JP2023179409A - 二重特異性抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】二重特異性抗体並びにこのような抗体を作製及び使用する方法を提供する。【解決手段】ＶＨ及びＶＬを含む、二重特異性抗体またはその抗原結合性断片を作製する方法であり、二重特異性抗体のＶＨ及びＶＬは共に対合して、第１のエピトープ及び第２のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、作製する方法は、（ａ）ＶＨ及びＶＬは共に対合して、第１のエピトープには結合するが第２のエピトープには結合しない抗原結合部位を形成し、かつ、該抗体はＶＬの位置３２、５０、または９１において静電的または疎水性のアミノ酸を少なくとも一つ含む、工程、（ｂ）工程（ａ）の抗体の１個以上の溶媒接近可能なアミノ酸残基が改変される、工程、（ｃ）ＶＬ及び工程（ｂ）で改変されたＶＨを発現させる工程、及び（ｄ）ＶＬ及び工程（ｃ）で改変されたＶＨを含む二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を選択する工程、を含む、方法である。【選択図】なし

Description

本発明は、二重特異性抗体、及びかかる抗体を作製及び使用する方法に関する。

抗体は、外来タンパク質、糖タンパク質、細胞、または他の抗原性外来物質による惹起に応答して脊椎動物の免疫系により産生される特異的免疫グロブリンポリペプチドである。この過程の重要な部分は、特定の外来物質に特異的に結合する抗体を産生することである。このようなポリペプチドの特定の抗原に対する結合特異性は高度に洗練されており、個々の脊椎動物で産生され得る特異性が多数あることは、その複雑さと可変性において注目に値する。何千もの抗原が応答を誘発でき、各応答は、ほぼ排他的にその応答を誘発した特定の抗原を対象とする。

抗原を特異的に認識することは抗体が適応免疫応答において機能するために必要不可欠である。重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の会合の組み合わせは、すべての脊椎動物において、抗体のレパトワ作製において保存されている。しかしながら、この重鎖と軽鎖の多様性は非対称である。ＨＣ（Ｖ_Ｈ）の可変ドメインの方が、有意に高い配列多様性を含み、ＬＣ（Ｖ_Ｌ）の可変ドメインよりも抗原認識の決定因子に寄与することが多い。しかしながら、かかる可変性によって抗体は特定の外来物質を認識して結合することから、抗体によっては抗原結合エネルギーをＶ_Ｌに大きく依存している。

抗体及び抗体断片が特定の抗原または複数の抗原に対して特異的であることにより、抗体が望ましい治療剤となる。抗体及び抗体断片を使用して、多様な生物学的役割を担う特定の抗原（例えば、サイトカイン）を標的とすることが可能である。したがって、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び増殖性疾患など、さまざまな疾患及び障害の治療に有用な治療的抗体、特に、抗体、断片、及びその誘導体を同定し特徴を明らかにすることが現在も引き続き求められている。

本発明は、二重特異性抗体及び抗体断片を作製する方法を提供する。本発明は、また、これらの方法を使用して同定された特異性抗体並びにその使用も提供する。

一般に、本発明の方法では、抗体のＶ_Ｈを多様化させて、ライブラリーに安定して発現させることが可能な二重特異性抗体改変体を作製する。一実施形態では、多様化される前の抗体は、それが有しているＶ_Ｈ及びＶ_Ｌが共に対合して、第１のエピトープに特異的に結合するが第２のエピトープには結合しない抗原結合部位を形成するとして特徴づけられる。抗体は、さらに、Ｖ_Ｌの位置３２、５０、または９１（Ｋａｂａｔ番号付けシステム）に見られる任意の１、２、または３個のアミノ酸に静電的または疎水性残基を有するとして特徴づけられる。これらの位置の１か所以上に疎水性または静電的残基を有するそのような抗体を、その後、Ｖ_Ｈの１個以上のアミノ酸残基において改変させる（例えば、溶媒露出したアミノ酸残基）。その後、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌを、発現させ（例えば、ライブラリーとして）、発現したＶ_Ｈ及びＶ_Ｌから、第１及び第２のエピトープに特異的に結合することができる多様化された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を選択する。

一態様では、可変重鎖ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び可変軽鎖ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む、二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を作製する方法であり、ここで、かかる二重特異性抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌは共に対合して、第１のエピトープ及び第２のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を形成する、二重特異性抗体またはその抗原結合性断片を作製する方法であって、（ａ）Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌを含む抗体を提供し、ここで、かかるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌは、共に対合して、第１のエピトープには結合するが第２のエピトープには結合しない抗原結合部位を形成し、かつ、かかる抗体は、Ｖ_Ｌの位置３２、５０、または９１において静電的または疎水性のアミノ酸を少なくとも一つ含み；（ｂ）工程（ａ）の抗体のＶ_Ｈをコードする核酸配列を改変し、ここで、１個以上の溶媒接近可能なアミノ酸残基を改変し；（ｃ）Ｖ_Ｌ及び工程（ｂ）で改変したＶ_Ｈを発現させ；かつ、（ｄ）Ｖ_Ｌ及び工程（ｃ）で改変したＶ_Ｈを含む二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を選択し、ここで、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、共に対合して、該第１のエピトープ及び該第２のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を形成する、各工程を含む該方法を本発明は特徴とする。

いくつかの実施形態では、位置３２、５０、または９１のアミノ酸の少なくとも２個は、静電的または疎水性である。いくつかの実施形態では、位置３２、５０及び９１の３個のアミノ酸すべてが静電的または疎水性である。いくつかの実施形態では、静電的残基はチロシンである。いくつかの実施形態では、疎水性残基はトリプトファンである。いくつかの実施形態では、Ｖ_Ｈをコードする核酸配列を、複数の天然に生じる重鎖アミノ酸配列の多様性に基づいて改変する。いくつかの実施形態では、溶媒露出残基の位置は、Ｖ_Ｈの位置３３、３４、５０～５８、及び９５～９７からなる群から選択されるアミノ酸残基の位置である。いくつかの実施形態では、方法は、工程（ａ）の抗体のＶ_Ｌをコードする核酸配列を改変し、ここで、１個以上の溶媒接近可能なアミノ酸残基を改変することをさらに含む。いくつかの実施形態では、溶媒露出残基の位置は、Ｖ_Ｌの９３～９６のアミノ酸から選択されるアミノ酸残基の位置である。いくつかの実施形態では、選択工程（ｄ）の間、改変したＶ_ＨをＶ_Ｌとファージに提示させる。いくつかの実施形態では、工程（ａ）の抗体は、軽鎖可変領域相補性決定領域である、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１、アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列ＱＱＤＹＴＳＰＷＴＦ（配列番号１１）を含むＣＤＲＬ３を含む。いくつかの実施形態では、工程（ａ）の抗体は、重鎖可変領域相補性決定領域である、アミノ酸配列ＤＹＳＭＨ（配列番号１３）を含むＣＤＲＨ１、アミノ酸配列ＶＷＩＮＴＥＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫ（配列番号１７）を含むＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列ＧＧＩＦＹＧＭ ＤＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲＨ３を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）の二重特異性抗体の抗原結合部位は、第１のエピトープ及び第２のエピトープを双方、排他的に結合する。その他の実施形態では、工程（ｄ）の二重特異性抗体の抗原結合部位は、第１のエピトープ及び第２のエピトープを同時に結合する。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは１個の生物学的分子由来であり、第２のエピトープはその同じ生物学的分子由来である。その他の実施形態では、第１のエピトープは第１の生物学的分子由来であり、第２のエピトープは第２の生物学的分子由来である。いくつかの実施形態では、第１の生物学的分子及び第２の生物学的分子は、ＩＬ４／ＩＬ５及びＩＬ４／ＩＬ１３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の生物学的分子及び第２の生物学的分子は、サイトカインである。いくつかの実施形態では、第１または第２の生物学的分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体に結合した場合に二重特異性抗体の半減期を延長できる分子である。いくつかの実施形態では、第１または第２の生物学的分子は血清アルブミンまたは胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）である。いくつかの実施形態では、第１または第２の生物学的分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体に結合した場合に二重特異性抗体のエフェクター機能を高めることができる分子である。いくつかの実施形態では、第１または第２の生物学的分子は、ナチュラルキラー細胞またはマクロファージ上の細胞表面タンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質はＦｃ受容体またはＣ１ｑである。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌは共に対合して、第１のエピトープまたは第２のエピトープに１０^-６以下のＫ_Ｄで特異的に結合する抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌは共に対合して、第１のエピトープまたは第２のエピトープに１０^-９以下のＫ_Ｄで特異的に結合する抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌは共に対合して、第１のエピトープまたは第２のエピトープに１０^-１２以下のＫ_Ｄで特異的に結合する抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌは共に対合して、第１のエピトープ及び第２のエピトープに１０^-６以下のＫ_Ｄで特異的に結合する抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌは共に対合して、第１のエピトープ及び第２のエピトープに１０^-９以下のＫ_Ｄで特異的に結合する抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌは共に対合して、第１のエピトープ及び第２のエピトープに１０^-１２以下のＫ_Ｄで特異的に結合する抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、第１の生物学的分子及び第２の生物学的分子は、構造的に類似していない。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）の選択では、ディープシークエンシング（ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ウルトラディープシークエンシング（ｕｌｔｒａ－ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、及び／または次世代シークエンシングを含む。

本発明の方法を使用して作製される例示的な抗体には、以下に記載のように、インターロイキン４（ＩＬ４）及びインターロイキン５（ＩＬ５）の両方を結合する抗体、並びに、ＩＬ４及びインターロイキン１３（ＩＬ１３）の両方を結合する抗体が含まれる。これらの抗体の作製成功は、抗体の重鎖可変ドメイン配列の改変は、二重の特異性及び機能を有する抗体作製へ向かうエンジニアリング全般の道筋となり得ることを示している。本明細書に記載のＩＬ４／ＩＬ５及びＩＬ４／ＩＬ１３抗体などを非限定的に含む二重特異性抗体は、２つの経路（冗長または非冗長）を同時に標的にする可能性を有し、また、免疫障害、炎症性障害、及び増殖性障害を非限定的に含むさまざまな疾患及び障害の治療に有用である。

したがって、別の態様では、本発明は、上記の本発明の方法により作製される単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を特徴とする。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、断片はＦａｂまたはｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体はＩｇＧである。

別の態様では、本発明は、図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、７Ａ、７Ｃ、または７Ｄの抗体のいずれか１抗体のアミノ酸配列、を含む単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を特徴とする。

別の態様では、本発明は、以下の６つのＣＤＲ：（ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１；（ｉｉ）アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＤＹＴＳＰＷＴＦ（配列番号１１）を含むＣＤＲＬ３；（ｉｖ）アミノ酸配列ＤＹＤＩＨ（配列番号１４）を含むＣＤＲＨ１；（ｖ）アミノ酸配列ＶＷＩＮＴＥＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫ（配列番号１７）を含むＣＤＲＨ２；及び（ｖｉ）アミノ酸配列ＥＩＬＦＹＧＭＤＹ（配列番号２１）を含むＣＤＲＨ３、を含む単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を特徴とする。

別の態様では、本発明は、以下の６つのＣＤＲ：（ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１；（ｉｉ）アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＤＹＴＳＰＷＴＦ（配列番号１１）を含むＣＤＲＬ３；（ｉｖ）アミノ酸配列ＤＹＦＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲＨ１；（ｖ）アミノ酸配列ＡＧＩＶＹＤＡＴＧＦＴＴＹＡＤＤＦＫ（配列番号１８）を含むＣＤＲＨ２；及び（ｖｉ）アミノ酸配列ＧＧＩＦＹＧＭＤＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲＨ３、を含む単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を特徴とする。

別の態様では、本発明は、以下の６つのＣＤＲ：（ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１；（ｉｉ）アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＤＹＴＰＦＰＬＴＦ（配列番号１２）を含むＣＤＲＬ３；（ｉｖ）アミノ酸配列ＤＹＬＭＨ（配列番号１６）を含むＣＤＲＨ１；（ｖ）アミノ酸配列ＡＶＩＶＳＩＴＧＲＴＹＹＡＤＤＦＫ（配列番号１９）を含むＣＤＲＨ２；及び（ｖｉ）アミノ酸配列ＧＧＩＦＹＧＭＤＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲＨ３、を含む単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を特徴とする。

別の態様では、本発明は、以下の６つのＣＤＲ：（ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１；（ｉｉ）アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＤＹＴＳＰＷＴＦ（配列番号１１）を含むＣＤＲＬ３；（ｉｖ）アミノ酸配列ＤＹＳＭＨ（配列番号１３）を含むＣＤＲＨ１；（ｖ）アミノ酸配列ＧＶＩＦＱＳＧＡＴＹＹＡＤＤＦＫ（配列番号２２）を含むＣＤＲＨ２；及び（ｖｉ）アミノ酸配列ＧＧＩＦＹＧＭＤＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲＨ３、を含む単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を特徴とする。

別の態様では、本発明は、以下の６つのＣＤＲ：（ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１；（ｉｉ）アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＤＹＴＳＰＷＴＦ（配列番号１１）を含むＣＤＲＬ３；（ｉｖ）アミノ酸配列ＤＹＳＭＨ（配列番号１３）を含むＣＤＲＨ１；（ｖ）アミノ酸配列ＧＩＩＦＹＴＧＨＴＹＹＡＤＤＦＫ（配列番号２３）を含むＣＤＲＨ２；及び（ｖｉ）アミノ酸配列ＧＧＩＦＹＧＭＤＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲＨ３、を含む単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を特徴とする。

別の態様では、本発明は、以下の６つのＣＤＲ：（ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１；（ｉｉ）アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＤＹＸ_１Ｘ_２ＰＷＴＦ（配列番号２４）を含むＣＤＲＬ３、ここで、Ｘ_１はＴｈｒ、ｌｉｅ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり、Ｘ_２はＳｅｒまたはＨｉｓである；（ｉｖ）アミノ酸配列ＤＹＦＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲＨ１；（ｖ）アミノ酸配列Ｘ_１ＧＩＶＹＤＡＴＧＦＴＸ_２ＹＡＸ_３Ｘ_４ＦＫ（配列番号２５）を含むＣＤＲＨ２、ここで、Ｘ_３はＡｌａまたはＧｌｙ、Ｘ_２はＴｈｒ、ｌｉｅ、Ｖａｌ、またはＡｌａ、Ｘ_３はＡｓｐ、Ｖａｌ、またはＧｌｕ、及びＸ_４はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ｌｉｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＰｈｅである；及び（ｖｉ）アミノ酸配列ＧＧＩＦＹＧＭ ＤＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲＨ３、を含む単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を特徴とする。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片は、以下の６つのＣＤＲを含む：（ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１；（ｉｉ）アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＤＹＴＨＰＷＴＦ（配列番号２７）を含むＣＤＲＬ３；（ｉｖ）アミノ酸配列ＤＹＦＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲＨ１；（ｖ）アミノ酸配列ＧＧＩＶＹＤＡＴＧＦＴＴＹＡＥＥＦＫ（配列番号２８）を含むＣＤＲＨ２；及び（ｖｉ）アミノ酸配列ＧＧＩＦＹＧＭＤＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲＨ３。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片は、以下の６つのＣＤＲを含む：（ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１；（ｉｉ）アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＤＹＫＨＰＷＴＦ（配列番号３１）を含むＣＤＲＬ３；（ｉｖ）アミノ酸配列ＤＹＦＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲＨ１；（ｖ）アミノ酸配列ＡＧＩＶＹＤＡＴＧＦＴＶＹＡＤＤＦＫ（配列番号３２）を含むＣＤＲＨ２；及び（ｖｉ）アミノ酸配列ＧＧＩＦＹＧＭ ＤＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲＨ３。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片は、アミノ酸配列ＧＲＸ_１ＴＩＴＸ_２ＤＸ_３ＳＴＳＴＸ_４（配列番号２６）を含むフレームワーク領域３（ＦＲ３）をさらに含み、ここで、Ｘ_１はＶａｌまたはＰｈｅ、Ｘ_２はＡｒｇまたはｌｉｅ、Ｘ_３はＴｈｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、またはＰｒｏ、及びＸ_４はＡｌａまたはＶａｌである。

