TW201945394A - 多特異性抗體及其用途 - Google Patents

多特異性抗體及其用途 Download PDF

Info

Publication number
TW201945394A
TW201945394A TW108113353A TW108113353A TW201945394A TW 201945394 A TW201945394 A TW 201945394A TW 108113353 A TW108113353 A TW 108113353A TW 108113353 A TW108113353 A TW 108113353A TW 201945394 A TW201945394 A TW 201945394A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
hvr
antigen
Prior art date
Application number
TW108113353A
Other languages
English (en)
Inventor
史蒂芬 丹格爾
舍貝斯俊 芬
詹斯 費雪
克勞蒂亞 柯斯騰費德
史蒂芬 克勞斯特曼
喬治 莫嫩肯
喬治 蒂芬泰勒
亞歷山大 布喬茲克
梅荷 麥傑提
西爾克 克屈納
Original Assignee
瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 filed Critical 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Publication of TW201945394A publication Critical patent/TW201945394A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明係關於結合至HLA-G及T細胞活化抗原之多特異性抗體、其製備、調配物及其使用方法。

Description

多特異性抗體及其用途
本發明係關於結合至HLA-G及T細胞活化抗原之多特異性抗體、其製備、調配物及其使用方法。
人類主要組織相容性複合體I類6亦稱為人類白血球抗原G (HLA-G)，其係人類中由HLA-G基因編碼之蛋白質。HLA-G屬HLA非典型I類重鏈同種同源物。此I類分子係由重鏈及輕鏈(β-2微球蛋白)組成之異二聚體。重鏈錨定在膜中，但亦可脫落/分泌。
• 重鏈由三個結構域組成：α1、α2及α3。α1及α2結構域形成側接兩個α螺旋之肽結合槽。小肽(約9聚體)可類似於其他MHC I蛋白結合至此槽。
• 第二鏈係β2微球蛋白，其類似於其他MHC I蛋白結合至重鏈。
對於HLA-G，存在7個同種型，3個為分泌形式且4個為膜結合形式(如圖1中示意性所顯示)。
HLA-G可形成功能活性複雜寡聚物結構(Kuroki, K等人 Eur J Immunol. 37 (2007) 1727-1729)。在兩個HLA-G分子之Cys 42之間形成二硫鍵聯之二聚體。(Shiroishi M等人，J Biol Chem 281 (2006) 10439-10447。三聚體及四聚體複合體亦已闡述於以下中：例如Kuroki, K等人 Eur J Immunol. 37 (2007) 1727-1729, Allan D.S.等人 J Immunol Methods. 268 (2002) 43-50及T Gonen-Gross等人，J Immunol 171 (2003)1343-1351)。
HLA-G主要在胎盤中之細胞滋養層上表現。若干腫瘤(包括胰臟、乳房、皮膚、結腸直腸、胃及卵巢)表現HLA-G (Lin, A.等人，Mol Med. 21 (2015) 782-791；Amiot, L.等人，Cell Mol Life Sci. 68 (2011) 417-431)。亦已報導，該表現與如發炎性疾病、GvHD及癌症等病理狀況相關。已報導HLA-G之表現與癌症較差預後相關。腫瘤細胞經由HLA-G表現藉由誘導免疫耐受/抑制而逃逸宿主免疫監督。
HLA-G與其他MHC I分子具有高同源性(＞98%)，因此難以產生對其他MHC I分子無交叉反應性之真正HLA-G特異性抗體。
先前闡述與HLA-G以不同方式相互作用之某些抗體：Tissue Antigens, 55 (2000) 510-518係關於單株抗體，例如87G及MEM-G/9；Neoplasma 50 (2003) 331-338係關於識別完整HLA-G寡聚複合體(例如87G及MEM-G9)以及無HLA-G之重鏈(例如4H84、MEM-G/1及MEM-G/2)之某些單株抗體；Hum Immunol. 64 (2003) 315-326係關於在表現HLA-G之JEG3腫瘤細胞上測試之若干抗體(例如MEM-G/09及-G/13，其僅與天然HLA-G1分子反應)。MEM-G/01識別(類似於4H84 mAb)所有同種型之變性HLA-G重鏈，而MEM-G/04識別選擇性變性之HLA-G1、-G2及-G5同種型；Wiendl等人Brain 2003 176-85係關於不同單株HLA-G抗體，如例如87G、4H84、MEM-G/9。
上述出版物報導結合至人類HLA-G或人類HLA-G/ß2M MHC複合體之抗體。然而，由於HLA家族之高多型性及高同源性，大部分抗體無真正特異性HLA-G結合性質且通常亦與其他HLA家族成員結合或交叉反應(呈具有ß2M之MHC複合體形式或呈其無ß2M形式)或其僅僅不抑制HLA-G ß2M MHC複合體與其受體ILT2及/或ILT4之結合(且被認為係非拮抗性抗體)。
結合至靶細胞上之表面抗原及T細胞上之活化T細胞抗原(例如CD3)的雙特異性抗體(本文中亦稱作T細胞雙特異性抗體或「TCB」)對各種癌症之治療持有很大希望。該抗體與其兩個靶之同時結合將迫使靶細胞與T細胞之間進行暫時相互作用，從而使得T細胞受體交聯及隨後活化任何細胞毒性T細胞及隨後溶解靶細胞。鑒於其在靶細胞殺死中之功效，靶標之選擇及靶向抗體之特異性對於T細胞雙特異性抗體係至關重要的，以避免靶上及脫靶毒性。細胞內蛋白(例如WT1)代表有吸引力之靶標，但僅可及T細胞受體(TCR)樣抗體，該等抗體結合衍生自細胞表面上之細胞內蛋白的主要組織相容性複合體(MHC)呈遞肽抗原。TCR樣抗體之固有問題係與MHC分子本身或除期望者外之呈遞肽之MHC分子的潛在交叉反應，此可能損害器官或組織選擇性。
本發明提供結合至人類HLA-G及T細胞活化抗原(特定而言人類CD3)之多特異性抗體，其包含結合至人類HLA-G之第一抗原結合部分及結合至T細胞活化抗原(特定而言人類CD3)之第二抗原結合部分。
在一個態樣中，結合至人類HLA-G及人類CD3之多特異性抗體(其包含結合至人類HLA-G之第一抗原結合部分及結合至人類CD3之第二抗原結合部分)不與包含SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合體(其中HLA-G特異性胺基酸由HLA-A共有胺基酸置換)交叉反應。
在本發明之一個實施例中，多特異性抗體係雙特異性的；且
結合至人類HLA-G之第一抗原結合部分抗體包含
A) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或
B) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；或
C) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；或
D) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；
且結合至T細胞活化抗原之第二抗原結合部分結合至人類CD3，且包含
E) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:58之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之HVR-L3。
在本發明之一個實施例中，第一抗原結合部分
A)
i) 包含SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列；
ii) 或i)下之抗體之VH及VL的人類化變體；或
iii) 包含SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列；或
B)
包含SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列；或
C)
包含SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列；或
D)
包含SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列；
且第二抗原結合部分
E)
包含SEQ ID NO:62之VH序列及SEQ ID NO:63之VL序列。
在本發明之一個實施例中，
第一抗原結合部分包含i) SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列；或ii) SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列；
且第二抗原結合部分
包含SEQ ID NO:62之VH序列及SEQ ID NO:63之VL序列。
在本發明之一個實施例中，多特異性抗體
a) 不與包含SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
b) 不與包含SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
c) 不與包含SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
d) 不與包含SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
e) 抑制ILT2與單體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合；及/或
f) 抑制ILT2與三聚體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合超過50% (在一個實施例中超過60 %) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例4b)；及/或
g) 抑制ILT2與單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合超過50% (在一個實施例中超過80 %) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例4b)；及/或
h) 抑制ILT2與JEG3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G)之結合(超過50 % (在一個實施例中超過80%)) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例6)；及/或
i) 結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G) (參見實例5)，且抑制ILT2與JEG-3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G)之結合(超過50 % (在一個實施例中超過80%)) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例6)；及/或
j) 抑制CD8a與HLAG之結合超過80% (當與無抗體之結合相比時) (參見例如實例4c)；及/或
k) 恢復與JEG-3細胞(ATCC HTB36)共培養之單核球的HLA-G特異性抑制之免疫反應(例如，抑制之腫瘤壞死因子(TNF) α釋放)；及/或
l) 在表現HLAG之腫瘤細胞(例如JEG-3細胞(ATCC HTB36))存在下誘導T細胞介導之細胞毒性(參見實例12)。
在本發明之一個實施例中，第一及第二抗原結合部分係Fab分子(各自係Fab分子)。
在本發明之一個實施例中，第二抗原結合部分係Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變結構域VL及VH或恆定結構域CL及CH1、特定而言可變結構域VL及VH由彼此置換。
在本發明之一個實施例中，第一抗原結合部分係Fab分子，其中在恆定結構域中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且位置123之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在本發明之一個實施例中，第一及第二抗原結合部分視情況經由肽連接體彼此融合。
在本發明之一個實施例中，第一及第二抗原結合部分各自係Fab分子且其中(i) 第二抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端，或(ii) 第一抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至第二抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端。
在本發明之一個實施例中，多特異性抗體包含第三抗原結合部分。
在本發明之一個實施例中，該第三抗原部分與該第一抗原結合部分相同。
在本發明之一個實施例中，多特異性抗體包含由第一及第二亞單元組成之Fc結構域。
在本發明之一個實施例中，第一、第二及(若存在)第三抗原結合部分各自係Fab分子；且其中(i) 第二抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端且第一抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之第一亞單元之N-末端，或(ii) 第一抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至第二抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端且第二抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之第一亞單元之N-末端；且其中第三抗原結合部分(若存在)在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之第二亞單元之N-末端。
本發明提供編碼根據以下技術方案中之任一者之抗體的經分離之核酸。
本發明提供包含該核酸之宿主細胞。
本發明提供產生抗體之方法，其包含培養該宿主細胞以使得產生抗體。
本發明提供產生抗體之該方法，其進一步包含自宿主細胞回收抗體。
本發明提供包含本文所述抗體及醫藥上可接受之載劑的醫藥調配物。
本發明提供本文所述抗體，其用作藥劑。
本發明提供本文所述抗體，其用於治療癌症。
本發明提供本文所述抗體在製造藥劑中之用途。在一個實施例中，該醫藥係用於治療癌症。
本發明提供治療患有癌症之個體之方法，其包含向個體投與有效量之本文所述抗體。
利用本文所述篩選方法，可選擇新抗HLA-G抗體。該等抗體顯示高度有價值之性質，如強烈抑制ILT2與JEG3細胞上表現之HLA-G之結合或抑制ILT2與單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合體之結合。
此外，本發明之抗體能夠恢復HLA-G特異性抑制之免疫反應，即恢復由與表現HLA-G之細胞共培養之單核球的LPS誘導之TNFa產生。
另外，抗體具有高度特異性且顯示不與小鼠或大鼠來源之HLA-A MHC I複合體或MHC I複合體交叉反應。
術語「HLA-G」、「人類HLA-G」在本文中使用時係指HLA-G人類主要組織相容性複合體I類G，亦稱為人類白血球抗原G (HLA-G) (實例性SEQ ID NO: 35)。通常，HLA-G與β2微球蛋白(B2M或β2m)一起形成MHC I類複合體。在一個實施例中，HLA-G係指HLA-G及β2微球蛋白之MHC I類複合體。
如本文所用，「結合至人類HLA-G (binding to human HLA-G)」、「特異性結合至人類HLA-G」、「結合至人類HLA-G (that binds to human HLA-G)」之抗體或「抗HLA-G抗體」係指以5.0 × 10-8 mol/l或更低之KD 值、在一個實施例中1.0 × 10-9 mol/l或更低之KD 值、在一個實施例中5.0 × 10-8 mol/l至1.0 × 10-13 mol/l之KD 值的結合親和性特異性結合至人類HLA-G抗原或其細胞外結構域(ECD)的抗體。在一個實施例中，抗體結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體。
結合親和性係利用標準結合分析(例如表面電漿共振技術(BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Sweden))例如使用包含HLA-G細胞外結構域(例如呈其天然3維結構)之構築體測定。在一個實施例中，結合親和性係利用標準結合分析使用包含含有SEQ ID NO: 43之MHC I類複合體的實例性可溶性HLA-G測定。
HLA-G具有規則MHC I摺疊且由兩條鏈組成：鏈1由三個結構域組成：α 1、α 2及α 3。α 1及α 2結構域形成側接兩個α螺旋之肽結合槽。小肽(約9聚體)可類似於其他MHCI蛋白結合至此槽。鏈2係與各種其他MHCI蛋白共用之β 2微球蛋白。
HLA-G可形成功能活性複雜寡聚物結構(Kuroki, K等人 Eur J Immunol. 37 (2007) 1727-1729)。在兩個HLA-G分子之Cys 42之間形成二硫鍵聯之二聚體。(Shiroishi M等人，J Biol Chem 281 (2006) 10439-10447)。三聚體及四聚體複合體亦已闡述於以下中：例如Kuroki, K等人 Eur J Immunol. 37 (2007) 1727-1729, Allan D.S.等人 J Immunol Methods. 268 (2002) 43-50及T Gonen-Gross等人，J Immunol 171 (2003)1343-1351)。與大部分其他MHC I類分子不同，HLA-G具有若干游離半胱胺酸殘基。Boyson等人，Proc Nat Acad Sci USA, 99: 16180 (2002)報導，重組可溶性形式之HLA-G5可與分子間Cys42-Cys42二硫鍵形成二硫鍵聯之二聚體。另外，膜結合形式之HLA-G1亦可在Jeg3細胞系之細胞表面上形成二硫鍵聯之二聚體，該Jeg3細胞系內源表現HLA-G。亦已在滋養層細胞之細胞表面上發現二硫鍵聯之二聚體形式之HLA-G1及HLA-G5 (Apps, R., Tissue Antigens, 68:359 (2006))。
HLA-G主要在胎盤中之細胞滋養層上表現。若干腫瘤(包括胰臟、乳房、皮膚、結腸直腸、胃及卵巢)表現HLA-G (Lin, A.等人，Mol Med. 21 (2015) 782-791；Amiot, L.等人，Cell Mol Life Sci. 68 (2011) 417-431)。亦已報導該表現與如發炎性疾病、GvHD及癌症等病理狀況相關。已報導HLA-G之表現與癌症中較差預後相關。腫瘤細胞經由HLA-G表現藉由誘導免疫耐受/抑制而逃逸宿主免疫監督。
對於HLA-G，存在7個同種型，3個為分泌形式且4個為膜結合形式(如圖1中示意性顯示)。HLA-G之最重要之功能同種型包括b2-微球蛋白相關之HLA-G1及HLA-G5。然而，該等同種型之致耐受性免疫效應係不同的且取決於配體之形式(單體、二聚體)及配體-受體相互作用之親和性。
HLA-G蛋白係使用標準分子生物技術產生。HLA-G同種型之核酸序列為業內已知。例如，參見GENBANK登錄號AY359818。
HLA-G異構形式經由ILT、特定而言ILT2、ILT4或其組合促進信號轉導。
ILT：ILT表示參與免疫細胞活化之調節及免疫細胞功能之控制的Ig型活化及抑制性受體(Borges, L.等人，Curr Top Microbial Immunol, 244:123-136 (1999))。ILT分類成三組：(i) 抑制性，含有基於細胞質免疫受體酪胺酸之抑制性基序(ITIM)且轉導抑制性信號(ILT2、ILT3、ILT4、ILT5及LIR8)之彼等；(ii) 活化，在跨膜結構域中含有短胞質尾區及帶電荷之胺基酸殘基(ILT1、ILT7、ILT8及LIR6α)且經由Fc受體之相關常見γ鏈之基於細胞質免疫受體酪胺酸之活化基序(ITAM)遞送活化信號的彼等；及(iii) 無跨膜結構域之可溶性分子ILT6。許多最近研究已強調抗原呈遞細胞(APC)表面上之ILT的免疫調節作用。ILT2、ILT3及ILT4受體，即最具特徵之免疫抑制性受體，主要在髓樣及漿細胞樣DC上表現。藉由將不成熟DC暴露於已知免疫抑制因子(包括IL-10、維生素D3或CD8 T細胞之抑制因子)上調ILT3及ILT4 (Chang, C. C.等人，Nat Immunol, 3:237-243 (2002))。DC上ILT之表現由發炎刺激、細胞介素及生長因子緊密控制，且在DC活化後下調(Ju, X. S.等人，Gene, 331:159-164 (2004))。ILT2及ILT4受體之表現由組織蛋白乙醯化高度調節，該組織蛋白乙醯化促進僅在細胞之髓系中嚴格控制基因表現(Nakajima, H., J Immunol, 171:6611-6620 (2003))。
抑制性受體ILT2及ILT4之嚙合改變單核球之細胞介素及趨化介素分泌/釋放曲線且可抑制Fc受體信號傳導(Colonna, M.等人 J Leukoc Biol, 66:375-381 (1999))。ILT3對DC之作用及功能先前已由Suciu-Foca組產生(Suciu-Foca, N., Int Immunopharmacol, 5:7-11 (2005))。儘管未知ILT3之配體，但已知ILT4可結合至HLA I類分子(HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-G)之第三結構域，與CD8競爭MHC I類結合(Shiroishi, M., Proc Natl Acad Sci USA, 100:8856-8861 (2003))。若干抑制性ILT受體之優先配體係HLA-G。HLA-G在母體-胎兒耐受性及腫瘤細胞自免疫識別及破壞中逃逸之機制中起潛在作用(Hunt, J. S.等人，Faseb J, 19:681-693 (2005))。最可能的是，藉由HLA-G-ILT相互作用調節DC功能係DC之生物學中之重要路徑。已經確定，高度表現ILT2及ILT4受體之人類單核球源DC，當用HLA-G處理並用同種異體T細胞刺激時，仍然保持穩定的致耐受性樣表型(CD80低、CD86低、HLA-DR低)且具有誘導T細胞無反應力之潛力(Ristich, V.等人，Eur J Immunol, 35:1133-1142 (2005))。此外，與高度表現ILT2及ILT4受體之DC之HLA-G相互作用導致參與MHC II類呈遞之若干基因之下調。由專業APC大量表現之溶酶體硫醇還原酶、IFN-γ誘導型溶酶體核醇還原酶(GILT)在HLA-G修飾之DC中大大減少。由於靶向基因破壞後無GILT之動物中對選擇抗原之活體內T細胞反應減少，因此引發之CD4+ T細胞譜可受到GILT之DC表現之影響(Marie, M.等人，Science, 294:1361-1365 (2001))。DC上HLA-G/ILT相互作用干擾MHC II類分子之組裝及轉運至細胞表面，此可能導致結構異常之MHC II類分子之呈遞或表現效率較低。確定HLA-G顯著降低高度表現ILT抑制性受體之人類單核球源DC上之變體鏈(CD74)、HLA-DMA及HLA-DMB基因的轉錄(Ristich, V.等人；Eur J Immunol 35:1133-1142 (2005))。
HLA-G之另一受體係KIR2DL4，此乃因KIR2DL4結合至表現HLA-G之細胞(US2003232051；Cantoni, C.等人 Eur J Immunol 28 (1998) 1980；Rajagopalan, S.及E. O. Long. [出版之錯誤出現在J Exp Med 191 (2000) 2027中] J Exp Med 189 (1999) 1093；Ponte, M.等人 PNAS USA 96 (1999) 5674)。KIR2DL4 (亦稱為2DL4)係與活化及抑制性受體共享結構特徵之KIR家族成員(亦稱為CD158d) (Selvakumar, A.等人 Tissue Antigens 48 (1996) 285)。2DL4具有細胞質ITIM，表明抑制性功能，且在跨膜區域中具有帶正電荷之胺基酸，此係活化KIR之典型特徵。與其他選殖分佈之KIR不同，2DL4由所有NK細胞轉錄(Valiante, N. M.等人 Immunity 7 (1997) 739；Cantoni, C.等人 Eur J Immunol 28 (1998) 1980；Rajagopalan, S.及E. O. Long. [出版之錯誤出現在J Exp Med 191 (2000) 2027中] J Exp Med 189 (1999) 1093)。
亦已顯示HLA-G與CD8在細胞毒性T細胞上相互作用(Sanders等人，J. Exp. Med., 1991)且在活化之CD8陽性細胞毒性T細胞中誘導CD95介導之細胞凋亡(Fournel等人，J. Immun., 2000)。消除細胞毒性T細胞之此機制已報導為懷孕、發炎性疾病及癌症中免疫逃逸及誘導耐受之機制之一(Amodio G.等人，Tissue Antigens, 2014)。
如本文所用，不與包含SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合體、包含SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合體、包含SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合體、包含SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合體「交叉反應」或「特異性結合」的抗HLA-G抗體係指實質上不結合至該等反抗原中之任一者的抗HLA-G抗體。在一個實施例中，不與包含SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合體、包含SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合體、包含SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合體及/或包含SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合體「交叉反應」或「特異性結合」的抗HLA-G抗體係指僅顯示非特異性結合的抗HLA-G抗體，其中結合親和性之KD 值為5.0 × 10-6 mol/l或更高。結合親和性係利用與各別抗原之標準結合分析(例如表面電漿共振技術(BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Sweden))測定：包含SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合體：包含SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合體、包含SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合體及/或包含SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合體。分析設置以及抗原之構築/製備闡述於實例中。
術語「抑制ILT2與JEG-3細胞(ATCC HTB36)上之HLAG結合」係指抑制如例如實例6中所述之分析中之重組ILT2的結合相互作用。
術語「HLA-G特異性抑制之免疫反應之恢復」或「恢復HLA-G特異性抑制之免疫反應」係指恢復由與表現HLA-G之細胞（特定而言JEG-3細胞）共培養之單核球的脂多醣(LPS)誘導之TNFa產生。因此，與未處理之共培養之JEG-3細胞相比，本發明抗體恢復表現HLA-G之JEG-3細胞(ATCC HTB36)及單核球之共培養物中脂多醣(LPS)刺激之TNF α之HLAG特異性釋放(取未處理之共培養物作為0%陰性參考；取僅單核球培養物作為100%陽性參考，其中TNF α分泌不受任何HLA-G /IL-T2特異性效應抑制((參見實例7)。在此情況下，「HLA-G特異性抑制之免疫反應」係指由於JEG-3細胞上之HLA-G表現所致之單核球的免疫抑制。相比之下，本發明之HLA-G抗體不能恢復與HLA-G剔除之JEG3細胞共培養之單核球的免疫反應。由於其他商業抗HLA-G能夠誘發與HLA-G剔除之JEG3細胞共培養之單核球的TNF α，故存在由該等抗體引起之非HLA-G特異性TNF α釋放。
如本文所用之「活化T細胞抗原」係指在T淋巴球(特定而言細胞毒性T淋巴球)表面上表現之抗原性決定子，其能夠在與抗體相互作用時誘導T細胞活化。具體地，抗體與活化T細胞抗原之相互作用可藉由觸發T細胞受體複合體之信號傳導級聯來誘導T細胞活化。在特定實施例中，活化T細胞抗原係CD3、特定而言CD3之ε亞單元(參見UniProt no. P07766 (第189版)，NCBI RefSeq no. NP_000724.1，SEQ ID NO: 76用於人類序列；或UniProt no. Q95LI5 (第49版)，NCBI GenBank編號BAB71849.1，SEQ ID NO: 77用於食蟹猴[長尾獼猴]序列)。
除非另有說明，否則「CD3」係指任何脊椎動物來源之任何天然CD3，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)；非人類靈長類動物(例如食蟹猴猴)及齧齒類動物(小鼠及老鼠)。該術語涵蓋未經處理之「全長」 CD3以及自細胞中處理產生之任一形式的CD3。該術語亦涵蓋CD3之天然變體，例如剪接變體或對偶基因變體。在一個實施例中，CD3係人類CD3，特定而言人類CD3之ε亞單元(CD3ε)。人類CD3ε之胺基酸序列示於UniProt (www.uniprot.org)登錄編號P07766 (第189版)或NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_000724.1中。亦參見SEQ ID NO: 76。食蟹猴[長尾獼猴] CD3ε之胺基酸序列示於NCBI GenBank編號BAB71849.1中。亦參見SEQ ID NO: 77。
如本文所用，結合至人類「CD3」、「特異性結合至人類CD3」、「結合至人類CD3」之抗體或「抗CD3抗體」係指以5.0 × 10-8 mol/l或更低之KD 值、在一個實施例中1.0 × 10-9 mol/l或更低之KD 值、在一個實施例中5.0 × 10-8 mol/l至1.0 × 10-13 mol/l之KD 值的結合親和性特異性結合至人類CD3抗原或其細胞外結構域(ECD)的抗體。在一個實施例中，抗體結合至包含SEQ ID NO: 76之CD3。
結合親和性係利用標準結合分析(例如表面電漿共振技術(BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Sweden))例如使用包含HLA-G細胞外結構域(例如呈其天然3維結構)之構築體測定。在一個實施例中，結合親和性係利用標準結合分析使用包含SEQ ID NO: 76之實例性CD3來測定。
如本文所用「T細胞活化」係指T淋巴球、具體而言細胞毒性T淋巴球之選自以下之一或多種細胞反應：增殖、分化、細胞介素分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒性活性及活化標記之表現。適於量測T細胞活化之分析為業內已知且如本文所述。
出於本文目的，「受體人類框架」係包含源自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之輕鏈可變結構域(VL)框架或重鏈可變結構域(VH)框架之胺基酸序列的框架，如下文所定義。「源自」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之受體人類框架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。在一些實施例中，VL受體人類框架之序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列相同。所獲得之抗體HLAG-0031之人類化變體的較佳VH受體人類框架係HUMAN_IGHV1-3。所獲得之抗體HLAG-0031之人類化變體的較佳VL受體人類框架係HUMAN_IGKV1-17 (V-結構域，在位置R46F具有一個額外回復突變，Kabat編號)。
術語「抗體」在本文中係以最廣泛含義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其呈現期望抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體外之分子，其包含完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原的一部分。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2 、雙鏈抗體、直鏈抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)及自抗體片段形成之多特異性抗體。
「結合相同表位之抗體」(作為參考抗體)係指在競爭分析中將參考抗體與其抗原之結合阻斷50%或更高的抗體，且反之，參考抗體在競爭分析中將該抗體與其抗原之結合阻斷50%或更高。本文中提供實例性競爭分析。
術語「雙特異性」意指抗體能夠特異性結合至至少兩個不同抗原決定子。通常，雙特異性抗體包含兩個抗原結合位點，其各自特異性針對不同抗原決定子。在某些實施例中，雙特異性抗體能同時結合兩個抗原決定子，特定而言在兩個不同細胞上表現之兩個抗原決定子。
如本文所用術語「化合價」表示抗體中存在指定數目之抗原結合位點。因此，術語「單價結合至抗原」表示抗體中存在一個(且不超過一個)對抗原具有特異性之抗原結合位點。
「抗原結合位點」係指提供與抗原之相互作用之抗體之位點，即一或多個胺基酸殘基。舉例而言，抗體之抗原結合位點包含來自互補決定區(CDR)之胺基酸殘基。天然免疫球蛋白分子通常具有兩個抗原結合位點，Fab分子通常具有單一抗原結合位點。
如本文所用術語「抗原結合部分」係指特異性結合至抗原決定子之多肽分子。在一個實施例中，抗原結合部分能夠使其所連接之實體(例如第二抗原結合部分)針對靶位點(例如針對具有抗原決定子之特定類型之腫瘤細胞)。在另一實施例中，抗原結合部分能夠經由其靶抗原(例如T細胞受體複合抗原)活化信號傳導。抗原結合部分包括如本文進一步定義之抗體及其片段。特定抗原結合部分包括抗體之抗原結合結構域，其包含抗體重鏈可變區及抗體輕鏈可變區。在某些實施例中，抗原結合部分可包含如本文進一步定義且業內已知之抗體恆定區。有用之重鏈恆定區包括五種同型α、δ、ε、γ或μ中之任一者。有用之輕鏈恆定區包括兩種同型κ及λ中之任一者。
如本文所用術語「抗原性決定子」或「抗原」係指抗原結合部分結合之多肽巨分子上的位點，從而形成抗原結合部分-抗原複合體。有用之抗原決定子可(例如)在腫瘤細胞表面上、在病毒感染之細胞表面上、在其他患病細胞表面上、在免疫細胞表面上、在血清中游離及/或在細胞外基質(ECM)中發現。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源自特定源或物種、而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自不同源或物種的抗體。
抗體之「類別」係指其重鏈所擁有之恆定結構域或恆定區之類型。存在5大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，且該等類別中之若干種可進一步分成子類(同種型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效地達成期望治療或預防結果之量。
術語「Fc結構域」或「Fc區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈中含有恆定區之至少一部分的C-末端區。該術語包括天然序列Fc區及變體Fc區。儘管IgG重鏈之Fc區之邊界可能稍微變化，但人類IgG重鏈Fc區通常經定義以自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基-末端。然而，宿主細胞產生之抗體可經歷重鏈C-末端之一或多個、尤其一或兩個胺基酸之轉譯後裂解。因此，宿主細胞藉由表現編碼全長重鏈之特定核酸分子產生之抗體可包括全長重鏈，或其可包括全長重鏈之經裂解變體(本文中亦稱作裂解變體重鏈摂)。此可係重鏈之最後兩個C-末端胺基酸為甘胺酸(G446)及離胺酸(K447，根據Kabat EU索引編號)之情形。因此，Fc區之C-末端離胺酸(Lys447)或C-末端甘胺酸(Gly446)及離胺酸(K447)可存在或可不存在。若未另外指明，則包括Fc結構域(或如本文定義之Fc結構域之亞單元)之重鏈之胺基酸序列在本文中表示為不含C-末端甘胺酸-離胺酸二肽。在本發明之一個實施例中，本發明之抗體或雙特異性抗體中所包含之包括如本文中指定之Fc結構域之亞單元的重鏈包含額外C-末端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat之EU索引編號)。在本發明之一個實施例中，本發明之抗體或雙特異性抗體中所包含之包括如本文中指定之Fc結構域之亞單元的重鏈包含額外C-末端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat之EU索引編號)。本發明組合物(例如本文所述之醫藥組合物)包含本發明之抗體或雙特異性抗體之群體。抗體或雙特異性抗體之群體可包含具有全長重鏈之抗體及具有經裂解變體重鏈之抗體。抗體或雙特異性抗體之群體可由具有全長重鏈之抗體與具有經裂解變體重鏈之抗體之混合物組成，其中至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%之抗體或雙特異性抗體具有經裂解變體重鏈。在本發明之一個實施例中，包含本發明之抗體或雙特異性抗體之群體之組合物包括包含包括具有額外C-末端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat之EU索引編號)之如本文指定之Fc結構域之亞單元的重鏈之抗體或雙特異性抗體。在本發明之一個實施例中，包含本發明之抗體或雙特異性抗體之群體之組合物包括包含包括具有額外C-末端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat之EU索引編號)之如本文指定之Fc結構域之亞單元的重鏈之抗體或雙特異性抗體。在本發明之一個實施例中，該組合物包含抗體或雙特異性抗體之群體，其包括包含包括如本文所指定之Fc結構域之亞單元之重鏈之分子；包含包括如本文所指定之Fc結構域之亞單元之重鏈之分子，其具有額外C-末端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat之EU索引編號)；及包含包括如本文所指定之Fc結構域之亞單元之重鏈之分子，其具有額外C-末端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat之EU索引編號)。除非在本文中另外說明，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統(亦稱為EU索引)，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所闡述(亦參見上文)。如本文所用之Fc結構域之「亞單元」係指形成二聚體Fc結構域之兩種多肽中之一者，即包含免疫球蛋白重鏈之C-末端恆定區之多肽，其能夠穩定自我締合。舉例而言，IgG Fc結構域之亞單元包含IgG CH2及IgG CH3恆定結構域。
「框架」或「FR」係指除超變區(HVR)殘基外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常係由4個FR結構域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，HVR及FR序列通常出現於VH (或VL)中之以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，其係指結構實質上類似於天然抗體結構或具有含有如本文所定義Fc區之重鏈的抗體。
「融合」意指直接或經由一或多個肽連接體由肽鍵連接的組分(例如Fab分子及Fc結構域亞單元)。
「Fab分子」係指由免疫球蛋白之重鏈(「Fab重鏈」)之VH及CH1結構域及輕鏈(「Fab輕鏈」)之VL及CL結構域組成的蛋白質。
「交叉」 Fab分子(亦稱作「Crossfab」)意指其中Fab重鏈及輕鏈之可變結構域或恆定結構域交換(即彼此置換)之Fab分子，即交叉Fab分子包含由輕鏈可變結構域VL及重鏈恆定結構域1 CH1 (VL-CH1，在N-末端至C-末端方向上)組成之肽鏈及由重鏈可變結構域VH及輕鏈恆定結構域CL (VH-CL，在N-末端至C-末端方向上)組成之肽鏈。為清晰起見，在其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變結構域交換之交叉Fab分子中，包含重鏈恆定結構域1 CH1之肽鏈在本文中稱作(交叉) Fab分子之「重鏈」。相反，在其中Fab輕鏈及Fab重鏈之恆定結構域交換之交叉Fab分子中，包含重鏈可變結構域VH之肽鏈在本文中稱作(交叉) Fab分子之「重鏈」。
與其相反，「習用」 Fab分子意指呈其天然型式之Fab分子，即包含由重鏈可變結構域及恆定結構域(VH-CH1，在N-末端至C-末端方向上)組成之重鏈及由輕鏈可變結構域及恆定結構域(VL-CL，在N-末端至C-末端方向上)組成之輕鏈。術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指其中引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之後代。宿主細胞包括「轉變體」及「經轉變細胞」，其包括原代經轉變細胞及源自其之後代(與傳代數無關)。後代之核酸含量可與親代細胞並不完全相同，而是可含有突變。本文包括經篩選或選擇用於原始經轉變細胞中之具有相同功能或生物活性的突變體後代。
「人類抗體」係具有對應於由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體譜或其他編碼人類抗體之序列之非人類來源的抗體之胺基酸序列的胺基酸序列者。此人類抗體之定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類抗體。
「人類共有框架」係代表在選擇人類免疫球蛋白VL或VH框架序列中最普遍存在之胺基酸殘基之框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變結構域序列之亞組。通常，序列亞組係如Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，Bethesda MD (1991)，NIH公開案91-3242，第1-3卷中之亞組。在一個實施例中，對於VL，亞組係如Kabat等人(前述文獻)中之亞組κI。在一個實施例中，對於VH而言，該亞組係如Kabat等人所述之III亞組(見上文)。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上全部之至少一個、且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部之HVR (例如，CDR)對應於非人類之彼等HVR，且全部或實質上全部之FR對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區域的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已經受人類化之抗體。
如本文所使用，術語「超變區」或「HVR」係指抗體可變結構域之序列(「互補決定區」或「CDR」)超變及/或形成在結構上經定義之環(「超變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原觸點」)之區中的每一者。通常，抗體包含6個HVR：3個在VH中(H1、H2、H3)，且3個在VL中(L1、L2、L3)。本文之實例性HVR包括：
(a) 在以下胺基酸殘基出現之超變環：26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3) (Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
(b) 在以下胺基酸殘基出現之CDR：24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3) (Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
(c) 胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)及93-101 (H3)出現之抗原觸點(MacCallum等人J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；及
(d) (a)、(b)及/或(c)之組合，包括HVR胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35 (H1)、50-63 (H2)及95-102 (H3)。
除非另有指示，否則可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)在本文中係根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)編號。
「免疫偶聯物」係偶聯至一或多個異源分子(包括(但不限於)細胞毒性劑)之抗體。
「個體」(「individual」或「subject」)係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如，母牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，例如猴)、兔及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體(individual或subject)係人類。
「經分離」抗體係已與其天然環境中之組分分離者。在一些實施例中，將抗體純化至大於95%或99%之純度，如藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)所測定。關於評價抗體純度之方法之綜述，例如，參見Flatman, S.等人，J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87。
「經分離」核酸係指已與其天然環境中之組分分離之核酸分子。分離之核酸包括含於通常含有核酸分子之細胞中之核酸分子，但該核酸分子存於染色體外或存於與其天然染色體位置不同之染色體位置處。
「編碼抗HLA-G抗體之經分離核酸」係指一或多個編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之核酸分子，包括單一載體或多個單獨載體中之該(等)核酸分子及存於宿主細胞中之一或多個位置處之該(等)核酸分子。
本文所用術語「單株抗體」係指自實質上同源抗體群體獲得之抗體，亦即，包含該群體之個別抗體相同及/或結合相同表位，可能之變體抗體除外，例如，含有天然突變或在產生單株抗體製劑期間產生，此等變體通常以較小量存在。與通常包含針對不同決定子(表位)之不同抗體之多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體針對抗原上之單一決定子。因此，修飾語「單株」指示如自抗體之實質上同源之群體獲得之抗體特徵，且不應解釋為需要藉由任一特定方法產生抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製得，包括但不限於雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法及利用含有所有或一部分人類免疫球蛋白基因座之轉基因動物之方法，該等方法及用於製備單株抗體之其他實例性方法闡述於本文中。
「促進Fc結構域之第一及第二亞單元締合之修飾」係降低或防止包含Fc結構域亞單元之多肽與相同多肽締合以形成同二聚體的肽主鏈之操縱或Fc結構域亞單元之轉譯後修飾。如本文所用之促進締合之修飾特定而言包括對締合所需之兩個Fc結構域亞單元(即Fc結構域之第一及第二亞單元)中之每一者進行之單獨修飾，其中修飾彼此互補以便促進兩個Fc結構域亞單元之締合。舉例而言，促進締合之修飾可改變Fc結構域亞單元中之一者或二者之結構或電荷，以便分別使其締合在空間或靜電上有利。因此，在包含第一Fc結構域亞單元之多肽與包含第二Fc結構域亞單元之多肽之間發生(雜)二聚化，在與亞單元(例如抗原結合部分)中之每一者融合之其他組分並不相同之意義上，其可能不相同。在一些實施例中，促進締合之修飾包含Fc結構域之胺基酸突變、特定而言胺基酸取代。在特定實施例中，促進締合之修飾包含Fc結構域之兩個亞單元中之每一者之單獨胺基酸突變、特定而言胺基酸取代。
「天然抗體」係指具有不同結構之天然免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體係約150,000道爾頓之異四聚體醣蛋白，其由二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈組成。自N末端至C末端，每一重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重結構域或重鏈可變結構域，之後為三個恆定結構域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N末端至C末端，每一輕鏈具有可變區(VL) (亦稱為可變輕結構域或輕鏈可變結構域)，之後為恆定輕鏈(CL)結構域。基於抗體恆定結構域之胺基酸序列，可將該抗體之輕鏈分配為兩種類型中之一者，稱為卡帕(κ)型及拉姆達(λ)型。
術語「包裝插頁」用於指通常包括於治療產品之商業包裝內之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或關於該等治療產品之使用之警告的資訊。
就參考多肽序列而言，「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列並引入空位(視需要)以達到最大序列一致性百分比後候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。彼等熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何算法。然而，出於本文目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2來生成胺基酸序列一致性%之值。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech, Inc.設計，且源代碼已與使用者文件一起編入美國版權局(U.S. Copyright Office)，Washington D.C., 20559中，其中其以美國版權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程式可自Genentech, Inc., South San Francisco, California公開獲得，或可自源代碼進行編譯。ALIGN-2程式應經編譯用於UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)中。所有序列比較參數皆係由ALIGN-2程式設定且不改變。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，給定胺基酸序列A相對於(to)、與(with)或對(against)給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(另一選擇為可表達為相對於、與或對給定胺基酸序列B具有或包含某一胺基酸序列一致性%之給定胺基酸序列A)計算如下：
100乘以分數X/Y
其中X係在A與B之程式比對中由序列比對程式ALIGN-2評定為一致性匹配之胺基酸殘基數，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A相對於B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另有明確說明，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%的值皆係如前面緊接段落中所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「醫藥調配物」係指如下製劑：其所呈現形式允許其中所含活性成分之生物活性有效，且不含對將投與該調配物之個體具有不可接受毒性的其他組分。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外之對個體無毒之成分。醫藥上可接受之載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
本文所用「治療(treatment)」(及其語法變化形式，例如「treat」或「treating」)係指試圖改變所治療個體之自然病程的臨床干預，且可出於預防性目的或在臨床病理學過程期間實施。治療之合意效應包括(但不限於)預防疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，使用本發明抗體來延遲疾病發生或減緩疾病進展。
術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原結合之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)通常具有類似結構，其中各結構域包含4個保守框架區(FR)及3個超變區(HVR)。(例如，參見Kindt, T.J.等人Kuby Immunology , 第6版，W.H. Freeman及Co., N.Y. (2007)，第91頁) 單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體之VH或VL結構域分離以分別篩選互補VL或VH結構域文庫。參見(例如) Portolano, S.等人，J. Immunol. 150 (1993) 880-887；Clackson, T.等人，Nature 352 (1991) 624-628)。
如本文所使用，術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核酸的核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構形式之載體，以及納入引入其之宿主細胞基因組中的載體。某些載體能引導與其可操作連接之核酸之表現。該等載體在本文中稱為「表現載體」。
I.組合物及方法 在一態樣中，本發明係部分基於以下發現：如本文所述之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)使用所選抗HLA-G抗體作為第一抗原結合位點/部分。該等抗HLA-G抗體以高特異性結合至HLA-G之某些表位(與其他物種及人類HLA-A共有序列無交叉反應性)，且具有特異性抑制ILT2及或ILT4與HLA-G結合的能力。其抑制(例如) ILT2與HLA-G結合且在適當刺激(利用例如脂多醣(LPS))時藉由免疫調節性細胞介素(如TNF α)之增加分泌特異性恢復單核球的HLA-G介導之免疫抑制，且顯示對HLAG剔除細胞無效應。
同時，如本文所述之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)以第二抗原結合位點(部分)結合至T細胞活化抗原(特定而言CD3、尤其CD3ε)。
A. 實例性多特異性抗HLA-G/抗CD3抗體 在本發明之一個實施例中，多特異性抗體係結合至人類HLA-G及人類CD3之雙特異性抗體，其包含結合至人類HLA-G之第一抗原結合部分及結合至人類CD3之第二抗原結合部分。
在一個實施例中，結合至人類HLA-G之第一抗原結合部分抗體包含
A) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或
B) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；
且結合至T細胞活化抗原之第二抗原結合部分結合至人類CD3，且包含
C) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:58之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之HVR-L3。
在本發明之一個實施例中，第一抗原結合部分
A)
包含SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列；或
B)
包含SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列；
且第二抗原結合部分
C)
包含SEQ ID NO:62之VH序列及SEQ ID NO:63之VL序列。
在本發明之一個實施例中，
第一抗原結合部分包含SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列；
且第二抗原結合部分
包含SEQ ID NO:62之VH序列及SEQ ID NO:63之VL序列。
在本發明之一個實施例中，
第一抗原結合部分包含SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列；
且第二抗原結合部分
包含SEQ ID NO:62之VH序列及SEQ ID NO:63之VL序列。
在一個實施例中，結合至人類HLA-G (在一個實施例中結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)之第一結合部分包含
A) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:3之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 33之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 34之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；或
B) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；或
C) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 14之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；或
D) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 31之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列。
在一個實施例中，結合至人類HLA-G (在一個實施例中結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)之第一結合部分包含
a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:3之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；且
其中抗體以與包含SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列的抗體實質上相同之結合親和性(在一個實施例中，以與包含SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多10倍的KD值，在一個實施例中以與包含SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多5倍的KD值) (如表面電漿共振分析中所測定)結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體。
在一個實施例中，結合至人類HLA-G (在一個實施例中結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)之第一結合部分包含
a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:3之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 33之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 34之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；
其中抗體以與包含SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列的抗體實質上相同之結合親和性(在一個實施例中，以與包含SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多10倍的KD值，在一個實施例中以與包含SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多5倍的KD值) (如表面電漿共振分析中所測定)結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體，及/或
其中抗體之特徵獨立地在於以下性質：抗HLA-G抗體
a) 不與包含SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
b) 不與包含SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
c) 不與包含SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
d) 不與包含SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
e) 抑制ILT2與單體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合；及/或
f) 抑制ILT2與三聚體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合超過50% (在一個實施例中超過60 %) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例4b)；及/或
g) 抑制ILT2與單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合超過50% (在一個實施例中超過80 %) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例4b)；及/或
h) 抑制ILT2與JEG3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G)之結合(超過50 % (在一個實施例中超過80%)) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例6)；及/或
i) 結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G) (參見實例5)，且抑制ILT2與JEG-3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G)之結合(超過50 % (在一個實施例中超過80%)) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例6)；及/或
j) 抑制CD8a與HLAG之結合超過80% (當與無抗體之結合相比時) (參見例如實例4c)；及/或
k) 恢復與JEG-3細胞(ATCC HTB36)共培養之單核球的HLA-G特異性抑制之免疫反應(例如，抑制之腫瘤壞死因子(TNF) α釋放)。
在一個實施例中，結合至人類HLA-G (在一個實施例中結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)之第一結合部分與包含SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列的抗體結合至相同表位。
在一個實施例中，結合至人類HLA-G (在一個實施例中結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)之第一結合部分包含
a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:11之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；且
其中抗體以與包含SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列的抗體實質上相同之結合親和性(在一個實施例中，以與包含SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多10倍的KD值，在一個實施例中以與包含SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多5倍的KD值) (如表面電漿共振分析中所測定)結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體。
在一個實施例中，結合至人類HLA-G (在一個實施例中結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)之第一結合部分包含
a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:11之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；
其中抗體以與包含SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列的抗體實質上相同之結合親和性(在一個實施例中，以與包含SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多10倍的KD值，在一個實施例中以與包含SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多5倍的KD值) (如表面電漿共振分析中所測定)結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體，及/或
其中抗體之特徵獨立地在於以下性質：抗HLA-G抗體
a) 不與包含SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
b) 不與包含SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
c) 不與包含SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
d) 不與包含SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
e) 抑制ILT2與單體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合；及/或
