KR20210042909A - 융합 구조물 및 그의 이용 방법 - Google Patents

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tgf
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헬렌 삽제바리
사이먼 메테노우
창흥 첸
루툴 알. 샤
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Abstract

본원은 항-PD1 항체 또는 그의 단편/변이체 및 TGF-트랩을 포함하는 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본원은 항-PD1 항체 또는 그의 단편/변이체 및 ADA2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 그의 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 본원은 암 치료에서 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

Description

융합 구조물 및 그의 이용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2018년 7월 9일자로 출원된 미국 가 특허출원 제 62/695,623 호, 2018년 7월 9일자로 출원된 제 62/695,627 호, 2019년 6월 19일자로 출원된 제 62/863,710 호, 2019년 6월 20일자로 출원된 제 62/864,367 호, 및 2019년 6월 25일자로 출원된 제 62/866,420 호의 이득을 청구하며, 이들은 내용 전체가 본원에 참고로 인용된다.
최근에, 적응면역계로 전달되는 억제 신호의 중단에 기반한 단클론 항체-기반 암 면역요법이 임상에 유망한 것으로 나타났다. CTLA-4 항체 억제제(예를 들어 이필리무맙) 및 PD-1 억제제(예를 들어 펨브롤리주맙, 니볼루맙)의 FDA 승인에 따라, 현재 보다 많은 치료 옵션을 폐암, 신세포암, 및 난소암을 포함한 고형 종양의 치료에 이용할 수 있다. 그러나, PD-1/PD-L1 및 TGF-β가 공동-발현되는 대다수의 적응증에서(예를 들어 난소, 위 및 결장직장), 면역관문 억제제에 대한 반응은 거의 내지 전혀 관찰되지 않았다.
따라서, 보다 안전하고 보다 유효한 암 치료제를 수득할 필요가 계속되고 있다.
참조에 의한 포함
본 명세서에서 언급되는 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별적인 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 인용됨을 가리키는 바와 동일한 정도로 본원에 참고로 인용된다.
발명의 요약
본원은 (a) 세포예정사 단백질-1(PD-1)에 결합하는 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 상기 항체의 변이체, 및 (b) 형질전환 성장인자 베타(TGF-β) 사이토카인 트랩을 포함하는 융합 단백질을 제공하며; 여기에서 상기 융합 단백질의 하나 이상의 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다.
하나의 구현예에서, 상기 링커는 (G4S)n(여기에서 n은 2, 3, 4, 5, 또는 6이다)을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 링커는 (Gly)n(여기에서 n은 6, 7, 또는 8이다), 하나의 구현예에서, 상기 링커는 (EAAAK)n(여기에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다)을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 링커는 A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 링커는 서열번호 17-34 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 TGF-β 사이토카인 트랩은 형질전환 성장인자 수용체(TGFβR), 또는 그의 기능성 단편, 항-TGF-β 항체 또는 그의 항원 결합 단편, TGF-β1 억제성 펩티드 또는 그의 변이체를 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 TGFβR은 형질전환 성장인자 베타 수용체 II(TGFβRII) 또는 그의 기능성 단편이다. 하나의 구현예에서, 상기 TGFβRII의 기능성 단편은 TGFβRII 세포외 도메인(ECD)이다. 하나의 구현예에서, 상기 ECD는 TGF-β1에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 ECD는 TGF-β3에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 ECD는 TGF-β1 및 TGF-β3에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 ECD는 TGF-β1 및 TGF-β3에 결합하지만 TGF-β2에는 결합하지 않는다. 하나의 구현예에서, 상기 TGF-β 사이토카인 트랩은 서열번호 14, 서열번호 141 또는 서열번호 142에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 TGF-β 사이토카인 트랩은 서열번호 14, 서열번호 141 또는 서열번호 142에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 TGF-β 사이토카인 트랩은 서열번호 14에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 항체(항-PD1)는 면역글로불린 G(IgG) 항체이다. 하나의 구현예에서, 상기 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다. 하나의 구현예에서, 상기 IgG4는 서열번호 146 또는 서열번호 292의 108번 위치에 돌연변이를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 돌연변이는 S108P 돌연변이이다. 하나의 구현예에서, 상기 IgG4는 상기 링커에 의해 상기 TGF-β 사이토카인 트랩에 연결된다. 하나의 구현예에서, 상기 항체의 상기 단편은 Fab, (Fab)2, (Fab')2, Fv, (Fv)2, 또는 scFv이다.
하나의 구현예에서, 상기 항체는 상기 항체의 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 링커는 상기 중쇄의 가변 영역(VH)을 상기 TGF-β 사이토카인 트랩에 연결한다. 하나의 구현예에서, 상기 링커는 상기 경쇄의 가변 영역(VL)을 상기 TGF-β 사이토카인 트랩에 연결한다. 하나의 구현예에서, 상기 중쇄의 가변 영역(VH)은 상기 융합 단백질 중의 제2 링커에 의해 상기 경쇄의 가변 영역(VL)에 연결된다. 하나의 구현예에서, 상기 제2 링커는 서열번호 17-34 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현에에서, 상기 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 1-7 및 149-164 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일하다.
하나의 구현예에서, 상기 경쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 8-13 및 148 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일하다. 하나의 구현예에서, 상기 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 1-7 및 149-164 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 경쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 8-13 및 148 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 90% 동일하고, 상기 경쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 90% 동일하다. 하나의 구현예에서, 상기 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하고 상기 경쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 16에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 143에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 90% 동일하고, 상기 경쇄의 가변 영역은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 90% 동일하다. 하나의 구현예에서, 상기 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하고 상기 경쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 296에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 145에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 296에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 144에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 항체는 결정가능 단편(fragment crystallizable region; Fc)을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 FC는 인간 FC1, FC2, FC3, FC4, 또는 그의 단편이다. 하나의 구현예에서, 상기 Fc는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 항체는 상기 scFv 및 상기 FC 단편을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 TGF-β 사이토카인 트랩은 상기 항-TGF β 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항-TGF β 항체는 서열번호 166, 168, 169, 171, 173, 175, 또는 177에 의해 암호화된 VH, 및 서열번호 165, 167, 170, 172, 174, 176, 또는 178에 의해 암호화된 VL을 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 TGF β 사이토카인 트랩은 상기 TGF β 억제성 펩티드 또는 그의 변이체를 포함한다. 하나의 구현예에서, TGF β 억제성 펩티드는 서열번호 193-227 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다.
본원은 본원에 개시된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본원은 본원에 개시된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하며, 여기에서 상기 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결된다. 하나의 구현에에서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터, 조직 특이성 프로모터, 또는 유도성 프로모터이다. 하나의 구현예에서, 상기 유도성 프로모터는 소분자 리간드-유도성 2 폴리펩티드 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치이다. 하나의 구현예에서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터이다.
본원은 (a) 본원에 개시된 융합 단백질, (b) 본원에 개시된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 (c) 본원에 개시된 발현 벡터, 및 (d) 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원은 세포를 (a) 본원에 개시된 융합 단백질, (b) 본원에 개시된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 (c) 본원에 개시된 발현 벡터와 접촉시킴을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 상기 세포는 암세포이다. 하나의 구현예에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다.
본원은 암을 가진 대상체의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 세포예정사 단백질-1(PD-1)에 결합하는 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 변이체 및 (b) 형질전환 성장인자 수용체(TGFβR) 또는 그의 기능성 단편, 항-TGF-β 항체 또는 그의 항원 결합 단편, TGF-β1 억제성 펩티드 또는 그의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 투여함을 포함하며; 여기에서 융합 단백질의 하나 이상의 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다.
하나의 구현예에서, 상기 링커는 (G4S)n(여기에서 n은 2, 3, 4, 5, 또는 6이다)을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 링커는 (Gly)n(여기에서 n은 6, 7, 또는 8이다), 하나의 구현예에서, 상기 링커는 (EAAAK)n(여기에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다)을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 링커는 A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 링커는 서열번호 17-34 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 형질전환 성장인자 수용체 단백질은 TGFβRII이다. 하나의 구현예에서, 상기 TGFβRII의 기능성 단편은 TGFβRII 세포외 도메인(ECD)이다. 하나의 구현예에서, 상기 TGF-β 사이토카인 트랩은 서열번호 14, 서열번호 141 또는 서열번호 142에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 TGF-β 사이토카인 트랩은 서열번호 14, 서열번호 141 또는 서열번호 142에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 항체는 면역글로불린 G(IgG) 항체이다. 하나의 구현예에서, 상기 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다. 하나의 구현예에서, 상기 IgG4는 서열번호 146 또는 서열번호 292의 108번 위치에 돌연변이를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 돌연변이는 S108P 돌연변이이다. 하나의 구현예에서, 상기 항체의 상기 단편은 상기 항체의 Fab, (Fab)2, (Fab')2, Fv, (Fv)2, 또는 scFv이다. 하나의 구현예에서, 상기 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 상기 항체의 변이체는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 링커는 상기 중쇄의 가변 영역(VH)을 상기 TGF-β 사이토카인 트랩에 연결한다. 하나의 구현예에서, 상기 링커는 상기 경쇄의 가변 영역(VL)을 상기 TGF-β 사이토카인 트랩에 연결한다.
하나의 구현예에서, 상기 중쇄의 가변 영역(VH)은 제2 링커에 의해 상기 경쇄의 가변 영역(VL)에 연결된다. 하나의 구현예에서, 상기 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 1-7 및 149-164 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일하다. 하나의 구현예에서, 상기 경쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 8-13 및 148 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일하다. 하나의 구현예에서, 상기 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 1-7 및 149-164 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 경쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 8-13 및 148 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 90% 동일하고, 상기 경쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 90% 동일하다. 하나의 구현예에서, 상기 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하고 상기 경쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 16에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 15(VL5 Igg4)에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 143에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 90% 동일하고, 상기 경쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 90% 동일하다. 하나의 구현예에서, 상기 중쇄의 가변 영역은 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하고 상기 경쇄의 가변 영역은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 296에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 145에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 296에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 144에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 항체는 결정가능 단편(FC)을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 FC는 인간 FC1, FC2, FC3, FC4, 또는 그의 단편이다. 하나의 구현예에서, 상기 Fc는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 항체는 상기 scFv 및 상기 FC 단편을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 암은 불응성(refractory) 암이다. 하나의 구현예에서, 상기 대상체는 PD-1 항체 또는 CTLA-4 항체에 의한 치료에 비-반응성이다. 하나의 구현예에서, 방법은 하나 이상의 추가적인 항암제를 투여함을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 추가적인 항암제는 PD-1 억제제, PD-L1 억제제 또는 CTLA-4 억제제이다. 하나의 구현예에서, 상기 PD-1 억제제는 항-PD-1 항체 또는 그의 단편 또는 변이체이다.
하나의 구현예에서, 상기 CTLA-4 억제제는 항-CTLA-4 항체 또는 그의 단편 또는 변이체이다. 하나의 구현예에서, 방법은 하나 이상의 사이토카인을 투여함을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 대상체는 포유동물 대상체이다. 하나의 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다. 하나의 구현예에서, 상기 암은 중피종, 교모세포종, 자궁내막암, 대장암, 위암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 유방암, 위암, 방광암, 간암, 호지킨 림프종, 폐암, 피부암, 신장암 또는 두경부암이다.
하나의 구현예에서, 피부암은 피부 편평세포 암종, 흑색종 또는 기저세포암이다. 하나의 구현예에서, 폐암은 비 소세포 폐암(NSLC) 또는 소세포 폐암(SCLC)이다. 하나의 구현예에서, 유방암은 3중 음성 유방암(TNBC)이다. 하나의 구현예에서, 방법은 외인성 수용체를 발현하도록 조작된 유효량의 T 세포를 투여함을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 외인성 수용체는 키메라 항원 수용체이다. 하나의 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 조작된 T-세포 수용체이다.
하나의 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 CD19, BCMA, CD44, α-폴레이트 수용체, CAIX, CD30, ROR1, CEA, EGP-2, EGP-40, HER2, HER3, 폴레이트-결합 단백질, GD2, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, 메소텔린, CD22, EGFR, 폴레이트 수용체 α, MUC-1, MUC-4, MUC-16, MAGE-A1, h5T4, PSMA, TAG-72, EGFR, CD20, EGFRvIII, CD123 또는 VEGF-R2상의 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 37-56 중에서 선택된 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 35-36 중에서 선택된 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 조작된 T-세포의 유효량은 적어도 102 세포/㎏이다. 하나의 구현예에서, 조작된 T-세포의 유효량은 적어도 104 세포/㎏이다. 하나의 구현예에서, 조작된 T-세포의 유효량은 적어도 105 세포/㎏이다. 하나의 구현예에서, 조작된 T-세포는 사이토카인을 추가로 발현한다. 하나의 구현에에서, 사이토카인은 IL-15 및 IL-15Rα를 포함하는 융합 단백질이다.
본원은 암 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, (a) 세포예정사 단백질-1(PD-1)에 결합하는 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 상기 항체의 변이체; 및 형질전환 성장인자 수용체(TGFβR) 단백질 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 투여하고; 여기에서 융합 단백질의 하나 이상의 폴리펩티드가 링커에 의해 연결됨; 및 (b) 유효량의 조작된 T-세포의 하나 이상의 용량을 대상체에게 투여함을 포함하고, 여기서 조작된 T-세포가 키메라 수용체 및 막 결합된 IL-15를 포함하는, 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 294에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 296에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 295에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 294에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 295에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
본원은 특히, (a) 세포예정사 단백질-1(PD-1)에 결합하는 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 상기 항체의 변이체; 및 (b) 아데노신 데아미나제(ADA) 단백질 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질을 개시하며; 여기에서 상기 융합 단백질의 하나 이상의 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다. 하나의 구현예에서, 상기 링커는 (G4S)n(여기에서 n은 2, 3, 4, 5, 또는 6이다)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 (Gly)n(여기에서 n은 6, 7, 또는 8이다)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 링커는 (EAAAK)n(여기에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다)을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 링커는 A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 링커는 서열번호 17-34 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 아데노신 데아미나제 단백질은 아데노신 데아미나제 2(ADA2) 또는 그의 돌연변이체 또는 그의 변이체이다. 또 다른 구현에에서, 아데노신 데아미나제(ADA) 단백질은 ADA2 돌연변이 1(서열번호 273), ADA2 돌연변이 2(서열번호 274), ADA2 돌연변이 3(서열번호 275), ADA2 돌연변이 4(서열번호 276), ADA2 돌연변이 5(서열번호 277), 또는 ADA2 돌연변이 6(서열번호 278), ADA2 돌연변이 7(서열번호 279), 또는 야생형 ADA2(서열번호 284) 중 어느 하나를 포함한다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제(ADA) 단백질은 서열번호 284 또는 273-279 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 아데노신 데아미나제(ADA) 단백질은 서열번호 284 또는 273-279 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 면역글로불린 G(IgG) 항체이다. 몇몇 구현예에서, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다. 하나의 구현예에서, IgG4는 서열번호 146 또는 서열번호 292의 108번 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 S108P 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 항체의 단편은 항체의 Fab, (Fab)2, (Fab')2, Fv, (Fv)2, 또는 scFv이다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 항체의 단편 또는 항체의 변이체는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 하나의 구현예에서, 링커는 중쇄의 가변 영역(VH)을 아데노신 데아미나제 2(ADA2) 또는 그의 돌연변이체 또는 그의 변이체에 연결한다. 또 다른 구현예에서, 링커는 경쇄의 가변 영역(VL)을 아데노신 데아미나제 2(ADA2) 또는 그의 돌연변이체 또는 그의 변이체에 연결한다.
하나의 예에서, 중쇄 가변 영역(VH)은 제2 링커에 의해 경쇄 가변 영역(VL)에 연결된다. 하나의 구현예에서, 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 1-7 및 149-164 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일하다. 또 다른 예에서, 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호 8-13 및 148 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일하다. 추가의 구현예에서, 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 1-7 및 149-164 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 경쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 8-13 및 148 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열(VH6)에 적어도 90% 일치하고 경쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열(VL5)에 적어도 90% 일치한다. 하나의 구현예에서, 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하고 경쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 융합 단백질은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열(VL5) 및 서열번호 280에 나타낸 바와 같은 서열(VH6 IgG4(mut)- ADA2 wt)을 포함한다. 또 다른 예에서, 융합 단백질은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열(VL5) 및 서열번호 281에 나타낸 바와 같은 서열(VH6 igG4(mut) ADA2 mut7)을 포함한다. 하나의 예에서, 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열(VH7)에 적어도 90% 일치하고 경쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열(VL6)에 적어도 90% 일치한다. 하나의 예에서, 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열(VH7)을 포함하고 경쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열(VL6)을 포함한다.
또 다른 예에서, 융합 단백질은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열(VL6) 및 서열번호 282에 나타낸 바와 같은 서열(VH7 igG4(mut) ADA2 wt)을 포함한다. 하나의 예에서, 융합 단백질은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열(VL6) 및 서열번호 283에 나타낸 바와 같은 서열(VH7 igG4(mut) ADA2 mut7)을 포함한다.
본원은 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 추가로 본원은 상기 태양 중 어느 하나의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하며, 여기에서 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터, 조직 특이성 프로모터, 또는 유도성 프로모터이다. 일부 구현에에서, 유도성 프로모터는 소분자 리간드-유도성 2 폴리펩티드 엑티손 수용체-기반 유전자 스위치이다. 일부 구현예에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터이다.
본원은 세포를 융합 단백질, 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 발현 벡터와 접촉시킴을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 암세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포이다.
추가로 본원은 융합 단백질; 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 또는 발현 벡터, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원은 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포예정사 단백질-1(PD-1)에 결합하는 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 상기 항체의 변이체; 및 아데노신 데아미나제 단백질 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 투여함을 포함하고; 여기에서 융합 단백질의 하나 이상의 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다. 몇몇 경우에, 아데노신 데아미나제 단백질은 아데노신 데아미나제 2(ADA2)이다. 다른 구현에에서, 아데노신 데아미나제(ADA) 단백질은 ADA2 돌연변이 1(서열번호 273), ADA2 돌연변이 2(서열번호 274), ADA2 돌연변이 3(서열번호 275), ADA2 돌연변이 4(서열번호 276), ADA2 돌연변이 5(서열번호 277), 또는 ADA2 돌연변이 6(서열번호 278), ADA2 돌연변이 7(서열번호 279), 또는 야생형 ADA2(서열번호 284) 중 어느 하나를 포함한다.
몇몇 경우에 링커는 (G4S)n(여기에서 n은 2, 3, 4, 5, 또는 6이다)을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 (Gly)n(여기에서 n은 6, 7, 또는 8이다)을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 (EAAAK)n(여기에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다)을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A를 포함한다. 일부의 경우에, 링커는 서열번호 17-34 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
본원은 암이 있는 대상체의 치료 방법을 제공한다. 몇몇 경우에, 암은 중피종, 교모세포종, 자궁내막암, 대장암, 위암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 유방암, 위암, 방광암, 간암, 호지킨 림프종, 폐암, 피부암, 신장암 또는 두경부암이다. 몇몇 경우에, 피부암은 피부 편평세포 암종, 흑색종 또는 기저세포암이다. 다른 구현예에서, 폐암은 비 소세포 폐암(NSLC) 또는 소세포 폐암(SCLC)이다. 일부의 경우에, 유방암은 3중 음성 유방암(TNBC)이다.
또 다른 구현예에서, 암이 있는 대상체의 치료 방법이 존재하며, 방법은 세포예정사 단백질-1(PD-1)에 결합하는 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 상기 항체의 변이체; 및 아데노신 데아미나제 단백질 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 조성물을 투여함을 포함하고; 여기에서 융합 단백질의 하나 이상의 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다. 추가의 구현예에서, 암이 있는 대상체의 치료 방법은 외인성 수용체를 발현하도록 조작된 유효량의 T 세포를 투여함을 추가로 포함한다.
일부의 경우에, 외인성 수용체는 키메라 항원 수용체이다. 다른 경우에, 키메라 항원 수용체는 조작된 T-세포 수용체이다. 하나의 경우에, 키메라 항원 수용체는 CD19, BCMA, CD44, α-폴레이트 수용체, CAIX, CD30, ROR1, CEA, EGP-2, EGP-40, HER2, HER3, 폴레이트-결합 단백질, GD2, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, 메소텔린, CD22, EGFR, 폴레이트 수용체 α, MUC-1, MUC-4, MUC-16, MAGE-A1, h5T4, PSMA, TAG-72, EGFR, CD20, EGFRvIII, CD123 또는 VEGF-R2상의 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 37-56 중에서 선택된 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 35-36 중에서 선택된 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 조작된 T-세포의 유효량은 적어도 102 세포/㎏이다. 또 다른 구현예에서, 조작된 T-세포의 유효량은 적어도 104 세포/㎏이다. 추가의 구현예에서, 조작된 T-세포의 유효량은 적어도 105 세포/㎏이다.
추가의 구현예에서, 조작된 T-세포는 사이토카인을 추가로 발현한다. 또 다른 구현에에서, 사이토카인은 IL-15 및 IL-15Rα를 포함하는 융합 단백질이다.
본원은 암 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 세포예정사 단백질-1(PD-1)에 결합하는 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 상기 항체의 변이체; 및 아데노신 데아미나제 단백질 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 투여하고; 여기에서 융합 단백질의 하나 이상의 폴리펩티드는 링커에 의해 연결됨, 및 유효량의 조작된 T-세포의 하나 이상의 용량을 대상체에게 투여함을 포함하고, 여기에서 조작된 T-세포가 키메라 수용체 및 막 결합된 IL-15를 포함하는, 방법을 제공한다.
본 개시내용의 특징을 첨부된 청구항의 세부사항과 함께 제시한다. 예시적인 구현예를 제시하는 하기의 상세한 설명(개시내용의 원리가 사용된다), 및 첨부된 도면을 참조로, 본 개시내용의 특징 및 장점에 대한 보다 양호한 이해가 획득될 것이며, 도면에서:
도 1은 면역억제에서 PD-1/PD-L1의 개략도이다.
도 2는 면역억제에서 TGF-β의 개략도이다.
도 3은 난소암 환자(III/IV기가 많음)의 부분집합에서 전이성 질병 및 불량한 예후와 상관있는 TGF-β 연관된 유전자 클러스터를 도시한다.
도 4A, 도 4B 및 도 4C는 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 설계의 도식적 설계를 도시한다. 다른 예시적인 구현예에서, ADA2는 항-PD1에 융합될 수 있다.
도 5는 항-PD1(VH6-VL5) IgG1-TGFβRII 및 항-PD1(VH6-VL5) IgG4-TGFβRII에 의한 PD-1/PD-L1 상호작용의 차단을 도시하는 그래프이다.
도 6은 항-PD1(VH6-VL5) IgG1-TGFβRII 및 항-PD1(VH6-VL5) IgG4-TGFβRII에 의한 TGF-β1 동형 신호전달의 중화를 도시하는 그래프이다.
도 7은 항-PD1(VH6-VL5) IgG1-TGFβRII 및 항-PD1(VH6-VL5) IgG4-TGFβRII에 의한 TGF-β2 동형의 중화를 도시하는 그래프이다.
도 8은 항-PD1(VH6-VL5) IgG1-TGFβRII 및 항-PD1(VH6-VL5) IgG4-TGFβRII에 의한 TGF-β3 동형 신호전달의 중화를 도시하는 그래프이다.
도 9A, 도 9B 및 도 9C는 항-PD1 또는 대조용 항체에 비해 용량 의존적인 방식으로 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 존재하에서 자극된 PBMC에 의한 증대된 증식 및 IFN-γ 생성을 도시하는 그래프이다.
도 9D 및 도 9E는 항-PD1-TGFRII 융합 단백질을 PBMC 및 대장암(결장직장 선암종) 세포주의 공-배양물에 첨가시 CD8+ T 세포상의 PD1 수용체 점유 및 IFN-γ 생산을 각각 도시하는 그래프이다.
도 9F 및 도 9G는 항-PD1-TGFRII 융합 단백질을 PBMC 및 두경부암(인두 암종) 세포주의 공-배양물에 첨가시 CD8+ T 세포상의 PD1 수용체 점유 및 IFN-γ 생산을 각각 도시하는 그래프이다.
도 9H 및 도 9I는 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 존재하에서 PBMC 및 대장암(결장직장 선암종) 세포 공-배양물의 상등액 중의 TGF-β1 및 TGF-β2 농도를 각각 묘사하는 그래프이다.
도 9J 및 도 9K는 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 존재하에서 PBMC 및 두경부암(인두 암종) 세포 공-배양물의 상등액 중의 TGF-β1 및 TGF-β2 농도를 각각 묘사하는 그래프이다.
도 9L 및 도 9M은 항-PD1 단독과 비교된, 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 존재하에서 대장암(결장직장 선암종) 세포 또는 두경부암(인두 암종) 세포 및 PBMC의 3D 회전타원체(spheroid) 배양물 중의 IFN-γ 생산을 각각 묘사하는 그래프이다.
도 10A-10D는 재조합 TGF-β1의 존재하에서 T 세포 증식 및 활성화에 대한 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 처리의 영향을 도시한다.
도 11A-11F는 재조합 TGF-β1의 존재하에서 및 항-PD1, 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 또는 대조용 항체의 존재하에서 PBMC에 의한 다양한 사이토카인의 발현을 도시한다.
도 12A는 대장암의 인간화된 마우스 모델에서 항-PD1 단독과 비교된, 종양 성장에 대한 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 영향을 도시한다.
도 12B는 대장암의 인간화된 마우스 모델에서 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 처리가 CD8+ T 세포 대 Treg 비를 현저하게 증가시킴을 도시한다.
도 12C는 결장직장암의 인간화된 마우스 모델에서 항-PD1 처리와 비교된, 퍼포린 발현 수준에 대한 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 처리의 영향을 도시한다.
도 12D 및 도 12E는 결장직장암의 인간화된 마우스 모델에서 항-PD1 처리와 비교된, 각각 TGF-β1 및 TGF-β2 농도에 대한 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 처리의 영향을 도시한다.
도 13A는 두경부암의 시험관내 모델에서 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 처리가 항-PD1 처리와 비교하여 IFNγ 생산을 현저하게 개선시켰음을 도시한다.
도 13B-13G는 다양한 경로 유전자의 발현 분석에 의해 입증된 바와 같이 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 처리가 T-세포 기능을 현저하게 증가시킴을 도시한다.
도 14A는 두경부암의 인간화된 마우스 모델에서 항-PD1 단독과 비교된, 종양 성장에 대한 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 영향을 도시한다.
도 14B는 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 대 항-PD1 단독 또는 아이소타입 대조군 처리시 두경부암의 인간화된 마우스 모델에서 종양 함유 마우스의 생존을 도시한다.
도 14C는 두경부암의 인간화된 마우스 모델에서 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 처리된 마우스의 종양 중 CD8+ T 세포 대 조절성 T 세포의 비를 도시한다.
도 14D 및 도 14E는 두경부암의 인간화된 마우스 모델에서 항-PD1 단독과 비교된, TGF-β1 및 TGF-β2 농도에 대한 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 영향을 도시한다.
도 14F는 두경부암의 인간화된 마우스 모델에서 IFN-γ 생산에 대한 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 영향을 도시한다.
도 15A-15B는 원발성 대장암 환자 샘플 중의 IFN-γ 생산 및 TGF-β1 농도에 대한 항-PD1(VH7/VL6)--TGFRII 융합 단백질의 영향을 도시한다.
도 15C는 항-DP1(VH7/VL6)--TGFRII 융합 단백질과 공-배양된 원발성 대장암 환자 샘플의 유전자 발현 분석을 도시한다.
도 16은 항-PD-L1--TGFRII 융합 단백질과 비교된, 항-PD1(VH7/VL6)-TGFRII 융합 단백질의 세포독성 분석 결과를 묘사하는 그래프를 도시한다.
도 17은 키메라 수용체 항원(CAR) T 세포와 병용된 항-PD1(VH7/VL6)-TGFRII 융합 단백질 대 CAR T 세포와 병용된 항-PD1 대 CAR T 세포 단독의 세포독성 분석 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 18A 및 도 18B는 각각 CD33 CAR-T와 병용된 항-PD1(VH6/VL5)-TGFRII 융합 단백질의 세포독성 분석 및 CD33 CAR-T와 병용된 항-PD1(VH7/VL6)-TGFRII 융합 단백질의 세포독성 분석의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 19A 및 도 19B는 NK 세포와 공-배양시 각각 항-PD1(VH6/VL5)-TGFRII 융합 단백질 및 항-PD1(VH7/VL6)-TGFRII 융합 단백질을 사용하는 종양 세포 용해를 묘사하는 그래프이다.
도 20은 상이한 링커를 사용하는 항-PD1(VH6/VL5)-TGFRII 융합 단백질에 의한 TGF-b1 및 PD1의 동시 결합의 Biacore 분석을 묘사하는 그래프이다.
도 21은 항-PD1 IgG4-ADA2에 의한 PD-1/PD-L1 상호작용의 차단을 도시하는 그래프이다.
도 22는 항-PD1 hIgG1-ADA2 및 항-PD1 hIgG4-ADA2에 대해 측정된 ADA2 효소 활성을 도시하는 그래프이다.
도 23A-23C는 PD-L1/PD-1 상호작용에 대한 항-PD1 및 항-PD1-ADA2 융합 단백질의 다양한 변이체의 영향을 도시하는 그래프이다.
도 24A-24F는 ADA 효소 활성에 의해 측정된 바와 같은 항PD1-ADA2 융합 단백질의 다양한 변이체의 효소 활성을 도시하는 그래프이다.
도 25는 ADA 효소 활성에 의해 측정된 바와 같은 항-PD1-mutADA2 대 항-PD1-wtADA2의 효소 활성을 도시하는 그래프이다.
도 26A-26D는 T 세포 증식에 대한 항-PD1-wtADA2의 변이체의 영향을 묘사하는 그래프이다.
도 26E는 항-PD1 또는 아이소타입 대조군과 비교된, 항-PD1-wtADA2에 의한 IFNγ 생산을 묘사하는 그래프이다.
도 27A-27B는 T 세포 증식의 아데노신-매개된 억제를 역전시키는 wtADA2 및 mutADA2의 유효성을 묘사하는 그래프이다.
도 28은 PD1-PDL1 상호작용의 차단에 대한 항-PD1-ADA2 융합 단백질의 변이체의 영향을 묘사하는 그래프이다.
도 29는 ADA 효소 활성에 의해 측정된 바와 같은 항-PD1-ADA2-scFv-Fc의 효소 활성을 도시하는 그래프이다.
도 30은 ADA 효소 활성에 의해 측정된 바와 같은 항-PD1-ADA2의 변이체의 효소 활성을 도시하는 막대 그래프이다.
도 31A-31B는 원발성 CRC 환자 종양에서 IFN-γ 생산 및 종양-침윤성 림프구(TIL)의 증식에 대한 항-PD1-wtADA2의 영향을 묘사하는 그래프이다.
도 32는 폐암의 인간화된 마우스 모델의 종양 부피에 대한 항-PD1 대 항-PD1-wtADA2의 영향을 묘사하는 그래프이다.
도 33A-33C는 항-PD1-아데노신 데아미나제 2(ADA2) 설계:항-PD1-ADA2의 도식적 설계를 도시한다.
하기의 설명 및 실시예는 본 개시내용의 구현예를 상세히 예시한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 특정 구현예로 제한되지 않으며 그 자체가 변할 수 있음은 물론이다. 당업자는 본 개시내용의 범위내에 포함된 본 개시내용의 변화 및 변형이 존재함을 알 것이다.
모든 용어는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 이해하기 위한 것이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술과학 용어는 개시내용이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용되는 섹션 제목은 구성을 목적으로만 사용되며 기재된 발명의 요지를 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
개시내용의 다양한 특징을 단일 구현예의 맥락에서 기재할 수 있지만, 특징을 또한 별도로 또는 임의의 적합한 조합으로 제공할 수도 있다. 환언하면, 본 개시내용을 명확성을 위해 별도의 구현예의 맥락으로 본원에 기재할 수 있지만, 본 개시내용을 또한 단일의 구현예로 실행할 수도 있다.
하기의 정의는 당해 분야의 정의를 보충하며 본 출원에 관한 것이고 임의의 관련되거나 관련되지 않은 사례가, 예를 들어 일반적으로 소유되는 특허 또는 출원에 있다고 생각해서는 안 된다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 균등한 임의의 방법 및 물질을 본 개시내용의 시험을 위해 실행에 사용할 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법을 본원에 기재한다. 따라서, 본원에 사용되는 용어는 단지 특정한 구현예를 기재하기 위한 것이며, 제한을 의도하지는 않는다.
정의
본원에서, 단수의 사용은 구체적으로 달리 서술되지 않는 한 복수를 포함한다. 명세서에 사용되는 바와 같이, "하나" 및 "상기"란 단수형은 문맥상 달리 명백히 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
본원에서, "또는"의 사용은 달리 서술되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 본원에 사용되는 바와 같은 "및/또는" 및 "그의 임의의 조합"이란 용어 및 그의 문법적 등가어는 호환 가능하게 사용될 수 있다. 이들 용어는 임의의 조합이 구체적으로 고려됨을 전달할 수 있다. 오직 예시를 목적으로, "A, B 및/또는 C" 또는 "A, B, C, 또는 이들의 임의의 조합"이란 어구는 "개별적인 A; 개별적인 B; 개별적인 C; A 및 B; B 및 C; A 및 C; 및 A, B 및 C"를 의미한다. "또는"이란 어구는 문맥상 분리적 사용을 지칭하지 않는 한 결합적으로 또는 분리적으로 사용될 수 있다.
더욱 또한, "포함하는"뿐만 아니라 다른 형태, 예를 들어 "포함하다" 및 "포함된"이란 용어의 사용은 제한적이지 않다.
본 명세서에서 "일부 구현예", "구현예", "하나의 구현예" 또는 "다른 구현예"에 대한 언급은 구현예와 관련하여 기재된 특정한 특징, 구조 또는 특성이 본 개시내용의 적어도 일부 구현예에 포함되지만, 반드시 모든 구현예에 포함되는 것은 아님을 의미한다.
본 명세서 및 청구항(들)에 사용되는 바와 같이, "포함하는"(및 "포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 형태), "갖는"(및 "갖다"와 같은 갖는의 임의의 형태), "내포하는"(및 "내포하다"와 같은 내포하는의 임의의 형태) 또는 "함유하는"(및 "함유하다"와 같은 함유하는의 임의의 형태)이란 단어는 포괄적이거나 오픈-엔드이며 추가의, 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의되는 임의의 구현예를 개시내용의 임의의 방법 또는 조성물에 관하여 실행하고, 이와 역으로 실행할 수 있음이 고려된다. 더욱 또한, 본 개시내용의 조성물을 사용하여 본 개시내용의 방법을 성취할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "약"이란 용어는 참조 수치 및 그의 문법적 등가어와 관련하여 상기 수치 자체 및 상기 수치의 + 또는 -10% 값의 범위를 포함할 수 있다.
"약" 또는 "대략적으로"란 용어는 당업자에 의해 측정된 바와 같은 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위이내임을 의미하며, 이는 부분적으로 상기 값을 어떻게 측정하거나 결정하는지에 따라, 즉 측정 시스템의 한계에 따라 변할 것이다. 예를 들어, "약"은 당해 분야에서의 실행당, 1 또는 1초과의 표준 편차 이내임을 의미할 수 있다. 한편으로, "약"은 주어진 값의 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하의 범위를 의미할 수 있다. 또 다른 예에서, "약 10"이란 양은 10 및 9 내지 11 중 임의의 양을 포함한다. 또 다른 예에서, "약"이란 용어는 참조 수치와 관련하여 또한 상기 값의 + 또는 -10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%의 범위의 값을 포함할 수 있다. 한편으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, "약"이란 용어는 하나의 값의 10배 이내, 바람직하게는 5배 이내, 및 보다 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정한 값을 본원 및 청구항에 기재하는 경우, 달리 서술되지 않는 한 특정 값의 허용 가능한 오차 범위 이내를 의미하는 "약"이란 용어가 가정될 것이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "폴리뉴클레오티드" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 임의의 길이의 뉴클레오티드 또는 핵산의 중합체 형태, 예를 들어 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. 상기 용어는 단지 분자의 1차 구조를 지칭할 뿐이다. 따라서, 상기 용어는 이중 및 단일 가닥 DNA, 삼중결합 DNA뿐만 아니라 이중 및 단일 가닥 RNA를 포함한다. 상기는 또한, 예를 들어 메틸화에 의해 및/또는 캡핑에 의해 변형된, 및 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 용어는 또한 뉴클레오티드 유사체뿐만 아니라 비-천연 또는 합성 뉴클레오티드를 포함하는 분자를 포함함을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "형질감염", "형질전환" 또는 "형질도입"은 물리적 또는 화학적 방법에 의한 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드의 숙주 세포내로의 도입을 지칭한다. 본원에 개시되거나 고려되는 폴리뉴클레오티드 서열 및 벡터를 예를 들어 형질감염, 형질전환 또는 형질도입에 의해 세포내에 도입시킬 수 있다. 다수의 형질감염 기법이 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 칼슘 포스페이트 DNA 공-침전(예를 들어 Murray E. J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991) 참조); DEAE-덱스트란; 일렉트로포레이션; 양이온성 리포솜-매개된 형질감염; 텅스텐 입자-촉진된 미세입자 충격(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 스트론튬 포스페이트 DNA 공-침전(Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))을 포함한다. 파지 또는 바이러스 벡터를 숙주 세포내에 도입시킬 수 있으며, 적합한 패키징 세포에서 감염성 입자의 성장 후에, 이 중 다수를 상업적으로 입수할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "폴리펩티드", "펩티드" 및 그의 문법적 등가어는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 폴리펩티드는 주어진 세포 환경에서 주어진 단백질에 전형적인 글리코실화 또는 다른 변형을 임의로 포함할 수 있다. 본원에 개시된 폴리펩티드 및 단백질(및 그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)은 하나 이상의 천연 아미노산 대신에 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 상기와 같은 합성 아미노산은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 아미노사이클로헥산 카복실산, 노르류신, α-아미노 n-데카노산, 호모세린, S-아세틸아미노메틸-시스테인, 트랜스-3- 및 트랜스-4-하이드록시프롤린, 4-아미노페닐알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-카복시페닐알라닌, β-페닐세린 β-하이드록시페닐알라닌, 페닐글리신, α-나프틸알라닌, 사이클로헥실알라닌, 사이클로헥실글리신, 인돌린-2-카복실산, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실산, 아미노말론산, 아미노말론산 모노아미드, N'-벤질-N'-메틸-리신, N',N'-디벤질-리신, 6-하이드록시리신, 오르니틴, α-아미노사이클로펜탄 카복실산, α-아미노사이클로헥산 카복실산, α-아미노사이클로헵탄 카복실산, α-(2-아미노-2-노르보난)-카복실산, α,γ-디아미노부티르산, α,β-디아미노프로피온산, 호모페닐알라닌, 및 α-3급-부틸글리신을 포함한다. 본 개시내용은 조작된 세포에서 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 단백질의 발현이 폴리펩티드 또는 단백질의 하나 이상의 아미노산의 번역-후 변형과 연관될 수 있음을 추가로 고려한다. 번역-후 변형의 비제한적인 예는 인산화, 아세틸화 및 포르밀화를 포함한 아실화, 글리코실화(N-연결된 및 O-연결된 포함), 아미드화, 하이드록실화, 메틸화 및 에틸화를 포함한 알킬화, 유비퀴틸화, 피롤리돈 카복실산의 부가, 디설파이드 가교의 형성, 황화, 미리스토일화, 팔미토일화, 이소프레닐화, 파르네실화, 제라닐화, 글리피에이션(glypiation), 리포일레이션(lipoylation) 및 요오드화를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "일치하는" 및 그의 문법적 등가어 또는 폴리펩티드의 2 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 상황에서 "서열 일치성"이란 용어는 명시된 비교창에 걸쳐 최대의 상응성으로 정렬시 동일한 2개 서열 중의 잔기를 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같은 "비교창"은 2개의 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 하나의 서열을 동일한 수의 인접한 위치의 참조 서열에 비교할 수 있는, 적어도 약 20, 대개는 약 50 내지 약 200, 보다 대개는 약 100 내지 약 150개의 인접한 위치의 분절을 지칭한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당해 분야에 주지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬을 문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해; 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)]의 정렬 알고리즘에 의해; 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A., 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법에 의해; 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행[비제한적으로 Intelligentics(Mountain View Calif.)에 의한 PC/Gene 프로그램의 CLUSTAL, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG)(575 Science Dr., Madison, Wis., U.S.A.)의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA 포함]에 의해 수행할 수 있으며; CLUSTAL 프로그램은 하기의 문헌에 충분히 기재되어 있다: Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244 (1988) 및 Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989); Corpet et al., Nucleic Acids Res., 16:10881-10890 (1988); Huang et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:155-165 (1992); 및 Pearson et al., Methods in Molecular Biology, 24:307-331 (1994). 정렬을 또한 종종 검사 및 수동 정렬에 의해 수행한다. 구현예의 한 부류에서, 본원의 폴리펩티드는 예를 들어 디폴트 매개변수를 사용하는 BLASTP(또는 CLUSTAL, 또는 임의의 다른 이용가능한 정렬 소프트웨어)에 의해 측정된 바와 같이, 참조 폴리펩티드 또는 그의 단편에 적어도 80%, 85%, 90%, 98% 99% 또는 100% 일치한다. 유사하게, 핵산을 또한 출발 핵산을 참조하여 기재할 수 있다, 예를 들어 상기는 디폴트 매개변수를 사용하는 BLASTN(또는 CLUSTAL, 또는 임의의 다른 이용가능한 정렬 소프트웨어)에 의해 측정된 바와 같이, 참조 핵산 또는 그의 단편에 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 98%, 99% 또는 100% 일치한다. 하나의 분자가 보다 큰 분자와 어떤 백분율의 서열 일치성을 갖는다고 할 때, 이는 상기 두 분자가 최적으로 정렬될 때, 보다 작은 분자 중의 잔기의 백분율이 상기 두 분자가 최적으로 정렬되는 순서에 따라 보다 큰 분자에서 합치 잔기를 발견함을 의미한다.