別の態様では、本発明は、配列番号１、５、２９、または３３のアミノ酸配列から選択される軽鎖可変領域、及び配列番号２、３、４、６、７、８、３０、または３４から選択される重鎖可変領域を含む、単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を特徴とする。いくつかの実施形態では、抗体、またはその抗原結合性断片は、ＩＬ４を５００ｎＭ以下のＫｄで、また、ＩＬ５を約９００ｎＭ以下のＫｄで結合する。いくつかの実施形態では、抗体、またはその抗原結合性断片は、ＩＬ４を１００ｎＭ以下のＫｄで、また、ＩＬ５を約１００ｎＭ以下のＫｄで結合する。いくつかの実施形態では、抗体、またはその抗原結合性断片は、ＩＬ４を１０ｎＭ以下のＫｄで、また、ＩＬ５を約５０ｎＭ以下のＫｄで結合する。その他の実施形態では、単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片は、ＩＬ４を５００ｎＭ以下のＫｄで、また、ＩＬ１３を約９００ｎＭ以下のＫｄで結合する。いくつかの実施形態では、抗体、またはその抗原結合性断片は、ＩＬ４を１００ｎＭ以下のＫｄで、また、ＩＬ１３を約１００ｎＭ以下のＫｄで結合する。いくつかの実施形態では、抗体、またはその抗原結合性断片は、ＩＬ４、ＩＬ５またはＩＬ１３がその受容体に結合するのを阻害またはブロッキングする。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗原結合性断片はＦａｂ断片または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、フレームワーク配列の少なくとも一部はヒトのコンセンサスフレームワーク配列である。いくつかの実施形態では、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である。

上述の二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片のうち、いずれか一つを含む医薬組成物も提供される。別の態様では、本発明は、本明細書に開示する二重特異性抗体のいずれかをコードする単離された核酸を特徴とし、かかる抗体を発現させるためのベクター（例えば、発現ベクター）を含む。

別の態様では、本発明は、上述の核酸及び／またはベクターを含む宿主細胞を特徴とする。いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳類の細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）である。その他の実施形態では、宿主細胞は原核細胞（例えば、大腸菌細胞）である。上述の二重特異性抗体のいずれか一つを作製する方法も提供され、かかる方法は、二重特異性抗体を産生する宿主細胞を培養し、その宿主細胞または培地から二重特異性抗体を回収することを含む。

別の態様では、本発明は、被検体の喘息を治療する方法を特徴とし、かかる方法は、本明細書に開示する二重特異性抗体のいずれかを被検体の喘息を治療または予防するのに十分な期間かつ量で被験者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＩｇＥ拮抗薬、抗ヒスタミン剤、テオフィリン、サルブタモール、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、クロモグリク酸ナトリウム、ステロイド剤、及び抗炎症剤からなる群から選択される喘息治療を少なくとも一つ追加で投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、喘息はアレルギー性喘息である。

さらに別の態様では、本発明は、被検体の増殖性障害を治療する方法を特徴とし、かかる方法は、本明細書に開示する二重特異性抗体のいずれかを被検体の増殖性障害を治療するのに十分な期間かつ量で被験者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、増殖性障害は癌である。いくつかの実施形態では、方法は、化学療法薬、細胞障害剤、及び抗血管新生薬からなる群から選択される追加の抗増殖剤を被検体に投与することをさらに含む。

図１Ａ及び１Ｂは、ｈｕ１９Ｃ１１抗体のＣＤＲの変異誘発マッピングを示すグラフである。ｈｕ１９Ｃ１１ Ｆａｂ改変体の相対的抗原結合親和性を測定するために、抗ＩＬ４ ｈｕ１９Ｃ１１野生型（ｗｔ）またはＬＣ ＣＤＲアラニン変異体を提示している系列希釈したファージと、ＥＬＩＳＡウェル上にコーティングされている抗ｇＤ抗体（Ａ）またはＩＬ４（Ｂ）との結合を、Ｆａｂ発現及び抗Ｍ１３ファージ－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体により検出し、それぞれ、抗原結合性を定量した。ｇＤは、軽鎖Ｃ末端に融合させた発現ペプチドタグである。抗ｇＤ抗体は、ＥＬＩＳＡウェル上に直接コーティングし、一方、ＩＬ４は、ＥＬＩＳＡウェル上にコーティングされている非ブロッキング抗ＩＬ４抗体で捕捉した。 図１Ｃは、図１Ａ及び１Ｂでのアッセイを実施して、Ｆａｂ改変体を提示しているファージの相対的ＩＬ４結合親和性を比較することにより、ＣＤＲの個々の部位でのアラニン変異の影響を調べたものをグラフに示している。アミノ酸の一文字表記を使用している。データを線形回帰モデルに当てはめてから、ＩＬ４結合の傾き（対ファージ濃度）をＦａｂ発現の傾きで割り、相対的なＩＬ４結合強度を測定した。低い値（点線より下）は、ＩＬ４結合親和性がｈｕ１９１１ ｗｔより低く破壊的変異であることを示しているとみなした。 図２Ａは、トラスツズマブＦａｂ（ＰＤＢ：１ＦＤＶ）の構造を上から見た図にｈｕ１９Ｃ１１のＩＬ４結合残基の重要残基をマッピングして示す構造図である。ｈｕ１９Ｃ１１の構造モデルを、重鎖及び軽鎖のテンプレートに、それぞれ、ＰＯＢエントリーの３ＳＱＯ及び３ＢＥＩを使用しＭＯＥを使用して作製した。ＩＬ４結合に重要な残基は、Ｋａｂａｔ番号付けにおける、ＬＣの３１、３２、５０、５３、９１、９２、残基及びＨＣの３１、３２、９６、９８、及び９９残基である。残基は、抗原結合部位を上から見た図中、モデル構造に赤で色付けされている。ファージに提示されたｈｕ１９Ｃ１１ Ｆａｂ改変体のライブラリーを部位特異的突然変異により作製した。２０アミノ酸すべてが野生型残基に対する選択性を有するＨＣ残基を太字で表示し、表示されている他のＨＣ残基及びＬＣ残基は、変異を制限し天然の多様性を模倣させた。 図２Ｂは、第２の抗原特異性をｈｕ１９Ｃ１１に動員するためのコンビナトリアルライブラリー設計を示す表である。親ｈｕ１９Ｃ１１野生型からの変異を有する抗ＩＬ５特異的（５Ａ）、抗ＩＬ４／５特異的（Ｅ７、Ｂ１）、及び抗ＩＬ４／１３特異的（Ｆ１、Ｆ２）な各抗体クローンを含む、選択されたクローンのＣＤＲ配列を示す。ライブラリーでランダム化され単離されたクローンで変異している残基に、それらの特性により影を付けた。すなわち、Ｙ、Ｗ、Ｆは芳香族側鎖を有し；Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍは疎水性；Ｋ、Ｒ、Ｈは塩基性；Ｄ、Ｅは酸性；Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑは極性；及びＰ、Ｇである。ファージ競合アッセイのＩＣ５０で測定した相対的抗原結合親和性が示されている。まず、Ｆａｂ提示ファージを、それぞれの抗原の系列希釈と共に溶液中で２時間インキュベートし、次いで、結合しなかったファージを抗原でコーティングしたＥＬＩＳＡウェルにより短時間捕捉し、抗Ｍ１３－ＨＲＰ複合体で検出した。抗原でコーティングしたウェルへのファージの結合を５０％阻害する抗原濃度をＩＣ５０として計算した。ＮＢは、抗原でコーティングしたウェルへのファージクローンの検出可能な直接的な結合は見られなかったことを意味する。 図３は、ＩＬ４結合能について、作製した１０のファージ提示ライブラリー（２１４４－１から２１４４－１０）に行った滴定を示すグラフである。 図４Ａは、ｈｕ１９Ｃ１１の二重特異性抗ＩＬ４／ＩＬ５改変体である（Ｅ７（配列番号１）及びＢ１（配列番号５））、並びに、抗ＩＬ５特異的５Ａ（配列番号１）の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列にアラインメントを行い、抗ＩＬ４特異的ｈｕ１９Ｃ１１（配列番号１）と整列させたものを示す。 図４Ｂは、ｈｕ１９Ｃ１１の二重特異性抗ＩＬ４／ＩＬ５改変体（Ｅ７（配列番号４）及びＢ１（配列番号６））、並びに、抗ＩＬ５特異的５Ａ（配列番号３）の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列にアラインメントを行い、抗ＩＬ４特異的ｈｕ１９Ｃ１１（配列番号２）と整列させたものを示す。 図４Ｃは、ｈｕ１９Ｃ１１の二重特異性抗ＩＬ４／ＩＬ１３改変体（Ｆ１（配列番号７）及びＦ２（配列番号８））の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列にアラインメントを行い、抗ＩＬ４特異的ｈｕ１９Ｃ１１（配列番号２）と整列させたものを示す。 図５は、ＩｇＧとした、ｈｕ１９Ｃ１１の選択された改変体の二重特異性を示すグラフである。ｈｕ１９Ｃ１１の選択された改変体の抗原結合特異性について、ヒトＩｇＧ１フォーマットのこれらの改変体と、標的抗原（複数可）またはＥＬＩＳＡウェル上にコーティングした無関係な数種のタンパク質との２５０ｎＭ での結合とし、抗Ｆｃ抗体－ＨＲＰ複合体を用いて検出して評価した。 図６は、指定の抗体濃度で、ＩＬ５をその受容体との相互作用でブロッキングした場合の、ｈｕ１９Ｃ１１の二重特異性改変体（抗ＩＬ４特異的野生型：１９Ｃ１１；抗ｌＬ５特異的：５Ａ；及び抗ＩＬ４／５特異的：Ｅ７及びＢ１）の結合特異性を特徴付けしたものを示すグラフである。ＩｇＧとしてのヒト化１９Ｃ１１または改変体の存在下、その濃度を増加させていった場合の、ＥＬＩＳＡウェル上に固定化されたＩＬ５に結合したビオチン化ＩＬ５受容体αのレベルをストレプトアビジン－ＨＲＰ複合体を用いて検出した。 図７Ａは、ＩＬ４／ＩＬ５特異的Ｅ７の親和性が成熟した改変体のアミノ酸配列、及び、ファージ競合アッセイで測定したこれら改変体の標的抗原に対する相対的親和性を示す表である。親和性を改善するため、「相同」（太字）、「限定的」（斜体字）及び「部分的（ｓｏｆｔ）」（灰色）ランダム化法、すなわち、それぞれ、野生型で相同なアミノ酸、天然抗体に基づく限定的多様性、または野生型約５０％とそれ以外の全アミノ酸約５０％がランダム化される方法で変異させた選択された残基を用いて、Ｅ７改変体を提示しているファージライブラリーを構築した。ＣＤＲ Ｈ２は、主に、新たに動員されたＩＬ５への結合機能を巧妙に最適化するために相同な変異下にあった。他のＣＤＲについては、ＩＬ４結合にとって重要ではない部位を標的とした。選択されたクローンの配列をＥ７と整列させ、変異が示されている。各クローンの相対的親和性を、上記のようにファージＩＣ５０により評価した。 図７Ｂは、Ｅ７並びに、Ｆａｂとして精製した、親和性が成熟したその改変体である１Ｃ３６及び１Ｃ６０について、ヒトＩＬ５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＩＬ４で固定化したＣＭ５センサーチップを使用し２５℃でＢｉａｃｏｒｅにより測定した、それぞれの親和性を示す表である。 図７Ｃは、Ｅ７の親和性が改善された二重特異性抗ＩＬ４／ＩＬ５改変体である１Ｃ３６（配列番号２９）及び１Ｃ６０（配列番号３３）の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列にアラインメントを行ったものを、Ｅ７の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）と整列させて示している。 図７Ｄは、Ｅ７の親和性が改善された二重特異性抗ＩＬ４／ＩＬ５改変体である１Ｃ３６（配列番号３０）及び１Ｃ６０（配列番号３４）の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列にアラインメントを行ったものを、Ｅ７の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号４）と整列させて示している。 図８Ａ及び８Ｂは、Ｅ７及びＥ７の親和性が成熟した改変体（１Ｃ３６及び１Ｃ６０）の結合特異性の特徴付けを示すグラフである。ＩｇＧ（１００ｎＭ）としてのＥ７及びＥ７の親和性が改善された改変体の、固定化した抗原及びＥＬＩＳＡプレート上の無関係なタンパク質への直接的な結合を抗ＩｇＧ－ＨＲＰにより検出した（Ａ）。緩衝液（ＰＢＳ）または５０ｎＭのＥ７、１Ｃ３６、若しくは１Ｃ６０の存在下で、ＥＬＩＳＡウェル上にコーティングしたＩＬ５受容体へのビオチン化ＩＬ５の結合をストレプトアビジン－ＨＲＰ複合体により検出した（Ｂ）。

多くの疾患経路は、１種以上のタンパク質または一つ以上の機能を有する１種のタンパク質の作用により発現する。例えば、アレルギー性、炎症性、または自己免疫性障害（例えば、喘息）に、複数のサイトカインが関与していることが多い。二重特異性抗体は、一つ以上の抗原を標的にすることが所望される治療用途及び診断用途の両方において有用である。我々は、二重特異性抗体を作製するための新規な方法を発見した。抗体のＶ_Ｌが抗体－抗原相互作用に重要な残基を含んでいる場合には、このような抗体は、Ｖ_Ｈ残基を単独で、または別のＶ_Ｌ及びフレームワーク残基と組み合わせて改変することにより多様化させることができる。

一般に、本発明の方法は、抗体のＶ_Ｈを多様化させてライブラリーに安定して発現させることが可能な改変体を作製することを含む。一般に、第１のエピトープに特異的に結合するが第２のエピトープには結合せず、また、Ｖ_Ｌの位置３２、５０、または９１（Ｋａｂａｔ番号付けによる）に見られる任意の１、２、または３個のアミノ酸において静電的または疎水性残基を有するとして特徴づけられる抗体に、Ｖ_Ｈ内の１個以上のアミノ酸残基（例えば、溶媒露出アミノ酸残基）における改変を行う。その後、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌを発現させ、第１及び第２のエピトープに特異的に結合することができる多様化された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を、発現したＶ_Ｈ及びＶ_Ｌから選択する。

本発明の方法を使用して作製される例示的な抗体には、以下に記載のように、インターロイキン４（ＩＬ４）及びインターロイキン５（ＩＬ５）の両方を結合する抗体、並びに、ＩＬ４及びインターロイキン１３（ＩＬ１３）の両方を結合する抗体が含まれる。これらの抗体により、ＩＬ４抗体の重鎖可変ドメイン（例えば、ＣＤＲ）内での変異が、ＩＬ４と、別の無関係のタンパク質とに対する二重の結合能を付与することが示され、また、二重特異性を付与するためにＶ_Ｈ内の残基に改変を行うという一般方法の概念が立証される。本明細書に記載する、ＩＬ４／ＩＬ５及びＩＬ４／ＩＬ１３抗体などを非限定的に含む二重特異性抗体は、複数の抗原、例えば、サイトカインの冗長及び非冗長経路を同時に標的にする可能性を有しており、サイトカイン介在性の疾患（例えば、喘息）など、さまざまな疾患及び障害の治療に有用となる。

Ｉ．定義
用語「多重特異性抗体」は、最も広い意味において使用され、具体的には、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含み、Ｖ_ＨＶ_Ｌユニットが、多エピトープに対する特異性（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を有している（すなわち、１個の生物学的分子上の異なる２つのエピトープまたは異なる生物学的分子上の各エピトープに結合できる）抗体が含まれる。このような多重特異性抗体には、完全長抗体、２つ以上のＶ_Ｌドメイン及びＶ_Ｈドメインを有する抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ及びトリアボディのような抗体断片、共有結合または非共有結合で結合している抗体断片が挙げられるが、これに限定されるものではない。「多エピトープに対する特異性（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」とは、同一または異なる標的（複数可）上の異なる２つ以上のエピトープに特異的に結合する能力をいう。「二重の特異性（ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」または「二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」とは、同一または異なる標的（複数可）上の２つの異なるエピトープに特異的に結合する能力をいう。しかしながら、二重特異的な（ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体とは対照的に、二重に特異的な（ｄｕａＬ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体は天然ＩｇＧ抗体の型をしており、そこでは、抗原を結合する２本の腕は、アミノ酸配列において同一であり、それぞれのＦａｂ腕が２種の抗原を認識できる。二重の特異性により、抗体は、単一ＦａｂまたはＩｇＧ分子として２つの異なる抗原と高い親和性で相互作用することができる。一実施形態によると、ＩｇＧ１形をした多重特異性抗体は、５μＭ～０．００１ｐＭ、３μＭ～０．００１ｐＭ、１μＭ～０．００１ｐＭ、０．５μＭ～０．００１ｐＭまたは０．１μＭ～０．００１ｐＭの親和性で各エピトープに結合する。「単一特異性」とは、一つのエピトープにのみ結合する能力をいう。