f) 抑制ILT2與三聚體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合超過50% (在一個實施例中超過60 %) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例4b)；及/或
g) 抑制ILT2與單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合超過50% (在一個實施例中超過80 %) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例4b)；及/或
h) 抑制ILT2與JEG3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G)之結合(超過50 % (在一個實施例中超過80%)) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例6)；及/或
i) 結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G) (參見實例5)，且抑制ILT2與JEG-3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G)之結合(超過50 % (在一個實施例中超過80%)) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例6)；及/或
j) 抑制CD8a與HLAG之結合超過80% (當與無抗體之結合相比時) (參見例如實例4c)；及/或
k) 恢復與JEG-3細胞(ATCC HTB36)共培養之單核球的HLA-G特異性抑制之免疫反應(例如，抑制之腫瘤壞死因子(TNF) α釋放)。
在一個實施例中，結合至人類HLA-G (在一個實施例中結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)之第一結合部分與包含SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列的抗體結合至相同表位。
在一個實施例中，結合至人類HLA-G (在一個實施例中結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)之第一結合部分包含
a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:19之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；且
其中抗體以與包含SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列的抗體實質上相同之結合親和性(在一個實施例中，以與包含SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多10倍的KD值，在一個實施例中以與包含SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多5倍的KD值) (如表面電漿共振分析中所測定)結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體。
在一個實施例中，結合至人類HLA-G (在一個實施例中結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)之第一結合部分包含
a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:19之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 24之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；
其中抗體以與包含SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列的抗體實質上相同之結合親和性(在一個實施例中，以與包含SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多10倍的KD值，在一個實施例中以與包含SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多5倍的KD值) (如表面電漿共振分析中所測定)結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體，及/或
其中抗體之特徵獨立地在於以下性質：抗HLA-G抗體
a) 不與包含SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
b) 不與包含SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
c) 不與包含SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
d) 不與包含SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
e) 抑制ILT2與單體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合；及/或
f) 抑制ILT2與三聚體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合超過50% (在一個實施例中超過60 %) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例4b)；及/或
g) 抑制ILT2與單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合超過50% (在一個實施例中超過80 %) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例4b)；及/或
h) 抑制ILT2與JEG3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G)之結合(超過50 % (在一個實施例中超過80%)) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例6)；及/或
i) 結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G) (參見實例5)，且抑制ILT2與JEG-3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G)之結合(超過50 % (在一個實施例中超過80%)) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例6)；及/或
j) 抑制CD8a與HLAG之結合超過80% (當與無抗體之結合相比時) (參見例如實例4c)；及/或
k) 恢復與JEG-3細胞(ATCC HTB36)共培養之單核球的HLA-G特異性抑制之免疫反應(例如，抑制之腫瘤壞死因子(TNF) α釋放)。
在一個實施例中，結合至人類HLA-G (在一個實施例中結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)之第一結合部分與包含SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列的抗體結合至相同表位。
在一個實施例中，結合至人類HLA-G (在一個實施例中結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)之第一結合部分包含
a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:27之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；且
其中抗體以與包含SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列的抗體實質上相同之結合親和性(在一個實施例中，以與包含SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多10倍的KD值，在一個實施例中以與包含SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多5倍的KD值) (如表面電漿共振分析中所測定)結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體。
在一個實施例中，結合至人類HLA-G (在一個實施例中結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)之第一結合部分包含
a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:27之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 31之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；
其中抗體以與包含SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列的抗體實質上相同之結合親和性(在一個實施例中，以與包含SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多10倍的KD值，在一個實施例中以與包含SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多5倍的KD值) (如表面電漿共振分析中所測定)結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體，及/或
其中抗體之特徵獨立地在於以下性質：抗HLA-G抗體
a) 不與包含SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
b) 不與包含SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
c) 不與包含SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
d) 不與包含SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
e) 抑制ILT2與單體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合；及/或
f) 抑制ILT2與三聚體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合超過50% (在一個實施例中超過60 %) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例4b)；及/或
g) 抑制ILT2與單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合超過50% (在一個實施例中超過80 %) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例4b)；及/或
h) 抑制ILT2與JEG3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G)之結合(超過50 % (在一個實施例中超過80%)) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例6)；及/或
i) 結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G) (參見實例5)，且抑制ILT2與JEG-3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G)之結合(超過50 % (在一個實施例中超過80%)) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例6)；及/或
j) 抑制CD8a與HLAG之結合超過80% (當與無抗體之結合相比時) (參見例如實例4c)；及/或
k) 恢復與JEG-3細胞(ATCC HTB36)共培養之單核球的HLA-G特異性抑制之免疫反應(例如，抑制之腫瘤壞死因子(TNF) α釋放)。
在一個實施例中，結合至人類HLA-G (在一個實施例中結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)之第一結合部分與包含SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列的抗體結合至相同表位。
在一個實施例中，結合至人類CD3 (在一個實施例中結合至包含SEQ ID NO: 76之CD3)之第二結合部分包含
(a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:58之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之HVR-L3。
在一個實施例中，結合至人類CD3 (在一個實施例中結合至包含SEQ ID NO: 76之CD3)之第二結合部分包含
包含SEQ ID NO:62之VH序列及SEQ ID NO:63之VL序列。
在一個實施例中，結合至人類HLA-G (在一個實施例中結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)之第一結合部分包含
a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:58之胺基酸序列之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 62之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 63之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列。
在一個實施例中，結合至人類HLA-G (在一個實施例中結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)之第一結合部分包含
a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:58之胺基酸序列之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 62之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 63之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；
其中抗體以與包含SEQ ID NO:62之VH序列及SEQ ID NO:63之VL序列的抗體實質上相同之結合親和性(在一個實施例中，以與包含SEQ ID NO:62之VH序列及SEQ ID NO:63之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多10倍的KD值，在一個實施例中以與包含SEQ ID NO:62之VH序列及SEQ ID NO:63之VL序列的抗體相比結合親和性降低至多5倍的KD值) (如表面電漿共振分析中所測定)結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體；
多特異性抗體
在較佳實施例中，本文提供之多特異性抗體係雙特異性抗體。多特異性抗體係對於至少兩個不同位點、即不同抗原上之不同表位或相同抗原上之不同表位具有結合特異性的單株抗體。在某些實施例中，多特異性抗體具有三種或更多種結合特異性。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對HLA-G且其他(兩種或更多種)特異性係針對CD3。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至HLA-G之兩個(或更多個)不同表位。多特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段。
製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein及Cuello,Nature 305: 537 (1983))及「杵臼(knob-in-hole)」改造(例如，參見美國專利第5,731,168號及Atwell等人，J. Mol. Biol. 270:26 (1997))。多特異性抗體亦可藉由以下製得：改造靜電引導效應用於製備抗體Fc-異二聚體分子(例如，參見WO 2009/089004)；交聯兩種或更多種抗體或片段(例如，參見美國專利第4,676,980號，及Brennan等人，Science , 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鍊以產生雙特異性抗體(例如，參見Kostelny等人，J. Immunol. , 148(5):1547-1553 (1992)及WO 2011/034605)；使用常見輕鏈技術用於防止輕鏈錯配問題(例如，參見WO 98/50431)；使用「雙價抗體」技術用於製備雙特異性抗體片段(例如，參見Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:6444-6448 (1993))；及使用單鏈Fv (sFv)二聚體(例如，參見Gruber等人，J. Immunol. , 152:5368 (1994))；及如例如Tutt等人J. Immunol. 147: 60 (1991)中所述製備三特異性抗體。
本文中亦包括具有三個或更多個抗原結合位點之經改造之抗體，包括(例如) 「章魚抗體」或DVD-Ig (參見(例如) WO 2001/77342及WO 2008/024715)。具有三個或更多個抗原結合位點之多特異性抗體的其他實例可參見WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO2010/145792及WO 2013/026831。雙特異性抗體或其抗原結合片段亦包括包含結合至HLA-G以及另一不同抗原、或HLA-G之兩個不同表位的抗原結合位點之「雙重作用FAb」或「DAF」 (例如，參見US 2008/0069820及WO 2015/095539)。
多特異性抗體亦可在相同抗原特異性之一或多個結合臂中進行結構域交換、即藉由改變VH/VL結構域(例如，參見WO 2009/080252及WO 2015/150447)、CH1/CL結構域(例如，參見WO 2009/080253)或完整Fab臂(例如，參見WO 2009/080251、WO 2016/016299，亦參見Schaefer等人，PNAS, 108 (2011) 1187-1191，及Klein等人，MAbs 8 (2016) 1010-20)以不對稱形式提供。不對稱Fab臂亦可藉由向結構域界面中引入帶電或不帶電之胺基酸突變而經改造以引導正確Fab配對。參見(例如) WO 2016/172485。
多特異性抗體之各種其他分子型式為業內已知且包括於本文中(例如，參見Spiess等人，Mol Immunol 67 (2015) 95-106)。
本文中亦包括之特定類型之多特異性抗體係雙特異性抗體，其經設計以同時結合至靶細胞(例如腫瘤細胞)上之表面抗原及T細胞受體(TCR)複合體(例如CD3)之活化不變組分用於重新靶向T細胞以殺死靶細胞。因此，在某些實施例中，本文提供之抗體係多特異性抗體、特定而言雙特異性抗體，其中結合特異性中之一者係針對HLA-G且另一者係針對CD3。
可用於此目的之雙特異性抗體型式的實例包括(但不限於)所謂「BiTE」 (雙特異性T細胞銜接器)分子，其中兩個scFv分子由撓性連接體融合(例如，參見WO2004/106381、WO2005/061547、WO2007/042261及WO2008/119567，Nagorsen及Bäuerle, Expcell Res 317, 1255-1260 (2011))；雙價抗體(Holliger等人，Prot Eng 9, 299-305 (1996))及其衍生物，例如串聯雙價抗體(「TandAb」；Kipriyanov等人，J Mol Biol 293, 41-56 (1999))；「DART」 (雙重親和性再靶向)分子，其係基於雙價抗體型式，但特徵在於用於額外穩定之C-末端二硫橋(Johnson等人，J Mol Biol 399, 436-449 (2010))，及所謂三功能抗體(triomab)，其係全雜交小鼠/大鼠IgG分子(綜述於Seimetz等人，Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)中)。本文中包括之特定T細胞雙特異性抗體型式闡述於以下中：WO 2013/026833、WO2013/026839、WO 2016/020309；Bacac等人，Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498。
結合至 HLA-G 及 CD3 之雙特異性抗體
本發明亦提供雙特異性抗體，即包含能夠特異性結合至兩個不同抗原決定子(第一及第二抗原)之至少兩個抗原結合部分的抗體。
本發明者基於其研發之HLA-G抗體已研發結合至HLA-G及又一抗原(特定而言活化T細胞抗原，例如CD3)的雙特異性抗體。
如實例中所示，該等雙特異性抗體具有許多顯著性質，包括良好效能及低毒性。
因此，在某些態樣中，本發明提供雙特異性抗體，其包含(a) 結合至第一抗原之第一抗原結合部分，其中第一抗原係HLA-G，及(b) 特異性結合至第二抗原之第二抗原結合部分，其中雙特異性抗體具有以下特徵中之任一者。
本發明之雙特異性抗體尤其誘導T細胞介導之表現HLA-G之細胞的殺死。在一些實施例中，本發明之雙特異性抗體尤其誘導T細胞介導之表現HLA-G之細胞的殺死。在更具體實施例中，雙特異性抗體尤其誘導T細胞介導之表現HLA-G之細胞的殺死。
在一個實施例中，由雙特異性抗體誘導T細胞介導之殺死係使用表現HLA-G之細胞來確定。
在一個實施例中，由雙特異性抗體活化T細胞係藉由以下確定：在表現HLA-G之細胞、特定而言肽脈衝之T2細胞存在下與雙特異性抗體一起培育後，特定而言藉由流式細胞術量測由T細胞之CD25及/或CD69之表現。
在具體實施例中，由雙特異性抗體誘導T細胞介導之殺死係如下確定：
在經重組HLAG轉染之SKOV3細胞 (SKOV3HLAG)上測試在表現HLAG之腫瘤細胞存在下抗HLA-G/抗CD3 TCB活化T細胞之能力。藉由T細胞上細胞表面活化標記CD25及早期活化標記CD69之FACS分析評價T細胞之活化。簡言之，藉由密度梯度離心使用淋巴球分離介質管(PAN編號P04-60125)自人類外周血分離PBMC。將PBMC及SKOV3HLAG細胞以10 : 1之比率接種於96孔U形底部板中。隨後如實例10中所述將共培養物與HLAG-TCB以不同濃度一起培育且於37℃下在具有5% CO2 之培育器中培育24h。次日，藉由流式細胞術量測CD25及CD69之表現。
對於流式細胞術分析，於4℃下將細胞用PerCP-Cy5.5小鼠抗人類CD8 (BD Pharmingen編號565310)、PE小鼠抗人類CD25 (eBioscience編號9012-0257)及APC小鼠抗人類CD69 (BD Pharmingen編號555533)染色。簡言之，將抗體稀釋至2倍濃度且在每一孔中添加25µl抗體稀釋物與25µl預洗滌之共培養物。於4℃下將細胞染色30 min，且用200μl/孔之染色緩衝液洗滌兩次且以300g離心5 min。將細胞團顆粒重新懸浮於200μl染色緩衝液中，並用DAPI染色，在2μg/ml之終濃度下進行活死區分。然後使用BD LSR流式細胞計數器量測樣品。使用FlowJo V.10.1軟體實施數據分析。輸出平均螢光強度之幾何平均值，且計算同型及抗體之幾何平均值之比率。
本發明之雙特異性抗體在表現HLA-G之細胞存在下尤其活化T細胞。在一些實施例中，本發明之雙特異性抗體在表現HLA-G之細胞存在下尤其活化T細胞。在更具體實施例中，雙特異性抗體在表現HLA-G之細胞存在下尤其活化T細胞。
在一個實施例中，雙特異性抗原結合不顯著誘導T細胞介導之表現HLA-G之細胞之殺死，或在表現HLA-G之細胞存在下活化T細胞。在一個實施例中，雙特異性抗體誘導T細胞介導之表現HLA-G之細胞之殺死或在表現HLA-G之細胞存在下活化T細胞，其EC50比誘導T細胞介導之表現HLA-G之細胞之殺死或在表現HLA-G之細胞存在下活化T細胞的EC50低至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少75倍或至少100倍。
根據本發明之特定實施例，雙特異抗體中包括之抗原結合部分為Fab分子(即由各自包含可變結構域及恆定結構域之重鏈及輕鏈組成之抗原結合結構域)。在一個實施例中，第一及/或第二抗原結合部分係Fab分子。在一個實施例中，該Fab分子係人類Fab分子。在具體實施例中，該Fab分子係人類化的。在又一實施例中，該Fab分子包含人類重鏈及輕鏈恆定結構域。
較佳地，至少一個抗原結合部分為交叉Fab分子。該修飾減少來自不同Fab分子之重鏈與輕鏈錯配，由此改良本發明之雙特異性抗體在重組產生中之產率及純度。在可用於本發明之雙特異性抗體之特定交叉Fab分子中，Fab輕鏈及Fab重鏈(分別為VL及VH)之可變結構域交換。然而，即使在此結構域交換情況下，雙特異性抗體之製備亦可由於錯配重鏈與輕鏈之間之所謂Bence Jones型相互作用包含某些副產物(參見Schaefer等人，PNAS, 108 (2011) 11187-11191)。為了進一步減少來自不同Fab分子之重鏈及輕鏈之錯配且因此增加期望雙特異性抗體之純度及產率，可在結合至第一抗原(HLA-G)之Fab分子、或結合至第二抗原(活化T細胞抗原，例如CD3)之Fab分子之CH1及CL結構域中的特定胺基酸位置引入具有相反電荷之帶電胺基酸，如本文進一步闡述。電荷修飾係在雙特異性抗體中包括之習用Fab分子(例如，例如於圖11 A-C、G-J中所示)中、或者在雙特異性抗體中包括之VH/VL交叉Fab分子(例如，例如於圖11 D-F、K-N中所示)中進行(但並非在兩者中進行)。在特定實施例中，電荷修飾係在雙特異性抗體(在特定實施例中，其結合至第一抗原，即HLA-G)中包括之習用Fab分子中進行。
在根據本發明之特定實施例中，雙特異性抗體能同時結合至第一抗原(即HLA-G)及第二抗原(例如活化T細胞抗原，特定而言CD3)。在一個實施例中，雙特異性抗體藉由同時結合HLA-G及活化T細胞抗原能使T細胞及靶細胞交聯。在甚至更特定實施例中，該同時結合使靶細胞、特定而言表現HLA-G之腫瘤細胞溶解。在一個實施例中，該同時結合使T細胞活化。在其他實施例中，該同時結合使T淋巴球、特定而言細胞毒性T淋巴球產生選自以下之群之細胞反應：增殖、分化、細胞介素分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒性活性及活化標記之表現。在一個實施例中，雙特異性抗體與活化T細胞抗原(特定而言CD3)之結合而不同時結合至HLA-G不會引起T細胞活化。
在一個實施例中，雙特異性抗體能將T細胞之細胞毒性活性重定向至靶細胞。在特定實施例中，該重定向獨立於藉助MHC介導之靶細胞之肽抗原呈遞及/或T細胞之特異性。
特定而言，根據本發明任一實施例之T細胞係細胞毒性T細胞。在一些實施例中，T細胞係CD4+ 或CD8+ T細胞、特定而言CD8+ T細胞。
第一抗原結合部分
本發明之雙特異性抗體包含至少一個結合至HLA-G (第一抗原)之抗原結合部分、特定而言Fab分子。在某些實施例中，雙特異性抗體包含兩個結合至HLA-G之抗原結合部分、特定而言Fab分子。在該特定實施例中，該等抗原結合部分中之每一者結合至相同抗原決定子。在甚至更特定實施例中，所有該等抗原結合部分皆相同，即其包含相同胺基酸序列，包括如本文所述之CH1及CL結構域中之相同胺基酸取代(若存在)。在一個實施例中，雙特異性抗體包含不超過兩個抗原結合部分、特定而言Fab分子，其結合至HLA-G。
在特定實施例中，結合至HLA-G之抗原結合部分係習用Fab分子。在該等實施例中，結合至第二抗原之抗原結合部分係如本文所述之交叉Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變結構域VH及VL或恆定結構域CH1及CL彼此交換/置換的Fab分子。
在替代實施例中，結合至HLA-G之抗原結合部分係如本文所述交叉Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變結構域VH及VL或恆定結構域CH1及CL彼此交換/置換之Fab分子。在該等實施例中，結合第二抗原之抗原結合部分係習用Fab分子。
HLA-G 結合部分能夠將雙特異性抗體定向至靶位點，例如表現HLA-G之特定類型之腫瘤細胞。
雙特異性抗體之第一抗原結合部分可關於結合HLA-G之抗體單獨或組合納入本文所述特徵中之任一者，除非在科學上明顯不合理或不可能。
因此，在一態樣中，本發明提供雙特異性抗體，其包含(a) 結合至第一抗原之第一抗原結合部分，其中第一抗原係HLA-G且第一抗原結合部分包含如下所述之VH結構域及VL結構域。
本發明之一個實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一個實施例中，抗體結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)，其中該抗體包含
A) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或
B) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；或
C) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；或
D) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3。
本發明之一個實施例係結合至人類HLA-G之經分離抗體(在一個實施例中抗體結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)，其中抗體
A)
i) 包含SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列；
ii) 或i)下之抗體之VH及VL的人類化變體；或
iii) 包含SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列；或
B)
包含SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列；或
C)
i) 包含SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列；或
D)
i) 包含SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列。
本發明之一個實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一個實施例中，抗體結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)，其中該抗體包含
(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列。
本發明之一個實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一個實施例中，抗體結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)，其中該抗體包含
(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列。
本發明之一個實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一個實施例中，抗體結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)，其中該抗體包含
(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列。
本發明之一個實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一個實施例中，抗體結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)，其中該抗體包含
(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列。
本發明之一個實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一個實施例中，抗體結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)，其中該抗體包含
i) SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列；
ii) 或i)下之抗體之VH及VL的人類化變體。
本發明之一個實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一個實施例中，抗體結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)，其中該抗體包含
i) SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列。
本發明之一個實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一個實施例中，抗體結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)，其中該抗體包含
SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列。
本發明之一個實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一個實施例中，抗體結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)，其中該抗體包含
SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列。
本發明之一個實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一個實施例中，抗體結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)，其中該抗體包含
SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列。
本發明之一個實施例係結合至人類HLA-G之(經分離)抗體(在一個實施例中，抗體結合至包含SEQ ID NO: 43之HLA-G ß2M MHC I複合體)，其中該抗體包含
A) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:3之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 33之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 34之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；或
B) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；或
C) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 14之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；或
D) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 31之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列。
在一個實施例中，第一抗原結合部分包含人類恆定區。在一個實施例中，第一抗原結合部分係包含人類恆定區、特定而言人類CH1及/或CL結構域之Fab分子。人類恆定結構域之實例性序列於SEQ ID NO 51及52 (分別人類κ及λ CL結構域)及SEQ ID NO: 53 (人類IgG1 重鏈恆定結構域CH1-CH2-CH3)中給出。在一些實施例中，第一抗原結合部分包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 51或SEQ ID NO: 52之胺基酸序列、特定而言SEQ ID NO: 51之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。特定而言，輕鏈恆定區可包含在「電荷修飾」下如本文所述之胺基酸突變及/或可包含(若在交叉Fab分子中)一或多個(特定而言兩個) N-末端胺基酸之缺失或取代。在一些實施例中，第一抗原結合部分包含重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 53之胺基酸序列中所包括之CH1結構域序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。特定而言，重鏈恆定區(尤其CH1結構域)可包含「電荷修飾」下如本文所述之胺基酸突變。
結合至 T 細胞活化抗原、特定而言 CD3 之第二抗原結合部分
本發明之雙特異性抗體包含至少一個結合至T細胞活化抗原、特定而言CD3之抗原結合部分、特定而言Fab分子。
在特定實施例中，結合T細胞活化抗原、特定而言人類CD3之抗原結合部分係如本文所述交叉Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變結構域VH及VL或恆定結構域CH1及CL彼此交換/置換之Fab分子。在該等實施例中，結合至HLA-G之抗原結合部分較佳係習用Fab分子。在存在超過一個結合至雙特異性抗體中所包括之T細胞活化抗原、特定而言CD3的抗原結合部分、特定而言Fab分子之實施例中，結合至T細胞活化抗原、特定而言CD3之抗原結合部分較佳係交叉Fab分子且結合至HLA-G之抗原結合部分係習用Fab分子。
在替代實施例中，結合至第二抗原之抗原結合部分係習用Fab分子。在該等實施例中，結合至第一抗原(即HLA-G)之抗原結合部分係如本文所述之交叉Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變結構域VH及VL或恆定結構域CH1及CL彼此交換/置換的Fab分子。在存在超過一個結合至雙特異性抗體中所包括之第二抗原的抗原結合部分、特定而言Fab分子之實施例中，結合至HLA-G之抗原結合部分較佳係交叉Fab分子且結合至CD3之抗原結合部分係習用Fab分子。
在一些實施例中，第二抗原係活化T細胞抗原(在本文中亦稱為「活化T細胞抗原結合部分或活化T細胞抗原結合Fab分子」)。在特定實施例中，雙特異性抗體包含不超過一個能夠特異性結合至活化T細胞抗原之抗原結合部分。在一個實施例中，雙特異性抗體提供與活化T細胞抗原之單價結合。
在特定實施例中，第二抗原係CD3、特定而言人類CD3 (SEQ ID NO: 76)或食蟹猴CD3 (SEQ ID NO: 77)、最特定而言人類CD3。在一個實施例中，第二抗原結合部分對人類及食蟹猴CD3具有交叉反應性(即與其特異性結合)。在一些實施例中，第二抗原係CD3之ε亞單元(CD3 ε)。
在一個實施例中，結合至人類CD3之第二抗原結合部分包含VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之HVR-L3。
在一個實施例中，結合至人類CD3之第二抗原結合部分包含VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 62之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 63之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，第二抗原結合部分係(源自)人類化抗體。在一個實施例中，VH係人類化VH及/或VL係人類化VL。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含如上述實施例中之任一者中之CDR，且進一步包含受體人類框架，例如人類免疫球蛋白框架或人類共有框架。
在一個實施例中，結合至人類CD3之第二抗原結合部分包含與SEQ ID NO: 62之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含與SEQ ID NO: 63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列。
在一個實施例中，結合至人類CD3之第二抗原結合部分包括包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列的VL。
在一個實施例中，結合至人類CD3之第二抗原結合部分包含人類恆定區。在一個實施例中，第二抗原結合部分係包含人類恆定區、特定而言人類CH1及/或CL結構域之Fab分子。人類恆定結構域之實例性序列於SEQ ID NO 51及52 (分別人類κ及λ CL結構域)及SEQ ID NO: 53 (人類IgG1 重鏈恆定結構域CH1-CH2-CH3)中給出。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 51或SEQ ID NO: 52之胺基酸序列、特定而言SEQ ID NO: 51之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。特定而言，輕鏈恆定區可包含在「電荷修飾」下如本文所述之胺基酸突變及/或可包含(若在交叉Fab分子中)一或多個(特定而言兩個) N-末端胺基酸之缺失或取代。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 53之胺基酸序列中所包括之CH1結構域序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。特定而言，重鏈恆定區(尤其CH1結構域)可包含「電荷修飾」下如本文所述之胺基酸突變。
在一些實施例中，第二抗原結合部分係Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變結構域VL及VH或恆定結構域CL及CH1、特定而言可變結構域VL及VH彼此置換(即根據該實施例，第二抗原結合部分係交叉Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變或恆定結構域交換)。在一個該實施例中，第一(及第三，若存在)抗原結合部分係習用Fab分子。
在一個實施例中，雙特異性抗體中存在不超過一個結合至第二抗原(例如活化T細胞抗原，例如CD3)之抗原結合部分(即雙特異性抗體提供與第二抗原之單價結合)。
電荷修飾
本發明之雙特異性抗原結合分子可包含其中所包括之Fab分子中之胺基酸取代，其具體而言有效減少輕鏈與非匹配重鏈之錯配(Bence-Jones型副產物)，其可出現在其結合臂之一者(或在包含兩個以上抗原結合Fab分子之分子之情形下，更多者)中具有VH/VL交換之基於Fab之雙特異性抗體的產生中(亦參見PCT公開案第WO 2015/150447號，具體而言其中之實例，其全文以引用方式併入本中)。可藉由在CH1及CL結構域中之特定胺基酸位置引入具有相反電荷之帶電胺基酸(有時在本文中稱作「電荷修飾」)來改良期望雙特異性抗體與不期望副產物(具體而言在其結合臂之一中具有VH/VL結構域交換之雙特異性抗體中出現的Bence Jones型副產物)相比之比率。
因此，在其中雙特異性抗體之第一及第二抗原結合部分二者皆係Fab分子的一些實施例中，且在抗原結合部分之一者(特定而言第二抗原結合部分)中，Fab輕鏈及Fab重鏈之可變結構域VL及VH彼此置換。
i)在第一抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸經帶正電之胺基酸取代(根據Kabat編號)，且其中在第一抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸經帶負電之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)；或
ii)在第二抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸經帶正電之胺基酸取代(根據Kabat編號)，且其中在第二抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸經帶負電之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。
雙特異性抗體不包含i)及ii)下提及之兩種修飾。具有VH/VL交換之抗原結合部分的恆定結構域CL及CH1彼此不置換(即保持未交換)。
在更具體實施例中，
i)在第一抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；或
ii)在第二抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個該實施例中，在第一抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，在第一抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在特定實施例中，在第一抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且位置123之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在更特定實施例中，在第一抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在甚至更特定實施例中，在第一抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在特定實施例中，若根據上述實施例之胺基酸取代係在第一抗原結合部分之恆定結構域CL及恆定結構域CH1中進行，則第一抗原結合部分之恆定結構域CL屬κ同型。
或者，根據上述實施例之胺基酸取代可在第二抗原結合部分之恆定結構域CL及恆定結構域CH1中而非在第一抗原結合部分之恆定結構域CL及恆定結構域CH1中進行。在該等特定實施例中，第二抗原結合部分之恆定結構域CL屬κ同型。
因此，在一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，在第二抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在零一實施例中，在第二抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且位置123之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，在第二抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在具體實施例中，本發明之雙特異性抗體包含
I) 結合至HLAG之第一抗原結合部分，且第一抗原結合部分係包含以下之Fab分子：
A) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或
B) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；或
C) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；或
D) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；
及
II) 第二抗原結合部分，其結合至人類CD3，
其中第二抗原結合部分係Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變結構域VL及VH經彼此置換，該第二抗原結合部分包含
E) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:58之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之HVR-L3；且
其中在第一抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號) (在特定實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且位置123之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號) (在特定實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且在第一抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在具體實施例中，本發明之雙特異性抗體包含
II) 結合至HLAG之第一抗原結合部分，且第一抗原結合部分係包含以下之Fab分子：
A)
i) 包含SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列；
ii) 或i)下之抗體之VH及VL的人類化變體；或
iii) 包含SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列；或
B)
包含SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列；或
C)
包含SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列；或
D)
包含SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列；
及
II) 第二抗原結合部分，其結合至人類CD3，
其中第二抗原結合部分係Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變結構域VL及VH經彼此置換，該第二抗原結合部分包含
E) SEQ ID NO:62之VH序列及SEQ ID NO:63之VL序列；且
其中在第一抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號) (在特定實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且位置123之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號) (在特定實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且在第一抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
雙特異性抗體型式
根據本發明之雙特異性抗體之組分可以各種構形彼此融合。實例性構形繪示於圖 11 中。
在特定實施例中，雙特異性抗體中所包括之抗原結合部分係Fab分子。在該等實施例中，第一、第二、第三等抗原結合部分在本文中可分別稱作第一、第二、第三等Fab分子。
在一個實施例中，雙特異性抗體之第一及第二抗原結合部分視情況經由肽連接體彼此融合。在特定實施例中，第一及第二抗原結合部分各自係Fab分子。在一個該實施例中，第二抗原結合部分係在Fab重鏈之C末端融合至第一抗原結合部分Fab重鏈之N末端。在另一該實施例中，第一抗原結合部分係在Fab重鏈之C末端融合至第二抗原結合部分Fab重鏈之N末端。在其中(i) 第二抗原結合部分係在Fab重鏈之C末端融合至第一抗原結合部分Fab重鏈之N末端或(ii) 第一抗原結合部分係在Fab重鏈之C末端融合至第二抗原結合部分Fab重鏈之N末端的實施例中，第一抗原結合部分之Fab輕鏈與第二抗原結合部分之Fab輕鏈另外可視情況經由肽連接體彼此融合。
能夠特異性結合至靶細胞抗原(例如HLA-G)之具有單一抗原結合部分之雙特異性抗體(例如Fab分子) (例如如圖 11A 、D 、G 、H 、K 、L 中所示)有用，特定而言在預計在高親和性抗原結合部分結合後內化靶細胞抗原的情形下。在該等情形下，一個以上對靶細胞抗原具有特異性之抗原結合部分之存在可增強靶細胞抗原之內化，藉此降低其可用性。
在其他情形下，然而，將有利地具有如下雙特異性抗體：其包含兩個或更多個對靶細胞抗原具有特異性之抗原結合部分(例如Fab分子) (參見圖 11B 、11C 、11E 、11F 、11I 、11J 、11M 或11N 中所示之實例)，例如以最佳化靶向靶位點或容許交聯靶細胞抗原。
因此，在特定實施例中，根據本發明之雙特異性抗體包含第三抗原結合部分。
在一個實施例中，第三抗原結合部分結合至第一抗原，即HLA-G。在一個實施例中，第三抗原結合部分係Fab分子。
在特定實施例中，第三抗原部分與第一抗原結合部分相同。
雙特異性抗體之第三抗原結合部分可關於結合HLA-G之第一抗原結合部分及/或抗體單獨或組合納入本文所述特徵中之任一者，除非在科學上明顯不合理或不可能。
在一個實施例中，第三抗原結合部分結合至HLA-G且包含
A) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或
B) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；或
C) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；或
D) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3。
在一個實施例中，第三抗原結合部分結合至HLA-G且包含
A) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:3之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 33之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 34之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；或
B) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；或
C) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 14之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；或
D) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；且其中該VH結構域包含與SEQ ID NO: 31之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；且其中該VL結構域包含與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100% (在一個較佳實施例中98%或99%或100%)序列一致性的胺基酸序列。
在一個實施例中，第三抗原結合部分
A)
iv) 包含SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列；
v) 或i)下之抗體之VH及VL的人類化變體；或
vi) 包含SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列；或
B)
包含SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列；或
C)
包含SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列；或
D)
包含SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列。
在一些實施例中，第三抗原結合部分係(源自)人類抗體。在一個實施例中，VH係人化VH及/或VL係人類VL。在一個實施例中，第三抗原結合部分包含如上述實施例中任一者中之CDR，且進一步包含人類框架，例如人類免疫球蛋白框架。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含(i) VH，其包含與SEQ ID NO: 7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO: 8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；
(ii) VH，其包含與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；
(iii) VH，其包含與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO: 24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；
(iv) VH，其包含與SEQ ID NO: 31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或
(v) VH，其包含與SEQ ID NO: 33之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO: 34之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含
(i) 包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之VL；
(ii) 包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列之VL；
(iii) 包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列之VL；
(iv) 包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列之VL；或
(iv) 包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列之VL。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含
包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之VL。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含
包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列之VL。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含
包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列之VL。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含
包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列之VL。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含
包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列之VL。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含人類恆定區。在一個實施例中，第三抗原結合部分係包含人類恆定區、特定而言人類CH1及/或CL結構域之Fab分子。人類恆定結構域之實例性序列於SEQ ID NO 51及522 (分別人類κ及λ CL結構域)及SEQ ID NO: 53 (人類IgG1 重鏈恆定結構域CH1-CH2-CH3)中給出。在一些實施例中，第三抗原結合部分包含輕鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 51或SEQ ID NO: 52之胺基酸序列、特定而言SEQ ID NO: 51之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。特定而言，輕鏈恆定區可包含在「電荷修飾」下如本文所述之胺基酸突變及/或可包含(若在交叉Fab分子中)一或多個(特定而言兩個) N-末端胺基酸之缺失或取代。在一些實施例中，第三抗原結合部分包含重鏈恆定區，其包含與SEQ ID NO: 51之胺基酸序列中所包括之CH1結構域序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。特定而言，重鏈恆定區(尤其CH1結構域)可包含「電荷修飾」下如本文所述之胺基酸突變。
在特定實施例中，第三及第一抗原結合部分各自係Fab分子且第三抗原結合部分與第一抗原結合部分相同。因此，在該等實施例中，第一及第三抗原結合部分包含相同重鏈及輕鏈胺基酸序列且具有結構域之相同排列(即習用或交叉))。此外，在該等實施例中，第三抗原結合部分包含與第一抗原結合部分相同之胺基酸取代(若存在)。舉例而言，本文中闡述為「電荷修飾」之胺基酸取代可在第一抗原結合部分及第三抗原結合部分中之每一者之恆定結構域CL及恆定結構域CH1中進行。或者，該等胺基酸取代可在第二抗原結合部分(在特定實施例中，其亦係Fab分子)之恆定結構域CL及恆定結構域CH1中、而非在第一抗原結合部分及第三抗原結合部分之恆定結構域CL及恆定結構域CH1中進行。
與第一抗原結合部分一樣，第三抗原結合部分特定而言係習用Fab分子。然而，亦涵蓋其中第一及第三抗原結合部分係交叉Fab分子(且第二抗原結合部分係習用Fab分子)的實施例。因此，在特定實施例中，第一及第三抗原結合部分各自係習用Fab分子，且第二抗原結合部分係如本文所述之交叉Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變結構域VH及VL或恆定結構域CL及CH1彼此交換/置換的Fab分子。在其他實施例中，第一及第三抗原結合部分各自係交叉Fab分子，且第二抗原結合部分係習用Fab分子。
若存在第三抗原結合部分，則在特定實施例中，第一及第三抗原部分結合至HLA-G，且第二抗原結合部分結合至第二抗原、特定而言活化T細胞抗原、更特定而言CD3、最特定而言CD3 ε。
在特定實施例中，雙特異性抗體包含由第一及第二亞單元組成之Fc結構域。Fc結構域之第一及第二亞單元能穩定締合。
根據本發明之雙特異性抗體可具有不同構形，即第一、第二(及視情況第三)抗原結合部分可彼此融合且以不同方式融合至Fc結構域。組分可彼此直接融合或較佳經由一或多個適宜肽連接體彼此融合。若Fab分子融合至Fc結構域之亞單元之N-末端，則其通常係經由免疫球蛋白鉸鏈區。
在一些實施例中，第一及第二抗原結合部分各自係Fab分子且第二抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之第一或第二亞單元之N-末端。在該等實施例中，第一抗原結合部分可在Fab重鏈之C-末端融合至第二抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端或Fc結構域之亞單元之另一者之N-末端。在該等特定實施例中，該第一抗原結合部分係習用Fab分子，且第二抗原結合部分係如本文所述交叉Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變結構域VH及VL或恆定結構域CL及CH1彼此交換/置換的Fab分子。在其他該等實施例中，該第一Fab分子係交叉Fab分子且第二Fab分子係習用Fab分子。
在一個實施例中，第一及第二抗原結合部分各自係Fab分子，第二抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之第一或第二亞單元之N-末端，且第一抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至第二抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端。在具體實施例中，雙特異性抗體基本上由以下組成：第一及第二Fab分子、由第一及第二亞單元組成之Fc結構域及視情況一或多個肽連接體，其中第一Fab分子在Fab重鏈之C-末端融合至第二Fab分子之Fab重鏈之N-末端，且第二Fab分子在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之第一或第二亞單元之N-末端。該構形示意性繪示於圖 11G 及11K 中(其中該等實例中之第二抗原結合結構域為VH/VL交叉Fab分子)。視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在另一實施例中，第一及第二抗原結合部分各自係Fab分子且第一及第二抗原結合部分各自在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之亞單元中之一者之N-末端。在具體實施例中，雙特異性抗體基本上由以下組成：第一及第二Fab分子、由第一及第二亞單元組成之Fc結構域及視情況一或多個肽連接體，其中第一及第二Fab分子各自在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之亞單元中之一者之N-末端。該構形示意性繪示於圖11A 及11D 中(在該等實例中，第二抗原結合結構域為VH/VL交叉Fab分子且第一抗原結合部分為習用Fab分子)。第一及第二Fab分子可直接融合或經由肽連接體融合至Fc結構域。在特定實施例中，第一及第二Fab分子經由免疫球蛋白鉸鏈區各自融合至Fc結構域。在具體實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區係人類IgG1 鉸鏈區，具體而言其中Fc結構域係IgG1 Fc結構域。
在一些實施例中，第一及第二抗原結合部分各自係Fab分子且第一抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之第一或第二亞單元之N-末端。在該等實施例中，第二抗原結合部分可在Fab重鏈之C-末端融合至第二抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端或(如上文所述)融合至Fc結構域之亞單元之另一者之N-末端。在該等特定實施例中，該第一抗原結合部分係習用Fab分子，且第二抗原結合部分係如本文所述交叉Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變結構域VH及VL或恆定結構域CL及CH1彼此交換/置換的Fab分子。在其他該等實施例中，該第一Fab分子係交叉Fab分子且第二Fab分子係習用Fab分子。
