하나 이상의 T-세포 수용체(T-cell receptor: TCR)를 포함하는, 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 수용 대상체에 대해 HLA 일치인 공여 대상체를 선택하는 방법을 더 포함하는, 방법.
  37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용 대상체는 상기 TIL의 투여 전 림프구가 고갈된, 방법.
KR1020237026018A 2021-01-19 2022-01-18 막 결합된 인터류킨 15를 갖는 종양 침윤성 림프구및 이의 용도 KR20230135086A (ko)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163139305P 2021-01-19 2021-01-19
US63/139,305 2021-01-19
US202163153367P 2021-02-24 2021-02-24
US63/153,367 2021-02-24
US202163226114P 2021-07-27 2021-07-27
US63/226,114 2021-07-27
US202163244166P 2021-09-14 2021-09-14
US63/244,166 2021-09-14
PCT/US2022/070227 WO2022159939A1 (en) 2021-01-19 2022-01-18 Tumor-infiltrating lymphocytes with membrane bound interleukin 15 and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230135086A true KR20230135086A (ko) 2023-09-22

Family

ID=80222452

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237026018A KR20230135086A (ko) 2021-01-19 2022-01-18 막 결합된 인터류킨 15를 갖는 종양 침윤성 림프구및 이의 용도
KR1020237026012A KR20230133869A (ko) 2021-01-19 2022-01-18 T 세포 및 종양 침윤성 림프구의 확장을 위한 조성물및 방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237026012A KR20230133869A (ko) 2021-01-19 2022-01-18 T 세포 및 종양 침윤성 림프구의 확장을 위한 조성물및 방법

Country Status (9)

Country Link
US (4) US20240108722A1 (ko)
EP (2) EP4281104A1 (ko)
JP (2) JP2024503113A (ko)
KR (2) KR20230135086A (ko)
AU (2) AU2022210485A1 (ko)
CA (2) CA3205293A1 (ko)
CO (2) CO2023009868A2 (ko)
MX (2) MX2023008481A (ko)
WO (2) WO2022159935A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023141436A1 (en) * 2022-01-18 2023-07-27 Obsidian Therapeutics, Inc. Methods for identifying and using allogeneic tumor infiltrating lymphocytes to treat cancer
WO2023220608A1 (en) * 2022-05-10 2023-11-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8173792B2 (en) 2007-02-09 2012-05-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for regulating protein function in cells using synthetic small molecules
US8530636B2 (en) 2008-05-07 2013-09-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for regulating protein function in cells in vivo using synthetic small molecules
WO2014186469A2 (en) * 2013-05-14 2014-11-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
WO2015152813A1 (en) 2014-04-03 2015-10-08 Deniz Kirik Gene expression system and regulation thereof
AU2015259877B2 (en) * 2014-05-15 2021-02-25 National University Of Singapore Modified natural killer cells and uses thereof
WO2017156238A1 (en) 2016-03-11 2017-09-14 President And Fellows Of Harvard College Protein stability-based small molecule biosensors and methods
US11446398B2 (en) 2016-04-11 2022-09-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
MX2018012615A (es) 2016-04-15 2019-05-30 Novartis Ag Composiciones y metodos para la expresion selectiva de proteinas.
EP4273248A3 (en) 2016-05-20 2024-01-10 Braingene AB Destabilising domains for conditionally stabilising a protein
US11629340B2 (en) 2017-03-03 2023-04-18 Obsidian Therapeutics, Inc. DHFR tunable protein regulation
WO2018161000A1 (en) 2017-03-03 2018-09-07 Obsidian Therapeutics, Inc. Dhfr tunable protein regulation
WO2018161038A1 (en) * 2017-03-03 2018-09-07 Obsidian Therapeutics, Inc. Il12 compositions and methods for immunotherapy
WO2018182511A1 (en) * 2017-03-27 2018-10-04 National University Of Singapore Stimulatory cell lines for ex vivo expansion and activation of natural killer cells
JP7362596B2 (ja) 2017-06-12 2023-10-17 オブシディアン セラピューティクス， インコーポレイテッド 免疫療法のためのｐｄｅ５組成物及び方法
WO2018237323A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University DOMAINS OF DETABILIZATION OF PDE5A
TW201923073A (zh) * 2017-11-20 2019-06-16 新加坡商泰莎治療私人有限公司 經修飾之k562細胞
WO2019236577A2 (en) * 2018-06-04 2019-12-12 Intrexon Corporation Muc16 specific chimeric antigen receptors and uses thereof
US20220403001A1 (en) 2018-06-12 2022-12-22 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
WO2020210202A1 (en) * 2019-04-11 2020-10-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cytotoxic t lymphocytes specific for mutated forms of epidermal growth factor receptor for use in treating cancer
MX2022002747A (es) 2019-09-10 2022-04-06 Obsidian Therapeutics Inc Proteinas de fusion de ca2-il15 para regulacion ajustable.
US20210171957A1 (en) * 2019-10-25 2021-06-10 Microcures, Inc. Methods and agents for enhancing t cell therapies