一般に、抗体は、２本の同一軽（Ｌ）鎖及び２本の同一重（Ｈ）鎖で構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である、基本的な４鎖抗体単位を含む（ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる付加的なポリペプチドを備えた５個の基本的ヘテロ四量体単位で構成され、そのため１０個の抗原結合部位を含有し、また、分泌ＩｇＡ抗体は、重合して、Ｊ鎖と共に２～５個の基本的４鎖ユニットを含む多価集合体を形成することができる）。ＩｇＧの場合、４鎖ユニットは一般に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、一つのジスルフィド共有結合によってＨ鎖に連結されており、２本のＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに応じて一つ以上のジスルフィド結合で互いに連結されている。各Ｈ鎖及びＬ鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有している。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有し、それに続いてα鎖及びγ鎖では３つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）を、またμ及びεの各アイソタイプでは４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を有し，そのもう一端に定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）が続く。Ｖ_ＬはＶ_Ｈと並んでおり、Ｃ_Ｌは重鎖（Ｃ_Ｈ１）の第１の定常ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間に界面を形成すると考えられている。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは互いに対合して抗原結合部位を形成する。抗体の各種クラスの構造及び特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｐ． Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ． Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ． Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，７１ページ及び第６章を参照のこと。いかなる脊椎動物由来の軽鎖でも、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に区別される型のいずれかに割り当てることができる。免疫グロブリンは、その重鎖（Ｃ_Ｈ）の定常ドメインのアミノ酸配列により、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つのクラス、すなわち、α、δ、γ、ε、及びμという重鎖をそれぞれ有する、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがある。γ及びαの両クラスはさらに，Ｃ_Ｈの配列及び機能における比較的小規模な相違に基づいてサブクラスに分けられ、例えば、ヒトでは、以下のサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２が発現する。

用語「可変」とは、可変ドメインの特定のセグメントの配列が抗体間で大きく異なっていることをいう。可変ドメインまたは「Ｖ」ドメインは抗原結合を仲介し、特定の抗体の、その対応する特定の抗原に対する特異性を決定する。しかし、可変性が、可変ドメインの１１０アミノ酸長にわたって均等に分布しているわけではない。代わりに、Ｖ領域は、アミノ酸が１５～３０個のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的インバリアントな一続きの部分（ｓｔｒｅｔｃｈ）が、長さ９～１２アミノ酸の「超可変領域」と呼ばれる可変性が極めて高い、短い領域で区切られた構成になっている。天然型の重鎖及び軽鎖の各可変ドメインは４つのＦＲを含み、これらのＦＲは主としてベータシート立体配置をとっており、これらを連結する３つの超可変領域はベータシート構造をつなぐループを形成し、場合によっては、この構造の一部を形成する。各鎖の超可変領域はＦＲ領域によって近接して結合しており、別の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体を抗原に結合させることに直接関与はしていないが、抗体依存性細胞障害において抗体が関与するような、さまざまなエフェクター機能を示す（ＡＤＣＣ）。

本明細書で使用する場合、用語「超可変領域」とは、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、Ｖ_Ｌの残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）及び８９～９７（Ｌ３）の周辺、並びに、Ｖ_Ｈの残基２６～３５（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）の周辺（一実施形態では、Ｈ１は、残基３１～３５の周辺）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））、及び／または、「超可変ループ」の残基（例えば、Ｖ_Ｌの残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、及び９１～９６（Ｌ３）、並びにＶ_Ｈの２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））を含む。

本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の母集団から得られる抗体、すなわち、存在したとしても一般には少量である、モノクローナル抗体作製中に発生し得る改変体を除いては、その母集団を構成する個々の抗体は実質的に同様であり、同一のエピトープ（複数可）に結合する抗体をいう。このようなモノクローナル抗体には、典型的には、標的を結合する可変領域を含む抗体が挙げられ、これにおいて、かかる抗体は、複数の抗体からその抗体を選択することを含む過程により得られたものである。例えば、かかる選択工程は、ハイブリドーマクローン、ファージクローンまたは組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンから特異なクローンを選択することであり得る。選択した抗体は、例えば、標的に対する親和性の向上、抗体のヒト化、細胞培養におけるその産生の改善、ｉｎ ｖｉｖｏでのその免疫原性の低下、多重特異性抗体の作製等のためにさらに改変させることが可能であること、及び、改変させた可変領域配列を含む抗体もまた本発明のモノクローナル抗体であることを理解されるべきである。モノクローナル抗体調製物は、その特異性に加え、典型的に他の免疫グロブリンが混入していない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を指すものであって、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって使用するモノクローナル抗体は、多種多様な技術で作製されてよく、これらとして、ハイブリドーマ方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ． １９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３－６８１，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組換えＤＮＡ方法（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，８１６，５６７を参照のこと）、ファージディスプレイ法（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）；Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）を参照のこと）、並びに、ヒト免疫グロブリンの座位の一部若しくは全部またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物からヒト抗体またはヒト様抗体を産生させる技術（例えば、Ｗ０９８／２４８９３、ＷＯ／９６３４０９６、ＷＯ／９６３３７３５、及びＷＯ／９１１０７４１、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５－２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，５４５，８０６、５，５６９，８２５、５，５９１，６６９（以上、すべてＧｅｎＰｈａｒｍ）；５，５４５，８０７；ＷＯ９７／１７８５２、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；及び５，６６１，０１６、並びに、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９－７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８５６－８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８１２－８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：８４５－８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：８２６（１９９６）；及びＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６５－９３（１９９５）を参照のこと）が挙げられる。

本明細書のモノクローナル抗体には、具体的には、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、及び親和性成熟抗体が含まれる。キメラ抗体とは、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定種由来の抗体または特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、その鎖（複数可）の残りの部分は、別の種由来の抗体または別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同な抗体であり、所望の生物活性を示す限りにおいては、このような抗体の断片についても同様である（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ． Ｎｏ．４，８１６，５６７；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））。本明細書で目的象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿等）及びヒトの定常領域配列に由来する可変ドメイン抗原結合性配列を含む。

非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト抗体由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分は、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエント抗体の超可変領域由来の残基が、所望の抗体特異性、親和性、及び能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種の超可変領域（ドナー抗体）由来の残基で置換されている。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基をみ得る。これらの修飾を、抗体性能をさらに高めるために行われる。一般に、かかるヒト化抗体には、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部が含まれることになり、ここで、超可変ループの全部または実質的に全部は、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、また、各ＦＲの全部または実質的に全部はヒト免疫グロブリン配列の各ＦＲである。ヒト化抗体には、任意選択で、少なくとも免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の一部が含まれることにもなる。詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照のこと。

「ヒト抗体」は、ヒトにより産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列をもつ抗体、及び／またはヒト抗体を製造するための任意の技術を使用して作製された抗体である。ヒト抗体の本定義では、具体的に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体は除外される。

「親和性が成熟した」抗体は、その抗体の一つ以上のＣＤＲに一つ以上の改変を有する抗体であり、かかる改変（複数可）は、これらを有していない親抗体より抗原に対する親和性を改善させる改変である。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対しナノモル、さらにはピコモルの親和性を有するであろう。親和性成熟抗体は、当技術分野で公知の手順により作製される。Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９－８３（１９９２）には、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインのシャッフリングによる親和性成熟が記載されている。ＣＤＲ及び／またはフレームワーク残基のランダム変異誘発は、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３８０９－１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ １６９：１４７－５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４－２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０－１９（１９９５）；及びＨａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９－９６（１９９２）により記載されている。

「完全な」抗体とは、抗原結合部位並びにＣ_Ｌ及び少なくとも重鎖定常ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３を含む抗体である。定常ドメインは、野生型配列の定常ドメイン（例えばヒトの野生型配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列改変体であり得る。好ましくは、完全抗体は一つ以上のエフェクター機能を有する。

「抗体断片」は、完全抗体の一部分、好ましくは完全抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；線状抗体（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，６４１，８７０の実施例２；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５）を参照のこと）；一本鎖抗体分子；並びに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。

表現「線状抗体」とは、一般に、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７－１ ０６２（１９９５）に記載の抗体をいう。簡単に述べれば、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する、一対の縦列Ｆｄセグメント（ＶＨ－Ｃ_Ｈ１－ＶＨ－Ｃ_Ｈ１）を含む。線状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。

抗体をパパインで消化すると、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一な抗原結合断片と、残りの「Ｆｃ」断片（その名称は、容易に結晶化できることを表す）が得られる。Ｆａｂ断片は、全Ｌ鎖と共にＨ鎖（Ｖ_Ｈ）の可変領域ドメイン及び１重鎖（Ｃ_Ｈ１）の第１の定常ドメインで構成される。抗体をペプシンで処理すると、おおざっぱに言えば、ジスルフィド結合で連結された２つのＦａｂ断片に相当する１個の大きなＦ（ａｂ’）_２断片が得られ、これは、２価の抗原結合活性を有し、なおも抗原と架橋できる。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域からの一つ以上のシステインを含む数個の残基をさらに有している点でＦａｂ断片とは異なる。本明細書でＦａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ’を指す。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は、元々はＦａｂ’断片の対として作製されたもので、その間にヒンジのシステイン残基を有する。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。

Ｆｃ断片は、ジスルフィドにより共に保持されている両Ｈ鎖のカルボキシ末端部を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列により決定される；この領域もまた、特定の種類の細胞で見られるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分である。

「Ｆｖ」は、一つの重鎖可変領域ドメインと一つの軽鎖可変領域ドメインとが強い非共有結合で会合している二量体からなる。これらの２ドメインをかけると、アミノ酸残基の抗原結合に寄与し抗原結合特異性を抗体に付与する超可変ループは６つになる（Ｈ鎖３ループ、Ｌ鎖３ループ）。しかし、単一の可変ドメイン（または、一つの抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でも、抗原を認識し結合する能力を有するが、完全な結合部位よりは親和性が低いことが多い。

「一本鎖Ｆｖ」は「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」と略記されるが、これらは、単一のポリペプチド鎖内に連結されたＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合に所望される構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメイン間にさらに含む。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ １９９５を参照のこと。

用語「ダイアボディ」とは、鎖内ではなく鎖間でＶドメインの対を形成させ、その結果として、二価の断片、すなわち、２つの抗原結合部位を有する断片を得られるように、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインの間に短いリンカー（約５～１０残基）を持つｓＦｖ断片（前段落を参照のこと）を構築することにより調製される小型の抗体断片をいう。二重特異性ダイアボディは、２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体であり、そこでは、２つの抗体のＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインは異なるポリペプチド鎖上に存在する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）にさらに詳細に記載されている。

「静電的」とは、電荷を有することを意味する。一般に、静電的アミノ酸は極性または電荷を持つ側鎖を有する。極性側鎖を持つアミノ酸の例としては、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられる。負電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸の例としては、アスパラギン酸、及びグルタミン酸が挙げられる。正電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸の例としては、リシン、アルギニン、及びヒスチジンが挙げられる。

「疎水性の」とは、水と適合しない、すなわち、水との溶解、吸収、または混合が容易に起こらないことを意味する。一般に、疎水性アミノ酸は非極性側鎖を有しており、その例には、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、及びバリンが挙げられる。

用語「サイトカイン」は、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用する一細胞集団により放出されるタンパク質の総称である。サイトカインの例には、リンホカイン、モノカイン、及び一般ポリペプチドホルモンが含まれる。これらのサイトカインとしては、ヒト成長ホルモン、Ｎ－メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン及びプロインスリン；レラキシン及びプロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝成長因子；線維ＢＬＡＳＴ増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子α及びβ；ミュラー管阻害因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポチエン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ－βのような神経成長因子；血小板成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）；ＴＧＦ－α及びＴＧＦ－βのようなトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン－α、－β、及び－γなどのインターフェロン；マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ１、ＩＬ１α、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ１１、ＩＬ１２、及びＩＬ１３などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ－αまたはＴＮＦ－βなどの腫瘍壊死因子；並びに、ＬＩＦ及びＫｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が挙げられる。本発明において、サイトカインという用語には、天然物質由来または組換細胞培養由来であり、野生型配列のサイトカインの生物学的に活性な同等物が含まれる。

本明細書で使用する場合、「コドンセット」とは、所望の改変アミノ酸をコードするために使用される、一組の異なるヌクレオチドのトリプレットをいう。一組のオリゴヌクレオチドは、コドンセットにより与えられるヌクレオチドトリプレットの可能な組み合わせすべてを表し、所望のアミノ酸群をコードする配列を含み、例えば、固相合成法により合成できる。コドン表記の標準形式はＩＵＢコードの形式で、これは当技術分野で公知であり本明細書に記載される。コドンセットは典型的には大文字３文字が斜字体、例えば、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＤＶＫ等で表される（例えば、ＮＮＫコドンは、コドンの位置１及び２がＮ＝Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ、位置３の等モル比でのＫ＝Ｇ／Ｔで２０個すべての天然アミノ酸をコードすることを指す）。したがって、本明細書で「ランダムではないコドンセット」っと言う場合、本明細書に記載するアミノ酸選択の基準を部分的、好ましくは完全に満たす選択アミノ酸をコードするコドンセットのことをいう。特定の位置に選択ヌクレオチドの「縮重」があるオリゴヌクレオチドの合成は当該技術分野で公知である、例えばＴＲＩＭ法がある（Ｋｎａｐｐｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７－８６，１９９９）；Ｇａｒｒａｒｄ ａｎｄ Ｈｅｎｎｅｒ，Ｇｅｎｅ １２８：１０３、１９９３）。特定のコドンセットを有するオリゴヌクレオチドのこのようなセットは、市販の核酸合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡより入手可能）を使用して合成できるが、市販のものを利用してもよい（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）。したがって、特定のコドンセットを有する一組の合成オリゴヌクレオチドには、典型的には、配列が異なる複数のオリゴヌクレオチドが含まれることになり、その違いは、配列全体の中にあるコドンセットにより確立されるものである。発明により使用されるオリゴヌクレオチドは、可変ドメインの核酸テンプレートに対するハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、必ずというわけではないが、有用な制限酵素部位（例えば、クローニングのため）を含むことができる。

目的抗原「を結合する」本発明の抗体は、その抗体が、抗原を発現しているタンパク質または細胞または組織を標的にする上で診断薬及び／または治療薬として有用であり、他のタンパク質と有意な交差反応を起こさないよう、十分な親和性で抗原を結合する抗体である。このような実施形態では、抗体が「非標的」タンパク質に結合する程度は、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）解析または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）またはＥＬＩＳＡで測定した場合、抗体がその特定標的タンパク質に結合する程度の約１０％未満となるであろう。標的分子に対する抗体の結合に関して、特定のポリペプチド標的または特定のポリペプチド上のエピトープと「特異的結合」または「特異的に結合する」または「に対して特異的である」という用語は、非特異的相互作用との相違が測定できる結合を意味する。特異的結合は、例えば、対照分子の結合と比較した、ある分子の結合を求めることにより測定できる。例えば、特異的結合は、標的分子、例えば、過剰の非標識標的分子に似た対照分子と競合させることにより判定できる。この場合、標識した標的分子のプローブへの結合が、過剰の未標識標的分子により競合的に阻害されれば、特異的結合であるとされる。本発明において、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープと「特異的結合」または「特異的に結合する」または「に対し特異的である」という用語は、例えば、標的に対するＫ_Ｄが１０^－４Ｍ以下、代替え的に１０^－５Ｍ以下、代替え的に１０^－６Ｍ以下、代替え的に１０^－７Ｍ以下、代替え的に１０^－８Ｍ以下、代替え的に１０^－９Ｍ以下、代替え的に１０^－１０Ｍ以下、代替え的に１０^－１１Ｍ以下、代替え的に１０^－１２Ｍ以下であるか、またはＫ_Ｄが１０^－４Ｍ～１０^－１２Ｍまたは１０^－６Ｍ～１０^－１０Ｍまたは１０^－７Ｍ～１０^－９Ｍの範囲にある分子で表され得る。当業者に認識されるように、親和性とＫ_Ｄ値は逆相関している。抗原の親和性が高いと測定したＫ_Ｄ値は低くなる。一実施形態では、用語「特異的結合」とは、ある分子が、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合し、他の任意のポリペプチドまたはポリペプチドのエピトープには実質的に結合しない場合の結合をいう。