在一個實施例中，第一及第二抗原結合部分各自係Fab分子，第一抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之第一或第二亞單元之N-末端，且第二抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端。在具體實施例中，雙特異性抗體基本上由以下組成：第一及第二Fab分子、由第一及第二亞單元組成之Fc結構域及視情況一或多個肽連接體，其中第二Fab分子在Fab重鏈之C-末端融合至第一Fab分子之Fab重鏈之N-末端，且第一Fab分子在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之第一或第二亞單元之N-末端。該構形示意性繪示於圖11H 及11L 中(在該等實例中，第二抗原結合結構域為VH/VL交叉Fab分子且第一抗原結合部分為習用Fab分子)。視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在一些實施例中，第三抗原結合部分、特定而言第三Fab分子在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之第一或第二亞單元之N-末端。在該等特定實施例中，該等第一及第三Fab分子各自係習用Fab分子，且第二Fab分子係如本文所述交叉Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變結構域VH及VL或恆定結構域CL及CH1彼此交換/置換的Fab分子。在其他該等實施例中，該等第一及第三Fab分子各自係交叉Fab分子且第二Fab分子係習用Fab分子。
在該特定實施例中，第二及第三抗原結合部分各自在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之亞單元中之一者之N-末端，且第一抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至第二Fab分子之Fab重鏈之N-末端。在具體實施例中，雙特異性抗體基本上由以下組成：第一、第二及第三Fab分子、由第一及第二亞單元組成之Fc結構域及視情況一或多個肽連接體，其中第一Fab分子在Fab重鏈之C-末端融合至第二Fab分子之Fab重鏈之N-末端，且第二Fab分子在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之第一亞單元之N-末端，且其中第三Fab分子在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之第二亞單元之N-末端。該構形示意性繪示於圖 11B 及11E 中(在該等實例中，第二抗原結合部分為VH/VL交叉Fab分子，且第一及第三抗原結合部分為習用Fab分子)，且示意性繪示於圖 11J 及11N 中(在該等實例中，第二抗原結合部分為習用Fab分子，且第一及第三抗原結合部分為VH/VL交叉Fab分子)。第二及第三Fab分子可直接或經由肽連接體融合至Fc結構域。在特定實施例中，第二及第三Fab分子經由免疫球蛋白鉸鏈區各自融合至Fc結構域。在具體實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區係人類IgG1 鉸鏈區，具體而言其中Fc結構域係IgG1 Fc結構域。視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在另一該實施例中，第一及第三抗原結合部分各自在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之亞單元中之一者之N-末端，且第二抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端。在具體實施例中，雙特異性抗體基本上由以下組成：第一、第二及第三Fab分子、由第一及第二亞單元組成之Fc結構域及視情況一或多個肽連接體，其中第二Fab分子在Fab重鏈之C-末端融合至第一Fab分子之Fab重鏈之N-末端，且第一Fab分子在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之第一亞單元之N-末端，且其中第三Fab分子在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之第二亞單元之N-末端。該構形示意性繪示於圖 11C 及11F 中(在該等實例中，第二抗原結合部分為VH/VL交叉Fab分子，且第一及第三抗原結合部分為習用Fab分子)，且示意性繪示於圖 11I 及11M 中(在該等實例中，第二抗原結合部分為習用Fab分子，且第一及第三抗原結合部分為VH/VL交叉Fab分子)。第一及第三Fab分子可直接或經由肽連接體融合至Fc結構域。在特定實施例中，第一及第三Fab分子經由免疫球蛋白鉸鏈區各自融合至Fc結構域。在具體實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區係人類IgG1 鉸鏈區，具體而言其中Fc結構域係IgG1 Fc結構域。視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在其中Fab分子經由免疫球蛋白鉸鏈區在Fab重鏈之C-末端融合至Fc結構域之亞單元中之每一者之N-末端的雙特異性抗體的構形中，兩個Fab分子、鉸鏈區及Fc結構域基本上形成免疫球蛋白分子。在特定實施例中，免疫球蛋白分子係IgG類免疫球蛋白。在甚至更特定實施例中，免疫球蛋白係IgG1 亞類免疫球蛋白。在另一實施例中，免疫球蛋白係IgG4 亞類免疫球蛋白。在又一特定實施例中，免疫球蛋白係人類免疫球蛋白。在其他實施例中，免疫球蛋白係嵌合免疫球蛋白或人類化免疫球蛋白。在一個實施例中，免疫球蛋白包含人類恆定區、特定而言人類Fc區。
在本發明之一些雙特異性抗體中，第一Fab分子之Fab輕鏈及第二Fab分子之Fab輕鏈視情況經由肽連接體彼此融合。端視第一及第二Fab分子之構形而定，第一Fab分子之Fab輕鏈可在其C-末端融合至第二Fab分子之Fab輕鏈之N-末端，或第二Fab分子之Fab輕鏈可在其C-末端融合至第一Fab分子之Fab輕鏈之N-末端。第一及第二Fab分子之Fab輕鏈之融合進一步減少不匹配Fab重鏈及輕鏈之錯配，且亦減少本發明之一些雙特異性抗體之表現所需之質體之數目。
抗原結合部分可直接或經由包含一或多個胺基酸、通常約2-20個胺基酸之肽連接體融合至Fc結構域或彼此融合。肽連接體為業內已知且闡述於本文中。適宜非免疫原性肽連接體包括(例如) (G4 S)n 、(SG4 )n 、(G4 S)n 或G4 (SG4 )n 肽連接體。「n」通常係1至10、通常2至4之整數。在一個實施例中，該肽連接體具有至少5個胺基酸之長度，在一個實施例中5至100、在另一實施例中10至50個胺基酸之長度。在一個實施例中，該肽連接體係(GxS)n 或(GxS)n Gm ，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸，且(x=3，n= 3、4、5或6，且m=0、1、2或3)或(x=4，n=2、3、4或5且m= 0、1、2或3)，在一個實施例中x=4且n=2或3，在另一實施例中，x=4且n=2。在一個實施例中，該肽連接體係(G4 S)2 。用於使第一及第二Fab分子之Fab輕鏈彼此融合之尤其適宜之肽連接體係(G4 S)2 。適於連接第一及第二Fab片段之Fab重鏈之實例性肽連接體包含序列(D)-(G4 S)2 (SEQ ID NO 110及111)。另一適宜該連接體包含序列(G4 S)4 。另外，連接體可包含免疫球蛋白鉸鏈區(之一部分)。特定而言，若Fab分子融合至Fc結構域亞單元之N-末端，則其可經由具有或無額外肽連接體之免疫球蛋白鉸鏈區或其部分融合。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗體包含如下多肽，其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈可變區由輕鏈可變區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與Fc結構域亞單元(VL(2) -CH1(2) -CH2-CH3(-CH4))共用羧基末端肽鍵；且包含如下多肽，其中第一Fab分子之Fab重鏈與Fc結構域亞單元(VH(1) -CH1(1) -CH2-CH3(-CH4))共用羧基末端肽鍵。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2) -CL(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基末端肽鍵。在某些實施例中，多肽係由(例如)二硫鍵共價連接。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗體包含如下多肽，其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈恆定區由輕鏈恆定區置換)，該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與Fc結構域亞單元(VH(2) -CL(2) -CH2-CH3(-CH4))共用羧基末端肽鍵；且包含如下多肽，其中第一Fab分子之Fab重鏈與Fc結構域亞單元(VH(1) -CH1(1) -CH2-CH3(-CH4))共用羧基末端肽鍵。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(2) -CH1(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基末端肽鍵。在某些實施例中，多肽係由(例如)二硫鍵共價連接。
在一些實施例中，雙特異性抗體包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈可變區由輕鏈可變區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈又與Fc結構域亞單元共用羧基末端肽鍵(VL(2) -CH1(2) -VH(1) -CH1(1) -CH2-CH3(-CH4))。在其他實施例中，雙特異性抗原包含如下多肽：其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基末端肽鍵，該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈可變區由輕鏈可變區替代)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與Fc結構域亞單元共用羧基末端肽鍵(VH(1) -CH1(1) -VL(2) -CH1(2) -CH2-CH3(-CH4))。
在該等實施例中之一些中，雙特異性抗體進一步包含第二Fab分子之交叉Fab輕鏈多肽，其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2) -CL(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基末端肽鍵。在該等實施例中之其他中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵，該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab輕鏈多肽共用羧基末端肽鍵(VH(2) -CL(2) -VL(1) -CL(1) )；或如下多肽：其中第一Fab分子之Fab輕鏈多肽與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基末端肽鍵，若適當，該第二Fab分子之Fab重鏈可變區又與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(VL(1) -CL(1) -VH(2) -CL(2) )。
根據該等實施例之雙特異性抗體可進一步包含(i) Fc結構域亞單元多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii) 多肽，其中第三Fab分子之Fab重鏈與Fc結構域亞單元(VH(3) -CH1(3) -CH2-CH3(-CH4))及第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3) -CL(3) )共用羧基末端肽鍵。在某些實施例中，多肽係由(例如)二硫鍵共價連接。
在一些實施例中，雙特異性抗體包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈恆定區由輕鏈恆定區置換)，該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈又與Fc結構域亞單元共用羧基末端肽鍵(VH(2) -CL(2) -VH(1) -CH1(1) -CH2-CH3(-CH4))。在其他實施例中，雙特異性抗原包含如下多肽：其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基末端肽鍵，該第二Fab分子之Fab重鏈可變區又與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈恆定區由輕鏈恆定區置換)，該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與Fc結構域亞單元共用羧基末端肽鍵(VH(1) -CH1(1) -VH(2) -CL(2) -CH2-CH3(-CH4))。
在該等實施例中之一些中，雙特異性抗體進一步包含第二Fab分子之交叉Fab輕鏈多肽，其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(2) -CH1(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基末端肽鍵。在該等實施例中之其他中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab輕鏈多肽共用羧基末端肽鍵(VL(2) -CH1(2) -VL(1) -CL(1) )；或如下多肽：其中第一Fab分子之Fab輕鏈多肽與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基末端肽鍵，若適當，該第二Fab分子之Fab重鏈可變區又與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(VL(1) -CL(1) -VH(2) -CL(2) )。
根據該等實施例之雙特異性抗體可進一步包含(i) Fc結構域亞單元多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii) 多肽，其中第三Fab分子之Fab重鏈與Fc結構域亞單元(VH(3) -CH1(3) -CH2-CH3(-CH4))及第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3) -CL(3) )共用羧基末端肽鍵。在某些實施例中，多肽係由(例如)二硫鍵共價連接。
在某些實施例中，雙特異性抗體不包含Fc結構域。在該等特定實施例中，該等第一及(若存在)第三Fab分子各自係習用Fab分子，且第二Fab分子係如本文所述交叉Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變結構域VH及VL或恆定結構域CL及CH1彼此交換/置換的Fab分子。在其他該等實施例中，該等第一及(若存在)第三Fab分子各自係交叉Fab分子且第二Fab分子係習用Fab分子。
在一個該實施例中，雙特異性抗體基本上由第一及第二抗原結合部分及視情況一或多個肽連接體組成，其中第一及第二抗原結合部分二者皆係Fab分子且第一抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至第二抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端。該構形示意性繪示於圖11O 及11S 中(在該等實例中，第二抗原結合結構域為VH/VL交叉Fab分子且第一抗原結合部分為習用Fab分子)。
在另一該實施例中，雙特異性抗體基本上由第一及第二抗原結合部分及視情況一或多個肽連接體組成，其中第一及第二抗原結合部分二者皆係Fab分子且第二抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至第一抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端。該構形示意性繪示於圖11P 及11T 中(在該等實例中，第二抗原結合結構域為VH/VL交叉Fab分子且第一抗原結合部分為習用Fab分子)。
在一些實施例中，第一Fab分子在Fab重鏈之C-末端融合至第二Fab分子之Fab重鏈之N-末端，且雙特異性抗體進一步包含第三抗原結合部分、特定而言第三Fab分子，其中該第三Fab分子在Fab重鏈之C-末端融合至第一Fab分子之Fab重鏈之N-末端。在某些該等實施例中，雙特異性抗體基本上由第一、第二及第三Fab分子及視情況一或多個肽連接體組成，其中第一Fab分子在Fab重鏈之C-末端融合至第二Fab分子之Fab重鏈之N-末端，且第三Fab分子在Fab重鏈之C-末端融合至第一Fab分子之Fab重鏈之N-末端。該構形示意性繪示於圖 11Q 及11U (在該等實例中，第二抗原結合結構域為VH/VL交叉Fab分子，且第一及第三抗原結合部分各自為習用Fab分子)，或圖 11X 及11Z 中(在該等實例中，第二抗原結合結構域為習用Fab分子，且第一及第三抗原結合部分各自為VH/VL交叉Fab分子)。
在一些實施例中，第二Fab分子在Fab重鏈之C-末端融合至第一Fab分子之Fab重鏈之N-末端，且雙特異性抗體進一步包含第三抗原結合部分、特定而言第三Fab分子，其中該第三Fab分子在Fab重鏈之N-末端融合至第一Fab分子之Fab重鏈之C-末端。在某些該等實施例中，雙特異性抗體基本上由第一、第二及第三Fab分子及視情況一或多個肽連接體組成，其中第二Fab分子在Fab重鏈之C-末端融合至第一Fab分子之Fab重鏈之N-末端，且第三Fab分子在Fab重鏈之N-末端融合至第一Fab分子之Fab重鏈之C-末端。該構形示意性繪示於圖 11R 及11V (在該等實例中，第二抗原結合結構域為VH/VL交叉Fab分子，且第一及第三抗原結合部分各自為習用Fab分子)，或圖 11W 及11Y 中(在該等實例中，第二抗原結合結構域為習用Fab分子，且第一及第三抗原結合部分各自為VH/VL交叉Fab分子)。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗體包含如下多肽：其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基末端肽鍵，該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈可變區由輕鏈可變區置換) (VH(1) -CH1(1) -VL(2) -CH1(2) )。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2) -CL(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基末端肽鍵。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗體包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈可變區由輕鏈可變區替代)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵(VL(2) -CH1(2) -VH(1) -CH1(1) )。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2) -CL(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基末端肽鍵。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗體包含如下多肽，其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈恆定區由輕鏈恆定區置換)，該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵(VH(2) -CL(2) -VH(1) -CH1(1) )。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(2) -CH1(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基末端肽鍵。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗體包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈可變區由輕鏈可變區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵(VL(2) -CH1(2) -VH(1) -CH1(1) )。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2) -CL(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基末端肽鍵。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗體包含如下多肽：其中第三Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈又與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基末端肽鍵，該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈可變區由輕鏈可變區替代) (VH(3) -CH1(3) -VH(1) -CH1(1) -VL(2) -CH1(2) )。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2) -CL(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基末端肽鍵。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3) -CL(3) )。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗體包含如下多肽：其中第三Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈又與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基末端肽鍵，該第二Fab分子之Fab重鏈可變區又與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈恆定區由輕鏈恆定區置換) (VH(3) -CH1(3) -VH(1) -CH1(1) -VH(2) -CL(2) )。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(2) -CH1(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基末端肽鍵。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3) -CL(3) )。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗體包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈可變區由輕鏈可變區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈又與第三Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵(VL(2) -CH1(2) -VH(1) -CH1(1) -VH(3) -CH1(3) )。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2) -CL(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基末端肽鍵。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3) -CL(3) )。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗體包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈恆定區由輕鏈恆定區置換)，該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈又與第三Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵(VH(2) -CL(2) -VH(1) -CH1(1) -VH(3) -CH1(3) )。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(2) -CH1(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基末端肽鍵。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3) -CL(3) )。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗體包含如下多肽，其中第二Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基末端肽鍵，該第一Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈可變區由輕鏈可變區置換)，該第一Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第三Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基末端肽鍵，該第三Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第三Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈可變區由輕鏈可變區置換) (VH(2) -CH1(2) -VL(1) -CH1(1) -VL(3) -CH1(3) )。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(1) -CL(1) )及第二Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(2) -CL(2) )共用羧基末端肽鍵。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第三Fab分子之Fab重鏈可變區與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(VH(3) -CL(3) )。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗體包含如下多肽，其中第二Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基末端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈可變區又與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈恆定區由輕鏈恆定區置換)，該第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第三Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基末端肽鍵，該第三Fab分子之Fab重鏈可變區又與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第三Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈恆定區由輕鏈恆定區置換) (VH(2) -CH1(2) -VH(1) -CL(1) -VH(3) -CL(3) )。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(1) -CH1(1) )及第二Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(2) -CL(2) )共用羧基末端肽鍵。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第三Fab分子之Fab輕鏈可變區與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(VL(3) -CH1(3) )。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗體包含如下多肽，其中第三Fab分子之Fab輕鏈可變區與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第三Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈可變區由輕鏈可變區置換)，該第三Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基末端肽鍵，該第一Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈可變區由輕鏈可變區)置換，該第一Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第二Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵(VL(3) -CH1(3) -VL(1) -CH1(1) -VH(2) -CH1(2) )。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(1) -CL(1) )及第二Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(2) -CL(2) )共用羧基末端肽鍵。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第三Fab分子之Fab重鏈可變區與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(VH(3) -CL(3) )。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗體包含如下多肽，其中第三Fab分子之Fab重鏈可變區與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第三Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈可變區由輕鏈可變區置換)，該第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基末端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈可變區又與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交叉Fab重鏈，其中重鏈恆定區由輕鏈恆定區)置換，該第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第二Fab分子之Fab重鏈共用羧基末端肽鍵(VH(3) -CL(3) -VH(1) -CL(1) -VH(2) -CH1(2) )。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(1) -CH1(1) )及第二Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(2) -CL(2) )共用羧基末端肽鍵。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含如下多肽：其中第三Fab分子之Fab輕鏈可變區與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基末端肽鍵(VL(3) -CH1(3) )。
在一個實施例中，本發明提供包含以下之雙特異性抗體：
a) 結合至HLAG之第一抗原結合部分，其中第一抗原結合部分係包含以下之Fab分子：
A) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或
B) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；或
C) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；或
D) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；
及
b) 第二抗原結合部分，其結合至人類CD3，
其中第二抗原結合部分係Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變結構域VL及VH或恆定結構域CL及CH1經彼此置換，該第二抗原結合部分包含
E) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:58之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之HVR-L3；及
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc結構域；
其中
(i) a)下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至b)下之第二抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端，且b)下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至c)下之Fc結構域之亞單元中之一者的N-末端，或
(ii) b)下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至a)下之第一抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端，且a)下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至c)下之Fc結構域之亞單元中之一者的N-末端。
在特定實施例中，本發明提供包含以下之雙特異性抗體：
a) 結合至HLAG之第一抗原結合部分，其中第一抗原結合部分係包含以下之Fab分子：
A) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或
B) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；或
C) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；或
D) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；
及
b) 第二抗原結合部分，其結合至人類CD3，
其中第二抗原結合部分係Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變結構域VL及VH或恆定結構域CL及CH1經彼此置換，該第二抗原結合部分包含
E) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:58之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之HVR-L3；及
c) 結合至第一抗原且與第一抗原結合部分相同之第三抗原結合部分；及
d) 由第一及第二亞單元組成之Fc結構域；
其中
(i) a)下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至b)下之第二抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端，且b)下之第二抗原結合部分及c)下之第三抗原結合部分各自在在Fab重鏈之C-末端融合至d)下之Fc結構域之亞單元中之一者的N-末端，或
(ii) b)下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至a)下之第一抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端，且a)下之第一抗原結合部分及c)下之第三抗原結合部分各自在在Fab重鏈之C-末端融合至d)下之Fc結構域之亞單元中之一者的N-末端。
在另一實施例中，本發明提供包含以下之雙特異性抗體：
a) 結合至HLAG之第一抗原結合部分，其中第一抗原結合部分係包含以下之Fab分子：
A) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或
B) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；或
C) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；或
D) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；
及
b) 第二抗原結合部分，其結合至人類CD3，
其中第二抗原結合部分係Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變結構域VL及VH或恆定結構域CL及CH1經彼此置換，該第二抗原結合部分包含
E) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:58之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之HVR-L3；及
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc結構域；
其中
a)下之第一抗原結合部分及b)下之第二抗原結合部分各自在Fab重鏈之C-末端融合至c)下之Fc結構域之亞單元中之一者的N-末端。
在根據本發明之雙特異性抗體之所有不同構形中，本文所述胺基酸取代(若存在)可在第一及(若存在)第三抗原結合分子/Fab分子之CH1及CL結構域或第二抗原結合分子/Fab分子之CH1及CL結構域中。較佳地，其係在第一及(若存在)第三抗原結合部分/Fab分子之CH1及CL結構域中。根據本發明之概念，若如本文所述之胺基酸取代係在第一(及若存在第三)抗原結合部分/Fab分子中進行，則第二抗原結合部分/Fab分子中未進行該等胺基酸取代。相反，若如本文所述胺基酸取代係在第二抗原結合部分/Fab分子中進行，則第一(及若存在，第三)抗原結合部分/Fab分子中不進行該等胺基酸取代。胺基酸取代特定而言係在包含Fab分子之雙特異性抗體中進行，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變結構域VL及VH1經彼此置換。
在根據本發明之雙特異性抗體、具體而言其中如本文所述胺基酸取代係在第一(及若存在，第三)抗原結合部分/Fab分子中進行之特定實施例中，第一(及若存在，第三) Fab分子之恆定結構域CL屬κ同型。在根據本發明之雙特異性抗體、特定而言其中如本文所述之胺基酸取代係在第二抗原結合部分/Fab分子中進行的其他實施例中，第二抗原結合部分/Fab分子之恆定結構域CL屬κ同型。在一些實施例中，第一(及若存在，第三)抗原結合部分/Fab分子之恆定結構域CL及第二抗原結合部分/Fab分子之恆定結構域CL屬κ同型。
在一個實施例中，本發明提供包含以下之雙特異性抗體：
a) 結合至HLAG之第一抗原結合部分，其中第一抗原結合部分係包含以下之Fab分子：
A) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或
B) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；
及
b) 第二抗原結合部分，其結合至人類CD3，
其中第二抗原結合部分係Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變結構域VL及VH經彼此置換，該第二抗原結合部分包含
E) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:58之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之HVR-L3；及
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc結構域；
其中在a)下之第一抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號) (最特定而言由精胺酸(R)取代)，且其中在a)下之第一抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；且
其中
(i) a)下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至b)下之第二抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端，且b)下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至c)下之Fc結構域之亞單元中之一者的N-末端，或
(ii) b)下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至a)下之第一抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端，且a)下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至c)下之Fc結構域之亞單元中之一者的N-末端。
在特定實施例中，本發明提供包含以下之雙特異性抗體：
a) 結合至HLAG之第一抗原結合部分，其中第一抗原結合部分係包含以下之Fab分子：
A) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或
B) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；
及
b) 第二抗原結合部分，其結合至人類CD3，
其中第二抗原結合部分係Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變結構域VL及VH經彼此置換，該第二抗原結合部分包含
E) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之HVR-H2、及包含選自SEQ ID NO:58之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之HVR-L3；及
c) 結合至第一抗原且與第一抗原結合部分相同之第三抗原結合部分；及
d) 由第一及第二亞單元組成之Fc結構域；
其中在a)下之第一抗原結合部分及c)下之第三抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號) (最特定而言由精胺酸(R)取代)，且其中在a)下之第一抗原結合部分及c)下之第三抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；且
其中
(i) a)下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至b)下之第二抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端，且b)下之第二抗原結合部分及c)下之第三抗原結合部分各自在在Fab重鏈之C-末端融合至d)下之Fc結構域之亞單元中之一者的N-末端，或
(ii) b)下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至a)下之第一抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端，且a)下之第一抗原結合部分及c)下之第三抗原結合部分各自在在Fab重鏈之C-末端融合至d)下之Fc結構域之亞單元中之一者的N-末端。
在另一實施例中，本發明提供包含以下之雙特異性抗體：
a) 結合至HLAG之第一抗原結合部分，其中第一抗原結合部分係包含以下之Fab分子：
A) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或
B) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；
及
b) 第二抗原結合部分，其結合至人類CD3，
其中第二抗原結合部分係Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變結構域VL及VH經彼此置換，該第二抗原結合部分包含
E) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:58之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之HVR-L3；及
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc結構域；
其中在a)下之第一抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號) (最特定而言由精胺酸(R)取代)，且其中在a)下之第一抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；且
其中a)下之第一抗原結合部分及b)下之第二抗原結合部分各自在Fab重鏈之C-末端融合至c)下之Fc結構域之亞單元中之一者的N-末端。
在一個實施例中，本發明提供包含以下之雙特異性抗體：
a) 結合至HLAG之第一抗原結合部分，其中第一抗原結合部分係包含以下之Fab分子：
A) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或
B) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；
及
b) 第二抗原結合部分，其結合至人類CD3，
其中第二抗原結合部分係Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變結構域VL及VH經彼此置換，該第二抗原結合部分包含
E) VH結構域，其包括包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之HVR-H2及包含選自SEQ ID NO:58之胺基酸序列之HVR-H3；及VL結構域，其包括包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之HVR-L3；及
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc結構域；
其中在a)下之第一抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號) (最特定而言由精胺酸(R)取代)，且其中在a)下之第一抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；且
其中
(i) a)下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至b)下之第二抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端，且b)下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至c)下之Fc結構域之亞單元中之一者的N-末端，或
(ii) b)下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至a)下之第一抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端，且a)下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至c)下之Fc結構域之亞單元中之一者的N-末端。
在特定實施例中，本發明提供包含以下之雙特異性抗體：
在特定態樣中，本發明提供包含以下之雙特異性抗體：
a) 結合至第一抗原之第一及第三抗原結合部分；其中第一抗原係HLA-G，且其中第一及第二抗原結合部分各自係包含以下之(習用) Fab分子：(i) 包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列之輕鏈可變區，或(ii) 包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列之輕鏈可變區；
b) 結合至第二抗原之第二抗原結合部分；其中第二抗原係CD3，且其中第二抗原結合部分係Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變結構域VL及VH經彼此置換，該Fab分子包括包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列之輕鏈可變區；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc結構域；
其中
在a)下之第一及第三抗原結合部分之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號) (最特定而言由精胺酸(R)取代)，且其中在a)下之第一及第三抗原結合部分之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；
且其中另外
a)下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至b)下之第二抗原結合部分之Fab重鏈之N-末端，且b)下之第二抗原結合部分及a)下之第三抗原結合部分在Fab重鏈之C-末端融合至c)下之Fc結構域之亞單元中之一者的N-末端。
在一個實施例中，根據本發明之該等態樣之，在Fc結構域之第一亞單元中，位置366之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在Fc結構域之第二亞單元中，位置407之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)，且視情況位置366蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換(T366S)且位置368之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A) (根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，根據本發明之該等態樣，在Fc結構域之第一亞單元中，另外，位置354之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(S354C)或位置356之麩胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(E356C) (具體而言位置354之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換)，且在Fc結構域之第二亞單元中，另外，位置349之酪胺酸殘基由半胱胺酸殘基置換(Y349C) (根據Kabat EU索引編號)。
在又一實施例中，根據本發明之該等態樣，在Fc結構域之第一及第二亞單元中之每一者中，位置234之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L234A)，位置235之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L235A)且位置329之脯胺酸殘基由甘胺酸殘基置換(P329G) (根據Kabat EU索引編號)。
在又一實施例中，根據本發明之該等態樣，Fc結構域係人類IgG1 Fc結構域。
本發明之具體實施例係結合至人類HLA-G及人類CD3之雙特異性抗體，其中抗體包括包含與SEQ ID NO: 64之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列的多肽、包含與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列的多肽、包含與SEQ ID NO: 66之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列的多肽及包含與SEQ ID NO: 67之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列的多肽。
在又一具體實施例中，雙特異性抗體包括包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列之多肽、包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之多肽、包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之多肽及包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之多肽。
本發明之具體實施例係結合至人類HLA-G及人類CD3之雙特異性抗體，其中抗體包括包含與SEQ ID NO: 68之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列的多肽、包含與SEQ ID NO: 69之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列的多肽、包含與SEQ ID NO: 70之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列的多肽及包含與SEQ ID NO: 71之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列的多肽。
在又一具體實施例中，雙特異性抗體包括包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之多肽、包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之多肽、包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列之多肽及包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之多肽。
本發明之具體實施例係結合至人類HLA-G及人類CD3之雙特異性抗體，其中抗體包括包含與SEQ ID NO: 72之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列的多肽、包含與SEQ ID NO: 73之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列的多肽、包含與SEQ ID NO: 74之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列的多肽及包含與SEQ ID NO: 75之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列的多肽。
在又一具體實施例中，雙特異性抗體包括包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列之多肽、包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列之多肽、包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列之多肽及包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之多肽。
Fc 結構域
在特定實施例中，本發明之雙特異性抗體包含由第一及第二亞單元組成之Fc結構域。應理解，關於雙特異性抗體之本文所述Fc結構域的特徵可同樣地適於本發明抗體中所包括之Fc結構域。
雙特異性抗體之Fc結構域由一對包含免疫球蛋白分子之重鏈結構域之多肽鏈組成。舉例而言，免疫球蛋白G (IgG)分子之Fc結構域係二聚體，其之每一亞單元包含CH2及CH3 IgG重鏈恆定結構域。Fc結構域之兩個亞單元能彼此穩定締合。在一個實施例中，本發明之雙特異性抗體包含不超過一個Fc結構域。
在一個實施例中，雙特異性抗體之Fc結構域係IgG Fc結構域。在特定實施例中，Fc結構域係IgG1 Fc結構域。在另一實施例中，Fc結構域係IgG4 Fc結構域。在更具體實施例中，Fc結構域係包含位置S228之胺基酸取代(Kabat EU索引編號)、具體而言胺基酸取代S228P之IgG4 Fc結構域。此胺基酸取代降低IgG4 抗體之活體內Fab臂交換(參見Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010))。在又一特定實施例中，Fc結構域係人類Fc結構域。在甚至更特定實施例中，Fc結構域係人類IgG1 Fc結構域。
促進異二聚化之 Fc 結構域修飾
根據本發明之雙特異性抗體包含不同抗原結合部分，其可融合至Fc結構域之兩個亞單元中之一者或另一者，因此Fc結構域之兩個亞單元通常包含於兩個不同多肽鏈中。該等多肽之重組共表現及隨後二聚化導致兩種多肽之若干可能之組合。為了改良重組產生中雙特異性抗體之產率及純度，因此有利的是在雙特異性抗體之Fc結構域中引入促進期望多肽之締合的修飾。
因此，在特定實施例中，根據本發明之雙特異性抗體之Fc結構域包含促進Fc結構域之第一及第二亞單元締合的修飾。人類IgG Fc結構域之兩個亞單元之間之最廣泛蛋白質-蛋白質相互作用的位點在Fc結構域之CH3結構域中。因此，在一個實施例中，該修飾係在Fc結構域之CH3結構域中。
存在若干在Fc結構域之CH3結構域中進行修飾以實施異二聚化的方法，其充分闡述於(例如) WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291中。通常，在所有該等方法中，Fc結構域之第一亞單元之CH3結構域及Fc結構域之第二亞單元之CH3結構域二者皆以互補方式經改造，使得每一CH3結構域(或包含其之重鏈)可不再與自身同二聚化，但迫使與經補體改造之其他CH3結構域異二聚化(使得第一及第二CH3結構域異二聚化且在兩個第一或兩個第二CH3結構域之間不形成同源二聚體)。涵蓋該等用於改良重鏈異二聚化之不同方法作為不同替代方案，其與雙特異性抗體中減少輕鏈錯配及Bence-Jones型副產物之重鏈-輕鏈修飾(例如，一個結合臂中之VH及VL交換/置換及在CH1/CL界面中引入具有相反電荷之帶電胺基酸的取代)組合。
在具體實施例中，促進Fc結構域之第一及第二亞單元締合之該修飾係所謂「凸起與孔洞」修飾，包含Fc結構域之兩個亞單元中之一者之「凸起」修飾及Fc結構域之兩個亞單元中之另一者之「孔洞」修飾。
凸起與孔洞技術闡述於(例如) US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。通常，該方法涉及在第一多肽之界面引入隆凸(「凸起」)且在第二多肽之界面引入相應空腔(「孔洞」)，從而該隆凸可定位於空腔中以促進異二聚體形成並防止同源二聚體形成。藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換來自第一多肽界面之較小胺基酸側鏈來構築隆凸。藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換較大胺基酸側鏈而在第二多肽之界面中產生尺寸與隆凸相同或類似之補償性空腔。
因此，在特定實施例中，在雙特異性抗體之Fc結構域之第一亞單元之CH3結構域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，藉此在第一亞單元之CH3結構域內生成隆凸，其可定位於第二亞單元之CH3結構域內之空腔中，且在Fc結構域之第二亞單元之CH3結構域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，藉此在第一亞單元之CH3結構域內之隆凸可定位之第二亞單元之CH3結構域內生成空腔。
較佳地，該具有較大側鏈體積之胺基酸殘基選自由以下組成之群：精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)。
較佳地，該具有較小側鏈體積之胺基酸殘基選自由以下組成之群：丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)。
隆凸及空腔可藉由例如藉由位點特異性誘變或藉由肽合成改變編碼多肽之核酸來製得。
在具體實施例中，在Fc結構域之第一亞單元(「凸起」亞單元)之(CH3結構域)中，位置366之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在Fc結構域之第二亞單元(「孔洞」亞單元)之(CH3結構域)中，位置407之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)。在一個實施例中，在Fc結構域之第二亞單元中，另外，位置366之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換(T366S)且位置368之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A) (根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，在Fc結構域之第一亞單元中，另外，位置354之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(S354C)或位置356之麩胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(E356C) (具體而言位置354之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換)，且在Fc結構域之第二亞單元中，另外，位置349之酪胺酸殘基由半胱胺酸殘基置換(Y349C) (根據Kabat EU索引編號)。引入該兩個半胱胺酸殘基導致在Fc結構域之兩個亞單元之間形成二硫橋，此進一步穩定二聚體(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。
在具體實施例中，Fc結構域之第一亞單元包含胺基酸取代S354C及T366W，且Fc結構域之第二亞單元包含胺基酸取代Y349C、T366S、L368A及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。
在特定實施例中，結合至,第二抗原(例如活化T細胞抗原)之抗原結合部分融合(視情況經由結合至HLA-G之第一抗原結合部分及/或肽連接體)至Fc結構域之第一亞單元(包含「凸起」修飾)。不期望受限於理論，結合第二抗原(例如活化T細胞抗原)之抗原結合部分與含有凸起之Fc結構域之亞單元之融合將(進一步)最小化包含兩個抗原結合部分之抗體的生成，該兩個抗原結合部分結合至活化T細胞抗原(兩個含有凸起之多肽之空間位阻)。
涵蓋用於實施異二聚化之CH3-修飾之其他技術作為本發明之替代方案且其闡述於(例如) WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中。
在一個實施例中，或者使用闡述於EP 1870459中之異二聚化方法。此方法係基於在Fc結構域之兩個亞單元之間之CH3/CH3結構域界面中之特定胺基酸位置引入具有相反電荷之帶電胺基酸。本發明之雙特異性抗體之一個較佳實施例係(Fc結構域)之兩個CH3結構域中之一者中的胺基酸突變R409D、K370E；及Fc結構域之CH3結構域中之另一者中之胺基酸突變D399K、E357K (根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，本發明之雙特異性抗體包含Fc結構域之第一亞單元之CH3結構域中之胺基酸突變T366W及Fc結構域之第二亞單元之CH3結構域中之胺基酸突變T366S、L368A、Y407V，及另外Fc結構域之第一亞單元之CH3結構域中之胺基酸突變R409D、K370E；及Fc結構域之第二亞單元之CH3結構域中之胺基酸突變D399K、E357K (根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，本發明之雙特異性抗體包含Fc結構域之第一亞單元之CH3結構域中之胺基酸突變S354C、T366W及Fc結構域之第二亞單元之CH3結構域中之胺基酸突變Y349C、T366S、L368A、Y407V，或該雙特異性抗體包含Fc結構域之第一亞單元之CH3結構域中之胺基酸突變Y349C、T366W及Fc結構域之第二亞單元之CH3結構域中之胺基酸突變S354C、T366S、L368A、Y407V，以及另外Fc結構域之第一亞單元之CH3結構域中之胺基酸突變R409D、K370E，及Fc結構域之第二亞單元之CH3結構域中之胺基酸突變D399K、E357K (所有編號皆係根據Kabat EU索引)。
在一個實施例中，或者使用闡述於WO 2013/157953中之異二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3結構域包含胺基酸突變T366K且第二CH3結構域包含胺基酸突變L351D (根據Kabat EU索引編號)。在另一實施例中，第一CH3結構域進一步包含胺基酸突變L351K。在另一實施例中，第二CH3結構域進一步包含選自以下之胺基酸突變：Y349E、Y349D及L368E (較佳L368E) (根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，或者使用闡述於WO 2012/058768中之異二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3結構域包含胺基酸突變L351Y、Y407A，且第二CH3結構域包含胺基酸突變T366A、K409F。在另一實施例中，第二CH3結構域進一步包含位置T411、D399、S400、F405、N390或K392之胺基酸突變，例如選自a) T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W，b) D399R、D399W、D399Y或D399K，c) S400E、S400D、S400R或S400K，d) F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W，e) N390R、N390K或N390D，f) K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E (根據Kabat EU索引編號)。在另一實施例中，第一CH3結構域包含胺基酸突變L351Y、Y407A，且第二CH3結構域包含胺基酸突變T366V、K409F。在另一實施例中，第一CH3結構域包含胺基酸突變Y407A，且第二CH3結構域包含胺基酸突變T366A、K409F。在另一實施例中，第二CH3結構域進一步包含胺基酸突變K392E、T411E、D399R及S400R (根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，或者使用闡述於WO 2011/143545中之異二聚化方法，例如選自由368及409組成之群之位置之胺基酸修飾(根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，或者使用闡述於WO 2011/090762中之異二聚化方法，其亦使用上述隆凸與孔洞技術。在一個實施例中，第一CH3結構域包含胺基酸突變T366W，且第二CH3結構域包含胺基酸突變Y407A。在一個實施例中，第一CH3結構域包含胺基酸突變T366Y，且第二CH3結構域包含胺基酸突變Y407T (根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，雙特異性抗體或其Fc結構域屬IgG2 亞類且或者使用闡述於WO 2010/129304中之異二聚化方法。