핵산 또는 아미노산 서열에 적용되는 바와 같은 "실질적으로 일치하는"이란 용어 및 그의 문법적 등가어는 핵산 또는 아미노산 서열이 표준 매개변수를 사용하여, 상술한 프로그램, 예를 들어 BLAST로 참조 서열과 비교시 적어도 90% 이상, 적어도 95%, 적어도 98%, 및 적어도 99%의 서열 일치성을 갖는 서열을 포함함을 의미한다. 예를 들어, BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 11의 단어 길이(W), 10의 기대값(E), M=5, N=-4, 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어 길이(W), 10의 기대값(E), 및 BLOSUM62 채점 행렬을 사용한다(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992) 참조). 서열 일치성의 백분율을 비교창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 측정하며, 여기에서 비교창 중의 폴리뉴클레오티드 서열 부분은 2개 서열의 최적의 정렬을 위해 참조 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않는다)에 비교시 부가 또는 결실(즉 끊김)을 포함할 수 있다. 백분율을, 2개 서열 모두에서 일치하는 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 존재하여 합치된 위치의 수를 생성시키는 위치의 수를 측정하고, 합치된 위치의 수를 비교창 중의 총 위치수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 일치성의 백분율을 생성시킴으로써 계산한다. 일부 구현예에서, 적어도 약 50 잔기 길이인 서열 영역에 걸쳐, 적어도 약 100 잔기의 영역에 걸쳐 상당한 일치성이 존재하며, 일부 구현에에서, 서열은 적어도 약 150 잔기에 걸쳐 실질적으로 일치한다. 일부 구현예에서, 서열은 암호화 영역의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 일치한다.
"상동성"은 일반적으로 2개 이상의 핵산 또는 단백질(또는 그의 서열)간의 서열 일치성으로부터 추론된다. 상동성 확립에 유용한 서열들간의 일치성의 정확한 백분율은 문제의 핵산 및 단백질에 따라 변하지만, 통상적으로 25% 정도로 낮은 서열 일치성이 상동성 확립에 사용된다. 보다 높은 수준의 서열 일치성, 예를 들어 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 이상을 또한 상동성 확립에 사용할 수 있다. 서열 일치성 퍼센트의 측정 방법(예를 들어 디폴트 매개변수를 사용하는 BLASTP 및 BLASTN)을 본원에 기재하며 일반적으로 이용할 수 있다. 핵산 및/또는 핵산 서열은 이들이 공통의 조상 핵산 또는 핵산 서열로부터 자연적으로 또는 인공적으로 유래될 때 "상동성"이다. 단백질 및/또는 단백질 서열은 이들의 암호화 DNA가 공통의 조상 핵산 또는 핵산 서열로부터 자연적으로 또는 인공적으로 유래될 때 "상동성"이다. 상동성 분자를 "상동체"라 칭할 수 있다. 예를 들어, 임의의 천연 단백질을 임의의 이용가능한 돌연변이유발 방법에 의해 변형시킬 수 있다. 발현시, 상기 돌연변이유발된 핵산은 원래 핵산에 의해 암호화된 단백질에 상동성인 폴리펩티드를 암호화한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "단리된"이란 용어 및 그의 문법적 등가어는 핵산의 그의 자연 환경으로부터의 제거를 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같은 "정제된"이란 용어 및 그의 문법적 등가어는 자연으로부터 제거되거나(게놈 DNA 및 mRNA 포함) 또는 실험실 조건하에서 합성(cDNA 포함) 및/또는 증폭되거나 간에, 순도가 증가된 분자 또는 조성물을 지칭하며, 여기에서 "순도"는 상대적인 용어이지, "절대 순도"가 아니다. 그러나, 핵산 및 단백질을 희석제 또는 항원보강제로 제형화할 수 있으며 더욱이 실용적인 목적을 위해 단리할 수 있음을 알아야 한다. 예를 들어, 핵산을 세포내로의 도입에 사용할 때 전형적으로는 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합한다. 본원에 사용되는 바와 같은 "실질적으로 정제된"이란 용어 및 그의 문법적 등가어는 핵산, 폴리펩티드, 단백질 또는 다른 화합물과 자연적으로 연관되는 폴리뉴클레오티드, 단백질, 폴리펩티드 및 다른 분자가 필수적으로 없는, 즉 약 50% 초과하여 없는, 약 70% 초과하여 없는, 약 90% 초과하여 없는 상기 핵산 서열, 폴리펩티드, 단백질 또는 다른 화합물을 지칭한다.
"발현 벡터" 또는 "벡터"는 부착된 분절의 복제 및/또는 발현을 일으키기 위해, 세포내에서 폴리뉴클레오티드 복제의 자율적인 단위로서 행동하거나(즉 자신의 통제하에서 복제가 가능하거나), 또는 숙주 세포 염색체내로의 삽입에 의해(또 다른 폴리뉴클레오티드 분절에의 부착에 의해) 복제가 가능해지는 임의의 유전학적 요소, 예를 들어 플라스미드, 염색체, 바이러스, 트랜스포손이다. 적합한 벡터는 비제한적으로 플라스미드, 트랜스포손, 박테리오파지 및 코스미드를 포함한다. 벡터는 상기 벡터의 목적하는 숙주 세포내로의 결찰 또는 삽입을 수행하고 부착된 분절의 발현을 수행하기 위해 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 상기와 같은 서열은 숙주 유기체에 따라 다르며; 상기 서열은 전사를 수행하기 위한 프로모터 서열, 전사를 증가시키기 위한 인헨서 서열, 리포솜 결합 부위 서열 및 전사 및 번역 종결 서열을 포함한다. 한편으로, 발현 벡터는 상기 벡터의 숙주 세포 DNA 서열내로의 결찰이나 통합없이 상기 중의 암호화된 핵산 서열 생성물을 직접 발현시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는, 숙주 세포에서 복제가 가능하고 적합한 선택압의 존재하에 숙주 세포내에서 DNA의 염색체외 분절로서 지속되는 "에피솜 발현 벡터" 또는 "에피솜"이다(예를 들어 Conese et al., Gene Therapy, 11:1735-1742 (2004) 참조). 전형적인 상업적으로 입수할 수 있는 에피솜 발현 벡터는 비제한적으로 엡스타인 바 핵 항원 1(EBNA1) 및 엡스타인 바 바이러스(EBV) 복제 기원(oriP)을 사용하는 에피솜 플라스미드를 포함한다. 벡터 pREP4, pCEP4, pREP7, 및 pcDNA3.1(Invitrogen(Carlsbad, Calif.)으로부터) 및 pBK-CMV(Stratagene(La Jolla, Calif.)으로부터)는 EBNA1 및 oriP 대신에 T-항원 및 SV40 복제 기원을 사용하는 에피솜 벡터의 비제한적인 예를 나타낸다.
본원에 사용되는 바와 같은 "선택성 마커 유전자"란 용어는 핵산 서열을 발현하는 세포가, 상응하는 선택제의 존재하에서 특이적으로 선택될 수 있게 하는 핵산 서열을 지칭한다. 적합한 선택성 마커 유전자는 당해 분야에 공지되어 있으며 예를 들어 하기의 문헌에 기재되어 있다: 국제 특허 출원 공보 WO 1992/08796 및 WO 1994/28143; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981); Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981); Santerre et al., Gene, 30: 147 (1984); Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987); Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977); Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962); Lowy et al., Cell, 22: 817 (1980); 및 미국특허 제 5,122,464 호 및 제 5,770,359 호.
본원에 사용되는 바와 같은 "암호화 서열"이란 용어는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 분절을 지칭한다. 영역 또는 서열은 5' 단부 부근에서 개시 코돈에 의해 및 3' 단부 부근에서 정지 코돈과 경계를 이룬다. 암호화 서열을 또한 개방 판독 프레임이라 칭할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "작동적으로 연결된"이란 용어는 분절들이 의도된 방식으로 기능하도록 하는 방식으로 DNA 분절이 또 다른 DNA 분절에 물리적 및/또는 기능적으로 연결됨을 지칭한다. 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열은 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인헨서 및/또는 사일런서에, DNA 서열의 전사 조절을 직접적으로 또는 간접적으로 허용하는 방식으로 연결될 때 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 예를 들어 DNA 서열은, 프로모터의 전사 개시 부위에 관하여 하류 프로모터에 전사 개시 부위에 대해 정확한 판독 프레임으로 결찰되고 DNA 서열을 통한 전사 연장의 진행이 허용될 때, 프로모터에 작동적으로 연결된다. 인헨서 또는 사일런서는 DNA 서열의 전사를 각각 증가시키거나 감소시키는 바와 같은 방식으로 DNA 서열에 결찰될 때 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된다. 인헨서 및 사일런서는 DNA 서열의 암호화 영역의 상류, 하류에 위치하거나 또는 내부에 포매될 수 있다. 신호 서열에 대한 DNA는 신호 서열이 폴리펩티드의 분비에 관여하는 프리-단백질로서 발현되는 경우 상기 폴리펩티드를 암호화하는 DNA에 작동적으로 연결된다. DNA 서열의 조절 서열에의 연결을 전형적으로는, 적합한 제한 부위에서의 결찰에 의해 또는 당업자에게 공지된 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 서열 중에 삽입된 어댑터 또는 링커를 통해 수행할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "유도하다", "유도"란 용어 및 그의 문법적 등가어는 일부 기초 수준의 전사에 비해, 전사 조절제에 의해 야기된 핵산 서열 전사, 프로모터 활성 및/또는 발현의 증가를 지칭한다.
"전사 조절제"란 용어는 몇몇 환경적 조건하에서 프로모터-구동된 DNA 서열의 전사를 방지 또는 억제하거나(예를 들어 리프레서 또는 핵 억제 단백질), 또는 몇몇 환경 조건하에서 프로모터-구동된 DNA 서열의 전사를 허용 또는 자극하는(예를 들어 유도인자 또는 인헨서) 작용을 하는 생화학적 요소를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "인헨서"란 용어는 예를 들어 작동적으로 연결된 핵산 서열의 전사를 증가시키는 DNA 서열을 지칭한다. 인헨서는 핵산 서열의 암호화 영역으로부터 수 킬로염기 떨어져 위치할 수 있으며 조절성 인자의 결합, DNA 메틸화의 패턴, 또는 DNA 구조의 변화를 매개할 수 있다. 다양한 상이한 공급원으로부터의 다수의 인헨서가 당해 분야에 주지되어 있으며 클로닝된 폴리뉴클레오티드로서 또는 상기내에서 입수할 수 있다(예를 들어 ATCC와 같은 기탁소뿐만 아니라 다른 상업적인 또는 개인적인 공급원으로부터). 프로모터(예를 들어 통상적으로 사용되는 CMV 프로모터)를 포함하는 다수의 폴리뉴클레오티드는 또한 인헨서 서열을 포함한다. 인헨서는 암호화 서열의 상류, 내부 또는 하류에 위치할 수 있다. "Ig 인헨서"란 용어는 면역글로불린(Ig) 유전자좌내에 맵핑된 인헨서 영역으로부터 유래된 인헨서 요소를 지칭한다(상기와 같은 인헨서는 예를 들어 중쇄(뮤) 5' 인헨서, 경쇄(카파) 5' 인헨서, 카파 및 뮤 인트론 인헨서, 및 3' 인헨서를 포함한다(일반적으로 Paul W. E. (ed), Fundamental Immunology, 3rd Edition, Raven Press, New York (1993), pages 353-363; 및 미국특허 제 5,885,827 호 참조).
"프로모터"란 용어는 암호화 서열의 전사를 개시시키는 폴리뉴클레오티드의 영역을 지칭한다. 프로모터는 DNA상의 동일한 가닥 및 상류에(센스 가닥의 5' 영역에 대해), 유전자의 전사 개시 부위 부근에 위치한다. 일부 프로모터는 세포내 모든 환경에서 활성이므로 구성적인 반면, 다른 것은 특정 자극에 반응하여 활성으로 되도록 조절된다, 예를 들어 유도성 프로모터. 본원에 사용되는 바와 같은 "프로모터 활성" 및 그의 문법적 등가어는, 활성을 측정하고자 하는 프로모터에 작동적으로 연결되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 지칭한다. 프로모터 활성을, 예를 들어 노던 블럿 분석에 의해 생성되는 RNA 전사물의 양을 측정함으로써 직접적으로, 또는 연결된 핵산 서열, 예를 들어 프로모터에 연결된 리포터 핵산 서열에 의해 암호화된 생성물의 양을 측정함으로써 간접적으로 측정할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "유도성 프로모터"는 전사 조절제, 예를 들어 생물 또는 무생물 인자의 존재 또는 부재에 의해 활성으로 유도되는 프로모터를 지칭한다. 유도성 프로모터는 상기에 작동적으로 연결된 유전자의 발현이 유기체 또는 특정 조직의 어떤 발생 단계를 켜거나 끌 수 있기 때문에 유용하다. 유도성 프로모터의 비제한적인 예는 알콜-조절된 프로모터, 테트라사이클린-조절된 프로모터, 스테로이드-조절된 프로모터, 금속-조절된 프로모터, 병인-조절된 프로모터, 온도-조절된 프로모터 및 빛-조절된 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터는 유전자 스위치 또는 유전학적 스위치의 부분일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "T 세포" 또는 "T 림프구"는 세포-매개된 면역성에 중요한 역할을 하는 림프구의 한 유형이다. 상기는 세포 표면상의 T-세포 수용체(TCR)의 존재에 의해 다른 림프구, 예를 들어 B 세포 및 자연살해 세포(NK 세포)와 구분될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "항체"(또한 면역글로불린(Ig)으로서 공지됨)란 용어는 단클론 또는 다클론 항체일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 "단클론 항체"란 용어는 B-세포의 단일 클론에 의해 생성되고 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 대조적으로, "다클론 항체"는 상이한 B-세포에 의해 생성되고 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 항체의 집단을 지칭한다. 항체는 임의의 동물 기원의 것일 수 있다. 항체는 IgG(IgGl, IgG2, IgG3, 및 IgG4 포함), IgA(IgAl 및 IgA2 포함), IgD, IgE, 또는 IgM, 및 IgY일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 단쇄 완전 항체를 포함한 완전 항체일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 항체의 단편일 수 있으며, 이는 비제한적으로 Fab, Fab', F(ab')2, Fd(VH 및 CH1로 이루어짐), Fv 단편(VH 및 VL로 이루어짐), 단쇄 가변 단편(scFv), 단쇄 항체, 디설파이드-연결된 가변 단편(dsFv), 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함할 수 있다. 완전 항체는 전형적으로 4개의 폴리펩티드: 중(H)쇄 폴리펩티드의 2개의 동일한 사본 및 경(L)쇄 폴리펩티드의 2개의 동일한 사본으로 이루어진다. 각각의 중쇄는 하나의 N-말단 가변(VH) 영역 및 3개의 C-말단 불변(CH1, CH2 및 CH3) 영역을 함유하며, 각각의 경쇄는 하나의 N-말단 가변(VL) 영역 및 하나의 C-말단 불변(CL) 영역을 함유한다. 경쇄 및 중쇄 각 쌍의 가변 영역은 항체의 항원 결합 부위를 형성한다. VH 및 VL 영역은 유사한 일반적인 구조를 가지며, 이때 각각의 영역은 4개의 프레임워크 영역을 포함하고, 이들의 서열은 비교적 보존된다. 프레임워크 영역은 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된다. 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 공지됨)은 항체의 "고가변 영역"을 형성하며, 이는 항원 결합을 담당한다. 이들 특정 영역은 하기의 문헌에 기재되었으며: Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) 및 Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991), Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), 및 MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)(이들은 모두 내용 전체가 본원에 참고로 인용된다), 여기에서 정의는 서로에 대해 비교될 때 아미노산 잔기의 중복 또는 부분집합을 포함한다. 바람직하게, "CDR"이란 용어는 서열 비교에 기초하여, Kabat에 의해 정의된 바와 같은 CDR이다. CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 중쇄 CDR을 나타내고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 경쇄 CDR을 나타낸다.
"항체의 단편", "항체 단편", "항체의 단편", "항원-결합 부분"이란 용어 또는 그의 문법적 등가어는 본원에서 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 부분을 의미하는데 호환 가능하게 사용된다(일반적으로 Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9):1126-1129 (2005) 참조). 항체 단편은 바람직하게는, 예를 들어 하나 이상의 CDR, 가변 영역(또는 그의 부분), 불변 영역(또는 그의 부분), 또는 이들의 조합을 포함한다. 항체 단편의 비제한적인 예는 (1) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편인 Fab 단편; (2) 줄기 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결되는 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (3) 항체의 단일 가지의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; (4) 2개의 도메인을 단일 폴리펩티드 쇄로서 합성될 수 있게 하는 링커에 의해 결합된 Fv 단편의 2개 도메인(즉 VL 및 VH)으로 이루어지는 1가 분자인 단쇄 Fv(scFv)(예를 들어 Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); 및 Osbourn et al., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998) 참조); 및 (5) 폴리펩티드 쇄의 이량체인 디아바디(여기에서 각각의 폴리펩티드 쇄는, 동일한 폴리펩티드 쇄상의 VH 및 VL간의 짝짓기를 허용하기에 너무 짧고, 이에 의해 2개의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 이량체성 분자를 생성시키도록 상이한 VH-VL 폴리펩티드 쇄상의 상보성 도메인간의 짝짓기를 구동하는 펩티드 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다)를 포함한다. 항체 단편은 당해 분야에 공지되어 있으며 예를 들어 미국특허 제 8,603,950 호에 보다 상세히 기재된다.
"항원 인식 부분", "항원 인식 도메인", "항원 결합 도메인", 또는 "항원 결합 영역"은 항원에 특이적으로 결합하는 분자 또는 분자의 부분을 지칭한다. 하나의 구현예에서, 항원 인식 부분은 항체, 항체 유사 분자 또는 그의 단편이다.
"보존적 아미노산 치환" 또는 "보존적 돌연변이"란 용어는 공통의 성질을 갖는 또 다른 아미노산에 의한 하나의 아미노산의 교체를 지칭한다. 개별적인 아미노산간의 공통의 성질을 한정하는 기능적인 방식은, 상동성 유기체의 상응하는 단백질간의 아미노산 변화의 정규화된 빈도를 분석하는 것이다(Schulz, G. E. and Schirmer, R. H., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)). 상기와 같은 분석에 따라, 그룹 내 아미노산이 서로와 우선적으로 교환되고 따라서 전체 단백질 구조에 대한 영향이 서로 가장 닮은 경우 아미노산의 그룹을 한정할 수 있다(상기 Schulz, G. E. and Schirmer, R. H.). 보존적 돌연변이의 예는 상기 하위그룹내 아미노산의 아미노산 치환, 예를 들어 양전하를 유지할 수 있도록 아르기닌 대신에 리신 및 이와 역; 음전하를 유지할 수 있도록 아스파트산 대신에 글루탐산 및 이와 역; 유리 -OH가 유지될 수 있도록 쓰레오닌 대신에 세린; 및 유리 -NH2가 유지될 수 있도록 아스파라진 대신에 글루탐산을 포함한다. 한편으로 또는 추가로, 기능성 변이체는 적어도 하나의 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 참조 단백질의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
"비-보존적 돌연변이"란 용어는 상이한 그룹간의 아미노산 치환, 예를 들어 트립토판 대신에 리신, 또는 세린 대신에 페닐알라닌 등을 포함한다. 이 경우에, 비-보존적 아미노산 치환은 기능성 변이체를 방해하지 않거나 또는 상기 변이체의 생물 활성을 억제하지 않는 것이 바람직하다. 비-보존적 아미노산 치환은 기능성 변이체의 생물 활성을 향상시킬 수 있으며, 따라서 기능성 변이체의 생물 활성이 상동성 모 단백질에 비해 증가된다.
본원에서 지칭되는 바와 같은 "증식성 질병"이란 용어는 과도한 세포의 증식 및/또는 세포 기질의 턴오버가 암을 포함한 질병의 병인에 중대하게 기여하는 통합적인 개념을 지칭한다. 일부 구현예에서, 증식성 질병은 암이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "환자(patient)" 또는 "대상체(subject)"는 암과 같은 증식성 질환을 갖거나 또는 상기 질환이 발생할 것으로 진단되거나 의심되는 포유동물 대상체를 지칭한다. 일부 구현예에서, "환자"란 용어는 암과 같은 증식성 질환이 발생할 평균적인 가능성보다 더 높은 가능성을 갖는 포유동물 대상체를 지칭한다. 예시적인 환자는 본원에 개시된 치료법이 이득이 될 수 있는 인간, 유인원, 개, 돼지, 소, 고양이, 말, 염소, 양, 설치류 및 다른 포유동물일 수 있다. 예시적인 인간 환자는 남성 및/또는 여성일 수 있다. "필요한 환자" 또는 "필요한 대상체"는 본원에서 질병 또는 질환, 예를 들어 비제한적으로 암을 갖는 것으로 진단되거나 또는 의심되는 환자로서 지칭된다.
본원에서 "투여"는 환자 또는 대상체에게 본원에 기재된 하나 이상의 조성물을 제공하는 것으로서 지칭된다. 예로서, 비제한적으로, 조성물 투여, 예를 들어 주사는 정맥내(i.v.) 주사, 피하(s.c.) 주사, 피내(i.d.) 주사, 복강내(i.p.) 주사, 또는 근육내(i.m.) 주사에 의해 수행될 수 있다. 하나 이상의 상기와 같은 경로를 사용할 수 있다. 비경구 투여는 예를 들어 일시주사 또는 시간에 걸친 점진적인 투여에 의할 수 있다. 한편으로, 또는 동반하여, 투여를 경구 경로에 의할 수 있다. 추가로, 투여를 또한 일시 주사 또는 세포 펠릿의 수술적 침착, 또는 의료 기구의 배치에 의할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 개시내용의 조성물은 본원에 기재된 핵산 서열을 발현하는 조작된 세포 또는 숙주 세포, 또는 본원에 기재된 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터를, 증식성 질환의 치료 또는 예방에 유효한 양으로 포함할 수 있다. 약학 조성물은 본원에 기재된 표적 세포 집단을 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함할 수 있다. 상기와 같은 조성물은 완충제, 예를 들어 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 등; 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 슈크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들어 글리신; 산화방지제; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA 또는 글루타치온; 항원보강제(예를 들어 수산화 나트륨); 및 보존제를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료", "치료하는"이란 용어, 또는 그의 문법적 등가어는 목적하는 약물학적 및/또는 생리학적 효과를 획득함을 지칭한다. 구현예에서, 효과는 치료학적이다, 즉 효과는 질병 및/또는 질병에 기인하는 불리한 증상을 부분적으로 또는 완전히 치유한다. 일부 구현예에서, "치료"란 용어는 질병 또는 상태의 "예방"을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료 구간"은 치료 주기, 예를 들어 정규 스케줄로 반복될 수 있는 치료제의 투여 과정을 지칭한다. 구현예에서, 투여량 섭생은 치료 구간 사이에 치료제의 하나 이상의 비투여 기간을 가질 수 있다. 예를 들어, 치료 구간은 제2 치료제, 예를 들어 CAR-T 세포의 투여와 함께(투여 전에, 동시에 또는 후에) 투여되는 융합 단백질의 하나의 용량을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "함께 투여된" 또는 "공-투여" 또는 "공-투여하는"이란 용어는 2개(또는 그 이상)의 상이한 치료를 대상체가 질환에 걸려 있는 동안 상기 대상체에게 전달함, 예를 들어 2개 이상의 치료를, 대상체가 질환으로 진단된 후 및 질환이 치유되거나 제거되기 전 또는 치료가 다른 이유로 인해 중단되기 전에 전달함을 의미한다. 일부 구현예에서, 하나의 치료의 전달이 두 번째 전달이 시작될 때 여전히 발생 중이며, 따라서 투여 기간이 겹친다. 이를 때때로 본원에서 "동시" 또는 "동반 전달"이라 칭한다. 다른 구현예에서, 하나의 치료의 전달이 다른 치료 전달의 시작 전에 끝난다. 어느 한 경우의 일부 구현에에서, 상기 치료는 병행 투여이므로 보다 유효하다. 예를 들어, 두 번째 치료가 더 유효하다, 예를 들어 더 적은 두 번째 치료로 균등한 효과가 관찰되거나, 또는 두 번째 치료가 첫 번째 치료의 부재하에서 투여되는 경우에 관찰되는 것보다 더 큰 정도로 증상을 감소시키거나, 또는 유사한 상황이 첫 번째 치료에 의해서 관찰된다. 일부 구현예에서, 전달은 증상, 또는 질환에 관련된 다른 매개변수의 감소가 다른 것의 부재하에서 전달된 하나의 치료에 의해 관찰되는 것보다 더 크도록 한다. 두 치료의 효과는 부분적으로 부가적이거나, 전적으로 부가적이거나, 또는 부가적인 것보다 더 클 수 있다. 전달은 전달된 첫 번째 치료의 효과가 두 번째가 전달되는 경우에도 여전히 검출되도록 할 수 있다.
일부 구현예에서, 첫 번째 치료 및 두 번째 치료를 동일하거나 별도의 조성물 중에서 동시적으로(예를 들어 동시에), 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 순차적인 투여는 하나의 치료가 추가적인, 예를 들어 두 번째 치료의 투여 전(예를 들어 직전, 5, 10, 15, 30, 45, 60분 미만; 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 48, 72, 96시간 이상; 4, 5, 6, 7, 8, 9일 이상; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 이상 전)의 투여임을 지칭한다. 첫 번째 및 두 번째 치료의 투여 순서는 또한 역전될 수 있다.
"치료학적 유효량", "치료량", "면역학적 유효량", "항-종양 유효량", "종양-억제 유효량"이란 용어 또는 그의 문법적 등가어는, 필요한 투여량에서 및 필요한 기간 동안, 목적하는 치료학적 결과를 성취하기에 유효한 양을 지칭한다. 치료 유효량은 인자, 예를 들어 개인의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 하나 이상의 대상체에서 목적하는 반응을 이끌어내는 본원에 기재된 조성물의 능력에 따라 변할 수 있다. 투여되는 본 개시내용의 조성물의 정확한 양을, 환자(대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 상태의 개별적인 차이를 고려하여 의사가 결정할 수 있다.
한편으로, 환자 또는 대상체에 대한 본원에 기재된 하나 이상의 조성물의 약물학적 및/또는 생리학적 효과는 "예방학적"일 수 있다, 즉 상기 효과는 질병 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다. "예방학적 유효량"은, 필요한 투여량에서 및 필요한 기간 동안, 목적하는 예방학적 결과(예를 들어 질병 개시의 예방)를 성취하기에 유효한 양을 지칭한다.
예정세포사 단백질 및 다른 관문 억제제
예정세포사 단백질 1(또한 PD-1 또는 CD279(분화 클러스터 279)로서 공지된다)은 면역관문 단백질이다. PD-1/PD-L1 신호전달 축은 종양 매개된 면역 회피를 촉진할 수 있다. 일부의 경우에, PDL-1은 종양 미세환경에서 종양 세포, 보조세포, 예를 들어 골수-유래된 억제세포(MDSC), 종양 관련된 대식세포(TAM), 항원 제시세포(APC)에 의해 과-발현될 수 있다. 일부의 경우에, PD-1은 "고갈된" T 세포에 의해 상향조절될 수 있으며 그의 리간드(PDL-1, PDL2 및 CD80)에 결합시 효과기 T 세포 기능을 억제하도록 신호전달할 수 있다. 항-PD-1 또는 항-PD-L1에 의한 PD-1/PD-L1 경로의 차단은 고갈된 T 세포의 기능을 복원시키고 종양 세포 사멸을 촉진할 수 있다(도 1).
일부 구현예에서, PD-1 억제제 및 TGF-β 트랩을 포함하는 융합 단백질은 비제한적으로 완전길이 니볼루맙(항-PD-1), MK-3945(항-PD-1), 펨브롤리주맙(항-PD-1), 피딜리주맙(항-PD-1), REGN2810(항-PD-1), AMP-224(항-PD-1), MEDI0680(항-PD-1), PDR001(항-PD-1), CT-001(항-PD-1), 또는 그의 기능성 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PD-1 억제제는 니볼루맙이다. 일부 구현예에서, PD-1 억제제는 펨브롤리주맙이다.
융합 단백질
일부 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 그의 변이체는 링커를 통해 사이토카인 트랩에 융합된 PD-1 억제제 또는 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, PD-1 억제제는 PD-1을 표적화하는 항체 또는 항체의 단편 또는 항체의 변이체일 수 있다. 일부 구현예에서, 프렘브롤리주맙을 포함하는 융합 단백질을 사이토카인 트랩(예를 들어 TGF-β 트랩)에 융합시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 니볼루맙을 포함하는 융합 단백질을 사이토카인 트랩(예를 들어 TGF-β 트랩)에 융합시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 그의 변이체는 상술한 바와 같은 사이토카인 트랩 및 면역관문 유전자를 표적화하는 항체, 항체의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역관문을 표적화하는 항체 또는 항체의 단편 또는 항체의 변이체, 예를 들어 세포독성 T 림프구 관련 단백질-4(CTLA-4) 및 예정세포사-리간드-1(PDL1)을 링커를 통해 TGF-β 트랩에 융합시킬 수 있다. 일부 구현예에서, PD-L1 억제제는 아테졸리주맙이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 그의 변이체는 본원에 기재된 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)에 융합된 PD1 억제제 또는 항체 또는 그의 기능성 변이체 또는 유도체를 포함한다.
사이토카인 트랩
사이토카인은 다수의 생물학적 과정에 영향을 미친다. 사이토카인의 억제는 예를 들어 암에서 임상적 이득을 가질 수 있다. 다수의 사이토카인이 다양한 질병에서 원인 인자임이 입증되었다. 상기와 같은 사이토카인은 비제한적으로 IL-1, IL-4, Il-6, TNF-α, TGF-베타 및 그의 다양한 동형을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같은 "사이토카인 트랩"이란 용어는 사이토카인 작용의 차단제 또는 중화제를 지칭한다. 상기와 같은 사이토카인 트랩의 예는 비제한적으로 사이토카인 수용체의 세포외 도메인, 사이토카인에 결합하는 항체, 및 사이토카인에 결합하는 펩티드(예를 들어 억제성 펩티드)를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 사이토카인은 TGF-β이다. 하나의 구현예에서, 사이토카인은 TGF-β1이다. 하나의 구현예에서, 사이토카인은 TGF-β3이다. 하나의 구현예에서, 사이토카인은 TGF-β1 및 TGF-β3이다. 추가의 구현예에서, TGF-β를 표적화하는 사이토카인 트랩(예를 들어 TGF-β 트랩)은 TGF-βRII 또는 그의 변이체(예를 들어 서열번호 141 및 142)의 세포외 도메인, 항-TGF-β 항체 및 TGF-β1, TGF-β2 및/또는 TGF-β3의 억제성 펩티드를 포함할 수 있다.
형질전환 성장인자
형질전환 성장 인자-β(TGF-β)는 다수의 세포 유형에서 증식, 분화, 및 다른 기능을 조절할 수 있는 펩티드의 다기능성 세트이다. TGF-β는 또한 형질전환의 유도에서 TGF-α와 상승작용적으로 작용할 수 있다. 상기는 또한 음의 자가분비 성장 인자로서 작용할 수 있다. TGF-β 활성화 및 신호전달의 조절이상은 세포사멸을 생성시킬 수 있다. 다수의 세포가 TGF-β를 합성할 수 있으며 이들 중 거의 모두 상기 펩티드에 대한 특이적인 수용체를 갖는다. TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3는 모두 동일한 수용체 신호전달 시스템을 통해 기능할 수 있다. TGF-β1은 면역계의 조절에 중요한 역할을 할 수 있으며 상이한 유형의 세포, 또는 상이한 발생 단계의 세포상에서 상이한 활성을 나타낼 수 있다. 대부분의 면역 세포(또는 백혈구)가 TGF-β1을 분비할 수 있다. TGF-β1은 전구체 단백질의 C-말단으로부터 단백질분해적 절단에 의해 유도된 112개 아미노산 잔기의 펩티드이다. 작은 분비된 폴리펩티드인 TGF-β는, I형 이량체성 수용체(TGFβR1)를 모집하고 인산화할 수 있는 II형 세린/쓰레오닌 키나제 이량체성 수용체(TGFβRII)를 통해 신호를 전달할 수 있다. TGFβRI은, 세포 증식, 분화, 세포사멸 및 성장에 관련된 전사 인자 조절 유전자일 수 있는 SMAD를 인산화하고 활성화할 수 있다. 다수의 진행된 단계의 암은 공격적인 종양 형성을 촉진하는 TGF-β 및 TGFβR을 모두 과발현하는 것으로 공지되어 있다. TGFB 신호전달 경로의 억제는 암 치료에 핵심적인 치료 전략일 수 있다.
일부 T 세포(예를 들어 조절성 T 세포)는 TGF-β1을 방출하여 다른 T 세포의 작용을 억제할 수 있다. 활성화된 T 세포의 IL-1 및 IL-2 의존성 증식, 및 정지성 헬퍼 T 세포 및 세포독성 T 세포의 활성화는 TGF-β1의 활성에 의해 방지될 수 있다. 유사하게, TGF-β1은 다수의 다른 사이토카인, 예를 들어 비제한적으로 인터페론-γ, 종양 괴사인자 알파(TNF-α) 및 다양한 인터류킨의 분비 및 활성을 억제할 수 있다. 상기는 또한 사이토카인 수용체, 예를 들어 IL-2 수용체의 발현 수준을 감소시켜 면역세포의 활성을 하향조절할 수 있다. 그러나, TGF-β1은 또한 T 세포에서 몇몇 사이토카인의 발현을 증가시킬 수 있으며 특히 세포가 미성숙한 경우 그의 증식을 촉진할 수 있다(도 2).
TGF-β1은 세포의 분화 상태에 따라 변하는 B 세포에 대해 유사한 영향을 미칠 수 있다. 상기는 증식을 억제할 수 있으며 B 세포의 세포사멸을 자극할 수 있고, 미성숙 및 성숙 B 세포상에서 항체, 트랜스페린, 및 MHC 부류 II 단백질의 발현을 조절하는데 한 역할을 할 수 있다.
대식세포 및 단핵세포에 대한 TGF-β1의 영향은 우세하게는 억제성일 수 있으며; 상기 사이토카인은 상기 세포의 증식을 억제할 수 있고 그의 반응성 산소(예를 들어 초산화물(O2 -)) 및 질소(예를 들어 산화 질소(NO)) 중간체의 생성을 방지할 수 있다. 그러나, 다른 세포 유형의 경우와 같이, TGF-β1은 또한 골수 기원의 세포에 대해 반대 효과를 가질 수도 있다. 예를 들어 TGF-β1은 화학유인물질로서 작용하여, 면역 반응이 일부 병원체를 향하게 할 수 있으며; 대식세포 및 단핵세포는 화학주성 방식으로 낮은 수준의 TGF-β1에 응답할 수 있다. 더욱 또한, 단핵세포성 사이토카인(IL-1α, IL-1β 및 TNF-α 포함)의 발현, 및 대식세포에 의한 식세포성 사멸이 TGF-β1의 작용에 의해 증가될 수 있다(도 2).
사이토카인 패밀리의 부분집합인 형질전환 성장인자-베타 III(TGF-β3)는 세포 증식, 배발생, 면역계 조절, 및 분화를 포함한 과다한 기능에 원인일 수 있다.
형질전환 성장인자-β 수용체 II(TGFβRII)
TGF-β 수용체(TGFβR)는 단일 통과 세린/쓰레오닌 키나제 수용체이다. 상기는 동종이량체성 또는 이종이량체성일 수 있는 다수의 상이한 동형으로 존재할 수 있다. TGF-β 상과에서 특성화된 리간드의 수는 공지된 수용체의 수를 훨씬 초과할 수 있으며, 이는 리간드와 수용체 상호작용이 뒤범벅임을 암시한다. TGF-β에 특이적인 3개의 TGF-β 상과 수용체(TGFβR)는 그들의 구조적 및 기능적 성질에 의해 구분될 수 있다. TGFβR1(ALK5) 및 TGFβRII는 유사한 리간드-결합 친화성을 가질 수 있으며 단지 펩티드 맵핑에 의해서만 서로 구분될 수 있다. TGFβR1 및 TGFβRII는 TGF-β1에 대해 높은 친화성 및 TGF-β2에 대해 낮은 친화성을 가질 수 있다. TGFβRIII(β-글리칸)는 동종이량체성 TGF-β1 및 TGF-β2 모두 및 또한 이종이량체 TGF-β1,2에 대해 높은 친화성을 가질 수 있다. TGFβ 수용체는 또한 TGF-β3에 결합할 수 있다. "TGFβRII" 또는 "TGFβ 수용체 II"는 야생형 인간 TGFβ 수용체 2형 동형 A 서열(예를 들어 NCBI 참조서열(RefSeq) 수납 번호 NP_001020018(서열번호 289)의 아미노산 서열)을 갖는 폴리펩티드, 또는 야생형 인간 TGFβ 수용체 2형 동형 B 서열(예를 들어 NCBI RefSeq 수납 번호 NP_003233(서열번호 290)의 아미노산 서열)을 갖거나 또는 서열번호 289 또는 서열번호 290의 아미노산 서열에 실질적으로 일치하는 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. TGFβRII는 야생형 서열의 TGFβ-결합 활성의 적어도 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 25%, 35%, 50%, 75%, 90%, 95%, 또는 99%를 유지할 수 있다. 발현된 TGFβRII의 폴리펩티드는 신호 서열이 없다.
TGF-β1은 성상세포 및 수지상세포에서 MHC II의 효능을 감소시킬 수 있으며, 이는 차례로 적합한 헬퍼 T 세포 집단의 활성화를 감소시킬 수 있다. TGF-β1은 암 진행에 따라 종양 성장을 촉진할 수 있으며, 일부 구현예에서 염증 세포 반응을 억제하지 않고 조절성 T 세포 기능을 촉진할 수 있다. TGF-β1은 종양 세포, 종양-관련된 섬유아세포, 조절성 T 세포 및 미성숙 골수 세포에 의해 생산될 수 있다. TGF-β1은 T 세포 프라이밍을 억제하고 고갈된 표현형을 촉진할 수 있다. TGF-β1은 자연살해 세포, 대식세포 및 수지상세포를 포함한 고유한 면역세포 집단의 항-종양 활성을 억제할 수 있다. TGF-β 수용체 II는 종양-관련된 골수 세포에 의해 상향조절될 수 있으며 전이를 촉진할 수 있다.
TGF-β 트랩 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체
본원은 면역관문 억제제, 예를 들어 PD-1 억제제 또는 항체, 및 사이토카인(예를 들어 TGF-β)을 중화시킬 수 있는 사이토카인 트랩을 포함하는 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 제공한다. 몇몇 경우에, 사이토카인 트랩은 서열번호 142를 포함하는 TGF-β 트랩(또한 TGF-βRII 또는 그의 단편 또는 변이체라 지칭된다)일 수 있다. TGF-β 트랩의 예는 비제한적으로 수용체(예를 들어 TGFβRII) 또는 그의 기능성 변이체 또는 유도체의 세포외 도메인(ECD), TGF-β 억제성 펩티드(예를 들어 서열번호 193-227), 또는 항-TGF-β 항체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항-TGF-β 항체는 서열번호 166, 168, 169, 171, 173, 175, 또는 177 중 어느 하나로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-TGF-β 항체는 서열번호 165, 167, 170, 172, 174, 176, 또는 178 중 어느 하나로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 몇몇 구현예에서, TGF-β 트랩은 TGF-β1 또는 TGF-β2 또는 TGF-β3에 특이적으로 결합하거나 또는 이들에 대해 높은 친화성을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, TGF-β 트랩은 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3에 특이적으로 결합하거나 또는 이들에 대해 높은 친화성을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, TGF-β 트랩은 TGF-β1 및 TGF-β3에 특이적으로 결합하거나 또는 이들에 대해 높은 친화성을 가질 수 있다. 추가의 구현예에서, TGF-β 트랩은 TGF-β2에 대해 낮은 친화성을 갖거나 결합하지 않을 수 있다.
본원에 제공된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체(예를 들어 사이토카인 트랩, 예를 들어 TGF-β 트랩에 융합된 PD-1 억제제 또는 항체)는 예를 들어 종양 세포상의 PD-L1과 면역세포상의 PD-1간의 상호작용의 동시 차단, 및 예를 들어 종양 미세환경내 TGF-β의 중화로 인해 상승작용적 항-종양 효과를 이끌어낼 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 효과는 단일 분자 개체에 의한 2개의 주요 면역 회피 기전 및 종양 미세환경내 TGF-β의 표적화된 고갈의 동시 차단으로부터 획득된다. 상기 고갈은 하기 중 하나 이상에 의해 성취될 수 있다: (1) 종양 세포의 항-PD-1 표적화; (2) TGF-β 트랩(예를 들어 TGFbRII)에 의한 종양 미세환경내 TGF-β의 결합; 및/또는 (3) PD-L1 수용체 매개된 내포작용을 통한 결합된 TGF-β의 파괴. 본원에 제공된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체(예를 들어 사이토카인 트랩, 예를 들어 TGF-β 트랩에 융합된 PD-1 억제제 또는 항체)는 또한 종양 세포의 자연살해 세포-매개된 사멸을 촉진할 수 있다.
(i) TGFβRII 트랩 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체.
