KR20230155605A - 이중 특이적 항체 - Google Patents

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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 이중 특이적 항체, 그리고 이런 항체를 만들고 이용하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 이중 특이적 항체는 정전 또는 소수성인 경쇄 가변 영역 VL 잔기를 갖는 단일특이적 항체를 확인하고, 그리고 단독으로 또는 상기 항체의 VL을 인코딩하는 핵산 서열의 변경과 합동으로 상기 항체의 VH에서 하나 또는 그 이상의 용매 접근가능한 잔기를 인코딩하는 핵산 서열을 변경함으로써 산출된다. 변경된 VH와 VL이 발현되고, 그리고 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편이 선별된다. 예시적인 이중 특이적 항체뿐만 아니라 이들 항체를 이용하는 방법 역시 제공된다.

Description

이중 특이적 항체{DUAL SPECIFIC ANTIBODIES}
발명의 분야
본 발명은 이중 특이적 항체, 그리고 이런 항체를 만들고 이용하는 방법에 관계한다.
발명의 배경
항체는 외래 단백질, 당단백질, 세포, 또는 다른 항원성 외래 물질에 의한 도전에 대한 응답으로 척추동물 면역계에 의해 생산되는 특정한 면역글로불린 폴리펩티드이다. 이러한 과정의 중요한 부분은 특정 외래 물질에 특이적으로 결합하는 항체의 산출이다. 특정 항원에 대한 이런 폴리펩티드의 결합 특이성은 고도로 정밀화되고, 그리고 개별 척추동물에 의해 산출될 수 있는 다수의 특이성은 이의 복잡성과 가변성에서 주목할 만하다. 수천 개의 항원이 반응을 이끌어낼 수 있고, 각각은 이것을 유도한 특정 항원에 거의 배타적으로 관계한다.
특이적 항원 인식은 항체가 적응성 면역 반응에서 기능하는데 필수적이다. 중쇄 (HC)와 경쇄 (LC)의 조합 연관은 항체 레퍼토리의 산출 시에 모든 척추동물에서 보존된다. 하지만, 이들 두 사슬에서 다양성의 비대칭이 있다. HC의 가변 도메인 (VH)은 훨씬 높은 서열 다양성을 내포하고, 그리고 LC의 가변 도메인 (VL)보다 더욱 종종, 항원 인식의 결정인자에 기여한다. 하지만, 항체가 특정 외래 물질을 인식하고 여기에 결합하는 가변성을 고려하면, 일부 항체는 항원 결합 에너지를 위해 VL에 심하게 의존한다.
특정 항원 또는 항원들에 대한 항체와 항체 단편의 특이성은 항체를 바람직한 치료적 작용제로 만든다. 항체와 항체 단편은 다면발현성 생물학적 역할을 갖는 특정 항원 (가령, 사이토킨)을 표적으로 하는데 이용될 수 있다. 따라서, 다양한 질환과 장애, 예를 들면, 알레르기 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환, 그리고 증식성 질환의 치료에서 유용한 치료 항체, 특히 항체, 단편, 그리고 이들의 유도체를 확인하고 특징짓는 것이 현재 지속적으로 요구된다.
발명의 요약
본 발명은 이중 특이적 항체와 항체 단편을 만드는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 이들 방법을 이용하여 확인된 특이적 항체뿐만 아니라 이들의 용도를 제공한다.
일반적으로, 본 발명의 방법은 라이브러리에서 안정되게 발현될 수 있는 이중 특이적 항체 변이체를 산출하기 위해 항체의 VH를 다양화하는 것을 수반한다. 한 구체예에서, 항체는 다양화되기에 앞서, 함께 짝을 이루어, 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하지만 두 번째 에피토프에 결합하지 않는 항원 결합 부위를 형성하는 VH와 VL을 갖는 것으로 특징된다. 항체는 VL의 위치 32, 50, 또는 91 (Kabat 넘버링 시스템)에서 발견된 아미노산 중에서 임의의 1개, 2개, 또는 3개에서 정전 또는 소수성 잔기를 갖는 것으로 더욱 특징화된다. 이들 위치 중에서 하나 또는 그 이상에서 소수성 또는 정전 잔기를 갖는 이런 항체는 이후, VH 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 (가령, 용매 노출된 아미노산 잔기)에서 변경된다. VH와 VL은 이후, 발현되고 (가령, 라이브러리로서), 그리고 첫 번째와 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 다양화된 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편은 발현된 VH와 VL에서 선택된다.
한 양상에서, 본 발명은 가변 중쇄 도메인 (VH) 및 가변 경쇄 도메인 (VL)을 포함하는 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 만드는 방법을 특징으로 하고, 여기서 이중 특이적 항체의 VH와 VL은 함께 짝을 이루어, 첫 번째 에피토프와 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) VH와 VL을 포함하는 항체를 제공하는 단계, 여기서 VH와 VL은 함께 짝을 이루어, 첫 번째 에피토프에 결합하지만 두 번째 에피토프에 결합하지 않는 항원 결합 부위를 형성하고, 그리고 여기서 상기 항체는 정전 또는 소수성인 VL의 위치 32, 50, 또는 91에서 최소한 하나의 아미노산을 포함하고; (b) 단계 (a)의 항체의 VH를 인코딩하는 핵산 서열을 변경하고, 여기서 하나 또는 그 이상의 용매 접근가능한 아미노산 잔기가 변경되고; (c) 단계 (b)의 VL과 변경된 VH를 발현하고; 그리고 (d) 단계 (c)의 VL과 변경된 VH를 포함하는 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 선별하고, 여기서 VH와 VL은 함께 짝을 이루어, 첫 번째 에피토프와 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구체예에서, 위치 32, 50, 또는 91에서 아미노산 중에서 최소한 2개는 정전 또는 소수성이다. 일부 구체예에서, 위치 32, 50과 91에서 3개의 아미노산 모두 정전 또는 소수성이다. 일부 구체예에서, 정전 잔기는 티로신이다. 일부 구체예에서, 소수성 잔기는 트립토판이다. 일부 구체예에서, VH를 인코딩하는 핵산 서열은 복수의 자연발생 중쇄 아미노산 서열의 다양성에 근거하여 변경된다. 일부 구체예에서, 용매 노출된 잔기 위치는 VH의 위치 33, 34, 50-58, 그리고 95-97로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 잔기 위치이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 단계 (a)의 항체의 VL을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하는 것을 더욱 포함하고, 여기서 하나 또는 그 이상의 용매 접근가능한 아미노산 잔기가 변경된다. 일부 구체예에서, 용매 노출된 잔기 위치는 VL의 아미노산 93-96에서 선택되는 아미노산 잔기 위치이다. 일부 구체예에서, 변경된 VH는 단계 (d)의 선별 동안 VL과 함께 파지 상에서 전시된다. 일부 구체예에서, 단계 (a)의 항체는 아미노산 서열 KASQSVINDAA (서열 번호: 9)를 포함하는 경쇄 가변 영역 상보성 결정 영역 CDRL1, 아미노산 서열 YTSHRYT (서열 번호: 10)를 포함하는 CDRL2, 그리고 아미노산 서열 QQDYTSPWTF (서열 번호: 11)를 포함하는 CDRL3을 포함한다. 일부 구체예에서, 단계 (a)의 항체는 아미노산 서열 DYSMH (서열 번호: 13)를 포함하는 중쇄 가변 영역 상보성 결정 영역 CDRH1, 아미노산 서열 VWINTETGEPTYADDFK (서열 번호: 17)를 포함하는 CDRH2, 그리고 아미노산 서열 GGIFYGMDY (서열 번호: 20)를 포함하는 CDRH3을 포함한다. 일부 구체예에서, 단계 (d)의 이중 특이적 항체의 항원 결합 부위는 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프에 상호간에 배타적으로 결합한다. 다른 구체예에서, 단계 (d)의 이중 특이적 항체의 항원 결합 부위는 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프에 동시에 결합한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 에피토프는 한 생물학적 분자로부터 유래되고, 그리고 두 번째 에피토프는 동일한 생물학적 분자로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 에피토프는 첫 번째 생물학적 분자로부터 유래되고, 그리고 두 번째 에피토프는 두 번째 생물학적 분자로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 생물학적 분자 및 두 번째 생물학적 분자는 IL4/IL5 및 IL4/IL13으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 첫 번째 생물학적 분자 및 두 번째 생물학적 분자는 사이토킨이다. 일부 구체예에서, 첫 번째 또는 두 번째 생물학적 분자는 생체내에서 항체에 결합될 때, 이중 특이적 항체의 반감기를 증가시킬 수 있는 분자이다. 일부 구체예에서, 첫 번째 또는 두 번째 생물학적 분자는 혈청 알부민 또는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)이다. 일부 구체예에서, 첫 번째 또는 두 번째 생물학적 분자는 생체내에서 항체에 결합될 때, 이중 특이적 항체의 작동체 기능을 증가시킬 수 있는 분자이다. 일부 구체예에서, 첫 번째 또는 두 번째 생물학적 분자는 자연 살해 세포 상에서 또는 대식세포 상에서 세포 표면 단백질에 결합한다. 일부 구체예에서, 세포 표면 단백질은 Fc 수용체 또는 C1q이다. 일부 구체예에서, 이중 특이적 항체의 VH와 VL은 함께 짝을 이루어, 10-6 또는 그 이하의 KD로 첫 번째 에피토프 또는 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구체예에서, 이중 특이적 항체의 VH와 VL은 함께 짝을 이루어, 10-9 또는 그 이하의 KD로 첫 번째 에피토프 또는 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구체예에서, 이중 특이적 항체의 VH와 VL은 함께 짝을 이루어, 10-12 또는 그 이하의 KD로 첫 번째 에피토프 또는 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구체예에서, 이중 특이적 항체의 VH와 VL은 함께 짝을 이루어, 10-6 또는 그 이하의 KD로 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구체예에서, 이중 특이적 항체의 VH와 VL은 함께 짝을 이루어, 10-9 또는 그 이하의 KD로 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구체예에서, 이중 특이적 항체의 VH와 VL은 함께 짝을 이루어, 10-12 또는 그 이하의 KD로 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 생물학적 분자 및 두 번째 생물학적 분자는 구조적으로 유사하지 않다. 일부 구체예에서, 단계 (d)의 선별은 심층 염기서열결정, 초심층 염기서열결정, 및/또는 차세대 염기서열결정을 포함한다.
본 발명의 방법을 이용하여 생산된 예시적인 항체는 아래에 설명된 바와 같이, 인터류킨 4 (IL4)와 인터류킨 5 (IL5) 둘 모두에 결합하는 항체뿐만 아니라 IL4와 인터류킨 13 (IL13) 둘 모두에 결합하는 항체를 포함한다. 이들 항체의 성공적인 생산은 항체의 중쇄 가변 도메인의 서열을 변경하는 것이 이중 특이성과 기능을 갖는 항체를 산출하는 것을 향한 일반적인 가공 통로로서 역할을 할 수 있다는 것을 증명한다. 본원에서 설명된 IL4/IL5와 IL4/IL13 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 이중 특이적 항체는 2가지 경로 (다중 또는 비다중)를 동시에 표적으로 하는 잠재력을 갖고, 그리고 면역질환, 염증성 장애 및 증식성 장애를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 질환과 장애의 치료에 유용하다.
따라서, 다른 양상에서, 본 발명은 앞서 설명된 본 발명의 방법에 의해 만들어진 단리된 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 이중 특이적 항체는 단일클론 항체이다. 일부 구체예에서, 단편은 Fab 또는 scFv이다. 일부 구체예에서, 이중 특이적 항체는 IgG이다.
다른 양상에서, 본 발명은 도면 4a, 4b, 4c, 7a, 7c, 또는 7d의 항체 중에서 임의의 한 가지의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 특징으로 한다.
다른 양상에서, 본 발명은 다음의 6개 CDR을 포함하는 단리된 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 특징으로 한다: (i) KASQSVINDAA의 아미노산 서열 (서열 번호: 9)을 포함하는 CDRL1; (ii) YTSHRYT의 아미노산 서열 (서열 번호: 10)을 포함하는 CDRL2; (iii) QQDYTSPWTF의 아미노산 서열 (서열 번호: 11)을 포함하는 CDRL3; (iv) DYDIH의 아미노산 서열 (서열 번호: 14)을 포함하는 CDRH1; (v) VWINTETGEPTYADDFK의 아미노산 서열 (서열 번호: 17)을 포함하는 CDRH2; 그리고 (vi) EILFYGMDY의 아미노산 서열 (서열 번호: 21)을 포함하는 CDRH3.
다른 양상에서, 본 발명은 다음의 6개 CDR을 포함하는 단리된 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 특징으로 한다: (i) KASQSVINDAA의 아미노산 서열 (서열 번호: 9)을 포함하는 CDRL1; (ii) YTSHRYT의 아미노산 서열 (서열 번호: 10)을 포함하는 CDRL2; (iii) QQDYTSPWTF의 아미노산 서열 (서열 번호: 11)을 포함하는 CDRL3; (iv) DYFIH의 아미노산 서열 (서열 번호: 15)을 포함하는 CDRH1; (v) AGIVYDATGFTTYADDFK의 아미노산 서열 (서열 번호: 18)을 포함하는 CDRH2; 그리고 (vi) GGIFYGMDY의 아미노산 서열 (서열 번호: 20)을 포함하는 CDRH3.
다른 양상에서, 본 발명은 다음의 6개 CDR을 포함하는 단리된 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 특징으로 한다: (i) KASQSVINDAA의 아미노산 서열 (서열 번호: 9)을 포함하는 CDRL1; (ii) YTSHRYT의 아미노산 서열 (서열 번호: 10)을 포함하는 CDRL2; (iii) QQDYTPFPLTF의 아미노산 서열 (서열 번호: 12)을 포함하는 CDRL3; (iv) DYLMH의 아미노산 서열 (서열 번호: 16)을 포함하는 CDRH1; (v) AVIVSITGRTYYADDFK의 아미노산 서열 (서열 번호: 19)을 포함하는 CDRH2; 그리고 (vi) GGIFYGMDY의 아미노산 서열 (서열 번호: 20)을 포함하는 CDRH3.
다른 양상에서, 본 발명은 다음의 6개 CDR을 포함하는 단리된 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 특징으로 한다: (i) KASQSVINDAA의 아미노산 서열 (서열 번호: 9)을 포함하는 CDRL1; (ii) YTSHRYT의 아미노산 서열 (서열 번호: 10)을 포함하는 CDRL2; (iii) QQDYTSPWTF의 아미노산 서열 (서열 번호: 11)을 포함하는 CDRL3; (iv) DYSMH의 아미노산 서열 (서열 번호: 13)을 포함하는 CDRH1; (v) GVIFQSGATYYADDFK의 아미노산 서열 (서열 번호: 22)을 포함하는 CDRH2; 그리고 (vi) GGIFYGMDY의 아미노산 서열 (서열 번호: 20)을 포함하는 CDRH3.
다른 양상에서, 본 발명은 다음의 6개 CDR을 포함하는 단리된 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 특징으로 한다: (i) KASQSVINDAA의 아미노산 서열 (서열 번호: 9)을 포함하는 CDRL1; (ii) YTSHRYT의 아미노산 서열 (서열 번호: 10)을 포함하는 CDRL2; (iii) QQDYTSPWTF의 아미노산 서열 (서열 번호: 11)을 포함하는 CDRL3; (iv) DYSMH의 아미노산 서열 (서열 번호: 13)을 포함하는 CDRH1; (v) GIIFYTGHTYYADDFK의 아미노산 서열 (서열 번호: 23)을 포함하는 CDRH2; 그리고 (vi) GGIFYGMDY의 아미노산 서열 (서열 번호: 20)을 포함하는 CDRH3.