在替代實施例中，促進Fc結構域之第一及第二亞單元締合之修飾包含介導靜電轉向效應之修飾，例如如PCT公開案WO 2009/089004中所述。通常，此方法涉及由帶電胺基酸殘基置換兩個Fc結構域亞單元之界面之一或多個胺基酸殘基，以使同二聚體形成變得靜電不利但異二聚化靜電有利。在一個該實施例中，第一CH3結構域包含K392或N392經帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，較佳K392D或N392D)之胺基酸取代，且第二CH3結構域包含D399、E356、D356或E357經帶正電胺基酸(例如離胺酸(K)或精胺酸(R)，較佳D399K、E356K、D356K或E357K，且更佳D399K及E356K)之胺基酸取代。在另一實施例中，第一CH3結構域進一步包含K409或R409經帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，較佳K409D或R409D)之胺基酸取代。在另一實施例中，第一CH3結構域進一步或另一選擇為包含K439及/或K370經帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D))之胺基酸取代(所有皆係根據Kabat EU索引編號)。
在又一實施例中，或者使用闡述於WO 2007/147901中之異二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3結構域包含胺基酸突變K253E、D282K及K322D，且第二CH3結構域包含胺基酸突變D239K、E240K及K292D (根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，可或者使用闡述於WO 2007/110205中之異二聚化方法。
在一個實施例中，Fc結構域之第一亞單元包含胺基酸取代K392D及K409D，且Fc結構域之第二亞單元包含胺基酸取代D356K及D399K (根據Kabat EU索引編號)。
降低 Fc 受體結合及 / 或效應功能之 Fc 結構域修飾
Fc結構域賦予雙特異性抗體(或抗體)有利的藥物動力學性質，包括長血清半衰期，其促使靶組織中之良好累積及有利的組織-血液分佈比。然而，同時其可導致雙特異性抗體(或抗體)不合意地靶向表現Fc受體之細胞而非靶向較佳的具有抗原之細胞。此外，Fc受體信號傳導路徑之共活化可導致細胞介素釋放，與雙特異性抗體之T細胞活化性質(例如在其中第二抗原結合部分結合至活化T細胞抗原之雙特異性抗體的實施例中)及長的半衰期組合，其導致在全身投與時細胞介素受體之過度活化及嚴重副作用。除T細胞外之(具有Fc受體之)免疫細胞之活化甚至可因例如NK細胞對T細胞之潛在破壞而降低雙特異性抗體(特定而言其中第二抗原結合部分結合至活化T細胞抗原之雙特異性抗體)的功效。
因此，在特定實施例中，與天然IgG1 Fc結構域相比，根據本發明之雙特異性抗體之Fc結構域展現降低之與Fc受體之結合親和性及/或降低之效應功能。在一個該實施例中，Fc結構域(或包含該Fc結構域之雙特異性抗體)與天然IgG1 Fc結構域(或包含天然IgG1 Fc結構域之雙特異性抗體)相比，展現與Fc受體之結合親和性之小於50%、較佳小於20%、更佳小於10%且最佳小於5%，及/或與天然IgG1 Fc結構域(或包含天然IgG1 Fc結構域之雙特異性抗體)相比，展現效應功能之小於50%、較佳小於20%、更佳小於10%且最佳小於5%。在一個實施例中，Fc結構域(或包含該Fc結構域之雙特異性抗體)並不實質上結合至Fc受體及/或誘導效應功能。在特定實施例中，Fc受體係Fcγ受體。在一個實施例中，Fc受體係人類Fc受體。在一個實施例中，Fc受體係活化Fc受體。在具體實施例中，Fc受體係活化人類Fcγ受體，更特定而言人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定而言人類FcγRIIIa。在一個實施例中，效應功能係選自CDC、ADCC、ADCP及細胞介素分泌之群中之一或多者。在特定實施例中，效應功能係ADCC。在一個實施例中，與天然IgG1 Fc結構域相比，Fc結構域展現實質上類似之與新生Fc受體(FcRn)之結合親和性。在Fc結構域(或包含該Fc結構域之雙特異性抗體)展現天然IgG1 Fc結構域(或包含天然IgG1 Fc結構域之雙特異性抗體)與FcRn之結合親和性之大於約70%、特定而言大於約80%、更特定而言大於約90%時，達成與FcRn實質上類似之結合。
在某些實施例中，Fc結構域經改造以具有與未經改造之Fc結構域相比，降低的對Fc受體之結合親和性及/或降低的效應功能。在特定實施例中，雙特異性抗體之Fc結構域包含一或多個胺基酸突變，其降低Fc結構域與Fc受體之結合親和性及/或效應功能。通常，相同的一或多個胺基酸突變存在於Fc結構域之兩個亞單位中之每一者中。在一個實施例中，胺基酸突變降低Fc結構域與Fc受體之結合親和性。在一個實施例中，胺基酸突變將Fc結構域對Fc受體之結合親和性降低至先前的至少1/2、至少1/5或至少1/10。在存在一個以上降低Fc結構域與Fc受體之結合親和性之胺基酸突變的實施例中，該等胺基酸突變之組合可將Fc結構域與Fc受體之結合親和性降低至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。在一個實施例中，與包含未經改造之Fc結構域之雙特異性抗體相比，包含經改造之Fc結構域之雙特異性抗體展現與Fc受體之結合親和性之小於20%、特定而言小於10%、更特定而言小於5%。在特定實施例中，Fc受體係Fcγ受體。在一些實施例中，Fc受體係人類Fc受體。在一些實施例中，Fc受體係活化Fc受體。在具體實施例中，Fc受體係活化人類Fcγ受體，更特定而言人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定而言人類FcγRIIIa。較佳地，降低對該等受體中每一者之結合。在一些實施例中，與補體組分之結合親和性、與C1q之特異性結合親和性亦降低。在一個實施例中，與新生Fc受體(FcRn)之結合親和性並未降低。對FcRn實質上相似之結合(即保留Fc結構域對該受體之結合親和性)係在Fc結構域(或包括該Fc結構域之雙特異性抗體)展現比Fc結構域之未經改造形式(或包括Fc結構域之該未經改造形式之雙特異性抗體)對FcRn之結合親和性大約70%之結合親和性時達成。Fc結構域或包含該Fc結構域之本發明之雙特異性抗體可展現該親和性之大於約80%且甚至大於約90%。在某些實施例中，雙特異性抗體之Fc結構域經改造以與未經改造之Fc結構域相比具有降低之效應功能。降低之效應功能可包括(但不限於)以下中之一或多者：降低之補體依賴性細胞毒性(CDC)、降低之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、降低之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、降低之細胞介素分泌、降低之免疫複合體介導之由抗原呈遞細胞的抗原攝取、降低之與NK細胞之結合、降低之與巨噬細胞之結合、降低之與單核球之結合、降低之與多型核細胞之結合、降低之誘導細胞凋亡之直接信號傳導、降低之靶結合之抗體之交聯、降低之樹突細胞成熟或降低之T細胞啟動。在一個實施例中，降低之效應功能選自降低之CDC、降低之ADCC、降低之ADCP及降低之細胞介素分泌之群中之一或多者。在特定實施例中，降低之效應功能係降低之ADCC。在一個實施例中，降低之ADCC係由未經改造之Fc結構域(或包含未經改造之Fc結構域之雙特異性抗體)誘導之ADCC之小於20%。
在一個實施例中，降低Fc結構域與Fc受體之結合親和性及/或效應功能之胺基酸突變係胺基酸取代。在一個實施例中，Fc結構域包含選自以下之群之位置之胺基酸取代：E233、L234、L235、N297、P331及P329 (根據Kabat EU索引編號)。在更具體實施例中，Fc結構域包含選自L234、L235及P329之群之位置之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在一些實施例中，Fc結構域包含胺基酸取代L234A及L235A (根據Kabat EU索引編號)。在一個該實施例中，Fc結構域係IgG1 Fc結構域、特定而言人類IgG1 Fc結構域。在一個實施例中，Fc結構域包含位置P329之胺基酸取代。在更具體實施例中，胺基酸取代係P329A或P329G、特定而言P329G (根據Kabat EU索引編號)。在一個實施例中，Fc結構域包含位置P329之胺基酸取代及選自E233、L234、L235、N297及P331之位置之其他胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在更具體實施例中，另一胺基酸取代係E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定實施例中，Fc結構域包含位置P329、L234及L235之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在更特定實施例中，Fc結構域包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G (「P329G LALA」、「PGLALA」或「LALAPG」)。尤其，在特定實施例中，Fc結構域之每一亞單元包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G (Kabat EU索引編號)，即在Fc結構域之第一及第二亞單元之每一者中，位置234之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L234A)，位置235之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L235A)且位置329之脯胺酸殘基由甘胺酸殘基置換(P329G) (根據Kabat EU索引編號)。
在一個該實施例中，Fc結構域係IgG1 Fc結構域、特定而言人類IgG1 Fc結構域。胺基酸取代之「P329G LALA」組合幾乎完全廢除人類IgG1 Fc結構域之Fcγ受體(以及補體)結合，如PCT公開案第WO 2012/130831號中所述，該案件之全文以引用方式併入本文中。WO 2012/130831亦闡述製備該突變Fc結構域之方法及測定其性質(例如Fc受體結合或效應功能)之方法。
與IgG1 抗體相比，IgG4 抗體展現降低之與Fc受體之結合親和性及降低之效應功能。因此，在一些實施例中，本發明之雙特異性抗體之Fc結構域係IgG4 Fc結構域、特定而言人類IgG4 Fc結構域。在一個實施例中，IgG4 Fc結構域包含位置S228之胺基酸取代、特定而言胺基酸取代S228P (根據Kabat EU索引編號)。為進一步降低IgG4 Fc結構域與Fc受體之結合親和性及/或其效應功能，在一個實施例中，該IgG4 Fc結構域包含位置L235之胺基酸取代、尤其胺基酸取代L235E (根據Kabat EU索引編號)。在另一實施例中，IgG4 Fc結構域包含位置P329之胺基酸取代、尤其胺基酸取代P329G (根據Kabat EU索引編號)。在特定實施例中，IgG4 Fc結構域包含位置S228、L235及P329之胺基酸取代、尤其胺基酸取代S228P、L235E及P329G (根據Kabat EU索引編號)。該等IgG4 Fc結構域突變體及其Fcγ受體結合性質闡述於PCT公開案第WO 2012/130831號中，其全部內容以引入方式併入本文中。
在特定實施例中，與天然IgG1 Fc結構域相比展現降低之與Fc受體之結合親和性及/或降低之效應功能的Fc結構域係包含胺基酸取代L234A、L235A及視情況P329G之人類IgG1 Fc結構域、或包含胺基酸取代S228P、L235E及視情況P329G之人類IgG4 Fc結構域(根據Kabat EU索引編號)。
在某些實施例中，已消除Fc結構域之N-醣基化。在一個該實施例中，Fc結構域包含位置N297之胺基酸突變、特定而言由丙胺酸(N297A)或天冬胺酸(N297D)置換天冬醯胺之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。
除上文及PCT公開案第WO 2012/130831號中所闡述之Fc結構域外，具有降低之Fc受體結合及/或效應功能之Fc結構域亦包括具有Fc結構域殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之取代的彼等(美國專利第6,737,056號) (根據Kabat EU索引編號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂「DANA」 Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
突變Fc結構域可藉由胺基酸缺失、取代、插入或修飾使用業內熟知之基因或化學方法製得。基因方法可包括編碼DNA序列之位點特異性誘變、PCR、基因合成及諸如此類。可(例如)藉由測序來驗證正確之核苷酸變化。
可容易地(例如)藉由ELISA或藉由表面電漿共振(SPR)使用標準設備(例如BIAcore儀器(GE Healthcare))來測定與Fc受體之結合，且Fc受體(例如)可藉由重組表現獲得。或者，可使用已知表現特定Fc受體之細胞系(例如表現FcγIIIa受體之人類NK細胞)評估Fc結構域或包含Fc結構域之雙特異性抗體針對Fc受體之結合親和性。
Fc結構域或包含Fc結構域之雙特異性抗體之效應功能可藉由業內已知之方法量測。用以評價所關注分子之ADCC活性之活體外分析的實例闡述於以下中：美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人 Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人，J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)。另一選擇為，可採用非放射性分析方法(例如參見用於流式細胞術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)及CytoTox 96® 非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。可用於該等分析之效應細胞包括末梢血單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。另一選擇為或另外，可在活體內評價所關注分子之ADCC活性，例如在動物模型中評價，例如Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)中所揭示之動物模型。
在一些實施例中，Fc結構域與補體組分、尤其與C1q之結合降低。因此，在其中Fc結構域經改造以具有降低之效應功能之一些實施例中，該降低之效應功能包括降低之CDC。可實施C1q結合分析以確定Fc結構域或包含Fc結構域之雙特異性抗體是否能夠結合C1q且因此具有CDC活性。例如參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評價補體活化，可實施CDC分析(例如參見Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202, 163 (1996)；Cragg等人，Blood 101, 1045-1052 (2003)；及Cragg及Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004))。
亦可使用業內已知方法來實施FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(例如，參見Petkova, S.B.等人，Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)；WO 2013/120929)。
在另一態樣中，上文任一實施例之抗HLA-G抗體可單獨或組合納入任一特徵，如下文在第1-6部分中所闡述：
1. 抗體親和性 在某些實施例中，本文所提供抗體之解離常數KD為≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如，10-8 M或更小，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。
在一個較佳實施例中，使用表面電漿共振分析使用BIACORE® ，在25℃下利用約10個反應單位(RU)下之經固定抗原CM5晶片量測KD。簡言之，根據供應商說明書，用N -乙基-N’ -(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N -羥基琥珀醯亞胺(NHS)來活化羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5，BIACORE, Inc.)。用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5 μg/ml (約0.2 μM)，然後以5 μl/分鐘之流速注射以達成約10反應單位(RU)之偶合蛋白質。在注射抗原後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測，在25℃下以約25 μl/min之流速注射Fab於含有0.05%聚山梨醇酯20 (TWEEN-20TM )表面活性劑之PBS (PBST)中之兩倍連續稀釋物(0.78 nM至500 nM)。締合速率(kon 或ka)及解離速率(koff 或kd)係使用簡單一對一Langmuir結合模型(BIACORE® 評估軟體3.2版)藉由同時擬合締合及解離感測圖來計算。平衡解離常數KD計算為比率kd/ka (koff /kon )。例如參見Chen Y.等人，J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881。若藉由上述表面電漿共振分析測得之上速率超過106 M-1 s-1 ，則上速率可藉由使用螢光猝滅技術進行測定，該技術在25℃下於增加濃度之抗原存在下量測存於PBS (pH 7.2)中之20 nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度的增加或降低(激發波長= 295 nm；發射波長= 340 nm，16 nm帶通)，如於分光光度計中所量測，例如帶有攪拌比色杯之停流裝備之分光光度計(Aviv Instruments)或8000-系列SLM-AMINCOTM 分光光度計(ThermoSpectronic)。
2. 抗體片段 在某些實施例中，本文所提供之抗體係抗體片段。抗體片段包括(但不限於) Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2 、Fv及scFv片段及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson, P.J.等人，Nat. Med. 9 (2003) 129-134。關於scFv片段之綜述，參見(例如) Plueckthun, A., 於The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷，Rosenburg及Moore (編輯), Springer-Verlag, New York (1994)， 第269-315頁；亦參見WO 93/16185；及美國專利第 5,571,894及5,587,458。關於包含補救受體結合抗原決定基殘基且具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab’)2 片段的論述，參見美國專利號5,869,046。
雙鏈抗體係具有兩個抗原結合位點之可為二價或雙特異性之抗體片段。參見(例如) EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson, P.J.等人，Nat. Med. 9 (2003) 129-134；及Holliger, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448。三價抗體及四價抗體亦闡述於Hudson, P.J.等人，Nat. Med. 9 (20039 129-134)中。
單一結構域抗體係包含抗體中重鏈可變結構域之全部或一部分或輕鏈可變結構域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單一結構域抗體係人類單一結構域抗體(Domantis, Inc.，Waltham, MA；例如，參見美國專利第6,248,516 B1號)。
可藉由各種技術來製備抗體片段，包括(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E. coli )或噬菌體)來產生，如本文所述。
3. 嵌合及人類化抗體 在某些實施例中，本文所提供抗體係嵌合抗體。某些嵌合抗體闡述於(例如)美國專利第4,816,567號；及Morrison, S.L.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984) 6851-6855)中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如，源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(例如猴子)之可變區)及人類恆定區。在又一實例中，嵌合抗體係類別或亞類已自親代抗體發生變化之類別轉換摂抗體。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體係人類化抗體。通常，將非人類抗體人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親代非人類抗體之特異性及親和性。通常，人類化抗體包含一或多個可變結構域，其中HVR (例如，CDR)(或其部分)係源自非人類抗體，且FR(或其部分)係源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，產生HVR殘基之抗體)之相應殘基取代以(例如)恢復或改良抗體特異性或親和性。
人類化抗體及其製備方法綜述於(例如) Almagro, J.C.及Fransson, J.,Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633，且進一步闡述於以下中：例如Riechmann, I.等人，Nature 332 (1988) 323-329；Queen, C.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri, S.V.等人， Methods 36: (2005) 25-34 (闡述SDR (a-CDR)接枝)；Padlan, E.A.,Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (闡述「表面重塑」)；Dall’Acqua, W.F.等人，Methods 36 (2005) 43-60 (闡述「FR改組」)；及Osbourn, J.等人，Methods 36 (2005) 61-68及Klimka, A.等人，Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (闡述FR改組之「引導選擇」方法)。
可用於人類化之人類框架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(例如，參見Sims, M.J.等人，J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308；源自具有輕鏈或重鏈可變區之特定亞組之人類抗體之共有序列的框架區(例如，參見Carter, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及Presta, L.G.等人，J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632)；人類成熟(體細胞突變)框架區或人類種系框架區(例如，參見Almagro, J.C.及Fransson, J.,Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633)；及源自篩選FR文庫之框架區(例如，參見Baca, M.等人，J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684及Rosok, M.J.等人，J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)。
4. 人類抗體 在某些實施例中，本文所提供抗體係人類抗體。可使用業內已知之各種技術來產生人類抗體。人類抗體通常闡述於van Dijk及van de Winkel, J.G. Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374及Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459中。
可藉由向轉基因動物投與免疫原來製備人類抗體，該轉基因動物已經改良以產生完整人類抗體或具有因應抗原性攻擊之人類可變區的完整抗體。此等動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，該等基因座置換內源免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此等轉基因小鼠中，內源免疫球蛋白基因座通常已不活化。關於自轉基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125。亦參見(例如)美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，其闡述XENOMOUSETM 技術；美國專利第5,770,429號，其闡述HUMAB®技術；美國專利第7,041,870號，其闡述K-M MOUSE®技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，其闡述VELOCIMOUSE®技術。可進一步(例如)藉由與不同人類恆定區組合來修飾由此等動物產生之完整抗體的人類可變區。
人類抗體亦可藉由基於雜交瘤之方法來製備。已闡述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞系。(例如，參見Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005；Brodeur, B.R.等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987)， 第51-63頁；及Boerner, P.等人，J. Immunol. 147 (1991) 86-95)經由人類B細胞雜交瘤技術生成之人類抗體亦闡述於(例如) Li, J.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562中。額外方法包括以下中闡述之彼等：例如美國專利第7,189,826號(闡述自雜交瘤細胞系產生單株人類IgM抗體)及Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (闡述人類-人類雜交瘤)。人類融合瘤技術(三源雜交瘤(Trioma)技術)亦闡述於Vollmers, H.P.及Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937及Vollmers, H.P.及Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191中。
亦可藉由分離選自人類源噬菌體顯示文庫之Fv純系可變結構域序列來產生人類抗體。隨後，此等可變結構域序列可與期望之人類恆定結構域組合。自抗體文庫選擇人類抗體之技術闡述於下文中。
5. 文庫源性抗體 可藉由在組合文庫中篩選具有期望活性之抗體來分離本發明抗體。舉例而言，業內已知用於產生噬菌體展示文庫及自該等文庫篩選具有期望結合特徵之抗體的各種方法。此等方法綜述於(例如) Hoogenboom, H.R.等人, Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37中且進一步闡述於(例如)以下文獻中：McCafferty, J.等人, Nature 348 (1990) 552-554；Clackson, T.等人, Nature 352 (1991) 624-628；Marks, J.D.等人, J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597；Marks, J.D.及Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175；Sidhu, S.S.等人, J. Mol. Biol. 338 (2004)299-310；Lee, C.V.等人, J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093；Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472；及Lee, C.V.等人, J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132。
在某些噬菌體展示方法中，藉由聚合酶鏈式反應(PCR)單獨選殖VH及VL基因譜且在噬菌體文庫中隨機重組，然後可針對結合抗原之噬菌體篩選該等噬菌體文庫，如Winter, G.等人，Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455中所述。噬菌體通常展示抗體片段，呈單鏈Fv (scFv)片段形式或呈Fab片段形式。來自經免疫來源之文庫可向免疫原提供高親和性抗體而無需構築雜交瘤。或者，可對天然譜進行選殖(例如，自人類)以不經任何免疫即提供針對眾多中非自體抗原亦及自體抗原之抗體之單一來源，如Griffiths, A.D.等人，EMBO J. 12 (1993) 725-734中所述。最後，亦可藉由以下方式合成製備天然文庫：自幹細胞選殖未重排V-基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引物編碼高可變CDR3區並完成活體外重排，如Hoogenboom, H.R.及Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388中所述。闡述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括(例如)：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第 2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
在本文中將自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段視為人類抗體或人類抗體片段。
6. 抗體變體 在某些實施例中，涵蓋本文提供抗體之胺基酸序列變體。舉例而言，可能期望改良抗體之結合親和性及/或其他生物學性質。抗體之胺基酸序列變體可藉由向編碼抗體之核苷酸序列中引入適當修飾或藉由肽合成來製備。此等修飾包括(例如)抗體胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入及取代之任一組合以獲得最終構築體，前提為最終構築體具有期望特性，例如抗原結合性。
a) 取代、插入及缺失變體 在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變體。用於取代突變誘發之所關注位點包括HVR及FR。實例性變化提供於表1之「實例性取代」標題下，且如下文參照胺基酸側鏈類別進一步所述。保守取代示於表1中之「較佳取代」標題下。可將胺基酸取代引入所關注抗體及經篩選具有期望活性之產物中，該期望活性係(例如)保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或經改良之ADCC或CDC。
表1
可根據常見側鏈性質將胺基酸分組：
(1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3) 酸性：Asp、Glu；
(4) 鹼性：His、Lys、Arg；
(5) 影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；
(6) 芳香族殘基：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代使得需要將該等類別之一種之成員與另一類別交換。
一種取代變體類型涉及取代親代抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個超變區殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變體相對於親代抗體在某些生物學性質(例如，增加之親和性、降低之免疫原性)中具有修飾(例如，改良)及/或實質上保留親代抗體之某些生物學性質。實例性取代變體係親和性成熟抗體，其可便利地(例如)使用基於噬菌體展示之親和性成熟技術(例如彼等闡述於本文中者)生成。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且將變體抗體展示於噬菌體上並篩選特定生物學活性(例如結合親和性)。
可對HVR作出改變(例如，取代)以(例如)改良抗體親和性。此等改變可在HVR「熱點」 (亦即，由在體細胞成熟過程期間經受高頻率突變之密碼子編碼的殘基) (例如，參見Chowdhury, P.S.，Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196)及/或SDR (a-CDR)中進行，其中測試所得變體VH或VL之結合親和性。藉由自二級文庫構築並再選擇之親和性成熟已闡述於(例如) Hoogenboom, H.R.等人之Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37中。在親和性成熟之一些實施例中，藉由各種方法中之任一者(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸指導的誘變)將多樣性引入針對成熟選擇之可變基因中。隨後建立二級文庫。隨後篩選文庫以鑑別具有期望親和性之任一抗體變體。引入多樣性之另一方法涉及HVR指導的方法，其中將若干HVR殘基(例如，一次4至6個殘基)隨機化。可特定鑑別(例如，使用丙胺酸掃描誘變或建模)參與抗原結合之HVR殘基。具體而言，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生於一或多個HVR內，只要此等變化不會實質上降低抗體結合抗原之能力即可。例如，可對HVR作出不實質上降低結合親和性之保守改變(例如，本文所提供之保守取代)。該等改變可位於HVR 「熱點」或SDR外部。在上文所提供之變體VH及VL序列之某些實施例中，每一HVR未經改變，或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
將用於鑑別抗體上可靶向用於誘變之殘基或區的有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如由Cunningham, B.C.及Wells, J.A., Science, 244 (1989) 1081-1085所闡述。在此方法中，已鑑別殘基或目標殘基組(例如，帶電殘基，例如arg、asp、his、lys及glu)，並由中性或帶負電之胺基酸(例如，丙胺酸或多丙胺酸)置換以確定是否影響抗體與抗原之相互作用。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置引入其他取代。另一選擇為或另外，抗原-抗體複合體之晶體結構以鑑別抗體與抗原間之接觸點。可靶向該等接觸殘基及相鄰殘基作為取代候選物或將其消除。可篩選變體以確定其是否含有期望特性。
胺基酸序列插入包括胺基-及/或羧基末端融合物(長度在一個殘基至含有上百或更多殘基之多肽範圍內)、以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N-末端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變體包括抗體N端或C端與酶(例如用於ADEPT)或延長抗體血清半衰期之多肽之融合物。
b) Fc區變體 在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供抗體之Fc區中，藉此產生Fc區變體。Fc區變體可包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)。
具有降低之效應功能之抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者具有取代者(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者具有取代之Fc突變體，包括在殘基265及297經丙胺酸取代之所謂「DANA」 Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
闡述具有經改良或降低之FcR結合的某些抗體變體。(參見(例如)美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312，及Shields, R.L.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)
在一個實施例中，本發明之該抗體係具有突變L234A及L235A或具有突變L234A、L235A及P329G之IgG1。在另一實施例中，或具有突變S228P及L235E或S228P、L235E或及P329G之IgG4 (根據Kabat等人之EU索引編號，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)
具有延長之半衰期及改良之與新生兒Fc受體(FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒中)之結合之抗體(Guyer, R.L.等人，J. Immunol. 117 (1976) 587-593及Kim, J.K.等人，J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434)闡述於US 2005/0014934中。彼等抗體包含具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代之Fc區。此等Fc變體包括在以下Fc區殘基之一或多者具有取代者：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，取代Fc區殘基434 (美國專利第7,371,826號)。
關於Fc區變體之其他實例，亦參見Duncan, A.R.及Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351。
c). 經半胱胺酸改造之抗體變體 在某些實施例中，可期望產生半胱胺酸改造之抗體，例如「硫代MAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代殘基在抗體之可及位點出現。如本文進一步所述，藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團由此位於抗體之可及位點處且可用於使抗體偶聯至其他部分(例如藥物部分或連接體-藥物部分)以產生免疫偶聯物。在某些實施例中，以下殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)、重鏈之A118 (EU編號)及重鏈Fc區之S400 (EU編號)。半胱胺酸改造之抗體可如(例如)美國專利第7,521,541號中所述來生成。
d)抗體衍生物 在某些實施例中，可進一步修飾本文所提供抗體以含有業內已知且易於獲得之額外非蛋白質性部分。適於衍生抗體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯基基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化之多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中具有穩定性而在製造方面具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為具支鏈或不具支鏈。連接至抗體之聚合物的數目可有所變化，且若連接一個以上聚合物，則其可為相同或不同分子。通常，用於衍生化之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)以下在內之考慮因素來確定：欲改良抗體之特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於界定條件下之療法等。
在另一實施例中，提供抗體與非蛋白質性部分之偶聯物，其可藉由暴露於輻射來選擇性加熱。在一個實施例中，非蛋白質性部分係碳奈米管(Kam, N.W.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605)。輻射可具有任一波長，且包括(但不限於)如下波長之輻射：其不會危害正常細胞，但將非蛋白質性部分加熱至可將毗鄰抗體-非蛋白質性部分之細胞殺滅的溫度。
B. 重組方法及組合物 可使用重組方法及組合物來產生抗體，例如，如美國專利第4,816,567號中所述。在一個實施例中，提供本文所述之編碼抗HLA-G抗體之分離核酸。此核酸可編碼抗體中包含VL之胺基酸序列及/或包含VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在其他實施例中，提供一或多個包含此核酸之載體(例如，表現載體)。在其他實施例中，提供包含此核酸之宿主細胞。在一個此實施例中，宿主細胞包含以下物質(例如，已經該等物質轉化)：(1)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及包含抗體之VH之胺基酸序列之核酸的載體，或(2)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列之核酸的第一載體，及包含編碼包含抗體之VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞係真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HEK293細胞或淋巴樣細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供製備抗HLA-G抗體之方法，其中該方法包含在適於表現抗體之條件下培養包含編碼如上文所提供抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
對於抗HLA-G抗體之重組產生，分離(例如)如上文所述之編碼抗體之核酸並將其插入一或多個載體中以供進一步選殖及/或在宿主細胞中表現。此核酸可使用習用程序(例如，藉由使用能與編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)容易地分離並測序。
用於選殖或表現編碼抗體之載體之適宜宿主細胞包括本文所述原核或真核細胞。舉例而言，抗體可在細菌中產生，尤其在無需醣基化及Fc效應功能時。關於抗體片段及多肽於細菌中之表現，參見例如 US 5,648,237, US 5,789,199及US 5,840,523。(亦參見Charlton, K.A.，於Methods in Molecular Biology, 第248卷, Lo, B.K.C. (編輯), Humana Press, Totowa, NJ (2003)， 第245-254頁，闡述抗體片段於大腸桿菌中之表現。)在表現後，抗體可自可溶性部分中之細菌細胞糊分離且可進一步純化。
除原核生物外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母)亦係編碼抗體之載體之適宜選殖或表現宿主，包括醣基化路徑已「人類化」的真菌及酵母菌株，造成產生具有部分或完全人類醣基化模式之抗體。參見Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及Li, H.等人, Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215。
用於表現醣基化抗體之適宜宿主細胞亦源自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別多種桿狀病毒株可與昆蟲細胞聯合使用，特別是用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda )細胞。
亦可利用植物細胞培養物作為宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(闡述用於轉基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM 技術)。
亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。舉例而言，可使用適於懸浮液中生長之哺乳動物細胞系。有用之哺乳動物宿主細胞系之其他實例係由SV40轉化之猴腎臟CV1系(COS-7)；人類胚胎腎臟細胞系(293或293細胞，如Graham, F.L.等人，J. Gen Virol.36 (1977) 59-74中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠賽特利(sertoli)細胞(TM4細胞，如Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cell) (BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如Mather, J.P.等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68中所述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他可用哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub, G.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)；及骨髓瘤細胞系，例如Y0、NS0及Sp2/0。關於某些適於抗體產生之哺乳動物宿主細胞系之綜述，參見例如 Yazaki, P.及Wu, A.M., Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo, B.K.C. (編輯)，Humana Press, Totowa, NJ (2004)，第255-268頁。
C. 分析 可藉由業內已知之各種分析來鑑別本文所提供之抗HLA-G抗體、篩選或表徵其物理/化學性質及/或生物活性。
1. 結合分析及其他分析 在一個態樣中，例如，藉由已知方法(例如ELISA、西方墨點等)測試本發明抗體之抗原結合活性。
在另一態樣中，競爭分析可用於鑑別與HLA-G-0032 (包含SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列)競爭結合至HLA-G的抗體。本發明之一個實施例係與包含SEQ ID NO:7之VH序列之所有3個HVR及SEQ ID NO:8之VL序列之所有3個HVR的抗HLA-G抗體競爭結合至人類HLA-G的抗體。在某些實施例中，該競爭抗體結合至由抗HLA-G抗體HLA-G-0032結合之相同表位(例如線性或構形表位)。在一個實施例中，提供與包含SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列之抗體結合至HLA-G上之相同表位的抗HLA-G抗體。在另一態樣中，競爭分析可用於鑑別與HLA-G-0037 (包含SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列)競爭結合至HLA-G的抗體。本發明之一個實施例係與包含SEQ ID NO:15之VH序列之所有3個HVR及SEQ ID NO:16之VL序列之所有3個HVR的抗HLA-G抗體競爭結合至人類HLA-G的抗體。在某些實施例中，該競爭抗體結合至由抗HLA-G抗體HLA-G-0037結合之相同表位(例如線性或構形表位)。在一個實施例中，提供與包含SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列之抗體結合至HLA-G上之相同表位的抗HLA-G抗體。用於定位抗體所結合之表位之詳細實例性方法提供於以下中：Morris, G.E. (編輯), Epitope Mapping Protocols，Methods in Molecular Biology, 第66卷, Humana Press, Totowa, NJ (1996)。
在實例性競爭分析中，在溶液中培育固定之HLA-G，該溶液包含結合至HLA-G之第一標記之抗體(例如抗HLA-G抗體HLA-G-0032或HLA-G.0037)及針對其與第一抗體競爭結合至HLA-G之能力進行測試的第二未經標記之抗體。第二抗體可存於雜交瘤上清液中。作為對照，在包含第一經標記抗體但不包含第二未經標記抗體之溶液中培育固定之HLA-G。在允許第一抗體與HLA-G之條件下培育後，去除過量未結合抗體，並量測與固定HLA-G結合之標記的量。若與固定化HLA-G締合之標記之量在測試樣品中相對於對照樣品顯著降低，則此指示第二抗體與第一抗體競爭結合至HLA-G。參見Harlow, E.及Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, 第14章, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)。對於另一實例性競爭分析，參見實例2 (表位定位ELISA/結合競爭分析)。
2. 活性分析 在一個態樣中，提供分析以鑑別其具有生物活性之抗HLA-G抗體。生物活性可包括例如增強不同免疫細胞(包括T細胞)之活化及/或增殖的能力。例如，其增強免疫調節細胞介素(例如干擾素-γ (IFN-γ)及/或腫瘤壞死因子α (TNF α))之分泌。其他或可被增強之免疫調節細胞介素係例如IL1ß、IL6、IL12、顆粒酶B等，結合至不同細胞類型。亦提供在活體內及/或活體外具有此生物活性之抗體。
在某些實施例中，本發明抗體針對該生物活性經測試，如(例如)下文實例中所述。
D.用於診斷及檢測之方法及組合物 在某些實施例中，本文所提供抗HLA-G抗體中之任一者皆可用於檢測生物試樣中HLA-G之存在。如本文所用之術語「檢測」涵蓋定量或定性檢測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織，例如免疫細胞或T細胞浸潤物及或腫瘤細胞。
在一個實施例中，提供用於診斷或檢測方法中之抗HLA-G抗體。在又一態樣中，提供檢測生物試樣中HLA-G之存在之方法。在某些實施例中，該方法包含使生物樣品與如本文所述之抗HLA-G抗體在允許抗HLA-G抗體結合至HLA-G之條件下接觸，及檢測在抗HLA-G抗體與HLA-G之間是否形成複合體。該方法可為活體外或活體內方法。在一個實施例中，使用抗HLA-G抗體來選擇適用於使用抗HLA-G抗體之療法的個體，例如，其中HLA-G係用於選擇患者之生物標記物。
在某些實施例中，提供經標記之抗HLA-G抗體。標記包括(但不限於)直接檢測之標記或部分(例如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記)以及經由(例如)酶促反應或分子相互作用間接檢測之部分(例如酶或配體)。實例性標記包括(但不限於)放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H及131 I、螢光團(例如稀土螯合物或螢光黃(fluorescein)及其衍生物)、玫瑰紅(rhodamine)及其衍生物、丹磺醯(dansyl)、傘形酮(umbelliferone)、螢光素酶(例如，螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶，美國專利第4,737,456號)、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、山葵過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶)、雜環氧化酶(例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化酶等採用過氧化氫來氧化染料前體之酶偶合)、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、噬菌體標記、穩定自由基及諸如此類。
E. 醫藥調配物 如本文所述抗HLA-G抗體之醫藥調配物係藉由混合具有期望純度之該抗體與一或多種醫藥上可接受之可選載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版，Osol, A. (編輯) (1980))以凍乾之調配物或水溶液形式製得。醫藥上可接受之載劑通常在所用劑量及濃度下對受體無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲氯銨；氯化苄烷銨；氯化苄甲乙氧銨；酚類、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚(乙烯吡咯啶酮)；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文之實例性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如，人類可溶性PH-20透明質酸酶醣蛋白，例如rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)。某些實例性sHASEGP及使用方法(包括rhuPH20)闡述於美國專利公開案第 2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一態樣中，將sHASEGP與一或多種額外糖胺聚醣酶(例如軟骨素酶)組合。
實例性凍乾抗體調配物闡述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括闡述於美國專利第6,171,586號及WO 2006/044908中之彼等，後一些調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文之調配物亦可視需要含有一種以上用於所治療之特定適應症之活性成分，較佳為具有不會對彼此造成不利影響之補充活性之彼等。舉例而言，可期望進一步提供。該等活性成分適宜地以有效地用於預期目的之量以組合形式存在。
活性成分亦可分別裝入藉由(例如)凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊(例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠質藥物遞送系統(例如，脂質粒、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或粗滴乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, Osol, A. (編輯) (1980)中。
可製備持續釋放型製劑。持續釋放製劑之適宜實例包括含有抗體之固體疏水聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物件之形式，例如，膜或微膠囊。
欲用於活體內投與之調配物通常為無菌的。無菌性可藉由(例如)經由無菌過濾膜進行過濾來容易地達成。
F.治療方法及組合物 本文提供之抗HLA-G抗體(或抗原結合蛋白)中之任一者可用於治療方法中。
在一個態樣中，提供用作藥劑之抗HLA-G抗體。在其他態樣中，提供治療癌症之抗HLA-G抗體或用途。在某些實施例中，提供用於治療方法中之抗HLA-G抗體。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有癌症之個體之方法之抗HLA-G抗體，該方法包含向個體投與有效量之抗HLA-G抗體。
在其他實施例中，本發明提供抗HLA-G抗體，其用作免疫調節劑以用於直接或間接誘導免疫細胞之增殖、活化(例如藉由分泌免疫刺激細胞介素(如TNF阿爾法(TNFa)及IFN伽馬(IFNg)))或進一步招募免疫細胞。在某些實施例中，本發明提供抗HLA-G抗體，其用於個體中之免疫調節方法，來直接或間接誘導免疫細胞之增殖、活化(例如藉由分泌免疫刺激細胞介素(如TNFa及IFNγ))或進一步招募免疫細胞，該方法包含向該個體投與有效量之抗HLA-G抗體用於免疫調節來直接或間接誘導免疫細胞之增殖、活化(例如藉由分泌免疫刺激細胞介素(如TNFa及IFNγ))或進一步招募免疫細胞。
在其他實施例中，本發明提供作為免疫刺激劑用於刺激腫瘤壞死因子α (TNF α)分泌之抗HLA-G抗體。在某些實施例中，本發明提供抗HLA-G抗體，其用於個體中之免疫調節方法，來直接或間接誘導免疫細胞之增殖、活化(例如藉由分泌免疫刺激細胞介素(如TNFa及IFNg))或進一步招募免疫細胞，該方法包含向該個體投與有效量之抗HLA-G抗體用於免疫調節來直接或間接誘導免疫細胞之增殖、活化(例如藉由分泌免疫刺激細胞介素(如TNFa及IFNg))或進一步招募免疫細胞。
根據上述實施例中之任一者之「個體」較佳係人類。在另一態樣中，本發明提供抗HLA-G抗體在製造或製備藥劑中之用途。在一個實施例中，該藥劑係用於治療癌症。在另一實施例中，該藥劑用於治療癌症之方法中，該方法包含向患有癌症之個體投與有效量之藥劑。在另一實施例中，該藥劑用於誘導細胞介導之癌細胞溶解。在另一實施例中，該藥劑用於患有癌症之個體中誘導細胞介導之癌細胞溶解之方法中，該方法包含向個體投與有效量之藥劑以誘導癌細胞中之細胞凋亡/或抑制癌細胞增殖。上文任一實施例之「個體」可係人類。
在另一態樣中，本發明提供用於治療癌症之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有癌症之個體投與有效量之抗HLA-G。上文任一實施例之「個體」可係人類。
在另一態樣中，本發明提供在患有癌症之個體中誘導細胞介導之癌細胞溶解的方法。在一個實施例中，該方法包含向個體投與有效量之抗HLA-G以誘導患有癌症之個體中細胞介導之癌細胞溶解。在一個實施例中，「個體」係人類。
在又一態樣中，本發明提供醫藥調配物，其包含本文所提供抗HLA-G抗體中之任一者以供(例如)用於上述治療方法中之任一者中。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文所提供任一抗HLA-G抗體及醫藥上可接受之載劑。
本發明抗體(及任一額外治療劑)可藉由任何適宜方式投與，包括非經腸、肺內、及鼻內以及(若期望用於局部治療)病灶內投與。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜腔內或皮下投與。可藉由任一適宜途徑、例如藉由注射、例如靜脈內或皮下注射投藥，此部分取決於投與係短期投與抑或長期投與。本文涵蓋各種投藥方案，包括(但不限於)在各個時間點單次或多次投與、濃注投與及脈衝輸注。
本發明抗體應以符合良好醫療實踐之方式調配、投藥及投與。在此上下文中需考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個體患者之臨床狀況、病因、醫藥之遞送位點、投與方法、投與時間安排及從業醫師所知之其他因素。抗體無需但視情況與一或多種當前用於預防或治療所論述病症之藥劑一起調配。此等其他藥劑之有效量端視調配物中所存在抗體之量、病症或治療之類型及上文所討論之其他因素而定。該等藥劑通常係以相同劑量及使用如本文所闡述之投與途徑或約1%至99%之本文所闡述之劑量或以任一劑量及藉由任一在經驗上/臨床上確定為適當之途徑來使用。
對疾病之預防或治療而言，本發明抗體之合適劑量(當單獨使用或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)應端視欲治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重程度及病程、投與抗體係用於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。將抗體適宜地一次性或在一系列治療內投與患者。端視疾病之類型及嚴重程度，不論(例如)藉由一或多次分開投與抑或藉由連續輸注來投與，約1 µg/kg至15 mg/kg (例如0.5 mg/kg至10 mg/kg)抗體可係投與患者之初始候選劑量。端視上述因素而定，一個典型日劑量可介於約1 µg/kg至100 mg/kg之間或更高。對於在若干天或更長時間內重複投與而言，端視病況而定，治療通常持續至對疾病症狀之期望阻抑出現為止。抗體之一種實例性劑量介於約0.05 mg/kg至約10 mg/kg之間。因此，可向患者投與一或多個約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任一組合)之劑量。該等劑量可間歇性投與，例如每週或每三週一次(例如，應使得患者接受約二至約二十或(例如)約六個劑量之抗體)。可投與初始較高負載劑量，隨後投與一或多個較低劑量。實例性投藥方案包括投與約4 mg/kg抗體之初始負荷劑量，隨後投與約2 mg/kg抗體之每週維持劑量。然而，可使用其他劑量方案。此療法之進展係容易地藉由習用技術及分析來監測。
應瞭解，可使用本發明之免疫偶聯物代替抗HLA-G抗體或與抗HLA-G抗體一起來實施任一上述調配物或治療方法。
應瞭解，可使用本發明之免疫偶聯物代替抗HLA-G抗體或與抗HLA-G抗體一起來實施任一上述調配物或治療方法。
II.製品 在本發明之另一態樣中，提供含有可用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料的製品。該製品包含容器及位於該容器上或與該容器相關之標記或包裝插頁。適宜容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可自諸如玻璃或塑膠等眾多種材料形成。容器裝有自身或與另一組合物組合時可有效治療、預防及/或診斷病況之組合物，且可具有無菌存取通道(例如，該容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。該組合物中至少一種活性劑係本發明抗體。標記或包裝插頁指示該組合物用於治療選定病況。另外，該製品可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明抗體；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病況之包裝插頁。另一選擇為或另外，該製品可進一步包含第二(或第三)容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝劑，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者角度來看期望之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、濾膜、針及注射器。
提供以下實例及圖以幫助理解本發明，本發明之實際範圍係闡述於隨附申請專利範圍中。應理解，可在不背離本發明精神之情況下修改程序。
胺基酸序列之說明 抗HLAG抗原結合位點(可變區及超變區(HVR))：
SEQ ID NO: 1 重鏈HVR-H1、HLA-G-0031
SEQ ID NO: 2 重鏈HVR-H2、HLA-G-0031
SEQ ID NO: 3 重鏈HVR-H3、HLA-G-0031
SEQ ID NO: 4 輕鏈HVR-L1、HLA-G-0031
SEQ ID NO: 5 輕鏈HVR-L2、HLA-G-0031
SEQ ID NO: 6 輕鏈HVR-L3、HLA-G-0031
SEQ ID NO: 7 重鏈可變結構域VH、HLA-G-0031
SEQ ID NO: 8 輕鏈可變結構域VL、HLA-G-0031
SEQ ID NO: 9 重鏈HVR-H1、HLA-G-0039
SEQ ID NO: 10 重鏈HVR-H2、HLA-G-0039
SEQ ID NO: 11 重鏈HVR-H3、HLA-G-0039
SEQ ID NO: 12 輕鏈HVR-L1、HLA-G-0039
SEQ ID NO: 13 輕鏈HVR-L2、HLA-G-0039
SEQ ID NO: 14 輕鏈HVR-L3、HLA-G-0039
SEQ ID NO: 15 重鏈可變結構域VH、HLA-G-0039
SEQ ID NO: 16 輕鏈可變結構域VL、HLA-G-0039
SEQ ID NO: 17 重鏈HVR-H1、HLA-G-0041
SEQ ID NO: 18 重鏈HVR-H2、HLA-G-0041
SEQ ID NO: 19 重鏈HVR-H3、HLA-G-0041
SEQ ID NO: 20 輕鏈HVR-L1、HLA-G-0041
SEQ ID NO: 21 輕鏈HVR-L2、HLA-G-0041
SEQ ID NO: 22 輕鏈HVR-L3、HLA-G-0041
SEQ ID NO: 23 重鏈可變結構域VH、HLA-G-0041
SEQ ID NO: 24 輕鏈可變結構域VL、HLA-G-0041
SEQ ID NO: 25 重鏈HVR-H1、HLA-G-0090
SEQ ID NO: 26 重鏈HVR-H2、HLA-G-0090
SEQ ID NO: 27 重鏈HVR-H3、HLA-G-0090
SEQ ID NO: 28 輕鏈HVR-L1、HLA-G-0090
SEQ ID NO: 29 輕鏈HVR-L2、HLA-G-0090
SEQ ID NO: 30 輕鏈HVR-L3、HLA-G-0090
SEQ ID NO: 31 重鏈可變結構域VH、HLA-G-0090
SEQ ID NO: 32 輕鏈可變結構域VL、HLA-G-0090
SEQ ID NO: 33 人類化變體重鏈可變結構域VH、HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104)
SEQ ID NO: 34 人類化變體輕鏈可變結構域VL、HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104)
其他序列
SEQ ID NO: 35 實例性人類HLA-G
SEQ ID NO: 36 實例性人類HLA-G細胞外結構域(ECD)
SEQ ID NO: 37 實例性人類ß2M
SEQ ID NO: 38 經修飾人類HLA-G (其中HLA-G特異性胺基酸經HLA-A共有胺基酸置換(= 去接枝之HLA-G，亦參見圖1) ECD)
SEQ ID NO: 39 實例性人類HLA-A2
SEQ ID NO: 40 實例性人類HLA-A2 ECD
