BR112020021111A2

BR112020021111A2 - anticorpo multiespecífico, ácido nucleico e formulação farmacêutica

Info

Publication number: BR112020021111A2
Application number: BR112020021111-7A
Authority: BR
Inventors: Stefan Dengl; Silke Kirchner; Sebastian Fenn; Jens Fischer; Claudia Kirstenpfad; Stefan Klostermann; Joerg Moelleken; Georg Tiefenthaler; Alexander BUJOTZEK; Meher Majety
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2018-04-18
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2021-02-17
Also published as: PE20210517A1; MX2020010946A; AR115052A1; MA52285A; CL2020002539A1; CO2020012360A2; CN111989343B; JP2023081898A; IL277559A; KR20210005639A; TW201945394A; US20210147554A1; AU2019256744A1; JP2021521785A; EP3781594A1; CA3095547A1; SG11202009692SA; PH12020500667A1; CN111989343A; WO2019202041A1

Abstract

A presente invenção diz respeito a anticorpos multiespecíficos que se ligam ao HLA-G e a um antígeno de ativação de célula T, a preparação dos mesmos, e formulações e métodos de uso dos mesmos.

Description

“ANTICORPO MULTIESPECÍFICO, ÁCIDO NUCLEICO E FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA”

[001] A presente invenção diz respeito a anticorpos multiespecíficos que se ligam ao HLA-G e um antígeno de ativação de célula T, a preparação dos mesmos, formulações e métodos de uso dos mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O Complexo Principal de Histocompatibilidade humano, classe I, 6, também conhecido como antígeno leucocitário humano G (HLA-G), é uma proteína que em humanos é codificada pelo gene HLA-G. O HLA-G pertence aos parálogos de cadeia pesada do HLA classe I não clássico. Esta molécula de classe I é um heterodímero que consiste em uma cadeia pesada e uma cadeia leve (microglobulina beta-2). A cadeia pesada é ancorada na membrana, mas também pode ser extravasada/secretada.

[003] • A cadeia pesada consiste em três domínios: alfa 1, alfa 2 e alfa 3. Os domínios alfa 1 e alfa 2 formam um sulco de ligação do peptídeo flanqueado por duas alfa-hélices. Peptídeos pequenos (aproximadamente 9 mers) podem ligar-se a este sulco semelhante a outras proteínas MHC I.

[004] • A segunda cadeia é a microglobulina beta 2 que se liga à cadeia pesada semelhante a outras proteínas MHC I.

[005] Para o HLA-G, existem 7 isoformas, 3 formas secretadas e 4 formas ligadas à membrana (tal como mostrado esquematicamente na Fig.1).

[006] O HLA-G pode formar estruturas oligoméricas complexas funcionalmente ativas (Kuroki, K et al. Eur J Immunol. 37 (2007) 1727–1729).

Dímeros ligados por ligações dissulfídicas são formados entre Cys 42 de duas moléculas HLA-G. (Shiroishi M et al., J Biol Chem 281 (2006) 10439-10447. Trímeros e complexos tetraméricos também foram descritos, por exemplo, em Kuroki, K et al. Eur J Immunol. 37 (2007) 1727–1729, Allan D.S., et al. J

Immunol Methods. 268 (2002) 43-50 e T Gonen-Gross et al., J Immunol 171 (2003)1343-1351).

[007] O HLA-G é expresso predominantemente em citotrofoblastos na placenta. Vários tumores (incluindo pancreático, de mama, pele, colorretal, gástrico e ovariano) expressam HLA-G (Lin, A. et al., Mol Med.

21 (2015) 782-791; Amiot, L., et al., Cell Mol Life Sci. 68 (2011) 417–431). A sua expressão também foi relatada como associada a condições patológicas como doenças inflamatórias, GvHD e câncer. Foi relatado que a expressão de HLA-G está associada a um mau prognóstico no câncer. As células tumorais escapam da vigilância imunológica do hospedeiro induzindo tolerância/supressão imunológica através da expressão de HLA-G.

[008] O HLA-G compartilha alta homologia (> 98%) com outras moléculas do MHC I, portanto, anticorpos verdadeiramente específicos para HLA-G sem reatividade cruzada com outras moléculas do MHC I são difíceis de gerar.

[009] Alguns anticorpos que interagem de diferentes maneiras com o HLA-G foram descritos anteriormente: Tissue Antigens, 55 (2000) 510- 518 refere-se a anticorpos monoclonais, por exemplo, 87G, e MEM-G/9; Neoplasma 50 (2003) 331-338 refere-se a determinados anticorpos monoclonais que reconhecem o complexo oligomérico HLA-L intacto (por exemplo, 87G e MEM-G9) assim como a cadeia pesada livre de HLA-G (por exemplo, 4H84, MEM-G/1 e MEM-G/2); Hum Immunol. 64 (2003) 315-326 refere-se a vários anticorpos testados em células tumorais JEG3 que expressam HLA-L (por exemplo, MEM-G/09 e -G/13 que reage exclusivamente com moléculas HLA-G1 nativas. MEM-G/01 reconhece (semelhante ao mAb 4H84) a cadeia pesada HLA-G desnaturada em todas as isoformas, enquanto MEM-G/04 reconhece isoformas HLA-G1, -G2 e -G5 seletivamente desnaturadas; Wiendl et al., Brain 2003; 176-85 relaciona-se com diferentes anticorpos monoclonais para HLA-G como por exemplo 87G, 4H84, MEM-G/9.

[010] As publicações acima relatam anticorpos, que se ligam ao HLA-G humano ou ao complexo humano HLA-G/MHC β2M. Entretanto, devido ao alto polimorfismo e alta homologia da família HLA, a maioria dos anticorpos carece de propriedades de ligação ao HLA-G verdadeiramente específicas e frequentemente esses anticorpos também se ligam ou reagem de forma cruzada com outros membros da família HLA (como complexo MHC com ß2M ou forma livre de ß2M) ou eles simplesmente não inibem a ligação do complexo MHC ß2M HLA-G aos seus receptores ILT2 e/ou ILT4 (e não são considerados como anticorpos antagonistas).

[011] Os anticorpos biespecíficos que se ligam a um antígeno de superfície nas células alvo e a um antígeno de ativação de célula T, tal como CD3 em células T (também são denominados na presente pedido como anticorpos biespecíficos de células T ou “TCBs”), são promissores para o tratamento de vários cânceres. A ligação simultânea de tal anticorpo aos seus alvos irá forçar uma interação temporária entre a célula alvo e a célula T, provocando a reticulação do receptor de célula T e a subsequente ativação de qualquer célula T citotóxica e a subsequente lise da célula alvo. Dada a sua potência na morte de células alvo, a escolha do alvo e a especificidade do anticorpo alvo são de extrema importância para os anticorpos biespecíficos de células T, para evitar toxicidades dentro e fora do alvo. As proteínas intracelulares, como a WT1, representam alvos atraentes, mas são acessíveis apenas a anticorpos do tipo receptor de células T (TCR) que se ligam ao Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC), apresentando antígenos peptídicos derivados da proteína intracelular na superfície celular. Uma questão inerente aos anticorpos do tipo TCR é a reatividade cruzada potencial com moléculas MHC per se, ou moléculas MHC que apresentam peptídeos diferentes do desejado, o que pode comprometer a seletividade de órgãos ou tecidos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[012] A invenção fornece um anticorpo multiespecífico que se liga ao HLA-G humano e a um antígeno de ativação de célula T (particularmente CD3 humano), compreendendo uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga ao HLA-G humano e uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno de ativação de célula T (particularmente CD3 humano).

[013] Em um aspecto, o anticorpo multiespecífico que se liga ao HLA-G humano e ao CD3 humano, compreendendo uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga ao HLA-G humano e uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga ao CD3 humano, não reage de forma cruzada com um complexo HLA-G ß2M MHC I humano (em que os aminoácidos específicos do HLA-G foram substituídos por aminoácidos de consenso HLA-A) compreendendo a SEQ ID NO: 44.

[014] Em um exemplo de realização da invenção, o anticorpo multiespecífico é biespecífico; e - a primeira porção de ligação ao antígeno do anticorpo que se liga ao HLA-G humano compreende; A) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ

ID NO: 3; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou

B) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ

ID NO: 11; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou

C) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ

ID NO: 19; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou

D) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ

ID NO: 27; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; - e a segunda porção de ligação ao antígeno, que se liga a um antígeno de ativação de célula T, liga-se ao CD3 humano, e compreende; E) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 58; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61.

[015] Em um exemplo de realização da invenção, a primeira porção de ligação ao antígeno: A) i) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 8; ii) ou a variante humanizada da VH e VL do anticorpo de (i); ou iii) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 33 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 34; ou B) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16; ou C) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 24; ou

D) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32; - e a segunda porção de ligação ao antígeno: E) - compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 62 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 63.

[016] Em um exemplo de realização do anticorpo multiespecífico: - a primeira porção de ligação ao antígeno compreende: i) uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32; ou ii) uma sequência VH de SEQ ID NO: 33 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 34; e e a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 62 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 63.

[017] Em um exemplo de realização da invenção, o anticorpo multiespecífico: a) não reage de forma cruzada com um complexo MHC I ß2M HLA-G humano modificado compreendendo a SEQ ID NO: 44; e/ou b) não reage de forma cruzada com o complexo MHC I ß2M HLA-A2 humano compreendendo a SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 37; e/ou c) não reage de forma cruzada com um complexo MHC I ß2M H2Kd de camundongo compreendendo a SEQ ID NO: 45; e/ou d) não reage de forma cruzada com o complexo MHC I ß2M RT1A de rato compreendendo a SEQ ID NO: 47; e/ou e) inibe a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G monomérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43); e/ou f) inibe a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G trimérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43), em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 60%) (quando comparado com a ligação sem anticorpo) (consulte o Exemplo 4b); e/ou g) inibe a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G monomérico e/ou dimérico e/ou trimérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43) em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%) (quando comparado com a ligação sem anticorpo) (vide o Exemplo 4b); e/ou h) inibe a ligação de ILT2 às células JEG3 (ATCC Nº.

HTB36) (HLA-G) (em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%)) (quando comparada com a ligação sem anticorpo) (consulte o Exemplo 6); e/ou i) liga-se as células (HLA-G) JEG3 (ATCC Nº. HTB36) (consulte o Exemplo 5) e inibe a ligação de ILT2 às células JEG-3 (HLA-G) (ATCC Nº. HTB36) (em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%)) (quando comparada com a ligação sem anticorpo) (consulte o Exemplo 6); e/ou j) inibe a ligação de CD8a ao HLAG em mais de 80% (quando comparada à ligação sem anticorpo) (consulte, por exemplo, o Exemplo 4c), e/ou k) restaura a resposta imune suprimida específica de HLA-G (por exemplo, liberação suprimida do fator de necrose tumoral (TNF) alfa) por monócitos cocultivados com células JEG-3 (ATCC HTB36), e/ou l) induz a citotoxicidade mediada por células T na presença de células tumorais que expressam HLAG (por exemplo, células JEG-3 (ATCC HTB36) (consulte o Exemplo 12).

[018] Em um exemplo de realização da invenção, a primeira e segunda porções de ligação ao antígeno são moléculas Fab (cada uma sendo uma molécula Fab).

[019] Em um exemplo de realização da invenção, a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1, particularmente os domínios variáveis VL e VH, da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos entre si.

[020] Em um exemplo de realização da invenção, a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que no domínio constante, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat); e no domínio constante CH1 o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[021] Em um exemplo de realização da invenção, a primeira e segunda porções de ligação ao antígeno são fundidas entre si, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[022] Em um exemplo de realização da invenção, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são, cada uma, uma molécula Fab, e em que (i) a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida pela porção C- terminal da cadeia pesada Fab à porção N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno, ou (ii) a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida pela porção C-terminal da cadeia pesada Fab à porção N- terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno.

[023] Em um exemplo de realização da invenção, o anticorpo multiespecífico compreende uma terceira porção de ligação ao antígeno.

[024] Em um exemplo de realização da invenção, a terceira porção de ligação ao antígeno é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno.

[025] Em um exemplo de realização, o anticorpo multiespecífico compreende um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade.

[026] Em um exemplo de realização da invenção, a primeira, a segunda e, quando presente, a terceira porção de ligação ao antígeno são, cada uma, uma molécula Fab; e em que (i) a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno e a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc, ou (ii) a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc; e em que, a terceira porção de ligação ao antígeno (quando presente) está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da segunda subunidade do domínio Fc.

[027] A invenção provê um ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.

[028] A invenção provê uma célula hospedeira compreendendo esse ácido nucleico.

[029] A invenção provê um método de produção de um anticorpo compreendendo o cultivo da célula hospedeira de modo que o anticorpo é produzido.

[030] A invenção provê esse método de produção de um anticorpo, compreendendo ainda a recuperação do anticorpo a partir da célula hospedeira.

[031] A invenção provê uma formulação farmacêutica compreendendo o anticorpo descrito na presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[032] A invenção provê o anticorpo descrito na presente invenção para uso como um medicamento.

[033] A invenção provê o anticorpo descrito na presente invenção para uso no tratamento do câncer.

[034] A invenção provê o uso do anticorpo descrito na presente invenção na fabricação de um medicamento. Em um exemplo de realização, o medicamento é para o tratamento do câncer.

[035] A invenção provê um método de tratamento de um indivíduo com câncer, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo descrito na presente invenção ao indivíduo.

[036] Com os métodos de triagem descritos na presente invenção, novos anticorpos anti-HLA-G podem ser selecionados. Estes anticorpos apresentam propriedades altamente valiosas como forte inibição da ligação de ILT2 ao HLA-G expresso em células JEG3 ou inibição da ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G monomérico e/ou dimérico e/ou trimérico.

[037] Adicionalmente, os anticorpos de acordo com a presente invenção são capazes de restaurar uma resposta imune suprimida de forma específica por HLA-G, ou seja, a restauração da produção de TNFα por monócitos em cocultura com células expressando HLA-G:

[038] Além disso, os anticorpos são altamente específicos e não apresentam reatividade cruzada com complexos MHC I HLA-A ou complexos MHC I de origem de camundongo ou rato.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[039] Figura 1: Diferentes isoformas de HLA-G.

[040] Figura 2: Fig. 2A: Representação esquemática de HLA-G com molécula em associação com ß2M.

[041] Fig. 2B: Estrutura da molécula HLA-G em associação com certos receptores: estrutura HLA-G em complexo com determinados receptores, como ILT4 e KIR2DL1. Estrutura ILT4 (código PDB: 2DYP). A estrutura KIR2DL1 é retirada do código PDB 1IM9 (estrutura complexa KIR2DL1: HLA-Cw4) e foi posicionada sobre HLA-G por sobreposição das estruturas HLA-Cw4 e HLA-G. Os receptores são mostrados em uma representação de fita, HLA-G é mostrado em uma representação de superfície molecular. Os resíduos HLA-G que são únicos ou conservados em outros parálogos de HLA são coloridos em branco e cinza, respectivamente. Os resíduos de superfície únicos foram substituídos por uma sequência de consenso HLA no contra-antígeno quimérico.

[042] Figura 3: Anticorpos HLA-G que inibem (ou estimulam) a interação/ligação HLA-G com ILT2 e ILT4, bem como CD8.

[043] Figura 3A: inibição de ILT2.

[044] Figura 3B: inibição de ILT4.

[045] Figura 3C: Inibição de CD8.

[046] Figura 4: Análise de citometria de fluxo da expressão da superfície celular de HLA-G usando anticorpos HLA-G em JEG3 (células que expressam naturalmente HLA-G), células SKOV-3 (tipo selvagem (wt) versus células transfectadas com HLAG (HLAG+)), e células PA-TU-8902 (tipo selvagem (wt) versus células transfectadas com HLAG (HLAG+)).

[047] Fig. 4A: HLA-G-0031 (#0031); Fig. 4B: HLA-G-0039

(#0039); Fig. 4C: HLA-G-0041 (#0041); Fig. 4D: HLA-G-0090 (#0090).

[048] Figura 5: Fig. 5A: Anticorpos anti-HLA-G (0031, 0039, 0041 e 0090) bloqueiam/modulam a interação da quimera ILT2 Fc humana com HLA-G expresso em células JEG3.

[049] A coloração de HLA-G na superfície celular com os novos anticorpos anti-HLA-G foi avaliada usando um anticorpo secundário anti-IgG de rato conjugado com Alexa488 (linha superior). Nos histogramas FACS são mostradas células coradas apenas com anticorpo secundário (linhas pontilhadas cinza) e células coradas com anticorpos anti-HLA-G (linhas sólidas pretas). Na linha inferior ILT2-Fc humano ligado ao HLA-G em células JEG3 é representado (linha pontilhada preta) em comparação com células coradas apenas com anticorpo secundário (linha pontilhada cinza). O impacto da pré- incubação de células JEG3 com anticorpos HLA-G na ligação da quimera ILT2 Fc pode ser observado (linha sólida preta): HLA-G-0031 e HLA-G-0090 mostraram inibição quase completa da ligação da quimera ILT2-Fc a Células JEG3. Curiosamente, os dois anticorpos 0039 e 0041 até mesmo aumentam a ligação de ILT2: Fc às células.

[050] Fig. 5B: Impacto de anticorpos anti-HLA-G comerciais/de referência sobre a ligação da quimera ILT2 Fc ao HLA-G em células JEG3.

[051] A coloração de HLA-G na superfície celular com anticorpos anti-HLA-G comerciais /de referência foi avaliada usando um anticorpo secundário espécie- específico conjugado com Alexa488 (linha superior). Nos histogramas FACS são mostradas células coradas apenas com anticorpo secundário (linhas pontilhadas cinza) e células coradas com anticorpos anti- HLA-G (linhas sólidas pretas). Na linha inferior ILT2-Fc quimérico ligado ao HLA-G em células JEG3 é representado (linha pontilhada preta) em comparação com células coradas apenas com anticorpo secundário (linha pontilhada cinza). O impacto da pré-incubação de células JEG3 com anticorpos de referência na ligação da quimera ILT2 Fc pode ser observado (linha sólida preta). Nenhum dos anticorpos de referência testados conseguiu bloquear a interação da quimera ILT2 Fc com HLA-G na superfície celular em células JEG3.

[052] Figura 6: O impacto do bloqueio de HLA-G com anticorpos inibidores anti-HLA-G na restauração da produção de TNF α avaliada em diferentes doadores.

[053] Figura 6A: Anticorpos anti-HLAG HLA-G-0031 (# 0031), HLA-G-0039 (# 0039) e HLA-G-0041 (# 0041) avaliados em um doador de monócitos representativo.

[054] Figura 6B: Anticorpo anti-HLAG HLA-G-0090 (# 0090)] avaliado em um doador de monócitos diferente.

[055] Figura 6C: Análise da expressão de HLAG em células JEG- 3 wt e variantes de silenciamento gênico (knock down) por Western blot.

[056] Figura 7: Ligação do anticorpo HLA-G TCB ao HLA-G natural ou recombinante expresso nas células (conforme avaliado por análise FACS) de anticorpos biespecíficos anti-HLA-G/anti-CD3 (P1AA1185 e P1AD9924).

[057] Figura 8: Ativação de células T mediada por TCB HLAG (anticorpos biespecíficos TCB anti-HLA-G/anti-CD3 (P1AA1185 e P1AD9924)).

[058] Figura 9: Secreção de IFN-γ por células T mediada por TCB HLAG (anticorpos biespecíficos TCB anti-HLA-G/anti-CD3 (P1AA1185 e P1AD9924)).

[059] Figura 10: Morte de células tumorais/indução de citotoxicidade mediadas por células T por anticorpos biespecíficos TCB anti- HLA-G/anti-CD3 (P1AA1185 e P1AD9924).

[060] Figura 11: Configurações exemplificativas das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção. (A, D) Ilustração da molécula

“1+1 CrossMab”. (B, E) Ilustração da molécula “2+1 IgG CrossFab" com ordem alternativa dos componentes CrossFab e Fab (“invertido”). (C, F) Ilustração da molécula “2+1 IgG CrossFab”. (G, K) Ilustração da molécula “1+1 IgG CrossFab” com ordem alternativa dos componentes CrossFab e Fab (“invertida”). (H, L) Ilustração da molécula “1+1 IgG CrossFab”. (I, M) Ilustração da molécula “2+1 IgG CrossFab” com dois CrossFabs. (J, N) Ilustração da molécula “2+1 IgG CrossFab” com dois CrossFabs e com ordem alternativa dos componentes CrossFab e Fab (“invertido”). (O, S) Ilustração da molécula “Fab- CrossFab”. (P, T) Ilustração da molécula “CrossFab-Fab”. (Q, U) Ilustração da molécula “(Fab)2-CrossFab”. (R, V) Ilustração da molécula “CrossFab-(Fab)2”.

(W, Y) Ilustração da molécula “Fab-(CrossFab)2”. (X, Z) Ilustração da molécula “(CrossFab)2-Fab”. Ponto Preto: modificação opcional no domínio Fc que promove a heterodimerização. ++, --: aminoácidos de cargas opostas, introduzidos opcionalmente nos domínios CH1 e CL. As moléculas CrossFab são representadas como compreendendo uma troca das regiões VH e VL, mas podem - em alguns exemplos de realização nos quais nenhuma modificação de carga é introduzida nos domínios CH1 e CL - compreender alternativamente uma troca dos domínios CH1 e CL.

[061] Figura 12: Eficácia antitumoral in vivo de anticorpos biespecíficos TCB anti-HLA-G/anti-CD3 (P1AA1185 e P1AD9924).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[062] Quando usado no presente pedido, o termo “HLA-G”, “HLA- G humano”, refere-se ao Complexo Principal de Histocompatibilidade humano HLA-G, classe I, G, também conhecido como antígeno leucocitário humano G (HLA-G) (SEQ ID NO: 35, por exemplo). Normalmente, o HLA-G forma um complexo MHC de classe I juntamente com a microglobulina β2 (B2M ou ß2m). Em um exemplo de realização, HLA-G refere-se ao complexo MHC de classe I de HLA-G e microglobulina ß2.

[063] Conforme utilizado na presente invenção, um anticorpo que “se liga ao HLA-G humano”, “se liga especificamente ao HLA-G humano”, “liga- se ao HLA-G humano” ou “anticorpo anti-HLA-G” refere-se a um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno HLA-G humano ou seu domínio extracelular (ECD) com uma afinidade de ligação com um valor K D de 50,0 x 10-8 mol/L ou menos, em um exemplo de realização com um valor K D de 1,0 x 10-9 mol/L ou menos, em um exemplo de realização de um valor K D de 50,0 x 10-8 mol/L a 1,0 x 10-13 mol/L. Em um exemplo de realização, o anticorpo liga- se ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43.

[064] A afinidade de ligação é determinada com um ensaio de ligação padrão, como a técnica de ressonância plasmônica de superfície (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Suécia), por exemplo, usando construções compreendendo o domínio extracelular HLA-G (por exemplo, em sua estrutura tridimensional de ocorrência natural). Em um exemplo de realização, a afinidade de ligação é determinada com um ensaio de ligação padrão usando HLA-G solúvel exemplar compreendendo complexo MHC classe I que compreende a SEQ ID NO: 43.

[065] O HLA-G tem um enovelamento MHC I regular e consiste em duas cadeias: A Cadeia 1 consiste em três domínios: alfa 1, alfa 2 e alfa 3.

Os domínios alfa 1 e alfa 2 formam um sulco de ligação do peptídeo flanqueado por duas alfa-hélices. Peptídeos pequenos (aproximadamente 9 mers) podem ligar-se a este sulco semelhante a outras proteínas MHC I. A Cadeia 2 é a microglobulina beta 2, que é compartilhada com várias outras proteínas MHC I.

[066] O HLA-G pode formar estruturas oligoméricas complexas funcionalmente ativas (Kuroki, K et al. Eur J Immunol. 37 (2007) 1727–1729). Dímeros ligados por ligações dissulfídicas são formados entre Cys 42 de duas moléculas HLA-G. (Shiroishi M et al., J Biol Chem 281 (2006) 10439-10447.

Trímeros e complexos tetraméricos também foram descritos, por exemplo, em Kuroki, K et al. Eur J Immunol. 37 (2007) 1727–1729, Allan D.S., et al. J Immunol Methods. 268 (2002) 43-50 e T Gonen-Gross et al., J Immunol 171 (2003)1343-1351). O HLA-G possui vários resíduos de cisteína livre, ao contrário da maioria das outras moléculas MHC de classe I. Boyson et al., Proc Na t Acad Sci USA, 99: 16180 (2002) relataram que a forma solúvel recombinante de HLA-G5 poderia formar um dímero ligado por dissulfeto com a ligação dissulfeto intermolecular Cys42-Cys42. Além disso, a forma ligada à membrana de HLA-G1 também pode formar um dímero ligado por dissulfeto na superfície celular da linhagem de células Jeg3, que expressa endogenamente HLA-G. As formas diméricas ligadas por dissulfeto de HLA-G1 e HLA-G5 também foram encontradas na superfície celular de células trofoblásticas (Apps, R., Tissue Antigens, 68: 359 (2006)).

[067] O HLA-G é expresso predominantemente em citotrofoblastos na placenta. Vários tumores (incluindo pancreático, de mama, pele, colorretal, gástrico e ovariano) expressam HLA-G (Lin, A. et al., Mol Med.

[068] Para HLA-G, existem 7 isoformas, 3 formas secretadas e 4 formas ligadas à membrana (tal como mostrado esquematicamente na Fig.1).

As isoformas funcionais mais importantes do HLA-G incluem o HLA-G1 e o HLA-G5 associados à b2-microglobulina. No entanto, o efeito imunológico tolerogênico dessas isoformas é diferente e depende da forma (monômero, dímero) dos ligantes e da afinidade da interação ligante-receptor.

[069] A proteína HLA-G pode ser produzida usando técnicas de biologia molecular padrão. A sequência de ácido nucleico para isoformas de HLA-G é conhecida no estado da técnica. Consulte, por exemplo, o número de Acesso no GENBANK: AY359818.

[070] As formas isoméricas HLA-G promovem a transdução de sinal através de ILTs, em particular ILT2, ILT4 ou uma combinação das mesmas.

[071] ILTs: ILTs representam tipos de Ig de receptores ativadores e inibidores que estão envolvidos na regulação da ativação de células imunes e controlam a função de células imunes (Borges, L., et al., Curr Top Microbial Immunol., 244: 123-136 (1999)). Os ILTs são categorizados em três grupos: (i) inibidores, aqueles contendo um Motivo Citoplasmático de Inibição do Imunorreceptor Baseado em Tirosina (ITIM) e transdução de um sinal inibidor (ILT2, ILT3, ILT4, ILT5 e LIR8); (ii) ativação, aqueles que contêm uma cauda citoplasmática curta e um resíduo de aminoácido carregado no domínio transmembranar (ILT1, ILT7, ILT8 e LIR6-alfa) e entrega de um sinal de ativação através do Motivo De Ativação Do Imunorreceptor Baseado Em Tirosina (ITAM) da cadeia gama comum associada do receptor Fc; e (iii) a molécula ILT6 solúvel sem o domínio transmembranar. Uma série de estudos recentes destacou os papéis imunorreguladores para ILTs na superfície das células apresentadoras de antígenos (APC). Os receptores ILT2, ILT3 e ILT4, os receptores inibitórios imunológicos mais caracterizados, são expressos predominantemente em DC mieloides e plasmocitoides. ILT3 e ILT4 são regulados positivamente pela exposição de DC imaturas a fatores imunossupressores conhecidos, incluindo IL-10, vitamina D3 ou células T CD8 supressoras (Chang, C.C., et al., Nat Immunol, 3: 237-243 (2002)). A expressão de ILTs em DC é rigidamente controlada por estímulos inflamatórios, citocinas e fatores de crescimento, e é regulada negativamente após a ativação de D.C. (Ju, X.S., et al., Gene, 331: 159-164 (2004)). A expressão dos receptores ILT2 e ILT4 é altamente regulada pela acetilação das histonas, que contribui para a expressão gênica estritamente controlada exclusivamente na linhagem mieloide de células (Nakajima, H., J Immunol, 171: 6611-6620 (2003)).

[072] O envolvimento dos receptores inibitórios ILT2 e ILT4 altera a citocina e o perfil de secreção/liberação de quimiocinas de monócitos e pode inibir a sinalização do receptor Fc (Colonna, M., et al. J Leukoc Biol, 66: 375- 381 (1999)). O papel e a função de ILT3 em DC foram precisamente descritos pelo grupo de Suciu-Foca (Suciu-Foca, N., Int Immunopharmacol, 5: 7-11 (2005)). Embora o ligante para ILT3 seja desconhecido, ILT4 é conhecido por se ligar ao terceiro domínio de moléculas HLA de classe I (HLA-A, HLA-B, HLA- C e HLA-G), competindo com CD8 pela ligação do MHC de classe I (Shiroishi, M., Proc Natl Acad Sci USA, 100: 8856-8861 (2003)). O ligante preferencial para vários receptores inibitórios de ILT é o HLA-G. O HLA-G desempenha um papel potencial na tolerância materno-fetal e nos mecanismos de escape das células tumorais a partir do reconhecimento e destruição imunológica (Hunt, J.S., et al., Faseb J, 19: 681-693 (2005)). É mais provável que a regulação da função das DC por interações HLA-G-ILT seja uma via importante na biologia das DC. Foi determinado que as DC derivadas de monócitos humanos que expressam altamente os receptores ILT2 e ILT4, quando tratadas com HLA-G e estimuladas com células T alogênicas, ainda mantêm um fenótipo semelhante ao tolerogênico estável (CD80low, CD86low, HLA-DRlow) com o potencial para induzir anergia de células T (Ristich, V., et al., Eur J Immunol, 35: 1133-1142 (2005)). Além disso, a interação do HLA-G com as DC que expressam altamente os receptores ILT2 e ILT4 resultou na regulação negativa de vários genes envolvidos na via de apresentação do MHC de classe II. Uma tiol redutase lisossomal, tiol redutase lisossomal induzível por IFN-gama (GILT),

abundantemente expressa por APC profissional, foi grandemente reduzida em DC modificadas por HLA-G. O repertório de células T CD4+ inicialmente estimulas (primed) pode ser influenciado pela expressão de GILT por DC, uma vez que as respostas de células T in vivo para selecionar antígenos foram reduzidas em animais sem GILT após a interrupção direcionada do gene (Marie, M., et al., Science, 294: 1361 -1365 (2001)). A interação HLA-G/ILT em DC interfere com a montagem e transporte de moléculas do MHC de classe II para a superfície celular, o que pode resultar em uma apresentação ou expressão menos eficiente das moléculas MHC de classe II estruturalmente anormais. Foi determinado que HLA-G diminuiu de maneira notável a transcrição da cadeia invariante (CD74), HLA-DMA e genes HLA-DMB em DC derivadas de monócitos humanos que expressam altamente receptores inibidores de ILT (Ristich, V., et al; Eur J Immunol 35: 1133-1142 (2005)).

[073] Outro receptor de HLA-G é KIR2DL4, uma vez que KIR2DL4 liga-se às células que expressam HLA-G (US2003232051; Cantoni, C. et al. Eur J Immunol 28 (1998) 1980; Rajagopalan, S. e E.O. Long. [Errata publicada em J Exp Med 191 (2000) 2027] J Exp Med 189 (1999) 1093; Ponte, M. et al. PNAS USA 96 (1999) 5674). KIR2DL4 (também referido como 2DL4) é um membro da família KIR (também designado CD158d) que compartilha características estruturais com os receptores ativadores e inibidores (Selvakumar, A. et al. Tissue Antigens 48 (1996) 285). 2DL4 tem um ITIM citoplasmático, sugerindo função inibitória, e um aminoácido carregado positivamente na região transmembranar, uma característica típica de ativação de KIR. Ao contrário de outros KIRs distribuídos clonalmente, 2DL4 é transcrito por todas as células NK (Valiante, N. M. et al. Immunity 7 (1997) 739; Cantoni, C. et al. Eur J Immunol 28 (1998) 1980; Rajagopalan, S. e E. O. Long. [errata publicada em J Exp Med 191 (2000) 2027] J Exp Med 189 (1999) 1093).

[074] HLA-G também mostrou interagir com CD8 (Sanders et al,

J. Exp. Med., 1991) em células T citotóxicas e induzir apoptose mediada por CD95 em células T citotóxicas positivas para CD8 ativadas (Fournel et al, J.

Immun., 2000). Esse mecanismo de eliminação de células T citotóxicas foi relatado como um dos mecanismos de escape imunológico e indução de tolerância na gravidez, doenças inflamatórias e câncer (Amodio G. et al, Tissue Antigens, 2014).

[075] Conforme utilizado na presente invenção, um anticorpo anti-HLA-G que “não apresenta reação cruzada com” ou que “não se liga especificamente a” um complexo MHC I ß2M HLA-G humano modificado compreendendo a SEQ ID NO: 44; um complexo de MHC I ß2M H2Kd de rato compreendendo a SEQ ID NO: 45, um complexo de rato MHC I ß2M RT1A compreendendo a SEQ ID NO: 47, um complexo MHC I ß2M HLA-A2 humano compreendendo a SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 37 refere-se a um Anticorpo anti-HLA-G que não se liga substancialmente a nenhum desses contra- antígenos. Em um exemplo de realização, um anticorpo anti-HLA-G que “não reage de forma cruzada com” ou que “não se liga especificamente a” um complexo MHC I ß2M HLA-G humano modificado compreendendo a SEQ ID NO: 44; um complexo MHC I ß2M H2Kd de rato compreendendo a SEQ ID NO: 45, um complexo MHC I ß2M RT1A de rato compreendendo a SEQ ID NO: 47 e/ou um complexo MHC I ß2M HLA-A2 humano compreendendo a SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 37 refere-se a um anticorpo anti-HLA-G que mostra apenas ligação não específica com uma afinidade de ligação com um valor K D de 50,0 x 10-6 mol/L ou mais elevado (até nenhuma afinidade de ligação detectável). A afinidade de ligação é determinada com um ensaio de ligação padrão, tal como técnica de ressonância plasmônica de superfície (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Suécia) com o respectivo antígeno: um complexo MHC I ß2M HLA-G humano modificado compreendendo a SEQ ID NO: 44; um complexo MHC I ß2M H2Kd de rato compreendendo a SEQ ID NO: 45 um complexo MHC I ß2M

RT1A de rato compreendendo a SEQ ID NO: 47, e/ou um complexo MHC I ß2M HLA-A2 humano compreendendo a SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 37. A configuração do ensaio, bem como a construção/preparação dos antígenos, está descrita nos Exemplos.

[076] O termo “inibe a ligação de ILT2 ao HLA-G em células JEG-3 (ATCC HTB36)” refere-se à inibição da interação de ligação de ILT2 recombinante em um ensaio como descrito, por exemplo, no Exemplo 6.

[077] Os termos “restauração da resposta imune suprimida de forma específica por HLA-G” ou “restaura a resposta imune suprimida HLA-G- específica” referem-se a uma restauração da produção de TNFα induzida por lipopolissacarídeo (LPS) por monócitos em cocultura com células expressando HLA-G, particularmente células JEG-3. Assim, os anticorpos da invenção restauram uma libertação HLA-G-específica de TNF alfa em coculturas estimuladas com lipopolissacarídeo (LPS) de células JEG-3 expressando HLA- G (ATCC HTB36) e monócitos em comparação com células JEG-3 não tratadas cocultivadas (coculturas não tratadas são tomadas como referência negativa de 0%; culturas apenas de monócitos são tomadas como referência positiva de 100%, em que a seção de TNF alfa não é suprimida por quaisquer efeitos específicos de HLA-G/IL-T2 ((consulte o Exemplo 7). Neste contexto, “resposta imune suprimida HLA-G -específica” refere-se a uma supressão imune de monócitos devido à expressão de HLA-G em células JEG-3. Em contrapartida, os anticorpos anti-HLA-G da presente invenção não são capazes de restaurar a resposta imune por monócitos cocultivados com células JEG3 com um nocaute de HLA-G. Como outros anti-HLA-Gs comerciais são capazes de induzir TNF alfa por monócitos cocultivados com células JEG3 com nocaute HLA-G, há uma liberação de TNF alfa não HLA-G-específica por esses anticorpos.

[078] Um “antígeno de ativação de célula T”, conforme utilizado na presente invenção refere-se a um determinante antigênico expresso na superfície de um linfócito T, particularmente, um linfócito T citotóxico, que é capaz de induzir a ativação de célula T mediante a interação com um anticorpo.

Especificamente, a interação de um anticorpo com um antígeno de ativação de célula T pode induzir a ativação das células T, desencadeando a cascata de sinalização do complexo ‘receptor de células T’. Em um exemplo de realização específico o antígeno de ativação de célula T é o CD3, particularmente a subunidade épsilon de CD3 (veja UniProt nº. P07766 (versão 189), NCBI RefSeq nº. NP_000724.1, SEQ ID NO: 76 para a sequência humana; ou UniProt nº. Q95LI5 (versão 49), NCBI GenBank nº. BAB71849.1; SEQ ID NO: 77 para a sequência de cinomolgo [Macaca fascicularis]).

[079] O termo “CD3” refere-se a qualquer CD3 nativo a partir de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, seres humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cinomolgos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. O termo abrange as formas não processadas de CD3 “completo” ou “de comprimento total”, bem como qualquer forma de CD3 resultante da transformação/processamento na célula. O termo também abrange formas variantes de CD3 que ocorrem naturalmente, por exemplo, as variantes por splicing alternativo ou variantes alélicas. Em um exemplo de realização, CD3 é CD3 humano, particularmente a subunidade épsilon do CD3 humano (CD3ε). A sequência de aminoácidos do CD3ε humano é mostrada no UniProt (www.uniprot.org). P07766 (versão 189), ou NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_000724.1. Veja também a SEQ ID NO: 76.

A sequência de aminoácidos de cinomolgos [Macaca fascicularis] CD3ε é mostrada no NCBI GenBank sob o nº BAB71849.1. Veja também a SEQ ID NO: 77.

[080] Conforme utilizado na presente invenção, um anticorpo que

“se liga ao CD3 humano”, “se liga especificamente ao CD3 humano”, “liga-se ao CD3 humano” ou “anticorpo anti-CD3” refere-se a um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno CD3 humano ou seu domínio extracelular (ECD) com uma afinidade de ligação com um valor KD de 50,0 x 10-8 mol/L ou menos, em um exemplo de realização com um valor KD de 1,0 x 10-9 mol/L ou menos, em um exemplo de realização de um valor KD de 50,0 x 10-8 mol/L a 1,0 x 10-13 mol/L. Em um exemplo de realização, o anticorpo liga-se ao CD3 compreendendo a SEQ ID NO: 76.

[081] A afinidade de ligação é determinada com um ensaio de ligação padrão, como a técnica de ressonância plasmônica de superfície (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Suécia), por exemplo, usando construções compreendendo o domínio extracelular HLA-G (por exemplo, em sua estrutura tridimensional de ocorrência natural). Em um exemplo de realização, a afinidade de ligação é determinada com um ensaio de ligação padrão usando CD3 exemplar compreendendo a SEQ ID NO: 76.

[082] A expressão “ativação de célula T”, utilizada na presente invenção refere-se a uma ou mais resposta celular de um linfócito T, particularmente um linfócito T citotóxico, selecionada a partir de: proliferação, diferenciação, secreção de citocina, liberação de molécula efetora citotóxica, atividade citotóxica, e expressão de marcadores de ativação. Ensaios adequados para mensurar a ativação de célula T são conhecidos no estado da técnica e descritos na presente invenção.