다른 양상에서, 본 발명은 다음의 6개 CDR을 포함하는 단리된 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 특징으로 한다: (i) KASQSVINDAA의 아미노산 서열 (서열 번호: 9)을 포함하는 CDRL1; (ii) YTSHRYT의 아미노산 서열 (서열 번호: 10)을 포함하는 CDRL2; (iii) QQDYX1X2PWTF의 아미노산 서열 (서열 번호: 24)을 포함하는 CDRL3, 여기서 X1은 Thr, Ile, Leu, 또는 Lys이고, 그리고 X2는 Ser 또는 His이고; (iv) DYFIH의 아미노산 서열 (서열 번호: 15)을 포함하는 CDRH1; (v) X1GIVYDATGFTX2YA X3X4FK의 아미노산 서열 (서열 번호: 25)을 포함하는 CDRH2, 여기서 X1은 Ala 또는 Gly이고, X2는 Thr, Ile, Val, 또는 Ala이고, X3은 Asp, Val, 또는 Glu이고, 그리고 X4는 Asp, Glu, Asn, Ser, Ile, Leu, Thr, Ala, 또는 Phe이고; 그리고 (vi) GGIFYGMDY의 아미노산 서열 (서열 번호: 20)을 포함하는 CDRH3. 일부 구체예에서, 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 6개 CDR을 포함한다: (i) KASQSVINDAA의 아미노산 서열 (서열 번호: 9)을 포함하는 CDRL1; (ii) YTSHRYT의 아미노산 서열 (서열 번호: 10)을 포함하는 CDRL2; (iii) QQDYTHPWTF의 아미노산 서열 (서열 번호: 27)을 포함하는 CDRL3; (iv) DYFIH의 아미노산 서열 (서열 번호: 15)을 포함하는 CDRH1; (v) GGIVYDATGFTTYAEEFK의 아미노산 서열 (서열 번호: 28)을 포함하는 CDRH2; 그리고 (vi) GGIFYGMDY의 아미노산 서열 (서열 번호: 20)을 포함하는 CDRH3. 일부 구체예에서, 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 6개 CDR을 포함한다: (i) KASQSVINDAA의 아미노산 서열 (서열 번호: 9)을 포함하는 CDRL1; (ii) YTSHRYT의 아미노산 서열 (서열 번호: 10)을 포함하는 CDRL2; (iii) QQDYKHPWTF의 아미노산 서열 (서열 번호: 31)을 포함하는 CDRL3; (iv) DYFIH의 아미노산 서열 (서열 번호: 15)을 포함하는 CDRH1; (v) AGIVYDATGFTVYADDFK의 아미노산 서열 (서열 번호: 32)을 포함하는 CDRH2; 그리고 (vi) GGIFYGMDY의 아미노산 서열 (서열 번호: 20)을 포함하는 CDRH3. 일부 구체예에서, 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 GRX1TITX2DX3STSTX4의 아미노산 서열 (서열 번호: 26)을 포함하는 프레임워크 영역 3 (FR3)을 더욱 포함하고, 여기서 X1은 Val 또는 Phe이고, X2는 Arg 또는 Ile이고, X3은 Thr, Phe, Met, 또는 Pro이고, 그리고 X4는 Ala 또는 Val이다.
다른 양상에서, 본 발명은 서열 번호: 1, 5, 29, 또는 33의 아미노산 서열에서 선택되는 경쇄 가변 영역, 그리고 서열 번호: 2, 3, 4, 6, 7, 8, 30, 또는 34에서 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 500 nM 또는 그 이하의 Kd로 IL4 및 약 900 nM 또는 그 이하의 Kd로 IL5에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 100 nM 또는 그 이하의 Kd로 IL4 및 약 100 nM 또는 그 이하의 Kd로 IL5에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 10 nM 또는 그 이하의 Kd로 IL4 및 약 50 nM 또는 그 이하의 Kd로 IL5에 결합한다. 다른 구체예에서, 단리된 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 500 nM 또는 그 이하의 Kd로 IL4 및 약 900 nM 또는 그 이하의 Kd로 IL13에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 100 nM 또는 그 이하의 Kd로 IL4 및 약 100 nM 또는 그 이하의 Kd로 IL13에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 수용체에 IL4, IL5 또는 IL13의 결합을 저해하거나 또는 차단한다. 일부 구체예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 IgG 항체이다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편 또는 단일 사슬 가변 단편 (scFv)이다. 일부 구체예에서, 프레임워크 서열의 최소한 일부는 인간 공통 프레임워크 서열이다. 일부 구체예에서, 항체는 키메라, 인간화, 또는 완전한 인간 항체이다.
선행하는 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편 중에서 임의의 한 가지를 포함하는 제약학적 조성물 역시 제공된다. 다른 양상에서, 본 발명은 항체를 발현하기 위한 벡터 (가령, 발현 벡터)를 포함하는, 본원에서 개시된 이중 특이적 항체 중에서 한 가지를 인코딩하는 단리된 핵산을 특징으로 한다.
다른 양상에서, 본 발명은 선행하는 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 포유류 세포 (가령, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포)이다. 다른 구체예에서, 숙주 세포는 원핵 세포 (가령, 대장균 (E. coli) 세포)이다. 선행하는 이중 특이적 항체 중에서 임의의 한 가지를 생산하는 방법 역시 제공되는데, 상기 방법은 이중 특이적 항체를 생산하는 숙주 세포를 배양하고, 그리고 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 이중 특이적 항체를 회수하는 것을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 개체에서 천식을 치료하는 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 본원에서 개시된 이중 특이적 항체 중에서 한 가지를 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 투여는 개체에서 천식을 치료하거나 또는 예방하는데 충분한 시간과 양으로 수행된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 IgE 길항제, 항히스타민제, 테오필린, 살부타몰, 베클로메타손 디프로피오네이트, 나트륨 크로모글리케이트, 스테로이드, 그리고 항염증제로 구성된 군에서 선택되는 최소한 하나의 추가 천식 치료제를 투여하는 것을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 천식은 알레르기 천식이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 개체에서 증식성 장애를 치료하는 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 본원에서 개시된 이중 특이적 항체 중에서 한 가지를 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 투여는 개체에서 증식성 장애를 치료하는데 충분한 시간과 양으로 수행된다. 일부 구체예에서, 증식성 장애는 암이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 화학요법 작용제, 세포독성 작용제, 그리고 항신생혈관제로 구성된 군에서 선택되는 추가 항증식성 작용제를 개체에 투여하는 것을 더욱 포함한다.
도면의 간단한 설명
도면 1a와 1b는 hu19C11 항체 CDR의 돌연변이유발 지도화를 보여주는 그래프이다. hu19C11 Fab 변이체의 상대적 항원 결합 친화성을 계측하기 위해, ELISA 웰 상에 코팅된 항-gD 항체 (A) 또는 IL4 (B)에 계열 희석된 파지 전시 항-IL4 hu19C11 야생형 (wt) 또는 LC CDR 알라닌 돌연변이체의 결합이 각각, Fab 발현 및 항원 결합을 정량하는 항-M13 파지 양고추냉이 과산화효소 (HRP) 접합체에 의해 검출되었다. gD는 경쇄의 C 말단에 융합된 발현 펩티드 태그이다. 항-gD 항체는 ELISA 웰 상에 직접적으로 코팅되고, 반면 IL4는 ELISA 웰 상에 코팅된 비-차단 항-IL4 항체로 포획되었다.
도면 1c는 CDR의 개별 부위에서 알라닌 돌연변이의 효과가 도면 1a와 1b에서처럼 검정을 수행함으로써 파지 전시 Fab 변이체의 상대적 IL4 결합 친화성을 비교함에 의해 조사되었다는 것을 보여주는 그래프이다. 아미노산의 1 문자 코드가 이용된다. 상대적 IL4-결합 강도는 데이터를 선형 회귀 모형으로 적합시키고, 그리고 이후, IL4 결합의 기울기 (파지 농도와 대비하여)를 Fab 발현의 기울기로 나눔으로써 결정되었다. 낮은 값 (점선 아래)은 hu1911 wt에 비하여 낮은 IL4 결합 친화성인 것으로 간주되고 교란적 돌연변이를 지시하였다.
도면 2a는 트라스투주맙 Fab (PDB: 1FDV)의 구조의 평면도 위에 지도화된 hu19C11의 IL4 결합의 결정적인 잔기를 보여주는 구조적 다이어그램이다. hu19C11의 구조적 모형은 POB 진입 3SQO와 3BEI를 각각, 중쇄와 경쇄에 대한 주형으로서 이용한 MOE를 이용하여 산출되었다. IL4 결합에 중요한 잔기는 LC 잔기 31, 32, 50, 53, 91, 92, 그리고 HC 잔기 31, 32, 96, 98과 99 (Kabat 넘버링에서)이다. 이들 잔기는 항원 결합 부위의 평면도 내에 모형 구조 상에 적색으로 착색된다. 파지 상에 전시된 hu19C11 Fab 변이체의 라이브러리는 부위 지향된 돌연변이에 의해 산출되었다. 야생형 잔기에 대한 선호를 갖는 20개 아미노산 모두가 허용된 HC 잔기는 굵게 표지화되고, 반면 다른 표지화된 HC와 LC 잔기는 자연 다양성을 모의하기 위해 제한된 돌연변이가 허용되었다.
도면 2b는 hu19C11에 이차 항원 특이성을 동원하기 위한 조합 라이브러리의 설계를 보여주는 표이다. 부모 hu19C11 야생형으로부터 돌연변이를 갖는 항-IL5 특정한 (5A), 항-IL4/5 특정한 (E7, B1), 그리고 항-IL4/13 특정한 (F1, F2) 항체 클론을 비롯한 선별된 클론의 CDR 서열이 도시된다. 라이브러리에서 무작위화된 잔기 및 단리된 클론에서 돌연변이는 그들의 성질에 따라 음영된다: 방향족 측쇄를 갖는 Y, W, F; 소수성 L, I, V, A, M; 염기성 K, R, H; 산성 D, E; 극성 S, T, N, Q; 그리고 P, G. 파지 경쟁 검정의 IC50에 의해 계측될 때 상대적 항원 결합 친화성이 도시된다. Fab 전시 파지는 먼저, 용해 상태에서 2 시간 동안 개별 항원의 연속 희석액과 함께 배양되고, 결합되지 않은 파지는 이후, 항원 코팅된 ELISA 웰에 의해 짧게 포획되고 항-M13 HRP 접합체로 검출되었다. 항원 코팅된 웰에 파지 결합의 50%를 저해하는 항원의 농도는 IC50으로서 계산된다. NB는 이들 항원 코팅된 웰에 직접적으로 파지 클론의 검출가능한 결합 없음을 표시한다.
도면 3은 IL4 결합 능력에 대한 10가지 산출된 파지 전시 라이브러리 (2144-1 내지 2144-10)의 적정을 보여주는 그래프이다.
도면 4a는 hu19C11의 이중 특이적 항-IL4/IL5 변이체 (E7 (서열 번호: 1)과 B1 (서열 번호: 5))뿐만 아니라 항-IL4 특정한 hu19C11 (서열 번호: 1)에 대항하여 정렬된 항-IL5 특정한 5A (서열 번호: 1)의 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 정렬을 보여준다.
도면 4b는 hu19C11의 이중 특이적 항-IL4/IL5 변이체 (E7 (서열 번호: 4)과 B1 (서열 번호: 6))뿐만 아니라 항-IL4 특정한 hu19C11 (서열 번호: 2)에 대항하여 정렬된 항-IL5 특정한 5A (서열 번호: 3)의 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 정렬을 보여준다.
도면 4c는 항-IL4 특정한 hu19C11 (서열 번호: 2)에 대항하여 정렬된, hu19C11의 이중 특이적 항-IL4/IL13 변이체 (F1 (서열 번호: 7)과 F2 (서열 번호: 8))의 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 정렬을 보여준다.
도면 5는 IgG로서 hu19C11의 선별된 변이체의 이중 특이성을 보여주는 그래프이다. hu19C11의 선별된 변이체의 항원 결합 특이성은 항-Fc 항체 HRP 접합체에 의한 검출로, ELISA 웰 상에 코팅된 표적 항원(들) 또는 여러 무관한 단백질에 250 nM에서 인간 IgG1 형식에서 이들 변이체의 결합으로서 사정되었다.
도면 6은 IL5와 이의 수용체의 상호작용을 차단하는데 있어서 지정된 항체 농도에서 hu19C11 (항-IL4 특정한 야생형: 19C11; 항-IL5 특정한: 5A; 그리고 항-IL4/5 특정한: E7과 B1)의 이중 특이적 변이체의 결합 특이성의 특성화를 보여주는 그래프이다. IgG로서 증가하는 농도의 인간화 19C11 또는 변이체의 존재에서 ELISA 웰 위에 고정된 IL5에 결합된 비오틴화된 IL5 수용체 α의 수준은 스트렙타비딘-HRP 접합체로 검출되었다.
도면 7a는 IL4/IL5-특이적 E7의 친화성-성숙 변이체의 아미노산 서열, 그리고 파지 경쟁 검정에 의해 계측될 때, 표적 항원에 대한 이들의 상대적 친화성을 보여주는 표이다. 친화성 향상을 위해, E7 변이체를 전시하는 파지 라이브러리가 "상동한" (굵은) 무작위화, "제한된" (이탤릭체) 무작위화 및 "온건한" (회색) 무작위화의 전략으로 돌연변이된 선별된 잔기로 작제되었는데, 이들은 각각, 자연 항체, 또는 대략 50%의 야생형 및 50%의 모든 다른 아미노산에 근거된 야생형과 상동성 아미노산, 제한된 다양성을 허용한다. CDR H2는 일차적으로, IL5를 향한 새로 동원된 결합 기능을 미묘하게 최적화하기 위한 상동성 돌연변이 하에 있었다. 다른 CDR의 경우에, 우리는 IL4 결합에 결정적이지 않은 부위를 표적으로 하였다. 선별된 클론의 서열은 E7에 대항하여 정렬되었고, 그리고 돌연변이가 도시된다. 각 클론의 상대적 친화성은 상기와 같이 파지 IC50에 의해 사정되었다.
도면 7b는 25℃에서 인간 IL5 (R&D systems) 또는 IL4로 고정된 CM5 센서 칩을 이용하여 Biacore에 의해 계측될 때, Fab로서 정제된 E7 및 이의 친화성-성숙된 변이체, 1C36과 1C60의 친화성을 보여주는 표이다.
도면 7c는 E7의 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 (서열 번호: 1)에 대항하여 정렬된, E7, 1C36 (서열 번호: 29) 및 1C60 (서열 번호: 33)의 친화성-향상된 이중 특이적 항-IL4/IL5 변이체의 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 정렬을 보여준다.
도면 7d는 E7의 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 (서열 번호: 4)에 대항하여 정렬된, E7, 1C36 (서열 번호: 30) 및 1C60 (서열 번호: 34)의 친화성-향상된 이중 특이적 항-IL4/IL5 변이체의 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 정렬을 보여준다.
도면 8a와 8b는 E7 및 E7의 친화성-성숙된 변이체 (1C36과 1C60)의 결합 특이성의 특성화를 보여주는 그래프이다. ELISA 평판 상에서 고정된 항원 및 무관한 단백질에 IgG로서 E7 및 E7의 친화성 향상된 변이체 (100 nM)의 직접적인 결합은 항-IgG-HRP (A)에 의해 검출되었다. 완충액 (PBS), 또는 50 nM의 E7, 1C36 또는 1C60의 존재에서 ELISA 웰 상에 코팅된 IL5 수용체에 비오틴화된 IL5 결합은 스트렙타비딘-HRP 접합체 (B)에 의해 검출되었다.
발명의 상세한 설명
많은 질환 경로는 하나 이상의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 또는 하나의 단백질의 작용을 통해 진전한다. 가령, 알레르기성, 염증성, 또는 자가면역 장애 (가령, 천식)은 복수 사이토킨을 종종 수반한다. 이중 특이적 항체는 하나 이상의 항원의 표적화가 요망되는 치료와 진단 적용 둘 모두에서 유용하다. 우리는 이중 특이적 항체를 산출하기 위한 신규한 방법을 발견하였다. 항체 VL이 항체-항원 상호작용에 대해 결정적인 잔기를 포함할 때, 이런 항체는 이후, 단독으로 또는 추가 VL과 프레임워크 잔기와 합동으로 VH 잔기의 변경에 의해 다양화될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 방법은 라이브러리에서 안정되게 발현될 수 있는 변이체를 산출하기 위해 항체의 VH를 다양화하는 것을 수반한다. 일반적으로, 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하지만 두 번째 에피토프에는 특이적으로 결합하지 않고, 그리고 VL의 위치 32, 50, 또는 91 (Kabat 넘버링에서)에서 발견되는 아미노산 중에서 임의의 1개, 2개, 또는 3개에서 정전 또는 소수성 잔기를 갖는 것으로 특징되는 항체는 VH 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 (가령, 용매 노출된 아미노산 잔기)에서 변경된다. VH와 VL은 이후, 발현되고, 그리고 첫 번째와 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 다양화된 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편은 이후, 발현된 VH와 VL에서 선택된다.