本発明のポリペプチドについて「生物学的に活性である」及び「生物学的活性」及び「生物学的特徴」とは、他に明記しない限り、生物学的分子に結合する能力を有することを意味する。

「生物学的分子」とは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、及びその組み合わせをいう。一実施形態では、生物学的分子天然に存在する。

「単離された」とは、本明細書に開示するさまざまな抗体の記載で使用される場合、その抗体を発現した細胞または細胞培養から同定及び分離及び／または回収された抗体を意味する。その天然環境の汚染成分とは、ポリペプチドの診断または治療への使用を典型的には妨げると考えられる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質を含めることができる。好ましい実施形態では、抗体は、（１）スピニングカップシークエネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を使用して、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（２）クマシーブルーまたは、好ましくは、銀染色を用いた還元条件または非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均一になるまで精製が行われる。ポリペプチドの天然環境の少なくとも１構成成分は存在しないことになるため、単離された抗体には、組換え型細胞内のｉｎ ｓｉｔｕ抗体が含まれる。しかし、通常は、単離されたポリペプチドは、少なくとも一つの精製工程により調製されることになる。

用語「制御配列」とは、特定の宿主生物に機能的に連結されたコード配列を発現させるために必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に好適な制御配列には、例えば、プロモーター、任意選択でオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを使用することで知られている。

核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれているときに「機能的に連結」している。例えば、あるプレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されているならば、そのポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結している；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に機能的に連結している；または、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするような位置にあれば、コード配列に機能的に連結している。一般に、「機能的に連結されている」とは、連結されているＤＮＡ配列が互いに近接している、また、分泌リーダーの場合は、配列が隣接しリーディングフェーズ（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位がない場合は、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーを従来の実施方法に従い使用する。

本明細書で同定されたポリペプチド配列について「パーセント（％）のアミノ酸配列同一性」とは、配列アラインメント後、また、配列同一性パーセントを最大にするために必要な場合はギャップを挿入した後に、比較対象ポリペプチド内のアミノ酸残基と同一な候補配列内アミノ酸残基の割合であり、いかなる保存的置換も配列同一と見なさないものと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを求めるためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを使用して、従来技術の範囲であるさまざまな方法で達成可能である。当業者は、比較対象配列の完全長にわたり最大アライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含め、アライメント測定に適切なパラメータを決定できる。しかしながら、本明細書での目的のため、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成されている。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社により作成されたプログラムで、そのソースコードはユーザー証拠資料と共に米国著作権局（Ｕ．Ｓ． Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ，洗浄ｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、そこで、米国著作権登録番号（Ｕ．Ｓ． Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｎｏ．）ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａにより公開されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄで使用するためにコンパイルしなければならない。配列比較パラメータはすべてＡＬＩＧＮ－２プログラムに設定されており変更することはない。

本明細書に記載するアミノ酸配列は、特に明記しない限り隣接アミノ酸配列である。

本発明による「構造的に類似していない」生物学的分子とは、同一クラスではない生物学的分子（タンパク質、核酸、脂質、炭水化物等）、または、例えば、タンパク質に言及する場合は互いにアミノ酸同一性６０％未満、アミノ酸同一性５０％未満、アミノ酸同一性４０％未満、アミノ酸同一性３０％未満、アミノ酸同一性２０％未満またはアミノ酸同一性１０％未満である生物学的分子をいう。

ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は当業者は容易に決定でき、一般に、プローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に応じ経験的に計算される。一般に、プローブが長いほど適切なアニーリングに必要な温度は高くなり、プローブが短いほど温度は低くてすむ。ハイブリダイゼーションは一般に、相補鎖がその融解温度を下回る環境にあるときの変性ＤＮＡが再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間に所望される相同性の程度が高いほど、使用可能な相対温度は高い。結果として、相対温度が高ければ、その反応条件は、よりストリンジェントになる傾向があり、温度が低ければその傾向は小さいということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに関するさらなる詳細及び説明は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照のこと。

「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、本明細書で定義されるように、（１）洗浄のために、低イオン強度及び高温、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃にて用いる；（２）ハイブリダイゼーション中、ホルムアミドなどの変性剤、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５リン酸ナトリウム緩衝液、及び７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを４２℃で用いる；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０ｐｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％デキストラン硫酸を用いる溶液中で４２℃にて一晩ハイブリダイゼーションを行い、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃にて１０分洗浄した後、５５℃で、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる、１０分間の高ストリンジェンシー洗浄を行う、という条件により同定可能である．

「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９による記載のように同定可能であり、洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、及びＳＤＳの％）をストリンジェンシーを上記より低くして使用することが含まれる。中程度にストリンジェントな条件の一例では、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍｌの断片化処理済み変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で３７℃にて一晩インキュベーションし、その後、フィルターを１×ＳＳＣ中で約３７～５０℃にて洗浄する。当業者は、プローブ長等のような因子に合わせて温度、イオン強度などを必要に応じ調整する方法を認識するであろう。

抗体「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（野生型配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列改変体Ｆｃ領域）に起因し、抗体アイソタイプにより異なる生物学的活性をいう。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞活性化が含まれる。

「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」すなわち「ＡＤＣＣ」とは細胞傷害の一形態であり、そこでは、分泌されてから、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合したＩｇにより、これらの細胞傷害性エフェクター細胞は抗原担持標的細胞に特異的に結合できるようになり、その後、標的細胞を細胞毒で死滅させ得る。抗体は細胞傷害性細胞を「装備」しており、こうした殺傷にはこの装備が絶対的に必要である。ＡＤＣＣを媒介する主要細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞で発現するＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－９２（１９９１）の４６４頁、表３にまとめられている。目的分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，５００，３６２または５，８２１，３３７に記載のようなｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを実施できる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。別法または追加として、目的分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルで評価できる。

「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表す。好ましいＦｃＲは野生型配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するＦｃＲであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が含まれ、アレル変異及び別法としてこれらの受容体がスプライスされた形態が含まれる、。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性型受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制型受容体」）が含まれ、これらは主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似したアミノ酸配列を有する。活性型受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。抑制型受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３－２３４、概説Ｍ．（１９９７）を参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：４５７－４９２（１９９１））；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５－３４（１９９４））；及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０－４１（１９９５））に概説されている。今後同定される他のＦｃＲは、本明細書の用語「ＦｃＲ」に包含される。かかる用語には、胎児性受容体であるＦｃＲｎも含まれ、これは、母体ＩｇＧの胎児への移行を担っている（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。

「ヒトエフェクター細胞」は、一つ以上のＦｃＲを発現しエフェクター機能をつかさどる白血球である。好ましくは、かかる細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現しＡＤＣＣエフェクター機能をつかさどる。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞、及び好中球が含まれ、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、天然の供給源、例えば、血液から単離できる。

「補体依存性細胞傷害」すなわち「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的細胞が溶解することをいう。古典的補体経路の活性化は、補体系第１成分（Ｃ１ｑ）が、自己の同族抗原に結合している（適切なサブクラスの）抗体に結合することで開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）に記載のアッセイを実施できる。

用語「治療的有効量」とは、被検体の疾患または障害を治療するための抗体または抗体断片の量をいう。アレルギー性、炎症性、または自己免疫性性疾患（例えば、喘息、関節炎等）の場合、治療的有効量の抗体または抗体断片（例えば、ＩＬ４とＩＬ５またはＩＬ４とＩＬ１３に対する二重特異性若しくは多重特異性抗体または抗体断片）は、疾患を改善若しくは治療する、または疾患に関連した症状を予防、低下、改善、若しくは治療し得る。増殖性疾患（例えば、腫瘍）の場合、治療的有効量の抗体または抗体断片により、癌細胞数の減少；原発性腫瘍サイズの縮小；癌細胞の周辺臓器への浸潤阻害（すなわち、ある程度遅らせ、好ましくは停止させる）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度遅らせ、好ましくは停止させる）；腫瘍増殖のある程度の阻害；及び／または障害に関連した一つ以上の症状のある程度の軽減があり得る。抗体または抗体断片がすでにある癌細胞の増殖を抑制し、かつ／または死滅させ得る限り、薬物は細胞増殖抑制性及び／または細胞障害性であってよい。癌治療については、ｉｎ ｖｉｖｏの有効性は、例えば、生存期間、疾患進行までの期間（ＴＴＰ）、無病生存期間（ＤＦＳ）、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、奏効率（ＲＲ）、奏効期間、及び／または生活の質を評価することにより測定可能である。

「低下させる（ｒｅｄｕｃｅ）または阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」とは、好ましくは２０％以上、さらに好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体的な減少をもたらす能力を意味する。低下させるまたは阻害するとは、治療される障害の症状、転移の存在若しくは大きさ、原発性腫瘍の大きさ、または、血管新生障害のある血管の大きさまたは数について言及し得る。

本明細書で使用する「炎症性疾患」とは、炎症、典型的には好中球走化性が原因の炎症をもたらす病理学的状態をいう。

本明細書で使用する「自己免疫性疾患」は、個人自身の組織から発症し、かつ、それが対象とされる疾患若しくは障害、またはそれが同時に認められるかまたは発症している、またはそれにより引き起こされる病態である。