SEQ ID NO: 41 實例性小鼠H2Kd ECD
SEQ ID NO: 42 實例性大鼠RT1A ECD
SEQ ID NO: 43 實例性人類HLA-G ß2M MHC I類複合體
SEQ ID NO: 44 實例性經修飾人類HLA-G ß2M MHC I類複合體 (其中HLA-G特異性胺基酸經HLA-A共有胺基酸置換(= 去接枝之 HLA-G)，亦參見圖1)
SEQ ID NO: 45 實例性小鼠H2Kd ß2M MHC I類複合體
SEQ ID NO: 46 實例性人類HLA-G/ 小鼠H2Kd ß2M MHC I類複合體，其中針對人類HLA-G具有特異性之位置接枝至小鼠H2Kd框架上
SEQ ID NO: 47 實例性大鼠RT1A ß2M MHC I類複合體
SEQ ID NO: 48 實例性人類HLA-G/ 大鼠RT1A ß2M MHC I類複合體，其中針對人類HLA-G具有特異性之位置接枝至大鼠RT1A框架上
SEQ ID NO: 49 連接體及his-Tag
SEQ ID NO: 50 肽
SEQ ID NO: 51 人類κ輕鏈恆定區
SEQ ID NO: 52 人類λ輕鏈恆定區
SEQ ID NO: 53 源自IgG1之人類重鏈恆定區
SEQ ID NO: 54 源自具有突變L234A、L235A及P329G之IgG1的人類重鏈恆定區
SEQ ID NO: 55 源自IgG4之人類重鏈恆定區
抗CD3抗原結合位點(可變區及超變區(HVR))：
SEQ ID NO: 56 重鏈HVR-H1、CH2527
SEQ ID NO: 57 重鏈HVR-H2、CH2527
SEQ ID NO: 58 重鏈HVR-H3、CH2527
SEQ ID NO: 59 輕鏈HVR-L1、CH2527
SEQ ID NO: 60 輕鏈HVR-L2、CH2527
SEQ ID NO: 61 輕鏈HVR-L3、CH2527
SEQ ID NO: 62 重鏈可變結構域VH、CH2527
SEQ ID NO: 63 輕鏈可變結構域VL、CH2527
雙特異性抗HLA-G/抗CD3 T細胞雙特異性(TCB)抗體：
P1AA1185 (基於HLA-G-0031及CH2527)：
SEQ ID NO: 64 輕鏈1 P1AA1185
SEQ ID NO: 65 輕鏈2 P1AA1185
SEQ ID NO: 66 重鏈1 P1AA1185
SEQ ID NO: 67 重鏈2 P1AA1185
P1AA1185-104 (基於HLA-G-0031-0104及CH2527)
SEQ ID NO: 68 輕鏈1 P1AA1185-104
SEQ ID NO: 69 輕鏈2 P1AA1185-104
SEQ ID NO: 70 重鏈1 P1AA1185-104
SEQ ID NO: 71 重鏈2 P1AA1185-104
P1AD9924 (基於HLA-G-0090及CH2527)
SEQ ID NO: 72 輕鏈1 P1AD992
SEQ ID NO: 73 輕鏈2 P1AD992
SEQ ID NO: 74 重鏈1 P1AD992
SEQ ID NO: 75 重鏈2 P1AD992
其他序列
SEQ ID NO: 76 實例性人類CD3
SEQ ID NO: 77 實例性食蟹猴CD3
抗 HLAG 結合部分之胺基酸序列 ( 可變區加下劃線且粗體超變區 (HVR)) ：
SEQ ID NO: 7：重鏈可變結構域VH、HLA-G-0031：
QVKLMQSGAALVKPGTSVKMSCNASGYTFT DYWVS WVKQSHGKRLEWVG EISPNSGASNFDENF KDKATLTVDKSTSTAYMELSRLTSEDSAIYYCTR SSHGSFRWFAY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 8：輕鏈可變結構域VL、HLA-G-0031：
AIVLNQSPSSIVASQGEKVTITC RASSSVSSNHLH WYQQKPGAFPKFVIY STSQRAS GIPSRFSGSGSGTSYSFTISRVEAEDVATYYC QQGSSNPYT FGAGTKLELK
SEQ ID NO: 33：人類化變體重鏈可變結構域VH、HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104)；
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT DYWVS WVRQAPGQRLEWMG EISPNSGASNFDENF QGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR SSHGSFRWFAY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 34：人類化變體輕鏈可變結構域VL、HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASSSVSSNHLH WYQQKPGKAPKFLIY STSQRAS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC QQGSSNPYT FGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 15：重鏈可變結構域VH、HLA-G-0039：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMN WVRQAPGKGLEWVS VISGSGVSTYYADSVKG RFTISRDNSRNTLSLQMNSLRAEDTAVYYCAK DGSYNYGYGDYFDY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 16：輕鏈可變結構域VL、HLA-G-0039
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVLYSSKNKNYLA WYQQKPGQPPKLFIY WASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQYYNTPRT FGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 23：重鏈可變結構域VH、HLA-G-0041：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS TYGMS WVRQAPGKGLEWVS VISGGGVSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNRLRAEDTAVYYCAK DGSYNYGYGDYFDY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 24：輕鏈可變結構域VL、HLA-G-0041
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQNVLYSSNNKNYLA WYQQKPGQPPKLLIY WASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQYYNTPRT FGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 31：重鏈可變結構域VH、HLA-G-0090：
QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDSVS SNRAAWN WIRQSPSRGLEWLG RTYYRSKWYNDYAVSVQG RITLIPDTSKNQFSLRLNSVTPEDTAVYYCAS VRAVAPFDY WGQGVLVTVSS
SEQ ID NO: 32：輕鏈可變結構域VL、HLA-G-0090
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVLNSSNNKNNLA WYQQQPGQPPKLLIY WASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQYYRTPWT FGQGTKVEIK
抗 CD3 結合部分之胺基酸序列 ( 可變區加下劃線且粗體超變區 (HVR)) ：
SEQ ID NO: 62 重鏈可變結構域VH、CH2527
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN TYAMN WVRQAPGKGLEWVA RIRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVS
SEQ ID NO: 63 輕鏈可變結構域VL、CH2527
QAVVTQESALTTSPGETVTLTC RSSTGAVTTSNYAN WVQEKPDHLFTGLIG GTNKRAP GVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFC ALWYSNLWV FGGGTKLTVLSSASTK
抗 HLA-G/ 抗 CD3 雙特異性抗體 之 胺基酸序列 ：
P1AA1185 ( 基於 HLA-G-0031 及 CH2527) ：
SEQ ID NO: 64 輕鏈1 P1AA1185
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVAR
IRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVR
HGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSAASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV
VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS
KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 65 輕鏈2 P1AA1185
AIVLNQSPSSIVASQGEKVTITCRASSSVSSNHLHWYQQKPGAFPKFVIY STSQRASGIPSRFSGSGSGTSYSFTISRVEAEDVATYYCQQGSSNPYTFG AGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 66 重鏈1 P1AA1185
QVKLMQSGAALVKPGTSVKMSCNASGYTFTDYWVSWVKQSHGKRLEWVGE ISPNSGASNFDENFKDKATLTVDKSTSTAYMELSRLTSEDSAIYYCTRSS HGSFRWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVE DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQ VCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
SEQ ID NO: 67 重鏈2 P1AA1185
QVKLMQSGAALVKPGTSVKMSCNASGYTFTDYWVSWVKQSHGKRLEWVGE ISPNSGASNFDENFKDKATLTVDKSTSTAYMELSRLTSEDSAIYYCTRSS HGSFRWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVE DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQESALTTSPGE TVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSG SLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK THTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
P1AA1185-104 ( 基於 HLA-G-0031-0104 及 CH2527)
SEQ ID NO: 68 輕鏈 1 P1AA1185-104
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVAR
IRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVR
HGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSAASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV
VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS
KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 69 輕鏈 2 P1AA1185-104
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSSNHLHWYQQKPGKAPKFLIY
STSQRASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQGSSNPYTFG
QGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGECSEQ ID NO: 70 重鏈 1 P1AA1185-104
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWVSWVRQAPGQRLEWMGE ISPNSGASNFDENFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSS HGSFRWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVE DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQ VCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPSEQ ID NO: 71 重鏈 2 P1AA1185-104
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWVSWVRQAPGQRLEWMGE ISPNSGASNFDENFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSS HGSFRWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVE DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQESALTTSPGE TVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSG SLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK THTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
P1AD9924 ( 基於 HLA-G-0090 及 CH2527)
SEQ ID NO: 72 輕鏈 1 P1AD992
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVAR
IRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVR
HGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSAASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV
VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS
KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 73 輕鏈 2 P1AD992
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLNSSNNKNNLAWYQQQPGQPP KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQYYRT PWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 74 重鏈 1 P1AD992
QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDSVSSNRAAWNWIRQSPSRGLEWL GRTYYRSKWYNDYAVSVQGRITLIPDTSKNQFSLRLNSVTPEDTAVYYCA SVRAVAPFDYWGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV EDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP QVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
SEQ ID NO: 75 重鏈 2 P1AD992
QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDSVSSNRAAWNWIRQSPSRGLEWL GRTYYRSKWYNDYAVSVQGRITLIPDTSKNQFSLRLNSVTPEDTAVYYCA SVRAVAPFDYWGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV EDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQESALTTSPG ETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFS GSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
在本發明之以下具體實施例中列示： 1. 一種結合至人類HLA-G及T細胞活化抗原(特定而言人類CD3)之多特異性抗體，其包含結合至人類HLA-G之第一抗原結合部分及結合至T細胞活化抗原(特定而言人類CD3)之第二抗原結合部分。
2. 如實施例1之多特異性抗體，其中該抗體係雙特異性抗體；且
其中結合至人類HLA-G之該第一抗原結合部分抗體包含
A) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或
B) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；或
C) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；或
D) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3；
且其中結合至T細胞活化抗原之該第二抗原結合部分結合至人類CD3，且包含
E) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:58之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之HVR-L3。
3. 如實施例2之雙特異性抗體，其中該第一抗原結合部分
A)
iv) 包含SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列；
v) 或i)下之該抗體之該VH及VL的人類化變體；或
vi) 包含SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列；或
B)
包含SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列；或
C)
包含SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列；或
D)
包含SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列；
且其中該第二抗原結合部分
E)
包含SEQ ID NO:62之VH序列及SEQ ID NO:63之VL序列。
4. 如實施例3之雙特異性抗體，
其中該第一抗原結合部分包含i) SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列；或ii) SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列；
且其中該第二抗原結合部分
包含SEQ ID NO:62之VH序列及SEQ ID NO:63之VL序列。
5. 如實施例1至4中任一實施例之多特異性抗體，其中該抗體
a) 不與包含SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
b) 不與包含SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
c) 不與包含SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
d) 不與包含SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或
e) 抑制ILT2與單體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合；及/或
f) 抑制ILT2與三聚體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合超過50% (在一個實施例中超過60 %) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例4b)；及/或
g) 抑制ILT2與單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合超過50% (在一個實施例中超過80 %) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例4b)；及/或
h) 抑制ILT2與JEG3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G)之結合(超過50 % (在一個實施例中超過 80%)) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例6)；及/或
i) 結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G) (參見實例5)，且抑制ILT2與JEG-3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G)之結合(超過50 % (在一個實施例中超過80%)) (當與無抗體之結合相比時) (參見實例6)；及/或
j) 抑制CD8a與HLAG之結合超過80% (當與無抗體之結合相比時) (參見例如實例4c)；及/或
k) 恢復與JEG-3細胞(ATCC HTB36)共培養之單核球的HLA-G特異性抑制之免疫反應(例如，抑制之腫瘤壞死因子(TNF) α釋放)；及/或
l) 在表現HLAG之腫瘤細胞(例如JEG-3細胞(ATCC HTB36))存在下誘導T細胞介導之細胞毒性(參見實例12)。
6. 如實施例1至5中任一實施例之多特異性抗體，其中該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分係Fab分子。
7. 如實施例1至6中任一實施例之多特異性抗體，其中該第二抗原結合部分係Fab分子，其中該Fab輕鏈及該Fab重鏈之該等可變結構域VL及VH或該等恆定結構域CL及CH1、特定而言該等可變結構域VL及VH由彼此置換。
8. 如實施例1至7中任一實施例之多特異性抗體，其中該第一抗原結合部分係Fab分子，其中在該恆定結構域中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且位置123之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在該恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
9. 如實施例1至8中任一實施例之多特異性抗體，其中該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分視情況經由肽連接體彼此融合。
10. 如實施例1至9中任一實施例之多特異性抗體，其中該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分各自係Fab分子且其中(i) 該第二抗原結合部分在該Fab重鏈之C-末端融合至該第一抗原結合部分之該Fab重鏈之N-末端，或(ii) 該第一抗原結合部分在該Fab重鏈之C-末端融合至該第二抗原結合部分之該Fab重鏈之N-末端。
11. 如實施例1至10中任一實施例之多特異性抗體，其包含第三抗原結合部分。
12. 如實施例11之多特異性抗體，其中該第三抗原部分與該第一抗原結合部分相同。
13. 如實施例1至12中任一實施例之多特異性抗體，其包含由第一及第二亞單元組成之Fc結構域。
14. 如實施例13之多特異性抗體，其中該第一、該第二及(若存在)該第三抗原結合部分各自係Fab分子；且其中(i) 該第二抗原結合部分在該Fab重鏈之C-末端融合至該第一抗原結合部分之該Fab重鏈之N-末端且該第一抗原結合部分在該Fab重鏈之C-末端融合至該Fc結構域之第一亞單元之N-末端，或(ii) 該第一抗原結合部分在該Fab重鏈之C-末端融合至該第二抗原結合部分之該Fab重鏈之N-末端且該第二抗原結合部分在該Fab重鏈之C-末端融合至該Fc結構域之該第一亞單元之N-末端；且其中該第三抗原結合部分(若存在)在該Fab重鏈之C-末端融合至該Fc結構域之該第二亞單元之N-末端。
15. 如實施例13或14之多特異性抗體，其中該Fc結構域係IgG、特定而言IgG1 Fc結構域。
16. 如實施例13至15中任一實施例之多特異性抗體，其中該Fc結構域係人類Fc結構域。
17. 如實施例13至16中任一實施例之多特異性抗體，其中該Fc結構域包含一或多個降低與Fc受體之結合及/或效應功能之胺基酸取代。
18. 如實施例17之多特異性抗體，其中該抗體屬具有突變L234A、L235A及P329G之IgG1同型(根據Kabat之EU索引編號)。
19. 如實施例13至18中任一實施例之多特異性抗體，其中該Fc結構域之該第一亞單元之該CH3結構域中之胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，藉此在該第一亞單元之該CH3結構域內產生隆凸，該隆凸可定位於該第二亞單元之該CH3結構域內之空腔內；且該Fc結構域之該第二亞單元之該CH3結構域中之胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，藉此在該第二亞單元之該CH3結構域內產生空腔，該空腔內可定位有該第一亞單元之該CH3結構域內之該隆凸。
20. 根據實施例19之多特異性抗體，其中該抗體屬在該Fc結構域之該第一亞單元具有突變T366W且在該Fc結構域之該第二亞單元中具有突變Y407V、T366S及L368A的IgG1同型(根據Kabat EU索引編號)。
21. 如實施例20之多特異性抗體，其中該抗體包含該Fc結構域之該第一亞單元中之額外突變S354C及該Fc結構域之該第二亞單元中之額外突變Y349C (根據Kabat EU索引編號)。
22. 如實施例20之多特異性抗體，其中該抗體包含該Fc結構域之該第一亞單元中之額外突變Y349C及該Fc結構域之該第二亞單元中之額外突變S354C (根據Kabat EU索引編號)。
23. 一種經分離之核酸，其編碼如前述實施例中任一實施例之多特異性抗體。
24. 一種宿主細胞，其包含如實施例23之核酸。
25. 一種產生多特異性抗體之方法，其包含培養如實施例24之宿主細胞以使得產生該抗體。
26. 如實施例25之方法，其進一步包含自該宿主細胞回收該多特異性抗體。
27. 一種醫藥調配物，其包含如實施例1至22中任一實施例之多特異性抗體及醫藥上可接受之載劑。
28. 如實施例1至22中任一實施例之多特異性抗體，其用作藥劑。
29. 如實施例1至22中任一實施例之多特異性抗體，其用於治療癌症。
30. 一種如實施例1至22中任一實施例之多特異性抗體的用途，其用於製造藥劑。
31. 如實施例30之用途，其中該藥劑用於治療癌症。
32. 一種治療患有癌症之個體之方法，其包含向該個體投與有效量之如實施例1至22中任一實施例之多特異性抗體。
實例
重組 DNA 技術
如以下文獻中所闡述使用標準方法來操作DNA：Sambrook, J.等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989。根據製造商之說明書使用分子生物學試劑。
基因及寡核苷酸合成
藉由化學合成在Geneart GmbH (Regensburg, Germany)製備期望基因區段。將合成之基因片段選殖至大腸桿菌質體中進行繁殖/擴增。藉由DNA測序驗證亞選殖之基因片段之DNA序列。或者，藉由使化學合成之寡核苷酸退火或經由PCR裝配短的合成DNA片段。藉由metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Germany)製備各別寡核苷酸。
基礎/標準哺乳動物表現質體之說明 對於期望基因/蛋白質(例如全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈或MHC I類分子，例如HLA-G、或與肽及β-2微球蛋白融合之MHC I類分子，例如與HLA-G結合肽及或β-2微球蛋白融合之HLA-G)的表現，使用包含以下功能元件之轉錄單位：
- 來自包括內含子A之人類巨細胞病毒(P-CMV)之立即早期增強子及啟動子， - 人類重鏈免疫球蛋白5’-未轉譯區(5’UTR)， - 鼠類免疫球蛋白重鏈信號序列，
- 欲表現之基因/蛋白質(例如全長抗體重鏈或MHC I類分子)，及
- 牛生長激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
除了包括欲表現之期望基因之表現單元/盒之外，基礎/標準哺乳動物表現質體亦含有
- 來自載體pUC18之複製起點，其容許在大腸桿菌中複製此質體，及 - β-內醯胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予胺苄青黴素(ampicillin)抗性。
蛋白質測定
藉由使用根據多肽之胺基酸序列計算之莫耳消光係數測定280 nm下之光學密度(OD)來測定純化多肽之蛋白質濃度。
實例 1
生成 HLA-G 嵌合分子用於篩選及反篩選
由於與其他MHC I分子之高同源性(＞98%)，用HLA-G分子免疫導致由MHC-I交叉反應性抗體以及真正HLA-G特異性抗體之混合物組成的多株血清之產生。
迄今為止尚未提供任何工具來選擇真正HLA-G特異性抗體而對其他人類MHC-I (例如HLA-A)無交叉反應性，並進一步選擇具有受體阻斷功能之彼等抗體。
鑑別獨特HLA-G位置與結構一致性及受體相互作用所需之位置的組合(ILT2/4及KIR2DL4)。
然後將人類HLA-G之獨特的近端位置「接枝」於來自不同齧齒動物物種(例如大鼠RT1A及小鼠H2kd)之MHC I類複合體分子上以生成「嵌合」免疫原/篩選抗原。
所生成抗體針對結合/特異性經受嚴格篩選(且分別對反抗原無結合/特異性)
篩選抗原：
- 重組HLA-G表現為包含SEQ ID NO: 43之人類HLA-G ß2M MHC複合體
- 將HLA-G特異性序列接枝至大鼠RT-1及小鼠H2kd上(SEQ ID NO: 46：人類HLA-G/小鼠H2Kd ß2M MHC I類複合體，其中將針對人類HLA-G具有特異性之位置接枝至小鼠H2Kd 框架上，及SEQ ID NO: 48：人類HLA-G/大鼠RT1A ß2M MHC I類複合體，其中將針對人類HLA-G具有特異性之位置接枝至大鼠RT1A框架上)
- 天然HLA-G MHC I類複合體表現細胞(例如Jeg3細胞)或人類HLA-G轉染之細胞系SKOV3 HLA-G+及PA-TU-8902 HLA-G +
篩選反抗原：
- 與不同肽組合之具有其他HLA-A序列(HLA-A2及HLA-G經 HlA-A 共有序列去接枝 )之反抗原(MHC I類複合體) (例如，參見HLA-G框架上之SEQ ID NO 40 (HLA-A2)及SEQ ID NO: 44 HLA-A共有序列)
- 來自其他物種之反抗原(MHC I類複合體)，例如大鼠RT-1及小鼠H2kd (SEQ ID NO: 45及SEQ ID NO: 47)
- 未經修飾之腫瘤細胞系SKOV3及PA-TU-8902，其特徵在於不存在HLA-G表現。
設計嵌合 HLA-G 抗原用於免疫及篩選 HLA 特異性抗體之生成 ( 參見圖 1) ：
設計攜帶HLA-G獨特位置(SEQ ID NO: 48)之嵌合大鼠MHC I分子(RT1-A)用於野生型(wt)及轉基因大鼠、或兔及小鼠等之免疫，及/或用於篩選分析：
藉由比對來自IMGT之2579個HLA-A、3283個HLA-B、2133個HLA-C、15個HLA-E、22個HLA-F及50個HLA-G序列來鑑別HLA-G獨特位置(可在2014年2月6日獲得)。在3個序列組HLA-A、HLA-B及HLA-C + HLA-E + HLA-F之組合組中之任一者之序列的小於1% (大多數約0%)中出現之HLA-G之彼等殘基稱為HLA-G獨特位置。
4個核心HLA-G獨特位置(α-1中2個，且α-3中2個)在HLA-G序列組中未顯示多型性，且其他HLA基因在該等位置皆不含有HLA-G特異性殘基(M100為1x HLA-A、Q103為1x HLA-B且Q103為1x HLA-C除外)。
大鼠RT1-A之晶體結構(Rudolph, M.G.等人 J.Mol.Biol. 324: 975-990 (2002)；PDB代碼：1KJM)疊加在人類HLA-G之晶體結構(Clements, C.S.等人 PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 102: 3360-3365 (2005)；PDB代碼1YDP)上。α鏈及相關之β-2-微球蛋白之整體結構係保守的。
在RT1-A結構中藉由比較序列及結構比對鑑別HLA-G獨特位置。在第一步驟中，鑑別獨特HLA-G位置，其暴露在HLA-G及RT1-A之分子表面上且因此對於抗體可及。包埋在蛋白質摺疊內之獨特位置被排除在工程改造之外。在第二步驟中，鑑別結構上近端殘基，其亦需要交換以使相應區域「HLA-G樣」，即產生含有獨特位置之真實HLA-G表位而非產生可為人造之HLA-G/大鼠RT1-A嵌合表位。分析因此選擇用於突變之所有位置以對來自HLA-G之各個殘基進行結構擬合，以避免突變時分子結構可能之局部擾動。
類似地產生攜帶HLA-G獨特位置(SEQ ID NO: 46)之嵌合小鼠MHC I分子(H2Kd)用於免疫及/或用於篩選分析。
藉由將 HLA-G 獨特位置朝向 HLA-A 共有序列 「 去接枝 」 設計基於 HLA-A 之抗原原子用作篩選中之反抗原 (SEQ ID NO:44)
在人類HLA-G (PDB代碼：1YDP)之晶體結構中分析源自多序列比對之獨特位置。首先，未暴露於HLA-G表面上且因此對於抗體不可及之位置被排除在工程改造之外。第二，針對胺基交換之可行性分析表面暴露之殘基(即，排除在相關位置之突變時分子結構之可能之局部擾動)。驗證總共14個位置用於交換。將經驗證位置中之胺基酸突變為HLA-A共有序列，該序列源自從IMGT下載之2579個HLA-A序列之多序列比對(可在2014年2月6日獲得)。
可溶性典型及非典型 MHC I 類分子之表現質體的生成
重組MHC I類基因編碼N-末端延伸之融合分子，其由已知由各別MHC I類分子結合之肽、β-2微球蛋白及各別MHC I類分子組成。
除了可溶性MHC I類分子表現盒之外，用於瞬時表現可溶性MHC I類分子之表現質體亦包括載體pUC18之複製起點，其允許在大腸桿菌中複製該質體；及β-內醯胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予胺苄青黴素抗性。
可溶性MHC I類分子之轉錄單元包括以下功能元件：
- 來自包括內含子A之人類巨細胞病毒(P-CMV)之立即早期增強子及啟動子，
- 人類重鏈免疫球蛋白5’-未轉譯區(5’UTR)，
- 鼠類免疫球蛋白重鏈信號序列，
- N-末端截短之金黃色葡萄球菌(S. aureus)轉肽酶A編碼核酸，及
- 牛生長激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
源自各種物種之成熟可溶性MHC I類分子之胺基酸序列係：
SEQ ID NO: 43： 實例性人類HLA-G ß2M MHC I類複合體
SEQ ID NO: 44： 實例性經修飾人類HLA-G ß2M MHC I類複合體(其中HLA-G特異性胺基酸由HLA共有胺基酸置換(= 去接枝之HLA-G，亦參見圖1)
SEQ ID NO: 45： 實例性小鼠H2Kd ß2M MHC I類複合體
SEQ ID NO: 46： 實例性人類HLA-G/小鼠H2Kd ß2M MHC複合體，其中針對人類HLA-G具有特異性之位置接枝至小鼠H2Kd框架上
SEQ ID NO: 47： 實例性大鼠RT1A ß2M MHC I類複合體
SEQ ID NO: 48： 實例性人類HLA-G/大鼠RT1A ß2M MHC複合體，其中針對人類HLA-G具有特異性之位置接枝至大鼠RT1A框架上
對於用於篩選之實例性HLA-A2 ß2M MHC I類複合體，使用以下組分且複合體在大腸桿菌中表現且經純化。
MHCI複合體HLA-A2 / b2M (SEQ ID NO 40及37) (二者皆具有額外N-末端甲硫胺酸) + VLDFAPPGA肽(SEQ ID NO: 50) + 連接體及his-Tag (SEQ ID NO: 49)
實例 2
免疫活動
A) 小鼠及大鼠之免疫
a. 嵌合蛋白(針對非特異性MHC-I/HLA之耐受性及針對獨特HLA-G位置)
使用自Charles River Laboratories International, Inc.獲得之Balb/C小鼠進行免疫。根據附錄A 「Guidelines for accommodation and care of animals」在AAALACi認可之動物設施中圈養動物。所有動物免疫方案及實驗皆由Government of Upper Bavaria批准(許可證號55.2-1-54-2531-19-10及55.2-1-54-2532-51-11)，且根據German Animal Welfare Act and the Directive 2010/63 of the European Parliament and Council實施。
6-8週齡之Balb/C小鼠(n=5)在4週過程中接受5輪利用嵌合H2Kd/HLA-G分子(SEQ ID NO: 46 (「HLA-G-0006」))之免疫。在每一免疫之前，用氧及異氟醚之氣體混合物麻醉小鼠。對於第一免疫，將溶解於20 mM His/HisCl、140 mM NaCl (pH 6.0)中之15 μg蛋白質與等體積之CFA (BD Difco，編號263810)混合且皮下(s.c.)投與至沿著小鼠之背部之引流淋巴結的近端6個部位，其中兩個部位在頸背處且兩個部位在腹股溝及小腿之兩側。將另外15 μg在RIBI佐劑(Sigma-Aldrich，編號S6322)中乳化之蛋白質投與至沿著腹部之六個並置部位，其中兩個部位各自在腋窩、腹股溝及大腿之兩側。以相似之方式在第7天(10 μg)、第14天(5 μg)、第21天(5 μg)及第28天(5 μg)給予降低抗原劑量之加強免疫，除了在整個過程中使用RIBI佐劑，且僅沿著腹部。在最終免疫後3天，將小鼠安樂死且無菌分離雙側膕、表淺性腹股溝、腋窩及鰓樣淋巴結且準備用於產生雜交瘤。在第三及第五免疫後，藉由ELISA測試血清之重組人類HLA-G及免疫原特異性總IgG抗體產生。
另一組6-8週齡之Balb/C小鼠(n=5)在3個月之過程中接受3次利用嵌合H2Kd/HLA-G分子(HLA-G-0006)之免疫。對於第一免疫，將100 μg溶解在20 mM His/HisCl、140 mM NaCl (pH 6.0)中之蛋白質與等體積之CFA (BD Difco，編號263810)混合且腹膜內(i.p.)投與。在第28天及第56天以相似之方式給予加強免疫，只是使用不完全弗氏佐劑(Freund`s adjuvant) (來自BD Difco之IFA，編號DIFC263910)。在最終免疫後4至5週，小鼠經靜脈內(i.v.)接受約25 μg之於無菌PBS中之免疫原，且72h後，無菌收穫脾且準備用於產生雜交瘤。在第三免疫後藉由ELISA測試血清之重組人類HLA-G (SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))及免疫原特異性嵌合H2Kd/HLA-G分子(SEQ ID NO: 46 (「HLA-G-0006」))且利用具有共有HLA-A特異質位置之「去接枝」人類HLA-G (SEQ ID NO: 44 (「HLA-G-0007」))及鼠類H2kd蛋白(SEQ ID NO: 45 「HLA-G-0009」))總IgG抗體產生進行反篩選。
b. wt HLA-G蛋白
使用自Charles River Laboratories International, Inc.獲得之CD大鼠進行免疫。根據附錄A 「Guidelines for accommodation and care of animals」在AAALACi認可之動物設施中圈養動物。所有動物免疫方案及實驗皆由Government of Upper Bavaria批准(許可證號55.2-1-54-2532-51-11)，且根據German Animal Welfare Act and the Directive 2010/63 of the European Parliament and Council實施。
6-8週齡之CD大鼠(n=4)在4個月之過程中接受4次利用重組人類HLA-G蛋白(SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))之免疫。對於第一免疫，將100 μg溶解在20 mM His/HisCl、140 mM NaCl (pH 6.0)中之蛋白質與等體積之CFA (BD Difco，編號263810)混合且腹膜內投與。在第28天、第56天及第84天以相似之方式給予加強免疫，只是始終使用不完全弗氏佐劑(來自BD Difco之IFA，編號DIFC263910)。在最終免疫後3至4週，大鼠i.v.接受約75 μg之於無菌PBS中之免疫原，且72h後，無菌收穫脾且準備用於產生雜交瘤。在第三及第四免疫後藉由ELISA測試血清之重組HLA-G (SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))特異性IgG1、IgG1a、IgG2b及IgG2c抗體產生，且經具有共有HLA-A特異性位置之「去接枝之」人類HLA-G (SEQ ID NO: 44 (「HLA-G-0007」))反篩選。
c. JEG3細胞(ATCC編號HTB36) (天然表現HLA-G)
使用自Charles River Laboratories International, Inc.獲得之CD大鼠進行免疫。根據附錄A 「Guidelines for accommodation and care of animals」在AAALACi認可之動物設施中圈養動物。所有動物免疫方案及實驗皆由Government of Upper Bavaria批准(許可證號AZ. 55.2-1-54- 2531-83-13)，且根據German Animal Welfare Act and the Directive 2010/63 of the European Parliament and Council實施。
兩組6-8週齡之CD大鼠(n=2)在五個月(A)至七個月(B)之過程中分別接受五次(組A)或七次(組B)使用JEG-3細胞(ATCC HTB36)之免疫。對於第一免疫，將溶解在無菌PBS中之1×10^7個細胞與等體積之CFA (BD Difco，編號263810)混合且腹膜內投與。在第28天、第56天、第84天、第112天、第140天(僅B)及第168天(僅B)以相似方式給予A及B加強免疫，只是始終使用不完全弗氏佐劑(來自BD Difco之IFA，編號DIFC263910)。在最終免疫後3週，大鼠i.v.接受100 μg於無菌PBS中之重組人類HLA-G蛋白(SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))；72h後，無菌收穫脾且準備用於產生雜交瘤。在第三、第五及第七免疫後藉由ELISA分別測試血清之重組HLA-G (SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))特異性IgG1、IgG1a、IgG2b及IgG2c抗體產生-特異性IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG2c抗體產生，且經具有共有HLA-A特異性位置之「去接枝之」人類HLA-G (SEQ ID NO: 44 (「HLA-G-0007」))反篩選。
d. JEG3/DNA IMS (用於加強效應)
使用自Charles River Laboratories International, Inc.獲得之CD大鼠進行免疫。根據附錄A 「Guidelines for accommodation and care of animals」在AAALACi認可之動物設施中圈養動物。所有動物免疫方案及實驗皆由Government of Upper Bavaria批准(許可證號AZ.55.2-1-54- 2531-83-13)，且根據German Animal Welfare Act and the Directive 2010/63 of the European Parliament and Council實施。
6-8週齡之CD大鼠(n=5)在三個月之過程中以交替方案接受質體DNA及基於細胞之免疫。編碼呈單鏈分子形式之人類HLA-G之質體DNA HLA-G-0030 (p17747)以及天然表現HLA-G之JEG-3細胞(ATCC HTB36)分別用於此目的。
對於第一免疫，將動物用異丙醚麻醉，且用100 μg於無菌H2O中之質體DNA真皮內(i.d.)免疫，該無菌H2O中之質體DNA施加至靠近動物之尾巴之剃毛後背之一個斑點。在i.d.施加中，在ECM 830電穿孔系統(BTX Harvard Apparatus)上使用以下參數對斑點進行電穿孔：兩次1000V/cm，每次0.1ms，間隔125ms，然後四次287.5V/cm達10ms，亦間隔125ms。對於第14天之第二免疫，動物接受溶解於無菌PBS中且與等體積之CFA (BD Difco，編號263810)混合之1×10^7個細胞，且在產生穩定之乳液後，腹膜內投與。在第28天(DNA)、第42天(細胞)、第56天(DNA)、第70天(細胞)以相似方式給予加強免疫，只是始終使用不完全弗氏佐劑(來自BD Difco之IFA，編號DIFC263910)進行細胞免疫。在最終免疫後4週，大鼠i.v.接受100 μg於無菌PBS中之可溶性重組人類HLA-G MHC I類蛋白(SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))；72h後，無菌收穫脾且準備用於產生雜交瘤。在第三、第五及第六免疫後藉由ELISA分別測試血清之可溶性重組人類HLA-G MHC I類蛋白(SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))特異性IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG2c抗體產生，且經具有共有HLA-A特異性位置之「去接枝之」人類HLA-G (SEQ ID NO: 44 (「HLA-G-0007」))反篩選。
在所有免疫策略中，誘導高度多反應性體液性免疫反應，從而識別HLA-G，以及用於反篩選之蛋白質(例如重組「去接枝之」人類HLA-G、嵌合H2Kd/HLA-G分子或相關人類HLA-A2分子)，如以ELISA型式使用來自經免疫動物之多株血清所分析(未顯示數據)
B) 人類化 OMNIRAT 7 系大鼠之免疫
OmniRat 7系大鼠係自Open Monoclonal Technology, Inc. (2747 Ross Road, Palo Alto, CA 94303, USA)配對且自Charles River Laboratories International, Inc繁殖並獲得。根據附錄A 「Guidelines for accommodation and care of animals」在AAALACi認可之動物設施中圈養動物。所有動物免疫方案及實驗皆由Government of Upper Bavaria批准(許可證號55.2-1-54-2532-51-11及55.2-1-54- 2531-83-13)，且根據German Animal Welfare Act and the Directive 2010/63 of the European Parliament and Council實施。
6-8週齡之OmniRat 7系大鼠(n=4)在4個月之過程中接受4次利用重組嵌合HLA-G蛋白(SEQ ID NO: 48 (「HLA-G-0011」))之免疫。對於第一免疫，將100 μg溶解在20 mM His/HisCl、140 mM NaCl (pH 6.0)中之蛋白質與等體積之CFA (BD Difco，編號263810)混合且腹膜內投與。在第28天、第56天及第84天以相似之方式給予加強免疫，只是始終使用不完全弗氏佐劑(來自BD Difco之IFA，編號DIFC263910)。在最終免疫後3至4週，大鼠i.v.接受約50 μg之於無菌PBS中之免疫原且i.p.接受25 µg之於無菌PBS中之免疫原，且72hr後，無菌收穫脾且準備用於產生雜交瘤。在第三及第四免疫後藉由ELISA測試血清之重組HLA-G (SEQ ID NO: 48 (「HLA-G-0011」))特異性IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG2c抗體產生，且經具有共有HLA-A特異性位置之「去接枝之」人類HLA-G (SEQ ID NO: 44 (「HLA-G-0007」))反篩選。
或者，6-8週齡之OmniRat 7系大鼠(n=5)在三個月之過程中以交替方案接受質體DNA及基於細胞之免疫。編碼呈單鏈分子形式之人類HLA-G之質體DNA (人類HLA-G MHC I類蛋白(SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))以及天然表現HLA-G之JEG-3細胞(ATCC HTB36)分別用於此目的。
對於第一免疫，將動物用異丙醚麻醉，且用100 μg於無菌H2O中之質體DNA真皮內(i.d.)免疫，該無菌H2O中之質體DNA施加至靠近動物之尾巴之剃毛後背之一個斑點。在i.d.施加中，在ECM 830電穿孔系統(BTX Harvard Apparatus)上使用以下參數對斑點進行電穿孔：兩次1000V/cm，每次0.1ms，間隔125ms，然後四次287.5V/cm達10ms，亦間隔125ms。對於第14天之第二免疫，動物接受溶解於無菌PBS中且與等體積之CFA (BD Difco，編號263810)混合之1×10^7個細胞，且在產生穩定之乳液後，腹膜內投與。在第28天(DNA)、第42天(細胞)、第56天(DNA)、第70天(細胞)以相似方式給予加強免疫，只是始終使用不完全弗氏佐劑(來自BD Difco之IFA，編號DIFC263910)進行細胞免疫。在最終免疫後4週，大鼠i.v.接受100 μg於無菌PBS中之可溶性重組人類HLA-G MHC I類蛋白(SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))；72h後，無菌收穫脾且準備用於產生雜交瘤。在第三、第五及第六免疫後藉由ELISA分別測試血清之可溶性重組人類HLA-G MHC I類蛋白(SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))特異性IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG2c抗體產生，且經具有共有HLA-A特異性位置之「去接枝之」人類HLA-G (SEQ ID NO: 44 (「HLA-G-0007」))反篩選。
在所有免疫策略中，誘導高度多反應性體液性免疫反應，從而識別HLA-G，以及用於反篩選之蛋白質(例如重組「去接枝之」人類HLA-G、嵌合H2Kd/HLA-G分子或相關人類HLA-A2分子)，如以ELISA型式使用來自經免疫動物之多株血清所分析(未顯示數據)
獲得之抗體
使用上述方法獲得特異性結合至人類抗HLA-G之抗體：來自CD大鼠之大鼠HLA-G 0031、來自人類化大鼠之人類HLAG 0039、HLA-G 0041及HLA-G 0090
獲得之抗HLA-G特異性抗體之結合性質及生物活性如以下實例中所述測定且與已知之參考抗體比較。抗體HLA-G-0031係使用其HVR及人類_IGHV1-3之VH受體人類框架及人類_IGKV1-17之VL受體人類框架(V-結構域，在位置R46F具有一個額外回復突變，Kabat編號)人類化。
為了在HLAG結合劑HLAG-0031之人類化期間鑑別適宜人類受體框架，使用兩種方法之組合。一方面，藉由搜索與親代抗體具有高序列同源性之受體框架及隨後將CDR區電腦模擬接枝至此受體框架上來採取典型方法。判斷鑑別之框架與親代抗體之每一胺基酸差異對結合劑之結構完整性之影響，且在適當時考慮朝向親代序列之回復突變。
另一方面，使用WO 2016/062734中闡述之電腦模擬工具以預測人類化型式之VH及VL結構域朝向彼此之取向。此係針對所有可能之人類種系組合上之CDR之虛擬移植物實施。將結果與親代結合劑之VH VL結構域取向進行比較，以選擇與起始抗體之幾何學幾乎接近之框架組合。
抗 HLAG 抗體 ( 可變區及超變區 (HVR) 之 SEQ ID No) ：
實例 3
A) 抗 HLA-G 抗體與可溶性人類 HLA-G 、具有 HLA-A 特異性序列之可溶性去接枝之人類 HLA-G 、人類 HLA-A2 及大鼠 / 小鼠 H2-Kd 的結合
針對自免疫獲得之抗體與人類、HLA-G、嵌合、去接枝之HLA-G、HLA-A2及大鼠/小鼠H2-Kd之結合性質篩選該等抗體。下文闡述各別分析。對於人類HLA-G之測試，使用單體以及二聚體及三聚體形式(參見下文之製備)。
人類 HLA-G MHC I 類蛋白之二聚化 / 三聚化
於室溫下使用ÄKTA-FPLC將含有單體His標記之可溶性人類HLA-G MHC I類蛋白(SEQ ID NO: 23)之上清液以0.2ml/min之流速裝載至具有5 ml Ni-Sepharose之HisTrap HP管柱(GE Healthcare編號17-5248-02)上過夜。然後用含有0.5M咪唑之2% DPBS (Merck編號8.14223.025)洗滌管柱直至達到基線。然後用含有0.5M咪唑之2% DPBS中之10mM DTT平衡管柱，且在室溫下培養30 min。 用PBS/10mM咪唑將DTT自管柱中洗出，且以具有0.5mM咪唑之2-100% DPBS之梯度溶析蛋白質。在使用Amicon-Ultra 15 M /Ultracel 10K濃縮溶析液後，將蛋白質在室溫下培育24小時，之後在4℃培育48小時以允許二聚體/多聚化。然後使用Superdex 200 HiLoad 16/60 (GE Healthcare編號17-5175-01)中之SEC實施二聚體及三聚體之分離，且用0.5M NaOH洗滌過夜。用PBS平衡管柱，之後用10mg/ml BSA飽和。然後收集二聚體(級分A9)及三聚體(級分A8)，等分並在-80℃下儲存直至進一步使用。
人類 wt HLA-G 結合 ELISA
將鏈黴抗生物素蛋白塗覆之板(Nunc，MicroCoat編號11974998001)用25 μl/孔之生物素化人類wt HLA-G以250 ng/ml之濃度塗覆，且在4℃培育過夜。在洗滌(3×90 μl/孔，用PBST-緩衝液)後，添加25 μl抗HLA-G樣品(在OSEP緩衝液中1:3稀釋)或參考抗體(G233，Thermo/Pierce編號MA1-19449，500 ng/ml)且在RT下培育1h。在洗滌(3×90 μl/孔，用PBST-緩衝液)後，添加25 μl/孔之山羊-抗小鼠H+L-POD (Biorad編號170-6561，1:2000，於OSEP中)或驢-抗兔IgG POD (GE編號NA9340V，1:5000，於OSE中)並在RT下在振盪器上培育1 h。為了檢測大鼠IgG，添加山羊-抗大鼠IgG1-POD (Bethyl編號A110-106P)、山羊- 抗大鼠IgG2a-POD (Bethyl編號A110-109P)及山羊抗大鼠IgG2b-POD (Bethyl編號A110-111P) 1:10000於OSEP中之混合物且在振盪器上在室溫下培育1 h。在洗滌(6×90μl/孔，用PBST-緩衝液)後，添加25 μl/孔之TMB受質(Roche，11835033001)且培育直至OD 2-3。量測在Tecan Safire 2儀器上於370/492 nm下進行。
利用 HLA-A 特異性序列結合 ELISA 之人類去接枝之 HLA-G
將鏈黴抗生物素蛋白塗覆之板(Nunc，MicroCoat編號11974998001)用25 μl/孔之生物素化人類去接枝之HLA-G以250 ng/ml之濃度塗覆，且在4℃培育過夜。在洗滌(3×90 μl/孔，用PBST-緩衝液)後，添加25 μl抗HLA-G樣品(在OSEP緩衝液中1:3稀釋)或大鼠血清(在OSEP中1:600稀釋)且在RT下培育1h。在洗滌(3×90 μl/孔，用PBST-緩衝液)後，添加25µl/孔之山羊-抗大鼠IgG1-POD (Bethyl編號A110-106P)、山羊-抗大鼠IgG2a-POD (Bethyl編號A110-109P)及山羊抗大鼠IgG2b-POD (Bethyl編號A110-111P)以1:10000於OSEP中之混合物且在振盪器上在室溫下培育1 h。在洗滌(6×90μl/孔，用PBST-緩衝液)後，添加25 μl/孔之TMB受質(Roche，11835033001)且培育直至OD 2-3。量測在Tecan Safire 2儀器上於370/492 nm下進行。
大鼠 MHC I (RT1-A) 結合 ELISA
將鏈黴抗生物素蛋白塗覆之板(Nunc，MicroCoat編號11974998001)用25 μl/孔之生物素化大鼠MHC I (RT1-A)以250 ng/ml之濃度塗覆，且在4℃培育過夜。在洗滌(3×90 μl/孔，用PBST-緩衝液)後，添加25 μl抗HLA-G樣品(在OSEP緩衝液中1:3稀釋)或大鼠血清(在OSEP中1:600稀釋)且在RT下培育1h。在洗滌(3×90 μl/孔，用PBST-緩衝液)後，添加25µl/孔之山羊-抗大鼠IgG1-POD (Bethyl編號A110-106P)、山羊-抗大鼠IgG2a-POD (Bethyl編號A110-109P)及山羊抗大鼠IgG2b-POD (Bethyl編號A110-111P)以1:10000於OSEP中之混合物且在振盪器上在室溫下培育1 h。在洗滌(6×90μl/孔，用PBST-緩衝液)後，添加25 μl/孔之TMB受質(Roche，11835033001)且培育直至OD 2-3。量測在Tecan Safire 2儀器上於370/492 nm下進行。
HLA-A2 結合 ELISA
將鏈黴抗生物素蛋白塗覆之板(Nunc，MicroCoat編號11974998001)用25 μl/孔之生物素化人類HLA-A2以250 ng/ml之濃度塗覆，且在4℃培育過夜。在洗滌(3×90 μl/孔，用PBST-緩衝液)後，添加25 μl抗HLA-G樣品(在OSEP緩衝液中1:3稀釋)或大鼠血清(在OSEP中1:600稀釋)且在RT下培育1h。在洗滌(3×90 μl/孔，用PBST-緩衝液)後，添加25µl/孔之山羊-抗大鼠IgG1-POD (Bethyl編號A110-106P)、山羊-抗大鼠IgG2a-POD (Bethyl編號A110-109P)及山羊抗大鼠IgG2b-POD (Bethyl編號A110-111P)以1:10000於OSEP中之混合物且在振盪器上在室溫下培育1 h。在洗滌(6×90μl/孔，用PBST-緩衝液)後，添加25 μl/孔之TMB受質(Roche，11835033001)且培育直至OD 2-3。量測在Tecan Safire 2儀器上於370/492 nm下進行。
抗 HLA-G 抗體之結合動力學
使用BIACORE T200儀器(GE Healthcare)藉由表面電漿共振研究抗HLA-G抗體與人類HLA-G、去接枝之人類HLA-G及人類HLA-A2之結合動力學。所有實驗皆在25℃下使用PBS緩衝液(pH 7.4 + 0.05% Tween20)作為運行緩衝液及PBS緩衝液(+ 0.1% BSA)作為稀釋緩衝液實施。於pH 5.0下藉由使用由GE Healthcare供應之胺偶合套組將抗人類Fc (JIR009-005-098, Jackson)或抗大鼠Fc (JIR112-005-071, Jackson)或抗小鼠Fc (JIR115-005-071, Jackson)抗體固定於系列S CM5感測器晶片(GE Healthcare)上。將抗HLA-G抗體捕獲於表面上，從而導致50 - 200 RU之捕獲反應。將HLA-G分子以30 µl/min以自2.5至高達800 nM之濃度(2×1:2及4×1:3稀釋系列)注射至表面上達180 s (結合期)。藉由用運行緩衝液洗滌監測解離相300-600秒。藉由對於抗人類Fc捕獲抗體注射H3PO4 (0.85%)達60 + 30秒、對於抗大鼠Fc捕獲抗體注射甘胺酸pH1.5達60秒及甘胺酸pH2.0達60秒、對於抗小鼠Fc捕獲抗體注射H3PO4 (0.85%)達80 + 60秒再生表面。藉由減去自模擬表面獲得之反應來校正體折射率差異。減去空白注射(雙重參照)。使用BIA評估軟體將得到之曲線擬合至1:1 Langmuir結合模型。
抗 HLA-G 抗體之交叉阻斷
使用BIACORE T200或B4000儀器(GE Healthcare)藉由表面電漿共振研究抗HLA-G抗體與人類HLA-G之結合的交叉阻斷實驗。所有實驗皆在25℃下使用PBS緩衝液(pH 7.4 + 0.05% Tween20)作為運行緩衝液實施。
根據提供者之方案將抗人類Fab (GE-Healthcare, 28-9583-25)抗體固定於系列S CM5感測器晶片(GE Healthcare)上，以自含有人類Ck結構域之OMT大鼠捕獲抗體。將抗HLA-G抗體以15 μg/ml之濃度捕獲70s。將Wt HLA-G (30μl/min)以500或1000 nM之濃度注射60秒。然後將Wt大鼠抗體以30μg/ml之濃度注射90秒。藉由用運行緩衝液洗滌監測解離相60或240秒。藉由注射甘胺酸pH 1.5達60秒及90秒之額外穩定時段再生表面。
在另一分析設置中，根據提供者之方案將抗人類Fab (GE-Healthcare, 28-9583-25)抗體固定於系列S CM5感測器晶片(GE Healthcare)上，以自含有人類Ck結構域之OMT大鼠捕獲抗體。將抗HLA-G抗體以30 μg/ml之濃度捕獲90s。藉由以500 µg/ml之濃度及30 µl/min之流速4 × 120秒注射人類IgG (JIR009-000-003)阻斷捕獲抗體上未佔據之結合位點。將Wt HLA-G以500 nM之濃度注射(30µl/min) 90秒。然後將來自OMT大鼠(人類Ck結構域)之第二抗體以30 μg/ml之濃度注射90秒。藉由用運行緩衝液洗滌監測解離相240秒。藉由注射甘胺酸pH 1.5達60秒及90秒之額外穩定時段再生表面。
表 ： HLA-G 抗體與呈其單體、二聚體及三聚體形式之重組可溶性 HLA-G MHC 1 類複合體的結合 (ELISA)
上表概述源自wt蛋白IMS之不同大鼠抗人類HLA-G單株抗體之結合。顯示與rec. wt單體、二聚體及三聚體HLA-G蛋白之各別結合的相對EC50值[ng/ml]，如藉由ELISA所評價。藉由將生物素化wt HLA-G抗原塗覆至鏈黴抗生物素蛋白板來設定ELISA。在培育及洗滌步驟後，各別抗體在1:2稀釋步驟中在10 - 0 µg之濃度範圍結合。藉由抗Fc-抗體-POD偶聯物實施結合抗體之檢測。自產生半最大信號之抗體濃度下之所得結合曲線測定EC50值。在非生物素化HLA-G二聚體及三聚體抗原之情況下，藉由在分析板上隨機塗覆實施固定。
HLA-G wt 對 HLA-G 去接枝物結合 ELISA ：
上表概述源自wt以及OMT大鼠之wt蛋白IMS的不同大鼠抗人類HLA-G單株抗體之結合。顯示與rec. wt單體HLA-G蛋白或所謂去接枝之HLA-G (HLA-G主鏈上之HLA-A共有序列)蛋白之各別結合的相對EC50值[ng/ml]及最大OD，如藉由ELISA所評估。藉由將生物素化wt HLA-G或共有抗原塗覆至鏈黴抗生物素蛋白板來設定ELISA。在培育及洗滌步驟後，各別抗體在1:2稀釋步驟中在10 - 0 µg之濃度範圍結合。藉由抗Fc-抗體-POD偶聯物實施結合抗體之檢測。自產生半最大信號之抗體濃度下之所得結合曲線測定EC50值。
HLA-G wt 對 HLA-G 去接枝物結合 - 表面電漿共振
HLA-G 抗體與重組 HLA-G (SEQ ID NO :43) 及對照經修飾人類 HLA-G ß2M MHC I 類複合體之結合親和性 ( 其中 HLA-G 特異性胺基酸經 HLA-A 共有胺基酸置換 (= 去接枝之 HLA-G SEQ ID NO: 44:) ( 「 - 」 指示無可檢測之結合 )
上表概述針對wt及去接枝之HLA-G之抗體親和性及t1/2值，如藉由表面電漿共振(Biacore)分析所評價。使用BIACORE T200儀器(GE Healthcare)藉由表面電漿共振研究抗HLA-G抗體與人類HLA-G及去接枝之人類HLA-G之結合動力學。所有實驗皆在25℃下使用PBS緩衝液(pH 7.4 + 0.05% Tween20)作為運行緩衝液及PBS緩衝液(+ 0.1% BSA)作為稀釋緩衝液實施。於pH 5.0下藉由使用由GE Healthcare供應之胺偶合套組將抗人類Fc (JIR009-005-098, Jackson)或抗大鼠Fc (JIR112-005-071, Jackson)或抗小鼠Fc (JIR115-005-071, Jackson)抗體固定於系列S CM5感測器晶片(GE Healthcare)上。將抗HLA-G抗體捕獲於表面上，從而導致50 - 200 RU之捕獲反應。將非生物素化HLA-G分子以30 µl/min以自2.5至高達800 nM之濃度(2×1:2及4×1:3稀釋系列)注射至表面上達180 s (結合期)。藉由用運行緩衝液洗滌監測解離相300-600秒。藉由對於抗人類Fc捕獲抗體注射H3PO4 (0.85%)達60 + 30秒、對於抗大鼠Fc捕獲抗體注射甘胺酸pH1.5達60秒及甘胺酸pH2.0達60秒、對於抗小鼠Fc捕獲抗體注射H3PO4 (0.85%)達80 + 60秒再生表面。藉由減去自模擬表面獲得之反應來校正體折射率差異。減去空白注射(雙重參照)。使用BIA評估軟體將得到之曲線擬合至1:1 Langmuir結合模型(上表中之-指示不可檢測到結合)。
在又一實驗中，比較以下參考抗體(自不同商業供應商獲得)與單體人類HLA-G MHC I (SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」))及具有共有HLA-A特異性位置之「去接枝之」人類HLA-G (SEQ ID NO: 44 (「HLA-G-0007」))的結合：
MEM/G9、87G、G233、2A12、4H84、5A6G7、6D463、9-1F10、MEM-G/1、MEM-G/11、MEM-G/2及MEM-G/4 (「-」指示無可檢測之結合)。

