JP2024503113A - 膜結合型インターロイキン１５を有する腫瘍浸潤リンパ球、及びその使用 - Google Patents

Abstract

膜結合型インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が、本明細書に提供される。ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは、外因性インターロイキン２（ＩＬ２）を使用せずに、急速拡張プロトコルを使用してインビトロで拡張することができ、ＩＬ２等の外因性サイトカインを併用することなく、養子細胞療法で使用することができる。ＴＩＬは、ｍｂＩＬ１５が、１つ以上の薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）に作動可能に連結されるように更に操作することができ、このＤＲＤは、リガンドとのＤＲＤの結合時にＩＬ１５の存在量及び／または活性を調節することができるポリペプチドである。また、本明細書では、改変ＴＩＬを作製するための成分、ならびに改変ＴＩＬを作製及び使用するための方法も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月１９日に出願された米国仮出願第６３／１３９，３０５号、２０２１年２月２４日に出願された米国仮出願第６３／１５３，３６７号、２０２１年７月２７日に出願された米国仮出願第６３／２２６，１１４号、２０２１年９月１４日に出願された米国仮出願第６３／２４４，１６６号の優先権を主張し、これらは全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

固形腫瘍は、効果的な養子細胞療法（ＡＣＴ）の開発において大きな課題を提示する。例えば、単一の腫瘍抗原を標的とすることは、抗原消失またはより積極的なクローンの再発をもたらし得る。更に、治療細胞の固形腫瘍への浸潤は困難であることが証明され、細胞が腫瘍に浸潤しても、腫瘍微小環境は免疫抑制機構のために生息し難い場合がある。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）でのＡＣＴは、少なくとも特定の固形腫瘍に対して、これらの問題に対処する治療法として提案されている。ＴＩＬは、例えば、複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）クローンを有するＴ細胞を含み、したがって、複数の腫瘍抗原をよりよく認識し、それによって腫瘍不均一性に対処することができる。加えて、ＴＩＬは、腫瘍特異的抗原及び腫瘍ネオ抗原を認識し、それらが、周囲の健康な組織と抗原的に異なる腫瘍を標的とすることを可能にする。

細胞療法としての使用のために、ＴＩＬは、腫瘍生検または外科的に除去された腫瘍の試料を使用して、対象の腫瘍部位から調製される。次いで、ＴＩＬを刺激し、インビトロで、インターロイキン－２（ＩＬ２）等の刺激物、及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）等のフィーダー細胞の存在下で拡張させる。拡張後、ＴＩＬを患者に再注入し、ＩＬ２を同時に投与する。しかしながら、ＩＬ２は用量依存性毒性を示し、これは複数の臓器系、最も顕著な心臓、肺、腎臓、及び中枢神経系に現れる可能性がある。ＩＬ２毒性の最も一般的な兆候は毛細血管漏出症候群であり、血管外空間における低血容量状態及び体液蓄積をもたらす。かなりの数の患者が補助的ＩＬ２治療に耐えられないため、ＴＩＬ治療から除外されなければならない。ＴＩＬを用いたＡＣＴをがんの安全でより効果的な治療とするには、現場での改善が必要である。

本開示は、膜結合型インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように改変される（すなわち、操作される）ＴＩＬに関する。改変ＴＩＬは、インターロイキン２（ＩＬ２）のような外因性サイトカインの非存在下で、インビトロまたはインビボで拡張することができる。ＴＩＬ免疫療法と併用またはＴＩＬ免疫療法後のがん患者へのＩＬ２の全身投与は、しばしば、すでに医学的に脆弱な患者に毒性を引き起こす。多くの患者は、低血圧及び毛細血管漏出症候群によるショックを含む、ＩＬ２投与後に重度の生命を脅かす副作用に苦しんでいる。低用量の併用ＩＬ２を用いたＴＩＬ療法は、高用量での治療よりも有効性が低かった。したがって、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、外因性ＩＬ２の使用を必要とする現在の治療レジメンよりも、がんを有する対象に毒性が低い治療レジメンで使用することができる。

ＴＩＬは、ｍｂＩＬ１５が１つ以上の薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）に作動可能に連結されるように更に操作することができる。ＤＲＤは、リガンドとの結合時に、ｍｂＩＬ１５等のペイロードの存在量及び／または活性を制御することができるポリペプチドである。複数のＤＲＤは、例えば、直列に、単一のペイロードを調節することができる。１つ以上のＤＲＤは、ｍｂＩＬ１５に作動可能に連結され、適切な条件下での有効量のリガンドとのＤＲＤの相互作用は、ペイロードの生物活性を改変することをもたらす。

また、改変されたＴＩＬの集団も提供される。複数のＴＩＬは、任意選択で、拡張を受けた改変ＴＩＬの亜集団を含む。したがって、任意選択でＤＲＤに作動可能に連結されたｍｂＩＬ１５を発現するように操作された拡張ＴＩＬも、本明細書に提供される。拡張ＴＩＬの集団もまた、本明細書に開示される。拡張後、ＴＩＬの集団は、外因性サイトカインの非存在下でさえ、フィーダー細胞を欠く培養物中で５日超、１０日超、または１５日超生存する。同様に、ＴＩＬの集団は、外因性サイトカイン投与なしで、インビボで生存する。ＩＬ２のような外因性サイトカインは、ＴＩＬのより多くの枯渇をもたらすため、改変ＴＩＬのインビボ及びインビトロでの拡張は、ＴＩＬのより強力な集団をもたらす。

拡張ＴＩＬの集団は、非拡張ＴＩＬの対照集団におけるＣＤ８＋細胞及びＣＤ４＋細胞の割合と比較して、ＣＤ８＋細胞の割合が高く、ＣＤ４＋細胞の割合が低い。したがって、拡張ＴＩＬの集団は、非拡張ＴＩＬの対照集団のＣＤ４：ＣＤ８比よりも低いＣＤ４：ＣＤ８比を有する。更に、拡張ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬの集団は、ＲＥＰにおける操作及び拡張の前に、ＲＥＰ前のＴＩＬにおけるＣＤ４ Ｔ_ｒｅｇ細胞の割合と比較して、ＣＤ４ Ｔ_ｒｅｇ細胞の割合がより少ない。拡張ＴＩＬの集団は、非拡張ＴＩＬの対照集団におけるＰＤ１＋細胞の割合と比較して、ＰＤ１＋細胞の割合が低い。更に、本明細書に記載の拡張ＴＩＬの集団は、非拡張ＴＩＬの対照集団における腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の両方を産生するＴＩＬの割合と比較して、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の両方を産生する細胞の割合が高い。

本明細書では、非改変ＴＩＬの亜集団と、任意選択でＤＲＤに作動可能に連結されたｍｂＩＬ１５を含む改変ＴＩＬの亜集団とを含む、ＴＩＬの混合集団が提供される。改変ＴＩＬの亜集団は、Ｋ５６２フィーダー細胞、４１ＢＢリガンド（４１ＢＢＬ）、及びインターロイキン２１（ＩＬ２１、Ｋ５６２フィーダー細胞に分泌または膜結合した）の存在下で拡張し、Ｋ５６２フィーダー細胞、４１ＢＢＬ、及びＩＬ２１の存在下での非操作（すなわち、非改変）ＴＩＬの亜集団よりも拡張する。操作（すなわち、改変）ＴＩＬの亜集団のこの優先的な拡張は、ＩＬ２のような外因性サイトカインの非存在下で発生する。

ｍｂＩＬ１５を発現するように操作されたＴＩＬを作製する方法は、ＴＩＬをベクターで形質導入することを含み、ベクターは、ＩＬ１５をコードする第１の核酸配列と、膜貫通ドメインをコードする第２の核酸とを含む。ＴＩＬを形質導入するために使用されるベクターは、ウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター、より具体的には、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）擬似型ガンマレトロウイルスベクターまたはヒヒ内因性レトロウイルスエンベロープ（ＢａＥＶ）擬似型レンチウイルスベクターであり得る。したがって、本明細書では、ＩＬ１５をコードする第１の核酸配列と、膜貫通ドメインをコードする第２の核酸配列とを含むＧＡＬＶ擬似型レトロウイルスベクターまたはＢａＥＶ擬似型レンチウイルスベクターが提供される。第１及び第２の核酸の発現時に、膜貫通ドメインは、リンカーまたはヒンジを介してＩＬ１５に任意選択で連結される、ＩＬ１５を細胞膜に、または細胞膜内に固定する役割を果たす。

本明細書に記載の任意のＴＩＬまたはＴＩＬの集団と、薬学的担体とを含む薬学的組成物も提供される。がんの治療方法として、がんを有するレシピエント対象に投与される任意のＴＩＬ、ＴＩＬの任意の集団、またはその任意の薬学的組成物を使用することができる。方法は、任意選択で、レシピエント対象に第２の薬剤を投与することを更に含み、第２の薬剤は、ｍｂＩＬ１５に作動可能に連結されたＤＲＤに結合するリガンドである。有効量のリガンドを投与し、リガンドをＤＲＤに結合すると、対象におけるｍｂＩＬ１５の生物活性が増加する。ｍｂＩＬ１５に作動可能に連結されるＤＲＤの有無にかかわらず、治療方法は、対象に、ＩＬ２等の外因性サイトカインを投与することを必要としない。治療方法は、腫瘍から１つ以上のＴＩＬを単離し、ｍｂＩＬ１５を発現する核酸を１つ以上のＴＩＬに導入することを任意選択で含む。ＴＩＬは、レシピエント対象の腫瘍から、またはドナー対象から単離することができ、ドナー対象は、レシピエント対象ではない。ドナー対象の腫瘍から単離されたＴＩＬは、ドナーから単離されたＴＩＬが、レシピエント対象の腫瘍に存在する１つ以上のがん抗原に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むように選択され得る。任意選択で、方法は、レシピエント対象に対するＨＬＡ適合であるドナー対象を選択することを更に含む。本明細書に記載の治療方法において、レシピエント対象は、ＴＩＬの投与前に、任意選択で、リンパ球枯渇されている。

同定された実施形態は、例示的であるだけであり、したがって、非限定的である。本発明の１つ以上の非限定的な実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載されている。本発明の他の実施形態は、本開示を考慮した後に当業者には明らかであるべきである。

新鮮な腫瘍消化物中及びＲＥＰ前ＴＩＬ培養の３週間後の、ＣＤ４５＋細胞（左）及びＣＤ４５＋細胞（右）内のＣＤ３＋Ｔ細胞の頻度を示す。 形質導入後５日目にフローサイトメトリーにより測定された２つの黒色腫ＴＩＬドナーにおけるＩＬ１５～２９３構築物の形質導入効率を示す。 Ａ～Ｂは、ｍｂＩＬ１５を発現するＴＩＬの抗原及びＩＬ２非依存的な拡張及び生存を示す。図３Ａは、構成的ｍｂＩＬ１５またはＧＦＰで形質導入され、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２の有無にかかわらず、ＲＥＰ中で１２日間拡張されたＴＩＬドナー００６細胞（ＴＩＬ００６）を示す。図３Ｂは、構成的ｍｂＩＬ１５（ＩＬ２なしで、ＲＥＰで拡張）またはＧＦＰ（６０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ２でＲＥＰで拡張）で形質導入され、６０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ２の有無にかかわらず、１４日間の抗原非依存生存アッセイで列挙されたＴＩＬ００６を示す。 急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）後の抗原非依存性ＴＩＬ拡張を示す。ＲＥＰ後、非操作及びｍｂＩＬ１５操作ＴＩＬ（構成的または調節されたｍｂＩＬ１５）を、外因性ＩＬ２またはアセタゾールアミド（ＡＣＺ）の有無にかかわらずプレーティングし、新しいウェルを３日ごとに採取して、細胞の列挙及び表現型を評価した。 抗原依存性設定におけるＴＩＬ拡張を示す。急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）の後、非操作及びｍｂＩＬ１５操作されたＴＩＬを、外因性ＩＬ２、アセタゾールアミド、またはビヒクル（ＤＭＳＯ）の有無にかかわらず、ＴＩＬ：腫瘍共培養アッセイ中のＨＬＡ適合マイトマイシンＣ処置された黒色腫細胞でプレーティングし、ウェルを３日ごとに採取して、細胞の列挙及び表現型を評価した。 Ａ～Ｂは、急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）後のＴＩＬの腫瘍反応性を示す。図６Ａは、ＴＩＬ００６及びＴＩＬ００５を示し、両方とも、調節されたｍｂＩＬ１５及び非操作対照で形質導入され、ＨＬＡ適合マイトマイシン－Ｃ処理された黒色腫細胞と２４時間共培養される。上清中のＩＦＮγを、ＭＳＤアッセイにより測定した。図６Ｂは、ルシフェラーゼタグ付きＨＬＡ適合黒色腫株による発光の喪失によって測定した、共培養におけるＴＩＬの細胞傷害性を示す。 Ａ～Ｂは、インビボ養子細胞療法実験のための動物への注入前のＴＩＬ拡張及び形質導入効率を示す。図７Ａは、非操作及びｍｂＩＬ１５操作ＴＩＬのインビボ養子細胞移入（ＡＣＴ）に使用されるＴＩＬドナー００６の細胞拡張を示す。図７Ｂは、急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）後の形質導入効率を示す。形質導入効率の尺度として、ＩＬ１５及びＩＬ１５ＲａＦｃの発現について、非操作及びｍｂＩＬ１５操作されたＴＩＬを評価した。 インビボ養子細胞療法実験のためのＴＩＬ列挙及びＩＬ１５発現の分析を示す。図８Ａは、末梢血試料からのフローサイトメトリーによる、養子移入された非操作及びｍｂＩＬ１５操作ＴＩＬの列挙を示す。ＴＩＬは、顎下静脈血液試料中の生きたヒトＣＤ３＋マウスＣＤ４５－細胞として同定した。図８Ｂ及び図８Ｃは、ＡＣＴの１４日後または５３日後に単離した脾臓及び骨髄試料のＴＩＬ列挙（ｈＣＤ３＋ｍＣＤ４５－）及びＩＬ１５発現（ＩＬ１５＋ＩＬ１５ＲａＦｃ＋）を示す。 インビボ養子細胞療法実験のためのＴＩＬ列挙及びＩＬ１５発現の分析を示す。図８Ａは、末梢血試料からのフローサイトメトリーによる、養子移入された非操作及びｍｂＩＬ１５操作ＴＩＬの列挙を示す。ＴＩＬは、顎下静脈血液試料中の生きたヒトＣＤ３＋マウスＣＤ４５－細胞として同定した。図８Ｂ及び図８Ｃは、ＡＣＴの１４日後または５３日後に単離した脾臓及び骨髄試料のＴＩＬ列挙（ｈＣＤ３＋ｍＣＤ４５－）及びＩＬ１５発現（ＩＬ１５＋ＩＬ１５ＲａＦｃ＋）を示す。 インビボ養子細胞療法実験のためのＴＩＬ列挙及びＩＬ１５発現の分析を示す。図８Ａは、末梢血試料からのフローサイトメトリーによる、養子移入された非操作及びｍｂＩＬ１５操作ＴＩＬの列挙を示す。ＴＩＬは、顎下静脈血液試料中の生きたヒトＣＤ３＋マウスＣＤ４５－細胞として同定した。図８Ｂ及び図８Ｃは、ＡＣＴの１４日後または５３日後に単離した脾臓及び骨髄試料のＴＩＬ列挙（ｈＣＤ３＋ｍＣＤ４５－）及びＩＬ１５発現（ＩＬ１５＋ＩＬ１５ＲａＦｃ＋）を示す。 凍結保存された調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬにおけるＩＬ１５発現及びシグナル伝達のアセタゾールアミド（ＡＣＺ）調節が、用量依存的様式で生じることを示す。４人の患者（患者１～４）からの調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを解凍し、ＡＣＺフリー培地中で２４時間放置し、次いで、０．１、１、２．５、５、１０、２５、１００μＭのＡＣＺ中で１８時間調節した。次に、ホスホフローサイトメトリーベースのアッセイを用いて、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを収集し、ＩＬ１５発現及びシグナル伝達について分析した。図９Ａは、ＣＤ３＋細胞の割合としてのＩＬ１５＋ＴＩＬの頻度を示す。図９Ｂ～９Ｅは、各患者の結果を示す。ここで、細胞をＩＬ１５＋上で更にゲーティングし、次いで、各ｐＳＴＡＴ５（白抜きの四角形）及びｐＳ６（閉じた円）の幾何平均蛍光強度を算出した。示された値は、ビヒクル対照に対して相対的に設定される。Ｎ＝４人のヒトドナー。 患者１～４のｐＳＴＡＴ５及びｐＳ６の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図１０Ａは、ｐＳＴＡＴ５のＭＦＩを示す。図１０Ｂは、ｐＳ６のＭＦＩを示す。 調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬの構成的ｍｂＩＬ１５発現及びＡＣＺ調節が、ＩＬ１５シグナル伝達経路に関与することを示す。ここで、患者１～３からの非操作ＴＩＬ及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを解凍し、ＡＣＺフリー培地中で２４時間放置し、次いでＩＬ２またはＡＣＺで１８時間調節した。次いで、ホスホフローサイトメトリーベースのアッセイを用いて、細胞を収集し、ＩＬ１５発現及びシグナル伝達について分析した。非操作ＴＩＬ及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ビヒクルを、生細胞、続いてシングレット、続いてＣＤ３＋上でゲーティングした。構成的ＩＬ１５ ＴＩＬ及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ＡＣＺ条件を、ＩＬ１５＋染色上で更にゲーティングした。各ｐＳＴＡＴ５及びｐＳ６の幾何平均蛍光強度を計算した。Ｎ＝３人のヒトドナー。 外因性サイトカインを含まない調節されたｍｂＩＬ５改変ＴＩＬが、非操作ＴＩＬ＋ＩＬ２よりも大きな多官能性を実証することを示す。非操作ＴＩＬ及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを解凍し、ＡＣＺフリー培地中で２４時間放置した。次に、非操作ＴＩＬを、以下の濃度のＩＬ２で処理した。２０、２００、１０００、及び６０００ＩＵ／ｍＬ、またはビヒクルならびに調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを、以下の濃度のＡＣＺで処理した。０．１、１、５、１０、２５、１００μＭのＡＣＺ、またはビヒクルである。１８時間の治療であった。細胞を、ブレフェルジンＡ及びモネンシンの存在下で、ＰＭＡ及びイオノマイシンで６時間刺激した。非刺激ＴＩＬを対照として使用した（データ割愛）。刺激後、フローサイトメトリーベースのアッセイを用いて、ＩＬ１５及び細胞内ＴＮＦα及びＩＦＮγの発現について細胞を分析した。ＴＩＬを、生細胞、続いてシングレット、続いてＣＤ３＋でゲーティングし、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを、更にＩＬ１５＋上でゲーティングした。図１２Ａは、ＩＬ２を有する非操作ＴＩＬ、及びＡＣＺを有する調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬについてのＴＮＦα及びＩＦＮγ二重陽性集団を示す。図１２Ｂは、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ培養物におけるＩＬ１５発現を示す。図１２Ｃは、選択したＩＬ２（２００ＩＵ／ｍＬ）及びＡＣＺ（２５μＭ）用量の比較を示す。 患者由来異種移植片（ＰＤＸ）効率モデルの結果を示す。急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）の終了時に、非操作ＴＩＬ及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ（＋／－アセタゾールアミド（ＡＣＺ））を、ヒト黒色腫ＰＤＸを有するマウスに養子移入した。平均腫瘍体積を評価した（＋／－ＳＥＭ）。図１３Ａは、養子細胞移入（ＡＣＴ）後の日数における所与の治療の平均腫瘍体積を示す。図１３Ｂは、ＡＣＴ後の日数における腫瘍体積を、ＴＩＬなし（左上）、非操作ＴＩＬ＋ＩＬ２（右上）、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ビヒクル（左下）、及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ＡＣＺ（右下）について示す。ここで、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ＡＣＺは、非操作ＴＩＬ＋ＩＬ２と比較して有意に優れた抗腫瘍有効性を示した（＊ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ Ｕ Ｗｈｉｔｎｅｙ（マン・ホイットニーのＵ検定））。 ＳＫ－ＭＥＬ－１異種移植片がんモデルの結果を示す。急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）の終了時に、非操作ＴＩＬ及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ（＋／－アセタゾールアミド（ＡＣＺ））を、ＳＫ－ＭＥＬ－１腫瘍を有するマウスに養子移入した。平均腫瘍体積を評価した（＋／－ＳＥＭ）。図１４Ａは、養子細胞移入（ＡＣＴ）後の日数における所与の治療の平均腫瘍体積を示す。図１４Ｂは、ＡＣＴ後の日数における腫瘍体積を、ＴＩＬなし（左上）、非操作ＴＩＬ＋ＩＬ２（右上）、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ビヒクル（左下）、及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ＡＣＺ（右下）について示す。ここで、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ＡＣＺは、非操作ＴＩＬ＋ＩＬ２と比較して有意に優れた抗腫瘍有効性を示す（＊ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ Ｕ Ｗｈｉｔｎｅｙ（マン・ホイットニーのＵ検定））。 調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬが、インビトロで黒色腫に対する向上したＭＨＣ－Ｉ依存性細胞傷害性を達成することを示す。ここでは、急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）の終了時に、非操作ＴＩＬ及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを凍結保存した。凍結保存されたＴＩＬを解凍し、サイトカインを含まない条件で一晩放置し、次いで、１：１及び５：１のエフェクター対標的（ＴＩＬ：黒色腫）比で、細胞トレースバイオレット標識黒色腫細胞（ＳＫ－ＭＥＬ－１）と共培養した。ＭＨＣ－１依存性細胞傷害性を制御するために、黒色腫細胞を、アッセイ前に８０μｇ／ｍＬのＨＬＡ ＡＢＣ ＭＨＣブロッキング抗体で２時間前処置した。３時間の共培養後、ＳＫ－ＭＥＬ－１細胞を、フローサイトメトリーによる細胞内切断カスパーゼ３（細胞死に対する不可逆的なコミットメントのマーカー）の発現について評価した。定量化された切断カスパーゼ３を、標的細胞単独（自発的またはバックグラウンド放出）のそれに正規化した。棒グラフは、６人の個々の患者からのＴＩＬと共培養されたときの標的腫瘍細胞上の切断カプサーゼ－３の発現を示す。 ＩＬ２１及び４１ＢＢＬを介した共刺激の両方を有するＫ５６２フィーダー細胞を用いてｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ（構成的）が生成されたときに、ＲＥＰにおける最大のＴＩＬ拡張が生じることを示すグラフである。 非操作ＴＩＬが、プールしたＰＢＭＣフィーダーまたは膜結合ＩＬ２１及び４１ＢＢＬを発現するＫ５６２フィーダー細胞で生成されたときに、ＲＥＰにおける最大ＴＩＬ拡張が生じることを示すグラフである。 ｍｂＩＬ１５（構成的）を有するＴＩＬがＫ５６２フィーダー細胞で生成され、ＩＬ２１及び４１ＢＢＬを介した共刺激の両方を受けた場合に、ＲＥＰにおけるＩＬ１５＋ＴＩＬの最大の拡張が生じることを示す。８日目、１１日目、１５日目、及び１８日目のフィーダー細胞の結果を左から右へ示す。ＰＢＭＣフィーダー、Ｋ５６２親フィーダー、Ｋ５６２＋４１ＢＢＬ、組換えのヒトＩＬ２１のＫ５６２＋４１ＢＢＬのフィーダー、Ｋ５６２＋ｍｂＩＬ２１のフィーダー、Ｋ５６２＋４１ＢＢＬ＋ｍｂＩＬ２１のフィーダーである。 ＩＬ１５発現が、Ｋ５６２フィーダー細胞で生成され、ＩＬ２１及び４１ＢＢＬを介した共刺激の両方を受けたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ（構成的）のＲＥＰプロセスを通して濃縮されることを示すグラフである。 ＩＬ２１及び４１ＢＢＬを介した共刺激の両方を有するＫ５６２フィーダー細胞で生成されたｍｂＩＬ１５を用いて拡張したＴＩＬが、ＲＥＰを通じてＣＤ４：ＣＤ８比が低下していることを示すグラフである。したがって、ＩＬ２１及び４１ＢＢＬ刺激の両方を有するＫ５６２フィーダー細胞の存在下で拡張ｍｂＩＬ１５を有するＴＩＬは、ＩＬ２１の非存在下で４１ＢＢＬを発現するプールされたＰＢＭＣフィーダー、非改変Ｋ５６２フィーダー、またはＫ５６２フィーダーで生成されたｍｂＩＬ１５を有する拡張ＴＩＬとは対照的に、ＣＤ８＋細胞傷害性エフェクター細胞について富化される。ＣＤ４：ＣＤ８比を、左から右へ、８日目、１１日目、１５日目、及び１８日目に示す。ＰＢＭＣフィーダー、Ｋ５６２親フィーダー、Ｋ５６２＋４１ＢＢＬ、組換えのヒトＩＬ２１のＫ５６２＋４１ＢＢＬのフィーダー、Ｋ５６２＋ｍｂＩＬ２１のフィーダー、Ｋ５６２＋４１ＢＢＬ＋ｍｂＩＬ２１のフィーダーである。 ＰＢＭＣフィーダー細胞または非改変Ｋ５６２フィーダー細胞で生成されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬと比較して、ｍｂＩＬ２１及び４１ＢＢＬの両方を発現するＫ５６２フィーダー細胞で生成された拡張ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ中のＴＮＦα＋インターフェロンγ＋細胞の割合が高いことを示すグラフである。ＴＮＦα＋インターフェロンγ＋ＴＩＬの割合が高いことは、ｍｂＩＬ２１及び４１ＢＢＬの両方を発現するＫ５６２フィーダー細胞で生成された拡張ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬにおける多官能性の向上を示す。 ＰＢＭＣフィーダー細胞、非改変Ｋ５６２フィーダー細胞、ｍｂ４１ＢＢＬのみを発現するＫ５６２フィーダー細胞、ｍｂＩＬ２１のみを発現するＫ５６２フィーダー細胞、４１ＢＢＬ及びｍｂＩＬ２１の両方を発現するＫ５６２フィーダー細胞、及び組換えヒトＩＬ２１の存在下で４１ＢＢＬを発現するＫ５６２フィーダー細胞で生成したｍｂＩＬ１５ ＴＩＬの１０日間生存アッセイの結果を示すグラフである。Ｋ５６２フィーダー細胞で生成され、ＩＬ２１及び４１ＢＢＬを介した共刺激の両方を受けた拡張ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは、ＰＢＭＣフィーダー細胞またはｍｂＩＬ２１または４１ＢＢＬを独立して発現するように非改変または改変されているＫ５６２フィーダー細胞で生成されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬと比較して、ＲＥＰ後の抗原非依存性生存率が向上したことを実証した。 ＰＢＭＣフィーダー、Ｋ５６２フィーダー、Ｋ５６２＋ｍｂＩＬ２１フィーダー、Ｋ５６２＋４１ＢＢＬフィーダー、Ｋ５６２＋４１ＢＢＬ＋ｍｂＩＬ２１フィーダー、またはＫ５６２＋４１ＢＢＬ＋ｒｈＩＬ２１フィーダーを用いて拡張した非操作ＴＩＬ及びｍｂＩＬ１５ ＴＩＬにおけるＴＣＲＶβサブファミリーの相対的な割合を示す。拡張ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ及び非操作ＴＩＬは、フィーダー細胞または条件に関係なく、多様なサブファミリー分布を維持する。 ＰＢＭＣフィーダー、Ｋ５６２親フィーダー、Ｋ５６２＋４１ＢＢＬのフィーダー、組換えのヒトＩＬ２１のＫ５６２＋４１ＢＢＬのフィーダー、Ｋ５６２＋ｍｂＩＬ２１のフィーダー、及びＫ５６２＋４１ＢＢＬ＋ｍｂＩＬ２１のフィーダーを用いて生成した非拡張ＴＩＬ及び拡張ＴＩＬにおいて、左から右にかけての生きたＣＤ３＋細胞上でゲーティングした、ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬの表面上でのＰＤ１の発現を示す。ＰＤ１発現は、非拡張ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬで最も高く、４１ＢＢＬ及びＩＬ２１を介したシグナル伝達の両方を伴うｍｂＩＬ１５ ＴＩＬの拡張は、ＰＤ１のほぼベースライン発現を伴うＴＩＬを生成する。 （実施例１に記載される）ＲＥＰ前ＴＩＬを（実施例３に記載される）操作ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬと比較する表現型決定を示す。ＲＥＰ前及びＲＥＰ後のＴＩＬを、実施例１３に記載されるように、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＰＤ１の抗体を用いてフローサイトメトリーによって表現型決定した。図２５Ａに示されるように、同じＴＩＬドナーからの対応するＲＥＰ前のＴＩＬと比較して、ＲＥＰ後のｍｂＩＬ１５ ＴＩＬについて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の方が高く、ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の方が低い。図２５Ｂにおいて、ＲＥＰ後のｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは、同じＴＩＬドナーからの対応するＲＥＰ前ＴＩＬよりも低いレベルのＰＤ１を発現する。図２５Ｃは、ＣＤ４＋としてゲーティングされ、ＣＤ２５及びＦｏｘＰ３二重陽性細胞として更に分類されるＣＤ３＋Ｔ細胞として同定される、ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬにおける制御性Ｔ細胞集団の割合を示す。ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは、操作ステップの前のＲＥＰ前ＴＩＬと比較して、制御性Ｔ細胞の割合が低下している。 フローサイトメトリーによって決定したように、Ａ３７５黒色腫細胞株及び患者由来異種移植片（ＰＤＸ）細胞（実施例１１に記載のＰＤＸ １６３Ａ）上での、保存された黒色腫関連抗原ＭＡＲＴ－１及びｇｐ１００の発現を示す。 ＭＡＲＴ－１－四量体陽性ＴＩＬ及びｇｐ１００－四量体陽性ＴＩＬの割合を、ＰＤＸ １６３ＡとＨＬＡが適合する４つの異なるＴＩＬドナーに由来するｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ中で示す。四量体陽性集団は、ＴＩＬが、ＨＬＡ：Ａ２：０１遺伝子座を介して、対応する黒色腫関連抗原に反応する細胞の一部を含有することを示す。＊で示されるドナーは、図３０に示されるように、ＰＤＸ有効性試験において利用された。 ＴＩＬ：腫瘍細胞共培養後のインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）産生を示し、ＰＤＸに反応するＴＩＬドナーを正確に予測する。このインビトロアッセイは、ＴＩＬドナー００６、３９Ａ、及び４１Ａが、ＰＤＸに応答して産生されるＩＦＮγの量が最も多いドナーであることを実証し、したがって、実施例１５に記載されるように、インビトロ有効性を調べるためのドナーとしてのそれらの候補性を支持する。 ＣＡ２ ＤＲＤ及びＣＡ２リガンドＡＣＺに作動可能に連結されたｍｂＩＬ１５を発現する拡張ＴＩＬで処理された例示的な黒色腫患者由来異種移植片モデルを示す概略図である。 図２９に示される治療パラダイムによる患者由来異種移植片モデルの治療は、非操作ＴＩＬ及び併用ＩＬ２治療による治療と比較して、優れた抗腫瘍有効性をもたらすことを示す。急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）の終了時に、非操作ＴＩＬ及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ（＋／－アセタゾールアミド（ＡＣＺ））を、ヒト黒色腫ＰＤＸを有するマウスに養子移入した。平均腫瘍体積を評価した（＋／－ＳＥＭ）。 Ａ～Ｂは、ＴＩＬがＣＡ２ ＤＲＤに作動可能に連結されたｍｂＩＬ１５を発現するＴＩＬは、非操作ＴＩＬ＋ＩＬ２よりも有意に多くの腫瘍内浸潤を示すことを示す。図３１Ａは、ヒトＣＤ３について免疫組織化学的に染色され、非操作ＴＩＬ及びＩＬ２で処置された動物におけるＴＩＬの腫瘍内浸潤を示す腫瘍切片の顕微鏡写真であり、ＣＡ２リガンドＡＣＺの存在下及び非存在下でＣＡ２ ＤＲＤに作動可能に連結されたｍｂＩＬ１５を発現するＴＩＬで処置された動物である。図３１Ｂは、間質＋腫瘍、間質のみ、及び腫瘍のみにおけるＴＩＬ数を示すグラフである。