炎症性または自己免疫性、またはその両方である疾患または障害の例には、喘息気管支炎（喘息気管支炎）、気管支喘息、及び自己免疫性喘息のような喘息；関節炎（急性関節炎などの関節リウマチ、慢性関節リウマチ、痛風性関節炎、急性痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、椎骨関節炎（ｖｅｒｔｅｂｒａｌ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、及び若年発症型関節リウマチ、変形性関節症、進行性慢性関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｃｈｒｏｎｉｃａ ｐｒｏｇｒｅｄｉｅｎｔｅ）、変形性関節炎、慢性原発性多発性関節炎（ｐｏｌｙａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｃｈｒｏｎｉｃａ ｐｒｉｍａｒｉａ）、反応性関節炎、並びに強直性脊椎炎）、炎症性の高増殖性皮膚疾患；尋常性乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬、及び爪の乾癬のような乾癬；接触性皮膚炎、慢性接触性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、及びアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎；Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群；慢性自己免疫性蕁麻疹を含む、慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性特発性蕁麻疹のような蕁麻疹；多発性筋炎／皮膚筋炎；若年性皮膚筋炎；中毒性表皮壊死剥離症；強皮症（全身強皮症を含む）；全身性硬化症、脊髄視神経型（ｓｐｉｎｏ－ｏｐｔｉｃａｌ）多発性硬化症、原発性進行性（ｐｒｉｍａｒｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ）多発性硬化症（ＰＰＭＳ）、及び再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）のような多発性硬化症（ＭＳ）、全身性進行性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、汎発性硬化症（ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔａ）、及び失調性硬化症のような硬化症；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病、自己免疫介在性消化器疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）、潰瘍性大腸炎（ｃｏｌｉｔｉｓ ｕｌｃｅｒｏｓａ）、顕微鏡的大腸炎、膠原性大腸炎、ポリープ様大腸炎（ｃｏｌｉｔｉｓ ｐｏｌｙｐｏｓａ）、壊死性腸炎、及び全層性大腸炎のような大腸炎、並びに自己免疫性炎症性腸疾患）；壊疽性膿皮症；結節性紅斑；原発性硬化性胆管炎；上強膜炎）、成人または急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む呼吸窮迫症候群；髄膜炎；ブドウ膜全部または一部の炎症；虹彩炎；脈絡膜炎；自己免疫性血液疾患；リウマチ様脊椎炎；突発性難聴；アナフィラキシー及びアレルギー性及びアトピー性鼻炎のようなＩｇＥ介在性疾患；高ＩｇＥ症候群；ラスムッセン脳炎並びに辺縁系脳炎及び／または脳幹脳炎のような脳炎；前部ブドウ膜炎、急性前部ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体抗原性（ｐｈａｃｏａｎｔｉｇｅｎｉｃ）ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、または自己免疫性ブドウ膜炎のようなブドウ膜炎；原発性糸球体腎炎、免疫介在性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎（膜性腎症）、特発性膜性糸球体腎炎若しくは特発性膜性腎症、Ｉ型及びＩＩ型を含む膜増殖性（ｍｅｍｂｒａｎｏ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）若しくは膜性増殖性（ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、及び急速進行性糸球体腎炎などの慢性または急性糸球体腎炎のような、ネフローゼ症候群の有無を問わない糸球体腎炎（ＧＮ）；アレルギー性病態；アレルギー性反応；アレルギー性またはアトピー性湿疹を含む湿疹；強皮症；ウィップル病、肥厚性瘢痕、子癇前症、腹部癒着症、Ｔ細胞の浸潤及び慢性炎症反応を伴う病態；慢性炎症性肺疾患；自己免疫性心筋炎；白血球接着欠乏症；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）すなわち皮膚エリテマトーデス、亜急性皮膚エリテマトーデス、新生児狼瘡症候群（ＮＬＥ）、播種性エリテマトーデス、ループス（腎炎、脳炎、小児期発症型（ｐｅｄｉａｔｒｉｃ）、非腎性、腎外、円板状、脱毛）のような全身性エリテマトーデス；小児インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）を含む若年性発症（Ｉ型）糖尿病；成人発症型糖尿病（ＩＩ型糖尿病）；自己免疫性糖尿病；特発性尿崩症；サイトカイン及びＴリンパ球の介在による急性及び遅延型過敏症に関連した免疫応答；結核；サルコイドーシス；リンパ腫様肉芽腫症、ウェゲナー肉芽腫症を含む肉芽腫症；無顆粒球症；血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）（大径血管炎（リウマチ性多発筋痛症及び巨細胞（高安動脈炎）動脈炎を含む）、中径血管炎（川崎病及び結節性多発性動脈炎を含む）、顕微鏡的多発性動脈炎、中枢神経系（ＣＮＳ）血管炎、壊死性、皮膚、または過敏性の血管炎、全身壊死性血管炎、並びに、チャーグ－ストラウス血管炎またはチャーグ－ストラウス症候群（ＣＳＳ）などのＡＮＣＡ関連血管炎を含む）を含む血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｄｅｓ）；側頭動脈炎；再生不良性貧血；自己免疫性再生不良性貧血；クームス陽性貧血；ダイアモンド－ブラックファン貧血；溶血性貧血または自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫性溶血性貧血；悪性貧血（悪性貧血（ａｎｅｍｉａ ｐｅｒｎｉｃｉｏｓａ））；アジソン病；真性赤血球性貧血または真性赤血球無形成（ＰＲＣＡ）；第ＶＩＩＩ 因子欠乏症；血友病Ａ；自己免疫性好中球減少症；汎血球減少症；白血球減少症；白血球遊出を伴う疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害；敗血症、外傷または出血に続発するなどの多臓器傷害症候群；抗原抗体複合体介在性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質抗体症候群；アレルギー性神経炎；ベーチェット病；キャッスルマン症候群；グッドパスチャー症候群；レイノー症候群；シェーグレン症候群；スチーヴンズ－ジョンソン症候群；水疱性天疱瘡及び皮膚天疱瘡のような類天疱瘡；天疱瘡（尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、粘膜類天疱瘡、及び紅斑性天疱瘡を含む）；自己免疫性多腺性内分泌障害；ライター病または症候群；免疫複合体性腎炎；抗体介在性腎炎；視神経脊髄炎；ポリニューロパシー；ＩｇＭポリニューロパシーまたはＩｇＭ介在性ニューロパシーなどの慢性ニューロパシー；血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）及び慢性若しくは急性の特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）のような自己免疫性または免疫介在性の血小板減少症を含む、血小板減少症（例えば、心筋梗塞患者に発症しているもの）；自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫性疾患；原発性甲状腺機能低下症；副甲状腺機能低下症；自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、または亜急性甲状腺炎のような甲状腺炎を含む自己免疫性内分泌疾患；自己免疫性甲状腺疾患；特発性甲状腺機能低下症；グレーブス病；自己免疫性多腺性症候群（または多腺性内分泌障害症候群）のような多腺性症候群；ランバート－イートン 筋無力性症候群若しくはイートン－ランバート症候群、スティッフマン若しくはスティッフパーソン症候群などの神経性腫瘍随伴症候群を含む腫瘍随伴症候群；アレルギー性脳脊髄炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓまたはｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ａｌｌｅｒｇｉｃａ）及び実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のような脳脊髄炎；胸腺腫関連重症筋無力症などの重症筋無力症；小脳変性；神経ミオトニー；眼球クローヌス若しくは眼球クローヌス－ミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、及び感覚性ニューロパシー；多巣性運動ニューロパシー；シーハン症候群；自己免疫性肝炎；慢性肝炎；ルポイド肝炎；巨細胞肝炎；慢性活動性肝炎若しくは自己免疫性慢性活動性肝炎；リンパ性間質性肺炎；閉塞性細気管支炎（非移植）と非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）；ギラン－バレー症候群；ベルジェ病（ＩｇＡ腎症）；特発性ＩｇＡ腎症；線状ＩｇＡ水疱性皮膚症；原発性胆汁性肝硬変；肺線維症；自己免疫性腸症症候群；セリアック病；セリアックスプルー（グルテン腸症）；難治性スプルー；特発性スプルー；クリオグロブリン血症；寒冷グロブリン血症；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病）；冠動脈疾患；自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）；自己免疫性難聴などの自己免疫性聴覚疾患；眼球クローヌス－ミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）；難治性若しくは再発性多発性軟骨炎などの多発性軟骨炎；肺胞蛋白症；アミロイドーシス；強膜炎；非癌性リンパ球増加症；モノクローナルＢ細胞リンパ球増加症（例えば、良性モノクローナル免疫グロブリン血症及び意義不明のモノクローナル免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）が含まれる原発性リンパ球増加症；末梢神経障害、腫瘍随伴症候群；てんかん、片頭痛、不整脈、筋障害、難聴、失明、周期性四肢麻痺、及び中枢神経系（ＣＮＳ）のチャネル病などのチャネル病；自閉（症）、炎症性筋障害、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼症、網膜ぶどう膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝疾患、線維筋痛症、多発性内分泌不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮症、初老期痴呆；自己免疫性脱髄性疾患などの脱髄性疾患、糖尿病性腎症、ドレスラー症候群、円形脱毛症、クレスト症候群（石灰症、レイノー現象、食道運動障害、強指症、及び毛細血管拡張症）；男性及び女性の自己免疫性不妊症、混合結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、反復流産、農夫肺、多形紅斑、心膜切除後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫血管炎、良性リンパ球血管炎、アルポート症候群；アレルギー性肺胞隔炎及び線維化肺胞炎などの肺胞炎；間質性肺疾患、輸血反応、ハンセン病；マラリア；
リーシュマニア症；キパノソミアシス（ｋｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ）；住血吸虫症；回虫症；アスペルギルス症；サムプター症候群（Ｓａｍｐｔｅｒ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；カプラン症候群；デング；心内膜炎；心内膜心筋線維症；びまん性間質肺線維症；間質性肺線維症；特発性肺線維症；嚢胞性線維症；眼内炎；持久性隆起性（ｅｌｅｖａｔｕｍ ｅｔ ｄｉｕｔｉｎｕｍ）紅斑；胎児赤芽球症；好酸球性筋膜炎；シャルマン症候群；フェルティ症候群；フィラリア症；慢性毛様体炎、虹彩異色性毛様体炎、虹彩毛様体炎、またはフックス毛様体炎などの毛様体炎；ヘノッホ－シェーンライン紫斑病；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症；エコーウイルス感染症；心筋症；アルツハイマー病；パルボウイルス感染症；風疹ウイルス感染症；予防接種後症候群；先天性の風疹感染；エプスタイン－バーウイスル感染症；流行性耳下腺炎；エバンス症候群；自己免疫性性腺機能不全；シデナム舞踏病；レンサ球菌感染後腎炎；血栓血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ ｕｂｉｔｅｒａｎｓ）；甲状腺中毒症；脊髄癆；脈絡膜炎；巨細胞多発筋痛症；内分泌性眼障害；慢性過敏性肺炎；乾性結膜炎；流行性角結膜炎；特発性腎炎症候群；微小変化型腎症；良性家族性及び虚血再潅流傷害；網膜自己免疫；関節炎；気管支炎；慢性閉塞性気道疾患；珪肺症；アフタ；アフタ性口内炎；動脈硬化障害、無精子形成（ａｓｐｅｒｍｉｏｇｅｎｅｓｅ）；自己免疫性溶血；ベック病；クリオグロブリン血症；デュピュイトラン拘縮；水晶体過敏性眼内炎；アレルギー性腸炎（ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ａｌｌｅｒｇｉｃａ）；らい性結節性紅斑；特発性顔面神経麻痺；慢性疲労症候群；リウマチ熱（ｆｅｂｒｉｓ ｒｈｅｕｍａｔｉｃａ）；ハマン－リッチ症候群；感音性難聴；発作性血色素尿症（ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ ｐａｒｏｘｙｓｍａｔｉｃａ）；性腺機能低下症；限局性回腸炎（ｉｌｅｉｔｉｓ ｒｅｇｉｏｎａｌｉｓ）；白血球減少；伝染性単核球症（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｓａ）；横断性脊髄炎；原発性特発性粘液水腫；ネフローゼ；交感性眼炎；肉芽種性睾丸炎（ｏｒｃｈｉｔｉｓ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓａ）；膵炎；急性多発性神経根炎（ｐｏｌｙｒａｄｉｃｕｌｉｔｉｓ ａｃｕｔａ）；壊疽性膿皮症；ケルヴァン甲状腺炎；後天性の脾臓萎縮；抗精子抗体（ａｎｔｉｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａｎ ａｎｔｏｂｏｄｙ）による不妊症；非悪性胸腺腫；白斑；重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）及びエプスタイン－バーウイスル関連疾患；後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）；リーシュマニアなどの寄生虫症；毒素性ショック症候群；食中毒；Ｔ細胞の浸潤を伴う病態；白血球接着欠乏症；サイトカイン及びＴリンパ球介在性の急性及び遅延型過敏症に関連した免疫応答；白血球遊出を伴う疾患；多臓器傷害症候群；抗原抗体複合体介在性の疾患；抗糸球体基底膜の疾患；アレルギー性神経炎；自己免疫性多腺性内分泌障害；卵巣炎；原発性粘液水腫；自己免疫性萎縮性胃炎；交感性眼炎；リウマチ性疾患；混合結合組織病；ネフローゼ症候群；膵島炎；多腺性機能不全；末梢神経障害；自己免疫性多腺性症候群Ｉ型；成人発症型特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）；全頭脱毛症；拡張型心筋症；後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）；血色素症；心筋炎；ネフローゼ症候群；原発性硬化性胆管炎；化膿性若しくは非膿性副鼻腔炎；急性若しくは慢性副鼻腔炎；副鼻腔（篩骨洞炎、前頭洞炎、上顎洞炎、または蝶形骨洞）炎；自己免疫性水疱性疾患；好酸球増加症；特発性好酸球増多症候群；好酸球肺浸潤；好酸球増多－筋肉痛症候群；レフラー症候群；慢性好酸球性肺炎；熱帯性肺好酸球増加症；気管支肺アスペルギルス症（ｂｒｏｎｃｈｏｐｎｅｕｍｏｎｉｃ ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）；アスペルギルス腫；または好酸球を含有している肉芽腫などの好酸球関連障害；アナフィラキシー；血清反応陰性脊椎関節炎（ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）；多腺性自己免疫性疾患；硬化性胆管炎；強膜炎；上強膜炎；慢性粘膜皮膚カンジダ症；ブルトン症候群；乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症；ヴィスコットオールドリッチ症候群；毛細血管拡張性失調症；膠原病、リウマチ、神経疾患、虚血再灌流障害、血圧応答低下、血管機能障害、血管拡張症、組織傷害、心血管虚血、痛覚過敏、脳虚血、及び血管新生を伴う疾患に関連した自己免疫性疾患；アレルギー性過敏障害；糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｄｅｓ）；再潅流傷害；心筋または他の組織の再潅流傷害；急性炎症性要素；急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症性障害を伴う皮膚疾患；眼及び眼窩の炎症性障害；顆粒球輸血関連症候群；サイトカイン誘導性の毒性；急性の強い炎症；慢性難治性炎症；腎盂炎；肺線維症；糖尿病網膜症；糖尿病性大径動脈障害；動脈内過形成（ｅｎｄａｒｔｅｒｉａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）；消化性潰瘍；弁膜炎；並びに子宮内膜症が挙げられるが、これに限定されるものではない。

本明細書の「アレルギー性疾患」とは、個人が、通常は非免疫原性の物質に対し過感作され、それに対する免疫反応を開始する疾患または障害である。アレルギー性疾患は、一般に、ＩｇＥによる肥満細胞の活性化を特徴とし、これは炎症応答を引き起こし、鼻水のような良性の症状から生命を脅かすアナフィラキシーショック及び死亡に至るまで、各種の症状を引き起こし得る。アレルギー性疾患の例には、喘息（例えば、アレルギー性喘息）、アレルギー性鼻炎（例えば、花粉症）、アレルギー性皮膚炎（例えば、湿疹）、接触性皮膚炎、食物アレルギー、及び蕁麻疹が挙げられるが、これに限定されるものではない。

上記で挙げた例はすべてを包括しているわけではなく、疾患または障害が種々の分類に入り得ることは当業者には理解されるであろう。例えば、喘息はアレルギー性疾患でもあり炎症性疾患でもあるが、臨床医によっては自己免疫性疾患とみなされる。

用語「癌」及び「癌性）」とは、典型的に制御されていない細胞増殖を特徴とする、哺乳類における生理的状態を意味するか、または表す。この定義に含まれるのは、良性及び悪性の癌である。

用語「前癌の」とは、典型的に、癌に先行する、または癌に発展する病態または成長をいう。

本明細書で使用する用語「増殖性疾患」は、ある程度の異常な細胞増殖に関連した疾患または障害である。一実施形態では、細胞増殖性障害は癌である。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、大腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、腎癌、前立腺癌、肝癌、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、及び膠芽腫からなる群から選択される。

本明細書で使用する用語「腫瘍」とは、悪性か良性かを問わず、すべての腫瘍形成細胞成長及び細胞増殖、並びにすべての前癌性及び癌性の細胞及び組織をいう。

「非転移性」とは、良性である、または原発部位にとどまる癌であり、リンパ系若しくは血管系内に、または原発部位以外の組織に侵入していない癌を意味する。一般に、非転移性癌は、０期、Ｉ期、またはＩＩ期の任意の癌であり、ときにＩＩＩ期の癌である。

「被検体」とは、脊椎動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒトである。哺乳類には、家畜（ウシなど）、競技用動物、ペット（ネコ、イヌ及びウマなど）、霊長類、マウス、及びラットが挙げられるが、これに限定されるものではない。

ＩＩ．二重特異性抗体の作製
重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）は、有意に高い配列多様性を含有し、軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）よりも抗原認識の決定因子に寄与することが多い。我々が先に得た結果から、二重特異性のある単一抗体を作るために軽鎖可変ドメインを改変できることが、初めて示された（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００８００６９８２０及びＢｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：１６１０－１６１４（２００９）を参照のこと。なお、参照によりその全体が本明細書に援用されるものとする。我々は、Ｖ_Ｈのアミノ酸残基の改変により、Ｖ_Ｌには変異がないことを含め、抗原認識に重要なＶ_Ｌ残基を有する抗体から二重特異性抗体を作製できることを発見した。これらの新規で、しかも予期しなかった方法を以下に詳述する。

我々は、Ｖ_Ｌの特定の残基は、静電的または疎水性の場合に同定可能であることを見出し、これは、Ｖ_Ｌが抗原認識に重要であることを示唆している。このような場合、第１のエピトープと第２のエピトープの両方に結合する二重特異性抗体を作製するために、抗体のＶ_Ｈの改変を使用する。具体的には、抗体の位置３２、５０、または９１（Ｋａｂａｔ番号付けによる）のアミノ酸残基の任意の１、２、または３個が静電的（例えば、チロシン）または疎水性（例えば、トリプトファン）であれば、その抗体のＶ_Ｈをコードする核酸配列を、溶媒接近可能アミノ酸残基一つ以上をコードするＶ_Ｈのコドンの一つ以上にて改変する。

さまざまな実施形態では、Ｖ_Ｈの改変対象となり得る残基には、３３、３４、５０～５８、または９５～９７の任意の１以上のアミノ酸が含まれる。任意選択で、重鎖残基の他、軽鎖のアミノ酸残基９３～９６を改変してよい。重鎖について、溶媒の接近可能性または抗原認識にとっての重要性は、構造マッピング及びアラニンスキャニング変異誘発など、これらに限定されない当技術分野で公知の標準的な技術を使用して決定してよい。

その後、Ｖ_Ｌ及び改変されたＶ_Ｈを発現させ（例えば、ライブラリーとして）、Ｖ_Ｌ及び改変されたＶ_Ｈが含まれる二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を選択し、これが、第１のエピトープ及び第２のエピトープに特異的に結合する。最初の抗体のＶ_Ｌは、Ｖ_Ｈの改変の他に改変を行っても行わなくてもよい。最初の抗体のフレームワーク領域のアミノ酸残基は、Ｖ_Ｈの改変の他に改変を行っても行わなくてもよい。

上記の選択方法により同定された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を、例えば、親和性熟成または当該技術分野で公知の他の方法でさらに修飾して、一方または両方の標的抗原に対する親和性を高めてよい。親和性熟成の選択過程には、大量並列シーケンシング法（例えば、ディープシークエンシング（ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ウルトラディープシークエンシング（ｕｌｔｒａ－ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、または次世代シークエンシング）を適用して、標的抗原の一方または両方との結合に寄与する（例えば、標的抗原の高親和性に寄与する）残基（複数可）（例えば、溶媒に露出されている、または溶媒に露出されていない残基）を同定することが含まれ得る。例えば、Ｆｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ． ７（９）：７４１－７４６，２０１０を参照のこと。二重特異性抗体は、安定性の向上または半減期の延長、または免疫原性の低下のために、修飾されることもある。このような修正は、当業者に公知である。

ＩＩＩ．治療上の使用
本明細書に記載する二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片は、ＩＬ４とＩＬ５の両方（例えば、Ｂ１、Ｅ７、及びＥ７親和性が成熟した改変体）またはＩＬ４とＩＬ１３の両方（例えば、Ｆ１及びＦ２）に結合し、これらを使用して、アレルギー性、炎症性、及び自己免疫性疾患（例えば、喘息）のような疾患；ＩＬ４介在性の疾患；ＩＬ５介在性の疾患；ＩＬ１３介在性の疾患；ＩＬ４／ＩＬ５介在性の疾患；ＩＬ４／ＩＬ１３介在性の疾患；及び／または増殖性障害（例えば、癌）を治療、抑制、または予防することができる。

二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片により治療され得る炎症性及び自己免疫性の疾患または障害の例は、上記の通りである。いくつかの実施形態では、疾患または障害には、喘息気管支炎、気管支喘息、及び自己免疫性喘息のような喘息が含まれるが、これらに限定されるものではない。

喘息は、気道の炎症、過敏性及び閉塞が見られる慢性肺疾患と表現される。生理学的には、気道過敏性は、メタコリンまたはヒスタミンで気管支誘発を行った後の気管支の気流減少により実証される。気道閉塞を引き起こす他の誘因には、冷たい空気、運動、ウイルス性の上気道感染、喫煙、及び呼吸器アレルゲンが含まれる。気管支をアレルゲンで誘発すると、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の介在による即時相の気流量減少が直ちに誘導され、多くの患者では、その後、ＩｇＥ介在による遅延相反応が現われ、４～８時間気管支の気流量が減少する。即時型応答は、ヒスタミン、ＰＧＤ_２、ロイコトリエン、トリプターゼ及び血小板活性化因子（ＰＡＦ）のような炎症性物質が急激に放出されることにより引き起こされ、遅延型応答は、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＴＮＦａ、ＩＬ４、ＩＬ１３）及びケモカイン（例えば、ＭＣＰ－１及びＭＩＰ－１α）が新規に合成されることにより引き起こされる（Ｂｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｉｎ：Ａｌｌｅｒｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｅｄ． Ｍｉｄｄｌｅｓｔｏｎ，１１７３（１９９８））。慢性の喘息患者では、持続的な肺の症状には、Ｔｈ２細胞の応答の亢進が介在している。Ｔｈ２サイトカイン、特に、喘息のげっ歯類モデルで示されたように、気道においてＮＫ表現型（ＮＫＴ）を有するＴｈ２細胞により産生されたＩＬ１３とＩＬ４（Ａｋｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，９：５８２（２００３））は、疾患において重要な役割を果たすと考えられている（Ｌａｒｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１１：４５０（２００３））。喘息の気道の全体病理は、肺の過膨張、平滑筋肥大、網状層の肥厚、粘膜の浮腫、上皮細胞の剥離、繊毛細胞破壊、及び粘液腺の過剰分泌を示す。顕微鏡的に、喘息は、気管支組織、気管支分泌物、及び粘液における好酸球、好中球、リンパ球、及び形質細胞の数の増加により特徴付けられる。まず、活性化ＣＤ４陽性Ｔリンパ球により血液循環から気道へ白血球の動員がある。活性化Ｔリンパ球は、好酸球、肥満細胞、及びリンパ球からの炎症性メディエーター放出もさせる。その上、Ｔｈ２細胞はＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ９及びＩＬ１３を産生する。ＩＬ４は、ＩＬ１３と共に、ＩｇＭ抗体からＩｇＥ抗体へ切り替えるようにシグナルを伝達する。

