JP2024501662A - Xbp1を標的とするオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、XBP1プレmRNAのスプライシングを変化させるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞、および哺乳動物タンパク質発現系、例えば異種タンパク質発現系におけるタンパク質発現のレベルおよび/または質を高めること、例えば、CHO細胞における抗体発現を増強することにおける用途を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、タンパク質病理学的疾患の処置または予防のためなどの治療における用途を有する。【選択図】なし
Description
発明の分野
本発明は、XBP1スプライスバリアントの発現を誘導するオリゴヌクレオチドに関する。そのようなオリゴヌクレオチドは、細胞におけるタンパク質発現のレベルおよび/または質を高め、哺乳動物タンパク質発現系、例えば異種タンパク質発現系において有用性を有することができる。オリゴヌクレオチドはまた、タンパク質病理学的疾患の処置または予防を含む治療的有用性を有する。
本発明は、XBP1スプライスバリアントの発現を誘導するオリゴヌクレオチドに関する。そのようなオリゴヌクレオチドは、細胞におけるタンパク質発現のレベルおよび/または質を高め、哺乳動物タンパク質発現系、例えば異種タンパク質発現系において有用性を有することができる。オリゴヌクレオチドはまた、タンパク質病理学的疾患の処置または予防を含む治療的有用性を有する。
背景
X-box結合タンパク質1であるXBP1は、タンパク質フォールディングおよび品質管理に関与する遺伝子を誘導することによってERストレスへの適応を媒介する転写因子である。
X-box結合タンパク質1であるXBP1は、タンパク質フォールディングおよび品質管理に関与する遺伝子を誘導することによってERストレスへの適応を媒介する転写因子である。
XBP1転写物は、発現がIRE1α(イノシトール要求酵素1アルファ)によって調節されるスプライスバリアントを含む異なるスプライス形態で存在する。哺乳動物細胞では、IRE1αは、小胞体(ER)ストレス下でXBP1 mRNAから26ヌクレオチド断片を切除して、機能的に活性なXBP1sタンパク質をコードするスプライスバリアントを生成する。
26ヌクレオチド断片の切除は、+2のフレーム外事象をもたらし、活性なXBP1転写因子(XBP-1S)の発現をもたらす。26ヌクレオチド断片は、XBP1成熟mRNAのエクソン4に存在する。
Cainら(Biotechnol Prog 2013;29(3):697-706)(非特許文献1)は、X-box結合タンパク質(XBP-1S)および小胞体オキシドレダクターゼ(ERO1-Lα)の両方を発現するように操作されたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(CHOS-XE.CHOS-XE細胞)について報告しており、これはCHOS細胞と比較して抗体収量の増加(5.3~6.2倍)を提供する。
Tongら(Neurochem.2012年11月;123(3):406-416)(非特許文献2)は、トランスジェニックラットにおける変異TDP-43の過剰発現について報告しており、これはニューロン喪失の前にユビキチンの顕著な凝集およびゴルジ複合体の断片化の喪失をもたらした。特に、ユビキチンの凝集およびゴルジ複合体の断片化の喪失の前に、XBP1の枯渇および小胞体ストレス応答(UPR)の不活性化がさらに先行した。これは、異常なタンパク質フォールディングに関連する疾患(タンパク質病理学的疾患)、例えばTDP-43病態を含む神経変性疾患、例えば前頭側頭葉変性症(FTLD)およびALSにおいて、XBP1媒介UPRを回復または上方制御する必要があることを示している。
国際公開第2003/89622号(特許文献1)には、小胞体ストレス応答を調節するための新規な遺伝子、組成物および方法が開示されている。
国際公開第2019/004939号(特許文献2)には、t細胞の機能を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドが開示されている。
国際公開第2008/016356号(特許文献3)には、乾癬に関連するヒト遺伝子の遺伝子マップが開示されている。
発明の目的
本発明者らは、驚くべきことに、活性XBP1スプライスバリアントが、主にタンパク質病理学的疾患の処置に関連して、タンパク質産生の方法および治療方法において用途を有することを決定した。
本発明者らは、驚くべきことに、活性XBP1スプライスバリアントが、主にタンパク質病理学的疾患の処置に関連して、タンパク質産生の方法および治療方法において用途を有することを決定した。
本発明者らは、驚くべきことに、XBP1プレmRNA転写物の一部に相補的、例えば完全に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、活性なXBP1スプライスバリアントを作製することができることを決定した。このXPB1スプライスバリアントは、XBP1Δ4スプライスバリアント(エクソン4が欠失したXBP1スプライスバリアント)であり得る。XBP1エクソン4は、インビボでIRE1αによって切除される26ヌクレオチド断片を含み、インビボIRE1α26ヌクレオチド切除事象と同様に、エクソン4のスキップは+2のフレーム外事象を導入する。
本発明は、組換え哺乳動物細胞におけるXBP1Δ4バリアントの生成または発現が、モノクローナル抗体などの異種発現タンパク質、特にそうでなければ発現が困難な異種発現タンパク質の発現増強をもたらすという知見に少なくとも部分的に基づく。XBP1Δ4バリアントの発現により、哺乳動物細胞における品質が向上したタンパク質発現を得ることができる。
本発明は、哺乳動物細胞においてXBP1Δ4の生成または発現を誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの化合物が、哺乳動物細胞における異種発現タンパク質の組換え発現を増強するのに有用であるという知見に少なくとも部分的に基づく。特に、哺乳動物細胞においてXBP1Δ4の発現を誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの化合物は、哺乳動物細胞において正しく折り畳まれた異種発現タンパク質の組換え発現を増強するのに有用である。
本発明は、哺乳動物細胞においてXBP1Δ4の発現を誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、タンパク質病理学的疾患の処置に有用であるという知見に少なくとも部分的に基づく。
Cainら(Biotechnol Prog 2013;29(3):697-706)
Tongら(Neurochem.2012年11月;123(3):406-416)
一態様によれば、本発明は、XBP1を発現する細胞におけるXBP1スプライスバリアントの生成または発現に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが8~40ヌクレオチド長であり、かつ哺乳動物XBP1プレmRNA転写物に相補的な8~40ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
XBP1スプライスバリアントは、XBP1Δ4バリアントであり得る。
連続ヌクレオチド配列は、ハムスターXBP1プレmRNA転写物(配列番号1)の少なくとも10個の連続ヌクレオチド、例えば、配列番号1のヌクレオチド2960~3113の少なくとも10個の連続ヌクレオチドまたは配列番号1のヌクレオチド2986~3018の少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的であり得る。
連続ヌクレオチド配列は、配列番号299、配列番号301、配列番号302、配列番号304、配列番号305、配列番号306、配列番号307、配列番号308、配列番号309、配列番号310、配列番号314、配列番号316、配列番号317、配列番号318、配列番号319、配列番号323、配列番号325、配列番号327、配列番号328、配列番号330、配列番号331、配列番号332、配列番号333、配列番号334、配列番号336、配列番号337、配列番号385、配列番号386、配列番号387、配列番号388、配列番号390、配列番号391、配列番号392、配列番号393、配列番号394、配列番号395、配列番号396、配列番号397、配列番号398、配列番号399、配列番号401、配列番号402、配列番号419、配列番号431、配列番号432、配列番号433、配列番号434、配列番号438、配列番号439、配列番号440、配列番号441、配列番号442、配列番号449、配列番号484、配列番号485、配列番号486、配列番号487、配列番号488、配列番号489、配列番号490、配列番号491、配列番号492、配列番号493、配列番号494、配列番号495、配列番号496、配列番号497、配列番号498、配列番号499、配列番号500、配列番号501、配列番号502、配列番号503、配列番号505、配列番号506、配列番号507、配列番号508、配列番号509、配列番号510、配列番号511、配列番号512、配列番号513、配列番号515、配列番号517、配列番号520、配列番号572、配列番号573、配列番号576、配列番号577、配列番号588および配列番号589からなる群から選択される配列に相補的であり得る。
連続ヌクレオチド配列は、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号45、配列番号46、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号110、配列番号111、配列番号128、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号158、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号229、配列番号281、配列番号282、配列番号285、配列番号286、配列番号297および配列番号298からなる群から選択され得る。
連続ヌクレオチド配列は、マウスXBP1プレmRNA転写物(配列番号590)の少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的であり得る。
連続ヌクレオチド配列は、配列番号699、配列番号700、配列番号703、配列番号710、配列番号713、配列番号724、配列番号729、配列番号739、配列番号743、配列番号744、配列番号745、配列番号749、配列番号750、配列番号751、配列番号752、配列番号753、配列番号754、配列番号755、配列番号756、配列番号757、配列番号758、配列番号759、配列番号760、配列番号761、配列番号762、配列番号763、配列番号773、配列番号776、配列番号778、配列番号781、配列番号783、配列番号784、配列番号785、配列番号787、配列番号789、配列番号790、配列番号791、配列番号792、配列番号793、配列番号794、配列番号795、配列番号796、配列番号797、配列番号798、配列番号799および配列番号800からなる群から選択される配列に相補的であり得る。
連続ヌクレオチド配列は、配列番号597、配列番号598、配列番号601、配列番号608、配列番号611、配列番号622、配列番号627、配列番号637、配列番号641、配列番号642、配列番号643、配列番号647、配列番号648、配列番号649、配列番号650、配列番号651、配列番号652、配列番号653、配列番号654、配列番号655、配列番号656、配列番号657、配列番号658、配列番号659、配列番号660、配列番号661、配列番号671、配列番号674、配列番号676、配列番号679、配列番号681、配列番号682、配列番号683、配列番号685、配列番号687、配列番号688、配列番号689、配列番号690、配列番号691、配列番号692、配列番号693、配列番号694、配列番号695、配列番号696、配列番号697および配列番号697からなる群から選択され得る。
連続ヌクレオチド配列は、ヒトXBP1プレmRNA転写物(配列番号801)の少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的であり得る。
連続ヌクレオチド配列は、配列番号947、配列番号948、配列番号949、配列番号950、配列番号951および配列番号988からなる群から選択される配列に相補的であり得る。
連続ヌクレオチド配列は、配列番号854、配列番号855、配列番号856、配列番号857、配列番号858および配列番号895からなる群から選択され得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、哺乳動物XBP1プレmRNA転写物に完全に相補的であり得る。
連続ヌクレオチド配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ長さであり得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、単離、精製または製造され得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、1つ以上の修飾ヌクレオチドまたは1つ以上の修飾ヌクレオシドを含み得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドミックスマーまたはトータルマーであり得るか、またはそれらを含み得る。
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのコンジュゲートおよび薬学的に許容され得る塩、ならびに本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物および医薬組成物を含む。
別の態様において、本発明は、単離されたXBP1Δ4タンパク質を提供する。
本発明の単離されたXBP1Δ4タンパク質は、配列番号7、配列番号596または配列番号807の配列を含み得る。
別の態様において、本発明は、本発明のXBP1Δ4タンパク質をコードする単離されたmRNAを提供する。
本発明の単離されたmRNAは、配列番号7、配列番号595または配列番号806の配列を含み得る。
別の態様において、本発明は、ポリペプチドを産生するための方法であって、
a)XBP1を発現しておりかつポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、
b)細胞または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含み、
培養が、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、医薬組成物、タンパク質またはmRNAの存在下で行われることを特徴とする、
方法を提供する。
a)XBP1を発現しておりかつポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、
b)細胞または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含み、
培養が、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、医薬組成物、タンパク質またはmRNAの存在下で行われることを特徴とする、
方法を提供する。
本発明内で、本方法は、
a1)XBP1を発現しておりかつポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む培養培地中で増殖させて、第1の細胞集団を得る工程と、
a2)第1の細胞集団のアリコートを、アンチセンスオリゴヌクレオチドを任意に含む培養培地と混合して、第2の細胞集団を得る工程と、
a3)第2の細胞集団を培養して、第3の細胞集団を得る工程と、
b)第3の細胞培養の細胞および/または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含み得る。
a1)XBP1を発現しておりかつポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む培養培地中で増殖させて、第1の細胞集団を得る工程と、
a2)第1の細胞集団のアリコートを、アンチセンスオリゴヌクレオチドを任意に含む培養培地と混合して、第2の細胞集団を得る工程と、
a3)第2の細胞集団を培養して、第3の細胞集団を得る工程と、
b)第3の細胞培養の細胞および/または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含み得る。
本発明の方法内で、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、25μM以上の最終濃度まで添加され得る。
本発明の方法内で、第1の細胞集団をもたらす細胞は、0.5×10E6~4×10E6細胞/mLの開始細胞密度で培養され得る。
本発明の方法内で、第2の細胞集団は、0.5×10E6~10×10E6細胞/mLの細胞密度を有し得る。
本発明の方法内で、哺乳動物細胞は、CHO細胞であり得る。
本発明の方法内で、ポリペプチドは、抗体であり得る。
本発明の一態様は、多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法であって、
a)XBP1バリアント、好ましい一実施形態において、XBP1バリアントはXBP1Δ4である、の形成を誘導している本発明による核酸の存在下で、多量体ポリペプチドをコードし、XBP1を発現している1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、
b)細胞または培養培地から多量体ポリペプチドを回収する工程と
を含む、方法である。
a)XBP1バリアント、好ましい一実施形態において、XBP1バリアントはXBP1Δ4である、の形成を誘導している本発明による核酸の存在下で、多量体ポリペプチドをコードし、XBP1を発現している1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、
b)細胞または培養培地から多量体ポリペプチドを回収する工程と
を含む、方法である。
本発明のさらなる一態様は、多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法であって、
a)XBP1 mRNAにおいてエクソン4のスキップを誘導しており、それにより、+2のフレーム外事象が導入される、本発明による核酸の存在下で、多量体ポリペプチドをコードし、XBP1を発現している1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、
b)細胞または培養培地から多量体ポリペプチドを回収する工程と
を含む、方法である。
a)XBP1 mRNAにおいてエクソン4のスキップを誘導しており、それにより、+2のフレーム外事象が導入される、本発明による核酸の存在下で、多量体ポリペプチドをコードし、XBP1を発現している1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、
b)細胞または培養培地から多量体ポリペプチドを回収する工程と
を含む、方法である。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本方法は、
a1)XBP1を発現しておりかつポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を、XBP1バリアント、好ましい一実施形態において、XBP1バリアントはXBP1Δ4である、の形成を誘導している本発明による核酸を含む培養培地中で増殖させて、第1の細胞集団を得る工程と、
a2)第1の細胞集団のアリコートを、XBP1バリアントXBP1Δ4の形成を誘導している本発明による同じまたは異なる核酸を任意に含む培養培地と混合して、第2の細胞集団を得る工程と、
a3)第2の細胞集団を培養して、第3の細胞集団を得る工程と、
b)第3の細胞培養の細胞および/または培養培地から多量体ポリペプチドを回収する工程と
を含む。
a1)XBP1を発現しておりかつポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を、XBP1バリアント、好ましい一実施形態において、XBP1バリアントはXBP1Δ4である、の形成を誘導している本発明による核酸を含む培養培地中で増殖させて、第1の細胞集団を得る工程と、
a2)第1の細胞集団のアリコートを、XBP1バリアントXBP1Δ4の形成を誘導している本発明による同じまたは異なる核酸を任意に含む培養培地と混合して、第2の細胞集団を得る工程と、
a3)第2の細胞集団を培養して、第3の細胞集団を得る工程と、
b)第3の細胞培養の細胞および/または培養培地から多量体ポリペプチドを回収する工程と
を含む。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本方法は、
a1)XBP1を発現しておりかつポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を、XBP1 mRNAにおいてエクソン4のスキップを誘導しており、それにより、+2のフレーム外事象が導入される、本発明による核酸を含む培養培地中で増殖させて、第1の細胞集団を得る工程と、
a2)第1の細胞集団のアリコートを、XBP1 mRNAにおいてエクソン4のスキップを誘導しており、それにより、+2のフレーム外事象が導入される、本発明による同じまたは異なる核酸を任意に含む培養培地と混合して、第2の細胞集団を得る工程と、
a3)第2の細胞集団を培養して、第3の細胞集団を得る工程と、
b)第3の細胞培養の細胞および/または培養培地から多量体ポリペプチドを回収する工程と
を含む。
a1)XBP1を発現しておりかつポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を、XBP1 mRNAにおいてエクソン4のスキップを誘導しており、それにより、+2のフレーム外事象が導入される、本発明による核酸を含む培養培地中で増殖させて、第1の細胞集団を得る工程と、
a2)第1の細胞集団のアリコートを、XBP1 mRNAにおいてエクソン4のスキップを誘導しており、それにより、+2のフレーム外事象が導入される、本発明による同じまたは異なる核酸を任意に含む培養培地と混合して、第2の細胞集団を得る工程と、
a3)第2の細胞集団を培養して、第3の細胞集団を得る工程と、
b)第3の細胞培養の細胞および/または培養培地から多量体ポリペプチドを回収する工程と
を含む。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、ハムスターXBP1プレmRNA転写物(配列番号1)の少なくとも10個の連続ヌクレオチド、例えば、配列番号1のヌクレオチド2960~3113からの少なくとも10個の連続ヌクレオチドまたは配列番号1のヌクレオチド2986~3018からの少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的である。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、ヒトXBP1プレmRNA転写物(配列番号801)の少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的である。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、配列番号23または配列番号24からなる群から選択される配列に相補的である。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、配列番号947、配列番号948、配列番号949、配列番号950、配列番号951および配列番号988からなる群から選択される配列に相補的である。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、配列番号854、配列番号855、配列番号856、配列番号857、配列番号858および配列番号895からなる群から選択される。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、XBP1バリアントは、配列番号7、配列番号596または配列番号807の配列を含む。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、XBP1バリアントは、配列番号7、配列番号595または配列番号806の配列によってコードされる。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、25μM以上の最終濃度まで添加される。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、第1の細胞集団をもたらす細胞は、0.5×10E6~4×10E6細胞/mLの開始細胞密度で培養される。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、第2の細胞集団は、0.5×10E6~10×10E6細胞/mLの開始細胞密度を有する。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、CHO細胞である。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、HEK細胞である。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、SP2/0細胞である。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、多量体ポリペプチドは、抗体である。特定の実施形態において、抗体は、二重特異性抗体である。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、ドメイン交換を有する全長抗体または抗体-多量体融合物である。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、三価二重特異性抗体である。特定の実施形態において、二重特異性三価抗体は、ドメイン交換および追加の重鎖C末端結合部位を有する全長抗体、またはドメイン交換を有する追加の重鎖C末端結合部位を有する全長抗体、またはT細胞二重特異性抗体である。特定の実施形態において、抗体は、二価または三価である。
本発明の一態様は、例えばモノクローナル抗体などの抗体の製造における、組換えタンパク質発現系によって産生される多量体ポリペプチドの収量または質を高めるための本発明による核酸の使用である。
本発明による核酸の使用のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
本発明による核酸の使用のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、ハムスターXBP1プレmRNA転写物(配列番号1)の少なくとも10個の連続ヌクレオチド、例えば、配列番号1のヌクレオチド2960~3113からの少なくとも10個の連続ヌクレオチドまたは配列番号1のヌクレオチド2986~3018からの少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的である。
本発明による核酸の使用の方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、ヒトXBP1プレmRNA転写物(配列番号801)の少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的である。
本発明による核酸の使用のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、配列番号947、配列番号948、配列番号949、配列番号950、配列番号951および配列番号988からなる群から選択される配列に相補的である。
本発明による核酸の使用のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、配列番号854、配列番号855、配列番号856、配列番号857、配列番号858および配列番号895からなる群から選択される。
本発明のさらなる一態様は、例えばモノクローナル抗体などの抗体の製造における、組換えタンパク質発現系によって産生される多量体ポリペプチドの収量または質を高めるための、エクソン4がスキップされ、+2のフレーム外事象が導入される、XBP1 mRNAから得られるXBP1バリアントの使用である。
本発明のさらなる一態様は、例えばモノクローナル抗体などの抗体の製造における、組換えタンパク質発現系によって産生される多量体ポリペプチドの収量または質を高めるための、配列番号7、配列番号596または配列番号807の配列を含むXBP1バリアントの使用である。
先に概説した使用のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、25μM以上の最終濃度で使用される。
別の態様において、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、医薬組成物、タンパク質および/または単離されたmRNAの治療的適用を提供する。
一態様において、本発明は、医学または治療に使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、医薬組成物、タンパク質および/または単離されたmRNAを提供する。
別の態様において、本発明は、タンパク質病理学的疾患を処置するための医薬品の製造における本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、医薬組成物、タンパク質および/または単離されたmRNAの使用を提供する。
別の態様において、本発明は、タンパク質病理学的疾患を処置する方法であって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、医薬組成物、タンパク質および/または単離されたmRNAを投与することを含む方法を提供する。
本発明の治療的適用を通して、タンパク質病理学的疾患は、運動ニューロン疾患または前頭側頭葉変性症などのTDP-43病態であり得る。
定義
概要
本発明を実施するための有用な方法および技術は、例えば、Ausubel,F.M.(編),Current Protocols in Molecular Biology,第I~III巻(1997);Glover,N.D.,およびHames,B.D.,編,DNA Cloning:A Practical Approach,第IおよびII巻(1985),Oxford University Press;Freshney,R.I.(編),Animal Cell Culture-a practical approach,IRL Press Limited(1986);Watson,J.D.,ら,Recombinant DNA,第2版,CHSL Press(1992);Winnacker,E.L.,From Genes to Clones;N.Y.,VCH Publishers(1987);Celis,J.,編,Cell Biology,第2版,Academic Press(1998);Freshney,R.I.,Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,第2版,Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)に記載されている。
概要
本発明を実施するための有用な方法および技術は、例えば、Ausubel,F.M.(編),Current Protocols in Molecular Biology,第I~III巻(1997);Glover,N.D.,およびHames,B.D.,編,DNA Cloning:A Practical Approach,第IおよびII巻(1985),Oxford University Press;Freshney,R.I.(編),Animal Cell Culture-a practical approach,IRL Press Limited(1986);Watson,J.D.,ら,Recombinant DNA,第2版,CHSL Press(1992);Winnacker,E.L.,From Genes to Clones;N.Y.,VCH Publishers(1987);Celis,J.,編,Cell Biology,第2版,Academic Press(1998);Freshney,R.I.,Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,第2版,Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)に記載されている。
組換えDNA技術を使用することにより、核酸の誘導体の作製が可能になる。このような誘導体は、例えば、置換、改変、交換、欠失または挿入によって、個々のまたはいくつかのヌクレオチド位置で修飾され得る。修飾または誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって行われ得る。このような修飾は、当業者によって容易に行われ得る(例えば、Sambrook,J.,ら,Molecular Cloning:A laboratory manual(1999)Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA;Hames,B.D.,およびHiggins,S.G.,Nucleic acid hybridization-a practical approach(1985)IRL Press,Oxford,England参照)。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈において特に明白な規定がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「1つの細胞(a cell)」への言及は、複数のそのような細胞、および当業者に公知であるその等価物を含み、他も同様である。同様に、用語「1つの(a)」(または「1つの(an)」)、「1つ以上の」、および「少なくとも1つの」も、本明細書において互換的に使用され得る。用語「含む(comprising)」、「含む(including)」、および「有する(having)」は互換的に使用され得ることにも留意すべきである。
用語「約」は、その後に続く数値の±20%の範囲を意味する。一実施形態において、約という用語は、その後に続く数値の±10%の範囲を意味する。一実施形態において、「約」という用語は、その後に続く数値の±5%の範囲を意味する。
用語「含む(comprising)」は、用語「からなる(consisting of)」も含む。
化合物
本明細書では、本発明の化合物の文脈において、「化合物」という用語は、XBP1の発現または活性を調節することができる任意の分子、特にXBP1プレmRNAのスプライシングを調節してXBP1およびXBP1スプライスバリアント、例えばXBP1エクソン4を欠くmRNAの発現のレベルを増加させることができる任意の分子を意味する。本発明の特定の化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子、およびこのような核酸分子を含むコンジュゲートである。
本明細書では、本発明の化合物の文脈において、「化合物」という用語は、XBP1の発現または活性を調節することができる任意の分子、特にXBP1プレmRNAのスプライシングを調節してXBP1およびXBP1スプライスバリアント、例えばXBP1エクソン4を欠くmRNAの発現のレベルを増加させることができる任意の分子を意味する。本発明の特定の化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子、およびこのような核酸分子を含むコンジュゲートである。
組換え哺乳動物細胞
本明細書で使用される「組換え哺乳動物細胞」という用語は、ポリペプチドを発現することができる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を意味する。そのようなポリペプチドは、該哺乳動物細胞に対して内因性または異種(外因性)のポリペプチドであり得る。そのような組換え哺乳動物細胞は、そのような細胞の子孫を含む、1つ以上の外因性核酸が導入された細胞である。したがって、「異種ポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳動物細胞」という用語は、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ、異種ポリペプチドを発現することができる外因性ヌクレオチド配列を含む細胞を意味する。一実施形態において、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞は、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む細胞であり、この外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1の組換え認識配列および第2の組換え認識配列、ならびに第1の組換え認識配列と第2の組換え認識配列との間に位置する第3の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列はすべて異なっている。