有趣的是，大多數量測之抗體未顯示與HLA-G MHC I (SEQ ID NO: 43 (「HLA-G-0003」)) (亦包括抗體87G)之任何特異性結合。由於寡聚形式之結合位點增加，如文獻中所述之與HLA-G寡聚形式之結合可為親合力驅動的。
僅結合親和性之KD值為7.7E-09 M之抗體MEM/G9、KD值為2.0E-08 M之抗體G233及結合親和性之KD值為1.2E-08 M之MEM-G/11顯示與單體wt人類HLA-G MHC I複合體的結合。然而，該等抗體MEM-G/11之一亦顯示對HLA-G去接枝物上共有之HLA-A (SEQ ID NO:44)的一些結合/交叉反應性。另外，另一抗體(MEM/G9)亦顯示與HLA-G去接枝物上共有之HLA-A (SEQ ID NO:44)的更強之非特異性結合。
實例 4
a) 受體結合抑制 ( 利用單 - 、二 - 及三聚體 HLA-G) ： ILT-2 及 ILT-4 阻斷 ELISA
將鏈黴抗生物素蛋白塗覆之板(Nunc，MicroCoat編號11974998001)用25 μl/孔之生物素化人類wt HLA-G以500-1000 ng/ml之濃度塗覆，且在4℃培育過夜。在洗滌(3×90 µl/孔，用PBST-緩衝液)後，以10或3 µg/ml開始不斷降低之濃度添加25 µl抗HLA-G複合體，然後在1:3或1:2步驟中稀釋且在RT下培育1h。在洗滌(3×90 µl/孔，用PBST-緩衝液)後，以200 ng/ml之濃度添加25µl/孔之c-myc標記之重組ILT-2受體且在室溫下培育1 h。在洗滌(3×90 µl/孔，用PBST-buffer)後，添加25 µl/孔之山羊-抗c-myc-POD (Bethyl編號A190-104P，1:7000於PBST + 0.5% BSA中)或抗人類FcgPOD (JIR, 109-036-098，1:8000，於PBST + 0.5% BSA中)且於RT下在振盪器上培育1 h。在洗滌(3×90μl/孔，用PBST-緩衝液)後，添加25 μl/孔之TMB受質(Roche，11835033001)且培育直至OD 2-3。量測在Tecan Safire 2儀器上於370/492 nm下進行
上表概述相對於未被阻斷之HLA-G:受體相互作用，3 µg/ml之濃度下之與HLA-G結合之不同抗體的ILT-2及ILT-4阻斷之程度。 在針對ILT2阻斷之單獨實驗中測試HLA-G-0090，未評價ILT4阻斷
b) 使用不同分析設置之抗 HLA-G 抗體的 ILT2 及 -4 結合抑制性質的生物化學比較
藉由將Fc標記之ILT2及ILT4分別塗覆至Maxisorp微量滴定板來設定ELISA。在培育及洗滌步驟後，以100nM之濃度添加各別抗體。將可溶性His標記之單體、二聚體或三聚體HLA-G添加孔中。在培育及洗滌步驟後，藉由抗His-抗體-POD偶聯物實施結合受體之檢測。與自具有無抗HLA-G或ILT2/4抗體之ILT2/4 + HLA-G (單-、二-或三聚體)的孔獲得之值比較計算抑制百分比(%) (100%結合= 0%抑制)。
上表概述藉由ELISA分析由濃度為110nM之所述HLAG抗體(*HLAG-0090係以44nM之濃度測試)的rec. HLA-G單體(單體及寡聚物)與其受體ILT2及ILT4之相互作用的阻斷。顯示HLA-G/受體相互作用(針對ILT2及ILT4)之抑制%。較不顯著之ILT4抑制取決於此受體之主要β2M依賴性相互作用。
圖4a及b中之條形圖顯示與市售抗體相比，藉由所述抗HLA-G抗體實現之抑制%。市售HLA-G抗體87G、MEM/G09及G233不像所述抗體那樣有效地阻斷HLA-G / ILT2或ILT4相互作用。此外，市售抗體導致在一些情況下結合時HLA-G與ILT2或ILT4之結合增加。
c) 由抗 HLAG 抗體抑制 CD8a 與 HLAG 之結合
將鏈黴抗生物素蛋白塗覆之384孔板用30μl/孔之阻斷溶液阻斷。藉由向35 ml起始塊T20中添加3.5 ml PVA + 3.5 ml PVP將5%聚乙烯醇(PVA，Sigma編號P8136)及8%聚乙烯基吡咯啶酮(PVP，Sigma編號PVP360) 1:10稀釋於起始塊T20 (Thermo Scientific編號37543)中製備阻斷溶液。將30µl稀釋於阻斷溶液中之生物素化HLAG (3µg/ml)添加至每一孔中且在室溫下在振盪器上培育1小時。將孔用100µl含有0.1% Tween-20 (Merck編號8.22184.500)之PBS (PAN Biotech編號P04-36500)洗滌3次。然後在室溫下在振盪器上將孔與30µl一式三份稀釋於阻斷緩衝液中之抗HLAG抗體一起培育1小時，且然後用100µl含有0.1% Tween-20之PBS洗滌3次。將重組CD8a (Sino Biological編號10980-H08H，於4℃下儲存1週時重構)稀釋於阻斷溶液(1.25µg/ml)中，且向所有孔中添加30µl且在室溫下在振盪器上培育2小時。將孔用100μl含有0.1% Tween-20之PBS洗滌3次。將HRP偶聯之多株抗CD8a大鼠IgG抗體(USBiological編號033547-HRP)稀釋於3%牛血清白蛋白級分V (Roche編號10735086001)/ PBS 0.2%Tween20中，並向每一孔中添加30μl此稀釋液。然後將板在室溫下在振盪器上培育1小時，且用100μl含有0.1% Tween-20之PBS洗滌3次。然後向每一孔中添加30μl TMB受質(BM-Blue，可溶性HRP受質，Roche編號11484281001)，之後在室溫下在振盪器上培育25分鐘。然後藉由向每一孔中添加25μl硫酸終止反應，且吸光度在讀板儀中在450 nM下量測。藉由自結合值之平均值減去背景值之平均值來計算CD8a與HLAG之特異性結合。在不存在抗體之情況下CD8與HLAG之總結合被認為100%結合或0%抑制。
圖4c中之條形圖顯示與市售抗體相比，由所述抗HLA-G抗體實現之抑制%。市售HLA-G抗體87G不阻斷HLA-G / CD8a相互作用，其中與此設置中所述之抗體相比，MEM/G09及G233部分抑制HLAG與CD8a之相互作用。
實例 5
抗 HLA-G 抗體與細胞之結合
a) 細胞表面 HLA-G 結合 ELISA
將25 μl/孔之JEG3細胞(天然表現HLA-G，20000個細胞/孔)、Skov-3細胞或在細胞表面上表現重組HLA-G之Skov-3細胞(二者皆10000個細胞/孔)接種至組織培養處理之384孔板(Corning，3701)中並在37℃下培育過夜。次日，添加12.5 μl抗HLA-G樣品(最終稀釋1:3)，且在4℃下培育2h藉由添加50 μl/孔之戊二醇至終濃度為0.05%固定細胞(Sigma目錄號G5882；批號：056K5318)。在洗滌(3×90 μl/孔，用PBST-緩衝液)後，添加25 μl/孔之山羊-抗小鼠H+L-POD (Biorad編號170-6561，1:2000，於OSEP中)或驢-抗兔IgG POD (GE編號NA9340V，1:5000，於OSE中)並在RT下在振盪器上培育1 h。為了檢測大鼠IgG，添加山羊-抗大鼠IgG1-POD (Bethyl編號A110-106P)、山羊- 抗大鼠IgG2a-POD (Bethyl編號A110-109P)及山羊抗大鼠IgG2b-POD (Bethyl編號A110-111P) 1:10000於OSEP中之混合物且在振盪器上在室溫下培育1 h。在洗滌(4×90μl/孔，用PBST-緩衝液)後，添加25 μl/孔之TMB受質(Roche，11835033001)且培育直至OD 2-3。量測在Tecan Safire 2儀器上於370/492 nm下進行。
上表概述不同大鼠抗人類HLA-G單株抗體與在不同細胞及細胞系上表現之HLA-G的結合，如藉由FACS分析所評價。闡述與天然表現HLA-G之JEG3腫瘤細胞或Skov3或PA-TU-8902轉染子及各別親代、未轉染之細胞的結合。
b) HLA-G 抗體與在細胞上表現之天然或重組 HLA-G 的結合 ( 如藉由 FACS 分析所評價 )
對於流式細胞術分析，在4℃下將細胞用抗HLA-G mAb染色。簡言之，將25μl/孔之每一細胞懸浮液(5×104 個細胞/孔)轉移至聚丙烯96孔V形底部板中，且在冰箱中於5℃下預冷10 min。將抗HLA-G樣品在染色緩衝液中稀釋至80μg/ml之2倍起始濃度。對抗體實施4倍連續稀釋，且將25μl/孔之抗體溶液添加至製備之細胞中且在5℃下培育1h。將細胞用200μl/孔之染色緩衝液洗滌兩次，且以300g離心3 min。對於檢測，將螢光標記之抗物種抗體(偶聯至Alexa 488之山羊抗大鼠IgG (H+L)，Life technologies編號A11006；或山羊抗小鼠IgG (H+L)，Life technologies編號A11001)；或偶聯至Alexa 488之山羊抗人類IgG (H+L)，Life technologies編號A11013)在染色緩衝液中稀釋至20µg/ml且將細胞糰粒重新懸浮於50µl/孔之檢測抗體中。在5℃下培育1小時後，再次用染色緩衝液洗滌細胞2次，重新懸浮於於70μl染色緩衝液中並在FACS Canto II下量測。
抗HLA-G抗體HLA-G 0031、HLAG 0039、HLA-G 0041及HLA-G 0090之實例性FACS染色於圖4之FACS疊加圖中給出：
實例 6
抗 HLA-G 抗體抑制 / 調節 ILT2 與 JEG3 細胞上表現之 HLA-G 的結合
對於分析，在與不同抗HLA-G抗體一起預培育或不一起預培育情況下，將JEG3細胞(ATCC HTB36)用ILT2-Fc融合蛋白(對照=無抑制)染色。對於與抗HLA-G抗體一起預培育，將25μl/孔之細胞懸浮液轉移至聚丙烯96孔V形底部板中且在冰箱中在4℃下預冷10 min。將抗HLA-G抗體或參考抗體(G233、MEM-G/9或87G)在染色緩衝液中稀釋至80µg/ml之2倍濃度且將25µl/孔之抗體添加至製備之細胞中且在5℃下培育1h。將細胞用200µl/孔之染色緩衝液洗滌兩次，以300g離心3min且最後重新懸浮於25µl/孔之染色緩衝液中。
如下確定人類ILT2-Fc嵌合體蛋白(RD編號2017-T2-050)與a) JEG3細胞預培育之抗HLA-G mAb或b) 未經處理之JEG3細胞作為參照的檢測：簡言之，將ILT2-Fc或對照人類IgG (Jackson-Immuno-Research編號009-000-003)在染色緩衝液中稀釋至20µg/ml之2倍濃度(ILT2)且將25µl/孔之ILT2-Fc蛋白溶液添加至製備之細胞中且在5℃下培育2h。再次將細胞用200µl/孔之染色緩衝液洗滌兩次。利用螢光標記之抗人類IgG Fc-γ特異性抗體(F(ab')₂片段山羊抗人類IgG、Fcγ片段特異性FITC (Jackson-Immuno-Research編號109-096-008)以染色緩衝液中10µg/ml之稀釋度檢測人類ILT2-Fc蛋白。將細胞糰粒重新懸於50μl/孔之檢測抗體中。在5℃下培育1小時後，將細胞用染色緩衝液洗滌2次，重新懸浮於70μl中並在FACS Canto II下量測以測定ILT2與JEG 3細胞之結合。
作為對照，藉由使用濃度為10µg/ml之抗物種抗體(偶聯至Alexa 488之山羊抗大鼠IgG (H+L) (Life technologies編號A11006)、或山羊抗小鼠IgG (H+L)-Alexa 488 (Life technologies，編號A11001)檢測抗HLA-G抗體與JEG-3預培育之細胞的結合。
圖5中之圖顯示不同HLA-G抗體修飾重組ILT2與JEG3腫瘤細胞上天然表現之HLA-G之相互作用及結合的各別能力。
下表概述實驗之結果。抗HLA-G抗體與JEG3細胞之結合繪示為+ =弱結合 - +++ =強結合。抗HLA-G抗體抑制/阻斷或增加ILT2與表現HLA-G之JEG3細胞之結合的能力。在最後一欄中，顯示/定量重組ILT2與細胞之結合或其抑制/阻斷(在不存在抗HLA-G抗體下ILT2-Fc之染色設定為至少100%結合，其中0%抑制，負值表示甚至增加之結合；染色信號差異低於5%並不顯著，此乃因分類無效應)：
實例 7
單核球細胞介素恢復分析 ( 在 HLA-G 介導之抑制後 )
表現HLA-G之細胞與單核球之以下共培養分析用於不同大鼠抗人類HLA-G單株抗體之功能表徵。自健康供體之血液中分離外周人類單核球。簡言之，將血液收集在含有抗凝劑之管中且在PBS中1:2稀釋。為了分離外周血單核細胞(PBMC)，將30ml混合物轉移至具有預填充分離介質之每一Leucosep管中。12min 離心(1200xg無制動)後收集PBMC特異性條帶，用PBS洗滌三次並以300xg離心10min。最後，將細胞糰粒重新懸浮於來自Miltenyi之MACS緩衝液中，並根據製造商之說明書，經由與Miltenyi之人類單核球分離套組II (編號130-091-153)磁分離自PBMC分離人類單核球(負向選擇)。將分離之單核球以5×10e5個細胞/ml之密度重新懸浮於原代細胞培養基(RPMI 1640，PAN編號P04-17500，補充有10% FCS，Gibco編號10500；2mM L-麩醯胺酸，Sigma編號G7513；1mM丙酮酸鈉，Gibco編號11360)；MEM非必需胺基酸，Gibco編號11140；0.1mM 2-巰基乙醇，Gibco編號31350；MEM維生素，Gibco編號11120；青黴素鏈黴素，Gibco編號15140)中。藉由流式細胞術監測CD14+ CD16+ 細胞之富集，且分析細胞之ILT2及ILT4表現。對於富集之單核球與表現HLA-G之細胞之共培養分析，將JEG-3細胞((ATCC HTB36)在分析前一天在96孔平底組織培養板中以8×10e3個細胞/孔接種於100µl JEG-3培養基(具有EBSS及L-麩醯胺酸之MEM Eagle，PAN編號P04-00509，補充有10% FCS，Gibco編號10500；1mM丙酮酸鈉，Gibco編號11360；MEM非必需胺基酸，Gibco編號11140)中，以在分析當天形成匯合層。在一些實驗中，使用JEG-3 HLAG剔除細胞系且如上所述接種為JEG-3 wt細胞。將黏附之JEG-3細胞在原代細胞培養基中與4倍連續稀釋之抗HLA-G抗體一起預培育。因此，移除黏附之JEG-3細胞之上清液，且添加50μl/孔之製備之抗體溶液且在37℃、5%CO2下在加濕氣氛中培育1h。將人類單核球以2.5×10e4個人類單核球/孔添加至50µl原代細胞培養基中之抗HLA-G抗體預培育之JEG-3細胞中，且將共培養物在37℃及5% CO2下在加濕氣氛中培育過夜(約18-20小時)。次日，用50ng/ml LPS實施LPS刺激7h，且其後收穫共培養物之上清液。使用來自eBioscience之人類TNF α ELISA Ready-SET-Go!® (編號88-7346-88)測定共培養物上清液之TNFα濃度。
下表概述不同抗體特徵下特定供體之給定HLA-G抗體的功能特徵。
表 ： 功能性抗 HLA-G 抗體能夠恢復 HLA-G 特異性抑制之免疫反應 ， 即恢復與表現 HLA-G 之細胞共培養之單核球的 LPS 誘導之 TNFa 產生 ： 功能抗 HLA-G 抗體之百分比 % TNF 釋放 ( 恢復 )
功能抗HLA-G抗體能夠誘導(恢復抑制之)免疫反應，即恢復與表現HLA-G之細胞共培養之單核球的LPS誘導之TNFa產生(對於HLAG特異性TNF誘導之陰性對照，使用HLAG剔除細胞系，以辨別抗體是否不顯示TNF誘導(真正HLA-G特異性者)或對剔除細胞系顯示TNF誘導(其不可為HLAG特異性)。
使用以下條件計算抗HLA-G抗體之%TNF誘導之值：JEG3細胞及單核球之未處理之共培養物 = 0%、僅單核球培養物(無HLA-G誘導之抑制)= 100%
自上表可以清楚地看出，本發明之抗體能夠誘導與表現HLA-G之JEG-3細胞共培養之單核球之TNFα釋放，而其不能誘導與HLA-G剔除之JEG-3細胞共培養之單核球之TNFα釋放。
自表中可以清楚地看出，參考抗體並非真正HLA-G特異性，此乃因其亦在HLA-G剔除細胞系中誘導強TNFα釋放。
端視供體(下文之不同供體)而定，% TNF釋放(恢復)變化。
實例8
結合至人類HLA-G及人類CD3之雙特異性抗體(抗HLA-G/CD3)的生成
重組 DNA 技術
如以下文獻中所述使用標準方法來操作DNA：Sambrook, J.等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989。根據製造商之說明書使用分子生物學試劑。
基因及寡核苷酸合成
藉由化學合成在Geneart GmbH(Regensburg，Germany)製備期望基因區段。將合成之基因片段選殖至大腸桿菌質體中進行繁殖/擴增。藉由DNA測序驗證亞選殖之基因片段之DNA序列。或者，藉由使化學合成之寡核苷酸退火或經由PCR裝配短的合成DNA片段。由metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Germany)製備各別寡核苷酸
基礎 / 標準哺乳動物表現質體之說明
對於期望基因/蛋白質(例如抗體重鏈或抗體輕鏈)之表現，使用包含以下功能元件之轉錄單元：
- 來自包括內含子A之人類巨細胞病毒(P-CMV)之立即早期增強子及啟動子，
- 人類重鏈免疫球蛋白5’-未轉譯區(5’UTR)，
- 鼠類免疫球蛋白重鏈信號序列，
- 欲表現之基因/蛋白質(例如全長抗體重鏈或MHC I類分子)，及
- 牛生長激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
除了包括欲表現之期望基因之表現單元/盒之外，基礎/標準哺乳動物表現質體亦含有
- 來自載體pUC18之複製起點，其容許在大腸桿菌中複製此質體，及
- β-內醯胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予胺苄青黴素抗性。
蛋白質測定
藉由使用根據多肽之胺基酸序列計算之莫耳消光係數測定280 nm下之光學密度(OD)來測定純化多肽之蛋白質濃度。
重組單株雙特異性抗體之表現質體的生成
重組單株抗體基因編碼各別免疫球蛋白重鏈及輕鏈。
除了免疫球蛋白重鏈或輕鏈表現盒之外，用於瞬時表現單株抗體分子之表現質體亦包括載體pUC18之複製起點，其允許在大腸桿菌中複製該質體；及β-內醯胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予胺苄青黴素抗性。
各別抗體重鏈或輕鏈之轉錄單元包括以下功能元件：
- 來自包括內含子A之人類巨細胞病毒(P-CMV)之立即早期增強子及啟動子，
- 人類重鏈免疫球蛋白5’-未轉譯區(5’UTR)，
- 鼠類免疫球蛋白重鏈信號序列，
- N-末端截短之金黃色葡萄球菌轉肽酶A編碼核酸，及
- 牛生長激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
瞬時表現及分析表徵
藉由在F17培養基(Invitrogen Corp.)中培養之HEK293細胞(人類胚腎細胞系293源)之瞬時轉染實施重組產生。對於單株抗體之產生，將細胞與含有各別免疫球蛋白重鏈及輕鏈之質體共轉染。對於轉染，使用「293-Fectin」轉染試劑(Invitrogen)。轉染按照製造商之說明書中所規定實施。轉染後三至七(3-7)天收穫細胞培養上清液。在降低之溫度(例如-80℃)下儲存上清液。
關於例如HEK293細胞中人類免疫球蛋白之重組表現的一般資訊在以下中給出：Meissner，P.等人，Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203。
使用重組DNA技術、生成重組單株抗體之表現質體及瞬時表現及分析表徵之上述方法，產生結合至人類HLA-G及人類CD3之以下雙特異性抗體並進行分析：
結合至人類HLA-G及人類CD3之雙特異性抗體(抗HLA-G/CD3) (結合人類HLA-G之抗原結合位點及結合人類CD3之抗原結合位點之可變區VH/VL及超變區(HVR)的SEQ ID No)：
結合至人類HLA-G及人類CD3之雙特異性抗體(抗HLA-G/抗CD3雙特異性抗體)：該抗HLA-G/抗CD3雙特異性抗體中包括之雙特異性抗體鏈的SEQ ID No (基於結合人類HLA-G之抗原結合位點及結合人類CD3之抗原結合位點的各別可變區VH/VL)：
P1AA1185 ( 基於 HLA-G-0031 及 CH2527) ：
SEQ ID NO: 64 輕鏈1 P1AA1185
SEQ ID NO: 65 輕鏈2 P1AA1185
SEQ ID NO: 66 重鏈1 P1AA1185
SEQ ID NO: 67 重鏈2 P1AA1185
P1AA1185-104 ( 基於 HLA-G-0031-0104 及 CH2527)
SEQ ID NO: 68 輕鏈1 P1AA1185-104
SEQ ID NO: 69 輕鏈2 P1AA1185-104
SEQ ID NO: 70 重鏈1 P1AA1185-104
SEQ ID NO: 71 重鏈2 P1AA1185-104
P1AD9924 ( 基於 HLA-G-0090 及 CH2527)
SEQ ID NO: 72 輕鏈1 P1AD992
SEQ ID NO: 73 輕鏈2 P1AD992
SEQ ID NO: 74 重鏈1 P1AD992
SEQ ID NO: 75 重鏈2 P1AD992
實例9
雙特異性抗 HLA-G/ 抗 CD3 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體與細胞上表現之天然或重組 HLA-G 之結合 ( 如藉由 FACS 分析評價 )
藉由FACS分析評價抗HLA-G TCB mAb與在不同細胞及細胞系上表現之HLA-G之結合能力。闡述與天然表現HLA-G之JEG3腫瘤細胞或Skov3或PA-TU-8902轉染子及各別親代、未轉染之細胞的結合。
對於流式細胞術分析，在4℃下將細胞用抗HLA-G TCB mAb染色。簡言之，將25μl/孔之每一細胞懸浮液(5×104 個細胞/孔)轉移至聚丙烯96孔V形底部板中，且在冰箱中於5℃下預冷10 min。將抗HLA-G樣品在染色緩衝液中稀釋至80μg/ml之2倍起始濃度。對抗體實施4倍連續稀釋，且將25μl/孔之抗體溶液添加至製備之細胞中且在5℃下培育1h。將細胞用200μl/孔之染色緩衝液洗滌兩次，且以300g離心5min。其後將細胞糰粒重新懸浮於25μl染色緩衝液中。對於檢測，將螢光標記之抗物種抗體(偶聯至PE之驢抗人類IgG (H+L)，Jackson Immuno Research編號709-116-149)在染色緩衝液中以1:100稀釋，且將25μl/孔之檢測抗體添加至細胞懸浮液中。在5℃下培育1小時後，再次用染色緩衝液洗滌細胞2次，重新懸浮於於70μl染色緩衝液中並在FACS Canto II下量測。P1AA1185之結合結果示於圖7中。
實例10
雙特異性抗 HLA-G/ 抗 CD3 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體介導之 T 細胞活化
在經重組HLAG轉染之SKOV3細胞(SKOV3HLAG)上測試在表現HLAG之腫瘤細胞存在下抗HLA-G TCB活化T細胞之能力。藉由T細胞上細胞表面活化標記CD25及早期活化標記CD69之FACS分析評價T細胞之活化。簡言之，藉由密度梯度離心使用淋巴球分離介質管(PAN編號P04-60125)自人類外周血分離PBMC。將PBMC及SKOV3HLAG細胞以10 : 1之比率接種於96孔U形底部板中。隨後如圖(圖8)中所示將共培養物與HLAG-TCB以不同濃度一起培育且於37℃下在具有5% CO2 之培育器中培育24h。次日，藉由流式細胞術量測CD25及CD69之表現。
對於流式細胞術分析，於4℃下將細胞用PerCP-Cy5.5小鼠抗人類CD8 (BD Pharmingen編號565310)、PE小鼠抗人類CD25 (eBioscience編號9012-0257)及APC小鼠抗人類CD69 (BD Pharmingen編號555533)染色。簡言之，將抗體稀釋至2倍濃度且在每一孔中添加25µl抗體稀釋物與25µl預洗滌之共培養物。於4℃下將細胞染色30 min，且用200μl/孔之染色緩衝液洗滌兩次且以300g離心5 min。將細胞團顆粒重新懸浮於200μl染色緩衝液中，並用DAPI染色，在2μg/ml之終濃度下進行活死區分。然後使用BD LSR流式細胞計數器量測樣品。使用FlowJo V.10.1軟體實施數據分析。輸出平均螢光強度之幾何平均值，且計算同型及抗體之幾何平均值之比率。雙特異性抗HLA-G/抗CD3 T細胞雙特異性(TCB)抗體P1AA1185及P1AD9924誘導T細胞活化。
實例11
雙特異性抗 HLA-G/ 抗 CD3 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體介導之由 T 細胞的 IFN γ 分泌
在經重組HLAG轉染之SKOV3細胞(SKOV3HLAG)及表現內源HLAG之JEG3細胞上測試在表現HLAG之腫瘤細胞存在下抗HLA-G TCB誘導由T細胞進行IFNγ分泌之能力。藉由Luminex技術檢測IFNγ分泌。為了量測在TCB處理後由T細胞之IFNγ分泌，將PBMC及SKOV3HLAG細胞或JEG3細胞之共培養物與抗HLAG TCB一起培育。簡言之，藉由密度梯度離心使用淋巴球分離介質管(PAN編號P04-60125)自人類外周血分離PBMC。將PBMC及SKOV3HLAG細胞以10 : 1之比率接種於96孔U形底部板中。隨後如圖(圖9)中所示將共培養物與HLAG-TCB以不同濃度一起培育且於37℃下在具有5% CO2 之培育器中培育24h。次日，收集上清液，並使用Milliplex MAP套組(Luminex技術)根據製造商之說明書量測IFNγ分泌。雙特異性抗HLA-G/抗CD3 T細胞雙特異性(TCB)抗體P1AA1185及P1AD9924誘導由T細胞之IFNγ分泌。
實例12
T 細胞介導之雙特異性抗 HLA-G/ 抗 CD3 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體之細胞毒性 / 腫瘤細胞殺死的誘導
在經重組HLAG轉染之SKOV3細胞(SKOV3HLAG)及表現內源HLAG之JEG3細胞上測試在表現HLAG之腫瘤細胞存在下抗HLA-G TCB誘導T細胞介導之細胞毒性之能力。藉由量測用HLAG TCB處理後細胞中之半胱天冬酶8活化來檢測細胞毒性。為了量測TCB處理後之半胱天冬酶8活化，將PBMC及SKOV3HLAG細胞或JEG3細胞之共培養物與抗HLAG TCB一起培育24或48小時，並使用半胱Caspase8Glo套組(Promega，編號G8200)量測半胱天冬酶8活化。簡言之，藉由密度梯度離心使用淋巴球分離介質管(PAN編號P04-60125)自人類外周血分離PBMC。將PBMC及SKOV3HLAG細胞以10: 1之比率(100µl/孔)接種於黑色透明底部96孔板中。隨後如圖(圖10)中所示將共培養物與HLAG-TCB以不同濃度一起培育且於37℃下在具有5% CO2 之培育器中培育24h或48h。次日，向每一孔中添加100μl Caspase8 Glo受質，且在室溫下置於振盪器上1小時。在BioTek Synergy 2機器上量測發光。對應於半胱天冬酶8活化/細胞毒性之相對發光單位(RLU)繪製在圖(圖10)中。雙特異性抗HLA-G/抗CD3 T細胞雙特異性(TCB)抗體P1AA1185及P1AD9924在表現HLAG之SKOV3及JEG3細胞中誘導T細胞介導之抗HLA-G/抗CD3雙特異性TCB抗體(P1AA1185及P1AD9924)之細胞毒性/腫瘤細胞殺死。
實例13
經與人類PBMC共接枝之重組HLAG轉染之SKOV3人類卵巢癌(SKOV3 HLAG)中雙特異性抗HLA-G/抗CD3 T細胞雙特異性(TCB)抗體之活體內抗腫瘤效能 向NSG (NOD/scid/IL-2Rγnull)小鼠(n=10)皮下注射5×106 個SKOV3 HLAG細胞，總體積為100μl。一旦腫瘤達到300mm3 之平均體積，每個小鼠以200μl總體積注射1×107 個人類PBMC。PBMC注射後7天，將小鼠隨機化且每週兩次用HLAG TCB(5mg/kg)處理。作為對照，一組小鼠每週兩次接受i.v.注射組胺酸緩衝液(媒劑)。每週兩次量測腫瘤體積直至研究終止。實驗結果示於圖12中。結果顯示不同研究組中如藉由測徑器量測之10隻小鼠之腫瘤體積的中值及四分位數範圍(IQR)。雙特異性抗HLA-G/抗CD3 T細胞雙特異性(TCB)抗體P1AA1185及P1AD9924皆顯示強的腫瘤生長抑制，其中P1AD9924顯示完全緩解。
圖 1 ： HLA-G之不同同種型。
圖 2 ： 圖 2A ： 具有與ß2M締合之分子之HLA-G的示意性代表圖。
圖 2B ： 與某些受體締合之HLA-G分子之結構：與諸如ILT4及KIR2DL1等給定受體複合的HLA-G結構。ILT4結構(PDB代碼：2DYP)。KIR2DL1結構係取自PDB代碼1IM9 (KIR2DL1: HLA-Cw4複合結構)且藉由HLA-Cw4及HLA-G結構之疊加位於HLA-G上。受體以長條表示顯示，HLA-G以分子表面表示顯示。獨特且在其他HLA同種同源物保守之HLA-G殘基分別以白色及灰色著色。獨特表面殘基由嵌合反抗原中之HLA共有序列置換。
圖 3 ： 抑制(或刺激)HLA-G與ILT2及ILT4以及CD8相互作用/結合之HLA-G抗體：
圖 3A ：ILT2抑制。
圖 3B ：ILT4抑制。
圖 3C ：CD8抑制。
圖 4 ： 使用JEG3 (天然表現HLA-G之細胞)、SKOV-3細胞(野生型(wt)對HLAG轉染之細胞(HLAG+))及PA-TU-8902細胞(野生型(wt)對HLAG轉染之細胞(HLAG+))上之HLA-G抗體之HLA-G之細胞表面表現的流式細胞分析：
圖 4A ： HLA-G-0031 (編號0031)；圖 4B ： HLA-G-0039 (編號0039)；圖 4C ： HLA-G-0041 (編號0041) ； 圖 4D ： HLA-G-0090 (編號0090)。
圖 5 ： 圖 5A ：抗HLA-G抗體(0031、0039、0041及0090)阻斷/調節人類ILT2 Fc嵌合體與JEG3細胞上表現之HLA-G的相互作用：
藉由使用與Alexa488偶聯之抗大鼠IgG二級抗體評價細胞表面HLA-G經新穎抗HLA-G抗體的染色(上方列 )。FACS直方圖中顯示用單獨二級抗體染色之細胞(灰色虛線)及用抗HLA-G抗體染色之細胞(黑色實線)。在下方列中，繪示與單獨用二級抗體染色之細胞(灰色虛線)相比，與JEG3細胞上之HLA-G結合之人類ILT2-Fc (黑色虛線)。可看到預培育JEG3細胞與HLA-G抗體對ILT2 Fc嵌合體結合之影響(黑色實線)：HLA-G-0031及HLA-G-0090顯示幾乎完全抑制ILT2-Fc嵌合體與JEG3細胞結合。有趣的是，兩種抗體0039及0041甚至增加ILT2:fc與細胞之結合。
圖 5B ：商業/參考抗HLA-G抗體對ILT2 Fc嵌合體與JEG3細胞上之HLA-G之結合的影響：
藉由使用與Alexa488偶聯之物種特異性二級抗體評價細胞表面HLA-G經商業/參考抗HLA-G抗體的染色(上方列 )。FACS直方圖中顯示用單獨二級抗體染色之細胞(灰色虛線)及用抗HLA-G抗體染色之細胞(黑色實線)。在下方列中，繪示與單獨用二級抗體染色之細胞(灰色虛線)相比，與JEG3細胞上之HLA-G結合之人類ILT2 Fc嵌合體(黑色虛線)。可看到預培育JEG3細胞與參考抗體對ILT2 Fc嵌合體結合之影響(黑色實線)。測試之參考抗體皆不可阻斷ILT2 Fc嵌合體與JEG3細胞上之細胞表面HLA-G的相互作用。
圖 6 ： 用抑制性抗HLA-G抗體阻斷HLA-G對針對不同供體評價之TNFα產生之恢復的影響。
圖 6A ：針對代表性單核球供體評估之抗HLAG抗體HLA-G-0031 (編號0031)、HLA-G-0039 (編號0039)及HLA-G-0041 (編號0041)。
圖 6B ：針對不同單核球供體評估之抗HLAG抗體HLA-G-0090 (編號0090)]。
圖 6C ： wt JEG-3細胞及敲低變體中之HLAG表現的西方墨點分析。
圖 7: HLA-G TCB抗體與抗HLA-G/抗CD3雙特異性抗體(P1AA1185及P1AD9924)之細胞上表現之天然或重組HLA-G的結合(如藉由FACS分析所評價)。
圖 8 ： HLAG TCB介導之T細胞活化(抗HLA-G/抗CD3雙特異性TCB抗體(P1AA1185及P1AD9924))。
圖 9 ： 由T細胞(抗HLA-G/抗CD3雙特異性TCB抗體P1AA1185及P1AD9924)之HLAG TCB介導之IFN γ分泌。
圖 10 ： 由抗HLA-G/抗CD3雙特異性TCB抗體(P1AA1185及P1AD9924)之T細胞介導之細胞毒性/腫瘤細胞殺死的誘導
圖 11 ： 本發明之雙特異性抗原結合分子的實例性構形。(A、D) 「1+1 CrossMab」分子之圖解說明。(B、E) 具有Crossfab及Fab組分之交替次序(「倒置」)之「2+1 IgG Crossfab」分子的圖解說明。(C、F) 「2+1 IgG Crossfab」分子之圖解說明。(G、K) 具有Crossfab及Fab組分之交替次序(「倒置」)之「1+1 IgG Crossfab」分子的圖解說明。(H、L) 「1+1 IgG Crossfab」分子之圖解說明。(I、M) 具有兩個CrossFab之「2+1 IgG Crossfab」分子之圖解說明。(J、N) 具有兩個CrossFab以及Crossfab及Fab組分之交替次序(「倒置」)之「2+1 IgG Crossfab」分子的圖解說明。(O、S) 「Fab-Crossfab」分子之圖解說明。(P、T) 「Crossfab-Fab」分子之圖解說明。(Q、U) 「(Fab)2-Crossfab」分子之圖解說明。(R、V) 「Crossfab-(Fab)2」分子之圖解說明。(W、Y) 「Fab-(Crossfab)2」分子之圖解說明。(X、Z) 「(Crossfab)2-Fab」分子之圖解說明。黑點：Fc結構域中促進異源二聚化之可選修飾。++、--：視情況引入CH1及CL結構域中之相反電荷之胺基酸。Crossfab分子繪示為包含VH及VL區之交換，但在其中CH1及CL結構域中未引入電荷修飾之實施例中或者可以包含CH1及CL結構域之交換。
圖 12 ： 抗HLA-G/抗CD3雙特異性TCB抗體(P1AA1185及P1AD9924)之活體內抗腫瘤效能。
Figure TW201945394A_D0016
Figure TW201945394A_D0017
Figure TW201945394A_D0018
Figure TW201945394A_D0019
Figure TW201945394A_D0020
Figure TW201945394A_D0021
Figure TW201945394A_D0022
Figure TW201945394A_D0023
Figure TW201945394A_D0024
Figure TW201945394A_D0025
Figure TW201945394A_D0026
Figure TW201945394A_D0027
Figure TW201945394A_D0028
Figure TW201945394A_D0029
Figure TW201945394A_D0030
Figure TW201945394A_D0031
Figure TW201945394A_D0032
Figure TW201945394A_D0033
Figure TW201945394A_D0034
Figure TW201945394A_D0035
Figure TW201945394A_D0036
Figure TW201945394A_D0037
Figure TW201945394A_D0038
Figure TW201945394A_D0039
Figure TW201945394A_D0040
Figure TW201945394A_D0041
Figure TW201945394A_D0042
Figure TW201945394A_D0043
Figure TW201945394A_D0044
Figure TW201945394A_D0045
Figure TW201945394A_D0046
Figure TW201945394A_D0047
Figure TW201945394A_D0048
Figure TW201945394A_D0049
Figure TW201945394A_D0050
Figure TW201945394A_D0051
Figure TW201945394A_D0052
Figure TW201945394A_D0053
Figure TW201945394A_D0054
Figure TW201945394A_D0055
Figure TW201945394A_D0056
Figure TW201945394A_D0057
Figure TW201945394A_D0058
Figure TW201945394A_D0059
Figure TW201945394A_D0060
Figure TW201945394A_D0061
Figure TW201945394A_D0062
Figure TW201945394A_D0063
Figure TW201945394A_D0064
Figure TW201945394A_D0065
Figure TW201945394A_D0066
Figure TW201945394A_D0067
Figure TW201945394A_D0068
Figure TW201945394A_D0069
Figure TW201945394A_D0070
Figure TW201945394A_D0071
Figure TW201945394A_D0072
Figure TW201945394A_D0073
Figure TW201945394A_D0074
Figure TW201945394A_D0075
Figure TW201945394A_D0076
Figure TW201945394A_D0077
Figure TW201945394A_D0078
Figure TW201945394A_D0079
Figure TW201945394A_D0080
Figure TW201945394A_D0081
Figure TW201945394A_D0082
Figure TW201945394A_D0083
Figure TW201945394A_D0084
Figure TW201945394A_D0085
Figure TW201945394A_D0086
Figure TW201945394A_D0087
Figure TW201945394A_D0088
Figure TW201945394A_D0089