アレルゲンが膜に結合したＩｇＥ分子を架橋すると、肥満細胞は脱顆粒を起こし、気道炎症を持続させるヒスタミン、ロイコトリエン、及び他のメディエーターを放出する。ＩＬ５は好酸球の動員及び活性化を活性化させる。活性化された肥満細胞及び好酸球も、炎症の持続を助ける自己のサイトカインを生成する。肺の組織の損傷に続くそれらの修復を伴う肺でのこうした炎症サイクルが繰り返されると、気道の長期的な構造変化（「リモデリング」）を起こし得る。

中等度喘息は、現在、抗炎症コルチコステロイドまたはクロモリンナトリウムまたはネドクロミルなどの肥満細胞の抑制剤の連日吸入に加え、突出的な症状、すなわち、アレルゲンまたは運動で誘発された喘息を軽減するため必要に応じて（１日３～４回）ベータ２作動薬の吸入で治療する。クロモリンナトリウム及びネドクロミルは気管支痙攣及び炎症を遮断するが、通常は、アレルゲンまたは運動に関連した喘息のみ、典型的には、若年喘息患者にのみ有効である。吸入コルチコステロイドは、炎症、気道過敏性、及び閉塞を改善し、急性増悪の回数を減少させる。しかし、明らかな効果が現われるまで少なくとも１か月、また顕著な改善が見られるまで最高１年を要する。最も頻度が高い副作用は、嗄声及び口の真菌感染症、すなわち、カンジダ症である。さらに重篤な副作用として、例えば、副腎の一部抑制、成長阻害、及び骨形成の低下が報告されているが、高用量で使用した場合に限られている。ベクロメタゾン、トリアムシノロン、及びフルニソリドはおそらく効力［効能・力価］は同様であると思われ、一方、ブデソニド及びフルチカゾンは、より強力で、全身副作用が少ないと報告されている。

疾患が軽度な患者であっても、粘膜の及び上皮への活性化されたＴ細胞、肥満細胞、及び好酸球の浸潤を含む気道の炎症を示す。Ｔ細胞及び肥満細胞は、好酸球の増殖及び熟成並びにＩｇＥ抗体産生を促進するサイトカインを放出し、放出されたサイトカインが今度は、微小血管の透過性を高め、上皮を破壊し、神経反射及び粘液分泌腺を刺激する。その結果、気道過敏性、気管支収縮、及び過剰分泌となり、喘鳴音、咳、及び呼吸困難となって現われる。

従来より、喘息は、経口及び吸入気管支拡張薬で治療されている。これらの薬剤は喘息症状の一助にはなるが、基礎疾患としての炎症には全く作用しない。この１０年間、喘息の病因論において炎症がいかに重要であるかという認識からコルチコステロイドの使用が増加したが、多くの患者が現在もなおコントロール不良の喘息に苦しんでいる。

ＩＬ４、ＩＬ５、及び／またはＩＬ１３に対する特異性を有する二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片は、複数の病原性経路を標的とすると思われ、喘息治療の治療薬として、単独または別の治療（例えば、当技術分野で公知または上記の）と組み合わせて使用できる。

別の実施形態では、二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を癌治療に使用してよい。癌という用語は、増殖性障害をまとめて含み、これらには前癌性増殖、良性腫瘍、及び悪性腫瘍が非限定的に含まれる。良性腫瘍は、その発生部位に限局的にとどまり、遠隔部位に浸潤、侵入、または転移する能力はない。悪性腫瘍は、侵入し、その周辺の他組織を損傷していく。悪性腫瘍は、その起源の部位から切り離れる能力を獲得し、通常、血液循環を介して、またはリンパ節が位置するリンパ系を介して体の他の部分へ広がる（転移する）こともできる。原発性腫瘍は、それが発生する組織の種類により分類され、転移性腫瘍は、癌細胞が由来する組織の種類により分類される。時間と共に、悪性腫瘍の細胞は、より異常になり、正常細胞のようではなくなる。癌細胞にみられるこの外観の変化は、腫瘍グレードと呼ばれ、癌細胞は、十分に分化されている、中程度に分化されている、ほとんど分化されていない、または、未分化であると表現される。十分に分化した細胞は外観は全く正常であり、それが由来する正常細胞に類似する。未分化な細胞は、細胞の起源を決定することがもはや不可能であるほど異常となっている細胞である。

ＩＶ．用量及び製剤
抗体または抗体断片の組成物は、適切な医療行為行為に一致した形で処方、用量決定、投与がなされる。この文脈で考慮される因子には、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳類動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に知られている他のファクターが含まれる。投与される抗体または抗体断片の「治療的有効量」は、このような因子を考慮に入れて決定され、アレルギー性、炎症性、自己免疫性、または増殖性の疾患または障害、またはその症状を予防、改善または治療するために必要な最小限量である。本発明の抗体または抗体断片を投与する用量及びタイミングは、被検体の全体的な健康状態及び症状、例えば、アレルギー性障害の症状の重症度など、さまざまな臨床的要因に依存することになる。本発明には、被検体のアレルギー性障害若しくはそれによる症状、またはアレルギー性障害発症のリスクを治療、予防、または低減するために抗体または抗体断片を使用することが含まれる。抗体または抗体断片は、任意の時期、例えば、アレルギー性障害またはアレルギー性障害に関連した病態が診断または検出された後、または、まだアレルギー性障害と診断されていないが、このような障害を発症するリスクのある被検体（例えば、免疫不全を患うまたはその治療を受けている被検体）のアレルギー性障害を予防するために、アレルギー性障害発症のリスクがあると確定された後に、投与することができる。

本発明はの二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片は、種多様な方法、例えば、特定の適応に知られている経路で処方及び投与が可能であり、これらには、吸入、局所的、経口、皮下、気管支注射、静脈内、脳内、経鼻、経皮吸収、腹腔内、筋肉内、肺内、経腟、経直腸、動脈内、脳脊髄内、関節内、滑膜内（ｉｎｔｒａｓｙｎｏｖｉａｌｌｙ）、病変内、非経口、脳室内、または眼内を含むが、これらに限定されない。例えば、抗体、または抗体断片は、経口投与用の丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、または徐放性錠剤；または静脈内、皮下若しくは投与用の液体；局所投与用のポリマーまたは他の徐放性ビヒクル；局所投与用の軟膏、クリーム、ゲル、液体、またはパッチの形態が可能である。

広範囲の副作用または毒性がＩＬ４、ＩＬ５、またはＩＬ１３の拮抗作用と関連している場合、局所投与が特に望ましいことがある。また、ｅｘ ｖｉｖｏ法を治療用途に用いることもできる。Ｅｘ ｖｉｖｏ法では、被検体から得られた細胞に、二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドで形質移入または形質導入を行う。その後、形質移入または形質導入された細胞は被検体に戻される。細胞は、造血性細胞（例えば骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイトまたは筋細胞を含むが、これらに限定されない広範な種類の任意のものであり得る。

例えば、連続全身輸注または定期的な注射／注入ｏｆ二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片、を使用できるｔｏ治療するまたは予防する障害。治療は、１日から被検体の寿命までの範囲の期間、さらに好ましくは１～１００日、最も好ましくは１～２０日、最も好ましくは、アレルギー性、炎症性、自己免疫性、若しくは増殖性の疾患または障害、またはその症状が軽減または除去されるまで継続可能である。用量，化合物及び病態の重症度に応じて異なる。二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片は、流量が一定またはプログラム可能な埋込み型ポンプを使用した輸注、または定期的な注射により継続的に投与可能である。徐放性システムも使用できる。ある特定の状況では、半透過性、埋込み型の膜デバイスも、二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を送達するための手段として有用である。別の実施形態では、二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片は、局所的に、例えば、吸入により投与され、定期的に繰り返えしてよい。肺へ投与することも可能であり、例えば、吸入器または噴霧器、エアロゾル化剤を含む製剤の使用により可能である。抗体を、乾燥粉末組成物の形態で患者の肺内に投与してもよい（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，５１４，４９６を参照のこと）。

二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片の用量は、被検体の体重及び病態並びに化合物の投与経路など他の臨床的要因に依存することになる。被検体の治療では、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重～５００ｍｇ／ｋｇ体重の二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片が投与され得る、。さらに好ましい範囲は、１ｍｇ／ｋｇ体重～５０ｍｇ／ｋｇ体重で、その最も好ましい範囲は１ｍｇ／ｋｇ体重～２５ｍｇ／ｋｇ体重である。個別の被験体内での抗体または抗体断片の半減期に応じ、抗体または抗体断片は１日数回から週１回の間で投与可能である。本発明の方法は、同時または長期間にわたるいずれでも与えられる単回並びに頻回投与を提供する。

好ましくは、二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片は、連続輸注により非経口的または静脈内に、または吸入器で局所的に投与される。用量及び投与レジメンは、疾患の重症度、及び被検体の全体的健康状態に依存する。非経口投与の場合、二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片は、注入可能な単位剤形（溶液、懸濁液、エマルジョン）で薬理学的に許容される非経口ビヒクルと共に処方される。このようなビヒクルは、本質的に非中毒性であり、非治療的である。このようなビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンである。不揮発性油及びオレイン酸エチルなどのを非水性ビヒクルを使用してもよい。リポソームを担体として使用してよい。ビヒクルは、等張性及び化学的安定性を高める物質、例えば、緩衝液及び保存料などの添加物を少量含有してよい。二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片は、典型的には、濃度約１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌでこのようなビヒクル内に配合される。吸入投与の場合、二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片は、本発明のエアロゾル形態を形成する任意の好適な方法で処方される。二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を含む組成物は、例えば、吸入器を使用して、薬理学的に許容される賦形剤と共に、または賦形剤なしで揮発または噴霧され、凝縮されて肺に直接吸い込まれ得る蒸気を発生させる。薬理学的に許容される賦形剤は揮発性であってよく、そのような賦形剤クラスは当技術分野で公知であり、これらには、気体、超臨界流体、液体及び固体の溶媒が非限定的に含まれる。かかるクラスに入る例示的な担体には、水、滅菌生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩液のような生理的緩衝液、テルペンｓ、アルコール、プロピレングリコール、グリセリン及び他の類似アルコール、ドライアイス、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、超臨界二酸化炭素、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

必要用量は、投与経路の選択、製剤の性質、被検体の疾患の性質、被検体のサイズ、体重、体表面積、年齢、及び性別、他の投与薬物、並びに担当医師の判断に依存する。必要用量は、入手可能なポリペプチド及び断片の種類及び各種投与経路により効率が異なることを鑑みて、大きく異なることが予測される。例えば、経口投与は、静脈内注射での投与より高用量を要すると考えられる。これらの用量レベルの変更は、標準的な経験的ルーチンを用いて調整し最適化することができ、従来より知見されているところである。投与は、単回であっても頻回であってもよい（例えば、２回、３回、６回、８回、１０回、２０回、５０回、１００回、１５０回、またはそれ以上）。ポリペプチドを好適な送達ビヒクル（例えば、ポリマー微粒子または埋込み型デバイス）に内包させると、送達、特に経口での送達の有効性を高め得る。

喘息治療の一実施形態では、二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片は、必ずしもそうする必要はないが、任意選択で、喘息または喘息を発症するリスクの予防または治療のために現在使用されている１種以上の薬剤と共に処方または併用（同時にまたは順次）投与される。抗体、またはその抗原結合性断片は、例えば、ＩｇＥ拮抗薬、気管支拡張薬（例えば、ベータ２－アドレナリン受容体作動薬、キサンチン、コリン受容体拮抗薬）、抗炎症剤（例えば、ジクロモグリク酸ナトリウム（ＤＳＣＧ）、ネドクロミルナトリウム、ケトチフェンなどの抗ヒスタミン薬、プレドニゾロンなどのコルチコステロイド）、テオフィリン、サルブタモール、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、または当技術分野で公知の別の喘息治療薬と共に処方可能である。このような他剤の有効量は、製剤中の二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片の量、障害または治療の種類、及び上記の他因子に依存する。

治療的製剤は、当技術分野で公知の標準方法を使用して、所望の純度を有する活性成分を任意選択の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と共に混合することにより調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ），ｅｄ． Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）。許容される担体には、生理食塩水、またはリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；並びに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤が含まれる。

任意選択ではあるが、好ましくは、製剤は、薬理学的に許容される塩、好ましくは塩化ナトリウムを、好ましくは生理的濃度周辺で含有する。任意選択で、本発明の製剤は、薬理学的に許容される保存料を含有し得る。いくつかの実施形態では、保存料濃度は、０．１～２．０％、典型的には０．１～２．０ｖ／ｖの範囲である。好適な保存料には、製薬分野で公知の保存料が含まれる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、メチルパラベン、及びプロピルパラベンは、例示的な保存料である。任意選択で、本発明の製剤には、薬理学的に許容される界面活性剤が濃度０．００５～０．０２％で含まれ得る。

本明細書の製剤は、治療される特定の適応の必要に応じ、１種以上の活性化合物をも含有してよく、これらは、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性のあるものでよい。このような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に含有される。

活性成分は、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製したマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル内に、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）またはマクロエマルションで封入してもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（前出）に開示されている。

徐放性調製物は、調製してよい。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含有している固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．３，７７３，９１９）、Ｌ－グルタミン酸とγエチル－Ｌ－グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア）のような分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、並びにポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン－酢酸ビニル及び乳酸－グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残ると、３７℃の水分に暴露された結果として変性または凝集し、生物学的活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ－ジスルフィド交換による分子間Ｓ－Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成され得る。

一例では、二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片は、疾患が許す限り、例えば、直接注射によって局所的に投与され、この注射は定期的に繰り返してよく、または、吸入により投与され得る。二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片は、被検体に全身的に、または患部に直接送達してもよい。

本発明は、また、二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片、及び薬理学的に許容される担体若しくは希釈剤を含む組成物も提供する。治療に使用するこの組成物は無菌であり、凍結乾燥してよい、。本発明の二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を、本明細書に記載する適応を治療するための薬品製造において使用することも意図される。組成物は、抗喘息薬、抗炎症薬、または抗増殖薬（例えば、化学療法薬、細胞障害剤または抗血管新生薬）などの第２の治療薬をさらに含む。

Ｖ．製造品及びキット
本発明の別の実施形態は、疾患または障害（例えば、アレルギー性疾患または障害または喘息）の治療に有用な材料を含む製造品である。本発明のさらに別の実施形態は、炎症性、自己免疫性、及び増殖性の疾患または障害の治療に有用な材料を含む製造品である。製造品は、容器、及び、容器上または容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。好適な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器はガラスまたはプラスチックなどのさまざまな材料で形成されてよい。容器は、病態の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有してよい（例えば、容器は、静脈注射用溶液のバッグまたは皮下注射針で穿孔可能なストッパーを有するバイアルでよい。）。組成物中の少なくとも一つの活性薬剤は本発明の二重特異性抗体または抗原結合性断片である。ラベルまたは添付文書は、組成物が特定の疾病を治療するために使用されること指示する。ラベルまたは添付文書には、抗体組成物を患者に投与するための指示がさらに含まれることになる。本明細書中に記載の併用治療を含む製造品及びキットも意図される。

添付文書は、慣習的に治療用製品の市販パッケージに含まれる指示書を指し、効能、使用、用量、投与、禁忌及び／またはこのような治療用製品の使用に関する警告についての情報を含むものである。一実施形態では、添付文書は、組成物が喘息治療に使用されることを指示する。