일부 구현예에서, 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체는 또한 사이토카인 트랩 및 PD-1 억제제 또는 항-PD-1 항체 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 구현예는 임의로 절단성 또는 비-절단성 링커를 통해 PD-1 억제제에 융합된 사이토카인 트랩(예를 들어 TGF-β 트랩)을 포함하는 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인 트랩(예를 들어 TGF-β 트랩)은 사이토카인 수용체(예를 들어 TGFβRII)이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 중 사이토카인 수용체 서열은 수용체(예를 들어 TGFβRII) 또는 그의 기능성 변이체 또는 유도체의 세포외 도메인(ECD)을 포함한다. 일부 구현예에서, TGFβRII의 세포외 도메인(ECD)은 서열번호 14에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체 중의 사이토카인 수용체 서열은 서열번호 14의 폴리펩티드 서열과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 중 사이토카인 수용체 서열은 수용체(예를 들어 TGFβRII) 또는 그의 기능성 변이체 또는 유도체의 세포외 도메인(ECD)을 포함한다. 일부 구현예에서, TGFβRII의 세포외 도메인(ECD)은 서열번호 141에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체 중의 사이토카인 수용체 서열은 서열번호 141의 폴리펩티드 서열과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 중 사이토카인 수용체 서열은 수용체(예를 들어 TGFβRII) 또는 그의 기능성 변이체 또는 유도체의 세포외 도메인(ECD)을 포함한다. 일부 구현예에서, TGFβRII의 세포외 도메인(ECD)은 서열번호 142에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체 중의 사이토카인 수용체 서열은 서열번호 142의 폴리펩티드 서열과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체 중의 사이토카인 수용체 서열은 TGF-β1 및/또는 TGF-β3에 결합하지만 TGF-β2에는 결합하지 않는다. 몇몇 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체 중의 사이토카인 수용체 서열은 오직 TGF-β1에만 결합한다. 몇몇 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체 중의 사이토카인 수용체 서열은 오직 TGF-β3에만 결합한다. 몇몇 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체 중의 사이토카인 수용체 서열은 오직 TGF-β1 및/또는 TGF-β3에만 결합하지만 TGF-β2에 대해서는 친화성이 낮거나 없다.
일부 구현예에서, PD-1 항체는 TGFβRII 또는 그의 단편(예를 들어 TGFβRII의 ECD)에 융합된다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 부분은 TGFβRII 또는 그의 단편(예를 들어 TGFβRII의 ECD)에 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 부분은 TGFβRII의 적어도 하나의 세포외 도메인에 융합된다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 부분은 TGFβRII의 적어도 하나의 세포외 도메인에 링커를 통해 융합된다.
일부 구현예에서, PD-1 항체 단편 또는 변이체는 PD-1 항체의 Fab, Fab2, (Fab')2, Fv, (Fv)2, scFv, scFv-FC, FC, 디아바디, 트리아바디, 또는 미니바디이다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 단편은 PD-1 항체의 단일-도메인 항체이다. 일부 구현예에서, 단일-도메인 항체는 PD-1 항체의 VNAR 또는 VHH 단편이다.
비제한적인 예시적인 융합 단백질을 도 4A-4C에 예시한다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩에 융합된 항-PD-1 항체 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 융합 단백질은 종양 세포상의 PD-L1과 면역세포상의 PD-1간의 상호작용의 동시 차단, 및 종양 미세환경내 TGF-β의 중화로 인해 상승작용적 항-종양 효과를 이끌어낼 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 효과는 단일 분자 개체에 의한 2개의 주요 면역 회피 기전 및 종양 미세환경내 TGF-β의 표적화된 고갈의 동시 차단으로부터 획득된다. 상기 고갈은 하기 중 하나 이상에 의해 성취된다: (1) 종양 세포의 PD-1 표적화; (2) TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)에 의한 종양 미세환경내 TGF-β의 결합; 및/또는 (3) PD-L1 수용체 매개된 내포작용을 통한 결합된 TGF-β의 파괴.
일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 중쇄의 가변 영역(VH)에 융합시킨다. 다른 구현예에서, TGF-β 트랩을 PD-1 항체의 IgG에 융합시킨다(예를 들어 도 4A). 몇몇 태양에서, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이다. 하나의 구현예에서, IgG는 IgG4이다. 또 다른 구현예에서, IgG4는 서열번호 146(야생형), 서열번호 291, 서열번호 292 또는 서열번호 147(S108P)이다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 중쇄의 가변 영역(VH)에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VH의 불변 영역에 융합시킨다. PD-1 항체 또는 그의 단편 또는 변이체의 VH 서열의 예는 비제한적으로 서열번호 1-7 및 149-164를 포함한다. PD-1 항체 또는 그의 단편 또는 변이체의 VL 서열의 예는 비제한적으로 서열번호 8-13 및 148을 포함한다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 경쇄의 가변 영역(VL)에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VL의 불변 영역에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 경쇄의 가변 영역(VL)에 융합시킨다. 하나의 태양에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)를 링커를 통해 VL 또는 VH 쇄 또는 그의 단편/변이체의 N- 또는 C-말단에 융합시킨다.
"항-PD1(VL/VH)-TGFβRII" 또는 "항-PD1(VH/VL)-TGFβRII"란 용어는 호환 가능하게 사용되며 융합 단백질에 사용된 특정한 VL 또는 VH를 나타낸다. 하나의 구현예에서, "항-PD1(VL/VH)-TGFβRII" 또는 "항-PD1(VH/VL)-TGFβRII"는 항-PD1의 중쇄의 불변 영역에 융합된 TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)를 지칭하거나, 또는 한편으로 항-PD1의 경쇄의 불변 영역에 융합된 TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 지칭한다.
일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 Fab에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 Fab에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 Fab2에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 Fab2에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 (Fab')2에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 (Fab')2에 융합시킨다. 하나의 태양에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 Fab 또는 (Fab')2의 N- 또는 C-말단에 융합시킨다.
일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 Fv에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 Fv에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 (Fv)2에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 (Fv)2에 융합시킨다. 하나의 태양에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 Fv 또는 (Fv)2의 N- 또는 C-말단에 융합시킨다.
일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 scFv에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 scFv에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 scFv-FC에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 scFv-FC에 융합시킨다. 하나의 태양에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 scFv 또는 scFv-FC의 N- 또는 C-말단에 융합시킨다.
일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 FC에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 FC에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 C-말단 FC에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 C-말단 FC에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 N-말단 FC에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 N-말단 FC에 융합시킨다.
일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 디아바디에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 디아바디에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 트리아바디에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 트리아바디에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 미니바디에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 미니바디에 융합시킨다. 하나의 태양에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 미니바디의 N- 또는 C-말단에 융합시킨다.
일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VNAR에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VNAR에 융합시킨다. 모든 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VNAR의 N- 또는 C-말단에 융합시킨다.
일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VHH에 융합시킨다. 일부 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VHH에 융합시킨다. 모든 구현예에서, TGF-β 트랩(예를 들어 TGFβRII)을 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VHH의 N- 또는 C-말단에 융합시킨다.
일부 구현예에서, PD-1 항체 부분을 TGFβRII 또는 그의 단편 또는 변이체(예를 들어 TGFβRII의 ECD)에 융합시킨다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 부분을 링커를 통해 TGFβRII 또는 그의 단편 또는 변이체(예를 들어 TGFβRII의 ECD)에 융합시킨다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 부분을 TGFβRII의 적어도 하나의 세포외 도메인에 융합시킨다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 부분을 링커를 통해 TGFβRII의 적어도 하나의 세포외 도메인에 융합시킨다. 비제한적인 예시적인 융합 단백질을 도 4A-4C에 예시한다.
일부 구현예에서, PD-1 항체 단편은 PD-1 항체의 Fab, Fab2, (Fab')2, Fv, (Fv)2, scFv, scFv-FC, FC, 디아바디, 트리아바디, 또는 미니바디이다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 단편은 PD-1 항체의 단일-도메인 항체이다. 일부 구현예에서, 단일-도메인 항체는 PD-1 항체의 VNAR 또는 VHH 단편이다.
일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 1-7 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 1-7 및 149-164에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 중쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 8-13 및 148 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 중쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 8-13 및 148에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열 및 서열번호 16에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 16에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열 및 서열번호 143에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 143에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열 및 서열번호 294에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 294에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 296에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열 및 서열번호 145에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 296에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 145에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 296에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열 및 서열번호 144에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 296에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 144에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 296에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열 및 서열번호 295에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 296에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 295에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열 및 서열번호 16에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열 및 서열번호 143에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열 및 서열번호 145에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 145에 나타낸 바와 같은 서열 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 링커 및 서열번호 16에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 링커 및 서열번호 16에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 149에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 149 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 157에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 157에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 158에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 158에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 149에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 149에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 157에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 157에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 158에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 158에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 158에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 158에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 149에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 149에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 150에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 150에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 151에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 151에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 152에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 152에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 153에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 153에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 154에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 154에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 155에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 155에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 156에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 156에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 157에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 157에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 158에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 158에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 159에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 159에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 160에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 160에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 161에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 161에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 162에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 162에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 163에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 163에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 164에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 164에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 9에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 9에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 10에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 10에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 11에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 11에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 148에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 148에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 16에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 16에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 143에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 143에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 144에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 144에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 145에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 145에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
(ii) 항-TGF-β 항체-융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체
다른 구현예에서, 사이토카인 트랩은 TGF-β에 대한 항체, 항체 단편 또는 항체 변이체이다. 상기와 같은 구현예에서, 상기와 같은 항체는 수용체가 TGF-β1, 2 및/또는 3에 결합하는 것을 차단하는 범-중화 항-TGF-β 항체, 또는 항-수용체 항체를 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 항체 단편 또는 변이체는 TGF-β 항체의 Fab, Fab2, (Fab')2, Fv, (Fv)2, scFv, scFv-FC, FC, 디아바디, 트리아바디, 또는 미니바디이다. 하나의 구현예에서, 항-TGF-β 항체 또는 그의 단편 또는 변이체는 TGF-β1, TGF-β2, 및 TGF-β3에 결합한다. 몇몇 구현예에서, 항-TGF-β 항체 또는 그의 단편 또는 변이체는 TGF-β1에 결합한다. 몇몇 구현예에서, 항-TGF-β 항체 또는 그의 단편 또는 변이체는 TGF-β3에 결합한다. 몇몇 구현예에서, 항-TGF-β 항체 또는 그의 단편 또는 변이체는 TGF-β1 및 TGF-β2에 결합한다. 몇몇 구현예에서, 항-TGF-β 항체 또는 그의 단편 또는 변이체는 TGF-β1 및 TGF-β3에 결합한다. TGF-β 항체 또는 그의 단편 또는 변이체의 VH 서열의 예는 비제한적으로 서열번호 166, 168, 169, 171, 173, 175, 및 177을 포함한다. TGF-β 항체 또는 그의 단편 또는 변이체의 VL 서열의 예는 비제한적으로 서열번호 165, 167, 170, 172, 174, 176, 및 178을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-TGF-β 항체는 서열번호 166, 168, 169, 171, 173, 175, 또는 177 중 어느 하나로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-TGF-β 항체는 서열번호 165, 167, 170, 172, 174, 176, 또는 178 중 어느 하나로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
(iii) TGF-β 길항작용성 펩티드-융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체
몇몇 구현예에서, 사이토카인 트랩은 TGF-β 길항작용성 펩티드 또는 TGF-β 억제성 펩티드를 포함할 수 있다. 상기와 같은 펩티드를 파지 디스플레이를 사용하여 드노보 생성시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기와 같은 펩티드는 TGF-β 동형(들) 또는 TGF-β 수용체(들)의 분절로부터 유래될 수 있다. TGF-β 길항작용성 펩티드의 예는 비제한적으로 서열번호 193-227을 포함할 수 있다. TGF-β 억제성 펩티드의 예는 비제한적으로 서열번호 193-227을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 펩티드는 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VH 및/또는 VL에 융합될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 하나의 펩티드를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체에 융합시킬 수 있다. 추가의 구현예에서, 하나 초과의 펩티드를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체에 융합시킬 수 있다. 하나 초과의 펩티드를 사용하는 경우, 펩티드를 링커로 또는 링커 없이 융합시켜 연쇄체(concatemer)를 형성시킬 수 있다. 하나 초과의 펩티드를 사용하는 경우, 동일한 펩티드를 사용하여 연쇄체를 형성시킬 수 있다. 한편으로, 2개 이상의 상이한 펩티드의 조합을 사용하여 연쇄체를 형성시킬 수 있다.
아데노신:
아데노신은 종양 미세환경 중의 핵심적인 면역 조절제이다. 세포외 아데노신은, 대부분의 면역세포에서 우세하게 발현되는 하위유형인 A2A 아데노신 수용체(A2AR)에 결합시 염증 반응을 억제한다. 다수의 종양은, 각각 ATP 및 ADP에서 AMP로, 및 AMP에서 아데노신으로의 전환을 담당하는 엑토뉴클레오티다제인 CD39 및 CD73을 높은 수준으로 발현한다. 상응하게, 아데노신은 Foxp3, CD39 및 CD73의 발현을 유도함으로써 조절성 T 세포의 억제 활성을 촉진한다. 추가로, 저산소증은 종양 미세환경에서 CD39 및 CD73의 유도를 통해 세포외 아데노신의 축적을 유도한다. 또한, 종양 미세환경에서 세포외 아데노신의 높은 수준은 뉴클레오티드 수송체 ENT-1의 저산소증-유도성 인자(HIF)-의존적인 억제 및 아데노신 키나제의 억제에 의해 유지되어, 각각 세포내 공간 중의 아데노신의 재배치를 방지하고 AMP의 형성을 방지한다. 상응하게, 종양 미세환경에서 세포외 아데노신의 감소를 표적화함은 면역세포 기능을 증대시키고 종양세포 사멸을 촉진하는 것으로 이해된다.
구현예에서 본원은 종양 미세환경에서 세포외 아데노신의 감소를 표적화하기 위해 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
아데노신 데아미나제
아데노신 데아미나제(또한 아데노신 아미노하이드롤라제, 또는 ADA로서 공지됨) ADA는 아데노신을 비가역적으로 탈아민화시켜, 상기를 케토기에 대한 아미노기의 치환에 의해 관련된 뉴클레오시드로 전환시킨다. 이어서 이노신을 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제(PNP)라 칭하는 또 다른 효소에 의해 탈리보실화시켜(리보스로부터 제거), 상기를 하이포잔틴으로 전환시킬 수 있다. ADA는 식품으로부터 아데노신의 분해 및 조직 중 핵산의 턴오버에 필요하다. 인간에서 그의 주기능은 면역계의 발달 및 유지이다. 그러나, ADA 연관성은 또한 상피세포 분화, 신경전달, 및 임신 유지에 대해서 관찰되었다. ADA의 2개의 동형: ADA1 및 ADA2가 존재한다.
ADA1은 대부분의 신체 세포, 특히 림프구 및 대식세포에서 발견되며, 여기에서 상기는 시토솔 및 핵에 존재할 뿐만 아니라, 엑토형으로서 디펩티딜 펩티다제-4(aka, CD26)에 부착된 세포막상에 존재한다. ADA1은 주로 세포내 활성에 관련되며, 작은 형태(단량체) 및 큰 형태(이량체) 모두로 존재한다. 작은 형태에서 큰 형태로의 상호전환은 폐의 '전환 인자'에 의해 조절된다.
ADA2는 인간 비장에서 처음 식별되었다. 상기는 후속적으로 대식세포(여기에서 ADA1과 공존한다)를 포함한 다른 조직에서 발견되었다. 2개의 동형은 아데노신 대 데옥시아데노신의 비를 조절한다. ADA2는 인간 혈장과 혈청에서 우세하게 발견되며, 주로 동종이량체로서 존재한다. ADA2는 인간 혈장에 우세한 형태로 존재하며 다수의 질병, 특히 면역계와 연관된 질병: 예를 들어 류머티스성 관절염, 건선 및 사르코이드증(sarcoidosis)에서 증가한다. 혈장 ADA2 동형은 또한 대부분의 암에서 증가한다. ADA2는 편재하지 않고 단핵세포-대식세포 중에서 ADA1과 공존한다.
ADA2 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체
본원은 면역관문 억제제, 예를 들어 PD-1 억제제 또는 항체, 및 아데노신을 중화시킬 수 있는 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 포함하는 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 제공한다. 본원에 제공된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체(예를 들어 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)에 융합된 PD-1 억제제 또는 항체)는 예를 들어 종양 세포상의 PD-L1과 면역세포상의 PD-1간의 상호작용의 동시 차단, 및 예를 들어 종양 미세환경내 아데노신의 중화로 인해 상승작용적 항-종양 효과를 이끌어낼 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 효과는 단일 분자 개체에 의한 2개의 주요 면역 회피 기전 및 종양 미세환경내 아데노신의 표적화된 고갈의 동시 차단으로부터 획득된다. 상기 고갈은 하기 중 하나 이상에 의해 성취될 수 있다: (1) 종양 세포의 항-PD-1 표적화; (2) 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)에 의한 종양 미세환경내 아데노신의 결합; 및 (3) PD-L1 수용체 매개된 내포작용을 통한 결합된 TGF-β의 파괴.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)는 PD-1 억제제 또는 항체 또는 그의 단편 또는 변이체를 또한 포함하는 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 일부이다. 일부 구현예는 임의로 절단성 또는 비-절단성 링커를 통해 PD-1 억제제에 융합된 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 포함하는 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 아데노신 데아미나제 2(ADA2)이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 본원에 기재된 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2) 또는 그의 기능성 변이체 또는 유도체를 포함한다. ADA2 및 변이체의 예는 WO 2016061286(본원에 내용 전체가 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, TGF-β 사이토카인 트랩은 ADA2 돌연변이 1, ADA2 돌연변이 2, ADA2 돌연변이 3, ADA2 돌연변이 4, ADA2 돌연변이 5, ADA2 돌연변이 6, 또는 ADA2 돌연변이 7 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체는 링커를 통해 ADA 단백질 또는 그의 기능성 단편에 융합된 PD-1 억제제 또는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1 억제제는 PD-1을 표적화하는 항체 또는 항체의 단편 또는 변이체일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체는 서열번호 284의 폴리펩티드 서열과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체는 서열번호 273의 폴리펩티드 서열과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체는 서열번호 274의 폴리펩티드 서열과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체는 서열번호 37275의 폴리펩티드 서열과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체는 서열번호 276의 폴리펩티드 서열과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체는 서열번호 277의 폴리펩티드 서열과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체는 서열번호 278의 폴리펩티드 서열과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체는 서열번호 279의 폴리펩티드 서열과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체는 상술한 바와 같은 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2) 및 면역관문 유전자를 표적화하는 항체, 항체의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역관문, 예를 들어 세포독성 T 림프구 관련 단백질-4(CTLA-4) 및 예정세포사-1(PD-1)을 표적화하는 항체 또는 항체의 단편 또는 변이체를 링커를 통해 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2) 분자에 융합시킬 수 있다.
일부 구현예에서, PD-1 항체 부분을 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2) 또는 그의 단편에 융합시킨다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 부분을 링커를 통해 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)에 융합시킨다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 부분을 ADA2의 적어도 하나의 도메인에 융합시킨다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 부분을 링커를 통해 ADA2의 적어도 하나의 도메인에 융합시킨다.
일부 구현예에서, PD-1 항체 단편 또는 변이체는 PD-1 항체의 Fab, Fab2, (Fab')2, Fv, (Fv)2, scFv, scFv-FC, FC, 디아바디, 트리아바디, 또는 미니바디이다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 단편은 PD-1 항체의 단일-도메인 항체이다. 일부 구현예에서, 단일-도메인 항체는 PD-1 항체의 VNAR 또는 VHH 단편이다.
비제한적인 예시적인 융합 단백질을 도 33A-33C에 예시한다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)에 융합된 항-PD-1 항체 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 융합 단백질은 종양 세포상의 PD-L1과 면역세포상의 PD-1간의 상호작용의 동시 차단, 및 종양 미세환경내 세포외 아데노신의 감소의 표적화로 인해 상승작용적 항-종양 효과를 이끌어낼 수 있다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 중쇄 가변 영역(VH)에 융합시킨다. 다른 구현예에서, 아데노신 데아미나제를 PD-1 항체의 IgG에 융합시킨다(예를 들어 도 4a). 몇몇 태양에서, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이다. 하나의 구현예에서, IgG는 IgG4이다. 또 다른 구현예에서, IgG4는 서열번호 146(야생형), 서열번호 291, 서열번호 292 또는 서열번호 147(S108P)이다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 중쇄의 가변 영역(VH)에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VH의 불변 영역에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 경쇄의 가변 영역(VL)에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 경쇄의 가변 영역(VL)에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VL의 불변 영역에 융합시킨다. 하나의 태양에서, 아데노신 데아미나제를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VH 또는 VL의 N- 또는 C-말단에 융합시킨다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 Fab에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 Fab에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 Fab2에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 Fab2에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 (Fab')2에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 (Fab')2에 융합시킨다. 하나의 태양에서, 아데노신 데아미나제를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 Fab 또는 Fab2의 N- 또는 C-말단에 융합시킨다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 Fv에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 Fv에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 (Fv)2에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 (Fv)2에 융합시킨다. 하나의 태양에서, 아데노신 데아미나제를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 Fv 또는 (Fv)2의 N- 또는 C-말단에 융합시킨다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 scFv에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 scFv에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 scFv-FC에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 scFv-FC에 융합시킨다. 하나의 태양에서, 아데노신 데아미나제를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 scFv 또는 scFv-FC의 N- 또는 C-말단에 융합시킨다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 FC에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 FC에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 C-말단 FC에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 C-말단 FC에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 N-말단 FC에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 N-말단 FC에 융합시킨다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 디아바디에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 디아바디에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 트리아바디에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 트리아바디에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 미니바디에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 미니바디에 융합시킨다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VNAR에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VNAR에 융합시킨다. 하나의 태양에서, 아데노신 데아미나제를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VNAR의 N- 또는 C-말단에 융합시킨다.
일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VHH에 융합시킨다. 일부 구현예에서, 아데노신 데아미나제(예를 들어 ADA2)를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VHH에 융합시킨다. 하나의 태양에서, 아데노신 데아미나제를 링커를 통해 PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 VHH의 N- 또는 C-말단에 융합시킨다.
일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 1-7 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 1-7 및 149-164에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 중쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 8-13 및 148 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 그의 단편/변이체의 중쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 8-13 및 148에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열 및 서열번호 280에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 280에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열 및 서열번호 281에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 281에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열 및 서열번호 282에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 282에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열 및 서열번호 283에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 283에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 149에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 149에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 150에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 150에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 151에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 151에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 152에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 152에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 153에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 153에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 154에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 154에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 155에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 155에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 156에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 156에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 157에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 157에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 158에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 158에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 159에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 159에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 160에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 160에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 161에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 161에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 162에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 162에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 163에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 163에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 164에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 164에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 9에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 9에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 10에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 10에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 11에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 11에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 148에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 148에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 280에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 280에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 281에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 281에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 282에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 282에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 283에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 283에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 149에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 149 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 157에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 157에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 158에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 158에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 149에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 149에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 157에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 157에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 158에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 158에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 158에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 158에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 일치하는 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다.
링커
일부 구현예에서, 링커는 서열번호 17-34 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 가요성 링커일 수 있다. 가요성 링커는 결합된 도메인이 어느 정도의 움직임이나 상호작용을 요하는 경우 적용될 수 있다. 가요성 링커는 작은, 비-극성(예를 들어 Gly) 또는 극성(예를 들어 Ser 또는 Thr) 아미노산으로 구성될 수 있다. 가요성 링커는 주로 Gly 및 Ser 잔기의 신장부로 이루어지는 서열을 가질 수 있다("GS" 링커). 가요성 링커의 비제한적인 예는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n의 서열을 가질 수 있으며, 여기에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다. 사본수 "n"을 조절함으로써, 상기 예시적인 GS 링커의 길이를, 기능성 도메인의 적합한 분리를 성취하거나 또는 필요한 도메인-간 상호작용을 유지시키기 위해 최적화할 수 있다. GS 링커 외에, 다른 가요성 링커를 재조합 융합 단백질에 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 가요성 링커는 (Gly)n의 서열을 가질 수 있으며, 여기에서 n은 6, 7 또는 8일 수 있다. 일부의 경우에, 가요성 링커는 또한 작은 또는 극성 아미노산, 예를 들어 Gly 및 Ser이 풍부할 수 있으나, 가요성을 유지하기 위해서 추가적인 아미노산, 예를 들어 Thr 및 Ala를 함유할 수 있다. 일부의 경우에, 본원에 기재된 링커는 강성 링커일 수 있다. 강성 링커를 사용하여 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 도메인간에 고정된 거리를 유지시킬 수 있다. 강성 링커의 비제한적인 예는 알파 나선-형성 링커, pro-풍부 서열, (XP)n, X-Pro 주쇄, (EAAAK)n(n=1-6)일 수 있다. 강성 링커는 α-나선 구조를 채택하거나 또는 일부의 경우에 다수의 Pro 잔기를 함유함으로써 비교적 경직된 구조를 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체 중의 면역관문 억제제, 예를 들어 PD-1 억제제, 및 사이토카인(예를 들어 TGF-β)을 중화시킬 수 있는 사이토카인 트랩(예를 들어 TGF-β 트랩)을 개재 링커 폴리펩티드를 암호화하는 개재 서열에 의해 분리시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체 중의 면역관문 억제제, 예를 들어 PD-1 억제제, 및 ADA2(또는 그의 돌연변이체)를 개재 링커 폴리펩티드를 암호화하는 개재 서열에 의해 분리시킬 수 있다. 몇몇 구현예에서, 링커 폴리펩티드는 하기 표에 개시된 서열을 포함한다:
링커 아미노산 서열 및 폴리뉴클레오티드 서열
서열번호 링커
17 DPGGGGSGGGGSNPGS
18 GGGGSGGGGSGSDPGS
19 DPGSGGGGSGGGGSGS
20 GGGGSGGGGSGGGGSDPGS
21 DPGSGGGGSGGGGSGGGGS
22 DPGSGSVPLGSGSNPGS
23 DPGSGGSVPLGSGGSNPGS
24 DPGVLEREDKPTTSKPNPGS
25 DPGVLEREDVPTTSYPNPGS
26 DPGVLEREDKVTTSKYNPGS
27 DPVLEREDKVTTSKNPGS
28 DIEGRMD
29 GEGKSSGSGSESKAS
30 GSTSGSGKPGSGEGSTKG
31 A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A
32 (G4S)n, n=1-10
33 (Gly)n, n=6-8
34 (EAAAK)n, n=1-6
일부 구현예에서, 링커는 가요성 링커, 강성 링커, 생체내 절단성 링커, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부의 경우에, 링커는 기능성 도메인을 함께 연결시키거나(가요성 및 강성 링커에서와 같이) 또는 생체내 절단성 링커에서와 같이 생체내에서 자유 기능성 도메인을 방출시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 생물학적 활성을 개선시키고, 발현 수율을 증가시키며, 바람직한 약동학적 프로파일을 성취할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 또한 히드라존, 펩티드, 디설파이드 또는 티오에스테르를 포함할 수 있다.
일부의 경우에, 본원에 기재된 링커 서열은 가요성 링커를 포함할 수 있다. 가요성 링커는 결합된 도메인이 어느 정도의 움직임이나 상호작용을 요하는 경우 적용될 수 있다. 가요성 링커는 작은, 비-극성(예를 들어 Gly) 또는 극성(예를 들어 Ser 또는 Thr) 아미노산으로 구성될 수 있다. 가요성 링커는 주로 Gly 및 Ser 잔기의 신장부로 이루어지는 서열을 가질 수 있다("GS" 링커). 가요성 링커의 일례는 (G4S)n의 서열을 가질 수 있으며, 여기에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 일부 구현예에서, 가요성 링커는 (Gly)n의 서열을 가질 수 있으며, 여기에서 n은 6, 7 또는 8일 수 있다. 일부의 경우에, 가요성 링커는 또한 작은 또는 극성 아미노산, 예를 들어 Gly 및 Ser이 풍부할 수 있으나, 가요성을 유지하기 위해서 추가적인 아미노산, 예를 들어 Thr 및 Ala를 함유할 수 있다. 다른 경우에, 극성 아미노산, 예를 들어 Lys 및 Glu를 사용하여 용해도를 개선시킬 수 있다. 사본수 "n"을 조절함으로써, 상기 비제한적인 예시적인 링커의 길이를, 기능성 도메인의 적합한 분리를 성취하거나, 또는 필요한 도메인-간 상호작용을 유지시키기 위해 최적화할 수 있다. GS 링커 외에, 다른 가요성 링커를 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체에 사용할 수 있다. 일부의 경우에, 가요성 링커는 또한 작은 또는 극성 아미노산, 예를 들어 Gly 및 Ser이 풍부할 수 있으나, 가요성을 유지하기 위해서 추가적인 아미노산, 예를 들어 Thr 및 Ala를 함유할 수 있다. 다른 경우에, 극성 아미노산, 예를 들어 Lys 및 Glu를 사용하여 용해도를 개선시킬 수 있다.
본원에 기재된 링커 서열 중에 포함된 가요성 링커는 Gly 및 Ser과 같은 작은 또는 극성 아미노산이 풍부하여 양호한 가요성 및 용해도를 제공할 수 있다. 가요성 링커는 어떤 움직임이나 상호작용이 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체 도메인에 요구되는 경우 적합한 선택일 수 있다. 또한, 가요성 링커는 강성 구조를 갖지는 않지만, 기능성 도메인간에 일정한 거리를 유지시키는 수동 링커로서 작용할 수 있다. 가요성 링커의 길이를, 적합한 폴딩을 허용하거나 또는 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 최적의 생물학적 활성을 성취하기 위해 조절할 수 있다.
일부의 경우에, 본원에 기재된 링커는 강성 링커를 추가로 포함할 수 있다. 강성 링커를 사용하여 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 도메인간에 고정된 거리를 유지시킬 수 있다. 강성 링커의 예는 몇 가지 언급하자면, 알파 나선-형성 링커, pro-풍부 서열, (XP)n, X-Pro 주쇄, (EAAAK)n(n=1-6)일 수 있다. 강성 링커는 α-나선 구조를 채택하거나 또는 일부의 경우에 다수의 Pro 잔기를 함유함으로써 비교적 경직된 구조를 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 링커는 절단성 링커일 수 있다. 다른 경우에 링커는 절단성이 아니다. 절단성이 아닌 링커는 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 기능성 도메인을 함께 공유적으로 결합시켜 생체내 과정 또는 생체외 과정 전체를 통해 하나의 분자로서 작용할 수 있다. 링커는 또한 생체내에서 절단성일 수 있다. 절단성 링커를 도입하여 생체내에서 자유 기능성 도메인을 방출시킬 수 있다. 절단성 링커를, 몇 가지 언급하자면 환원 시약, 프로테아제의 존재하에서 절단시킬 수 있다. 예를 들어, 디설파이드 결합의 환원을 이용하여 절단성 링커를 생성시킬 수 있다. 디설파이드 링커의 경우에, 티올, 예를 들어 글루타치온과의 디설파이드 교환을 통한 절단 사건이 절단을 생성시킬 수 있었다. 다른 경우에, 재조합 융합 단백질 중 링커의 생체내 절단을 또한, 특정한 세포 또는 조직에서, 병적인 조건(예를 들어 암 또는 염증)하에 생체내에서 발현되거나, 또는 몇몇 세포 구획내에 제한될 수 있는 프로테아제에 의해 수행할 수 있다. 일부의 경우에, 절단성 링커는 표적화된 절단을 허용할 수 있다. 예를 들어, 다수의 프로테아제의 특이성은 제한된 구획내에서 링커의 보다 느린 절단을 제공할 수 있다. 절단성 링커는 또한 히드라존, 펩티드, 디설파이드, 또는 티오에스테르를 포함할 수 있다. 예를 들어, 히드라존은 혈청 안정성을 부여할 수 있다. 다른 경우에, 히드라존은 산성 구획에서 절단을 허용할 수 있다. 산성 구획은 7 이하의 pH를 가질 수 있다. 링커는 또한 티오에테르를 포함할 수 있다. 티오에테르는 비환원성일 수 있다. 티오에테르를 세포내 단백질분해적 분해용으로 설계할 수 있다.
일부의 경우에, 링커는 조작된 링커일 수 있다. 예를 들어, 링커를 소수성과 같은 화학 특징을 포함하도록 설계할 수 있다. 일부의 경우에, 적어도 2개의 상이한 링커 폴리펩티드 서열은 동일한 폴리펩티드 링커 서열을 암호화할 수 있다. 링커의 설계 방법은 컴퓨터에 의할 수 있다. 일부의 경우에, 컴퓨터 방법은 그래픽 기법을 포함할 수 있다. 컴퓨터 방법을 사용하여 데이터베이스로부터 유래된 3차원 펩티드 구조의 라이브러리로부터 적합한 펩티드를 검색할 수 있다. 예를 들어, Brookhaven Protein Data Bank(PDB)를 사용하여 링커의 선택된 아미노산 사이의 공간 중의 거리를 눈대중 할 수 있다. 일부의 경우에, 폴리펩티드 링커는 또한 하나 이상의 GS 링커 서열, 예를 들어 (G4S)n, (GS)n, (SG)n, (GSG)n, 및 (SGSG)n을 포함할 수 있으며, 여기에서 n은 0 내지 15의 임의의 수일 수 있다.
암 치료 방법
또한 본원은 면역관문 억제제, 예를 들어 PD-1 억제제, 및 사이토카인(예를 들어 TGF-β)을 중화시킬 수 있는 사이토카인 트랩(예를 들어 TGF-β 트랩)을 포함하는 융합 단백질로 암을 치료하는 방법을 제공한다. 또한 본원은 면역관문 억제제, 예를 들어 PD-1 억제제, 및 아데노신 데아미나제 단백질을 포함하는 융합 단백질로 암을 치료하는 방법을 제공한다. 면역관문 경로, 예를 들어 PD1 및 PD-L1/2 신호전달 경로 및 CTLA-4 및 CD80/86 신호전달 경로의 차단을 표적화하는 단클론 항체의 개발은 암 치료에 혁신적이었으며, 다수의 암 적응증, 예를 들어 비제한적으로 흑색종, 비-소세포 폐암, 신세포 암종, 방광암, 두경부 편평세포 암종, MSI-고 결장직장 암종, 메르켈 세포 암종, 및 호지킨 림프종에서 장기 지속적인 임상 활성을 나타내었다. 장기 지속적인 반응에도 불구하고, 반응율은 여전히 매우 낮으며, 다수의 환자가 내성을 나타내어 질병이 진행하게 되었다. 더욱 또한, 다수의 적응증, 예를 들어 난소, 위식도, 전립선, 췌장 및 다수의 다른 암에서, 면역관문 억제제는 어떠한 실질적인 임상 반응도 보이지 못했다.
면역관문 차단의 실패는 종양 미세환경에 존재하는 면역억제 인자의 복잡성에 기인할 수 있다. 이러한 인자는 비제한적으로 억제성 세포, 예를 들어 골수 유래된 억제성 세포, 종양-관련 대식세포(TAM); 억제성 사이토카인 및 성장 인자, 예를 들어 TGF-β 및 인터류킨 10(IL-10); 및 대사 유도체, 예를 들어 아데노신 및 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO) 부산물을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 항-PD1-TGFβII 융합 단백질은 종양 미세환경 중 2개의 음의 억제성 경로를 표적화할 수 있는 치료법의 일례이다. 상기 경로는 면역에 대해 종양 세포에 의해 매개되는 세포 본래의 상호작용(여기에서 PD-1/PD-L1 상호작용이 큰 역할을 할 수 있다), 및 면역억제성 사이토카인에 의해 매개되는 세포 외부적인 상호작용(여기에서 TGF-β는 중요한 일원일 수 있다)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 암은 비제한적으로 교모세포종, 결장직장, 위, 자궁경부, 난소, 췌장, 전립선, 유방 및 신장암이다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질은 비-소세포암(NSCL) 및 흑색종(여기에서 관문 차단의 반응율은 보다 낮으며 TGF-β가 고도로 발현된다)과 같은 적응증에 잘 들을 수 있다.
암은 비제한적으로 B 세포암, 예를 들어 다발성 골수종(multiple myeloma), 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄병(heavy chain diseases), 예를 들어 알파쇄 병(alpha chain disease), 감마쇄 병(gamma chain disease) 및 뮤쇄 병(mu chain disease), 양성 단클론 감마병증(benign monoclonal gammopathy) 및 면역세포성 아밀로이드증(immunocytic amyloidosis), 흑색종, 유방암, 폐암, 기관지암, 대장암, 전립선암(예를 들어 전이성, 호르몬 불응성 전립선암), 췌장암, 위암, 난소암, 방광암, 뇌 또는 중추신경계암, 말초 신경계암, 식도암, 자궁경부암, 자궁 또는 자궁내막암, 구강 또는 인두의 암, 간암, 신장암, 고환암, 담관암, 소장 또는 부속기암, 침선암, 갑상선암, 부신암, 골육종, 연골육종, 혈액 조직암 등을 포함한다. 본 개시내용에 의해 포함되는 방법에 적용가능한 암 유형의 다른 비제한적인 예는 인간 육종 및 암종, 예를 들어 섬유육종(fibrosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 골원성 육종(osteogenic sarcoma), 척삭종(chordoma), 혈관육종(angiosarcoma), 내피육종(endotheliosarcoma), 림프관육종(lymphangiosarcoma), 림프관내피육종(lymphangioendotheliosarcoma), 윤활막종(synovioma), 중피종(mesothelioma), 유잉 종양(Ewing's tumor), 평활근육종(leiomyosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 결장암종, 대장암, 췌장암, 유방암, 삼중음성유방암, 난소암, 편평세포 암종, 기저세포 암종, 선암종, 한선 암종(sweat gland carcinoma), 피지선 암종(sebaceous gland carcinoma), 유두 암종(papillary carcinoma), 유두 선암종(papillary adenocarcinomas), 낭선암종(cystadenocarcinoma), 수질 암종(medullary carcinoma), 기관지암종(bronchogenic carcinoma), 신세포 암종, 간종양, 담관 암종, 간암, 간세포 암종(HCC), 융모암종(choriocarcinoma), 정상피종(seminoma), 배아 암종(embryonal carcinoma), 윌름 종양(Wilms' tumor), 자궁경부암, 골암, 뇌 종양, 고환암, 폐암종, 소세포 폐암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 수모세포종(medulloblastoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 상의세포종(ependymoma), 송과체종(pinealoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 청신경종(acoustic neuroma), 핍지교종(oligodendroglioma), 뇌수막종(meningioma), 흑색종, 신경모세포종(neuroblastoma), 망막모세포종(retinoblastoma); 백혈병, 예를 들어 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수구성 백혈병(골수모구성, 풋골수성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 적백혈병(erythroleukemia)); 만성 백혈병(만성 골수구성(과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병); 및 진성 적혈구 증가증(polycythemia vera), 림프종(lymphoma)(호지킨병 및 비-호지킨병), 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 및 중쇄병을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법에 의해 표현형이 측정되는 암은 상피암, 예를 들어 비제한적으로 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 부인과암, 신장암, 후두암, 폐암, 구강암, 두경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 또는 피부암이다. 다른 구현예에서, 암은 유방암, 전립선암, 폐암 또는 결장암이다. 더욱 다른 구현예에서, 상피암은 비-소세포 폐암, 비유두 신세포 암종, 자궁경부 암종, 난소 암종(예를 들어 장액성 난소 암종), 또는 유방 암종이다. 상피암은 비제한적으로 장액성, 자궁내막모양, 점액성, 투명세포, 브레너, 또는 미분화를 포함하여 다양한 다른 방식으로 특성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용을 림프종 또는 비제한적으로 외투세포 림프종을 포함한 그의 하위유형의 치료, 진단 및/또는 예후에 사용한다.
몇몇 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD-1-TGFβRII 융합 단백질은 표준 요법(비제한적으로 화학요법, 화학요법 및 현행 임상 시험 요법 포함)에 대해 약 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95% 평균 반응율을 갖는 암의 치료에 사용될 수 있는 치료법의 일례이다. 몇몇 구현예에서, 본원에 제공된 항-PD1-ADA2 융합 단백질은 표준 요법(비제한적으로 화학요법, 화학요법 및 현행 임상 시험 요법 포함)에 대해 약 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95% 평균 반응율을 갖는 암의 치료에 사용될 수 있는 치료법의 일례이다. 상기와 같은 암은 비제한적으로, 호지킨 림프종, 흑색종, 비-소세포 폐암(NSCLC), 현미부수체 불안정성(microsatellite instability)(MSI)-고 또는 오합치 수복(MMR)-결함 고형 종양, CSCC, RCC, CRC, 흑색종, 메르켈 세포 암, 방광암, RCC, 간세포 암종(HCC), 두경부암(H&N), 자궁경부암, 위암, 소세포 폐암(SCLC), 자궁내막암, 중피종, 난소암, 삼중 음성 유방암(TNBC), 유방암, 대장암(CRC), 췌장암, 전립선암을 포함한다.