본 발명의 방법을 이용하여 생산된 예시적인 항체는 아래에 설명된 바와 같이, 인터류킨 4 (IL4)와 인터류킨 5 (IL5) 둘 모두에 결합하는 항체뿐만 아니라 IL4와 인터류킨 13 (IL13) 둘 모두에 결합하는 항체를 포함한다. 이들 항체는 IL4 항체의 중쇄 가변 도메인 (가령, CDR)에서 돌연변이가 추가의 관련 없는 단백질뿐만 아니라 IL4에 대한 이중 결합 능력을 부여한다는 것을 증명하고, 그리고 이중 특이성을 부여하기 위해 VH 내에 잔기를 변경하는 일반적인 전략에 대한 개념 증거를 제공한다. 본원에서 설명된 IL4/IL5와 IL4/IL13 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 이중 특이적 항체는 복수 항원, 예를 들면, 사이토킨의 다중과 비다중 경로를 동시에 표적으로 하는 잠재력을 갖는데, 이것은 이들을 사이토킨-매개된 질환 (가령, 천식)을 비롯한 다양한 질환과 장애의 치료에 유용하게 만든다.
I. 정의
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체를 특이적으로 커버하고, 여기서 VHVL 단위는 폴리에피토프 특이성을 갖는다 (즉, 한 생물학적 분자 상에서 2개의 상이한 에피토프 또는 상이한 생물학적 분자 상에서 각 에피토프에 결합할 수 있다). 이런 다중특이적 항체는 전장 항체, 2개 또는 그 이상의 VL과 VH 도메인을 갖는 항체, 항체 단편, 예를 들면, Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디와 트리아바디, 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된 항체 단편을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. "폴리에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상에서 2개 또는 그 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. "이중 특이성 (dual specificity)" 또는 "이중특이성 (bi-specificity)"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상에서 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. 하지만, 이중특이적 (bi-specific) 항체와 대조적으로, 이중 특이적 (dual-specific) 항체는 형식에서 자연 IgG 항체이고, 여기서 2개의 항원 결합 팔은 아미노산 서열에서 동일하고, 그리고 각 Fab 팔은 2개의 항원을 인식할 수 있다. 이중 특이성은 항체가 단일 Fab 또는 IgG 분자로서 2개의 상이한 항원과 높은 친화성으로 상호작용하는 것을 허용한다. 한 구체예에 따라, IgG1 형태에서 다중특이적 항체는 5μM 내지 0.001pM, 3μM 내지 0.001pM, 1μM 내지 0.001pM, 0.5μM 내지 0.001pM 또는 0.1μM 내지 0.001pM의 친화성으로 각 에피토프에 결합한다. "단일특이적"은 단지 하나만 에피토프에만 결합하는 능력을 지칭한다.
일반적으로, 항체는 염기성 4-사슬 항체 단위를 포함하는데, 이것은 2개의 동일한 가벼운 (L) 사슬 및 2개의 동일한 무거운 (H) 사슬로 구성된 헤테로사합체성 당단백질이다 (IgM 항체는 J 사슬로 불리는 추가 폴리펩티드와 함께 5개의 염기성 헤테로사합체 단위로 구성되고, 이런 이유로 10개의 항원 결합 부위를 내포하고, 반면 분비된 IgA 항체는 중합하여 J 사슬과 함께 2-5개의 염기성 4-사슬 단위를 포함하는 다가 기계조립을 형성할 수 있다). IgG의 경우에, 4-사슬 단위는 일반적으로, 약 150,000 달톤이다. 각 L 사슬은 하나의 공유 이황화 결합에 의해 H 사슬에 연결되고, 반면 2개의 H 사슬은 H 사슬 아이소타입에 따라, 하나 또는 그 이상의 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 각 H와 L 사슬은 또한, 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화 다리를 갖는다. 각 H 사슬은 N 말단에서, 가변 도메인 (VH), 그 이후에 α와 γ 사슬 각각에 대해 3개의 불변 도메인 (CH) 및 μ와 ε 아이소타입에 대해 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각 L 사슬은 N 말단에서, 가변 도메인 (VL), 그 이후에 이의 다른 단부에서 불변 도메인 (CL)을 갖는다. VL은 VH에 맞추어 정렬되고, 그리고 CL은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(CH1)에 맞추어 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에 인터페이스를 형성하는 것으로 생각된다. VH와 VL의 짝짓기는 항원 결합 부위를 함께 형성한다. 항체의 상이한 부류의 구조와 성질에 대해, 가령, Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 및 Chapter 6을 참조한다. 임의의 척추동물 종으로부터 L 사슬은 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 카파와 람다로 불리는 2가지 명확하게 상이한 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있다. 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 아이소타입에 배정될 수 있다. 5가지 부류의 면역글로불린이 있다: 각각, α, δ, γ, ε, 그리고 μ로서 지정된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG, 그리고 IgM. γ와 α 부류는 CH 서열과 기능에서 상대적으로 작은 차이에 근거하여 하위부류로 더욱 나눠진다, 가령, 인간은 다음의 하위부류를 발현하다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 그리고 IgA2.
용어 "가변적"은 가변 도메인의 일정한 분절이 항체 사이에서 서열에서 광범위하게 다르다는 사실을 지칭한다. 가변적 또는 "V" 도메인은 항원 결합을 매개하고, 그리고 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 규정한다. 하지만, 가변성은 가변 도메인의 110-아미노산 스팬에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 그 대신에, V 영역은 각각 9-12개 아미노산 길이인 "초가변 영역"으로 불리는 극도로 가변성의 더욱 짧은 영역에 의해 분리된 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 상대적으로 불변 스트레치로 구성된다. 선천적 중쇄와 경쇄의 가변 도메인은 각각, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 베타-시트 형상을 주로 채택하는 4개의 FR을 포함하고, 이들은 루프 연결을 형성하고, 그리고 일부 경우에, 베타-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬에서 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하여 결합되고, 그리고 다른 사슬로부터 초가변 영역과 함께, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)를 참조한다). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데 직접적으로 관련되지 않지만, 다양한 작동체 기능, 예를 들면, 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에서 항체의 참여를 전시한다.
본원에서 이용될 때, 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로, "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터 아미노산 잔기 (가령, VL에서 대략 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 그리고 VH에서 대략 잔기 26-35 (H1), 49-65 (H2) 및 95-102 (H3) (한 구체예에서, H1은 대략 잔기 31-35이다); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터 잔기 (가령, VL에서 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 그리고 VH에서 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 실제적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 단일클론 항체의 생산 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체를 제외하고, 개체군을 구성하는 개별 항체는 실제적으로 유사하고 동일한 에피토프(들)에 결합하고, 이런 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 이런 단일클론 항체는 전형적으로, 표적에 결합하는 가변 영역을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서 상기 항체는 복수의 항체로부터 항체의 선별을 포함하는 과정에 의해 획득되었다. 가령, 선별 과정은 복수의 클론, 예를 들면, 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 독특한 클론의 선별일 수 있다. 선별된 항체는 예로서, 표적에 대한 친화성을 향상시키고, 항체를 인간화하고, 세포 배양 동안 이의 생산을 향상시키고, 생체내에서 이의 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체를 창출하고, 기타 등등을 위해 더욱 변경될 수 있고, 그리고 변경된 가변 영역 서열을 포함하는 항체 역시 본 발명의 단일클론 항체인 것으로 이해되어야 한다. 단일클론 항체 제조물은 그들의 특이성에 더하여, 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 균질한 개체군으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 지시하고, 그리고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 가령, 본 발명에 따라서 이용되는 단일클론 항체는 하이브리도마 방법 (가령, Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981), 재조합 DNA 방법 (가령, U.S. 특허 번호 4,816,567을 참조한다), 파지 전시 기술 (가령, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J.Mol.Biol.340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); 그리고 Lee et al. J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)를 참조한다), 그리고 인간 면역글로불린 서열을 인코딩하는 인간 면역글로불린 좌위 또는 유전자 중에서 일부 또는 전부를 갖는 동물로부터 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하기 위한 기술 (가령, WO98/24893, WO/9634096, WO/9633735, 그리고 WO/91 10741, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); U.S. 특허 번호 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (이들 모두 GenPharm); 5,545,807; WO 97/17852, U.S. 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016, 그리고 Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); 그리고 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)를 참조한다)를 비롯한 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.
본원에서 단일클론 항체는 키메라, 인간화, 완전 인간, 그리고 친화성 성숙된 항체를 특정적으로 포함한다. 키메라 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 이들 서열과 상동하고, 반면 사슬(들)의 나머지 부분이 다른 종으로부터 유래되거나 또는 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 이들 서열에 상동한 항체뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 전시하기만 하면, 이런 항체의 단편이다 (U.S. 특허 번호 4,816,567; 그리고 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). 본원에서 관심되는 키메라 항체는 비인간 영장류 (가령, 긴꼬리원숭이, 유인원 등)으로부터 유래된 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다.
비인간 (가령, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 내포하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터 잔기가 원하는 항체 특이성, 친화성, 그리고 능력을 갖는, 비인간 종 (공여자 항체), 예를 들면, 생쥐, 쥐, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터 잔기에 의해 대체되는 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 게다가, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 정밀화하기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 최소한 하나, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실제적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 초가변 루프의 전부 또는 실제적으로 전부가 비인간 면역글로불린의 것들에 상응하고, 그리고 FR의 전부 또는 실제적으로 전부가 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체는 임의선택적으로 또한, 전형적으로 인간 면역글로불린의 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 최소한 일부를 포함할 것이다. 추가 상세를 위해, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 그리고 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)을 참조한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 소유하고 및/또는 인간 항체를 만들기 위한 기술 중에서 한 가지를 이용하여 만들어진 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특정적으로 배제한다.
"친화성 성숙된" 항체는 변경(들)을 소유하지 않는 부모 항체와 비교하여, 항원에 대한 항체의 친화성에서 향상을 유발하는, 하나 또는 그 이상의 CDR에서 하나 또는 그 이상의 변경을 갖는 것이다. 바람직한 친화성 성숙된 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화성을 가질 것이다. 친화성 성숙된 항체는 당분야에서 공지된 절차에 의해 생산된다. Marks et al. Bio/Technology 10:779-83 (1992)은 VH와 VL 도메인 뒤섞음에 의한 친화성 성숙을 설명한다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-13 (1994); Schier et al. Gene 169:147-55 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-19 (1995); 그리고 Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-96 (1992)에 의해 설명된다.
"무손상" 항체는 항원 결합 부위뿐만 아니라 CL 및 최소한 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2와 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 선천적 서열 불변 도메인 (가령, 인간 선천적 서열 불변 도메인) 또는 이들의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 무손상 항체는 하나 또는 그 이상의 작동체 기능을 갖는다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 부분, 바람직하게는, 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 실례는 Fab, Fab', F(ab')2, 그리고 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (U.S. 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)를 참조한다); 단일 사슬 항체 분자; 그리고 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
표현 "선형 항체"는 일반적으로, Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)에서 설명된 항체를 지칭한다. 간단히 말하면, 이들 항체는 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께, 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 분절 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 그리고 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 명칭인 잔여 "Fc" 단편을 생산한다. Fab 단편은 H 사슬의 가변 영역 도메인 (VH), 그리고 중쇄의 첫 번째 불변 도메인 (CH1)과 함께, 전체 L 사슬로 구성된다. 항체의 펩신 처리는 이가 항원 결합 활성을 갖는 2개의 이황화 연결된 Fab 단편에 거의 상응하고 여전히 교차연결 항원일 수 있는 단일 큰 F(ab')2 단편을 산출한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 추가의 소수 잔기를 가짐으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서, 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 Fab' 단편의 쌍으로서 최초 생산되었는데, 이들은 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는다. 항체 단편의 다른 화학적 연계 역시 알려져 있다.
Fc 단편은 이황화물에 의해 묶인 양쪽 H 사슬의 카르복시 말단 부분을 포함한다. 항체의 작동체 기능은 Fc 영역 내에 서열에 의해 결정된다; 이러한 영역은 또한, 일정한 유형의 세포 상에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식되는 부분이다.
"Fv"는 단단한, 비공유 연관에서 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이합체로 구성된다. 이들 두 도메인의 접힘으로부터, 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항원 결합 특이성을 항체에 부여하는 6개의 초가변 루프 (H와 L 사슬 각각으로부터 3개의 루프)가 발산된다. 하지만, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특정한 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 비록 종종, 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만, 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.
또한 "sFv" 또는 "scFv"로서 약칭되는 "단일 사슬 Fv"는 단일 폴리펩티드 사슬 내로 연결된 VH와 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더욱 포함하는데, 이것은 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. sFv의 재고를 위해, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995를 참조한다.
용어 "디아바디"는 V 도메인의 사슬내가 아닌 사슬간 짝짓기가 달성되어 이가 단편, 다시 말하면, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 단편이 산출되도록, VH와 VL 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5-10 잔기)로 sFv 단편 (선행하는 단락 참조)을 구축함으로써 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이적 디아바디는 2개의 "교배" sFv 단편의 이형이합체인데, 여기서 이들 두 항체의 VH와 VL 도메인은 상이한 폴리펩티드 사슬 상에 존재한다. 디아바디는 예로서, EP 404,097; WO 93/11161; 그리고 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에서 더욱 충분히 설명된다.
"정전"은 전하를 갖는 것으로 의미된다. 일반적으로, 정전 아미노산은 극성 또는 하전된 측쇄를 갖는다. 극성 측쇄를 갖는 아미노산의 실례는 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 아스파라긴, 그리고 글루타민을 포함한다. 음성으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산의 실례는 아스파르트산, 그리고 글루타민산을 포함한다. 양성으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산의 실례는 리신, 아르기닌, 그리고 히스티딘을 포함한다.
"소수성"은 물과 양립하지 않거나 또는 물에 용해되지 않고, 물을 흡수하지 않고, 또는 물과 쉽게 혼합되지 않는다는 것으로 의미된다. 일반적으로, 소수성 아미노산은 비극성 측쇄를 갖고, 그리고 실례는 알라닌, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 그리고 발린을 포함한다.
용어 "사이토킨"은 세포간 매개체로서 다른 세포에 작용하는, 한 세포 개체군에 의해 방출된 단백질에 대한 일반 용어이다. 사이토킨의 실례는 림포카인, 모노카인, 그리고 전통적인 폴리펩티드 호르몬을 포함한다. 사이토킨 중에는 성장 호르몬, 예를 들면, 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 그리고 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린과 프로인슐린; 렐락신과 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들면, 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 그리고 황체형성 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α와 -β; 뮐러-저해 물질; 생쥐 성선자극호르몬-연관된 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예를 들면, NGF-β; 혈소판-성장 인자; 전환 성장 인자 (TGFs), 예를 들면, TGF-α와 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자-I과 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 뼈유도성 인자; 인터페론, 예를 들면, 인터페론-α, -β, 그리고 -γ; 집락 자극 인자 (CSFs), 예를 들면, 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 그리고 과립구-CSF (G-CSF); 인터류킨 (ILs), 예를 들면, IL1, IL1α, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL11, IL12, 그리고 IL13; 종양 괴사 인자, 예를 들면, TNF-α 또는 TNF-β; 그리고 LIF와 키트 리간드 (KL)를 비롯한 다른 폴리펩티드 인자를 포함된다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 사이토킨은 자연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양으로부터 단백질, 그리고 선천적 서열 사이토킨의 생물학적으로 활성 등가물을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "코돈 세트"는 원하는 변이체 아미노산을 인코딩하는데 이용된 한 세트의 상이한 뉴클레오티드 삼중항 서열을 지칭한다. 한 세트의 올리고뉴클레오티드는 예로서, 코돈 세트에 의해 제공된 뉴클레오티드 삼중항의 모든 가능한 조합을 나타내고, 그리고 아미노산의 원하는 군을 인코딩할 서열을 포함하는 고체상 합성에 의해 합성될 수 있다. 코돈 지정의 표준 형태는 IUB 코드의 형태인데, 이것은 당분야에서 공지되고 본원에서 설명된다. 코돈 세트는 전형적으로, 이탤릭체로 3개의 대문자, 예를 들면, NNK, NNS, XYZ, DVK, 기타 등등에 의해 표시된다 (가령, NNK 코돈은 20개 자연 아미노산 모두를 인코딩하기 위한 코돈 내에 위치 1과 2에서 N = A/T/G/C, 그리고 위치 3에서 동몰 비율에서 K = G/T를 지칭한다). 본원에서 이용된 바와 같이, "비무작위 코돈 세트"는 따라서, 본원에서 설명된 바와 같은 아미노산 선별을 위한 규준을 부분적으로, 바람직하게는 완전하게 완수하는 선별된 아미노산을 인코딩하는 코돈 세트를 지칭한다. 일정한 위치에서 선별된 뉴클레오티드 "축중성"을 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성은 당분야에서 널리 공지되어 있다, 예를 들면, TRIM 접근법 (Knappek et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 1999); Garrard and Henner, Gene 128:103, 1993). 일정한 코돈 세트를 갖는 올리고뉴클레오티드의 이런 세트는 상업적인 핵산 합성장치 (가령, Applied Biosystems, Foster City, CA로부터 가용)를 이용하여 합성될 수 있거나, 또는 상업적으로 획득될 수 있다 (가령, Life Technologies, Rockville, MD로부터). 이런 이유로, 특정 코돈 세트를 갖는 합성된 한 세트의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로, 상이한 서열을 갖는 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것인데, 이들 차이는 전반적인 서열 내에서 코돈 세트에 의해 확립된다. 본 발명에 따라 이용된 바와 같은 올리고뉴클레오티드는 가변 도메인 핵산 주형에 혼성화를 허용하는 서열을 갖고, 그리고 또한, 예로서, 클로닝 목적에 유용한 제한 효소 부위를 포함할 수 있지만 반드시 그러한 것은 아니다.