Also Published As

Publication number Publication date
MX2023008481A (es) 2023-07-28
CA3205293A1 (en) 2022-07-28
JP2024504585A (ja) 2024-02-01
WO2022159935A1 (en) 2022-07-28
AU2022211438A1 (en) 2023-08-17
US20240226158A9 (en) 2024-07-11
CO2023009868A2 (es) 2023-08-09
WO2022159939A1 (en) 2022-07-28
US20240131069A1 (en) 2024-04-25
KR20230133869A (ko) 2023-09-19
US20240108722A1 (en) 2024-04-04
US20220133801A1 (en) 2022-05-05
CA3205291A1 (en) 2022-07-28
MX2023008162A (es) 2023-07-24
JP2024503113A (ja) 2024-01-24
AU2022210485A9 (en) 2024-07-18
US20240075064A1 (en) 2024-03-07
EP4281104A1 (en) 2023-11-29
CO2023010328A2 (es) 2023-09-08
AU2022210485A1 (en) 2023-08-17
EP4281103A1 (en) 2023-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220089750A1 (en) Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
KR102612367B1 (ko) G-단백질 커플화 수용체를 표적화하는 키메라 항원 수용체 및 그의 용도
CN114651003A (zh) 用于可调调节的ca2-il15融合蛋白
CN110650975B (zh) 双顺反子嵌合抗原受体及其用途
RU2761632C2 (ru) Химерные антигенные рецепторы, нацеленные на антиген созревания в-клеток, и их применение
KR20200131867A (ko) 항-cd33 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
US20230026259A1 (en) Ca2 compositions and methods for tunable regulation
ES2842899T3 (es) Tampones para la estabilización de preparaciones lentivirales
KR20230135086A (ko) 막 결합된 인터류킨 15를 갖는 종양 침윤성 림프구및 이의 용도
ES2962588T3 (es) Proteínas de fusión de PD-1 y 4-1BB
US20220259616A1 (en) A Platform for T Lymphocyte Genome Engineering and In Vivo High-Throughput Screening Thereof
CN115243713A (zh) 用于递送修饰的淋巴细胞聚集体的方法和组合物
CN114585641A (zh) 间皮素car及其用途
KR20200035104A (ko) Braf 특이적 tcr 및 그의 용도
CN114450308A (zh) 用于调节性调控的ca2组合物和方法
WO2021250511A1 (ko) Mr1에 결합하는 t-세포 수용체 및 이의 용도
KR20230002681A (ko) 대형 아데노바이러스 페이로드의 통합
CN108939064B (zh) 基于重组减毒绵羊李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗
CN116801902A (zh) 具有膜结合白细胞介素15的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途
NL2022714B1 (en) Optimised RAG1 deficient SCID Gene Therapy
CN115515605A (zh) 表达造血生长因子受体的nk细胞或t细胞及用于治疗癌症的用途
RU2822193C2 (ru) Мезотелиновые car-рецепторы и их применение
US20240352087A1 (en) T Cell Receptors (TCR) to Human Papillomavirus Proteins, Compositions, and Uses Thereof
CN114945673A (zh) 无限增殖化成肌细胞系及其用途
CN111206044A (zh) 一种新的质粒载体构建方法