병용 요법
일부 구현예에서, 융합 단백질을 추가적인 치료제와 병용 요법으로서 투여한다. 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 생물학적 분자, 예를 들어 항체를 포함한다. 예를 들어, 치료는, 비제한적으로 EGFR, HER2/ErbB2, 및/또는 VEGF에 결합하는 항체를 포함한 종양-관련 항원에 대한 항체와 융합 단백질의 병용 투여를 수반할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 추가적인 치료제는 암 줄기세포 마커에 특이적인 항체이다. 몇몇 구현예에서, 추가적인 치료제는 혈관형성 억제제(예를 들어 항-VEGF 또는 VEGF 수용체 항체)인 항체이다. 몇몇 구현예에서, 추가적인 치료제는 베바시주맙(AVASTIN), 라무시루맙, 트라스투주맙(HERCEPTIN), 페르투주맙(OMNITARG), 파니투무맙(VECTIBIX), 니모투주맙, 잘루투무맙, 또는 세툭시맙(ERBITUX)이다. 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 소분자와 같은 작용제를 포함한다. 예를 들어 치료는 본원에 제공된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체와, 비제한적으로 EGFR, HER2(ErbB2), 및/또는 VEGF를 포함한 종양-관련 항원에 대한 억제제로서 작용하는 소분자와의 병용 투여를 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 제피티닙(IRESSA), 에를로티닙(TARCEVA), 수니티닙(SUTENT), 라파타닙, 반데타닙(ZACTIMA), AEE788, CI-1033, 세디라닙(RECENTIN), 소라페닙(NEXAVAR), 및 파조파닙(GW786034B)으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 단백질 키나제 억제제와 함께 투여한다. 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 mTOR 억제제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 추가적인 치료제는 화학요법 또는 TREG 세포의 수를 감소시키는 다른 억제제이다. 몇몇 구현예에서, 치료제는 사이클로포스파미드 또는 항-CTLA4 항체이다. 또 다른 구현예에서, 추가적인 치료제는 골수-유래된 억제인자 세포의 존재를 감소시킨다. 추가의 구현예에서, 추가적인 치료제는 카르보탁솔이다. 추가의 구현예에서, 추가적인 치료제는 이브루티닙이다.
일부 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체와 함께 하나 이상의 면역관문 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 관문 억제제는 CTLA-4 항체일 수 있다. 항-CTLA-4 항체(예를 들어 이필리무맙)는 진행된 흑색종이 있는 참가자에서 장기 지속적인 항-종양 활성 및 연장된 생존을 나타내어, 2011년에 식품의약품 안전청(FDA)에서 승인되었다. 문헌[Hodi et al., Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. (2010) Aug 19; 363(8):711-23]을 참조하시오. 일부 구현예에서, 하나 이상의 관문 억제제는 항-PD-L1 항체일 수 있다. 일부 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 완전길이 아테졸리주맙(항-PD-L1), 아벨루맙(항-PD-L1), 듀르발루맙(항-PD-L1), 또는 그의 단편 또는 변이체일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 관문 억제제는 CD27 억제제, CD28 억제제, CD40 억제제, CD122 억제제, CD137 억제제, OX40(또한 CD134로서 공지됨) 억제제, GITR 억제제, ICOS 억제제, 또는 이들의 임의의 조합 중 임의의 하나 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 관문 억제제는 A2AR 억제제, B7-H3(또한 CD276로서 공지됨) 억제제, B7-H4(또한 VTCN1로서 공지됨) 억제제, BTLA 억제제, IDO 억제제, KIR 억제제, LAG3 억제제, TIM-3 억제제, VISTA 억제제, 또는 이들의 임의의 조합 중 임의의 하나 이상일 수 있다.
몇몇 구현예에서, 추가적인 치료제는 제2 면역치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 추가적인 면역치료제는 비제한적으로 콜로니 자극 인자, 인터류킨, 면역억제성 기능을 차단하는 항체(예를 들어 항-CTLA-4 항체, 항-CD28 항체, 항-CD3 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIGIT 항체), 면역 세포 기능을 증대시키는 항체(예를 들어 항-GITR 항체, 항-OX-40 항체, 항-CD40 항체, 또는 항-4-1BB 항체), 톨형 수용체(예를 들어 TLR4, TLR7, TLR9), 용해성 리간드(예를 들어, GITRL, GITRL-Fc, OX-40L, OX-40L-Fc, CD40L, CD40L-Fc, 4-1BB 리간드, 또는 4-1BB 리간드-Fc), 또는 B7 패밀리의 일원(예를 들어 CD80, CD86)을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가적인 면역치료제는 CTLA-4, CD28, CD3, PD-L1, TIGIT, GITR, OX-40, CD-40, 또는 4-1BB를 표적화한다.
일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 추가적인 면역관문 억제제이다. 일부 구현예에서, 추가적인 면역관문 억제제는 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD28 항체, 항-TIGIT 항체, 항-LAG3 항체, 항-TIM3 항체, 항-GITR 항체, 항-4-1BB 항체, 또는 항-OX-40 항체이다. 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 항-TIGIT 항체이다. 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 BMS935559(MDX-1105), 아테졸리주맙(MPDL3280A), 듀르발루맙(MEDI4736), 및 아벨루맙(MSB0010718C)으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 항-PD-L1 항체이다. 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 이필리무맙(YERVOY) 및 트레멜리무맙으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 항-CTLA-4 항체이다. 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 BMS-986016 및 LAG525로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 항-LAG-3 항체이다. 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 MEDI6469, MEDI0562, 및 MOXR0916으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 항-OX-40 항체이다. 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 PF-05082566으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 항-4-1BB 항체이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 사이토카인, 아드레노메둘린(AM), 안지오포이에틴(Ang), BMP, BDNF, EGF, 에리쓰로포이에틴(EPO), FGF, GDNF, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 줄기세포 인자(SCF), GDF9, HGF, HDGF, IGF, 이동-자극 인자, 마이오스타틴(GDF-8), NGF, 뉴로트로핀, PDGF, 트롬보포이에틴, TGF-α, TGF-β, TNF-α, VEGF, PlGF, 감마-IFN, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, 및 IL-18로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 생물 분자와 함께 투여할 수 있다.
사이토카인
일부의 경우에, 사이토카인은 적어도 하나의 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인, 종양괴사인자, 또는 그의 변이체 또는 조합을 포함한다. 일부의 경우에, 사이토카인은 인터류킨이다. 일부의 경우에 인터류킨은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33 및 그의 기능성 변이체 및 단편 중 적어도 하나이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 막 결합되거나 분비될 수 있다. 구현예에서, 사이토카인은 용해성 IL-15, 용해성 IL-15/IL-15Rα 복합체(예를 들어 ALT-803)이다. 몇몇 경우에, 인터류킨은 막 결합된 IL-15(mbIL-15) 또는 IL-15와 IL-15Rα와의 융합을 포함할 수 있다. 일부의 경우에, mbIL-15는 본원에 기재된 변형된 면역 효과기 세포와 공동-발현될 수 있는 막-결합된 키메라 IL-15이다. 일부 구현예에서, mbIL-15는 완전길이 IL-15Rα, 그의 단편 또는 변이체와 인프레임 융합된, 완전길이 IL-15(예를 들어 고유 IL-15 폴리펩티드) 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부의 경우에, IL-15는 링커를 통해 IL-15Rα에 간접적으로 연결된다. 일부의 경우에, mbIL-15는 문헌[Hurton et al., "Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells," PNAS 2016]에 기재된 바와 같다. 일부의 경우에, 사이토카인은 CAR과 동일한 면역 효과기 세포에서 발현된다.
일부 구현예에서, mbIL-15는 본원에 기재된 바와 같은 세포 태그, 예를 들어 HER1t, HER-1t-1, CD20t-1 또는 CD20과 함께 발현된다. mbIL-15는 HER1t, HER-1t-1, CD20t-1 또는 CD20과 인프레임 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, mbIL-15는 유전자 전사를 위해 유도성 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 하나의 태양에서, 유도성 프로모터는 유전자 스위치 리간드 유도성 프로모터일 수 있다. 일부의 경우에, 유도성 프로모터는 소분자 리간드-유도성 2 폴리펩티드 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치, 예를 들어 RHEOSWITCH® 유전자 스위치일 수 있다.
또 다른 태양에서, 인터류킨은 IL-12를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-12는 단쇄 IL-12(scIL-12), 프로테아제 민감성 IL-12, 탈안정화된 IL-12, 막 결합된 IL-12, 삽입된 IL-12이다. 일부의 경우에, IL-12 변이체는 WO2015/095249, WO2016/048903, WO2017/062953(이들은 모두 내용 전체가 본원에 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 상술한 사이토카인은 유전자 전사를 위해 유도성 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 하나의 태양에서, 유도성 프로모터는 유전자 스위치 리간드 유도성 프로모터일 수 있다. 일부의 경우에, 유도성 프로모터는 소분자 리간드-유도성 2 폴리펩티드 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치, 예를 들어 RHEOSWITCH® 유전자 스위치일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질은 유전자 전사를 위해 유도성 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 하나의 태양에서, 유도성 프로모터는 유전자 스위치 리간드 유도성 프로모터일 수 있다. 일부의 경우에, 유도성 프로모터는 소분자 리간드-유도성 2 폴리펩티드 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치, 예를 들어 RHEOSWITCH® 유전자 스위치일 수 있다.
유전자 스위치
본원은 유전자 스위치 폴리펩티드, 리간드-유도성 유전자 스위치 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법 및 시스템을 제공한다. "유전자 스위치"란 용어는 프로모터와 연관된 반응 요소, 및 예를 들어 엑디손 수용체(EcR) 기반 시스템(하나 이상의 리간드의 존재하에서 반응 요소 및 프로모터가 통합된 유전자의 발현을 조절한다)의 조합을 지칭한다. 엄격하게 조절되는 유도성 유전자 발현 시스템 또는 유전자 스위치가 다양한 용도, 예를 들어 유전자 요법, 세포에서 단백질의 대규모 생산, 세포 기반 신속 대량처리 선별 분석, 기능성 유전체학 및 트랜스제닉 식물 및 동물에서 특성의 조절에 유용하다. 상기와 같은 유도성 유전자 발현 시스템은 리간드 유도성 이종 유전자 발현 시스템을 포함할 수 있다.
EcR-기반 유전자 스위치의 초기 버전은 드로소필라 멜라노가스터 EcR(DmEcR) 및 무스 무스쿨루스 RXR(MmRXR) 폴리펩티드를 사용하였으며 이들 수용체는 스테로이드, 포나스테론 A의 존재하에서 포유동물 세포주 및 트랜스제닉 마우스에서 리포터 유전자를 전사촉진하는 것으로 나타났다(Christopherson et al., 1992; No et al., 1996). 이후에, 셔 등(Suhr et al., 1998)은 비-스테로이드성 엑디손 작용물질, 테부페노지드가 외인성 이종이량체 상대의 부재하에 봄빅스 모리 EcR(BmEcR)을 통해 포유동물 세포에서 리포터 유전자의 높은 수준의 전사촉진을 유도함을 보였다.
국제특허 출원 PCT/US97/05330(WO 97/38117) 및 PCT/US99/08381 (WO99/58155)는 외인성 유전자 및 엑디손 반응 요소를 포함하는 DNA 구조물을, 상기에 대한 리간드의 부재하에서 및 임의로 침묵 상대로서 작용할 수 있는 수용체의 존재하에서 엑디손 반응 요소에 결합하여 유전자 발현을 유도하는 엑디손 수용체를 포함하는 제2 DNA 구조물에 의해 활성화시키는, 외인성 유전자의 발현을 조절하는 방법을 개시한다. 상기 예에서, 엑디손 수용체는 드로소필라 멜라노가스터로부터 단리되었다. 전형적으로, 상기와 같은 시스템은 최적의 활성화를 제공하기 위해 침묵 상대, 바람직하게는 레티노이드 X 수용체(RXR)의 존재를 요한다. 포유동물 세포에서, 곤충 엑디손 수용체(EcR)는 포유동물 레티노이드 X 수용체(RXR)와 이종이량체화할 수 있으며 이에 의해 리간드 의존적인 방식으로 표적 유전자 또는 이종 유전자의 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 국제특허 출원 PCT/US98/14215(WO 99/02683)는 누에나방 봄빅스 모리로부터 단리된 엑디손 수용체가 외인성 이량체 상대에 대한 필요 없이 포유동물 시스템에서 기능성임을 개시한다.
미국특허 제 6,265,173 호는 수용체의 스테로이드/갑상선 상과의 다양한 구성원을 적어도 유전자 발현 시스템에 사용하기 위해 초기문 수용체(USP)의 이량체화 도메인을 포함하는 드로소필라 멜라노가스터 USP 또는 그의 단편과 병용할 수 있음을 개시한다. 미국특허 제 5,880,333 호는 전사촉진 도메인 및 DNA 결합 도메인이 2개의 상이한 하이브리드 단백질상에 위치하는, 식물에 사용되는 드로소필라 멜라노가스터 EcR 및 초기문(USP) 이종이량체 시스템을 개시한다. 각각의 이들 경우에, 전사촉진 도메인 및 DNA 결합 도메인(국제특허 출원 PCT/US98/14215에서와 같은 고유 EcR로서, 또는 국제특허 출원 PCT/US97/05330에서와 같은 변형된 EcR로서)은 단일 분자내에 통합되었으며, 다른 이종이량체성 상대 USP 또는 RXR은 고유의 상태로 사용된다.
국제특허 출원 PCT/US01/0905는 엑디손 수용체-기반 유도성 유전자 발현 시스템을 개시하며, 여기에서 전사촉진 및 DNA 결합 도메인은 이들을 2개의 상이한 단백질상에 놓음으로써 서로 분리되어, 리간드 부재하에서 크게 감소된 배경 활성 및 리간드 존재하에서 배경에 대해 현저하게 증가된 활성을 생성시킨다. 이러한 2-하이브리드 시스템은 출원 PCT/US97/05330 및 PCT/US98/14215에 개시된 2개 시스템에 비해 현저하게 개선된 유도성 유전자 발현 조절 시스템이다. 2-하이브리드 시스템은, DNA 결합 도메인이 유전자상의 DNA 결합 부위에 결합할 때 전사촉진 도메인이 프로모터를 보다 유효하게 활성화시키도록 전사 활성화 도메인을 DNA 결합 도메인에 비해 보다 유리한 위치로 가져가는 한 쌍의 상호작용 단백질의 능력을 활용하는 것으로 여겨진다(예를 들어 미국특허 제 5,283,173 호를 참조하시오). 2-하이브리드 유전자 발현 시스템은 2개의 유전자 발현 카세트, 즉 핵 수용체 폴리펩티드에 융합된 DNA 결합 도메인을 암호화하는 첫 번째 및 상이한 핵 수용체 폴리펩티드에 융합된 전사촉진 도메인을 암호화하는 두 번째를 포함한다. 리간드의 존재하에서, 항체와 TGF-β 사이토카인 트랩과의 상호작용을 촉진하여, DNA 결합 도메인 및 전사촉진 도메인의 이량체화를 생성시키는 입체형태적 변화가 유도되는 것으로 여겨진다. DNA 결합 및 전사촉진 도메인은 2개의 상이한 분자상에 존재하므로, 리간드 부재하에서 배경 활성이 크게 감소한다.
2-하이브리드 시스템의 몇몇 변형은 또한, 스테로이드성 리간드, 예를 들어 포나스테론 A("PonA") 또는 뮤리스테론 A("MurA")에 비해, 비-스테로이드성 리간드, 예를 들어 디아실히드라진에 대해 개선된 감도를 제공할 수 있다. 즉, 스테로이드에 비해, 비-스테로이드성 리간드는 보다 낮은 리간드 농도에서 보다 높은 유전자 전사 활성을 제공하였다. 더욱또한, 2-하이브리드 시스템은, 변형되지 않은 RXR이 스위칭 상대로서 사용될 때 발생할 수 있는 RXR의 과발현으로 인한 일부 부작용을 피한다. 바람직한 2-하이브리드 시스템에서, EcR 또는 RXR의 고유 DNA 결합 및 전사촉진 도메인이 제거되며, 결과적으로 상기 하이브리드 분자는 세포 중에 존재하는 다른 스테로이드 호르몬 수용체와 상호작용할 기회가 보다 적고, 이에 의해 부작용이 감소된다.
엑디손 수용체(EcR)는 핵 수용체 상과의 일원이며 하위부류 1, 그룹 H(본원에서 "그룹 H 핵 수용체"라 칭한다)로 분류된다. 각 그룹의 구성원은 E(리간드 결합) 도메인에서 40-60%의 아미노산 일치성을 공유한다(Laudet et al., A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily, 1999; Cell 97: 161-163). 엑디손 수용체 외에, 상기 핵 수용체 하위부류 1, 그룹 H의 다른 구성원은 편재성 수용체(UR), 희귀 수용체 1(OR-1), 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1(NER-1), RXR 상호작용 단백질-15(RIP-15), 간 x 수용체 β(LXRβ), 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질(RLD-1), 간 x 수용체(LXR), 간 x 수용체 α(LXRα), 파르네소이드 x 수용체(FXR), 수용체 상호작용 단백질 14(RIP-14), 및 파르네솔 수용체(HRR-1)를 포함한다.
일부의 경우에, 유도성 프로모터("IP")는 소분자 리간드-유도성 2 폴리펩티드 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치, 예를 들어 Intrexon Corporation's RHEOSWITCH® 유전자 스위치일 수 있다. 일부의 경우에, 유전자 스위치는 비제한적으로 하기에 기재된 시스템 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 엑디손-기반 수용체 성분 중에서 선택될 수 있다: PCT/US2001/009050 (WO 2001/070816); 미국특허 제 7,091,038; 7,776,587; 7,807,417; 8,202,718 호; PCT/US2001/030608 (WO 2002/029075); 미국특허 제 8,105,825; 8,168,426 호; PCT/US52002/005235 (WO 2002/066613); 미국특허 출원 10/468,200(미국특허 공보 20120167239); PCT/US2002/005706(WO 2002/066614); 미국특허 제 7,531,326; 8,236,556; 8,598,409 호; PCT/U52002/005090(WO 2002/066612); 미국특허 제 8,715,959 호(미국특허 공보 20060100416); PCT/US2002/005234(WO 2003/027266); 미국특허 제 7,601,508; 7,829,676; 7,919,269; 8,030,067 호; PCT/U52002/005708 (WO 2002/066615); 미국특허 출원 10/468,192(미국특허 공보 20110212528); PCT/US2002/005026(WO 2003/027289); 미국특허 제 7,563,879; 8,021,878; 8,497,093 호; PCT/US2005/015089(WO 2005/108617); 미국특허 제 7,935,510; 8,076,454 호; PCT/U52008/011270(WO 2009/045370); 미국특허 출원 12/241,018(미국특허 공보 20090136465); PCT/US2008/011563(WO 2009/048560); 미국특허 출원 12/247,738(미국특허 공보 20090123441); PCT/US2009/005510(WO 2010/042189); 미국특허 출원 13/123,129(미국특허 공보 20110268766); PCT/US2011/029682(WO 2011/119773); 미국특허 출원 13/636,473(미국특허 공보 20130195800); PCT/US2012/027515(WO 2012/122025); WO 2018/132494(PCT/US2018/013196); 및 미국특허 제 9,402,919 호; 이들은 각각 내용 전체가 참고로 인용된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "리간드"란 용어는 리간드-활성화된 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치에 적용시 유전자 스위치를 활성화하여 유전자 발현을 자극하는 능력을 갖는(즉 상기 중에 폴리뉴클레오티드(예를 들어 mRNA, miRNA 등) 및/또는 폴리펩티드의 리간드 유도성 발현을 제공하는) 다양한 용해도의 소분자(예를 들어 디아실히드라진 화합물)이다. 상기와 같은 리간드의 예는 비제한적으로 하기에 기재된 것들을 포함한다: WO 2004/072254 (PCT/US2004/003775); WO 2004/005478 (PCT/US2003/021149); WO 2005/017126 (PCT/US2004/005149); WO 2004/078924 (PCT/US2004/005912); WO 2008/153801 (PCT/US2008/006757); WO 2009/114201 (PCT/US2009/001639); WO 2013/036758 (PCT/US2012/054141); WO 2014/144380 (PCT/US2014/028768); 및 WO 2016/044390 (PCT/US2015/050375); 이들은 각각 내용 전체가 참고로 인용된다.
리간드의 예는 또한, 비제한적으로 엑디스테로이드, 예를 들어 엑디손, 20-하이드록시엑디손, 포나스테론 A, 뮤리스테론 A 등, 9-시스-레티노산, 레티노산의 합성 유사체, N,N'-디아실히드라진, 예를 들어 미국특허 제 6,258,603; 6,013,836; 5,117,057; 5,530,028; 5,378,726; 7,304,161; 7,851,220; 8,748,125; 9,272,986; 7,456,315; 7,563,928; 8,524,948; 9,102,648; 9,169,210; 9,255,273; 및, 9,359,289 호에 개시된 것들; 미국특허 제 8,669,072; 및 8,895,306 호에 기재된 바와 같은 옥사디아졸린; 디벤조일알킬 시아노히드라진, 예를 들어 유럽 출원 제 2,461,809 호에 개시된 바와 같은 것들; N-알킬-N,N'-디아로일히드라진, 예를 들어 미국특허 제 5,225,443 호에 개시된 것들; N-아실-N-알킬카보닐히드라진, 예를 들어 유럽 출원 제 234,994 호에 개시된 것들; N-아로일-N-알킬-N'-아로일히드라진, 예를 들어 미국특허 제 4,985,461 호에 개시된 것들; 아미도케톤, 예를 들어 미국특허 제 7,375,093; 8,129,355; 및 9,802,936 호에 기재된 것들(이들은 각각 내용 전체가 참고로 인용된다); 및 3,5-디-3급-부틸-4-하이드록시-N-이소부틸-벤즈아미드, 8-O-아세틸하르파지드, 옥시스테롤, 22(R) 하이드록시콜레스테롤, 24(S) 하이드록시콜레스테롤, 25-에폭시콜레스테롤, T0901317, 5-알파-6-알파-에폭시콜레스테롤-3-설페이트(ECHS), 7-케토콜레스테롤-3-설페이트, 파메솔, 담즙산, 1,1-비포스포네이트 에스테르, 유약 호르몬 III 등을 포함한 다른 유사한 물질을 포함한다. 본 발명에 유용한 디아실히드라진 리간드의 예는 RG-115819(3,5-디메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(2-메틸-3-메톡시벤조일)-히드라지드), RG-115932((R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-3급-부틸-부틸)N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드), 및 RG-115830(3,5-디메틸-벤조산 N-(1-3급-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드)를 포함한다. 예를 들어, WO 2008/153801(PCT/US2008/006757); 및 WO 2013/036758(PCT/US2012/054141)(이들은 모두 내용 전체가 참고로 인용된다)을 참조하시오.
예를 들어, 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치에 대한 리간드를 임의의 적합한 리간드 중에서 선택할 수 있다. 천연 엑디손 또는 엑디손 유사체(예를 들어 20-하이드록시엑디손, 뮤리스테론 A, 포나스테론 A, 포나스테론 B, 포나스테론 C, 26-요오도포나스테론 A, 이노코스테론 또는 26-메실이노코스테론) 및 비-스테로이드성 유도인자를 본 발명의 유전자 스위치에 대한 리간드로서 사용할 수 있다. 미국특허 제 6,379,945 호는 스테로이드성 및 몇몇 비-스테로이드성 유도인자에 반응성인 유전자 스위치로서 작용할 수 있는 헬로이티스 비레센스("HEcR")로부터 단리된 곤충 스테로이드 수용체를 기재한다. 비-스테로이드성 유도인자는 스테로이드 및 비-스테로이드 유도인자 모두에 반응성인 상기 및 다수의 다른 시스템에 대해서, 예를 들어 하기를 포함한 다수의 이유로 인해 스테로이드보다 명백한 장점을 갖는다: 보다 낮은 제조 비용, 대사 안정성, 곤충, 식물 또는 포유동물로부터의 부재, 및 환경적인 허용성. 미국특허 제 6,379,945 호는 엑디손-기반 유전자 스위치에 대한 리간드로서 2개의 디벤조일히드라진, 1,2-디벤조일-1-3급-부틸-히드라진 및 테부페노지드(N-(4-에틸벤조일)-N'-(3,5-디메틸벤조일)-N'-3급-부틸-히드라진)의 유용성을 기재한다. 리간드로서 다른 디벤조일히드라진, 예를 들어 미국특허 제 5,117,057 호에 개시된 것들이 또한 본 발명에 포함된다. 드로소필라 멜라노가스터로부터의 엑디손 수용체에 대한 화학적 리간드로서 테부페노지드의 사용이 또한 미국특허 제 6,147,282 호에 개시되어 있다. 엑디손 리간드의 추가의 비제한적인 예는 3,5-디-3급-부틸-4-하이드록시-N-이소부틸-벤즈아미드, 8-O-아세틸하르파지드, 1,2-디아실 히드라진, N'-치환된-N,N'-이치환된 히드라진, 디벤조일알킬 시아노히드라진, N-치환된-N-알킬-N,N-디아로일 히드라진, N-치환된-N-아실-N-알킬, 카보닐 히드라진 또는 N-아로일-N'-알킬N'-아로일 히드라진이다(미국특허 제 6,723,531 호를 참조하시오).
하나의 구현예에서, 엑디손-기반 유전자 스위치 시스템에 대한 리간드는 디아실히드라진 리간드 또는 키랄 디아실히드라진 리간드이다. 유전자 스위치 시스템에 사용되는 리간드는 하기 화학식 I의 화합물; 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물, 결정성 형태 또는 비결정성 형태일 수 있다:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기에서, A는 알콕시, 아릴알킬옥시 또는 아릴옥시이고; B는 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고; R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 알킬, 아릴알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 임의로 치환된 사이클로알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 헤테로사이클로, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이다.
또 다른 구현예에서, 리간드는 하기 화학식 II의 에난티오머 풍부 화합물; 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물, 결정성 형태 또는 비결정성 형태일 수 있다:
[화학식 II]
Figure pct00002
상기에서, A는 알콕시, 아릴알킬옥시, 아릴옥시, 아릴알킬, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고; B는 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고; R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 알킬, 아릴알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 임의로 치환된 사이클로알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 헤테로사이클로, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이나; 단 R1은 R2와 동일하지 않고; 여기에서 비대칭 탄소 원자 함유 R1 및 R2의 절대 배열은 우세하게는 S이다.
몇몇 구현예에서, 리간드는 하기 화학식 III의 에난티오머 풍부 화합물; 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물, 결정성 형태 또는 비결정성 형태일 수 있다:
[화학식 III]
Figure pct00003
상기에서, A는 알콕시, 아릴알킬옥시, 아릴옥시, 아릴알킬, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고; B는 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고; R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 알킬, 아릴알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 임의로 치환된 사이클로알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 헤테로사이클로, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이나; 단 R1은 R2와 동일하지 않고; 여기에서 비대칭 탄소 원자 함유 R1 및 R2의 절대 배열은 우세하게는 R이다.
하나의 구현예에서, 리간드는 적어도 95%의 에난티오머 과잉을 갖는 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-3급부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물, 결정성 형태 또는 비결정성 형태일 수 있다.
화학식 I의 디아실히드라진 리간드 및 화학식 II 또는 III의 키랄 디아실히드라진 리간드는 엑디손-기반 유전자 스위치 시스템에 사용될 때, 본 발명의 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현의 외부적인 일시적 조절 수단을 제공한다. 미국특허 제 8,076,517; 8,884,060; 및 9,598,355 호(이들은 각각 전체가 본원에 참고로 인용된다)를 참조하시오.
본 발명에 사용되는 리간드는 염을 형성할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 "염(들)"이란 용어는 무기 및/또는 유기산 및 염기와 형성된 산성 및/또는 염기성 염을 나타낸다. 또한, 화학식 I, II 또는 III의 화합물이 염기성 부분 및 산성 부분을 모두 함유하는 경우, 쯔비터이온("내부 염")이 형성될 수 있으며, 이는 본원에 사용되는 바와 같은 "염(들)"이란 용어내에 포함된다. 약학적으로 허용 가능한(즉 무독성, 생리학적으로 허용가능한) 염이, 다른 염도 또한 유용하지만, 예를 들어 제조 중 사용될 수 있는 단리 또는 정제 단계에 사용된다. 화학식 I, II 또는 III의 화합물의 염을, 예를 들어 화합물을 일정량, 예를 들어 당량의 산 또는 염기와, 매질, 예를 들어 염이 침전되는 매질 또는 수성 매질 중에서 반응시킴으로써 형성시킨 다음 동결건조시킬 수 있다.
염기성 부분을 함유하는 리간드는 다양한 유기 및 무기산과 염을 형성할 수 있다. 예시적인 산부가염은 아세테이트(예를 들어 아세트산 또는 트리할로아세트산, 예를 들어 트리플루오로아세트산과 형성된 염), 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 비설페이트, 보레이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 퓨마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로클로라이드(염산과 형성됨), 하이드로브로마이드(브롬화 수소와 형성됨), 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말리에이트(말레산과 형성됨), 메탄설포네이트(메탄설폰산과 형성됨), 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 숙시네이트, 설페이트(예를 들어 황산과 형성된 염), 설포네이트(예를 들어 본원에서 언급된 것들), 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 예를 들어 토실레이트, 운데카노에이트 등을 포함한다.
산성 부분을 함유하는 리간드는 다양한 유기 및 무기 염기와 염을 형성할 수 있다. 예시적인 염기성 염은 암모늄염, 알칼리 금속염, 예를 들어 나트륨, 리튬 및 칼륨염, 알칼리 토금속염, 예를 들어 칼슘 및 마그네슘염, 유기염기(예를 들어 유기 아민)과의 염, 예를 들어 벤자틴, 디사이클로헥실아민, 하이드라바민(N,N-비스(데하이드로아비에틸)에틸렌디아민과 형성된), N-메틸-D-글루카민, N-메틸-D-글루카미드, t-부틸 아민, 및 아미노산, 예를 들어 아르기닌, 리신 등과의 염을 포함한다.
유도성 유전자 발현 시스템에 대한 리간드의 비제한적인 예는 또한 FK506 결합 도메인을 사용하는 것을 포함하며, FK506, 사이클로스포린 A 또는 라파마이신이다. FK506, 라파마이신 및 그의 유사체는 미국특허 제 6,649,595; 6,187,757; 7,276,498; 및 7,273,874 호에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 유도성 유전자 발현을 위한 디아실히드라진 리간드를 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 120 ㎎의 1일 단위 용량으로 투여한다. 일부 구현예에서, 디아실히드라진 리간드를 약 5 ㎎의 1일 단위 용량으로 투여한다. 일부 구현예에서, 디아실히드라진 리간드를 약 10㎎의 1일 단위 용량으로 투여한다. 일부 구현예에서, 디아실히드라진 리간드를 약 15㎎의 1일 단위 용량으로 투여한다. 일부 구현예에서, 디아실히드라진 리간드를 약 20㎎의 1일 단위 용량으로 투여한다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 치료제의 병용 요법은 상이한 작용 기전에 의해 작용하는 작용제를 사용할 수 있지만, 필요한 것은 아니다. 상이한 작용 기전을 갖는 작용제를 사용하는 병용 요법은 부가적인 또는 상승작용적인 효과를 생성시킬 수 있다. 병용 요법은 단일요법에 사용되는 경우보다 더 낮은 각각의 작용제의 용량을 허용하며, 이에 의해 독성 부작용을 감소시키고/시키거나 작용제(들)의 치료 지수를 증가시킬 수 있다. 병용 요법은 내성 암세포가 발생할 가능성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 병용 요법은 면역 반응에 영향을 미치는(예를 들어 반응을 증대 또는 활성화시키는) 치료제 및 종양/암세포에 영향을 미치는(예를 들어 억제하거나 사멸시키는) 치료제를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 방법 또는 치료는 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 투여 외에, 적어도 하나의 추가적인 치료제의 투여를 추가로 포함한다. 추가적인 치료제를 작용제 투여 전에, 상기 투여와 동시에, 및/또는 상기 투여에 후속적으로 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 치료제는 1, 2, 3 또는 그 이상의 추가적인 치료제를 포함한다.
본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체와 함께 투여될 수 있는 치료제는 화학요법제를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 방법 또는 치료는 화학요법제와 함께 또는 화학요법제의 칵테일과 함께 본원에 기재된 작용제의 투여를 수반한다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체와 함께 하나 이상의 항신생물제, 예를 들어 시스플라틴, 카페시타빈, 또는 5-플루오로우라실을 추가로 포함할 수 있다. 작용제에 의한 치료는 화학요법제의 투여 전, 상기 투여와 동시에, 또는 상기 투여에 후속적으로 발생할 수 있다. 병행 투여는 단일 약학 제형 또는 별도의 제형을 사용하는 공-투여, 또는 어느 한 순서로, 그러나 일반적으로는 모든 활성제가 동시에 그의 생물학적 활성을 발휘할 수 있도록 하는 기간내의 연속적인 투여를 포함할 수 있다. 상기와 같은 화학요법제에 대한 제조 및 투여 스케줄을 제조사의 지시에 따라 또는 숙련가에 의해 경험상 결정된 바와 같이 사용할 수 있다. 상기와 같은 화학요법에 대한 제조 및 투여 스케줄은 또한 문헌[The Chemotherapy Source Book, 4th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA]에 기재되어 있다.
유용한 부류의 화학요법제는 예를 들어 항-튜불린제, 아우리스타틴, DNA 작은 홈 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제(예를 들어 백금 착체, 예를 들어 시스플라틴, 모노(백금), 비스(백금) 및 트리-핵 백금 착체 및 카르보플라틴), 안트라사이클린, 항생제, 항-폴레이트, 대사길항제, 화학요법 감작제, 듀오카마이신, 에토포시드, 불소화된 피리미딘, 이오노포어, 렉시트로프신, 니트로소우레아, 플라티놀, 퓨린 대사길항제, 퓨로마이신, 방사선 감작제, 스테로이드, 탁산, 국소이성화효소 억제제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제2 치료제는 알킬화제, 대사길항제, 항생제, 국소이성화효소 억제제, 또는 혈관형성 억제제이다.
본원에 제공된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 단독으로 또는 통상적인 치료 섭생, 예를 들어 수술, 방사선조사, 화학요법 및/또는 골수 이식(자기유래, 동계, 동종이계 또는 관련되지 않은)과 함께 사용할 수 있다. 일련의 종양 항원이, 예를 들어 대부분의 암 환자에서 유용할 수 있다.
키메라 수용체와 병용되는 융합 단백질
일부 구현예에서, 융합 단백질을 추가적인 치료제와 병용 요법으로서 투여한다. 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 키메라 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체 또는 조작된 T-세포 수용체를 포함한다. 예를 들어, 치료는 융합 단백질과 키메라 수용체와의 동시 투여를 수반할 수 있다. 하나의 구현예에서, 치료는 융합 단백질과 키메라 수용체를 포함하는 변형된 효과기 세포와의 공-투여를 수반할 수 있다. 하나의 구현예에서, 치료는 키메라 수용체를 포함하는 변형된 효과기 세포의 투여에 이은 융합 단백질 투여의 연속적인 투여를 수반할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 치료는 융합 단백질의 투여에 이은 키메라 수용체를 포함하는 변형된 효과기 세포 투여의 연속적인 투여를 수반할 수 있다. 하나의 태양에서, 투여 사이에 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 또는 24시간의 지체가 있을 수 있다. 또 다른 태양에서, 투여 사이에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 75, 90일 이상이 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 효과기 세포는 T 세포 및/또는 자연살해 세포를 포함하는 변형된 면역 세포이다. T 세포 또는 T 림프구는 세포-매개된 면역성에 관련된 백혈구의 하위유형이다. 예시적인 T 세포는 T 헬퍼 세포, 세포독성 T 세포, TH17 세포, 줄기 기억 T 세포(TSCM), 미경험 T 세포, 기억 T 세포, 효과기 T 세포, 조절성 T 세포, 또는 자연살해 T 세포를 포함한다. 몇몇 태양에서, 본원에 기재된 구현예는 세포를 키메라 수용체를 암호화하는 DNA(또는 RNA) 구조물을 함유하는 발현 벡터로 형질감염시킴을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포(예를 들어 T-세포, Treg, NK-세포 또는 NK T-세포)의 제조 및/또는 확대를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된, 세포 표면상에서 발현된 키메라 수용체를 포함하는 변형된 효과기 세포를 포함한다. 일부의 경우에, 키메라 수용체는 종양 항원, 예를 들어 종양-관련 항원 또는 종양-특이성 항원의 인식 및 결합을 가능하게 하는 항원 결합 영역을 포함한다. 일부의 경우에, 항원 결합 영역은 항체 또는 결합 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab')3, scFv, sc(Fv)2, dsFv, 디아바디, 미니바디, 및 나노바디 또는 이들의 결합 단편을 포함한다. 일부의 경우에, 항원 결합 영역은 scFv를 포함한다. 일부의 경우에, 키메라 수용체는 scFv(예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR))를 포함한다. 일부의 경우에, 키메라 항원 수용체는 패턴-인식 수용체를 포함한다. 다른 경우에, 키메라 수용체는 조작된 T-세포 수용체(TCR)를 포함한다.
추가로 본원은 사멸 스위치, 선택 마커, 생물마커 또는 이들의 조합으로서 사용하기 위한 세포 태그를 포함하는 면역 효과기 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 세포 태그는 HER1t, HER1t-1, CD20t-1 또는 CD20을 포함한다. 일부의 경우에, 세포 태그는 HER1t를 포함하고, 상기 HER1t는 서열번호 68의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부의 경우에, 세포 태그는 HER1t-1을 포함하고, 상기 HER1t-1은 서열번호 69의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
키메라 항원 수용체(CAR)
키메라 항원 수용체(CAR)는 면역 효과기 세포상에 외인성 특이성을 접목시키는 조작된 수용체이다. 일부의 경우에, CAR은 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인(엑토도메인), 줄기 영역, 막관통 도메인 및 세포내(엔도도메인) 도메인을 포함한다. 일부의 경우에, 세포내 도메인은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부의 경우에, 본원에 기재된 CAR은 항원 결합 도메인, 줄기 영역, 막관통 도메인, 하나 이상의 공동자극 도메인, 및 T-세포 활성화를 위한 신호전달 도메인을 포함한다.
항원 결합 도메인은 단클론 항체의 상보성 결정 영역, 단클론 항체의 가변 영역, 및/또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 상보성 결정 영역(CDR)은, 항원을 보완하고 따라서 특정 항원에 대한 특이성을 수용체에 제공하는 항원 수용체(예를 들어 면역글로불린 및 T-세포 수용체) 단백질의 가변 도메인 중에서 발견되는 짧은 아미노산 서열이다. 항원 수용체의 각각의 폴리펩티드 쇄는 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 함유할 수 있다. 일부의 경우에, 항원 결합 도메인은 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, 또는 scFv를 포함한다. 일부의 경우에, 항원 결합 도메인은 scFv이다. 일부의 경우에, 항원 결합 도메인은 Fab이다. 일부의 경우에, 항원 결합 도메인은 Fab'이다. 일부의 경우에, 항원 결합 도메인은 F(ab')2이다. 일부의 경우에, 항원 결합 도메인은 Fv이다.
일부의 구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 CD19, BCMA, CD44, α-폴레이트 수용체, CAIX, CD30, ROR1, CEA, EGP-2, EGP-40, HER2, HER3, 폴레이트-결합 단백질, GD2, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, 메소텔린, CD22, EGFR, 폴레이트 수용체 α, 뮤신, 예를 들어 MUC-1, MUC-4 또는 MUC-16, MAGE-A1, h5T4, PSMA, TAG-72, EGFR, CD20, EGFRvIII, CD123 또는 VEGF-R2상의 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 MUC16상의 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 CD19 또는 CD33상의 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부의 예에서, 본원에 기재된 CAR은 CD19상의 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부의 경우에, 본원에 기재된 CAR은 CD33상의 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 추가의 구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 HLA-A2, 마이엘린 올리고덴드로사이트 당단백질(MOG), 인자 VIII(FVIII), MAdCAM1, SDF1 또는 콜라겐 II형상의 에피토프에 결합하는 항원 결합 영역 또는 자가항원을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CAR 및 방법은 과증식성 질병, 예를 들어 암, 자가면역 질병의 치료, 또는 감염, 예를 들어 바이러스, 세균 또는 기생충 감염의 치료에 사용될 수 있다. 일부의 태양에서, CAR은 암세포, 자가면역세포 또는 바이러스, 세균 또는 기생충에 의해 감염된 세포에서 상승되는 항원을 표적화한다. 표적화될 수 있는 병원체는 비제한적으로 플라스모디움, 트리파노솜, 아스퍼질러스, 칸디다, A형 간염, B형 간염, C형 간염, HSV, HPV, RSV, EBV, CMV, JC 바이러스, BK 바이러스, 또는 에볼라 병원체를 포함한다. 자가면역 질병은 이식편대 숙주병(graft-versus-host disease), 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 루푸스(lupus), 셀리악병(celiac disease), 크론병(Crohn's disease), 쇼그렌 증후군(Sjogren Syndrome), 류머티스 다발근통(polymyalgia rheumatic), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 시신경 척수염(neuromyelitis optica), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 1형 당뇨병(Type 1 diabetes), 원형 탈모(alopecia areata), 혈관염(vasculitis), 측두동맥염(temporal arteritis), 수포성 유사천포창(bullous pemphigoid), 건선(psoriasis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 또는 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis)을 포함할 수 있다.
CAR에 의해 인식되는 병원체는 본질적으로 임의의 종류의 병원체일 수 있으나, 일부 구현예에서 병원체는 진균, 세균 또는 바이러스이다. 예시적인 바이러스 병원체는 아데노비리다에, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡기 합포체 바이러스(RSV), JC 바이러스, BK 바이러스, HPV, HSV, HHV 과의 바이러스, 간염 과의 바이러스, 피코르나비리다에, 헤르페스비리다에, 헤파드나비리다에, 플라비비리다에, 레트로비리다에, 오쏘믹소비리다에, 파라믹소비리다에, 파포바비리다에, 폴리오마바이러스, 라브도비리다에, 및 토가비리다에 과의 병원체를 포함한다. 예시적인 병원성 바이러스는 두창, 인플루엔자, 유행성이하선염, 홍역, 수두, 에볼라 및 풍진을 일으킨다. 예시적인 병원성 진균은 칸디다, 아스퍼질러스, 크립토코커스, 히스토플라스마, 뉴모시스티스, 및 스타키보트리스를 포함한다. 예시적인 병원성 세균은 스트렙토코커스, 슈도모나스, 시겔라, 캄필로박터, 스타필로코커스, 헬리코박터, 이 콜라이, 리켓차, 바실러스, 보르데텔라, 클라미디아, 스피로헤테스 및 살모넬라를 포함한다. 일부 구현예에서 병원체 수용체 덱틴-1을 사용하여, 진균, 예를 들어 아스퍼질러스의 세균벽상의 탄수화물 구조를 인식하는 CAR을 생성시킬 수 있다. 또 다른 구현예에서, CAR을 바이러스 감염 및 병리를 방해하는 항체 인식 바이러스 결정인자(예를 들어 CMV 및 에볼라로부터의 당단백질)에 기초하여 생성시킬 수 있다.