[083] Uma “região estrutural aceptora humana” (acceptor human framework) para os propósitos da presente invenção é uma região estrutural ou arcabouço (framework) que compreende a sequência de aminoácidos de uma região estrutural do domínio variável de cadeia leve (V L) ou uma região estrutural do domínio variável de cadeia pesada (VH) derivada de uma região estrutural de imunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano, tal como definido abaixo. Uma região estrutural ou região de arcabouço (framework) aceptora humana “derivada de” uma região estrutural de uma imunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano pode compreender a mesma sequência de aminoácido destas ou pode conter alterações na sequência de aminoácidos. Em alguns exemplos de realização, o número de alterações de aminoácidos é de 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Em alguns exemplos de realização, a região estrutural aceptora VL humana é idêntica em sua sequência com a sequência da região estrutural da imunoglobulina humana VL ou sequência da região estrutural de consenso humano. Uma região estrutural aceptora humana de VH preferida para uma variante humanizada do anticorpo obtido HLAG-0031 é a HUMAN_IGHV1-3.

Uma região estrutural humana aceptora de VL para uma variante humanizada do anticorpo obtido HLAG-0031 é a HUMAN_IGKV1-17 (domínio V, com uma mutação reversa (back mutation) adicional na posição R46F, numeração de Kabat).

[084] O termo “anticorpo” na presente invenção é utilizado no sentido mais amplo e abrange diferentes estruturas de anticorpo, incluindo, mas não se limitando, a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.

[085] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula que não é um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a Fv, Fab, Fab’, Fab’- SH, F(ab’)2, diacorpos (diabodies), anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFV); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

[086] Um “anticorpo que se liga ao mesmo epítopo” como um anticorpo de referência refere-se a um anticorpo que bloqueia em 50% ou mais a ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um ensaio de competição, e inversamente, os anticorpos de referência bloqueiam a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais.

Um ensaio de competição exemplar é fornecido na presente invenção.

[087] O termo “biespecífico” significa que o anticorpo é capaz de se ligar especificamente a, pelo menos, dois determinantes antigênicos distintos. Normalmente, um anticorpo biespecífico compreende dois sítios de ligação ao antígeno, cada um deles é específico para um determinante antigênico diferente. Em determinados exemplos de realização o anticorpo biespecífico é capaz de se ligar, simultaneamente, a dois determinantes antigênicos, em particular dois determinantes antigênicos expressos em duas células distintas.

[088] O termo “valente”, usado no presente pedido denota a presença de um número especificado de sítios de ligação ao antígeno em um anticorpo. Como tal, o termo “ligação monovalente a um antígeno” indica a presença de um (e não mais do que um) sítio de ligação ao antígeno específico para o antígeno no anticorpo.

[089] Um “sítio de ligação ao antígeno” refere-se ao sítio (local), ou seja, um ou mais resíduos de aminoácidos de um anticorpo que provê interação com o antígeno. Por exemplo, o sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo compreende os resíduos de aminoácidos a partir das regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Uma molécula de imunoglobulina nativa geralmente possui dois sítios de ligação ao antígeno, de uma molécula Fab tipicamente tem apenas um único sítio de ligação ao antígeno.

[090] Conforme utilizado no presente, o termo “molécula de ligação ao antígeno” refere-se a uma molécula polipeptídica que se liga especificamente a um determinante antigênico. Em um exemplo de realização, uma porção de ligação ao antígeno é capaz de direcionar a entidade ao qual está ligada (por exemplo, uma segunda molécula de ligação a antígeno) para um local alvo, por exemplo, para um tipo específico de célula tumoral que carrega o determinante antigênico. Em outro exemplo de realização uma porção de ligação ao antígeno é capaz de ativar a sinalização através do seu antígeno alvo, por exemplo, um complexo de antígenos do receptor de células T. As moléculas de ligação ao antígeno incluem anticorpos e fragmentos destes, conforme adicionalmente definido na presente invenção. Moléculas de ligação ao antígeno específicas incluem um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada do anticorpo e uma região variável de cadeia leve do anticorpo. Em determinados exemplos de realização, as moléculas de ligação ao antígeno compreendem regiões constantes de anticorpo, conforme definido adicionalmente no presente pedido e conhecido no estado da técnica. As regiões constantes de cadeia pesada úteis incluem qualquer um dos cinco isotipos: α, δ, ε, γ, ou μ. As regiões constantes da cadeia leve úteis incluem qualquer um dos dois isotipos: κ e λ.

[091] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “determinante antigênico” ou “antígeno” refere-se a um local em uma macromolécula de polipeptídeo ao qual uma porção de ligação ao antígeno se liga, formando um complexo ‘porção de ligação ao antígeno - antígeno’. Os determinantes antigênicos úteis podem ser encontrados, por exemplo, sobre as superfícies de células tumorais, sobre as superfícies de células infectadas por vírus, sobre as superfícies de outras células doentes, sobre as superfícies de células do sistema imunológico, livres no soro sanguíneo, e/ou na matriz extracelular (ECM).

[092] O termo anticorpo “quimérico” refere-se a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma determinada fonte ou espécie, enquanto que o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.

[093] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante presente em sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados de , , , , e , respectivamente.

[094] Uma “quantidade eficaz” de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático ou terapêutico desejado.

[095] O termo “domínio Fc” ou “região Fc” é usado no presente para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina contendo pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões de Fc de sequências nativas e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de IgG possam variar levemente, a região Fc da cadeia pesada da IgG humana é normalmente definida como se estendendo a partir da Cis226, ou a partir da Pro230 até a região carboxi-terminal da cadeia pesada. Entretanto, os anticorpos produzidos por células hospedeiras podem ser submetidos a clivagem pós-traducional de um ou mais, especialmente um ou dois, aminoácidos a partir da extremidade C-terminal da cadeia pesada. Por esse motivo, um anticorpo produzido por uma célula hospedeira pela expressão de uma molécula de ácido nucleico específica que codifica uma cadeia pesada de comprimento total pode incluir a cadeia pesada de comprimento total, ou pode incluir uma variante clivada da cadeia pesada de comprimento total (também referida no presente como “cadeia pesada variante clivada”). Este pode ser o caso em que os dois aminoácidos C-terminais finais da cadeia pesada são glicina (G446) e lisina (K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Portanto, a lisina C-terminal (Lis447), ou a glicina C- terminal (Gli446) e a lisina (K447) da região Fc, podem ou não estar presentes.

As sequências de aminoácidos das cadeias pesadas, incluindo os domínios Fc (ou uma subunidade de um domínio Fc, conforme definido na presente invenção) são indicadas no presente sem o dipeptídeo glicina-lisina C-terminal, se não indicado de outra forma. Em um exemplo de realização da invenção, uma cadeia pesada que inclua uma subunidade de um domínio Fc, conforme especificado no presente, compreendida em um anticorpo ou anticorpo biespecífico de acordo com a presente invenção, compreende um dipeptídeo glicina-lisina C-terminal adicional (G446 e K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização da invenção, uma cadeia pesada que inclua uma subunidade de um domínio Fc, conforme especificado no presente, compreendida em um anticorpo ou anticorpo biespecífico de acordo com a presente invenção, compreende um resíduo glicina C-terminal adicional (G446, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). As composições da invenção, tais como as composições farmacêuticas descritas no presente, compreendem uma população de anticorpos ou anticorpos biespecíficos da invenção. A população de anticorpos ou anticorpos biespecíficos pode compreender moléculas possuindo uma cadeia pesada de comprimento total (completa) e moléculas com uma cadeia pesada variante clivada. A população de anticorpos ou anticorpos biespecíficos pode consistir de uma mistura de moléculas possuindo uma cadeia pesada de comprimento total e moléculas possuindo uma cadeia pesada variante clivada, em que pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% dos anticorpos ou anticorpos biespecíficos têm uma cadeia pesada variante clivada.

Em um exemplo de realização da invenção, uma composição compreendendo uma população de anticorpos ou anticorpos biespecíficos compreende um anticorpo ou anticorpo biespecífico que compreende uma cadeia pesada que inclui uma subunidade de um domínio Fc, conforme especificado no presente, com um dipeptídeo glicina-lisina C-terminal adicional

(G446 e K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização da invenção, uma composição compreendendo uma população de anticorpos ou anticorpos biespecíficos compreende um anticorpo ou anticorpo biespecífico que compreende uma cadeia pesada que inclui uma subunidade de um domínio Fc, conforme especificado no presente, com um resíduo de glicina C-terminal adicional (G446, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização da invenção, tal composição compreende uma população de anticorpos ou anticorpos biespecíficos compreendidos de moléculas que compreendem uma cadeia pesada incluindo uma subunidade de um domínio Fc conforme especificado na presente invenção; moléculas compreendendo uma cadeia pesada incluindo uma subunidade de um domínio Fc conforme especificado na presente invenção com um resíduo glicina C-terminal adicional (G446, numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e moléculas compreendendo uma cadeia pesada incluindo uma subunidade de um domínio Fc conforme especificado na presente invenção com um dipeptídeo glicina-lisina C-terminal adicional (G446 e K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). A menos que especificado de outra maneira, a numeração dos resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado o índice EU, conforme descrito em Kabat et al.,

Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed.

Public Health Service,

National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 (veja também acima). Uma “subunidade” de um domínio Fc, conforme utilizado no presente, refere-se a um dos dois polipeptídeos que formam o domínio Fc dimérico, ou seja, um polipeptídeo compreendendo as regiões constantes C-terminais de uma cadeia pesada da imunoglobulina, capaz de realizar autoassociação estável. Por exemplo, uma subunidade de um domínio Fc de IgG compreende uma CH2 de IgG e um domínio constante CH3 de IgG.

[096] Os termos “região estrutural”, “região de arcabouço” ou “FR” (do inglês framework region) referem-se aos resíduos de domínios variáveis que não são resíduos da região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável consiste geralmente em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Assim, as sequências HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência na VH (ou VL): FR1-H1 (L1)-FR2-H2 (L2)-FR3-H3 (L3)-FR4.

[097] Os termos “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo intacto”, “anticorpo inteiro” ou “anticorpo completo” são utilizados na presente invenção de forma alternada para se referirem a um anticorpo possuindo uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura do anticorpo nativo ou possuindo as cadeias pesadas que contem uma região Fc conforme definido no presente.

[098] “Fundido” significa-se que os componentes (por exemplo, uma molécula Fab e uma subunidade do domínio Fc) estão ligados por meio de ligações peptídicas, seja diretamente ou através de um ou mais ligantes peptídicos.

[099] Uma “molécula Fab” refere-se a uma proteína que consiste no domínio VH e CH1 da cadeia pesada (a “cadeia pesada Fab”) e o domínio VL e CL da cadeia leve (a “cadeia leve Fab”) de uma imunoglobulina.

[100] Por uma molécula Fab crossover (Fab cruzada) (também denominada “cross-Fab”) entende-se uma molécula Fab na qual tanto as regiões variáveis quanto as regiões constantes da cadeia pesada e leve do Fab estão trocadas (ou seja, substituídas entre si), isto é, a molécula Fab crossover compreende uma cadeia peptídica constituída pelo domínio variável de cadeia leve VL e o domínio constante de cadeia pesada 1 CH1 (VL-CH1, na direção N- para C-terminal), e uma cadeia peptídica constituída pelo domínio variável de cadeia pesada VH e o domínio constante de cadeia leve CL (VH-CL, na direção N- para C-terminal). Para maior clareza, uma molécula Fab crossover em que os domínios variáveis de cadeia leve Fab e de cadeia pesada Fab estão trocados, a cadeia peptídica que compreende o domínio constante de cadeia pesada 1 CH1 é referia no presente documento como “cadeia pesada” da molécula Fab (crossover). Por outro lado, uma molécula Fab crossover em que os domínios constantes de cadeia leve Fab e de cadeia pesada Fab estão trocados, a cadeia peptídica que compreende o domínio variável da cadeia pesada VH é referia no presente documento como “cadeia pesada” da molécula Fab (crossover).

[101] Em contrapartida, por uma molécula Fab “convencional” entende-se uma molécula Fab em seu formato natural, ou seja, compreendendo uma cadeia pesada composta pelos domínios variável e constante de cadeia pesada (VH-CH1, na direção N- para C-terminal) e uma cadeia leve composta pelos domínios variável e constante de cadeia leve (VL- CL, na direção N- para C-terminal). Os termos “célula hospedeira”, “linhagem de célula hospedeira” e “cultura de células hospedeiras” são utilizados de maneira alternada e referem-se a células nas quais um ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e progênie dela derivada sem levar em conta o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica quanto a conteúdo de ácido nucleico em relação à célula parental, mas pode conter mutações. A progênie mutante que possui a mesma função ou atividade biológica, conforme triado ou selecionado na célula transformada inicial, é abrangida pela presente invenção.

[102] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde ao de um anticorpo produzido por um ser humano ou uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências codificantes de anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado, que compreende resíduos não humanos de ligação ao antígeno.

[103] Uma “região estrutural (ou de arcabouço) de consenso humano” é uma região estrutural que representa os resíduos de aminoácidos de ocorrência mais comum em uma seleção de sequências da região estrutural VH ou VL da imunoglobulina humana. De modo geral, a seleção das sequências VH ou VL da imunoglobulina humana ocorre a partir de um subgrupo de sequências de domínios variáveis. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Edição, Bethesda MD (1991), NIH Publication 91- 3242, vols.1-3. Em um exemplo de realização, para a V L, o subgrupo é subgrupo kappa I como em Kabat et al. supra. Em um exemplo de realização, para a VL, o subgrupo é subgrupo III como em Kabat et al. supra.

[104] Um anticorpo “humanizado” refere-se a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos a partir de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas Em alguns exemplos de realização, o anticorpo humanizado compreenderá de substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode compreender, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região constante do anticorpo derivado de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere- se a um anticorpo que foi submetido à humanização.

[105] O termo “região hipervariável” ou “HVR” conforme utilizado no presente refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que é hipervariável na sequência (“região determinante de complementaridade” ou “CDRs”) e/ou forma alças (loops) estruturalmente definidas (“alças hipervariáveis”) e/ou contém resíduos de contanto ao antígeno (“contato ao antígeno”). De modo geral, os anticorpos compreendem seis HVRs; sendo três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). HVRs exemplares na presente invenção incluem: (a) alças hipervariáveis que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96- 101 (H3) (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); (b) CDRs que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), e 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); (c) contatos ao antigênio que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), e 93- 101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996); e (d) combinações de (a), (b), e/ou (c), incluindo os resíduos de aminoácidos da HVR 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35 (H1), 50-63 (H2) e 95-102 (H3).

[106] Salvo quando indicado de outra forma, os resíduos HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos FR) são numerados no presente pedido de acordo com Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

[107] Um “imunoconjugado” é um anticorpo conjugado com uma ou mais molécula(s) heteróloga(s), incluindo, mas não se limitando a um agente citotóxico.

[108] Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cachorros e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em determinados exemplos de realização, o indivíduo ou sujeito é um ser humano.

[109] Um anticorpo “isolado” é aquele que foi identificado e separado a partir de um componente de seu ambiente natural. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo é purificado a mais de 95% ou 99% de pureza, conforme determinado, por exemplo, por métodos eletroforéticos (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou por cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca iônica ou HPLC de fase inversa). Para uma revisão de métodos para a avaliação da pureza do anticorpo, vide, por exemplo, Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87.

[110] Um ácido nucleico “isolado” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada a partir de um componente de seu ambiente natural. Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida nas células que normalmente expressam a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente extracromossomalmente ou está em uma localização cromossômica que é diferente de sua localização cromossômica natural.

[111] “Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti-HLA- G” refere-se a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos (ou fragmentos dos mesmos), incluindo tais moléculas de ácido nucleico em um único vetor ou em vetores separados, e a(s) dita(s) molécula(s) de ácido nucleico estão presentes em pelo menos um ou mais local(ais) de uma célula hospedeira.

[112] O termo “anticorpo monoclonal” conforme utilizado no presente refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, ou seja, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos e/ou se ligam ao(s) mesmo(s) epítopo(s), exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou que podem surgir durante a produção do anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estão presentes em pequenas quantidades. Ao contrário das preparações com anticorpo policlonal, que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante sobre um antígeno. Portanto, o adjetivo “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como uma necessidade de se produzir o anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não se limitando aos métodos de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição por fago, e métodos que utilizam animais transgênicos contendo a totalidade ou parte dos loci de imunoglobulinas humanas, e tais métodos e outros métodos exemplares para produzir anticorpos monoclonais descritos na presente divulgação.

[113] Uma “modificação que promove a associação da primeira e segunda subunidade do domínio Fc” é uma manipulação da estrutura peptídica ou modificações pós-traducionais de uma subunidade do domínio Fc que reduz ou evita a associação de um polipeptídeo que compreende a subunidade do domínio Fc com um polipeptídeo idêntico para formar um homodímero. Uma modificação que promove a associação, conforme utilizado no presente inclui, particularmente, as modificações feitas em cada uma das duas subunidades de domínio Fc separadamente (ou seja, a primeira e a segunda subunidade do domínio Fc), em que as modificações são complementares entre si, de modo a promover a associação das duas subunidades do domínio Fc. Por exemplo, uma modificação que promove a associação pode alterar a estrutura ou a carga de uma ou ambas as subunidades do domínio Fc de modo a fazer a sua associação estéricamente ou eletrostaticamente favorável, respectivamente.

Assim, a (hetero)dimerização ocorre entre um polipeptídeo que compreende a primeira subunidade do domínio Fc e um polipeptídeo que compreende a segunda subunidade do domínio Fc, que devem ser não idênticas no sentido de que outros componentes fundidos a cada uma das subunidades (por exemplo, porções de ligação ao antígeno) não sejam iguais. Em alguns exemplos de realização, a modificação que promove a associação compreende uma mutação de aminoácidos no domínio Fc, especificamente, uma substituição de aminoácidos. Em um exemplo de realização específico, a modificação que promove a associação compreende uma mutação de aminoácidos separada, especificamente uma substituição de aminoácidos em cada uma das duas subunidades do domínio Fc.

[114] Os “anticorpos nativos” referem-se a moléculas de imunoglobulinas de ocorrência natural com estruturas variáveis. Por exemplo, os anticorpos IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de

150.000 Daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por ligações dissulfídicas. A partir da extremidade N- para a C-terminal, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também denominada de domínio pesado variável ou domínio variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). Do mesmo modo, a partir da extremidade N- para a C-terminal, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também denominada de domínio leve variável ou domínio variável de cadeia leve, seguido por um domínio constante (CL). A “cadeia leve” de um anticorpo pode ser atribuída a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappa (κ) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.

[115] O termo “bula” da forma como é utilizado no presente refere-se a instruções habitualmente incluídas nos recipientes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, utilização, posologia, administração, terapia combinada, contraindicações e/ou advertências relativas à utilização de tais produtos terapêuticos.

[116] A “porcentagem (%) de identidade da sequência de aminoácidos” com relação a uma sequencia polipeptídica (proteína) é definida no presente como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de lacunas/intervalos (gaps), se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequências, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequências. O alinhamento para propósitos da determinação da porcentagem de identidade de sequências de aminoácidos pode ser obtido de várias formas que estão dentro do conhecimento da técnica, por exemplo, o uso de softwares de computador publicamente disponíveis, tais como os softwares BLAST, BLAST- 2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos hábeis no assunto podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências que estão sendo comparadas. Para os propósitos da presente invenção, no entanto, os valores da % de identidade da sequência de aminoácido são gerados usando o programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2 é de autoria da Genentech, Inc. e o código fonte foi apresentado com a documentação de usuário no Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington, DC, 20559, onde foi registrado com o n° de Registro de Direitos Autorais Norte-Americano TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível pela Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código-fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo o UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN- 2 e não variam.

[117] Em situações onde o ALIGN-2 é empregado para a comparação de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A, com, ou contra, uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma determinada sequência de aminoácido A que contenha certa % de identidade de sequência de aminoácidos com, ou contra, uma dada sequência de aminoácidos B) é calculado da seguinte forma: 100 vezes a fração X/Y - em que, X é a quantidade de resíduos de aminoácidos pontuados como correspondentes idênticos pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento A e B do programa e em que Y é a quantidade total de resíduos de aminoácidos em B. Será compreendido que,

quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não for igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, o percentual de identidade de sequências de aminoácidos de A para B não é igual ao percentual de identidade de sequências de aminoácidos de B para A. A menos que especificamente indicado em contrário, todos os valores percentuais de identidade de sequências de aminoácidos utilizados no presente são obtidos, tal como descrito no parágrafo anterior, pelo uso do programa ALIGN-2.

[118] O termo “formulação farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em uma forma que permite que a atividade biológica do ingrediente ativo contida nela seja eficaz, e que não contenha componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação deveria ser administrada.

[119] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica que não seja um ingrediente ativo e que não seja tóxico para um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.

[120] Conforme utilizado no presente, o termo “tratamento” (e variações gramaticais deste como “tratar” ou “tratando”) refere-se a intervenções clínicas em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo que está sendo tratado, e pode ser realizado para profilaxia ou durante o desenvolvimento da patologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem, mas não estão limitados a, prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de qualquer consequência patológica direta ou indireta da doença, prevenção de metástase, redução da velocidade de progressão da doença, melhora ou alívio do estado da doença, e remissão ou prognóstico melhorado. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos da presente invenção são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença, ou para retardar a progressão de uma doença.

[121] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões conservadas denominadas regiões estruturais ou arcabouços (frameworks - FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Vide, por exemplo, Kindt, T.J. et al.

Kuby Immunology, 6ª ed., W.H. Freeman & Co., NY (2007), página 91). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno específico podem ser isolados utilizando um domínio VH ou VL a partir de um anticorpo que se liga ao antígeno para pesquisar uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano, S.

et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).

[122] O termo “vetor”, da forma utilizada na presente invenção, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual ele foi ligado. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado ao genoma de uma célula hospedeira na qual ele foi introduzido. Determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais eles estão operacionalmente ligados. Such vectors are referred to herein as “expression vectors”.

I. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS

[123] Em um aspecto, a invenção é baseada, em parte, na descoberta de que os anticorpos multiespecíficos (por exemplo, os anticorpos biespecíficos), conforme descrito no presente documento, usam os anticorpos anti-HLA-G selecionados como primeiro sítio/porção de ligação ao antígeno.

Estes anticorpos anti-HLA-G ligam-se a determinados epítopos de HLA- G com alta especificidade (nenhuma reatividade cruzada com sequências HLA-A de consenso humano e de outras espécies), e têm a capacidade de inibir especificamente ILT2 e ou ILT4 ligando-se ao HLA-G. Eles inibem, por exemplo, a ligação de ILT2 ao HLA-G e revertem especificamente a supressão imune de monócitos mediada por HLA-G pelo aumento da liberação de citocinas imunomoduladoras, como TNF alfa após estimulação apropriada (por exemplo, com lipopolissacarídeos (LPS)) e não exibem efeito sobre células com nocaute para HLA-G.

[124] Ao mesmo tempo, os anticorpos multiespecíficos (por exemplo, os anticorpos biespecíficos), conforme descrito no presente documento, ligam-se com um segundo sítio (porção) de ligação ao antígeno a um antígeno de ativação de célula T (particularmente CD3, especialmente CD3 épsilon).

A. ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS ANTI-HLA-G/ANTI-CD3 EXEMPLARES

[125] Em um exemplo de realização da invenção, o anticorpo multiespecífico é um anticorpo biespecífico que se liga ao HLA-G humano e ao CD3 humano, compreendendo uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga ao HLA-G humano e uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga ao CD3 humano.

[126] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno do anticorpo que se liga ao HLA-G humano compreende: A) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou B) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 27; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; - e a segunda porção de ligação ao antígeno, que se liga a um antígeno de ativação de célula T, liga-se ao CD3 humano, e compreende: C) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 58; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61.

[127] Em um exemplo de realização da invenção, a primeira porção de ligação ao antígeno: A) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 33 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 34; ou B) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32; - e a segunda porção de ligação ao antígeno: C) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 62 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 63.

[128] Em um exemplo de realização da invenção: - a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 33 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 34; - e a segunda porção de ligação ao antígeno; e - compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 62 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 63.

[129] Em um exemplo de realização da invenção: - a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32; - e a segunda porção de ligação ao antígeno; e - compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 62 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 63.

[130] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43), compreende: A) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3; e em que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-

L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6; e em que o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%,

96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98%

ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou

B) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ

ID NO: 11; e em que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14; e em que o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou

100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16;

ou

C) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ

ID NO: 19; e em que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22; e em que o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou D) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 27; e em que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 28; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 29 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30; e em que o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[131] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43), compreende: a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e - em que o anticorpo se liga ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43 com uma afinidade de ligação que é substancialmente a mesma que (em um exemplo de realização com um valor KD da afinidade de ligação é reduzido no máximo 10 vezes em comparação com, em um exemplo de realização com um valor KD da afinidade de ligação reduzido no máximo 5 vezes em comparação com) um anticorpo compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 33 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 34 (conforme determinado em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície).

[132] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43), compreende: (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3; e em que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 33; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6; e em que o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou

100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 34; e

- em que o anticorpo se liga ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43 com uma afinidade de ligação que é substancialmente a mesma que (em um exemplo de realização com um valor

KD da afinidade de ligação é reduzido no máximo 10 vezes em comparação com, em um exemplo de realização com um valor KD da afinidade de ligação reduzido no máximo 5 vezes em comparação com) um anticorpo compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 33 e uma sequência VL de

SEQ ID NO: 34 (conforme determinado em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície); e/ou

- em que o anticorpo é caracterizado independentemente pelas seguintes propriedades: o anticorpo anti-HLA-G;

a) não reage de forma cruzada com um complexo MHC I ß2M

HLA-G humano modificado compreendendo a SEQ ID NO: 44; e/ou b) não reage de forma cruzada com o complexo MHC I ß2M

HLA-A2 humano compreendendo a SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 37; e/ou c) não reage de forma cruzada com um complexo MHC I ß2M

H2Kd de camundongo compreendendo a SEQ ID NO: 45; e/ou d) não reage de forma cruzada com o complexo MHC I ß2M RT1A de rato compreendendo a SEQ ID NO: 47; e/ou e) inibe a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G monomérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43); e/ou f) inibe a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G trimérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43), em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 60%) (quando comparado com a ligação sem anticorpo) (consulte o Exemplo 4b); e/ou g) inibe a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G monomérico e/ou dimérico e/ou trimérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43) em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%) (quando comparado com a ligação sem anticorpo) (vide o Exemplo 4b); e/ou h) inibe a ligação de ILT2 às células JEG3 (ATCC Nº. HTB36) (HLA-G) (em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%)) (quando comparada com a ligação sem anticorpo) (consulte o Exemplo 6); e/ou i) liga-se as células (HLA-G) JEG3 (ATCC Nº. HTB36) (consulte o Exemplo 5) e inibe a ligação de ILT2 às células JEG-3 (HLA-G) (ATCC Nº. HTB36) (em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%)) (quando comparada com a ligação sem anticorpo) (consulte o Exemplo 6); e/ou j) inibe a ligação de CD8a ao HLAG em mais de 80% (quando comparada à ligação sem anticorpo) (consulte, por exemplo, o Exemplo 4c), e/ou k) restaura a resposta imune suprimida específica de HLA-G (por exemplo, liberação suprimida do fator de necrose tumoral (TNF) alfa) por monócitos cocultivados com células JEG-3 (ATCC HTB36).

[133] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43), liga-se ao mesmo epítopo como um anticorpo compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 33 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 34.

[134] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43), compreende: a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; e - em que o anticorpo se liga ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43 com uma afinidade de ligação que é substancialmente a mesma que (em um exemplo de realização com um valor KD da afinidade de ligação é reduzido no máximo 10 vezes em comparação com, em um exemplo de realização com um valor KD da afinidade de ligação reduzido no máximo 5 vezes em comparação com) um anticorpo compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16 (conforme determinado em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície).

[135] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43), compreende: (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; e em que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou

100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 15; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14; e em que o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou

100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 16; e

KD da afinidade de ligação é reduzido no máximo 10 vezes em comparação com, em um exemplo de realização com um valor KD da afinidade de ligação reduzido no máximo 5 vezes em comparação com) um anticorpo compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de

SEQ ID NO: 16 (conforme determinado em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície); e/ou

a) não reage de forma cruzada com um complexo MHC I ß2M

HLA-A2 humano compreendendo a SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 37; e/ou c) não reage de forma cruzada com um complexo MHC I ß2M H2Kd de camundongo compreendendo a SEQ ID NO: 45; e/ou d) não reage de forma cruzada com o complexo MHC I ß2M

RT1A de rato compreendendo a SEQ ID NO: 47; e/ou e) inibe a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G monomérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43); e/ou f) inibe a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G trimérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43), em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 60%) (quando comparado com a ligação sem anticorpo) (consulte o Exemplo 4b); e/ou g) inibe a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G monomérico e/ou dimérico e/ou trimérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43) em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%) (quando comparado com a ligação sem anticorpo) (vide o Exemplo 4b); e/ou h) inibe a ligação de ILT2 às células JEG3 (ATCC Nº. HTB36) (HLA-G) (em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%)) (quando comparada com a ligação sem anticorpo) (consulte o Exemplo 6); e/ou i) liga-se as células (HLA-G) JEG3 (ATCC Nº. HTB36) (consulte o Exemplo 5) e inibe a ligação de ILT2 às células JEG-3 (HLA-G) (ATCC Nº. HTB36) (em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%)) (quando comparada com a ligação sem anticorpo) (consulte o Exemplo 6); e/ou j) inibe a ligação de CD8a ao HLAG em mais de 80% (quando comparada à ligação sem anticorpo) (consulte, por exemplo, o Exemplo 4c), e/ou k) restaura a resposta imune suprimida específica de HLA-G (por exemplo, liberação suprimida do fator de necrose tumoral (TNF) alfa) por monócitos cocultivados com células JEG-3 (ATCC HTB36).

[136] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43), liga-se ao mesmo epítopo como um anticorpo compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16.

[137] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43), compreende: a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; e - em que o anticorpo se liga ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43 com uma afinidade de ligação que é substancialmente a mesma que (em um exemplo de realização com um valor KD da afinidade de ligação é reduzido no máximo 10 vezes em comparação com, em um exemplo de realização com um valor KD da afinidade de ligação reduzido no máximo 5 vezes em comparação com) um anticorpo compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 24 (conforme determinado em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície).

[138] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43), compreende: (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; e em que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou

100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 23; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22; e em que o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou

100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 24; e

KD da afinidade de ligação é reduzido no máximo 10 vezes em comparação com, em um exemplo de realização com um valor KD da afinidade de ligação reduzido no máximo 5 vezes em comparação com) um anticorpo compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência VL de

SEQ ID NO: 24 (conforme determinado em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície); e/ou

- em que o anticorpo é caracterizado independentemente pelas seguintes propriedades: o anticorpo anti-HLA-G:

a) não reage de forma cruzada com um complexo MHC I ß2M

HLA-G humano modificado compreendendo a SEQ ID NO: 44; e/ou b) não reage de forma cruzada com o complexo MHC I ß2M HLA-A2 humano compreendendo a SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 37; e/ou c) não reage de forma cruzada com um complexo MHC I ß2M

[139] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43), liga-se ao mesmo epítopo como um anticorpo compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 24.

[140] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43), compreende: a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; e - em que o anticorpo se liga ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43 com uma afinidade de ligação que é substancialmente a mesma que (em um exemplo de realização com um valor KD da afinidade de ligação é reduzido no máximo 10 vezes em comparação com, em um exemplo de realização com um valor KD da afinidade de ligação reduzido no máximo 5 vezes em comparação com) um anticorpo compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32 (conforme determinado em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície).

[141] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43), compreende: (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; e em que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou

100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 31; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 28; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 29 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30; e em que o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou

100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 32; e

KD da afinidade de ligação é reduzido no máximo 10 vezes em comparação com, em um exemplo de realização com um valor KD da afinidade de ligação reduzido no máximo 5 vezes em comparação com) um anticorpo compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de

SEQ ID NO: 32 (conforme determinado em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície); e/ou

a) não reage de forma cruzada com um complexo MHC I ß2M HLA-G humano modificado compreendendo a SEQ ID NO: 44; e/ou b) não reage de forma cruzada com o complexo MHC I ß2M

H2Kd de camundongo compreendendo a SEQ ID NO: 45; e/ou d) não reage de forma cruzada com o complexo MHC I ß2M

RT1A de rato compreendendo a SEQ ID NO: 47; e/ou e) inibe a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G monomérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43); e/ou f) inibe a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G trimérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43), em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 60%) (quando comparado com a ligação sem anticorpo) (consulte o Exemplo 4b); e/ou g) inibe a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G monomérico e/ou dimérico e/ou trimérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43)

em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%) (quando comparado com a ligação sem anticorpo) (vide o Exemplo 4b); e/ou h) inibe a ligação de ILT2 às células JEG3 (ATCC Nº.

HTB36)

(HLA-G) (em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%))

(quando comparada com a ligação sem anticorpo) (consulte o Exemplo 6); e/ou i) liga-se as células (HLA-G) JEG3 (ATCC Nº.

HTB36)

(consulte o Exemplo 5) e inibe a ligação de ILT2 às células JEG-3 (HLA-G)

(ATCC Nº.

HTB36) (em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%)) (quando comparada com a ligação sem anticorpo) (consulte o

Exemplo 6); e/ou j) inibe a ligação de CD8a ao HLAG em mais de 80%

(quando comparada à ligação sem anticorpo) (consulte, por exemplo, o

Exemplo 4c), e/ou k) restaura a resposta imune suprimida específica de HLA-G

(por exemplo, liberação suprimida do fator de necrose tumoral (TNF) alfa) por monócitos cocultivados com células JEG-3 (ATCC HTB36).

[142] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43), liga-se ao mesmo epítopo como um anticorpo compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32.

[143] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação que se liga ao CD3 humano (em um exemplo de realização ao CD3 compreendendo a SEQ ID NO: 76), compreende: (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 58; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61.

[144] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação que se liga ao CD3 humano (em um exemplo de realização ao CD3 compreendendo a SEQ ID NO: 76), compreende: - uma sequência VH de SEQ ID NO: 62 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 63.

[145] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43), compreende: (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 57, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir da SEQ ID NO: 58; e em que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 59; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 60 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61; e em que o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63.

[146] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43), compreende: (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 57, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir da SEQ ID NO: 58; e em que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 59; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 60 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61; e em que o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e - em que o anticorpo se liga ao complexo MHC I ß2M HLA-G compreendendo a SEQ ID NO: 43 com uma afinidade de ligação que é substancialmente a mesma que (em um exemplo de realização com um valor KD da afinidade de ligação é reduzido no máximo 10 vezes em comparação com, em um exemplo de realização com um valor KD da afinidade de ligação reduzido no máximo 5 vezes em comparação com) um anticorpo compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 62 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 63 (conforme determinado em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície).

ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS

[147] Em um exemplo de realização preferido, o anticorpo multiespecífico aqui fornecido é um anticorpo biespecífico. Os anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois sítios diferentes, ou seja, epítopos diferentes em antígenos diferentes ou epítopos diferentes no mesmo antígeno. Em determinados exemplos de realização, o anticorpo multiespecífico tem três ou mais especificidades de ligação. Em determinados exemplos de realização, uma das especificidades de ligação é para o HLA-G e a outra (ou duas ou mais) especificidade é para CD3. Em determinados exemplos de realização, os anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois (ou mais) epítopos de HLA-G diferentes. Os anticorpos multiespecíficos podem ser preparados como anticorpos completos (de comprimento total) ou fragmentos de anticorpo.

[148] As técnicas para produzir anticorpos multiespecífico incluem, mas não estão limitadas a, coexpressão recombinante de dois pares cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina possuindo diferentes especificidades (vide Milstein e Cuello, Nature 305:537(1983)), e a engenharia

“knob-in-hole” (vide, por exemplo, a Patente US 5.731.168 e Atwell et al., J.

Mol. Biol. 270:26 (1997)). Os anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos; pela manipulação de efeitos de orientação eletrostática para a produção de moléculas heterodiméricas de Fc-anticorpo (consulte, por exemplo, o documento WO 2009/089004); pela reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (consulte, por exemplo, a Patente US 4.676.980, e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); pelo uso de zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Kostelny et al., J.

Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992) e o documento WO 2011/034605); pelo uso da tecnologia comum da cadeia leve para contornar o problema de pareamento de cadeia leve (consulte, por exemplo, WO 98/50431); utilizando a tecnologia de “diabody” (diacorpo) para produzir fragmentos de anticorpo biespecíficos (consulte, por exemplo, Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA, 90: 6444-6448 (1993)); e pelo uso de dímeros de Fv (sFv) de cadeia única (consulte, por exemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)); e preparação de anticorpos triespecíficos como descrito, por exemplo, em Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

[149] Os anticorpos manipulados com três ou mais sítios de ligação ao antígeno, incluindo, por exemplo, “Anticorpos polvo” (octopus antibodies) ou DVD-Ig também estão incluídos no presente documento (consulte, por exemplo, os documentos WO 2001/77342 e WO 2008/024715).

Outros exemplos de anticorpos multiespecíficos com três ou mais sítios de ligação ao antígeno podem ser encontrados nos documentos WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO2010/145792 e WO 2013/026831. O anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação ao antígeno também inclui um “FAb de ação dupla” ou “DAF” compreendendo um sítio de ligação ao antígeno que se liga ao HLA-G, bem como outro antígeno diferente ou dois epítopos diferentes do HLA-G (consulte, por exemplo, US

2008/0069820 e WO 2015/095539).

[150] Os anticorpos multiespecíficos também podem ser fornecidos em uma forma assimétrica com um cruzamento de domínio em um ou mais braços de ligação da mesma especificidade de antígeno, ou seja, trocando os domínios VH/VL (consulte, por exemplo, WO 2009/080252 e WO 2015/150447), os domínios CH1/CL (consulte, por exemplo, WO 2009/080253) ou os braços Fab completos (consulte, por exemplo, WO 2009/080251, WO 2016/016299, vide também Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191, e Klein et al., MAbs 8 (2016) 1010-20). Os braços Fab assimétricos também podem ser projetados através da introdução de mutações de aminoácidos carregadas ou não carregadas em interfaces de domínio para direcionar o pareamento correto de Fab. Vide, por exemplo, o documento WO 2016/172485.

[151] Vários formatos moleculares adicionais para anticorpos multiespecíficos são conhecidos no estado da técnica e estão incluídos no presente documento (consulte, por exemplo, Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106).

[152] Um tipo particular de anticorpos multiespecíficos também incluídos na presente invenção são anticorpos biespecíficos projetados para se ligarem simultaneamente a um antígeno de superfície em uma célula alvo, por exemplo, uma célula tumoral e a um componente ativador e invariante do complexo receptor de célula T (TCR), como o CD3, para redirecionar as células T para matar as células alvo. Portanto, em determinados exemplos de realização, um anticorpo fornecido na presente invenção é um anticorpo multiespecífico, particularmente um anticorpo biespecífico, em que uma das especificidades de ligação é para HLA-G e a outra é para CD3.

[153] Exemplos de formatos de anticorpos biespecíficos que podem ser úteis para essa finalidade incluem, mas não se limitam, as moléculas chamadas “BiTE” (do inglês “bispecific T-cell engager”), em que duas moléculas scFv são fundidas por um ligante flexível (consulte, por exemplo, WO2004/106381, WO2005/061547, WO2007/042261 e WO2008/119567, Nagorsen e Bäuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)); diabodies (Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) e seus derivados, tais como diabodies em tandem (“TandAb”; Kipriyanov et al., J. Mol Biol 293, 41-56 (1999)); Moléculas “DART” (redirecionamento de dupla afinidade) que são baseadas no formato de diabody, mas apresentam uma ponte de dissulfeto C- terminal para estabilização adicional (Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 (2010)) e os chamados triomabs, que são moléculas de IgG híbridas inteiras de camundongo/rato (revisadas em Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)). Formatos específicos de anticorpos biespecíficos para células T incluídos na presente invenção são descritos nos documentos WO 2013/026833, WO2013/026839, WO 2016/020309; Bacac et al., Oncoimmunology 5 (8) (2016) e1203498.