本明細書で使用される「組換え哺乳動物細胞」という用語は、ポリペプチドを発現することができる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を意味する。そのようなポリペプチドは、該哺乳動物細胞に対して内因性または異種(外因性)のポリペプチドであり得る。そのような組換え哺乳動物細胞は、そのような細胞の子孫を含む、1つ以上の外因性核酸が導入された細胞である。したがって、「異種ポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳動物細胞」という用語は、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ、異種ポリペプチドを発現することができる外因性ヌクレオチド配列を含む細胞を意味する。一実施形態において、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞は、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む細胞であり、この外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1の組換え認識配列および第2の組換え認識配列、ならびに第1の組換え認識配列と第2の組換え認識配列との間に位置する第3の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列はすべて異なっている。
そのような「組換え哺乳動物細胞」は、任意の規模で該目的の相同または異種ポリペプチドの産生に使用され得る。
形質転換細胞
外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞は、「形質転換細胞」である。この用語は、継代の回数に関わらず、初代形質転換細胞も、それに由来する子孫も含む。子孫は、例えば、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではなくてもよいが、突然変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物学的活性を有している変異子孫は、包含される。
外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞は、「形質転換細胞」である。この用語は、継代の回数に関わらず、初代形質転換細胞も、それに由来する子孫も含む。子孫は、例えば、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではなくてもよいが、突然変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物学的活性を有している変異子孫は、包含される。
単離
「単離された」組成物とは、その天然環境の成分から分離された組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、電気泳動(例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動法(IEF)、キャピラリー電気泳動、CE-SDS)法またはクロマトグラフィー(例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換もしくは逆相HPLC)法によって測定した場合に95%または99%を超える純度まで精製される。例えば、抗体の純度を評価するための方法の総説については、例えば、Flatman,S.ら,J.Chrom.B 848(2007)79-87を参照されたい。
「単離された」組成物とは、その天然環境の成分から分離された組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、電気泳動(例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動法(IEF)、キャピラリー電気泳動、CE-SDS)法またはクロマトグラフィー(例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換もしくは逆相HPLC)法によって測定した場合に95%または99%を超える純度まで精製される。例えば、抗体の純度を評価するための方法の総説については、例えば、Flatman,S.ら,J.Chrom.B 848(2007)79-87を参照されたい。
「単離された」核酸は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外、または天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「単離された」ポリペプチドまたは抗体は、その天然環境の成分から分離されたポリペプチド分子または抗体分子を指す。
組込み部位
用語「組込み部位」は、外因性ヌクレオチド配列が挿入される、細胞ゲノム内の核酸配列を意味する。特定の実施形態において、組込み部位は、細胞ゲノム中の隣り合う2つのヌクレオチドの間にある。特定の実施形態において、組込み部位は、ヌクレオチド配列のストレッチを含む。特定の実施形態において、組込み部位は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内に位置している。特定の実施形態において、組込み部位は、哺乳動物細胞の内因性遺伝子内にある。
用語「組込み部位」は、外因性ヌクレオチド配列が挿入される、細胞ゲノム内の核酸配列を意味する。特定の実施形態において、組込み部位は、細胞ゲノム中の隣り合う2つのヌクレオチドの間にある。特定の実施形態において、組込み部位は、ヌクレオチド配列のストレッチを含む。特定の実施形態において、組込み部位は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内に位置している。特定の実施形態において、組込み部位は、哺乳動物細胞の内因性遺伝子内にある。
用語「ベクター」または「プラスミド」は、互換的に使用され得、本明細書で使用される場合、それが連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、およびベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
選択マーカー
本明細書で使用される場合、用語「選択マーカー」は、その遺伝子を有する細胞が、対応する選択剤の存在下でポジティブまたはネガティブに特異的に選択されることを可能にする遺伝子を意味する。例えば、限定するわけではないが、選択マーカーにより、その選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、各選択剤の存在下(選択的培養条件下)で、ポジティブに選択されることが可能になり得、形質転換されていない宿主細胞は、選択的培養条件下で増殖することも生存することもできないと考えられる。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、または二機能性であり得る。ポジティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞の選択が可能になり得るのに対し、ネガティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞を選択的に排除することが可能になり得る。選択マーカーは、宿主細胞において薬物に対する耐性を付与することができるか、または代謝もしくは異化の欠陥を補うことができる。原核細胞においては、とりわけ、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、またはクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を使用することができる。真核細胞において選択マーカーとして有用な耐性遺伝子としては、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ(APH)(例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HYG)、ネオマイシン、およびG418 APH)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、チミジンキナーゼ(TK)、グルタミン合成酵素(GS)、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素(インドール)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(ヒスチジノールD))の遺伝子、ならびにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。さらなるマーカー遺伝子は、国際公開第92/08796号および国際公開第94/28143号に記載されている。
本明細書で使用される場合、用語「選択マーカー」は、その遺伝子を有する細胞が、対応する選択剤の存在下でポジティブまたはネガティブに特異的に選択されることを可能にする遺伝子を意味する。例えば、限定するわけではないが、選択マーカーにより、その選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、各選択剤の存在下(選択的培養条件下)で、ポジティブに選択されることが可能になり得、形質転換されていない宿主細胞は、選択的培養条件下で増殖することも生存することもできないと考えられる。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、または二機能性であり得る。ポジティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞の選択が可能になり得るのに対し、ネガティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞を選択的に排除することが可能になり得る。選択マーカーは、宿主細胞において薬物に対する耐性を付与することができるか、または代謝もしくは異化の欠陥を補うことができる。原核細胞においては、とりわけ、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、またはクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を使用することができる。真核細胞において選択マーカーとして有用な耐性遺伝子としては、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ(APH)(例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HYG)、ネオマイシン、およびG418 APH)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、チミジンキナーゼ(TK)、グルタミン合成酵素(GS)、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素(インドール)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(ヒスチジノールD))の遺伝子、ならびにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。さらなるマーカー遺伝子は、国際公開第92/08796号および国際公開第94/28143号に記載されている。
対応する選択剤の存在下での選択を容易にすることを超えて、選択マーカーは、別法として、普通は細胞に存在しない分子、例えば、緑色蛍光性タンパク質(GFP)、高感度GFP(eGFP)、合成GFP、黄色蛍光性タンパク質(YFP)、高感度YFP(eYFP)、シアン蛍光性タンパク質(CFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed単量体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean、およびT-Sapphireであり得る。例えば、コードされるポリペプチドが発する蛍光の検出または不在にそれぞれ基づいて、そのような分子を発現する細胞を、この遺伝子を内部に持たない細胞と区別することができる。
作動可能に連結
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、目的の様式でそれらが機能することを可能にする関係にある、2つ以上の成分の近接した配置を指す。例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサーがコード配列の転写を調節する役割を果たす場合、そのプロモーターおよび/またはエンハンサーはコード配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、「作動可能に連結されて」いるDNA配列は、単一の染色体上で近接し、隣り合っている。特定の実施形態において、例えば、1つの分泌リーダーと1つのポリペプチドといった2つのタンパク質のコード領域を結合する必要があるとき、これら配列は近接し、隣り合い、かつ同じリーディングフレームに存在する。特定の実施形態において、作動可能に連結されたプロモーターは、コード配列の上流に位置しており、かつコード配列に隣り合うことができる。特定の実施形態において、例えば、コード配列の発現を調節するエンハンサー配列に関して、2つの成分は、隣り合ってはいないが、作動可能に連結され得る。エンハンサーがコード配列の転写を増大させる場合、エンハンサーはコード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部、または下流に位置することができ、かつコード配列のプロモーターからかなり離れて位置することができる。作動可能な連結は、当該技術分野で公知の組換え法によって、例えば、PCR方法を用いて、かつ/または好都合な制限部位でのライゲーションによって、達成され得る。好都合な制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の手順に従って使用することができる。内部リボソーム進入部位(IRES)は、それが5’末端に非依存的な方法により内部位置でORFの翻訳を開始できる場合、オープンリーディングフレーム(ORF)に作動可能に連結されている。
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、目的の様式でそれらが機能することを可能にする関係にある、2つ以上の成分の近接した配置を指す。例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサーがコード配列の転写を調節する役割を果たす場合、そのプロモーターおよび/またはエンハンサーはコード配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、「作動可能に連結されて」いるDNA配列は、単一の染色体上で近接し、隣り合っている。特定の実施形態において、例えば、1つの分泌リーダーと1つのポリペプチドといった2つのタンパク質のコード領域を結合する必要があるとき、これら配列は近接し、隣り合い、かつ同じリーディングフレームに存在する。特定の実施形態において、作動可能に連結されたプロモーターは、コード配列の上流に位置しており、かつコード配列に隣り合うことができる。特定の実施形態において、例えば、コード配列の発現を調節するエンハンサー配列に関して、2つの成分は、隣り合ってはいないが、作動可能に連結され得る。エンハンサーがコード配列の転写を増大させる場合、エンハンサーはコード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部、または下流に位置することができ、かつコード配列のプロモーターからかなり離れて位置することができる。作動可能な連結は、当該技術分野で公知の組換え法によって、例えば、PCR方法を用いて、かつ/または好都合な制限部位でのライゲーションによって、達成され得る。好都合な制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の手順に従って使用することができる。内部リボソーム進入部位(IRES)は、それが5’末端に非依存的な方法により内部位置でORFの翻訳を開始できる場合、オープンリーディングフレーム(ORF)に作動可能に連結されている。
外因性
本明細書で使用される場合、用語「外因性」は、あるヌクレオチド配列が特定の細胞に由来せず、DNA送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、または形質転換法によって該細胞に導入されることを示す。したがって、外因性ヌクレオチド配列は人工配列であり、この人工物は、例えば、起源が異なる部分配列の組合せ(例えば、SV40プロモーターを有するリコンビナーゼ認識配列と緑色蛍光性タンパク質のコード配列との組合せは、人工核酸である)から、または配列(例えば、膜結合型受容体の細胞外ドメインのみをコードする配列もしくはcDNA)の部分的な欠失もしくは核酸塩基の突然変異から、生じ得る。用語「内因性」は、細胞に由来するヌクレオチド配列を指す。「外因性」ヌクレオチド配列は、塩基組成が同一である「内因性」対応物を部分的に有し得るが、「外因性」配列は、例えば組換えDNA技術によって細胞に導入されている。
本明細書で使用される場合、用語「外因性」は、あるヌクレオチド配列が特定の細胞に由来せず、DNA送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、または形質転換法によって該細胞に導入されることを示す。したがって、外因性ヌクレオチド配列は人工配列であり、この人工物は、例えば、起源が異なる部分配列の組合せ(例えば、SV40プロモーターを有するリコンビナーゼ認識配列と緑色蛍光性タンパク質のコード配列との組合せは、人工核酸である)から、または配列(例えば、膜結合型受容体の細胞外ドメインのみをコードする配列もしくはcDNA)の部分的な欠失もしくは核酸塩基の突然変異から、生じ得る。用語「内因性」は、細胞に由来するヌクレオチド配列を指す。「外因性」ヌクレオチド配列は、塩基組成が同一である「内因性」対応物を部分的に有し得るが、「外因性」配列は、例えば組換えDNA技術によって細胞に導入されている。
異種
本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、あるポリペプチドが特定の細胞に由来せず、それぞれのコードする核酸が、DNA送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、または形質転換法によって該細胞に導入されていることを示す。したがって、異種ポリペプチドは、それを発現する細胞に対して人工的なポリペプチドであり、そのため、そのポリペプチドが異なる細胞/生物に由来する天然に存在するポリペプチドであるか、または人工ポリペプチドであるかどうかに依存しない。
本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、あるポリペプチドが特定の細胞に由来せず、それぞれのコードする核酸が、DNA送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、または形質転換法によって該細胞に導入されていることを示す。したがって、異種ポリペプチドは、それを発現する細胞に対して人工的なポリペプチドであり、そのため、そのポリペプチドが異なる細胞/生物に由来する天然に存在するポリペプチドであるか、または人工ポリペプチドであるかどうかに依存しない。
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、2つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者に一般に理解されるように定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子またはオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製および単離によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合には、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその修飾が言及される。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、人工のものであり、化学的に合成され、通常は精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば2’糖修飾ヌクレオシドなどのヌクレオシド類似体とも呼ばれる1つ以上の修飾ヌクレオシドを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、1つ以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合のような、1つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、2つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者に一般に理解されるように定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子またはオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製および単離によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合には、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその修飾が言及される。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、人工のものであり、化学的に合成され、通常は精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば2’糖修飾ヌクレオシドなどのヌクレオシド類似体とも呼ばれる1つ以上の修飾ヌクレオシドを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、1つ以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合のような、1つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「ASO」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってsiRNAでもshRNAでもない。いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖であり得る。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己内または自己間の相補性の程度がオリゴヌクレオチドの全長にわたって約50%未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重構造(同じオリゴヌクレオチドの2つの分子間の二重鎖)を形成することができるものと理解される。いくつかの実施形態において、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNAヌクレオシドを含まない。本開示の他の箇所に記載されるように、いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド、例えば2’糖修飾ヌクレオシドを含む。特定の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの非修飾ヌクレオシドは、DNAヌクレオシドである。
本明細書で使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「ASO」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってsiRNAでもshRNAでもない。いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖であり得る。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己内または自己間の相補性の程度がオリゴヌクレオチドの全長にわたって約50%未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重構造(同じオリゴヌクレオチドの2つの分子間の二重鎖)を形成することができるものと理解される。いくつかの実施形態において、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNAヌクレオシドを含まない。本開示の他の箇所に記載されるように、いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド、例えば2’糖修飾ヌクレオシドを含む。特定の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの非修飾ヌクレオシドは、DNAヌクレオシドである。
特定の文脈において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと称され得る。
連続ヌクレオチド配列
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で「連続核酸塩基配列」という用語およびオリゴヌクレオチド「配列モチーフ」という用語と互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「配列モチーフ」という用語は、ヌクレオシド糖の化学的性質および/または設計とは無関係の核酸塩基の配列を表す。いくつかの実施形態において、核酸塩基A、T、CおよびGは修飾され得、例えば、大文字Cは5-メチルシトシンベータ-D-オキシLNAヌクレオシドであり得、RNA配列では、TはUであり得る。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。連続ヌクレオチド配列は、標的核酸または標的配列に相補的であり、場合によっては完全に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの配列である。
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で「連続核酸塩基配列」という用語およびオリゴヌクレオチド「配列モチーフ」という用語と互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「配列モチーフ」という用語は、ヌクレオシド糖の化学的性質および/または設計とは無関係の核酸塩基の配列を表す。いくつかの実施形態において、核酸塩基A、T、CおよびGは修飾され得、例えば、大文字Cは5-メチルシトシンベータ-D-オキシLNAヌクレオシドであり得、RNA配列では、TはUであり得る。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。連続ヌクレオチド配列は、標的核酸または標的配列に相補的であり、場合によっては完全に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの配列である。
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を含み、任意に、さらなるヌクレオチド、例えば、官能基(例えばコンジュゲート基)を連続ヌクレオチド配列に結合するのに使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であり得る。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的ではない。アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、それ自体としてアンチセンスオリゴヌクレオチドより長くなることはできないことと、アンチセンスオリゴヌクレオチドは連続ヌクレオチド配列より短くなることはできないことと、が理解される。
核酸
「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は、複数の核酸を包含することを意図している。いくつかの実施形態において、「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は、インビボまたはインビトロでの標的配列、例えばプレmRNA、mRNA、またはDNAを指す。
「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は、複数の核酸を包含することを意図している。いくつかの実施形態において、「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は、インビボまたはインビトロでの標的配列、例えばプレmRNA、mRNA、またはDNAを指す。
この用語が標的配列中の核酸またはヌクレオチドを指す場合、核酸またはヌクレオチドは、細胞内に天然に存在する配列であり得る。いくつかの実施形態において、「核酸」または「ヌクレオチド」は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド中の配列を指す。この用語がアンチセンスオリゴヌクレオチド中の配列を指す場合、核酸またはヌクレオチドは、天然に存在しない、すなわち、化学的に合成される、酵素的に生成される、組換え産生される、またはそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の核酸またはヌクレオチドは、合成的または組換え的に産生されるが、天然に存在する配列またはその断片ではない。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の核酸またはヌクレオチドは、本来天然に存在しない少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含有するため、天然に存在しない。
「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は、単離された形態であるかまたはポリヌクレオチド中に存在する単一の核酸セグメント、例えばDNA、RNA、またはその類似体を指す。「核酸」または「ヌクレオチド」は、天然に存在する核酸または天然に存在しない核酸を含む。いくつかの実施形態において、「ヌクレオチド」、「単位」および「モノマー」という用語は、互換的に使用される。ヌクレオチドまたはモノマーの配列に言及する場合、言及されるものは、A、T、G、CまたはUおよびその類似体などの塩基の配列であることが認識されるであろう。
この用語が核酸、またはポリペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸を指す場合、核酸またはヌクレオチドは、細胞内の天然に存在する配列または人工配列であり得る。いくつかの実施形態において、核酸は、合成的または組換え的に産生される。
ヌクレオチド
本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語は、糖部分、塩基部分、および共有結合基(結合基)、例えばリン酸またはホスホロチオエートヌクレオチド間結合基を含むグリコシドを指し、天然に存在するヌクレオチド、例えばDNAまたはRNA、ならびに本明細書で「ヌクレオチド類似体」とも呼ばれる修飾された糖および/または塩基部分を含む天然に存在しないヌクレオチドの両方を包含する。本明細書において、単一のヌクレオチド(単位)は、モノマーまたは核酸単位とも称され得る。特定の実施形態において、「ヌクレオチド類似体」という用語は、修飾糖部分を有するヌクレオチドを指す。修飾糖部分(例えば、LNA)を有するヌクレオチドの非限定的な例は、本明細書の他の箇所に開示されている。いくつかの実施形態において、「ヌクレオチド類似体」という用語は、修飾核酸塩基部分を有するヌクレオチドを指す。修飾核酸塩基部分を有するヌクレオチドとしては、5-メチル-シトシン、イソシトシン、5-チオゾロ-シトシン、5-プロピニル-シトシン、プソイドイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニル-ウラシル、チアゾロ-ウラシル、2-チオ-ウラシル、2-チオチミン、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、2,6-ジアミノプリンおよび2-クロロ-6-アミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。当業者が認識するように、オリゴヌクレオチド(例えば、本明細書に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド)の5’末端ヌクレオチドは5’ヌクレオチド間結合基を含まないが、5’末端基を含み得る。
本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語は、糖部分、塩基部分、および共有結合基(結合基)、例えばリン酸またはホスホロチオエートヌクレオチド間結合基を含むグリコシドを指し、天然に存在するヌクレオチド、例えばDNAまたはRNA、ならびに本明細書で「ヌクレオチド類似体」とも呼ばれる修飾された糖および/または塩基部分を含む天然に存在しないヌクレオチドの両方を包含する。本明細書において、単一のヌクレオチド(単位)は、モノマーまたは核酸単位とも称され得る。特定の実施形態において、「ヌクレオチド類似体」という用語は、修飾糖部分を有するヌクレオチドを指す。修飾糖部分(例えば、LNA)を有するヌクレオチドの非限定的な例は、本明細書の他の箇所に開示されている。いくつかの実施形態において、「ヌクレオチド類似体」という用語は、修飾核酸塩基部分を有するヌクレオチドを指す。修飾核酸塩基部分を有するヌクレオチドとしては、5-メチル-シトシン、イソシトシン、5-チオゾロ-シトシン、5-プロピニル-シトシン、プソイドイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニル-ウラシル、チアゾロ-ウラシル、2-チオ-ウラシル、2-チオチミン、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、2,6-ジアミノプリンおよび2-クロロ-6-アミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。当業者が認識するように、オリゴヌクレオチド(例えば、本明細書に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド)の5’末端ヌクレオチドは5’ヌクレオチド間結合基を含まないが、5’末端基を含み得る。
ヌクレオシド
本明細書で使用される「ヌクレオシド」という用語は、糖部分および塩基部分を含むグリコシドを指すために使用され、したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間のヌクレオチド間結合によって共有結合しているヌクレオチド単位を指す場合に使用され得る。バイオテクノロジーの分野では、「ヌクレオチド」という用語は、核酸モノマーまたは単位を指すために使用されることが多い。アンチセンスオリゴヌクレオチドの文脈において、「ヌクレオチド」という用語は、塩基単独、すなわち、シトシン(DNAおよびRNA)、グアニン(DNAおよびRNA)、アデニン(DNAおよびRNA)、チミン(DNA)およびウラシル(RNA)を含む核酸塩基配列を指し得、糖骨格およびヌクレオチド間結合の存在は暗黙的である。同様に、特に1つ以上のヌクレオチド間結合基が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合、「ヌクレオチド」という用語は「ヌクレオシド」を指し得る。例えば、ヌクレオシド間の結合の存在または性質を特定する場合であっても、「ヌクレオチド」という用語が使用され得る。
本明細書で使用される「ヌクレオシド」という用語は、糖部分および塩基部分を含むグリコシドを指すために使用され、したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間のヌクレオチド間結合によって共有結合しているヌクレオチド単位を指す場合に使用され得る。バイオテクノロジーの分野では、「ヌクレオチド」という用語は、核酸モノマーまたは単位を指すために使用されることが多い。アンチセンスオリゴヌクレオチドの文脈において、「ヌクレオチド」という用語は、塩基単独、すなわち、シトシン(DNAおよびRNA)、グアニン(DNAおよびRNA)、アデニン(DNAおよびRNA)、チミン(DNA)およびウラシル(RNA)を含む核酸塩基配列を指し得、糖骨格およびヌクレオチド間結合の存在は暗黙的である。同様に、特に1つ以上のヌクレオチド間結合基が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合、「ヌクレオチド」という用語は「ヌクレオシド」を指し得る。例えば、ヌクレオシド間の結合の存在または性質を特定する場合であっても、「ヌクレオチド」という用語が使用され得る。
ヌクレオチド長
本明細書で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の「ヌクレオチド長」または「長さ」という用語は、所与の配列中のヌクレオチド(モノマー)の総数を意味する。ヌクレオチドおよびヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成単位であり、本開示の目的のために、天然に存在するヌクレオチドおよびヌクレオシドと、天然に存在しないヌクレオチドおよびヌクレオシド(ヌクレオシド/ヌクレオチド類似体)との両方を含む。本来、DNAヌクレオチドおよびRNAヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および1つ以上のリン酸基(ヌクレオシドには存在しない)を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、互換的に「単位」または「モノマー」と称され得る。
本明細書で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の「ヌクレオチド長」または「長さ」という用語は、所与の配列中のヌクレオチド(モノマー)の総数を意味する。ヌクレオチドおよびヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成単位であり、本開示の目的のために、天然に存在するヌクレオチドおよびヌクレオシドと、天然に存在しないヌクレオチドおよびヌクレオシド(ヌクレオシド/ヌクレオチド類似体)との両方を含む。本来、DNAヌクレオチドおよびRNAヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および1つ以上のリン酸基(ヌクレオシドには存在しない)を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、互換的に「単位」または「モノマー」と称され得る。