일부 구현예에서, "줄기" 영역, 또는 "이격자" 또는 "힌지" 영역을 사용하여 항원-결합 도메인을 막관통 도메인에 연결시킨다. 일부의 예에서, "줄기 도메인" 또는 "줄기 영역"은 막관통 도메인을 세포외 도메인, 또는 폴리펩티드 쇄 중의 세포질 도메인에 연결시키는 기능을 하는 임의의 올리고뉴클레오티드- 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기는 항원 인식을 촉진하기 위해 항원-결합 도메인을 상이한 방향으로 향하게 하기에 충분히 가요성이다. 일부의 예에서, 줄기 영역은 IgG1으로부터의 힌지 영역을 포함한다. 대안의 예에서, 줄기 영역은 면역글로불린의 CH2CH3 영역 및 임의로 CD3의 부분을 포함한다. 일부의 경우에, 줄기 영역은 WO/2016/073755에 기재된 바와 같은 CD8α 힌지 영역, IgG4-Fc 12 아미노산 힌지 영역(ESKYGPPCPPCP), 또는 IgG4 힌지 영역을 포함한다.
막관통 도메인은 천연 또는 합성 소스로부터 유래될 수 있다. 소스가 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 적합한 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 막관통 영역(들); 또는 CD28, CD3 입실론, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8알파, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154로부터의 막관통 영역을 포함할 수 있다. 한편으로 막관통 도메인은 합성일 수 있으며, 소수성 잔기, 예를 들어 류신 및 발린을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플릿이 합성 막관통 도메인의 하나 또는 2개의 말단 모두에서 발견된다. 임의로, 일부의 구현예에서 2 내지 10 아미노산 길이의 짧은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 링커가 CAR의 막관통 도메인과 세포질 신호전달 도메인 사이에 연결을 형성시킬 수 있다. 일부의 구현예에서, 링커는 글리신-세린 링커이다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인 또는 CD3ζ 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 막관통 도메인은 CD3ζ 막관통 도메인을 포함한다.
세포내 도메인은 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공동자극 도메인은 비제한적으로 CD8, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), ICOS, DAP10, DAP12, OX40(CD134) 또는 그의 단편 또는 조합을 포함한다. 일부의 예에서, 본원에 기재된 CAR은 CD8, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), ICOS, DAP10, DAP12, OX40(CD134) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상, 또는 2개 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부의 예에서, 본원에 기재된 CAR은 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), ICOS, OX40(CD134) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상, 또는 2개 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부의 예에서, 본원에 기재된 CAR은 CD8, CD28, 4-1BB(CD137) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상, 또는 2개 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부의 예에서, 본원에 기재된 CAR은 CD28, 4-1BB(CD137) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상, 또는 2개 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부의 예에서, 본원에 기재된 CAR은 공동자극 도메인 CD28 및 4-1BB(CD137) 또는 그의 각각의 단편을 포함한다. 일부의 예에서, 본원에 기재된 CAR은 공동자극 도메인 CD28 및 OX40(CD134) 또는 그의 각각의 단편을 포함한다. 일부의 예에서, 본원에 기재된 CAR은 공동자극 도메인 CD8 및 CD28 또는 그의 각각의 단편을 포함한다. 일부의 예에서, 본원에 기재된 CAR은 공동자극 도메인 CD28 또는 그의 단편을 포함한다. 일부의 예에서, 본원에 기재된 CAR은 공동자극 도메인 4-1BB(CD137) 또는 그의 단편을 포함한다. 일부의 예에서, 본원에 기재된 CAR은 공동자극 도메인 OX40(CD134) 또는 그의 단편을 포함한다. 일부의 예에서, 본원에 기재된 CAR은 공동자극 도메인 CD8 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포내 도메인은 T-세포 활성화를 위한 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부의 예에서, T-세포 활성화를 위한 신호전달 도메인은 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 입실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 또는 CD66d로부터 유래된 도메인을 포함한다. 일부의 경우에, T-세포 활성화를 위한 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CAR을, 비제한적으로 본원에 기재된 사이토카인을 포함하는 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 대상체에게 투여한다. 추가의 구현예에서, 본원에 기재된 CAR을 발현하는 면역 효과기 세포는 막-결합된 IL-15("mIL-15 또는 mbIL-15")를 발현한다. 본 발명의 태양에서, mbIL-15는 IL-15와 IL-15Rα간의 융합 단백질을 포함한다. 추가의 구현예에서, mbIL-15는 서열번호 69의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 경우에, CAR 및 사이토카인은 별도의 벡터에서 발현된다. 특정한 경우에, 벡터는 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포손일 수 있다.
CD19-특이성 CAR
CD19는 면역글로불린 상과의 세포 표면 당단백질이며 악성 B-계통 세포에서 우세하게 발견된다. 일부의 예에서, CD19는 또한 고형 종양, 예를 들어 췌장암, 간암 및 전립선암에서 검출되었다.
일부 구현예에서, 본원은 CD19-특이성 CAR을 기재하며, 여기에서 항원 결합 도메인은 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, 또는 scFv를 포함한다. 일부의 예에서, 항원 결합 도메인은 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 FMC63에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부 구현예에서 scFv 및/또는 VH/VL 도메인은 FMC63으로부터 유래된다. FMC63은 일반적으로 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대해 발생한 마우스 단클론 IgG1 항체를 지칭한다(Ling, N. R., el al. (1987). Leucocyte typing III. 302). 일부의 예에서, CD19-특이성 CAR-T 세포는 CD8알파 막관통 도메인 또는 CD3ζ 막관통 도메인 중에서 선택된 막관통 도메인; CD27, CD28, 4-1BB(CD137), ICOS, DAP10, OX40(CD134) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상의 공동자극 도메인; 및 CD3ζ으로부터의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 JCAR014, JCAR015, JCAR017, 또는 19-28z CAR(Juno Therapeutics)에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부 구현예에서, 본원은 CD19-특이성 CAR-T 세포를 기재하며, 여기에서 항원 결합 도메인은 JCAR014, JCAR015, JCAR017, 또는 19-28z CAR(Juno Therapeutics)에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부의 예에서, CD19-특이성 CAR-T 세포는 CD8알파 막관통 도메인 또는 CD3ζ 막관통 도메인 중에서 선택된 막관통 도메인; CD27, CD28, 4-1BB(CD137), ICOS, DAP10, OX40(CD134) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상의 공동자극 도메인; 및 CD3ζ으로부터의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원은 scFv 항원 결합 도메인을 포함하는 CD19-특이성 CAR-T 세포를 기재하며, 항원 결합 도메인은 JCAR014, JCAR015, JCAR017, 또는 19-28z CAR(Juno Therapeutics)에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부의 예에서, CD19-특이성 CAR-T 세포는 CD8알파 막관통 도메인 또는 CD3ζ 막관통 도메인 중에서 선택된 막관통 도메인; CD27, CD28, 4-1BB(CD137), ICOS, DAP10, OX40(CD134) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상의 공동자극 도메인; 및 CD3ζ으로부터의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CD19-특이성 CAR-T 세포는 US20160152723에 기재된 항-CD19 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CD19-특이성 CAR-T 세포는 WO2015/123642에 기재된 항-CD19 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 CD19-특이성 CAR-T 세포는 클론 FMC63으로부터 유래된 항-CD19 scFv를 포함한다(Nicholson et al. Construction and characterisation of a functional CD19 specific single chain Fv fragment for immunotherapy of B lineage leukaemia and lymphoma. Mol. Immunol., 34:1157-1165, 1997).
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 KTE-C19(Kite Pharma, Inc.)에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부 구현예에서, 본원은 CD19-특이성 CAR-T 세포를 기재하며, 여기에서 항원 결합 도메인은 KTE-C19에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부의 예에서, CD19-특이성 CAR-T 세포는 CD8알파 막관통 도메인 또는 CD3ζ 막관통 도메인 중에서 선택된 막관통 도메인; CD27, CD28, 4-1BB(CD137), ICOS, DAP10, OX40(CD134) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상의 공동자극 도메인; 및 CD3ζ으로부터의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원은 scFv 항원 결합 도메인을 포함하는 CD19-특이성 CAR-T 세포를 기재하며, 항원 결합 도메인은 KTE-C19에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부 구현예에서, CD19-특이성 CAR-T 세포는 CD8알파 막관통 도메인 또는 CD3ζ 막관통 도메인 중에서 선택된 막관통 도메인; CD27, CD28, 4-1BB(CD137), ICOS, DAP10, OX40(CD134) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상의 공동자극 도메인; 및 CD3ζ으로부터의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CD19-특이성 CAR-T 세포는 WO2015187528에 기재된 항-CD19 항체 또는 그의 단편 또는 유도체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CTL019(Novartis)에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부 구현예에서, 본원은 CD19-특이성 CAR-T 세포를 기재하며, 여기에서 항원 결합 도메인은 CTL019에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부의 예에서, CD19-특이성 CAR-T 세포는 CD8알파 막관통 도메인 또는 CD3ζ 막관통 도메인 중에서 선택된 막관통 도메인; CD27, CD28, 4-1BB(CD137), ICOS, DAP10, OX40(CD134) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상의 공동자극 도메인; 및 CD3ζ으로부터의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원은 scFv 항원 결합 도메인을 포함하는 CD19-특이성 CAR-T 세포를 기재하며, 항원 결합 도메인은 CTL019에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부의 예에서, CD19-특이성 CAR-T 세포는 CD8알파 막관통 도메인 또는 CD3ζ 막관통 도메인 중에서 선택된 막관통 도메인; CD27, CD28, 4-1BB(CD137), ICOS, DAP10, OX40(CD134) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상의 공동자극 도메인; 및 CD3ζ으로부터의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 UCART19(Cellectis)에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부 구현예에서, 본원은 CD19-특이성 CAR-T 세포를 기재하며, 여기에서 항원 결합 도메인은 UCART19에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부의 예에서, CD19-특이성 CAR-T 세포는 CD8알파 막관통 도메인 또는 CD3ζ 막관통 도메인 중에서 선택된 막관통 도메인; CD27, CD28, 4-1BB(CD137), ICOS, DAP10, OX40(CD134) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상의 공동자극 도메인; 및 CD3ζ으로부터의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원은 scFv 항원 결합 도메인을 포함하는 CD19-특이성 CAR-T 세포를 기재하며, 항원 결합 도메인은 UCART19에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부 구현예에서, CD19-특이성 CAR-T 세포는 CD8알파 막관통 도메인 또는 CD3ζ 막관통 도메인 중에서 선택된 막관통 도메인; CD27, CD28, 4-1BB(CD137), ICOS, DAP10, OX40(CD134) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상의 공동자극 도메인; 및 CD3ζ으로부터의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 BPX-401(Bellicum)에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부 구현예에서, 본원은 CD19-특이성 CAR-T 세포를 기재하며, 여기에서 항원 결합 도메인은 BPX-401에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부의 예에서, CD19-특이성 CAR-T 세포는 CD8알파 막관통 도메인 또는 CD3ζ 막관통 도메인 중에서 선택된 막관통 도메인; CD27, CD28, 4-1BB(CD137), ICOS, DAP10, OX40(CD134) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상의 공동자극 도메인; 및 CD3ζ으로부터의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원은 scFv 항원 결합 도메인을 포함하는 CD19-특이성 CAR-T 세포를 기재하며, 항원 결합 도메인은 BPX-401에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부의 예에서, CD19-특이성 CAR-T 세포는 CD8알파 막관통 도메인 또는 CD3ζ 막관통 도메인 중에서 선택된 막관통 도메인; CD27, CD28, 4-1BB(CD137), ICOS, DAP10, OX40(CD134) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상의 공동자극 도메인; 및 CD3ζ으로부터의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
일부의 경우에, 항원 결합 도메인은 블리나투모맙(Amgen), 콜툭시맙라브탄신(ImmunoGen Inc./Sanofi-aventis), MOR208(Morphosys AG/Xencor Inc.), MEDI-551(Medimmune), 데닌투주맙마포도틴(Seattle Genetics), B4(또는 DI-B4)(Merck Serono), 타플리투모맙팝톡스(National Cancer Institute), XmAb 5871(Amgen/Xencor, Inc.), MDX-1342(Medarex) 또는 AFM11(Affimed)에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부의 예에서, CD19-특이성 CAR-T 세포는 CD8알파 막관통 도메인 또는 CD3ζ 막관통 도메인 중에서 선택된 막관통 도메인; CD27, CD28, 4-1BB(CD137), ICOS, DAP10, OX40(CD134) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상의 공동자극 도메인; 및 CD3ζ으로부터의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원은 CD19-특이성 CAR-T 세포를 기재하며, 여기에서 항원 결합 도메인은 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, 또는 scFv를 포함한다. 일부의 예에서, 항원 결합 도메인은 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 블리나투모맙(Amgen), 콜툭시맙라브탄신(ImmunoGen Inc./Sanofi-aventis), MOR208(Morphosys AG/Xencor Inc.), MEDI-551(Medimmune), 데닌투주맙마포도틴(Seattle Genetics), B4(또는 DI-B4)(Merck Serono), 타플리투모맙팝톡스(National Cancer Institute), XmAb 5871(Amgen/Xencor, Inc.), MDX-1342(Medarex) 또는 AFM11(Affimed)에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부 구현예에서, CD19-특이성 CAR-T 세포는 CD8알파 막관통 도메인 또는 CD3ζ 막관통 도메인 중에서 선택된 막관통 도메인; CD27, CD28, 4-1BB(CD137), ICOS, DAP10, OX40(CD134) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상의 공동자극 도메인; 및 CD3ζ으로부터의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
일부의 경우에, 본원에 기재된 CD19-특이성 CAR-T 세포는 scFv 항원 결합 도메인을 포함하며, 항원 결합 도메인은 FMC63, 블리나투모맙(Amgen), 콜툭시맙라브탄신(ImmunoGen Inc./Sanofi-aventis), MOR208(Morphosys AG/Xencor Inc.), MEDI-551(Medimmune), 데닌투주맙마포도틴(Seattle Genetics), B4(또는 DI-B4)(Merck Serono), 타플리투모맙팝톡스(National Cancer Institute), XmAb 5871(Amgen/Xencor, Inc.), MDX-1342(Medarex) 또는 AFM11(Affimed)에 의해 또한 인식되는 CD19상의 에피토프를 인식한다. 일부 구현예에서, CD19-특이성 CAR-T 세포는 CD8알파 막관통 도메인 또는 CD3ζ 막관통 도메인 중에서 선택된 막관통 도메인; CD27, CD28, 4-1BB(CD137), ICOS, DAP10, OX40(CD134) 또는 그의 단편 또는 조합 중에서 선택된 하나 이상의 공동자극 도메인; 및 CD3ζ으로부터의 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
CD33-특이성 CAR
"CD33"은 67 kDa 단일 통과 막관통 당단백질이며 시알산-결합 면역글로불린-유사 렉틴(Siglecs) 상과의 일원이다. CD33은 시알산 결합을 담당하는 V-세트 Ig-유사 도메인 및 그의 세포외 도메인 중의 C2-세트 Ig-유사 도메인을 특징으로 한다. CD33 mRNA의 대안의 이어맞추기는 V-세트 Ig-유사 도메인뿐만 아니라 V- 및 C2-세트 Ig-유사 도메인을 연결하는 디설파이드 결합이 없는 보다 짧은 동형(CD33m)을 유도한다. 건강한 대상체에서, CD33은 정상적인 다능성 골수 전구체, 단분화능 콜로니-형성 세포, 단핵세포 및 성숙 과립구상에서 발견되는 골수 분화 항원으로서 주로 발현된다. CD33은 골수성 백혈병 세포의 80%를 초과하는 세포상에서 발현되지만 정상적인 조혈모세포 또는 성숙한 과립구상에서는 발현되지 않는다(Andrews, R. et al., The L4F3 antigen is expressed by unipotent and multipotent colony-forming cells but not by their precursors, Blood, 68(5):1030-5 (1986)). CD33은 악성 골수세포, 활성화된 T 세포 및 활성화된 NK 세포상에서 발현되는 것으로 보고되었으며 적어도 AML 환자의 대다수에서 아세포의 부분집합상에서 발견된다(Pollard, J. et al., Correlation of CD33 expression level with disease characteristics and response to gemtuzumab ozogamicin containing chemotherapy in childhood AML, Blood, 119(16):3705-11 (2012)). AML 아세포상에서의 광범위 발현 외에, CD33은 AML에 근원하는 줄기세포상에서 발현될 수 있다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR의 항원 결합 부분은 CD33(CD33 CAR)에 특이적이다. CD33-특이적인 CAR은 세포 표면상에서 발현시 인간 CD33에 대한 T 세포의 특이성을 재유도한다. 구현예에서, 항원 결합 도메인은 가요성 링커, 예를 들어 글리신-세린 링커 또는 휘틀로우(Whitlow) 링커에 의해 연결된 표적 항원 특이성 단클론 항-CD33 항체의 가변 도메인 경쇄(VL) 및 가변 도메인 중쇄(VH)를 포함하는 단쇄 항체 단편(scFv)을 포함한다. 구현예에서, scFv는 M195, m2H12, DRB2, 및/또는 My9-6이다. 구현예에서, scFv는 인간화된다, 예를 들어 hM195이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부분은 예를 들어 N에서부터 C말단으로 직접 연결되는 VH 및 VL, VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH를 포함할 수 있다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 35(hM195 VL)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 36(hM195 VH)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 37(M2H12 VH)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 38(M2H12 VL)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 39(DRB2 VH)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 40(DRB2 VL)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 41(My9-6 VH)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 42(My9-6 VL)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
MUC16-특이성 CAR
MUC16은 CA-125로서 또한 공지된 큰 탄수화물 항원이다. MUC16은 인간 염색체 19상에 위치한 MUC16 유전자에 의해 암호화된다. MUC16은 3 도메인을 포함하는 고도로 글리코실화된 다중-도메인 I형 막관통 단백질이다. C-말단 도메인은 자가단백질분해 활성을 갖는 다수의 세포외 SEA(성게 정자 단백질, 엔테로키나제, 및 아그린)를 함유한다. SEA는 막관통(TM) 도메인에 근접한 2개의 단백질분해 부위를 갖는다. CA-125라 칭하는 큰 절단된 도메인이 산성 pH에서 순환내로 방출된다. CA-125는 난소암에 대한 질병 생물마커로서 통상적으로 사용된다. 고도로 보존된 절두된 세포외 막이 MUC16엑토 도메인이라 칭하는 단백질 도메인을 속박하였다. 종양 세포 표면상에 유지되는 MUC16의 엑토도메인에 특이적으로 결합된 MUC16 항체가 식별되었다. 관심 세포(예를 들어 암세포)에 의한 "MUC16의 과발현"은 대조용 세포(예를 들어 비-암성 세포, 정상 세포 등)에 비해 상기 관심 세포에 의해 발현되는 보다 높은 수준의 MUC16 단백질 및/또는 mRNA를 지칭한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR의 항원 결합 부분은 MUC16에 특이적이다(MUC16 CAR). MUC16-특이성 CAR은 세포 표면상에서 발현시 인간 MUC16에 대한 T 세포의 특이성을 재유도한다. 구현예에서, 항원 결합 도메인은 가요성 링커, 예를 들어 글리신-세린 링커 또는 휘틀로우 링커에 의해 연결된 표적 항원 특이성 단클론 항-MUC16 항체의 가변 도메인 경쇄(VL) 및 가변 도메인 중쇄(VH)를 포함하는 단쇄 항체 단편(scFv)을 포함한다. 구현예에서, scFv는 MUC16-1 scFv(서열번호 43-44), MUC16-2 scFv(서열번호 45-46), MUC16-3 scFv(서열번호 47-48), MUC16-4 scFv(서열번호 49-50), MUC16-5 scFv(서열번호 51-52), MUC16-6 scFv(서열번호 53-54) 또는 MUC16-7 scFv(서열번호 55-56)이다. 구현예에서, scFv는 인간화된다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 43(MUC16-1)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 44(MUC16-1)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 45(MUC16-2)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 46(MUC16-2)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 47(MUC16-3)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 48(MUC16-3)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 49(MUC16-4)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 50(MUC16-4)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 51(MUC16-5)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 52(MUC16-5)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 53(MUC16-5)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 54(MUC16-6)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 55(MUC16-7)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VL 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 56(MUC16-7)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성을 갖는 VH 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 부분을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 부분은 예를 들어 N에서부터 C말단으로 직접 연결되는 VH 및 VL, VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH를 포함할 수 있다.
조작된 T-세포 수용체(TCR)
일부 구현예에서, 키메라 수용체는 조작된 T-세포 수용체를 포함한다. T 세포 수용체(TCR)는 T 세포의 표면상에서 짝을 이루어 이종이량체성 수용체를 형성하는 2개의 쇄(αβ 또는 γδ)로 구성된다. 일부의 예에서, αβ TCR은 신체 중 대부분의 T 세포상에서 발현되며 특정한 MHC-제한된 항원의 인식에 관련되는 것으로 공지되어 있다. 각각의 α 및 β 쇄는 2개의 도메인, 즉 단백질을 세포막에 고정시키고 CD3 신호전달 기구의 불변 서브유닛과 연관되는 불변 도메인(C); 및 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하는 6개의 고리를 통해 항원 인식을 부여하는 가변 도메인(V)으로 구성된다. 일부의 예에서, 각각의 V 도메인은 3개의 CDR; 예를 들어 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하며, 이때 CDR3은 고가변 영역이다. 이들 CDR은 주 조직적합성 복합체(pepMHC)에 의해 암호화된 단백질에 결합된 항원 펩티드간에 형성된 복합체(예를 들어, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA, 또는 HLA-DRB1 복합체)와 상호작용한다. 일부의 예에서, 불변 도메인은 불변 도메인을 가변 도메인에 연결하는 결합 영역을 추가로 포함한다. 일부의 경우에, 베타 쇄는 결합 영역의 부분을 구성하는 짧은 다양성 영역을 추가로 포함한다.
일부의 경우에, 상기와 같은 TCR은 특정한 종양 항원, 예를 들어 NY-ESO, Mage A3, Titin에 반응성이다. 다른 경우에, 상기와 같은 TCR은 환자의 종양내에서 발현된 특정한 네오항원(즉 종양에 의해 발현된 환자-특이성, 체세포, 그다지 밀접하지 않은 돌연변이)에 반응성이다. 일부의 경우에, 조작된 TCR은 친화성-증대될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR을 International Immunogenetics(IMGT) TCR 명명법을 사용하여 기재하며, 상기는 TCR 서열의 IMGT 공개 데이터베이스에 연계된다. 예를 들어, 프레임워크, CDR1, CDR2 및 CDR3 서열에 의해 구분되는 다수 유형의 알파쇄 가변(Vα) 영역 및 다수 유형의 베타쇄 가변(Vβ) 영역이 있을 수 있다. 이와 같이, Vα 유형을 IMGT 명명법에서 특유의 TRAV 번호에 의해 지칭할 수 있다. 예를 들어, "TRAV21"은 특유의 프레임워크 및 CDR1 및 CDR2 서열, 및 부분적으로 TCR마다 보존되는 아미노산 서열에 의해 한정되지만 또한 TCR마다 변하는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 서열을 갖는 TCR Vα 영역을 한정한다. 유사하게, "TRBV5-1"은 특유의 프레임워크 및 CDR1 및 CDR2 서열, 및 단지 부분적으로 한정된 CDR3 서열을 갖는 TCR Vβ 영역을 한정한다.
일부의 경우에, 베타쇄 다양성 영역은 IMGT 명명법에서 약어 TRBD에 의해 지칭된다.
일부의 예에서, IMGT 명명법에 의해 한정된 특유의 서열은 널리 공지되어 있으며 TCR 분야에서 일하는 사용자에게 입수가능하다. 예를 들어, 상기는 IMGT 공개 데이터베이스 및 문헌["T cell Receptor Factsbook", (2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8]에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, αβ 이종이량체성 TCR은 예를 들어 세포질 및 막관통 도메인을 모두 갖는 완전길이 쇄로서 형질감염된다. 일부의 경우에, TCR은 예를 들어 WO 2006/000830에 기재된 바와 같이, 각각의 불변 도메인의 잔기 사이에 도입된 디설파이드 결합을 함유한다.
일부의 예에서, 본원에 기재된 TCR은 단쇄 포맷이다, 예를 들어 WO 2004/033685를 참조하시오. 단쇄 포맷은 Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ, Vα-Cα-L-Vβ-Cβ 유형의 αβ TCR 폴리펩티드를 포함하며, 여기에서 Vα 및 Vβ는 각각 TCR α 및 β 가변 영역이고, Cα 및 Cβ는 각각 TCR α 및 β 불변 영역이고, L은 링커 서열이다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 단쇄 TCR은 WO 2004/033685에 기재된 바와 같이, 각각의 불변 도메인의 잔기 사이에 도입된 디설파이드 결합을 가질 수 있다.
본원에 기재된 TCR은 검출가능한 표지, 치료제 또는 PK 변형 부분과 연관될 수 있다.
진단용의 예시적인 검출가능한 표지는 비제한적으로 형광 표지, 방사성표지, 효소, 핵산 탐침 및 콘트라스트 시약을 포함한다.
본원에 기재된 TCR과 연관될 수 있는 치료제는 면역조절제, 방사성 화합물, 효소(예를 들어 퍼포린) 또는 화학요법제를 포함한다. 독성 효과가 목적하는 장소에서 발휘되게 하기 위해서, 화합물이 조절된 방식으로 방출되도록 독소를 TCR에 연결된 리포솜내에 둘 수 있다. 일부의 경우에, 조절된 방출은 체내 수송 중 손상 효과를 최소화하며 관련된 항원제시세포에 TCR 결합 후에 독소가 최대의 효과를 갖게 한다.
일부 구현예에서, 추가적인 적합한 치료제는 예를 들어:
a. 소분자 세포독성제, 예를 들어 700 달톤 미만의 분자량을 갖는, 포유동물 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 화합물. 상기와 같은 화합물은 또한 세포독성 효과를 가질 수 있는 독성 금속을 함유할 수 있다. 더욱 또한, 상기 소분자 세포독성제는 또한 전구-약물, 즉 생리학적 조건하에서 붕괴되거나 전환되어 세포독성제를 방출하는 화합물을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 상기와 같은 작용제의 예는 시스플라틴, 메이탄신 유도체, 라켈마이신, 칼리키아미신, 도세탁셀, 에토포시드, 젬시타빈, 이포스파미드, 이리노테칸, 멜팔란, 미톡산트론, 소르피머 나트륨포토프린 II, 테모졸로미드, 토포테칸, 트리메트리에이트 글루쿠로네이트, 아우리스타틴 E 빈크리스틴 및 독소루비신;
b. 펩티드 세포독소, 즉 포유동물 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 단백질 또는 그의 단편. 예를 들어, 리신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 세균 외독소 A, DNase 및 RNase;
c. 방사성핵종, 즉 α 또는 β 입자, 또는 γ 선 중 하나 이상의 동시 방출과 함께 붕괴되는 원소의 불안정한 방사성동위원소. 예를 들어, 요오드 131, 레늄 186, 인듐 111, 이트륨 90, 비스무스 210 및 213, 액티늄 225 및 아스타틴 213; 킬레이트제를 사용하여 상기 방사성핵종의 고 친화성 TCR, 또는 그의 다량체에의 회합을 촉진시킬 수 있다;
d. 면역자극제, 즉 면역 반응을 자극하는 면역 효과기 분자. 예를 들어 사이토카인, 예를 들어 IL-2 및 IFN-γ,
e. 초항원 및 그의 돌연변이체;
f. TCR-HLA 융합물;
g. 케모카인, 예를 들어 IL-8, 혈소판 인자 4, 흑색종 성장 자극 단백질 등;
h. 항-T 세포 또는 NK 세포 결정인자 항체(예를 들어 항-CD3, 항-CD28, 또는 항-CD16)를 포함한 항체 또는 그의 단편;
i. 항체 유사 결합 특징을 갖는 대안의 단백질 스캐폴드
j. 보체 활성제; 및
k. 이종발생성 단백질 도메인, 동종이계 단백질 도메인, 바이러스/세균 단백질 도메인, 바이러스/세균 펩티드
를 포함한다.
용량
사용되는 융합 단백질 및 변형된 면역 효과기 세포의 적합한 투여량은 대상체의 연령 및 체중 및 사용되는 특정 약물에 따라 변할 것이다. 융합 단백질 및 변형된 면역 효과기 세포의 투여량 및 치료 섭생을 숙련가에 의해 측정할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 융합 단백질을 주사(예를 들어 피하 또는 정맥내)에 의해, 약 1 내지 30 ㎎/㎏, 예를 들어 약 5 내지 25 ㎎/㎏, 약 10 내지 20 ㎎/㎏, 약 1 내지 5 ㎎/㎏, 또는 약 3 ㎎/㎏의 용량으로 투여한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질을 약 1 ㎎/㎏, 약 3 ㎎/㎏, 약 5 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏, 또는 약 40 ㎎/㎏의 용량으로 투여한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질을 약 1-3 ㎎/㎏, 또는 약 3-10 ㎎/㎏의 용량으로 투여한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질을 약 0.5-2, 2-4, 2-5, 5-15, 또는 5-20 ㎎/㎏의 용량으로 투여한다. 투여 스케줄은 예를 들어 1주일에 1회 내지 2, 3 또는 4주마다 1회로 변할 수 있다. 하나의 구현예에서, 융합 단백질을 2주마다 약 10 내지 20 ㎎/㎏의 용량으로 투여한다. 또 다른 구현예에서, 융합 단백질을 2주마다 1회 약 1 ㎎/㎏, 2주마다 1회 약 3 ㎎/㎏, 2주마다 1회 10 ㎎/㎏, 4주마다 1회 3 ㎎/㎏, 또는 4주마다 1회 5 ㎎/㎏의 용량으로 투여한다.
다른 구현예에서, 융합 단백질을 주사(예를 들어 피하 또는 정맥내)에 의해 약 200 ㎎ 내지 500 ㎎, 예를 들어 약 250 ㎎ 내지 450 ㎎, 약 300 ㎎ 내지 400 ㎎, 약 250 ㎎ 내지 350 ㎎, 약 350 ㎎ 내지 450 ㎎, 또는 약 300 ㎎ 또는 약 400 ㎎의 용량(예를 들어 플랫 용량)으로 투여한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질을 약 200 ㎎, 약 250 ㎎, 약 300 ㎎, 약 350 ㎎, 약 400 ㎎, 약 450 ㎎, 또는 약 500 ㎎의 용량으로 투여한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질을 200 또는 300 ㎎의 용량으로 투여한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질을 약 250-450 ㎎, 또는 약 300-400 ㎎의 용량으로 투여한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질을 약 200-300 ㎎, 250-350 ㎎, 300-400 ㎎, 350-450 ㎎, 또는 400-500 ㎎의 용량으로 투여한다. 투여 스케줄은 예를 들어 1주일에 1회 내지 2, 3, 4, 5 또는 6주마다 1회로 변할 수 있다. 하나의 구현예에서 융합 단백질을 3주마다 1회 또는 4주마다 1회 약 300 ㎎ 내지 400 ㎎의 용량으로 투여한다. 하나의 구현예에서, 융합 단백질을 3주마다 1회 약 300 ㎎의 용량으로 투여한다. 하나의 구현예에서, 융합 단백질을 4주마다 1회 약 400 ㎎의 용량으로 투여한다. 하나의 구현예에서, 융합 단백질을 4주마다 1회 약 300 ㎎의 용량으로 투여한다. 하나의 구현예에서, 융합 단백질을 3주마다 1회 약 400 ㎎의 용량으로 투여한다. 융합 단백질을 1회 이상, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7회 또는 그 이상으로 투여할 수 있다. 하나의 구현예에서, 융합 단백질을 6회 투여한다. 융합 단백질을 CAR-발현 세포, 예를 들어 MUC16, CD33, CD19 또는 BCMA-특이성 CAR 발현 세포 투여후 적어도 5일, 예를 들어 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 20, 25, 30, 35, 또는 40일째에 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질을 CAR-발현 세포, 예를 들어 MUC16 특이성 CAR 발현 세포 또는 CD33 특이성 CAR 발현 세포 투여후 약 8일 또는 약 15일째에 투여할 수 있다.
융합 단백질을 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여할 수 있지만, 다수의 치료학적 용도를 위해서, 바람직한 투여 경로/방식은 정맥내 주사 또는 주입이다. 예를 들어 융합 단백질을 정맥내 주입에 의해, 약 35 내지 440 ㎎/m2, 전형적으로 약 70 내지 310 ㎎/m2, 및 보다 전형적으로 약 110 내지 130 ㎎/m2의 용량에 도달하도록 20 ㎎/분 초과, 예를 들어 20-40 ㎎/분, 및 전형적으로 40 ㎎/분 이상의 속도로 투여할 수 있다. 구현예에서, 융합 단백질을 정맥내 주입에 의해, 약 1 내지 100 ㎎/m2, 바람직하게는 약 5 내지 50 ㎎/m2, 약 7 내지 25 ㎎/m2 및 보다 바람직하게는 약 10 ㎎/m2의 용량에 도달하도록 10 ㎎/분 미만; 바람직하게는 5 ㎎/분 이하의 속도로 투여할 수 있다.
융합 단백질을 정맥내 주입에 의해, 약 35 내지 440 ㎎/m2, 전형적으로 약 70 내지 310 ㎎/m2, 및 보다 전형적으로 약 110 내지 130 ㎎/m2의 용량에 도달하도록 20 ㎎/분 초과, 예를 들어 20-40 ㎎/분, 및 전형적으로 40 ㎎/분 이상의 속도로 투여할 수 있다. 구현예에서, 약 110 내지 130 ㎎/m2의 주입 속도는 약 3 ㎎/㎏의 수준을 성취한다. 구현예에서, 융합 단백질을 정맥내 주입에 의해, 약 1 내지 100 ㎎/m2, 바람직하게는 약 5 내지 50 ㎎/m2, 약 7 내지 25 ㎎/m2 또는 약 10 ㎎/m2의 용량에 도달하도록 10 ㎎/분 미만, 예를 들어 5 ㎎/분 이하의 속도로 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체를 약 30분의 기간에 걸쳐 주입한다.
변형된 효과기 세포 용량
일부 구현예에서, 변형된 효과기 세포의 양을 필요한 대상체에게 투여하며 상기 량은 사이토카인-관련 독성을 유도하는 효능 및 잠재성에 기초하여 결정한다. 일부의 경우에, 변형된 효과기 세포의 양은 약 105 내지 약 109 변형된 효과기 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 변형된 효과기 세포의 양은 약 105 내지 약 108 변형된 효과기 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 변형된 효과기 세포의 양은 약 105 내지 약 107 변형된 효과기 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 변형된 효과기 세포의 양은 약 106 내지 약 109 변형된 효과기 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 변형된 효과기 세포의 양은 약 106 내지 약 108 변형된 효과기 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 변형된 효과기 세포의 양은 약 107 내지 약 109 변형된 효과기 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 변형된 효과기 세포의 양은 약 105 내지 약 106 변형된 효과기 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 변형된 효과기 세포의 양은 약 106 내지 약 107 변형된 효과기 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 변형된 효과기 세포의 양은 약 107 내지 약 108 변형된 효과기 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 변형된 효과기 세포의 양은 약 108 내지 약 109 변형된 효과기 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 변형된 효과기 세포의 양은 약 109 변형된 효과기 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 변형된 효과기 세포의 양은 약 108 변형된 효과기 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 변형된 효과기 세포의 양은 약 107 변형된 효과기 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 변형된 효과기 세포의 양은 약 106 변형된 효과기 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 변형된 효과기 세포의 양은 약 105 변형된 효과기 세포/㎏을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 효과기 세포는 변형된 T 세포이다. 일부의 예에서, 변형된 T 세포는 CAR-T 세포이다. 일부의 경우에, CAR-T 세포의 양은 약 105 내지 약 109 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CAR-T 세포의 양은 약 105 내지 약 108 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CAR-T 세포의 양은 약 105 내지 약 107 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CAR-T 세포의 양은 약 106 내지 약 109 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CAR-T 세포의 양은 약 106 내지 약 108 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CAR-T 세포의 양은 약 107 내지 약 109 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CAR-T 세포의 양은 약 105 내지 약 106 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CAR-T 세포의 양은 약 106 내지 약 107 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CAR-T 세포의 양은 약 107 내지 약 108 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CAR-T 세포의 양은 약 108 내지 약 109 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CAR-T 세포의 양은 약 109 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CAR-T 세포의 양은 약 108 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CAR-T 세포의 양은 약 107 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CAR-T 세포의 양은 약 106 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CAR-T 세포의 양은 약 105 CAR-T 세포/㎏을 포함한다.
일부의 구현예에서, CAR-T 세포는 CD19-특이성 CAR-T 세포이다. 일부의 경우에, CD19-특이성 CAR-T 세포의 양은 약 105 내지 약 109 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CD19-특이성 CAR-T 세포의 양은 약 105 내지 약 108 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CD19-특이성 CAR-T 세포의 양은 약 105 내지 약 107 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CD19-특이성 CAR-T 세포의 양은 약 106 내지 약 109 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CD19-특이성 CAR-T 세포의 양은 약 106 내지 약 108 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CD19-특이성 CAR-T 세포의 양은 약 107 내지 약 109 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CD19-특이성 CAR-T 세포의 양은 약 105 내지 약 106 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CD19-특이성 CAR-T 세포의 양은 약 106 내지 약 107 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CD19-특이성 CAR-T 세포의 양은 약 107 내지 약 108 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CD19-특이성 CAR-T 세포의 양은 약 108 내지 약 109 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CD19-특이성 CAR-T 세포의 양은 약 109 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CD19-특이성 CAR-T 세포의 양은 약 108 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CD19-특이성 CAR-T 세포의 양은 약 107 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CD19-특이성 CAR-T 세포의 양은 약 106 CAR-T 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, CD19-특이성 CAR-T 세포의 양은 약 105 CAR-T 세포/㎏을 포함한다.
일부의 구현예에서, 변형된 T 세포는 조작된 TCR T-세포이다. 일부의 경우에, 조작된 TCR T-세포의 양은 약 105 내지 약 109 TCR 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 조작된 TCR 세포의 양은 약 105 내지 약 108 TCR 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 조작된 TCR 세포의 양은 약 105 내지 약 107 TCR 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 조작된 TCR 세포의 양은 약 106 내지 약 109 TCR 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 조작된 TCR 세포의 양은 약 106 내지 약 108 TCR 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 조작된 TCR 세포의 양은 약 107 내지 약 109 TCR 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 조작된 TCR 세포의 양은 약 105 내지 약 106 TCR 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 조작된 TCR 세포의 양은 약 106 내지 약 107 TCR 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 조작된 TCR 세포의 양은 약 107 내지 약 108 TCR 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 조작된 TCR 세포의 양은 약 108 내지 약 109 TCR 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 조작된 TCR 세포의 양은 약 109 TCR 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 조작된 TCR 세포의 양은 약 108 TCR 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 조작된 TCR 세포의 양은 약 107 TCR 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 조작된 TCR 세포의 양은 약 106 TCR 세포/㎏을 포함한다. 일부의 경우에, 조작된 TCR 세포의 양은 약 105 TCR 세포/㎏을 포함한다.
투여량 값은 경감시키고자 하는 상태의 유형 및 중증도에 따라 변할 수 있음에 유의한다. 임의의 특정한 대상체의 경우, 특정한 투여량 섭생을 개인의 필요성 및 조성물을 투여하거나 조성물의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간에 걸쳐 조절해야 하며 본원에 제시된 투여량 범위는 단지 예시적인 것이고 청구된 조성물의 범위 또는 실행을 제한하고자 하는 것은 아님을 또한 알아야 한다.
융합 단백질의 발현 및 정제 시스템
본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를, 상기 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 발현을 허용하기에 충분한 조건하에서 및 시간량 동안 상기 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 세포로부터 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 이 콜라이에서 발현된 폴리펩티드를 봉입체로부터 리폴딩시킬 수 있다(Hou et al. (1998) Cytokine 10:319-30 참조). 세균 발현 시스템 및 그의 사용 방법은 당해 분야에 주지되어 있다(Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, and Molecular Cloning - A Laboratory Manual - 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001) 참조). 코돈 선택, 적합한 발현 벡터 및 적합한 숙주 세포는 다수의 인자에 따라 변할 수 있으며, 필요에 따라 쉽게 최적화될 수 있다. 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 포유동물 세포 또는 다른 발현 시스템, 예를 들어 비제한적으로 효모, 바큘로바이러스, 및 시험관내 발현 시스템에서 발현시킬 수 있다(Kaszubska et al. (2000) Protein Expression and Purification 18:213-220 참조).
발현에 이어서, 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 정제하거나 단리할 수 있다. 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체에 적용되는 바와 같은 "정제된" 또는 "단리된"이란 용어는 자연적으로 동반되는 성분(예를 들어 단백질 또는 다른 천연의 생물 또는 유기 분자), 예를 들어 다른 단백질, 지질, 및 단백질을 발현하는 원핵생물 중의 핵산으로부터 분리되거나 정제된 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭할 수 있다. 전형적으로, 폴리펩티드는 상기가 샘플 중 전체 단백질의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%(중량 기준)를 구성할 때 정제된다.