ANTICORPOS BIESPECÍFICOS QUE SE LIGAM AO HLA-G E CD3

[154] A invenção também fornece um anticorpo biespecífico, ou seja, um anticorpo que compreende pelo menos duas frações de ligação ao antígeno capazes de ligação específica a dois determinantes antigênicos distintos (um primeiro e um segundo antígeno).

[155] Com base nos anticorpos HLA-G que eles desenvolveram, os presentes inventores desenvolveram moléculas de ligação a antígenos biespecíficos que se ligam ao HLA-G e um antígeno adicional, particularmente um antígeno de ativação de célula T, tal como o CD3.

[156] Como mostrado nos Exemplos, esses anticorpos biespecíficos têm várias propriedades notáveis, incluindo boa eficácia e baixa toxicidade.

[157] Assim, em determinados aspectos, a invenção provê um anticorpo biespecífico, compreendendo (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA-G e (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que o anticorpo biespecífico tem qualquer uma das seguintes características.

[158] O anticorpo biespecífico da invenção induz especificamente a morte mediada por células T de células que expressam HLA-G. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico da invenção induz especificamente a morte mediada por células T de células que expressam HLA-G. Em um exemplo de realização mais específico, o anticorpo biespecífico induz especificamente a morte mediada por células T de células que expressam HLA-G.

[159] Em um exemplo de realização, a indução de morte mediada por células T pelo anticorpo biespecífico é determinada usando células que expressam HLA-G.

[160] Em um exemplo de realização, a ativação de células T pelo anticorpo biespecífico é determinada medindo, particularmente por citometria de fluxo, a expressão de CD25 e/ou CD69 pelas células T após incubação com o anticorpo biespecífico na presença de células que expressam HLA-G, particularmente células T2 pulsadas com peptídeo.

[161] Em um exemplo de realização específico, a indução de morte mediada por células T pelo anticorpo biespecífico é determinada da seguinte forma.

[162] A capacidade do TCB anti-HLA-G/anti CD3 para ativar células T na presença de células tumorais que expressam HLA-G é testada em células SKOV3 transfectadas com HLA-G recombinante (SKOV3HLAG). A ativação de células T é avaliada por análise FACS de marcadores de ativação de superfície celular CD25 e marcador de ativação precoce CD69 em células T.

Resumidamente, PBMCs são isoladas a partir do sangue periférico humano por centrifugação em gradiente de densidade usando tubos de meio de separação de linfócitos (PAN # P04-60125). As células PBMC e SKOV3HLAG são semeadas em uma proporção de 10:1 em placas de fundo U de 96 poços. A cocultura é então incubada com HLAG-TCB em diferentes concentrações, conforme descrito no Exemplo 10 e incubada por 24 horas a 37ºC em uma incubadora com 5% de CO2. No dia seguinte, a expressão de CD25 e CD69 é medida por citometria de fluxo.

[163] Para análise de citometria de fluxo, as células são coradas com camundongo Anti-CD8 Humano - PerCP-Cy5.5 (BD Pharmingen # 565310), camundongo anti-CD25 Humano - PE (eBioscience # 9012-0257) e Camundongo Anti-CD69 humano - APC (BD Pharmingen # 555533) a 4ºC.

Resumidamente, os anticorpos são diluídos para uma concentração de 2 vezes e 25 µL de diluição de anticorpo são adicionados em cada poço com 25 µL de coculturas pré-lavadas. As células são coradas durante 30 min a 4ºC e lavadas duas vezes com tampão de coloração 200 µL/poço e centrifugação a 300g durante 5 min. Os sedimentos celulares são ressuspensos em 200 µL de tampão de coloração e corados com DAPI para discriminação de células mortas / vivas a uma concentração final de 2 µg/mL. As amostras são então medidas usando o citômetro de fluxo BD LSR. A análise de dados é realizada usando o software FlowJo V.10.1. As médias geométricas das intensidades de fluorescência são exportadas e a proporção das médias geométricas para o isotipo e anticorpo é calculada.

[164] O anticorpo biespecífico da invenção induz especificamente a morte mediada por células T de células que expressam HLA-G. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico da invenção induz especificamente a morte mediada por células T de células que expressam HLA-G. Em um exemplo de realização mais específico, o anticorpo biespecífico ativa especificamente células T na presença de células que expressam HLA-G.

[165] Em um exemplo de realização, a ligação do antígeno biespecífico não induz significativamente a morte mediada por células T ou ativa células T na presença de células que expressam HLA- G. Em um exemplo de realização, o anticorpo biespecífico induz a morte mediada por células T e/ou ativa células T na presença de células que expressam HLA- G com uma EC50 que é pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75 ou pelo menos 100 vezes menor do que a EC50 para indução de morte mediada por células T ou ativação de células T na presença de células que expressam HLA- G.

[166] De acordo com exemplos de realização específicos da invenção, as porções de ligação ao antígeno compreendidas no anticorpo biespecífico são moléculas Fab (ou seja, domínios de ligação ao antígeno composto de uma cadeia pesada e uma cadeia leve, cada uma compreendendo um domínio variável e um domínio constante). Em um exemplo de realização, a primeira e/ou segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab. Em um exemplo de realização, a referida molécula Fab é humana. Em um exemplo de realização, a referida molécula Fab é humanizada. Em outro exemplo de realização adicional, a referida molécula Fab compreende domínios constantes de cadeia pesada e leve humana.

[167] De modo preferido, pelo menos uma das porções de ligação ao antígeno é uma molécula Fab crossover (cruzada). Tais modificações reduzem o pareamento incorreto de cadeias leves e pesadas entre diferentes moléculas Fab, melhorando assim o rendimento e a pureza do anticorpo biespecífico da presente invenção na produção recombinante. Em uma molécula Fab crossover particular útil para o anticorpo biespecífico da invenção, os domínios variáveis de cadeia leve Fab e de cadeia pesada Fab (VL e VH, respectivamente) são trocados. Entretanto, mesmo com essa troca de domínio a preparação do anticorpo biespecífico pode compreender determinados produtos secundários devido a uma interação do tipo Bence Jones entre cadeias pesadas e leves incorretamente pareadas (vide Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191). Para reduzir ainda mais o desalinhamento (pareamento incorreto) das cadeias pesadas e leves de diferentes moléculas Fab e, assim, aumentar a pureza e o rendimento do anticorpo biespecífico desejado, podem ser introduzidos aminoácidos carregados com cargas opostas em posições específicas de aminoácidos nos domínios CH1 e CL da(s) molécula(s) Fab que se ligam ao primeiro antígeno (HLA-G), ou a molécula Fab que se liga ao segundo antígeno de ativação de célula T, tal como CD3, conforme descrito na presente invenção. As modificações de carga são feitas nas moléculas Fab convencionais compreendidas no anticorpo biespecífico (como mostrado, por exemplo, nas Figuras 11 A-C, G-J), ou nas moléculas Fab cruzadas VH/VL compreendidas no anticorpo biespecífico (como mostrado por exemplo, nas Figuras 11 D-F, K- N) (mas não em ambas). Em exemplos de realização específicos, as modificações de carga são feitas na(s) molécula(s) Fab convencional(is) compreendida(s) no anticorpo biespecífico (que em exemplos de realização específicos se ligam especificamente ao primeiro antígeno, ou seja, HLA-G).

[168] Em um exemplo de realização específica de acordo com a invenção, o anticorpo biespecífico é capaz de se ligar simultaneamente ao primeiro antígeno (ou seja, HLA-G) e ao segundo antígeno (por exemplo, um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3). Em um exemplo de realização, o anticorpo biespecífico é capaz de reticular com uma célula T e uma célula alvo pela ligação simultânea ao HLA-G e a um antígeno de ativação de célula T. Em um exemplo de realização ainda mais específico, tal ligação simultânea resulta na lise da célula-alvo, particularmente uma célula tumoral expressando HLA-G. Em um exemplo de realização, tal ligação simultânea resulta na ativação da célula T. Em outros exemplos de realização, tal ligação simultânea resulta em uma resposta celular de um linfócito T, particularmente, um linfócito T citotóxico, selecionado a partir do grupo consistindo de: proliferação, diferenciação, secreção de citocina, liberação de molécula efetora citotóxica, atividade citotóxica, e expressão de marcadores de ativação. Em um exemplo de realização, a ligação do anticorpo biespecífico ao antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, sem ligação simultânea ao HLA-G, não resulta na ativação da célula T.

[169] Em um exemplo de realização, o anticorpo biespecífico é capaz de redirecionar a atividade citotóxica de uma célula T para uma célula alvo. Em um exemplo de realização específico, a referida reorientação é independente da apresentação de antígeno mediada por MHC pela célula-alvo e/ou da especificidade da célula T.

[170] Particularmente, uma célula T, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização da invenção, é uma célula T citotóxica. Em alguns exemplos de realização a célula T é uma célula T CD4 + ou uma célula T CD8+, em particular é uma célula T CD8+.

PRIMEIRA PORÇÃO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO

[171] O anticorpo biespecífico da invenção compreende pelo menos uma porção de ligação ao antígeno, particularmente uma molécula Fab, que se liga ao HLA-G (primeiro antígeno). Em determinados exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende duas porções de ligação ao antígeno, particularmente moléculas Fab, que se ligam ao HLA-G. Em tal exemplo de realização específico, cada uma destas porções de ligação ao antígeno liga-se ao mesmo determinante antigênico. Em um exemplo de realização ainda mais específico, todas estas porções de ligação ao antígeno são idênticas, ou seja, compreendem as mesmas sequências de aminoácidos, incluindo as mesmas substituições de aminoácidos no domínio CH1 e CL,

conforme descrito na presente invenção (se houver). Em um exemplo de realização, o anticorpo biespecífico compreende mais do que duas porções de ligação ao antígeno, particularmente moléculas Fab, que se ligam ao HLA-G.

[172] Em exemplos de realização particulares, a(s) porção(ões) de ligação ao antígeno que se liga(m) a um HLA-G é(são) uma molécula(s) Fab convencional(ais). Em tais exemplos de realização, a(s) porção(ões) de ligação ao antígeno que se liga(m) a um segundo antígeno é(são) molécula(s) Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, ou seja, molécula(s) Fab na(s) qual(quais) os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si.

[173] Em tais exemplos de realização alternativos, a(s) porção(ões) de ligação ao antígeno que se liga(m) HLA-G é(são) uma molécula(s) Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si. Em tais exemplos de realização, a(s) porção(ões) que se liga(m) a um segundo antígeno é(são) preferencialmente molécula(s) Fab convencional(ais).

[174] A porção de ligação ao HLA-G é capaz de direcionar o anticorpo biespecífico para um sítio alvo, por exemplo, para um tipo específico de célula tumoral que expressa HLA-G.

[175] A primeira porção de ligação ao antígeno do anticorpo biespecífico pode incorporar qualquer um dos recursos, isoladamente ou em combinação, descritos na presente invenção em relação ao anticorpo que se liga ao HLA-G, a menos que seja cientificamente claramente irracional ou impossível.

[176] Assim, em um aspecto, a invenção provê um anticorpo biespecífico, compreendendo (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é HLA-G e a primeira porção de ligação ao antígeno compreende:

- Um exemplo de realização da invenção é um anticorpo (isolado)

que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização, o anticorpo se liga ao complexo HLA-G MHC I ß2M compreendendo a SEQ ID NO: 43), em que o anticorpo compreende:

A) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ

ID NO: 19; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou D) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 27; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.

[177] Um exemplo de realização da invenção é um anticorpo isolado que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização, o anticorpo se liga ao complexo HLA-G MHC I ß2M compreendendo a SEQ ID NO: 43), em que o anticorpo: A) i) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 8; ii) ou a variante humanizada da VH e VL do anticorpo de (i); ou iii) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 33 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 34; ou B) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16; ou C) i) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 24; ou

D) i) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32.

[178] Um exemplo de realização da invenção é um anticorpo (isolado) que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização, o anticorpo se liga ao complexo HLA-G MHC I ß2M compreendendo a SEQ ID NO: 43), em que o anticorpo compreende: (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR -H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[179] Um exemplo de realização da invenção é um anticorpo (isolado) que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização, o anticorpo se liga ao complexo HLA-G MHC I ß2M compreendendo a SEQ ID NO: 43), em que o anticorpo compreende: (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (c) HVR -H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

[180] Um exemplo de realização da invenção é um anticorpo (isolado) que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização, o anticorpo se liga ao complexo HLA-G MHC I ß2M compreendendo a SEQ ID

NO: 43), em que o anticorpo compreende: (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; (c) HVR -H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

[181] Um exemplo de realização da invenção é um anticorpo (isolado) que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização, o anticorpo se liga ao complexo HLA-G MHC I ß2M compreendendo a SEQ ID NO: 43), em que o anticorpo compreende: (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; (c) HVR -H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.

[182] Um exemplo de realização da invenção é um anticorpo (isolado) que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização, o anticorpo se liga ao complexo HLA-G MHC I ß2M compreendendo a SEQ ID NO: 43), em que o anticorpo compreende: i) uma sequência VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 8; e ii) ou a variante humanizada da VH e VL do anticorpo de (i).

[183] Um exemplo de realização da invenção é um anticorpo (isolado) que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização, o anticorpo se liga ao complexo HLA-G MHC I ß2M compreendendo a SEQ ID NO: 43), em que o anticorpo compreende: i) uma sequência VH de SEQ ID NO: 33 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 34.

[184] Um exemplo de realização da invenção é um anticorpo (isolado) que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização, o anticorpo se liga ao complexo HLA-G MHC I ß2M compreendendo a SEQ ID NO: 43), em que o anticorpo compreende: - uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16.

[185] Um exemplo de realização da invenção é um anticorpo (isolado) que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização, o anticorpo se liga ao complexo HLA-G MHC I ß2M compreendendo a SEQ ID NO: 43), em que o anticorpo compreende: - uma sequência VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 24.

[186] Um exemplo de realização da invenção é um anticorpo (isolado) que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização, o anticorpo se liga ao complexo HLA-G MHC I ß2M compreendendo a SEQ ID NO: 43), em que o anticorpo compreende: - uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32.

[187] Um exemplo de realização da invenção é um anticorpo (isolado) que se liga ao HLA-G humano (em um exemplo de realização, o anticorpo se liga ao complexo HLA-G MHC I ß2M compreendendo a SEQ ID NO: 43), em que o anticorpo compreende: A) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3; e em que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos

95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido

98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-

96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98%

B) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ

ID NO: 11; e em que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14; e em que o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16;

ou

C) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ

ID NO: 19; e em que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22; e em que o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou

100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14;

ou

D) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ

ID NO: 27; e em que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 28; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 29 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30; e em que o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[188] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante humana. Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região constante humana, particularmente um domínio CH1 e/ou CL humano. Sequências exemplares de domínios constantes humanos são fornecidas nas SEQ ID NOs: 51 e 52 (domínios CL kappa e lambda humanos, respectivamente) e SEQ ID NO: 53 (domínios constantes de cadeia pesada CH1-CH2-CH3 de IgG1 humana). Em alguns exemplos de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52, particularmente a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.

Particularmente, a região constante de cadeia leve pode compreender mutações de aminoácidos tal como descrito na presente invenção na seção “modificações de carga” e/ou pode compreender deleção ou substituições de um ou mais (particularmente dois) aminoácidos N-terminais se presente em uma molécula Fab crossover. Em alguns exemplos de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de domínio CH1 compreendida em a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53. Particularmente, a região constante de cadeia pesada (especificamente domínio CH1) pode compreender mutações de aminoácidos conforme descrito na presente invenção em “modificações de carga”.

SEGUNDA PORÇÃO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO QUE SE LIGA A UM ANTÍGENO DE ATIVAÇÃO DE CÉLULA T, PARTICULARMENTE CD3

[189] O anticorpo biespecífico da invenção compreende pelo menos uma porção de ligação ao antígeno, particularmente uma molécula Fab, que se liga a um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3.

[190] Em exemplos de realização específicos, a porção de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, é uma molécula Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si. Em tais exemplos de realização particulares, a(s) porção(ões) de ligação ao antígeno que se liga(m) a ao HLA- G é(são) preferencialmente molécula Fab convencional. Em exemplos de realização onde há mais de uma porção de ligação ao antígeno, particularmente moléculas Fab, que se liga a um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3 compreendido no anticorpo biespecífico, a porção de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, é preferencialmente um molécula cross-Fab e as porções de ligação ao antígeno que se ligam ao HLA-G são moléculas Fab convencionais.

[191] Em exemplos de realização alternativos, a(s) porção(ões) que se liga(m) ao segundo antígeno é(são) preferencialmente uma molécula(s) Fab convencional(ais). Em tais exemplos de realização, a(s) porção(ões) de ligação ao antígeno que se liga(m) ao primeiro antígeno (ou seja, HLA-G) é(são) uma molécula(s) Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si. Em exemplos de realização onde há mais de uma porção de ligação ao antígeno, particularmente moléculas Fab, que se liga a um segundo antígeno compreendido no anticorpo biespecífico, a porção de ligação ao antígeno que se liga ao HLA-G é preferencialmente uma molécula cross-Fab e as porções de ligação ao antígeno que se ligam ao CD3 são moléculas Fab convencionais.

[192] Em alguns exemplos de realização, o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T (também referido como uma “porção de ligação ao antígeno de ativação de célula T” ou “molécula Fab de ligação ao antígeno de ativação de célula T”). Em um exemplo de realização específico, o anticorpo biespecífico compreende não mais do que uma porção de ligação ao antígeno capaz de desempenhar ligação específica a um antígeno de ativação de célula T. Em um exemplo de realização, o anticorpo biespecífico fornece ligação monovalente ao antígeno de ativação de célula T.

[193] Em exemplos de realização específicos, o segundo antígeno é o CD3, particularmente o CD3 humano (SEQ ID NO: 76) ou CD3 de cinomolgo (SEQ ID NO: 77), sendo mais particularmente o CD3 humano. Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno reage cruzadamente (ou seja, se liga especificamente) com CD3 humano e CD3 de cinomolgo. Em alguns exemplos de realização, o segundo antígeno é a subunidade épsilon do CD3 (CD3 épsilon).

[194] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno que se liga ao CD3 humano compreende um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; e um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61.

[195] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno que se liga ao CD3 humano compreende um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 57, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; e em que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; e um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 59; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 60 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61; e em que o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63.

[196] Em alguns exemplos de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno é (derivada de) um anticorpo humanizado. Em alguns exemplos de realização, a VH é uma VH humanizada e/ou a VL é uma VL humanizada. Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende CDRs como em qualquer um dos exemplos de realização anteriores, e compreende ainda uma região de arcabouço humana aceptora, por exemplo, um arcabouço (framework) de imunoglobulina humana ou arcabouço de consenso humano.

[197] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno que se liga ao CD3 humano compreende uma sequência

VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62. Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63.

[198] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno que se liga ao CD3 humano compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63.

[199] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno que se liga ao CD3 humano compreende uma região constante humana. Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região constante humana, particularmente um domínio CH1 e/ou CL humano.

Sequências exemplares de domínios constantes humanos são fornecidas nas SEQ ID NOs: 51 e 52 (domínios CL kappa e lambda humanos, respectivamente) e SEQ ID NO: 53 (domínios constantes de cadeia pesada CH1-CH2-CH3 de IgG1 humana). Em alguns exemplos de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52, particularmente a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51. Particularmente, a região constante de cadeia leve pode compreender mutações de aminoácidos tal como descrito na presente invenção na seção “modificações de carga” e/ou pode compreender deleção ou substituições de um ou mais (particularmente dois) aminoácidos N-terminais se presente em uma molécula Fab crossover.

Em alguns exemplos de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de domínio CH1 compreendida em a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53. Particularmente, a região constante de cadeia pesada (especificamente domínio CH1) pode compreender mutações de aminoácidos conforme descrito na presente invenção em “modificações de carga”.

[200] Em alguns exemplos de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1, particularmente os domínios variáveis VL e VH, da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos entre si (ou seja, de acordo com tal exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab crossover em que os domínios variáveis ou constantes da cadeia leve Fab e cadeia pesada Fab estão trocados). Em um desses exemplos de realização, a primeira (e a terceira se houver) porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional.

[201] Em um exemplo de realização, não mais de uma porção de ligação ao antígeno que se liga ao segundo antígeno (por exemplo, um antígeno de ativação de célula T, como CD3) está presente no anticorpo biespecífico (ou seja, o anticorpo biespecífico fornece ligação monovalente ao segundo antígeno).

MODIFICAÇÕES DE CARGA

[202] Os anticorpos biespecíficos da invenção podem compreender substituições de aminoácidos nas moléculas Fab compreendidas nelas que são particularmente eficientes na redução do pareamento incorreto de cadeias leves com cadeias pesadas não correspondentes (subprodutos do tipo Bence-Jones), que pode ocorrer na produção de anticorpos biespecíficos baseados em Fab com uma troca VH/VL em um (ou mais, no caso de moléculas que compreendem mais de duas moléculas Fab de ligação ao antígeno) de seus braços de ligação (veja também a Publicação PCT WO 2015/150447, particularmente os exemplos aí descritos, integralmente incorporados ao presente como referência). A proporção de um anticorpo biespecífico desejado em comparação com subprodutos indesejados, em particular subprodutos do tipo Bence Jones que ocorrem em anticorpos biespecíficos com uma troca de domínio VH/VL em um de seus braços de ligação, pode ser melhorada pela introdução de aminoácidos carregados com cargas opostas em posições específicas de aminoácidos nos domínios CH1 e CL (às vezes referidos na presente invenção como “modificações de carga”).

[203] Consequentemente, em alguns exemplos de realização, quando a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno do anticorpo biespecífico são, ambas, moléculas Fab, e em uma das porções de ligação ao antígeno (particularmente a segunda porção de ligação ao antígeno) os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro: i) no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por um aminoácido carregado positivamente (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído por um aminoácido carregado negativamente (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); ou ii) no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por um aminoácido carregado positivamente (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído por um aminoácido carregado negativamente (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[204] O anticorpo biespecífico não compreende ambas as modificações mencionadas em i) e ii). Os domínios constantes CL e CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno possuindo a troca VH/VL não são substituídos um pelo outro (ou seja, permanecem inalterados).

[205] Em um exemplo de realização mais específico: (i) no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); ou (ii) no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[206] Em tal exemplo de realização, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[207] Em um exemplo de realização adicional, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[208] Em um exemplo de realização específico, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat); e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[209] Em um exemplo de realização mais específico, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[210] Em outro exemplo de realização particular, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por arginina (R) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[211] Em exemplos de realização específicos, se as substituições de aminoácidos de acordo com os exemplos de realização acima forem feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno é do isotipo kappa.

[212] Alternativamente, as substituições de aminoácidos de acordo com os exemplos de realização acima podem ser feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno ao invés de serem feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno. Em tais exemplos de realização, o domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno é do isotipo kappa.

[213] Consequentemente, em um exemplo de realização, no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[214] Em um exemplo de realização adicional, no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[215] Ainda em outro exemplo de realização, no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat); e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[216] Em um exemplo de realização mais específico, no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[217] Em outro exemplo de realização, no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por arginina (R) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[218] Em um exemplo de realização específico, um anticorpo biespecífico da invenção compreende: I) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um HLA-G, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo: A) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou B) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 11; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou

ID NO: 27; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; e

II) uma segunda porção de ligação ao antígeno, que se liga ao

CD3 humano;

- em que a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, compreendendo:

E) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 58; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; e em que, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização preferido, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)), e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização particular, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)); e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[219] Em um exemplo de realização específico, um anticorpo biespecífico da invenção compreende: I) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um HLA-G, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab que: A) i) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 8; ii) ou a variante humanizada da VH e VL do anticorpo de (i); ou iii) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 33 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 34; ou B) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16; ou

C)

compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 24; ou

D)

compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32;

e;

II) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga ao

CD3 humano;

E) uma sequência VH de SEQ ID NO: 62 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 63; e

- em que, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat)

(em um exemplo de realização preferido, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)), e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H)

(numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização particular, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)); e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

FORMATOS DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS

[220] Os componentes do anticorpo biespecífico de acordo com a presente invenção, podem ser fundidos entre si em uma variedade de configurações. Configurações exemplares são apresentadas na Figura 11.

[221] Em exemplos de realização específicos, as porções de ligação ao antígeno compreendidas no anticorpo biespecífico são moléculas Fab. Em tais exemplos de realização, a primeira, segunda, terceira etc. porção de ligação ao antígeno pode ser referida no presente como primeira, segunda, terceira etc. molécula Fab, respectivamente.

[222] Em um exemplo de realização, a primeira e a segunda porção de ligação do anticorpo biespecífico estão fundidas uma à outra, opcionalmente através de um peptídeo ligante. Em exemplos de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são, cada uma, uma molécula Fab. Em tal exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno. Em outro exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno. Em exemplos de realização em que (i) a segunda porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno, ou (ii) a primeira porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno, adicionalmente, a cadeia leve do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno e a cadeia leve do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno podem estar fundidas entre si, opcionalmente por meio de um peptídeo ligante.

[223] Um anticorpo biespecífico com uma única porção de ligação ao antígeno (como uma molécula Fab) capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, tal como HLA-G, (por exemplo, conforme mostrado na Figura 11A, D, G, H, K, L) é útil, particularmente nos casos onde se espera a internalização do antígeno da célula alvo após a ligação de uma porção de ligação ao antígeno de alta afinidade. Em tais casos, a presença de mais do que uma porção de ligação ao antígeno específica para o antígeno de células-alvo pode aumentar a internalização do antígeno das células-alvo, reduzindo deste modo a sua disponibilidade.

[224] Entretanto, em outros casos será vantajoso dispor de um anticorpo biespecífico compreendendo duas ou mais porções de ligação ao antígeno (tal como moléculas Fab) específicas para um antígeno da célula alvo (veja os exemplos mostrados na Figure 11B, 11C, 11E, 11F, 11I, 11J, 11M ou 11N), por exemplo, para otimizar o direcionamento para o local alvo ou para permitir a reticulação de antígenos da célula alvo.

[225] Consequentemente, em exemplos de realização específicos, o anticorpo biespecífico de acordo com a presente invenção compreende uma terceira porção de ligação ao antígeno.

[226] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno liga-se ao primeiro antígeno, isto é, HLA-G. Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab.

[227] Em exemplos de realização específicos, a terceira porção de ligação ao antígeno é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno.

[228] A terceira porção de ligação ao antígeno do anticorpo biespecífico pode incorporar qualquer um dos recursos, isoladamente ou em combinação, descritos na presente invenção em relação a primeira porção de ligação ao antígeno e/ou ao anticorpo que se liga ao HLA-G, a menos que cientificamente seja claramente irracional ou impossível.

[229] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno liga-se ao HLA-G e compreende: A) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou B) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 11; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou C) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 19; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou D) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 27; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.

[230] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno liga-se ao HLA-G e compreende: A) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3; e em que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR- L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6; e em que o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou B) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ

ou

D) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 27; e em que o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 28; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 29 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30; e em que o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (em um exemplo de realização preferido 98% ou 99% ou 100%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[231] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno: A) iv) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 8; v) ou a variante humanizada da VH e VL do anticorpo de (i); ou vi) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 33 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 34; ou B) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16; ou C)

compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 24; ou D) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32.

[232] Em alguns exemplos de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno é (derivada de) um anticorpo humano. Em alguns exemplos de realização, a VH é uma VH humana e/ou a VL é uma VL humana.

Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende CDRs como em qualquer um dos exemplos de realização acima, e compreende ainda uma região de arcabouço (framework) humana, por exemplo, um arcabouço de imunoglobulina humana.

[233] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende: (i) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (ii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (iii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%,

99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (iv) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; ou (v) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.

[234] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende: (i) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (ii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (iii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (iv) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; ou (v) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.

[235] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende: - uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[236] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende: - uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[237] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende: - uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[238] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende: - uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[239] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende: - uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.

[240] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante humana. Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região constante humana, particularmente um domínio CH1 e/ou CL humano. Sequências exemplares de domínios constantes humanos são fornecidas nas SEQ ID NOs: 51 e 522 (domínios CL kappa e lambda humanos, respectivamente) e SEQ ID NO: 53 (domínios constantes de cadeia pesada CH1-CH2-CH3 de IgG1 humana). Em alguns exemplos de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52, particularmente a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.

Particularmente, a região constante de cadeia leve pode compreender mutações de aminoácidos tal como descrito na presente invenção na seção “modificações de carga” e/ou pode compreender deleção ou substituições de um ou mais (particularmente dois) aminoácidos N-terminais se presente em uma molécula Fab crossover. Em alguns exemplos de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de domínio CH1 compreendida em a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.

Particularmente, a região constante de cadeia pesada (especificamente domínio CH1) pode compreender mutações de aminoácidos conforme descrito na presente invenção em “modificações de carga”.

[241] Em exemplos de realização específicos, a terceira e a primeira porção de ligação ao antígeno são uma molécula Fab e a terceira porção de ligação ao antígeno é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno. Assim, nestes exemplos de realização, a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno compreendem as mesmas sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve e têm o mesmo arranjo de domínios (isto é,

convencional ou cruzado (crossover)). Além disso, nestes exemplos de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende as mesmas substituições de aminoácidos (se presentes), que a primeira porção de ligação ao antígeno. Por exemplo, as substituições de aminoácidos descritas na presente invenção como “modificações de carga” serão feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 de cada uma das primeiras porções de ligação ao antígeno e a terceira porção de ligação ao antígeno.

Alternativamente, as referidas substituições de aminoácidos podem ser feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno (que em exemplos de realização específicos também é uma molécula Fab), mas não no domínio constante CL e no domínio constante CH1 de a primeira porção de ligação ao antígeno e terceira porção de ligação ao antígeno.

[242] Como a primeira porção de ligação ao antígeno, a terceira porção de ligação ao antígeno é particularmente uma molécula Fab convencional. Exemplos de realização em que a primeira e a terceira porções de ligação ao antígeno são moléculas Fab crossover (e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional) também são, no entanto, contempladas. Assim, em exemplos de realização específicos, a primeira e a terceira porções de ligação ao antígeno são uma molécula Fab convencional e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constante CL e CH1 das cadeias pesada e leve do Fab são trocados/substituídos um pelo outro. Em outros exemplo de realização, a primeira e a terceira porções de ligação ao antígeno são, cada uma, uma molécula Fab crossover, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional.

[243] Se uma terceira porção de ligação ao antígeno estiver presente, em um exemplo de realização específico, a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno se ligam ao HLA-G, e a segunda porção de ligação ao antígeno se liga a um segundo antígeno, particularmente um antígeno de ativação de célula T, mais particularmente o CD3, mais particularmente o CD3 épsilon.

[244] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade. A primeira e a segunda subunidade do domínio Fc são capazes de desempenhar associação estável.

[245] O anticorpo biespecífico de acordo com a invenção pode ter configurações diferentes, ou seja, a primeira, segunda (e opcionalmente terceira) porção de ligação ao antígeno podem estar fundidas entre si e com o domínio Fc de diferentes maneiras. Os componentes podem ser fundidos entre si diretamente ou, preferencialmente, através de um ou mais ligantes peptídicos adequados. Quando a fusão de uma molécula Fab está na extremidade N-terminal de uma subunidade do domínio Fc, ela tipicamente é via região de dobradiça de imunoglobulina.

[246] Em alguns exemplos de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são moléculas Fab e a segunda porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc. Em tais exemplos de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno pode ser fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno ou ao N- terminal da outra subunidade do domínio Fc. Em particular, em tais exemplos de realização, a referida primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, isto é, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CL e CH1 das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si. Em outros exemplos de realização, a referida primeira molécula Fab é uma molécula Fab crossover (cruzada) e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab convencional.

[247] Em um exemplo de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são, cada uma, moléculas Fab, a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc, e a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada do Fab ao N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno. Em um destes exemplos de realização específicos, o anticorpo biespecífico consiste essencialmente na primeira e na segunda molécula Fab, o domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N- terminal da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, e a segunda molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc. Essa configuração é representada esquematicamente nas Figuras 11G e 11K (com o segundo domínio de ligação ao antígeno nesses exemplos sendo uma molécula Fab crossover VH/VL). Opcionalmente, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab podem ser adicionalmente fundidas entre si.

[248] Em outro exemplo de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são moléculas Fab e a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc. Em um exemplo de realização específico, o anticorpo biespecífico consiste essencialmente na primeira e na segunda molécula Fab, o domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira e a segunda molécula Fab estão fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab com o N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc.

Essa configuração é esquematicamente representada nas Figuras 11A e 11D (nesses exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional). A primeira e a segunda molécula Fab podem estar fundidas ao domínio Fc diretamente ou através de um ligante peptídico. Em um exemplo de realização particular, a primeira e a segunda molécula Fab estão fundidas ao domínio Fc por uma região de dobradiça de imunoglobulina. Em um exemplo de realização específico, a região de dobradiça de imunoglobulina é uma região de dobradiça de IgG1 humana, particularmente quando o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1.

[249] Em alguns exemplos de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são moléculas Fab e a primeira porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da segunda subunidade do domínio Fc.

Em tais exemplos de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno pode ser fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno ou (conforme descrito acima) ao N-terminal da outra subunidade do domínio Fc. Em particular, em tais exemplos de realização, a referida primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, isto é, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CL e CH1 das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si. Em outros exemplos de realização, a referida primeira molécula Fab é uma molécula Fab crossover (cruzada) e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab convencional.

[250] Em um exemplo de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são, cada uma, moléculas Fab, a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc, e a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada do Fab ao N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno. Em um destes exemplos de realização específicos, o anticorpo biespecífico consiste essencialmente na primeira e na segunda molécula Fab, o domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a segunda molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N- terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, e a primeira molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc. Essa configuração é esquematicamente representada nas Figuras 11H e 11L (nesses exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional). Opcionalmente, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab podem ser adicionalmente fundidas entre si.

[251] Em alguns exemplos de realização, a terceira porção de ligação, particularmente uma terceira molécula Fab, é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc. Em particular, em tais exemplos de realização, as referidas primeira e terceira moléculas Fab são, cada uma, uma molécula Fab convencional, e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, isto é, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CL e CH1 das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si. Em outros exemplos de realização, as referidas primeira e terceira moléculas Fab são, cada uma, uma molécula Fab crossover e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab convencional.

[252] Em um exemplo de realização específico, a segunda e a terceira porção de ligação ao antígeno são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc, e a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab.

Em um exemplo de realização específico, o anticorpo biespecífico consiste essencialmente na primeira, segunda e terceira molécula Fab, o domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira molécula Fab está fundida no C- terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, e a segunda molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc e em que a terceira molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da segunda subunidade do domínio Fc. Essa configuração é esquematicamente representada na Figura 11B e 11E (nesses exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional) e na Figura 11J e 11N (nestes exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL). A segunda e a terceira molécula Fab podem ser fundidas ao domínio Fc diretamente ou através de um ligante peptídico. Em um exemplo de realização particular, a segunda e a primeira molécula Fab estão fundidas ao domínio Fc por uma região de dobradiça de imunoglobulina. Em um exemplo de realização específico, a região de dobradiça de imunoglobulina é uma região de dobradiça de IgG1 humana, particularmente quando o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1. Opcionalmente, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab podem ser adicionalmente fundidas entre si.

[253] Em outro exemplo de realização, a primeira e terceira porção de ligação ao antígeno são cada uma fundida na extremidade C- terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc, e a segunda porção de ligação ao antígeno está fundida com a extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno. Em um exemplo de realização específico, o anticorpo biespecífico consiste essencialmente na primeira, segunda e terceira molécula Fab, o domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a segunda molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, e a primeira molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc e em que a terceira molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da segunda subunidade do domínio Fc. Essa configuração é esquematicamente representada na Figura 11C e 11F (nesses exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional) e na Figura 11l e 11M (nestes exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula

Fab convencional e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL). A primeira e a terceira molécula Fab podem ser fundidas ao domínio Fc diretamente ou através de um ligante peptídico. Em um exemplo de realização particular, a primeira e a terceira molécula Fab estão fundidas ao domínio Fc por uma região de dobradiça de imunoglobulina. Em um exemplo de realização específico, a região de dobradiça de imunoglobulina é uma região de dobradiça de IgG 1 humana, particularmente quando o domínio Fc é um domínio Fc de IgG 1.

Opcionalmente, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab podem ser adicionalmente fundidas entre si.

[254] Em configurações do anticorpo biespecífico, em que uma molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de cada uma das subunidades do domínio Fc através de uma região de dobradiça de imunoglobulina, as duas moléculas Fab, as regiões de dobradiça e o domínio Fc formam essencialmente uma molécula de imunoglobulina. Em um exemplo de realização específico, a molécula de imunoglobulina é uma imunoglobulina da classe IgG. Em um exemplo de realização ainda mais específico, a imunoglobulina é uma imunoglobulina da subclasse IgG1. Em outro exemplo de realização, a imunoglobulina é uma imunoglobulina da subclasse IgG4. Em um exemplo de realização adicional, a imunoglobulina é uma imunoglobulina humana. Em outros exemplos de realização, a imunoglobulina é uma imunoglobulina quimérica ou uma imunoglobulina humanizada. Em um exemplo de realização, a imunoglobulina compreende uma região constante humana, particularmente uma região Fc humana.

[255] Em alguns dos anticorpos biespecíficos da invenção, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab estão fundidas entre si, opcionalmente através de um ligante peptídico. Dependendo da configuração da primeira e da segunda porção de ligação ao antígeno, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab pode estar fundida em sua extremidade C-terminal com a extremidade N-terminal da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab, ou a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab pode estar fundida em sua extremidade C-terminal com a extremidade N-terminal da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab. A fusão das cadeias leves Fab da primeira e da segunda molécula Fab reduz ainda mais o pareamento errôneo de cadeias pesadas e leves Fab sem correspondência, e também reduz o número de plasmídeos necessários para a expressão dos anticorpos biespecíficos da invenção.

[256] As porções de ligação ao antígeno podem ser fundidas com o domínio Fc ou diretamente entre si ou através de um peptídeo ligante, que compreende um ou mais aminoácidos, tipicamente cerca de 2-20 aminoácidos. Os ligantes peptídicos são conhecidos no estado da técnica e estão descritos na presente invenção. Os ligantes peptídicos adequados não imunogênicos incluem, por exemplo, os ligantes peptídicos (G 4S)n, (SG4)n, (G4S)n ou G4(SG4)n. “n” é geralmente um número inteiro de 1 a 10, normalmente de 2 a 4. Em um exemplo de realização, o referido ligante peptídico tem um comprimento de pelo menos 5 aminoácidos, em um exemplo de realização, um comprimento de 5 a 100, em outro exemplo de realização de 10 a 50 aminoácidos. Em um exemplo de realização, o referido ligante peptídico é (GxS)n ou (GxS)nGm com G = glicina, S = serina; e (x = 3, n = 3, 4, 5 ou 6, e m = 0, 1, 2 ou 3) ou (x = 4, n = 2, 3, 4 ou 5 e m = 0, 1, 2 ou 3), em um exemplo de realização x = 4 e n = 2 ou 3, e em um exemplo de realização adicional x = 4, n = 2. Em um exemplo de realização, o ligante peptídico mencionado é (G4S)2. Um peptídeo de ligação particularmente adequado para a fusão das cadeias leve Fab entre a primeira e segunda molécula Fab é o (G4S)2. Um peptídeo de ligação exemplar apropriado para ligar as cadeias pesadas Fab do primeiro e segundo fragmentos Fab compreende a sequência

(D)-(G4S)2 (SEQ ID NOs 110 e 111). Outro ligante adequado compreende a sequência (G4S)4. Além disso, os ligantes podem compreender (uma porção de) uma região de dobradiça de imunoglobulina. Particularmente quando uma molécula Fab está fundida com a porção N-terminal de uma subunidade do domínio Fc, ela pode ser fundida por uma região de dobradiça de imunoglobulina ou uma porção da mesma, com ou sem um peptídeo de ligação adicional.