修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」、または「ヌクレオシド類似体」という用語は、糖部分または(核酸)塩基部分の1つ以上の修飾の導入によって、同等のDNAまたはRNAヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの1つ以上の修飾ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む。「修飾ヌクレオシド」という用語はまた、「ヌクレオシド類似体」、修飾「単位」、または修飾「モノマー」という用語と互換的に使用され得る。非修飾DNAまたはRNA糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではDNAまたはRNAヌクレオシドと称される。いくつかの実施形態において、DNAまたはRNAヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対合可能な場合には、依然としてDNAまたはRNAと称される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに使用され得る修飾ヌクレオシドの非限定的な例としては、LNA、2’-O-MOEおよびモルホリノヌクレオシド類似体が挙げられる。他の修飾ヌクレオシドの例は、本開示の他の箇所に提供される。
本明細書で使用される「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」、または「ヌクレオシド類似体」という用語は、糖部分または(核酸)塩基部分の1つ以上の修飾の導入によって、同等のDNAまたはRNAヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの1つ以上の修飾ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む。「修飾ヌクレオシド」という用語はまた、「ヌクレオシド類似体」、修飾「単位」、または修飾「モノマー」という用語と互換的に使用され得る。非修飾DNAまたはRNA糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではDNAまたはRNAヌクレオシドと称される。いくつかの実施形態において、DNAまたはRNAヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対合可能な場合には、依然としてDNAまたはRNAと称される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに使用され得る修飾ヌクレオシドの非限定的な例としては、LNA、2’-O-MOEおよびモルホリノヌクレオシド類似体が挙げられる。他の修飾ヌクレオシドの例は、本開示の他の箇所に提供される。
高親和性修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される「高親和性修飾ヌクレオシド」は、オリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、例えば融解温度(Tm)によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める修飾ヌクレオチドである。本開示の高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドあたり+0.5~+12℃、場合によっては+1.5~+10℃、他の場合では+3~+8℃の融解温度の上昇をもたらし得る。数多くの高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野で公知であり、例えば、多くの2’置換ヌクレオシドおよびロックド核酸(LNA)が挙げられる(例えば、Freier&Altmann;Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443およびUhlmann;Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),203-213を参照されたい)。
本明細書で使用される「高親和性修飾ヌクレオシド」は、オリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、例えば融解温度(Tm)によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める修飾ヌクレオチドである。本開示の高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドあたり+0.5~+12℃、場合によっては+1.5~+10℃、他の場合では+3~+8℃の融解温度の上昇をもたらし得る。数多くの高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野で公知であり、例えば、多くの2’置換ヌクレオシドおよびロックド核酸(LNA)が挙げられる(例えば、Freier&Altmann;Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443およびUhlmann;Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),203-213を参照されたい)。
修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、2つのヌクレオシドを共に共有結合する、ホスホジエステル(PO)結合以外の結合として当業者に一般的に理解されるように定義される。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、1つ以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合のような、1つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、2つのヌクレオシドを共に共有結合する、ホスホジエステル(PO)結合以外の結合として当業者に一般的に理解されるように定義される。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、1つ以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合のような、1つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、本明細書に開示される)またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも約50%のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%またはそれ以上のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合のすべてが、ホスホロチオエートである。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列のすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであるか、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。
核酸塩基
「核酸塩基」という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン(例えばアデニンおよびグアニン)およびピリミジン(例えばウラシル、チミンおよびシトシン)部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーションの際に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」とは、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、およびヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基と、天然に存在しないバリアントとの両方を指す。このようなバリアントは、例えば、Hiraoら(2012)Accounts of Chemical Research第45巻第2055頁およびBergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1に記載されている。
「核酸塩基」という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン(例えばアデニンおよびグアニン)およびピリミジン(例えばウラシル、チミンおよびシトシン)部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーションの際に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」とは、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、およびヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基と、天然に存在しないバリアントとの両方を指す。このようなバリアントは、例えば、Hiraoら(2012)Accounts of Chemical Research第45巻第2055頁およびBergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1に記載されている。
いくつかの実施形態において、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを修飾プリンまたはピリミジン、例えば置換プリンまたは置換ピリミジン、例えばイソシトシン、プソイドイソシトシン、5-メチルシトシン、5-チオゾロ-シトシン、5-プロピニル-シトシン、5-プロピニル-ウラシル、5-ブロモウラシル、5-チアゾロ-ウラシル、2-チオ-ウラシル、2’-チオ-チミン、イノシン、ジアミノプリン、6-アミノプリン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリンおよび2-クロロ-6-アミノプリンから選択される核酸塩基に変えることにより修飾される。
核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基についての文字コード、例えば、A、T、G、CまたはUにより示され得、各文字は、等価機能の修飾核酸塩基を任意に含み得る。例えば、特定の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基部分は、A、T、G、Cおよび5-メチルシトシンから選択される。任意に、LNAギャップマーについて、5-メチルシトシンLNAヌクレオシドが使用され得る。
修飾オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、1つ以上の修飾ヌクレオシド(例えば、糖修飾ヌクレオシド)および/または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)を表す。「キメラオリゴヌクレオチド」という用語は、修飾ヌクレオシド(例えば、糖修飾ヌクレオシド)およびDNAヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。いくつかの実施形態において、本開示のASOは、キメラオリゴヌクレオチドである。
本明細書で使用される「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、1つ以上の修飾ヌクレオシド(例えば、糖修飾ヌクレオシド)および/または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)を表す。「キメラオリゴヌクレオチド」という用語は、修飾ヌクレオシド(例えば、糖修飾ヌクレオシド)およびDNAヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。いくつかの実施形態において、本開示のASOは、キメラオリゴヌクレオチドである。
アルキル
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、1~8個の炭素原子(C1-8)を有する直鎖または分岐鎖アルキル基、特に1~6個の炭素原子(C1-6)を有する直鎖または分岐鎖アルキル基、より具体的には1~4個の炭素原子(C1-4)を有する直鎖または分岐鎖アルキル基を意味する。直鎖および分岐鎖C1-C8アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチル、異性体ペンチル、異性体ヘキシル、異性体ヘプチル、および異性体オクチル、特に、メチル、エチル、プロピル、ブチル、およびペンチルである。アルキルの特定の例は、メチルである。アルキルのさらなる例は、モノ、ジまたはトリフルオロメチル、エチルまたはプロピル、例えばシクロプロピル(cPr)、またはモノ、ジまたはトリフルオロシクロプロピルである。
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、1~8個の炭素原子(C1-8)を有する直鎖または分岐鎖アルキル基、特に1~6個の炭素原子(C1-6)を有する直鎖または分岐鎖アルキル基、より具体的には1~4個の炭素原子(C1-4)を有する直鎖または分岐鎖アルキル基を意味する。直鎖および分岐鎖C1-C8アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチル、異性体ペンチル、異性体ヘキシル、異性体ヘプチル、および異性体オクチル、特に、メチル、エチル、プロピル、ブチル、およびペンチルである。アルキルの特定の例は、メチルである。アルキルのさらなる例は、モノ、ジまたはトリフルオロメチル、エチルまたはプロピル、例えばシクロプロピル(cPr)、またはモノ、ジまたはトリフルオロシクロプロピルである。
アルコキシ
用語「アルコキシ」は、単独または組み合わせて、式アルキル-O-の基を意味し、ここで、用語「アルキル」は、前に付与した意味、例えばメトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec.ブトキシおよびtert.ブトキシを意味する。特定の「アルコキシ」はメトキシである。
用語「アルコキシ」は、単独または組み合わせて、式アルキル-O-の基を意味し、ここで、用語「アルキル」は、前に付与した意味、例えばメトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec.ブトキシおよびtert.ブトキシを意味する。特定の「アルコキシ」はメトキシである。
二環式糖
本明細書で使用される場合、「二環式糖」という用語は、4~7員環の2つの原子を連結して第2の環を形成し、二環式構造をもたらす架橋を含む4~7員環を含む修飾糖部分を指す。いくつかの実施形態において、架橋は、LNAヌクレオシドにおいて観察されるように、ヌクレオシド(すなわち、2’-4’架橋)のリボース糖環のC2’およびC4’を連結する。
本明細書で使用される場合、「二環式糖」という用語は、4~7員環の2つの原子を連結して第2の環を形成し、二環式構造をもたらす架橋を含む4~7員環を含む修飾糖部分を指す。いくつかの実施形態において、架橋は、LNAヌクレオシドにおいて観察されるように、ヌクレオシド(すなわち、2’-4’架橋)のリボース糖環のC2’およびC4’を連結する。
エクソン
本明細書で使用される場合、本明細書で互換的に使用され得る「エクソン」または「エクソン領域」または「エクソン配列」という用語は、スプライシングおよび他のRNAプロセシング後に、RNAに転写され、RNAの成熟形態、例えばmRNA(メッセンジャーRNA)で表されるヌクレオチドの配列を含む核酸分子を指す。mRNAは、作動可能に連結された1つ以上のエクソンを含む。いくつかの実施形態において、エクソンは、ポリペプチドまたはポリペプチドの一部をコードすることができる。いくつかの実施形態において、エクソンは、非翻訳配列、例えば翻訳調節配列を含み得る。
本明細書で使用される場合、本明細書で互換的に使用され得る「エクソン」または「エクソン領域」または「エクソン配列」という用語は、スプライシングおよび他のRNAプロセシング後に、RNAに転写され、RNAの成熟形態、例えばmRNA(メッセンジャーRNA)で表されるヌクレオチドの配列を含む核酸分子を指す。mRNAは、作動可能に連結された1つ以上のエクソンを含む。いくつかの実施形態において、エクソンは、ポリペプチドまたはポリペプチドの一部をコードすることができる。いくつかの実施形態において、エクソンは、非翻訳配列、例えば翻訳調節配列を含み得る。
イントロン
「イントロン」または「イントロン領域」または「イントロン配列」という用語は、互換的に使用され得、RNAに転写され、次いで典型的にはスプライシングによってRNAから除去されてRNAの成熟形態、例えばmRNAを作製するヌクレオチドの配列を含む核酸分子を指す。いくつかの実施形態において、イントロンのヌクレオチド配列は成熟RNAに組み込まれず、イントロン配列またはその一部は翻訳されてポリペプチドに組み込まれない。スプライスドナーおよびアクセプターなどのスプライスシグナル配列は、RNAからイントロンを除去するために細胞のスプライシング機構によって使用される。いくつかの実施形態において、1つのスプライスバリアントにおけるイントロンは、別のバリアントにおけるエクソン(すなわち、スプライシングされた転写物中に存在する)であり得る。したがって、イントロン融合タンパク質をコードするスプライシングされたmRNAは、エクソンおよびイントロンを含み得る。
「イントロン」または「イントロン領域」または「イントロン配列」という用語は、互換的に使用され得、RNAに転写され、次いで典型的にはスプライシングによってRNAから除去されてRNAの成熟形態、例えばmRNAを作製するヌクレオチドの配列を含む核酸分子を指す。いくつかの実施形態において、イントロンのヌクレオチド配列は成熟RNAに組み込まれず、イントロン配列またはその一部は翻訳されてポリペプチドに組み込まれない。スプライスドナーおよびアクセプターなどのスプライスシグナル配列は、RNAからイントロンを除去するために細胞のスプライシング機構によって使用される。いくつかの実施形態において、1つのスプライスバリアントにおけるイントロンは、別のバリアントにおけるエクソン(すなわち、スプライシングされた転写物中に存在する)であり得る。したがって、イントロン融合タンパク質をコードするスプライシングされたmRNAは、エクソンおよびイントロンを含み得る。
スプライシング
本明細書で使用される場合、「スプライシング」という用語は、プレmRNA中のイントロンが除去され、エクソンが作動可能に連結されてメッセンジャーRNA(mRNA)を作製するRNA成熟のプロセスを指す。
本明細書で使用される場合、「スプライシング」という用語は、プレmRNA中のイントロンが除去され、エクソンが作動可能に連結されてメッセンジャーRNA(mRNA)を作製するRNA成熟のプロセスを指す。
選択的スプライシング
本明細書で使用される場合、「選択的スプライシング」という用語は、遺伝子から複数のmRNAを産生するプロセスを指す。いくつかの実施形態において、選択的スプライシングは、遺伝子のすべてのエクソンよりも少ないエクソンを作動可能に連結すること、および/または遺伝子に由来するすべての転写物に存在しない1つ以上の選択的エクソンを作動可能に連結することを含み得る。
本明細書で使用される場合、「選択的スプライシング」という用語は、遺伝子から複数のmRNAを産生するプロセスを指す。いくつかの実施形態において、選択的スプライシングは、遺伝子のすべてのエクソンよりも少ないエクソンを作動可能に連結すること、および/または遺伝子に由来するすべての転写物に存在しない1つ以上の選択的エクソンを作動可能に連結することを含み得る。
スプライス調節
本明細書で使用される「スプライス調節」という用語は、潜在的スプライシングを修正し、選択的スプライシングを調節し、オープンリーディングフレームを回復させ、タンパク質ノックダウンを誘導するために使用され得るプロセスを指す。本発明の文脈において、スプライス調節は、XBP1プレmRNAの選択的スプライシングを調節してスプライスバリアントを生成するために使用され得る。例えば、スプライス調節は、XBP1プレmRNAの選択的スプライシングを調節してXBP1Δ4 mRNAを生成し、それによってXBP1Δ4タンパク質の発現を増強するために使用され得る。スプライス調節は、プレmRNAの異なるスプライス産物の定量的評価を可能にするRNAシーケンシング(RNA-Seq)によってアッセイされ得る。本発明のいくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン4を含む成熟XBP1 mRNA(mRNA)のレベルを低下させ、エクソン4を欠く成熟XBP1 mRNA(XBP1Δ4 mRNA)のレベルの発現を増加させるように、XBP1プレmRNAのスプライシングを調節する。
本明細書で使用される「スプライス調節」という用語は、潜在的スプライシングを修正し、選択的スプライシングを調節し、オープンリーディングフレームを回復させ、タンパク質ノックダウンを誘導するために使用され得るプロセスを指す。本発明の文脈において、スプライス調節は、XBP1プレmRNAの選択的スプライシングを調節してスプライスバリアントを生成するために使用され得る。例えば、スプライス調節は、XBP1プレmRNAの選択的スプライシングを調節してXBP1Δ4 mRNAを生成し、それによってXBP1Δ4タンパク質の発現を増強するために使用され得る。スプライス調節は、プレmRNAの異なるスプライス産物の定量的評価を可能にするRNAシーケンシング(RNA-Seq)によってアッセイされ得る。本発明のいくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン4を含む成熟XBP1 mRNA(mRNA)のレベルを低下させ、エクソン4を欠く成熟XBP1 mRNA(XBP1Δ4 mRNA)のレベルの発現を増加させるように、XBP1プレmRNAのスプライシングを調節する。
コード領域
本明細書で使用される場合、互換的に使用され得る「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。「終止コドン」(TAG、TGAまたはTAA)は典型的にはアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部と考えられ得る。ただし、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域(「UTR」)などの任意の隣接配列はコード領域の一部ではない。コード領域の境界は、典型的には、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする5’末端の開始コドン、および得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする3’末端の翻訳終止コドンによって決定される。
本明細書で使用される場合、互換的に使用され得る「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。「終止コドン」(TAG、TGAまたはTAA)は典型的にはアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部と考えられ得る。ただし、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域(「UTR」)などの任意の隣接配列はコード領域の一部ではない。コード領域の境界は、典型的には、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする5’末端の開始コドン、および得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする3’末端の翻訳終止コドンによって決定される。
非コード領域
本明細書で使用される「非コード領域」という用語は、コード領域ではないヌクレオチド配列を意味する。非コード領域の例としては、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域(「UTR」)、非コードエクソンなどが挙げられるが、これらに限定されない。エクソンのいくつかは、各転写物の5’非翻訳領域(5’UTR)または3’非翻訳領域(3’UTR)の全体または一部であり得る。非翻訳領域は、転写物の効率的な翻訳、ならびに転写物の翻訳速度および半減期の制御にとって重要である。
本明細書で使用される「非コード領域」という用語は、コード領域ではないヌクレオチド配列を意味する。非コード領域の例としては、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域(「UTR」)、非コードエクソンなどが挙げられるが、これらに限定されない。エクソンのいくつかは、各転写物の5’非翻訳領域(5’UTR)または3’非翻訳領域(3’UTR)の全体または一部であり得る。非翻訳領域は、転写物の効率的な翻訳、ならびに転写物の翻訳速度および半減期の制御にとって重要である。
領域
「領域」という用語は、ヌクレオチド配列の文脈で使用される場合、その配列の一部を指す。例えば、「ヌクレオチド配列内の領域」または「ヌクレオチド配列の相補体内の領域」という語句は、ヌクレオチド配列よりも短いが、それぞれ特定のヌクレオチド配列内またはヌクレオチド配列の相補体内に位置する少なくとも10ヌクレオチドよりも長い配列を指す。「サブシーケンス」または「部分配列」という用語はまた、ヌクレオチド配列の領域を指し得る。
「領域」という用語は、ヌクレオチド配列の文脈で使用される場合、その配列の一部を指す。例えば、「ヌクレオチド配列内の領域」または「ヌクレオチド配列の相補体内の領域」という語句は、ヌクレオチド配列よりも短いが、それぞれ特定のヌクレオチド配列内またはヌクレオチド配列の相補体内に位置する少なくとも10ヌクレオチドよりも長い配列を指す。「サブシーケンス」または「部分配列」という用語はまた、ヌクレオチド配列の領域を指し得る。
下流および上流
「下流」という用語は、ヌクレオチド配列に言及する場合、核酸またはヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列に対して3’側に位置することを意味する。特定の実施形態において、下流ヌクレオチド配列は、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写の開始部位の下流に位置する。
「下流」という用語は、ヌクレオチド配列に言及する場合、核酸またはヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列に対して3’側に位置することを意味する。特定の実施形態において、下流ヌクレオチド配列は、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写の開始部位の下流に位置する。
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の5’側に位置するヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態において、上流ヌクレオチド配列は、転写の開始点に先行する配列に関する。例えば、遺伝子のプロモーター配列は、転写の開始部位の上流に位置する。
調節領域
本明細書で使用される場合、「調節領域」という用語は、コード領域の上流(5’非コード配列)、内部、または下流(3’非コード配列)に位置し、関連するコード領域の転写、RNAプロセシング、安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節領域は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位、UTR、およびステムループ構造を含み得る。コード領域が真核細胞における発現を意図する場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の3’側に位置する。
本明細書で使用される場合、「調節領域」という用語は、コード領域の上流(5’非コード配列)、内部、または下流(3’非コード配列)に位置し、関連するコード領域の転写、RNAプロセシング、安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節領域は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位、UTR、およびステムループ構造を含み得る。コード領域が真核細胞における発現を意図する場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の3’側に位置する。
標的配列
本明細書で使用される「標的配列」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指し、すなわち本発明の文脈において、哺乳動物のXBP1プレmRNA配列は標的核酸であり、標的配列は、エクソン4のスプライシングを調節するために効果的に標的とされ得る標的核酸の領域であり、例えばXBP1エクソン4、ならびにXBP1プレmRNA転写物のエクソン4に隣接する領域5’および/または3’を含む。
本明細書で使用される「標的配列」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指し、すなわち本発明の文脈において、哺乳動物のXBP1プレmRNA配列は標的核酸であり、標的配列は、エクソン4のスプライシングを調節するために効果的に標的とされ得る標的核酸の領域であり、例えばXBP1エクソン4、ならびにXBP1プレmRNA転写物のエクソン4に隣接する領域5’および/または3’を含む。
例えば、本発明の場合、標的核酸は、ハムスターXBP1プレmRNA(配列番号1、特に配列番号1のヌクレオチド2960~3113)、マウスXBP1プレmRNA(配列番号590)またはヒトXBP1プレmRNA(配列番号801)であり得る。
いくつかの実施形態において、標的配列は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列、または標的領域と称され得る。いくつかの実施形態において、標的配列は、単一のアンチセンスオリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば、本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドにより標的とされ得る標的核酸の好ましい領域を表し得る。
細胞または標的細胞
本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、標的核酸を発現する細胞を指す。いくつかの実施形態において、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞もしくはラット細胞、またはハムスター細胞、例えばCHO細胞、または霊長類細胞、例えばサル細胞もしくはヒト細胞を含む。いくつかの実施形態において、標的細胞は、XBP1標的核酸を発現しているトランスジェニック哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば異種発現を介してXBP1Δ4 mRNAを発現しているトランスジェニック動物細胞である。
本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、標的核酸を発現する細胞を指す。いくつかの実施形態において、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞もしくはラット細胞、またはハムスター細胞、例えばCHO細胞、または霊長類細胞、例えばサル細胞もしくはヒト細胞を含む。いくつかの実施形態において、標的細胞は、XBP1標的核酸を発現しているトランスジェニック哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば異種発現を介してXBP1Δ4 mRNAを発現しているトランスジェニック動物細胞である。
異種タンパク質発現におけるその一般的な使用のために、タンパク質発現方法で使用するための好ましい細胞は、ハムスター細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)であり、特に懸濁状態で増殖するCHO-K1細胞が好ましい。
神経変性障害における本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療的適用のために、標的細胞はニューロン細胞であり得る。
典型的には、本発明の標的細胞は、細胞内で成熟XBP1 mRNAにプロセシングされ、XBP1-E4タンパク質(XBPuとも呼ばれる)およびXBP1Δ4転写バリアントの両方の発現をもたらすXBP1プレmRNAを発現する。本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、XBP1エクソン4を欠くXBP1 mRNAの割合を増加させるためにXBP1プレmRNAのスプライシングを調節する。好適には、それによって、XBP1-E4転写バリアントと比較して、XBP1Δ4転写バリアントの発現を増加させることができる。
相補性
「相補性」または「核酸塩基相補性」という用語は、本明細書で互換的に使用され得、ヌクレオシド/ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対合能を表す。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン(G)-シトシン(C)およびアデニン(A)-チミン(T)/ウラシル(U)である。
「相補性」または「核酸塩基相補性」という用語は、本明細書で互換的に使用され得、ヌクレオシド/ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対合能を表す。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン(G)-シトシン(C)およびアデニン(A)-チミン(T)/ウラシル(U)である。
オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでいてもよく、例えば5-メチルシトシンは、しばしばシトシンの代わりに用いられ、したがって、相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のワトソン・クリック塩基対合を包含することが理解されよう(例えば、Hiraoら(2012)Accounts of Chemical Research第45巻第2055頁およびBergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1を参照されたい)。
用語「%相補的」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列(例えば、標的配列または配列モチーフ)に対して相補的である、核酸分子(例えば、オリゴヌクレオチド)内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合(パーセント)を指す。したがって、相補性のパーセンテージは、2つの配列間(標的配列5’-3’と3’-5’からのオリゴヌクレオチド配列とを整列させた場合)で相補的である(ワトソン・クリック塩基対から)整列した核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、100を掛けることによって計算される。このような比較において、整列(塩基対を形成)しない核酸塩基/ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の%相補性の計算において許容されない。相補性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう(例えば、5’-メチルシトシンは、%同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であるとみなされる)。
本発明内で、「相補的」という用語は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、XBP1プレmRNA転写物に対して少なくとも約80%相補的であるか、または少なくとも約90%相補的であることを必要とする。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ハムスター(配列番号1)、マウス(配列番号590)またはヒト(配列番号801)XBP1プレmRNA転写物に対して少なくとも約80%、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%または少なくとも約99%相補的であり得る。言い換えれば、いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つ、2つ、3つまたはそれを超えるミスマッチを含んでいてもよく、ミスマッチは、その標的と塩基対を形成しない本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドである。
「完全に相補的な」という用語は、100%の相補性を指す。
相補体
本明細書で使用される「相補体」という用語は、参照配列に相補的な配列を示す。相補性は、2つのDNAまたはRNA配列間で共有される特性であるので、それらが互いに逆平行に整列されると、鏡を見て逆を見るのと同様に、配列中の各位置のヌクレオチド塩基が相補的になるように、相補性はDNA複製および転写の基本原理(ワトソン・クリック塩基対合)であることは周知である。したがって、例えば、5’-ATGC-3’の配列の相補体は、3’-TACG-5’または5’-GCAT-3’と書かれ得る。本明細書で使用される「逆相補体」、「逆相補的」、および「逆相補性」という用語は、「相補体」、「相補的」、および「相補性」という用語と互換的である。