さらに、製造品は、注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液のような薬理学的に許容される緩衝液を含む第２の容器を含んでもよい。さらに、他の緩衝、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。

また、さまざまな目的、例えば、ＩＬ４、ＩＬ５、またはＩＬ１３を細胞から精製または免疫沈降するために有用なキットが提供される。ＩＬ４、ＩＬ５、またはＩＬ１３の単離または精製用に、キットは、ビーズ（例えばセファロースビーズ）に結合したＩＬ４／ＩＬ５またはＩＬ４／ＩＬ１３抗体を含み得る。例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにおいて、ＩＬ４、ＩＬ５、またはＩＬ１３をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出及び定量するための抗体を含むキットが提供され得る。製造品と同様に、キットは、容器，及び、容器上または容器に付随するラベル若しくは添付文書を含む。容器は、本発明の少なくとも一つの二重特異性若しくは多重特異性抗体または抗体断片を含む組成物を収容する。例えば、希釈剤及び緩衝液または対照抗体を含む別の容器が含まれてよい。ラベルまたは添付文書は、組成物の説明並びに意図されるｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用または診断上の使用についての指示を提供してよい。

以下の実施例は、あくまで事例を提供するにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。事実、本明細書で示され記載される内容に加え本発明の他のさまざまな変更は、前述の記載から当業者に明らかとなり、添付の請求の範囲内となる。

実施例
下記実施例において示す市販の試薬は、特に明記しない限り、製造者の指示に従って使用した。以下の実施例及び明細書全体にわたってＡＴＣＣ受託番号によって識別される細胞の供与源はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡである。特に断りのない限り、本発明は、本明細書中及び以下のテキストに記載されるような組換えＤＮＡ技術の標準的な手順を用いる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（前出）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）；Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．：Ｎ．Ｙ．，１９９０）；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８８）；Ｇａｉｔ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９８７；Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１。

実施例１。ライブラリー設計及び構築
軽鎖（ＬＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）の変異により、単一特異性抗体は、その第１の抗原特異性を維持しつつ新規抗原に対する第２の結合特異性を動員することができる。さらに、二重の結合は、低ナノモルのＫ_Ｄまで親和性が成熟し得る。二重特異性を操作するこの行程は、その主要抗原を結合するために重鎖（ＨＣ）ＣＤＲを主に利用する抗体に適している。ここでは、結合エネルギーをＬＣ ＣＤＲに大きく依存する抗インターロイキン４抗体のマウスハイブリドーマに由来するもの、及びＨＣ ＣＤＲのみの変異、またはＬＣ ＣＤＲでのさらなる変異を有する二重特異性へこの抗体が進化することについて記載する。このような、インターロイキン４（ＩＬ４）及びインターロイキン５（ＩＬ５）に対する二重特異性改変体をＫ_Ｄが低ナノモルの高い二重親和性まで成熟させる。結果は、抗体が二重特異性に進化できることをさらに強調しており、変異に寛容性があり第２の結合特異性への進化を可能にし得る抗原結合部位の領域を同定するために変異スキャニング法を使用し、任意の抗体に二重特異性を発生させるための、一般応用が可能なエンジニアリングの道筋を示している。

我々は、ヒト化抗体１９Ｃ１１（ｈｕ１９Ｃ１１、生殖細胞系ＶＨ１及びカッパＩの骨格においてヒト化されている）への第２の抗原特異性の動員に着手した。この抗体は、ＩＬ４を結合し、そのＩＬ４受容体αへの結合を阻止する。我々は、まず最初に、そのＦａｂを「ファージミド」構成体（ｐＶ０１１５）にクローニングし、ＬＣ並びに、バイシストロン性に、可変ドメイン、及び、記載があるように（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０：１０７３－９３，２００４）Ｃ末端でＭ１３マイナーコートタンパク質ｐ３に融合したＨＣの定常ドメイン１（ＣＨ１）を共発現させた。アミノ酸配列ＫＴＨＴＣを有する、ＩｇＧのヒンジ領域の一部分を、ＣＨ１とＭ１３ ｐ３の間に含め、二価のＦａｂを提示させ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０：１０７３－９３，２００４）、固体表面支持体上に固定化された抗原への結合有効性を高めた。我々は、最初に、Ｆａｂ提示ファージが、Ｃ末端でＬＣに融合した発現タグ（ｇＤ）の抗体及びＩＬ４に、ＩｇＧとしての抗体で測定した親和性と同様の高親和性（ファージＥＣ_５０＝１ｎＭ）でうまく結合したことを検証。

第２の結合特異性をｈｕ１９Ｃ１１に動員するエンジニアリング方法を測定するために、まず、その３つのＬＣ ＣＤＲのＩＬ４結合に対する重要性を、各ＬＣ ＣＤＲの２つまたは３つの残基をアラニンに変異させることにより調べた。これらのＬＣ ＣＤＲ位置が選択された理由は、主要な抗原結合をＨＣ ＣＤＲに大きく依存している抗体から二重特異性クローンを選択するためのＬＣライブラリー手法の組み合わせ変異誘発の場合に、これらが主要な位置として先に同定されているためである（Ｂｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ６：ｅ１７８８７，２０１１）。ファージ提示ｈｕ１９Ｃ１１野生型の、アラニン変異体Ｌ１（Ｉ３０Ａ／Ｎ３１Ａ／Ｄ３２Ａ）、Ｌ２（Ｙ５０Ａ／Ｈ５３Ａ／Ｒ５４Ａ）、またはＬ３（Ｄ９１Ａ／Ｙ９２Ａ）を、抗ｇＤ抗体（図１Ａ）またはＩＬ４（図１Ｂ）に固定化し、ＥＬＩＳＡを用いて結合についてアッセイした。我々は、ＬＣ ＣＤＲがエネルギー的に重要であろうことを見いだした。アラニン変異を有するファージ提示Ｆａｂは３つのＬＣ ＣＤＲいずれにおいても、検出可能なＩＬ４結合を示さなかったが、抗ｇＤ抗体には結合しており、このことは、野生型Ｆａｂより低レベルではあるものの、これらの変異体が実際にファージに提示され、それらのＩＬ４への結合が重度に破壊されていることを示す（図１Ａ及び１Ｂ）。したがって、第２の抗原結合を発生させるために利用可能なアミノ酸残基数が極めて限られているため、ランダム化したＬＣ ＣＤＲライブラリーを作製する方法では二重特異性抗体が得られる可能性が低いと考えられる。次に、ＬＣ ＣＤＲ並びに表面接近可能なＨＣ ＣＤＲの個々の主要な残基を先に記載のとおり変異させ（Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３３８：２９９－３１０，２００４；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３４０：１０７３－１０９３，２００４）、これらがＩＬ４結合に果たす役割を、これらのアラニン変異体の相対的結合親和性を野生型ｈｕ１９Ｃ１１と比較して測定することにより評価した。結果から、ＩＬ４結合の上記の主要なＬＣ ＣＤＲ残基の重要性が確認された。しかしながら、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ１及びＨ３の半数の被験位置はいずれも変異に寛容であるようであった（図１Ｃ）。

ＩＬ４結合に極めて重要な残基（ＬＣ残基３０、３１、３２、５０、５３、５４、９１、９２；ＨＣ残基３１、３２、９８、９９（Ｋａｂａｔ番号付けによる））を、モデルとしてトラスツズマブＦａｂ（ＰＤＢ：１ＦＤＶ）の構造上でマッピングすることにより、変異に寛容性であったＣＤＲ Ｈ２に集中した領域を特定し、この領域は、第２の特異性を発生させるのに好適であり得る（図２Ａ）。次いで、変異スキームのためにＣＤＲ Ｈ２に集中したランダム化を行うため、アラニン変異に寛容性のあったＣＤＲ Ｈ １（３３、３４）、Ｈ２（５０～５８）、Ｈ３（９５～９７）、及びＬ３（９３～９６）において一組ずつ残基を選択し、Ｋｕｎｋｅｌらの変異誘発方法（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７－８２，１９８７）にしたがって、４つのＣＤＲ各々でこれらの選択残基をランダム化するための対象に、一組の合成オリゴヌクレオチドを使用した。ランダム化スキームは、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｌ３のアミノ酸組成及び長さの変動性に関し、天然抗体の多様性により導びかれた（図２Ｂ）。変異誘発のテンプレートは、ＣＤＲ Ｈ２にのみ終止コドンを含み、これにより、Ｆａｂ提示ライブラリーのこのＣＤＲの変異が保証された。各々のサイズが１０^８～１０^９の範囲の１０のファージ提示ライブラリーを作製した。非ブロッキング抗ＩＬ４抗体で捕捉され固定化されたＩＬ４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）に結合しているｈｕ１９Ｃ１１及び１０のＨＣライブラリー（２１４４－１から２１４４－１０）をファージの力価測定により評価したところ、プールとしての各ライブラリーは、全般的にテンプレートの抗体ｈｕ１９Ｃ１１よりかなり低い、ある低レベルのＩＬ４結合性を示し、平均的にＩＬ４結合を破壊するレベルが異なることが示された（図３）。

第２の抗原としてＩＬ５及びＩＬ１３を選択した。これらの２インターロイキンは、ＩＬ４のように４ヘリックス束のサイトカインファミリーに属しているが、これらはアミノ酸配列及び構造機構レベルで極めて相違している（ＬａＰｏｒｔｅ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ．１３２：２５９－２７２，２００８；Ｐａｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．１９：１８６４－１８７５，２０１１；Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：１６６３－１６７４，２０１０）。ＩＬ４とＩＬ１３の配列同一性は１２％であるが、ＩＬ４とＩＬ５のそれは１１％である。構造的には、ＩＬ５は、１本の鎖のα－ヘリックスがもう１本の鎖の３つのα－ヘリックスと４－ヘリックス束を形成する、絡み合った固有のホモ二量体を形成している（Ｍ ｉｌｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ． ３６３：１７２－１７６，１９９３；Ｐａｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． １９：１８６４－１８７５，２０１１）。ＩＬ４及びＩＬ１３は、どちらも単量体である。しかし、３種のサイトカインは、その生物学的機能において関連しており、これらのサイトカインのうち２つを結合し遮断する二重特異性抗体は、喘息９などのアレルギー性疾患の治療剤として有用である可能性は高い（Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：１６６３－１６７４，２０１０；Ｈａｌｄａｒ ｅｔ ａｌ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３６０：９７３－９８４，２００９）。

我々は、先に記載のとおり構築されたファージ提示ライブラリーからのＩＬ４結合を維持している、ＩＬ５またはＩＬ１３を結合しているクローンのパニング及び濃縮を数回実施した（Ｂｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３２３：１６１０－１６１４，２００９）。各々約１００のクローンをスクリーニングすることにより、ＩＬ５／ＩＬ４またはＩＬ１３／ＩＬ４への二重の結合性を示したクローンを、それぞれ、３～８ずつ見出した。また、シークエンシングから、２つの特異なＩＬ４／ＩＬ５結合クローン（Ｂ１、Ｅ７）及び２つの特異なＩＬ４／ＩＬ１３（Ｆｌ、Ｆ２）結合クローンを同定した（図２Ｂ）。さらに、ＩＬ５にのみ結合したクローン（例えば、クローン５Ａ）を単離した。クローンＢ１を除き、すべてのクローンは、単一特異的なそれらの親テンプレートに対し、ＨＣ ＣＤＲにのみ変異を有していた（図４Ａ～４Ｃ）。このことは、単一特異性抗体のＨＣ ＣＤＲの変異により二重特異性が付与され得ることを示している。我々は、ファージ結合競合アッセイを実施し、クローン親和性を、Ｆａｂ提示ファージの固定化インターロイキンへの結合を５０％阻害するために必要とされるインターロイキンの濃度（ＩＣ５０）として予測した。第２の抗原への結合は、マイクロモル範囲ではＩＣ５０が弱いものであったが、ＩＬ４結合は低ナノモル範囲で維持されていた。

実施例２。ライブラリーの性能の評価
二重結合特異性を検証するため、クローンＢ１、Ｅ７、Ｆ２、及び５ＡをＩｇＧとして発現させ、得られた各ＩｇＧが他の数個のタンパク質ではなく期待抗原に結合することが確認された（図５）。さらに、結合特異性の検討を行い、ＩＬ４、ＩＬ５、及びＩＬ１３を発現しないヒト上皮腎細胞株２９３細胞へのＩｇＧの最小結合、並びに、昆虫細胞株から作製したバキュロウイルス（ＢＶ）粒子へのＩｇＧの最小結合を、それぞれ、フローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡで実証して行った（Ｈｏｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ． ＭＡｂｓ． ４：７５３－７６０，２０１２）。さらに、ＩＬ４／ＩＬ５二重特異性抗体Ｂ１及びＥ７は、単一特異性ＩＬ５結合抗体と共に、ＩＬ５がＩＬ５受容体αに結合するのを阻止することが示され、これによりＩＬ５上の結合エピトープがＩＬ５受容体の結合エピトープと重複していることが示唆された（図６）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定では、ＩＬ４／ＩＬ５二重特異性クローンＥ７は、ＩＬ５に対する親和性は低かった（Ｋ_Ｄ＝９０５ｎＭ）が、ＩＬ４結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定したその親抗体ｈｕ１９Ｃ１１の高親和性（Ｋ_Ｄ＝３．４ｎＭ）は維持していた（図７Ａ及び７Ｂ）。

実施例３。二重特異性抗原結合性断片の親和性熟成
Ｅ７の二重親和性を改善するため、Ｅ７ ＣＤＲを部位指向性変異誘発でランダム化し、結合を選択するため改変体をファージに提示させた。記載にあるとおり（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３４０：１０７３－１０９３，２００４；Ｂｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．５２５：１－２４，２００９；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ．１０８：３１０３－３１１１，２００６）、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｌ３の残基（Ｈ２／Ｌ３ライブラリー）、ＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２及びＨ３の残基（Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３ライブラリー）、またはＣＤＲ Ｈ２の残基を標的にして３つのライブラリーを作製し、ランダム化のためＨＣのフレームワーク領域３（ＦＲ３）の部位を選択した（Ｈ２／ＦＲ３ライブラリー）（図７Ａ）。クローンＥ７はＩＬ４結合の高親和性を維持したため、ライブラリーの選択をＩＬ５結合の改善に絞った。Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３ライブラリーから、多くのクローンでＩＬ５に対する親和性は改善されたがＩＬ４に対する親和性が大幅に低下していたことを見出し、一方、Ｈ２／Ｌ３ライブラリー及びＨ２／ＦＲ３ライブラリーからのクローンでは、ＩＬ４結合親和性を喪失せずにＩＬ５結合の改善が示された（図４Ａ）。選択クローンをＩｇＧとして精製しＥ７と比較した。Ｈ２／Ｌ３ライブラリーの多くの改変体は、非標的タンパク質の組への結合を高めることなくＩｇＧとして高い二重結合性を示した（図８Ａ）。さらに我々は、上記のようにＢＶ結合及び２９３細胞ＦＡＣＳを使用して、標的外の結合が低いこと、及び改善されたクローンがなおもＩＬ５のその受容体への結合を阻止したことを確認した（図８Ｂ）。２つの改善された改変体、１Ｃ３６及び１Ｃ６０の１価の結合親和性（図７Ｃ及び７Ｄ）を、固定化したＩＬ４またはＩＬ５に結合するＦａｂとしてＳＰＲ測定により決定した。両改変体ともＩＬ４に対する高い親和性を維持し（Ｋ_Ｄ＝３～４ｎＭ）、ＩＬ５に対する親和性を、それぞれ、３７倍及び２０倍改善していた（１Ｃ３６はＫ_Ｄ＝２４．１ｎＭ、及び１Ｃ６０は４４．４ｎＭ）（図７Ｂ）。