[257] Em determinados exemplos de realização, o anticorpo biespecífico de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)) e um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(1)- CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VL(1)-CL(1)). Em determinados exemplos de realização, os polipeptídeos estão ligados de forma covalente, por exemplo, por uma ligação dissulfídica.

[258] Em determinados exemplos de realização, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade de domínio Fc (VH(2)-CL(2)-CH2 -CH3(-CH4)), e um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade de domínio Fc (VH(1)-CH1(1)- CH2-CH3(-CH4)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VL(1)-CL(1)). Em determinados exemplos de realização, os polipeptídeos estão ligados de forma covalente, por exemplo, por uma ligação de dissulfeto.

[259] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)). Em outros exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)).

[260] Em alguns destes exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende adicionalmente um polipeptídeo de cadeia leve Fab crossover da segunda molécula Fab, em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL(1)-CL(1)). Em outros destes exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VH(2)-CL(2)-VL(1)-CL(1)) ou um polipeptídeo em que o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2)), conforme apropriado.

[261] O anticorpo biespecífico de acordo com estes exemplos de realização pode compreender ainda; (i) um polipeptídeo da subunidade do domínio Fc (CH2-CH3(-CH4)); ou (ii) um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha um ligação peptídica carboxi- terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) e o polipeptídeo de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VL (3)-CL(3)).

Em determinados exemplos de realização, os polipeptídeos estão ligados de forma covalente, por exemplo, por uma ligação de dissulfeto.

[262] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)). Em outros exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4)).

[263] Em alguns destes exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende adicionalmente um polipeptídeo de cadeia leve Fab crossover da segunda molécula Fab, em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL(1)-CL(1)). Em outros destes exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1)) ou um polipeptídeo em que o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL (1)-CL(1)- VH(2)-CL(2)), conforme apropriado.

[264] O anticorpo biespecífico de acordo com estes exemplos de realização pode compreender ainda; (i) um polipeptídeo da subunidade do domínio Fc (CH2-CH3(-CH4)); ou (ii) um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha um ligação peptídica carboxi- terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) e o polipeptídeo de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VL (3)-CL(3)).

[265] Em determinados exemplos de realização, o anticorpo biespecífico não compreende um domínio Fc. Em particular, em tais exemplos de realização, as referidas primeira e (se presente) terceira molécula(s) Fab é(são), cada uma, uma molécula Fab convencional, e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, isto é, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CL e CH1 das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si. Em outros exemplos de realização, a referida primeira e, se presente, terceira molécula Fab são, cada uma, uma molécula Fab crossover e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab convencional.

[266] Em uma destes exemplos de realização, o anticorpo biespecífico consiste essencialmente na primeira e na segunda porção de ligação ao antígeno, e opcionalmente um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são moléculas Fab e a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno. Essa configuração é esquematicamente representada nas Figuras 11O e 11S (nesses exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional).

[267] Em outro exemplo de realização, o anticorpo biespecífico consiste essencialmente na primeira e na segunda porção de ligação ao antígeno, e opcionalmente um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são moléculas Fab e a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno. Essa configuração é esquematicamente representada nas Figuras 11P e 11T (nesses exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional).

[268] Em alguns exemplos de realização, a primeira molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, e o anticorpo biespecífico compreende ainda uma terceira porção de ligação ao antígeno, particularmente uma terceira molécula Fab em que a referida terceira molécula Fab está fundida no C- terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab. Em determinados exemplos de realização, o anticorpo biespecífico consiste essencialmente na primeira, na segunda e na terceira molécula Fab e, opcionalmente, em um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N- terminal da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab e a terceira molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab. Essa configuração é esquematicamente representada na Figura 11Q e 11U (nesses exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional) e na Figura 11X e 11Z (nestes exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL).

[269] Em alguns exemplos de realização, a segunda molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, e o anticorpo biespecífico compreende ainda uma terceira porção de ligação ao antígeno, particularmente uma terceira molécula Fab em que a referida terceira molécula Fab está fundida no N- terminal da cadeia pesada Fab ao C-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab. Em determinados exemplos de realização, anticorpo biespecífico consiste essencialmente na primeira, na segunda e na terceira molécula Fab e, opcionalmente, em um ou mais ligantes peptídicos, em que a segunda molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-

terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab e a terceira molécula Fab está fundida no N-terminal da cadeia pesada Fab ao C-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab. Essa configuração é esquematicamente representada na Figura 11R e 11V (nesses exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional) e na Figura 11W e 11Y (nestes exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL).

[270] Em determinados exemplos de realização, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve) (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)).

Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VL (1)-CL(1)).

[271] Em determinados exemplos de realização, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada

Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VL(1)-CL(1)).

[272] Em determinados exemplos de realização, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VL(1)-CL(1)).

[273] Em determinados exemplos de realização, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada

[274] Em determinados exemplos de realização, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve) (VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VL(1)-CL(1)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda o polipeptídeo Fab da cadeia leve de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CL(3)).

[275] Em determinados exemplos de realização, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve) (VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VL(1)-CL(1)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda o polipeptídeo Fab da cadeia leve de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CL(3)).

[276] Em determinados exemplos de realização, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (VL (2)-

CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VL(1)-CL(1)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda o polipeptídeo Fab da cadeia leve de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CL(3)).

[277] Em determinados exemplos de realização, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da primeira molécula Fab (VL(1)-CL(1)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda o polipeptídeo Fab da cadeia leve de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CL(3)).

[278] Em determinados exemplos de realização, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (ou seja, a terceira molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve) (VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)- VL(3)-CH1(3)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região constante de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VH(1)-CL(1)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CL(2)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região constante de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VH(3)-CL(3)).

[279] Em determinados exemplos de realização, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (ou seja, a terceira molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve) (VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-VH(3)-CL(3)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL(1)-CH1(1)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CL(2)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CH1(3)).

[280] Em determinados exemplos de realização, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (ou seja, a terceira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VL(3)-CH1(3)-VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2)).

Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VH (1)-CL(1)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL (2)-CL(2)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VH(3)-CL(3)).

[281] Em determinados exemplos de realização, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (ou seja, a terceira molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VH(3)-CL(3)-VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2)).

Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL (1)-CH1(1)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL (2)-CL(2)). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (VL(3)- CH1(3)).

[282] Em um exemplo de realização, a invenção provê um anticorpo biespecífico compreendendo: a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um HLA-G, em que a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo: A) um domínio VH compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e uma HVR- H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e um domínio VL compreendendo uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou B) um domínio VH compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e uma HVR-

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

SEQ ID NO: 11; e um domínio VL compreendendo uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e uma HVR-

L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou

C) um domínio VH compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e uma HVR-

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

SEQ ID NO: 19; e um domínio VL compreendendo uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e uma HVR-

L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou

D) um domínio VH compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e uma HVR-

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

SEQ ID NO: 27; e um domínio VL compreendendo uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, e uma HVR-

L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; e b) uma segunda porção de ligação ao antígeno, que se liga ao CD3 humano;

- em que a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve Fab e cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, compreendendo:

E) um domínio VH compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, e uma HVR-

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

SEQ ID NO: 58; e um domínio VL compreendendo uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, e uma HVR-

L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; e c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que

(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-

terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou

(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-

terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou

- Em um exemplo de realização específico, a invenção provê um anticorpo biespecífico compreendendo:

a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um

HLA-G, em que a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo:

A) um domínio VH compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e uma HVR-

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

SEQ ID NO: 3; e um domínio VL compreendendo uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou

B) um domínio VH compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e uma HVR-

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou

D) um domínio VH compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e uma HVR- H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; e c) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que:

terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou

terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou

- Em outro exemplo de realização, a invenção provê um anticorpo biespecífico compreendendo:

a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um

HLA-G, em que a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo;

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; e b) uma segunda porção de ligação ao antígeno, que se liga ao CD3 humano:

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 58; e um domínio VL compreendendo uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, e uma HVR- L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; e c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que: - a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).

[283] Em todas as diferentes configurações do anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, as substituições de aminoácidos aqui descritas, se presentes, podem estar nos domínios CH1 e CL do primeiro e (se presente) do terceiro grupo de ligação ao antígeno/Molécula Fab, ou nos domínios CH1 e CL da segunda porção de ligação ao antígeno/molécula Fab.

Preferencialmente, eles estão nos domínios CH1 e CL da primeira e (se presente) da terceira porção de ligação ao antígeno/molécula Fab. De acordo com o conceito da invenção, se as substituições de aminoácidos aqui descritas forem feitas na primeira (e, se presente, na terceira) porção de ligação ao antígeno/molécula Fab, nenhuma substituição de aminoácidos será feita na segunda porção de ligação ao antígeno/Molécula Fab. Por outro lado, se as substituições de aminoácidos aqui descritas forem feitas na segunda porção de ligação ao antígeno/molécula Fab, nenhuma substituição de aminoácidos será feita na primeira (e, se presente, na terceira) porção de ligação ao antígeno/molécula Fab. As substituições de aminoácidos são particularmente feitas em anticorpos biespecíficos compreendendo uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH1 da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro.

[284] Em exemplos de realização particulares do anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, particularmente quando as substituições de aminoácidos aqui descritas são feitas na primeira (e, se presente, na terceira) porção de ligação ao antígeno/molécula Fab, o domínio constante CL da primeira (e, se presente, da terceira) molécula Fab é do isotipo kappa. Em outros exemplos de realização do anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, particularmente em que as substituições de aminoácidos aqui descritas são feitas na segunda porção de ligação ao antígeno/molécula Fab, o domínio constante CL da segunda molécula Fab é do isotipo kappa. Em alguns exemplos de realização, o domínio constante CL da primeira (e, se presente, da terceira) porção de ligação ao antígeno/molécula Fab e o domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno/molécula Fab são do isotipo kappa.

[285] Em um exemplo de realização, a invenção provê um anticorpo biespecífico compreendendo: a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um HLA-G, em que a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo: A) um domínio VH compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e uma HVR- H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e um domínio VL compreendendo uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou B) um domínio VH compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e uma HVR- H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 27; e um domínio VL compreendendo uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, e uma HVR-

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; e c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;

- em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K)

(numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat)

(mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de

Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e

- em que:

- Em um exemplo de realização particular, a invenção provê um anticorpo biespecífico compreendendo:

a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

B) um domínio VH compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e uma HVR-

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

em que a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula

Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, compreendendo:

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; e c) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;

- em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 124 é substituído pela lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de

Kabat); e

- em que:

a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

em que a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; e c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade:

- em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e - em que a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).

[286] Em um exemplo de realização, a invenção provê um anticorpo biespecífico compreendendo: a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um HLA-G, em que a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo: A) um domínio VH compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e uma HVR- H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e um domínio VL compreendendo uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou B) um domínio VH compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e uma HVR-

H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da

Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E)

(numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e

- em que:

- Em outro aspecto particular, a invenção provê um anticorpo biespecífico compreendendo:

a) uma primeira e uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno; em que o primeiro antígeno é HLA-G, e em que a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são, cada uma, uma molécula Fab (convencional) compreendendo (i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 32, ou (ii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34;

b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno; em que o segundo antígeno é CD3 e em que a segunda porção de ligação ao antígeno é a molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que: - no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira e da terceira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que, adicionalmente; e - a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (a) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (c).

[287] Em um exemplo de realização de acordo com estes aspectos da invenção, na primeira subunidade do domínio Fc, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de triptofano (T366W), e na segunda subunidade do domínio Fc, o resíduo de tirosina na posição 407 é substituído por um resíduo de valina (Y407V) e, opcionalmente, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de serina (T366S) e o resíduo de leucina na posição 368 é substituído por um resíduo de alanina (L368A) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[288] Em um exemplo de realização adicional de acordo com este aspecto da invenção, na primeira subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína (S354C) ou o resíduo ácido glutâmico na posição 356 é substituído por um resíduo cisteína (E356C) (particularmente o resíduo serina na posição 354 é substituído pelo resíduo de cisteína), e na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído por um resíduo de cisteína (Y349C) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[289] Em um exemplo de realização adicional de acordo com estes aspectos da invenção, em cada uma da primeira e da segunda subunidades do domínio Fc, o resíduo leucina na posição 234 é substituído por um resíduo de alanina (L234A), o resíduo de leucina na posição 235 é substituído por um resíduo de alanina (L235A) e o resíduo de prolina na posição 329 é substituído por um resíduo de glicina (P329G) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[290] Ainda em outro exemplo de realização adicional de acordo com estes aspectos da invenção, o domínio de Fc é um domínio de Fc de IgG1 humana.

[291] Um exemplo de realização específico da invenção é o anticorpo biespecífico que se liga ao HLA-G humano e ao CD3 humano, em que o anticorpo compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 64, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 65, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 66 e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 67.

[292] Em um exemplo de realização específico adicional, o anticorpo biespecifico compreende um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 e um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

67.

[293] Um exemplo de realização específico da invenção é o anticorpo biespecífico que se liga ao HLA-G humano e ao CD3 humano, em que o anticorpo compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 68, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 69, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 70 e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 71.

[294] Em um exemplo de realização específico adicional, o anticorpo biespecifico compreende um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 e um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

71.

[295] Um exemplo de realização específico da invenção é o anticorpo biespecífico que se liga ao HLA-G humano e ao CD3 humano, em que o anticorpo compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 72, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 73, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 74 e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 75.

[296] Em um exemplo de realização específico adicional, o anticorpo biespecifico compreende um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 e um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

75.

DOMÍNIO FC

[297] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo biespecífico da invenção compreende ainda um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade. Entende-se que as características do domínio Fc descritas na presente invenção em relação ao anticorpo biespecífico podem se aplicar igualmente a um domínio Fc compreendido em um anticorpo da invenção.

[298] O domínio Fc de um anticorpo biespecífico consiste em um par de cadeias polipeptídicas compreendendo domínios de cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina. Por exemplo, o domínio de Fc de uma molécula de imunoglobulina G (IgG) é um dímero, e cada subunidade compreende domínios constantes de cadeia pesada de IgG - CH2 e CH3. As duas subunidades do domínio de Fc são capazes de realizar associação estável entre si. Em um exemplo de realização, o anticorpo biespecífico da invenção compreende não mais do que um domínio Fc.

[299] Em um exemplo de realização, o domínio Fc do anticorpo biespecífico é um domínio Fc de IgG. Em um exemplo de realização particular, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1. Em outro exemplo de realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4. Em um exemplo de realização mais específico, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG 4 que compreende uma substituição de aminoácido na posição S228 (numeração do índice EU de Kabat), particularmente a substituição de aminoácido S228P. Esta substituição de aminoácidos reduz in vivo a troca braço Fab de anticorpos IgG4 (vide Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). Em um exemplo de realização particular adicional, o domínio Fc é um domínio Fc humano. Em um exemplo de realização ainda mais específico, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1 humana.

MODIFICAÇÕES DO DOMÍNIO FC PARA PROMOÇÃO DA HETERODIMERIZAÇÃO

[300] Os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção compreendem diferentes porções de ligação ao antígeno, que podem estar fundidas a uma ou outra das duas subunidades do domínio Fc, assim, as duas subunidades do domínio Fc são tipicamente compostas por duas cadeias polipeptídicas não idênticas. A coexpressão recombinante desses polipeptídeos e a subsequente dimerização conduzem a várias combinações possíveis dos dois polipeptídeos. Para melhorar o rendimento e a pureza de tais anticorpos biespecíficos na produção recombinante, será vantajoso introduzir no domínio Fc do anticorpo biespecífico uma modificação que promova a associação dos polipeptídeos desejados.

[301] Consequentemente, em exemplos de realização específicos, o domínio Fc dos anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção compreende uma modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc. O sítio de interação proteína-proteína mais amplo entre as duas subunidades de um domínio Fc da IgG humana está no domínio CH3 do domínio Fc. Assim, em um exemplo de realização, a referida modificação é no domínio CH3 do domínio Fc.

[302] Existem diversas abordagens para modificações no domínio CH3 do domínio Fc com o intuito a impor a heterodimerização, que são bem descritas, por exemplo, nas publicações WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129,304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Tipicamente, em todas essas abordagens, o domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e o domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc são ambos modificados de uma maneira complementar, de modo que cada domínio CH3 (ou a cadeia pesada compreendendo tal domínio) não mais se homodimeriza consigo, mas é forçado a se heterodimerizar com o outro domínio CH3 complementarmente modificado (de modo que o primeiro e o segundo domínio CH3 se heterodimerizam e não são formados homodímeros entre os dois primeiros ou os dois segundos domínios CH3). Estas diferentes abordagens para melhorar a heterodimerização da cadeia pesada são contempladas como alternativas diferentes em combinação com as modificações da cadeia pesadas - leve (por exemplo, troca/substituição VH e VL em um braço de ligação e introdução de substituições de aminoácidos carregados com cargas opostas na interface CH1/CL) no anticorpo biespecífico, que reduzem o pareamento incorreto da cadeia leve/pesada e os subprodutos tipo Bence-Jones.

[303] Em um exemplo de realização específico, a referida modificação que promove a associação da primeira e segunda subunidades do domínio Fc é uma modificação do tipo “Knob-into-hole”, compreendendo uma modificação “Knob” (protuberância) em uma das duas subunidades do domínio Fc e uma modificação “hole” (cavidade) na outra subunidade do domínio Fc.

[304] A tecnologia knob-into-hole está descrita, por exemplo, nas Patentes US 5.731.168; US 7.695.936; e em Ridgway et al, Prot Eng. 9, 617- 621 (1996) e Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). De modo geral, o método envolve a introdução de uma protuberância (“knob”) na interface de um primeiro polipeptídeo e uma cavidade/orifício (“hole“) correspondente na interface de um segundo polipeptídeo, de tal modo que a protuberância pode ser posicionada na cavidade a fim de promover a formação de heterodímero e impedir a formação de homodímero. As protuberâncias são construídas pela substituição de aminoácidos com cadeias laterais pequenas na interface do primeiro polipeptídeo por aminoácidos com cadeias laterais maiores (por exemplo, a tirosina ou triptofano). As “cavidades” (hole) compensatórias de tamanho idêntico ou similar ao das protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo pela substituição de aminoácidos com cadeias laterais grandes por aminoácidos com cadeias laterais menores (por exemplo, alanina ou treonina).

[305] Consequentemente, em um exemplo de realização específico, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc do anticorpo biespecífico um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem um volume de cadeia lateral maior, gerando, assim, uma protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável dentro de uma cavidade no interior do domínio CH3 da segunda subunidade, e um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo aminoácido que tem um menor volume de cadeia lateral, gerando assim uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade, dentro da qual a protuberância do domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável.

[306] Preferencialmente o dito resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral de volume maior é selecionado a partir do grupo que consiste de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W).

[307] Preferencialmente o dito resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral de volume menor é selecionado a partir do grupo que consiste de alanina (A), serina (S), treonina (T) e valina (V).

[308] A protuberância e a cavidade podem ser feitas através da alteração de ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por mutagênese sítio-específica, ou por síntese peptídica.

[309] Em um exemplo de realização específico, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc (a subunidade “knob”), o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de triptofano (T366W), e no (domínio CH3) da segunda subunidade do domínio Fc (a subunidade “hole”), o resíduo tirosina na posição 407 é substituído por um resíduo de valina (Y407V). Em um exemplo de realização, na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo treonina na posição 366 é substituído por um resíduo serina (T366S) e o resíduo leucina na posição 368 é substituído por um resíduo de alanina (L368A) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[310] Em um exemplo de realização adicional, na primeira subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína (S354C) ou o resíduo ácido glutâmico na posição 356 é substituído por um resíduo cisteína (E356C) (particularmente o resíduo serina na posição 356 é substituído pelo resíduo de cisteína), e na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído por um resíduo de cisteína (Y349C) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). A introdução destes dois resíduos de cisteína resulta na formação de uma ligação de dissulfeto entre as duas subunidades do domínio Fc, estabilizando adicionalmente o dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

[311] Em um exemplo de realização específico, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W, e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S, L368A e Y407V (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[312] Em um exemplo de realização específico, a porção de ligação ao antígeno que se liga ao segundo antígeno (por exemplo, um antígeno de ativação de célula T) é fundida (opcionalmente através da primeira porção de ligação ao antígeno, que se liga ao HLA-G e/ou a um ligante peptídico) à primeira subunidade do domínio Fc (que compreende a modificação “knob”). Sem pretender ser limitar a teoria, a fusão da porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno, tal como um antígeno de ativação de célula T, na subunidade contendo a modificação knob do domínio Fc irá minimizar (ainda mais) a geração de anticorpos compreendendo duas porções de ligação ao antígeno capazes de ligar a um antígeno de ativação de célula T (choque estérico de dois polipeptídeos contendo a modificação knob).

[313] São contempladas outras técnicas como alternativas para a modificação de CH3 a fim de realizar a heterodimerização de acordo com a presente invenção que estão descritas, por exemplo, nas publicações WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.

[314] Em um exemplo de realização, a abordagem para a heterodimerização descrita no documento EP 1870459 é alternativamente utilizada. Esta abordagem se baseia na introdução de aminoácidos carregados com cargas opostas em posições específicas de aminoácidos na interface do domínio CH3/CH3 entre as duas subunidades do domínio Fc. Um exemplo de realização preferido para o anticorpo biespecífico da invenção são as mutações de aminoácidos R409D; K370E em um dos dois domínios CH3 (do domínio Fc) e as mutações de aminoácidos D399K; E357K no outro domínio CH3 do domínio Fc (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[315] Em outro exemplo de realização, o anticorpo biespecífico da invenção compreende a mutação de aminoácidos T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e as mutações de aminoácidos T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc e adicionalmente mutações de aminoácidos R409D; K370E no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e mutações de aminoácidos D399K; E357K no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[316] Em outro exemplo de realização, o anticorpo biespecífico da invenção compreende as mutações de aminoácidos S354C, T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e as mutações de aminoácidos Y349C, T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, ou o referido anticorpo biespecífico compreende mutações de aminoácidos Y349C, T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e mutações de aminoácidos S354C, T366S, L368A,

Y407V nos domínios CH3 da segunda subunidade do domínio Fc e adicionalmente mutações de aminoácidos R409D; K370E no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e mutações de aminoácidos D399K; E357K no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc (todas as numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[317] Em um exemplo de realização, a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2013/157953 é alternativamente utilizada.

Em um exemplo de realização um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos T366K e o segundo domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos L351D (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em outro exemplo de realização o primeiro domínio CH3 compreende ainda a mutação de aminoácido L351K. Em um exemplo de realização adicional o segundo domínio CH3 compreende adicionalmente uma mutação de aminoácido selecionada a partir de Y349E, Y349D e L368E (preferencialmente L368E) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[318] Em um exemplo de realização, a abordagem de heterodimerização descrita no WO 2012/058768 é alternativamente utilizada.

Em um exemplo de realização, um primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido L351Y, Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido T366A, K409F. Em outro exemplo de realização, o segundo domínio CH3 compreende adicionalmente uma mutação de aminoácidos na posição T411, D399, S400, F405, N390 ou K392, por exemplo, selecionada a partir de a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E ou T411W, b) D399R, D399W, D399Y ou D399K, c) S400E, S400D, S400R, ou S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V ou F405W, e) N390R, N390K ou N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F ou K392E (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização adicional, um primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido L351Y, Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido T366V, K409F. Em um exemplo de realização adicional, um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácido Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido T366A, K409F. Em um exemplo de realização adicional, o segundo domínio CH3 compreende adicionalmente as mutações de aminoácido K392E, T411E, D399R e S400R (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[319] Em um exemplo de realização, a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2011/143545 é alternativamente utilizada, por exemplo, com a modificação de aminoácido em uma posição selecionada a partir das posições 368 e 409 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[320] Em um exemplo de realização, a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2011/090762, que também usa a tecnologia knobs-into-holes descrita acima é alternativamente utilizada. Em um exemplo de realização, um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácido T366W e o segundo domínio CH3 compreende a mutação de aminoácido Y407A. Em um exemplo de realização um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos T366Y e o segundo domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos Y407T (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[321] Em um exemplo de realização, o anticorpo biespecífico ou seu domínio Fc é da subclasse IgG2 e a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2010/129304 é alternativamente utilizada.

[322] Em um exemplo de realização alternativo, uma associação que promove a modificação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc compreende uma modificação que medeia efeitos de direcionamento eletrostático, por exemplo, conforme descrito na publicação PCT WO

2009/089004. Em geral, este método envolve a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na interface das duas subunidades do domínio Fc por resíduos de aminoácidos carregados de modo que a formação de homodímeros se torna eletrostaticamente desfavorável, mas a heterodimerização eletrostaticamente favorável. Em tal exemplo de realização um primeiro domínio CH3 compreende a substituição do aminoácido K392 ou N392 por um aminoácido de carga negativa (por exemplo, ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), de preferência K392D ou N392D) e um segundo domínio CH3 compreende uma substituição de aminoácido D399, E356, D356, ou E357 por um aminoácido de carga positiva (por exemplo, lisina (K) ou arginina (R), de preferência, D399K, E356K, D356K, ou E357K e mais preferencialmente D399K e E356K). Em outro exemplo de realização o primeiro domínio CH3 compreende ainda a substituição do aminoácido K409 ou R409 por um aminoácido negativamente carregado (por exemplo, ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), de preferência K409D ou R409D). Em outro exemplo de realização, o primeiro domínio CH3 compreende adicionalmente ou alternativamente a substituição do aminoácido K439 e/ou K370 por um aminoácido de carga negativa (por exemplo, ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D)) (todas as numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[323] Em um exemplo de realização adicional, a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2007/147901 é alternativamente utilizada.

Em um exemplo de realização um primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido K253E, D282K, e K322D e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido D239K, E240K, e K292D (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[324] Em outro exemplo de realização, a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2007/110205 pode ser alternativamente utilizada.

[325] Em um exemplo de realização, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos K392D e K409D, e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos D356K e D399K (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

MODIFICAÇÕES DO DOMÍNIO FC QUE REDUZEM A LIGAÇÃO AO RECEPTOR FC E/OU A FUNÇÃO EFETORA

[326] O domínio Fc confere propriedades farmacocinéticas favoráveis ao anticorpo da presente invenção, incluindo uma meia-vida sérica longa que contribui para um bom acúmulo no tecido alvo e uma relação de distribuição tecido/sangue favorável. Ao mesmo tempo, ele pode, no entanto, levar ao direcionamento indesejável do anticorpo biespecífico (ou o anticorpo) nas células que expressam receptores Fc ao invés de direcionar para as células contendo antígenos preferenciais. Além disso, a coativação das vias de sinalização do receptor Fc pode levar à liberação de citocinas que, em combinação com as propriedades de ativação das células T (por exemplo, nos exemplos de realização do anticorpo biespecífico, em que a segunda porção de ligação ao antígeno se liga a um antígeno de ativação de célula T) e a meia- vida prolongada da molécula de ligação ao antígeno biespecífica, resulta em ativação excessiva de receptores de citocinas e efeitos colaterais graves na administração sistêmica. A ativação de células imunes (portadoras de receptor Fc) que não são células T pode até reduzir a eficácia do anticorpo biespecífico (particularmente um anticorpo biespecífico em que a segunda porção de ligação ao antígeno liga-se a um antígeno de ativação de célula T) devido à destruição potencial de células T, por exemplo, células NK.

[327] Consequentemente, em exemplos de realização específicos, o domínio Fc do anticorpo biespecífico de acordo com a invenção exibe afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou uma função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc de IgG1 nativo. Em tal exemplo de realização, o domínio Fc (ou o anticorpo biespecífico compreendendo o referido domínio Fc) exibe menos do que 50%, de preferência menos do que 20%, mais preferivelmente menos do que 10% e mais preferivelmente ainda menos do que 5% da afinidade de ligação para um receptor Fc, quando comparado com um domínio Fc de IgG 1 nativa (ou um anticorpo biespecífico compreendendo um domínio Fc de IgG1 nativa), e/ou menos do que 50%, de preferência menos do que 20%, mais preferencialmente menos do que 10% e mais preferivelmente menos do que 5% da função efetora, quando comparado com um domínio Fc de IgG 1 nativa (ou um anticorpo biespecífico compreendendo um domínio Fc de IgG 1 nativa). Em um exemplo de realização, o domínio Fc (ou o anticorpo biespecífico compreendendo o referido domínio Fc) não se liga substancialmente a um receptor de Fc e/ou induz função efetora. Em um exemplo de realização específico, o receptor Fc é um receptor Fcγ. Em um exemplo de realização, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em um exemplo de realização, o receptor Fc é um receptor Fc de ativação. Em um exemplo de realização específico, o receptor Fc é um receptor Fcγ humano de ativação, mais especificamente FcγRIIIa, FcyRI ou FcγRIIa humanos, mais especificamente FcγRIIIa humano. Em um exemplo de realização, a função efetora é uma ou mais selecionada dentre o grupo de CDC, ADCC, ADCP, e secreção de citocina. Em um exemplo de realização particular, a função efetora é a ADCC.

Em um exemplo de realização, o domínio Fc exibe uma afinidade de ligação substancialmente semelhante ao receptor Fc neonatal (FcRn), em comparação com um domínio Fc da IgG1 nativa. Uma ligação substancialmente semelhante ao FcRn é alcançada quando o domínio Fc (ou o anticorpo biespecífico compreendendo o referido domínio Fc) exibe mais do que cerca de 70%, particularmente mais do que cerca de 80%, particularmente mais do que cerca de 90% da afinidade de ligação de um domínio Fc da IgG 1 nativa (ou o anticorpo biespecífico compreendendo o referido domínio Fc de IgG1 nativa) para o FcRn.

[328] Em determinados exemplos de realização, o domínio Fc é projetado para ter uma afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio de Fc não modificado. Em exemplos de realização específicos, o domínio Fc do anticorpo biespecífico da presente invenção compreende uma ou mais mutações de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor de Fc e/ou a função efetora. Normalmente, a mesma uma ou mais mutações de aminoácidos está presente em cada uma das duas subunidades do domínio Fc. Em um exemplo de realização, a mutação de aminoácidos reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor de Fc. Em um exemplo de realização, a mutação de aminoácidos reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc em pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes. Em exemplos de realização em que há mais do que uma mutação de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação do domínio de Fc ao receptor Fc, a combinação destas mutações de aminoácidos pode reduzir a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc em pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 50 vezes. Em um exemplo de realização, o anticorpo biespecífico compreendendo um domínio Fc modificado exibe menos do que 20%, particularmente menos do que 10%, e mais particularmente menos do que 5% da afinidade de ligação para um receptor Fc quando comparado a um anticorpo biespecífico compreendendo um domínio Fc não modificado. Em um exemplo de realização específico, o receptor Fc é um receptor Fcγ. Em alguns exemplos de realização, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em alguns exemplos de realização, o receptor Fc é um receptor Fc de ativação. Em um exemplo de realização específico, o receptor

Fc é um receptor Fcγ humano de ativação, mais especificamente FcγRIIIa, FcyRI ou FcγRIIa humanos, mais especificamente FcγRIIIa humano.

Preferencialmente, a ligação a cada um destes receptores é reduzida. Em alguns exemplos de realização, a afinidade de ligação a um componente do complemento, especificamente a afinidade de ligação ao C1q, também está reduzida. Em um exemplo de realização, a afinidade de ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) não está reduzida. Uma ligação substancialmente similar ao FcRn, ou seja, a preservação da afinidade de ligação do domínio Fc para o referido receptor, é obtida quando o domínio Fc (ou o anticorpo biespecífico compreendendo o referido domínio Fc) exibe mais do que cerca de 70% da afinidade de ligação de uma forma não modificada do domínio Fc (ou o anticorpo biespecífico compreendendo a referida forma não modificada do domínio Fc) para o FcRn. O domínio Fc, ou anticorpos biespecíficos da invenção, compreendendo o referido domínio de ligação ao Fc, pode(m) apresentar mais do que cerca de 80%, ou mesmo mais do que cerca de 90% de tal afinidade. Em determinados exemplos de realização, o domínio Fc do anticorpo biespecífico é modificado para ter uma redução na função efetora em comparação com um domínio Fc não modificado. A função efetora reduzida pode incluir, mas não está limitada a, uma ou mais das seguintes: redução da citotoxicidade dependente de complemento (CDC), redução da citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), redução da fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP), redução da secreção de citocinas, redução da captação de antígeno mediada por complexo imune pelas células apresentadoras de antígeno, redução da ligação de células NK, redução da ligação aos macrófagos, redução da ligação aos monócitos, redução da ligação as células polimorfonucleares, redução do sinal de indução de apoptose direta, redução da reticulação aos anticorpos ligados ao alvo, redução da maturação de células dendríticas, ou redução do priming de células T. Em um exemplo de realização, a função efetora reduzida é uma ou mais selecionada de entre o grupo de redução da CDC, redução da ADCC, redução da ADCP, e redução da secreção de citocinas. Em um exemplo de realização específico, a função efetora reduzida é a ADCC. Em um exemplo de realização, a ADCC reduzida é inferior a 20% da ADCC induzida por um domínio Fc não modificado (ou um anticorpo biespecífico compreendendo um domínio Fc não modificado).

[329] Em um exemplo de realização, a mutação de aminoácidos, que reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc e/ou a função efetora é uma substituição de aminoácidos. Em um exemplo de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de um aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo de E233, L234, L235, N297, P331 e P329 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização mais específico, o domínio Fc compreende uma substituição de um aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo de L234, L235 e P329 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em alguns exemplos de realização, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A e L235A (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em tal exemplo de realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1, particularmente um domínio Fc de IgG1 humana. Em um exemplo de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição P329. Em um exemplo de realização mais específico, a substituição de aminoácido é a P329A ou P329G, particularmente a P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição P329 e adicionalmente uma substituição de aminoácidos na posição selecionada dentre E233, L234, L235, N297 e P331 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização mais específico, a outra substituição de aminoácidos é a E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ou P331S. Em exemplos de realização específicos, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos nas posições P329, L234 e L235 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em exemplos de realização específicos, o domínio Fc compreende as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (“P329G LALA”, “PGLALA” ou “LALAPG”). Especificamente, em exemplos de realização específicos, cada subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numeração pelo índice EU de Kabat), ou seja, em cada uma da primeira e segunda subunidades do domínio Fc, o resíduo de leucina na posição 234 é substituído por um resíduo de alanina (L234A), o resíduo de leucina na posição 235 é substituído por um resíduo de alanina (L235A) e o resíduo de prolina na posição 329 é substituído por um resíduo de glicina (P329G) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[330] Em tal exemplo de realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1, particularmente um domínio Fc de IgG1 humana. A combinação “P329G LALA” de substituições de aminoácidos elimina quase completamente a ligação ao receptor Fcγ (bem como ao complemento) de um domínio Fc de IgG1 humana, tal como descrito na publicação PCT WO 2012/130831, que é integralmente incorporada ao presente pela referência. A publicação WO 2012/130831 também descreve métodos de preparação de tais domínios Fc mutantes e métodos para a determinação de suas propriedades, tal como funções de ligação aos receptores Fc ou funções efetoras.

[331] Anticorpos IgG4 exibem afinidade de ligação aos receptores Fc reduzida e funções efetoras reduzidas, em comparação com os anticorpos IgG1. Assim, em alguns exemplos de realização o domínio Fc dos anticorpos biespecíficos da invenção é um domínio Fc de IgG 4, particularmente um domínio Fc de IgG4 humana. Em um exemplo de realização, o domínio Fc de IgG4 compreende as substituições de aminoácidos na posição S228, especialmente a substituição de aminoácido S228P (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Para reduzir ainda mais a sua afinidade de ligação a um receptor Fc e/ou a sua função efetora, em um exemplo de realização o domínio Fc da IgG4 compreende uma substituição de aminoácido na posição L235, especificamente a substituição de aminoácido L235E (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em outro exemplo de realização, o domínio Fc da IgG4 compreende uma substituição de aminoácido na posição P329, especificamente a substituição de aminoácido P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização particular, o domínio Fc da IgG4 compreende as substituições de aminoácidos nas posições S228, L235 e P329, especificamente as substituições de aminoácidos S228P, L235E e P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Tal domínio Fc de IgG4 mutante e suas propriedades de ligação aos receptores Fcγ encontram-se descritos na publicação de Patente PCT WO 2012/130831, integralmente incorporada ao presente pela referência.

[332] Em um exemplo de realização particular, o domínio Fc que exibe afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc de IgG1 nativa, é um domínio Fc de IgG1 humana compreendendo as substituições de aminoácidos L234A, L235A e opcionalmente P329G, ou um domínio Fc de IgG 4 humana compreendendo as substituições de aminoácidos S228P, L235E e opcionalmente P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[333] Em determinados exemplos de realização, a N-glicosilação do domínio Fc foi eliminada. Em tal exemplo de realização, o domínio Fc compreende uma mutação de aminoácidos na posição N297, particularmente uma substituição de aminoácido que substitui a asparagina por alanina (N297A) ou por ácido aspártico (N297D) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[334] Além dos domínios Fc descritos acima e na Publicação

PCT WO 2012/130831, os domínios Fc com ligação reduzida para o receptor Fc e/ou com função efetora reduzida incluem também aqueles com substituição de um ou mais resíduos do domínio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente US 6.737.056) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

Tais Fc mutantes incluem Fc mutantes com substituições em duas ou mais das seguintes posições de aminoácidos: 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o Fc mutante então denominado de “DANA” com substituições dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente US 7.332.581).

[335] Os domínios Fc mutantes podem ser preparados por deleção, substituição, inserção ou modificação de aminoácidos usando métodos genéticos ou químicos bem conhecidos no estado da técnica. Os métodos genéticos podem incluir a mutagênese sítio-especifica da sequência de DNA codificante, PCR, síntese gênica, e similares. As alterações de nucleotídeos corretas podem ser verificadas, por exemplo, por sequenciamento.

[336] A ligação aos receptores Fc pode ser facilmente determinada, por exemplo, por ELISA, ou por ressonância plasmônica de superfície (SPR), utilizando instrumentos convencionais, tais como um instrumento BIAcore (GE Healthcare), e os receptores Fc podem ser obtidos por expressão recombinante. Alternativamente, a afinidade de ligação dos domínios Fc ou dos anticorpos biespecíficos compreendendo um domínio Fc aos receptores Fc pode ser avaliada utilizando linhagens de células que expressam receptores Fc específicos, tais como as células NK humanas que expressam o receptor FcγIIIa.

[337] A função efetora de um domínio Fc ou de um anticorpo biespecífico compreendendo um domínio Fc, pode ser mensurada por métodos conhecidos no estado da técnica. Exemplos de ensaios in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse encontram-se descritos na

Patente US 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) e Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); Patente US 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987).

Alternativamente, podem ser utilizados métodos de ensaios não radioativos (vide, por exemplo, o ensaio de citotoxicidade não radioativo ACTI ® para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA), e o ensaio de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (Natural Killer ou NK).

Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como divulgado em Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).

[338] Em alguns exemplos de realização, a ligação do domínio Fc a um componente do sistema complemento, especificamente a ligação ao C1q, é reduzida. Assim, em alguns exemplos de realização, quando o domínio Fc é projetado para ter função efetora reduzida, a referida função efetora reduzida inclui redução da CDC. Ensaios de ligação de C1q podem ser realizados para determinar se o domínio Fc, ou anticorpo biespecífico compreendendo o domínio Fc, é capaz de se ligar ao C1q e, portanto, ter atividade CDC. Vide, por exemplo, ELISA de ligação ao C1q e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio CDC pode ser executado (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro et al, J Immunol Methods 202, 163 (1996), Cragg et al, Blood 101, 1045-1052 (2003); e Cragg e Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

[339] A determinação da ligação de FcRn e a depuração/meia vida in vivo também pode ser realizada utilizando métodos conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol.

18(12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929).

[340] Em outro aspecto, um anticorpo anti-HLA-G de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima pode incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, conforme descrito nas seções 1-6 abaixo.