관심되는 항원에 "결합하는" 본 발명의 항체는 항체가 항원을 발현하는 단백질 또는 세포 또는 조직을 표적으로 하는데 있어서 진단적 및/또는 치료적 작용제로서 유용하고, 그리고 다른 단백질과 유의미하게 교차 반응하지 않을 만큼 충분한 친화성으로 항원에 결합하는 것이다. 이런 구체예에서, "비표적" 단백질에 항체의 결합의 정도는 형광 활성화된 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사면역침강 (RIA) 또는 ELISA에 의해 결정될 때, 특정 표적 단백질에 항체의 결합의 약 10%보다 적을 것이다. 표적 분자에 항체의 결합에 대하여, 특정 폴리펩티드 표적 상에서 특정 폴리펩티드 또는 에피토프에 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적이다"는 비특이적 상호작용과 계측가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은 예로서, 대조 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 계측될 수 있다. 가령, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조 분자, 예를 들면, 과잉의 비표지화된 표적과의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이러한 경우에, 특이적 결합은 프로브에 표지화된 표적의 결합이 과잉의 표지되지 않은 표적에 의해 경쟁적으로 저해되면 표시된다. 본원에서 이용된 바와 같이 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상에서 에피토프에 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적이다"는 예로서, 10-4 M 또는 그 이하, 대안으로 10-5 M 또는 그 이하, 대안으로 10-6 M 또는 그 이하, 대안으로 10-7 M 또는 그 이하, 대안으로 10-8 M 또는 그 이하, 대안으로 10-9 M 또는 그 이하, 대안으로 10-10 M 또는 그 이하, 대안으로 10-11 M 또는 그 이하, 대안으로 10-12 M 또는 그 이하의 표적에 대한 KD 또는 10-4 M 내지 10-12 M 또는 10-6 M 내지 10-10 M 또는 10-7 M 내지 10-9 M의 범위에서 KD를 갖는 분자에 의해 전시될 수 있다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 친화성 및 KD 값은 역으로 관련된다. 항원에 대한 높은 친화성은 낮은 KD 값에 의해 계측된다. 한 구체예에서, 용어 "특이적 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실제적으로 결합하지 않으면서, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상에서 에피토프에 결합하는 결합을 지칭한다.
본 발명의 폴리펩티드에 대하여 "생물학적으로 활성적" 및 "생물학적 활성" 및 "생물학적 특성"은 달리 특정되는 경우를 제외하고, 생물학적 분자에 결합하는 능력을 갖는다는 것을 의미한다.
"생물학적 분자"는 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 그리고 이들의 조합을 지칭한다. 한 구체예에서, 생물학적 분자는 자연에서 존재한다.
본원에서 개시된 다양한 항체를 설명하는데 이용될 때, "단리된"은 항체가 자신이 발현되었던 세포 또는 세포 배양액으로부터 확인되고 분리되고 및/또는 회수되었다는 것을 의미한다. 자연 환경의 오염체 성분은 상기 폴리펩티드에 대한 진단적 또는 치료적 이용을 전형적으로 간섭하는 물질이고, 그리고 효소, 호르몬, 그리고 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항체는 (1) 회전 컵 배열결정장치의 이용에 의해 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 최소한 15개 잔기를 획득하는데 충분한 정도까지, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는, 은 염색을 이용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질성까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내에서 원지에서 항체를 포함하는데, 그 이유는 폴리펩티드 자연 환경의 최소한 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 통상적으로, 하지만, 단리된 폴리펩티드는 최소한 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
용어 "제어 서열"은 특정 숙주 생명체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 위해 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은 예로서, 프로모터, 임의선택적으로 오퍼레이터 서열, 그리고 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 그리고 인핸서를 활용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에서 배치될 때 "작동가능하게 연결된다". 가령, 프리서열 또는 분비성 리더에 대한 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현되면, 이것은 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된다; 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 주면, 이것은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다; 또는 리보솜 결합 부위가 번역을 용이하게 하기 위해 배치되면, 이것은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 그리고, 분비성 리더의 경우에, 인접하고 판독 시기에 있다는 것을 의미한다. 하지만, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편의한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 만약 이런 부위가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 전통적인 관례에 따라서 이용된다.
본원에서 확인된 폴리펩티드 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 최고 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하면, 갭을 도입한 후에, 그리고 임의의 보존성 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 비교되는 폴리펩티드 내에 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내에 아미노산 잔기의 백분율로서 규정된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당분야의 기술 범위 안에 있는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 정렬을 계측하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 하지만, 본원에서 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 산출된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 저술되었고, 그리고 공급원 코드가 사용자 문서로 U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559에 제출되었는데, 여기서 이것은 U.S. Copyright 등록 번호 TXU510087 하에 등록된다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc., South San Francisco, California를 통해 공개적으로 가용하다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체계, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D에서 이용을 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 세팅되고 변하지 않는다.
본원에서 설명된 아미노산 서열은 달리 명시되지 않으면, 인접한 아미노산 서열이다.
본 발명에 따른 "구조적으로 유사하지 않은" 생물학적 분자는 동일한 부류 (단백질, 핵산, 지질, 탄수화물 등)에 있지 않거나 또는 예로서, 단백질을 지칭할 때, 서로 비교하여 60%보다 적은 아미노산 동일성, 50%보다 적은 아미노산 동일성, 40%보다 적은 아미노산 동일성, 30%보다 적은 아미노산 동일성, 20%보다 적은 아미노산 동일성 또는 10%보다 적은 아미노산 동일성을 갖는 생물학적 분자를 지칭한다.
혼성화 반응의 "엄격함"은 당업자에 의해 쉽게 결정가능하고, 그리고 일반적으로, 프로브 길이, 세척 온도, 그리고 염 농도에 의존하는 경험적 계산이다. 일반적으로, 더욱 긴 프로브는 적절한 어닐링을 위해 더욱 높은 온도를 필요로 하고, 반면 더욱 짧은 프로브는 더욱 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로, 상보성 가닥이 그들의 융해 온도 아래의 환경에서 존재할 때, 변성된 DNA의 재어닐링하는 능력에 의존한다. 프로브 및 혼성화가능한 서열 사이에 원하는 상동성의 정도가 더욱 높을수록, 이용될 수 있는 상대적 온도가 더욱 높다. 결과적으로, 더욱 높은 상대적 온도는 반응 조건을 더욱 엄격하게 만드는 경향이 있을 것이고, 반면 더욱 낮은 온도는 덜 엄격하게 할 것이다. 혼성화 반응의 엄격함의 추가 상세와 설명을 위해, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)을 참조한다.
본원에서 규정된 바와 같이, "엄격한 조건" 또는 "높은 엄격함 조건"은 다음의 것들에 의해 확인될 수 있다: (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도와 높은 온도, 예를 들면, 50C에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 구연산나트륨/0.1% 황산도데실나트륨을 이용하고; (2) 42℃에서 혼성화 동안 변성제, 예를 들면, 포름아미드, 예를 들면, 750 mM 염화나트륨, 75 mM 구연산나트륨으로 pH 6.5에서 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50mM 인산나트륨 완충액과 함께 50% (v/v) 포름아미드를 이용하고; 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 구연산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 나트륨 피로인산염, 5 x 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 μg/ml), 0.1% SDS, 그리고 10% 덱스트란 황산염을 이용하는 용액에서 하룻밤 동안 혼성화, 42℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/구연산나트륨)에서 10 분 세척, 그 이후에 55℃에서 EDTA를 내포하는 0.1 x SSC로 구성되는 10 분 높은-엄격함 세척.
"중간 정도로 엄격한 조건"은 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989에 의해 설명된 바와 같이 확인될 수 있고, 그리고 앞서 설명된 것들보다 덜 엄격한 세척 용액과 혼성화 조건 (가령, 온도, 이온 강도, 그리고 %SDS)의 이용을 포함한다. 중간 정도로 엄격한 조건의 실례는 37℃에서 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 트리소듐 구연산염), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 황산염, 그리고 20 mg/ml 변성된 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서 하룻밤 동안 배양, 그 이후에 약 37-50℃에서 1 x SSC에서 필터 세척이다. 당업자는 인자, 예를 들면, 프로브 길이 등을 수용하기 위해 필요에 따라, 온도, 이온 강도 등을 어떻게 조정할 지를 인식할 것이다.
항체 "작동체 기능"은 항체의 Fc 영역 (선천적 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인한 생물학적 활성을 지칭하고, 그리고 항체 아이소타입에 따라 변한다. 항체 작동체 기능의 실례는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (가령, B 세포 수용체)의 하향조절; 그리고 B 세포 활성화.
"항체 의존성 세포 매개된 세포독성" 또는 "ADCC"는 일정한 세포독성 세포 (가령, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 그리고 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcRs) 위에 결합된 분비된 Ig가 이들 세포독성 작동체 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고, 그리고 차후에, 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성의 한 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포를 "무장시키고", 그리고 이런 사멸을 위해 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포, NK 세포는 단지 FcγRIII만을 발현하고, 반면 단핵구는 FcγRI, FcγRII, 그리고 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)의 464 페이지 상에 표 3에서 요약된다. 관심되는 분자의 ADCC 활성을 사정하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예를 들면, US 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에서 설명된 것이 수행될 수 있다. 이런 검정을 위한 유용한 작동체 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안으로, 또는 부가적으로, 관심되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 동물 모형, 예를 들면, Clynes 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 95:652-656 (1998)에서 개시된 것에서 사정될 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명한다. 바람직한 FcR은 선천적 서열 인간 FcR이다. 게다가, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하고, 그리고 FcγRI, FcγRII, 그리고 FcγRIII 하위부류의 수용체뿐만 아니라 이들 수용체의 대립형질 변이체와 대안으로 스플라이싱된 형태를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("저해 수용체")를 포함하는데, 이들은 주로 세포질 도메인에서 다른 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기초된 활성화 모티프 (ITAM)를 내포한다. 저해 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기초된 저해 모티프 (ITIM)를 내포한다 (재고를 위해 M. in Daron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)를 참조한다). FcR은 Ravetch and Kinet, (Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)); Capel et al., (Immunomethods 4:25-34 (1994)); 그리고 de Haas et al., (J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995))에서 재고된다. 장래에 확인될 것들을 비롯한 다른 FcR은 본원에서 용어 "FcR"에 의해 포괄된다. 상기 용어는 또한, 신생아 수용체, FcRn을 포함하는데, 이것은 모성 IgG의 태아로의 전달을 책임진다 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
"인간 작동체 세포"는 하나 또는 그 이상의 FcR을 발현하고 작동체 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이들 세포는 최소한 FcγRIII을 발현하고 ADCC 작동체 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 실례는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포, 그리고 호중구를 포함한다; PBMC와 NK 세포가 바람직하다. 이들 작동체 세포는 선천적 공급원으로부터, 예를 들면, 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재에서 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적 보체 경로의 활성화는 동계 항원에 결합되는 항체 (적절한 하위부류의)에 보체계 (C1q)의 첫 번째 성분의 결합에 의해 시작된다. 보체 활성화를 사정하기 위해, 예로서 Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)에서 설명된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다.
용어 "치료 효과량"은 개체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 항체 또는 항체 단편의 양을 지칭한다. 알레르기성, 염증성, 또는 자가면역 질환 (가령, 천식, 관절염 등)의 경우에, 항체 또는 항체 단편 (가령, IL4 및 IL5 또는 IL4 및 IL13에 대한 이중 특이적 또는 다중특이적 항체 또는 항체 단편)의 치료 효과량은 질환을 개선하거나 또는 치료하고, 또는 상기 질환과 연관된 증상을 예방하거나, 감소시키거나, 개선하거나 또는 치료할 수 있다. 증식성 질환 (가령, 암성 종양)의 경우에, 항체 또는 항체 단편의 치료 효과량은 암 세포의 숫자를 감소시키고; 원발성 종양 크기를 감소시키고; 말초 장기 내로 암 세포 침윤을 저해하고 (즉, 얼마간 늦추고, 바람직하게는 중단시키고); 종양 전이를 저해하고 (즉, 얼마간 늦추고, 바람직하게는 중단시키고); 종양 성장을 얼마간 저해하고; 및/또는 상기 장애와 연관된 증상 중에서 하나 또는 그 이상을 얼마간 완화시킬 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 암 세포의 성장을 예방하고 및/또는 현존하는 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지, 정균성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 요법을 위해, 생체내 효력은 예로서, 생존의 지속 기간, 질환 진행까지 기간 (TTP), 질환 없는 생존 (DFS)의 지속 기간, 진행 없는 생존 (PFS)의 지속 기간, 반응률 (RR), 반응의 지속 기간, 및/또는 삶의 질을 사정함으로써 계측될 수 있다.
"감소시키거나 또는 저해한다"는 전반적인 감소, 바람직하게는 20% 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 50% 또는 그 이상, 그리고 가장 바람직하게는 75%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 이상의 감소를 유발하는 능력인 것으로 의미된다. "감소시킨다" 또는 "저해한다"는 치료되는 장애의 증상, 전이의 존재 또는 크기, 원발성 종양의 크기, 또는 혈관형성 장애에서 혈관의 크기 또는 숫자를 지칭할 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "염증성 질환"은 전형적으로 호중구 화학주성에 의해 유발되는 염증을 유발하는 병리학적 상태를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "자가면역 질환"은 개체의 자기 조직으로부터 발생하고 이들 조직에 대해 지향된 질환 또는 장애, 또는 이의 공동분리 또는 현시, 또는 이것으로부터 결과의 상태이다.