ＴＩＬを拡張するための現在のプロセスは、インターロイキン２（ＩＬ２）に基づくＴＩＬ拡張（急速拡張プロトコル前またはＲＥＰ前）、続いて急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）を必要とする。ＲＥＰ前段階では、ＴＩＬを外因性ＩＬ２とともに培養し、解離した腫瘍組織の塊に腫瘍抗原が存在する。したがって、ＲＥＰ前は、フィーダー細胞の非存在下でＩＬ２を必要とする。ＲＥＰステップは、典型的には、急速なＴＩＬ拡張を支持するために、追加のフィーダー細胞を必要とする。ＲＥＰフィーダー細胞及びＴＩＬ刺激は、典型的には、照射された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、高用量のＩＬ２、及び任意選択で抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）である。しかしながら、ＲＥＰ中のＩＬ２はＴＩＬを排出する傾向があり、ＴＩＬ産物の強度が低下する。現在のプロセスを使用したエクスビボＲＥＰの後、拡張ＴＩＬを、ＩＬ２とともに患者に投与し、ＩＬ２は、ＴＩＬ投与の前に、中に、及び／または後に投与してもよく、再びＴＩＬを消耗させ得る。現在のＴＩＬ療法の一般的なプロトコルでは、同日またはＴＩＬ注入の翌日に開始する高用量ＩＬ２投与を必要とする。例として、高用量ＩＬ２レジメンは、耐容性まで８時間ごとのボーラス静脈内注入、最大１４用量、９日間の休息、及び別の１４用量の繰り返しからなることができる。他のＩＬ２レジメンは、２８日ごとに最大４サイクル繰り返される４日間のＩＬ２投与サイクル、または最大２１日持続するＰＥＧ化ＩＬ２レジメンからなることができる。

ＴＩＬの消耗を促進することに加えて、高用量のＩＬ２は、がん患者に重篤な副作用を引き起こす可能性があり、ＡＣＴを必要とする患者によって許容されないことが多い。本組成物及び方法は、任意選択で、ＴＩＬの投与の前、その間、またはその後に、ＩＬ２のようなインターロイキン等の外因性サイトカイン投与を必要としない、ＴＩＬ療法を提供する。別の言い方をすれば、本方法では、ＴＩＬ注入とインターロイキン療法を併用する必要はない。例えば、任意選択で、対象は、ＴＩＬ注入前、またはＴＩＬ注入後５日間、７日間、１０日間、１４日間、２１日間、もしくは２８日間の外因性ＩＬ２の投与を必要としない。同様に、本方法は、改変ＩＬ２または他の改変サイトカイン（改変ＩＬ７またはＩＬ１５等）の注入の必要性を排除する。例として、改変インターロイキンは、ＩＬ２、ＩＬ７、またはＩＬ１５のうちの１つ以上の機能を保持するが、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞増殖を促進することができる（例えば、親和性を低下させることによって）受容体等の特定の受容体への結合を低下させる、ＩＬ２、ＩＬ７、またはＩＬ１５の突然変異体または断片であり得る。

本明細書で使用される場合、拡張は、数または量の増加を指す。「拡張」という用語が、ＴＩＬの集団または亜集団に関して本明細書で使用される場合、この用語は、ＲＥＰ後の細胞の集団を指す。拡張集団のサイズ（すなわち、ＲＥＰ後のＴＩＬの数）は、非拡張集団（すなわち、ＴＩＬのＲＥＰ前の数、または細胞の機能的拡張の非存在をもたらす不成功なＲＥＰ後のＴＩＬの数）よりも大きい。拡張ＴＩＬ等の細胞に関して使用される場合、それは、ＴＩＬ集団の機能的拡張をもたらしたＲＥＰ（すなわち、フィーダー細胞及び選択した刺激因子を有する培養物）の生成物または結果である細胞である。したがって、本明細書で使用される場合、拡張ＴＩＬは、ＲＥＰ下で培養され、機能的拡張をもたらすＴＩＬ（例えば、ｍｂＩＬ１５を発現するように改変されたＴＩＬ）の子孫である。同様に、本明細書で使用される非拡張ＴＩＬは、ＲＥＰで機能的拡張を受けていないＴＩＬを指す。しかしながら、そのような非拡張ＴＩＬは、最初のＩＬ２のＲＥＰ前ステップを経ているか、または細胞の機能的拡張の非存在をもたらす不成功なＲＥＰを経ている可能性がある。

本明細書で使用される場合、「拡張」という用語は、より多く拡張する、より少なく拡張する、より大きな拡張、より少ない拡張等のように、定量的に使用され得る。そのような相対用語は、一般に、異なる集団または亜集団と比較して、集団または亜集団におけるＴＩＬのより大きな倍数からより小さな倍数への増加（例えば、非改変ＴＩＬの拡張と比較する改変ＴＩＬの拡張）を指す。したがって、例えば、非改変ＴＩＬと比較して、改変ＴＩＬの亜集団のより大きな拡張は、非改変ＴＩＬと比較して、改変ＴＩＬのより大きな倍の増加、例えば、１．２５倍の増加と比較して１．５倍の増加、１．５倍の増加と比較して２倍の増加、２倍の増加と比較して５倍の増加、５倍の増加と比較して１０倍の増加、１０倍の増加と比較して４０倍の増加等を意味する。

改変腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）
本明細書に記載のＴＩＬは、ｍｂＩＬ１５を発現するように操作される。したがって、ＴＩＬは、ＩＬ１５をコードする外因性核酸配列、膜貫通ドメインをコードする外因性核酸、及び任意選択で、リンカー、ヒンジ、及び／またはリーダー配列をコードする外因性核酸配列を含む。ＩＬ１５は、一般に、膜結合分子として発現されないため、ｍｂＩＬ１５を発現するために、ＩＬ１５は、膜貫通ドメイン、例えば、膜貫通タンパク質または膜貫通タンパク質の一部と会合しなければならない。本明細書で使用されるＩＬ１５は、ＩＬ１５ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４０９３３（ＩＬ１５＿ＨＵＭＡＮ））を指す。一実施形態では、ＩＬ１５ペイロードは、表２（配列番号１２）に提供されるアミノ酸配列、または１つ以上のＩＬ１５機能を保持する（例えば、改変ＴＩＬのインビボでの拡張を促進し、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の細胞傷害性を促進する）配列番号１２に対して少なくとも８５、９０、９５または９９％の同一性を有するポリペプチドを含む。

ＩＬ１５を膜に結合する際に使用するために、膜貫通ドメイン及び／またはヒンジ領域を選択することができる例示的な膜貫通タンパク質としては、ＭＨＣ１、ＣＤ８、Ｂ７－１、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ヒトＩｇＧ４、またはＩＬ１５受容体サブユニット（例えば、ＩＬ１５αＲ）が挙げられる。ＩＬ１５は、膜貫通ドメインに直接連結されてもよく、またはリンカー及び／またはヒンジを介して連結されてもよい。

多数のリンカー配列（リンカー）が当該技術分野において知られている。リンカーとしては、限定されないが、ＧＳリンカー、ＧＳＧリンカー、及びＧＧＳＧリンカーが挙げられる。これらのリンカーは、サブユニットの１回以上の反復である。したがって、ＧＳリンカーは、ＧＳ_ｎリンカーであり、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である数値である。同様に、ＧＳＧリンカーは、ＧＳ_ｎリンカーであり、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である数値である。ＧＧＳＧリンカーは、ＧＧＳＧ_ｎリンカーであり、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である数値である。リンカー選択またはリンカーの長さは、ＩＬ１５ペイロードの活性レベル（すなわち、リガンドの非存在下での基底活性）に影響を及ぼし得、特定のリンカー及び長さは、低い基底活性レベル及びリガンド（例えば、薬物）応答性を維持しながら、オン状態（例えば、最大活性レベル）を最大化するように選択され得る。

更に別の例として、特定のヒンジは、コンフォメーション変化を可能にし得、それによってリガンドの応答性に影響を及ぼし、したがって、ペイロード存在量及び生物活性の所望の範囲（すなわち、ゼロまたは最小から最大飽和までのリガンドの変動に対応する許容可能なペイロード活性範囲）を得るのに十分なダイナミックレンジをもたらすように選択される。

ヒンジ配列は、接続された成分間の柔軟性を促進するアミノ酸の短い配列である。ヒンジ配列は、任意の好適な分子に由来、または任意の好適な分子から得られる任意の好適な配列であり得る。ヒンジ配列は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域、すなわち、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ４ Ｆｃヒンジ）のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間にある配列、または野生型配列もしくはその誘導体であり得るＣＤ８α ＣＤ４、ＣＤ２８、及びＣＤ７等の１型膜タンパク質の細胞外領域の全部または一部に由来し得る。いくつかのヒンジ領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメインまたはＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインの両方を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジは膜貫通ドメインに由来する。

本明細書に記載の改変ＴＩＬは、任意選択で、細胞内（細胞質）または膜貫通尾部をコードする外因性核酸配列を更に含む。任意選択で、細胞内／細胞質または膜貫通尾部は、Ｂ７．１、ＣＤ８、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、またはＮＫＧ２Ｃ細胞内尾部である。

本明細書に記載の改変ＴＩＬは、任意選択で、シグナル配列（リーダー配列）をコードする外因性核酸配列を更に含む。代表的なリーダー配列としては、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＳＧＡＲＣ（配列番号１０）、ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（ＩｇＥｓｓ、配列番号５８）、ＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡＧＩＨＶＦＩＬＧＣＦＳＡＧＬＰＫＴＥＡ（天然ＩＬ１５ＬＳ、配列番号５９）、ＭＧＬＶＲＲＧＡＲＡＧＰＲＭＰＲＧＷＴＡＬＣＬＬＳＬＬＰＳＧＦＭＡ（ＣＤ３４：配列番号６０）

加えて、ある特定のＴＩＬは、ＤＲＤをコードする外因性核酸配列を更に含む。ＩＬ１５は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞増殖にとって重要であるが、高レベルのＩＬ１５への継続的な曝露は、インビボでこれらの細胞の消耗につながる可能性があり、これは、ＩＬ１５発現ＴＩＬの有効性を低下させるであろう。したがって、特定の実施形態では、ＤＲＤは、ｍｂＩＬ１５に作動可能に連結されて、ＴＩＬ免疫療法中のＩＬ１５活性の調節を提供する。

薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）は、ペイロードの発現または活性レベルを調節するポリペプチドである。薬物応答性ドメインと称されるが、ＤＲＤが応答性であるリガンドは、承認された小分子「薬物」または生物学的「製剤」である必要はない。より具体的には、ＤＲＤは、ＤＲＤがペイロードに動作可能に連結されるときに、ペイロードの特徴（例えば、活性または存在量）のリガンド依存的な可逆的調節を与えるように、リガンドと相互作用する。米国特許第９，４８７，７８７号及び同第１０，１３７，１８０号、米国公開第２０１９／０１９２６９１号、同第２０２０／０１０１１４２号、同第２０２０／０１７２８７９号、同第２０２１／００６９２４８号、ならびに米国特許出願第１７／２５１，６３５号、及び同第１７／２８８，３７３号（各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、この開示によるＤＲＤ（及びそれらの対のリガンド）の例を提供する。この開示による使用に好適なこれらのＤＲＤ及び他の例示的なＤＲＤのうちのあるものは、本明細書の他の箇所にも提供される。ＤＲＤは、例として、ＦＫＢＰ（配列番号４）、ｅｃＤＨＦＲ（配列番号１）、ｈＤＨＦＲ（配列番号２）、ＥＲ（配列番号９）、ＰＤＥ５完全長（配列番号６）、ＰＤＥ５リガンド結合ドメイン（配列番号５）、及びＣＡ２（配列番号７）、またはＤＲＤ機能を維持する前述のいずれかの部分、または配列番号１、２、４、５、６、７、もしくは９またはそのＤＲＤ機能部分に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列から選択することができる。例えば、ＦＫＢＰ、ｅｃＤＨＦＲ、ｈＤＨＦＲ、ＥＲ、ＰＤＥ５、及びＣＡ２のアミノ酸配列における１つ以上の変異（切断、置換、及び欠失を含む）は、ＤＲＤを更に不安定化するのに有利であり得る。不安定化ドメインまたはリガンド結合ドメインと称され得る好適なＤＲＤは、当該技術分野でも既知である。例えば、ＷＯ２０１８／１６１０００、ＷＯ２０１８／２３１７５９、ＷＯ２０１９／２４１３１５、ＵＳ８，１７３，７９２、ＵＳ８，５３０，６３６、ＷＯ２０１８／２３７３２３、ＷＯ２０１７／１８１１１９、ＵＳ２０１７／０１１４３４６、ＵＳ２０１９／０３００８６４、ＷＯ２０１７／１５６２３８、Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１３４：３９４２（２０１２）；Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ １２６：９９５－１００４；Ｓｔａｎｋｕｎａｓ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １２：１６１５－１６２４；Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１４：１１２３－１１２７；Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１７：９８１－９８８；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：１００７－１００９；Ｍａｄｅｉｒａ ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：７５８３－７５８８；Ｐｒｕｅｔｔ－Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．５：ｅ１０００３７６、及びＦｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｅｌｉｆｅ ４：ｅ１０６０６参照（各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

理論によって限定される意味を持たないが、ＤＲＤは、対応する安定化リガンド（対のリガンドまたはリガンドとも称される）の非存在下で分解するが、安定化リガンドへの結合によってその安定性が救われる不安定なポリペプチドであると考えられる。リガンドとＤＲＤとの結合は可逆的であるため、後でリガンドを除去すると、ＤＲＤが展開し、不安定になり、最終的にユビキチン－プロテアソームシステム（「ＵＰＳ」）によって分解のためにタグ付けされる。したがって、ＤＲＤがｍｂＩＬ１５のようなペイロードに作動可能に連結されている場合、構築物全体（すなわち、ＤＲＤ＋ＩＬ１５）自体は、ＵＰＳによって不安定になり、劣化されると考えられる。しかしながら、対のリガンドの存在下では、構築物は安定化され、ｍｂＩＬ１５ペイロードは利用可能なままである。更に、ＤＲＤ安定性の条件的性質は、安定したタンパク質から不安定なＵＰＳ基板への迅速かつ非摂動的な切り替えを可能にし、ペイロードの活性レベルの調節または変調、及び／またはペイロードの活性レベルの変調を容易にし得ると考えられる。

ペイロードの存在量及び利用可能性は、ペイロードの活性化に関連するため、本開示の目的では、「存在量」、「利用可能性」、「活性化」という用語、及び「存在量及び／または活性化」という句（及び同様に、存在量のレベル、利用可能性のレベル、活性化のレベル、ならびに存在量及び／または活性化のレベル）は、本開示全体を通して交換可能に使用され、別段に明示的に記載されていない限り、または文脈において無意味である場合を除き、一般に「活性化」と称される。更に、存在量の測定値及び利用可能性は、活性レベルの代理として使用され、活性レベルを反映するために本明細書で使用され得る。したがって、リガンドの非存在と比較して、有効量のリガンドの存在下でのペイロードの存在量または利用可能性の変化は、任意選択で、活性レベルの変化を測定するための代理として機能する。

多数のＤＲＤが本明細書に記載されているが、当業者であれば、追加のＤＲＤを識別することができる。例として、ＤＲＤは、ライブラリスクリーニング及び構造誘導エンジニアリングを使用して識別され、リガンドの非存在下で十分な不安定性を有し、リガンドの存在下で十分な安定性を有する最適なＤＲＤ変異形を選択することができる。変異型ＤＲＤ候補を用いて細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）を形質導入することにより、ランダム変異誘発スクリーニングを用いて変異型ライブラリを生成することができる。濃縮ライブラリを生成するために、次いで、所望の特徴（低い基底活性／発現及び高いダイナミックレンジ）を有する細胞を、リガンドの濃度の範囲にわたってレポーター遺伝子の発現を試験することによって選択する。次いで、単一細胞クローンを作製し、特徴付けて、候補ＤＲＤを同定する。ＤＲＤは、それが動作可能に連結しているペイロードの特徴、例えば、存在量または活性レベルに影響を及ぼすことができる。更に、１つ以上のＤＲＤは、リガンドと相互作用して、ペイロードの特性のリガンド依存的な可逆的調節を提供する。ＤＲＤは対のリガンドに応答する。任意選択で、ＤＲＤは、ＦＤＡが承認した小分子等の小分子薬物である対のリガンドに応答する。しかしながら、当業者は、システムの特定のニーズを満たすために、ＤＲＤ及びその対のリガンドを選択することができる。本明細書に記載の特定のＤＲＤに対する安定化リガンド及びそれらの使用の例は、表１及び２０１２年３月２２日に出願された米国特許第９，４８７，７８７号、２０１３年９月６日に出願された米国特許第１０，１３７，１８０号、２０１８年６月１２日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３７００５、２０１９年６月１２日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３６６５４、２０１９年１０月２３日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５７６９８、２０２０年３月６日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２１５９６、及び２０１９年９月２日に出願された米国特許出願第１６／５５８，２２４号に示されており、前述の出願の全ての開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

任意選択で、本開示のＤＲＤは、金属酵素のスーパーファミリーである炭酸脱水酵素のメンバーであるヒト炭素脱水酵素２（ｈＣＡ２）に由来し得る。本開示のＤＲＤは、ＣＡ２のアミノ酸１～２６０（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ００９１８）（配列番号７）に由来し得る。任意選択で、ＤＲＤは、親ＣＡ２配列のアミノ酸２～２６０（例えば、アミノ酸２～２６０）を含むＣＡ２に由来する。これは、本明細書では、ＣＡ２ Ｍ１ｄｅｌ変異（ＣＡ２、配列番号５５）と称される。任意選択で、本開示のＤＲＤは、ヒト炭酸脱水酵素２の領域またはその全体を含み、Ｍ１ｄｅｌ、Ｌ１５６Ｈ、及びＳ５６Ｎから選択される全長配列に対する１つ以上の変異を更に含む。任意選択で、ＤＲＤは、配列番号７、２６、５５、５６、及び５７からなる群から選択される。

例として、改変ＴＩＬは、ＩＬ１５ポリペプチド成分に対してＣ末端である膜貫通ドメインと、膜貫通ドメインに対してＣ末端である細胞内尾部とをコードする核酸とを含むことができる。

改変ＴＩＬの構築物及び構築物成分の非限定的な例を表２に示す。ＯＴ－ＩＬ１５－２９２として指定される構築物は、Ｎ末端からシグナル配列、ＩＬ１５、（ＧＳ）_１５リンカー、ヒンジ領域、膜貫通領域、及び細胞内尾部を含む。ＯＴ－ＩＬ１５－２９３として指定される構築物は、Ｃ末端にＤＲＤ（具体的には、ＣＡ２ ＤＲＤ（Ｍ１ｄｅｌ、Ｌ１５６Ｈ））を含む。

十分なダイナミックレンジ（すなわち、ゼロから最大飽和までのリガンドの変動に対応する許容可能な活性範囲）で調節可能なＤＲＤに作動可能に連結されたＩＬ１５のような膜連結サイトカインを生成するために、ポリペプチドは、Ｎ末端からペイロード（ＩＬ１５）、リンカー、ヒンジ、膜貫通領域、尾部、及びＤＲＤを任意選択で含む。尾部及び／またはリンカーならびに尾部及びリンカーの長さは、リガンドの非存在下での活性レベルに影響を及ぼし得、いくつかの実施形態では、特定の尾部及び／またはリンカーならびに長さは、低い基底活性レベル及びリガンド応答性を維持しながらオン状態（例えば、最大活性レベル）を最大化するように選択される。特定のヒンジは、コンフォメーションの変化を可能にし得、それによって、十分なダイナミックレンジにわたってリガンドの応答性に影響を与え得る。

本明細書に記載のｍｂＩＬ１５を発現する改変ＴＩＬは、いくつかの利点を有する。第一に、改変ＴＩＬは、フィーダー細胞（例えば、４１ＢＢＬ及びＩＬ２１（任意選択でｍｂＩＬ２１）を発現するＫ５６２フィーダー細胞）の存在下で、インビトロで拡張することができる。重要なことに、ＲＥＰ前段階に続いて、改変ＴＩＬは、外因性サイトカインの非存在下で、インビトロで拡張することができ、拡張ＴＩＬは、活性化され、ＩＬ２等の外因性サイトカインの投与なしに、インビボで更に拡張することができる。

複数の改変ＴＩＬを含むＴＩＬの集団は、拡張を受けたＴＩＬの亜集団（すなわち、フィーダー細胞、及びＩＬ２１及び４１ＢＢＬ等の刺激分子を有するＲＥＰ）を含むことができる。拡張ＴＩＬは、いくつかの利点を実証する。例えば、ＲＥＰを受けた改変ＴＩＬは、次いで、フィーダー細胞を欠く培養物中で生存することができる。より具体的には、ｍｂＩＬ１５を発現するように操作されたＴＩＬは、外因性サイトカイン、例えば、ＩＬ２等のインターロイキンの非存在下で、非操作細胞よりも長く生存することができる。ＤＲＤに作動可能に連結されたｍｂＩＬ１５を発現するように操作されたＴＩＬは、リガンドの存在下ではあるが、外因性サイトカインの非存在下の方が、非操作ＴＩＬよりも生存率が高い。更に、拡張ＴＩＬの集団は、特定のＴＩＬの優先的な拡張を示し、したがって、非拡張ＴＩＬの対照集団と比較して、ＴＩＬの亜型がより少ないかまたはより多いことを示す。本明細書で使用される非拡張ＴＩＬの対照集団は、拡張ＴＩＬと同様に改変されたが、ＲＥＰを受けていないＴＩＬを指す。

拡張ＴＩＬの集団は、例えば、非拡張ＴＩＬの対照集団と比較して、ＣＤ８＋細胞の割合が高く、ＣＤ４＋細胞の割合が低く、ＣＤ４＋：ＣＤ８＋比が低い。ＣＤ８＋ＴＩＬは、細胞傷害性分子及びサイトカインを放出することによってがん細胞を殺す重要な役割を果たすと考えられており、腫瘍中のＣＤ４＋ＴＩＬの数（すなわち、ＣＤ４＋：ＣＤ８＋比）と比較したＣＤ８＋ＴＩＬの数は、陽性転帰と相関することが見出されている。

更に、特定の実施形態では、拡張ＴＩＬの集団は、非拡張ＴＩＬの対照集団におけるＴ_ｒｅｇ細胞の割合と比較して、ＣＤ４ Ｔ_ｒｅｇ細胞の割合が低い。ＣＤ４ Ｔ_ｒｅｇ細胞は、免疫反応を抑制することによって、免疫寛容及び免疫恒常性において役割を果たす。したがって、ＴＩＬを用いたＡＣＴ等の免疫療法において、より低い割合のＴ_ｒｅｇ細胞が望ましい。

拡張ＴＩＬの集団はまた、より少ない消耗されたＴＩＬ及びより多くの多官能性ＴＩＬを示す。拡張ＴＩＬの集団は、非拡張ＴＩＬの対照集団におけるＰＤ１＋細胞の割合と比較して、ＰＤ１＋細胞の割合が低い。更に、拡張ＴＩＬの集団は、非拡張ＴＩＬの対照集団におけるＴＮＦα及びＩＦＮγの両方を産生するＴＩＬの割合と比較して、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の両方を産生する細胞の割合が高い。

本明細書では、非改変ＴＩＬの亜集団と、任意選択でＤＲＤに作動可能に連結されたｍｂＩＬ１５を含む改変ＴＩＬの亜集団とを含む、ＴＩＬの混合集団が提供される。改変ＴＩＬの亜集団は、４１ＢＢＬ及びＩＬ２１（例えば、ｍｂＩＬ２１）を発現するＫ５６２フィーダー細胞の存在下で拡張する。改変ＴＩＬの亜集団は、４１ＢＢＬ及びＩＬ２１を発現するＫ５６２フィーダー細胞の存在下での非操作ＴＩＬの亜集団よりも拡張する。改変ＴＩＬのこの優先的な拡張は、ＲＥＰ中に外因性ＩＬ２が存在しない場合に生じる。

改変腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の作製方法
ＴＩＬは、当該技術分野で既知の方法を使用して、腫瘍またはその生検から単離することができる。例えば、腫瘍の断片（例えば、サイズが１～５ｍｍ）は、酵素的消化（例えば、コラゲナーゼ（０．５～５ｍｇ／ｍＬ）、ＤＮＡｓｅ、ヒアルロニダーゼ）または機械的解離に供される。解離した細胞を、他の細胞よりもＴＩＬの増殖を優先する条件下で（すなわち、ＩＬ２の存在下で）細胞培養培地中でインキュベートする。この段階はＲＥＰ前の段階である。ＲＥＰ前段階では、細胞を、２０００～８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２（例えば、６０００ＩＵ／ｍｌ）の存在下で、及び任意選択で、不活性化ヒトＡＢ血清の存在下で培養することができる（例えば、３～２８日）。いくつかの実施形態では、細胞をある期間、一般に３～２８日間培養される。いくつかの実施形態では、このＲＥＰ前細胞集団は、７～２１日間培養される。

ＲＥＰ前のＴＩＬは、凍結保存することができる。凍結保存された細胞は、活性化の前に解凍され、放置される。細胞は、例えば、プレート結合ＯＫＴ３、可溶性ＯＫＴ３、共刺激抗体（例えば、ＣＤ２８または４１ＢＢに対する抗体）＋ＯＫＴ３、ビーズまたは断片に結合した抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体等を使用して活性化することができる。活性化ステップは、１～２日以上であり得る。活性化後、次いで、１つ以上のＴＩＬを操作して、ＩＬ１５をコードする第１の核酸配列及び膜貫通ドメインをコードする第２の核酸配列を有するベクターを用いて１つ以上のＴＩＬを形質導入することによって、膜結合型インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）を発現させる。任意選択で、ベクターは、シグナルペプチド、リンカー、ヒンジ、細胞内尾部、またはＤＲＤをコードする１つ以上の核酸配列を更に含む。ベクトルは、所望のｍｂＩＬ１５を達成するための任意の数の方法で構成することができる。例示的な核酸構築物としては、それぞれ、ＤＲＤの有無にかかわらず、ＯＴ－ＩＬ１５－２９３及びＯＴ－ＩＬ１５－２９２をコードする核酸配列が挙げられる。したがって、ベクターは、任意選択で、配列番号２９、３１、５３、または５４を含む。ベクターは、プロモーター配列及び他の調節エレメント（エンハンサー、翻訳制御エレメント（例えば、ＩＲＥＳ）、及び半減期を制御するエレメント）等の追加のエレメントを含むか、またはコードする。ベクターは、任意選択で、翻訳を制御するエレメント（例えば、ＩＲＥＳ、ＷＰＲＥ等）をコードする核酸配列を含むか、または含むことができる。

ベクターは、ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、及び人工染色体から選択することができる。例として、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターであり得る。例として、ウイルスベクターは、ＩＬ１５をコードする核酸及び膜貫通ドメインをコードする核酸を含むヒヒのエンベロープ擬似型レンチウイルスベクターを含むことができる。発現時に、ＩＬ１５は、膜貫通ドメインに会合し、膜貫通ドメインによって膜結合される。

ベクターは、針、エレクトロポレーション、ソノポレーション、ハイドロポレーション、化学的担体（例えば、無機粒子（例えば、リン酸カルシウム、シリカ、金））、及び／または化学方法等の非ウイルス方法によって、任意選択で細胞に移入される。いくつかの実施形態では、合成または天然の生分解性薬剤は、陽イオン性脂質、脂質ナノエマルジョン、ナノ粒子、ペプチドベースのベクター、またはポリマーベースのベクター等の送達のために使用される。

ＩＬ１５をコードする核酸は、ゲノムまたは非ゲノム核酸であり得る。すなわち、ＩＬ１５コード核酸を送達するために使用される送達系は、ＴＩＬのゲノムに組み込むことができ、または非組み込み（すなわち、エピソーム）であり得、またはＲＮＡベクターを使用してＲＮＡとして細胞質内に移入することができる。

ｍｂＩＬ１５を含むＴＩＬは、ＲＥＰ段階（例えば、５～２１日、または７～１４日を含む、その間の任意の量）で拡張される。実施例に更に記載されるように、ＩＬ１５を発現するように改変されたＴＩＬは、Ｋ５６２フィーダー細胞ならびに４１ＢＢＬ及びＩＬ２１の存在下で拡張される。特定の実施形態では、Ｋ５６２フィーダー細胞は、膜結合型ＩＬ２１（ｍｂＩＬ２１）であり得る４１ＢＢＬ及びＩＬ２１を発現するように操作される。ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを拡張するこの方法は、ＲＥＰ中のＩＬ２、ＩＬ７、またはＩＬ１５等の外因性サイトカインの必要性を減少または排除する。いくつかの実施形態では、改変ＴＩＬは、ｍｂＩＬ２１及び４１ＢＢＬを１：１～１００：１、１：１～５０：１、１：１～２０：１、１：１～１０：１、または２：１～５：１の割合で発現するように改変されたＫ５６２細胞（ＴＩＬ：フィーダー細胞）で培養される。

フィーダー細胞が本発明の方法で使用される前に、それらは最初に複製を不能にされる。フィーダー細胞を処置する様々な手段が当該技術分野において既知である。そのような方法としては、照射（例えば、ガンマ線またはＸ線による）、マイトマイシン－Ｃ処理、電気パルス、軽度の化学固定（例えば、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドによる）、またはフィーダー細胞の自殺遺伝子による形質導入が挙げられる。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞はヒト細胞である。例として、照射は、例えば、セシウム源またはＸ線源によって送達される２５～３００Ｇｙであり得る。

フィーダー細胞上での拡張の後、ＴＩＬは、任意選択で、フィーダー細胞から単離される。本明細書で使用される場合、単離という用語は、ＴＩＬがフィーダー細胞等の他の成分を完全に含まないことを示唆するものではなく、ＴＩＬがフィーダー細胞を比較的含まないことを示唆するに過ぎない。

本明細書では、ｍｂＩＬ１５を含むＴＩＬ、ＴＩＬの集団、またはＴＩＬの亜集団を作製する方法が提供される。ｍｂＩＬ１５をコードする核酸配列、ｍｂＩＬ１５をコードする核酸配列を含むベクター、４１ＢＢＬ及びＩＬ２１を発現するように改変された複製不能Ｋ５６２フィーダー細胞、ならびに本明細書に記載の方法によって作製されるＴＩＬもまた提供される。

薬学的組成物
本明細書では、ＡＣＴでの使用に好適な薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、拡張ＴＩＬ等のＴＩＬ及び薬学的に許容される担体を含むことができる。薬学的組成物中のＴＩＬの集団は、任意選択で、改変ＴＩＬ（すなわち、ＩＬ１５を発現するように操作されたＴＩＬ）及び非改変ＴＩＬ（すなわち、形質導入されていないＴＩＬまたは非操作ＴＩＬ）の亜集団を含むＴＩＬの混合集団である。

「担体」という用語とは、化合物、組成物、物質、または構造であって、化合物または細胞と組み合わせると、その意図される用途または目的のために、化合物または細胞の調製、貯蔵、投与、送達、有効性、選択性、または任意の他の特徴を補助または促進する化合物、組成物、物質、または構造を意味する。例えば、ＴＩＬの任意の分解を最小限に抑え、対象における任意の有害な副作用を最小限に抑えるために、担体を選択することができる。そのような薬学的に許容される担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、人工脳脊髄液、デキストロース、及び水を含むがこれらに限定されない、無菌の生体適合性の薬学的担体が挙げられる。薬学的に許容されるとは、許容されない生物学的効果を引き起こすことなく、またはＴＩＬと有害な様式で相互作用することなく、ＴＩＬまたはＴＩＬ集団とともに個体に投与することができる、生物学的またはその他の点で好ましくないとは言えない物質を意味する。

任意選択で、薬学的組成物は、凍結保護剤（凍結保存剤）を更に含む。このような凍結保護剤は、ＴＩＬが将来の使用のために凍結された場合、許容できない細胞溶解または損傷を防止するのに役立つ。凍結保護剤は、当該技術分野において既知である。かかる凍結保護剤は、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中から選択され得る。

本明細書に記載の薬学的組成物は、任意選択で、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤（例えば、ヒト血清アルブミンまたはポリマー材料（例えば、ＰＥＧ））を更に含む。

本開示の組成物は、送達に好適な任意の方法で製剤化することができる。ＴＩＬは、例えば、ナノ粒子、ポリ（乳酸コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、脂質、リポプレックス、リポソーム、ポリマー、炭水化物（単糖を含む）、カチオン性脂質、またはそれらの組み合わせで投与され得る。