1. AFINIDADE DE ANTICORPO

[341] Em determinados exemplos de realização, um anticorpo fornecido na presente invenção tem uma constante de dissociação KD ≤ 1 μM, ≤ 100nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ou ≤ 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 a 10-13, por exemplo 10-9 a 10-13 M).

[342] Em um exemplo de realização preferido, o valor KD é mensurado utilizando ensaios de ressonância plasmônica de superfície utilizando um instrumento BIACORE® a 25ºC, com antígeno imobilizado em chips CM5 a ~ 10 unidades de resposta (RU). Resumidamente, chips biossensores de dextrano carboximetilados (CM5, BIAcore Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) e N- hidroxisucinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, a 5 μg/ml (~ 0,2 μM) antes de ser injetado a uma velocidade de fluxo de 5 μL/minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção do antígeno, etanolamina 1 M é adicionada para bloquear grupos que não reagiram. Para a mediação cinética, diluições seriadas em duplicatas de Fab (0,78 nM e 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% de tensoativo polissorbato-20 (Tween-20®) (PBST) a 25 °C em uma taxa de fluxo de cerca de 25 μL/min. A velocidade de associação (Kon ou ka) e a velocidade de dissociação (koff ou Kd) são calculadas utilizando um modelo de ligação simples um-para-um de Langmuir (BIAcore Evaluation Software version 3.2) pelo ajuste simultâneo de sensorgramas de associação e dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação KD é calculada como a relação Kd/Ka (koff/kon). Vide,

por exemplo, Chen, Y., et al., J. Mol Biol 293 (1999) 865-881. Se a medida for superior a 106 M-1 S-1 pelo ensaio de ressonância plasmônica descrito acima, então a taxa pode ser determinada por uma técnica de inibição (quenching) de fluorescência que mede o aumento ou a diminuição das emissões de intensidade de fluorescência (excitação= 295 nm; Emissão = 340 nm, banda de passagem=16 nm) a 25 ºC de 20 nM de um anticorpo anti-antígeno (na forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes do antígeno mensurado em espectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com válvula do tipo stop-flow (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic), com agitador de cuveta.

2. FRAGMENTOS DE ANTICORPOS

[343] Em determinados exemplos de realização, um anticorpo fornecido na presente invenção é um fragmento de anticorpo. Os fragmentos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a, fragmentos Fab, Fab’, Fab’- SH, F(ab’)2, Fv, scFv, e outros fragmentos descritos abaixo. Para uma revisão de determinados fragmentos de anticorpos, vide Hudson, P. J. et al. Nat. Med.

9:129-134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv vide, por exemplo, Pluckthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg & Moore (Eds), Springer-Verlag, Nova Iorque, (1994) págs. 269- 315; vide também a publicação WO 93/16185; e as Patentes US 5.571.894 e US 5.587.458. Para uma discussão sobre os fragmentos Fab e F(ab’)2 compreendendo os resíduos do epítopo de ligação aos receptores de recuperação (salvage) e possuindo uma meia-vida in vivo aumentada, vide a Patente US 5.869.046.

[344] Os diacorpos (diabodies) são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos.

Vide, por exemplo, a EP 404.097; o documento WO 1993/01161; Hudson, P. J.

et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; e Hollinger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 90 (1993) 6444-6448. Os triacorpos (triabodies) e tetracorpos (tetrabodies) também estão descritos em Hudson, P. J. et al. Nat. Med. 9 (2003) 129-134.

[345] Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia pesada ou a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em determinadas realizações, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA, vide, por exemplo, Patente US 6.248.516 B1).

[346] Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por diversas técnicas, incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto bem como a produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, Escherichia coli ou fagos), conforme descrito na presente invenção.

3. ANTICORPOS QUIMÉRICOS E HUMANIZADOS

[347] Em certas realizações, um anticorpo fornecido na presente invenção é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na Patente US 4.816.567; e em Morrison, S.L. et al,.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984) 6851-6855). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho, ou primata não humano, tal como um macaco) e uma região constante humana. Em um exemplo adicional, um anticorpo quimérico é um anticorpo de “classe alterada” no qual a classe ou subclasse foi alterada em relação ao do anticorpo parental. Os anticorpos quiméricos incluem os fragmentos de ligação ao antígeno destes.

[348] Em determinados exemplos de realização, o anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade aos seres humanos, enquanto retém a especificidade e afinidade do anticorpo parental não humano. De modo geral, um anticorpo humanizado inclui um ou mais domínios variáveis nos quais as HVRs, por exemplo, CDRs, (ou porções das mesmas) são derivadas de um anticorpo não humano, e as FRS (ou porções das mesmas) são derivadas de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado também irá compreender, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em alguns exemplos de realização, alguns resíduos FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, anticorpo a partir do qual os resíduos da HVR são derivados), por exemplo, para restabelecer ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.

[349] Os anticorpos humanizados e métodos para produzi-los são revistos, por exemplo, em Almagro, J.C. e Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, são adicionalmente descritos, por exemplo, em Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 86 (1989) 10029-10033; Patentes US 5.821.337, US 7,527.791, US

6.982.321, e US 7.087.409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (descrevendo o enxerto de SDR (a-CDR)).; Padlan, E.A., Mol. Immunol.

28:489-498 (1991) (descrevendo o “resurfacing”); Dall'Acqua, W.F., et al, Métodos 36:43-60 (2005) (descrevendo o “shuffling de FR”); e Osbourn, J. et al, Methods 36:61-68 (2005) e Klimka, A., et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que descrevem a abordagem de “seleção guiada” para o shuffling de FR).

[350] As regiões estruturais (ou regiões de arcabouço - Framework) humanas que podem ser utilizadas para a humanização incluem, mas não estão limitadas a: regiões estruturais selecionadas usando o método de “melhor ajuste” (best-fit) (vide, por exemplo, Sims, M. J., et al. J. Immunol

151 (1993) 2296-2308); regiões estruturais derivadas da sequência de consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (vide, por exemplo, Carter, P., et al. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 4285-4289; e Presta, L. G., et al. J. Immunol, 151 (1993) 2623-2632); regiões estruturais maduras humanas (somaticamente mutadas) ou regiões estruturais humanas da linhagem germinativa (vide, por exemplo, Almagro J.C., et al., Front. Biosci. 13 (2008)1619-1633), e regiões estruturais derivadas a partir da triagem de bibliotecas de FR (vide, por exemplo, Baca, M., et al, J. Biol..Chem. 272 (1997) 10678-10684 e Rosok, M.J., et al., J. Biol.Chem. 271 (1996) 22611-22618).

4. ANTICORPOS HUMANOS

[351] Em determinados exemplos de realização, um anticorpo fornecido na presente invenção é um anticorpo humano. Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas no estado da técnica. Os anticorpos humanos estão descritos de modo geral em van Dijk, M.A. e van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-74 e Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459.

[352] Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração de um imunógeno a um animal transgênico, que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico. Tais animais contêm tipicamente a totalidade ou uma porção dos loci de imunoglobulinas humanas, que substituem os loci de imunoglobulinas endógenas, ou que estão presentes extracromossomicamente ou integrados aleatoriamente nos cromossomos do animal. Em tais camundongos transgênicos, os loci de imunoglobulinas endógenas geralmente foram inativados. Para uma revisão dos métodos para a obtenção de anticorpos humanos a partir de animais transgênicos, vide Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125. Vide também, por exemplo, as

Patentes US 6.075.181 e US 6.150.584 que descrevem a tecnologia XENOMOUSE®; a Patente US 5.770.429 que descreve a tecnologia HUMAB®; a Patente US 7.041.870 que descreve a tecnologia K-M MOUSE®, e o Pedido de Patente US 2007/0061900, que descreve a tecnologia VELOCIMOUSE®). As regiões variáveis humanas a partir de anticorpos intactos gerados por esses animais podem ser ainda modificadas, por exemplo, por combinação com uma região constante humana diferente.

[353] Os anticorpos humanos podem ser preparados por métodos baseados em hibridoma. Linhagens de células de mieloma humano e heteromieloma humano-camundongo para a produção de anticorpos monoclonais humanos também foram descritas. (vide, por exemplo, Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque (1987), págs. 51-63; e Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Os anticorpos humanos gerados pela tecnologia de hibridoma de células B humanas são também descritos em Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 (2006) 3557-3562. Métodos adicionais incluem os descritos, por exemplo, na Patente US 7.189.826 (que descreve a produção de anticorpos IgM monoclonais humanos a partir de linhagem de células de hibridoma) e Ni,J., Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que descreve hibridomas humano- humano). A tecnologia de hibridoma humano (tecnologia de Trioma) também é descrita em Vollmers H.P., e, Brandlein, S., Histology and Histopathology, 20 (3) (2005) 927-937 e Vollmers H.P., e Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3) (2005) 185-91.

[354] Os anticorpos humanos também podem ser gerados pelo isolamento de sequências de domínio variável de clones Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição em fagos derivadas de humanos. Tais sequências de domínio variável podem ser combinadas com um domínio constante humano desejado. As técnicas de seleção de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpos estão descritas abaixo.

5. ANTICORPOS DERIVADOS DE BIBLIOTECA

[355] Os anticorpos da presente invenção podem ser isolados pela triagem de bibliotecas combinatórias para selecionar anticorpos com a atividade ou atividades desejada(s). Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida no estado arte para a produção de bibliotecas de exibição por fago e a seleção tais bibliotecas para anticorpos que possuam as características de ligação desejadas. Tais métodos são revistos, por exemplo, em Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37 e adicionalmente descritos em McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581- 597; Marks, J.D. e Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161- 175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol.

Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; e Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-

132.

[356] Em determinados métodos de exibição em fagos, os repertórios de genes VH e VL são separadamente clonados por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados de forma aleatória em bibliotecas de fagos, que podem ser triados em busca de clones que se ligam ao antígeno, conforme descrito em Winter, G., et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455. O fago normalmente exibe fragmentos de anticorpo, como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou como fragmentos Fab. As bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade para o imunógeno, sem a necessidade de construção de hibridomas. Alternativamente, o repertório inicial (naïve) pode ser clonado (por exemplo, a partir de humanos) para fornecer uma única fonte de anticorpos humanos para uma ampla faixa de antígenos não próprios (non-self) e também próprios (self), sem qualquer imunização, conforme descrito por Griffiths, A.D., et al., EMBO J, 12 (1993) 725-734. Finalmente, bibliotecas iniciais (naïves) também podem ser produzidas sinteticamente por meio de clonagem dos segmentos de genes V não rearranjados a partir de células-tronco, e utilizando primers de PCR que contém sequências aleatórias para codificar as regiões CDR3 altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, conforme descrito por Hoogenboom, H.R., e Winter, G., J. Mol. Biol., 227 (1992) 381-388. As Publicações de patentes que descrevem bibliotecas de fagos de anticorpos humanos incluem, por exemplo: a Patente US 5.750.373, e as publicações de Pedidos de Patente US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936, e US 2009/0002360.

[357] Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo isolados a partir de bibliotecas de anticorpos humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos na presente invenção.

6. ANTICORPOS VARIANTES

[358] Em determinados exemplos, são contempladas sequências de aminoácidos variantes dos anticorpos fornecidos na presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As sequências de aminoácidos variantes de um anticorpo podem ser preparadas pela introdução de modificações apropriadas na sequência nucleotídica que codifica o anticorpo ou pela síntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para se chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno.

A) VARIANTES DE SUBSTITUIÇÃO, INSERÇÃO E DELEÇÃO

[359] Em certos exemplos de realização, são fornecidos variantes de anticorpos possuindo uma ou mais substituições de aminoácidos.

Os sítios de interesse para mutagênese de substituição incluem as HVRs e FRs. Alterações exemplares são fornecidas na Tabela 1 sob o título de “substituições exemplares”, e conforme descrito abaixo em referência às classes de cadeias laterais de aminoácidos. Substituições conservadoras são exibidas na Tabela 1 sob o título de “substituições preferidas”. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos selecionados para uma atividade desejada, por exemplo, uma ligação ao antígeno melhorada/mantida, diminuição da imunogenicidade, ou ADCC ou CDC melhorada.

TABELA 1 Resíduo Substituições Exemplares Substituições Original Preferidas Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu Leu (L) Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu

Resíduo Substituições Exemplares Substituições Original Preferidas Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu

[360] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades comuns da cadeia lateral: (1) Hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam na orientação de cadeia: Gly, Pro; e (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

[361] Substituições não conservadoras causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe.

[362] Um tipo particularmente preferido de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano e humanizado). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para um estudo mais aprofundado terá(ão) modificações (por exemplo, melhorias) em certas propriedades biológicas (por exemplo, aumento da afinidade, imunogenicidade reduzida) em relação ao anticorpo parental e/ou terá(ão) certas propriedades biológicas do anticorpo parental substancialmente retidas. Uma variante de substituição exemplar é um anticorpo de afinidade maturada que pode ser facilmente gerado, por exemplo, usando técnicas de maturação de afinidade baseadas na exibição por fagos, tal como aquelas descritas no presente. Resumidamente, um ou mais resíduos da HVR está mutado e os anticorpos variantes são apresentados no fago e rastreados por uma atividade biológica específica (por exemplo, a afinidade de ligação).

[363] As alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, para melhorar a afinidade do anticorpo. Tais alterações podem ser feitas em “hotspots” da HVR, ou seja, os resíduos codificados pelos códons que são submetidos à mutação em alta frequência durante o processo de maturação somática (vide, por exemplo, Chowdhury, P.S. Methods Mol.

Biol. 207 (2008) 179-196), e/ou em SDRs (a-CDRs), com a variante de VH ou VL resultante avaliada pela afinidade de ligação. A maturação de afinidade por meio da construção e reseleção a partir de bibliotecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom, H.R. et al. em Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. Em alguns exemplos de realização de maturação de afinidade, a diversidade é introduzida nos genes variáveis escolhidos para a maturação por qualquer um dentre uma variedade de métodos (por exemplo, PCR sujeito a erros, embaralhamento (shuffling) de cadeias, ou mutagênese dirigida de oligonucleotídeos). Uma biblioteca secundária é então criada. A biblioteca é então pesquisada para identificar quaisquer variantes de anticorpos com a afinidade desejada. Outro método para introduzir diversidade envolve abordagens dirigidas à HVR, nas quais vários resíduos HVR (por exemplo, 4 a 6 resíduos de cada vez) são distribuídos aleatoriamente. Os resíduos HVR envolvidos na ligação ao antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, utilizando a mutagênese por scanning de alanina (Ala-scan) ou modelação. Particularmente a CDR-H3 e CDR-L3 são alvos frequentes.

[364] Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs contanto que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade dos anticorpos de se ligarem ao antígeno. Por exemplo, podem ser feitas alterações conservadoras (por exemplo, substituições conservadoras conforme previsto na presente invenção) nas HVRs que não reduzam substancialmente a afinidade de ligação. Tais alterações podem estar fora dos “hotspots” da HVR ou SDRs. Em certos exemplos de realização das sequências VH e VL variantes fornecidas acima, cada HVR está inalterada, ou não possui mais do que uma, duas ou três substituições de aminoácidos.

[365] Um método útil para a identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que podem ser direcionados para mutagênese é denominado de “mutagênese de varredura de alanina”, conforme descrito por Cunningham, B.C. e Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. Neste método, um resíduo ou grupo de resíduos alvos (por exemplo, resíduos carregados, tais como Arg, Asp, His, Lys e Glu) é identificado e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Outras substituições podem ser introduzidas nos locais de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições iniciais. Alternativamente ou adicionalmente, uma estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno pode ser analisada.

Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser selecionados ou eliminados como candidatos a substituição. As variantes podem ser rastreadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.

[366] As inserções de sequências de aminoácidos incluem: fusões carbóxi- e/ou amino-terminais que variam de comprimento desde um resíduo, até polipeptídeos que possuem cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequências de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N- ou C-terminal do anticorpo com uma enzima (por exemplo, ADEPT) ou um polipeptídeo que aumente a meia vida do anticorpo no soro.

B) VARIANTES DE REGIÃO FC

[367] Em certos exemplos de realização, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo fornecido na presente invenção, gerando assim um variante da região Fc. A região Fc variante humana pode compreender uma sequência da região Fc (por exemplo, sequência da região Fc da IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em um ou mais posições de aminoácidos.

[368] Os anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com a substituição de um ou mais dos seguintes resíduos da região Fc: 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente US 6.737.056). Tais Fc mutantes incluem Fc mutantes com substituições em duas ou mais das seguintes posições de aminoácidos: 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o Fc mutante então denominado de “DANA” com substituições dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente US 7.332.581).

[369] Certos variantes de anticorpos com ligação a FCRs melhorada ou diminuída são descritos. (vide, por exemplo, a Patente US

6.737.056; o documento WO 2004/056312, e Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem.

276 (2001) 6591-6604).

[370] Em um exemplo de realização da invenção, esse anticorpo é uma IgG1 com as mutações L234A e L235A ou com as mutações L234A, L235 A e P329G. Em outro exemplo de realização ou IgG4 com mutações S228P e L235E ou S228P, L235E ou P329G (numeração de acordo com o índice EU de Kabat, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda,

MD, 1991).

[371] As anticorpos com a meia-vida aumentada e ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) melhorada, que são responsáveis pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593 e Kim, J. K., et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), são descritos na US 2005/0014934. Tais anticorpos compreendem uma região Fc, com uma ou mais substituições neste local que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Tais variantes de Fc incluem aquelas formas variantes com substituições de um ou mais dos resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, a substituição do resíduo 434 da região Fc (Patente US 7.371.826).

[372] Vide também Duncan, A.R., e Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5.648.260; US 5.624.821; e WO 94/29351 relativos a outros exemplos de variantes da região Fc.

C) ANTICORPOS VARIANTES MODIFICADOS COM CISTEÍNA

[373] Em determinados exemplos de realização, pode ser desejável a criação de anticorpos modificados com cisteína, por exemplo, “thioMAbs”, no qual um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em exemplos de realização específicos, os resíduos substituídos ocorrer em sítios acessíveis do anticorpo. Pela substituição de tais resíduos com cisteína, os grupos tióis reativos são assim posicionados em locais acessíveis do anticorpo e podem ser utilizados para conjugar o anticorpo a outras moléculas, tais como moléculas de droga ou moléculas ligante-droga, para criar um imunoconjugado, conforme descrito na presente invenção. Em determinados exemplos de realização, qualquer um ou mais dos seguintes resíduos podem ser substituídos por cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração EU)

da região Fc da cadeia pesada. Os anticorpos modificados com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, na Patente US 7.521.541.

D) ANTICORPO DERIVADOS

[374] Em determinados exemplos de realização, um anticorpo da fornecido na presente invenção pode ser adicionalmente modificado para conter moléculas adicionais não proteináceas que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. As moléculas adequadas para a derivatização do anticorpo incluem, mas não estão limitadas a polímeros solúveis em água.

Exemplos não limitantes de polímeros hidrossolúveis incluem, mas não se limitando a, polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etileno-glicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, policloreto pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero etileno/maleico anidrido, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli (n-vinil pirrolidona) polietileno-glicol, homopolímeros de propropileno glicol, co- polímeros de óxido de prolipropileno óxido de etileno, poliálcool polióis (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e misturas dos mesmos. O propionaldeído polietilenoglicol pode ter vantagens no processo de fabricação devido à sua estabilidade na água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros acoplados ao anticorpo pode variar, e se mais de um polímero encontra-se acoplado, os polímeros podem ser da mesma molécula ou de moléculas diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros utilizado para derivatização pode ser determinado com base em considerações, incluindo, mas não se limitando a, propriedades específicas ou funções do anticorpo a ser melhorado, se o anticorpo derivado será utilizado em uma terapia sob condições definidas, etc.

[375] Em outro exemplo de realização, são fornecidos conjugados de anticorpo e porção não proteinácea que podem ser seletivamente aquecida por exposição à radiação. Em um exemplo de realização, a porção não proteinácea é um nanotubo de carbono (Kam, N.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda, e inclui, mas não se limita a, comprimento de ondas que não prejudicam células normais, mas que aquece a porção não proteinácea a uma temperatura no qual as células próximas ao anticorpo–porção não proteinácea são mortas.

B. MÉTODOS E COMPOSIÇÕES RECOMBINANTES

[376] Os anticorpos podem ser produzidos utilizando métodos e composições recombinantes, por exemplo, conforme descrito na Patente US

4.816.567. Em um exemplo de realização, é fornecido o ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti-HLA-G descrito na presente invenção. Tais ácidos nucleicos podem codificar uma sequência de aminoácidos compreendendo VL e/ou a sequência de aminoácidos compreendendo VH do anticorpo (por exemplo, cadeias leve e/ou pesadas do anticorpo). Em um exemplo de realização adicional, um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) compreendendo tal ácido nucleico é(são) fornecido(s). Em um exemplo de realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo o referido ácido nucleico. Em tal exemplo de realização, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo. Em um exemplo de realização, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), uma célula HEK293 ou célula linfoide (por exemplo, célula Y0, NS0, SP20). Em um exemplo de realização, é fornecido um método de produzir um anticorpo anti-HLA-G, em que o método compreende a cultura de uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica o anticorpo, tal como estabelecido acima, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo, e, opcionalmente, a recuperação do anticorpo a partir da célula hospedeira (ou meio de cultura das células hospedeiras).

[377] Para a produção recombinante de um anticorpo anti-HLA- G, o ácido nucleico codificante de um anticorpo, por exemplo, conforme descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem adicional e/ou para a expressão em uma célula hospedeira. O referido ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo).

[378] As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores codificantes de anticorpos incluem células procarióticas ou eucarióticas descritas na presente invenção. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, particularmente quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias. Para a expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, vide, por exemplo, as Patentes US

5.648.237, US 5.789.199 e US 5.840.523. (Vide também Charlton, K. A., Methods in Molecular Biology, vol. 248 Lo, B.K.C. (Ed)., Humana Press, Totowa, NJ, (2003), págs 245-254, descrevendo a expressão de fragmentos de anticorpos em E. coli). Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado a partir da pasta celular de bactérias em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado.

[379] Além dos procariotos, os micróbios eucariotos como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros adequados para clonagem ou expressão de vetores codificantes de anticorpos, incluindo as cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano. Vide, Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; e Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

[380] Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados podem ser derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas cepas de baculovírus que podem ser utilizadas em conjunto com células de insetos, particularmente para transfecção de células Spodoptera frugiperda.

[381] As culturas de células vegetais também podem ser utilizadas como hospedeiros. Vide, por exemplo, as Patentes US 5.959.177, US

6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 e US 6.417.429 (descrevendo a tecnologia PLANTIBODIES® para produção de anticorpos em plantas transgênicas).

[382] As células de vertebrados também podem ser utilizadas como hospedeiros. Por exemplo, a linhagem de células de mamíferos que são adaptadas para crescerem em suspensão pode ser útil. Outros exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são; linhagem CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (293 ou células 293 conforme descrito em Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); células rim de hamster neonato (BHK), células de Sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, J. P., Biol. Reprod 23 (1980) 243-252); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células humanas de carcinoma cervical (HeLa); células de rim de cão (MDCK); células do fígado de rato búfalo (BRL 3A); células pulmonares humanas (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather, J. P., et al, Annals NY Acad.Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem a célula de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO- - DHFR (Urlaub, G. et al, Proc Acad Nat.

Sci USA 77 (1980) 4216-4220) e linhagem de células de mieloma, como NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de anticorpos, vide, por exemplo, Yazaki e Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, vol. 248, Lo, B.K.C. (Ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), págs 255-268.

C. ENSAIOS

[383] Os anticorpos anti-HLA-G fornecidos na presente invenção podem ser identificados, rastreados, ou caracterizados por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos na arte.

1. ENSAIOS DE LIGAÇÃO E OUTROS ENSAIOS

[384] Em um aspecto, um anticorpo da invenção é testado quanto à sua atividade de ligação ao antígeno, por exemplo, por métodos conhecidos, como o ELISA, Western blot, e etc.

[385] Em outro aspecto, os ensaios de competição podem ser usados para identificar um anticorpo que compete com HLA-G-0032 (compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 8) para ligação ao HLA-G. Um exemplo de realização da invenção é um anticorpo que compete pela ligação ao HLA-G humano com um anticorpo anti-HLA-G compreendendo todas as 3 HVRs da sequência VH de SEQ ID NO: 7 e todas as 3 HVRs da sequência VL de SEQ ID NO: 8. Em determinados exemplos de realização, tal anticorpo competidor liga-se ao mesmo epítopo

(por exemplo, um epítopo linear ou conformacional) que é ligado pelo anticorpo anti-HLA-G, HLA-G-0032. Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo anti-HLA-G que se liga ao mesmo epítopo no HLA-G, tal como um anticorpo compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 8. Em outro aspecto, os ensaios de competição podem ser usados para identificar um anticorpo que compete com HLA-G-0037 (compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16) para ligação ao HLA-G. Um exemplo de realização da invenção é um anticorpo que compete pela ligação ao HLA-G humano com um anticorpo anti-HLA-G compreendendo todas as 3 HVRs da sequência VH de SEQ ID NO: 15 e todas as 3 HVRs da sequência VL de SEQ ID NO: 16. Em determinados exemplos de realização, tal anticorpo competidor liga-se ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou conformacional) que é ligado pelo anticorpo anti-HLA-G, HLA-G-0037. Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo anti-HLA-G que se liga ao mesmo epítopo no HLA-G, tal como um anticorpo compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16. Métodos exemplares detalhados para o mapeamento de um epítopo ao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris, G.E. (ed.) “Epitope Mapping Protocols,” Em Methods in Molecular Biology, vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996).

[386] Em um ensaio de competição exemplar, o HLA-G imobilizado é incubado com uma solução compreendendo um primeiro anticorpo marcado que se liga ao HLA-G (por exemplo, o anticorpo HLA-G- 0032 ou HLA-G-0037) e um segundo anticorpo não marcado que está sendo testado quanto à sua capacidade de competir com o primeiro anticorpo para se ligar ao HLA-G. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como controle, o HLA-G imobilizado é incubado com uma solução compreendendo o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após a incubação sob condições permissivas para a ligação do primeiro anticorpo HLA-G, o excesso de anticorpo não ligado é removido, e a quantidade de marcador associada com HLA-G imobilizado é mensurada. Se a quantidade de marcador associado com o HLA-G imobilizado for substancialmente reduzida na amostra teste em relação à amostra controle, então isso indica que o segundo anticorpo compete com o primeiro anticorpo pela ligação ao HLA-G. Vide Harlow, E. e Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988). Para outro ensaio de competição exemplar, consulte o Exemplo 2 (ELISA de mapeamento de epítopo/ensaio de competição de ligação).

2. ENSAIOS DE ATIVIDADE

[387] Em outro aspecto, os ensaios são fornecidos para a identificação de anticorpos anti-HLA-G possuindo atividade biológica. A atividade biológica pode incluir, por exemplo, a capacidade de aumentar a ativação e/ou proliferação de diferentes células imunes, incluindo células T. Por exemplo, elas aumentam a secreção de citocinas imunomoduladoras (por exemplo, interferon-gama (IFN-gama) e/ou fator de necrose tumoral alfa (TNF alfa)). Outras citocinas imunomoduladoras que são ou podem ser melhoradas são, por exemplo, IL1ß, IL6, IL12, granzima B, etc. ligando a diferentes tipos de células. Anticorpos possuindo tal atividade biológica, in vivo e/ou in vitro também são fornecidos.

[388] Em certos exemplos de realização, um anticorpo da invenção é testado para a atividade biológica conforme descrito, por exemplo, nos exemplos abaixo.

D MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA DIAGNÓSTICOS E DETECÇÃO

[389] Em alguns exemplos de realização, qualquer um dos anticorpos anti-HLA-G fornecidos na presente invenção são úteis para detectar a presença de HLA-G em uma amostra biológica. O termo “detecção”,

conforme utilizado no presente abrange a detecção quantitativa ou qualitativa.

Em determinados exemplos de realização, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido, tal como células imunes ou infiltrados de células T e/ou células tumorais.

[390] Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo anti-NRG para uso em um método diagnóstico ou de detecção. Em outro aspecto, é fornecido um método para detectar a presença de HLA-G em uma amostra biológica. Em certos exemplos de realização, o método compreende o contato da amostra biológica com um anticorpo anti-HLA-G descrito na presente invenção sob condições permissivas para a ligação do anticorpo anti- HLA-G ao HLA-G, e detectar se é formado um complexo entre o anticorpo anti- HLA-G e o HLA-G. Tal método pode ser um método in vitro ou in vivo. Em um exemplo de realização, um anticorpo anti-HLA-G é utilizado para selecionar sujeitos elegíveis para a terapia com um anticorpo anti-HLA-G, por exemplo, onde o HLA-G é um biomarcador para a seleção dos pacientes.

[391] Em certos exemplos de realização, são fornecidos anticorpos anti-HLA-G marcados. Os marcadores incluem, mas não estão limitados a, marcadores ou moléculas que são detectados diretamente (tais como marcadores fluorescentes, cromóforos, eletrodensos, quimioluminescentes e radioativos), bem como moléculas, tais como enzimas ou ligantes, que são detectadas indiretamente, por exemplo, por meio de uma reação enzimática ou interação molecular. Marcadores exemplares incluem, mas não se limitam a, radioisótopos P32, S32, C14, I125, H3, e I131, fluoróforos tais como quelatos terrosos raros ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, umbeliferona, luceriferases, por exemplo, a luciferase do vaga-lume e luciferase bacteriana (Patente US 4.737.456), luciferina, 2,3- dihidroftalazinadionas, peroxidase de rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacárido-oxidases, por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase, oxidases heterocíclicas como uricase e xantina-oxidase, acoplados com uma enzima que emprega o peróxido de hidrogênio para oxidar um precursor de corante, tal como a HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/avidina, marcadores de spin, mercadores de bacteriófagos, radicais livres estáveis, e similares.

E. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

[392] As formulações farmacêuticas de um anticorpo anti-HLA-G conforme descrito na presente invenção são preparadas pela mistura do antagonista possuindo o grau de pureza desejado com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edição, Osol, A. (ed.) (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são geralmente atóxicos aos receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem, mas não se limitam a, tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzilíco; alquil parabenos tais como metil ou propil-parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como poli(vinilpirrolidona); aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo a glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açucares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal tal como sódio; complexos metálicos (tal como, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tal como polietileno glicol (PEG). Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem ainda agentes de dispersão intersticial de fármacos, tais como glicoproteínas hialuronidase neutro-ativas solúveis (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas hialuronidase PH-20 humana solúvel, como a rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exemplares e métodos de utilização, incluindo a rhuPH20, estão descritos nas Publicações de Patente US 2005/0260186 e US 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.

[393] Formulações de anticorpos liofilizados exemplares estão descritas na Patente US 6.267.958. As formulações aquosas de anticorpos incluem as descritas na Patente US 6.171.586 e no documento WO2006/044908, sendo que as formulações deste último incluem um tampão histidina-acetato.

[394] A presente formulação também pode conter mais de um ingrediente ativo de acordo com a necessidade para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não sejam prejudiciais entre si. Por exemplo, pode ser desejável fornecer um agente adicional. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes na combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

[395] Os ingredientes ativos podem ser retidos (encapsulados) em microcápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de coacervação ou por meio de polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli- (metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª Edição, Osol, A. Ed.

(1980).

[396] Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham o anticorpo, que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas.

[397] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilização pode ser facilmente obtida, por exemplo, por meio da filtragem através de membranas de filtração estéreis.

F. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS TERAPÊUTICOS

[398] Qualquer um dos anticorpos anti-HLA-G (ou proteínas de ligação ao antígeno) fornecidos na presente invenção podem ser usados em métodos terapêuticos.

[399] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-HLA-G para uso como um medicamento. Em aspectos adicionais, é fornecido um anticorpo anti-HLA-G para uso no tratamento do câncer. Em certos exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-HLA-G para uso em um método de tratamento. Em certos exemplos de realização, a invenção fornece um anticorpo anti-HLA-G para uso em um método de tratamento de um indivíduo possuindo câncer, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-HLA-G ao dito indivíduo.

[400] Em outros exemplos de realização, a invenção fornece um anticorpo anti-HLA-G para uso como agente imunomodulador/para induzir direta ou indiretamente a proliferação, ativação de células imunes, como, por exemplo, pela secreção de citocinas imunoestimuladoras como TNF alfa (TNFα) e IFNgama (IFNγ) ou recrutamento adicional de células imunes. Em determinados exemplos de realização, a invenção provê um anticorpo anti- HLA-G para uso em um método de agente imunomodulador/para induzir direta ou indiretamente a proliferação, ativação de células imunes, por exemplo, pela secreção de citocinas imunoestimuladoras como TNFα e IFNγ ou recrutamento adicional de células imunes em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de um anticorpo anti-HLA-G eficaz para imunomodulação/ou induzir direta ou indiretamente a proliferação, ativação de células imunes, por exemplo, por secreção de citocinas imunoestimuladoras como TNFα e IFNγ ou posterior recrutamento de células imunes.

[401] Em outros exemplos de realização, a invenção provê um anticorpo anti-HLA-G para uso como agente imunoestimulador/ou na estimulação da secreção do fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa). Em certos exemplos de realização, a invenção fornece um anticorpo anti-HLA-G para uso em um método de imunomodulação para induzir direta ou indiretamente a proliferação, ativação, por exemplo, pela secreção de citocinas imunoestimuladoras como TNFα e IFNγ ou recrutamento adicional de células imunes em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do anticorpo anti-HLA-G para a imunomodulação que induz, direta ou indiretamente, a proliferação, a ativação, por exemplo, por secreção de citocinas imunoestimuladoras, como TNFα e IFNγ ou recrutamento adicional de células imunes. Assim, inibe a imunossupressão no tumor.

[402] Um “indivíduo”, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima é preferencialmente um ser humano. Em um aspecto adicional, a invenção fornece o uso de um anticorpo anti-HLA-G na fabricação ou preparação de um medicamento. Em um exemplo de realização, o medicamento é para o tratamento do câncer. Em um exemplo de realização adicional, o medicamento é para uso em um método de tratamento do câncer, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do medicamento a um indivíduo com câncer. Em outro exemplo de realização, o medicamento é para induzir a lise mediada por células de células cancerosas. Em outro exemplo de realização, o medicamento é para uso em um método de induzir a lise mediada por células de células cancerosas em um indivíduo que sofre de câncer, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do medicamento para induzir apoptose em uma célula cancerosa/ou para inibir a proliferação de células cancerosa. Um “indivíduo”, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima pode ser um humano.

[403] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para o tratamento do câncer. Em um exemplo de realização, o método compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti- HLA-G a um indivíduo possuindo câncer. Um “indivíduo”, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima pode ser um humano.

[404] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para induzir a lise mediada por células de células cancerosas em um indivíduo que sofre de câncer. Em um exemplo de realização, o método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um anti-HLA-G para induzir a lise mediada por células de células cancerosas no indivíduo que sofre de câncer. Em um exemplo de realização, um “indivíduo” é um humano.

[405] Em um aspecto adicional, a invenção fornece formulações farmacêuticas que compreendem qualquer um dos anticorpos anti-HLA-G fornecidos no presente, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos descritos acima. Em um exemplo de realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos anti-HLA-G fornecidos na presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[406] Um anticorpo da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer via apropriada, que inclui a via parenteral, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A administração pode ser feita por qualquer via de administração adequada, por exemplo, por injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. Vários esquemas de dosagem, incluindo, mas não se limitando a administrações únicas ou múltiplas ao longo do tempo, em vários pontos de tempo, administração em bolus, e infusão pulsada são contempladas pela presente invenção.

[407] Os anticorpos da invenção podem ser formulados, dosados, e administrados de forma consistente com a boa prática médica. Os fatores que devem ser considerados neste contexto incluem o distúrbio específico a ser tratado, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica do paciente, a causa do distúrbio, o local de entrega do agente, o método de administração, o esquema de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. O anticorpo não precisa ser, mas opcionalmente é formulado com um ou mais agentes atualmente utilizados para prevenir ou tratar os distúrbios em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, o tipo de distúrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos anteriormente. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descritas acima ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente, ou em qualquer dosagem e por qualquer via de administração descrita que é empiricamente/ clinicamente determinada como sendo apropriada.

[408] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um anticorpo da invenção (quando utilizado isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo, da gravidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, da terapia anterior, do histórico clínico do paciente e resposta ao anticorpo, e o critério do médico atendente. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente em uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 µg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,5mg/kg - 10 mg/kg) de anticorpo é uma possível dose candidata inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou por meio de infusão contínua. Uma dosagem diária típica poderá variar em cerca de 1 µg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima.

Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento pode ser mantido até que ocorra supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo estará na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Desta forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação destas) podem ser administradas ao paciente.

Essas doses podem ser administradas intermitentemente, tal como semanalmente ou a cada três semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte, tal como cerca de seis doses do anticorpo). Pode ser administrada uma dose de ataque inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. Um regime de dosagem exemplar compreende a administração de uma dose de ataque inicial de cerca de 4 mg/kg, seguida por dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo. Entretanto, outros regimes de dosagens podem ser úteis.

O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e ensaios convencionais.

[409] Deve ser compreendido que quaisquer formulações ou métodos terapêuticos descritos acima podem ser realizados utilizando um imunoconjugado da invenção no lugar ou além de um anticorpo anti-HLA-G.

[410] Deve ser compreendido que quaisquer formulações ou métodos terapêuticos descritos acima podem ser realizados utilizando um imunoconjugado da invenção no lugar ou além de um anticorpo anti-HLA-G.

II. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO

[411] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigo de manufatura que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos distúrbios descritos anteriormente. O artigo de manufatura compreende um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou associado a ele. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas de soluções para administração i.v. e etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente guarda uma composição que é por si só, ou em combinação com outra composição, eficaz para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou uma ampola que contém uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo da presente invenção.

O rótulo ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição de escolha. Além disso, o artigo de manufatura pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição ali contida, em que a composição compreende um anticorpo da presente invenção, e (b) um segundo recipiente com uma segunda composição ali contida, em que a segunda composição compreende um agente citotóxico adicional ou outro agente terapêutico. O artigo de manufatura neste exemplo de realização pode compreender ainda uma bula indicando que a composição pode ser usada para tratar uma condição específica. Alternativamente ou adicionalmente, o artigo de manufatura pode compreender ainda um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

[412] Os exemplos e figuras a seguir são fornecidos para auxiliar a compreensão da presente invenção, o verdadeiro escopo é estabelecido nas reivindicações anexas. Deve-se compreender que modificações nos procedimentos estabelecidos podem ser feitas sem nos afastarmos do espírito da presente invenção.

DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS

[413] Os sítios de ligação ao antígeno do anti-HLA-G (regiões variáveis e regiões hipervariáveis (HVRs)): - SEQ ID NO: 1 HVR-H1 de cadeia pesada, HLA-G-0031; - SEQ ID NO: 2 HVR-H2 de cadeia pesada, HLA-G-0031; - SEQ ID NO: 3 HVR-H3 de cadeia pesada, HLA-G-0031; - SEQ ID NO: 4 HVR-L1 de cadeia leve, HLA-G-0031; - SEQ ID NO: 5 HVR-L2 de cadeia leve, HLA-G-0031; - SEQ ID NO: 6 HVR-L3 de cadeia leve, HLA-G-0031; - SEQ ID NO: 7 Domínio variável de cadeia pesada VH, HLA- G-0031; - SEQ ID NO: 8 Domínio variável de cadeia leve VL, HLA-G- 0031; - SEQ ID NO: 9 HVR-H1 de cadeia pesada, HLA-G-0039; - SEQ ID NO: 10 HVR-H2 de cadeia pesada, HLA-G-0039; - SEQ ID NO: 11 HVR-H3 de cadeia pesada, HLA-G-0039; - SEQ ID NO: 12 HVR-L1 de cadeia leve, HLA-G-0039; - SEQ ID NO: 13 HVR-L2 de cadeia leve, HLA-G-0039; - SEQ ID NO: 14 HVR-L3 de cadeia leve, HLA-G-0039;

- SEQ ID NO: 15 Domínio variável de cadeia pesada VH, HLA-

G-0039;

- SEQ ID NO: 16 Domínio variável de cadeia leve VL, HLA-G-

0039;

- SEQ ID NO: 17 HVR-H1 de cadeia pesada, HLA-G-0041;

- SEQ ID NO: 18 HVR-H2 de cadeia pesada, HLA-G-0041;

- SEQ ID NO: 19 HVR-H3 de cadeia pesada, HLA-G-0041;

- SEQ ID NO: 20 HVR-L1 de cadeia leve, HLA-G-0041;

- SEQ ID NO: 21 HVR-L2 de cadeia leve, HLA-G-0041;

- SEQ ID NO: 22 HVR-L3 de cadeia leve, HLA-G-0041;

- SEQ ID NO: 23 Domínio variável de cadeia pesada VH, HLA-

G-0041;

- SEQ ID NO: 24 Domínio variável de cadeia leve VL, HLA-G-

0041;

- SEQ ID NO: 25 HVR-H1 de cadeia pesada, HLA-G-0090;

- SEQ ID NO: 26 HVR-H2 de cadeia pesada, HLA-G-0090;

- SEQ ID NO: 27 HVR-H3 de cadeia pesada, HLA-G-0090;

- SEQ ID NO: 28 HVR-L1 de cadeia leve, HLA-G-0090;

- SEQ ID NO: 29 HVR-L2 de cadeia leve, HLA-G-0090;

- SEQ ID NO: 30 HVR-L3 de cadeia leve, HLA-G-0090;

- SEQ ID NO: 31 Domínio variável de cadeia pesada VH, HLA-

G-0090;

- SEQ ID NO: 32 Domínio variável de cadeia leve VL, HLA-G-

0090;

- SEQ ID NO: 33 Variante humanizada do domínio variável de cadeia pesada VH, HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104); - SEQ ID NO: 34 Variante humanizada do domínio variável de cadeia leve VL, HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104) (;

- Sequências adicionais:

- SEQ ID NO: 35 HLA-G humano exemplar;

- SEQ ID NO: 36 Domínio extracelular (ECD) do HLA-G humano exemplar;

- SEQ ID NO: 37 ß2M humano exemplar;

- SEQ ID NO: 38 HLA-G humano modificado (em que os aminoácidos específicos do HLA-G foram substituídos pelos aminoácidos de consenso do HLA-A (= HLA-G degrafted (desenxertado) veja também a Figura

1) ECD);

- SEQ ID NO: 39 HLA-A2 humano exemplar;

- SEQ ID NO: 40 ECD do HLA-A2 humano ECD exemplar;

- SEQ ID NO: 41 ECD do H2Kd de camundongo;

- SEQ ID NO: 42 ECD do RT1A de rato exemplar;

- SEQ ID NO: 43 Complexo MHC classe I ß2M HLA-G humano exemplar;

- SEQ ID NO: 44 Complexo MHC classe I ß2M HLA-G humano modificado exemplar (em que os aminoácidos específicos do HLA-G foram substituídos pelos aminoácidos de consenso do HLA-A (= HLA-G degrafted

(desenxertado)) veja também a Figura 1);

- SEQ ID NO: 45 Complexo MHC classe I ß2M H2Kd de camundongo exemplar;

- SEQ ID NO: 46 HLA-G humano/ Complexo MHC classe I ß2M

H2Kd de camundongo exemplar em que as posições específicas para HLA-G humano são enxertadas na região estrutural do H2Kd de camundongo;

- SEQ ID NO: 47 Complexo MHC classe I ß2M RT1A de rato exemplar; - SEQ ID NO: 48 HLA-G humano/ Complexo MHC classe I ß2M

RT1A de rato exemplar em que as posições específicas para HLA-G humano são enxertadas na região estrutural do no RT1A de rato; - SEQ ID NO: 49 ligante e his-Tag; - SEQ ID NO: 50 peptídeo; - SEQ ID NO: 51 Região constante de cadeia leve kappa humana; - SEQ ID NO: 52 Região constante de cadeia leve lambda humana; - SEQ ID NO: 53 Região constante de cadeia pesada humana derivada da IgG1; - SEQ ID NO: 54 Região constante de cadeia pesada humana derivada da IgG1 com mutações L234A, L235A e P329G; - SEQ ID NO: 55 Região constante de cadeia pesada humana derivada da IgG4; - Sítios de ligação ao antígeno anti-CD3 (regiões variáveis e regiões hipervariáveis (HVRs)): - SEQ ID NO: 56 HVR-H1 de cadeia pesada, CH2527; - SEQ ID NO: 57 HVR-H2 de cadeia pesada, CH2527; - SEQ ID NO: 58 HVR-H3 de cadeia pesada, CH2527; - SEQ ID NO: 59 HVR-L1 de cadeia leve, CH2527; - SEQ ID NO: 60 HVR-L2 de cadeia leve, CH2527; - SEQ ID NO: 61 HVR-L3 de cadeia leve, CH2527; - SEQ ID NO: 62 Domínio variável de cadeia pesada VH, CH2527; e - SEQ ID NO: 63 Domínio variável de cadeia leve VL, CH2527.

[414] Anticorpos biespecíficos para células T (TCB) anti- CD3/anti-HLA-G: - P1AA1185 (baseado no HLA-G-0031 e CH2527): - SEQ ID NO: 64 cadeia leve 1 P1AA1185;

- SEQ ID NO: 65 cadeia leve 2 P1AA1185; - SEQ ID NO: 66 cadeia pesada 1 P1AA1185; - SEQ ID NO: 67 cadeia pesada 2 P1AA1185; - P1AA1185-104 (baseado no HLA-G-0031-0104 e CH2527): - SEQ ID NO: 68 cadeia leve 1 P1AA1185-104; - SEQ ID NO: 69 cadeia leve 2 P1AA1185-104; - SEQ ID NO: 70 cadeia pesada 1 P1AA1185-104; - SEQ ID NO: 71 cadeia pesada 2 P1AA1185-104; - P1AD9924 (baseado no HLA-G-0090 e CH2527): - SEQ ID NO: 72 cadeia leve 1 P1AD992; - SEQ ID NO: 73 cadeia leve 2 P1AD992; - SEQ ID NO: 74 cadeia pesada 1 P1AD992; e - SEQ ID NO: 75 cadeia pesada 2 P1AD992.

[415] Sequências adicionais: - SEQ ID NO: 76 CD3 humano exemplar; e - SEQ ID NO: 77 CD3 de cinomolgo exemplar.

[416] As sequências de aminoácidos das porções de ligação anti- HLA-G (regiões variáveis com regiões hipervariáveis (HVRs) sublinhadas e em negrito): - SEQ ID NO: 7: domínio variável de cadeia pesada VH, HLA-G- 0031:

QVKLMQSGAALVKPGTSVKMSCNASGYTFTDYWVSWVKQSHGKRLEWVG

EISPNSGASNFDENFKDKATLTVDKSTSTAYMELSRLTSEDSAIYYCTRSSHGSFRWFA YWGQGTLVTVSS; - SEQ ID NO: 8: domínio variável de cadeia leve VL, HLA-G-0031:

AIVLNQSPSSIVASQGEKVTITCRASSSVSSNHLHWYQQKPGAFPKFVI YSTSQRASGIPSRFSGSGSGTSYSFTISRVEAEDVATYYCQQGSSNPYTFGAGTKLELK ;

- SEQ ID NO: 33: variante humanizada do domínio variável de cadeia pesada VH, HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104):

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWVSWVRQAPGQRLEWMG

EISPNSGASNFDENFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSSHGSFRWFA YWGQGTLVTVSS; - SEQ ID NO: 34: variante humanizada do domínio variável de cadeia leve VL, HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104):

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSSNHLHWYQQKPGKAPKFLI

YSTSQRASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQGSSNPYTFGQGTKLEIK ; - SEQ ID NO: 15: domínio variável de cadeia pesada VH, HLA-G- 0039:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVS

VISGSGVSTYYADSVKGRFTISRDNSRNTLSLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGSYNYGYGD YFDYWGQGTLVTVSS; - SEQ ID NO: 16: domínio variável de cadeia leve VL, HLA-G- 0039:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSKNKNYLAWYQQKPGQP

PKLFIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNTPRTFGQGT KVEIK; - SEQ ID NO: 23: domínio variável de cadeia pesada VH, HLA-G- 0041:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMSWVRQAPGKGLEWVS

VISGGGVSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNRLRAEDTAVYYCAKDGSYNYGYGD YFDYWGQGTLVTVSS; - SEQ ID NO: 24: domínio variável de cadeia leve VL, HLA-G- 0041:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQP

PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNTPRTFGQGT KVEIK; - SEQ ID NO: 31: domínio variável de cadeia pesada VH, HLA-G- 0090:

QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDSVSSNRAAWNWIRQSPSRGLEW

LGRTYYRSKWYNDYAVSVQGRITLIPDTSKNQFSLRLNSVTPEDTAVYYCASVRAVAPF DYWGQGVLVTVSS; - SEQ ID NO: 32: domínio variável de cadeia leve VL, HLA-G- 0090:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLNSSNNKNNLAWYQQQPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQYYRTPWTFGQGT KVEIK.

[417] As sequências de aminoácidos das porções de ligação anti- CD3 (regiões variáveis com regiões hipervariáveis (HVRs) sublinhadas e em negrito): - SEQ ID NO: 62 domínio variável de cadeia pesada VH, CH2527:

EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVA

RIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSY VSWFAYWGQGTLVTVS; e - SEQ ID NO: 63 domínio variável de cadeia leve VL, CH2527:

QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGL IGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTV LSSASTK.

[418] Sequências de aminoácidos de anticorpos biespecíficos anti-HLA-G/anti- CD3: - P1AA1185 (baseado no HLA-G-0031 e CH2527): - SEQ ID NO: 64 cadeia leve 1 P1AA1185:

EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVA R; IRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCV R; HGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSAASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS V;

VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL S; KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC; - SEQ ID NO: 65 cadeia leve 2 P1AA1185:

AIVLNQSPSSIVASQGEKVTITCRASSSVSSNHLHWYQQKPGAFPKFVI Y; STSQRASGIPSRFSGSGSGTSYSFTISRVEAEDVATYYCQQGSSNPYTF G; AGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW K;

VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH Q; GLSSPVTKSFNRGEC; - SEQ ID NO: 66 cadeia pesada 1 P1AA1185:

QVKLMQSGAALVKPGTSVKMSCNASGYTFTDYWVSWVKQSHGKRLEWVG E; ISPNSGASNFDENFKDKATLTVDKSTSTAYMELSRLTSEDSAIYYCTRS S; HGSFRWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV E; DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ T; YICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPK P; KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY N; STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP Q;

VCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP V; LDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP; - SEQ ID NO: 67 cadeia pesada 2 P1AA1185:

QVKLMQSGAALVKPGTSVKMSCNASGYTFTDYWVSWVKQSHGKRLEWVG E; ISPNSGASNFDENFKDKATLTVDKSTSTAYMELSRLTSEDSAIYYCTRS S; HGSFRWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV E; DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ T; YICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQESALTTSPG E; TVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFS G; SLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTK G; PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP A; VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD K; THTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP E; VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC K; VSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG F;

YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN V; FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP; - P1AA1185-104 (baseado no HLA-G-0031-0104 e CH2527): - SEQ ID NO: 68 cadeia leve 1 P1AA1185-104:

VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL S; KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC; - SEQ ID NO: 69 cadeia leve 2 P1AA1185-104:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSSNHLHWYQQKPGKAPKFLI Y; STSQRASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQGSSNPYTF G; QGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW K; VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH

Q; GLSSPVTKSFNRGEC; - SEQ ID NO: 70 cadeia pesada 1 P1AA1185-104:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWVSWVRQAPGQRLEWMG E; ISPNSGASNFDENFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRS S; HGSFRWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV E; DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ T; YICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPK P; KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY N; STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP Q;

VCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP V; LDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP; - SEQ ID NO: 71 cadeia pesada 2 P1AA1185-104;

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWVSWVRQAPGQRLEWMG E; ISPNSGASNFDENFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRS S; HGSFRWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV E; DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ T; YICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQESALTTSPG E; TVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFS G; SLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTK G; PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP A; VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD K; THTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP E; VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC K; VSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG F;

YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN V; FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP; - P1AD9924 (baseado no HLA-G-0090 e CH2527): - SEQ ID NO: 72 cadeia leve 1 P1AD992:

VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL S; KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC; - SEQ ID NO: 73 cadeia leve 2 P1AD992:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLNSSNNKNNLAWYQQQPGQP P; KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQYYR T; PWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPRE A;

KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA C; EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC; - SEQ ID NO: 74 cadeia pesada 1 P1AD992:

QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDSVSSNRAAWNWIRQSPSRGLEW L; GRTYYRSKWYNDYAVSVQGRITLIPDTSKNQFSLRLNSVTPEDTAVYYC A; SVRAVAPFDYWGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL V; EDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT Q; TYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP K; PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ Y; NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPRE P; QVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP P;

VLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP ; - SEQ ID NO:75 cadeia pesada 2 P1AD992:

QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDSVSSNRAAWNWIRQSPSRGLEW L; GRTYYRSKWYNDYAVSVQGRITLIPDTSKNQFSLRLNSVTPEDTAVYYC A; SVRAVAPFDYWGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL V; EDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT Q; TYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQESALTTSP G; ETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARF S; GSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSAST K; GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF P; AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC D; KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED P; EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK C; KVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVK G;

FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG N; e VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP.

[419] Os seguintes exemplos de realização específicos da invenção são listados.

[420] 1. Um anticorpo multiespecífico que se liga ao HLA-G humano e a um antígeno de ativação de célula T (particularmente CD3 humano), compreendendo uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga ao HLA-G humano e uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno de ativação de célula T (particularmente CD3 humano).

[421] 2. O anticorpo multiespecífico, de acordo com o exemplo de realização 1, em que o anticorpo é biespecífico; e - em que a primeira porção de ligação ao antígeno do anticorpo que se liga ao HLA-G humano compreende: A) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou B) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 11; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou

- e em que a segunda porção de ligação ao antígeno, que se liga a um antígeno de ativação de célula T, liga-se ao CD3 humano, e compreende:

E) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ

ID NO: 58; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61.

[422] 3. O anticorpo biespecífico, de acordo com o exemplo de realização 2, em que a primeira porção de ligação ao antígeno: A) iv) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 8; v) ou a variante humanizada da VH e VL do anticorpo de (i); ou vi) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 33 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 34; ou B) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16; ou C) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 24; ou D) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32; - e em que a segunda porção de ligação ao antígeno; e E) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 62 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 63.

[423] 4. O anticorpo biespecífico de acordo com o exemplo de realização 3: - em que a primeira porção de ligação ao antígeno compreende i) uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32; ou ii) uma sequência VH de SEQ ID NO: 33 e uma sequência VL de SEQ ID

NO: 34; - e em que a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 62 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 63.

[424] 5. O anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer um dos exemplos de realização 1 a 4, em que o anticorpo: a) não reage de forma cruzada com um complexo MHC I ß2M HLA-G humano modificado compreendendo a SEQ ID NO: 44; e/ou b) não reage de forma cruzada com o complexo MHC I ß2M HLA-A2 humano compreendendo a SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 37; e/ou c) não reage de forma cruzada com um complexo MHC I ß2M H2Kd de camundongo compreendendo a SEQ ID NO: 45; e/ou d) não reage de forma cruzada com o complexo MHC I ß2M RT1A de rato compreendendo a SEQ ID NO: 47; e/ou e) inibe a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G monomérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43); e/ou f) inibe a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G trimérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43), em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 60%) (quando comparado com a ligação sem anticorpo) (consulte o Exemplo 4b); e/ou g) inibe a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G monomérico e/ou dimérico e/ou trimérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43) em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%) (quando comparado com a ligação sem anticorpo) (vide o Exemplo 4b); e/ou h) inibe a ligação de ILT2 às células JEG3 (ATCC Nº. HTB36) (HLA-G) (em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%)) (quando comparada com a ligação sem anticorpo) (consulte o Exemplo 6); e/ou i) liga-se as células (HLA-G) JEG3 (ATCC Nº. HTB36) (consulte o Exemplo 5) e inibe a ligação de ILT2 às células JEG-3 (HLA-G)

(ATCC Nº. HTB36) (em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%)) (quando comparada com a ligação sem anticorpo) (consulte o Exemplo 6); e/ou j) inibe a ligação de CD8a ao HLAG em mais de 80% (quando comparada à ligação sem anticorpo) (consulte, por exemplo, o Exemplo 4c), e/ou k) restaura a resposta imune suprimida específica de HLA-G (por exemplo, liberação suprimida do fator de necrose tumoral (TNF) alfa) por monócitos cocultivados com células JEG-3 (ATCC HTB36); e l) induz a citotoxicidade mediada por células T na presença de células tumorais que expressam HLAG (por exemplo, células JEG-3 (ATCC HTB36) (consulte o Exemplo 12).

[425] 6. O anticorpo multiespecífico de qualquer uma dos exemplos de realização de 1 a 5, em que a primeira e segunda porções de ligação ao antígeno são moléculas Fab.

[426] 7. O anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 6, caracterizado pela segunda porção de ligação ao antígeno ser uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1, particularmente os domínios variáveis VL e VH, da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab estão substituídos entre si.

[427] 8. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 7, em que a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab, na qual no domínio constante o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat); e no domínio constante CH1 o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[428] 9. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 8, em que a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno estão fundidas entre si, opcionalmente por um peptídeo ligante.

[429] 10. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 9, em que a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são, cada uma, moléculas Fab, e em que (i) a segunda porção de ligação ao antígeno está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno, ou (ii) a primeira porção de ligação ao antígeno está fundida no C- terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno.

[430] 11. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 10, compreendendo uma terceira porção de ligação ao antígeno.

[431] 12. O anticorpo multiespecífico, de acordo com o exemplo de realização 11, em que a terceira porção de ligação ao antígeno é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno.

[432] 13. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 12, compreendendo um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade.

[433] 14. O anticorpo multiespecífico, de acordo com o exemplo de realização 13, em que a primeira, a segunda e, quando presente, a terceira porção de ligação ao antígeno são, cada uma, uma molécula Fab; - e em que (i) a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno e a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc, ou (ii) a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc; - e em que, a terceira porção de ligação ao antígeno (quando presente) está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da segunda subunidade do domínio Fc.

[434] 15. O anticorpo multiespecífico, de acordo com o exemplo de realização 13 ou 14, em que o domínio Fc é de uma IgG, particularmente um domínio Fc de IgG1.

[435] 16. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos exemplos de realização de 13 a 15, em que o domínio Fc é um domínio Fc humano.

[436] 17. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos exemplos de realização de 13 a 16, em que o domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc e/ou a função efetora.

[437] 18. O anticorpo multiespecífico de acordo com o exemplo de realização 17, em que o anticorpo é do isotipo IgG 1 com as mutações L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[438] 19. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos exemplos de realização de 13 a 18, em que um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc é substituído por um resíduo de aminoácido que tem um volume de cadeia lateral maior, gerando, assim, uma protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável dentro de uma cavidade no interior do domínio CH3 da segunda subunidade, e um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc ser substituído por um resíduo aminoácido que tem um menor volume de cadeia lateral, gerando assim uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade, dentro da qual a protuberância do domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável.

[439] 20. O anticorpo multiespecífico, de acordo com o exemplo de realização 19, em que o anticorpo é do isotipo IgG 1 com a mutação T366W na primeira subunidade do domínio Fc e com as mutações Y407V, T366S e L368A na segunda subunidade do domínio Fc (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[440] 21. O anticorpo multiespecífico, de acordo com o exemplo de realização 20, em que o anticorpo compreende uma mutação S354C adicional na primeira subunidade do domínio Fc e uma mutação Y349C adicional na segunda subunidade do domínio Fc (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[441] 22. O anticorpo multiespecífico, de acordo com o exemplo de realização 20, em que o anticorpo compreende uma mutação Y349C adicional na primeira subunidade do domínio Fc e uma mutação S354C adicional na segunda subunidade do domínio Fc (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[442] 23. Ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer um dos exemplos de realização precedentes.

[443] 24. Uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico do exemplo de realização 23.

[444] 25. Um método de produção de um anticorpo multiespecífico compreendendo o cultivo da célula hospedeira do exemplo de realização 24 de modo que o anticorpo é produzido.

[445] 26. O método de acordo o exemplo de realização 25 compreendendo adicionalmente a recuperação do anticorpo multiespecífico a partir da célula hospedeira.

[446] 27. Uma formulação farmacêutica compreendendo o anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 22 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[447] 28. O anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 22 para o uso como um medicamento.

[448] 29. O anticorpo multiespecífico, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 22, para uso no tratamento do câncer.

[449] 30. O uso do anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 22 na fabricação de um medicamento.

[450] 31. O uso de acordo com o exemplo de realização 30, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para o tratamento do câncer.

[451] 32. Um método de tratamento de um indivíduo com câncer compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do anticorpo multiespecífico de qualquer um dos exemplos de realização de 1 a

22.

EXEMPLOS TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE

[452] Foram usados métodos padronizados para manipular o DNA conforme descrito em Sambrook, J. et al, “Molecular cloning: A laboratory manual”; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989. Os reagentes para a biologia molecular foram utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes.

SÍNTESE DE GENES E OLIGONUCLEOTÍDEOS

[453] Os segmentos de genes desejados foram preparados por síntese química na Geneart GmbH (Regensburg, Alemanha). Os fragmentos de gene sintetizados foram clonados em um plasmídeo de E. coli para propagação/amplificação. As sequências de DNA dos fragmentos de genes subclonados foram verificadas pelo sequenciamento de DNA. Alternativamente, fragmentos de DNA sintéticos curtos foram montados pelo anelamento de oligonucleotídeos sintetizados quimicamente ou via PCR. Os respectivos oligonucleotídeos foram preparados pela metabion GmbH (Planegg- Martinsried, Alemanha).

DESCRIÇÃO DO PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO EM MAMÍFEROS PADRÃO/BÁSICO

[454] Para a expressão de um gene/proteína desejada (por exemplo, cadeia pesada de anticorpo de comprimento total, cadeia leve de anticorpo de comprimento total ou uma molécula MHC de classe I, por exemplo, HLA-G, ou uma molécula de MHC de classe I fundida a um peptídeo e/ou microglobulina beta-2, por exemplo, HLA-G fundido com o peptídeo de ligação HLA-G e/ou microglobulina beta-2), é utilizada uma unidade de transcrição que compreende os seguintes elementos funcionais: - o facilitador (enhancer) e promotor precoce imediato a partir do citomegalovírus humano (P-CMV) incluindo o íntron A; - uma região 5' não traduzida (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana; - uma sequência sinal de cadeia pesada de imunoglobulina murina; - um gene/proteína a ser expresso (por exemplo, cadeia pesada de anticorpo de comprimento total ou molécula MHC classe I); e - a sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH pA).

[455] Ao lado da unidade/cassete de expressão incluindo o gene que se pretende expressar, o plasmídeo de expressão em mamífero básico/padrão contém: - uma origem de replicação a partir do vetor pUC18 que permite a replicação deste plasmídeo em E. coli; e - um gene beta-lactamase que confere resistência à ampicilina em E. coli.

DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS

[456] A concentração de proteína de polipeptídeos purificados foi determinada por meio da medição da densidade óptica (OD) a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos do polipeptídeo.

EXEMPLO 1 GERAÇÃO DE MOLÉCULAS QUIMÉRICAS DE HLA-G PARA TRIAGEM DE

CONTRATRIAGEM

[457] Devido à elevada homologia (> 98%) com outras moléculas do MHC I, a imunização com moléculas HLA-G resulta na geração de anticorpos policlonais séricos, compostos por uma mistura de anticorpos que reagem cruzadamente dentro do MHC-I bem como anticorpos verdadeiramente específicos para HLA-G.

[458] Até agora, nenhuma ferramenta foi fornecida para selecionar anticorpos verdadeiramente específicos para HLA-G sem reatividade cruzada com outra molécula do MHC-I humano (por exemplo, HLA- A), e para selecionar adicionalmente aqueles com função de bloqueio do receptor.

[459] Nós identificado posições únicas do HLA-G em combinação com as posições necessárias para conformidade estrutural e interação com o receptor (ILT2/4 e KIR2DL4.)

[460] As posições únicas e proximais do HLA-G humano foram então “enxertadas” em moléculas do complexo MHC de classe I a partir de diferentes espécies de roedores (tais como RT1A de rato e H2kd de camundongo) para gerar antígenos imunógenos/de triagem “quiméricos”.

[461] Os anticorpos gerados foram submetidos à triagem rigorosa para ligação/especificidade, (e nenhuma ligação/especificidade para contra-antígenos, respectivamente).

[462] Triagem de antígenos: ‒ rec. HLA-G expresso como complexo MHC ß2M HLA-G humano compreendendo a SEQ ID NO: 43; ‒ Sequências específicas de HLA-G enxertadas em RT-1 de rato e H2kd de camundongo (SEQ ID NO: 46: HLA-G humano/complexo MHC classe I ß2M H2Kd de camundongo em que as posições específicas para HLA- G humano são enxertadas no framework do H2Kd de camundongo e SEQ ID NO: 48: complexo HLA-G humano/MHC classe I ß2M RT1A rato em que as posições específicas para HLA-G humano são enxertadas no framework do RT1A de rato); e ‒ Células que expressam complexos MHC de classe I HLA-G naturais (por exemplo células Jeg3), ou linhagens de células transfectadas com HLA-G humano SKOV3 HLA-G+ e PA-TU-8902 HLA-G+.

[463] Triagem de contra-antígenos: ‒ Contra-antígenos (complexos MHC classe I) com outras sequências HLA-A (HLA-A2 e HLA-G degrafted (desenxertado) com sequência de consenso HLA-A) combinados com diferentes peptídeos) (vide, por exemplo, a SEQ ID NO 40 (HLA-A2) e SEQ ID NO: 44 sequência de consenso

HLA-A na estrutura HLA-G); ‒ Contra-antígenos (complexos MHC classe I) de outras espécies, como RT-1 de rato e H2k d de camundongo (SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 47); e ‒ Linhagens de células tumorais não modificadas SKOV3 e PA-TU-8902, que são caracterizadas pela ausência de expressão de HLA-G.

DESENVOLVIMENTO DE ANTÍGENOS HLA-G QUIMÉRICOS PARA USO NA IMUNIZAÇÃO E TRIAGEM PARA A GERAÇÃO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS PARA HLA (VIDE A FIGURA 1)

[464] Desenvolvimento de uma molécula MHC I de rato quimérica (RT1-A) carregando posições únicas de HLA-G (SEQ ID NO: 48) para uso na imunização de ratos tipo selvagem (wt) e transgênicos, ou coelhos e camundongos, etc., e/ou para usar em ensaios de triagem.

[465] As posições únicas de HLA-G foram identificadas pelo alinhamento de 2579 HLA-A, 3283 HLA-B, 2133 HLA-C, 15 HLA-E, 22 HLA-F e 50 sequências HLA-G de IMGT (conforme disponível em 6 de fevereiro de 2014). Tais resíduos de HLA-G que ocorrem em menos de 1% (principalmente ~ 0%) das sequências de qualquer um dos 3 conjuntos de sequências HLA-A, HLA-B e um conjunto combinado de HLA-C + HLA-E + HLA-F são chamados de posições únicas de HLA-G.

[466] As posições únicas de 4 núcleos HLA-G (2 em alfa-1 e 2 em alfa-3) não mostram polimorfismo no conjunto de sequências HLA-G e nenhum dos outros genes HLA contém os resíduos específicos do HLA -G nessas posições (exceto 1x HLA-A para M100, 1x HLA-B para Q103 e 1x HLA-C para Q103).

[467] A estrutura cristalina de RT1-A de rato (Rudolph, MG et al. J. Mol. Biol. 324: 975-990 (2002); código PDB: 1KJM) foi sobreposta na estrutura cristalina do HLA-G humano (Clements, C.S. et al. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 102: 3360-3365 (2005); código PDB: 1YDP). A estrutura geral da cadeia alfa e da beta-2 microglobulina associada é conservada.

[468] As posições únicas de HLA-G foram identificadas na estrutura RT1-A por comparação da sequência e alinhamentos estruturais.

Em uma primeira etapa, foram identificadas posições HLA-G únicas que são expostas na superfície molecular de HLA-G e RT1-A e, portanto, acessíveis para um anticorpo. As posições únicas que estão enterradas (cobertas) no enovelamento proteico foram excluídas da modificação. Em uma segunda etapa, foram identificados resíduos estruturalmente proximais, que também precisam ser trocados para fazer a região correspondente “semelhante ao HLA-G”, ou seja, para gerar epítopos HLA- G reais contendo as posições únicas em vez de gerar Epítopos quiméricos HLA-G/RT1-A de rato que seriam artificiais. Todas as posições que foram assim selecionadas para mutação foram analisadas quanto ao ajuste estrutural do respectivo resíduo de HLA-G para evitar possíveis distúrbios locais da estrutura molecular após a mutação.

[469] Uma molécula MHC I de camundongo quimérica (H2Kd) carregando posições únicas de HLA-G (SEQ ID NO: 46) para uso na imunização e/ou para uso em ensaios de triagem foi gerada de forma análoga.

[470] Concepção de contra-antígenos baseados no HLA-A por “desenxertia” (degrafting) das posições de HLA-G únicas no sentido de uma sequência HLA-A de consenso para o uso como um contra-antígeno na triagem (SEQ ID NO: 44).

[471] As posições únicas derivadas do alinhamento de sequência múltipla foram analisadas em uma estrutura cristalina de HLA-G humano (código PDB: 1YDP). Em primeiro lugar, as posições que não são expostas na superfície HLA-G e, portanto, não são acessíveis para um anticorpo foram excluídas da manipulação. Em segundo lugar, os resíduos expostos à superfície foram analisados quanto à viabilidade de troca de aminoácidos (ou seja, exclusão de possíveis distúrbios locais da estrutura molecular após mutação da posição relevante). No total, 14 posições foram validadas para troca. Os aminoácidos nas posições validadas foram mutados em direção a uma sequência de consenso HLA-A derivada de um alinhamento de sequência múltipla de 2579 sequências do HLA-A baixadas do IMGT (disponível em 6 de fevereiro de 2014).

[472] Geração de plasmídeos de expressão para moléculas de MHC de classe I clássicas e não clássicas.

[473] Os genes de MHC de classe I recombinantes codificam moléculas de fusão estendidas no N-terminal que consistem em um peptídeo conhecido por estar ligado pela respectiva molécula MHC de classe I, microglobulina beta-2 e a respectiva molécula de MHC de classe I.

[474] Os plasmídeos de expressão para a expressão transitória das moléculas MHC classe I solúveis compreendia além do cassete de expressão da molécula MHC classe I solúvel, uma origem de replicação do vetor pUC18 que permite a replicação deste plasmídeo em E.

coli, e um gene da beta-lactamase que confere resistência a ampicilina em E. coli.

[475] A unidade de transcrição da molécula MHC classe I solúvel compreendia os seguintes elementos funcionais: - o facilitador (enhancer) e promotor precoce imediato a partir do citomegalovírus humano (P-CMV) incluindo o íntron A, - uma região 5' não traduzida (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana, - uma sequência sinal de cadeia pesada de imunoglobulina murina, - um ácido nucleico codificando uma sortase A de S.

aureus truncada N-terminalmente, e - a sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH pA).

[476] As sequências de aminoácidos das moléculas de MHC de classe I maduras derivadas de várias espécies são: - SEQ ID NO: 43: complexo MHC classe I ß2M HLA-G humano exemplar; - SEQ ID NO: 44: Complexo MHC classe I ß2M HLA-G humano modificado exemplar (em que os aminoácidos específicos do HLA - G foram substituídos por aminoácidos de consenso HLA-A (= HLA-G degrafted (desenxertado) veja também a Figura 1); - SEQ ID NO: 45: Complexo MHC classe I ß2M H2Kd de camundongo exemplar; - SEQ ID NO: 46: Complexo MHC ß2M HLA-G humano/ H2Kd de camundongo exemplar em que as posições específicas para HLA-G humano são enxertadas na região estrutural do H2Kd de camundongo; - SEQ ID NO: 47: Complexo MHC classe I ß2M RT1A de rato exemplar; e - SEQ ID NO: 48: Complexo MHC ß2M HLA-G humano/ RT1A de rato exemplar em que as posições específicas para HLA-G humano são enxertadas na região estrutural do no RT1A de rato.

[477] Para o exemplo do complexo MHC classe I ß2M HLA-A2 usado na triagem/rastreio, os seguintes componentes foram usados e o complexo foi expresso em E. coli e purificado.

[478] O complexo MHCI HLA-A2 / b2M (SEQ ID NOs 40 e 37) (ambos com uma metionina N-terminal adicional) + peptídeo VLDFAPPGA

(SEQ ID NO: 50) + ligante e his-Tag (SEQ ID NO: 49) EXEMPLO 2

CAMPANHAS DE IMUNIZAÇÃO A) IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS E RATOS A. PROTEÍNAS QUIMÉRICAS (PARA TOLERÂNCIA CONTRA MHC-I/HLA INESPECÍFICA E DIREÇÃO PARA POSIÇÕES HLA-G ÚNICAS)

[479] Camundongos Balb/C obtidos da Charles River Laboratories International, Inc., foram usados para a imunização. Os animais foram alojados de acordo com o Apêndice A “Diretrizes para acomodação e cuidado dos animais” em uma instalação de animais credenciada pela AAALACi. Todos os protocolos e experimentos de imunização animal foram aprovados pelo Governo da Alta Baviera (números de licença 55.2-1-54-2531- 19-10 e 55.2-1-54-2532-51-11) e realizados de acordo com a Lei Alemã de Bem-Estar Animal e Diretrizes 2010/63 do Parlamento e Conselho Europeu.

[480] Os camundongos Balb/C (n = 5), de 6-8 semanas de idade, receberam cinco rodadas de imunização com uma molécula H2Kd/HLA-G quimérica (SEQ ID NO: 46 (“HLA-G-0006”)) ao longo de um período de 4 semanas. Antes de cada imunização, os camundongos foram anestesiados com uma mistura de gases de oxigênio e isoflurano. Para a primeira imunização, 15 µg de proteína dissolvida em His/HisCl 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, foram misturados com um volume igual de CFA (BD Difco, # 263810) e administrados por via subcutânea (s.c.) a seis locais proximais à drenagem linfonodos, ao longo do dorso dos camundongos, com dois locais na nuca e dois locais bilateralmente na virilha e na panturrilha. Outros 15 µg de proteína emulsionada em adjuvante RIBI (Sigma-Aldrich, #S6322) foram administrados em seis locais justapostos ao longo do abdômen, com dois locais cada bilateralmente à axila, virilha e coxa. Doses de antígeno decrescentes das imunizações de reforço (boost) foram administradas nos dias 7 (10 µg), 14 (5 µg), 21 (5 µg) e 28 (5 µg) de maneira semelhante, exceto que o adjuvante RIBI foi usado apenas ao longo do abdômen. Três dias após a imunização final, os camundongos foram sacrificados e os linfonodos poplíteos, inguinais superficiais, axilares e branquiais foram isolados assepticamente e preparados para a geração de hibridoma. O soro foi testado para a produção de HLA-G humano recombinante e produção de anticorpo IgG total imunógeno-específico por ELISA após a terceira e quinta imunização.

[481] Outro conjunto de camundongos Balb/C (n = 5), de 6-8 semanas de idade, receberam três imunizações com uma molécula H2Kd/HLA- G quimérica (HLA-G-0006)) ao longo de 3 meses. Para a primeira imunização, 100 µg de proteína dissolvida em His/HisCl 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, foram misturados com um volume igual de CFA (BD Difco, #263810) e administrados por via intraperitoneal (i.p.). As imunizações de reforço foram administradas nos dias 28 e 56 de uma forma semelhante, exceto que foi usado adjuvante incompleto de Freund (IFA da BD Difco, #DIFC263910).

Quatro a cinco semanas após a imunização final, os camundongos receberam aproximadamente 25 µg do imunógeno por via intravenosa (i.v.) em PBS estéril e após 72h os baços foram coletados assepticamente e preparados para a geração de hibridoma. O soro foi testado para HLA-G humano recombinante (SEQ ID NO: 43 (“HLA-L-0003”)), e molécula H2Kd/HLA-G quimérica imunógeno-específica (SEQ ID NO: 46 (“HLA-G-0006”)) e contratriado com HLA-G humano degrafted (desenxertado) com posições específicas de HLA-A de consenso (SEQ ID NO: 44 (“HLA-G-0007”)) e proteína H2kd murina (SEQ ID NO: 45 “HLA-G -0009”)) e produção total de anticorpos IgG por ELISA após a terceira imunização.

B. PROTEÍNA HLA-G TIPO SELVAGEM (WT)

[482] Ratos CD obtidos da Charles River Laboratories International, Inc., foram usados para a imunização. Os animais foram alojados de acordo com o Apêndice A “Diretrizes para acomodação e cuidado dos animais” em uma instalação de animais credenciada pela AAALACi. Todos os protocolos e experimentos de imunização animal foram aprovados pelo Governo da Alta Baviera (número de licença 55.2-1-54-2532-51-11) e realizados de acordo com a Lei Alemã de Bem-Estar Animal e Diretrizes 2010/63 do Parlamento e Conselho Europeu.

[483] Os ratos CD (n = 4), de 6-8 semanas de idade, receberam quatro imunizações com proteína HLA-G humana recombinante (SEQ ID NO: 43 (“HLA-G-0003”)) ao longo de um curso de 4 meses. Para a primeira imunização, 100 µg de proteína dissolvida em His/HisCl 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, foram misturados com um volume igual de CFA (BD Difco, #263810) e administrados por via intraperitoneal. As imunizações de reforço foram administradas nos dias 28, 56 e 84 de uma forma semelhante, exceto que foi usado adjuvante incompleto de Freund durante as imunizações (IFA da BD Difco, #DIFC263910). Três a quatro semanas após a imunização final, os ratos receberam aproximadamente 75µg do imunógeno i.v. em PBS estéril e após 72h os baços foram coletados assepticamente e preparados para a geração de hibridoma. O soro foi testado para a produção de anticorpos específicos para HLA-G (SEQ ID NO: 43 (“HLA-G-0003”)) IgG1, IgG1a, IgG2b e IgG2c por ELISA após a terceira e quarta imunização e contratriagem com HLA-G humano degrafted (desenxertado) com posições específicas de consenso de HLA-A (SEQ ID NO: 44 (“HLA-G-0007”)).

C. CÉLULAS JEG3 (ATCC Nº. HTB36) (EXPRESSANDO NATURALMENTE HLA-G)

[484] Ratos CD obtidos da Charles River Laboratories International, Inc., foram usados para a imunização. Os animais foram alojados de acordo com o Apêndice A “Diretrizes para acomodação e cuidado dos animais” em uma instalação de animais credenciada pela AAALACi. Todos os protocolos e experimentos de imunização animal foram aprovados pelo

Governo da Alta Baviera (número de licença AZ. 55.2-1-54- 2531-83-13) e realizados de acordo com a Lei Alemã de Bem-Estar Animal e Diretrizes 2010/63 do Parlamento e Conselho Europeu.

[485] Dois grupos de ratos CD (n = 2), de 6-8 semanas de idade, receberam cinco (grupo A) ou sete (grupo B) de imunizações usando células JEG-3 (ATCC HTB36) ao longo de cinco (A) a sete (B) meses, respectivamente. Para a primeira imunização, 1x107 células dissolvidas em PBS estéril, foram misturadas com um volume igual de CFA (BD Difco, # 263810) e administradas por via intraperitoneal. As imunizações de reforço foram administradas a A e B nos dias 28, 56, 84, 112, 140 (apenas B) e 168 (apenas B) de uma forma semelhante, exceto que o adjuvante incompleto de Freund (IFA de BD Difco, #DIFC263910) foi usado ao longo das imunizações.