本明細書で使用される「相補体」という用語は、参照配列に相補的な配列を示す。相補性は、2つのDNAまたはRNA配列間で共有される特性であるので、それらが互いに逆平行に整列されると、鏡を見て逆を見るのと同様に、配列中の各位置のヌクレオチド塩基が相補的になるように、相補性はDNA複製および転写の基本原理(ワトソン・クリック塩基対合)であることは周知である。したがって、例えば、5’-ATGC-3’の配列の相補体は、3’-TACG-5’または5’-GCAT-3’と書かれ得る。本明細書で使用される「逆相補体」、「逆相補的」、および「逆相補性」という用語は、「相補体」、「相補的」、および「相補性」という用語と互換的である。
同一性
本明細書で使用される「同一性」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列(例えば、配列モチーフ)と同一である、核酸分子(例えば、オリゴヌクレオチド)内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合(パーセントで表される)を指す。
本明細書で使用される「同一性」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列(例えば、配列モチーフ)と同一である、核酸分子(例えば、オリゴヌクレオチド)内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合(パーセントで表される)を指す。
したがって、同一性のパーセンテージは、2つの配列(本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列および参照配列における)の間で同一の(一致する)整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、100を掛けることによって計算される。したがって、同一性のパーセンテージ=(一致数×100)/整列領域(例えば、連続ヌクレオチド配列)の長さ。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージの計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう(例えば、5-メチルシトシンは、%同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であるとみなされる)。
本明細書で使用される場合、「相同」および「相同性」という用語は、「同一性」および「同一」という用語と互換的である。
天然に存在するバリアント
「天然に存在するバリアント」という用語は、定義された分類群、例えば哺乳動物、例えばマウス、ラット、チャイニーズハムスター、サルおよびヒトの中で天然に存在するXBP1ポリペプチド配列またはXBP1核酸配列(例えば、転写物)のバリアントを指す。典型的には、ポリヌクレオチドの「天然に存在するバリアント」に言及する場合、この用語はまた、染色体転座または重複によるXBP1をコードするゲノムDNAの任意の対立遺伝子バリアント、およびRNA、例えばそれに由来するmRNAを包含し得る。「天然に存在するバリアント」はまた、XBP1 mRNAの選択的スプライシングに由来するバリアントを含み得る。特定のポリペプチド配列、例えばXBP1に言及する場合、この用語は、天然に存在する形態のタンパク質も含み、したがって、これは、例えば、翻訳時修飾または翻訳後修飾、例えばシグナルペプチド切断、タンパク質分解的切断、グリコシル化などによってプロセシングされ得る。いくつかの実施形態において、天然に存在するバリアントは、哺乳動物XBP1標的核酸、例えば、配列番号1(ハムスター)、配列番号590(マウス)または配列番号801(ヒト)に示されるものに対して少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%またはそれを超える相同性を有する。いくつかの実施形態において、天然に存在するバリアントは、配列番号1のハムスターXBP1標的核酸に対して少なくとも99%相同性を有する。いくつかの実施形態において、天然に存在するバリアントは、配列番号590のマウスXBP1標的核酸に対して少なくとも99%相同性を有する。いくつかの実施形態において、天然に存在するバリアントは、配列番号801のヒトXBP1標的核酸に対して少なくとも99%相同性を有する。
「天然に存在するバリアント」という用語は、定義された分類群、例えば哺乳動物、例えばマウス、ラット、チャイニーズハムスター、サルおよびヒトの中で天然に存在するXBP1ポリペプチド配列またはXBP1核酸配列(例えば、転写物)のバリアントを指す。典型的には、ポリヌクレオチドの「天然に存在するバリアント」に言及する場合、この用語はまた、染色体転座または重複によるXBP1をコードするゲノムDNAの任意の対立遺伝子バリアント、およびRNA、例えばそれに由来するmRNAを包含し得る。「天然に存在するバリアント」はまた、XBP1 mRNAの選択的スプライシングに由来するバリアントを含み得る。特定のポリペプチド配列、例えばXBP1に言及する場合、この用語は、天然に存在する形態のタンパク質も含み、したがって、これは、例えば、翻訳時修飾または翻訳後修飾、例えばシグナルペプチド切断、タンパク質分解的切断、グリコシル化などによってプロセシングされ得る。いくつかの実施形態において、天然に存在するバリアントは、哺乳動物XBP1標的核酸、例えば、配列番号1(ハムスター)、配列番号590(マウス)または配列番号801(ヒト)に示されるものに対して少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%またはそれを超える相同性を有する。いくつかの実施形態において、天然に存在するバリアントは、配列番号1のハムスターXBP1標的核酸に対して少なくとも99%相同性を有する。いくつかの実施形態において、天然に存在するバリアントは、配列番号590のマウスXBP1標的核酸に対して少なくとも99%相同性を有する。いくつかの実施形態において、天然に存在するバリアントは、配列番号801のヒトXBP1標的核酸に対して少なくとも99%相同性を有する。
対応する
2つの別個の核酸またはヌクレオチド配列を参照する場合、本明細書で互換的に使用され得る「対応する(corresponding to)」および「対応する(corresponds to)」という用語は、相同性および/または機能性に基づいて互いに対応するまたは類似する配列の領域を明確にするために使用され得るが、特定の配列のヌクレオチドには異なる番号を付すことができる。例えば、遺伝子転写物の異なるアイソフォームは、ヌクレオチド配列の類似のまたは保存された部分を有することができ、そのナンバリングは、選択的スプライシングおよび/または他の修飾に基づいてそれぞれのアイソフォームにおいて異なり得る。さらに、核酸またはヌクレオチド配列を特徴付けるときに異なるナンバリングシステムを使用できることが認識されている(例えば、遺伝子転写物、および翻訳開始コドンから配列のナンバリングを開始するか、または5’UTRを含めるかどうか)。さらに、遺伝子または遺伝子転写物の異なるバリアントの核酸またはヌクレオチド配列は変化し得ることが認識されている。しかしながら、本明細書で使用される場合、核酸またはヌクレオチド配列の相同性および/または機能性を共有するバリアントの領域は、互いに「対応する」とみなされる。例えば、配列番号1(「参照配列」)のヌクレオチドX~Yに対応するXBP1転写物のヌクレオチド配列は、配列番号1のヌクレオチドX~Yと同一の配列または類似の配列を有するXBP1転写物配列(例えば、XBP1プレmRNAまたはmRNA)を指し、Xは開始部位であり、Yは終了部位である。当業者は、XBP1転写物配列を配列番号1と整列させることによって、XBP1転写物配列中の対応するXおよびY残基を同定することができる。
2つの別個の核酸またはヌクレオチド配列を参照する場合、本明細書で互換的に使用され得る「対応する(corresponding to)」および「対応する(corresponds to)」という用語は、相同性および/または機能性に基づいて互いに対応するまたは類似する配列の領域を明確にするために使用され得るが、特定の配列のヌクレオチドには異なる番号を付すことができる。例えば、遺伝子転写物の異なるアイソフォームは、ヌクレオチド配列の類似のまたは保存された部分を有することができ、そのナンバリングは、選択的スプライシングおよび/または他の修飾に基づいてそれぞれのアイソフォームにおいて異なり得る。さらに、核酸またはヌクレオチド配列を特徴付けるときに異なるナンバリングシステムを使用できることが認識されている(例えば、遺伝子転写物、および翻訳開始コドンから配列のナンバリングを開始するか、または5’UTRを含めるかどうか)。さらに、遺伝子または遺伝子転写物の異なるバリアントの核酸またはヌクレオチド配列は変化し得ることが認識されている。しかしながら、本明細書で使用される場合、核酸またはヌクレオチド配列の相同性および/または機能性を共有するバリアントの領域は、互いに「対応する」とみなされる。例えば、配列番号1(「参照配列」)のヌクレオチドX~Yに対応するXBP1転写物のヌクレオチド配列は、配列番号1のヌクレオチドX~Yと同一の配列または類似の配列を有するXBP1転写物配列(例えば、XBP1プレmRNAまたはmRNA)を指し、Xは開始部位であり、Yは終了部位である。当業者は、XBP1転写物配列を配列番号1と整列させることによって、XBP1転写物配列中の対応するXおよびY残基を同定することができる。
ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される「ハイブリダイズ」または「ハイブリダイズする」という用語は、2つの核酸鎖(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび標的核酸)が対向する鎖上の塩基対間に水素結合を形成することにより二重鎖を形成することと理解されるべきである。2つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、度々、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される、融解温度(Tm)の観点から説明される。生理学的条件では、Tmは、親和性に厳密に比例しない(MergnyおよびLacroix,2003,Oligonucleotides 13:515-537)。標準状態ギブス自由エネルギーΔG°は、結合親和性をより正確に表し、ΔG°=-RTln(Kd)によって反応の解離定数(Kd)に関連付けられ、式中、Rは気体定数であり、Tは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔG°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔG°は、水溶液濃度が1M、pHが7、温度が37℃である反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合のΔG°は、ゼロ未満である。ΔG°は、例えば、Hansenら,1965,Chem.Comm.36-38およびHoldgateら,2005,Drug Discov Todayに記載されているように、例えば等温滴定熱量測定(ITC)法を使用することによって、実験的に測定され得る。当業者は、ΔG°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔG°はまた、SantaLucia,1998,Proc Natl Acad Sci USA.95:1460-1465に記載されているように、Sugimotoら,1995,Biochemistry 34:11211-11216およびMcTigueら,2004,Biochemistry 43:5388-5405に記載されている適切に誘導した熱力学パラメータを使用して、最近接モデル(nearest neighbor model)を用いることにより数値的に推定され得る。
本明細書で使用される「ハイブリダイズ」または「ハイブリダイズする」という用語は、2つの核酸鎖(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび標的核酸)が対向する鎖上の塩基対間に水素結合を形成することにより二重鎖を形成することと理解されるべきである。2つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、度々、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される、融解温度(Tm)の観点から説明される。生理学的条件では、Tmは、親和性に厳密に比例しない(MergnyおよびLacroix,2003,Oligonucleotides 13:515-537)。標準状態ギブス自由エネルギーΔG°は、結合親和性をより正確に表し、ΔG°=-RTln(Kd)によって反応の解離定数(Kd)に関連付けられ、式中、Rは気体定数であり、Tは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔG°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔG°は、水溶液濃度が1M、pHが7、温度が37℃である反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合のΔG°は、ゼロ未満である。ΔG°は、例えば、Hansenら,1965,Chem.Comm.36-38およびHoldgateら,2005,Drug Discov Todayに記載されているように、例えば等温滴定熱量測定(ITC)法を使用することによって、実験的に測定され得る。当業者は、ΔG°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔG°はまた、SantaLucia,1998,Proc Natl Acad Sci USA.95:1460-1465に記載されているように、Sugimotoら,1995,Biochemistry 34:11211-11216およびMcTigueら,2004,Biochemistry 43:5388-5405に記載されている適切に誘導した熱力学パラメータを使用して、最近接モデル(nearest neighbor model)を用いることにより数値的に推定され得る。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、10~30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して-10kcal未満の推定ΔG°値で標的核酸にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔG°により測定される。オリゴヌクレオチドは、8~30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して-10kcalの範囲未満、例えば-15kcal未満、例えば-20kcal未満、および例えば-25kcal未満の推定ΔG°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、-10~-60kcal、例えば-12~-40、例えば-15~-30kcal、または-16~-27kcal、例えば-18~-25kcalの推定ΔG°値で、標的核酸にハイブリダイズする。
転写物
本明細書で使用される「転写物」という用語は、DNAの転写によって合成され、プロセシング後にメッセンジャーRNA(mRNA)、すなわち前駆体メッセンジャーRNA(プレmRNA)になる一次転写物、およびプロセシングされたmRNA自体を指し得る。「転写物」という用語は、「プレmRNA」および「mRNA」と互換的に使用され得る。DNA鎖が一次転写物に転写された後、新たに合成された一次転写物は、異なるタンパク質およびRNA、例えばmRNA、tRNA、rRNA、lncRNA、miRNAなどを生成するために、それらの成熟した機能的形態に変換されるようにいくつかの方法で修飾される。したがって、用語「転写物」は、エクソン、イントロン、5’-UTRおよび3’-UTRを含み得る。
本明細書で使用される「転写物」という用語は、DNAの転写によって合成され、プロセシング後にメッセンジャーRNA(mRNA)、すなわち前駆体メッセンジャーRNA(プレmRNA)になる一次転写物、およびプロセシングされたmRNA自体を指し得る。「転写物」という用語は、「プレmRNA」および「mRNA」と互換的に使用され得る。DNA鎖が一次転写物に転写された後、新たに合成された一次転写物は、異なるタンパク質およびRNA、例えばmRNA、tRNA、rRNA、lncRNA、miRNAなどを生成するために、それらの成熟した機能的形態に変換されるようにいくつかの方法で修飾される。したがって、用語「転写物」は、エクソン、イントロン、5’-UTRおよび3’-UTRを含み得る。
発現
本明細書で使用される「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えばRNAまたはポリペプチドを産生するプロセスを指す。これには、限定されないが、メッセンジャーRNA(mRNA)へのポリヌクレオチドの転写およびポリペプチドへのmRNAの翻訳が含まれる。発現は「遺伝子産物」をもたらす。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーRNA、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載の遺伝子産物には、転写後修飾、例えばポリアデニル化もしくはスプライシングを有する核酸、または翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、もしくはタンパク質分解的切断を有するポリペプチドがさらに含まれる。
本明細書で使用される「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えばRNAまたはポリペプチドを産生するプロセスを指す。これには、限定されないが、メッセンジャーRNA(mRNA)へのポリヌクレオチドの転写およびポリペプチドへのmRNAの翻訳が含まれる。発現は「遺伝子産物」をもたらす。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーRNA、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載の遺伝子産物には、転写後修飾、例えばポリアデニル化もしくはスプライシングを有する核酸、または翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、もしくはタンパク質分解的切断を有するポリペプチドがさらに含まれる。
化合物番号
本明細書で使用される「化合物番号(Compound Number)」または「化合物番号(Comp No.)」という用語は、成分、例えばヌクレオシド(例えば、DNA)、ヌクレオシド類似体(例えば、LNA、例えば、ベータ-D-オキシ-LNA)、核酸塩基(例えば、A、T、G、C、U、またはMC)および骨格構造(例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジエステル)の詳細な化学構造を有するヌクレオチド配列に与えられる固有の番号を指す。
本明細書で使用される「化合物番号(Compound Number)」または「化合物番号(Comp No.)」という用語は、成分、例えばヌクレオシド(例えば、DNA)、ヌクレオシド類似体(例えば、LNA、例えば、ベータ-D-オキシ-LNA)、核酸塩基(例えば、A、T、G、C、U、またはMC)および骨格構造(例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジエステル)の詳細な化学構造を有するヌクレオチド配列に与えられる固有の番号を指す。
配列番号への言及は、特定の核酸配列を含むが、いかなる設計または完全な化学構造も含まない。さらに、本明細書の実施例に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、代表的な設計を示すが、特に指示しない限り、示される特定の設計に限定されない。
対象
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後診断または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、飼育動物、家畜、スポーツ動物、および動物園動物(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマなどを含む)が含まれる。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後診断または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、飼育動物、家畜、スポーツ動物、および動物園動物(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマなどを含む)が含まれる。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
いくつかの実施形態において、対象は、タンパク質病理学的疾患に罹患しているか、またはタンパク質病理学的疾患を発症するリスクがあるヒトである。
医薬組成物
「医薬組成物」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ組成物が投与される対象に許容できないほどに有毒なさらなる成分を含有しない調製物を指す。そのような組成物は無菌であり得る。
「医薬組成物」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ組成物が投与される対象に許容できないほどに有毒なさらなる成分を含有しない調製物を指す。そのような組成物は無菌であり得る。
タンパク質病理学的疾患
タンパク質病理学的疾患(プロテオパチー、プロテイノパチー、タンパク質コンフォメーション障害、またはタンパク質ミスフォールディング疾患としても知られている)には、プリオン病、例えばクロイツフェルト・ヤコブ病;タウオパチー、例えばアルツハイマー病;シヌクレイノパチー、例えばパーキンソン病;アミロイドーシス、多系統萎縮症;およびTDP-43病態、例えば筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭葉変性症(FTLD);CAGリピート病、例えば脊髄小脳失調症、例えば脊髄小脳失調症1型、脊髄小脳失調症2型(SCA2)および脊髄小脳失調症3型(SCA3、マチャド・ジョセフ病)などの疾患が含まれる。
タンパク質病理学的疾患(プロテオパチー、プロテイノパチー、タンパク質コンフォメーション障害、またはタンパク質ミスフォールディング疾患としても知られている)には、プリオン病、例えばクロイツフェルト・ヤコブ病;タウオパチー、例えばアルツハイマー病;シヌクレイノパチー、例えばパーキンソン病;アミロイドーシス、多系統萎縮症;およびTDP-43病態、例えば筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭葉変性症(FTLD);CAGリピート病、例えば脊髄小脳失調症、例えば脊髄小脳失調症1型、脊髄小脳失調症2型(SCA2)および脊髄小脳失調症3型(SCA3、マチャド・ジョセフ病)などの疾患が含まれる。
有効量
本明細書に開示される組成物(例えば、化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはそのコンジュゲートもしくは塩を含む組成物)の「有効量」は、具体的に述べられた目的を実行するのに十分な量を指す。「有効量」は、述べられた目的に関連して、経験的にかつ日常的な方法で決定され得る。
本明細書に開示される組成物(例えば、化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはそのコンジュゲートもしくは塩を含む組成物)の「有効量」は、具体的に述べられた目的を実行するのに十分な量を指す。「有効量」は、述べられた目的に関連して、経験的にかつ日常的な方法で決定され得る。
処置
「処置すること(treating)」または「処置(treatment)」または「処置する(to treat)」または「緩和すること(alleviating)」または「緩和する(to alleviate)」などの用語は、(1)診断された病理学的状態もしくは障害の治癒、減速、症状の軽減、および/または進行の停止を行う治療的手段と、(2)標的病理学的状態または障害、例えばタンパク質病理学的疾患の発症を予防および/または減速する予防的(prophylactic)または予防的(preventative)手段の両方を指す。したがって、処置が必要なものとしては、障害を既に有するもの、障害を有する傾向があるもの、および障害を予防する必要があるものが挙げられる。特定の実施形態において、患者が、例えば、疾患または障害に関連する症状の全体的、部分的、または一過性の緩和または排除を示す場合、対象は、本明細書で提供される方法に従って、本明細書の他の箇所に開示される疾患または状態に対して成功裏に「処置」される。
「処置すること(treating)」または「処置(treatment)」または「処置する(to treat)」または「緩和すること(alleviating)」または「緩和する(to alleviate)」などの用語は、(1)診断された病理学的状態もしくは障害の治癒、減速、症状の軽減、および/または進行の停止を行う治療的手段と、(2)標的病理学的状態または障害、例えばタンパク質病理学的疾患の発症を予防および/または減速する予防的(prophylactic)または予防的(preventative)手段の両方を指す。したがって、処置が必要なものとしては、障害を既に有するもの、障害を有する傾向があるもの、および障害を予防する必要があるものが挙げられる。特定の実施形態において、患者が、例えば、疾患または障害に関連する症状の全体的、部分的、または一過性の緩和または排除を示す場合、対象は、本明細書で提供される方法に従って、本明細書の他の箇所に開示される疾患または状態に対して成功裏に「処置」される。
抗体
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Kabat,E.A.,ら,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)に示されている。
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Kabat,E.A.,ら,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)に示されている。
本明細書で使用される場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Kabat,ら,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)において説明されるKabatナンバリングシステムによりナンバリングされ、本明細書では「Kabatによるナンバリング」と称される。具体的には、Kabat,ら,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)のKabatナンバリングシステム(第647~660頁を参照されたい)は、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLに使用され、Kabat,ら,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)のKabat EUインデックスナンバリングシステム(第661~723頁を参照されたい)は、重鎖定常ドメイン(CH1、ヒンジ、CH2およびCH3であって、本明細書では、この場合には、「Kabat EUインデックスによるナンバリング」と称することによってさらに明確にされている)に使用される。
本明細書での「抗体」という用語は、最も広義に使用され、全長抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、および抗体-抗体断片-融合物ならびにそれらの組合せを含む様々な抗体構造を包含するが、これらに限定されない。
天然抗体
「天然抗体」という用語は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、天然IgG抗体は、ジスルフィド結合されている2つの同一の軽鎖および2つの同一の重鎖で構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に、各重鎖は、重鎖可変領域(VH)とそれに続く3つの重鎖定常ドメイン(CH1、CH2、およびCH3)を有し、それにより、第1の重鎖定常ドメインと第2の重鎖定常ドメインとの間にヒンジ領域が配置される。同様に、N末端からC末端に、各軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)とそれに続く軽鎖定常ドメイン(CL)を有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる2種類の1つに割り当てられてもよい。
「天然抗体」という用語は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、天然IgG抗体は、ジスルフィド結合されている2つの同一の軽鎖および2つの同一の重鎖で構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に、各重鎖は、重鎖可変領域(VH)とそれに続く3つの重鎖定常ドメイン(CH1、CH2、およびCH3)を有し、それにより、第1の重鎖定常ドメインと第2の重鎖定常ドメインとの間にヒンジ領域が配置される。同様に、N末端からC末端に、各軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)とそれに続く軽鎖定常ドメイン(CL)を有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる2種類の1つに割り当てられてもよい。
全長抗体
「全長抗体」という用語は、天然抗体の構造と実質的に類似した構造を有する抗体を意味する。全長抗体は、それぞれがN末端からC末端の方向に、軽鎖可変領域および軽鎖定常ドメインを含む2つの全長抗体軽鎖、ならびにそれぞれがN末端からC末端の方向に、重鎖可変領域、第1の重鎖定常ドメイン、ヒンジ領域、第2の重鎖定常ドメイン、および第3の重鎖定常ドメインを含む、2つの全長抗体重鎖を含む。天然抗体とは対照的に、全長抗体は、1つ以上の追加のscFv、または重鎖もしくは軽鎖Fab断片、または、全長抗体の異なる鎖の1つ以上の末端にコンジュゲートしているが各末端には1つの断片のみであるscFabなどのさらなる免疫グロブリンドメインを含んでもよい。これらのコンジュゲートもまた、全長抗体という用語により包含される。
「全長抗体」という用語は、天然抗体の構造と実質的に類似した構造を有する抗体を意味する。全長抗体は、それぞれがN末端からC末端の方向に、軽鎖可変領域および軽鎖定常ドメインを含む2つの全長抗体軽鎖、ならびにそれぞれがN末端からC末端の方向に、重鎖可変領域、第1の重鎖定常ドメイン、ヒンジ領域、第2の重鎖定常ドメイン、および第3の重鎖定常ドメインを含む、2つの全長抗体重鎖を含む。天然抗体とは対照的に、全長抗体は、1つ以上の追加のscFv、または重鎖もしくは軽鎖Fab断片、または、全長抗体の異なる鎖の1つ以上の末端にコンジュゲートしているが各末端には1つの断片のみであるscFabなどのさらなる免疫グロブリンドメインを含んでもよい。これらのコンジュゲートもまた、全長抗体という用語により包含される。
抗体結合部位
「抗体結合部位」という用語は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの対を意味する。抗原への適切な結合を確実にするために、これらの可変ドメインは同族の可変ドメインであり、すなわち一緒に属する。抗体結合部位は、少なくとも3つのHVR(例えば、VHHの場合)または3~6つのHVR(例えば、天然に存在する、すなわち、VH/VL対を有する従来の抗体の場合)を含む。一般に、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基が、結合部位を形成する。これらの残基は通常、抗体重鎖可変ドメインと対応する抗体軽鎖可変ドメインの対に含まれる。抗体の抗原結合部位は、「超可変領域」または「HVR」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「FR」領域は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインは、N末端からC末端に向けて、領域FR1、HVR1、FR2、HVR2、FR3、HVR3、およびFR4を含む。特に、重鎖可変ドメインのHVR3領域は、抗原結合に最も寄与し、抗体の結合特異性を定義する領域である。「機能的結合部位」は、その標的に特異的に結合することができる。「特異的に結合する」という用語は、インビトロアッセイにおいて、一実施形態では結合アッセイにおいて、その標的への結合部位の結合を意味する。そのような結合アッセイは、結合事象が検出され得る限り、任意のアッセイであり得る。例えば、抗体を表面に結合させ、該抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定される、結合アッセイである。あるいは、ブリッジングELISAを使用することができる。
「抗体結合部位」という用語は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの対を意味する。抗原への適切な結合を確実にするために、これらの可変ドメインは同族の可変ドメインであり、すなわち一緒に属する。抗体結合部位は、少なくとも3つのHVR(例えば、VHHの場合)または3~6つのHVR(例えば、天然に存在する、すなわち、VH/VL対を有する従来の抗体の場合)を含む。一般に、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基が、結合部位を形成する。これらの残基は通常、抗体重鎖可変ドメインと対応する抗体軽鎖可変ドメインの対に含まれる。抗体の抗原結合部位は、「超可変領域」または「HVR」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「FR」領域は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインは、N末端からC末端に向けて、領域FR1、HVR1、FR2、HVR2、FR3、HVR3、およびFR4を含む。特に、重鎖可変ドメインのHVR3領域は、抗原結合に最も寄与し、抗体の結合特異性を定義する領域である。「機能的結合部位」は、その標的に特異的に結合することができる。「特異的に結合する」という用語は、インビトロアッセイにおいて、一実施形態では結合アッセイにおいて、その標的への結合部位の結合を意味する。そのような結合アッセイは、結合事象が検出され得る限り、任意のアッセイであり得る。例えば、抗体を表面に結合させ、該抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定される、結合アッセイである。あるいは、ブリッジングELISAを使用することができる。
超可変領域
「超可変領域」または「HVR」という用語は、本明細書で使用される場合、超可変的な配列(「相補性決定領域」または「CDR」)であり、かつ/または構造的に定義されるループ(「超可変ループ」)を形成し、かつ/または抗原に接触する残基(「抗原接触」)を含有するアミノ酸残基ストレッチを含む、抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般的に、抗体は、6つのHVRを含み、重鎖可変ドメインVHに3つ(H1、H2、H3)、軽鎖可変ドメインVLに3つ(L1、L2、L3)である。
「超可変領域」または「HVR」という用語は、本明細書で使用される場合、超可変的な配列(「相補性決定領域」または「CDR」)であり、かつ/または構造的に定義されるループ(「超可変ループ」)を形成し、かつ/または抗原に接触する残基(「抗原接触」)を含有するアミノ酸残基ストレッチを含む、抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般的に、抗体は、6つのHVRを含み、重鎖可変ドメインVHに3つ(H1、H2、H3)、軽鎖可変ドメインVLに3つ(L1、L2、L3)である。
HVRには、次のものが含まれる:
(a)アミノ酸残基26~32(L1)、50~52(L2)、91~96(L3)、26~32(H1)、53~55(H2)、および96~101(H3)に生じる超可変ループ(Chothia,C.およびLesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)、
(b)アミノ酸残基24~34(L1)、50~56(L2)、89~97(L3)、31~35b(H1)、50~65(H2)、および95~102(H3)に生じるCDR(Kabat,E.A.ら,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)、
(c)アミノ酸残基27c~36(L1)、46~55(L2)、89~96(L3)、30~35b(H1)、47~58(H2)、および93~101(H3)に生じる抗原接触(MacCallumらJ.Mol.Biol.262:732-745(1996))、ならびに
(d)アミノ酸残基46~56(L2)、47~56(L2)、48~56(L2)、49~56(L2)、26~35(H1)、26~35b(H1)、49~65(H2)、93~102(H3)、および94~102(H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
(a)アミノ酸残基26~32(L1)、50~52(L2)、91~96(L3)、26~32(H1)、53~55(H2)、および96~101(H3)に生じる超可変ループ(Chothia,C.およびLesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)、