本明細書に提供される薬学的組成物の説明は、主にヒトへの投与に好適な薬学的組成物を対象とするが、そのような組成物が、一般に、任意の他の動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に好適であることを当業者によって理解されるであろう。薬学的組成物の投与が企図される対象には、牛、馬、ニワトリ及びブタ等の農業動物、猫、イヌ等の家畜、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、及び非ヒト霊長類等の研究動物が含まれるが、これらに限定されない。

治療方法
本明細書では、対象（すなわち、レシピエント対象）に、ｍｂＩＬ１５を発現する改変ＴＩＬまたはその集団（拡張ＴＩＬの集団もしくは亜集団、またはその薬学的組成物を含む）を投与することによって、対象においてがんを治療する方法を提供する。がんは、黒色腫、ブドウ膜（眼）黒色腫、子宮頸癌、卵巣癌、頭頚部癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膀胱癌、乳癌、腎細胞癌、膵臓癌、前立腺癌、中枢神経系の癌、胃腸癌（例えば、結腸直腸癌）であり得るが、これらに限定されない。

これまでのＴＩＬ療法は、ＴＩＬの投与と同時に、及びそれに続いて、高用量のＩＬ２の同時投与を必要とする。しかし、ＴＩＬによる従来の治療とは異なり、本方法は、ＩＬ２の投与を必要としない。むしろ、改変ＴＩＬは、ｍｂＩＬ１５を発現することによって、ＴＩＬの増殖及び活性を刺激するのに十分なサイトカイン源を提供する。

がんを治療する方法は、本明細書に記載の腫瘍から１つ以上のＴＩＬを単離することと、１つ以上のＴＩＬに、ｍｂＩＬ１５を発現する核酸を導入することと、を更に含むことができる。ＴＩＬは、レシピエント対象の腫瘍（自己供給源）から単離され得る。ＴＩＬが単離される腫瘍は、原発腫瘍または転移性腫瘍であり得る。したがって、生検由来のＴＩＬまたは原発腫瘍の一部が凍結保存される場合、それらを解凍し、後日、得られる転移性腫瘍または異なる原発腫瘍の治療に使用することができる。代替的に、ＴＩＬは、ドナー（同種異系源）に由来する腫瘍から単離され得、ドナー対象はレシピエント対象ではない。治療される同じ腫瘍に由来する単離されたＴＩＬは、腫瘍と同一であるネオアンチゲン及び不均一性を有するという利点を有する。同じ対象の異なる腫瘍から、またはドナー対象の腫瘍から単離されるＴＩＬは、ＴＣＲの四量体染色等の当該技術分野で既知の方法によって、レシピエント対象の腫瘍に存在するがん抗原との反応性のために選択することができる。ＴＩＬがドナー対象から単離される場合、方法は、移植片対宿主応答を低減するために、レシピエント対象に対してＨＬＡ適合であるドナー対象を選択することを更に含むことができる。

ＴＩＬは、腫瘍試料の外科的切除、組織生検、針生検、または最初のステップとしての他の手段から得ることができる。ＴＩＬは、次いで、本明細書に記載されるように形質導入され、次いで、エクスビボで拡張されて、ＡＣＴのために細胞のより大きな集団を提供する。

改変ＴＩＬの投与は、約１０００個の細胞／注射～最大約１００億個の細胞／注射、例えば２×１０^１１、１×１０^１１、１×１０^１０、１×１０^９、１×１０^８、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^４、５×１０^４、１×１０^３、５×１０^３個の細胞／注射、または端点を含む数字の任意の２つの間の任意の範囲の量を含み得る。任意選択で、約１×１０^８～約１×１０^１１個の細胞を対象に投与する。

本開示のＴＩＬは、任意の好適な経路によって投与することができる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内、くも膜下腔内、リンパ内投与によって投与される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、静脈内注入、または動脈内注入によって投与される。任意選択で、ＴＩＬは、局所的に、例えば、腫瘍または腫瘍を供給する血管に直接投与される。

ＴＩＬは、単回用量で投与することができるが、特定の事例では、複数回用量で投与することができる。

治療方法は、ＴＩＬの投与前に、レシピエント対象のリンパ球枯渇を更に含むことができる。黒色腫のヒト及びマウスモデルにおける研究は、リンパ球枯渇が、Ｔ細胞増殖を抑制することができる制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ細胞）及び末梢骨髄由来サプレッサー細胞を含む陰性調節細胞を枯渇させることを示唆している。したがって、リンパ球枯渇は、養子移入されたＴＩＬの増殖を助ける。リンパ球枯渇コンディショニングレジメンとしては、例えば、ＴＩＬの養子移入前に、全身照射またはリンパ球枯渇剤を用いてレシピエント対象を前処理することが挙げられる。この前調整（プリレコンディショニング）により、ＴＩＬは、Ｔ_ｒｅｇ細胞を排除し、正常細胞が新たに注入されたＴＩＬと競合する潜在的なサイトカインシンクを除去することによって拡張することができる。

リンパ球枯渇剤の一例は、フルダラビン（例えば、０．５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌの用量で）である。いくつかの実施形態では、フルダラビンは、ＴＩＬ投与の前に１～７日間、１μｇ／ｍｌの濃度で毎日投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビンは、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、３５ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日、または４５ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビン処置は、２５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間投与される。

いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、０．５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの濃度で、その活性形態であるマホスファミドを提供するために投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、ＴＩＬ投与前の１～７日間、毎日１μｇ／ｍＬの濃度でマホスファミドを提供するために投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、５０ｍｇ／ｍ^２／日、７５ｍｇ／ｍ^２／日、１００ｍｇ／ｍ^２／日、１５０ｍｇ／ｍ^２／日、１７５ｍｇ／ｍ^２／日、２００ｍｇ／ｍ^２／日、２２５ｍｇ／ｍ^２／日、２５０ｍｇ／ｍ^２／日、２７５ｍｇ／ｍ^２／日、または３００ｍｇ／ｍ^２／日の投与量で投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは静脈内（ｉ．ｖ．）に投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間、静脈内（ｉ．ｖ）に投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ^２／日で４～５日間、静脈内（ｉ．ｖ．）に投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ^２／日で４日間、静脈内（ｉ．ｖ．）に投与される。

特定の実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇで２日間及びフルダラビン２５ｍｇ／ｍ^２で５日間またはシクロホスファミド２５０ｍｇ／ｍ^２／日で４日間及びフルダラビン２５ｍｇ／ｍ^２で４日間等のリンパ球枯渇剤の組み合わせの投与を含む。

ＴＩＬによって発現されたＩＬ１５がＤＲＤに作動可能に連結されている場合、本方法は、ＴＩＬのＩＬ１５活性を増加させるのに有効な量でＤＲＤに結合する第２の薬剤（リガンド）をレシピエント対象に投与することを、更に含むことができる。リガンドは、選択された量のＩＬ１５活性を対象に提供する投与レジメンを使用して投与することができる。リガンドは、対象における連続的または断続的なＩＬ１５活性を達成するために送達することができる。対象への投与の頻度及び持続時間を決定することは、例えば、ＩＬ１５のより多くの活性が所望され、より少ない活性が所望される場合にリガンド投与を減少または排除する場合に、リガンドの投与のより高い用量またはより長い投与持続時間を提供することを考慮することによって、当業者によって決定される。リガンド投与の用量及び持続時間、ならびに結果として生じるＩＬ１５活性も、対象における許容できない副作用または毒性を回避するために選択される。したがって、対象は、有効量のＩＬ１５を達成するために、有効量のリガンドを投与される。有効量という用語は、所望の生理学的応答を生成するために必要な任意の量として定義される。リガンドを投与するための有効量及びスケジュールは、得られるＩＬ１５の量、ＩＬ１５の活性に基づいて、またはＩＬ１５活性の効果の１つ以上の徴候に基づいて、当業者によって経験的に決定され得る。リガンドの投与の範囲は、ゼロから飽和用量までの範囲であり、結果として生じるＩＬ１５活性は、リガンドの非存在下での基底レベルから、飽和量のリガンドの存在下での最大レベルまでの範囲である。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞を、選択された量のリガンドと接触させることを含み、選択された量のリガンドは、ＩＬ１５ペイロードの選択された活性レベルをもたらす。特定の実施形態では、本方法は、代替的に、細胞を様々な選択された量のリガンドと接触させて、基底レベルから最大レベルまで及ぶ様々な選択された活性レベルを達成することを含む。任意選択で、リガンドに対する所望の用量応答を可能にする十分なダイナミックレンジ及びペイロードの併用活性範囲を有する（例えば、所与のリガンド及びペイロードの場合、オフ状態及び最大ペイロード活性の差異の範囲は、リガンドの少なくとも１０倍の範囲から生じるであろう）。この十分なダイナミックレンジにより、微調整及び許容できないほど急な線量反応曲線が可能になる。

リガンドは、連続的または断続的なＩＬ１５ペイロード活性を達成するために送達することができる。連続的なペイロード活性は、実質的に一貫した活性レベルであってもよく、または活性レベルは、変調されてもよい。オフ状態とオン状態との間の断続的な活性は、オフ状態と実質的に一貫したオン状態との間、またはオフ状態と様々なオン状態活性レベルとの間の活性を変調することを含む。リガンドのより高い用量またはより長い投与期間は、ＩＬ１５ペイロードのより多くの活性が所望される場合に投与され、より少ない活性が所望される場合にリガンド用量の減少または排除が選択される。リガンドの投与の投与量または頻度、ならびに結果として生じるＩＬ１５ペイロードの量及び活性は、許容できない副作用を引き起こすほど大きくあってはならず、患者の年齢、患者の一般的状態、性別、治療されるがんの種類、がんの程度、及び他の治療薬が治療レジメンに含まれるかどうかによって変化する。所与のクラスのリガンドに対する適切な用量についてのガイダンスは、文献中に見出され得る。

いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５または調節可能なｍｂＩＬ１５（すなわち、ＤＲＤに作動可能に連結された）で改変されたＴＩＬは、１つ以上の免疫チェックポイント制御剤と組み合わせて投与することができる。チェックポイント阻害剤には、ＰＤ－１を標的とするか、またはＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を阻害する抗体が含まれ、これらに限定されないが、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、ペムブロリズマブ（ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ（ラムブロリズマブ）、ＭＫ０３４７５またはＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ＪＳ００１（ＳｈａｎｇＨａｉ ＪｕｎＳｈｉ）、モノクローナル抗ＰＤ－１抗体ＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ，Ｉｎｃ．）、ピディリズマブ（抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＣＴ－０１１、Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体ＢＧＢ－Ａ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ）、及び／または抗ＰＤ－１抗体ＳＨＲ－１２１０（ＳｈａｎｇＨａｉ ＨｅｎｇＲｕｉ）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ－１１０６（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、及び／またはヒト化抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が含まれる。対象は、治療の結果について任意選択で監視される。したがって、例えば、試料中の悪性細胞の数、試料中の循環腫瘍ＤＮＡ、または撮像時の固形腫瘍のサイズを検出することができる。所望の評価項目が達成される場合（例えば、がんの治療の成功を示す）、リガンドは、ＩＬ１５を低減または排除するように低減または中止することができる。同様に、対象がＩＬ１５からサイトカインストーム、アレルギー反応、または他の有害作用を発症した場合、リガンドを低減または中止することができる。

定義
約及び近似という用語は、量、濃度、用量、時間、温度、活性、レベル、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、重量、位置、長さ等の測定可能な値を指すために使用される場合、指定された量、濃度、用量、時間、温度、活性、レベル、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、重量、位置、長さ等の±１５％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または更には±０．１％の変動を包含し得る実験誤差に起因する変動を含むことを意味する。全ての測定値または数値は、たとえ測定値または数値が約という単語によって明示的に修正されていなくても、約という単語によって修正されると暗黙的に理解される。参照ポリペプチド内の領域の配置または位置に関連して約及び近似という用語が使用される場合、これらの用語は、±最大２０個のアミノ酸残基、±最大１５個のアミノ酸残基、±最大１０個のアミノ酸残基、±最大５個のアミノ酸残基、±最大４個のアミノ酸残基、±最大３個のアミノ酸残基、±最大２個のアミノ酸残基、または更には±１個のアミノ酸残基のバリエーションを包含する。

本明細書で使用される場合、作動可能に連結されることは、対のリガンドの存在下で、ＤＲＤがＩＬ１５に直接的または間接的に連結されて、ＩＬ１５の測定可能な特性を変化させる（例えば、対のリガンドの非存在下での活性レベルと比較してＩＬ１５の活性レベルを変化させる）ことを意味する。いくつかの実施形態では、ＩＬ１５の量及び／または活性の測定レベルは、リガンドの非存在下での発現または活性の測定レベルと比較して、有効量のリガンドの存在下で増加する。リガンドの有効量は、ＩＬ１５の量または活性の測定値の増加を見るために必要なリガンドの量を意味する。いくつかの実施形態では、有効量は、許容できない毒性またはオフターゲット効果を生み出すほど大きくはない。任意選択で、測定可能な特徴は、治療成績、試料中のペイロードの量、またはペイロードの生物学的活性レベル（ペイロードの量を測定することは、そのための代理として機能することができる）である。

リンクまたは結合されたフレーズ等が使用される場合、別段に明示的に記載されていない限り、または文脈において無意味でない限り、フレーズは直接的または間接的に続くと理解される。したがって、ｍｂＩＬ１５にリンクされた、結合された、または関連付けられたＤＲＤへの言及は、各ケースで、ＤＲＤがＩＬ１５に直接的または間接的にリンクされていることを意味する。

本明細書で使用される場合、ＴＩＬの生存、及びＴＩＬの持続性という用語は、互換的に使用される。生存は、ＴＩＬの持続的な効果に基づいて決定される。

本明細書で使用される場合、拡張は、機能的ＲＥＰ中に生じる細胞数の機能的増加を指すために使用される。機能的ＲＥＰは、治療用に十分な細胞数を提供する拡張細胞集団をもたらす。一方、ＲＥＰの不成功は、細胞数の機能的な倍率増加の欠如をもたらすであろう。非拡張細胞には、ＲＥＰ前の細胞と、拡張細胞集団と比較してＲＥＰで機能的拡張を受けていない細胞とが含まれる。非機能的拡張は、拡張細胞集団の１０％以下の拡張を含む。例えば、所与の期間内に１００倍拡張したＴＩＬ集団は、１０倍以下しか拡張しなかった拡張されていない集団と比較することができる。したがって、本明細書で使用される場合、拡張細胞または拡張細胞集団は、機能的ＲＥＰを受けた細胞または細胞の集団を指す。拡張されていない細胞または細胞の集団は、細胞の集団の機能的拡張をもたらさなかったＲＥＰ前またはＲＥＰ後の細胞または細胞の集団を指す。例として、特定の改変ＴＩＬは、改変Ｋ５６２フィーダー細胞上で拡張するが、ＰＢＭＣ上での拡張倍率は、改変Ｋ５６２フィーダー細胞上での拡張倍率の１０％未満である。したがって、拡張されていないＴＩＬは、ＰＢＭＣ上でのＲＥＰ後の改変ＴＩＬのＲＥＰ前または改変ＴＩＬであり得る。

当該技術分野で既知の「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上の配列間の関係を指す。当該技術分野では、同一性はまた、２つ以上の残基（アミノ酸または核酸）の鎖間の一致数によって決定される、配列間の配列関連性の程度を意味する。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、アルゴリズム）によって対処されるギャップアラインメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列間の同一の一致率を測定する。関連配列の同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。そのような方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１、及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載された方法が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、この開示の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、本明細書に記載され、当業者に既知の配列アライメントプログラム及びパラメータによって決定されるように、その特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、しかし１００％未満の配列同一性を有する。アライメントのためのそのようなツールには、ＢＬＡＳＴ ｓｕｉｔｅのものが含まれる（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｒｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），”Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。

本明細書で使用される「フィーダー細胞」という用語は、細胞培養物中に分泌するか、またはフィーダー細胞膜成長または生存因子上に提示することによって等、培養物中のＴＩＬの拡張を支持する細胞を指す。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞は、成長停止している（すなわち、複製不能である）。

本明細書で使用される場合、対象及び患者は同義語として使用され、ヒト対象または患者に限定されるものではない。

本明細書で使用される治療は、がんの１つ以上の徴候または症状の軽減または遅延を指す。一例として、疾患の測定可能なパラメータにおける少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれ以上の好ましい変化は、効果的な治療を示すことができる。したがって、疾患の治療または改善の有効性は、例えば、疾患の進行、疾患の寛解、症状の重症度、疼痛の軽減、生活の質、治療効果を維持するために必要な薬物の用量、疾患マーカーのレベル、または治療もしくは治療のために標的とされる所与の疾患に適切な任意の他の測定可能なパラメータを測定することによって評価することができる。本開示の組成物の投与に関連して、がん治療の有効量は、臨床的に適切な方法での投与が、症状の改善、治癒、疾患負荷の減少、腫瘍質量または細胞数の減少、寿命の延長、生活の質の改善、または特定のタイプのがんの治療に精通した医師によって一般的に良いと認識される他の効果等、少なくとも統計的に有意な一部の患者に対する有益な効果をもたらすことを示す。

範囲が指定されている場合、端点が含まれる。更に、別段の指示がない限り、または当業者の文脈及び理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈で明確に別段の指示がない限り、この開示の異なる実施形態では、記載された範囲内の任意の特定の値またはサブ範囲を、範囲の下限の単位の１０分の１まで想定することができることを理解されたい。

本開示の１つ以上の実施形態の詳細は、説明及び添付の図面に記載されている。他の実施形態が利用され、この開示の範囲から逸脱することなく構造的またはプロセス的変更が行われ得ることを理解されたい。言い換えれば、例示的な実施形態及び態様が記載される。しかし、そのような実際の実施形態の開発では、臨床的に関連する制約へのコンプライアンス等、開発者の特定の目標を達成するために多数の実装固有の決定が行われ得ることがあり、それは実装ごとに異なる場合があることを理解されたい。更に、そのような開発努力は複雑で時間がかかるかもしれないが、それにもかかわらず、この開示の利益を有する当業者にとっては日常的な仕事であることを理解されたい。

本明細書で引用される刊行物及びそれらが引用される資料は、参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる。

以下の実施例は、本明細書に記載の方法及び組成物の特定の態様を更に例示することを意図しており、特許請求の範囲を限定することを意図していない。

実施例１：患者の腫瘍試料からのＴＩＬの単離及び拡大（ＲＥＰ前培養）
黒色腫及び頭頸部腫瘍試料は、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋから入手した。腫瘍試料を、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）緩衝液中で１～３ｍｍの断片に切断し、断片を、６０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び０．１ｍｇ／ｍＬのＮｏｒｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を含有する２ｍＬのＴＩＬ培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ＨＥＰＥＳ、５０μＭの２－メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０）に、１個の断片／ウェルでマルチウェルプレートに入れた。培地の半分を、５日目からＩＬ２を含有する新鮮な培地に置き換え、細胞を複数のウェルまたはフラスコに分割して、それらが３週間にわたってコンフルエントになった。この培養プロセスは、急速拡張プロトコル前（ＲＥＰ前）と称される。ＲＥＰ前の後、ＴＩＬを等分し、細胞凍結培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ、Ｂｕｌｌｄｏｇ Ｂｉｏ、またはＣｒｙｏｓｔｏｒ－１０、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で凍結し、液体窒素中で長期間保存した。

ＲＥＰ前培養前後のＴ細胞の頻度変化を決定するために、ＲＥＰ前培養の前に腫瘍片の一部をコラゲナーゼとＤＮａｓｅ Ｉで消化して単細胞懸濁液を作成し、ＲＥＰ前培養後に得た細胞と比較した。Ｔ細胞の頻度を、蛍光色素複合抗ＣＤ４５及び抗ＣＤ３抗体を使用してフローサイトメトリーによって分析した。図１に示されるように、培養前腫瘍細胞懸濁液中の細胞のほぼ半分（４４．２９±２１．６７％）はＣＤ４５＋であり、これらのうち約４０％（約３９．８５±２３．６９％）のみがＣＤ３＋Ｔ細胞であった。ＩＬ２（ＲＥＰ前）の存在下での３週間の培養後、細胞の大部分はＣＤ４５＋（９０．３５±７．２８％）であり、造血細胞の濃縮を示し、ＣＤ３＋（８０．６４±１５．１９％）であり、Ｔ細胞の濃縮を示した。

乳房、肺、腎臓、子宮内膜、肝臓、膵臓、及び卵巣からの黒色腫腫瘍及び悪性腫瘍を含む他のヒト腫瘍タイプのＴＩＬを、上記と同じ方法で単離した。

実施例２膜結合型ＩＬ２１及び４－１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞の生成
膜結合型ＩＬ２１及び４－１ＢＢＬベクター構築体組立体
ＩＬ２１－４１ＢＢＬ－００１インサートは、リーダー配列、膜結合ＩＬ２１（ｍｂＩＬ２１）、Ｐ２Ａ配列、及び４－１ＢＢＬをコードする核酸配列を含む。ｍｂＩＬ２１核酸配列は、ＩＬ２１配列、ＩｇＧヒンジ、ＩｇＧ４鎖、ＣＤ４膜貫通ドメイン、及びＧｌｙｃｉｎｅ－Ｓｅｒｉｎｅ（グリシンセリン）（ＧＳ）リンカーを順にコードする（表３を参照）。ＩＬ２１－４１ＢＢＬ－００１インサートを含むＯＴ－ＩＬ２１－４１ＢＢＬ－００１は、標準的な分子生物学技術を使用して、ｐＥＬＮＳベクター（第３世代の自己不活性化レンチウイルス発現ベクター）で構築した。遺伝子断片（Ｇｂｌｏｃｋ）をｐＥＬＮＳベクターに挿入し、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ（ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ Ｈｉｆｉ）を使用してＥＦ１ａプロモーターの制御下に置いた。組み立てられたプラスミドを増幅のためにＥ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ ｓｔａｂｌｅ）に形質転換し、ウイルス産生を進める前に配列を確認した。