Após três semanas da imunização final, os ratos receberam 100 µg de proteína HLA-G humana recombinante (SEQ ID NO: 43 (“HLA-G-0003”)) i.v. em PBS estéril; e 72h depois, os baços foram coletados assepticamente e preparados para a geração do hibridoma. O soro foi testado para a produção de anticorpos IgG1, IgG1a, IgG2b e IgG2c específicos para HLA-G recombinante (SEQ ID NO: 43 (“HLA-G-0003”)) e por ELISA após a terceira, quinta e sétima imunização, respectivamente e contratriagem com HLA-G humano degrafted (desenxertado) com posições específicas de HLA-A de consenso (SEQ ID NO: 44 (“HLA-G-0007”)).

D. EG3/DNA IMS (PARA EFEITO DE REFORÇO)

[486] Ratos CD obtidos da Charles River Laboratories International, Inc., foram usados para a imunização. Os animais foram alojados de acordo com o Apêndice A “Diretrizes para acomodação e cuidado dos animais” em uma instalação de animais credenciada pela AAALACi. Todos os protocolos e experimentos de imunização animal foram aprovados pelo Governo da Alta Baviera (número de licença AZ. 55.2-1-54- 2531-83-13) e realizados de acordo com a Lei Alemã de Bem-Estar Animal e Diretrizes 2010/63 do Parlamento e Conselho Europeu.

[487] Os ratos CD (n = 5), de 6-8 semanas de idade, receberam DNA plasmidial e imunizações baseadas em células em um regime alternado ao longo de um curso de três meses. O plasmídeo de DNA HLA-G -0030 (p17747) que codifica HLA-G humano como uma molécula de cadeia única, bem como as células JEG-3 que expressam HLA-G naturalmente (ATCC HTB36) foram utilizados para este propósito, respectivamente.

[488] Para a primeira imunização, os animais foram anestesiados com isoflurano e imunizados por via intradérmica (i.d.) com 100μg de DNA plasmidial em H2O estéril aplicado em um ponto nas costas depiladas, próximo à cauda do animal. Após a aplicação i.d., o ponto foi eletroporado usando os seguintes parâmetros em um sistema de eletroporação ECM 830 (BTX Harvard Apparatus): duas vezes 1000V/cm por 0,1ms cada, separados por um intervalo de 125ms, seguido por quatro vezes 287,5V/cm por 10ms, separados também por intervalos de 125ms. Para a segunda imunização no dia 14, os animais receberam 1x107 células dissolvidas em PBS estéril, que foram misturadas com um volume igual de CFA (BD Difco, # 263810) e, após a geração de uma emulsão estável, administradas por via intraperitoneal. As imunizações de reforço foram administradas nos dias 28 (DNA), 42 (células), 56 (DNA) e 70 (células) de uma forma semelhante, exceto que foi usado adjuvante incompleto de Freund durante as imunizações com células (IFA da BD Difco, #DIFC263910). Após quatro semanas da imunização final, os ratos receberam 100 µg de proteína MHC classe I HLA-G humana recombinante solúvel (SEQ ID NO: 43 (“HLA-G-0003”)) i.v. em PBS estéril; e 72h depois, os baços foram coletados assepticamente e preparados para a geração do hibridoma. O soro foi testado para a produção de anticorpos IgG1, IgG1a, IgG2b e IgG2c específicos para proteína MHC classe I HLA-G humana recombinante solúvel

(SEQ ID NO: 43 (“HLA-G-0003”)) por ELISA após a terceira, quinta e sexta imunizações, respectivamente, e contratriagem com HLA-G humano degrafted (desenxertado) com posições específicas de consenso de HLA-A (SEQ ID NO: 44 (“HLA-G-0007”)).

[489] Em todas as estratégias de imunização foi induzida uma resposta imunológica altamente humoral polirreativa que reconhece HLA-G, assim como as proteínas utilizadas para a contratriagem (por exemplo, HLA-G humano recombinante degrafted (desenxertado), molécula H2Kd/HLA-G quimérica ou moléculas HLA-A2 humana relacionadas) conforme analisado em um ensaio no formato ELISA usando soros policlonais de animais imunizados (nenhum dado mostrado).

B) IMUNIZAÇÃO DE RATOS OMNIRAT LINE 7 HUMANIZADOS

[490] Ratos OMNIRAT line 7 da Open Monoclonal Technology, Inc. (2747 Ross Road, Palo Alto, CA 94303, EUA) foram criados e obtidos da Charles River Laboratories International, Inc. Os animais foram alojados de acordo com o Apêndice A “Diretrizes para acomodação e cuidado dos animais” em uma instalação de animais credenciada pela AAALACi. Todos os protocolos e experimentos de imunização animal foram aprovados pelo Governo da Alta Baviera (números de licença 55.2-1-54-2532-51-11 e 55.2-1-54- 2531-83-13) e realizados de acordo com a Lei Alemã de Bem-Estar Animal e Diretrizes 2010/63 do Parlamento e Conselho Europeu.

[491] Os ratos OmniRat Line 7 (n = 4), de 6-8 semanas de idade, receberam quatro imunizações com proteína HLA-G humana quimérica (SEQ ID NO: 48 (“HLA-G-0011”)) ao longo de um curso de 4 meses. Para a primeira imunização, 100 µg de proteína dissolvida em His/HisCl 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, foram misturados com um volume igual de CFA (BD Difco, #263810) e administrados por via intraperitoneal. As imunizações de reforço foram administradas nos dias 28, 56 e 84 de uma forma semelhante, exceto que foi usado adjuvante incompleto de Freund durante as imunizações (IFA da BD Difco, #DIFC263910). Três a quatro semanas após a imunização final, os ratos receberam aproximadamente 50µg do imunógeno i.v. e 25 μg do imunógeno i;.p. em PBS estéril e após 72h os baços foram coletados assepticamente e preparados para a geração de hibridoma. O soro foi testado para a produção de anticorpos específicos para HLA-G (SEQ ID NO: 48 (“HLA-G-0011”)) IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG2c por ELISA após a terceira e quarta imunização e contratriagem com HLA-G humano degrafted (desenxertado) com posições específicas de consenso de HLA-A (SEQ ID NO: 44 (“HLA-G-0007”)).

[492] Alternativamente, ratos OmniRat Line 7 (n = 5), de 6-8 semanas de idade, receberam DNA plasmidial e imunizações baseadas em células em um regime alternado ao longo de um curso de três meses. O plasmídeo de DNA HLA-G humano como uma molécula de cadeia única (proteína MHC classe I HLA-G humana (SEQ ID NO: 44 (“HLA-G-0003”)), bem como as células JEG-3 que expressam HLA-G naturalmente (ATCC HTB36) foram utilizados para este propósito, respectivamente.

[493] Para a primeira imunização, os animais foram anestesiados com isoflurano e imunizados por via intradérmica (i.d.) com 100μg de DNA plasmidial em H2O estéril aplicado em um ponto nas costas depiladas, próximo à cauda do animal. Após a aplicação i.d., o ponto foi eletroporado usando os seguintes parâmetros em um sistema de eletroporação ECM 830 (BTX Harvard Apparatus): duas vezes 1000V/cm por 0,1ms cada, separados por um intervalo de 125ms, seguido por quatro vezes 287,5V/cm por 10ms, separados também por intervalos de 125ms. Para a segunda imunização no dia 14, os animais receberam 1x107 células dissolvidas em PBS estéril, que foram misturadas com um volume igual de CFA (BD Difco, # 263810) e, após a geração de uma emulsão estável, administradas por via intraperitoneal. As imunizações de reforço foram administradas nos dias 28 (DNA), 42 (células), 56 (DNA) e 70

(células) de uma forma semelhante, exceto que foi usado adjuvante incompleto de Freund durante as imunizações com células (IFA da BD Difco, #DIFC263910). Após quatro semanas da imunização final, os ratos receberam 100 µg de proteína MHC classe I HLA-G humana recombinante solúvel (SEQ ID NO: 43 (“HLA-G-0003”)) i.v. em PBS estéril; e 72h depois, os baços foram coletados assepticamente e preparados para a geração do hibridoma. O soro foi testado para a produção de anticorpos IgG1, IgG1a, IgG2b e IgG2c específicos para proteína MHC classe I HLA-G humana recombinante solúvel (SEQ ID NO: 43 (“HLA-G-0003”)) por ELISA após a terceira, quinta e sexta imunizações, respectivamente, e contratriagem com HLA-G humano degrafted (desenxertado) com posições específicas de consenso de HLA-A (SEQ ID NO: 44 (“HLA-G-0007”)).

[494] Em todas as estratégias de imunização foi induzida uma resposta imunológica altamente humoral polirreativa que reconhece HLA-G, assim como as proteínas utilizadas para contratriagem (por exemplo, HLA-G humano recombinante degrafted (desenxertado), molécula H2Kd/HLA-G quimérica ou moléculas HLA-A2 humana relacionadas) conforme analisado em um ensaio no formato ELISA usando soros policlonais de animais imunizados (nenhum dado mostrado).

ANTICORPOS OBTIDOS

[495] Utilizando os métodos anteriores, foram obtidos os seguintes anticorpos anti-HLA-G que se ligam especificamente ao HLA-G humano:HLA-G 0031 de rato de ratos CD, HLA-G 0039 humano, HLA-G 0041 e HLA-G 0090 de ratos humanizados.

[496] As propriedades de ligação dos anticorpos específicos anti- HLA-G obtidos e as atividades biológicas foram determinadas conforme descrito nos seguintes exemplos e comparadas com anticorpos de referência conhecidos. O anticorpo HLA-G-0031 foi humanizado utilizando suas HVRs e estrutura humana aceptora de VH HUMAN_IGHV1-3 e estrutura humana aceptora de VL HUMAN_IGKV1- 17 (domínio V, com uma mutação reversa adicional na posição R46F, numeração de Kabat).

[497] Para a identificação de uma estrutura aceptora humana adequada durante a humanização do ligante de HLA-G, HLA-G-0031, foi usada uma combinação de duas metodologias. Por um lado, foi adotada uma abordagem clássica procurando uma estrutura aceptora com alta homologia de sequência com o anticorpo parental e enxerto subsequente in silico das regiões CDR nesta estrutura aceptora. Cada diferença de aminoácidos das estruturas identificadas para o anticorpo parental foi avaliada quanto ao impacto na integridade estrutural do ligante e as retromutações em relação à sequência parental foram consideradas sempre que apropriado.

[498] Por outro lado, uma ferramenta in silico descrita no documento WO 2016/062734 foi usada para prever a orientação dos domínios VH e VL das versões humanizadas entre si. Isso foi realizado para os enxertos virtuais das CDRs em todas as possíveis combinações de linhagens germinativas humanas. Os resultados foram comparados com a orientação do domínio VH-VL dos ligantes parentais para selecionar combinações de regiões estruturais que são próximas em geometria em relação aos anticorpos originais.

ANTICORPO ANTI-HLA-G (SEQ ID NOS DAS REGIÕES VARIÁVEIS E REGIÕES HIPERVARIÁVEIS (HVRS)): Anticorpo anti- HVR-H1 HVR-H2 HVR-H3 HVR-L1 HVR-L2 HVR-L3 VH VL

HLAG

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID HLA-G-0031 NO: 1 NO: 2 NO: 3 NO: 4 NO: 5 NO: 6 NO: 7 NO: 8 HLA-G-0031- 0104 (variante

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID humanizada de NO: 1 NO: 2 NO: 3 NO: 4 NO: 5 NO: 6 NO: 33 NO: 34 HLA-G-0031) (HLA-G-0104)

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID HLA-G-0039 NO: 9 NO: 10 NO: 11 NO: 12 NO: 13 NO: 14 NO: 15 NO: 16

Anticorpo anti- HVR-H1 HVR-H2 HVR-H3 HVR-L1 HVR-L2 HVR-L3 VH VL

HLAG

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID HLA-G-0041 NO: 17 NO: 18 NO: 19 NO: 20 NO: 21 NO: 22 NO: 23 NO: 24

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID HLA-G-0090 NO: 25 NO: 26 NO: 27 NO: 28 NO: 29 NO: 30 NO: 31 NO: 32 EXEMPLO 3 A) LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-HLA-G AO HLA-G HUMANO SOLÚVEL, HLA-G HUMANO DEGRAFTED SOLÚVEL COM SEQUÊNCIA ESPECÍFICA DE HLA-A, HLA-A2 HUMANO E H2-KD DE RATO/CAMUNDONGO

[499] Os anticorpos obtidos a partir da imunização foram rastreados quanto às suas propriedades de ligação ao HLA-G humano, quimérico, HLA-G degrafted (desenxertado), HLA-A2 e H2-Kd de rato/camundongo. Os respectivos ensaios estão descritos abaixo. Para o teste de HLA-G humano, foram usadas as formas monoméricas, bem como as formas diméricas e triméricas (vide a preparação abaixo).

DIMERIZAÇÃO/TRIMERIZAÇÃO DA PROTEÍNA MHC CLASSE I HLA-G HUMANA

[500] O sobrenadante contendo proteína MHC de classe I HLA-G humana solúvel marcada com His (SEQ ID NO: 23) foi carregado em uma coluna HisTrap HP (GE Healthcare # 17-5248-02) com 5 mL de Ni-Sepharose em uma velocidade de fluxo de 0,2 mL/min durante a noite em temperatura ambiente usando um ÄKTA-FPLC. A coluna foi então lavada com 2% de DPBS contendo 0,5 M de imidazol (Merck # 8.14223.025) até o valor basal ser alcançado. A coluna foi então equilibrada com DTT 10 mM em DPBS a 2% contendo Imidazol 0,5 M e incubada durante 30 min à temperatura ambiente. O DTT foi lavado da coluna com PBS/Imidazol 10 mM e a proteína foi eluída a um gradiente de 2-100% de DPBS com Imidazol 0,5 mM. Após concentrar o eluato usando Amicon-Ultra 15 M/Ultracel 10K, a proteína foi incubada durante 24 horas em temperatura ambiente seguido por 48 horas a 4ºC para permitir dímero/multimerização. A separação dos dímeros e trímeros foi então realizada usando SEC em Superdex 200 HiLoad 16/60 (GE Healthcare #17-5175-01) e lavada com NaOH 0,5 M durante a noite. A coluna foi equilibrada com PBS seguido por saturação com 10 mg/mL BSA. Os dímeros (fração A9) e os trímeros (fração A8) foram então coletados, aliquotados e armazenados a - 80ºC até o uso posterior.

ELISA DE LIGAÇÃO AO HLA-G WT HUMANO

[501] Placas revestidas com estreptavidina (Nunc, MicroCoat #11974998001) foram revestidas com 25 µL/poço de HLA-G humano wt biotinilado a uma concentração de 250 ng/mL e incubadas a 4ºC durante a noite. Após a lavagem (3x90 µL/poço com tampão PBST), foram adicionadas amostras de 25 µl de anticorpo anti-HLA-G (diluição 1: 3 em tampão OSEP) ou anticorpo de referência (G233, Thermo/Pierce #MA1-19449, 500 ng/mL) e incubado 1h à temperatura ambiente. Após lavagem (3x90 µL/poço com tampão PBST) 25 µL/poço de anticorpo de cabra anti-camundongo H+L-POD (Biorad # 170-6561, 1: 2000 em OSEP) ou anticorpo de burro anti-IgG de coelho POD (GE # NA9340V, 1: 5000 em OSE) foram adicionados e incubados à temperatura ambiente durante 1 h em agitador. Para a detecção de IgGs de rato, foi adicionada uma mistura de anticorpo de cabra anti-IgG1-de rato POD (Bethyl # A110-106P), anticorpo de cabra anti-IgG2a de rato POD (Bethyl # A110-109P) e anticorpo de cabra anti-IgG2b de rato POD (Bethyl # A110-111P) 1:10000 em OSEP e a mistura foi incubada à temperatura ambiente por 1 h em agitador. Após a lavagem (6 x 90 µL/poço com tampão PBST), foram adicionados 25 µL/poço de substrato TMB (Roche: 11835033001) e as placas foram incubadas até uma medição de OD 2 – 3. A medição ocorreu em um instrumento Tecan Safire 2 no comprimento de onda de 370/492 nm.

LIGAÇÃO POR ELISA DE HLA-G DEGRAFTED HUMANO COM SEQUÊNCIAS ESPECÍFICAS HLA-A

[502] Placas revestidas com estreptavidina (Nunc, MicroCoat

#11974998001) foram revestidas com 25 µL/poço de HLA-G degrafted (desenxertado) humano biotinilado a uma concentração de 250 ng/mL e incubadas a 4ºC durante a noite. Após a lavagem (3x90 µL/poço com tampão PBST), foram adicionadas amostras de 25 µl de anticorpo anti-HLA-G (diluição 1:3 em tampão OSEP) ou soro de rato e incubado 1h à temperatura ambiente.

Após a lavagem (3x90 µL/poço com tampão PBST) foram adicionados 25 µL/poço de uma mistura de anticorpo de cabra anti-IgG1 de rato POD (Bethyl # A110-106P), anticorpo de cabra anti-IgG2a de rato POD (Bethyl # A110-109P) e anticorpo de cabra anti-IgG2b de rato POD (Bethyl # A110-111P) 1:10000 em OSEP e as misturas foram incubadas à temperatura ambiente por 1 h em agitador. Após a lavagem (6 x 90 µL/poço com tampão PBST), foram adicionados 25 µL/poço de substrato TMB (Roche: 11835033001) e as placas foram incubadas até uma medição de OD 2 – 3. A medição ocorreu em um instrumento Tecan Safire 2 no comprimento de onda de 370/492 nm.

ELISA DE LIGAÇÃO AO MHC I DE RATO (RT1-A)

[503] Placas revestidas com estreptavidina (Nunc, MicroCoat #11974998001) foram revestidas com 25 µL/poço de MHC I de rato biotinilado a uma concentração de 250 ng/mL e incubadas a 4ºC durante a noite. Após a lavagem (3x90 µL/poço com tampão PBST), foram adicionadas amostras de 25 µl de anticorpo anti-HLA-G (diluição 1:3 em tampão OSEP) ou soro de rato e incubado 1h à temperatura ambiente. Após a lavagem (3x90 µL/poço com tampão PBST) foram adicionados 25 µL/poço de uma mistura de anticorpo de cabra anti-IgG1 de rato POD (Bethyl # A110-106P), anticorpo de cabra anti- IgG2a de rato POD (Bethyl # A110-109P) e anticorpo de cabra anti-IgG2b de rato POD (Bethyl # A110-111P) 1:10000 em OSEP e as misturas foram incubadas à temperatura ambiente por 1 h em agitador. Após a lavagem (6 x 90 µL/poço com tampão PBST), foram adicionados 25 µL/poço de substrato TMB (Roche: 11835033001) e as placas foram incubadas até uma medição de

OD 2 – 3. A medição ocorreu em um instrumento Tecan Safire 2 no comprimento de onda de 370/492 nm.

ELISA DE LIGAÇÃO AO HLA-A2

[504] Placas revestidas com estreptavidina (Nunc, MicroCoat #11974998001) foram revestidas com 25 µL/poço de HLA-A2 humano biotinilado a uma concentração de 250 ng/mL e incubadas a 4ºC durante a noite. Após a lavagem (3x90 µL/poço com tampão PBST), foram adicionadas amostras de 25 µl de anticorpo anti-HLA-G (diluição 1:3 em tampão OSEP) ou soro de rato e incubado 1h à temperatura ambiente. Após a lavagem (3x90 µL/poço com tampão PBST) foram adicionados 25 µL/poço de uma mistura de anticorpo de cabra anti-IgG1 de rato POD (Bethyl # A110-106P), anticorpo de cabra anti-IgG2a de rato POD (Bethyl # A110-109P) e anticorpo de cabra anti- IgG2b de rato POD (Bethyl # A110-111P) 1:10000 em OSEP e as misturas foram incubadas à temperatura ambiente por 1 h em agitador. Após a lavagem (6 x 90 µL/poço com tampão PBST), foram adicionados 25 µL/poço de substrato TMB (Roche: 11835033001) e as placas foram incubadas até uma medição de OD 2 – 3. A medição ocorreu em um instrumento Tecan Safire 2 no comprimento de onda de 370/492 nm.

CINÉTICA DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-HLA-G

[505] A cinética de ligação de anticorpos anti-HLA-G ao HLA-G humano, HLA-G humano degrafted (desenxertado) e HLA-A2 humano foi investigada por ressonância plasmônica de superfície usando um instrumento BIACORE T200 (GE Healthcare). Todas os experimentos foram realizadas a 25ºC usando tampão PBS (pH 7,4 + Tween20 0,05%) como tampão de corrida e tampão PBS (+ BSA a 0,1%) como tampão de diluição. Os anticorpos anti-Fc humano (JIR009-005-098, Jackson) ou anti-Fc de rato (JIR112-005-071, Jackson) ou anti-Fc de camundongo (JIR115-005-071, Jackson) foram imobilizados em um chip Sensor CM5 Série S (GE Healthcare) em pH 5,0 usando um kit de acoplamento de amina fornecido pela GE Healthcare. Os anticorpos anti-HLA-G foram capturados na superfície levando a uma resposta de captura de 50 - 200 RU. As moléculas de HLA-G foram injetadas por 180 s a 30 µL/min com concentrações de 2,5 a 800 nM (diluição seriada de 2x1:2 e 4x1:3) na superfície (fase de associação). A fase de dissociação foi monitorada durante 300-600 segundos por lavagem com tampão de corrida. A superfície foi regenerada pela injeção de H3PO4 (0,85%) por 60 + 30 segundos para anticorpos de captura anti-Fc humano, glicina pH 1,5 por 60 segundos e glicina pH 2,0 por 60 segundos para anticorpos de captura anti-Fc de rato, H3PO4 (0,85%) por 80 + 60 segundos para anticorpos de captura anti-Fc de camundongo. Diferenças no índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo a resposta obtida a partir de uma superfície da amostra simulada (branco). As injeções da amostra em branco são subtraídas (= dupla referenciação). As curvas derivadas foram ajustadas a um modelo de ligação Langmuir 1:1 usando o software BIAevaluation.

BLOQUEIO CRUZADO DE ANTICORPOS ANTI-HLA-G

[506] Os experimentos de bloqueio cruzado de anticorpos anti- HLA-G que se ligam ao HLA-G humano foram investigados por ressonância plasmônica de superfície usando um instrumento BIACORE T200 ou B4000 (GE Healthcare). Todos os experimentos foram realizados a 25ºC usando tampão PBS (pH 7,4 + Tween20 0,05%) como tampão de corrida.

[507] Anticorpos anti-Fab humano (GE-Healthcare, 28-9583-25) foram imobilizados em um Chip sensor Series S CM5 (GE Healthcare) de acordo com o protocolo do fornecedor, para capturar anticorpos de ratos OMT que contêm um domínio Ck humano. Os anticorpos anti-HLA-G foram capturados por 70s a uma concentração de 15 µg/mL. HLA-G wt foi injetado (30 µL/min) a uma concentração de 500 ou 1000 nM por 60 segundos. O anticorpo de rato wt foi então injetado durante 90 segundos a uma concentração de 30 µg/mL. A fase de dissociação foi monitorada durante 60 ou 240 segundos por lavagem com tampão de corrida. A superfície foi regenerada pela injeção de Glicina pH 1,5 por 60 segundos e um período de estabilização adicional de 90 segundos.

[508] Em outra configuração de ensaio, anticorpos anti-Fab humano (GE-Healthcare, 28-9583-25) foram imobilizados em um Chip sensor Series S CM5 (GE Healthcare) de acordo com o protocolo do fornecedor, para capturar anticorpos de ratos OMT que contêm um domínio Ck humano. Os anticorpos anti-HLA-G foram capturados por 90s a uma concentração de 30 µg/mL. Os sítios de ligação não ocupados nos anticorpos de captura foram bloqueados com injeções (4 x 120 seg.) de IgG humana (JIR009-000-003) a uma concentração de 500 µg/mL e uma velocidade de fluxo de 30 µL/min.

HLA-G wt foi injetado (30 µL/min) a uma concentração de 500 nM por 90 segundos. O segundo anticorpo de ratos OMT (domínio Ck humano) foi então injetado durante 90 segundos a uma concentração de 30 µg/mL. A fase de dissociação foi monitorada durante 240 segundos por lavagem com tampão de corrida. A superfície foi regenerada pela injeção de Glicina pH 1,5 por 60 segundos e um período de estabilização adicional de 90 segundos.

TABELA LIGAÇÃO DE ANTICORPOS HLA-G AO COMPLEXO MHC CLASSE 1 HLA-G SOLÚVEL RECOMBINANTE, EM SUA FORMA MONOMÉRICA, DIMÉRICA E TRIMÉRICA (ELISA) HLA-G HLA-G Dímero HLA-G Trímero Anticorpo Monômero EC50 [nM] EC50 [nM] EC50 [nM] HLA-G-0031 7,19 1,87 1,86 HLA-G-0039 7,35 4,10 5,29 HLA-G-0041 4,95 5,31 4,87 HLA-G-0090 n.a. n.a. n.a.

[509] A tabela acima resume a ligação de diferentes anticorpos monoclonais de rato anti-HLA-G humano, derivados da proteína IMS wt. São mostrados os valores relativos de EC50 [ng/mL] da respectiva ligação às proteínas HLA-G monoméricas, diméricas e triméricas wt registradas avaliadas por ELISA. O ensaio ELISA foi preparado revestindo o antígeno HLA-G wt biotinilado em placas de estrepdavidina. Após as etapas de incubação e lavagem, os respectivos anticorpos foram ligados em uma faixa de concentração de 10 - 0 µg em etapas de diluição 1:2. A detecção de anticorpos ligados foi realizada por conjugados anticorpo anti-Fc POD. Os valores de EC50 foram determinados a partir das curvas de ligação resultantes nas concentrações de anticorpos que geram a metade do sinal máximo. No caso dos antígenos diméricos e triméricos de HLA-G não biotinilados, a imobilização foi realizada por revestimento aleatório em placas de ensaio.

[510] ELISA para Ligação de HLA-G wt versus HLA-G degraft: HLA-G wt (SEQ ID NO: 43) HLA-A consenso no HLA-G degraft Anticorpo (monômero) (SEQ ID NO: 44) EC50 rel [ng/mL] Max, OD EC50 rel [ng/mL] Max, OD HLA-G-0031 7,19 1,6 - 0,13 HLA-G-0039 7,35 1,4 - 0,13 HLA-G-0041 8,60 2,3 - 0,15 HLA-G-0090 10,37 3,4 - 0,2

[511] A tabela acima resume a ligação de diferentes anticorpos monoclonais de rato anti-HLA-G humano, derivados da proteína IMS wt tanto de ratos wt quanto de ratos OMT. São mostrados os valores relativos de EC 50 [ng/mL] e DO máxima da respectiva ligação de proteína HLA-G monomérica wt ou a chamada proteína HLA-G degrafted (sequência de consenso HLA-A no esqueleto do HLA-G) conforme avaliado por ELISA. O ensaio ELISA foi preparado revestindo o antígeno HLA-G wt biotinilado ou antígeno consenso em placas de estrepdavidina. Após as etapas de incubação e lavagem, os respectivos anticorpos foram ligados em uma faixa de concentração de 10 - 0 µg em etapas de diluição 1:2. A detecção de anticorpos ligados foi realizada por conjugados anticorpo anti-Fc POD. Os valores de EC50 foram determinados a partir das curvas de ligação resultantes nas concentrações de anticorpos que geram a metade do sinal máximo.

LIGAÇÃO DE HLA-G WT VERSUS HLA-G DEGRAFT - RESSONÂNCIA PLASMÔNICA DE SUPERFÍCIE

[512] As afinidades de ligação para anticorpos HLA-G contra HLA-G recombinante (SEQ ID NO: 43) e complexo MHC classe-I ß2M HLA-G modificado humano de controle (no qual aminoácidos específicos do HLA-G foram substituídos por aminoácidos de consenso do HLA-A (= HLA-G degrafted (desenxertado) SEQ ID NO: 44:) (“-”indica que não há ligação detectável) HLA-G wt (SEQ ID NO: 25) HLA-A consenso no HLA-G degrafted (SEQ Anticorpo (monômero) ID NO: 26) ka t 1/2 kd (1/s) KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) t 1/2 (min) KD (M) (1/Ms) (min) HLA-G- 4,9E+04 3,7E-03 3 7,5E-08 - - - - 0031 HLA-G- 8,3E+04 2,0E-03 6 2,4E-08 0031-0104 (humaniza do) HLA-G- 4,6E+05 4,4E-04 27 9,5E-10 - - - - 0039 HLA-G- 3,8E+05 4,9E-04 23 1,3E-09 - - - - 0041 HLA-G- 2,3E+05 8,5E-04 14 3,6E-09 - - - - 0090

[513] A tabela acima resume as afinidades do anticorpo e os valores t1/2 contra HLA-G wt e degrafted conforme avaliado por análise de ressonância plasmônica de superfície (Biacore).

[514] A cinética de ligação de anticorpos anti-HLA-G ao HLA-G humano e HLA-G humano degrafted (desenxertado) foi investigada por ressonância plasmônica de superfície usando um instrumento BIACORE T200 (GE Healthcare). Todas os experimentos foram realizadas a 25ºC usando tampão PBS (pH 7,4 + Tween20 0,05%) como tampão de corrida e tampão PBS (+ BSA a 0,1%) como tampão de diluição. Os anticorpos anti-Fc humano (JIR009-005-098, Jackson) ou anti-Fc de rato (JIR112-005-071, Jackson) ou anti-Fc de camundongo (JIR115-005-071, Jackson) foram imobilizados em um chip Sensor CM5 Série S (GE Healthcare) em pH 5,0 usando um kit de acoplamento de amina fornecido pela GE Healthcare. Os anticorpos anti-HLA- G foram capturados na superfície levando a uma resposta de captura de 50 - 200 RU. As moléculas de HLA-G não biotiniladas foram injetadas por 180 s a 30 µL/min com concentrações de 2,5 a 800 nM (diluição seriada de 2x1:2 e 4x1:3) na superfície (fase de associação). A fase de dissociação foi monitorada durante 300-600 segundos por lavagem com tampão de corrida. A superfície foi regenerada pela injeção de H3PO4 (0,85%) por 60 + 30 segundos para anticorpos de captura anti-Fc humano, glicina pH 1,5 por 60 segundos e glicina pH 2,0 por 60 segundos para anticorpos de captura anti-Fc de rato, H3PO4 (0,85%) por 80 + 60 segundos para anticorpos de captura anti-Fc de camundongo. Diferenças no índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo a resposta obtida a partir de uma superfície da amostra simulada (branco). As injeções da amostra em branco são subtraídas (= dupla referenciação). As curvas derivadas foram ajustadas a um modelo de ligação de Langmuir 1:1 usando o software BIAevaluation (“-” na tabela acima indica que nenhuma ligação pôde ser detectada).

[515] Em um experimento adicional, os seguintes anticorpos de referência (obtidos de diferentes fornecedores comerciais) foram comparados para ligação ao MHC I HLA-G monomérico humano (SEQ ID NO: 43 (“HLA-G- 0003”)) e HLA-G humano “degrafted” com posições específicas de consenso

HLA-A (SEQ ID NO: 44 (“HLA-G-0007”)): MEM/G9, 87G, G233, 2A12, 4H84, 5A6G7, 6D463, 9-1F10, MEM-G/1, MEM- G/11, MEM-G/2 E MEM-G/4 (“-” INDICA LIGAÇÃO NÃO DETECTÁVEL). Antígeno Anticorpo ka (1/Ms) kd (1/s) t 1/2 (Min) KD (M) MEM/G9 1,5E+05 1,1E-03 10 7,7E-09 87G - - - - G233 1,8E+05 3,7E-03 3 2,0E-08 2A12 - - - - 4H84 - - - - 5A6G7 - - - - HLA-G wt (SEQ ID NO: 43) (monômero) 6D463 - - - - 9-1F10 - - - - MEM-G/1 - - - - MEM-G/11 7,4E+04 8,5E-04 14 1,2E-08 MEM-G/2 - - - - MEM-G/4 - - - - Antígeno Anticorp ka kd t 1/2 KD o (1/Ms) (1/s) (Min) (M) MEM/G9 1,2E+05 3,6E- 0,3 3,0E- 02 07 87G - - - - G233 - - - - 2A12 - - - - 4H84 - - - - HLA-A consenso no HLA-G degrafted (SEQ ID NO: 44) 5A6G7 - - - - 6D463 - - - - 9-1F10 - - - - MEM-G/1 - - - - MEM- 8,9E+04 1,2E- 10 1,3E- G/11 03 08 MEM-G/2 - - - - MEM-G/4 - - - -

[516] Interessantemente, a maior parte dos anticorpos medidos não mostrou qualquer ligação específica ao MHC I HLA-G monomérico humano (SEQ ID NO: 43 (“HLA-L-0003”)), incluindo também o anticorpo 87G. A ligação às formas oligoméricas do HLA-G, conforme descrito na literatura, pode ser impulsionada pela avidez devido ao aumento dos sítios de ligação das formas oligoméricas.

[517] Apenas o anticorpo MEM/G9 com um valor KD de afinidade de ligação de 7,7E-09 M, o anticorpo G233 com um valor KD de 2,0E-08 M e MEM-G/11 com um valor KD de afinidade de ligação de 1,2E-08 M mostrou ligação ao complexo MHC I HLA-G monomérico humano wt. No entanto, um desses anticorpos MEM-G/11 também mostrou alguma ligação/reatividade cruzada ao consenso HLA-A no HLA-G degraft (SEQ ID NO: 44). Além disso, outro anticorpo (MEM/G9) também mostrou ligação inespecífica mais forte ao consenso de HLA-A no HLA-G ‘degraft’ (SEQ ID NO: 44).

EXEMPLO 4 A) INIBIÇÃO DA LIGAÇÃO AO RECEPTOR (COM HLA-G MONO-, DI- E TRIMÉRICO): ELISA DE BLOQUEIO DE ILT-2 E ILT-4

[518] Placas revestidas com estreptavidina (Nunc, MicroCoat #11974998001) foram revestidas com 25 µL/poço de HLA-G humano wt biotinilado a uma concentração de 500-1000 ng/mL e incubadas a 4ºC durante a noite. Após a lavagem (3x90 µL/poço com tampão PBST), foram adicionadas amostras de 25 µL de anti-HLA-G em concentrações decrescentes começando em 10 ou 3 µg/mL, depois diluídas em etapas de 1:3 ou 1:2 e incubadas 1h em temperatura ambiente. Após lavagem (3x90 µL/poço com tampão PBST) foram adicionados 25 µL/poço de receptor ILT-2 recombinante marcado com c-myc a uma concentração de 200 ng/mL e a placa foi incubada durante 1 h à temperatura ambiente. Após a lavagem (3x90 µL/poço com tampão PBST) foram adicionados 25 µL/poço de anticorpo de cabra anti-c-myc-POD (Bethyl # A190-104P 1: 7000 em PBST + 0,5% BSA) ou anti Fcγ humano POD (JIR, 109- 036 -098, 1: 8000 em PBST + 0,5% BSA) e as placas foram incubadas à temperatura ambiente por 1 h em um agitador. Após a lavagem (3 x 90 µL/poço com tampão PBST), foram adicionados 25 µL/poço de substrato TMB (Roche: 11835033001) e as placas foram incubadas até uma medição de OD 2 – 3. A medição ocorreu em um instrumento Tecan Safire 2 no comprimento de onda de 370/492 nm.

% de inib. ILT2 % de inib. ILT4 Candidato (3 µg/mL de anticorpo) (3 µg/mL de anticorpo) HLA-G-0031 72,8 39,8 HLA-G-0039 14,0 23,9 HLA-G-0041 17,4 18,4 HLA-G-0090 100 Não testado

[519] A tabela acima resume a extensão do bloqueio de ILT-2 e ILT-4 de diferentes anticorpos ligados a HLA-G a uma concentração de 3 µg/mL, em relação a uma interação HLA-G:receptor que não está bloqueada.

HLA-G-0090 foi testado em um experimento separado para bloqueio de ILT2, o bloqueio de ILT4 não foi avaliado. B) COMPARAÇÃO BIOQUÍMICA DE ANTICORPOS ANTI-HLA-G PARA SUAS PROPRIEDADES DE INIBIÇÃO DE LIGAÇÃO A ILT2 E 4 USANDO UMA CONFIGURAÇÃO DE

ENSAIO DIFERENTE

[520] O ensaio ELISA foi preparado revestindo o ILT2 e ILT4 marcados com Fc, respectivamente, em placas de microtitulação Maxisorp.

Após as etapas de incubação e lavagem, os respectivos anticorpos foram adicionados a uma concentração de 100 nM. Adicionou-se aos poços HLA-G monomérico, dimérico ou trimérico marcado com His solúvel. Após as etapas de incubação e lavagem, a detecção do receptor ligado foi realizada por conjugados anti-anticorpo-His POD. A porcentagem de inibição (%) foi calculada em comparação com os valores obtidos dos poços com ILT2/4 +

HLA-G (mono-, di- ou trimérico) sem anticorpos anti HLA-G ou ILT2/4 (100% de ligação = 0% de inibição).

% de inibição da ligação de ILT2 % de inibição da ligação de ILT4 Anticorpo monômero dímero trímero monômero dímero trímero HLAG-0031 101 99 100 17 54 68 HLAG-0039 -450 25 70 -224 -105 -43 HLAG-0041 -437 23 67 -184 -113 -39 HLAG-0090* 92 100 99 31 31 47 MEM-G/9 -442 1 4 -14 -44 -40 87G -49 19 29 13 18 14 G233 12 -132 3 -898 -20 58 anti-ILT2/ILT4 113 100 101 44 60 60

[521] As tabelas acima resumem o bloqueio de interação entre proteínas HLA-G (monômero e oligômeros) para seus receptores ILT2 e ILT4 registrada pelos anticorpos HLA-G descritos a uma concentração de 110nM (*HLA-G-0090 foi testado a uma concentração de 44nM) conforme avaliado por ELISA. São mostradas as % de inibições da interação HLA-G/receptor (para ILT2 e ILT4). A inibição menos pronunciada de ILT4 depende da principal interação dependente de ß2M desse receptor.

[522] Os gráficos de barras nas Figuras 4a e b mostram a % de inibição alcançada pelos anticorpos anti-HLA-G descritos em comparação com os anticorpos disponíveis comercialmente. Os anticorpos HLA-G disponíveis comercialmente 87G, MEM/G09 e G233 não bloqueiam a interação HLA- G/ILT2 ou ILT4 de maneira tão eficaz como os anticorpos aqui descritos. Além disso, em alguns casos os anticorpos comercialmente disponíveis levam a uma maior ligação do HLA-G ao ILT2 ou ILT4 após ligação.

C) INIBIÇÃO DA LIGAÇÃO DE CD8A AO HLA-G POR ANTICORPOS ANTI-HLA-G

[523] As placas de 384 poços revestidas com estreptavidina foram bloqueadas com 30 µL/poço de solução de bloqueio. A solução de bloqueio preparada pela diluição de álcool polivinílico a 5% (PVA, Sigma #

P8136) e polivinilpirrolidona a 8% (PVP, Sigma # PVP360) 1:10 no bloco T20 inicial (Thermo Scientific # 37543) adicionando 3,5 mL de PVA + 3,5 mL e PVP a 35mL de Bloco T20 inicial. 30 µL de HLA-G biotinilado (3 µg/mL) diluído em solução de bloqueio foram adicionados a cada poço e a placa foi incubada à temperatura ambiente durante 1 hora em um agitador.

Os poços foram lavados

3 vezes com 100 µL de PBS (PAN Biotech # P04-36500) contendo Tween-20 a

0,1% (Merck # 8.22184.500). Os poços foram então incubados com 30 µL de anticorpos anti-HLA-G diluídos em tampão de bloqueio em triplicatas durante 1 hora à temperatura ambiente em um agitador e depois lavados 3 vezes com

100 µL de PBS contendo Tween-20 a 0,1%. CD8a recombinante (Sino

Biological # 10980-H08H, reconstituído e armazenado por 1 semana a 4ºC) foi diluído em solução de bloqueio (1,25 µg/mL), e 30 µL foram adicionados a todos os poços e incubados por 2 horas à temperatura ambiente em um agitador.