(b)アミノ酸残基24~34(L1)、50~56(L2)、89~97(L3)、31~35b(H1)、50~65(H2)、および95~102(H3)に生じるCDR(Kabat,E.A.ら,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)、
(c)アミノ酸残基27c~36(L1)、46~55(L2)、89~96(L3)、30~35b(H1)、47~58(H2)、および93~101(H3)に生じる抗原接触(MacCallumらJ.Mol.Biol.262:732-745(1996))、ならびに
(d)アミノ酸残基46~56(L2)、47~56(L2)、48~56(L2)、49~56(L2)、26~35(H1)、26~35b(H1)、49~65(H2)、93~102(H3)、および94~102(H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
別段の指示がない限り、HVR残基および可変ドメインの他の残基(例えば、FR残基)は、本明細書において、上記のKabatらに従ってナンバリングされている。
抗体クラス
抗体の「クラス」は、定常ドメインまたは定常領域、好ましくはその重鎖が持つFc領域の種類を指す。抗体には、次の5種類の主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMが存在し、これらのうちのいくつかを、「サブクラス」(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2にさらに分けてもよい。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
抗体の「クラス」は、定常ドメインまたは定常領域、好ましくはその重鎖が持つFc領域の種類を指す。抗体には、次の5種類の主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMが存在し、これらのうちのいくつかを、「サブクラス」(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2にさらに分けてもよい。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
重鎖定常領域
「重鎖定常領域」という用語は、定常ドメイン、すなわち、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む免疫グロブリン重鎖の領域を意味する。一実施形態において、ヒトIgG定常領域は、重鎖のAla118からカルボキシル末端に及ぶ(Kabat EUインデックスによるナンバリング)。しかし、定常領域のC末端リジン(Lys447)は、存在していてもよく、または存在していなくてもよい(Kabat EUインデックスによるナンバリング)。「定常領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合することができる2つの重鎖定常領域を含む二量体を意味する。
「重鎖定常領域」という用語は、定常ドメイン、すなわち、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む免疫グロブリン重鎖の領域を意味する。一実施形態において、ヒトIgG定常領域は、重鎖のAla118からカルボキシル末端に及ぶ(Kabat EUインデックスによるナンバリング)。しかし、定常領域のC末端リジン(Lys447)は、存在していてもよく、または存在していなくてもよい(Kabat EUインデックスによるナンバリング)。「定常領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合することができる2つの重鎖定常領域を含む二量体を意味する。
重鎖Fc領域
「重鎖Fc領域」という用語は、少なくとも一部のヒンジ領域(中央および下部ヒンジ領域)、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を意味する。一実施形態において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Asp221またはCys226またはPro230から重鎖のカルボキシル末端に及ぶ(Kabat EUインデックスによるナンバリング)。したがって、Fc領域は定常領域よりも小さいが、C末端部分はそれと同一である。しかしながら、重鎖Fc領域のC末端リジン(Lys447)は、存在してもよく、または存在しなくてもよい(Kabat EUインデックスによるナンバリング)。「Fc領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合することができる2つの重鎖Fc領域を含む二量体を意味する。
「重鎖Fc領域」という用語は、少なくとも一部のヒンジ領域(中央および下部ヒンジ領域)、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を意味する。一実施形態において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Asp221またはCys226またはPro230から重鎖のカルボキシル末端に及ぶ(Kabat EUインデックスによるナンバリング)。したがって、Fc領域は定常領域よりも小さいが、C末端部分はそれと同一である。しかしながら、重鎖Fc領域のC末端リジン(Lys447)は、存在してもよく、または存在しなくてもよい(Kabat EUインデックスによるナンバリング)。「Fc領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合することができる2つの重鎖Fc領域を含む二量体を意味する。
抗体の定常領域、より正確にはFc領域(および同様に定常領域)は、補体活性化、C1q結合、C3活性化、およびFc受容体結合に直接関与している。補体系に対する抗体の影響は、特定の条件に依存するが、C1qへの結合は、Fc領域における規定の結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は、先行技術で公知であり、例えば、Lukas,T.J.,ら,J.Immunol.127(1981)2555-2560;Brunhouse,R.,およびCebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917;Burton,D.R.,ら,Nature 288(1980)338-344;Thommesen,J.E.,ら,Mol.Immunol.37(2000)995-1004;Idusogie,E.E.,ら.,J.Immunol.164(2000)4178-4184;Hezareh,M.,ら,J.Virol.75(2001)12161-12168;Morgan,A.,ら,Immunology 86(1995)319-324;および欧州特許第0307434号において記載されている。このような結合部位は、例えば、L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331およびP329である(Kabat EUインデックスによるナンバリング)。サブクラスIgG1、IgG2およびIgG3の抗体は通常、補体活性化、C1q結合およびC3活性化を示すのに対し、IgG4は、補体系を活性化せず、C1qと結合せず、C3を活性化しない。「抗体のFc領域」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。
モノクローナル抗体
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、かつ/または同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得るバリアント抗体は例外であり、かかるバリアントは一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基(エピトープ)に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は、1つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない種々の技術によって作製されてもよい。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、かつ/または同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得るバリアント抗体は例外であり、かかるバリアントは一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基(エピトープ)に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は、1つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない種々の技術によって作製されてもよい。
価数
「価数」という用語は、本出願内で使用される場合、抗体内の特定数の結合部位の存在を意味する。したがって、「二価」、「四価」および「六価」という用語は、抗体内のそれぞれ2個の結合部位、4個の結合部位および6個の結合部位の存在を意味する。
「価数」という用語は、本出願内で使用される場合、抗体内の特定数の結合部位の存在を意味する。したがって、「二価」、「四価」および「六価」という用語は、抗体内のそれぞれ2個の結合部位、4個の結合部位および6個の結合部位の存在を意味する。
単一特異性抗体
「単一特異性抗体」は、単一の結合特異性を有する、すなわち、1つの抗原に特異的に結合する抗体を意味する。単一特異性抗体は、全長抗体もしくは抗体断片(例えば、F(ab’)2)またはそれらの組合せ(例えば、全長抗体と追加のscFvまたはFab断片)として調製され得る。単一特異性抗体は、一価である必要はない。すなわち、単一特異性抗体は、1つの抗原に特異的に結合する1つを超える結合部位を含んでもよい。例えば、天然抗体は、単一特異性であるが二価である。
「単一特異性抗体」は、単一の結合特異性を有する、すなわち、1つの抗原に特異的に結合する抗体を意味する。単一特異性抗体は、全長抗体もしくは抗体断片(例えば、F(ab’)2)またはそれらの組合せ(例えば、全長抗体と追加のscFvまたはFab断片)として調製され得る。単一特異性抗体は、一価である必要はない。すなわち、単一特異性抗体は、1つの抗原に特異的に結合する1つを超える結合部位を含んでもよい。例えば、天然抗体は、単一特異性であるが二価である。
多重特異性抗体
「多重特異性抗体」は、同じ抗原または2つの異なる抗原上の少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体を意味する。多重特異性抗体は、全長抗体もしくは抗体断片(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)またはそれらの組合せ(例えば、全長抗体と追加のscFvまたはFab断片)として調製され得る。多重特異性抗体は、少なくとも二価であり、すなわち、2つの抗原結合部位を含む。さらに、多重特異性抗体は、少なくとも二重特異性である。したがって、二価の二重特異性抗体は、多重特異性抗体の最も単純な形態である。2つ、3つまたはより多く(例えば、4つ)の機能的な抗原結合部位を有する操作された抗体も報告されている(例えば、米国特許出願公開第2002/0004587号を参照)。
「多重特異性抗体」は、同じ抗原または2つの異なる抗原上の少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体を意味する。多重特異性抗体は、全長抗体もしくは抗体断片(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)またはそれらの組合せ(例えば、全長抗体と追加のscFvまたはFab断片)として調製され得る。多重特異性抗体は、少なくとも二価であり、すなわち、2つの抗原結合部位を含む。さらに、多重特異性抗体は、少なくとも二重特異性である。したがって、二価の二重特異性抗体は、多重特異性抗体の最も単純な形態である。2つ、3つまたはより多く(例えば、4つ)の機能的な抗原結合部位を有する操作された抗体も報告されている(例えば、米国特許出願公開第2002/0004587号を参照)。
特定の実施形態において、抗体は、多重特異性抗体、例えば、少なくとも二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原またはエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態において、1つの結合特異性は第1の抗原に対するものであり、他は、異なる第2の抗原に対するものである。特定の実施形態において、多重特異性抗体は、同じ抗原の2つの異なるエピトープに結合し得る。多重特異性抗体を使用して、抗原を発現する細胞に細胞毒性剤を局在化させてもよい。
多重特異性抗体は、全長抗体または抗体-抗体断片-融合物として調製され得る。
多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え共発現(Milstein,C.およびCuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540、国際公開第93/08829号、ならびにTraunecker,A.ら,EMBO J.10(1991)3655-3659を参照)、および「ノブ・イン・ホール(knob-in-hole)」操作(例えば、米国特許第5,731,168号を参照)が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の改変(国際公開第2009/089004号);2つ以上の抗体もしくは断片の架橋(例えば、米国特許第4,676,980号、およびBrennan,M.,ら,Science 229(1985)81-83を参照);ロイシンジッパーを使用した二重特異性抗体の産生(例えば、Kostelny,S.A.,ら,J.Immunol.148(1992)1547-1553を参照);軽鎖のミスペアリング問題を回避するための、一般的な軽鎖技術の使用(例えば、国際公開第98/50431号を参照);二重特異性抗体断片を作製するための特定の技術の使用(例えば、Holliger,P.,ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448を参照);および、例えばTutt,A.,ら,J.Immunol.147(1991)60-69に記載されている三重特異性抗体の調製により作製されてもよい。
例えば、「オクトパス(Octopus)抗体」を含む3つ以上の抗原結合部位を有する操作された抗体、またはDVD-Igも本明細書に含まれる(例えば、国際公開第2001/77342号および国際公開第2008/024715号を参照)。3つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第2010/115589号、国際公開第2010/112193号、国際公開第2010/136172号、国際公開第2010/145792号、および国際公開第2013/026831号に見出され得る。二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、「二重作用Fab」または「DAF」もまた含む(例えば、米国特許出願公開第2008/0069820号および国際公開第2015/095539号を参照)。
多重特異性抗体はまた、同じ抗原特異性の1つ以上の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称の形で、すなわちVH/VLドメイン(例えば、国際公開第2009/080252号および国際公開第2015/150447号を参照)、CH1/CLドメイン(国際公開第2009/080253号を参照)または完全なFabアーム(国際公開第2009/080251号、国際公開第2016/016299号を参照、Schaeferら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(2011)1187-1191、およびKleinら,MAbs 8(2016)1010-1020も参照)を交換することによっても提供され得る。一態様において、多重特異性抗体はクロスFab断片を含む。「クロスFab断片」または「xFab断片」または「クロスオーバーFab断片」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されたFab断片を指す。クロスFab断片は、軽鎖可変領域(VL)と重鎖定常領域1(CH1)とで構成されるポリペプチド鎖、および重鎖可変領域(VH)と軽鎖定常領域(CL)とで構成されるポリペプチド鎖を含む。非対称Fabアームはまた、荷電または非荷電アミノ酸突然変異をドメインインターフェースに導入して正しいFabペアリングを指示することによって操作され得る。例えば、国際公開第2016/172485号を参照。
抗体または断片はまた、国際公開第2009/080254号、国際公開第2010/112193号、国際公開第2010/115589号、国際公開第2010/136172号、国際公開第2010/145792号または国際公開第2010/145793号に記載されている多重特異性抗体であり得る。
抗体またはその断片はまた、国際公開第2012/163520号に開示されるような多重特異性抗体であってもよい。
多重特異性抗体の様々なさらなる分子フォーマットが当技術分野で公知であり、本明細書に含まれる(例えば、Spiessら,Mol.Immunol.67(2015)95-106を参照)。
二重特異性抗体は、一般に、同じ抗原上の2つの異なる重複しないエピトープまたは異なる抗原上の2つのエピトープに特異的に結合する抗体分子である。
複合体(多重特異性)抗体は、以下のものである。
- ドメイン交換を有する全長抗体:
第1のFab断片および第2のFab断片を含む多重特異性IgG抗体であって、第1のFab断片において、
a)CH1およびCLドメインのみが互いに置き換えられている(すなわち、第1のFab断片の軽鎖はVLおよびCH1ドメインを含み、第1のFab断片の重鎖はVHおよびCLドメインを含む);b)VHおよびVLドメインのみが互いに置き換えられている(すなわち、第1のFab断片の軽鎖はVHおよびCLドメインを含み、第1のFab断片の重鎖はVLおよびCH1ドメインを含む);または
c)CH1およびCLドメインが互いに置き換えられ、VHおよびVLドメインが互いに置き換えられている(すなわち、第1のFab断片の軽鎖はVHおよびCH1ドメインを含み、第1のFab断片の重鎖はVLおよびCLドメインを含む);および
第2のFab断片は、VLおよびCLドメインを含む軽鎖と、VHおよびCH1ドメインを含む重鎖とを含む;
ドメイン交換を有する全長抗体は、CH3ドメインを含む第1の重鎖と、CH3ドメインを含む第2の重鎖とを含み得、例えば、国際公開第96/27011号、国際公開第98/050431号、欧州特許第1870459号、国際公開第2007/110205号、国際公開第2007/147901号、国際公開第2009/089004号、国際公開第2010/129304号、国際公開第2011/90754号、国際公開第2011/143545号、国際公開第2012/058768号、国際公開第2013/157954号または国際公開第2013/096291号(参照により本明細書に組み込まれる)に開示されるように、第1重鎖および修飾された第2重鎖のヘテロ二量体化を支援するために、両CH3ドメインは、それぞれのアミノ酸置換によって、相補的な様式で操作されている、多重特異性IgG抗体;
- ドメイン交換および追加の重鎖C末端結合部位を有する全長抗体:
多重特異性IgG抗体であって、
a)全長抗体軽鎖と全長抗体重鎖のそれぞれ2対を含む1つの全長抗体であって、全長重鎖と全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第1の抗原に特異的に結合する、1つの全長抗体と、
b)1つの追加のFab断片であって、追加のFab断片が全長抗体の1つの重鎖のC末端に融合されており、追加のFab断片の結合部位が第2の抗原に特異的に結合する、1つの追加のFab断片と、を含み、
第2の抗原に特異的に結合する追加のFab断片が、i)a)軽鎖可変ドメイン(VL)および重鎖可変ドメイン(VH)が互いに置き換えられている、またはb)軽鎖定常ドメイン(CL)および重鎖定常ドメイン(CH1)が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含むか、またはii)一本鎖Fab断片である、多重特異性IgG抗体;
- 1アーム一本鎖フォーマット(=1アーム一本鎖抗体):
第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである:
- 軽鎖(可変軽鎖ドメイン+軽鎖カッパ定常ドメイン)
- 軽鎖/重鎖の組合せ(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン+ペプチドリンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ノブ変異を有するCH3)
- 重鎖(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ホール変異を有するCH3);
- 2アーム一本鎖抗体:
第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである:
- 軽鎖/重鎖1の組合せ(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン+ペプチドリンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ホール変異を有するCH3)
- 軽鎖/重鎖2の組合せ(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン+ペプチドリンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ノブ変異を有するCH3);
- 共通の軽鎖二重特異性抗体:
第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである:
- 軽鎖(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン)
- 重鎖1(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ホール変異を有するCH3)
- 重鎖2(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ノブ変異を有するCH3);
- T細胞二重特異性抗体:
ドメイン交換を有する追加の重鎖N末端結合部位を有する全長抗体であって、
- 第1および第2のFab断片であって、第1および第2のFab断片の各結合部位が第1の抗原に特異的に結合する、第1および第2のFab断片と、
- 第3のFab断片であって、第3のFab断片の結合部位が第2の抗原に特異的に結合し、第3のFab断片が、可変軽鎖ドメイン(VL)および可変重鎖ドメイン(VH)が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第3のFab断片と、
- 第1のFc領域ポリペプチドと第2のFc領域ポリペプチドとを含むFc領域と、を含み、
第1のFab断片および第2のFab断片は、それぞれ、重鎖断片および全長軽鎖を含み、
第1のFab断片の重鎖断片のC末端は、第1のFc領域ポリペプチドのN末端に融合されており、
第2のFab断片の重鎖断片のC末端は、第3のFab断片の可変軽鎖ドメインのN末端に融合されており、第3のFab断片のCH1ドメインのC末端は、第2のFc領域ポリペプチドのN末端に融合されている、全長抗体;
- 抗体-多量体融合物であって、
(a)抗体重鎖および抗体軽鎖と、
(b)N末端からC末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第1の部分、抗体重鎖CH1ドメインまたは抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖CH2ドメイン、および抗体重鎖CH3ドメインを含む第1の融合ポリペプチドと、N末端からC末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第2の部分、および第1のポリペプチドが抗体重鎖CH1ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、または第1のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖CH1ドメインを含む、第2の融合ポリペプチドと、を含み、
(i)(a)の抗体重鎖と(b)の第1の融合ポリペプチド、(ii)(a)の抗体重鎖と(a)の抗体軽鎖、および(iii)(b)の第1の融合ポリペプチドと(b)の第2の融合ポリペプチドが、それぞれ互いに独立して、少なくとも1つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
抗体重鎖および抗体軽鎖の可変ドメインが、抗原に特異的に結合する結合部位を形成する、抗体-多量体融合物。
- ドメイン交換を有する全長抗体:
第1のFab断片および第2のFab断片を含む多重特異性IgG抗体であって、第1のFab断片において、
a)CH1およびCLドメインのみが互いに置き換えられている(すなわち、第1のFab断片の軽鎖はVLおよびCH1ドメインを含み、第1のFab断片の重鎖はVHおよびCLドメインを含む);b)VHおよびVLドメインのみが互いに置き換えられている(すなわち、第1のFab断片の軽鎖はVHおよびCLドメインを含み、第1のFab断片の重鎖はVLおよびCH1ドメインを含む);または
c)CH1およびCLドメインが互いに置き換えられ、VHおよびVLドメインが互いに置き換えられている(すなわち、第1のFab断片の軽鎖はVHおよびCH1ドメインを含み、第1のFab断片の重鎖はVLおよびCLドメインを含む);および
第2のFab断片は、VLおよびCLドメインを含む軽鎖と、VHおよびCH1ドメインを含む重鎖とを含む;
ドメイン交換を有する全長抗体は、CH3ドメインを含む第1の重鎖と、CH3ドメインを含む第2の重鎖とを含み得、例えば、国際公開第96/27011号、国際公開第98/050431号、欧州特許第1870459号、国際公開第2007/110205号、国際公開第2007/147901号、国際公開第2009/089004号、国際公開第2010/129304号、国際公開第2011/90754号、国際公開第2011/143545号、国際公開第2012/058768号、国際公開第2013/157954号または国際公開第2013/096291号(参照により本明細書に組み込まれる)に開示されるように、第1重鎖および修飾された第2重鎖のヘテロ二量体化を支援するために、両CH3ドメインは、それぞれのアミノ酸置換によって、相補的な様式で操作されている、多重特異性IgG抗体;
- ドメイン交換および追加の重鎖C末端結合部位を有する全長抗体:
多重特異性IgG抗体であって、
a)全長抗体軽鎖と全長抗体重鎖のそれぞれ2対を含む1つの全長抗体であって、全長重鎖と全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第1の抗原に特異的に結合する、1つの全長抗体と、
b)1つの追加のFab断片であって、追加のFab断片が全長抗体の1つの重鎖のC末端に融合されており、追加のFab断片の結合部位が第2の抗原に特異的に結合する、1つの追加のFab断片と、を含み、
第2の抗原に特異的に結合する追加のFab断片が、i)a)軽鎖可変ドメイン(VL)および重鎖可変ドメイン(VH)が互いに置き換えられている、またはb)軽鎖定常ドメイン(CL)および重鎖定常ドメイン(CH1)が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含むか、またはii)一本鎖Fab断片である、多重特異性IgG抗体;
- 1アーム一本鎖フォーマット(=1アーム一本鎖抗体):
第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである:
- 軽鎖(可変軽鎖ドメイン+軽鎖カッパ定常ドメイン)
- 軽鎖/重鎖の組合せ(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン+ペプチドリンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ノブ変異を有するCH3)
- 重鎖(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ホール変異を有するCH3);
- 2アーム一本鎖抗体:
第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである:
- 軽鎖/重鎖1の組合せ(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン+ペプチドリンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ホール変異を有するCH3)
- 軽鎖/重鎖2の組合せ(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン+ペプチドリンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ノブ変異を有するCH3);
- 共通の軽鎖二重特異性抗体:
第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである:
- 軽鎖(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン)
- 重鎖1(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ホール変異を有するCH3)
- 重鎖2(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ノブ変異を有するCH3);
- T細胞二重特異性抗体:
ドメイン交換を有する追加の重鎖N末端結合部位を有する全長抗体であって、
- 第1および第2のFab断片であって、第1および第2のFab断片の各結合部位が第1の抗原に特異的に結合する、第1および第2のFab断片と、
- 第3のFab断片であって、第3のFab断片の結合部位が第2の抗原に特異的に結合し、第3のFab断片が、可変軽鎖ドメイン(VL)および可変重鎖ドメイン(VH)が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第3のFab断片と、
- 第1のFc領域ポリペプチドと第2のFc領域ポリペプチドとを含むFc領域と、を含み、
第1のFab断片および第2のFab断片は、それぞれ、重鎖断片および全長軽鎖を含み、
第1のFab断片の重鎖断片のC末端は、第1のFc領域ポリペプチドのN末端に融合されており、
第2のFab断片の重鎖断片のC末端は、第3のFab断片の可変軽鎖ドメインのN末端に融合されており、第3のFab断片のCH1ドメインのC末端は、第2のFc領域ポリペプチドのN末端に融合されている、全長抗体;
- 抗体-多量体融合物であって、
(a)抗体重鎖および抗体軽鎖と、
(b)N末端からC末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第1の部分、抗体重鎖CH1ドメインまたは抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖CH2ドメイン、および抗体重鎖CH3ドメインを含む第1の融合ポリペプチドと、N末端からC末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第2の部分、および第1のポリペプチドが抗体重鎖CH1ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、または第1のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖CH1ドメインを含む、第2の融合ポリペプチドと、を含み、
(i)(a)の抗体重鎖と(b)の第1の融合ポリペプチド、(ii)(a)の抗体重鎖と(a)の抗体軽鎖、および(iii)(b)の第1の融合ポリペプチドと(b)の第2の融合ポリペプチドが、それぞれ互いに独立して、少なくとも1つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
抗体重鎖および抗体軽鎖の可変ドメインが、抗原に特異的に結合する結合部位を形成する、抗体-多量体融合物。
「ノブ・イントゥー・ホール」二量体化モジュールおよび抗体操作におけるその使用は、Carter P.;Ridgway J.B.B.;Presta L.G.:Immunotechnology,第2巻,第1号,1996年2月,第73~73(1)頁に記載されている。
抗体の重鎖のCH3ドメインは、「ノブ・イントゥー・ホール」技術によって改変され得る。これは、例えば、国際公開第96/027011号、Ridgway,J.B.,ら,Protein Eng.9(1996)617-621;およびMerchant,A.M.,ら,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681に、いくつかの例を伴って詳細に記載されている。この方法では、2つのCH3ドメインの相互作用表面を改変して、これら2つのCH3ドメインのヘテロ二量体化を増加させ、それによってそれらを含むポリペプチドのヘテロ二量体化を増加させる。(2つの重鎖の)2つのCH3ドメインのそれぞれは「ノブ」であり得、他方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入はさらに、ヘテロ二量体を安定化させ(Merchant,A.M.,ら,Nature Biotech.16(1998)677-681;Atwell,S.,ら,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)、収量を増加させる。
(抗体重鎖の)CH3ドメインの変異T366Wは、「ノブ変異」または「変異ノブ」として表され、(抗体重鎖の)CH3ドメインの変異T366S、L368A、Y407Vは、「ホール変異」または「変異ホール」として表される(Kabat EUインデックスによるナンバリング)。CH3ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋も、例えば、「ノブ変異」を有する重鎖のCH3ドメインにS354C変異を導入すること(「ノブ-cys-変異」または「変異ノブ-cys」と表記)、および「ホール変異」を有する重鎖のCH3ドメインにY349C変異を導入すること(「ホール-cys-変異」または「変異ホール-cys」と表記)により、使用することができる(Merchant,A.M.,ら,Nature Biotech.16(1998)677-681)(KabatのEUインデックスによるナンバリング)。
ドメインクロスオーバー
「ドメインクロスオーバー」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体重鎖VH-CH1断片とその対応する同族の抗体軽鎖との対において、すなわち抗体Fab(断片-抗原結合)において、少なくとも1つの重鎖ドメインが、その対応する軽鎖ドメインによって置換されており、その逆も同様である、という点について、ドメイン配列が天然抗体の配列から逸脱していることを意味する。ドメインクロスオーバーは、一般的に3種類あり、(i)CH1およびCLドメインのクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってVL-CH1ドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってVH-CLドメイン配列(またはVH-CL-ヒンジ-CH2-CH3ドメイン配列を有する全長抗体重鎖)がもたらされるもの、(ii)VHおよびVLドメインのドメインクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってVH-CLドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってVL-CH1ドメイン配列がもたらされるもの、ならびに(iii)完全な軽鎖(VL-CL)および完全なVH-CH1重鎖断片のドメインクロスオーバー(「Fabクロスオーバー」)であって、ドメインクロスオーバーによってVH-CH1ドメイン配列を有する軽鎖がもたらされ、ドメインクロスオーバーによってVL-CLドメイン配列を有する重鎖断片がもたらされるもの(上述のすべてのドメイン配列は、N末端からC末端への方向で示されている)がある。
「ドメインクロスオーバー」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体重鎖VH-CH1断片とその対応する同族の抗体軽鎖との対において、すなわち抗体Fab(断片-抗原結合)において、少なくとも1つの重鎖ドメインが、その対応する軽鎖ドメインによって置換されており、その逆も同様である、という点について、ドメイン配列が天然抗体の配列から逸脱していることを意味する。ドメインクロスオーバーは、一般的に3種類あり、(i)CH1およびCLドメインのクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってVL-CH1ドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってVH-CLドメイン配列(またはVH-CL-ヒンジ-CH2-CH3ドメイン配列を有する全長抗体重鎖)がもたらされるもの、(ii)VHおよびVLドメインのドメインクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってVH-CLドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってVL-CH1ドメイン配列がもたらされるもの、ならびに(iii)完全な軽鎖(VL-CL)および完全なVH-CH1重鎖断片のドメインクロスオーバー(「Fabクロスオーバー」)であって、ドメインクロスオーバーによってVH-CH1ドメイン配列を有する軽鎖がもたらされ、ドメインクロスオーバーによってVL-CLドメイン配列を有する重鎖断片がもたらされるもの(上述のすべてのドメイン配列は、N末端からC末端への方向で示されている)がある。