염증성, 자가면역, 또는 둘 모두인 질환 또는 장애의 실례는 천식, 예를 들면, 기관지 천식, 기관지 천식, 그리고 자가면역 천식, 관절염 (류마티스성 관절염, 예를 들면, 급성 관절염, 만성 류마티스성 관절염, 통풍성 관절염, 급성 통풍성 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 감염성 관절염, 라임 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 척추골 관절염, 그리고 소아-개시 류마티스성 관절염, 골관절염, 관절염 크로니카 프로그레디엔테, 변형성 관절염, 다발관절염 크로니카 프리마리아, 반응성 관절염, 그리고 강직성 척추염), 염증성 과증식성 피부 질환, 건선, 예를 들면, 플라크 건선, 구타테 건선, 농포성 건선, 그리고 손발톱의 건선, 접촉성 피부염, 만성 접촉성 피부염, 알레르기 피부염, 알레르기 접촉성 피부염, 포진성 피부염, 그리고 아토피성 피부염을 비롯한 피부염, x-연관된 과다 IgM 증후군, 두드러기, 예를 들면, 만성 자가면역 두드러기를 비롯하여, 만성 알레르기성 두드러기 및 만성 특발성 두드러기, 다발근육염/피부근염, 소아성 피부근염, 독성 표피 괴사용해, 경피증 (전신성 경피증 포함), 경화증, 예를 들면, 전신 경화증, 다발성 경화증 (MS), 예를 들면, 스피노 옵티컬 MS, 원발성 진행형 MS (PPMS), 그리고 재발 이완성 MS (RRMS), 진행성 전신 경화증, 죽상경화증, 동맥경화증, 파종성 경화증, 그리고 실조성 경화증, 염증성 장 질환 (IBD) (가령, 크론병, 자가면역-매개된 위장관 질환, 대장염, 예를 들면, 궤양성 대장염, 궤양 대장염, 미세 대장염, 콜라겐성 대장염, 폴리포사 대장염, 괴사성 소장결장염, 그리고 경벽 대장염, 그리고 자가면역 염증성 장 질환), 괴저성 화농피부증, 결절성 홍반, 원발성 경화 담관염, 상공막염), 성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)을 비롯한 호흡 곤란 증후군, 수막염, 포도막의 전부 또는 일부의 염증, 홍채염, 맥락막염, 그리고 자가면역 혈액학적 장애, 류마티스성 척추염, 급성 청력 상실, IgE-매개된 질환, 예를 들면, 아나필락시스 및 알레르기성과 아토피성 비염, 과다 IgE 증후군, 뇌염, 예를 들면, 라스무센 뇌염 및 변연 및/또는 뇌간 뇌염, 포도막염, 예를 들면, 전포도막염, 급성 전포도막염, 육아종 포도막염, 비육아종 포도막염, 파코항원성 포도막염, 후포도막염, 또는 자가면역 포도막염, 신증후군을 동반하거나 동반하지 않는 사구체신염 (GN), 예를 들면, 만성 또는 급성 사구체신염, 예를 들면, 원발성 GN, 면역-매개된 GN, 막성 GN (막성 신장병증), 특발성 막성 GN 또는 특발성 막성 신장병증, 유형 I과 유형 II를 비롯한 막- 또는 막성 증식성 GN (MPGN), 그리고 급속 진행성 GN, 알레르기성 질환, 알레르기 반응, 알레르기성 또는 아토피성 습진을 비롯한 습진, 경피증, 휘플씨병, 비후 흉터형성, 전자간증, 복부 접착, T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 질환, 만성 폐 염증성 질환, 자가면역 심근염, 백혈구 부착 결핍, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) 또는 전신성 홍반성 루푸스, 예를 들면, 피부 SLE, 아급성 피부 홍반성 루푸스, 신생아 루푸스 증후군 (NLE), 파종상 홍반성 루푸스, 루푸스 (신장염, 뇌염, 소아, 비-신장, 신장외, 원판양, 탈모증 포함), 소아성 인슐린 의존성 진성 당뇨병 (IDDM)을 비롯한 소아 개시 (I형) 진성 당뇨병, 성인 개시 진성 당뇨병 (II형 당뇨병), 자가면역 당뇨병, 특발성 요붕증, 사이토킨과 T-림프구에 의해 매개된 급성과 지연된 과민성과 연관된 면역 반응, 결핵, 사르코이드증, 림프종모양 육아종증, 베게너 육아종증을 비롯한 육아종증, 무과립구증, 맥관염 (큰 맥관 맥관염 (류마티스성 다발근육통증 및 거대 세포 (타까야수) 동맥염 포함), 중간 혈관 맥관염 (가와사키병 및 결절성 다발동맥염 포함), 미세 다발동맥염, CNS 맥관염, 괴사성, 피부, 또는 과민성 맥관염, 전신 괴사성 맥관염, 그리고 ANCA-연관된 맥관염, 예를 들면, 척 스트라우스 맥관염 또는 증후군 (CSS))을 비롯한 맥관염, 측두 동맥염, 재생불량성 빈혈, 자가면역 재생불량성 빈혈, 쿰스 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙판 빈혈, 용혈성 빈혈 또는 자가면역 용혈성 빈혈 (AIHA)을 비롯한 면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈 (악성 빈혈), 애디슨병, 순수 적혈구 빈혈 또는 형성부전증 (PRCA), 인자 VIII 결핍, A형 혈우병, 자가면역 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 누출을 수반하는 질환, CNS 염증성 장애, 복수 장기 손상 증후군, 예를 들면, 패혈증, 외상 또는 출혈에 이차적인 것들, 항원 항체 복합체- 매개된 질환, 항사구체 기저막 질환, 항인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베흐체트병, 캐슬만 증후군, 굿파스처 증후군, 레이노이드 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스 존슨 증후군, 유천포창, 예를 들면, 수포성 유천포창 및 피부 유천포창, 천포창 (심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 천포창 점액-막 유천포창, 그리고 홍반성 천포창 포함), 자가면역 다발성 내분비병증, 라이터병 또는 라이터 증후군, 면역복합체 신장염, 항체-매개된 신장염, 시신경척수염, 다발신경병증, 만성 신경병증, 예를 들면, IgM 다발신경병증 또는 IgM-매개된 신경병증, 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP) 및 자가면역 또는 면역-매개된 혈소판감소증, 예를 들면, 만성 또는 급성 ITP를 포함하는 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP)을 비롯한 혈소판감소증 (가령, 심근 경색 환자에 의해 발달됨), 자가면역 고환염과 난소염을 비롯한 고환과 난소의 자가면역 질환, 원발성 갑상선기능저하증, 부갑상선저하증, 갑상선염, 예를 들면, 자가면역 갑상선염, 하시모토병, 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염), 또는 아급성 갑상선염을 비롯한 자가면역 내분비 질환, 자가면역 갑상선 질환, 특발성 갑상선기능저하증, 그레이브스병, 다선성 증후군, 예를 들면, 자가면역 다선성 증후군 (또는 다선성 내분비병증 증후군), 신경학적 부종양성 증후군, 예를 들면, 람베르트 이튼 근무력 증후군 또는 이튼 람베르트 증후군을 비롯한 부종양성 증후군, 강직 인간 증후군, 뇌척수염, 예를 들면, 알레르기성 뇌척수염 또는 알레르기성 뇌척수염 및 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE), 중증 근무력증, 예를 들면, 흉선종-연관된 중증 근무력증, 소뇌 변성, 신경근긴장증, 눈클로누스 또는 눈클로누스 간대성근경련 증후군 (OMS), 그리고 감각 신경병증, 다초점성 운동 신경병증, 시한 증후군, 자가면역 간염, 만성 간염, 루포이드 간염, 거대 세포 간염, 만성 활성 간염 또는 자가면역 만성 활성 간염, 림프구양 간질성 폐렴, 폐색성 세기관지염 (비-이식조직) 대 NSIP, 길랭 바레 증후군, 베르게르병 (IgA 신장병증), 특발성 IgA 신장병증, 선형 IgA 피부병, 원발성 담즙성 간경변, 폐경변, 자가면역 장병증 증후군, 소아 지방변증, 복강 스프루 (글루텐 장병증), 난치성 스프루, 특발성 스프루, 한랭글로불린혈증, 근위축성 축삭 경화증 (ALS; 루게릭병), 관상 동맥 질환, 자가면역 귀 질환, 예를 들면, 자가면역 내이 질환 (AIED), 자가면역 청력 상실, 눈클로누스 간대성근경련 증후군 (OMS), 다발연골염, 예를 들면, 난치성 또는 재발된 다발연골염, 폐포 단백증, 아밀로이드증, 공막염, 비암성 림프구증가증, 원발성 림프구증가증 (이것은 단일클론 B 세포 림프구증가증 (가령, 양성 단일클론 감마글로불린병증 및 미결정 유의성의 단일클론 감마글로불린병증, MGUS를 포함한다), 말초 신경병증, 부종양성 증후군, 채널 병리, 예를 들면, 간질, 편두통, 부정맥, 근육 장애, 귀머거리, 시각상실, 주기 마비, 그리고 CNS의 채널 병리, 자폐증, 염증성 근병증, 국소 분절 사구체경화증 (FSGS), 내분비 눈병증, 포도망막염, 맥락망막염, 자가면역 간장 질환, 섬유근통, 복수 내분비 부전, 슈미트 증후군, 부신염, 위 위축, 노년전 치매, 탈수초성 질환, 예를 들면, 자가면역 탈수초성 질환, 당뇨병성 신장병증, 드레슬러 증후군, 원형탈모증, 크레스트 증후군 (석회증, 레이노 현상, 식도 운동성 장애, 가락피부경화증, 그리고 모세관확장증), 남성과 여성 자가면역 불임, 혼합 결합 조직병, 샤가스병, 류마티스열, 재발성 유산, 농부 폐, 다형 홍반, 심장절개후 증후군, 쿠싱 증후군, 새 사육자 폐, 알레르기성 육아종 맥관염, 양성 림프구성 맥관염, 알포트 증후군, 폐포염, 예를 들면, 알레르기성 폐포염 및 섬유성 폐포염, 사이질 폐질환, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 리슈만편모충증, 키파노소미아시스, 주혈흡충증, 회충증, 아스페르길루스증, 샘터 증후군, 카플란 증후군, 뎅기, 심내막염, 심내막심근 섬유증, 미만성 간질성 폐섬유증, 간질성 폐 섬유증, 특발성 폐섬유증, 낭포성 섬유증, 안구내염, 지구성 융기성 홍반, 태아 적혈모구증, 호산성 근막염, 슐만 증후군, 펠티 증후군, 필라리아증, 모양체염, 예를 들면, 만성 모양체염, 이시성 모양체염, 홍채모양체염, 또는 푸치 모양체염, 헤노흐 쇤라인 자반병, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염, 에코바이러스 감염, 심근병증, 알츠하이머병, 파보바이러스 감염, 풍진 바이러스 감염, 예방접종후 증후군, 선천성 풍진 감염, 엡스타인 바르 바이러스 감염, 유행성 이하선염, 이반 증후군, 자가면역 생식선 부전, 시덴함 무도병, 연쇄상구균 감염후 신장염, 폐색성 혈전혈관염, 갑상선중독증, 척수 매독, 맥락막염, 거대 세포 다발근육통증, 내분비 오프타모증, 만성 과민성 폐렴, 건성 각결막염, 유행성 각결막염, 특발성 신장염 증후군, 최소 변화 신병증, 양성 가족성과 허혈-재관류 손상, 망막 자가면역, 관절 염증, 기관지염, 만성 폐쇄성 기도 질환, 규폐증, 아프타, 아프타성 구내염, 동맥경화성 장애, 아스퍼미오진, 자가면역 용혈, 베크병, 한랭글로불린혈증, 뒤퓌트랑 구축, 엔도프탈미아 파코아날피라티카, 알레르기성 장염, 나병 결절성 홍반, 특발성 얼굴 마비, 만성 피로 증후군, 루마티카열, 하만 리치 질환, 감각신경 청력 상실, 해모글로비누리아 파록시마티카, 생식샘저하증, 국한성 회장염, 백혈구 감소증, 전염성 단핵구증, 트래버스 척수염, 원발성 특발성 점액부종, 신장증, 오프탈미아 심파티카, 육아종성 고환염, 췌장염, 급성 다발신경근염, 괴저성 화농피부증, 퀘르바인 갑상선염, 후천성 스페닉 위축, 항정자성 항체로 인한 불임, 비악성 흉선종, 백반증, SCID 및 엡스타인 바르 바이러스-연관된 질환, 후전성 면역결핍 증후군 (AIDS), 기생충 질환, 예를 들면, 리슈만편모충증, 독성-쇼크 증후군, 식중독, T 세포의 침윤을 수반하는 질환, 백혈구-부착 결핍, 사이토킨과 T-림프구에 의해 매개된 급성과 지연된 과민성과 연관된 면역 반응, 백혈구 누출을 수반하는 질환, 복수 장기 손상 증후군, 항원 항체 복합체-매개된 질환, 항사구체 기저막 질환, 알레르기성 신경염, 자가면역 다발성 내분비병증, 난소염, 원발성 점액부종, 자가면역 위축성 위염, 교감성 안염, 류마티스성 질환, 혼합 결합 조직병, 신증후군, 췌도염, 다내분비선 부전, 말초 신경병증, 자가면역 다선성 증후군 유형 I, 성인-개시 특발성 부갑상선저하증 (AOIH), 전두 탈모증, 확장 심근병증, 후전성 수포성 표피박리증 (EBA), 혈색소증, 심근염, 신증후군, 원발성 경화 담관염, 화농성 또는 비화농성 부비강염, 급성 또는 만성 부비강염, 사골, 전두, 상악골, 또는 접형 동염, 자가면역 수포성 질환, 호산구-관련된 장애, 예를 들면, 호산구증가증, 특발성 과호산구 증후군, 폐침윤 호산구증가증, 호산구증가-근육통증 증후군, 뢰플러 증후군, 만성 호산구성 폐렴, 열대 폐호산구증가증, 기관지폐렴성 아스페르길루스증, 아스페르길루스종, 또는 호산구를 내포하는 육아종, 아나필락시스, 혈청반응음성 척추관절염, 다내분비선 자가면역 질환, 경화 담관염, 공막, 상공막, 만성 점막피부 칸디다증, 브루톤 증후군, 영아기의 일시적인 저감마글로불린혈증, 비스코트 올드리치 증후군, 모세혈관확장성 운동실조증, 교원질병과 연관된 자가면역 장애, 류마티즘, 신경학적 질환, 허혈성 재관류 장애, 혈압 반응에서 감소, 혈관 기능장애, 혈관확장증, 조직 손상, 심혈관 허혈, 통각과민증, 대뇌 허혈, 그리고 혈관화를 동반하는 질환, 알레르기성 과민 질환, 사구체신염, 재관류 손상, 심근 또는 다른 조직의 재관류 손상, 급성 염증성 성분을 동반하는 피부장애, 급성 화농성 수막염 또는 다른 중추신경계 염증성 장애, 안구와 안와 염증성 장애, 과립구 수혈-연관된 증후군, 사이토킨-유도된 독성, 급성 심각한 염증, 만성 난치성 염증, 신우염, 폐경변, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 큰-동맥 장애, 동맥내막 과형성, 소화성 궤양, 심판막염, 그리고 자궁내막증을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 "알레르기 질환"은 개체가 정상적으로는 비면역원성인 물질에 과민화되고, 그리고 이에 대항하여 면역학적 반응을 증가시키는 질환 또는 장애이다. 알레르기 질환은 일반적으로, IgE에 의한 비만 세포의 활성화에 의해 특징화되고, 유하게는 코감기에서부터 치명적인 아나필락시스 쇼크와 사망까지 증상을 유발할 수 있는 염증 반응을 유발한다. 알레르기 질환의 실례는 천식 (가령, 알레르기 천식), 알레르기 비염 (가령, 고초열), 알레르기 피부염 (가령, 습진), 접촉성 피부염, 음식 알레르기, 그리고 두드러기를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
상기 목록은 완전히 포괄적인 것이 아니고, 그리고 질환 또는 장애는 다양한 범주 안에 들어갈 수 있는 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다. 가령, 천식은 알레르기성 장애와 염증성 장애 둘 모두에 해당하고, 그리고 일부 임상의에 의해 자가면역 장애인 것으로 간주된다.
용어 "암"과 "암성"은 전형적으로, 조절되지 않은 세포 성장에 의해 특징화되는, 포유동물에서 생리학적 상태를 지칭하거나 또는 설명한다. 이러한 정의 내에 양성 암과 악성 암이 포함된다.
용어 "전암성"은 전형적으로, 암에 선행하거나 또는 암으로 발달하는 상태 또는 성장을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "증식성 질환"은 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 연관되는 질환 또는 장애이다. 한 구체예에서, 세포 증식성 장애는 암이다. 일부 구체예에서, 암은 유방암, 대장암, 비소세포 폐암, 비호지킨 림프종 (NHL), B 세포 림프종, B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 신장암, 전립선암, 간암, 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종, 그리고 교모세포종으로 구성된 군에서 선택된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "종양"은 악성 또는 양성인 지에 상관없이 모든 신생물 세포 성장과 증식, 그리고 모든 전암성과 암성 세포와 조직을 지칭한다.
"비전이성"은 양성이거나 또는 원발성 부위에서 남아있고 림프계 또는 혈관계 내로 또는 원발성 부위 이외의 조직으로 침투하지 않은 암인 것으로 의미된다. 일반적으로, 비전이성 암은 0, I, 또는 II기 암, 그리고 때때로, III 기 암인 임의의 암이다.
"개체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간이다. 포유동물은 경작용 동물 (가령, 소), 스포츠 동물, 애완 동물 (가령, 고양이, 개 및 말), 영장류, 생쥐, 그리고 쥐를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
II. 이중 특이적 항체의 산출
중쇄 가변 도메인 (VH)은 경쇄 가변 도메인 (VL)보다 훨씬 높은 서열 다양성을 내포하고 항원 인식의 결정인자에 더욱 빈번하게 기여한다. 우리의 이전 결과는 처음으로, 이중 특이성을 갖는 단일 항체를 생산하기 위해 경쇄 가변 도메인이 변경될 수 있었다는 것을 증명하였다 (본원에서 전체적으로 참조로서 편입되는 US 특허 출원 공개 번호 20080069820 및 Bostrom et al., Science 232:1610-1614 (2009)를 참조한다). 우리는 이중 특이적 항체가 VL에 돌연변이의 부재를 포함하는, VH에서 아미노산 잔기의 변경에 의한 항원 인식에 대해 결정적인 VL 잔기를 갖는 항체로부터 산출될 수 있다는 것을 발견하였다. 이들 신규하고 예상치 못한 방법이 아래에 상세하게 설명된다.