Os poços foram lavados 3 vezes com 100 µL de PBS contendo

Tween-20 a 0,1%. O anticorpo IgG anti rato anti-CD8a de rato policlonal conjugado com HRP (USBiological # 033547-HRP) foi diluído em 3% de Fração

V de albumina de soro bovino (Roche # 10735086001)/PBS 0,2% de Tween20 e 30 µL desta diluição foram adicionados a cada poço.

A placa foi então incubada durante 1 hora à temperatura ambiente em um agitador e lavada 3 vezes com 100 µL de PBS contendo Tween-20 a 0,1%. 30 µL de substrato

TMB (BM-Blue, substrato HRP solúvel, Roche # 11484281001) foram então adicionados a cada poço seguido por 25 minutos de incubação à temperatura ambiente em um agitador.

A reação foi então interrompida adicionando 25 µL de ácido sulfúrico a cada poço e a absorbância foi medida a 450 nM em um leitor de placas.

A ligação específica de CD8a ao HLA-G foi calculada subtraindo a média dos valores de fundo da média dos valores de ligação.

A ligação total de CD8 ao HLA-G na ausência de anticorpos foi considerada

100% de ligação ou 0% de inibição.

[524] O gráfico de barras nas Figuras 4c mostra a % de inibição alcançada pelos anticorpos anti-HLA-G descritos em comparação com os anticorpos disponíveis comercialmente. Os anticorpos para HLA-G comercialmente disponíveis, 87G, não bloqueiam a interação HLA-G/CD8a, enquanto MEM/G09 e G233 inibem parcialmente a interação de HLA-G com CD8a em comparação com os anticorpos descritos nesta configuração.

EXEMPLO 5 LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-HLA-G ÀS CÉLULAS A) ELISA DE LIGAÇÃO AO HLA-G NA SUPERFÍCIE CELULAR

[525] 25 µL/poço de células JEG3 (expressando naturalmente HLA-G, 20000 células/poço), células Skov-3 ou células Skov-3 que expressam HLA-G recombinante na superfície celular (ambas 10000 células/poço) foram semeadas em placas de cultura de tecidos de 384 poços tratadas (Corning, 3701) e incubadas a 37ºC durante a noite. No dia seguinte, 12,5 µL de amostras de anti-HLA-G (diluição final 1: 3) foram adicionados e os poços foram incubados por 2h a 4ºC. As células foram fixadas por adição de 50 µL/poço de glutaraldeído a uma concentração final de 0,05 % (Sigma nº de Cat.: G5882; Lote Nº: 056K5318). Após lavagem (3x90 µL/poço com tampão PBST) 25 µL/poço de anticorpo de cabra anti-camundongo H+L-POD (Biorad # 170-6561, 1: 2000 em OSEP) ou anticorpo de burro anti-IgG de coelho POD (GE # NA9340V, 1: 5000 em OSE) foram adicionados e incubados à temperatura ambiente durante 1 h em agitador. Para a detecção de IgGs de rato, foi adicionada uma mistura de anticorpo de cabra anti-IgG1-de rato POD (Bethyl # A110-106P), anticorpo de cabra anti-IgG2a de rato POD (Bethyl # A110-109P) e anticorpo de cabra anti-IgG2b de rato POD (Bethyl # A110-111P) 1:10000 em OSEP e a mistura foi incubada à temperatura ambiente por 1 h em agitador. Após a lavagem (4 x 90 µL/poço com tampão PBST), foram adicionados 25 µL/poço de substrato TMB (Roche: 11835033001) e as placas foram incubadas até uma medição de OD 2 – 3. A medição ocorreu em um instrumento Tecan Safire 2 no comprimento de onda de 370/492 nm. + wt PA-TU- HLA-G+ PA-TU- Anticorpo Jeg3 wt Skov3 HLA-G Skov3 8902 8902 HLA-G-0031 +++ - +++ - +++ HLA-G-0039 +++ + +++ - +++ HLA-G-0041 +++ ++ +++ - +++ HLA-G-0090 +++ - +++ - +++

[526] A tabela acima resume a ligação de diferentes anticorpos monoclonais de rato anti-HLA-G humano ao HLA-G expresso em diferentes células e linhagens celulares avaliadas por análise FACS. É descrita a ligação a células tumorais JEG3 que expressam HLA-G naturalmente ou a transfectantes Skov3 ou PA-TU-8902 e as respectivas células parentais não transfectadas.

B) LIGAÇÃO DE ANTICORPOS HLA-G ÀS CÉLULAS EXPRESSANDO HLA-G NATURALMENTE OU DE FORMA RECOMBINANTE (CONFORME AVALIADO POR ANÁLISE FACS)

[527] Para a análise de citometria de fluxo, as células foram coradas com mAbs anti HLA-G a 4ºC. Resumidamente, 25 µL/poço de cada suspensão de células (5x104 células/poço) foram transferidos para uma placa de polipropileno de 96 poços com fundo em V e pré-resfriada no refrigerador a 5ºC por 10 min. As amostras anti-HLA-G foram diluídas em tampão de coloração para uma concentração inicial de 2 vezes de 80 µg/mL. Foi realizada uma diluição em série de 4 vezes dos anticorpos e 25 µL/poço da solução de anticorpo foram adicionados às células preparadas e incubadas durante 1 h a 5ºC. As células foram lavadas duas vezes com tampão de coloração 200 µL/poço e centrifugadas a 300g durante 3min. Para detecção o anticorpo antiespécie marcado com fluorescência (cabra anti-IgG rato (H+L) conjugado com Alexa 488, Life technologies # A11006; ou cabra anti-IgG de camundongo (H+L), Life technologies # A11001) ou cabra anti-IgG humana (H+L) conjugado com Alexa 488, Life technologies # A11013) foi diluído a 20 µg/mL em tampão de coloração e os sedimentos de células foram ressuspensos em 50 µL/poço de anticorpo de detecção. Após incubação por 1 hora em gelo, as células foram novamente lavadas por duas vezes com tampão de coloração, resuspensas em 70 μL de tampão de coloração e medidas em um FACS Canto II.

[528] Uma coloração FACS exemplar para os anticorpos anti- HLA-G HLA-G 0031, HLA-G 0039, HLA-G 0041 e HLA-G 0090 é fornecida nas sobreposições de FACS da Figura 4.

EXEMPLO 6 ANTICORPOS ANTI HLA-G INIBEM/MODULAM A LIGAÇÃO DE ILT2 AO HLA-G EXPRESSO EM CÉLULAS JEG3

[529] Para análise, células JEG3 (ATCC HTB36) foram coradas com proteínas de fusão ILT2-Fc (controle = sem inibição) com ou sem pré- incubação com diferentes anticorpos anti-HLA-G. Para a pré-incubação com anticorpos anti-HLA-G, 25 µL/poço da suspensão de células foram transferidos para uma placa de polipropileno de 96 poços com fundo em V e pré-resfriada a 4ºC por 10 min. Anticorpos anti-HLA-G ou anticorpos de referência (G233, MEM-G/9 ou 87G) foram diluídos em tampão de coloração para uma concentração de 2 vezes de 80 µg/mL e 25 µL/poço da solução de anticorpo foram adicionados às células preparadas e incubadas por 1h a 5ºC. As células foram lavadas duas vezes com 200 µL/poço de tampão de coloração com centrifugação a 300g durante 3 min e finalmente ressuspensas em 25 µL/poço de tampão de coloração.

[530] A detecção da proteína quimérica ILT2-Fc humana (RD #

2017-T2-050) para a) células JEG3 pré-incubadas com mAb anti HLA-G ou b) células JEG3 não tratadas como referência foi determinada da seguinte forma: Resumidamente, o ILT2-Fc ou IgG humana de controle (Jackson-Immuno- Research # 009-000-003) foram diluídos em tampão de coloração para uma concentração de 2 vezes de 20 µg/mL (ILT2) e 25 µL/poço da solução de proteína ILT2-Fc foram adicionados às células preparadas e incubadas por 2h a 5ºC. As células foram novamente lavadas duas vezes com tampão de coloração a 200 µL/poço, a proteína ILT2-Fc humana foi detectada com anticorpo anti-Fc-gama de IgG humana específico marcado com fluorescência (Fragmento F(ab')2 de cabra anti-IgG humana, específico para fragmento Fcγ- FITC, Jackson-Immuno-Research # 109-096-008) a uma diluição de 10 µg/mL em tampão de coloração. Os sedimentos celulares foram resuspensos em 50 µL/poço de anticorpo de detecção. Após uma incubação de 1 hora a 5ºC, as células foram lavadas duas vezes com tampão de coloração, ressuspensas em 70 µL e medidas em um FACS Canto II para determinar a ligação de ILT2 a células JEG 3.

[531] Como controle, os anticorpos anti-HLA-G ligados às células pré-incubadas JEG-3 foram detectados usando anticorpo anti-espécie (cabra anti-IgG de rato (H+L) conjugado com Alexa 488, (Life technologies # A11006), ou cabra anti-IgG de camundongo (H+L) Alexa 488, (Life technologies, # A11001) a uma concentração de 10 µg/mL.

[532] O gráfico na Figura 5 mostra a capacidade respectiva de diferentes anticorpos HLA-G para modificar a interação e ligação de ILT2 recombinante ao HLA-G naturalmente expresso em células tumorais JEG3.

[533] A tabela a seguir resume os resultados dos experimentos.

A ligação dos anticorpos anti-HLA-G às células JEG3 é descrita como + = ligação fraca - +++ = ligação forte. A capacidade dos anticorpos anti-HLA-G é de inibir/bloquear ou aumentar a ligação de ILT2 às células JEG3 que expressam HLA-G. Na última coluna, a ligação do ILT2 recombinante às células ou a inibição/bloqueio do mesmo é mostrada/quantificada (a coloração de ILT2-Fc na ausência de um anticorpo anti-HLA-G foi definida como 100% de ligação que corresponde a 0% inibição, um valor negativo indica uma ligação ainda maior; diferenças de sinal de coloração abaixo de 5% não foram significativas e categorizadas como sem efeito): Ligação sobre Inibição da ligação de ILT2 às Anticorpo Interação HLA-G:ILT2 células JEG-3 células Jeg3 sem mAb 0% de inibição =100% - - (controle) ligação 95,1 % HLA-G-0031 +++ inibe a ligação de ILT2 inibição aumenta a ligação de -72,9 % (=aumento/estímulo da HLA-G-0039 +++ ILT2 ligação ILT2) aumenta a ligação de -76,7 % (=aumento/estímulo da HLA-G-0041 +++ ILT2 ligação ILT2) 91,8 % HLA-G-0090 +++ inibe a ligação de ILT2 inibição 2,3 % 87G ++ sem efeito significante inibição -27,9 % (=aumento/estímulo da MEM-G/9 +++ inibe a ligação de ILT2 ligação ILT2) -55,8% (=aumento/estímulo da G233 +++ inibe a ligação de ILT2 ligação ILT2) EXEMPLO 7 ENSAIO DE RESTAURAÇÃO DE CITOCINAS DE MONÓCITOS (APÓS SUPRESSÃO MEDIADA POR HLA-G)

[534] O seguinte ensaio de cocultura de células que expressam HLA-G com monócitos foi utilizado para a caracterização funcional dos diferentes anticorpos monoclonais de rato anti-HLA-G humano. Monócitos periféricos humanos foram isolados a partir do sangue de doadores saudáveis.

Resumidamente, o sangue foi coletado em tubos contendo um agente anticoagulante e diluído 1:2 em PBS. Para isolar as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) 30mL da mistura foram transferidos para cada tubo Leucosep com meio de separação pré-preenchido. A banda PBMC específica foi coletada após 12min de centrifugação (1200 x g sem freio do rotor), lavada três vezes com PBS e centrifugada por 10min a 300 x g. Finalmente, os sedimentos (pellets) celulares foram ressuspensos em tampão MACS da Miltenyi e os monócitos humanos foram isolados das PBMCs por meio de separação magnética com o kit Monocyte Isolation Kit II da Miltenyi (# 130-091- 153) de acordo com as instruções do fabricante (seleção negativa). Os monócitos isolados foram ressuspensos em meio de cultura de células primárias (RPMI 1640, PAN # P04-17500 suplementado com 10% de SBF, Gibco # 10500; 2mM L-glutamina, Sigma # G7513; 1mM de piruvato de sódio, Gibco # 11360; Aminoácidos não essenciais MEM, Gibco # 11140; 0,1 mM de 2-Mercaptoetanol, Gibco # 31350; Vitaminas MEM, Gibco # 11120; Penicilina estreptomicina, Gibco # 15140) a uma densidade de 5x10 5 células/mL. O enriquecimento de células CD14+ CD16+ foi monitorado por citometria de fluxo e a expressão de ILT2 e ILT4 das células foi analisada. Para o ensaio de cocultura dos monócitos enriquecidos com células que expressam HLA-G, as células JEG-3 ((ATCC HTB36) foram semeadas um dia antes do ensaio em uma placa de cultura de tecido de fundo plano de 96 poços com células 8x103/poço em 100 µL em meio de cultura para JEG-3 (MEM Eagle com EBSS e L-glutamina, PAN # P04-00509 suplementado com 10% de SBF, Gibco # 10500; Piruvato de sódio a 1 mM, Gibco # 11360; Aminoácidos não essenciais MEM Gibco # 11140) para formar uma camada confluente no dia do ensaio. .

Em alguns experimentos uma linhagem de célula JEG-3 com nocaute para HLA-G foi usada e semeada como as células JEG-3 wt, conforme descrito acima. As células JEG-3 aderentes foram pré-incubadas com uma diluição em série de 4 vezes de anticorpos anti-HLA-G em meio de cultura de células primárias. Portanto, o sobrenadante das células JEG-3 aderentes foi removido e 50 µL/poço da solução de anticorpo preparada foram adicionados e incubados a 37ºC e 5% de CO2 em uma atmosfera umidificada por 1 h. Os monócitos humanos foram adicionados às células JEG-3 pré-incubadas com anticorpos anti HLA-G com 2,5x104 monócitos humanos/poço em 50 µL de meio de cultura de células primárias e a cocultura foi incubada a 37ºC e 5% de CO2 em uma atmosfera umidificada durante a noite (aprox. 18-20 horas). No dia seguinte, uma estimulação de LPS com 50 ng/mL de LPS foi realizada por 7h e, em seguida, o sobrenadante da cocultura foi coletado. A concentração de TNF-alfa do sobrenadante de cocultura foi determinada usando o ELISA para TNF-alfa humano Ready-SET-Go!® da eBioscience (# 88-7346-88).

[535] As tabelas abaixo resumem as características funcionais de determinados anticorpos para HLA-G para um doador específico em diferentes características de anticorpos.

[536] Tabelas: Anticorpos Anti-HLA-G funcionais são capazes de restaurar uma resposta imune suprimida de forma específica por HLA-G, ou seja, a restauração da produção de TNFα induzida por LPS por monócitos em cocultura com células expressando HLA-G.

[537] Percentagem % de liberação (restauração) de TNF de anticorpos anti-HLA-G funcionais

[538] Os anticorpos anti-HLA-G funcionais são capazes de induzir a resposta imune (restaurar uma resposta suprimida), ou seja, restaurar da produção de TNFα induzida por LPS pelos monócitos em cocultura com células que expressam HLA-G (para o controle negativo da indução de TNFα específica por HLA-G foi usada uma linhagem de células com nocaute de HLA- G a fim de distinguir se os anticorpos não mostram indução de TNF (aqueles verdadeiramente específicos para HLA-G) ou mostram uma indução de TNF nas linhas de células com nocaute (que não podem ser específicos para HLA- G).

[539] Os valores da % de indução de TNF de anticorpos anti- HLA-G são calculados com a seguinte condição: cocultura não tratada de células JEG3 e monócitos = 0%, cultura apenas de monócitos (sem supressão induzida por HLA-G) = 100%. JEG-3 JEG-3 tipo JEG-3 Linhagem HLAG JEG-3 JEG-3 JEG-3 selvagem JEG-3 wt HLAG JEG-3 wt de células nocaute HLAG ko HLAG ko wt (wt) ko (ko) Anticorpo HLAG- HLAG- HLAG- HLAG- anti-HLA- 87G 87G G223 G223 0031 0031 0041 0041

G 40 µg/mL -20% 275% 12% 53% 86% 150% 154% 144% 10 µg/mL 6% 216% 16% 41% 40% 85% 50% 104% 2,5 µg/mL -40% 170% -13% 63% 3% 38% 29% 63% 0,63 -23% 83% -18% 34% -8% 20% 5% 33% µg/mL 0,16 -29% 23% -1% 43% -12% 25% 0% 20% µg/mL não 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% tratado apenas 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% monócito

[540] A partir da tabela acima, torna-se claro que os anticorpos da presente invenção foram capazes de induzir uma liberação de TNF alfa na cocultura de monócitos com células JEG-3 expressando HLA-G, embora não fossem capazes de induzir uma liberação de TNF alfa em monócitos cocultivados com células JEG-3 com um nocaute de HLA-G.

[541] A partir da tabela, torna-se claro que os anticorpos de referência não são verdadeiramente específicos para HLA-G, uma vez que induzem forte liberação de TNF alfa também nas linhagens de células com nocaute de HLA-G.

[542] Dependendo do doador (doador abaixo diferente), a porcentagem de liberação (restauração) de TNF varia. JEG-3 tipo JEG-3 tipo JEG-3 tipo Linhagem de células selvagem (wt) selvagem (wt) selvagem (wt) Anticorpo anti-HLA-G HLAG-0090 HLAG-0031 HLAG-0041 40 µg/mL 214% 77% 10 µg/mL 221% 74% 40%

JEG-3 tipo JEG-3 tipo JEG-3 tipo Linhagem de células selvagem (wt) selvagem (wt) selvagem (wt) 2,5 µg/mL 233% 67% 59% 0,63 µg/mL 219% 44% 66% 0,16 µg/mL 198% 14% 44% não tratada 0% 0% 0% Apenas monócito 100% 100% 100% EXEMPLO 8 GERAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS QUE SE LIGAM AO HLA-G HUMANO E AO CD3 HUMANO (ANTI-HLA-G/CD3)

TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE

[543] Foram usados métodos padronizados para manipular o DNA conforme descrito em Sambrook, J. et al, “Molecular cloning: A laboratory manual”; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989. Os reagentes para a biologia molecular foram utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes.

SÍNTESE DE GENES E OLIGONUCLEOTÍDEOS

[544] Os segmentos de genes desejados foram preparados por síntese química na Geneart GmbH (Regensburg, Alemanha). Os fragmentos de gene sintetizados foram clonados em um plasmídeo de E. coli para propagação/amplificação. As sequências de DNA dos fragmentos de genes subclonados foram verificadas pelo sequenciamento de DNA. Alternativamente, fragmentos de DNA sintéticos curtos foram montados pelo anelamento de oligonucleotídeos sintetizados quimicamente ou via PCR. Os respectivos oligonucleotídeos foram preparados pela metabion GmbH (Planegg- Martinsried, Alemanha).

DESCRIÇÃO DO PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO EM MAMÍFEROS PADRÃO/BÁSICO

[545] Para a expressão de um gene/proteína desejada (por exemplo, cadeia pesada de anticorpo ou cadeia leve de anticorpo), uma unidade de transcrição compreendendo os seguintes elementos funcionais foi usada: - o facilitador (enhancer) e promotor precoce imediato a partir do citomegalovírus humano (P-CMV) incluindo o íntron A, - uma região 5' não traduzida (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana, - uma sequência sinal de cadeia pesada de imunoglobulina murina, - um gene/proteína a ser expresso (por exemplo, cadeia pesada de anticorpo de comprimento total ou molécula MHC classe I), e - a sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH pA).

[546] Ao lado da unidade/cassete de expressão incluindo o gene que se pretende expressar, o plasmídeo de expressão em mamífero básico/padrão contém: - uma origem de replicação a partir do vetor pUC18 que permite a replicação deste plasmídeo em E. coli; e - um gene beta-lactamase que confere resistência à ampicilina em E. coli.

DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS

[547] A concentração de proteína de polipeptídeos purificados foi determinada por meio da medição da densidade óptica (OD) a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos do polipeptídeo.

GERAÇÃO DE PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO PARA ANTICORPOS BIESPECÍFICOS MONOCLONAIS RECOMBINANTES

[548] Os genes do anticorpo monoclonal recombinante codificam as respectivas cadeias pesada e leve de imunoglobulina.

[549] Os plasmídeos de expressão para a expressão transitória das moléculas de anticorpo monoclonal compreendia além do cassete de expressão da cadeia pesada ou leve de imunoglobulina, uma origem de replicação do vetor pUC18 que permite a replicação deste plasmídeo em E.

coli, e um gene da beta-lactamase que confere resistência a ampicilina em E.

coli.

[550] A unidade de transcrição de uma respectiva cadeia pesada ou leve de anticorpo compreendia os seguintes elementos funcionais: - o facilitador (enhancer) e promotor precoce imediato a partir do citomegalovírus humano (P-CMV) incluindo o íntron A, - uma região 5' não traduzida (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana, - uma sequência sinal de cadeia pesada de imunoglobulina murina, - um ácido nucleico codificando uma sortase A de S. aureus truncada N-terminalmente, e - a sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH pA).

EXPRESSÃO TRANSITÓRIA E CARACTERIZAÇÃO ANALÍTICA

[551] A produção recombinante foi realizada pela transfecção transitória de células HEK293 (linha de células derivadas de rim embrionário humano 293) cultivadas em meio F17 (Invitrogen Corp.). Para a produção de anticorpos monoclonais, as células foram cotransfectadas com plasmídeos contendo as respectivas cadeias pesada e leve de imunoglobulina. Para a transfecção foi utilizado o reagente de transfecção “293-Fectin” (Invitrogen). As transfecções foram efetuadas seguindo as instruções do fabricante. Os sobrenadantes da cultura de células foram coletados três a sete (3-7) dias após a transfecção. Os sobrenadantes foram armazenados em baixa temperatura (por exemplo, -80ºC).

[552] Informações gerais sobre a expressão recombinante de imunoglobulinas humanas em células HEK293 são fornecidas, por exemplo, em: Meissner, P., et al, Biotechnol.. Bioeng. 75(2001) 197-203.

[553] Usando os métodos descritos acima para técnicas de DNA recombinante, a geração de plasmídeos de expressão para anticorpos monoclonais recombinantes e expressão transitória e caracterização analítica, os seguintes anticorpos biespecíficos que se ligam ao HLA-G humano e ao CD3 humano foram produzidos e analisados:

[554] Anticorpos biespecíficos que ligam ao HLA-G humano e ao CD3 humano (Anti-HLA-G/CD3) (SEQ ID NOs de regiões variáveis VH/VL e regiões hipervariáveis (HVRs) de sítios de ligação ao antígeno que se ligam ao HLA-G humano e de sítios de ligação ao antígeno que se ligam ao CD3 humano): Sítio de ligação ao antígeno Anti- HVR-H1 HVR-H2 HVR-H3 HVR-L1 HVR-L2 HVR-L3 VH VL

HLAG

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID HLA-G-0031 NO: 1 NO: 2 NO: 3 NO: 4 NO: 5 NO: 6 NO: 7 NO: 8 HLA-G-0031- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID 0104 (variante NO: 1 NO: 2 NO: 3 NO: 4 NO: 5 NO: 6 NO: 33 NO: 34 humanizada de HLA-G-0031) (HLA-G-0104)

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID HLA-G-0090 NO: 25 NO: 26 NO: 27 NO: 28 NO: 29 NO: 30 NO: 31 NO: 32 Sítio de ligação HVR-H1 HVR-H2 HVR-H3 HVR-L1 HVR-L2 HVR-L3 VH VL ao antígeno anti- CD3 CH2527 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 56 NO: 57 NO: 58 NO: 59 NO: 60 NO: 61 NO: 62 NO: 63

[555] Anticorpos biespecíficos que se ligam ao HLA-G humano e ao CD3 humano (anticorpo biespecífico anti-HLA-G/anti-CD3): SEQ ID NOs das cadeias de anticorpos biespecíficos compreendidas em tal anticorpo biespecífico anti-HLA-G/anti-CD3 (com base nas respectivas regiões variáveis VH/VL de sítios de ligação a antígeno que se ligam ao HLA-G humano e sítios de ligação ao antígeno que se ligam ao CD3 humano): - P1AA1185 (baseado no HLA-G-0031 e CH2527): - SEQ ID NO: 64 cadeia leve 1 P1AA1185; - SEQ ID NO: 65 cadeia leve 2 P1AA1185; - SEQ ID NO: 66 cadeia pesada 1 P1AA1185; - SEQ ID NO: 67 cadeia pesada 2 P1AA1185; - P1AA1185-104 (baseado no HLA-G-0031-0104 e CH2527): - SEQ ID NO: 68 cadeia leve 1 P1AA1185-104; - SEQ ID NO: 69 cadeia leve 2 P1AA1185-104; - SEQ ID NO: 70 cadeia pesada 1 P1AA1185-104; - SEQ ID NO: 71 cadeia pesada 2 P1AA1185-104; - P1AD9924 (baseado no HLA-G-0090 e CH2527): - SEQ ID NO: 72 cadeia leve 1 P1AD992; - SEQ ID NO: 73 cadeia leve 2 P1AD992; - SEQ ID NO: 74 cadeia pesada 1 P1AD992; e - SEQ ID NO: 75 cadeia pesada 2 P1AD992.

EXEMPLO 9 LIGAÇÃO DO ANTICORPO BIESPECÍFICO DE CÉLULAS T (TCB) ANTI-CD3/ANTI- HLA- G NATURAL OU RECOMBINANTE EXPRESSO EM CÉLULAS (CONFORME AVALIADO POR ANÁLISE FACS)

[556] A capacidade de ligação do mAb anti-HLA-G TCB ao HLA- G expresso em diferentes células e linhagens de células foi avaliada por análise FACS. É descrita a ligação a células tumorais JEG3 que expressam HLA-G naturalmente ou a transfectantes Skov3 ou PA-TU-8902 e as respectivas células parentais não transfectadas.

[557] Para a análise de citometria de fluxo, as células foram coradas com mAbs TCB anti-HLA-G a 4ºC. Resumidamente, 25 µL/poço de cada suspensão de células (5x104 células/poço) foram transferidos para uma placa de polipropileno de 96 poços com fundo em V e pré-resfriada no refrigerador a 5ºC por 10 min. As amostras anti-HLA-G foram diluídas em tampão de coloração para uma concentração inicial de 2 vezes de 80 µg/mL.

Foi realizada uma diluição em série de 4 vezes dos anticorpos e 25 µL/poço da solução de anticorpo foram adicionados às células preparadas e incubadas durante 1 h a 5ºC. As células foram lavadas duas vezes com tampão de coloração 200 µL/poço e centrifugadas a 300g durante 5min. Em seguida, os sedimentos celulares foram ressuspensos em 25 µL de tampão de coloração.

Para a detecção de anticorpo antiespécie marcado com fluorescência (burro anti-IgG humana (H+L) conjugado com PE, Jackson Immuno Research # 709- 116-149) foi diluído 1:100 em tampão de coloração e 25 µL/poço de anticorpo de detecção foi adicionado à suspensão de células. Após incubação por 1 hora em gelo, as células foram novamente lavadas por duas vezes com tampão de coloração, resuspensas em 70 μL de tampão de coloração e medidas em um FACS Canto II. Os resultados da ligação de P1AA1185 são mostrados na Figura 7.

EXEMPLO 10 ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T MEDIADA POR ANTICORPO BIESPECÍFICO ANTI-HLA- G/ANTI-CD3 T DE CÉLULAS T (TCB)

[558] A capacidade do TCB anti-HLA-G para ativar células T na presença de células tumorais que expressam HLA-G foi testada em células SKOV3 transfectadas com HLA-G recombinante (SKOV3HLAG). A ativação de células T foi avaliada por análise FACS de marcadores de ativação de superfície celular CD25 e marcador de ativação precoce CD69 em células T. Resumidamente, PBMCs foram isoladas a partir do sangue periférico humano por centrifugação em gradiente de densidade usando tubos de meio de separação de linfócitos (PAN # P04-60125). As células PBMC e SKOV3HLAG foram semeadas em uma proporção de 10:1 em placas de fundo U de 96 poços. A cocultura foi então incubada com HLAG-TCB em diferentes concentrações, conforme descrito na Figura 8 e incubada por 24 horas a 37ºC em uma incubadora com 5% de CO2. No dia seguinte, a expressão de CD25 e CD69 foi medida por citometria de fluxo.

[559] Para análise de citometria de fluxo, as células foram coradas com camundongo Anti-CD8 Humano - PerCP-Cy5.5 (BD Pharmingen # 565310), camundongo anti-CD25 Humano - PE (eBioscience # 9012-0257) e CAamundongo Anti-CD69 humano - APC (BD Pharmingen # 555533) a 4ºC.

Resumidamente, os anticorpos foram diluídos para uma concentração de 2 vezes e 25 µL de diluição de anticorpo foram adicionados em cada poço com 25 µL de coculturas pré-lavadas. As células foram coradas durante 30 min a 4ºC e lavadas duas vezes com tampão de coloração 200 µL/poço e centrifugação a 300g durante 5 min. Os sedimentos celulares foram ressuspensos em 200 µL de tampão de coloração e corados com DAPI para discriminação de células mortas / vivas a uma concentração final de 2 µg/mL.

As amostras foram então medidas usando o citômetro de fluxo BD LSR. A análise de dados foi realizada usando o software FlowJo V.10.1. As médias geométricas das intensidades de fluorescência foram exportadas e a proporção das médias geométricas para o isotipo e anticorpo foi calculada. Ambos os anticorpos biespecíficos anti-HLA-G/anti-CD3 de células T biespecíficos (TCB), P1AA1185 e P1AD9924, induziram a ativação de células T.

EXEMPLO 11 SECREÇÃO DE IFN GAMA MEDIADA POR ANTICORPO BIESPECÍFICO ANTI-HLA- G/ANTI-CD3 T DE CÉLULAS T (TCB)

[560] A capacidade do TCB anti-HLA-G em induzir a secreção de IFN gama na presença de células tumorais que expressam HLA-G foi testada em células SKOV3 transfectadas com HLA-G recombinante (SKOV3HLAG) e células JEG3 expressando endogenamente HLA-G. A secreção de IFN gama foi detectada pela tecnologia Luminex. Para medição da secreção de IFN gama por células T após o tratamento com TCB, coculturas de PBMCs e células SKOV3HLAG ou células JEG3 foram incubadas com TCB anti-HLAG.

Resumidamente, PBMCs foram isoladas a partir do sangue periférico humano por centrifugação em gradiente de densidade usando tubos de meio de separação de linfócitos (PAN # P04-60125). As células PBMC e SKOV3HLAG foram semeadas em uma proporção de 10:1 em placas de fundo U de 96 poços. A cocultura foi então incubada com HLAG-TCB em diferentes concentrações, conforme mostrado na Figura 9 e incubada por 24 horas a 37ºC em uma incubadora com 5% de CO2. No dia seguinte, os sobrenadantes foram coletados e a secreção de IFN gama foi medida usando o kit Milliplex MAP (tecnologia Luminex) de acordo com as instruções do fabricante. Ambos os anticorpos biespecíficos de células T (TCB) anti-HLA-G/anti-CD3, P1AA1185 e P1AD9924, induziram a secreção de IFN gama pelas células T.

EXEMPLO 12 INDUÇÃO DE CITOTOXICIDADE MEDIADA POR CÉLULAS T/MORTE DE CÉLULAS TUMORAIS POR ANTICORPO BIESPECÍFICO DE CÉLULAS T (TCB) ANTI-HLA-G/ANTI- CD3

[561] A capacidade do TCB anti-HLA-G em induzir a citotoxicidade mediada por células T na presença de células tumorais que expressam HLA-G foi testada em células SKOV3 transfectadas com HLA-G recombinante (SKOV3HLAG) e células JEG3 expressando endogenamente HLA-G. A citotoxicidade foi detectada medindo a ativação da Caspase 8 em células após o tratamento com TCB HLAG. Para a medição da ativação da Caspase 8 após o tratamento com TCB, coculturas de células PBMCs e células SKOV3HLAG ou células JEG3 foram incubadas com TCB anti-HLAG por 24 ou

48 horas e a ativação da caspase8 foi medida usando o kit Caspase8Glo (Promega, # G8200). Resumidamente, PBMCs foram isoladas a partir do sangue periférico humano por centrifugação em gradiente de densidade usando tubos de meio de separação de linfócitos (PAN # P04-60125). Células PBMC e SKOV3HLAG foram semeadas a uma proporção de 10:1 (100 µL por poço) em placas de fundo escuro de 96 poços. A cocultura foi então incubada com HLAG-TCB em diferentes concentrações, conforme mostrado na Figura 10 e incubada por 24 horas ou 48 horas a 37ºC em uma incubadora com 5% de CO2. No dia seguinte, 100 µL de substrato Caspase8 Glo foram adicionados a cada poço e colocados em um agitador por 1 hora em temperatura ambiente. A luminescência foi medida em uma máquina BioTek Synergy 2. As unidades de luminescência relativa (RLUs) correspondendo à ativação/citotoxicidade de Caspase8 estão representadas no gráfico (Fig. 10). Ambos os anticorpos biespecíficos de células T (TCB) anti-HLA-G/anti-CD3, P1AA1185 e P1AD9924, induziram citotoxicidade mediada por células T/morte de células tumorais por anticorpos biespecíficos TCB anti-HLA-G/anti-CD3 (P1AA1185 e P1AD9924) em células SKOV3 e JEG3 que expressam HLA-G EXEMPLO 13

EFICÁCIA ANTITUMORAL IN VIVO POR ANTICORPO BIESPECÍFICO DE CÉLULAS T (TCB) ANTI-HLA-G/ANTI-CD3 EM CÉLULAS CARCINOMA DE OVÁRIO HUMANO SKOV3 TRANSFECTADAS COM HLAG RECOMBINANTE (SKOV3 HLAG)

COENXERTADAS COM PBMCS HUMANAS

[562] Camundongos NSG (NOD/scid/IL-2Rγnull) (n = 10) foram injetados por via subcutânea com 5x106 células SKOV3 HLAG em um volume total de 100 µL. Uma vez que os tumores atingiram um volume médio de 300 mm3, 1x107 PBMCs humanas foram injetadas por camundongo em um volume total de 200 µL. Sete dias após a injeção de PBMC, os camundongos foram randomizados e tratados com HLAG TCB (5 mg/kg) duas vezes por semana.

Como controle, um grupo de camundongos recebeu injeções i.v. bissemanais de tampão de histidina (veículo). O volume do tumor foi medido duas vezes por semana até o término do estudo.

Os resultados do experimento estão apresentados na Figura xx.

Os resultados mostram o intervalo mediano e interquartil (IQR) do volume do tumor de 10 camundongos, medido com um paquímetro nos diferentes grupos de estudo.

Ambos os anticorpos biespecíficos de células T (TCB) anti-CD3/anti-HLA-G, P1AA1185 e

P1AD9924, exibiram forte inibição do crescimento tumoral, com P1AD9924 mostrando remissão completa dos tumores.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. ANTICORPO MULTIESPECÍFICO que se liga ao HLA-G humano e ao CD3 humano, caracterizado por compreender uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga ao HLA-G humano e uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga ao CD3 humano, e - em que o anticorpo multiespecífico não reage de forma cruzada com um complexo MHC I ß2M HLA-G humano modificado (em que os aminoácidos específicos do HLA-G foram substituídos por aminoácidos de consenso HLA-A) compreendendo a SEQ ID NO: 44.

2. ANTICORPO MULTIESPECÍFICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo ser biespecífico; e - em que a primeira porção de ligação ao antígeno do anticorpo que se liga ao HLA-G humano compreende: A) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou B) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 11; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou C) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 19; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou D) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 27; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; - e em que a segunda porção de ligação ao antígeno, que se liga a um antígeno de ativação de célula T liga-se ao CD3 humano, e compreende: E) (a) um domínio VH compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 58; e (b) um domínio VL compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61.

3. ANTICORPO biespecífico, de acordo com a reivindicação

2, caracterizado pela primeira porção de ligação ao antígeno: A) vii) compreender uma sequência VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 8; viii) ou a variante humanizada da VH e VL do anticorpo de (i); ou ix) compreender uma sequência VH de SEQ ID NO: 33 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 34; ou B) compreender uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16; ou C) compreender uma sequência VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 24; ou D) compreender uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32; - e em que a segunda porção de ligação ao antígeno; E) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 62 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 63.

4. ANTICORPO biespecífico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que: - a primeira porção de ligação ao antígeno compreende i) uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32; ou ii) uma sequência VH de SEQ ID NO: 33 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 34; - e a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 62 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 63.

5. ANTICORPO MULTIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo anticorpo:

a) não reagir de forma cruzada com o complexo MHC I ß2M

HLA-A2 humano compreendendo a SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 37; e/ou b) não reagir de forma cruzada com um complexo MHC I ß2M

H2Kd de camundongo compreendendo a SEQ ID NO: 45; e/ou c) não reagir de forma cruzada com o complexo MHC I ß2M

RT1A de rato compreendendo a SEQ ID NO: 47; e/ou d) inibir a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G monomérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43); e/ou e) inibir a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G trimérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43), em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 60%) (quando comparado com a ligação sem anticorpo); e/ou f) inibir a ligação de ILT2 ao complexo MHC I ß2M HLA-G monomérico e/ou dimérico e/ou trimérico (compreendendo a SEQ ID NO: 43)

em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%) (quando comparado com a ligação sem anticorpo); e/ou g) inibir a ligação de ILT2 às células JEG3 (ATCC Nº.

HTB36)

(HLA-G) (em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%))

(quando comparada com a ligação sem anticorpo); e/ou h) ligar-se às células (HLA-G) JEG3 (ATCC Nº.

HTB36)

(consulte o Exemplo 5) e inibe a ligação de ILT2 às células JEG-3 (HLA-G)

(ATCC Nº.

HTB36) (em mais de 50% (em um exemplo de realização em mais de 80%)) (quando comparada com a ligação sem anticorpo); e/ou i) inibir a ligação de CD8a ao HLAG em mais de 80% (quando comparada à ligação sem anticorpo), e/ou j) restaurar a resposta imune suprimida específica para HLA-

G por monócitos cocultivados com células JEG-3 (ATCC HTB36); e/ou k) induzir a citotoxicidade mediada por células T na presença de células tumorais que expressam HLAG (por exemplo, células JEG-3 (ATCC HTB36).

6. ANTICORPO MULTIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pela primeira e segunda porção de ligação ao antígeno serem moléculas Fab.

7. ANTICORPO MULTIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pela segunda porção de ligação ao antígeno ser uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1, particularmente os domínios variáveis VL e VH, da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos entre si.

8. ANTICORPO MULTIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pela primeira porção de ligação ao antígeno ser uma molécula Fab, na qual no domínio constante o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat); e no domínio constante CH1 o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

9. ANTICORPO MULTIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pela primeira e segunda porções de ligação ao antígeno estarem fundidas entre si,

opcionalmente por um peptídeo ligante.

10. ANTICORPO MULTIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pela primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno serem, cada uma, moléculas Fab, e em que (i) a segunda porção de ligação ao antígeno está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno, ou (ii) a primeira porção de ligação ao antígeno está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno.

11. ANTICORPO MULTIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado por compreender uma terceira porção de ligação ao antígeno.

12. ANTICORPO MULTIESPECÍFICO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela terceira porção de antígeno ser idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno.

13. ÁCIDO NUCLEICO isolado, caracterizado por codificar o anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.

14. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

15. ANTICORPO MULTIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado por ser para uso no tratamento do câncer.