互いに置き換えられた
本明細書で使用される場合、対応する重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインに関して「互いに置き換えられた」という用語は、上述のドメインクロスオーバーを指す。そのため、CH1およびCLドメインが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目(i)の下で言及されたドメインクロスオーバー、ならびに結果として生じる重鎖および軽鎖ドメイン配列を指す。したがって、VHおよびVLが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目(ii)の下で言及されたドメインクロスオーバーを指し、またCH1およびCLドメインが「互いに置き換えられ」、かつVHおよびVLドメインが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目(iii)の下で言及されたドメインクロスオーバーを指す。ドメインクロスオーバーを含む二重特異性抗体は、例えば、国際公開第2009/080251号、国際公開第2009/080252号、国際公開第2009/080253号、国際公開第2009/080254号、およびSchaefer,W.,ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(2011)11187-11192において報告されている。このような抗体は、一般にCrossMabと呼ばれる。
本明細書で使用される場合、対応する重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインに関して「互いに置き換えられた」という用語は、上述のドメインクロスオーバーを指す。そのため、CH1およびCLドメインが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目(i)の下で言及されたドメインクロスオーバー、ならびに結果として生じる重鎖および軽鎖ドメイン配列を指す。したがって、VHおよびVLが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目(ii)の下で言及されたドメインクロスオーバーを指し、またCH1およびCLドメインが「互いに置き換えられ」、かつVHおよびVLドメインが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目(iii)の下で言及されたドメインクロスオーバーを指す。ドメインクロスオーバーを含む二重特異性抗体は、例えば、国際公開第2009/080251号、国際公開第2009/080252号、国際公開第2009/080253号、国際公開第2009/080254号、およびSchaefer,W.,ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(2011)11187-11192において報告されている。このような抗体は、一般にCrossMabと呼ばれる。
多重特異性抗体はまた、一実施形態において、上記の項目(i)で述べたCH1およびCLドメインのドメインクロスオーバー、または上記の項目(ii)で述べたVHおよびVLドメインのドメインクロスオーバー、または上記の項目(iii)で述べたVH-CH1およびVL-VLドメインのドメインクロスオーバーのいずれかを含む、少なくとも1つのFab断片を含む。ドメインクロスオーバーを伴う多重特異性抗体の場合、同じ抗原に特異的に結合するFabは、同じドメイン配列であるように構築される。そのため、ドメインクロスオーバーを伴う1つを超えるFabが、多重特異性抗体に含まれる場合、該Fabは、同じ抗原に特異的に結合する。
ヒト化
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基、およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含むものであり、それにおいて、HVR(例えば、CDR)のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、FRのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する少なくとも一部の抗体定常領域を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基、およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含むものであり、それにおいて、HVR(例えば、CDR)のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、FRのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する少なくとも一部の抗体定常領域を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
組換え抗体
「組換え抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、組換え細胞などの組換え手段により調製、発現、作製または単離されたすべての抗体(キメラ、ヒト化およびヒト)を意味する。これには、NS0、HEK、BHK、羊膜細胞、CHO細胞などの組換え細胞から単離された抗体が含まれる。
「組換え抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、組換え細胞などの組換え手段により調製、発現、作製または単離されたすべての抗体(キメラ、ヒト化およびヒト)を意味する。これには、NS0、HEK、BHK、羊膜細胞、CHO細胞などの組換え細胞から単離された抗体が含まれる。
抗体断片
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指し、すなわちそれは、機能的な断片である。抗体断片の例としては、以下に限定されないが、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、二重特異性Fab、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子(例えば、scFvまたはscFab)が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指し、すなわちそれは、機能的な断片である。抗体断片の例としては、以下に限定されないが、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、二重特異性Fab、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子(例えば、scFvまたはscFab)が挙げられる。
組換え法
抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号に記載されているように、組換え法および組成物を使用して産生され得る。これらの方法のために、抗体をコードする1つ以上の単離された核酸が提供される。
抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号に記載されているように、組換え法および組成物を使用して産生され得る。これらの方法のために、抗体をコードする1つ以上の単離された核酸が提供される。
一態様において、抗体を作製する方法が提供され、本方法は、上記で提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意に、抗体を宿主細胞(または宿主細胞培養培地)から回収することと、を含み、少なくとも1つの培養工程は、本発明による化合物の存在下で行われる。
抗体の組換え産生に関しては、例えば、上述の抗体をコードする核酸が単離され、さらなるクローニングおよび/または宿主細胞内での発現のために、1つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、従来の手順を用いて(例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)、容易に単離および配列決定され得るか、または組換え法によって産生され得るか、または化学合成によって得られ得る。
組換え哺乳動物細胞
通常、例えば治療用抗体のような目的のポリペプチドの組換え大量産生のためには、該ポリペプチドを安定に発現し分泌する細胞が必要とされる。
通常、例えば治療用抗体のような目的のポリペプチドの組換え大量産生のためには、該ポリペプチドを安定に発現し分泌する細胞が必要とされる。
この細胞は、「組換え哺乳動物細胞」または「組換え産生細胞」であり、このような細胞を作製するために使用される方法は「細胞株開発」と呼ばれる。細胞株開発方法の第1の工程において、例えばCHO細胞などの好適な宿主細胞に、該目的のポリペプチドの発現に好適な核酸配列をトランスフェクトする。第2の工程において、目的のポリペプチドを安定に発現する細胞を、目的のポリペプチドをコードする核酸と共にコトランスフェクトしておいた選択マーカーの共発現に基づいて選択する。
ポリペプチドをコードする核酸、すなわちコード配列は、構造遺伝子と呼ばれる。このような構造遺伝子は、純粋なコード情報である。したがって、その発現にはさらなる調節エレメントが必要である。したがって、通常、構造遺伝子はいわゆる発現カセットに組み込まれる。発現カセットが哺乳動物細胞において機能的となるために必要とされる最小限の調節エレメントは、構造遺伝子の上流、すなわち5’側に位置する、該哺乳動物細胞において機能的なプロモーター、および構造遺伝子の下流、すなわち3’側に位置する、該哺乳動物細胞において機能的なポリアデニル化シグナル配列である。プロモーター、構造遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列は、作動可能に連結された形態で並べられる。
目的のポリペプチドが、異なる(単量体)ポリペプチド、例えば、抗体または複合体抗体フォーマットなどから構成されるヘテロ多量体ポリペプチドである場合、単一の発現カセットが必要であるだけでなく、含まれる構造遺伝子が異なる多数の発現カセット、すなわち、ヘテロ多量体ポリペプチドの異なる(単量体)ポリペプチドのそれぞれに対して少なくとも1つの発現カセットが必要である。例えば、全長抗体は、軽鎖の2つのコピーおよび重鎖の2つのコピーを含むヘテロ多量体ポリペプチドである。したがって、全長抗体は、2つの異なるポリペプチドから構成される。したがって、全長抗体の発現のためには2つの発現カセット、すなわち軽鎖のための1つおよび重鎖のための1つが必要とされる。例えば、全長抗体が二重特異性抗体である場合、すなわち、抗体が2つの異なる抗原に特異的に結合する2つの異なる結合部位を含む場合、2つの軽鎖および2つの重鎖もまた互いに異なる。したがって、このような二重特異性全長抗体は、4つの異なるポリペプチドで構成されているため、4つの発現カセットが必要となる。
発現ベクター
目的のポリペプチドのための発現カセットは、一般に、1つ以上のいわゆる「発現ベクター」に組み込まれる。「発現ベクター」は、細菌細胞中で該ベクターを増幅し、かつ含まれる構造遺伝子を哺乳動物細胞中で発現させるのに必要とされるすべてのエレメントを提供する核酸である。典型的には、発現ベクターは、例えば大腸菌の場合、複製開始点および原核生物選択マーカー、さらには真核生物選択マーカー、ならびに目的の構造遺伝子の発現に必要とされる発現カセットを含む、原核生物プラスミド増殖単位を含む。「発現ベクター」は、哺乳動物細胞に発現カセットを導入するための輸送運搬体である。
目的のポリペプチドのための発現カセットは、一般に、1つ以上のいわゆる「発現ベクター」に組み込まれる。「発現ベクター」は、細菌細胞中で該ベクターを増幅し、かつ含まれる構造遺伝子を哺乳動物細胞中で発現させるのに必要とされるすべてのエレメントを提供する核酸である。典型的には、発現ベクターは、例えば大腸菌の場合、複製開始点および原核生物選択マーカー、さらには真核生物選択マーカー、ならびに目的の構造遺伝子の発現に必要とされる発現カセットを含む、原核生物プラスミド増殖単位を含む。「発現ベクター」は、哺乳動物細胞に発現カセットを導入するための輸送運搬体である。
発現しようとするポリペプチドが複雑であるほど、必要とされる異なる発現カセットの数もまた多くなる。本質的に、発現カセットの数と共に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる核酸のサイズも大きくなる。同時に、発現ベクターのサイズも大きくなる。しかし、ベクターのサイズの実用的な上限は約15kbpの範囲にあり、それを上回ると、操作および処理の効率が著しく落ちる。この問題は、2つ以上の発現ベクターを用いることによって対処され得る。それにより、発現カセットは、それぞれが発現カセットの一部のみを含む異なる発現ベクター間で分割され得、その結果サイズの縮小がもたらされる。
細胞株開発
例えば多重特異性抗体などの異種ポリペプチドを発現する組換え細胞を生成するための細胞株開発(CLD)は、目的の異種ポリペプチドの発現および産生に必要なそれぞれの発現カセットを含む核酸のランダム組込み(RI)または標的化組込み(TI)のいずれかを使用する。
例えば多重特異性抗体などの異種ポリペプチドを発現する組換え細胞を生成するための細胞株開発(CLD)は、目的の異種ポリペプチドの発現および産生に必要なそれぞれの発現カセットを含む核酸のランダム組込み(RI)または標的化組込み(TI)のいずれかを使用する。
RIを使用すると、一般に、複数のベクターまたはその断片が、同一または異なる遺伝子座で細胞のゲノムに組み込まれる。
TIを使用すると、一般に、異なる発現カセットを含む導入遺伝子の単一コピーが、宿主細胞のゲノムの所定の「ホットスポット」に組み込まれる。
RI CLDとは違って、標的化組込み(TI)CLDは、細胞のゲノム中の所定の「ホットスポット」に、異なる発現カセットを含む導入遺伝子を導入する。また、この導入は、所定の比率の発現カセットを用いる。その結果、この理論に拘束されるわけではないが、ヘテロ多量体ポリペプチドの異なるポリペプチドのすべてが、同じ(または少なくとも同程度であり、わずかに異なるだけの)速度かつ適切な比率で発現される。
また、所定のコピー数および所定の組込み部位が与えられたとすると、TIによって得られる組換え細胞は、RIによって得られる細胞と比べて、優れた安定性を有しているはずである。さらに、選択マーカーは、適切なTIを有する細胞を選択するためだけに使用され、高レベルの導入遺伝子発現を示す細胞を選択するためには使用されないことから、メトトレキサート(MTX)またはメチオニンスルホキシミン(MSX)のような選択剤の突然変異誘発性が原因の一部である配列バリアント(SV)が生じる可能性を最小限にするために、突然変異誘発性の低いマーカーを適用してよい。
(グリコシル化された)抗体の発現に好適な宿主細胞は、一般に、例えば脊椎動物などの多細胞生物に由来する。
宿主細胞
懸濁液中で増殖するように適合された任意の哺乳動物細胞株を、本発明による方法で使用することができる。さらに、組込み法とは無関係に、すなわち、RIおよびTIの場合、任意の哺乳動物宿主細胞を使用することができる。
懸濁液中で増殖するように適合された任意の哺乳動物細胞株を、本発明による方法で使用することができる。さらに、組込み法とは無関係に、すなわち、RIおよびTIの場合、任意の哺乳動物宿主細胞を使用することができる。
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ヒト羊膜細胞(例えば、Woelfel,J.ら,BMC Proc.5(2011)P133に記載のCAP-T細胞);SV40(COS-7)で形質転換されたサル腎臓CV1株;ヒト胚腎臓株(例えば、Graham,F.L.ら,J.Gen Virol.36(1977)59-74)に記載のHEK293細胞またはHEK293T細胞);ベビーハムスター腎臓細胞(BHK);マウスセルトリ細胞(例えば、Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252)に記載のTM4細胞);サル腎臓細胞(CV1);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76);ヒト子宮頚癌細胞(HELA);イヌ腎臓細胞(MDCK;バッファローラット肝臓細胞(BRL3A);ヒト肺細胞(W138);ヒト肝臓細胞(HepG2);マウス乳腺腫瘍(MMT060562);TRI細胞(例えば、Mather,J.P.ら,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68に記載の);MRC5細胞;およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、DHFR-CHO細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(Urlaub,G.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)、および、骨髄腫細胞株、例えば、Y0、NS0およびSp2/0が挙げられる。
抗体産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Yazaki,P.およびWu,A.M.,Methods in Molecular Biology,第248巻,Lo,B.K.C.(編),Humana Press,Totowa,NJ(2004)、第255~268頁を参照されたい。
一実施形態において、哺乳動物宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(例えば、CHO K1、CHO DG44など)、ヒト胚腎臓(HEK)細胞、リンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp2/0細胞)、またはヒト羊膜細胞(例えば、CAP-Tなど)である。好ましい一実施形態において、哺乳動物(宿主)細胞は、CHO細胞である。
標的化組込みにより、哺乳動物細胞ゲノムの所定の部位に外因性ヌクレオチド配列が組み込まれることが可能になる。特定の実施形態において、標的化組込みは、ゲノムおよび組み込まれる外因性ヌクレオチド配列に存在する1つ以上の組換え認識配列(RRS)を認識するリコンビナーゼによって媒介される。特定の実施形態において、標的化組込みは、相同組換えによって媒介される。
組換え認識配列
「組換え認識配列」(RRS)は、リコンビナーゼによって認識され、リコンビナーゼに媒介された組換え事象のために必要かつ十分である、ヌクレオチド配列である。RRSを用いて、ヌクレオチド配列中の組換え事象が起こると考えられる位置を定めることができる。
「組換え認識配列」(RRS)は、リコンビナーゼによって認識され、リコンビナーゼに媒介された組換え事象のために必要かつ十分である、ヌクレオチド配列である。RRSを用いて、ヌクレオチド配列中の組換え事象が起こると考えられる位置を定めることができる。
特定の実施形態において、RRSは、Creリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、RRSは、FLPリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、RRSは、Bxb1インテグラーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、RRSは、φC31インテグラーゼによって認識され得る。
RRSがLoxP部位である特定の実施形態において、細胞は、組換えを行うためにCreリコンビナーゼを必要とする。RRSがFRT部位である特定の実施形態において、細胞は、組換えを行うためにFLPリコンビナーゼを必要とする。RRSがBxb1 attP部位またはBxb1 attB部位である特定の実施形態において、細胞は、組換えを行うためにBxb1インテグラーゼを必要とする。RRSがφC31 attP部位またはφC31 attB部位である特定の実施形態において、細胞は、組換えを行うためにφC31インテグラーゼを必要とする。これらのリコンビナーゼは、これらの酵素のコード配列を含む発現ベクターを用いて、またはタンパク質もしくはmRNAとして細胞中に導入され得る。
TIに関して、ゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれた、本明細書に記載のランディング部位を含む、TIに好適な任意の既知または将来の哺乳動物宿主細胞を、本発明において使用することができる。このような細胞は、哺乳動物TI宿主細胞と呼ばれる。特定の実施形態において、哺乳動物TI宿主細胞は、本明細書に記載のランディング部位を含む、ハムスター細胞、ヒト細胞、ラット細胞、またはマウス細胞である。好ましい一実施形態において、哺乳動物TI宿主細胞は、CHO細胞である。特定の実施形態において、哺乳動物TI宿主細胞は、ゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれた、本明細書に記載のランディング部位を含む、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、CHO K1細胞、CHO K1SV細胞、CHO DG44細胞、CHO DUKXB-11細胞、CHO K1S細胞、またはCHO K1M細胞である。
特定の実施形態において、哺乳動物TI宿主細胞は、組み込まれたランディング部位を含み、ランディング部位は、1つ以上の組換え認識配列(RRS)を含む。RRSは、リコンビナーゼ、例えば、Creリコンビナーゼ、FLPリコンビナーゼ、Bxb1インテグラーゼ、またはφC31インテグラーゼによって認識され得る。RRSは、互いに独立して、LoxP配列、LoxP L3配列、LoxP 2L配列、LoxFas配列、Lox511配列、Lox2272配列、Lox2372配列、Lox5171配列、Loxm2配列、Lox71配列、Lox66配列、FRT配列、Bxb1 attP配列、Bxb1 attB配列、φC31 attP配列、およびφC31 attB配列からなる群から選択され得る。複数のRRSが存在しなければならない場合、同一でないRRSが選択される限りにおいて、各配列の選択は他方に依存する。
特定の実施形態において、ランディング部位は、1つ以上の組換え認識配列(RRS)を含み、RRSは、リコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、組み込まれたランディング部位は、少なくとも2つのRRSを含む。特定の実施形態において、組み込まれたランディング部位は、3つのRRSを含み、第3のRRSは、第1のRRSと第2のRRSの間に位置する。特定の好ましい実施形態において、3つのRSSはすべて異なる。特定の実施形態において、ランディング部位は、第1のRRS、第2のRRS、および第3のRRS、ならびに第1のRRSと第2のRRSの間に位置する少なくとも1つの選択マーカーを含み、かつ第3のRRSは、第1のRRSおよび/または第2のRRSとは異なる。特定の実施形態において、ランディング部位は、さらに第2の選択マーカーを含み、かつ第1および第2の選択マーカーは異なる。特定の実施形態において、ランディング部位は、第3の選択マーカーおよび内部リボソーム進入部位(IRES)もさらに含み、該IRESは該第3の選択マーカーに作動可能に連結されている。第3の選択マーカーは、第1または第2の選択マーカーとは異なり得る。
本発明は、以下CHO細胞で例示されるが、これは本発明を例示するためにのみ提示され、限定として解釈されるべきではない。本発明の真の範囲は、特許請求の範囲に記載されている。
本発明による方法における使用に好適な例示的な哺乳動物TI宿主細胞は、そのゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれたランディング部位を有するCHO細胞であり、ランディング部位は、Creリコンビナーゼに媒介されたDNA組換えのための3つの異種特異的loxP部位を含む。
この例では、異種特異的loxP部位は、L3、LoxFas、および2Lであり(例えば、Lanzaら,Biotechnol.J.7(2012)898-908;Wongら,Nucleic Acids Res.33(2005)e147を参照)、その際、L3および2Lはランディング部位の5’末端および3’末端にそれぞれ隣接し、LoxFasはL3部位と2L部位の間に位置している。ランディング部位は、IRESを介した選択マーカーの発現を蛍光性GFPタンパク質の発現に結び付けて、ポジティブ選択によってランディング部位を安定化すること、ならびにトランスフェクションおよびCre組換え後に該部位が存在しないものを選択すること(ネガティブ選択)を可能にする、バイシストロン性単位をさらに含む。緑色蛍光タンパク質(GFP)は、RMCE反応をモニターするのに役立つ。
先の段落で概説したようにランディング部位がこのように編成されていることによって、2つのベクター、例えば、いわゆる、L3部位およびLoxFas部位を有するフロントベクターならびにLoxFas部位および2L部位を有するバックベクターの同時組込みが可能になる。ランディング部位に存在するものとは異なる、選択マーカー遺伝子の機能的エレメントは、両方のベクター間に分配され得、プロモーターおよび開始コドンはフロントベクター上に位置し得るのに対し、コード領域およびポリAシグナルはバックベクター上に位置している。両方のベクターに由来する該核酸の正しいリコンビナーゼ媒介組込みのみが、それぞれの選択剤に対する耐性を誘導する。
通常、哺乳動物TI宿主細胞は、哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれるランディング部位を含む哺乳動物細胞であって、該ランディング部位が、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1の組換え認識配列および第2の組換え認識配列、ならびに第1の組換え認識配列と第2の組換え認識配列の間に位置する第3の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なっている、ランディング部位を含む哺乳動物細胞である。
選択マーカーは、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ(APH)(例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HYG)、ネオマイシン、およびG418 APH)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、チミジンキナーゼ(TK)、グルタミン合成酵素(GS)、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素(インドール)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(ヒスチジノールD)、ならびにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され得る。また、選択マーカーは、緑色蛍光性タンパク質(GFP)、高感度GFP(eGFP)、合成GFP、黄色蛍光性タンパク質(YFP)、高感度YFP(eYFP)、シアン蛍光性タンパク質(CFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed単量体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald6、CyPet、mCFPm、Cerulean、およびT-Sapphireからなる群から選択される蛍光性タンパク質であり得る。
外因性ヌクレオチド配列は、特定の細胞に由来しないが、DNA送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、または形質転換法などによって該細胞に導入され得るヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、哺乳動物TI宿主細胞は、哺乳動物細胞のゲノム中の1つ以上の組込み部位に組み込まれた少なくとも1つのランディング部位を含む。特定の実施形態において、ランディング部位は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の1つ以上の組込み部位に組み込まれる。
特定の実施形態において、組み込まれたランディング部位は、少なくとも1つの選択マーカーを含む。特定の実施形態において、組み込まれたランディング部位は、第1、第2および第3のRRS、ならびに少なくとも1つの選択マーカーを含む。特定の実施形態において、選択マーカーは、第1と第2のRRSの間に位置している。特定の実施形態において、2つのRRSは、少なくとも1つの選択マーカーに隣接する。すなわち、第1のRRSが選択マーカーの5’(上流)に位置し、第2のRRSが選択マーカーの3’(下流)に位置している。特定の実施形態において、第1のRRSは選択マーカーの5’末端と隣り合っており、第2のRRSは、選択マーカーの3’末端に隣り合っている。特定の実施形態において、ランディング部位は、第1のRRS、第2のRRS、および第3のRRS、ならびに第1のRRSと第3のRRSの間に位置する少なくとも1つの選択マーカーを含む。
特定の実施形態において、選択マーカーは第1と第2のRRSの間に位置しており、かつこれら2つの隣接RRSは互いに異なる。特定の好ましい実施形態において、第1の隣接RRSはLoxP L3配列であり、第2の隣接RRSはLoxP 2L配列である。特定の実施形態において、LoxP L3配列は選択マーカーの5’に位置しており、LoxP 2L配列は選択マーカーの3’に位置している。特定の実施形態において、第1の隣接RRSは野生型FRT配列であり、第2の隣接RRSは変異FRT配列である。特定の実施形態において、第1の隣接RRSはBxb1 attP配列であり、第2の隣接RRSはBxb1 attB配列である。特定の実施形態において、第1の隣接RRSはφC31 attP配列であり、第2の隣接RRSはφC31 attB配列である。特定の実施形態において、2つのRRSは、同じ向きに位置決めされている。特定の実施形態において、2つのRRSは、両方が順方向または逆方向に向いている。特定の実施形態において、2つのRRSは、反対の向きに位置決めされている。
特定の実施形態において、組み込まれたランディング部位は、2つのRSSが隣接する、第1の選択マーカーおよび第2の選択マーカーを含み、該第1の選択マーカーは該第2の選択マーカーとは異なる。特定の実施形態において、2つの選択マーカーのどちらも、互いに独立して、グルタミン合成酵素選択マーカー、チミジンキナーゼ選択マーカー、HYG選択マーカー、およびピューロマイシン耐性選択マーカーからなる群から選択される。特定の実施形態において、組み込まれたランディング部位は、チミジンキナーゼ選択マーカーおよびHYG選択マーカーを含む。特定の実施形態において、第1の選択マーカーは、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ(APH)(例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HYG)、ネオマイシン、およびG418 APH)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、チミジンキナーゼ(TK)、グルタミン合成酵素(GS)、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素(インドール)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(ヒスチジノールD)、ならびにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され、第2の選択マーカーは、GFP、eGFP、合成GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed単量体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean、およびT-Sapphire蛍光性タンパク質からなる群から選択される。特定の実施形態において、第1の選択マーカーはグルタミン合成酵素選択マーカーであり、第2の選択マーカーはGFP蛍光性タンパク質である。特定の実施形態において、両方の選択マーカーに隣接する2つのRRSは異なっている。
特定の実施形態において、選択マーカーは、プロモーター配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、選択マーカーは、SV40プロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態において、選択マーカーは、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターに作動可能に連結されている。
標的化組込み
本発明による組換え哺乳動物細胞を作製するための1つの方法は、標的化組込み(TI)である。
本発明による組換え哺乳動物細胞を作製するための1つの方法は、標的化組込み(TI)である。
標的化組込みでは、哺乳動物TI宿主細胞のゲノム中の特定の遺伝子座に外因性核酸を導入するために部位特異的組換えが用いられる。これは、ゲノムにおける組込み部位の配列が外因性核酸と交換される酵素プロセスである。このような核酸交換を行うために使用される1つの系は、Cre-lox系である。交換を触媒する酵素はCreリコンビナーゼである。交換される配列は、ゲノム内および外因性核酸内の2つのlox(P)部位の位置によって定義される。これらのlox(P)部位は、Creリコンビナーゼによって認識される。他に必要とされるものはなく、すなわち、ATPなども必要とされない。元々、Cre-lox系はバクテリオファージP1で発見された。
Cre-lox系は、哺乳動物、植物、細菌、および酵母など、異なる細胞型で機能する。
一実施形態において、異種ポリペプチドをコードする外因性核酸は、単一または二重リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)によって哺乳動物TI宿主細胞に組み込まれている。それにより、組換えCHO細胞などの組換え哺乳動物細胞が得られ、その中で、定義された特異的な発現カセット配列が単一の遺伝子座でゲノムに組み込まれ、それが次に異種ポリペプチドの効率的な発現および産生をもたらす。
Cre-LoxP部位特異的組換え系は、多くの生物学的実験系において広く使用されている。Creリコンビナーゼは、34bpのLoxP配列を認識する38kDaの部位特異的DNAリコンビナーゼである。CreリコンビナーゼはバクテリオファージP1に由来し、チロシンファミリーの部位特異的リコンビナーゼに属する。Creリコンビナーゼは、LoxP配列間の分子内組換えと分子間組換えの両方を媒介することができる。LoxP配列は、2つの13bpインバートリピートに隣接する8bpの非パリンドロームコア領域から構成される。Creリコンビナーゼは13bpリピートに結合し、それによって8bpのコア領域内での組換えを媒介する。Cre-LoxP媒介組換えは、高い効率で起こり、他のいかなる宿主因子も必要としない。2つのLoxP配列が同じヌクレオチド配列上で同じ方向に配置されている場合、Creリコンビナーゼ媒介組換えは、2つのLoxP配列の間に位置するDNA配列を共有結合で閉じた環として切り取るであろう。2つのLoxP配列が同じヌクレオチド配列上で逆方向の位置に配置されている場合、Creリコンビナーゼ媒介組換えは、2つの配列の間に位置するDNA配列の向きを反転するであろう。2つのLoxP配列が2つの異なるDNA分子上にあり、1つのDNA分子が環状である場合、Creリコンビナーゼ媒介組換えにより、環状DNA配列の組込みがもたらされるであろう。
一致RRS
用語「一致RRS」とは、2つのRRS間で組換えが起こることを示す。特定の実施形態において、2つの一致RRSは同じである。特定の実施形態において、どちらのRRSも、野生型LoxP配列である。特定の実施形態において、どちらのRRSも、変異LoxP配列である。特定の実施形態において、どちらのRRSも、野生型FRT配列である。特定の実施形態において、どちらのRRSも、変異FRT配列である。特定の実施形態において、2つの一致RRSは、異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、第1の一致RRSはBxb1 attP配列であり、第2の一致RRSはBxb1 attB配列である。特定の実施形態において、第1の一致RRSはφC31 attB配列であり、第2の一致RRSはφC31 attB配列である。
用語「一致RRS」とは、2つのRRS間で組換えが起こることを示す。特定の実施形態において、2つの一致RRSは同じである。特定の実施形態において、どちらのRRSも、野生型LoxP配列である。特定の実施形態において、どちらのRRSも、変異LoxP配列である。特定の実施形態において、どちらのRRSも、野生型FRT配列である。特定の実施形態において、どちらのRRSも、変異FRT配列である。特定の実施形態において、2つの一致RRSは、異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、第1の一致RRSはBxb1 attP配列であり、第2の一致RRSはBxb1 attB配列である。特定の実施形態において、第1の一致RRSはφC31 attB配列であり、第2の一致RRSはφC31 attB配列である。
2プラスミドRMCE
「2プラスミドRMCE」戦略または「二重RMCE」は、2つのベクターの組合せを使用する場合、本発明による方法で用いられる。例えば、限定されるものではないが、組み込まれたランディング部位は、3つのRRS、例えば、第3のRRS(「RRS3」)が第1のRRS(「RRS1」)と第2のRRS(「RRS2」)の間に存在する配置を含み得、一方、第1のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第1のRRSおよび第3のRRSと一致する2つのRRSを含み、第2のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第3のRRSおよび第2のRRSと一致する2つのRRSを含む。