表３は、本明細書に開示されるｍｂＩＬ２１－４１ＢＢＬ構築物のドメインの核酸配列及びアミノ酸配列を示す。ＯＴ－ＩＬ１２－（２４１－２６２）及びＯＴ－ＣＤ１９－ＩＬ１２－（２９７－３１６，３１９－３３２）プラスミドを各々、標準分子生物学技術を使用して、ｐＥＬＮＳベクター（第３世代の自己不活性化レンチウイルス発現ベクター）中で構築した。ＩＬ１２をコードする遺伝子断片（Ｇｂｌｏｃｋｓまたは鎖ＤＮＡ）、グリシンセリンリンカー、種々のヒンジ、膜貫通ドメイン、及び細胞質尾部を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＴｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。遺伝子断片をｐＥＬＮＳベクターに挿入し、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ（ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ Ｈｉｆｉ）を使用してＥＦ１ａプロモーターの制御下に置いた。組み立てられたプラスミドを、ウイルス産生を進める前に、増幅及び配列確認のためにＥ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ ｓｔａｂｌｅ）に形質転換した。

ＯＴＬＶ－ＩＬ２１－４１ＢＢＬ－００１レンチウイルス産生
トランスフェクション当日、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、総体積２０ｍＬの成長培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中の１５×１０^６細胞／フラスコを含むコラーゲン被覆組織培養フラスコに播種した。トランスフェクションの１時間前に、成長培地を温めたＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ－２９３に置き換えた。ＯＴ－ＩＬ２１－４１ＢＢＬ－００１及びパッケージングプラスミドｐＲＳＶ．Ｒｅｖ、ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ及びｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２５９０）を用いて、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬及びＰ３０００エンハンサー試薬を用いて細胞をトランスフェクトした。培地を、トランスフェクション後６～８時間（時間）で、ＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ－２９３で置き換えた。ＯＴＬＶ－ＩＬ２１－４１ＢＢＬ－００１を含有する上清をトランスフェクション後２４時間で採取し、新鮮な培地を添加し、上清をトランスフェクション後４８時間で再び採取した。ウイルス上清を濾過して破片を除去し、２５，０００ｇで２時間、４℃で超遠心分離によって濃縮した。ＯＴＬＶ－ＩＬ２１－４１ＢＢＬ－００１レンチウイルスを再懸濁し、等分し、－８０℃で保存した。

ＯＴＬＶ－ＩＬ２１－４１ＢＢＬ－００１レンチウイルスによるＫ５６２細胞の形質導入
Ｋ５６２細胞を、２ｍＭのＬ－グルタミン及び１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０（完全ＲＰＭＩ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含有する成長培地中で培養した。トランスフェクション当日、Ｋ５６２細胞を、５００μＬのＫ５６２細胞成長培地中、１．５×１０^５細胞／ウェルのマルチウェルプレートに播種した。細胞をＯＴＬＶ－ＩＬ２１－４１ＢＢＬ－００１レンチウイルスで形質導入し、次いで８００ｇで、３２℃で１時間遠心分離した。細胞を２４～４８時間インキュベートし、次いで、抗体ｅＦｌｕｏｒ ７８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１：１０００）、４－１ＢＢＬフィコエリスリン（１：５０）、及びＩＬ２１アロフィコシアニン（１：５０）を用いて、フローサイトメトリーにより、ＩＬ２１及び４－１ＢＢＬの生存能及び発現を評価した。形質導入Ｋ５６２細胞を完全ＲＰＭＩ中で１７日間拡張させ、その後等分し、細胞凍結培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ、Ｂｕｌｌｄｏｇ Ｂｉｏ）を使用して凍結させ、液体窒素中で長期間保存した。これらの形質導入Ｋ５６２は、本明細書においてＫ５６２－ＩＬ２１－４１ＢＢＬと称される。

Ｋ５６２－ＩＬ２１－４１ＢＢＬ細胞をマイトマイシンＣで照射または処理した後、ＴＩＬ ＲＥＰプロセスでフィーダー細胞として使用した。照射のために、Ｋ５６２－ＩＬ２１－４１ＢＢＬ細胞を新鮮な細胞培養物から採取し、遠心分離し、５～２０×１０^６細胞／ｍＬで完全ＲＰＭＩに再懸濁させた。再懸濁細胞をＸ線照射器中で５０～２００Ｇｙに曝露させ、次いで細胞を洗浄し、ＲＥＰプロセスで直ちに使用するために３×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁した。マイトマイシンＣ処理のために、細胞を解凍し、遠心分離し、ＴＩＬ培地中で５×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁した。１０μｇ／ｍＬのマイトマイシン－Ｃを細胞に加え、細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を５０ｍＬのＴＩＬ培地で３回洗浄し、３×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁して、ＲＥＰプロセスで即座に使用した。

実施例３．レンチウイルスベクターを用いたＴＩＬの形質導入
ＩＬ１５ベクター構築体組立体
ＯＴ－ＩＬ１５－２９２及びＯＴ－ＩＬ１５－２９３（以下の配列）は、各々、標準的な分子生物学技術を使用して、ｐＥＬＮＳベクター（第３世代の自己不活性化レンチウイルス発現ベクター）中に構築した。コドン最適化ＩＬ１５、ＧＳリンカー、Ｂ７－１ヒンジ、膜貫通ドメイン、及び細胞質尾部をコードする遺伝子断片（Ｇｂｌｏｃｋｓ）を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）から購入した。遺伝子断片をｐＥＬＮＳベクターに挿入し、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ（ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ Ｈｉｆｉ）を使用してＥＦ１ａプロモーターの制御下に置いた。組み立てられたプラスミドを、ウイルス産生を進める前に、増幅及び配列確認のためにＥ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ ｓｔａｂｌｅ）に形質転換した。

表１及び表２（上記で提供される）は、本明細書に開示される構成的ｍｂＩＬ１５構築物（ＯＴ－ＩＬ１５－２９２）及びＡＣＺ制御ｍｂＩＬ１５構築物（ＯＴ－ＩＬ１５－２９３）の成分の核酸及びアミノ酸配列を示す。構築物ＯＴ－ＩＬ１５－２９３は、表１中のＣＡ２（Ｍ１ｄｅｌ、Ｌ１５６Ｈ）として標識された不安定化ドメインを含む。

表２（上記で提供される）はまた、本明細書に開示される構成的ＩＬ１５（ＩＬ１５－２９２）及びＡＣＺ制御ＩＬ１５（ＩＬ１５－２９３）構築物の核酸及びアミノ酸配列を示す。

ＢａＥＶ－擬似型レンチウイルス産生
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、７０％コンフルエントになるまで、コラーゲン被覆組織培養プレート上に播種した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬及びＰ３０００エンハンサー試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、細胞を構成的（ＩＬ１５－２９２）または調節された（ＩＬ１５－２９３）ＩＬ１５構築物、ならびにパッケージングプラスミドｐＲＳＶ．Ｒｅｖ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２５３）、ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２５１）及びＯＴ－ＢａＥＶｇ－００２（配列番号ＸＸ）を担持するｐＥＬＮＳ移入ベクターでトランスフェクトした。無血清培地（ＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ－２９３、Ｃｙｔｉｖａ）でトランスフェクション６～８時間（時間）後に培地を置き換えた。ウイルスを含有する上清をトランスフェクション後２４時間で採取し、新鮮な培地を添加し、上清をトランスフェクション後４８時間で再び採取した。ウイルス上清を濾過して破片を除去し、低速超遠心分離によって濃縮した。ウイルスを再懸濁し、等分し、－８０℃で保管した。

急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）及びＢａＥＶ－擬似型レンチウイルスベクターを用いたＴＩＬの形質導入
実施例１に記載されるように調製された頭頸部腫瘍試料から生成されたＴＩＬを、ＲＥＰ前培養中で３週間後に操作した。６０００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ２を用いて、ＴＩＬを解凍し、ＴＩＬ培地中で一晩放置にした。次に、ＴＩＬを、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を３：１のビーズ対ＴＩＬ比で、またはプレート結合ＯＫＴ３を３μｇ／ｍＬ（Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦ精製抗ヒトＣＤ３抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び６０００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ２で、２４ウェルプレート内で２４時間活性化した。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（３０μｇ／ｍＬ）を使用して、９６ウェル非コーティング細胞培養プレートを４℃で一晩コーティングした。翌日、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎを除去し、プレートをＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックし、次いでプレートをＰＢＳで洗浄した。上記のように調製したＢａＥＶ疑似型レンチウイルス上清をＴＩＬ培地中で希釈し、１～４ＴＵ／細胞のＭＯＩに対してウェル当たり１００～２００μＬの総体積で添加した。ウイルスベクターを含有するプレートを１４００ｇで２時間、３２℃で遠心分離し、次いで上清を除去した。上清除去後、１ウェル当たり１．５×１０^５個の活性化ＴＩＬを０～６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２とともに移し、３７℃で一晩インキュベートした。細胞をウイルス添加なしで同様に処理し、陰性対照として使用した（「非操作」）。形質導入の２４時間後、ＴＩＬを、合計１６～４０ｍＬのＴＩＬ培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ＨＥＰＥＳ、５０μＭの２－メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏ）を添加したＲＰＭＩ－１６４０）中で６Ｍ ＧＲＥＸウェルプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）に移した。実施例２に記載されるように、４１ＢＢＬ及びｍｂＩＬ２１で形質導入された照射またはマイトマイシン－Ｃ処理されたＫ５６２フィーダー細胞を、２：１または５：１のＫ５６２対ＴＩＬの割合で培養物に添加した。調節されたｍｂＩＬ１５構築物で形質導入されたＴＩＬは２５μＭのアセタゾラミド（ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ）を受け、形質導入されていないＴＩＬは６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２を受けた。細胞を「急速拡張プロトコル」またはＲＥＰのためにＧＲＥＸプレートで１４日間成長させ、必要に応じて培地を添加または交換した。拡張の間、各ＧＲＥＸウェルを再懸濁させ、完全に混合し、細胞計数（Ｃｅｌｌａｃａ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ）及びフローサイトメトリー染色のためにアリコートを採取した。抗体ＣＤ３－ＢＵＶ３９５（ＢＤ）、ＣＤ５６－ＢＶ７１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４－ＢＶ６０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＬ１５－ＤｙＬ６５０（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ、社内で抱合させた）、ＩＬ１５ＲａＦｃ－Ｂｉｏｔｉｎ（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と二次ストレプトアビジン－ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及び固定可能な生存率染料ｅＦｌｕｏｒ ７８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて試料を染色した。試料をＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター上に流し、Ｆｌｏｗ Ｊｏ Ｖ１０．７．１を使用して分析を行った。形質導入効率は、生のＣＤ３陽性細胞集団内でＩＬ１５－ＤｙＬ６５０及びＩＬ１５ＲａＦｃ－Ｂｉｏｔｉｎについて二重陽性を染色した細胞のパーセントによって決定した（図２）。

本明細書に記載のｍｂＩＬ１５をコードする核酸配列を含むレンチウイルスで形質導入されたＴＩＬは、以下の実施例では、「ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ」と称され得る。ＯＴ－ＩＬ１５－２９３等の調節されたｍｂＩＬ１５をコードする核酸配列を含むレンチウイルスで形質導入されたＴＩＬは、以下の実施例では、「調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ」とも称され得る。ＯＴ－ＩＬ１５－２９２等の構成的ｍｂＩＬ１５をコードする核酸配列を含むレンチウイルスで形質導入されたＴＩＬは、以下の実施例では、「構成的ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ」とも称され得る。

実施例４．急速拡張プロトコルのＴＩＬ拡張
ＴＩＬ及びフィーダー細胞を上記の実施例１～３に記載されているように生成した。簡潔に述べると、ＲＥＰ前培養中で３週間後に、凍結保存されたＴＩＬを解凍し、６０００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ２で一晩放置した。次いで、ＴＩＬを抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａｂｅａｄｓまたはＯＫＴ３被覆されたマルチウェルプレート上で２４時間活性化し、その後、それらを構成的ｍｂＩＬ１５（ＯＴ－ＩＬ１５－２９２）またはＧＦＰ（ＯＴ－ＥＧＦＰ－００１）レンチウイルスベクターで形質導入したか、または非操作状態として改変されていない。形質導入の２４時間後、ＴＩＬは、ＧＲＥＸ ６Ｍウェルプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）中のＫ５６２－ＩＬ２１－４１ＢＢＬフィーダー細胞（フィーダー細胞：ＴＩＬの比が２：１）で拡張され、６０００ＩＵ／ｍＬのＩ－２が、非操作ＴＩＬならびに実験的な「＋ＩＬ２」条件に添加された。細胞を「急速拡張プロトコル」またはＲＥＰのためにＧＲＥＸプレートで１２日間成長させ、必要に応じて培地を添加または交換した。形質導入後５日目、８日目、及び１２日目に、各ＧＲＥＸウェルを再懸濁した。抗体ＣＤ３－ＢＵＶ３９５（ＢＤ）、ＣＤ５６－ＢＶ７１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４－ＢＶ６０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＬ１５－ＤｙＬ６５０（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ、社内で抱合させた）、ＩＬ１５ＲａＦｃ－Ｂｉｏｔｉｎ（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と二次ストレプタビジン－ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及び固定可能な生存率色素ｅＦｌｕｏｒ ７８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、実施例３に記載されるＩＬ１５＋またはＧＦＰ＋細胞の数を定量するためのフローサイトメトリー染色のためにアリコートを採取した。ＧＦＰ発現ＴＩＬは、ＲＥＰでの拡張のために外因性ＩＬ２を必要とするが、構成的ｍｂ－ＩＬ１５発現ＴＩＬは、ＩＬ２の非存在下で拡張する（図３Ａ）。

実施例５．抗原非依存性設定における拡張及び生存
次に、インビトロ抗原非依存生存アッセイとの関連で持続または拡大する能力について評価したＲＥＰ後のＴＩＬ。ＲＥＰ拡張の１２日後、サイトカインなしで拡張したｍｂＩＬ１５形質導入細胞と、６０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ２で拡張したＧＦＰ細胞を、脱ビーズし、洗浄し、サイトカインなしで一晩放置した。翌日、ＴＩＬを、ＩＬ２（６０００ＩＵ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したか否かにかかわらず、ＴＩＬ培地中で５×１０^５細胞／ウェルの４８ウェルプレートにプレーティングした。細胞を分割したか、または合計１０日間、２日ごとに培地を添加した。フローサイトメトリー染色についても２日ごとにアリコートを採取し、実施例３に記載されるように、ＩＬ１５＋またはＧＦＰ＋細胞の数を定量した。構成的ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは、外因性ＩＬ２の有無にかかわらず、１４日間生存アッセイ中に拡大したが、ＧＦＰ ＴＩＬは、拡張のためにＩＬ２を必要とした（図３Ｂ）。

調節されたｍｂＩＬ１５発現ＴＩＬを含む新しい研究において、上記の実施例１～３に記載されているように、ＴＩＬ及びフィーダー細胞を生成した。簡潔に述べると、ＲＥＰ前培養中で３週間後に、凍結保存されたＴＩＬを解凍し、６０００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ２で一晩放置した。次いで、ＴＩＬを抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａｂｅａｄｓまたはＯＫＴ３被覆されたマルチウェルプレート上で２４時間活性化し、その後、それらを構成的ｍｂＩＬ１５（ＯＴ－ＩＬ１５－２９２）または調節されたｍｂＩＬ１５（ＯＴ－ＩＬ１５－２９３）レンチウイルスベクターで形質導入したか、または非操作型で形質導入した。形質導入の２４時間後、ＵＴ ＴＩＬに６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２を添加し、２５μＭのアセタゾールアミド（ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ）を調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬに添加したＧＲＥＸ ６Ｍウェルプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）中のＫ５６２－ＩＬ２１－４１ＢＢＬフィーダー細胞（フィーダー細胞：ＴＩＬの比が５：１）でＴＩＬを拡張した。１４日間の拡張後、ＴＩＬを単離し、ＩＬ２（２００ＩＵ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）またはアセタゾールアミド（２５μＭ、ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ）を添加したか否かにかかわらず、ＴＩＬ培地中で５×１０^５細胞／ウェルのマルチウェルプレートにプレーティングした。細胞計数（Ｃｅｌｌｅｃａ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｎｅｘｅｌｏｍ）による細胞拡張及びフローサイトメトリー（ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ）による表現型の分析のためにウェル全体を採取し、新鮮なサイトカイン／リガンドを３日ごとに添加した。図４で実証されるように、このアッセイの１５日間にわたって、非操作ＴＩＬは、外因性サイトカインなしでは拡張しなかった（０．０７±０．０３倍の拡張）が、外因性ＩＬ２（２００ＩＵ／ｍＬ）によって、２０倍を超える拡張（２７．８±０．２５倍の拡張）をすることができた。対照的に、改変ＴＩＬは外因性サイトカインを添加することなく有意に拡張し、１５日後に構成的ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは８倍（８．２８±１．９倍の拡張）拡張し、２５μＭのアセタゾールアミドを与えられた調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは１７倍（１７．３±０．８２倍の拡張）拡張した。アセタゾールアミドを添加せずに、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは、リガンドと比較して４倍低く拡張し（４．５２±０．４８倍の拡張）、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬの生存を調節する際のアセタゾールアミドの役割を強調した。

実施例６．抗原依存性設定における拡張及び生存
ＴＩＬ及びフィーダー細胞を上記の実施例１～３に記載されているように生成した。簡潔に述べると、ＲＥＰ前培養中で３週間後に、凍結保存されたＴＩＬを解凍し、６０００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ２で一晩放置した。次いで、ＴＩＬを抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａｂｅａｄｓまたはＯＫＴ３被覆されたマルチウェルプレートで２４時間活性化し、その後、それらを調節されたｍｂＩＬ１５（ＯＴ－ＩＬ１５－２９３）レンチウイルスベクターで形質導入したか、または非操作型で形質導入した。形質導入の２４時間後、ＵＴ ＴＩＬに６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２を添加し、２５μＭのアセタゾールアミド（ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ）を調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬに添加したＧＲＥＸ ６Ｍウェルプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）中のＫ５６２－ＩＬ２１－４１ＢＢＬフィーダー細胞（フィーダー細胞：ＴＩＬの比が５：１）でＴＩＬを拡張した。１４日間の拡張後、ＴＩＬをＢａｍｂａｎｋｅｒ凍結培地（Ｂｕｌｌｄｏｇ Ｂｉｏ）中で凍結保存した。後に、凍結保存されたＴＩＬを解凍し、２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２（非操作ＴＩＬ）でＴＩＬ培地中、または２５μＭのアセタゾールアミド（調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ）で、ＴＩＬ培地中で一晩放置した。一晩放置後、ＴＩＬを、ＩＬ２（２００ＩＵ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）またはアセタゾールアミド（２５μＭ、ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ）を添加したか否かにかかわらず、ＴＩＬ培地中のＴＩＬ：腫瘍共培養アッセイ中のマイトマイシンＣで処理した黒色腫細胞と１：１の比率でマルチウェルプレートにプレーティングし、アッセイを合計２７日間維持した。ビヒクルのみの対照をアセタゾールアミドに含め、同じ体積のＤＭＳＯをビヒクル対照群に添加した。黒色腫細胞は、ピュロマイシン依存性ルシフェラーゼベクターで改変したＡ３７５細胞株（ＡＴＣＣ）に由来し、これらの腫瘍細胞の増殖を防止するために、上記（実施例３）のように１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣで処理した。３日ごとに、この共培養アッセイのウェルを混合し、細胞計数（Ｃｅｌｌｅｃａ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｎｅｘｅｌｏｍ）による細胞拡張及びフローサイトメトリー（ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ）による表現型の分析のためにアリコートを単離した。新鮮なマイトマイシンＣで処理したＡ３７５黒色腫細胞ならびにＴＩＬ培地中の新鮮なサイトカイン／リガンドを３日ごとに添加した。図５で実証されるように、アセタゾールアミドで調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは安定した拡張動態を確立し、慢性刺激がＴＩＬを急速に排出し、細胞数を減少させるであろうこの抗原依存性の設定においてさえ、形質導入されたＴＩＬが持続した。アッセイでは、非操作ＴＩＬは、外因性サイトカインなしでは拡張しなかった（１日目～２７日目までの０．４６±０．０２倍の拡張）が、外因性ＩＬ２（２００ＩＵ／ｍＬ）では、２５倍を超える拡張（１日目～２７日目までの２５．４±４．０６倍の拡張）が可能であった。対照的に、改変ＴＩＬは、任意の外因性サイトカインを添加することなく拡張し、２５μＭのアセタゾールアミドを与えられた特に調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは、１日目～２７日目まで１２倍（１２．２±０．１０倍の拡張）拡張した。（ビヒクル対照のみを伴う）アセタゾールアミドの添加なしで、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは、リガンド（１日目～２７日目までの２．６８±０．４２倍の拡張）と比べて４倍低く拡張し、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬの生存を調節する上でのアセタゾールアミドの役割を強調した。