우리는 VL에서 특정한 잔기가 확인될 수 있다는 것을 발견하였는데, 이것은 정전 또는 소수성일 때, VL이 항원 인식을 위해 결정적이라는 것을 암시한다. 이런 경우에, 항체의 VH의 변경이 첫 번째 에피토프와 두 번째 에피토프 둘 모두에 결합하는 이중 특이적 항체를 산출하는데 이용된다. 구체적으로, 항체의 위치 32, 50, 또는 91 (Kabat 넘버링에서)에서 아미노산 잔기 중에서 임의의 1개, 2개, 또는 3개가 정전 (가령, 티로신) 또는 소수성 (가령, 트립토판)이면, 항체의 VH를 인코딩하는 핵산 서열은 하나 또는 그 이상의 용매 접근가능한 아미노산 잔기를 인코딩하는 VH의 하나 또는 그 이상의 코돈에서 변경된다.
다양한 구체예에서, VH에서 잔기는 아미노산 33, 34, 50-58, 또는 95-97 중에서 임의의 한 가지 또는 그 이상을 포함하도록 변경될 수 있다. 임의선택적으로, 경쇄의 아미노산 잔기 93-96이 중쇄 잔기에 더하여, 변경될 수 있다. 항원 인식을 위한 용매 접근성 또는 중요성은 구조적 지도화 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 당분야에서 공지된 표준 기술을 이용하여 중쇄에 대해 결정될 수 있다.
VL 및 변경된 VH가 이후, 발현되고 (가령, 라이브러리로서), 그리고 VL 및 변경된 VH를 포함하고 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이 선별된다. 초기 항체의 VL이 VH에 더하여, 변경되거나 또는 변경되지 않을 수도 있다. 초기 항체의 프레임워크 영역에서 아미노산 잔기가 VH에 더하여, 변경되거나 또는 변경되지 않을 수도 있다.
상기 선별 방법을 통해 확인되는 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 한쪽 또는 양쪽 표적 항원에 대한 친화성을 증가시키기 위해, 예로서 친화성 성숙 또는 다른 공지된 방법에 의해 더욱 변형될 수 있다. 친화성 성숙 선별 과정은 한쪽 또는 양쪽 표적 항원의 결합에 기여하는 (가령, 증가된 표적 항원 친화성에 기여하는) 잔기(들) (가령, 용매 노출된 또는 비-용매 노출된 잔기)를 확인하기 위한 대량 평행 염기서열결정 접근법 (가령, 심층 염기서열결정, 초심층 염기서열결정, 또는 차세대 염기서열결정)의 적용을 포함할 수 있다. 가령, Fowler et al. Nat. Methods. 7(9): 741-746, 2010을 참조한다. 이중 특이적 항체는 또한, 안정성 또는 반감기를 증가시키거나, 또는 면역원성을 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 이런 변형은 당업자에게 알려져 있다.
III. 치료적 이용
IL4와 IL5 (가령, B1, E7, 그리고 E7 친화성-성숙된 변이체) 또는 IL4와 IL13 (가령, F1 및 F2) 둘 모두에 결합하는 본원에서 설명된 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편은 질환, 예를 들면, 알레르기성, 염증성, 그리고 자가면역 질환 (가령, 천식); IL4-매개된 질환; IL5-매개된 질환; IL13-매개된 질환; IL4/IL5-매개된 질환; IL4/IL13-매개된 질환; 및/또는 증식성 장애 (가령, 암)를 치료하거나, 억제하거나, 또는 예방하는데 이용될 수 있다.
이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편에 의해 치료될 수 있는 염증성과 자가면역 질환 또는 장애의 실례는 전술된다. 일부 구체예에서, 질환 또는 장애는 천식, 예를 들면, 기관지 천식, 기관지 천식, 그리고 자가면역 천식을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
천식은 기도 염증, 과민반응성 및 폐색을 수반하는 만성 폐 질환으로서 설명된다. 생리학적으로, 기도 과민반응성은 메타콜린 또는 히스타민으로 기관지수축유발 후, 감소된 기관지 기류에 의해 방증된다. 기도 폐쇄를 유발하는 다른 유발요인은 차가운 공기, 운동, 바이러스 상부 호흡기 감염, 담배 연기, 그리고 호흡성 알레르겐을 포함한다. 알레르겐으로 기관지 수축유발은 기관지 기류에서 즉각적인 초기 단계 면역글로불린 E (IgE)-매개된 감소를 유도하고, 많은 환자에서 4-8 시간 동안 기관지 기류에서 감소와 함께 후기 IgE-매개된 반응이 이어진다. 초기 반응은 염증성 물질, 예를 들면, 히스타민, PGD2, 류코트리엔, 트립신분해효소 및 혈소판 활성화 인자 (PAF)의 급성 방출에 의해 유발되고, 반면 후기 반응은 데노보 합성된 친염증성 사이토킨 (가령, TNFα, IL4, IL13) 및 케모킨 (가령, MCP-1 및 MIP-1α)에 의해 유발된다 (Busse et al. In: Allergy: Principles and Practice, Ed. Middleston, 1173 (1998)). 만성 천식 환자에서, 지속 폐 증상은 Th2 세포의 고조된 반응에 의해 매개된다. Th2 사이토킨, 특히, 설치류에서 천식 모형 (Akbari et al., Nature Med., 9: 582 (2003))에서 지시된 바와 같이 기도에서 NK 표현형 (NKT)을 갖는 Th2 세포에 의해 생산된 IL13과 IL4가 상기 질환에서 필수적인 역할을 하는 것으로 생각된다 (Larche et al., J. Allergy Clin. Immunol., 111: 450 (2003)). 천식 기도의 육안적 병리는 폐 과다팽창, 평활근 비대, 망상판 농화, 점막 부종, 상피 세포 딱지형성, 섬모 세포 파괴, 그리고 점액 샘 분비과다를 전시한다. 현미경적으로, 천식은 기관지 조직, 기관지 분비액, 그리고 점액 내에 증가된 숫자의 호산구, 호중구, 림프구, 그리고 형질 세포의 존재에 의해 특징화된다. 초기에, 활성화된 CD4+ T-림프구에 의한 혈류로부터 기도로 백혈구의 동원이 나타난다. 활성화된 T-림프구는 또한, 호산구, 비만 세포, 그리고 림프구로부터 염증성 매개인자의 방출을 주도한다. 이에 더하여, Th2 세포는 IL4, IL5, IL9 및 IL13을 생산한다. IL4는 IL13과 함께, IgM로부터 IgE 항체로의 전환을 신호한다.
알레르겐에 의한 막-결합된 IgE 분자의 교차연결은 비만 세포가 탈과립화하여, 히스타민, 류코트리엔, 그리고 기도 염증을 영속시키는 다른 매개체를 방출하도록 유발한다. IL5는 호산구의 동원과 활성화를 활성화시킨다. 활성화된 비만 세포와 호산구는 또한, 염증을 영속시키는데 조력하는 그들의 사이토킨을 산출한다. 폐 조직에 손상, 그 이후에 수복으로 폐에서 반복된 염증 주기는 기도의 장기간 구조적 변화 ("재형성")를 유발할 수 있다.
중등도 천식은 현재, 돌파 증상 또는 알레르겐- 또는 운동-유발 천식을 완화하기 위해, 필요에 따라 (하루에 3-4 회) 매일 흡입된 항염증성-코르티코스테로이드 또는 비만 세포 저해제, 예를 들면, 크로몰린 나트륨 또는 네도크로밀 + 흡입된 베타2-효현제로 치료된다. 크로몰린 나트륨 및 네도크로밀은 기관지경련과 염증을 차단하지만, 통상적으로 알레르겐 또는 운동과 연관되는 천식, 그리고 전형적으로, 소아성 천식에만 효과적이다. 흡입된 코르티코스테로이드는 염증, 기도 과다반응, 그리고 폐색을 향상시키고, 그리고 급성 악화의 횟수를 감소시킨다. 하지만, 효과가 명확해지는데 최소한 1 개월이 소요되고, 그리고 현저한 향상이 발생하는데 최대 1 년이 소요된다. 가장 빈번한 부작용은 쉰소리 및 경구 진균 감염, 다시 말하면, 칸디다증이다. 더욱 심각한 부작용, 예를 들면, 부분적인 부신 억제, 성장 저해, 그리고 감소된 뼈 형성이 보고되긴 했지만, 단지 더욱 높은 용량의 이용 때에만 그러하였다. 베클로메타손, 트리암시놀론, 그리고 플루니솔리드가 아마도 유사한 효능을 갖는다; 반면 부데소니드 및 플루티카손은 더욱 강력하고, 그리고 보고된 바에 따르면, 더욱 적은 전신 부작용을 갖는다.
경미한 질환을 앓는 환자조차도 활성화된 T 세포, 비만 세포, 그리고 호산구로 점막층과 상피의 침윤을 비롯한 기도 염증을 보여준다. T 세포와 비만 세포는 호산구 성장과 성숙 및 IgE 항체의 생산을 증진하는 사이토킨을 방출하고, 그리고 이들은 차례로, 미세혈관 투과성을 증가시키고, 상피를 교란하고, 그리고 신경 반사 및 점액-분비 샘을 자극한다. 결과는 천명, 기침, 그리고 호흡 곤란에 의해 현성되는 기도 과다반응, 기관지수축, 그리고 분비과다이다.
전통적으로, 천식은 경구와 흡입 기관지확장제로 치료되었다. 이들 작용제는 천식의 증상에 도움을 주지만, 근원적인 염증에는 어떤 도움도 주지 못한다. 천식의 병인에서 염증의 중요성에 관한 지난 10년 동안의 인식은 코르티코스테로이드의 증가된 이용을 야기하였지만, 많은 환자가 통제되지 않는 천식을 여전히 앓고 있다.
IL4, IL5, 및/또는 IL13에 대한 특이성을 갖는 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편은 복수 병원성 경로를 표적으로 할 것이고, 그리고 천식의 치료를 위해, 단독으로 또는 추가 요법 (가령, 당분야에서 공지된 또는 앞서 설명된 것들)과 합동으로, 치료제로서 이용될 수 있다.
추가 구체예에서, 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편은 암을 치료하는데 이용될 수 있다. 용어 암은 전암성 성장, 양성 종양, 그리고 악성 종양을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 증식성 장애의 집합을 수용한다. 양성 종양은 기원의 부위에서 국부화된 상태로 남아있고, 그리고 멀리 떨어진 부위로 침윤하거나, 침입하거나, 또는 전이하는 능력을 갖지 않는다. 악성 종양은 다른 조직을 침입하고 그들 주변의 조직에 피해를 줄 것이다. 이들은 또한, 그들이 시작된 곳으로부터 갈라지고, 그리고 통상적으로 혈류를 통해 또는 림프절이 위치되는 림프계를 통해 다른 신체 부위로 확산하는 (전이하는) 능력을 획득할 수 있다. 원발성 종양은 그들이 발생하는 조직의 유형에 의해 분류된다; 전이성 종양은 암 세포가 유래되는 조직 유형에 의해 분류된다. 시간의 추이에서, 악성 종양의 세포는 더욱 비정상적으로 되고 정상적일 것 같지 않은 세포로 보인다. 암 세포의 모습에서 이러한 변화는 종양 등급으로 불리고, 그리고 암 세포는 충분히-분화된, 중간 정도로-분화된, 불량하게-분화된, 또는 미분화된 것으로 설명된다. 충분히-분화된 세포는 매우 정상적으로 보이고 그들이 기원하는 정상적인 세포와 유사하다. 미분화 세포는 세포의 기원을 결정하는 것이 가능하지 않을 만큼 비정상적으로 되는 세포이다.
IV. 용량 및 제제
항체 또는 항체 단편 조성물은 모범 의료행위 지침과 일치하는 방식으로 조제되고, 복용되고, 그리고 투여될 것이다. 이러한 문맥에서 고려를 위한 인자는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여의 일정, 그리고 의사에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 투여되는 항체 또는 항체 단편의 "치료 효과량"은 이런 고려 사항에 의해 지배될 것이고, 그리고 알레르기성, 염증성, 자가면역, 또는 증식성 질환 또는 장애, 또는 이의 증상을 예방하거나, 개선하거나, 또는 치료하는데 필요한 최소량이다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 투여하는 용량과 시기는 개체의 전반적인 건강 및 예로서, 알레르기성 장애의 증상의 심각도를 비롯한 다양한 임상적 인자에 의존할 것이다. 본 발명은 개체에서 알레르기성 장애 또는 그것으로부터 증상, 또는 알레르기성 장애가 발달할 위험을 치료하거나, 예방하거나, 또는 감소시키기 위한 항체 또는 항체 단편의 용도를 포함한다. 항체 또는 항체 단편은 언제든지, 예를 들면, 알레르기성 장애 또는 알레르기성 장애와 연관된 상태의 진단 또는 검출 후, 또는 알레르기성 장애가 발달할 위험이 결정된 후에, 알레르기성 장애로 아직 진단되지 않았지만 이런 장애가 발달할 위험에 처해있는 개체 (가령, 약화된 면역계로 고통받거나 또는 이로 인해 치료를 받고 있는 개체)에서 알레르기성 장애의 예방을 위해 투여될 수 있다.
본 발명의 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편은 다양한 방식으로, 예를 들면, 흡입, 국소, 경구, 피하, 기관지 주사, 정맥내, 뇌내, 비내, 경피, 복막내, 근육내, 폐내, 질, 직장, 동맥내, 뇌척수내, 관절내, 활막내, 병소내, 비경구, 뇌에서 뇌실내, 또는 안구내를 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 특정한 징후에 대한 공지된 루트로 조제되고 투여될 수 있다. 가령, 항체, 또는 항체 단편은 경구 투여를 위한 알약, 정제, 캡슐, 액체, 또는 지속된 방출 정제; 또는 정맥내, 피하 또는 투여를 위한 액체; 국부 투여를 위한 중합체 또는 다른 지속된 방출 운반제; 국소 투여를 위한 연고, 크림, 겔, 액체, 또는 패치의 형태일 수 있다.
국부 투여는 특히, 광범위한 부작용 또는 독성이 IL4, IL5, 또는 IL13 길항작용과 연관되면, 요망될 수 있다. 탈체 전략 또한 치료 적용에 이용될 수 있다. 탈체 전략은 개체로부터 획득된 세포를 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키거나 또는 형질도입하는 것을 수반한다. 형질감염된 또는 형질도입된 세포는 이후, 개체로 복귀된다. 이들 세포는 제한 없이, 조혈 세포 (가령, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, T 세포, 또는 B 세포), 섬유모세포, 상피 세포, 내피 세포, 각질세포, 또는 근육 세포를 비롯한 넓은 범위의 유형 중에서 한 가지일 수 있다.
가령, 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편의 연속적 전신 주입 또는 주기적 주사가 장애를 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다. 치료는 1 일부터 개체의 평생까지 범위에서 변하는 기간, 더욱 바람직하게는 1 내지 100 일, 그리고 가장 바람직하게는 1 내지 20 일, 그리고 가장 바람직하게는, 알레르기성, 염증성, 자가면역, 또는 증식성 질환 또는 장애, 또는 이의 증상이 감소되거나 또는 제거될 때까지, 지속될 수 있다. 용량은 화합물 및 질환의 심각도에 따라 변한다. 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편은 일정한- 또는 프로그램가능-흐름 이식가능 펌프를 이용한 주입에 의해 연속적으로, 또는 주기적 주사에 의해 투여될 수 있다. 지속된 방출 시스템 역시 이용될 수 있다. 반투성, 이식가능한 막 장치 역시 일정한 상황에서, 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편을 전달하기 위한 수단으로서 유용하다. 다른 구체예에서, 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편은 예로서, 흡입에 의해 국부 투여되고, 그리고 주기적으로 반복될 수 있다. 폐 투여 역시, 예로서 흡입기 또는 분무기의 이용, 그리고 에어로졸화제를 이용한 조제에 의해 활용될 수 있다. 항체는 또한, 건조 분말 조성물의 형태에서 환자의 폐 내로 투여될 수 있다 (가령, U.S. 특허 번호 6,514,496을 참조한다).