본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 샘플 중에 존재하는 다른 성분에 따라 다양한 방식으로 단리하거나 정제할 수 있다. 표준 정제 방법은 전기영동, 분자, 면역학적 및 크로마토그래피 기법, 예를 들어 이온 교환, 소수성, 친화성 및 역상 HPLC 크로마토그래피를 포함한다. 예를 들어, 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 표준 항-융합 단백질 항체 친화성 컬럼을 사용하여 정제할 수 있다. 단백질 농축과 함께 한외여과 및 정용여과 기법이 또한 유용하다. 예를 들어 문헌[Scopes (1994) "Protein Purification, 3rd edition," Springer-Verlag, New York City, N.Y]을 참조하시오. 필요한 정제 정도는 목적하는 용도에 따라 변할 수 있다. 일부의 예에서, 발현된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 정제가 필요하지 않다.
정제된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 수율 또는 순도를 측정하는 방법은 예를 들어 브래드포드 분석, UV 분광분석, 뷰렛 단백질 분석, 로우리 단백질 분석, 아미도 블랙 단백질 분석, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 질량 분광분석(MS), 및 젤 전기영동 방법(예를 들어 단백질 착색제, 예를 들어 쿠마씨 블루 또는 콜로이드 은 착색제)을 포함할 수 있다. 일단 발현, 정제되거나 또는 발현에 이어서 정제된 후에, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 시험관내 또는 생체내 분석, 예를 들어 본원에 기재된 것 중 어느 하나를 사용하여 다수의 목적하는 성질 중 어느 하나에 대해 분석할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를, 예를 들어 PD-1을 억제하고 TGF-β를 포집하는 능력에 대해 분석할 수 있다.
본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 다양한 기법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 예를 들어 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 전사 및 번역 조절 서열(예를 들어 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 정지 서열, 번역 개시 및 정지 서열, 전사 종결자 신호, 폴리아데닐화 신호, 및 인헨서 또는 활성제 서열을 포함할 수 있다)을 함유하는 발현 벡터내에 삽입할 수 있다. 일부 구현예에서, 조절 서열은 프로모터 및 전사 개시 및 정지 서열을 포함할 수 있다. 또한, 발현 벡터는 2개의 상이한 유기체, 예를 들어 발현을 위해서 포유동물 또는 곤충 세포, 및 클로닝 및 증폭을 위해서 원핵생물 숙주에 유지될 수 있도록 하나 초과의 복제 시스템을 포함할 수 있다.
다수의 가능한 벡터 시스템을 포유동물 세포(예를 들어 숙주 세포) 중의 핵산으로부터의 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 발현에 이용할 수 있다. 예를 들어, 하나의 벡터 부류는 목적하는 유전자 서열의 숙주 세포 게놈내로의 통합에 따라 변한다. 안정하게 통합된 DNA를 갖는 세포를, 약물 내성 유전자, 예를 들어 이 콜라이 gpt(Mulligan and Berg (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78:2072) 또는 Tn5 neo(Southern and Berg (1982) Mol Appl Genet 1:327)의 동시 도입에 의해 선택할 수 있다. 선택성 마커 유전자를, 발현하고자 하는 DNA 유전자 서열에 연결하거나, 또는 공-형질감염에 의해 동일한 세포내에 도입시킬 수 있다(Wigler et al. (1979) Cell 16:77). 또 다른 부류의 벡터는 염색체외 플라스미드에 자율 복제 능력을 부여하는 DNA 요소를 사용한다. 상기 벡터는 동물 바이러스, 예를 들어 소 파필로마바이러스(Sarver et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA, 79:7147), 폴리오마 바이러스(Deans et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:1292), 또는 SV40 바이러스(Lusky and Botchan (1981) Nature 293:79)로부터 유래될 수 있다. 발현 벡터를 핵산의 후속 발현에 적합한 방식으로 세포(예를 들어 숙주 세포)내에 도입시킬 수 있다. 도입 방법은 주로 하기에 논의되는 표적화된 세포 유형에 의해 지시된다. 비제한적인 예시적인 방법은 CaPO4 침전, 리포솜 융합, 리포펙션, 일렉트로포레이션, 바이러스 감염, 데스트란-매개된 형질감염, 폴리브렌-매개된 형질감염, 원형질체 융합, 및 직접 미세주입을 포함할 수 있다.
융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 발현에 적합한 숙주 세포는 비제한적으로 효모, 세균, 곤충, 식물, 및 상술한 바와 같이, 포유동물 세포를 포함할 수 있다. 이 콜라이와 같은 세균, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 진균, SF9와 같은 곤충 세포, 포유동물 세포주(예를 들어 인간 세포주)뿐만 아니라 1차 세포주(예를 들어 1차 포유동물 세포)가 중요하다. 일부 구현예에서, 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 또는 적합한 골수종 세포주, 예를 들어 NS0에서 발현시킬 수 있다. 적합한 세포주는 또한 예를 들어 BHK-21(아기 햄스터 신장) 세포; 293(인간 배아 신장) 세포; HMEpC(인간 유방상피 세포); 3T3(마우스 배아 섬유아세포) 세포를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 다양한 세포-기반 발현 시스템에서 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 발현 및 정제, 예를 들어 세균, 포유동물, 곤충, 효모 및 키마도모나스 세포에서 단백질의 생성을 제공한다. 단백질 발현은 구성적이거나 또는 유도인자, 예를 들어 황산 구리, 당, 예를 들어 갈락토스, 메탄올, 메틸아민, 티아민, 테트라사이클린, 또는 IPTG에 의해 유도성일 수 있다. 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 숙주 세포에서 발현시킨 후에, 숙주 세포를 용해시켜, 정제를 위해 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 유리시킨다. 다양한 숙주 세포의 용해 방법은 ["Sample Preparation-Tools for Protein Research" EMD Bioscience] 및 [Current Protocols in Protein Sciences(CPPS)]에 특성화되어 있다. 비제한적인 예시적인 정제 방법은 친화성 크로마토그래피, 예를 들어 히스티딘-태그된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 경우 니켈, 코발트, 또는 아연 친화성 수지를 사용하는 이온-금속 친화성 크로마토그래프이다. 히스티딘-태그된 단백질의 정제 방법은 문헌[Clontech using their Talonx cobalt resin] 및 [Novagen in their pET system manual, 10th edition]에 기재되어 있다. 또 다른 비제한적인 예시적인 정제 전략은 면역-친화성 크로마토그래피에 의한 것이다, 예를 들어 항-myc 항체 접합된 수지를 사용하여, 예를 들어 myc-태그된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 친화성 정제할 수 있다. 세린 프로테아제, 예를 들어 트롬빈 및 엔테로키나제에 의한 효소적 절단은 히스티딘 또는 myc 태그로부터 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 절단 및 방출시켜, 히스티딘-태그 및 myc-태그는 친화성 수지에 부착된 채로 남기면서 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 친화성 수지로부터 방출시킨다.
융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 세포(예를 들어 숙주 세포)에 도입시키고 발현시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 발현 벡터의 상황에서, 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 당해 분야의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 세균, 효모 또는 곤충 세포에 쉽게 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터를 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포내로 전달할 수 있다.
숙주 세포내로 폴리뉴클레오티드의 물리적인 도입 방법은 칼슘 포스페이트 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입, 일렉트로포레이션 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포의 생성 방법은 당해 분야에 주지되어 있다. 예를 들어 문헌[Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001)]을 참조하시오. 구현예에서, 숙주 세포내에 폴리뉴클레오티드의 도입 방법은 칼슘 포스페이트 형질감염 또는 폴리에틸렌이민(PEI) 형질감염이다.
숙주 세포내에 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 생물학적 도입 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터가 포유동물, 예를 들어 인간 세포내 유전자 삽입에 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스 단순 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어 미국특허 제 5,350,674 호 및 5,585,362 호를 참조하시오.
일부 구현예에서, 발현 벡터는 각각의 숙주 세포에서 효율적인 유전자 전사 및 번역에 필요한 5' 상류 및 3' 하류 조절 요소, 예를 들어 프로모터 서열, 리보솜 인식 및 결합 TATA 박스, 및 3' UTR AAUAAA 전사 종결 서열을 가질 수 있다. 발현 벡터는 추가적인 서열, 예를 들어 6X-히스티딘, V5, 티오레독신, 글루타치온-S-트랜스퍼라제, c-Myc, VSV-G, HSV, FLAG, 말토스 결합 펩티드, 금속-결합 펩티드, HA 및 "분비" 신호(Honeybee melittin, .alpha.-factor, PHO, Bip)(이들은 발현된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체에 통합된다)를 가질 수 있다. 또한, 이러한 서열 뒤에 효소 절단 부위가 통합되어 필요하지 않게 된 후 효소 제거를 용이하게 할 수 있다. 이들 추가적인 서열은 융합 단백질 발현, 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제, 숙주 세포질에 대한 재조합 단백질의 증대된 용해도, 및/또는 배양 배지내로, 원핵생물 세균의 주변 세포질, 또는 효모 세포의 스페로플라스트내로 융합 단백질의 분비의 검출에 유용할 수 있다. 융합 단백질의 발현은 숙주 세포에서 구성적이거나, 또는 예를 들어 황산 구리, 당, 예를 들어 갈락토스, 메탄올, 메틸아민, 티아민, 테트라사이클린, 바큘로바이러스에 의한 감염, 및 (이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드) IPTG, 락토스의 안정한 합성 유사체에 의해 유도될 수 있다.
발현 벡터 및 숙주 세포의 비제한적인 예는 이 콜라이 숙주 세포, 예를 들어 BL21, BL21(DE3) 및 AD494(DE3)pLysS, Rosetta(DE3), 및 Origami(DE3)(Novagen)에서의 단백질 발현을 위한 pET 벡터(Novagen), pGEX 벡터(Amersham Pharmacia), 및 pMAL 벡터(New England labs. Inc.); 포유동물 세포주, 예를 들어 CHO, COS, HEK-293, Jurkat 및 MCF-7에서의 발현을 위한 강한 CMV 프로모터-기반 pcDNA.3.1(Invitrogen) 및 pCIneo 벡터(Promega); 포유동물 세포에서 아데노바이러스-매개된 유전자 전달 및 발현을 위한 복제 불능 아데노바이러스 벡터 벡터 pAdeno X, pAd5F35, pLP-Adeno-X-CMV(Clontech), pAd/CMV/V5-DEST, pAd-DEST 벡터(Invitrogen); 포유동물 세포에서 레트로바이러스-매개된 유전자 전달 및 발현을 위한 Retro-XTM 시스템과 함께 사용하기 위한 pLNCX2, pLXSN, 및 pLAPSN 레트로바이러스 벡터; 포유동물 세포에서 렌티바이러스-매개된 유전자 전달 및 발현을 위한 pLenti4V5-DEST.TM., pLenti6/V5-DESTTM, 및 pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen); 포유동물 세포에서 아데노-관련 바이러스-매개된 유전자 전달 및 발현을 위한 아데노바이러스-관련 바이러스 발현 벡터, 예를 들어 pAAV-MCS, pAAV-IRES-hrGFP, 및 pAAV-RC 벡터(Stratagene); 스포도페라 프루기페르다 9(S9) 및 Sfl1 곤충 세포주에서 발현을 위한 BACpak6 바큘로바이러스(Clontech) 및 pFastBacTM-HT(Invitrogen); 드로소필라 슈나이더(Drosophila Schneider) S2 세포에서 발현을 위한 pMT/BiP/V5-His(Invitrogen); 피키아 파스토리스에서 발현을 위한 피키아 발현 벡터 pPICZα, pPICZ, pFLDα 및 pFLD(Invitrogen) 및 피 메타놀리카(P. methanolica)에서 발현을 위한 벡터 pMETα 및 pMET; 효모 사카로마이세스 세레비지아에에서 발현을 위한 pYES2/GS 및 pYD1(Invitrogen) 벡터를 포함할 수 있다. 클라미도모나스 레인하르트티이(Chlamydomonas reinhardtii)에서 대규모 발현 이종 단백질의 최근의 진보가 문헌[Griesbeck C. et. al. 2006 Mol. Biotechnol. 34:213-33 and Fuhrmann M. 2004, Methods Mol Med. 94:191-5]에 기재되어 있다.
세포-기반 발현 시스템 외에, 무세포 발현 시스템이 또한 고려된다. 무세포 발현 시스템은 전통적인 세포-기반 발현 방법에 비해, 단백질 폴딩을 촉진하는 반응 조건의 용이한 변형, 생성물 독성에 대해 감소된 민감성, 및 감소된 반응 부피 및 공정 시간으로 인한 신속 대량처리 전략, 예를 들어 신속 발현 선별 또는 다량의 단백질 생산을 포함한 다수의 장점을 제공한다. 무세포 발현 시스템은 플라스미드 또는 선형 DNA를 사용할 수 있다. 더욱이, 번역 효율의 개선은 반응 혼합물 밀리리터당 1 단백질 밀리그램을 초과하는 수율을 생성시켰다.
하나의 구현예에서, 연속적인 무세포 번역 시스템을 사용하여 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 생성시킬 수 있다. 단백질을 고수율로 생성시킬 수 있는 연속적인 무세포 번역 시스템은 문헌[Spirin A S. et. al., Science 242:1162 (1988)]에 기재되어 있다. 상기 방법은 반응 혼합물 전체를 통해 아미노산, 예를 들어 아데노신 트리포스페이트(ATP) 및 구아노신 트리포스페이트(GTP)를 함유하는 공급 완충제 및 번역된 폴리펩티드 생성물의 연속적인 제거의 연속적인 유동 설계를 사용한다. 시스템은 이 콜라이 용해물을 사용하여 무세포 연속 공급 완충제를 제공한다. 이러한 연속적인 유동 시스템은 원핵생물 및 진핵생물 발현 벡터 모두와 화합성이다. 대규모 무세포 생성은 문헌[Chang G. el. al., Science 310:1950-3 (2005)]에 기재되어 있다.
다른 상업적으로 입수할 수 있는 무세포 발현 시스템은 ExpresswayTM 무세포 발현 시스템(Invitrogen)(상기는 효율적인, 결합된 전사 및 번역 반응에 이 콜라이-기반 시험관내 시스템을 사용하여 튜브 반응 포맷으로 활성 재조합 단백질을 밀리그램 량까지 생성시킨다); 고속 번역 시스템(RTS)(Roche Applied Science)(상기는 이 콜라이-기반 시험관내 시스템을 또한 사용한다); 및 TNT 결합된 망상적혈구 용해물 시스템(Promega)(상기는 토끼 망상적혈구-기반 시험관내 시스템을 사용한다)을 포함한다.
다른 예시적인 생성 방법에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 전적으로 또는 부분적으로 화학적 방법을 사용하여 드노보 생합성할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 성분 아미노산 서열을 고상 기법에 의해 합성하고, 수지로부터 절단하고, 예비 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제시킨 다음 화학적으로 연결하여 목적하는 폴리펩티드를 형성시킬 수 있다. 합성 펩티드의 조성을 아미노산 분석 또는 서열분석에 의해 확인할 수 있다.
샘플 중에 존재하는 내독소의 양(정제 전후 모두)을 검출 및/또는 측정하는 방법은 입수할 수 있는 상업적인 키트에 기반할 수 있다. 예를 들어, 단백질 샘플 중의 내독소의 농도를 QCL-1000 색원성 키트(BioWhittaker), 리물루스 아메보사이트(limulus amebocyte) 용해물(LAL)-기반 키트, 예를 들어 Pyrotell®, Pyrotell®-T, Pyrochrome®, Chromo-LAL, 및 CSE 키트(the Associates of Cape Cod Incorporated로부터 입수할 수 있다)를 사용하여 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 내독소를 다양한 상업적으로 입수할 수 있는 시약, 예를 들어 비제한적으로 ProteoSpinTM 내독소 제거 키트(Norgen Biotek Corporation), Detoxi-Gel 내독소 제거 젤(Thermo Scientific; Pierce Protein Research Products), MiraCLEAN® 내독소 제거 키트(Mirus), 또는 AcrodiscTM-Mustang® E 멤브레인(Pall Corporation)을 사용하여 융합 단백질 제제로부터 제거할 수 있다.
일부 구현예에서, 발현 및 정제에 이어서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 변형시킬 수 있다. 변형은 공유 또는 비-공유 변형일 수 있다. 상기와 같은 변형을, 예를 들어 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 상기 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체에 도입시킬 수 있다. 적합한 변형 부위를 다양한 기준, 예를 들어 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 구조 분석 또는 아미노산 서열 분석 중 어느 하나를 사용하여 선택할 수 있다.
일부 예시적인 생성 방법에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 이종 부분에 접합시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 부분은 예를 들어 이종 폴리펩티드, 치료제(예를 들어 독소 또는 약물), 또는 검출성 표지, 예를 들어 비제한적으로 방사성 표지, 효소 표지, 형광 표지 또는 발광 표지일 수 있다. 적합한 이종 폴리펩티드는 예를 들어 항체 또는 그의 단편 또는 변이체를 정제하는데 사용하기 위한 항원성 태그(예를 들어 FLAG, 폴리히스티딘, 헤마글루티닌(HA), 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST), 또는 말토스-결합 단백질(MBP))을 포함할 수 있다. 이종 폴리펩티드는 또한 진단 또는 검출성 마커로서 유용한 폴리펩티드, 예를 들어 루시페라제, 녹색 형광 단백질(GFP), 또는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT)를 포함할 수 있다. 이종 부분이 폴리펩티드인 경우, 상기 부분을 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체내에 통합시켜, 상기 이종 부분을 포함하는 융합 단백질을 생성시킬 수 있다.
프로모터
"프로모터"는 암호화 서열의 전사를 개시시키는 폴리뉴클레오티드의 영역을 지칭한다. 프로모터는 유전자의 전사 개시 부위 부근에, DNA상의 동일한 가닥 및 상류에(센스 가닥의 5' 영역쪽으로) 위치한다. 일부 프로모터는 세포내 모든 환경에서 활성이므로 구성적인 반면, 다른 것은 특정한 자극, 예를 들어 유도성 프로모터에 반응하여 조절되어 활성으로 된다. 더욱 다른 프로모터는 조직 특이성 또는 활성화된 프로모터, 예를 들어 비제한적으로 T-세포 특이성 프로모터이다.
"프로모터 활성"이란 용어 및 본원에 사용되는 바와 같은 그의 문법적 등가어는 측정 중인 활성을 갖는 프로모터에 작동적으로 연결되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 지칭한다. 프로모터 활성을, 예를 들어 노던 블럿 분석에 의해, 생성된 RNA 전사물의 양을 측정함으로써 직접적으로, 또는 연결된 핵산 서열, 예를 들어 프로모터에 연결된 리포터 핵산 서열에 의해 암호화된 생성물의 양을 측정함으로써 간접적으로 측정할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "유도성 프로모터"는 전사 조절제, 예를 들어 생물 또는 무생물 인자의 존재 또는 부재에 의해 활성으로 유도되는 프로모터를 지칭한다. 유도성 프로모터는 상기에 작동적으로 연결된 유전자의 발현이 유기체 또는 특정 조직 중의 어떤 발생 단계에서 켜지거나 꺼질 수 있기 때문에 유용하다. 유도성 프로모터의 예는 알콜-조절된 프로모터, 테트라사이클린-조절된 프로모터, 스테로이드-조절된 프로모터, 금속-조절된 프로모터, 병인-조절된 프로모터, 온도-조절된 프로모터, 및 빛-조절된 프로모터이다.
적합한 프로모터의 일례는 전초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 상기 프로모터 서열은 작동적으로 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 구동할 수 있는 강한 구성적 프로모터 서열이다. 그러나, 다른 구성적 프로모터 서열, 예를 들어 비제한적으로 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 전초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 예를 들어 비제한적으로 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터를 또한 사용할 수 있다. 더욱이, 본 개시내용은 구성적 프로모터의 용도를 제한하고자 하지 않는다. 유도성 프로모터는 또한 본 개시내용의 부분으로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 발현을 원하는 경우 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 켜거나, 또는 발현을 원하지 않는 경우 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 비제한적으로 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로제스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터를 포함한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터, 조직 특이성 프로모터, 또는 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 소분자 리간드-유도성 2 폴리펩티드 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치이다.
추가적인 프로모터 요소, 예를 들어 인헨서는 전사 개시의 빈도를 조절할 수 있다. 전형적으로, 상기는 개시 부위의 30-110 bp 상류 영역에 위치하지만, 다수의 프로모터가 최근에 개시 부위의 하류에도 또한 기능성 요소를 함유함이 입증되었다. 프로모터 요소 사이의 간격은 흔히 유연하며, 따라서 프로모터 기능이, 요소가 도치되거나 또는 서로에 대해 이동할 때 보존된다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성 감소 시작 전에 50 bp까지 멀리 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별적인 요소는 협력하거나 독립적으로 기능하여 전사를 활성화시킬 수 있는 것으로 볼 수 있다.
리포터
리포터 유전자를 잠재적으로 형질감염된 세포의 식별 및 조절 서열의 기능 평가에 사용할 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는, 숙주 세포 중에 존재하지 않거나 상기 세포에 의해 발현되지 않으며 일부 쉽게 검출가능한 성질, 예를 들어 효소 활성에 의해 발현을 나타내는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현을, 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 암호화하는 폴리펩티드를 숙주 세포내에 도입시킨 후 적합한 시간에 분석한다. 적합한 리포터 유전자는 비제한적으로 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제를 암호화하는 유전자, 또는 녹색 형광 단백질 유전자(예를 들어 Ui-Tei et al., FEBS Letters 479: 79-82 (2000))를 포함할 수 있다. 적합한 발현 시스템은 주지되어 있으며 공지된 기법을 사용하여 제조하거나 또는 상업적으로 수득할 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최고의 발현 수준을 나타내는 최소 5' 측면인접 영역을 갖는 폴리뉴클레오티드가 프로모터로서 식별된다. 상기와 같은 프로모터 영역을 리포터 유전자에 연결할 수 있으며 이를 프로모터-구동된 전사를 조절하는 능력에 대해 작용제를 평가하는데 사용할 수 있다.
변이체
"단편" 또는 "변이체"란 용어는 예를 들어 PD-1 및/또는 TGF-β에 대한, 하나 이상의 결합 부분을 함유하는 본원에 기재된 융합 단백질의 변이체 및 유도체를 지칭한다. 몇몇 구현예에서, 융합 단백질의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질의 아미노산 서열 변이체가 융합 단백질의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선시키기 위해 고려된다. 아미노산 변이체의 예시적인 제조 방법은 비제한적으로, 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열내 적합한 변형의 도입, 또는 펩티드 합성을 포함한다. 상기와 같은 변형은 예를 들어 융합 단백질의 아미노산 서열내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 다양한 도메인에 대해 수행하여 최종 융합 단백질에 도달할 수 있으나, 단 최종 융합 단백질은 목적하는 특징, 예를 들어 PD-1 억제 및 TGF-β 트랩을 가져야 한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 치환 돌연변이유발에 중요한 부위는 CDR 및 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환을 관심 표적-결합 단백질의 가변 도메인에 도입시키고 생성물을 목적하는 활성, 예를 들어 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 항체-의존적인 세포 매개된 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존적인 세포독성(CDC)에 대해 선별할 수 있다. 보존적 및 비-보존적 아미노산 치환이 모두 항체 변이체(예를 들어 PD-1 항체 변이체)의 제조에 고려될 수 있다.
변이형 융합 단백질의 생성을 위한 치환의 또 다른 예는 모 항체 중의 하나 이상의 고가변 영역 잔기의 치환일 수 있다. 이어서, 일반적으로 변이체를 모 항체에 비해 목적하는 성질, 예를 들어 증가된 친화성, 감소된 친화성, 감소된 면역원성, 결합의 증가된 pH 의존성의 개선에 기초하여 선택한다. 예를 들어, 친화성 성숙된 변이형 항체를, 예를 들어 파지 디스플레이-기반 친화성 성숙화 기법, 예를 들어 본원에 기재되고 당해 분야에 공지된 기법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 치환을 모 항체의 고가변 영역(HVR)에서 수행하여 변이체를 생성시킬 수 있으며, 이어서 변이체를 결합 친화성에 기초하여, 즉 친화성 성숙화에 의해 선택한다. 친화성 성숙화의 일부 구현예에서, 다양한 방법(예를 들어 오류빈발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-유도된 돌연변이유발) 중 어느 하나에 의해 성숙화를 위해 선택된 가변 유전자내에 다양성을 도입시킬 수 있다. 이어서 2차 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 이어서 라이브러리를 목적하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체의 식별을 위해 선별할 수 있다. 다양성을 도입시키는 또 다른 방법은 HVR-유도된 접근법을 수반할 수 있으며, 상기에서 다수의 HVR 잔기(예를 들어 한 번에 4-6 잔기)를 무작위화할 수 있다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기를 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 특별히 식별할 수 있다. 치환은 모 항체 서열내 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 부위에서 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질의 단편 또는 변이체는 각각 천연 VL 또는 VH 도메인의 아미노산 서열에 상응하지만, "인간화된", 즉 천연 VL 또는 VH 도메인의 아미노산 서열 중(및 특히 프레임워크 서열 중) 하나 이상의 아미노산 잔기를, 인간으로부터의 통상적인 4-쇄 항체의 VL 또는 VH 도메인 중의 상응하는 위치(들)에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나 이상에 의해 교체시킴으로써 인간화된 아미노산 서열을 갖는 VL 및 VH 도메인을 포함할 수 있다. 이를 당업자에게 명백할 수 있는, 당해 분야에 공지된 방식으로, 예를 들어 본원의 추가의 기재에 기초하여 수행할 수 있다. 상기와 같은 인간화된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체는 그 자체로서 공지된 임의의 적합한 방식으로 수득되며 따라서 이들은 출발 물질로서 천연 VL 및/또는 VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 수득된 폴리펩티드로 엄격하게 제한되지 않음에 유의해야 한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질의 단편 또는 변이체는 각각 천연 VL 또는 VH 도메인의 아미노산 서열에 상응하지만, "카멜화된", 즉 통상적인 4-쇄 항체로부터의 천연 VL 또는 VH 도메인의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 잔기를, 중쇄 항체의 VL 또는 VH 도메인 중의 상응하는 위치(들)에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나 이상에 의해 교체시킴으로써 카멜화된 아미노산 서열을 갖는 VL 및 VH 도메인을 포함할 수 있다. 상기와 같은 "카멜화"를 바람직하게는, VH-VL 계면 및/또는 소위 카멜리다에(Camelidae) 특징 잔기(예를 들어 WO 94/04678 및 Davies and Riechmann(1994 및 1996) 참조)에 형성되고/되거나 존재하는 아미노산 위치에 삽입할 수 있다. 일부 구현예에서 카멜화된 단일 도메인의 생성 또는 설계를 위한 출발 물질 또는 출발점으로서 사용되는 VH 서열은 포유동물, 예를 들어 인간으로부터의 VH 서열, 예를 들어 VH3 서열일 수 있다. 상기와 같은 카멜화된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체는 몇몇 구현예에서 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방식으로 수득되며 따라서 이들은 출발 물질로서 천연 VL 및/또는 VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 수득된 폴리펩티드로 엄격하게 제한되지 않음에 유의해야 한다.
예를 들어, "인간화" 및 "카멜화"는 모두 각각 천연 VL 및/또는 VH 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하고, 이어서 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 코돈을, 새로운 폴리뉴클레오티드 서열이 각각 "인간화된" 또는 "카멜화된" 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 암호화하는 바와 같은 방식으로 변화시킴으로써 수행될 수 있다. 이어서 상기 폴리뉴클레오티드를, 목적하는 결합 능력(예를 들어 PD-1)을 제공하도록 발현시킬 수 있다. 한편으로, 다른 구현예에서, 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체는 VL 및/또는 VH 도메인을 포함하는 천연 항체의 아미노산 서열로부터 공지된 펩티드 합성 기법을 사용하여 드노보 합성된 "인간화된" 또는 "카멜화된" 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체는 각각 VL 및/또는 VH 도메인을 포함하는 천연 항체의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열로부터 공지된 펩티드 합성 기법을 사용하여 드노보 합성된 "인간화된" 또는 "카멜화된" 항체를 포함한다. 각각 본 개시내용의 목적하는 인간화된 또는 카멜화된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 설계하고 이어서 핵산 합성에 공지된 기법을 사용하여 드노보 합성하고, 그 후에 목적하는 항체를 제공하기 위해서, 상기와 같이 수득된 핵산을 공지된 발현 기법을 사용하여 발현시킨다.
예를 들어 VL 또는 VH 도메인에 대한 천연 서열로부터 출발하는, 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 수득하기 위한 다른 적합한 방법 및 기법은 상기 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 제공하기 위해, 하나 이상의 천연 VL 또는 VH 서열 중 하나 이상의 부분(예를 들어 하나 이상의 프레임워크(FR) 서열 및/또는 상보성 결정 영역(CDR) 서열), 및/또는 동종이량체보다 이종이량체의 형성에 유리한 아미노산 치환을 포함하는 하나 이상의 합성 또는 반-합성 서열, 및/또는 CH2 도메인의 천연 서열, 및 CD3 도메인의 천연 서열을 적합한 방식으로 조합함을 포함한다.
항체 조작
일부 구현예에서, 하기와 같이, 최종 항체(예를 들어 PD-1 항체)의 보다 큰 화학 안정성을 제공하기 위해서 노출된 측쇄를 함유하는 몇몇 아미노산을 또 다른 아미노산 잔기로 변화시키는 것이 바람직할 수 있다. 아스파라진의 탈아미드화는 N-G 또는 D-G 서열에서 발생할 수 있으며 폴리펩티드 쇄에 킹크를 도입시키고 그의 안정성을 감소시키는 이소아스파트산 잔기를 생성시킨다(이소아스파트산 효과). 일부 구현예에서, 본 개시내용의 융합 단백질의 항체는 아스파라진 이성화 부위를 함유하지 않는다.
예를 들어, 아스파라진(Asn) 잔기를 Gln 또는 Ala로 변화시켜, 특히 CDR내의 임의의 Asn-Gly 서열에서 이소아스파테이트의 형성 가능성을 감소시킬 수 있다. 유사한 문제가 Asp-Gly 서열에서 발생할 수 있다. Reissner and Aswad (2003) Cell. Mol. Life Sci. 60:1281. 이소아스파테이트 형성은 항체의 그의 표적 항원에의 결합을 약화시키거나 또는 완전히 없앨 수 있다. Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 at 734 참조. 하나의 구현예에서, 아스파라진을 글루타민(Gln)으로 변화시킬 수 있다. 아스파라진(Asn) 또는 글루타민(Gln) 잔기에 인접한 아미노산을 변경시켜 탈아미드화(이는 작은 아미노산이 아스파라진 또는 글루타민에 인접하여 발생할 때 더 큰 비율로 발생한다) 가능성을 감소시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. Bischoff & Kolbe (1994) J. Chromatog. 662:261 참조. 또한, CDR 중 임의의 메티오닌 잔기(전형적으로 용매 노출된 Met)를, 메티오닌 황이 산화(이는 항원 결합 친화성을 감소시킬 수 있으며 최종 항체 제제에서 분자 이종성에 기여할 수 있다)할 가능성을 감소시키기 위해서 Lys, Leu, Ala 또는 Phe로 변화시킬 수 있다. Id. 하나의 구현예에서, 메티오닌을 알라닌(Ala)으로 변화시킬 수 있다. 추가로, 잠재적으로 절단되기 쉬운 Asn-Pro 펩티드 결합을 방지하거나 최소화하기 위해서, CDR에서 발견되는 임의의 Asn-Pro 조합을 Gln-Pro, Ala-Pro 또는 Asn-Ala로 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기와 같은 치환을 갖는 항체를 후속적으로 선별하여, 치환이 인간 PD-L1에 대한 항체의 친화성 또는 특이성, 또는 다른 목적하는 생물학적 활성을 허용가능하지 않은 수준으로 감소시키지 않게 할 수 있다.
본원에 개시된 융합 단백질의 항체를 또한 화학적 부분, 예를 들어 방사성핵종 또는 다른 검출성 표지에 접합시킬 수 있다. 방사성핵종은 99Tc, 90Y, 111In, 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, 11C, 15O, 13N, 18F, 35S, 51Cr, 57To, 226Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 152Eu, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Th, and 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr, 및 56Fe를 포함한다. 형광 또는 화학발광 표지는 형광단, 예를 들어 희토 킬레이트, 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 이소티오시아네이트, 피코에리쓰린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드, 플루오레스카민, 152Eu, 단실, 움벨리페론, 루시페린, 루미날 표지, 이소루미날 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 아미다졸 표지, 아크리디뮴 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 아쿠오린 표지, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 비오틴/아비딘, 스핀 표지 및 안정한 유리 라디칼을 포함할 수 있다.
항체 분자의 다양한 부분에의 접합에 대해 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 하기 문헌에 기재된 방법을 사용할 수 있다: Hunter, et al., (1962) Nature 144:945; David, et al., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219; 및 Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407. 항체 접합 방법은 통상적이며 당해 분야에 매우 충분히 공지되어 있다.
약학 조성물
본 개시내용은 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체 및 그의 담체(예를 들어 약학적으로 허용 가능한 담체)를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 바람직하게는 생리학적으로 허용 가능한(예를 들어 약학적으로 허용 가능한) 조성물이며, 담체, 바람직하게는 생리학적으로(예를 들어 약학적으로) 허용가능한 담체, 및 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함한다. 임의의 적합한 담체는 본 개시내용의 상황내에서 사용될 수 있으며, 상기와 같은 담체는 당해 분야에 주지되어 있다. 담체의 선택은 부분적으로 조성물의 특정 용도(예를 들어 동물에의 투여) 및 조성물 투여에 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 것이다. 이상적으로, 복제-결함 아데노바이러스 벡터의 상황에서, 약학 조성물은 바람직하게는 복제-능력 아데노바이러스가 없다. 약학 조성물은 임의로 멸균성일 수 있다.
적합한 조성물은 산화방지제, 완충제 및 세균발육저지제를 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 등장성 멸균 용액, 및 현탁제, 용해제, 증점제, 안정제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현택액을 포함한다. 조성물은 단위-용량 또는 수회-용량의 밀봉된 용기, 예를 들어 앰풀 및 바이알 중에서 제공될 수 있으며, 사용 직전에 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 수 첨가만을 요하는 동결-건조된(동결건조된) 조건하에 보관될 수 있다. 즉석 용액 및 현탁액을 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조할 수 있다. 바람직하게, 담체는 완충된 염수 용액이다. 일부의 경우에, 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체는, 상기 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 투여에 앞서 손상으로부터 보호하도록 제형화한 조성물의 부분이다. 예를 들어 조성물을, 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 제조, 보관 또는 투여에 사용되는 장치, 예를 들어 유리제품, 주사기 또는 바늘상에서 상기 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 손실을 줄이도록 제형화할 수 있다. 조성물을 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 광 민감성 및/또는 온도 민감성을 감소시키도록 제형화할 수 있다. 이를 위해서, 조성물은 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 액체 담체, 예를 들어 상술한 것, 및 폴리소르베이트 80, L-아르기닌, 폴리비닐피롤리돈, 트레할로스, 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 안정제를 포함한다. 상기와 같은 조성물의 사용은 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 저장 수명을 연장시키고 그의 투여를 용이하게 할 것이다. 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체-함유 조성물에 대한 제형은 예를 들어 미국특허 제 6,225,289 호, 미국특허 제 6,514,943 호, 및 국제특허출원 공보 WO 2000/034444에 추가로 기재된다.
조성물을 또한 형질도입 효율을 증대시키기 위해 제형화할 수 있다. 또한, 당업자는 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체가 조성물 중에 다른 치료제 또는 생물학적 활성제와 함께 존재할 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 염증을 억제하는 인자, 예를 들어 이부프로펜 또는 스테로이드가 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체의 생체내 투여와 연관된 부종 및 염증을 감소시키기 위해 조성물의 부분일 수 있다. 항생제, 즉 살균제 및 살진균제가 기존의 감염을 치료하고/하거나 차후 감염, 예를 들어 투여 과정과 연관된 감염의 위험성을 감소시키기 위해 존재할 수 있다.
일부의 예에서, 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 약학 조성물을, 활성 화합물의 약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화한다. 적합한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 변한다. 본원에 기재된 약학 조성물에 대한 요약을 예를 들어 하기의 문헌에서 찾을 수 있다: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999).
약학 조성물을 임의로 통상적인 방식으로, 예를 들어 단지 예로서, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 연화, 유화, 캡슐화, 포집 또는 압착 공정에 의해 제조한다.
몇몇 구현예에서, 조성물은 또한 하나 이상의 pH 조절제 또는 완충제, 예를 들어 아세트산, 붕산, 시트르산, 락트산, 인산 및 염산과 같은 산; 수산화 나트륨, 나트륨 포스페이트, 나트륨 보레이트, 나트륨 시트레이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 락테이트 및 트리스-하이드록시메틸아미노메탄과 같은 염기; 및 시트레이트/덱스트로스, 나트륨 비카보네이트 및 염화 암모늄과 같은 완충제를 포함할 수 있다. 상기와 같은 산, 염기 및 완충제를 조성물 중의 pH를 허용 가능한 범위로 유지시키는데 필요한 양으로 포함시킨다.
다른 구현예에서, 조성물은 또한 조성물의 삼투압몰농도를 허용 가능한 범위로 가져가는데 필요한 양으로 하나 이상의 염을 포함할 수 있다. 상기와 같은 염은 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 양이온 및 클로라이드, 시트레이트, 아스코르베이트, 보레이트, 포스페이트, 비카보네이트, 설페이트, 티오설페이트 또는 비설파이트 음이온을 포함하는 것들을 포함하며; 적합한 염은 염화 나트륨, 염화 칼륨, 나트륨 티오설페이트, 나트륨 비설파이트 및 암모늄 설페이트를 포함한다.
본원에 기재된 약학 조성물을 임의의 적합한 투여 경로, 예를 들어 비제한적으로 경구, 비경구(예를 들어 정맥내, 피하, 근육내, 뇌내, 뇌혈관내, 관절내, 복강내 또는 두개내), 비내, 구강, 설하, 또는 직장 투여 경로에 의해 투여한다. 일부의 예에서, 약학 조성물을 비경구(예를 들어 정맥내, 피하, 근육내, 뇌내, 뇌혈관내, 관절내, 복강내 또는 두개내) 투여용으로 제형화한다.
본원에 기재된 약학 조성물을 임의의 적합한 투여형, 예를 들어 비제한적으로, 수성 경구 분산액, 액체, 젤, 시럽, 엘릭서, 슬러리, 현탁액 등, 치료되는 개인에 의한 경구 섭취를 위해, 고체 경구 투여형, 에어로졸, 조절된 방출 제형, 빠르게 녹는 제형, 발포성 제형, 동결건조된 제형, 정제, 분말, 환제, 당의정, 캡슐, 지연된 방출 제형, 연장된 방출 제형, 맥동성 방출 제형, 다미립자 제형, 및 혼합된 즉시 방출 및 조절 방출 제형으로 제형화한다. 일부 구현예에서, 약학 조성물을 캡슐로 제형화한다. 일부 구현예에서, 약학 조성물을 용액(예를 들어 IV 투여를 위한)으로 제형화한다. 일부의 경우에, 약학 조성물을 주입으로서 제형화한다. 일부의 경우에, 약학 조성물을 주사로서 제형화한다.
본원에 기재된 약학 고체 투여형은 임의로 본원에 기재된 융합 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 첨가제, 예를 들어 화합성 담체, 결합제, 충전제, 현탁제, 풍미제, 감미제, 붕해제, 분산제, 계면활성제, 윤활제, 착색제, 희석제, 용해제, 보습제, 가소제, 안정제, 침투 촉진제, 습윤제, 소포제, 산화방지제, 보존제, 또는 이들의 하나 이상의 조합을 포함한다.
더욱 다른 태양에서, 표준 코팅 과정, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition (2000)]에 기재된 과정을 사용하여, 필름 코팅을 조성물 주위에 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물을 입자(예를 들어 캡슐에 의한 투여를 위해서)로 제형화하며, 입자 중 일부 또는 전부를 코팅할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물을 입자(예를 들어 캡슐에 의한 투여를 위해서)로 제형화하며, 입자 중 일부 또는 전부를 미세캡슐화할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물을 입자(예를 들어 캡슐에 의한 투여를 위해서)로 제형화할 수 있으며, 입자 중 일부 또는 전부를 미세캡슐화하지 않고 코팅하지 않는다.
몇몇 구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 또한 미생물 활성을 억제하기 위해 하나 이상의 보존제를 포함할 수 있다. 적합한 보존제는 수은-함유 물질, 예를 들어 메르펜 및 티오메르살; 안정화된 이산화 염소; 및 4급 암모늄 화합물, 예를 들어 벤즈알코늄 클로라이드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 및 세틸피리디늄 클로라이드를 포함한다.
"소포제"는 수성 분산액의 응고, 완성된 필름 중에 기포를 생성시키거나 또는 일반적으로 공정을 해칠 수 있는 공정 중 기포형성을 감소시킨다. 예시적인 소포제는 규소 유화액 또는 솔비탄 세스퀴올리에이트를 포함한다.
"산화방지제"는 예를 들어 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 나트륨 아스코르베이트, 아스코르브산, 나트륨 메타비설파이트 및 토코페롤을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 산화방지제는 필요한 경우 화학 안정성을 증대시킨다.