実施例７．ＲＥＰ後の新鮮なＴＩＬの腫瘍反応性
２人の黒色腫ドナー由来のＴＩＬを、実施例１～３に記載されているように生成した。簡潔に述べると、ＲＥＰ前培養中で３週間後に、凍結保存されたＴＩＬを解凍し、６０００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ２で一晩放置した。次いで、ＴＩＬを抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａｂｅａｄｓまたはＯＫＴ３被覆されたマルチウェルプレートで２４時間活性化し、その後、それらを調節されたｍｂＩＬ１５（ＯＴ－ＩＬ１５－２９３）レンチウイルスベクターで形質導入したか、または非操作型で形質導入した。形質導入の２４時間後、ＴＩＬを、ＧＲＥＸ ６Ｍウェルプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）中のＫ５６２－ＩＬ２１－４１ＢＢＬフィーダー細胞（フィーダー細胞：ＴＩＬの比が５：１）で拡張し、非操作ＴＩＬに６０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ２を添加し、２５μＭのアセタゾールアミド（ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ）を調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬに添加した。１４日間の拡張後、ＴＩＬを採取し、脱ビーズし、ＩＬ２及びアセタゾールアミドの有無にかかわらず一晩放置した。ルシフェラーゼ、Ａ３７５－ＦＬｕｃ－Ｐｕｒｏ（ＡＴＣＣ）を発現する黒色腫細胞株を、５×１０^６細胞／ｍＬでＴＩＬ培地に再懸濁した。１０μｇ／ｍＬのミトマイシン－Ｃを細胞に加え、次いで３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を５０ｍＬのＴＩＬ培地で３回洗浄した。１ウェル当たり１×１０^５個のＡ３７５細胞を９６ウェルの平底組織培養処理プレートに添加した。いくつかのウェルでは、８０μｇ／ｍＬのＨＬＡ－ＡＢＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）ブロッキング抗体を添加して、標的細胞上のＭＨＣクラスＩをブロックした。一晩放置したＴＩＬを、ＴＩＬ：Ａ３７５の比が１：１または３：１で、ウェル当たりの総体積が２００μＬであるように添加した。４８時間の時点で、上清を各ウェルから保存し、ＩＦＮγの濃度をＭＳＤによってアッセイした。製造業者のプロトコルに従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して腫瘍細胞の溶解を分析した。溶解パーセントを、共培養ウェル内の発光量からバックグラウンド蛍光量を差し引いたものを、Ａ３７５のみの対照ウェル内の発光量からバックグラウンド蛍光量を差し引いたもので割ったものとして、算出した。ＩＬ２で培養された形質導入されていないＴＩＬと、ＩＬ２の非存在下でＲＥＰ中に拡大された調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬとの両方が、ＴＩＬ単独と比較して、Ａ３７５黒色腫株との共培養において増加したＩＦＮγを産生する（図６Ａ）。加えて、標的細胞株の発光の低下によって測定された共培養条件における腫瘍細胞の特異的溶解があった（図６Ｂ）。ＭＨＣクラスＩブロッキング抗体との共培養条件において、特異的溶解パーセント及びＩＦＮγ産生の両方が減少し、この腫瘍細胞株に対するＴＩＬの細胞傷害性がＭＨＣクラスＩ依存性であることを示す。この結果は、２つの黒色腫ドナーにおいて繰り返される。

実施例８．ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは、ＩＬ２なしで、インビボで長期間持続する。
１つのドナー及びフィーダー細胞からのＴＩＬを、上記の実施例１～３に記載されているように生成した。簡潔に述べると、ＲＥＰ前培養中で３週間後に、凍結保存されたＴＩＬを解凍し、６０００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ２で一晩放置した。次いで、ＴＩＬを抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓで２４時間活性化し、その後、それらを構成的ｍｂＩＬ１５（ＯＴ－ＩＬ１５－２９２）または調節されたｍｂＩＬ１５（ＯＴ－ＩＬ１５－２９３）レンチウイルスベクターまたは非操作型で形質導入した。形質導入の２４時間後、ＴＩＬを、ＧＲＥＸ ６Ｍウェルプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）中のＫ５６２－ＩＬ２１－４１ＢＢＬフィーダー細胞（フィーダー細胞：ＴＩＬの比が５：１）で拡張し、非操作ＴＩＬに６０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ２を添加し、２５μＭのアセタゾールアミド（ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ）を調節ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬに添加した。１４日間の拡張後、ＴＩＬを採取し、脱ビーズし、養子細胞移入のために調製した。非操作ＴＩＬは６１２倍、構成的ｍｂＩＬ５ ＴＩＬは１０８０倍、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは４５０倍拡張した（図７Ａ）。

ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。６～８週齢の雌マウスに、表４に記載されるように、外因性ＩＬ２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、または臨床グレードのアセタゾールアミドもしくはビヒクルの有無にかかわらず、１０×１０^６ＴＩＬ／マウスを全身的に注入した。

養子細胞療法当日のＩＬ１５発現についてＴＩＬを評価し、構成的ｍｂＩＬ１５形質導入ＴＩＬは、調節されたｍｂＩＬ１５形質導入ＴＩＬ（２３．６±１．１％ ＩＬ１５＋ＩＬ１５ＲａＦｃ＋）よりもわずかに高いレベルのｍｂＩＬ１５形質導入（３０．２±０．４６％ ＩＬ１５＋ＩＬ１５ＲａＦｃ＋）を示したが、両方の形質導入集団は、養子細胞移入に対して許容可能であった（図７Ｂ）。ＩＬ１５の発現または形質導入効率をフローサイトメトリーによって評価し、細胞をＦｃブロックでインキュベートし、最初にＤｙＬ６５０（Ｌａｋｅ Ｐｈａｒｍａ、社内で抱合させた）及びビオチン化ＩＬ１５ＲａＦｃ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に抱合させたＩＬ１５で染色した。暗所で、２５分間室温でインキュベートした後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、遠心分離し、ＢＶ４２１に抱合させたストレプトアビジンを含有するＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。４℃で、２０分間暗所でインキュベートした後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、試料をＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター上で走行させた。ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０．７．１で解析が行われた。

養子細胞療法後の７、１４、２１、３２、３９、４６、及び５３日目に、ＥＤＴＡ含有チューブ内の顎下静脈収集を介して７５μＬの全身血を単離し、ＴＩＬの列挙のために処理した。血液サンプルは、１～３ｍＬのＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）を受け、１０～２０分間インキュベートして赤血球（ＲＢＣ）を溶解した。ＲＢＣ溶解後、試料を、７０μｍ細胞ストレーナを通して濾過し、遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。細胞計数（Ｃｅｌｌｅｃａ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｎｅｘｅｌｏｍ）の分析のために各試料のアリコートを単離し、残りをフローサイトメトリー（ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ）による表現型評価のために使用した。表現型の評価のために、血液試料を、ＣＤ３（ＢＤ）、マウスＣＤ４５、ＣＤ２５（ＢＤ）、ＦｏｘＰ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ１５（Ｌａｋｅ Ｐｈａｒｍａ、社内で抱合された）、ＫＬＲＧ１、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ６９、ＣＣＲ７、ＣＤ５６、及びビオチン化ＩＬ１５ＲａＦｃ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に特異的な抗体で染色した。抗体を、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰＥ－Ｃｙ５、ＰＥ－Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＤｙＬ６５０、ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＢＵＶ３９５、ＢＵＶ７３７、ＢＶ４２１、ＢＶ５１０、ＢＶ６０５、ＢＶ７１１、またはＢＶ７８６（別途特定されない限り、全てのＢｉｏｌｅｇｅｎｄの抗ヒト抗体）に抱合させた。加えて、生存率色素（ｅ７８０固定可能な生存率色素、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を全ての試料に含めた。試料をＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター上に流し、Ｆｌｏｗ Ｊｏ Ｖ１０．７．１を使用して分析を行った。研究を通してＴＩＬを列挙するために、ＴＩＬを生きた細胞、続いてリンパ球、続いてヒトＣＤ３＋及びマウスＣＤ４５－細胞としてゲーティングした。図８Ａに見られるように、非操作ＴＩＬは、インビボで急速に減少し、注入後５３日目までに検出不可能なレベルに達した。外因性ＩＬ２を受けた非操作ＴＩＬの方が良好であったが、持続性は注入後５３日目までに低く、定量化されたＴＩＬは０．６４±０．１７％であった。対照的に、５３日後の注入までに、形質導入ＴＩＬが全身的に検出可能なレベルにとどまり、構成的ｍｂＩ１５ ＴＩＬは５．７３±１．２％であったことが明らかであった。そして１０．２±２．０％で調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ＡＣＺ。注入後５３日目までに調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ビヒクルは、２．９４±０．３６％でほぼ検出不可能であったため、アセタゾールアミドのインビボ調節効果は明らかであった。

養子細胞療法の後の１４日目及び５３日目に、実験群当たり５匹の動物のコホートを、末端収集のために屠殺した。これらの動物から、２００μＬの全身性血液を心臓穿刺によって採取し、脾臓を単離し、ならびに１個の大腿骨から抽出した骨髄を採取した。血液を上記のように処理した。脾臓を７０μｍの細胞ストレーナを通して機械的に破壊し、ＡＣＫ溶解を３分間受けてＲＢＣを溶解し、７０μｍの細胞ストレーナを通して再び収集した。骨髄（ＢＭ）を１つの大腿骨を通してフラッシュし、７０μｍの細胞ストレーナを通して収集した。各処理された組織懸濁液のアリコートを細胞計数（Ｃｅｌｌｅｃａ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｎｅｘｅｌｏｍ）の分析のために単離し、残りをフローサイトメトリー（ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ）による表現型評価のために使用した。表現型評価のために、試料を、ＣＤ３（ＢＤ）、マウスＣＤ４５、ＣＤ２５（ＢＤ）、ＦｏｘＰ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ１５（Ｌａｋｅ Ｐｈａｒｍａ）、ＫＬＲＧ１、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ６９、ＣＣＲ７、ＣＤ５６、及びビオチン化ＩＬ１５ＲａＦｃ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に特異的な抗体で染色した。抗体を、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰＥ－Ｃｙ５、ＰＥ－Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＤｙＬ６５０、ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＢＵＶ３９５、ＢＵＶ７３７、ＢＶ４２１、ＢＶ５１０、ＢＶ６０５、ＢＶ７１１、またはＢＶ７８６（別途特定されない限り、全てのＢｉｏｌｅｇｅｎｄの抗ヒト抗体）に抱合させた。加えて、生存率色素（ｅ７８０固定可能な生存率色素、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を全ての試料に含めた。試料をＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター上に流し、Ｆｌｏｗ Ｊｏ Ｖ１０．７．１を使用して分析を行った。研究を通してＴＩＬを列挙するために、ＴＩＬを生きた細胞、続いてリンパ球、続いてヒトＣＤ３＋及びマウスＣＤ４５－細胞としてゲーティングした。図８Ｂ及び図８Ｃに実証されるように、形質導入ＴＩＬは、注入後１４日目及び５３日目に末梢リンパ系臓器において高レベルで同定され、ＡＣＺ処置された調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは、それらのビヒクル処置された対応物よりも有意に高い持続性を実証した（ｐ＜０．００５）。

表５は、本明細書に記載の様々な構築物のウイルスベクター配列を示す。

実施例９．ＴＩＬのレトロウイルスのトランスフェクションを用いる急速拡張プロトコル
ＲＥＰ前ＴＩＬは、実施例１と同様に調製した。簡潔に述べると、黒色腫及び頭頸部腫瘍試料を、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋから入手した。腫瘍試料を、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）緩衝液中１～３ｍｍの断片に切断し、断片を、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１０ｕｇ．ｍＬの４１ＢＢ抗体（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＬａｂｓ）、３０ｎｇ／ｍＬのＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及び０．１ｍｇ／ｍＬのＮｏｒｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を含有するＴＩＬ培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ＨＥＰＥＳ、５０μＭの２－メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０）に、１～１０個の断片／フラスコでＧｒｅｘ容器に入れた。栄養素枯渇が同定されたときには、およそ３～４日ごとに血管に定期的に供給された。この培養プロセスは、急速拡張プロトコル前（ＲＥＰ前）と称される。ＲＥＰ前の後、ＴＩＬを等分し、細胞凍結培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ、Ｂｕｌｌｄｏｇ Ｂｉｏ、またはＣｒｙｏｓｔｏｒ－１０、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で凍結し、液体窒素中で長期間保存した。

これらのＲＥＰ前のＴＩＬを解凍し、６０００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ２を含むＴＩＬ培地中で一晩放置にした。次いで、３ｕｇ／ｍＬ（Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦ精製抗ヒトＣＤ３抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）のＯＫＴ３及び６０００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ２で被覆された２４ウェルプレート中で、ＴＩＬを２４時間活性化した。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（３０μｇ／ｍＬ）を使用して、２４ウェル非組織培養細胞培養プレートを４℃で一晩コーティングした。翌日、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎを除去し、プレートをＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックし、次いでプレートをＰＢＳで洗浄した。テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）擬似型ガンマレトロウイルスベクター（ｍｂＩＬ１５－ＣＡ２ ＤＲＤ発現がマウス白血病ウイルスＬＴＲ由来のプロモーターの制御下にある）上清を安定な産生細胞株から調製した。レトロウイルスベクター上清をＴＩＬ培地中で希釈し、ウェル当たり５００μＬの総体積で添加し、１６～８０の近似ＭＯＩを得た。ウイルスベクターを含有するプレートを１４００×ｇで２時間、３２℃で遠心分離し、次いで上清を除去した。上清除去後、１ウェル当たり１．０×１０^６個の活性化ＴＩＬを１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２とともに移し、３７℃で一晩インキュベートした。細胞をウイルス添加なしで同様に処理し、陰性対照として使用した（「非操作」）。形質導入の２４時間後、５×１０^５ＴＩＬを、６Ｍ ＧＲＥＸウェルプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）の各ウェルに、ウェル当たり合計６０ｍＬのＴＩＬ培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ＨＥＰＥＳ、５０μＭの２－メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０）で移した。照射したＫ５６２フィーダー細胞（４－１ＢＢＬ及びｍｂＩＬ２１で形質導入し、１００Ｇｙで照射した）または照射したＰＢＭＣフィーダー細胞（２５Ｇｙで照射した）を解凍し、それぞれ５０：１のＫ５６２：ＴＩＬまたは２００：１のＰＢＭＣ：ＴＩＬの割合で培養物に添加した。調節されたｍｂＩＬ１５構築物で形質導入されたＴＩＬは２５μＭのアセタゾールアミド（ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ）を受け、形質導入されていないＴＩＬは６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２を受けた。細胞を「急速拡張プロトコル」またはＲＥＰのためにＧＲＥＸプレートで１４日間成長させ、必要に応じて培地を添加または交換した。

実施例１０．調節されたｍｂＩＬ１５改変ＴＩＬ：シグナル伝達及び多官能性
ＡＣＺは、用量依存的様式で、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬにおけるＩＬ１５発現及びシグナル伝達を調節する。
ＲＥＰ前のＴＩＬを、実施例１～３及び９の方法と同様に調製し、非操作及びｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを、実施例１～３及び９に記載されるように、それに応じて生成した。ＩＬ１５シグナル伝達経路の係合は、転写因子タンパク質ＳＴＡＴ５及びリボソームタンパク質Ｓ６を含むシグナル伝達物質の下流のリン酸化をもたらす。ＡＣＺ制御されたｍｂＩＬ１５発現が制御されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬにおけるＩＬ１５シグナル伝達をもたらすことを実証するために、以下のようにホスホフローサイトメトリーベースのアッセイを用いた。４人のヒトドナー（患者１～４）から得た凍結保存された調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを解凍し、次いで２４時間ＡＣＺフリー培地中に放置した。次に、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを、０．１、１、２．５、５、１０、２５、１００μＭを含む一連の濃度のＡＣＺ、ならびにビヒクル対照の存在下で１８時間調節した。次いで、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを、染色及びＦＡＣＳ解析のために収集した。

簡潔に述べると、細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ１５に対する抗体、及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄマーカーを用いて染色した。次いで、細胞を２％ホルムアルデヒド（ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ）中に固定し、メタノール系緩衝液（ＢＤ Ｐｈｏｓｐｈｏ Ｐｅｒｍ ＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ）を使用して透過処理した後、リン酸化ＳＴＡＴ５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＳ６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に特異的な抗体で染色した。ＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ上で細胞を取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。

ｍｂＩＬ１５のＡＣＺ発現の濃度が増加するにつれて、ＡＣＺの１０～２５μＭ付近でプラトーになる。図９Ａ．同様に、ｐＳＴＡＴ５及びｐＳ６の染色強度は、制御されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬにおけるＡＣＺの濃度が高いほど増加し、ＩＬ１５シグナル伝達の程度が大きいことを示す。これらの結果は、ＡＣＺとＩＬ１５発現とシグナル伝達との間の用量依存的関係を示す。図９Ｂ～Ｅ及び図１０。

調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬの構成的ｍｂＩＬ１５発現及びＡＣＺ調節は、ＩＬ１５シグナル伝達経路に関与する。
ＩＬ１５発現の異なる戦略を比較するために、ｍｂＩＬ１５及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを構成的に発現するＴＩＬを利用した。３人のヒトドナーからの凍結保存された非操作ＴＩＬ、構成的ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ、及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを解凍し、次いでＡＣＺフリー培地中に２４時間放置した。次に、前述のＴＩＬを以下のように培地中で１８時間調節した。（１）非操作ＴＩＬに２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を加え、（２）２５μＭのＡＣＺを調節ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ培養物に加えた。ビヒクルを制御条件に追加した。１８時間処理後、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ１５及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄマーカーに対する抗体を用いて細胞を染色した。次いで、リン酸化ＳＴＡＴ５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＳ６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に特異的な抗体で染色する前に、細胞を２％ホルムアルデヒド（ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ）中に固定し、メタノール系緩衝液（ＢＤ Ｐｈｏｓｐｈｏ Ｐｅｒｍ ＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ）を使用して透過処理した。ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ上で細胞を取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。

図１１に示すように、ＩＬ２は、ＳＴＡＴ５及びＳ６を介したシグナル伝達を含む、ＩＬ１５と重複するシグナル伝達経路を共有する。ＩＬ２で培養した非操作ＴＩＬは、対応するビヒクル状態と比較して、シグナル伝達経路の関与の増加を示した。図１１．同様に、構成的ｍｂＩＬ１５発現及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ＡＣＺの両方が、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ビヒクル対照と比較して、ＳＴＡＴ５及びＳ６のリン酸化の増加を示した。図１１．

調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは、非操作ＴＩＬ＋ＩＬ２よりも大きな多官能性を実証する。
多官能性Ｔ細胞は、刺激に応答して複数のエフェクター分子を同時に産生する能力を有する。加えて、多官能性は、Ｔ細胞の有効性と相関する。非操作ＴＩＬの多官能性を調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬと比較するために、凍結保存された細胞を解凍し、ＩＬ２及びＡＣＺを含まない培地に２４時間放置した。次に、細胞の調節は、以下のように起こった：非操作ＴＩＬを、ＩＬ２（２０、２００、１０００、及び６０００ ＩＵ／ｍＬ、またはビヒクル）の範囲の濃度の存在下で１８時間調節した。調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを、ＡＣＺ（０．１、１、５、１０、２５、１００μＭ ＡＣＺ、またはビヒクル）の存在下で１８時間調節した。次に、ブレフェルジンＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びモネンシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の存在下で、ホルボール１２－ミリスチン酸１３－アセテート（ＰＭＡ）及びイオノマイシン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で細胞を６時間刺激した。非刺激の非操作ＴＩＬ及び非刺激の調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを対照として使用した。刺激後、次いで、染色及びＦＡＣＳ解析のために細胞を収集した。

簡潔に述べると、細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ１５の抗体及び生存率染料を用いて染色した。次いで、細胞をホルムアルデヒド固定及び透過処理し（ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ ｋｉｔ）、次いで、ＴＮＦα及びＩＦＮγ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対する抗体を用いて染色した。ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ上で細胞を取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。ＴＮＦα及びＩＦＮγの発現に対して二重陽性である細胞は、多官能性とみなされる。

図１２に示すように、全ての培養条件は、いくつかの多官能性集団を含有していたが、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬにおける多官能性は、より高い濃度のＡＣＺとともに増加した。図１２Ａ、１２Ｂ．更に、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは、同じドナーからの非操作ＴＩＬ＋ＩＬ２よりも多官能であった。図１２Ａ、１２Ｃ．ｍｂＩＬ１５を発現する調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬの割合も、ＡＣＺ用量と用量応答関係を示した。

実施例１１．調節されたＩＬ１５ ＴＩＬのインビボ有効性
ＰＤＸ １６３Ａ有効性
患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルを、腫瘍バンク（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ：ＣＨＴＮ）から得られた新鮮な原発性黒色腫試料（患者腫瘍番号Ｍ１２００１６３Ａ）から生成された。ＮＳＧ雌マウスを用いたマウスモデルが確立された（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号０００５５７）。モデルが確立されると、凍結保存された腫瘍切片を、イソフルラン麻酔、免疫不全マウス（ＮＳＧ雌マウス、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号０００５５７）に無菌的に移植した。腫瘍を約１０００ｍｍ^３～２０００ｍｍ^３まで成長させ、次いでマウスを安楽死させた。腫瘍を無菌的に採取し、約１００ｍｇの切片に切片化した後、１３日間成長させたより大きなコホートのマウスに移植した。１３日後、腫瘍を測定し、それぞれの治療群に無作為化に分けられた（５０ｍｍ^３～１００ｍｍ^３）。翌日、１０００万（１０Ｍ）のＴＩＬを静脈内に導入した。ＴＩＬを上記の急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）に従って生成した。

処置群は以下の通りであった。（１）ＩＬ２を投与された非操作ＴＩＬ、ならびに（２）アセタゾールアミド（ＡＣＺ）を投与された調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ。非操作ＴＩＬを受けたマウスに、５０，０００国際単位（ＩＵ）のＩＬ２を５日間、１日２回投与した。調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬで処置されたマウスは、研究全体にわたって、ビヒクルまたは２００ｍｇ／ｋｇのアセタゾールアミド（ＡＣＺ）のいずれかを毎日投与された。腫瘍及び体重を週２回収集した。