이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편의 용량은 다른 임상적 인자, 예를 들면, 개체의 체중과 상태 및 화합물의 투여 루트에 의존할 것이다. 개체를 치료하기 위해, 대략 0.1 mg/kg 내지 500 mg/kg 체중의 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편이 투여될 수 있다. 더욱 바람직한 범위는 1 mg/kg 내지 50 mg/kg 체중이고, 그리고 가장 바람직한 범위는 1 mg/kg 내지 25 mg/kg 체중이다. 특정 개체에서 항체 또는 항체 단편의 반감기에 따라, 항체 또는 항체 단편은 하루에 수회 내지 주 1회 사이에서 투여될 수 있다. 본 발명의 방법은 단일 투여뿐만 아니라 동시에 또는 연장된 기간에 걸쳐 제공되는 복수 투여를 제공한다.
바람직하게는, 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편은 연속 주입에 의해 비경구 또는 정맥내, 또는 흡입기에 의해 국부 투여된다. 용량 및 투약 섭생은 질환의 심각도, 그리고 개체의 전반적인 건강에 의존한다. 비경구 투여를 위해, 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편은 제약학적으로 허용되는 비경구 운반제와 연관하여, 단위 용량 주사가능 형태 (용액, 현탁액, 유제)로 조제된다. 이런 운반제는 내재적으로 비독성이고, 그리고 비-치료적이다. 이런 운반제의 실례는 물, 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 그리고 5% 인간 혈청 알부민이다. 비수성 운반제, 예를 들면, 고정유 및 에틸 올레산염 역시 이용될 수 있다. 리포솜이 담체로서 이용될 수 있다. 운반제는 소량의 첨가제, 예를 들면, 등장성 및 화학적 안정성을 증강하는 물질, 예를 들면, 완충액 및 보존제를 내포할 수 있다. 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편은 전형적으로, 이런 운반제에서 약 1 mg/ml 내지 10 mg/ml의 농도로 조제된다. 흡입에 의한 투여를 위해, 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편은 본 발명의 에어로졸 형태를 형성하는 임의의 적절한 방법에서 조제된다. 이중 특이적 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은 예로서, 흡입기를 이용하여 폐 내로 직접적으로 압축되고 호흡될 수 있는 증기를 생산하기 위해, 제약학적으로 허용되는 부형제와 함께, 또는 이런 부형제 없이 휘발되거나 또는 분무된다. 제약학적으로 허용되는 부형제는 휘발성일 수 있고, 그리고 이런 부형제의 부류는 당분야에서 공지되고 제한 없이, 가스성, 초임계 유체, 액체와 고체 용매를 포함한다. 이러한 부류 내에 예시적인 담체는 제한 없이, 물, 무균 식염수, 인산염 완충된 식염수와 같은 생리학적 완충액, 테르펜, 알코올, 프로필렌 글리콜, 글리세롤 및 다른 유사한 알코올, 드라이아이스, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 초임계 이산화탄소, 그리고 이들의 혼합물을 포함한다.
필요한 용량은 투여 루트의 선택; 제제의 성격; 개체의 질병의 성격; 개체의 크기, 체중, 표면적, 연령, 그리고 성별; 투여되는 다른 약물; 그리고 주치의의 판단에 의존한다. 필요한 용량에서 넓은 변이가 가용한 다양한 폴리펩티드와 단편, 그리고 다양한 투여 루트의 상이한 효율에 비추어 예상된다. 가령, 경구 투여는 정맥내 주사에 의한 투여보다 더욱 높은 용량을 필요로 하는 것으로 예상될 것이다. 이들 용량 수준에서 변이는 당분야에서 충분히 이해되는 바와 같이, 최적화를 위한 표준 경험적 루틴을 이용하여 조정될 수 있다. 투여는 단일 또는 복수 (가령, 2-, 3-, 6-, 8-, 10-, 20-, 50-,100-, 150-, 또는 그 이상) 투여일 수 있다. 적합한 전달 운반제 (가령, 중합성 마이크로입자 또는 이식가능한 장치)에서 폴리펩티드의 피포는 전달, 특히 경구 전달의 효율을 증가시킬 수 있다.
천식의 치료를 위한 한 구체예에서, 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 천식 또는 천식이 발달할 위험을 예방하거나 치료하는데 현재 이용되고 있는 하나 또는 그 이상의 작용제와 임의선택적으로 함께 조제되거나 또는 합동으로 (동시에 또는 순차적으로) 투여되지만 반드시 그러할 필요는 없다. 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 예로서, IgE 길항제, 기관지확장제 약물 (가령, 베타2-아드레날린 수용체 효현제, 크산틴, 콜린 수용체 길항제), 항염증제 (가령, 이나트륨 크로모글리케이트 (DSCG), 네도크로밀 나트륨, 항히스타민제, 예를 들면, 케토티펜, 코르티코스테로이드, 예를 들면, 프레드니솔론), 테오필린, 살부타몰, 베클로메타손 디프로피오네이트, 또는 당분야에서 공지된 다른 치료 천식 작용제와 함께 조제될 수 있다. 이런 다른 작용제의 효과량은 제제 내에 존재하는 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 양, 장애 또는 치료의 유형, 그리고 상기 논의된 다른 인자에 의존한다.
치료 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분을 임의선택적 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써 당분야에서 공지된 표준 방법을 이용하여 제조된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). 허용되는 담체는 식염수, 또는 완충액, 예를 들면, 인산염, 구연산염 및 다른 유기 산; 아스코르빈산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 잔기보다 적은) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 그리고 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA; 당 알코올, 예를 들면, 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들면, 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, TWEEN™, PLURONICS™, 또는 PEG를 포함한다.
임의선택적으로, 하지만 바람직하게는, 제제는 제약학적으로 허용되는 염, 바람직하게는 염화나트륨을, 그리고 바람직하게는 대략 생리학적 농도에서 내포한다. 임의선택적으로, 본 발명의 제제는 제약학적으로 허용되는 보존제를 내포할 수 있다. 일부 구체예에서, 보존제 농도는 0.1 내지 2.0% (전형적으로 v/v) 범위에서 변한다. 적합한 보존제는 약학에서 공지된 것들을 포함한다. 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, 메틸파라벤, 그리고 프로필파라벤이 예시적인 보존제이다. 임의선택적으로, 본 발명의 제제는 0.005 내지 0.02%의 농도에서 제약학적으로 허용되는 계면활성제를 포함할 수 있다.
본원에서 제제는 치료되는 특정 징후에 대해 필요에 따라 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 부정적인 영향을 주지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 또한 내포할 수 있다. 이런 분자는 의도된 목적에 효과적인 양에서 합동으로 적절히 존재한다.
활성 성분은 또한, 예로서 액적형성 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (가령, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로유제, 나노입자 및 나노캡슐)에서 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 또는 마크로유제 내에 포획될 수 있다. 이런 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기에서 개시된다.
지속된 방출 제조물이 제조될 수 있다. 지속된 방출 제조물의 적합한 실례는 항체를 내포하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하고, 여기서 이들 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속된 방출 매트릭스의 실례는 폴리에스테르, 하이드로겔 (가령, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (U.S. 특허 번호 3,773,919), L-글루타민산과 γ 에틸-L-글루타민산염의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세트산염, 분해성 젖산-글리콜산 공중합체, 예를 들면, LUPRON DEPOT™ (젖산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세트산염으로 구성된 주사가능 마이크로스피어), 그리고 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예를 들면, 에틸렌-비닐 아세트산염 및 젖산-글리콜산은 100 일 이상 동안 분자의 방출을 할 수 있게 하는 반면, 일정한 하이드로겔은 더욱 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 피포된 항체가 오랜 시간 동안 체내에 남아있을 때, 이들은 37℃에서 수분에 노출의 결과로서 변성되거나 또는 응집되어, 생물학적 활성의 상실 및 면역원성에서 가능한 변화가 유발될 수 있다. 합리적인 전략이 관련된 기전에 따라 안정화를 위해 창안될 수 있다. 가령, 응집 기전이 티오-이황화물 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 안정화는 술피드릴 잔기를 변형하고, 산성 용액으로부터 동결건조하고, 수분 함량을 제어하고, 적절한 첨가제를 이용하고, 그리고 특정한 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성될 수 있다.
한 가지 실례에서, 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 장애가 허용할 때, 예로서 직접적인 주사에 의해 국부 투여되고, 그리고 이들 주사는 주기적으로 반복될 수 있고, 또는 흡입에 의해 투여된다. 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 또한, 개체에 전신적으로 또는 병든 부위에 직접적으로 전달될 수 있다.
본 발명은 또한, 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 그리고 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다. 치료 이용을 위한 이러한 조성물은 무균이고 동결건조될 수 있다. 본원에서 설명된 징후를 치료하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 이중 특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 이용이 또한 예기된다. 조성물은 두 번째 치료적 작용제, 예를 들면, 항천식 작용제, 항염증제, 또는 항증식성 작용제 (가령, 화학요법 작용제, 세포독성 작용제 또는 항신생혈관제)를 더욱 포함할 수 있다.
V. 제조 물품 및 키트
본 발명의 다른 구체예는 질환 또는 장애 (가령, 알레르기 질환 또는 장애 또는 천식)의 치료에 유용한 물질을 내포하는 제조 물품이다. 본 발명의 또 다른 구체예는 염증성, 자가면역, 그리고 증식성 질환 또는 장애의 치료에 유용한 물질을 내포하는 제조 물품이다. 제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적절한 용기에는 예로서, 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 이들 용기는 다양한 물질, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 질환을 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하고, 그리고 무균 접근 포트를 가질 수 있다 (가령, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통되는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내에 최소한 하나의 활성제는 본 발명의 이중 특이적 항체 또는 항원 결합 단편이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 특정 질환을 치료하는데 이용된다는 것을 표시한다. 라벨 또는 포장 삽입물은 항체 조성물을 환자에 투여하기 위한 사용설명서를 더욱 포함할 것이다. 본원에서 설명된 조합 요법을 포함하는 제조 물품과 키트 역시 예기된다.
포장 삽입물은 이런 치료적 산물의 이용과 관련된 징후, 용법, 용량, 투여, 금기 및/또는 주의사항에 관한 정보를 내포하는, 치료적 산물의 상업적인 포장에 관례적으로 포함되는 사용설명서를 지칭한다. 한 구체예에서, 포장 삽입물은 조성물이 천식을 치료하는데 이용된다는 것을 표시한다.
부가적으로, 제조 물품은 제약학적으로 허용되는 완충액, 예를 들면, 주사용 정균수 (BWFI), 인산염-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 두 번째 용기를 더욱 포함할 수도 있다. 이것은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 그리고 주사기를 비롯하여, 상업적 관점 및 이용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 더욱 포함할 수도 있다.
다양한 목적, 예를 들면, 세포로부터 IL4, IL5, 또는 IL13의 정제 또는 면역침전에 유용한 키트 역시 제공된다. IL4, IL5, 또는 IL13의 단리와 정제를 위해, 키트는 비드 (가령, 세파로오스 비드)에 연계된 IL4/IL5 또는 IL4/IL13 항체를 내포할 수 있다. 시험관내에서, 예를 들면, ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 IL4, IL5, 또는 IL13의 검출과 정량을 위한 항체를 내포하는 키트가 제공될 수 있다. 제조 물품에서처럼, 키트는 용기 및 용기 상에 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 용기는 본 발명의 최소한 하나의 이중 특이적 또는 다중특이적 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물을 보유한다. 가령, 희석제 및 완충액 또는 대조 항체를 내포하는 추가 용기가 포함될 수 있다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물에 관한 설명뿐만 아니라 의도된 시험관내 또는 진단적 이용을 위한 사용설명서를 제공할 수 있다.
다음 실시예는 단지 예시적인 목적으로만 제공되고, 그리고 본 발명의 범위를 어떤 방식으로도 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 실제로, 본원에서 도시되고 설명된 것들에 더하여, 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이고 첨부된 청구항의 범위에 들어간다.
실시예
아래 실시예에서 언급된 상업적으로 가용한 시약은 달리 지시되지 않으면, 제조업체의 사용설명서에 따라 이용되었다. 다음 실시예에서, 그리고 명세서 전반에서 ATCC 수탁 번호에 의해 확인되는 세포의 출처는 American Type Culture Collection, Manassas, VA이다. 달리 언급되지 않으면, 본 발명은 재조합 DNA 기술의 표준 절차, 예를 들면, 위에서 및 다음의 교과서에서 설명된 것들을 이용한다: Sambrook et al., 상기; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.
실시예 1. 라이브러리 설계와 작제
경쇄 (LC) 상보성 결정 영역 (CDRs)에서 돌연변이에 의해, 단일특이적 항체가 이의 일차 항원 특이성을 유지하면서, 새로운 항원을 향한 두 번째 결합 특이성을 동원할 수 있다. 게다가, 이중 결합은 낮은 나노몰의 KD에서 친화성-성숙될 수 있다. 이중 특이성을 가공하는 이러한 통로는 그들의 일차 항원에 결합하기 위해 중쇄 (HC) CDR을 주로 활용하는 항체에 충분히 적합하다. 여기에서, 우리는 생쥐 하이브리도마-유래된 항-인터류킨 4 항체를 설명하는데, 이것은 결합 에너지, 그리고 단독으로 또는 LC CDR에서 추가 돌연변이와 함께 HC CDR에서 돌연변이로 이러한 항체의 이중 특이성으로의 진화를 위해 LC CDR에 심하게 의존하다. 인터류킨 4 (IL4)와 인터류킨 5 (IL5) 둘 모두를 향한 이와 같은 한 가지 이중 특이적 변이체는 낮은 나노몰의 KD에서 높은 이중 친화성으로 성숙된다. 이들 결과는 이중 특이성을 진전시키는 항체의 능력을 더욱 강조하고, 그리고 돌연변이를 관용하고 이차 결합 특이성의 진화를 허용할 수 있는 항원 결합 부위의 영역을 확인하기 위한 돌연변이 스캐닝의 전략을 이용하여 임의의 항체에서 이중 특이성을 진전시키기 위한 일반적으로 적용가능한 가공 통로를 증명한다.
우리는 두 번째 항원 특이성을 인간화 항체 19C11 (hu19C11, 생식계열 VH1과 카파 I의 중추에서 인간화) 내로 동원하는데 착수하였는데, 상기 항체는 IL4에 결합하고 이것이 IL4 수용체 α와 맞물리는 것을 차단한다. 우리는 먼저 이의 Fab를 "파지미드" 구조체 (pV0115) 내로 클로닝하여 LC, 그리고 이중시스트론으로, 기존에 설명된 바와 같은 M13 작은 외피 단백질 p3에 C 말단 융합된 HC의 가변 도메인 및 불변 도메인 1 (CH1)을 공동발현하였다 (Lee et al., J. Mol. Biol. 340:1073-93, 2004). 아미노산 서열 KTHTC를 갖는 IgG의 힌지 영역의 부분이 이가 Fab 전시 (Lee et al., J. Mol. Biol. 340:1073-93, 2004)를 허용하여 고체 표면 지지체 위에 고정된 항원에 대한 결합의 효율을 증가시키기 위해, CH1과 M13 p3 사이에 포함되었다. 우리는 먼저, Fab-전시 파지가 높은 친화성 (파지 EC50 = 1nM)으로 LC에 C 말단 융합된 발현 태그 (gD)에 대한 항체 및 IL4에 충분히 결합하는 지를 실증하였는데, 이것은 IgG로서 항체의 계측된 친화성과 유사하다.