본원에 기재된 제형은 산화방지제, 금속 킬레이트제, 티올 함유 화합물 및 다른 일반적인 안정제로부터 이득을 얻을 수 있다. 상기와 같은 안정제의 예는 비제한적으로 (a) 약 0.5% 내지 약 2% w/w 글리세롤, (b) 약 0.1% 내지 약 1% w/v 메티오닌, (c) 약 0.1% 내지 약 2% w/v 모노티오글리세롤, (d) 약 1 mM 내지 약 10 mM EDTA, (e) 약 0.01% 내지 약 2% w/v 아스코르브산, (f) 0.003% 내지 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, (g) 0.001% 내지 약 0.05% w/v 폴리소르베이트 20, (h) 아르기닌, (i) 헤파린, (j) 덱스트란 설페이트, (k) 사이클로덱스트린, (l) 펜토산 폴리설페이트 및 다른 헤파리노이드, (m) 2가 양이온, 예를 들어 마그네슘 및 아연; 또는 (n) 이들의 조합을 포함한다.
"결합제"는 결합 성질을 부여하며 예를 들어 알긴산 및 그의 염; 셀룰로스 유도체, 예를 들어 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스(예를 들어 Methocel®), 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스(예를 들어 Klucel®), 에틸셀룰로스(예를 들어 Ethocel®), 및 미정질 셀룰로스(예를 들어 Avicel®); 미정질 덱스트로스; 아밀로스; 마그네슘 알루미늄 실리케이트; 폴리사카라이드 산; 벤토나이트; 젤라틴; 폴리비닐피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체; 크로스포비돈; 포비돈; 전분; 예비젤라틴화된 전분; 트라가칸트, 덱스트린, 당, 예를 들어 슈크로스(예를 들어 Dipac®), 글루코스, 덱스트로스, 당밀, 만니톨, 솔비톨, 자일리톨(예를 들어 Xylitab®), 및 락토스; 천연 또는 합성 검, 예를 들어 아카시아, 트라가칸트, 가티검, 이사폴 껍질의 고무장, 폴리비닐피롤리돈(예를 들어 Polyvidone® CL, Kollidon® CL, Polyplasdone® XL-10), 라치 아라보갈락탄, Veegum®, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스, 나트륨 알기네이트 등을 포함한다.
"담체" 또는 "담체 물질"은 약제에 통상적으로 사용되는 부형제를 포함하며 본원에 개시된 화합물, 예를 들어 이브루티닙의 화합물과 항암제와의 화합성, 및 목적하는 투여형의 방출 프로파일 성질에 기초하여 선택되어야 한다. 예시적인 담체 물질은 예를 들어 결합제, 현탁제, 붕해제, 충전제, 계면활성제, 용해제, 안정제, 윤활제, 습윤제, 희석제 등을 포함한다.
"약학적으로 화합성인 담체 물질"은 비제한적으로 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 이산화 규소, 칼슘 글리세로포스페이트, 칼슘 락테이트, 말토덱스트린, 글리세린, 마그네슘 실리케이트, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 나트륨 카제이네이트, 대두 레시틴, 타우로콜산, 포스포티딜콜린, 염화 나트륨, 삼칼슘 포스페이트, 이칼륨 포스페이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 접합체, 당 나트륨 스테아로일 락틸레이트, 카라기난, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 예비젤라틴화된 전분 등을 포함할 수 있다. 예를 들어 하기 문헌을 참조하시오: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999).
"분산제" 및/또는 "점도 조절제"는 액체 매질 또는 과립화 방법 또는 블렌드 방법을 통해 약물의 확산 및 균질성을 조절하는 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 작용제는 또한 코팅 또는 침식 기질의 유효성을 촉진한다. 예시적인 확산 촉진제/분산제는 예를 들어 친수성 중합체, 전해질, Tween® 60 또는 80, PEG, 폴리비닐피롤리돈(PVP; Plasdone®으로서 상업적으로 공지됨), 및 탄수화물-기반 분산제, 예를 들어 하이드록시프로필 셀룰로스(예를 들어 HPC, HPC-SL, 및 HPC-L), 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(예를 들어 HPMC K100, HPMC K4M, HPMC K15M, 및 HPMC K100M), 카복시메틸셀룰로스 나트륨, 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 아세테이트 스테아레이트(HPMCAS), 비결정성 셀룰로스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 트리에탄올아민, 폴리비닐 알콜(PVA), 비닐 피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체(S630), 에틸렌 옥사이드 및 포름알데히드를 갖는 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페놀 중합체(또한 틸록사폴로서 공지됨), 폴록사머(예를 들어 Pluronics F68®, F88® 및 F108®, 이들은 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드의 블록 공중합체이다); 및 폴록사민(예를 들어 Tetronic 908®, 또한 Poloxamine 908®로서 공지됨, 이는 프로필렌 옥사이드 및 에틸렌 옥사이드의 에틸렌디아민에의 연속 부가로부터 유도된 4작용성 블록 공중합체이다(BASF Corporation, Parsippany, N.J.)), 폴리비닐피롤리돈 K12, 폴리비닐피롤리돈 K17, 폴리비닐피롤리돈 K25, 또는 폴리비닐피롤리돈 K30, 폴리비닐피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체(S-630), 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어 상기 폴리에틸렌 글리콜은 약 300 내지 약 6000, 또는 약 3350 내지 약 4000, 또는 약 7000 내지 약 5400의 분자량을 가질 수 있다), 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 폴리소르베이트-80, 나트륨 알기네이트, 검, 예를 들어 검 트라가칸트 및 검 아카시아, 구아검, 잔탄, 잔탄검 포함, 당, 셀룰로식, 예를 들어 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리소르베이트-80, 나트륨 알기네이트, 폴리에톡실화된 솔비탄 모노라우레이트, 폴리에톡실화된 솔비탄 모노라우레이트, 포비돈, 카보머, 폴리비닐 알콜(PVA), 알기네이트, 키토산 및 이들의 조합을 포함한다. 가소제, 예를 들어 셀룰로스 또는 트리에틸 셀룰로스가 또한 분산제로서 사용될 수 있다. 리포솜 분산액 및 자기-유화 분산엑에 특히 유용한 분산제는 디미리스토일 포스파티딜 콜린, 계란으로부터의 천연 포스파티딜 콜린, 계란으로부터의 천연 포스파티딜 글리세롤, 콜레스테롤 및 이소프로필 미리스테이트이다.
하나 이상의 침식 촉진제와 하나 이상의 확산 촉진제의 조합을 또한 본 조성물에 사용할 수 있다.
"희석제"란 용어는 전달에 앞서 관심 화합물을 희석시키는데 사용되는 화학 화합물을 지칭한다. 희석제는 또한 보다 안정한 환경을 제공할 수 있기 때문에 화합물 안정화에 사용될 수 있다. 완충된 용액에 용해된 염(또한 pH 조절 또는 유지를 제공할 수 있다), 예를 들어 비제한적으로 포스페이트 완충된 염수 용액을 당해 분야에서 희석제로서 사용한다. 몇몇 구현예에서, 희석제는 조성물의 벌크를 증가시켜, 캡슐 충전을 위한 균질한 블렌드에 대한 압착을 촉진하거나 또는 상기에 충분한 벌크를 생성시킨다. 상기와 같은 화합물은 예를 들어 락토스, 전분, 만니톨, 솔비톨, 덱스트로스, 미정질 셀룰로스, 예를 들어 Avicel®; 이염기성 칼슘 포스페이트, 이칼슘 포스페이트 디하이드레이트; 삼칼슘 포스페이트, 칼슘 포스페이트; 무수 락토스, 분무-건조된 락토스; 예비젤라틴화된 전분, 압축성 당, 예를 들어 Di-Pac®(Amstar); 만니톨, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 아세테이트 스테아레이트, 슈크로스-기반 희석제, 분당, 일염기성 칼슘 설페이트 모노하이드레이트, 칼슘 설페이트 디하이드레이트; 칼슘 락테이트 트리하이드레이트, 덱스트레이트; 가수분해된 시리얼 고체, 아밀로스; 분말화된 셀룰로스, 칼슘 카보네이트; 글리신, 카올린; 만니톨, 염화 나트륨; 이노시톨, 벤토나이트 등을 포함한다.
"충전제"는 락토스, 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 이염기성 칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 미정질 셀룰로스, 셀룰로스 분말, 덱스트로스, 덱스트레이트, 덱스트란, 전분, 예비젤라틴화된 전분, 슈크로스, 자일리톨, 락티톨, 만니톨, 솔비톨, 염화 나트륨, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 화합물을 포함한다.
"윤활제" 및 "활주제"는 물질의 부착 또는 마찰을 방지, 감소 또는 억제하는 화합물이다. 예시적인 윤활제는 예를 들어 스테아르산, 수산화 칼슘, 활석, 나트륨 스테아릴 푸메레이트, 탄화수소, 예를 들어 무기 오일, 또는 수소화된 식물성 오일, 예를 들어 수소화된 대두 오일(Sterotex®), 고급 지방산 및 그의 알칼리-금속 및 알칼리 토금속 염, 예를 들어 알루미늄, 칼슘, 마그네슘, 아연, 스테아르산, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤, 활석, 왁스, Stearowet®, 붕산, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트, 염화 나트륨, 류신, 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어 PEG-4000), 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어 CarbowaxTM, 나트륨 올리에이트, 나트륨 벤조에이트, 글리세릴 베헤네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 마그네슘 또는 나트륨 라우릴 설페이트, 콜로이드성 실리카, 예를 들어 SyloidTM, Cab-O-Sil®, 전분, 예를 들어 옥수수 전분, 실리콘 오일, 계면활성제 등을 포함한다.
"가소제"는 미세캡슐화 물질 또는 필름 코팅제를 유연하게 하여 덜 무르게 하는데 사용되는 화합물이다. 적합한 가소제는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어 PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1450, PEG 3350, 및 PEG 800, 스테아르산, 프로필렌 글리콜, 올레산, 트리에틸 셀룰로스 및 트리아세틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 가소제는 또한 분산제 또는 습윤제로서 기능할 수 있다.
"용해제"는 트리아세틴, 트리에틸시트레이트, 에틸 올리에이트, 에틸 카프릴레이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 도큐세이트, 비타민 E TPGS, 디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, N-하이드록시에틸피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 사이클로덱스트린, 에탄올, n-부탄올, 이소프로필 알콜, 콜레스테롤, 담즘염, 폴리에틸렌 글리콜 200-600, 글리코퓨롤, 트랜스큐톨, 프로필렌 글리콜, 및 디메틸 이소소르바이드 등과 같은 화합물을 포함한다.
"안정제"는 임의의 산화방지제, 완충제, 산, 보존제 등과 같은 화합물을 포함한다.
"현탁제"는 폴리비닐피롤리돈, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈 K12, 폴리비닐피롤리돈 K17, 폴리비닐피롤리돈 K25, 또는 폴리비닐피롤리돈 K30, 비닐 피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체(S630), 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어 상기 폴리에틸렌 글리콜은 약 300 내지 약 6000, 또는 약 3350 내지 약 4000, 또는 약 7000 내지 약 5400의 분자량을 가질 수 있다), 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스 아세테이트 스테아레이트, 폴리소르베이트-80, 하이드록시 에틸셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 검, 예를 들어 검 트라가칸트 및 검 아카시아, 구아검, 잔탄, 잔탄검 포함, 당, 셀룰로식, 예를 들어 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 폴리소르베이트-80, 나트륨 알기네이트, 폴리에톡실화된 솔비탄 모노라우레이트, 폴리에톡실화된 솔비탄 모노라우레이트, 포비돈 등과 같은 화합물을 포함한다.
"계면활성제"는 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 도큐세이트, Tween 60 또는 80, 트리아세틴, 비타민 E TPGS, 솔비탄 모노올리에이트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올리에이트, 폴리소르베이트, 폴락소머, 담즙염, 글리세릴 모노스테아레이트, 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드의 공중합체, 예를 들어 Pluronic®(BASF) 등과 같은 화합물을 포함한다. 일부 다른 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 지방산 글리세라이드 및 식물성 오일, 예를 들어 폴리옥시에틸렌(60) 수소화된 피마자 오일; 및 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 및 알킬페닐 에테르, 예를 들어 옥톡시놀 10, 옥톡시놀 40을 포함한다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 물리적 안정성을 증대시키거나 또는 다른 목적을 위해 포함될 수 있다.
"점도 향상제"는 예를 들어 메틸 셀룰로스, 잔탄 검, 카복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스 아세테이트 스테아레이트, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스 프탈레이트, 카보머, 폴리비닐 알콜, 알기네이트, 아카시아, 키토산 및 이들의 조합을 포함한다.
"습윤제"는 올레산, 글리세릴 모노스테아레이트, 솔비탄 모노올리에이트, 솔비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올리에이트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노라우레이트, 나트륨 도큐세이트, 나트륨 올리에이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 도큐세이트, 트리아세틴, Tween 80, 비타민 E TPGS, 암모늄 염 등과 같은 화합물을 포함한다.
키트/제조 물품
본원은 몇몇 구현예에서 본원에 기재된 하나 이상의 방법과 함께 사용하기 위한 키트 및 제조 물품을 개시한다. 상기와 같은 키트는 캐리어, 패키지, 또는 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용하도록 구획화된 용기를 포함하며, 상기 용기(들)는 각각 본원에 기재된 방법에 사용되는 별도의 요소 중 하나를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험관을 포함한다. 하나의 구현예에서, 용기는 다양한 물질, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성된다.
본원에 제공된 제조 물품은 패키징 물질을 함유한다. 약학 패키징 물질의 예는 비제한적으로 블리스터 팩, 병, 튜브, 주머니, 용기, 병, 및 선택된 제형 및 의도된 투여 및 치료 방식에 적합한 임의의 패키징 물질을 포함한다.
키트는 전형적으로 내용물을 나열하는 표지 및/또는 사용 설명서, 및 사용 설명서를 갖는 패키지 삽입지를 포함한다. 설명서 세트가 또한 전형적으로 포함될 것이다.
일부 구현예에서, 표지는 용기상에 또는 용기와 결합된다. 하나의 구현예에서, 표지는 상기 표지를 형성하는 문자, 숫자 또는 다른 캐릭터가 용기 자체에 부착되거나, 몰딩되거나 식각될 때 용기상에 있는 것이고; 용기를 또한 유지하는 수용조 또는 캐리어내에 존재할 때 상기 용기와 결합되는 것이다(예: 패키지 삽입지). 하나의 구현예에서, 표지를 사용하여 내용물이 특정한 치료 용도에 사용됨을 가리킨다. 표지는 또한 본원에 기재된 방법에서와 같이, 내용물의 사용법을 가리킨다.
실시예
본 실시예는 단지 예시를 위해 제공되며 본원에 제공된 청구항의 범위를 제한하기 위해 제공되지 않는다.
실시예 1. 항-PD1-TGF-β 트랩의 융합 단백질
항-PD1 VH 및 VL을 합성하고 링커 (G4S)2에 의해 C-말단에 융합된 TGFβRII와 IgG, scFv-Fc 또는 scFv 배열로 포맷화하였다. 항-PD1-트랩 융합 단백질을 제조사의 프로토콜에 따라 Expi293에서 일시 발현시켰다. 융합 단백질을 정제하기 위해서, 형질감염된 상등액을 AKTA AVANT를 사용하여 단백질 L 컬럼상에 로딩하였다. 컬럼을 PBS로 세척한 후에, 단백질을 IgG 용출 완충제(Pierce)로 용출시켰다. 이어서 용출된 단백질을 PD-10 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 PBS로 완충제-교환하였다.
표면 플라스몬 공명
표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance; SPR) 분석을 Biacore3000, CM5 칩, 아민-커플링 키트, 10X HBS-P 러닝 완충제 및 재생용 글리신(GE Healthcare)을 사용하여 수행하였다. 항-PD1 동역학적 분석을 위해서, 정제된 PD-1 Fc 융합 단백질을 사전-한정된 리간드 고정화 프로그램을 사용하여 CM5 칩상에 고정화시켰다. 정제된 항-PD-1-트랩 융합 단백질을 HBS-P 러닝 완충제에서 최종 농도의 범위로 희석하고 주입하였다. 용해를 진행한 다음 칩 표면의 재생을 위해 10 mM 글리신(pH 1.5)의 펄스를 가하였다.
항-PD1-트랩 융합 단백질이 PD1 및 TGFβRII에 동시 결합할 수 있는지를 조사하기 위해서, 100 nM의 항-PD1 트랩 융합 단백질을 3분간 PD1 고정화된 CM5 칩에 주입한 다음 3분 해리시켰다. 후속적으로, 상이한 동형의 TGF-β를 주입하여 PD1 결합 항-PD1-트랩 융합 단백질에의 TGF-β의 결합을 조사하였다.
항-PD1-TGFβRII의 TGF-β 동형에의 결합 친화성을 분석하기 위해서, 항-PD1-TGFβRII를 CM5 칩상에 고정화시키고 이어서 TGF-β 단백질을 HBS-P 러닝 완충제에서 최종 농도 범위로 희석시키고 주입하여 고정화된 항-PD1-TGFβRII에 대한 TGF-β의 결합 친화성을 측정하였다. 고정화된 PD-1에 대한 항-PD1(VH6-VL5 또는 VH7-VL6)-TGFβRII 융합 단백질의 친화성을 표 2에 나타낸다(도 6-8). 고정화된 항-PD-1 IgG4 항체(VH6-VL5)-TGFβRII 융합 단백질에 대한 TGF-β 동형의 친화성을 표 3에 나타낸다. 관찰된 바와 같이, 융합 단백질은 TGF-β1 및 TGF-β3에 높은 친화성으로 결합되고 TGF-β2에 보다 낮은 친화성으로 결합되었다.
고정화된 PD-1에 대한 항-PD1-TGFβRII의 친화성
항-PD1-TGFβRII 포맷 KD (M)
항-PD1(VH7-VL6) IgG4-TGFβRII 3.79e-11
항-PD1(VH6-VL5) IgG4-TGFβRII 2.95e-11
항-PD1(VH7-VL6) IgG1-TGFβRII 8.11e-13
항-PD1(VH6-VL5) IgG1-TGFβRII 7.64e-12
항-PD1(VH7-VL6) scFv-Fc-TGFβRII 3.53e-10
항-PD1(VH6-VL5) scFv-Fc-TGFβRII 2.79e-10
항-PD1(VH7-VL6) scFv-TGFβRII 7.77e-9
항-PD1(VH6-VL5) scFv-TGFβRII 1.97e-8
고정화된 항-PD-1(VH6-VL5) IgG4-TGFβRII에 대한 TGF-β의 친화성
항-PD1-TGFβRII TGF-β 동형 KD (M)
항-PD1(VH6-VL5)
IgG4-TGFβRII		 TGF- β1 5.22e-12
TGF- β2 8.59e-10
TGF- β3 2.19e-12
TGFβRII에 융합된 다양한 항-PD-1 변이체의 결합 친화성을 Biacore 3000을 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의해 평가하였다. 인간 Fc 영역에 융합된 PD-1을 센서 칩 CM5상에 고정화시켰다. 상이한 농도의 다양한 융합 단백질을 용액 상에 주입하고 데이터를 BIA평가를 사용하여 분석하여 융합 단백질의 KD를 계산하였다. 변이체, 예를 들어 항-PD1(VH6-VL5)-TGFβRII 융합 단백질 및 항-PD1(VH7-VL6)-TGFβRII 융합 단백질은 각각의 항-PD1 단독에 비해 PD1에 대해 유사한 결합 친화성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
각각의 항-PD1 항체 단독과 비교된 2개의 항-PD1-TGFβRII 융합 단백질의 친화성
융합 단백질 PD-1-Fc 항원에 대한 결합 친화성 (KD, M)
항-PD1(VH6-VL5)-TGFβRII 3.42E-13
항-PD1(VH6-VL5) 4.74E-13
항-PD1(VH7-VL6)-TGFβRII 6.69E-13
항-PD1(VH7-VL6) 2.44E-13
PD-1/PDL-1 차단 분석
항-PD-1-TGFβRII 융합 단백질이 PD-1/PD-L1 상호작용의 차단에 의해 항-PD1 항체로서 기능할 수 있는지를 조사하기 위해서, PD-1/PD-L1 차단 생물분석 키트(Promega)를 사용하였다. 간단히, PD-L1 aAPC/CHO-K1 세포를 분석 개시 하루 전에 해동시키고 37℃, 5% CO2에서 16 내지 20시간 동안 밤새 회복시켰다. 용량 반응 곡선을 생성시키기 위해서, 100 nM 내지 0.098 nM 범위의 항-PD1 TGFβRII 단백질의 연속 희석물을 제조하였다. 이어서 플레이트를 배양기로부터 제거하고 세포 배지를 버렸다. 이어서 관심 항체를 PD-L1 aAPC/CHO-K1 세포를 함유하는 플레이트에 직접 가하였다. 상기 단계에 이어서, PD-1 효과기 세포를 해동시키고 96-웰 플레이트에 가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 6시간 동안 배양하였다. Bio-GloTM 루시페라제 기질 시약(Promega)을 각 웰에 가하고 상대 루시페라제 단위(RLU)를 Glomax 96-미세플레이트 광도계상에서 측정하였다. 항-PD1 TGFβRII 단백질의 IC50을, 4 매개변수 로지스틱 방정식에 RLU-농도 데이터를 적합시켜 측정하였다. 상기 값을 PD-1/PD-L1 차단 효능의 척도로서 사용하였다(도 5).
HEK-블루 TGF-β 분석
TGF-β의 기능을 중화시키는 항-PD1 TGFβRII 융합 단백질의 효능을 조사하기 위해서, 유도된 리포터 유전자를 갖는 안정한 세포주(HEK-BlueTM TGF-β 리포터 세포주, Invitrogen)를 사용하였다. 상기 안정한 세포주는 TGF-β/SMAD 경로의 활성화를 통해 생물활성 TGF-β의 검출을 허용하여, 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 생성을 유도하고, 이를 정량분석할 수 있다. 간단히, TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3를 사전-측정된 EC50 농도로 희석하고, 편평 바닥 96-웰 플레이트에 가하였다. 용량 반응 곡선을 생성시키기 위해서, 항-PD1 TGFβRII 단백질의 연속 희석물을 상이한 동형의 TGF-β를 함유하는 플레이트에 가하였다. 플레이트를 37℃에서 30분간 배양하였다. 이어서 HEK-BlueTM TGF-β 세포를 플레이트에 0.7x106 세포/㎖의 최종 농도로 가하였다. 이어서 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 총 20시간 동안 배양하였다. 배양에 이어서, 상등액의 1회 분액을 제거하여, 분비된 SEAP를 정량분석하는데 사용된 QUANTI-BlueTM 기질(Invitrogen)을 함유하는 플레이트에 가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서 플레이트를 620 내지 655 ㎚에서 SpectraMax Plus 플레이트 판독기상에서 판독하였다. IC50을, 흡광도-농도 데이터를 4-매개변수 로지스틱 방정식(GraphPad Prism)에 적합시킴으로써 측정하였다. 대조군과 비교된 다양한 항-PD1 TGFβRII 융합 단백질의 효능의 결과를 도 5-8에 묘사한다.
표 6 및 7은 시험된 다양한 융합 단백질 및 TGF-β1 유도된 보고된 유전자 활성의 억제를 추가로 나열한다.
IC50 - 다양한 융합 구조물에 대한 TGF-β1 유도된 리포터 유전자 활성의 억제의 요약
융합 단백질 IC50 (pM)
항-PD1 (VL5-VH6).IgG4 9.0
항-PD1 (VL5-VH6).IgG4(S108P). TGFbRII 9.7
항-PD1 (VL5-VH6) ScFv-Fc 4.3
항-PD1 (VL6-VH7).IgG4. TGFbRII 5.6
항-PD1 (VL6-VH7).IgG4(S108P). TGFbRII 9.3
항-PD1 (nVL1-nVH3).IgG4-TGFbRII 10.7
항-PD1 (nVL1-nVH3).scFv-Fc-TGFbRII 6.5
항-PD1 (nVL1-nVH7).IgG4-TGFbRII 15.1
항-PD1 (nVL1-nVH8).IgG4-TGFbRII 54.5
항-RSV IgG4-TGFbRII 8.6
항-RSV S108P IgG4-TGFbRII 6.9
항-RSV scFv-Fc4 8.9
다양한 융합 구조물의 TGF-β1 중화 활성의 요약
융합 단백질 IC50 (pM)
항-PD1 (VL5/VH6).IgG4-링커2 -TGFbRII 1.2
항-PD1 (VL5/VH6).IgG4-링커12 -TGFbRII 2.7
항-PD1 (VL5/VH6).IgG4-링커7 -TGFbRII 1.1
항-PD1 (VL5/VH6).IgG4-링커8-TGFbRII 1.2
항-PD1 (VL5/VH6).IgG4-링커10 -TGFbRII 1.9
다양한 항-PD1 IgG4-TGFbRII 융합 구조물의 PD1 결합
PD1-Fc 항원 및 참조 항원을 Biacore CM5 표면상에 고정화시켰다. 다양한 항-PD1 IgG4-TGFbRII의 6-12 반복된 연속 희석된 농도를 PD1-Fc 항원 및 참조 표면에 연속 주입하였다. 동역학 데이터를 1:1 모델: 물질전달과 Langmuir에 대해 평가하였다. 표 7에서 관찰된 바와 같이, 항-PD1 IgG4-TGFbRII와 PD1-Fc 항원과의 결합 친화성(KD)은 1012 내지 1010 범위였다.
PD1 IgG4-TGFbRII 융합 단백질의 PD1 결합 친화성 분석
융합 단백질 KD (M)
항-PD1 (nVL1-nVH3).IgG4 1.48E-11
항-PD1 (nVL1-nVH3).IgG4-TGFbRII 2.77E-11
항-PD1 (nVL1-nVH3).IgG4(S108P) 1.41E-11
항-PD1 (nVL1-nVH3).IgG4-(S108P)-TGFbRII 8.16E-12
항-PD1 (nVL1-nVH7).IgG4-TGFbRII 1.47E-10
항-PD1 (nVL1-nVH8).IgG4-TGFbRII 3.21E-10
다양한 항-PD1 IgG4-TGFβRII 융합 구조물의 동시적인 PD1 및 TGF-β1 결합
상이한 링커를 갖는 항-PD1-TGFRII 융합 단백질(표 9)이 PD1 및 TGF-β1에 동시에 결합할 수 있는지의 여부를 조사하기 위해서, 하기의 구조물을 제조하고 Biacore 실험에서 시험하였다. PD1-Fc 항원을 Biacore CM5 칩 표면상에 고정화시켰다. 항-PD1(VL5-VH6).IgG4-링커-TGFbRII를 센서 표면위에 주입한 다음 TGF-β1을 센서 표면위에 주입하였다. 도 20에 도시된 바와 같이, 항-PD1(VL5-VH6).IgG4-링커-TGFRII 구조물은 모두 PD1-Fc 항원 및 TGFβ1 모두에 동시에 결합하였다.
다양한 링커를 갖는 항-PD1(VL5-VH6).IgG4-링커-TGFRII 구조물
융합 단백질 링커
항-PD1 (VL5-VH6).IgG4-링커 2 -TGFbRII GGGGSGGGS (링커 2)
(서열번호 293)
항-PD1 (VL5-VH6).IgG4-링커12 -TGFbRII DPVLEREDKVTTSKNPGS (링커 12)
(서열번호 27)
항-PD1 (VL5-VH6).IgG4-링커7 -TGFbRII DPGSGSVPLGSGSNPGS (링커7)
(서열번호 22)
항-PD1 (VL5-VH6).IgG4-링커8 -TGFbRII DPGSGGSVPLGSGGSNPGS (링커 8)
(서열번호 23)
항-PD1 (VL5-VH6).IgG4-링커10 -TGFbRII DPGVLEREDVPTTSYPNPGS (링커10)
(서열번호 25)
실시예 2. 항-PD1-TGF-β 트랩은 시험관내 배양물에서 T 세포 활성화를 촉진한다.
T 세포 기능을 촉진하는 항-PD1-TGF-β 트랩의 능력을 평가하기 위해서, 백혈구성분채집술 생성물(의학연구윤리심의 위원회(IRB) 승인된 프로토콜하에 정상적인 건강한 공여자로부터 수득됨)로부터 Ficoll-Hypaque를 사용하여 정제한 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 시험관내에서 사용하였다. PBMC를 세포 증식 염료 CellTrace 바이올렛으로 표지하고 항-CD3 및 항-CD28로 자극하였다. 배양의 끝에서 배양 상등액을 수집하고 IFN-γ 방출 분석에 사용될 때까지 보관하였다. 세포를 T 세포 증식 평가를 위해 형광 접합된 항체로 표지하였다.
항-PD1-TGF-β 트랩의 존재하에서 자극된 PBMC는 항-PD1 또는 항-RSV 대조용 항체에 비해 증대된 증식 및 IFN-γ 생성을 용량 의존적인 방식으로 나타내었으며, 이는 PD-1/PD-L1 및 TGF-β 경로 모두를 표적화하는 융합 분자의 능력을 암시한다(도 9A-9C). 데이터는 또한 항-PD1 단독에 비해 융합 분자의 부가적인 증대된 효과를 입증한다.
항 PD1-TGF-RII는 대장암의 시험관내 모델에서 항 PD1 단독에 비해 우수한 항-종양 반응을 나타낸다
항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 유효성을 대장암의 시험관내 모델에서 평가하였다. 건강한 공여자로부터 정제된 PBMC를 암세포주 HT-29와 5일간 공-배양하였다. 세포를 아이소타입 대조군, 항-PD1 또는 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 존재하에서 항-CD3으로 자극하였다. 배양 상등액을 수집하고 IFN-γ 수준을 제조사의 프로토콜에 따라 MSD에 의해 정량분석하였다. 세포를 수집하고 T 세포상의 표적 점유를 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 세포 배양 상등액 중의 TGF-β1, TGF-β2, 및 TGF-β3의 수준을 제조사의 프로토콜에 따라 Luminex에 의해 정량분석하였다.
도 9D는 항-PD1-TGFRII가 항 PD1의 경우와 유사하게 CD8+ T 세포 표면상의 PD1에 결합함을 도시한다. 도 9E에 도시된 바와 같이, 항-PD1-TGFRII 융합 단백질은 항-PD1 또는 아이소타입 대조군에 비해 더 높은 수준의 IFN-γ 생성을 촉진하였다. 도 9H. HT-29 PBMC 공배양 시스템에서 생성된 TGF-β1은 심지어 시험된 최저 용량에서조차 항-PD1-TGFRII 처리시 완전하게 중화된다. 도 9I. HT-29 PBMC 공배양 시스템에서 생성된 TGF-β2는 항-PD1-TGFRII 처리시 부분적으로 중화된다. 종합적으로, 이러한 시험관내 모델로부터의 결과는 항-PD1 항체에 비해 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 우수한 항-종양 반응을 나타낸다.
항-PD1-TGFRII는 두경부암의 시험관내 모델에서 항-PD1 단독에 비해 우수한 항-종양 반응을 나타낸다
항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 유효성을 두경부암의 시험관내 모델에서 평가하였다. 건강한 공여자로부터 정제된 PBMC를 암세포주 Detroit 562와 5일간 공-배양하였다. 세포를 아이소타입 대조군, 항-PD1 또는 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 존재하에서 항-CD3으로 자극하였다. 배양 상등액을 수집하고 IFN-γ 수준을 제조사의 프로토콜에 따라 MSD에 의해 정량분석하였다. 세포를 수집하고 T 세포상의 표적 점유를 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 세포 배양 상등액 중의 TGF-β1, TGF-β2, 및 TGF-β3의 수준을 제조사의 프로토콜에 따라 luminex에 의해 정량분석하였다.
도 9F는 항-PD1-TGFRII가 항 PD1의 경우와 유사하게 CD8+ T 세포 표면상의 PD1에 결합함을 도시한다. 도 9G에 도시된 바와 같이, 항-PD1-TGFRII 융합 단백질은 항-PD1 또는 아이소타입 대조군에 비해 더 높은 수준의 IFN-γ 생성을 촉진하였다. 도 9J. Detroit 562 PBMC 공배양 시스템에서 생성된 TGF-β1은 심지어 시험된 최저 용량에서조차 항-PD1-TGFRII 처리시 완전하게 중화된다. 도 9K. Detroit 562 PBMC 공배양 시스템에서 생성된 TGF-β2는 항-PD1-TGFRII 처리시 부분적으로 중화된다. 종합적으로, 상기 시험관내 모델로부터의 결과는 항-PD1 항체에 비해 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 우수한 항-종양 반응을 나타낸다.
항 PD1-TGF-RII는 대장암의 시험관내 3D 종양 회전타원체(spheroid) 모델에서 항 PD1 단독에 비해 우수한 항-종양 반응을 나타낸다.
항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 유효성을 대장암의 시험관내 3D 종양 회전타원체 모델에서 평가하였다. 3D 종양 회전타원체를, 대장암 세포주 HT-29 및 섬유아세포 세포주를 공배양함으로써 생성시켰다. 이어서 건강한 공여자로부터 정제된 PBMC를 회전타원체 배양물에 가하였다. 세포를 아이소타입 대조군, 항-PD1 또는 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 존재하에서 5일 동안 항-CD3으로 자극하였다. 배양 상등액을 수집하고 IFN-γ 수준을 제조사의 프로토콜에 따라 MSD에 의해 정량분석하였다.
도 9L에 도시된 바와 같이, 항-PD1-TGFRII 융합 단백질은 항-PD1 또는 아이소타입 대조군에 비해 보다 높은 수준의 IFN-γ 생성을 촉진하였다. 종합적으로, 상기 3D 종양 회전타원체 모델로부터의 결과는 항-PD1 항체에 비해 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 우수한 항-종양 반응을 나타낸다.
항 PD1-TGF-RII는 두경부암의 시험관내 3D 종양 회전타원체 모델에서 항 PD1 단독에 비해 우수한 항-종양 반응을 나타낸다
항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 유효성을 대장암의 시험관내 3D 종양 회전타원체 모델에서 평가하였다. 3D 종양 회전타원체를, Detroit 562 세포주 및 섬유아세포 세포주를 공배양함으로써 생성시켰다. 이어서 건강한 공여자로부터 정제된 PBMC를 회전타원체 배양물에 가하였다. 세포를 아이소타입 대조군, 항-PD1 또는 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 존재하에서 5일 동안 항-CD3으로 자극하였다. 배양 상등액을 수집하고 IFN-γ 수준을 제조사의 프로토콜에 따라 MSD에 의해 정량분석하였다.
도 9M에 도시된 바와 같이, 항-PD1-TGFRII 융합 단백질은 항-PD1 또는 아이소타입 대조군에 비해 보다 높은 수준의 IFN-γ 생성을 촉진하였다. 종합적으로, 상기 3D 종양 회전타원체 모델로부터의 결과는 항-PD1 항체에 비해 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 우수한 항-종양 반응을 나타낸다.
실시예 3. 항-PD1-TGF-β 트랩은 시험관내에서 재조합 TGF-β1의 존재하에 항-PD1에 비해 우수한 활성을 갖는다.
높은 수준의 TGF-β를 갖는 환경에서 T 세포 기능을 촉진하는 항-PD1-TGF-β 트랩의 능력을 평가하기 위해서, PBMC를 재조합 TGF-β1의 존재하에서 상기에서와 같이 자극하였다. 배양의 끝에서, 배양 상등액을 수집하고 사이토카인 분석에 사용될 때까지 보관하였다. 세포를 형광 접합된 항체로 표지하고 활성화에 대한 판독으로서 T 세포 증식 및 IL-2 수용체 알파 또는 CD25의 상향조절에 대해 평가하였다.
재조합 TGF-β1은 T 세포 활성화, 증식 및 사이토카인 및 케모카인 생성을 억제하였다(도 10 및 도 11). 상기 억제는 항-PD1에 비해 항-PD1-TGF-β1 트랩에 의해 용량 의존적인 방식으로 현저하게 역전되었다. 데이터는 다량의 외인성 TGF-β1을 중화시키고 PD-1/PD-L1 경로를 붕괴시켜 증대된 T 세포 면역 반응을 생성시키는 융합 단백질의 능력을 암시한다. 따라서, 융합 분자에 의한 PD-1/PD-L1의 차단 및 TGF-β의 중화는, 관문 억제제 치료가 실패한 암 적응증에서 효능있는 항-종양 반응을 이끌어내기에 매력적인 면역요법일 수 있다.
실시예 4. 항-DP1-TGF-RII는 대장암의 인간화된 마우스 모델에서 항-PD1 단독에 비해 우수한 항-종양 반응을 나타낸다.
대장암 종양을 억제하는 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 능력을 인간화된 마우스 모델에서 평가하였다. 인간화된 NOG 마우스에 HT-29 암세포를 투여하였다. 종양 함유 마우스를 무작위분류하고 매주 2회 항-PD1-TGFRII 융합 단백질, 항-PD1 항체 단독 또는 아이소타입 대조군을 투여하였다. 도 12A에서 보이는 바와 같이, 항-PD1-TGFRII 융합 단백질은 항-PD1 및 아이소타입 대조군에 비해 종양 성장을 현저하게 억제하였다. 연구의 끝에서 종양의 분석은 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 처리된 마우스가 보다 높은 빈도의 종양 침윤성 림프구(TIL)를 가짐을 보였다. 항-PD1-TGFRII 처리된 마우스로부터의 종양의 분석은 또한 보다 높은 비의 CD8+ T 세포 대 조절성 T 세포(Treg)를 보였다.
실시예 5. 항-PD1-TGFRII는 두경부암의 시험관내 모델에서 항 PD1 단독에 비해 우수한 항-종양 반응을 나타낸다.
항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 유효성을 두경부암의 시험관내 모델에서 평가하였다. 건강한 공여자로부터 정제된 PBMC를 암세포주 Detroit 562와 48시간 동안 공-배양하였다. 세포를 아이소타입 대조군, 항-PD1 또는 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 존재하에서 항-CD3으로 자극하였다. 배양 상등액을 수집하고 IFN-γ 수준을 제조사의 프로토콜에 따라 MSD에 의해 정량분석하였다. 배양 기간의 끝에서 공-배양물로부터 세포 펠릿을 원심분리에 의해 수확하고 RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 Qiagen RNAeasy 미세 키트를 사용하여 정제하였다. 정제된 RNA를 제조사의 설명에 따라 나노스트링을 사용하는 유전자 발현 분석에 사용하였다. 유전자 발현을 Nanostring nCounter 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
도 13A에 도시된 바와 같이, 항-PD1-TGFRII 융합 단백질은 항-PD1 또는 아이소타입 대조군에 비해 더 높은 수준의 IFN-γ 생성을 촉진하였다. 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 처리는 항-PD1 처리에 비해 인터페론 경로 유전자(도 13B)뿐만 아니라 세포독성 유전자(도 13C)의 현저한 상향조절을 생성시켰으며, 이는 항-PD1 항체에 비해 종양의 존재하에서 개선된 세포독성 기능을 강조한다. 더욱 또한, 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 처리는 종양 전이 및 혈관형성 경로에 관련된 유전자의 현저한 하향조절을 생성시켰다(도 13D). 종합적으로, 상기 시험관내 모델로부터의 결과는 항-PD1 항체에 비해 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 우수한 항-종양 반응을 나타낸다.
실시예 6. 항-DP1-TGFRII는 두경부암의 인간화된 마우스 모델에서 항-PD1 단독에 비해 우수한 항-종양 반응을 나타낸다.
두경부암을 억제하는 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 능력을 인간화된 마우스 모델에서 평가하였다. 인간화된 NSG 마우스에 D562 세포주를 투여하였다. 종양 함유 마우스를 무작위분류하고 매주 2회 항-PD1-TGFRII 융합 단백질, 항-PD1 항체 단독 또는 아이소타입 대조군을 투여하였다. 도 14에서 보이는 바와 같이, 항-PD1-TGFRII 융합 단백질은 항-PD1 및 아이소타입 대조군에 비해 종양 성장을 현저하게 억제하고(도 14A), 종양 함유 마우스의 생존을 개선시키고(도 14B) IFNγ 수준을 증가시켰다(도 14F). 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 처리는 종양에서 CD8+ T 세포 대 Treg 비를 현저하게 개선시켰다(도 14C).
실시예 7. 항 PD1-TGFRII는 원발성 대장암(CRC) 환자 샘플에서 항-PD1 단독에 비해 우수한 항-종양 반응을 나타낸다.
항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 유효성을 원발성 대장암 환자 샘플에서 평가하였다. CRC 환자로부터의 PBMC를 해리된 종양 세포와 공-배양하였다. 세포를 아이소타입 대조군, 항-PD1 또는 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 존재하에서 자극하였다. 배양 상등액을 수집하고 IFN-γ 수준을 제조사의 프로토콜에 따라 MSD에 의해 정량분석하였다. TGF-β 수준을 제조사의 프로토콜에 따라 Luminex에 의해 평가하였다. 배양 기간의 끝에서 공-배양물로부터 세포 펠릿을 원심분리에 의해 수확하고 RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 Qiagen RNAeasy 미세 키트를 사용하여 정제하였다. 정제된 RNA를 제조사의 설명에 따라 나노스트링을 사용하는 유전자 발현 분석에 사용하였다. 유전자 발현을 Nanostring nCounter 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
도 15A에 도시된 바와 같이, 항-PD1-TGFRII 융합 단백질은 항-PD1 또는 아이소타입 대조군에 비해 더 높은 수준의 IFN-γ 생성을 촉진하였다. 항-PD1-TGFRII 융합 단백질은 환자 PBMC 및 해리된 종양 세포에 의해 생성된 TGF-β1을 완전히 중화시켰다(도 15B). 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 처리는 항-PD1 처리에 비해 세포독성 유전자의 현저한 상향조절을 생성시켰으며(도 15C), 이는 항-PD1 항체에 비해 종양의 존재하에서 개선된 세포독성 기능을 강조한다. 더욱 또한, 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 처리는 종양 전이 및 혈관형성 경로에 관련된 유전자의 현저한 하향조절을 생성시켰다(도 15C). 예상된 바와 같이 TGF-β 신호전달 경로는 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 처리 그룹에서 현저하게 하향조절된다. 종합적으로, 상기 환자 유래된 샘플로부터의 결과는 항-PD1 항체에 비해 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 우수한 항-종양 반응을 나타낸다.