図１３は、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルの結果を示す。急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）の終了時に、非操作ＴＩＬ及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ（＋／－アセタゾールアミド（ＡＣＺ））を、ヒト黒色腫ＰＤＸを有するマウスに養子移入した。平均腫瘍体積を評価した（＋／－ＳＥＭ）。図１３Ａは、養子細胞移入（ＡＣＴ）後の日数における所与の治療の平均腫瘍体積を示す。図１３Ｂは、ＡＣＴ後の日数における腫瘍体積を、ＴＩＬなし（左上）、非操作ＴＩＬ＋ＩＬ２（右上）、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ビヒクル（左下）、及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ＡＣＺ（右下）について示す。図１３に示すように、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ＡＣＺは、非操作ＴＩＬ＋ＩＬ２と比較して、有意に優れた抗腫瘍有効性を有する。

ＳＫ－ＭＥＬ－１有効性
本発明の調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを評価するために、ＳＫ－ＭＥＬ－１異種移植片がんモデルを作成した。広範かつ急速に進行する悪性黒色腫（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ－６７）を有する患者の胸部管から得られた細胞を使用して、モデルを作成した。ＮＳＧ雌マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号０００５５７）は、がん細胞を受け入れるために使用したマウスであった。簡潔に述べると、低通過細胞を解凍し、生存可能な亜流体培養物を維持するように成長させた。注射当日、細胞を計数し、洗浄し、３０×１０^６細胞／ｍＬ（１００μＬの注射につき３^６細胞）の濃度の滅菌ＰＢＳ中で再懸濁した。各マウスは、２７ゲージ、１／２インチの針を含有するＢＤツベルクリン注射器を使用して、剃毛された右側面に皮下注射された１００μＬの細胞を投与された。腫瘍を９日間成長させ、次いで測定し、それぞれの治療群に無作為に分けられた（５０ｍｍ^３～１００ｍｍ^３）。翌日、１０００万（１０Ｍ）のＴＩＬを静脈内に導入した。ＴＩＬを上記の急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）に従って生成した。

処置群は以下の通りであった。（１）ＩＬ２を投与された非操作ＴＩＬ、ならびに（２）アセタゾールアミド（ＡＣＺ）を投与された調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ。非操作ＴＩＬを受けたマウスに、５０，０００国際単位（ＩＵ）のＩＬ２を５日間、１日２回投与した。調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬで処置されたマウスは、研究全体にわたって、ビヒクルまたは２００ｍｇ／ｋｇのアセタゾールアミド（ＡＣＺ）のいずれかを毎日投与された。腫瘍及び体重を週２回収集した。

図１４は、ＳＫ－ＭＥＬ－１異種移植片がんモデルの結果を示す。急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）の終了時に、非操作ＴＩＬ及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ（＋／－アセタゾールアミド（ＡＣＺ））を、ＳＫ－ＭＥＬ－１腫瘍を有するマウスに養子移入した。平均腫瘍体積を評価した（＋／－ＳＥＭ）。図１４Ａは、養子細胞移入（ＡＣＴ）後の日数における所与の治療の平均腫瘍体積を示す。図１４Ｂは、ＡＣＴ後の日数における腫瘍体積を、ＴＩＬなし（左上）、非操作ＴＩＬ＋ＩＬ２（右上）、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ビヒクル（左下）、及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ＡＣＺ（右下）について示す。図１４に示すように、結果は、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬ＋ＡＣＺが、非操作ＴＩＬ＋ＩＬ２と比較して、有意に優れた抗腫瘍有効性を示すことを実証する。

実施例１２．調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを伴うインビトロ細胞傷害性
ＲＥＰ前のＴＩＬを、実施例１～３及び９の方法と同様に調製し、非操作及びｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを、実施例１～３及び９の方法に従って生成した。調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬの抗腫瘍細胞傷害性の可能性を評価するために、ＨＬＡ適合腫瘍細胞株ＳＫ－ＭＥＬ－１（ＡＴＣＣ）及び６つの異なる患者ＴＩＬ試料を使用して、腫瘍－ＴＩＬ共培養アッセイを実施した。同一の実験もＰＤＸ細胞を使用して設定した。評価された患者ＴＩＬ試料は、拡張された非操作ＴＩＬ、または拡張された調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬであった。調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを、上記ＲＥＰプロトコル（実施例１～９）に従って作製し、次いで凍結保存した。次いで、６人の患者からの非操作ＴＩＬ及び調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを解凍し、計数し、７．５×１０^５細胞／ｍＬの細胞密度で２４時間、以下のいずれかを補充した培地で放置した。＋／－非操作ＴＩＬ、またはビヒクル（ＤＭＳＯ）の場合は、＋／－６０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ２、または調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬの場合は２５μＭ ＡＣＺである。翌日、ＨＬＡ適合ＳＫ－ＭＥＬ－１細胞をインビトロ培養物から採取し、製造業者のプロトコルに従って、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄで標識した。加えて、ＰＤＸ細胞を新鮮なまたは凍結保存された塊から得、製造業者のプロトコルに従ってＧｅｎｔｌｅＭＡＣｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で消化した。

次に、ＴＩＬを、ＭＨＣクラスＩブロッキング試薬（腫瘍細胞のみを８０μｇ／ｍＬの抗ヒトＨＬＡ ＡＢＣで２時間培養した後、ＴＩＬとの共培養）を用いて、または用いずに、上記の同じ補充ＩＬ２またはＡＣＺ条件で標識された黒色腫細胞との５：１及び１：１（ＴＩＬエフェクター：腫瘍標的）比で共培養した。共培養系におけるバックグラウンドカスパーゼ－３活性を評価するために、標識されていない、及び標識された黒色腫細胞単独の追加の対照を含めた。このＴＩＬ腫瘍細胞共培養を３時間インキュベートし、その後、細胞を固定し、透過処理し、細胞内で切断カスパーゼ－３（腫瘍細胞内での細胞死に対する不可逆的なコミットメントのマーカー）を染色した。

試料を、Ｆｌｏｗ Ｊｏ Ｖ１０．７．１を使用して実施された分析を用いて、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで取得した。ここで、細胞傷害性は、生きているＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ陽性細胞集団内で、切断カスパーゼ－３を陽性に染色する細胞の割合によって決定された（バックグラウンドカスパーゼ－３陽性を差し引いた）。

図１５に示すように、ＴＩＬ腫瘍対の抗腫瘍細胞傷害性のこの評価において、調節されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは、非操作ＴＩＬ＋ＩＬ２と比較して、全ての６人のドナーにわたって優れた抗腫瘍細胞傷害活性を示した。図１５．

実施例１３：明確なフィーダー細胞を有する非操作及びｍｂＩＬ１５ ＴＩＬの生成
腫瘍試料から生成されたＲＥＰ前のＴＩＬを実施例１及び９に記載されるように調製した。ＲＥＰ前のＴＩＬを解凍し、ＴＩＬ培地（６０００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を用いて、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ＨＥＰＥＳ、５０μＭの２－メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０）で４８時間静置した。次いで、ＴＩＬを、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を３μｇ／及び６０００ＩＵ／ｍＬ可溶性ヒトＩＬ２で被覆された２４ウェルＮＵＮＣプレート中で２４時間活性化した。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（３０μｇ／ｍＬ）を使用して、２４ウェル非コーティング細胞培養プレートを４℃で一晩コーティングした。翌日、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎを除去し、プレートをＰＢＳ中の２．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）でブロックし、次いでプレートをＰＢＳで洗浄した。実施例９に記載されるように調製したＢａＥＶ擬似型レンチウイルス上清をＴＩＬ培地中で希釈し、各ウェルに添加して０．０１～０．６のＭＯＩを達成した。ウイルスベクターを含有するプレートを１４００ｇで２時間、３２℃で遠心分離し、次いで上清を除去した。上清除去後、１ウェル当たり１×１０^６個の活性化ＴＩＬを０～１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２とともに移し、３７℃で一晩インキュベートした。細胞を、ウイルスをＴＩＬ培地に添加することなく同様に処理し、陰性対照（「非操作」）として使用した。形質導入の２４時間後、ＴＩＬを６Ｍ ＧＲＥＸフラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）に、合計４０ｍＬのＴＩＬ ＲＥＰ培地（上述の５０％ＴＩＬ培地、５０％ＡＩＭ－Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ））で移した。増殖が損なわれた（照射またはマイトマイシン－Ｃ処理）フィーダー細胞（プールしたＰＢＭＣ、非改変Ｋ５６２フィーダー、膜結合ＩＬ２１を発現するように改変されたＫ５６２、４１ＢＢＬを発現するように改変されたＫ５６２、４１ＢＢＬ及び膜結合ＩＬ２１を発現するように改変されたＫ５６２）を、Ｋ５６２対ＴＩＬの比率５０：１で培養物に添加した。外因性ＩＬ２１を受けるように指定された群には、５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ２１を投与した。調節されたｍｂＩＬ１５構築物で形質導入されたＴＩＬ構築物は、２５μＭのアセタゾールアミド（Ｈｉｋｍａ）を受け、非操作ＴＩＬは３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２を受けた。細胞を「急速拡張プロトコル」またはＲＥＰのためにＧＲＥＸプレート中で１４日間拡張させ、必要に応じて培地を添加した。

ＲＥＰにおけるＴＩＬ拡張の評価
拡張中に定期的に、各ＧＲＥＸウェルを再懸濁し、完全に混合し、Ａｃｒｉｄｉｎｅ Ｏｒａｎｇｅ／Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ生存率染料（Ｃｅｌｌａｃａ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ）及びフローサイトメトリー染色を用いて細胞計数のためにアリコートを採取した。抗体ＣＤ３－ＢＵＶ３９５（ＢＤ）、ＣＤ５６－ＢＶ７１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４－ＢＶ６０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、二次ストレプトアビジン－ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を有するＩＬ１５ＲａＦｃ－Ｂｉｏｔｉｎ（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及び固定可能な生存率染料ｅＦｌｕｏｒ ７８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて試料を染色した。試料をＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーター上に流し、Ｆｌｏｗ Ｊｏ Ｖ１０．７．１を使用して分析を行った。

ＲＥＰを通して特定の時点での全生存細胞数を得ることによって、全ＴＩＬ拡張を決定した。図１６は、ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬについて、Ｋ５６２フィーダー細胞の使用及びＩＬ－２１及び４１ＢＢＬを介した共刺激の両方を受けたことにより、ＲＥＰ及びＰＢＭＣフィーダー細胞ならびに４１ＢＢＬを含まないＫ５６２フィーダー細胞における最大の細胞拡張が、ＲＥＰにおけるＴＩＬ拡張のサブ最適レベルのみを支持したことを示す。対照的に、非操作ＴＩＬは、フィーダー細胞のいずれかを使用してＩＬ２の存在下で拡張したが、ＰＢＭＣフィーダー細胞は、ＲＥＰ中の非操作ＴＩＬの最大拡張を促進した。

ＩＬ１５発現は、生きた細胞、ＣＤ３陽性細胞、ＣＤ５６陰性細胞の集団内でＢＶ４２１－ストレプトアビジン陽性を染色する細胞の割合によって決定された。Ｋ５６２フィーダー細胞で生成され、ＩＬ－２１及び４１ＢＢＬを介した共刺激の両方を受けたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬにおいて、ｍｂＩＬ１５＋ＴＩＬの頻度は、ＲＥＰプロセスを通じて増加し、操作ＴＩＬ細胞培養物内のｍｂＩＬ１５形質導入サブセットの濃縮を示唆した（図１８）。同様に、ＲＥＰにおけるｍｂＩＬ１５＋ＴＩＬの最大拡張は、ＩＬ－２１及び４１ＢＢＬを介した共刺激の両方を有するＫ５６２フィーダー細胞を用いて構成的または調節されたｍｂＩＬ１５＋ＴＩＬのいずれかを生成するときに生じた（図１９）。

ＣＤ４：ＣＤ８比は、（生細胞、ＣＤ３陽性細胞、ＣＤ５６陰性細胞の）ＣＤ４陽性を染色する細胞の割合と、（生細胞、ＣＤ３陽性細胞、ＣＤ５６陰性細胞の）ＣＤ８陽性を染色する細胞の割合との比によって決定された。Ｋ５６２フィーダー細胞で生成され、ＩＬ－２１及び４１ＢＢＬを介した共刺激の両方を受けている拡張ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを、ＣＤ８＋細胞傷害性エフェクター細胞について濃縮した。これは、ＣＤ４：ＣＤ８比がＲＥＰを通して低下したことによって示される（図２０）。対照的に、プールされたＰＢＭＣフィーダー、改変されていないＫ５６２フィーダー、または４１ＢＢＬ単独を発現するＫ５６２フィーダーで生成されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬのＣＤ４：ＣＤ８比は、ＲＥＰ中に減少しなかった。

多機能性の評価のために、ＲＥＰ終了時の非操作及びｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを、製造業者のプロトコルに従って、９６ウェル組織培養処理丸底プレート中で、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ ＣＤ３／ＣＤ２８刺激（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して共培養した。１時間のインキュベーション後、１０００ｘ輸送阻害剤（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＭｏｎｅｎｓｉｎ、ＢｉｏｌｅｇｅｎｄのＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ）を添加し、共培養物を３７℃で更に５時間でインキュベートした。インキュベーション後、上記の抗体を用いて試料を染色した後、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて固定及び透過処理した。ＩＬ２－ＢＶ７３７（ＢＤ）、ＩＦＮγ－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＴＮＦα－ＰＥＣＦ５９４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ｇｒａｎｚｙｍｅＢ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対する抗体を用いて細胞内染色を行った。試料をＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーター上に流し、Ｆｌｏｗ Ｊｏ Ｖ１０．７．１を使用して分析を行った。多官能性は、生きたリンパ球のうち、ＴＮＦα及びＩＦＮγ二重陽性細胞の割合として決定された。膜結合ＩＬ－２１及び４１ＢＢＬの両方を発現するＫ５６２フィーダー細胞で生成されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは、ＰＢＭＣフィーダー細胞または改変されていないＫ５６２フィーダー細胞で生成されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬと比較して、ＲＥＰ終了時に多官能性の向上を示した（図２１）。

抗原非依存性生存アッセイにおけるインビトロＴＩＬ持続性の評価
ＲＥＰ後のＴＩＬを、抗原非依存生存アッセイにおけるインビトロ持続性について評価した。ＲＥＰ終了時に、非操作及びｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを２４時間サプリメントなしの条件下で放置した。翌日、非操作細胞を、サイトカイン支持体なしで、または６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２のいずれかで、２４ウェルのＧＲＥＸプレート中で１×１０^６細胞／ウェルで二重に培養し、ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬを、２５μＭのＡＣＺまたは同一体積のビヒクル（ＤＭＳＯ）のいずれかで、同じ密度で培養した。０日目に、１００μＬの各ウェルを、ＴＩＬ列挙及び表現型特性決定のためにサンプリングし、これを、上記のように、細胞数及び抗体による染色によって行った。４日目に、細胞を再懸濁し、５００μＬの細胞を除去し、５００μＬの培地＋処理を各ウェルに添加して、培養体積を１０００μＬまで増加させた。６日目に細胞を再懸濁し、１００μＬのアリコートをサンプリングして表現型を決定し、４００μＬの細胞を除去し、５００μＬの培地＋処理を各ウェルに添加して、培養体積を１０００μＬまで増加させた。８日目に、細胞を再懸濁し、５００μＬの細胞を除去し、５００μＬの培地＋処理を各ウェルに添加して、培養体積を１０００μＬまで増加させた。１０日目に細胞を再懸濁し、１００μＬのアリコートをサンプリングして表現型を決定した後、培養を終了した。試料をＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーター上に流し、Ｆｌｏｗ Ｊｏ Ｖ１０．７．１を使用して分析を行った。Ｋ５６２フィーダー細胞で生成され、ＩＬ－２１及び４１ＢＢＬを介した共刺激の両方を受けている拡張ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは、ＰＢＭＣフィーダー細胞、またはｍｂＩＬ－２１及び４１ＢＢＬを独立して発現する、改変されていないＫ５６２フィーダー細胞で生成されたｍｂＩＬ１５ ＴＩＬと比較して、１０日間生存アッセイの持続性の改善を示す（図２２）。

ＴＣＲの多様性の評価
ＴＣＲＶβサブファミリーの多様性を測定するために、製造業者のプロトコルに従って、Ｂｅｔａ Ｍａｒｋ ＴＣＲ Ｖｂｅｔａ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、ＲＥＰの終わりにある非操作及びｍｂＩＬ１５ ＴＩＬをフローサイトメトリー用に染色した。試料をＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーター上で流し、Ｆｌｏｗ Ｊｏ Ｖ１０．７．１を用いて分析を行い、ＴＣＲＶβサブファミリー分布を各サブファミリーの陽性率を評価し、対象となる全てのサブファミリーの集合としてデータを表示することによって評価した。非操作及びｍｂＩＬ１５ ＴＩＬの両方が、ＲＥＰにおける拡張のためのフィーダー細胞にかかわらず、多様なＴＣＲＶβサブファミリー分布を維持した（図２３）。

４１ＢＢＬ及びＩＬ２１を介したシグナル伝達の両方を有するｍｂＩＬ１５ ＴＩＬにおけるＰＤ１発現
ＴＩＬ枯渇のレベルを評価するために、ＰＤ１発現を決定した。抗体ＣＤ３－ＢＵＶ３９５（ＢＤ）、ＣＤ５６－ＢＶ７１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４－ＢＶ６０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＤ１－ＰＥＣｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５－ＢＵＶ７３７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、二次ストレプトアビジン－ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を有するＩＬ１５ＲａＦｃ－Ｂｉｏｔｉｎ（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及び固定可能な生存率染料ｅＦｌｕｏｒ ７８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて試料を染色した。細胞内染色のために、細胞を最初に上記の表面抗体で染色し、次に細胞を固定し、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ製造業者のプロトコルを使用して透過処理した。次いで、透過性細胞を抗体ＦｏｘＰ３－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して染色し、試料をＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーター上で流し、Ｆｌｏｗ Ｊｏ Ｖ１０．７．１を使用して分析を行った。ＰＤ１発現は、生きた細胞、ＣＤ３陽性細胞、ＣＤ５６陰性細胞の集団内でＰＤ１陽性を染色する細胞の割合によって決定された。図２５に示すように、ＰＤ１発現は、未拡張ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬにおいて最も高く、４１ＢＢＬ及びＩＬ２１を介したシグナル伝達の両方を伴うｍｂＩＬ１５ ＴＩＬの拡張は、ＰＤ１のほぼベースライン発現を伴うＴＩＬを生成する。

実施例１４：ＲＥＰ前のＴＩＬ（ＣＤ８＋、ＣＤ４＋、ＰＤ１＋、及び制御性Ｔ細胞の頻度）と比較した、操作及び拡張中のｍｂＩＬ１５ ＴＩＬの表現型変化
表現型決定を行って、（実施例１に記載されるような）ＲＥＰ前のＴＩＬを（実施例３に記載されるような）操作ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬと比較した。ＲＥＰ前及びＲＥＰ後のＴＩＬを、実施例１３に記載されるように、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＰＤ１の抗体を用いてフローサイトメトリーによって表現型決定した。図２５Ａに示されるように、ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、同じＴＩＬドナーからの対応するＲＥＰ前のＴＩＬと比較して、ＲＥＰ後のｍｂＩＬ１５ ＴＩＬについてより高く、ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度は低く、これは、実施例１３からの図２０に示される結果と一致している。ＣＤ８＋Ｔ細胞のこの増加は、実施例１３で論じられ、評価されたような細胞傷害性エフェクター細胞の増加を反映している。同様に、図２５Ｂに示すように、ＲＥＰ後のｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは、同じＴＩＬドナーからの対応するＲＥＰ前のＴＩＬよりも低いレベルのＰＤ１を発現し、これは実施例１３からの図２４に示す結果と一致する。

拡張ＴＩＬ集団における制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ細胞）を検出するために、抗体ＣＤ３－ＢＵＶ３９５（ＢＤ）、ＣＤ５６－ＢＶ７１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４－ＢＶ６０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＤ１－ＰＥＣｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５－ＢＵＶ７３７（Ｂｉｏｌｏｇｅｎｄ）、二次ストレプトアビジン－ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を有するＩＬ１５ＲａＦｃ－Ｂｉｏｔｉｎ（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及び固定可能な生存率染料ｅＦｌｕｏｒ ７８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して試料を染色した。細胞内染色のために、細胞を最初に上記の表面抗体で染色し、次に細胞を固定し、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ製造業者のプロトコルを使用して透過処理した。次いで、透過性細胞を抗体ＦｏｘＰ３－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して染色し、試料をＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター上で流し、Ｆｌｏｗ Ｊｏ Ｖ１０．７．１を使用して分析を行った。制御性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋としてゲーティングされ、更にＣＤ２５及びＦｏｘＰ３二重陽性細胞として分類されるＣＤ３＋Ｔ細胞として同定された。図２５Ｃに示されるように、拡張ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬは、操作ステップの前のＲＥＰ前のＴＩＬと比較して、調節Ｔ細胞の割合が低下している。

実施例１５：患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルと操作ＴＩＬによる治療
患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルの確立
患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデル（ＰＤＸ １６３Ａ）を、実施例１１に記載されるように、腫瘍バンクから取得した新鮮な原発性黒色腫試料から作製した。モデルが確立されると、腫瘍の凍結保存切片を、イソフルラン麻酔、免疫不全マウスに無菌的に移植した。腫瘍は、安楽死させたときに約１０００ｍｍ^３～２０００ｍｍ^３に成長し、腫瘍は、ＰＤＸ腫瘍成長を維持し、有効性試験のための動物のコホートを構築するために、後続の動物に連続して継代された（以下に記載する）。