以上をまとめると、我々は、単一特異性抗体のＨＣ ＣＤＲにおける変異は第２の結合特異性を動員し得ることを示し、また、単離された二重特異性抗体の一つを改善して両抗原に対するｎＭ親和性を低下させた。先に、我々は、トラスツズマブのＦａｂがＬＣ ＣＤＲでの変異を介して二重特異性を発生させることを示したが、それ以来、同じＬＣ手法を使用して二重特異性の抗体が他にも作製されている。現在の研究による知見と共に、我々は、抗体の結合特異性の進化の可能性を強調した。ＣＤＲにおける限定的な変異を軽鎖の側だけではなく重鎖にも行うことにより、抗体は、別の結合特異性を付加し得ることを我々は見出した。自然界では、抗体は、遺伝子シャッフリング及び体細胞突然変異により常にリモデリング下にある。抗体は、体細胞突然変異を介して異なる結合特性、つまりは異なる機能を持つ抗体に変化することにより「再使用」可能であることが示されている。抗体は、限定的変異で結合特異性を発生させるための理想的な折り畳み及び構造の一つを有する可能性があり、これは、自然免疫応答が本質的に限りない種類の外来抗原を認識するその広範な能力において役割を果たしているに違いない。さらに、本研究は、以下にまとめる任意の単一特異性抗体から二重特異性抗体を発生させるためのエンジニアリング全般の道筋を初めて示すものである。変異誘発分析（例えば、アラニンスキャニング）によって、その主要抗原の結合性を著しく破壊せずに変異に寛容な抗原結合部位の領域を最初に同定できる。

他の実施形態
本明細書内で引用または参照された特許、特許出願、特許出願公開、及び他の刊行物はいずれも、個々の特許、特許出願、特許出願公開または刊行物の各々が参照により本明細書に援用されるものとすることが具体的に及び個別に示された場合と同程度に、ここで参照により本明細書に援用されるものとする。

Claims (68)

1. 可変重鎖ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び可変軽鎖ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合性断片を作製する方法であり、二重特異性抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌは共に対合して、第１のエピトープ及び第２のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、該方法は
   （ａ）Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌを含む抗体を提供する工程であって、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは共に対合して、第１のエピトープには結合するが第２のエピトープには結合しない抗原結合部位を形成し、かつ、前記抗体はＶ_Ｌの位置３２、５０、または９１において静電的または疎水性のアミノ酸を少なくとも一つ含む、工程、
   （ｂ）工程（ａ）の抗体の前記Ｖ_Ｈをコードする核酸配列を改変する工程であって、１個以上の溶媒接近可能なアミノ酸残基が改変される、工程、
   （ｃ）Ｖ_Ｌ及び工程（ｂ）で改変されたＶ_Ｈを発現させる工程、及び
   （ｄ）Ｖ_Ｌ及び工程（ｃ）で改変されたＶ_Ｈを含む二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片を選択する工程であって、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは共に対合して、第１のエピトープ及び第２のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を形成する、工程
   を含む、方法。
2. 位置３２、５０、または９１のアミノ酸の少なくとも２個は静電的または疎水性である、請求項１に記載の方法。
3. 位置３２、５０及び９１の３アミノ酸すべてが、静電的または疎水性である、請求項１に記載の方法。
4. 静電的残基はチロシンである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 疎水性残基はトリプトファンである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
6. Ｖ_Ｈをコードする核酸配列を、複数の天然に存在する重鎖アミノ酸配列の多様性に基づいて改変する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 溶媒露出残基の位置が、Ｖ_Ｈの位置３３、３４、５０～５８、及び９５～９７からなる群から選択されるアミノ酸残基位置である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 工程（ａ）の抗体のＶ_Ｌをコードする核酸配列を改変し、ここで、１個以上の溶媒接近可能なアミノ酸残基を改変することをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 溶媒露出残基の位置は、Ｖ_Ｌの９３～９６のアミノ酸から選択されるアミノ酸残基の位置である、請求項８に記載の方法。
10. 工程（ｄ）の選択の間に、改変されたＶ_ＨがＶ_Ｌと共にファージに提示される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 工程（ａ）の抗体が、軽鎖可変領域の相補性決定領域である、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１、アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２、及びアミノ酸配列ＱＱＤＹＴＳＰＷＴＦ（配列番号１１）を含むＣＤＲＬ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 工程（ａ）の抗体が、重鎖可変領域の相補性決定領域である、アミノ酸配列ＤＹＳＭＨ（配列番号１３）を含むＣＤＲＨ１、アミノ酸配列ＶＷＩＮＴＥＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫ（配列番号１７）を含むＣＤＲＨ２、及びアミノ酸配列ＧＧＩＦＹＧＭＤＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲＨ３を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 工程（ｄ）の二重特異性抗体の抗原結合部位が、前記第１のエピトープ及び第２のエピトープ双方を排他的に結合する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 工程（ｄ）の二重特異性抗体の抗原結合部位が、前記第１のエピトープ及び第２のエピトープに同時に結合する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
15. 第１のエピトープが１個の生物学的分子由来であり、第２のエピトープがその同じ生物学的分子由来である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 第１のエピトープが第１の生物学的分子由来であり、第２のエピトープが第２の生物学的分子由来である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
17. 第１の生物学的分子及び第２の生物学的分子が、ＩＬ４／ＩＬ５、ＩＬ４／ＩＬ１３からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
18. 第１の生物学的分子及び第２の生物学的分子が、サイトカインである、請求項１６に記載の方法。
19. 第１または第２の生物学的分子が、ｉｎ ｖｉｖｏで前記抗体に結合した場合に前記二重特異性抗体の半減期を延長できる分子である、請求項１６に記載の方法。
20. 第１または第２の生物学的分子が、血清アルブミンまたは胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）である、請求項１６に記載の方法。
21. 第１または第２の生物学的分子が、ｉｎ ｖｉｖｏで前記抗体に結合した場合に二重特異性抗体のエフェクター機能を高めることができる分子である、請求項１６に記載の方法。
22. 第１または第２の生物学的分子が、ナチュラルキラー細胞またはマクロファージ上の細胞表面タンパク質に結合する、請求項１６に記載の方法。
23. 細胞表面タンパク質がＦｃ受容体またはＣ１ｑである、請求項２２に記載の方法。
24. 二重特異性抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌが共に対合して、第１のエピトープまたは第２のエピトープに１０^－６以下のＫ_Ｄで特異的に結合する抗原結合部位を形成する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 二重特異性抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌが共に対合して、第１のエピトープまたは第２のエピトープに１０^－９以下のＫ_Ｄで特異的に結合する抗原結合部位を形成する、請求項２４に記載の方法。
26. 二重特異性抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌが共に対合して、第１のエピトープまたは第２のエピトープに１０^－１２以下のＫ_Ｄで特異的に結合する抗原結合部位を形成する、請求項２５に記載の方法。
27. 二重特異性抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌが共に対合して、第１のエピトープ及び第２のエピトープに１０^－６以下のＫ_Ｄで特異的に結合する抗原結合部位を形成する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
28. 二重特異性抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌが共に対合して、第１のエピトープ及び第２のエピトープに１０^－９以下のＫ_Ｄで特異的に結合する抗原結合部位を形成する、請求項２７に記載の方法。
29. 二重特異性抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌが共に対合して、第１のエピトープ及び第２のエピトープに１０^－１２以下のＫ_Ｄで特異的に結合する抗原結合部位を形成する、請求項２８に記載の方法。
30. 第１の生物学的分子及び第２の生物学的分子が、構造的に類似していない、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 選択工程（ｄ）が、ディープシークエンシング（ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 請求項１に記載の方法により作製される、単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
33. 二重特異性抗体がモノクローナル抗体である、請求項３２に記載の単離された二重特異性抗体。
34. 断片がＦａｂまたはｓｃＦｖである、請求項３２に記載の単離された二重特異性抗体。
35. 二重特異性抗体がＩｇＧである、請求項３２に記載の単離された二重特異性抗体。
36. 図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、７Ａ、７Ｃ、または７Ｄの抗体のいずれか１抗体のアミノ酸配列を含む、単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
37. 以下の６つのＣＤＲ：
    （ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１、
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２、
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＤＹＴＳＰＷＴＦ（配列番号１１）を含むＣＤＲＬ３、
    （ｉｖ）アミノ酸配列ＤＹＤＩＨ（配列番号１４）を含むＣＤＲＨ１、
    （ｖ）アミノ酸配列ＶＷＩＮＴＥＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫ（配列番号１７）を含むＣＤＲＨ２、及び
    （ｖｉ）アミノ酸配列ＥＩＬＦＹＧＭＤＹ（配列番号２１）を含むＣＤＲＨ３
    を含む、単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
38. 以下の６つのＣＤＲ：
    （ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１、
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２、
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＤＹＴＳＰＷＴＦ（配列番号１１）を含むＣＤＲＬ３、
    （ｉｖ）アミノ酸配列ＤＹＦＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲＨ１、
    （ｖ）アミノ酸配列ＡＧＩＶＹＤＡＴＧＦＴＴＹＡＤＤＦＫ（配列番号１８）を含むＣＤＲＨ２、及び
    （ｖｉ）アミノ酸配列ＧＧＩＦＹＧＭＤＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲＨ３
    を含む単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
39. 以下の６つのＣＤＲ：
    （ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１、
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２、
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＤＹＴＰＦＰＬＴＦ（配列番号１２）を含むＣＤＲＬ３、
    （ｉｖ）アミノ酸配列ＤＹＬＭＨ（配列番号１６）を含むＣＤＲＨ１、
    （ｖ）アミノ酸配列ＡＶＩＶＳＩＴＧＲＴＹＹＡＤＤＦＫ（配列番号１９）を含むＣＤＲＨ２、及び
    （ｖｉ）アミノ酸配列ＧＧＩＦＹＧＭＤＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲＨ３
    を含む、単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
40. 以下の６つのＣＤＲ：
    （ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１、
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２、
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＤＹＴＳＰＷＴＦ（配列番号１１）を含むＣＤＲＬ３、
    （ｉｖ）アミノ酸配列ＤＹＳＭＨ（配列番号１３）を含むＣＤＲＨ１、
    （ｖ）アミノ酸配列ＧＶＩＦＱＳＧＡＴＹＹＡＤＤＦＫ（配列番号２２）を含むＣＤＲＨ２、及び
    （ｖｉ）アミノ酸配列ＧＧＩＦＹＧＭＤＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲＨ３
    を含む、単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
41. 以下の６つのＣＤＲ：
    （ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１、
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２、
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＤＹＴＳＰＷＴＦ（配列番号１１）を含むＣＤＲＬ３、
    （ｉｖ）アミノ酸配列ＤＹＳＭＨ（配列番号１３）を含むＣＤＲＨ１、
    （ｖ）アミノ酸配列ＧＩＩＦＹＴＧＨＴＹＹＡＤＤＦＫ（配列番号２３）を含むＣＤＲＨ２、及び
    （ｖｉ）アミノ酸配列ＧＧＩＦＹＧＭＤＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲＨ３
    を含む、単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
42. 以下の６つのＣＤＲ：
    （ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１、
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２、
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＤＹＸ_１Ｘ_２ＰＷＴＦ（配列番号２４）を含むＣＤＲＬ３、ここで、Ｘ_１はＴｈｒ、ｌｉｅ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり、Ｘ_２はＳｅｒまたはＨｉｓである、
    （ｉｖ）アミノ酸配列ＤＹＦＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲＨ１、
    （ｖ）アミノ酸配列Ｘ_１ＧＩＶＹＤＡＴＧＦＴＸ_２ＹＡＸ_３Ｘ_４ＦＫ（配列番号２５）を含むＣＤＲＨ２、ここで、Ｘ_１はＡｌａまたはＧｌｙ、Ｘ_２はＴｈｒ、ｌｉｅ、Ｖａｌ、またはＡｌａ、Ｘ_３はＡｓｐ、Ｖａｌ、またはＧｌｕ、かつ、Ｘ_４はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ｌｉｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＰｈｅである、及び
    （ｖｉ）アミノ酸配列ＧＧＩＦＹＧＭＤＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲＨ３
    を含む、単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
43. 以下の６つのＣＤＲ：
    （ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１、
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２、
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＤＹＴＨＰＷＴＦ（配列番号２７）を含むＣＤＲＬ３、
    （ｉｖ）アミノ酸配列ＤＹＦＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲＨ１、
    （ｖ）アミノ酸配列ＧＧＩＶＹＤＡＴＧＦＴＴＹＡＥＥＦＫ（配列番号２８）を含むＣＤＲＨ２、及び
    （ｖｉ）アミノ酸配列ＧＧＩＦＹＧＭＤＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲＨ３
    を含む、請求項４１に記載の単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
44. 以下の６つのＣＤＲ：
    （ｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＩＮＤＡＡ（配列番号９）を含むＣＤＲＬ１、
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＹＴＳＨＲＹＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲＬ２、
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＤＹＫＨＰＷＴＦ（配列番号３１）を含むＣＤＲＬ３、
    （ｉｖ）アミノ酸配列ＤＹＦＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲＨ１、
    （ｖ）アミノ酸配列ＡＧＩＶＹＤＡＴＧＦＴＶＹＡＤＤＦＫ（配列番号３２）を含むＣＤＲＨ２、及び
    （ｖｉ）アミノ酸配列ＧＧＩＦＹＧＭＤＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲＨ３
    を含む、請求項４１に記載の単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
45. アミノ酸配列ＧＲＸ_１ＴＩＴＸ_２ＤＸ_３ＳＴＳＴＸ_４（配列番号２６）を含むフレームワーク領域３（ＦＲ３）をさらに含み、ここで、Ｘ_１はＶａｌまたはＰｈｅ、Ｘ_２はＡｒｇまたはｌｉｅ、Ｘ_３はＴｈｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、またはＰｒｏ、及びＸ_４はＡｌａまたはＶａｌである、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
46. 配列番号１、５、２９、または３３のアミノ酸配列から選択される軽鎖可変領域及び配列番号２、３、４、６、７、８、３０、または３４から選択される重鎖可変領域を含む、単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
47. 前記抗体、またはその抗原結合性断片が、ＩＬ４を５００ｎＭ以下のＫｄで、また、ＩＬ５を約９００ｎＭ以下のＫｄで結合する、請求項３８、３９、及び４２～４６のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
48. 前記抗体が、ＩＬ４を１００ｎＭ以下のＫｄで、また、ＩＬ５を約１００ｎＭ以下のＫｄで結合する、請求項３８、３９、及び４２～４６のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
49. 前記抗体が、ＩＬ４を１０ｎＭ以下のＫｄで、また、ＩＬ５を約５０ｎＭ以下のＫｄで結合する、請求項３８、３９、及び４２～４６のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
50. 前記抗体が、ＩＬ４を５００ｎＭ以下のＫｄで、また、ＩＬ１３を約９００ｎＭ以下のＫｄで結合する、請求項４０、４１、及び４６のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
51. 前記抗体が、ＩＬ４を１００ｎＭ以下のＫｄで、また、ＩＬ１３を約１００ｎＭ以下のＫｄで結合する、請求項４０、４１、及び４６のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
52. 前記抗体が、ＩＬ４、ＩＬ５、またはＩＬ１３のその受容体への結合を阻害または阻止する、請求項３６～５１のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
53. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３６～５１のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
54. 前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項３６～５１のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
55. 前記断片が、Ｆａｂ断片または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項３６～５１のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
56. フレームワーク配列の少なくとも一部がヒトのコンセンサスフレームワーク配列である、請求項３６～５１のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
57. 抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である、請求項３２～５１のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片。
58. 請求項３２～５７のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
59. 請求項３２～５７のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗体、またはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
60. 請求項５９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
61. 請求項６０に記載のベクターを含む宿主細胞。
62. 請求項３２～５７のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合性断片を作製する方法であって、請求項６０に記載のベクターを含む宿主細胞を培養すること、及び前記抗体を回収すること、を含む前記方法。
63. 被検体の喘息を治療する方法であって、請求項３２～５７のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗体断片を前記被検体に投与することを含み、ここで、前記投与は、前記被検体の前記喘息を治療または予防するのに十分な期間かつ量で行われる、前記方法。
64. 前記方法が、ＩｇＥ拮抗薬、抗ヒスタミン薬、テオフィリン、サルブタモール、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、クロモグリク酸ナトリウム、ステロイド、及び抗炎症剤からなる群から選択される、少なくとも一つの追加の喘息治療薬を投与することをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
65. 喘息がアレルギー性喘息である、請求項６３または６４に記載の方法。
66. 被検体の増殖性障害を治療する方法であって、請求項３２～５７のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗体断片を前記被検体に投与することを含み、ここで、前記投与は、前記被検体の前記増殖性障害を治療または予防するのに十分な期間かつ量で行われる、前記方法。
67. 前記増殖性障害が癌である、請求項６６に記載の方法。
68. 化学療法薬、細胞障害剤、及び抗血管新生薬からなる群から選択される追加の抗増殖剤を前記被検体に投与することをさらに含む、請求項６７に記載の方法。

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