실시예 8. 항-PD1-TGFRII는 난소암의 시험관내 모델에서 항-PD-L1-TGFRII에 비해 증가된 세포독성을 나타낸다.
항-PD1-TGFRII의 유효성을 난소암의 시험관내 모델에서 항-PD-L1-TGFRII와 비교하였다. 건강한 공여자로부터의 PBMC를 암세포주 SK-OV-3과 공-배양하였다. 면역 세포를 아이소타입 대조군, 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 또는 항-PD-L1-TGFRII 융합 단백질의 존재하에서 자극하였다. 종양 세포의 사멸을 Incucyte 생세포 분석 시스템을 사용하여 배양 기간에 걸쳐 평가하였다.
도 16에 도시된 바와 같이, 항-PD1-TGFRII 융합 단백질의 존재는 항-PD-L1-TGFRII 융합 단백질과 비교시 종양 세포의 증가된 사멸을 나타내었다. 종합적으로, 항-PD1-TGFRII는 항-PD-L1-TGFRII와 비교시 개선된 세포독성을 나타낸다.
실시예 9. 항-PD1-TGF-RII와 CAR-T와의 조합은 항-PD1과의 조합 또는 CAR-T 단독과 비교시 3D 종양 회전타원체 사멸을 현저하게 증대시켰다.
항-PD1-TGFRII 융합 단백질과 CAR-T 세포와의 조합을 난소암의 시험관내 3D 종양 회전타원체 모델에서 평가하였다. 이 실시예에서, CAR-T 세포는 MUC16 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포를 지칭함에 유의한다. 3D 종양 회전타원체를, 난소암 세포주 SK-OV-3 및 섬유아세포 세포주를 공배양함으로써 생성시켰다. 이어서 CAR-T 세포를 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 또는 항-PD1의 존재하에서 3D 종양 회전타원체 배양물에 가하였다. 3D 종양 회전타원체의 표적 특이성 사멸을 Incucyte 생세포 분석 시스템을 사용하여 시간에 걸쳐 평가하였다.
도 17에 도시된 바와 같이, 항-PD1-TGFRII 융합 단백질과 CAR-T 세포와의 조합은 항-PD1 및 CAR-T 세포의 조합 또는 CAR-T 세포 단독과 비교시 3-D 종양 회전타원체의 증가된 사멸을 보였다. 종합적으로, 상기 사멸 분석으로부터의 결과는 CAR-T 세포에의 항-PD-1-TGF-RII의 부가가 CAR-T 세포의 항-종양 반응을 증대시킴을 암시한다.
실시예 10 항-PD1-TGF-RII와 CD33 특이성 CAR-T 세포와의 조합
CD33 CAR-T 세포를 세포독성 분석에서 MOLM-13 AML 종양 세포주와 공-배양하고 배양물을 IncuCyte S3 생세포 분석 장비에서 배양하였다. 항 PD1 또는 항-PD1-TGFRII를 표시된 배양물에 동몰 농도로 가하였다. 사이톡스 그린을 배양 시작시 직접 가하여 배양물 중 염색 세포의 식별 및 열거를 허용하였다. 분석을 IncuCyte S3 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 도시된 그래프에 제공된 데이터는 웰당 5 스캔을 취하여, 3회 중복 웰로부터 평균±SD이다. 도 18A에 도시된 바와 같이, 항-PD1(VH6/VL5)-TGFRII 융합 단백질과 CD33 CAR T 세포와의 조합은 CAR T 세포 및 항-PD1(VH6/VL5) 조합 또는 CAR T 세포 단독에 비해 증가된 사멸을 나타내었다.
도 18B에 도시된 바와 같이, 항-PD1(VH7/VL6)-TGFRII 융합 단백질과 CD33 CAR T 세포와의 조합은 CAR T 세포 및 항-PD1 조합 또는 CAR T 세포 단독에 비해 증가된 사멸을 나타내었다. 종합적으로, 이들 세포독성 분석에 대한 결과는 항-PD1(VH6/VL5)-TGFRII 융합 단백질 및 항-PD1(VH7/VL6)-TGFRII 융합 단백질이 CAR-T 세포의 항-종양 면역 반응을 증대시킴을 입증한다.
실시예 11. 항-PD1-TGF-RII와 CD19 CAR-T 세포의 조합은 종양 세포 사멸을 증대시킨다.
CD19 CAR-T 세포를 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 또는 항-PD1의 존재하에서 세포 표면상의 CD19 항원을 발현하는 종양 세포와 공-배양한다. 항-PD1-TGFRII 융합 단백질과 CD19 CAR-T 세포의 조합은 항-PD1 및 CAR-T 세포의 조합 또는 CAR-T 세포 단독에 비해 종양 세포 사멸의 증가를 보인다.
실시예 12. 항-PD1-TGF-RII와 BCMA 특이성 CAR-T의 조합은 CAR-T 세포의 세포독성 가능성을 개선시킨다.
BCMA 특이성 CAR-T 세포를 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 또는 항-PD1의 존재 또는 부재하에서 BCMA 항원을 발현하는 종양 세포주와 공-배양한다. 항-PD1-TGF-RII 융합 단백질과 CAR-T 세포의 조합은 항-PD1 및 CAR-T 세포의 조합 또는 CAR-T 세포 단독에 비해 CAR-T 세포의 세포독성 가능성을 개선시킨다.
실시예 13. 항-PD1-TGF-RII와 PSMA 특이성 CAR-T의 조합은 CAR-T 세포에 의한 종양세포 사멸을 증대시킨다.
PSMA 특이성 CAR-T 세포를 항-PD1-TGFRII 융합 단백질 또는 항-PD1의 존재 또는 부재하에서 PSMA 항원을 발현하는 종양 세포주와 공-배양한다. 항-PD1-TGF-RII 융합 단백질과 CAR-T 세포의 조합은 항-PD1 및 CAR-T 세포의 조합 또는 CAR-T 세포 단독에 비해 CAR-T 세포의 세포독성을 개선시킨다.
실시예 14. NK 세포 표적 세포 용해가 항-PD1-TGFRII에 의해 개선되었다.
종양 세포의 자연살해 세포-매개된 사멸을 촉진하는 항-PD1(VH7/VL6)-TGFRII 및 항-PD1(VH6/VL5)-TGFRII의 능력을 난소암의 시험관내 모델에서 평가하였다. 효과기 NK 세포를 건강한 공여자로부터 정제하고 SK-OV-3 표적 세포주를 항-RSV-TFGBRII(대조군), 항-PD1(VH6/VL5) 및 항-PD1(VH7/VL6), 항-PD1(VH7/VL6)-TGFRII 및 항-PD1(VH6/VL5)-TGFRII의 존재하에 상이한 E:T 세포비에서 밤새 공-배양하였다. 프로피디움 요오드를 배양물에 가하여 죽은 세포를 식별하고 Nexcelom Celigo를 사용하여 세포사를 분석하였다. 도 19A 및 도 19B에서 관찰되는 바와 같이, 항-PD1-TGFBRII 융합 단백질은 항-PD1 또는 TGFBRII 단독(항-RSV-TGFBRII)에 비해 보다 높은 종양 세포 사멸을 촉진하였다.
실시예 15: 항-PD1-ADA2의 융합 단백질
항-PD1 VH 및 VL을 합성하고 링커 (G4S)2에 의해 C-말단에 융합된 아데노신 데아미나제 2(ADA2)와 IgG, scFv-Fc 또는 scFv 배열로 포맷화하였다. 항-PD1-아데노신 데아미나제 융합 단백질을 제조사의 프로토콜에 따라 Expi293에서 일시 발현시키고 AKTA AVANT를 사용하여 정제시켰다.
표면 플라스몬 공명
표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 Biacore3000, CM5 칩, 아민-커플링 키트, 10X HBS-P 러닝 완충제 및 글리신을 사용하여 수행하였다. 항-PD1 동역학적 분석을 위해서, 재조합 PD-1 Fc 단백질을 사전-한정된 리간드 고정화 프로그램을 사용하여 칩상에 고정화시켰다. 정제된 항-PD1-아데노신 데아미나제 융합 단백질을 러닝 완충제에서 최종 농도의 범위로 희석하고 주입하였다. 용해를 진행한 다음 칩 표면의 재생을 진행하였다.
고정화된 PD1에 대한 항-PD1-ADA2의 친화성
융합 단백질 KD (M)
항-PD1 (VH7-VL6) IgG4-ADA2 6.63e-14
항-PD1 (VH6-VL5) IgG4-ADA2 6.16e-14
항-PD1 (VH7-VL6) IgG1-ADA2 5.09e-13
항-PD1 (VH6-VL5) IgG1-ADA2 3.09e-13
항-PD1 (VH7-VL6) scFv-Fc-ADA2 5.63e-10
항-PD1 (VH6-VL5) scFv-Fc-ADA2 1.84e-12
항-PD1 (VH7-VL6) scFv-ADA2 1.3e-10
항-PD1 (VH6-VL5) scFv-ADA2 3.46e-9
PD-1/PDL-1 차단 분석
항-PD1-ADA2 융합 단백질이 PD-1/PD-L1 상호작용의 차단에 의해 항-PD1 항체로서 기능할 수 있는지를 조사하기 위해서, Promega로부터의 PD-1/PD-L1 차단 생물분석 키트를 실시예 1에 묘사된 바와 같이 사용하였다. 상기 값은 PD-1/PD-L1 차단 효능의 척도로서 사용되었다(도 21).
ADA 효소 활성 분석
항-PD1 ADA2 융합 단백질 효소 활성을 측정하기 위해서, 비색측정 아데노신 데아미나제(ADA) 활성 키트(Abcam)를 제조사의 권장에 따라 사용하였다. 2분 및 30분 시점을 선택하여 시간에 걸쳐 ADA 효소 활성을 계산하였다. 도 22에 도시된 바와 같이, 항-PD1-ADA2 융합 단백질은 시간에 걸쳐 효소 활성을 나타내었다.
실시예 16: 항-PD1 IgG4 S108P-wtADA2 및 -mutADA2의 PD1 결합 친화성 분석
PD1-Fc 항원 및 참조를 Biacore CM5 표면상에 고정화시키고, 이어서 항-PD1 IgG4 S108P-wtADA2 및 -mutADA2의 6-12 반복된 연속 희석된 농도를 PD1-Fc 항원 및 참조 표면에 연속 주입하였다. 동역학 데이터를 1:1 모델: 물질전달과 Langmuir에 대해 평가하였다. 결과는 표 11에 묘사된 바와 같다.
항-PD1(VH6/VL5) 및 (VH7/VL6) IgG4 S108P와 항-PD1-wtADA2 및 -mutADA2와의 결합 친화성
분석물 KD (M)
항-PD1 (VH6/VL5) IgG4 S108P 3.34e-13
항-PD1 (VH6/VL5) IgG4 S108P-ADA2 7.53e-13
항-PD1 (VH6/VL5) IgG4 S108P-mutADA2 2.18e-13
항-PD1 (VH7/VL6) IgG4 S108P 3.92e-13
항-PD1 (VH7/VL6) IgG4 S108P-ADA2 4.13e-13
항-PD1 (VH7/VL6) IgG4 S108P-mutADA2 3.38e-13
실시예 17: 항-PD1-ADA2 융합 단백질은 PD-L1/PD1 신호전달을 유효하게 차단하였다.
PD1/PD-L1 상호작용을 차단하는 항-PD1-ADA2 융합 단백질의 능력을 실시예 12에서 언급한 바와 같이 리포터 생물분석을 사용하여 평가하였다.
도 23A-23B에 도시된 바와 같이, 항-PD1(VH7/VL6)-wtADA2 및 -mut7ADA2, 항-PD1(VH6/VL5)-wtADA2 및 -mut7ADA2는 유사한 효능으로 PD1/PD-L1 상호작용을 차단하였다.
실시예 18: ADA2 효소 활성
아데노신을 효소적으로 분해하는 항-PD1-ADA2 융합 단백질의 능력을 실시예 12에서 언급한 바와 같이 시험관내 ADA 효소 활성 분석에서 평가하였다.
도 24A-24F에 도시된 바와 같이, 보다 낮은 아데노신 농도에서, mut7ADA2는 wtADA2에 비해 보다 높은 효소 활성을 갖는다.
실시예 19: 항-PD1-mut7-ADA2는 항-PD1-wtADA2보다 더 높은 효소 활성을 갖는다.
항-PD1(VH6/VL5)-wtADA2 및 항-PD1(VH6/VL5)-mut7ADA2의 미카엘리스 멘텐 상수(Km)를 형광측정 ADA2 효소 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 도 25에서 관찰된 바와 같이, 항-PD1-mut7ADA2는 항-PD1-wtADA2에 비해 더 높은 Km을 갖는다.
실시예 20: 항-PD1-wtADA2는 T 세포 증식의 아데노신-매개된 억제를 역전시킨다.
T 세포 증식을 촉진하는 항-PD1-wtADA2의 능력을 정상적인 공여자 PBMC를 사용하여 시험관내에서 평가하였다. 1 mM 아데노신을 함유하는 배지에서 공배양된 CellTrace Violet-표지된 PBMC를, 증가하는 농도의 항-PD1(VH6/VL5)-wtADA2 및 항-PD1(VH6/VL5)의 존재하에서 자극하였다. 상등액을 사이토카인 분석을 위해 수집하였다. 세포를 유식 세포측정에 의해 T 세포 증식에 대해 분석하였다. 데이터는 항-PD1(VH6/VL5)-wtADA2가 항-PD1(VH6/VL5) 또는 아이소타입 대조군에 비해 CD4+(도 26A) 및 CD8+ T 세포(도 26B)의 아데노신-매개된 억제를 현저하게 역전시킴을 보였다. 도 26C 및 D에서 관찰된 바와 같이, 항-PD1 및 항-PD1-wtADA2는 모두 CD4+(도 26C) 및 CD8+ T 세포(도 26D)상의 PD1 수용체를 유사하게 점유하였다.
T 세포 기능을 촉진하는 항-PD1(VH7/VL6)-wtADA2의 능력을, 증가하는 농도의 항-PD1(VH7/VL6), 항-PD1(VH7/VL6)-wtADA2 또는 아이소타입 대조군의 존재하에서 아데노신을 함유하는 배지에서 PBMC를 자극함으로써 추가로 평가하였다. 배양 상등액을 수집하고 IFNγ의 생성에 대해 분석하였다. 도 26E는 항-PD1(VH7/VL6)-wtADA2가 항-PD1 또는 아이소타입 대조군에 비해 현저하게 더 많은 IFN-γ를 유도하였음을 보인다.
실시예 21: wtADA2 및 mutADA2는 T 세포 증식의 아데노신-매개된 억제의 필적하는 역전을 보였다.
T 세포 증식의 아데노신-매개된 억제를 역전시키는 wtADA2 및 mutADA2의 유효성을, 증가하는 농도의 항-PD1-wtADA2, 항-PD1-mutADA2, 항-RSV-wtADA2 및 항-RSV-mutADA2의 존재하에서 아데노신을 함유하는 배지에서 -표지된 PBMC를 자극함으로써 평가하였다. 세포를 염색하고, 이어서 유식 세포측정에 의해 증식에 대해 분석하였다. wtADA2 및 mutADA 융합 단백질 모두 CD4 T 세포(도 27A) 및 CD8 T 세포(도 27B)의 아데노신-매개된 억제의 역전에 균등하게 유효하였다.
실시예 22: 항-PD1(VH6/VL5)-ADA2에 의한 PD1-PDL1 상호작용의 차단
PD1/PD-L1 상호작용을 차단하는 다양한 형태의 항-PD1-ADA2 융합 단백질의 능력을 실시예 12에서 언급한 바와 같이 리포터 생물분석을 사용하여 평가하였다.
도 28에 도시된 바와 같이, 항-PD1(VH6/VL5)scFv-Fc-ADA2, hIgG1-ADA2 및 scFv-ADA2는 모두 PD1/PD-L1 차단 생물분석에 의해 측정된 바와 같이 기능 활성을 보였다.
실시예 23: 항-PD1-ADA2-scFv-Fc의 ADA 효소 활성
아데노신을 효소적으로 분해하는 다양한 형태의 항-PD1-ADA2 융합 단백질의 능력을 실시예 12에서 언급한 바와 같이 시험관내 ADA 효소 활성 분석에서 평가하였다.
도 29에 도시된 바와 같이, 항-PD1(VH7/VL6) scFv-Fc-ADA2 및 (VH6/VL5) scFv-Fc-ADA2는 대조군에 필적하는 유사한 ADA2 효소 활성을 갖는다.
실시예 24: 다양한 항-PD1-ADA2 및 항-PD1-mutADA2 구조물의 ADA 효소 활성
ADA 효소 활성 분석을 상술한 바와 같이 수행하였다. 도 30에 도시된 바와 같이, 10 nM의 아데노신에서 mutADA2는 wtADA2에 비해 더 높은 효소 활성을 갖는다.
실시예 25: 항-PD1-ADA2는 원발성 CRC 환자 종양에서 IFN-γ 생성 및 종양-침윤성 림프구(TIL)의 증식을 촉진하였다.
CRC 환자로부터 정제된 PBMC를 합치되는 해리된 종양 세포와 공-배양하였다. CellTrace Violet-표지된 세포를 아이소타입 대조군, 항-PD1(VH6/VL5) 또는 항-PD1(VH6/VL5)-wtADA2 융합 단백질의 존재하에서 항-CD3 및 항-CD28로 자극하였다. 배양 상등액을 수집하고 IFN-γ 수준을 제조사의 프로토콜에 따라 MSD에 의해 정량분석하고 세포를 T 세포 증식에 대해 평가하였다. 유전자 발현 분석을 위해서, 세포 펠릿을 원심분리에 의해 수확하고 RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 Qiagen RNAeasy 미세 키트를 사용하여 정제하였다. 정제된 RNA를 제조사의 설명에 따라 나노스트링을 사용하는 유전자 발현 분석에 사용하였다. 유전자 발현을 Nanostring nCounter 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
도 31A에 도시된 바와 같이, 항-PD1-wtADA2 융합 단백질은 항-PD1 또는 아이소타입 대조군에 비해 더 높은 수준의 IFN-γ 생성 및 T 세포 증식(도 31B)을 촉진하였다. 항-PD1-wtADA2 융합 단백질 처리는 항-PD1 처리에 비해 IFN-γ 신호전달 및 케모카인 신호전달 유전자 및 세포독성 유전자의 현저한 상향 조절을 생성시켰으며(도 31C) 이는 항-PD1 항체에 비해 종양의 존재하에서 T 세포의 개선된 세포독성 기능을 강조한다.
실시예 26: 폐암의 인간화된 마우스 모델에서 항-PD1-wtADA2 융합 단백질의 효과
말초 혈액 단핵세포로 인간화된 NSG 마우스를 췌장암 세포주 Panc.08.fLuc.eGFP로 췌장내(동소 주사) 접종하였다. 마우스 체중을 매주 측정하고 종양 중량을 38일째 연구의 끝에서 측정하였다. 마우스를 처리 그룹으로 무작위 분류하고 HBSS(비히클 대조군), 항-PD1(VH6/VL5) 및 항-PD1(VH6/VL5)-wtADA2로 매주 2회 처리하였다. 도 32에서 볼 수 있는 바와 같이, 항-PD-wtADA2로 처리된 마우스는 항-PD1 또는 아이소타입 대조군으로 처리된 마우스에 비해 현저하게 더 작은 종양을 가졌다.
도 32에서 볼 수 있는 바와 같이, 항-PD-wtADA2로 처리된 마우스는 항-PD1 또는 아이소타입 대조군으로 처리된 마우스에 비해 현저하게 더 작은 종양을 가졌다.
실시예 27: 항-PD1(VH6/VL5)-wtADA2의 처리는 아데노신 경로, 혈관형성을 하향조절하고 세포독성 및 사이토카인 유전자를 상향조절하였다.
CRC 환자로부터 정제된 PBMC를 합치되는 해리된 종양 세포와 공-배양하였다. CellTrace Violet-표지된 세포를 아이소타입 대조군, 항-PD1(VH6/VL5) 또는 항-PD1(VH6/VL5)-wtADA2 융합 단백질의 존재하에서 항-CD3 및 항-CD28로 자극하였다. 배양 상등액을 수집하고 IFN-γ 수준을 제조사의 프로토콜에 따라 MSD에 의해 정량분석하고 세포를 T 세포 증식에 대해 평가하였다. 유전자 발현 분석을 위해서, 배양물을 복제하고 세포 펠릿을 원심분리에 의해 수확하고 RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 Qiagen RNAeasy 미세 키트를 사용하여 정제하였다. 정제된 RNA를 제조사의 설명에 따라 나노스트링을 사용하는 유전자 발현 분석에 사용하였다. 유전자 발현을 Nanostring nCounter 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
항-PD1-wtADA2 융합 단백질은 항-PD1 또는 아이소타입 대조군에 비해 더 높은 수준의 IFN-γ 생성 및 T 세포 증식을 촉진하였다. 항-PD1-wtADA2 융합 단백질 처리는 또한 항-PD1 처리에 비해 IFN-γ 신호전달 및 케모카인 신호전달 유전자 및 세포독성 유전자의 현저한 상향 조절을 생성시켰으며(데이터 도시 안 됨) 이는 항-PD1 항체에 비해 종양의 존재하에서 T 세포의 개선된 세포독성 기능을 강조한다.
서열
본원은 본원에 제공된 구현예에 포함된 몇몇 서열의 전형적인 목록을 제공한다.
[표 4]
비제한적인 예시적인 폴리펩티드 및 뉴클레오티드 서열
Figure pct00004
Figure pct00005
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Figure pct00029
[표 12]
예시적인 항-TGF-β VH 및 VL 서열
표 12는 본원에 기재된 항-PD1 융합 단백질에 사용하기 위한 예시적인 TGF-β 수용체 서열을 제공한다. 예를 들어 TGFβRII ECD와의 융합 단백질을 예시하는 임의의 구현예에서, 항-TGF-β 항체(예를 들어 scFv, Fab)를 대신 사용할 수 있다.
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
예시적인 TGFβ1 억제성 펩티드 및 뉴클레오티드 서열
표 13은 본원에 기재된 항-PD1 융합 단백질에 사용하기 위한 예시적인 TGF-β1 억제성 펩티드를 제공한다. 예를 들어 TGFβRII ECD와의 융합 단백질을 예시하는 임의의 구현예에서, TGFβ1 억제성 펩티드를 대신 사용할 수 있다.
명칭 서열
번호		 아미노산 서열 서열
번호 		뉴클레오티드 서열
TGFb1-I36 263 HANFCLGPCPYIWSLA 268 CACGCCAACTTCTGCCTGGGCCCCTGCCCCTACATCTGGAGCCTGGCC
TGFb1-I37 264 FCLGPCPYIWSLDTA 269 TTCTGCCTGGGCCCCTGCCCCTACATCTGGAGCCTGGACACCGCC
TGFb1-I38 265 SNPYSAFQVDIIVDIA 270 AGCAACCCCTACAGCGCCTTCCAGGTGGACATCATCGTGGACATCGCC
TGFb1-I39 266 TSLDATMIWTMMA 271 ACCAGCCTGGACGCCACCATGATCTGGACCATGATGGCC
TGFb1-I40 267 TSLDASIWAMMQNA 272 ACCAGCCTGGACGCCAGCATCTGGGCCATGATGCAGAACGCC
[표 14]
예시적인 ADA2 서열
표 14는 본원에 기재된 항-PD1 융합 단백질에 사용하기 위한 예시적인 ADA2 서열을 제공한다. 예를 들어 TGFβRII ECD와의 융합 단백질을 예시하는 임의의 구현예에서, ADA2 서열을 대신 사용할 수 있다.
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
표 15는 본원에 기재된 융합 단백질에 사용하기 위한 예시적인 항-PD1 VH/VL 쌍을 제공한다
예시적인 항-PD1 VL 예시적인 항-PD1 VH
항-PD1 VL5 (서열번호 12) 항-PD1 VH6 (서열번호 6)
항-PD1 VL6 (서열번호 13 항-PD1 VH7 (서열번호 7)
항-PD1 VL1 (서열번호 8) 항-PD1 VH5 (서열번호 5)
항-PD1 nVL1 (서열번호 8) 항-PD1 nVH3 (서열번호 149)
항-PD1 nVL1 (서열번호 8) 항-PD1 nVH7 (서열번호 157)
항 PD1 nVL1 (서열번호 8) 항-PD1 nVH8 (서열번호 158)
예시적인 항-PD1-TGFbRII ECD 융합 단백질 서열
표 16은 예시적인 항-PD1-TGFbRII ECD 융합 단백질 서열을 제공한다. 항-PD1 융합 단백질은 경쇄의 항-PD1 가변 영역을 암호화하는 서열 및 중쇄의 항-PD1 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함한다. ECD는 세포외 도메인을 나타낸다. "wt"는 야생형 서열을 지칭하고 "mut"는 돌연변이 서열을 지칭한다.
예시적인 VL 예시적인 VH-IgG4-ECD
VL5 (서열번호 15) VH6-IgG4(wt)-링커-ECD (서열번호 16)
VL5 (서열번호 15) VH6-IgG4(mut)-링커-ECD (서열번호 143)
VL5 (서열번호 15) VH6-IgG4(mut)-링커-ECD (서열번호 294)
VL6 (서열번호 296 VH7-IgG4(wt)-링커-ECD (서열번호 145)
VL6 (서열번호 296) VH7-IgG4(mut)-링커-ECD (서열번호 144)
VL6 (서열번호 296) VH7-IgG4(mut)-링커-ECD (서열번호 295)
예시적인 항-PD1-ADA2 융합 단백질 서열
표 17은 예시적인 항-PD1-ADA2 융합 단백질 서열을 제공한다. 항-PD1 융합 단백질은 경쇄의 항-PD1 가변 영역을 암호화하는 서열 및 중쇄의 항-PD1 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함한다. "wt"는 야생형 서열을 지칭하고 "mut"는 돌연변이 서열을 지칭한다.
예시적인 VL 예시적인 VH-IgG4-ADA2
VL5 (서열번호 12) VH6-IgG4(mut)-링커-ADA2 (wt)
(서열번호 280)
VL5 (서열번호 12) VH6-IgG4(mut)-링커-ADA2 (mut 7)
(서열번호 281)
VL6 (서열번호 13) VH7-IgG4(mut)-링커-ADA2 (wt)
(서열번호 282)
VL6 (서열번호 13) VH7-IgG4(mut)-링커-ADA2 (mut 7)
(서열번호 283)

Claims (120)

  1. a. 세포예정사 단백질-1(PD-1)에 결합하는 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 상기 항체의 변이체; 및
    b. 형질전환 성장인자 베타(TGF-β) 사이토카인 트랩
    을 포함하는 융합 단백질로, 융합 단백질의 하나 이상의 폴리펩티드가 링커에 의해 연결된, 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    링커가 (G4S)n을 포함하고, n이 2, 3, 4, 5, 또는 6인 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    링커가 (Gly)n을 포함하고, n이 6, 7, 또는 8인 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    링커가 (EAAAK)n을 포함하고, n이 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6인 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    링커가 A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A를 포함하는 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    링커가 서열번호 17-34 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    TGF-β 사이토카인 트랩이 형질전환 성장인자 수용체(TGFβR), 또는 그의 기능성 단편, 항-TGF-β 항체 또는 그의 항원 결합 단편, TGF-β1 억제성 펩티드 또는 그의 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  8. 제7항에 있어서,
    TGFβR이 형질전환 성장인자 베타 수용체 II(TGFβRII) 또는 그의 기능성 단편인 융합 단백질.
  9. 제8항에 있어서,
    TGFβRII의 기능성 단편이 TGFβRII 세포외 도메인(ECD)인 융합 단백질.
  10. 제9항에 있어서,
    ECD가 TGF-β1에 결합하는 융합 단백질.
  11. 제9항에 있어서,
    ECD가 TGF-β3에 결합하는 융합 단백질.
  12. 제9항에 있어서,
    ECD가 TGF-β1 및 TGF-β3에 결합하는 융합 단백질.
  13. 제12항에 있어서,
    ECD가 TGF-β1 및 TGF-β3에 결합하지만 TGF-β2에는 결합하지 않는 융합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    TGF-β 사이토카인 트랩이 서열번호 14, 서열번호 141 또는 서열번호 142에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 융합 단백질.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    TGF-β 사이토카인 트랩이 서열번호 14, 서열번호 141 또는 서열번호 142에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 융합 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    TGF-β 사이토카인 트랩이 서열번호 14에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 융합 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체(항-PD1)가 면역글로불린 G(IgG) 항체인 융합 단백질.
  18. 제17항에 있어서,
    IgG가 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4인 융합 단백질.
  19. 제18항에 있어서,
    IgG4가 서열번호 146 또는 서열번호 292의 108번 위치에 돌연변이를 포함하는 융합 단백질.
  20. 제19항에 있어서,
    돌연변이가 S108P 돌연변이인 융합 단백질.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    IgG4가 링커에 의해 TGF-β 사이토카인 트랩에 연결된 융합 단백질.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체의 단편이 Fab, (Fab)2, (Fab')2, Fv, (Fv)2, 또는 scFv인 융합 단백질.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 상기 항체의 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함하는 융합 단백질.
  24. 제23항에 있어서,
    링커가 중쇄의 가변 영역(VH)을 TGF-β 사이토카인 트랩에 연결하는 융합 단백질.
  25. 제23항에 있어서,
    링커가 경쇄의 가변 영역(VL)을 TGF-β 사이토카인 트랩에 연결하는 융합 단백질.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄의 가변 영역(VH)이 융합 단백질 중의 제2 링커에 의해 경쇄의 가변 영역(VL)에 연결되는 융합 단백질.
  27. 제26항에 있어서,
    제2 링커가 서열번호 17-34 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 융합 단백질.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄의 가변 영역(VH)이 서열번호 1-7 및 149-164 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일한 융합 단백질.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    경쇄의 가변 영역(VL)이 서열번호 8-13 및 148 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일한 융합 단백질.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄의 가변 영역(VH)이 서열번호 1-7 및 149-164 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 융합 단백질.
  31. 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    경쇄의 가변 영역(VL)이 서열번호 8-13 및 148 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 융합 단백질.
  32. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄의 가변 영역(VH)이 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 90% 동일하고, 경쇄의 가변 영역(VL)이 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 90% 동일한 융합 단백질.
  33. 제32항에 있어서,
    중쇄의 가변 영역(VH)이 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하고 경쇄의 가변 영역(VL)이 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 융합 단백질.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 16에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 융합 단백질.
  35. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 143에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 융합 단백질.
  36. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄의 가변 영역(VH)이 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 90% 동일하고, 경쇄의 가변 영역이 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 90% 동일한 융합 단백질.
  37. 제36항에 있어서,
    중쇄의 가변 영역(VH)이 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하고 경쇄의 가변 영역(VL)이 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 융합 단백질.
  38. 제1항 내지 제31항, 제36항, 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 296에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 145에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 융합 단백질.
  39. 제1항 내지 제31항, 제36항, 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 296에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 144에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 융합 단백질.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 결정가능 단편(fragment crystallizable region; FC)을 추가로 포함하는 융합 단백질.
  41. 제40항에 있어서,
    FC가 인간 FC1, FC2, FC3, FC4, 또는 그의 단편인 융합 단백질.
  42. 제40항에 있어서,
    FC가 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 융합 단백질.
  43. 제22항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 scFv 및 FC 단편을 포함하는 융합 단백질.
  44. 제7항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    TGF-β 사이토카인 트랩이 항-TGF β 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질.
  45. 제44항에 있어서,
    항-TGF β 항체가 서열번호 166, 168, 169, 171, 173, 175, 또는 177에 의해 암호화된 VH, 및 서열번호 165, 167, 170, 172, 174, 176, 또는 178에 의해 암호화된 VL을 포함하는 융합 단백질.
  46. 제7항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    TGF β 사이토카인 트랩이 TGF β 억제성 펩티드 또는 그의 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  47. 제46항에 있어서,
    TGF β 억제성 펩티드가 서열번호 193-227 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 융합 단백질.
  48. 제1항 내지 제47항, 및 제117항 내지 제120항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  49. 제1항 내지 제47항, 및 제117항 내지 제120항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로, 상기 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동적으로 연결되는 발현 벡터.
  50. 제49항에 있어서,
    프로모터가 구성적 프로모터, 조직 특이성 프로모터, 또는 유도성 프로모터인 발현 벡터.
  51. 제50항에 있어서,
    유도성 프로모터가 소분자 리간드-유도성 2 폴리펩티드 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치인 발현 벡터.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    아데노바이러스 벡터인 발현 벡터.
  53. (a) 제1항 내지 제47항 및 제117항 내지 제120항 중 어느 한 항의 융합 단백질;
    (b) 제1항 내지 제47항 및 제117항 내지 제120항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 또는
    (c) 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항의 발현 벡터; 및
    (d) 약학적으로 허용 가능한 부형제
    를 포함하는 약학 조성물.
  54. (a) 제1항 내지 제47항 및 제117항 내지 제120항 중 어느 한 항의 융합 단백질;
    (b) 제1항 내지 제47항 및 제117항 내지 제120항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 또는
    (c) 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항의 발현 벡터
    와 세포를 접촉시킴을 포함하는 암 치료 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    세포가 암세포인 방법.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서,
    세포가 포유동물 세포인 방법.
  57. 암을 가진 대상체의 치료 방법으로, 상기 방법은
    (a) 세포예정사 단백질-1(PD-1)에 결합하는 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 변이체; 및
    (b) 형질전환 성장인자 수용체(TGFβR) 또는 그의 기능성 단편, 항-TGF-β 항체 또는 그의 항원 결합 단편, TGF-β1 억제성 펩티드 또는 그의 변이체
    를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 투여함을 포함하며;
    상기 융합 단백질의 하나 이상의 폴리펩티드가 링커에 의해 연결된, 방법.
  58. 제57항에 있어서,
    링커가 (G4S)n을 포함하고, n이 2, 3, 4, 5, 또는 6인 방법.
  59. 제57항에 있어서,
    링커가 (Gly)n을 포함하고, n이 6, 7, 또는 8인 방법.
  60. 제57항에 있어서,
    링커가 (EAAAK)n을 포함하고, n이 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6인 방법.
  61. 제57항에 있어서,
    링커가 A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A를 포함하는 방법.
  62. 제57항에 있어서,
    링커가 서열번호 17-34 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 방법.
  63. 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    형질전환 성장인자 수용체 단백질이 TGFβRII인 방법.
  64. 제63항에 있어서,
    TGFβRII의 기능성 단편이 TGFβRII 세포외 도메인(ECD)인 방법.
  65. 제57항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    TGF-β 사이토카인 트랩이 서열번호 14, 서열번호 141 또는 서열번호 142에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 방법.
  66. 제57항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    TGF-β 사이토카인 트랩이 서열번호 14, 서열번호 141 또는 서열번호 142에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 방법.
  67. 제57항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 면역글로불린 G(IgG) 항체인 방법.
  68. 제57항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    IgG가 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4인 방법.
  69. 제68항에 있어서,
    IgG4가 서열번호 146 또는 서열번호 292의 108번 위치에 돌연변이를 포함하는 방법.
  70. 제69항에 있어서,
    돌연변이가 S108P 돌연변이인 방법.
  71. 제57항에 있어서,
    항체의 단편이 상기 항체의 Fab, (Fab)2, (Fab')2, Fv, (Fv)2, 또는 scFv인 방법.
  72. 제57항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 상기 항체의 단편 또는 상기 항체의 변이체가 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함하는 방법.
  73. 제72항에 있어서,
    링커가 중쇄의 가변 영역(VH)을 TGF-β 사이토카인 트랩에 연결하는 방법.
  74. 제72항에 있어서,
    링커가 경쇄의 가변 영역(VL)을 TGF-β 사이토카인 트랩에 연결하는 방법.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄의 가변 영역(VH)이 제2 링커에 의해 경쇄의 가변 영역(VL)에 연결되는 방법.
  76. 제72항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄의 가변 영역(VH)이 서열번호 1-7 및 149-164 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일한 방법.
  77. 제72항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    경쇄의 가변 영역(VL)이 서열번호 8-13 및 148 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일한 방법.
  78. 제72항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄의 가변 영역(VH)이 서열번호 1-7 및 149-164 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 방법.
  79. 제72항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
    경쇄의 가변 영역(VL)이 서열번호 8-13 및 148 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 방법.
  80. 제72항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄의 가변 영역(VH)이 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 90% 동일하고, 경쇄의 가변 영역(VL)이 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 90% 동일한 방법.
  81. 제80항에 있어서,
    중쇄의 가변 영역(VH)이 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하고 경쇄의 가변 영역(VL)이 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 방법.
  82. 제57항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질이 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 16에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 방법.
  83. 제57항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질이 서열번호 15(VL5 Igg4)에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 143에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 방법.
  84. 제72항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄의 가변 영역(VH)이 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 90% 동일하고, 경쇄의 가변 영역(VL)이 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열과 적어도 90% 동일한 방법.
  85. 제84항에 있어서,
    중쇄의 가변 영역이 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하고 경쇄의 가변 영역이 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 방법.
  86. 제57항 내지 제79항, 제84항, 및 제85항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질이 서열번호 296에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 145에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 방법.
  87. 제57항 내지 제79항, 제84항, 및 제85항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질이 서열번호 296에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 144에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 방법.
  88. 제57항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 결정가능 단편(FC)을 추가로 포함하는 방법.
  89. 제88항에 있어서,
    FC가 인간 FC1, FC2, FC3, FC4, 또는 그의 단편인 방법.
  90. 제88항에 있어서,
    FC가 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 방법.
  91. 제71항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 scFv 및 FC 단편을 포함하는 방법.
  92. 제57항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 불응성(refractory) 암인 방법.
  93. 제57항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 PD-1 항체 또는 CTLA-4 항체에 의한 치료에 비-반응성인 방법.
  94. 제57항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 추가적인 항암제를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  95. 제94항에 있어서,
    추가적인 항암제가 PD-1 억제제, PD-L1 억제제 또는 CTLA-4 억제제인 방법.
  96. 제95항에 있어서,
    PD-1 억제제가 항-PD-1 항체 또는 그의 단편 또는 변이체인 방법.
  97. 제95항에 있어서,
    CTLA-4 억제제가 항-CTLA-4 항체 또는 그의 단편 또는 변이체인 방법.
  98. 제57항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 사이토카인을 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  99. 제57항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 포유동물 대상체인 방법.
  100. 제57항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 인간인 방법.
  101. 제57항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 중피종, 교모세포종, 자궁내막암, 대장암, 위암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 유방암, 위암, 방광암, 간암, 호지킨 림프종, 폐암, 피부암, 신장암 또는 두경부암인 방법.
  102. 제101항에 있어서,
    피부암이 피부 편평세포 암종, 흑색종 또는 기저세포암인 방법.
  103. 제101항에 있어서,
    폐암이 비 소세포 폐암(NSLC) 또는 소세포 폐암(SCLC)인 방법.
  104. 제101항에 있어서,
    유방암이 3중 음성 유방암(TNBC)인 방법.
  105. 제57항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서,
    외인성 수용체를 발현하도록 조작된 T 세포의 유효량을 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  106. 제105항에 있어서,
    외인성 수용체가 키메라 항원 수용체인 방법.
  107. 제106항에 있어서,
    키메라 항원 수용체가 조작된 T-세포 수용체인 방법.
  108. 제106항 또는 제107항에 있어서,
    키메라 항원 수용체가 CD19, BCMA, CD44, α-폴레이트 수용체, CAIX, CD30, ROR1, CEA, EGP-2, EGP-40, HER2, HER3, 폴레이트-결합 단백질, GD2, GD3, IL-13R-a2, KDR, EDB-F, 메소텔린, CD22, EGFR, 폴레이트 수용체 α, MUC-1, MUC-4, MUC-16, MAGE-A1, h5T4, PSMA, TAG-72, EGFR, CD20, EGFRvIII, CD123 또는 VEGF-R2 상의 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 방법.
  109. 제108항에 있어서,
    항원 결합 도메인이 서열번호 37-56 중에서 선택된 서열을 포함하는 방법.
  110. 제108항에 있어서,
    항원 결합 도메인이 서열번호 35 및 36 중에서 선택된 서열을 포함하는 방법.
  111. 제107항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서,
    조작된 T-세포의 유효량이 적어도 102 세포/㎏인 방법.
  112. 제107항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서,
    조작된 T-세포의 유효량이 적어도 104 세포/㎏인 방법.
  113. 제107항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서,
    조작된 T-세포의 유효량이 적어도 105 세포/㎏인 방법.
  114. 제107항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서,
    조작된 T-세포가 사이토카인을 또한 발현하는 방법.
  115. 제114항에 있어서,
    사이토카인이 IL-15 및 IL-15Rα를 포함하는 융합 단백질인 방법.
  116. 암 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법으로,
    (a) 세포예정사 단백질-1(PD-1)에 결합하는 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 상기 항체의 변이체; 및 형질전환 성장인자 수용체(TGFβR) 단백질 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 투여하고; 상기 융합 단백질의 하나 이상의 폴리펩티드가 링커에 의해 연결됨; 및
    (b) 유효량의 조작된 T-세포의 하나 이상의 용량을 대상체에게 투여함을 포함하고, 상기 조작된 T-세포가 키메라 수용체 및 막 결합된 IL-15를 포함하는, 방법.
  117. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 294에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 융합 단백질.
  118. 제1항 내지 제31항, 제36항, 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 296에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 295에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 융합 단백질.
  119. 제57항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질이 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 294에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 방법.
  120. 제57항 내지 제79항, 제84항, 및 제85항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질이 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열 및 서열번호 295에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 방법.
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