腫瘍保有動物から切除したＰＤＸ １６３Ａ腫瘍も、フローサイトメトリーを使用して、共有の黒色腫腫瘍抗原の発現について評価した。黒色腫細胞上の保存された黒色腫抗原のレベルを評価するために、本明細書に記載の黒色腫細胞株Ａ３７５及び黒色腫ＰＤＸを、フローサイトメトリーによってアッセイした。実施例１１に記載される黒色腫ＰＤＸ由来の腫瘍塊（複数可）を新鮮にまたは凍結保存から得、生存可能な単一細胞懸濁液を得るために、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って消化した。試料は、ＭＡＲＴ－１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ｇｐ１００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及び固定可能な生存率染料ｅＦｌｕｏｒ ７８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に対する抗体を使用して試料をＦｃブロッキング試薬でブロックし、染色した。試料をＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーター上に流し、Ｆｌｏｗ Ｊｏ Ｖ１０．７．１を使用して分析を行った。黒色腫関連抗原発現腫瘍細胞の頻度は、生きた細胞集団内でＭＡＲＴ－１またはｇｐ１００のいずれかの陽性を染色する細胞の割合によって決定された。図２６は、保存された黒色腫関連抗原ＭＡＲＴ－１及びｇｐ１００の両方が、本実施例（以下）に記載されるように、ＴＩＬ有効性モデリングのために選択されたＰＤＸ腫瘍上で発現したことを示す。

同種遺伝子の有効性モデリングのためのドナーの選択
８人の黒色腫ドナーからのＴＩＬを、実施例１～３または９に記載されているように生成した。簡潔に述べると、ＲＥＰ前培養中で３週間後に、凍結保存されたＴＩＬを解凍し、６０００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ２で一晩放置した。次いで、ＴＩＬを抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａｂｅａｄｓまたはＯＫＴ３被覆されたマルチウェルプレートで２４時間活性化し、その後、それらを調節されたｍｂＩＬ１５ベクターで形質導入したか、または非操作型で形質導入した。形質導入の２４時間後、ＴＩＬをＧＲＥＸ ６Ｍウェルプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）中のＫ５６２－ＩＬ２１－４１ＢＢＬフィーダー細胞で拡張させ、非操作ＴＩＬに６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２を添加し、２５μＭのアセタゾールアミド（ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍまたはＨｉｋｍａ）を調節ｍｂＩＬ１５ ＴＩＬに添加した。１４日間の拡張後、ＴＩＬを採取し、脱ビーズし、ＩＬ２及びアセタゾールアミドの有無にかかわらず一晩放置した。

四量体染色を使用して、どのＴＩＬドナーが共有黒色腫抗原、ＭＡＲＴ－１及びｇｐ１００に反応したかを決定した。抗原反応性ＴＩＬのレベルを評価するために、フローサイトメトリーを実施して、四量体反応性細胞の頻度を調べた。試料をＦｃブロッキング試薬でブロックし、抗体ＣＤ３－ＢＵＶ３９５（ＢＤ）、ＣＤ４－ＢＶ６０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＨＬＡ－Ａ２：０１－ＭＡＲＴ－１四量体（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ＨＬＡ－Ａ２：０１－ｇｐ１００（ＭＢＬインターナショナル）、二次ストレプトアビジン－ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を有するＩＬ１５ＲａＦｃ－Ｂｉｏｔｉｎ（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及び固定可能な生存性染料ｅＦｌｕｏｒ ７８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して染色した。試料をＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーター上に流し、Ｆｌｏｗ Ｊｏ Ｖ１０．７．１を使用して分析を行った。抗原反応性ＴＩＬの頻度は、生きた細胞、ＣＤ３陽性、ＣＤ８陽性細胞の集団内で、２つの四量体の各々について陽性染色する細胞の割合によって独立して決定された。図２７に示すように、試験した４人のドナー全てがＭＡＲＴ－１抗原に対して反応性を示し、試験した４人のドナーのうち３人がｇｐ１００抗原に対して反応性を示した。四量体陽性集団は、ＴＩＬが、ＨＬＡ：Ａ２：０１遺伝子座を介して、対応する黒色腫関連抗原に反応する細胞の一部を含有することを示す。図２７において、＊で示されるドナーは、この実施例（以下）に示されるように、ＰＤＸ有効性試験において利用された。

実施例１１に記載される黒色腫ＰＤＸ由来の腫瘍塊（複数可）を新鮮にまたは凍結保存から得、生存可能な単一細胞懸濁液を得るために、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って消化した。次いで、ＰＤＸ細胞をＴＩＬ培地中で５×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁した。１０μｇ／ｍＬのマイトマイシン－Ｃを細胞に加え、次いで３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を５０ｍＬのＴＩＬ培地で３回洗浄した。１ウェル当たり１×１０^５個のＰＤＸ細胞を９６ウェルの平底組織培養処理プレートに添加した。いくつかのウェルでは、８０μｇ／ｍＬのＨＬＡ－ＡＢＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）ブロッキング抗体を添加して、標的細胞上のＭＨＣクラスＩをブロックした。一晩放置したＴＩＬを、ＴＩＬ：ＰＤＸの比が１：１で、ウェル当たりの総体積が２００μＬであるように添加した。陽性対照として、ＴＩＬをＰＭＡ／イオノマイシンと１：１０００で共培養し、最大ＩＦＮγ分泌を誘発した。陰性対照として、ＴＩＬを追加の試薬または細胞なしで共培養し、「非刺激」ＴＩＬとして同定した。２４時間の時点で、上清を各ウェルから保存し、ＩＦＮγの濃度をＭＳＤによってアッセイした。

図２８は、ＴＩＬ：腫瘍細胞共培養後のインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）産生を使用して、ＰＤＸ腫瘍に反応するＴＩＬドナーを予測することができることを示す。このインビトロアッセイは、ＴＩＬドナー００６、３９Ａ、及び４１Ａが、ＰＤＸに応答して産生されるＩＦＮγの量が最も多いドナーであることを示し、したがって、この実施例（以下）に記載されるように、インビボ有効性を調べるためのドナーとしてのそれらの候補性を支持する。

ＴＩＬ有効性試験のための患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルの使用
ＰＤｘ腫瘍保有マウス（上記のように継代された）由来の腫瘍を無菌的に採取し、約１００ｍｇの切片に切片化し、次いで、より大きなマウスコホートに移植し、それを１３日間成長させ、それを測定し、それぞれの治療群に無作為に分けられた（５０ｍｍ^３～１００ｍｍ^３）。翌日、１０ＭのＴＩＬを静脈内に導入した。非操作ＴＩＬを受けたマウスに、６００，０００国際単位（ＩＵ）のＩＬ２を４日間毎日投与した。ｍｂＩＬ１５がＣＡ２に作動可能に連結されたｍｂＩＬ１５生成物を受けたマウスは、研究全体にわたって毎日２００ｍｇ／ｋｇのアセタゾールアミド（ＡＣＺ）を投与された。腫瘍及び体重を週２回収集した。治療パラダイムを図２９に示す。図３０に示すように、操作ＴＩＬ＋ＡＣＺは、非操作ＴＩＬ＋ＩＬ２と比較して優れた抗腫瘍効果を示した。加えて、操作されたＴＩＬ、特にＡＣＺの存在下では、図３１Ａに示されるように、より良好な腫瘍浸潤を示し、図３１Ｂに示されるように、間質及び腫瘍コンパートメントの両方においてより多くの数を示した。

ＴＩＬ有効性試験のための患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルの使用
ＰＤｘ腫瘍保有マウス（上記のように継代された）由来の腫瘍を無菌的に採取し、約１００ｍｇの切片に切片化し、次いで、より大きなマウスコホートに移植し、それを１３日間成長させ、それを測定し、それぞれの治療群に無作為に分けられた（５０ｍｍ^３～１００ｍｍ^３）。翌日、１０ＭのＴＩＬを静脈内に導入した。非操作ＴＩＬを受けたマウスに、６００，０００国際単位（ＩＵ）のＩＬ２を４日間毎日投与した。ｍｂＩＬ１５がＣＡ２に作動可能に連結されたｍｂＩＬ１５生成物を受けたマウスは、研究全体にわたって毎日２００ｍｇ／ｋｇのアセタゾールアミド（ＡＣＺ）を投与された。腫瘍及び体重を週２回収集した。治療パラダイムを図２９に示す。図３０に示すように、操作ＴＩＬ＋ＡＣＺは、非操作ＴＩＬ＋ＩＬ２と比較して優れた抗腫瘍効果を示した。加えて、操作されたＴＩＬ、特にＡＣＺの存在下では、図３１Ａに示されるように、より良好な腫瘍浸潤を示し、図３１Ｂに示されるように、間質及び腫瘍コンパートメントの両方においてより多くの数を示した。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
膜結合型インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）。
(項目２)
前記ｍｂＩＬ１５が、薬物応答性ドメインに作動可能に連結されている、項目１に記載のＴＩＬ。
(項目３)
前記ＴＩＬが、外因性サイトカインの非存在下で拡張することができる、項目１または２に記載のＴＩＬ。
(項目４)
前記外因性サイトカインが、ＩＬ２である、項目３に記載のＴＩＬ。
(項目５)
項目１～４のいずれか１項に記載の複数のＴＩＬを含む、ＴＩＬの集団。
(項目６)
前記ＴＩＬの少なくとも亜集団が拡張を受けた、項目５に記載のＴＩＬの集団。
(項目７)
膜結合型インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された、拡張腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）。
(項目８)
前記ｍｂＩＬ１５が、薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）に作動可能に連結されている、項目７に記載の拡張ＴＩＬ。
(項目９)
項目７または８に記載の複数のＴＩＬを含む、拡張ＴＩＬの集団。
(項目１０)
前記拡張ＴＩＬの集団が、非拡張ＴＩＬの対照集団におけるＣＤ８＋細胞の割合と比較して、ＣＤ８＋細胞の割合が高い、項目９に記載の拡張ＴＩＬの集団。
(項目１１)
前記拡張ＴＩＬの集団が、非拡張ＴＩＬの対照集団におけるＣＤ４＋細胞の割合と比較して、ＣＤ４＋細胞の割合が低い、項目９～１０のいずれか１項に記載の拡張ＴＩＬの集団。
(項目１２)
前記拡張ＴＩＬの集団が、非拡張ＴＩＬの対照集団のＣＤ８：ＣＤ４比よりも大きいＣＤ８：ＣＤ４比を有する、項目９に記載の拡張ＴＩＬの集団。
(項目１３)
前記拡張ＴＩＬの集団が、非拡張ＴＩＬの対照集団におけるＰＤ１＋細胞の割合と比較して、ＰＤ１＋細胞の割合が低い、項目９に記載の拡張ＴＩＬの集団。
(項目１４)
前記拡張ＴＩＬの集団が、非拡張ＴＩＬの対照集団において、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の両方を産生するＴＩＬの割合と比較して、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の両方を産生する細胞の割合が高い、項目９～１３のいずれか１項に記載の拡張ＴＩＬの集団。
(項目１５)
ＴＩＬの混合集団であって、
（ａ）非改変ＴＩＬの亜集団と、
（ｂ）膜結合型ＩＬ１５（ｍｂＩＬ１５）を含む改変ＴＩＬの亜集団と、を含む、前記混合集団。
(項目１６)
前記ｍｂＩＬ１５が、薬物応答性ドメインに作動可能に連結されている、項目１５に記載のＴＩＬの混合集団。
(項目１７)
前記改変ＴＩＬの亜集団が、Ｋ５６２フィーダー細胞、４１ＢＢＬ、及びＩＬ２１の存在下で拡張する、項目１５または１６に記載のＴＩＬの混合集団。
(項目１８)
前記改変ＴＩＬの亜集団が、Ｋ５６２フィーダー細胞、４１ＢＢＬ、及びＩＬ２１の存在下での形質導入されていないＴＩＬの亜集団よりも拡張する、項目１７に記載のＴＩＬの混合集団。
(項目１９)
前記改変ＴＩＬの亜集団の前記拡張が、インターロイキン２（ＩＬ２）の非存在下で生じる、項目１７または１８に記載のＴＩＬの混合集団。
(項目２０)
膜結合型インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を作製する方法であって、前記ＴＩＬをベクターで形質導入することを含み、前記ベクターが、ＩＬ１５をコードする第１の核酸配列と、膜貫通ドメインをコードする第２の核酸配列と、を含む、前記方法。
(項目２１)
前記ベクターが、ウイルスベクターである、項目２０に記載の方法。
(項目２２)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、項目２１に記載の方法。
(項目２３)
前記レンチウイルスベクターが、ヒヒ内因性レトロウイルスエンベロープ（ＢａＥＶ）擬似型レンチウイルスベクターである、項目２２に記載の方法。
(項目２４)
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、項目２１に記載の方法。
(項目２５)
前記レトロウイルスベクターが、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープ疑似型ガンマレトロウイルスベクターである、項目２４に記載の方法。
(項目２６)
ＩＬ１５をコードする第１の核酸配列と、膜貫通ドメインをコードする第２の核酸配列と、を含む、ヒヒ内因性レトロウイルスエンベロープ（ＢａＥＶ）擬似型レンチウイルスベクター。
(項目２７)
ＩＬ１５をコードする第１の核酸配列と、膜貫通ドメインをコードする第２の核酸配列と、を含む、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープ疑似型ガンマレトロウイルスベクター。
(項目２８)
項目１～４のいずれか１項に記載のＴＩＬ、項目５もしくは６に記載のＴＩＬの集団、項目７もしくは８に記載の拡張ＴＩＬ、項目９～１４のいずれか１項に記載の拡張ＴＩＬの集団、または項目１５～１９のいずれか１項に記載のＴＩＬの混合集団を含む、薬学的組成物。
(項目２９)
がんを有するレシピエント対象を治療する方法であって、項目１～４のいずれか１項に記載のＴＩＬ、項目５もしくは６に記載のＴＩＬの集団、項目７もしくは８に記載の拡張ＴＩＬ、項目９～１４のいずれか１項に記載の拡張ＴＩＬの集団、項目１５～１９のいずれか１項に記載のＴＩＬの混合集団、または項目２８に記載の薬学的組成物を前記レシピエント対象に投与することを含む、前記方法。
(項目３０)
前記レシピエント対象にリガンドを投与することを更に含み、前記リガンドが、ｍｂＩＬ１５に作動可能に連結された薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）に結合する、項目２９に記載の方法。
(項目３１)
前記レシピエント対象が、ＩＬ２を投与されない、項目２９または３０に記載の方法。
(項目３２)
１つ以上のＴＩＬを腫瘍から単離し、前記１つ以上のＴＩＬにＩＬ１５を発現する核酸を導入することを更に含む、項目２９～３１のいずれか１項に記載の方法。
(項目３３)
前記ＴＩＬが、前記レシピエント対象の腫瘍から単離される、項目３２に記載の方法。
(項目３４)
前記ＴＩＬが、ドナー対象に由来する腫瘍から単離され、前記ドナー対象が、前記レシピエント対象ではない、項目３２に記載の方法。
(項目３５)
前記ドナー対象の前記腫瘍から単離された前記ＴＩＬが、前記レシピエント対象の前記腫瘍に存在するがん抗原に特異的な１つ以上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、項目３４に記載の方法。
(項目３６)
前記レシピエント対象に対してＨＬＡ適合であるドナー対象を選択することを更に含む、項目３４または３５に記載の方法。
(項目３７)
前記レシピエント対象が、前記ＴＩＬの投与前にリンパ球枯渇されている、項目２９～３６のいずれか１項に記載の方法。

Claims (37)

1. 膜結合型インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）。
2. 前記ｍｂＩＬ１５が、薬物応答性ドメインに作動可能に連結されている、請求項１に記載のＴＩＬ。
3. 前記ＴＩＬが、外因性サイトカインの非存在下で拡張することができる、請求項１または２に記載のＴＩＬ。
4. 前記外因性サイトカインが、ＩＬ２である、請求項３に記載のＴＩＬ。
5. 請求項１～４のいずれか１項に記載の複数のＴＩＬを含む、ＴＩＬの集団。
6. 前記ＴＩＬの少なくとも亜集団が拡張を受けた、請求項５に記載のＴＩＬの集団。
7. 膜結合型インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された、拡張腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）。
8. 前記ｍｂＩＬ１５が、薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）に作動可能に連結されている、請求項７に記載の拡張ＴＩＬ。
9. 請求項７または８に記載の複数のＴＩＬを含む、拡張ＴＩＬの集団。
10. 前記拡張ＴＩＬの集団が、非拡張ＴＩＬの対照集団におけるＣＤ８＋細胞の割合と比較して、ＣＤ８＋細胞の割合が高い、請求項９に記載の拡張ＴＩＬの集団。
11. 前記拡張ＴＩＬの集団が、非拡張ＴＩＬの対照集団におけるＣＤ４＋細胞の割合と比較して、ＣＤ４＋細胞の割合が低い、請求項９～１０のいずれか１項に記載の拡張ＴＩＬの集団。
12. 前記拡張ＴＩＬの集団が、非拡張ＴＩＬの対照集団のＣＤ８：ＣＤ４比よりも大きいＣＤ８：ＣＤ４比を有する、請求項９に記載の拡張ＴＩＬの集団。
13. 前記拡張ＴＩＬの集団が、非拡張ＴＩＬの対照集団におけるＰＤ１＋細胞の割合と比較して、ＰＤ１＋細胞の割合が低い、請求項９に記載の拡張ＴＩＬの集団。
14. 前記拡張ＴＩＬの集団が、非拡張ＴＩＬの対照集団において、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の両方を産生するＴＩＬの割合と比較して、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の両方を産生する細胞の割合が高い、請求項９～１３のいずれか１項に記載の拡張ＴＩＬの集団。
15. ＴＩＬの混合集団であって、
    （ａ）非改変ＴＩＬの亜集団と、
    （ｂ）膜結合型ＩＬ１５（ｍｂＩＬ１５）を含む改変ＴＩＬの亜集団と、を含む、前記混合集団。
16. 前記ｍｂＩＬ１５が、薬物応答性ドメインに作動可能に連結されている、請求項１５に記載のＴＩＬの混合集団。
17. 前記改変ＴＩＬの亜集団が、Ｋ５６２フィーダー細胞、４１ＢＢＬ、及びＩＬ２１の存在下で拡張する、請求項１５または１６に記載のＴＩＬの混合集団。
18. 前記改変ＴＩＬの亜集団が、Ｋ５６２フィーダー細胞、４１ＢＢＬ、及びＩＬ２１の存在下での形質導入されていないＴＩＬの亜集団よりも拡張する、請求項１７に記載のＴＩＬの混合集団。
19. 前記改変ＴＩＬの亜集団の前記拡張が、インターロイキン２（ＩＬ２）の非存在下で生じる、請求項１７または１８に記載のＴＩＬの混合集団。
20. 膜結合型インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を作製する方法であって、前記ＴＩＬをベクターで形質導入することを含み、前記ベクターが、ＩＬ１５をコードする第１の核酸配列と、膜貫通ドメインをコードする第２の核酸配列と、を含む、前記方法。
21. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項２１に記載の方法。
23. 前記レンチウイルスベクターが、ヒヒ内因性レトロウイルスエンベロープ（ＢａＥＶ）擬似型レンチウイルスベクターである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項２１に記載の方法。
25. 前記レトロウイルスベクターが、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープ疑似型ガンマレトロウイルスベクターである、請求項２４に記載の方法。
26. ＩＬ１５をコードする第１の核酸配列と、膜貫通ドメインをコードする第２の核酸配列と、を含む、ヒヒ内因性レトロウイルスエンベロープ（ＢａＥＶ）擬似型レンチウイルスベクター。
27. ＩＬ１５をコードする第１の核酸配列と、膜貫通ドメインをコードする第２の核酸配列と、を含む、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープ疑似型ガンマレトロウイルスベクター。
28. 請求項１～４のいずれか１項に記載のＴＩＬ、請求項５もしくは６に記載のＴＩＬの集団、請求項７もしくは８に記載の拡張ＴＩＬ、請求項９～１４のいずれか１項に記載の拡張ＴＩＬの集団、または請求項１５～１９のいずれか１項に記載のＴＩＬの混合集団を含む、薬学的組成物。
29. がんを有するレシピエント対象を治療する方法であって、請求項１～４のいずれか１項に記載のＴＩＬ、請求項５もしくは６に記載のＴＩＬの集団、請求項７もしくは８に記載の拡張ＴＩＬ、請求項９～１４のいずれか１項に記載の拡張ＴＩＬの集団、請求項１５～１９のいずれか１項に記載のＴＩＬの混合集団、または請求項２８に記載の薬学的組成物を前記レシピエント対象に投与することを含む、前記方法。
30. 前記レシピエント対象にリガンドを投与することを更に含み、前記リガンドが、ｍｂＩＬ１５に作動可能に連結された薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）に結合する、請求項２９に記載の方法。
31. 前記レシピエント対象が、ＩＬ２を投与されない、請求項２９または３０に記載の方法。
32. １つ以上のＴＩＬを腫瘍から単離し、前記１つ以上のＴＩＬにＩＬ１５を発現する核酸を導入することを更に含む、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記ＴＩＬが、前記レシピエント対象の腫瘍から単離される、請求項３２に記載の方法。
34. 前記ＴＩＬが、ドナー対象に由来する腫瘍から単離され、前記ドナー対象が、前記レシピエント対象ではない、請求項３２に記載の方法。
35. 前記ドナー対象の前記腫瘍から単離された前記ＴＩＬが、前記レシピエント対象の前記腫瘍に存在するがん抗原に特異的な１つ以上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、請求項３４に記載の方法。
36. 前記レシピエント対象に対してＨＬＡ適合であるドナー対象を選択することを更に含む、請求項３４または３５に記載の方法。
37. 前記レシピエント対象が、前記ＴＩＬの投与前にリンパ球枯渇されている、請求項２９～３６のいずれか１項に記載の方法。