Claims (15)

  1. 一種結合至人類HLA-G及人類CD3之多特異性抗體，其包含結合至人類HLA-G之第一抗原結合部分及結合至人類CD3之第二抗原結合部分， 其中該多特異性抗體不與包含SEQ ID NO:44之經修飾人類HLA-G ß2M MHC I複合體(其中HLA-G特異性胺基酸被HLA-A共有胺基酸置換)交叉反應。
  2. 如請求項1之多特異性抗體，其中該抗體係雙特異性抗體；且 其中結合至人類HLA-G之該第一抗原結合部分抗體包含 A) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:3之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之HVR-L3；或 B) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:11之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之HVR-L3；或 C) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:19之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之HVR-L3；或 D) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之HVR-L3； 且其中結合至T細胞活化抗原之該第二抗原結合部分結合至人類CD3，且包含 E) (a) VH結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之HVR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii) 包含選自SEQ ID NO:58之胺基酸序列之HVR-H3；及(b) VL結構域，其包含(i) 包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之HVR-L1；(ii) 包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之HVR-L2及(iii) 包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之HVR-L3。
  3. 如請求項2之多特異性抗體，其中該第一抗原結合部分 A) vii) 包含SEQ ID NO:7之VH序列及SEQ ID NO:8之VL序列； viii) 或i)之該抗體之該VH及VL的人類化變體；或 ix) 包含SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列；或 B) 包含SEQ ID NO:15之VH序列及SEQ ID NO:16之VL序列；或 C) 包含SEQ ID NO:23之VH序列及SEQ ID NO:24之VL序列；或 D) 包含SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列； 且其中該第二抗原結合部分 E) 包含SEQ ID NO:62之VH序列及SEQ ID NO:63之VL序列。
  4. 如請求項3之多特異性抗體， 其中該第一抗原結合部分包含i) SEQ ID NO:31之VH序列及SEQ ID NO:32之VL序列；或ii) SEQ ID NO:33之VH序列及SEQ ID NO:34之VL序列； 且其中該第二抗原結合部分 包含SEQ ID NO:62之VH序列及SEQ ID NO:63之VL序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之多特異性抗體，其中該抗體 a) 不與包含SEQ ID NO:39及SEQ ID NO: 37之人類HLA-A2 ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或 b) 不與包含SEQ ID NO:45之小鼠H2Kd ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或 c) 不與包含SEQ ID NO:47之大鼠RT1A ß2M MHC I複合體交叉反應；及/或 d) 抑制ILT2與單體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合；及/或 e) 抑制ILT2與三聚體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合超過50% (在一個實施例中超過60 %) (當與無抗體之結合相比時)；及/或 f) 抑制ILT2與單體及/或二聚體及/或三聚體HLA-G ß2M MHC I複合體(包含SEQ ID NO: 43)之結合超過50% (在一個實施例中超過80 %) (當與無抗體之結合相比時)；及/或 g) 抑制ILT2與JEG3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G)之結合(超過50 % (在一個實施例中超過80%)) (當與無抗體之結合相比時)；及/或 h) 結合至JEG3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G) (參見實例5)，且抑制ILT2與JEG-3細胞(ATCC編號HTB36) (其上之HLA-G)之結合(超過50 % (在一個實施例中超過80%)) (當與無抗體之結合相比時)；及/或 i) 抑制CD8a與HLAG之結合超過80% (當與無抗體之結合相比時)；及/或 j) 恢復與JEG-3細胞(ATCC HTB36)共培養之單核球的HLA-G特異性抑制之免疫反應；及/或 k) 在表現HLAG之腫瘤細胞(例如JEG-3細胞(ATCC HTB36))存在下誘導T細胞介導之細胞毒性。
  6. 如請求項1至4中任一項之多特異性抗體，其中該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分係Fab分子。
  7. 如請求項1至4中任一項之多特異性抗體，其中該第二抗原結合部分係Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變結構域VL及VH或恆定結構域CL及CH1，特定而言該等可變結構域VL及VH，彼此置換。
  8. 如請求項1至4中任一項之多特異性抗體，其中該第一抗原結合部分係Fab分子，其中在恆定結構域中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且位置123之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在該恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
  9. 如請求項1至4中任一項之多特異性抗體，其中該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分視情況經由肽連接體彼此融合。
  10. 如請求項1至4中任一項之多特異性抗體，其中該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分各自係Fab分子且其中(i) 該第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至該第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端，或(ii) 該第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端融合至該第二抗原結合部分之Fab重鏈之N端。
  11. 如請求項1至4中任一項之多特異性抗體，其包含第三抗原結合部分。
  12. 如請求項11之多特異性抗體，其中該第三抗原部分與該第一抗原結合部分相同。
  13. 一種編碼如請求項1至12中任一項之多特異性抗體之經分離核酸。
  14. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至12中任一項之多特異性抗體及醫藥上可接受之載劑。
  15. 如請求項1至4中任一項之多特異性抗體，其用於治療癌症。
TW108113353A 2018-04-18 2019-04-17 多特異性抗體及其用途 TW201945394A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18168053.9 2018-04-18
EP18168053 2018-04-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201945394A true TW201945394A (zh) 2019-12-01