두 번째 결합 특이성을 hu19C11에 동원하는 가공 전략을 결정하기 위해, 우리는 먼저, 각 LC CDR의 2개 또는 3개 잔기를 알라닌으로 돌연변이시킴으로써, IL4에 결합하기 위한 이의 3개의 LC CDR의 중요성을 조사하였다. 이들 LC CDR 위치는 이들 위치가 일차 항원 결합을 위해 HC CDR에 심하게 의존하는 항체로부터 이중 특이적 클론을 선별하기 위한 LC 라이브러리 접근법에서 조합 돌연변이유발을 위한 핵심 위치로서 이전에 확인되었기 때문에 선택되었다 (Bostrom et al. PLoS One. 6:e17887, 2011). 파지 전시 hu19C11 야생형, 알라닌 돌연변이체 L1 (I30A/N31A/D32A), L2 (Y50A/H53A/R54A), 또는 L3 (D91A/Y92A)이 항-gD 항체 (도면 1a) 또는 IL4 (도면 1b)에 고정되었고 ELISA를 이용하여 결합에 대해 검정되었다. 우리는 LC CDR이 활동적으로 중요한 것으로 보인다는 것을 발견하였다. 3개의 LC CDR 중에서 하나에서 알라닌 돌연변이를 갖는 파지 전시 Fab는 IL4에 검출가능한 결합을 전시하지 않지만 항-gD 항체에 결합하였는데, 이것은 이들 돌연변이체가 비록 야생형 Fab보다 낮은 수준이긴 하지만 파지 상에 실제로 전시되고, IL4에 대한 그들의 결합은 심하게 교란되었다는 것을 지시한다 (도면 1a와 1b). 이런 이유로, 무작위화된 LC CDR 라이브러리를 산출하는 접근법은 아마도 이중 특이적 항체를 생산하지 못할 것인데, 그 이유는 이차성 항원 결합을 진전시키는데 가용한 아미노산 잔기의 숫자가 매우 제한되기 때문이다. 우리는 그 다음, 기존에 설명된 바와 같이 LC CDR의 개별 핵심 잔기뿐만 아니라 표면 접근가능한 HC CDR을 돌연변이시키고 (Sidhu et al. J Mol Biol. 338:299-310, 2004; Lee et al. J Mol Biol. 340:1073-1093, 2004), 그리고 야생형 hu19C11과 비교하여 이들 알라닌 돌연변이체의 상대적 결합 친화성을 결정함으로써, IL4 결합에서 그들의 역할을 평가하였다. 이들 결과는 IL4 결합을 위한 이들 핵심 LC CDR 잔기의 중요성을 실증하였다. 하지만, CDR H2의 모든 시험된 위치 및 CDR H1과 H3의 절반이 돌연변이를 관용하는 것으로 나타났다 (도면 1c).
모형으로서 트라스투주맙 Fab (PDB: 1FDV)의 구조 상에서 IL4 결합에 결정적으로 중요한 잔기 (LC 잔기 30, 31, 32, 50, 53, 54, 91, 92; HC 잔기 31, 32, 98, 99 (Kabat 넘버링에서))를 지도화함으로써, 우리는 돌연변이를 관용하고 두 번째 특이성을 진전시키는데 적합할 수 있는 CDR H2에서 중심된 부위를 확인하였다 (도면 2a). 우리는 이후, 돌연변이 계획을 위해 CDR H2에 중심하는 무작위화를 위한 알라닌 돌연변이를 관용하는 CDR H1 (33, 34), H2 (50-58), H3 (95-97), 그리고 L3 (93-96)에서 한 세트의 잔기를 선별하고, 그리고 Kunkel 등 (Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-82, 1987)의 돌연변이유발 방법에 따라 4개의 CDR 각각에서 이들 선별된 잔기를 무작위화하는데 관계된 한 세트의 합성 올리고뉴클레오티드를 이용하였다. 무작위화 계획은 아미노산 조성 및 CDR H2와 CDR L3의 길이 가변성의 면에서 자연 항체에서 다양성에 의해 보도되었다 (도면 2b). 돌연변이유발을 위한 주형은 단지 CDR H2에서만 종결 코돈을 내포하였는데, 이것은 Fab-전시 라이브러리 내에 이러한 CDR에서 돌연변이를 담보하였다. 우리는 10개의 파지 전시 라이브러리를 산출하였는데, 이들은 각각 108-109 범위에서 변하는 크기를 갖는다. 비-차단 항-IL4 항체에 의해 포획된 고정된 IL4 (PeproTech)에 대한 hu19C11과 10개의 HC 라이브러리 (2144-1 내지 2144-10) 결합의 파지 적정에 의해 사정될 때, 각 라이브러리는 풀로서, 주형 항체 hu19C11와 비교하여 일반적으로 훨씬 감소된, IL4를 향한 상당히 낮은 수준의 결합을 보여주었는데, 이것은 평균적으로 IL4 결합의 상이한 붕괴 수준을 지시한다 (도면 3).
우리는 IL5과 IL13을 이차 항원으로서 선택하였다. 이들 2가지 인터류킨은 IL4와 유사하게, 4-나선 묶음 사이토킨 패밀리에 속하지만, 이들은 아미노산 서열 및 구조 조직화의 수준에서 매우 상이하다 (LaPorte et al. Cell. 132:259-272, 2008; Patino et al. Structure. 19:1864-1875, 2011; Finkelman et al. J Immunol. 184:1663-1674, 2010). IL4와 IL13 사이에 서열 동일성은 12%이고, 반면 IL4와 IL5 사이에 서열 동일성은 11%이다. 구조적으로, IL5는 한 사슬로부터 1개의 α-나선과 독특한 뒤얽힌 동종이합체를 형성하고 다른 사슬로부터 3개의 α-나선과 4-나선 묶음을 형성한다 (Milburn et al. Nature. 363:172-176, 1993; Patino et al. Structure. 19:1864-1875, 2011); IL4와 IL13은 둘 모두 단위체이다. 하지만, 이들 3가지 사이토킨은 그들의 생물학적 기능에서 관련되고, 그리고 이들 사이토킨 중에서 2가지에 결합하고 이들을 차단하는 이중 특이적 항체는 알레르기 질환, 예를 들면, 천식에 대한 치료제로서 잠재적 유용성을 가질 수 있다 9 (Finkelman et al. J Immunol. 184:1663-1674, 2010; Haldar et al. N Engl J Med. 360:973-984, 2009).
우리는 기존에 설명된 바와 같이 작제된 파지 전시 라이브러리로부터 IL4 결합을 유지하는 IL5 또는 IL13 결합 클론에 대한 여러 라운드의 패닝과 농축을 수행하였다 (Bostrom et al. Science. 323:1610-1614, 2009). 대략 100개의 클론을 각각 선별검사함으로써, 우리는 각각, IL5/IL4 또는 IL13/IL4에 이중 결합을 전시하는 3 내지 8개 클론을 발견하였다. 그리고 염기서열결정으로부터, 2개의 독특한 IL4/IL5 결합 클론 (B1, E7) 및 2개의 독특한 IL4/IL13 (FI, F2) 결합 클론이 확인되었다 (도면 2b). 우리는 또한, 오로지 IL5에만 결합하는 클론 (가령, 클론 5A)을 단리하였다. 클론 B1을 제외하고, 모든 클론은 그들의 단일특이적 부모 주형과 비교하여, 단지 HC CDR에서만 돌연변이를 내포하였다 (도면 4a-4c). 이것은 단일특이적 항체의 HC CDR의 돌연변이가 이중 특이성을 부여할 수 있다는 것을 증명하였다. 우리는 파지 결합 경쟁 검정을 이용하여 클론 친화성을, 고정된 인터류킨에 결합으로부터 Fab 전시 파지의 50%를 저해하는데 필요한 인터류킨의 농도 (IC50)로서 추정하였다. 우리는 두 번째 항원에 결합이 마이크로 몰 범위에서 IC50으로 약한 반면, IL4 결합이 낮은 나노몰 범위에서 유지된다는 것을 발견하였다.
실시예 2. 라이브러리 성능의 평가
이중 결합 특이성을 실증하기 위해, 클론 B1, E7, F2, 그리고 5A가 IgG로서 발현되었고, 그리고 여러 다른 단백질이 아닌 예상된 항원에 결과의 IgG의 결합이 확증되었다 (도면 5). 우리는 유세포분석법에 의해 IL4, IL5와 IL13을 발현하지 않는 인간 상피 신장 세포주 293 세포뿐만 아니라 ELISA에 의해 곤충 세포주로부터 산출된 배큘로바이러스 (BV) 입자에 대한 IgG의 최소 결합을 증명함으로써, 결합 특이성을 더욱 시험하였다 (Hotzel et al. MAbs. 4:753-760, 2012). 게다가, IL4/IL5 이중 특이적 항체 B1과 E7는 단일특이적 IL5 결합 항체와 함께, IL5가 IL5 수용체 α에 결합하는 것을 차단하는 것으로 나타났는데, 이것은 IL5 상에서 결합 에피토프가 IL5 수용체의 것과 중첩되었다는 것을 암시한다 (도면 6). 표면 플라스몬 공명 (SPR) 계측에 의해, IL4/IL5 이중 특이적 클론 E7은 IL5를 향한 낮은 친화성 (KD = 905 nM)을 가졌지만, 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 계측될 때, 이의 부모 항체 hu19C11의 높은 친화성 IL4 결합 (KD = 3.4 nM)을 유지하였다 (도면 7a와 7b).
실시예 3. 이중 특이적 항원 결합 단편의 친화성 성숙
E7의 이중 친화성을 향상시키기 위해, 우리는 특정 부위 돌연변이유발을 통해 E7 CDR을 무작위화하고 결합 선별을 위해 이들 변이체를 파지 상에 전시하였다. 기존에 설명된 바와 같이 무작위화를 위해, CDR H2와 CDR L3 (H2/L3 라이브러리)의 잔기, CDR H1, H2와 H3 (H1/H2/H3 라이브러리)의 잔기, 또는 CDR H2와 HC의 프레임 영역 3 (FR3)에서 선별된 부위 (H2/FR3 라이브러리)의 잔기를 표적으로 하는 3개의 라이브러리가 산출되었다 (Lee et al. J Mol Biol. 340:1073-1093, 2004; Bostrom et al. Methods Mol Biol. 525:1-24, 2009; Lee et al. Blood. 108:3103-3111, 2006) (도면 7a). 클론 E7이 높은 IL4 결합 친화성을 유지했기 때문에, 우리는 IL5 결합을 향상시키는데 있어서 라이브러리 선별에 집중하였다. H1/H2/H3 라이브러리로부터, 우리는 IL5를 향한 향상된 친화성, 하지만 IL4를 향한 크게 감소된 친화성을 갖는 많은 클론을 발견하였고, 반면 H2/L3 라이브러리 및 H2/FR3 라이브러리로부터 클론은 IL4-결합 친화성의 상실 없이 향상된 IL5 결합을 보여주었다 (도면 4a). 선별된 클론은 IgG로서 정제되고 E7과 비교되었다. H2/L3 라이브러리로부터 많은 변이체는 한 세트의 비표적화된 단백질에 증가하는 결합 없이 IgG로서 더욱 높은 이중 결합을 전시하였다 (도면 8a). 우리는 또한, 상기와 같이 BV 결합과 293 세포 FACS를 이용하여 낮은 부정확한 결합을 확증하였고, 그리고 향상된 클론이 IL5가 이의 수용체에 결합하는 것을 여전히 차단한다는 것을 확증하였다 (도면 8b). 2개의 향상된 변이체, 1C36과 1C60의 일가 결합 친화성 (도면 7c와 7d)은 고정된 IL4 또는 IL5에 Fabs 결합으로서 SPR 계측에 의해 결정되었다. 양쪽 변이체는 IL4를 향한 높은 친화성 (KD = 3-4 nM)을 유지하였고, 그리고 IL5을 향한 친화성을 각각, 37-배와 20-배 향상시켰다 (KD = 1C36의 24.1nM 및 1C60의 경우 44.4nM) (도면 7b).
요약하면, 우리는 단일특이적 항체의 HC CDR에서 돌연변이가 이차 결합 특이성을 동원할 수 있다는 것을 보여주었고, 그리고 우리는 단리된 이중 특이적 항체 중에서 한 가지를 양쪽 항원을 향한 낮은 nM 친화성까지 향상시켰다. 이전에, 우리는 트라스투주맙 Fab가 LC CDR에서 돌연변이를 통해 이중 특이성을 진전시킨다는 것을 증명하였다; 그 이후로, 다른 이중 특이적 항체는 동일한 LC 접근법을 이용하여 산출되었다. 본 연구의 조사 결과와 함께, 우리는 항체의 결합 특이성의 진화가능성을 강조하였다. 우리는 경쇄뿐만 아니라 중쇄의 측면에서 CDR 내에 제한된 돌연변이로, 항체가 다른 결합 특이성을 추가할 수 있다는 것을 발견하였다. 자연에서, 항체는 유전자 뒤섞음 및 체세포 돌연변이에 의해 끊임없이 재형성 중에 있다. 항체는 체세포 돌연변이를 통해 상이한 결합 성질, 따라서 상이한 기능을 갖는 항체로 변함으로써, "재생"될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항체는 제한된 돌연변이에 의해 결합 특이성을 진전시키기 위한 이상적인 접힘과 구조 중에서 한 가지를 가질 수 있는데, 이것은 본질적으로 무한한 다양한 외래 항원을 인식하는 자연 면역 반응의 방대한 능력에서 일정한 역할을 수행할 것임에 틀림없다. 게다가, 이러한 작업은 처음으로, 아래와 같이 요약된 임의의 단일특이적 항체로부터 이중 특이적 항체를 진전시키는 일반적인 가공 통로를 보여준다. 돌연변이유발 분석 (가령, 알라닌 스캐닝)을 통해, 먼저 일차 항원의 결합을 심하게 교란하지 않으면서 돌연변이를 관용하는 항원 결합 부위의 영역을 확인할 수 있다.
다른 구체예
본 명세서에서 인용되거나 또는 언급된 모든 특허, 특허 출원, 특허 출원 공보, 그리고 다른 간행물은 마치 각 독립된 특허, 특허 출원, 특허 출원 공보 또는 간행물이 특정적으로 및 개별적으로 참조로서 편입되는 것으로 지시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로서 편입된다.
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. F. Hoffmann-La Roche AG <120> DUAL SPECIFIC ANTIBODIES <130> 50474-029WO3 <150> US 61/946,547 <151> 2014-02-28 <150> US 61/919,552 <151> 2013-12-20 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Asp 20 25 30 Ala Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser His Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 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Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Ile Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Lys Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Asp Ala Ala 1 5 10 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Tyr Thr Ser His Arg Tyr Thr 1 5 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Gln Gln Asp Tyr Thr Pro Phe Pro Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Asp Tyr Ser Met His 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Asp Tyr Asp Ile His 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Asp Tyr Phe Ile His 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Asp Tyr Leu Met His 1 5 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Val Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 1 5 10 15 Lys <210> 18 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Ala Gly Ile Val Tyr Asp Ala Thr Gly Phe Thr Thr Tyr Ala Asp Asp 1 5 10 15 Phe Lys <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 Ala Val Ile Val Ser Ile Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe 1 5 10 15 Lys <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Gly Gly Ile Phe Tyr Gly Met Asp Tyr 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Glu Ile Leu Phe Tyr Gly Met Asp Tyr 1 5 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Gly Val Ile Phe Gln Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Gly Ile Ile Phe Tyr Thr Gly His Thr Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Thr, Ile, Lys, or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Ser or His <400> 24 Gln Gln Asp Tyr Xaa Xaa Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 25 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Ala or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Thr, Ile, Val, or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is Asp, Val, or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is Asp, Glu, Asn, Ser, Ile, Leu, Thr, Ala, or Phe <400> 25 Xaa Gly Ile Val Tyr Asp Ala Thr Gly Phe Thr Xaa Tyr Ala Xaa Xaa 1 5 10 15 Phe Lys <210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Val or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Arg or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Thr, Phe, Met, or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is Ala or Val. <400> 26 Gly Arg Xaa Thr Ile Thr Xaa Asp Xaa Ser Thr Ser Thr Xaa 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 Gln Gln Asp Tyr Thr His Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Gly Gly Ile Val Tyr Asp Ala Thr Gly Phe Thr Thr Tyr Ala Glu Glu 1 5 10 15 Phe Lys <210> 29 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Asp 20 25 30 Ala Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser His Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Thr His Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 30 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Val Tyr Asp Ala Thr Gly Phe Thr Thr Tyr Ala Glu Glu 50 55 60 Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Gly Ile Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 Gln Gln Asp Tyr Lys His Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 32 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Ala Gly Ile Val Tyr Asp Ala Thr Gly Phe Thr Val Tyr Ala Asp Asp 1 5 10 15 Phe Lys <210> 33 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Asp 20 25 30 Ala Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser His Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Lys His Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 34 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Gly Ile Val Tyr Asp Ala Thr Gly Phe Thr Val Tyr Ala Asp Asp 50 55 60 Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Gly Ile Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (1)

  1. 다음의 6개 CDR을 포함하는 단리된 이중 특이적 항체의 용도:
    (i) KASQSVINDAA의 아미노산 서열 (서열 번호: 9)을 포함하는 CDRL1;
    (ii) YTSHRYT의 아미노산 서열 (서열 번호: 10)을 포함하는 CDRL2;
    (iii) QQDYTSPWTF의 아미노산 서열 (서열 번호: 11)을 포함하는 CDRL3;
    (iv) DYDIH의 아미노산 서열 (서열 번호: 14)을 포함하는 CDRH1;
    (v) VWINTETGEPTYADDFK의 아미노산 서열 (서열 번호: 17)을 포함하는 CDRH2; 그리고
    (vi) EILFYGMDY의 아미노산 서열 (서열 번호: 21)을 포함하는 CDRH3.
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