「2プラスミドRMCE」戦略または「二重RMCE」は、2つのベクターの組合せを使用する場合、本発明による方法で用いられる。例えば、限定されるものではないが、組み込まれたランディング部位は、3つのRRS、例えば、第3のRRS(「RRS3」)が第1のRRS(「RRS1」)と第2のRRS(「RRS2」)の間に存在する配置を含み得、一方、第1のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第1のRRSおよび第3のRRSと一致する2つのRRSを含み、第2のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第3のRRSおよび第2のRRSと一致する2つのRRSを含む。
2プラスミドRMCE戦略では、3つのRRS部位を使用して、2つの独立したRMCEを同時に実行することを含む。したがって、2プラスミドRMCE戦略を用いる哺乳動物TI宿主細胞のランディング部位は、第1のRRS部位(RRS1)に対しても第2のRRS部位(RRS2)に対しても交差活性を有していない第3のRRS部位(RRS3)を含む。標的化される2つのプラスミドは、効率的な標的化のために同じ隣接RRS部位を必要とし、一方のプラスミド(フロント)にはRRS1およびRRS3が隣接し、他方(バック)にはRRS3およびRRS2が隣接している。さらに、2プラスミドRMCEでは、2つの選択マーカーが必要とされる。1つの選択マーカー発現カセットは、2つの部分に分割された。フロントプラスミドは、プロモーターとそれに続く開始コドンおよびRRS3配列を含む。バックプラスミドは、開始コドン(ATG)を欠き、選択マーカーコード領域のN末端に融合されたRRS3配列を有する。融合タンパク質のインフレーム翻訳、すなわち作動可能な連結を確実にするために、RRS3部位と選択マーカー配列の間に追加のヌクレオチドを挿入する必要がある場合がある。両方のプラスミドが正確に挿入された場合にのみ、選択マーカーの完全な発現カセットが組み立てられ、したがって、各選択剤に対する耐性が細胞に与えられる。
2プラスミドRMCEは、リコンビナーゼによって触媒される、標的ゲノム遺伝子座内の2つの異種特異的RRSとドナーDNA分子の間の二重組換えクロスオーバー事象を伴う。2プラスミドRMCEは、フロントベクターおよびバックベクターに由来する組み合わせられたDNA配列のコピーを、哺乳動物TI宿主細胞ゲノムの所定の遺伝子座に導入するように設計されている。RMCEは、原核生物ベクターの配列が哺乳動物TI宿主細胞ゲノム内に導入されず、したがって、宿主の免疫または防御機構の望まれない誘発を低減および/または防止するように、実行され得る。RMCE手順は、複数のDNA配列を用いて繰り返され得る。
特定の実施形態において、標的化組込みは、2回のRMCEによって実現され、その際、2つの異なるDNA配列が両方とも、哺乳動物TI宿主細胞に一致するRRSのゲノムの所定の部位に組み込まれ、各DNA配列は、ヘテロ多量体ポリペプチドの一部分および/または2つの異種特異的RRSが隣接する少なくとも1つの選択マーカーもしくはその一部分をコードする、少なくとも1つの発現カセットを含む。特定の実施形態において、標的化組込みは、複数回のRMCEによって実現され、その際、複数のベクターに由来するDNA配列がすべて、哺乳動物TI宿主細胞のゲノムの所定の部位に組み込まれ、各DNA配列は、ヘテロ多量体ポリペプチドの一部分および/または2つの異種特異的RRSが隣接する少なくとも1つの選択マーカーもしくはその一部分をコードする、少なくとも1つの発現カセットを含む。特定の実施形態において、選択マーカーは、一部が第1のベクターにおいてコードされ、一部が第2のベクターにおいてコードされ得、その結果、二重RMCEによって両方が正確に組み込まれた場合にのみ、その選択マーカーの発現が可能になる。
特定の実施形態において、リコンビナーゼ媒介組換えによる標的化組込みにより、原核生物ベクターに由来する配列を含まずに、宿主細胞ゲノムの1つ以上の所定の組込み部位に、選択マーカーおよび/または多量体ポリペプチドの異なる発現カセットが組み込まれる。
一実施形態のように、ノックアウトは、異種ポリペプチドをコードする外因性核酸の導入前またはその後のいずれでも実施され得ることが指摘されなければならない。
発明の詳細な説明
XBP1エクソン4は、+2のフレーム外事象を導入し、XBP1sを産生するために、インビボでIRE1αによって切除される26ヌクレオチド断片を含む。本発明者らは、エクソン4のスキップも+2のフレーム外事象を導入し、機能性タンパク質を産生することを決定した。エクソン4のスキップは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して達成され得る。本発明に従ってエクソン4をスキップすることによって、IRE1αによって切除された26ヌクレオチド断片と比較して、146bpのはるかに大きいヌクレオチド断片がプレmRNAから除去される。したがって、本発明によるXBP1Δ4は、インビボスプライシングされたXBP1に等しくない。
XBP1エクソン4は、+2のフレーム外事象を導入し、XBP1sを産生するために、インビボでIRE1αによって切除される26ヌクレオチド断片を含む。本発明者らは、エクソン4のスキップも+2のフレーム外事象を導入し、機能性タンパク質を産生することを決定した。エクソン4のスキップは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して達成され得る。本発明に従ってエクソン4をスキップすることによって、IRE1αによって切除された26ヌクレオチド断片と比較して、146bpのはるかに大きいヌクレオチド断片がプレmRNAから除去される。したがって、本発明によるXBP1Δ4は、インビボスプライシングされたXBP1に等しくない。
本発明者らはまた、哺乳動物細胞におけるXBP1Δ4バリアントの生成または発現が、モノクローナル抗体などの異種発現タンパク質、特にそうでなければ発現が困難な異種発現タンパク質の組換え発現増強をもたらすことを同定した。これは、XBP1Δ4バリアントの生成または発現が哺乳動物細胞におけるタンパク質発現の質の向上をもたらすことを示している。
本発明は、XBP1プレmRNA転写物の一部に相補的、例えば完全に相補的な特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを開示し、利用する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、XBP1転写物中のXBP1エクソン4の包含を減少させる(切除を増強する)ことができる。それにより、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、XBP1Δ4バリアントの発現またはその発現増強をもたらす。
本発明者らは、哺乳動物細胞におけるXBP1Δ4バリアントの生成または発現がタンパク質発現の増強をもたらすことを同定した。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えばモノクローナル抗体などの抗体の製造において、異種タンパク質発現系から産生されるタンパク質の収量または質を高めるために使用されてもよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、タンパク質病理学的疾患の処置および予防において治療的有用性を有する。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
一態様において、本発明は、XBP1を発現する細胞におけるXBP1スプライスバリアントの発現に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、アンチセンスオリゴヌクレオチドが8~40ヌクレオチド長であり、かつ哺乳動物XBP1プレmRNA転写物に相補的な8~40ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
一態様において、本発明は、XBP1を発現する細胞におけるXBP1スプライスバリアントの発現に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、アンチセンスオリゴヌクレオチドが8~40ヌクレオチド長であり、かつ哺乳動物XBP1プレmRNA転写物に相補的な8~40ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
本発明の特定の実施形態において、XBP1スプライスバリアントは、+2のフレーム外事象を有する。
特定の実施形態において、XBP1スプライスバリアントは、XBP1Δ4である。
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが8~40ヌクレオチド長であり、かつ哺乳動物XBP1プレmRNA転写物に相補的、例えば完全に相補的な少なくとも12ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが8~40ヌクレオチド長であり、かつ哺乳動物XBP1プレmRNA転写物に相補的、例えば完全に相補的な12~16ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが12~16ヌクレオチド長であり、哺乳動物XBP1プレmRNA転写物に相補的、例えば完全に相補的な12~16ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが8~40ヌクレオチド長であり、かつ哺乳動物XBP1プレmRNA転写物に相補的、例えば完全に相補的な12~18ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39または40ヌクレオチド長であり得る。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、8~40、12~40、12~20、10~20、14~18、12~18または16~18ヌクレオチド長である。
連続ヌクレオチド配列は、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39または40ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、少なくとも12ヌクレオチド長、例えば12~16または12~18ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ長さである。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列からなる。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸の領域または標的配列と少なくとも約80%、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%または少なくとも約99%相補的である、8~40ヌクレオチド長の連続配列を含む。言い換えれば、いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つ、2つ、3つまたはそれを超えるミスマッチを含んでいてもよく、ミスマッチは、その標的と塩基対を形成しない本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドである。
オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が標的配列の領域と完全に相補的(100%相補的)である場合が有利である。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、単離、精製または製造される。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つ以上の修飾ヌクレオチドまたは1つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つ以上の修飾ヌクレオシド、例えば、2’-O-アルキル-RNA、2’-O-メチルRNA(2’-OMe)、2’-アルコキシ-RNA、2’-O-メトキシエチル-RNA(2’-MOE)、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-RNA、2’-フルオロ-DNA、アラビノ核酸(ANA)、2’-フルオロ-ANA、二環式ヌクレオシド類似体(LNA)、またはそれらの任意の組合せからなる群から独立して選択される1つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、1つ以上の修飾ヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。
いくつかの実施形態において、1つ以上の修飾ヌクレオシドは、二環式糖を含む。
いくつかの実施形態において、1つ以上の修飾ヌクレオシドは、親和性増強2’糖修飾ヌクレオシドである。
いくつかの実施形態において、1つ以上の修飾ヌクレオシドは、LNAヌクレオシドである。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、1つ以上の5’-メチル-シトシン核酸塩基を含む。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合のうちの1つ以上が修飾されている。
いくつかの実施形態において、1つ以上の修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合を含む。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または約100%のヌクレオシド間結合が修飾されている。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または約100%のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、固体粉末形態、例えば凍結乾燥粉末の形態である。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する追加の開示は、本開示を通して提供される。
標的
本明細書に記載されるように、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、XBP1スプライスバリアント、例えばXBP1Δ4バリアントの発現を引き起こすために、XBP1 mRNA配列を標的とする。
本明細書に記載されるように、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、XBP1スプライスバリアント、例えばXBP1Δ4バリアントの発現を引き起こすために、XBP1 mRNA配列を標的とする。
本明細書で使用される場合、用語「XBP1Δ4」とは、エクソン4を欠くXBP1転写物(XBP1Δ4バリアント)、またはXBP1エクソン4によってコードされるアミノ酸を欠くXBP1タンパク質を指す。XBP1Δ4バリアントの重要な特徴は、エクソン4の欠失およびXBP1コード配列における+2フレームシフトの導入が生じており、その結果、(IRE1によって誘導される)XBP1のXBP1sバリアントのC末端領域と相同なC末端領域を有するXBP1Δ4バリアントの発現がもたらされることである。
特定の実施形態において、XBP1Δ4タンパク質は、XBP1エクソン4によってコードされるペプチド配列のすべてまたは本質的にすべてを欠く。
本明細書で使用される「標的」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズ/結合する遺伝子の転写物(すなわち、「XBP1」)を指すために使用される。
XBP1は、X-box結合タンパク質1、TREB-5、TREB5、XBP-1およびXBP2としても知られている。
本発明のオリゴヌクレオチドの標的は、XBP1プレmRNA転写物である。XBP1プレmRNA転写物は、好ましくは哺乳動物XBP1プレmRNA転写物である。
いくつかの実施形態において、哺乳動物XBP1プレmRNA転写物は、ハムスターXBP1プレmRNA転写物である。
ハムスターXBP1プレmRNA配列を配列番号1に列挙する。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、ハムスターXBP1プレmRNA転写物(配列番号1)の少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的である。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号1のヌクレオチド2960~3113からの少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的であり得る。
他の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号1のヌクレオチド2986~3018からの少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的であり得る。
いくつかの実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、ハムスターXBP1プレmRNA転写物(配列番号1)の少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個または少なくとも17個の連続ヌクレオチドに相補的である。
他の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号299、配列番号301、配列番号302、配列番号304、配列番号305、配列番号306、配列番号307、配列番号308、配列番号309、配列番号310、配列番号314、配列番号316、配列番号317、配列番号318、配列番号319、配列番号323、配列番号325、配列番号327、配列番号328、配列番号330、配列番号331、配列番号332、配列番号333、配列番号334、配列番号336、配列番号337、配列番号385、配列番号386、配列番号387、配列番号388、配列番号390、配列番号391、配列番号392、配列番号393、配列番号394、配列番号395、配列番号396、配列番号397、配列番号398、配列番号399、配列番号401、配列番号402、配列番号419、配列番号431、配列番号432、配列番号433、配列番号434、配列番号438、配列番号439、配列番号440、配列番号441、配列番号442、配列番号449、配列番号484、配列番号485、配列番号486、配列番号487、配列番号488、配列番号489、配列番号490、配列番号491、配列番号492、配列番号493、配列番号494、配列番号495、配列番号496、配列番号497、配列番号498、配列番号499、配列番号500、配列番号501、配列番号502、配列番号503、配列番号505、配列番号506、配列番号507、配列番号508、配列番号509、配列番号510、配列番号511、配列番号512、配列番号513、配列番号515、配列番号517、配列番号520、配列番号572、配列番号573、配列番号576、配列番号577、配列番号588および配列番号589からなる群から選択されるヌクレオチド配列に相補的であり得る。
他の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号305、配列番号307、配列番号314、配列番号315、配列番号316、配列番号317、配列番号319、配列番号331、配列番号332、配列番号392、配列番号394、配列番号395、配列番号440、配列番号492、配列番号497、配列番号498、配列番号499、配列番号500、配列番号501、配列番号502、配列番号513および配列番号576からなる群から選択されるヌクレオチド配列に相補的であり得る。
他の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号314または配列番号315に相補的であり得る。
いくつかの実施形態において、哺乳動物XBP1プレmRNA転写物は、マウスXBP1プレmRNA転写物である。
マウスXBP1プレmRNAを配列番号590に列挙する。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、マウスXBP1プレmRNA転写物(配列番号590)の少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的である。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号590のヌクレオチド3560~3783からの少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的であり得る。
いくつかの実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、マウスXBP1プレmRNA転写物(配列番号590)の少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個または少なくとも17個の連続ヌクレオチドに相補的である。
他の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号699、配列番号700、配列番号703、配列番号710、配列番号713、配列番号724、配列番号729、配列番号739、配列番号743、配列番号744、配列番号745、配列番号749、配列番号750、配列番号751、配列番号752、配列番号753、配列番号754、配列番号755、配列番号756、配列番号757、配列番号758、配列番号759、配列番号760、配列番号761、配列番号762、配列番号763、配列番号773、配列番号776、配列番号778、配列番号781、配列番号783、配列番号784、配列番号785、配列番号787、配列番号789、配列番号790、配列番号791、配列番号792、配列番号793、配列番号794、配列番号795、配列番号796、配列番号797、配列番号798、配列番号799および配列番号800からなる群から選択されるヌクレオチド配列に相補的であり得る。
他の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号710、配列番号754、配列番号756、配列番号757、配列番号758、配列番号759、配列番号760、配列番号791、配列番号792、配列番号794、配列番号795および配列番号797からなる群から選択されるヌクレオチド配列に相補的であり得る。
いくつかの実施形態において、哺乳動物XBP1プレmRNA転写物は、ヒトXBP1プレmRNA転写物である。
ヒトXBP1プレmRNAを配列番号801に列挙する。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、ヒトXBP1プレmRNA転写物(配列番号801)の少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的である。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号801のヌクレオチド4338~4563からの少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的であり得る。
いくつかの実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、ヒトXBP1プレmRNA転写物(配列番号801)の少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個または少なくとも17個の連続ヌクレオチドに相補的である。
他の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号947、配列番号948、配列番号949、配列番号950、配列番号951および配列番号988からなる群から選択されるヌクレオチド配列に相補的であり得る。
他の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号951に相補的であり得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチド配列
連続ヌクレオチド配列は、ハムスターXBP1プレmRNA転写物(配列番号1)の一部に相補的であり得る。
連続ヌクレオチド配列は、ハムスターXBP1プレmRNA転写物(配列番号1)の一部に相補的であり得る。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号45、配列番号46、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号110、配列番号111、配列番号128、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号158、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号229、配列番号281、配列番号282、配列番号285、配列番号286、配列番号297および配列番号298からなる群から選択され得る。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号14、配列番号16、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号28、配列番号40、配列番号41、配列番号101、配列番号103、配列番号104、配列番号149、配列番号201、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号222および配列番号285からなる群から選択され得る。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号23または配列番号24であり得る。
連続ヌクレオチド配列は、マウスXBP1プレmRNA転写物(配列番号590)の一部に相補的であり得る。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号597、配列番号598、配列番号601、配列番号608、配列番号611、配列番号622、配列番号627、配列番号637、配列番号641、配列番号642、配列番号643、配列番号647、配列番号648、配列番号649、配列番号650、配列番号651、配列番号652、配列番号653、配列番号654、配列番号655、配列番号656、配列番号657、配列番号658、配列番号659、配列番号660、配列番号661、配列番号671、配列番号674、配列番号676、配列番号679、配列番号681、配列番号682、配列番号683、配列番号685、配列番号687、配列番号688、配列番号689、配列番号690、配列番号691、配列番号692、配列番号693、配列番号694、配列番号695、配列番号696、配列番号697および配列番号698からなる群から選択され得る。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号608、配列番号652、配列番号654、配列番号655、配列番号656、配列番号657、配列番号658、配列番号689、配列番号690、配列番号692、配列番号693および配列番号695からなる群から選択され得る。
連続ヌクレオチド配列は、ヒトXBP1プレmRNA転写物(配列番号801)の一部に相補的であり得る。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号854、配列番号855、配列番号856、配列番号857、配列番号858および配列番号895からなる群から選択され得る。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号858であり得る。
いくつかの実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ長さである。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列からなる。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列である。
本発明はまた、その少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個または少なくとも17個の連続ヌクレオチドの断片を含む、連続ヌクレオチド配列の断片を企図する。
アンチセンスオリゴヌクレオチド活性
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるものなどの哺乳動物XBP1プレmRNA転写物のスプライシングを調節する。いくつかの実施形態において、哺乳動物XBP1プレmRNA転写物のスプライシングを調節することにより、特定のXBP1バリアントの発現および/または活性を調節することができる。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるものなどの哺乳動物XBP1プレmRNA転写物のスプライシングを調節する。いくつかの実施形態において、哺乳動物XBP1プレmRNA転写物のスプライシングを調節することにより、特定のXBP1バリアントの発現および/または活性を調節することができる。
理論に拘束されることを望むものではないが、スプライス調節オリゴヌクレオチドは、典型的には、分解機構(RNaseHまたはRISC媒介阻害など)を介するのではなく、占有ベースの機構を介して作用する。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞におけるエクソン4を含むXBP1 mRNA転写物の発現(例えば、数)を低減または阻害することができる。本明細書では、エクソン4を含むXBP1 mRNA転写物をXBP1-E4と呼ぶ。
本明細書で使用される転写物の発現を「低減する」または「阻害する」という用語は、(例えば、XBP1-E4 mRNAの発現を低減または阻害し、それによってXBP1-E4タンパク質の発現を低減することによって)標的細胞におけるXBP1-E4タンパク質の量または活性を阻害または低減するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力の全体的な用語として理解されるべきである。
活性の阻害は、XBP1-E4 mRNAのレベル(例えば、数)を測定することによって、または細胞におけるXBP1-E4タンパク質のレベル(例えば、数)もしくは活性を測定することによって、決定され得る。したがって、発現の阻害は、インビトロまたはインビボで決定され得る。スプライス調節は、細胞におけるXBP1-E4転写物(例えば、mRNA)またはそのコードされるタンパク質の発現(例えば、数)の阻害をもたらし得ることが理解されよう。特定の実施形態において、XBP1-E4転写物(例えば、mRNA)の発現(例えば、数)は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない対応する細胞と比較して、少なくとも約1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%またはそれを超えて低減される。
本明細書で使用される場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない対応する細胞」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する前の同じ細胞、または同じ細胞型(しかし、同じ細胞ではない)を指し得る。
したがって、いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞を処理すると、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理前の同じ細胞におけるXBP1-E4転写物(例えば、mRNA)の発現と比較して、細胞におけるXBP1-E4転写物(例えば、mRNA)の発現が低減される(例えば、少なくとも約10%または少なくとも約20%)。
他の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞を処理すると、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理を受けていない同じ細胞型におけるXBP1-E4転写物(例えば、mRNA)の発現と比較して、細胞におけるXBP1-E4転写物(例えば、mRNA)の発現が低減される(例えば、少なくとも約10%または少なくとも約20%)。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞におけるエクソン4を欠くXBP1 mRNA転写物の発現(例えば、数)を増加させるまたは増強することができる。本明細書では、エクソン4を欠くXBP1 mRNA転写物をXBP1Δ4と呼ぶ。
本明細書で使用される転写物の発現を「増加させる」という用語は、(例えば、XBP1Δ4 mRNAの発現を増加させ、それによってXBP1Δ4タンパク質の発現を増加させることによって)標的細胞におけるXBP1Δ4タンパク質の量または活性を増加させるまたは増強するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力の全体的な用語として理解されるべきである。
活性の増加は、XBP1Δ4 mRNAのレベル(例えば、数)を測定することによって、または細胞におけるXBP1Δ4タンパク質のレベル(例えば、数)もしくは活性を測定することによって、決定され得る。したがって、発現の増加は、インビトロまたはインビボで決定され得る。スプライス調節は、細胞におけるXBP1Δ4転写物(例えば、mRNA)またはそのコードされるタンパク質の発現(例えば、数)の増加をもたらし得ることが理解されよう。特定の実施形態において、XBP1Δ4転写物(例えば、mRNA)の発現(例えば、数)は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない対応する細胞と比較して、少なくとも約1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%またはそれを超えて増加または増強される。XBP1Δ4転写物(例えば、mRNA)の発現(例えば、数)は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない対応する細胞と比較して、少なくとも約1%または少なくとも約5%増加または増強されることが好ましい。
本明細書で使用される場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない対応する細胞」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する前の同じ細胞、または同じ細胞型(しかし、同じ細胞ではない)を指し得る。
したがって、いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞を処理すると、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理前の同じ細胞におけるXBP1Δ4転写物(例えば、mRNA)の発現と比較して、細胞におけるXBP1Δ4転写物(例えば、mRNA)の発現が増加または増強される(例えば、少なくとも約10%または少なくとも約20%)。
他の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞を処理すると、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理を受けていない同じ細胞型におけるXBP1Δ4転写物(例えば、mRNA)の発現と比較して、細胞におけるXBP1Δ4転写物(例えば、mRNA)の発現が増加または増強される(例えば、少なくとも約10%または少なくとも約20%)。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞において発現される代替的なXBP1スプライスバリアントの比率を変化させることができる。例えば、XBP1Δ4の発現の増加または増強は、XBP1Δ4/XBP1E4転写物の発現比の増加をもたらす。
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない細胞の対応する比と比較して、XBP1Δ4/XBP1E4 mRNA転写物の発現比を増加させることができる。特定の実施形態において、XBP1-E4 mRNA転写物の発現に対するXBP1Δ4 mRNA転写物の発現の比は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない細胞の対応する比と比較して、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、少なくとも約30倍、少なくとも約35倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍またはそれを超えて増加する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない細胞の対応する比と比較して、XBP1Δ4/XBP1E4タンパク質の発現比を増加させることができる。特定の実施形態において、XBP1-E4タンパク質の発現に対するXBP1Δ4タンパク質の発現の比は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない細胞の対応する比と比較して、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍またはそれを超えて増加する。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、i)標的細胞におけるXBP1Δ4 mRNAまたはXBP1Δ4タンパク質の量を増加させること、およびii)標的細胞におけるXBP1-E4 mRNAおよびXBP1-E4タンパク質の量を減少させることの両方が可能である。