Family

ID=62025743

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108113353A TW201945394A (zh) 2018-04-18 2019-04-17 多特異性抗體及其用途

Country Status (19)

Country Link
US (1) US20210147554A1 (zh)
EP (1) EP3781594A1 (zh)
JP (2) JP2021521785A (zh)
KR (1) KR20210005639A (zh)
CN (1) CN111989343B (zh)
AR (1) AR115052A1 (zh)
AU (1) AU2019256744A1 (zh)
BR (1) BR112020021111A2 (zh)
CA (1) CA3095547A1 (zh)
CL (1) CL2020002539A1 (zh)
CO (1) CO2020012360A2 (zh)
IL (1) IL277559A (zh)
MA (1) MA52285A (zh)
MX (1) MX2020010946A (zh)
PE (1) PE20210517A1 (zh)
PH (1) PH12020500667A1 (zh)
SG (1) SG11202009692SA (zh)
TW (1) TW201945394A (zh)
WO (1) WO2019202041A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI821956B (zh) * 2021-03-24 2023-11-11 聖安生醫股份有限公司 免疫調節及抗腫瘤相關奈米抗體暨其核酸編碼序列及其應用

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201829463A (zh) 2016-11-18 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗hla-g抗體及其用途
EP3820904A2 (en) 2018-07-09 2021-05-19 Five Prime Therapeutics, Inc. Antibodies binding to ilt4
CN113528448B (zh) * 2020-04-14 2023-01-24 同济大学 一种人胚胎干细胞的构建方法
AU2021286650A1 (en) * 2020-06-11 2023-01-19 Tizona Therapeutics Bispecific immune cell engagers with binding specificity for HLA-G and another antigen
EP4188439A2 (en) * 2020-07-29 2023-06-07 Janssen Biotech, Inc. Proteins comprising hla-g antigen binding domains and their uses
EP4263609A1 (en) * 2020-12-17 2023-10-25 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-hla-g antibodies and use thereof
US12012454B2 (en) * 2021-03-24 2024-06-18 China Medical University Hospital Anti-tumor antigen nanobody and nucleic acid encoding sequence thereof, and uses of the same
CN113398253B (zh) * 2021-05-14 2023-01-24 北京化工大学 β2微球蛋白聚集抑制剂
AU2022280063A1 (en) * 2021-05-26 2024-01-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptor to target hla-g-positive cancers

Family Cites Families (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8211999B2 (en) * 1970-02-11 2012-07-03 Immatics Biotechnologies Gmbh Tumor-associated peptides binding promiscuously to human leukocyte antigen (HLA) class II molecules
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
CA2116774C (en) 1991-09-19 2003-11-11 Paul J. Carter Expression in e. coli antibody fragments having at least a cysteine present as a free thiol. use for the production of bifunctional f(ab') 2 antibodies
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
CA2129663C (en) 1992-02-06 2005-07-05 James S. Huston Biosynthetic binding protein for cancer marker
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
DE69830901T2 (de) 1997-05-02 2006-05-24 Genentech Inc., San Francisco ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
DE60022369T2 (de) 1999-10-04 2006-05-18 Medicago Inc., Sainte Foy Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
US20030180714A1 (en) 1999-12-15 2003-09-25 Genentech, Inc. Shotgun scanning
AU2001247616B2 (en) 2000-04-11 2007-06-14 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
AU2002228745A1 (en) 2000-10-23 2002-05-06 Rajagopalan, Sumati Antibodies and other ligands directed against kir2dl4 receptor for production of interferon gamma
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7041870B2 (en) 2000-11-30 2006-05-09 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
TWI335821B (en) 2002-12-16 2011-01-11 Genentech Inc Immunoglobulin variants and uses thereof
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
WO2004106381A1 (en) 2003-05-31 2004-12-09 Micromet Ag Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd3, anti-cd19 antibody constructs for the treatment of b-cell related disorders
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
AU2005230848B9 (en) 2004-03-31 2011-06-02 Genentech, Inc. Humanized anti-TGF-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
ES2403055T3 (es) 2004-04-13 2013-05-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-P-selectina
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
WO2006034488A2 (en) 2004-09-23 2006-03-30 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP3623473A1 (en) 2005-03-31 2020-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
AU2006301492B2 (en) 2005-10-11 2011-06-09 Amgen Research (Munich) Gmbh Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
EP2465870A1 (en) 2005-11-07 2012-06-20 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
PT1999154E (pt) 2006-03-24 2013-01-24 Merck Patent Gmbh Domínios proteicos heterodiméricos modificados
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
US20080044455A1 (en) 2006-08-21 2008-02-21 Chaim Welczer Tonsillitus Treatment
US10118970B2 (en) 2006-08-30 2018-11-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
RS53008B2 (sr) 2007-04-03 2022-12-30 Amgen Res Munich Gmbh Interspecijski specifičan cd3-epsilon vezujući domen
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
DK2235064T3 (en) 2008-01-07 2016-01-11 Amgen Inc A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects
MX2011010159A (es) 2009-04-02 2011-10-17 Roche Glycart Ag Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla.
JP5616428B2 (ja) 2009-04-07 2014-10-29 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 三価の二重特異性抗体
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
EP2435473B1 (en) 2009-05-27 2013-10-02 F.Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
WO2011034605A2 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
ME02505B (me) 2009-12-29 2017-02-20 Aptevo Res & Development Llc Heterodimerni vezujući proteini i njihove upotrebe
EP2569337A1 (en) 2010-05-14 2013-03-20 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
RS59589B1 (sr) 2010-11-05 2019-12-31 Zymeworks Inc Dizajniranje stabilnog heterodimernog antitela sa mutacijama u fc domenu
KR20160044598A (ko) 2011-03-29 2016-04-25 로슈 글리카트 아게 항체 Fc 변이체
CA2837975C (en) 2011-08-23 2022-04-05 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
PL2748202T3 (pl) 2011-08-23 2018-12-31 Roche Glycart Ag Dwuswoiste cząsteczki wiążące antygen
CN107586340B (zh) * 2011-08-23 2022-01-21 罗切格利卡特公司 对t细胞活化性抗原和肿瘤抗原特异性的双特异性抗体及使用方法
DK2794905T3 (da) 2011-12-20 2020-07-06 Medimmune Llc Modificerede polypeptider til bispecifikke antistofgrundstrukturer
MX360352B (es) 2012-02-15 2018-10-30 Hoffmann La Roche Cromatografia de afinidad basada en receptores fc.
NZ772318A (en) 2012-04-20 2023-06-30 Merus Nv Methods and means for the production of ig-like molecules
KR20230155605A (ko) 2013-12-20 2023-11-10 제넨테크, 인크. 이중 특이적 항체
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
KR102170533B1 (ko) * 2014-04-03 2020-10-27 셀렉티스 암 면역요법을 위한 cd33 특이적 키메라 항원 수용체들
EP3174897B1 (en) 2014-07-29 2020-02-12 F.Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
DK3608337T3 (da) 2014-08-04 2024-06-17 Hoffmann La Roche Bispecifikke T-celleaktiverende antigenbindende molekyler
EP3209684B1 (en) 2014-10-24 2020-12-23 F.Hoffmann-La Roche Ag Vh-vl-interdomain angle based antibody humanization
US20190119385A1 (en) * 2015-03-27 2019-04-25 University Of Southern California Hla-g as a novel target for car t-cell immunotherapy
KR20240093813A (ko) 2015-04-24 2024-06-24 제넨테크, 인크. 다중특이적 항원-결합 단백질

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI821956B (zh) * 2021-03-24 2023-11-11 聖安生醫股份有限公司 免疫調節及抗腫瘤相關奈米抗體暨其核酸編碼序列及其應用

Also Published As

Publication number Publication date
PH12020500667A1 (en) 2021-07-26
JP2021521785A (ja) 2021-08-30
AU2019256744A1 (en) 2020-11-19
SG11202009692SA (en) 2020-11-27
CO2020012360A2 (es) 2020-10-30
EP3781594A1 (en) 2021-02-24
KR20210005639A (ko) 2021-01-14
MA52285A (fr) 2021-02-24
MX2020010946A (es) 2020-11-09
CA3095547A1 (en) 2019-10-24
JP2023081898A (ja) 2023-06-13
CL2020002539A1 (es) 2021-01-22
WO2019202041A1 (en) 2019-10-24
PE20210517A1 (es) 2021-03-17
US20210147554A1 (en) 2021-05-20
CN111989343A (zh) 2020-11-24
CN111989343B (zh) 2023-12-26
AR115052A1 (es) 2020-11-25
BR112020021111A2 (pt) 2021-02-17
IL277559A (en) 2020-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11613587B2 (en) Combination therapy of T cell activating bispecific antigen binding molecules and PD-1 axis binding antagonists
CN111989343B (zh) 多特异性抗体及其用途
JP7108612B2 (ja) 抗ｈｌａ－ｇ抗体とその使用
TWI535736B (zh) 對ｆａｐ及ｄｒ５具特異性之雙特異性抗體、對ｄｒ５具特異性之抗體及使用方法
JP7186239B2 (ja) 抗ｈｌａ－ｇ抗体及びその使用
JP2019502676A (ja) 抗薬物抗体の形成を減少させるためのｉｉ型抗ｃｄ２０抗体
TW201420607A (zh) 介白素－２融合蛋白及其用途
TWI808571B (zh) 抗hla-g抗體及其用途
TWI845353B (zh) 抗 hla-g 抗體及其用途
CN117545770A (zh) 抗hla-g抗体及其用途