異なる転写物(例えば、XBP1-E4対XBP1Δ4)の比の変化は、mRNAレベルまたは対応するタンパク質産物のレベルを比較することによって測定され得る。XBP1に対して産生されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む、XBP1-E4およびXBP1Δ4のタンパク質レベルをアッセイするために使用され得る抗XBP1抗体。
オリゴヌクレオチド設計
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体の両方を含むヌクレオチド配列を含み得、ギャップマー、ブロックマー、ミックスマー、ヘッドマー、テールマーまたはトータルマーの形態であり得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体の両方を含むヌクレオチド配列を含み得、ギャップマー、ブロックマー、ミックスマー、ヘッドマー、テールマーまたはトータルマーの形態であり得る。
一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも16個、少なくとも16個、または少なくとも17個の修飾ヌクレオシドを含む。
本明細書で使用される「ギャップマー」という用語は、1つ以上の親和性増強修飾ヌクレオシド(隣接部(flank))が5’および3’に隣接するRNase H動員オリゴヌクレオチドの領域(ギャップ)を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。「ヘッドマー」および「テールマー」という用語は、1つの隣接部が欠損している、すなわちオリゴヌクレオチドの1つの末端のみが親和性増強修飾ヌクレオシドを含む、RNaseHを動員することができるオリゴヌクレオチドである。ヘッドマーの場合、3’隣接部が欠損しており(すなわち、5’隣接部が、親和性増強修飾ヌクレオシドを含む)、テールマーの場合、5’隣接部が欠損している(すなわち、3’隣接部が、親和性増強修飾ヌクレオシドを含む)。「LNAギャップマー」という用語は、少なくとも1つの親和性増強修飾ヌクレオシドがLNAヌクレオシドであるギャップマーオリゴヌクレオチドである。「混合ウィングギャップマー」という用語は、隣接部領域が、少なくとも1つのLNAヌクレオシドおよび少なくとも1つのDNAヌクレオシドまたは非LNA修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも1つの2’置換された修飾ヌクレオシド、例えば、2’-O-アルキル-RNA、2’-O-メチル-RNA、2’-アルコキシ-RNA、2’-O-メトキシエチル-RNA(MOE)、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-RNA、2’-フルオロ-DNA、アラビノ核酸(ANA)、および2’-フルオロ-ANAヌクレオシドを含むLNAギャップマーを指す。
「ミックスマー」と呼ばれる他の「キメラ」アンチセンスオリゴヌクレオチドは、(i)RNaseによって認識および切断可能なDNAモノマーまたはヌクレオシド類似体モノマーと、(ii)非RNase動員ヌクレオシド類似体モノマーとの交互組成物からなる。
「トータルマー」は、天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のみを含む一本鎖ASOである。
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、例えば融解温度(Tm)によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり+0.5~+12℃、より好ましくは+1.5~+10℃、最も好ましくは+3~+8℃の融解温度の上昇をもたらす。数多くの高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野で公知であり、例えば、多くの2’置換ヌクレオシドおよびロックド核酸(LNA)が挙げられる(例えば、Freier&Altmann;Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443およびUhlmann;Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),203-213を参照されたい)。
高親和性修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、例えば融解温度(Tm)によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり+0.5~+12℃、より好ましくは+1.5~+10℃、最も好ましくは+3~+8℃の融解温度の上昇をもたらす。数多くの高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野で公知であり、例えば、多くの2’置換ヌクレオシドおよびロックド核酸(LNA)が挙げられる(例えば、Freier&Altmann;Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443およびUhlmann;Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),203-213を参照されたい)。
糖修飾
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖部分、すなわち、DNAおよびRNAに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する1つ以上のヌクレオシドを含み得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖部分、すなわち、DNAおよびRNAに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する1つ以上のヌクレオシドを含み得る。
リボース糖部分の修飾を有する数多くのヌクレオシドが、親和性および/またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善することを主な目的として作製されてきた。
そのような修飾には、例えばヘキソース環(HNA)または二環式環(典型的には、リボース環(LNA)上のC2とC4炭素の間にバイラジカル架橋を有する)、または典型的にはC2とC3炭素の間の結合を欠く非結合リボース環(例えば、UNA)で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸(国際公開第2011/017521号)または三環式核酸(国際公開第2013/154798号)が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、糖部分が例えばペプチド核酸(PNA)またはモルホリノ核酸の場合には非糖部分で置き換えられているヌクレオシドも含まれる。
糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を、水素以外の基、またはDNAおよびRNAヌクレオシド中に天然に存在する2’-OH基に変更することによってなされる修飾も含まれる。置換基は、例えば2’、3’、4’、または5’位で導入され得る。
2’糖修飾ヌクレオシド
2’糖修飾ヌクレオシドは、2’位にHもしくは-OH以外の置換基を有するヌクレオシド(2’置換ヌクレオシド)、またはリボース環の2’炭素と第2の炭素との間に架橋を形成できる2’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばLNA(2’-4’バイラジカル架橋)ヌクレオシドである。
2’糖修飾ヌクレオシドは、2’位にHもしくは-OH以外の置換基を有するヌクレオシド(2’置換ヌクレオシド)、またはリボース環の2’炭素と第2の炭素との間に架橋を形成できる2’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばLNA(2’-4’バイラジカル架橋)ヌクレオシドである。
実際、2’糖置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、数多くの2’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、2’修飾糖は、増強された結合親和性および/または増大されたヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドにもたらし得る。2’置換修飾ヌクレオシドの例は、2’-O-アルキル-RNA、2’-O-メチル-RNA、2’-アルコキシ-RNA、2’-O-メトキシエチル-RNA(MOE)、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-RNAおよび2’-F-ANAヌクレオシドである。さらなる例については、例えばFreier&Altmann;Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443およびUhlmann;Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),203-213、およびDeleavey and Damha,Chemistry and Biology 2012,19,937を参照されたい。以下は、いくつかの2’置換修飾ヌクレオシドの例示である。
本発明に関して、2’置換糖修飾ヌクレオシドは、LNAのような2’架橋ヌクレオシドを含まない。
ロックド核酸ヌクレオシド(LNAヌクレオシド)
「LNAヌクレオシド」は、該ヌクレオシドのリボース糖環のC2’とC4’とを結合するビラジカル(「2’-4’架橋」とも呼ばれる)を含む2’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限または固定する。これらのヌクレオシドはまた、文献において、架橋核酸または二環式核酸(BNA)とも称されている。リボースの立体配座の固定は、LNAが相補的RNAまたはDNA分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の増強(二重鎖の安定化)に関連している。これは、オリゴヌクレオチド/相補二重鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定され得る。
「LNAヌクレオシド」は、該ヌクレオシドのリボース糖環のC2’とC4’とを結合するビラジカル(「2’-4’架橋」とも呼ばれる)を含む2’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限または固定する。これらのヌクレオシドはまた、文献において、架橋核酸または二環式核酸(BNA)とも称されている。リボースの立体配座の固定は、LNAが相補的RNAまたはDNA分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の増強(二重鎖の安定化)に関連している。これは、オリゴヌクレオチド/相補二重鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定され得る。
非限定的な、例示的なLNAヌクレオシドは、国際公開第99/014226号、国際公開第00/66604号、国際公開第98/039352号、国際公開第2004/046160号、国際公開第00/047599号、国際公開第2007/134181号、国際公開第2010/077578号、国際公開第2010/036698号、国際公開第2007/090071号、国際公開第2009/006478号、国際公開第2011/156202号、国際公開第2008/154401号、国際公開第2009/067647号、国際公開第2008/150729号、Moritaら,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76,SethらJ.Org.Chem.2010,第75(5)巻第1569~81頁、およびMitsuokaら,Nucleic Acids Research 2009,37(4),1225-1238、およびSeth,J.Medical Chemistry 2016,59,9645-9667に開示されている。
特定のLNAヌクレオシドは、ベータ-D-オキシ-LNA、6’-メチル-ベータ-D-オキシLNA、例えば(S)-6’-メチル-ベータ-D-オキシ-LNA(ScET)およびENAである。
特定の有利なLNAは、ベータ-D-オキシ-LNAである。
モルホリノオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノヌクレオシドを含むか、またはモルホリノヌクレオシドからなる(すなわち、モルホリノオリゴマーであり、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー(PMO)として)。スプライス調節モルホリノオリゴヌクレオチドは、臨床使用が承認されており、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置に使用される、DMDのフレームシフト変異を標的とする30ntモルホリノオリゴヌクレオチドである、エテプリルセンを参照のこと。モルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、以下の4つの連続するモルホリノヌクレオチドの説明に示されるように、ホスホロジアミデート基を介して連結されたメチレンモルホリン環など、リボースではなく6員のモルホリン環に結合した核酸塩基を有する。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノヌクレオシドを含むか、またはモルホリノヌクレオシドからなる(すなわち、モルホリノオリゴマーであり、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー(PMO)として)。スプライス調節モルホリノオリゴヌクレオチドは、臨床使用が承認されており、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置に使用される、DMDのフレームシフト変異を標的とする30ntモルホリノオリゴヌクレオチドである、エテプリルセンを参照のこと。モルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、以下の4つの連続するモルホリノヌクレオチドの説明に示されるように、ホスホロジアミデート基を介して連結されたメチレンモルホリン環など、リボースではなく6員のモルホリン環に結合した核酸塩基を有する。
いくつかの実施形態において、本発明のモルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、20~40モルホリノヌクレオチド長、例えば、25~35モルホリノヌクレオチド長であり得る。
RNase Hの活性および動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのRNase H活性とは、相補的RNA分子との二重鎖にあるときにRNase Hを動員する能力を指す。国際公開第01/23613号は、RNaseH活性を決定するためのインビトロ方法を提供し、これはRNaseHを動員する能力の決定に使用され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドが、相補的標的核酸配列が提供された場合に、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中のすべてのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するDNAモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開第01/23613号(参照により本明細書に組み込まれる)の実施例91~95により提供される方法論を使用したときに決定された初期速度の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%または20%超のpmol/l/分で測定された初期速度を有する場合に、このオリゴヌクレオチドはRNase Hを動員することができるとみなされる。RHase H活性の決定に使用するために、組換えRNase H1が、Lubio Science GmbH、Lucerne、Switzerlandから入手可能である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのRNase H活性とは、相補的RNA分子との二重鎖にあるときにRNase Hを動員する能力を指す。国際公開第01/23613号は、RNaseH活性を決定するためのインビトロ方法を提供し、これはRNaseHを動員する能力の決定に使用され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドが、相補的標的核酸配列が提供された場合に、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中のすべてのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するDNAモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開第01/23613号(参照により本明細書に組み込まれる)の実施例91~95により提供される方法論を使用したときに決定された初期速度の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%または20%超のpmol/l/分で測定された初期速度を有する場合に、このオリゴヌクレオチドはRNase Hを動員することができるとみなされる。RHase H活性の決定に使用するために、組換えRNase H1が、Lubio Science GmbH、Lucerne、Switzerlandから入手可能である。
DNAオリゴヌクレオチドは、2’糖修飾ヌクレオシド、典型的には高親和性2’糖修飾ヌクレオシド、例えば2-O-MOEおよび/またはLNAを含む領域が5’および3’に隣接するDNAヌクレオシド(典型的には少なくとも5または6個の連続するDNAヌクレオシド)の領域を含むギャップマーオリゴヌクレオチドと同様に、RNaseHを効果的に動員することが公知である。スプライシングの効果的な調節のために、プレmRNAの分解は望ましくなく、したがって、標的のRNaseH分解を回避することが好ましい。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNaseH動員ギャップマーオリゴヌクレオチドではない。
RNaseH動員は、オリゴヌクレオチド中の連続DNAヌクレオチドの数を制限することによって回避され得るので、ミックスマーおよびトータルマー設計が使用され得る。好都合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、3個を超える連続DNAヌクレオシドを含まない。さらに好都合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、4個を超える連続DNAヌクレオシドを含まない。さらに好都合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、2個を超える連続DNAヌクレオシドを含まない。
ミックスマーおよびトータルマー
スプライス調節のために、RNAaseHを動員しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することがしばしば有利である。RNaseH活性はDNAヌクレオチドの連続配列を必要とするので、アンチセンスオリゴヌクレオチドのRNaseH活性は、3個を超えるか、または4個を超える連続DNAヌクレオシドの領域を含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することによって達成され得る。これは、2’糖修飾ヌクレオシドなどの糖修飾ヌクレオシドと、1、2もしくは3個のDNAヌクレオシドなどのDNAヌクレオシドの短い領域とを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオシド領域をミックスマー設計で使用することによって達成され得る。ミックスマーは、本明細書において、1つおきの設計によって例示され、ここではヌクレオシドが1個のLNAヌクレオシドと1個のDNAヌクレオシドとを交互に繰り返し、例えばLDLDLDLDLDLDLDLLであり、5’および3’末端LNAヌクレオシドを伴い;ならびに2つおきの設計によって例示され、例えばLDDLDDLDDLDDLDDLであり、2つおきのヌクレオシドがLNAヌクレオシドである。
スプライス調節のために、RNAaseHを動員しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することがしばしば有利である。RNaseH活性はDNAヌクレオチドの連続配列を必要とするので、アンチセンスオリゴヌクレオチドのRNaseH活性は、3個を超えるか、または4個を超える連続DNAヌクレオシドの領域を含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することによって達成され得る。これは、2’糖修飾ヌクレオシドなどの糖修飾ヌクレオシドと、1、2もしくは3個のDNAヌクレオシドなどのDNAヌクレオシドの短い領域とを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオシド領域をミックスマー設計で使用することによって達成され得る。ミックスマーは、本明細書において、1つおきの設計によって例示され、ここではヌクレオシドが1個のLNAヌクレオシドと1個のDNAヌクレオシドとを交互に繰り返し、例えばLDLDLDLDLDLDLDLLであり、5’および3’末端LNAヌクレオシドを伴い;ならびに2つおきの設計によって例示され、例えばLDDLDDLDDLDDLDDLであり、2つおきのヌクレオシドがLNAヌクレオシドである。
トータルマーは、DNAまたはRNAヌクレオシドを含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列であり、例えば、治療的使用のための効果的なスプライス調節因子であると報告されている完全MOEホスホロチオエート、例えばMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM(M=2’-O-MOE)などの2’-O-MOEヌクレオシドのみを含んでもよい。
あるいは、ミックスマーは、MLMLMLMLMLMLMLMLMLMLなどの修飾ヌクレオシドの混合物を含んでいてもよく、式中、L=LNAおよびM=2’-O-MOEヌクレオシドである。
有利には、ミックスマーおよびトータルマー中のヌクレオシド間ヌクレオシドはホスホロチオエートであってもよく、またはミックスマー中のヌクレオシド結合の大部分はホスホロチオエートであってもよい。ミックスマーおよびトータルマーは、例として、ホスホジエステルまたはホスホロジチオエートなどの他のヌクレオシド間結合を含み得る。
オリゴヌクレオチド内の領域D’またはD”
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばミックスマーまたはトータルマー領域、ならびにさらに5’および/または3’ヌクレオシドを含むか、またはそれからなり得る。さらなる5’および/または3’ヌクレオシドは、標的核酸に相補的、例えば完全に相補的であってもよく、または相補的、例えば完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる5’および/または3’ヌクレオシドは、本明細書では領域D’およびD”と称され得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばミックスマーまたはトータルマー領域、ならびにさらに5’および/または3’ヌクレオシドを含むか、またはそれからなり得る。さらなる5’および/または3’ヌクレオシドは、標的核酸に相補的、例えば完全に相補的であってもよく、または相補的、例えば完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる5’および/または3’ヌクレオシドは、本明細書では領域D’およびD”と称され得る。
領域D’またはD”の付加は、連続ヌクレオチド配列、例えばミックスマーまたはトータルマーをコンジュゲート部分または別の官能基に連結する目的のために使用され得る。連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分と連結するために使用される場合、それは生体切断可能なリンカーとして働くことができる。あるいは、それはエキソヌクレアーゼ保護を提供するために、または合成もしくは製造を容易にするために使用されてもよい。
領域D’またはD”は、独立して、1、2、3、4または5個の追加のヌクレオチドを含むか、またはそれからなり、標的核酸に対して相補的であっても、相補的でなくてもよい。FもしくはF’領域に隣接するヌクレオチドは、DNAもしくはRNAなどの糖修飾ヌクレオチドではなく、またはこれらの塩基修飾バージョンでもない。D’またはD”領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る(リンカーの定義を参照されたい)。いくつかの実施形態において、追加の5’および/または3’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合されており、DNAまたはRNAである。領域D’またはD”としての使用に好適なヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカーは、国際公開第2014/076195号に開示されており、これには例としてホスホジエステル結合DNAジヌクレオチドが含まれる。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカーの使用は国際公開第WO2015/113922号に開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物を単一のオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。
一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミックスマーまたはトータルマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域D’および/またはD”を含む。
いくつかの実施形態において、領域D’またはD”とミックスマーまたはトータルマー領域との間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。
コンジュゲート
本発明は、少なくとも1つのコンジュゲート部分に共有結合したアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、これは本発明のコンジュゲートと称され得る。
本発明は、少なくとも1つのコンジュゲート部分に共有結合したアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、これは本発明のコンジュゲートと称され得る。
本明細書で使用される「コンジュゲート」という用語は、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分または領域Cまたは第3の領域)に共有結合したアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。コンジュゲート部分は、任意に領域D’またはD”などのリンカー基を介して、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合していてもよい。
オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびそれらの合成については、Manoharan in Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications,S.T.Crooke,編,Ch.16,Marcel Dekker,Inc.,2001およびManoharan,Antisense and Nucleic Acid Drug Development,2002,12,103の包括的総説でも報告されている。
いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分は、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたはそれらの任意の組合せを含み得る。
いくつかの実施形態において、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分)は、炭水化物(例えば、GalNAc)、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素(例えば、細菌毒素)、ビタミン、ウイルスタンパク質(例えば、カプシド)、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートはプロドラッグである。ここで、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、コンジュゲート部分は核酸分子から切断され得る。
リンカー
結合またはリンカーは、1つ以上の共有結合を介して目的の1つの化学基またはセグメントを目的の別の化学基またはセグメントに連結する、2つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接または連結部分(例えば、リンカーまたはテザー)を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合され得る。リンカーは、第3の領域、例えばコンジュゲート部分(領域C)を、第1の領域、例えば、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列(領域A)に共有結合する役割を果たす。
結合またはリンカーは、1つ以上の共有結合を介して目的の1つの化学基またはセグメントを目的の別の化学基またはセグメントに連結する、2つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接または連結部分(例えば、リンカーまたはテザー)を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合され得る。リンカーは、第3の領域、例えばコンジュゲート部分(領域C)を、第1の領域、例えば、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列(領域A)に共有結合する役割を果たす。
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のコンジュゲートまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、任意に、標的核酸に対して相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列(領域Aまたは第1の領域)と、コンジュゲート部分(領域Cまたは第3の領域)との間に位置するリンカー領域(第2の領域または領域Bおよび/または領域Y)を含み得る。
領域Bは、哺乳動物の体内で通常遭遇するまたは遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか、またはそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換(例えば、切断)を受ける条件には、pH、温度、酸化もしくは還元条件、または薬剤などの化学条件、ならびに哺乳動物の細胞で見られるまたは遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素または加水分解酵素またはヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態において、生体切断可能なリンカーは、S1ヌクレアーゼ切断を受けやすい。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、少なくとも2つの連続ホスホジエステル結合を含むDNAヌクレオシドなどの1~5個のヌクレオシドを含む。ホスホジエステルを含有する生体切断可能なリンカーは、国際公開第2014/076195号により詳細に記載されている。
領域Yは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分(領域Cまたは第3の領域)をオリゴヌクレオチド(領域Aまたは第1の領域)に共有結合する役割を果たすリンカーを指す。領域Yリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位またはアミノアルキル基などの反復単位の鎖構造またはオリゴマーを含み得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の領域エレメントA-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-CまたはA-Y-Cから構築され得る。いくつかの実施形態において、リンカー(領域Y)は、例えばC6~C12アミノアルキル基を含むC2~C36アミノアルキル基などのアミノアルキルである。いくつかの実施形態において、リンカー(領域Y)は、C6アミノアルキル基である。
薬学的な塩
本発明は、薬学的に許容され得る塩の形態である、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。「薬学的に許容され得る塩」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的有効性および特性を保持する従来の酸付加塩または塩基付加塩を指す。
本発明は、薬学的に許容され得る塩の形態である、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。「薬学的に許容され得る塩」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的有効性および特性を保持する従来の酸付加塩または塩基付加塩を指す。
いくつかの実施形態において、薬学的に許容され得る塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはアンモニウム塩であり得る。
本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明によるコンジュゲートの薬学的に許容され得るナトリウム塩を提供する。
本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明によるコンジュゲートの薬学的に許容され得るカリウム塩を提供する。
本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明によるコンジュゲートの薬学的に許容され得るアンモニウム塩を提供する。
医薬組成物
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明のコンジュゲートまたは本発明の塩と、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、および/またはアジュバントとを含む、医薬組成物を提供する。
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明のコンジュゲートまたは本発明の塩と、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、および/またはアジュバントとを含む、医薬組成物を提供する。
薬学的に許容され得る希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)が含まれ、薬学的に許容され得る塩には、限定するものではないが、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれる。いくつかの実施形態において、薬学的に許容され得る希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施形態において、核酸分子は、50~300μMの溶液の濃度で薬学的に許容され得る希釈剤中で使用される。
本発明での使用に好適な製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,Pa.,第17版,1985に見られる。薬物送達の方法の簡単な総説については、例えば、Langer(Science 249:1527-1533,1990)を参照されたい。国際公開第2007/031091号は、薬学的に許容され得る希釈剤、担体およびアジュバントの好適な好ましいさらなる例を提供している(参照により本明細書に組み込まれる)。好適な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組合せ、プロドラッグ製剤もまた、国際公開第2007/031091号に提供されている。
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明のコンジュゲートと、薬学的に許容され得る塩とを含む、医薬組成物を提供する。例えば、塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはアンモニウム塩などの金属カチオンを含み得る。
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明のコンジュゲートまたは本発明の薬学的に許容され得る塩と、水性希釈剤または溶媒とを含む、本発明による医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、本発明のコンジュゲート、またはその薬学的に許容され得る塩は、固体形態、例えば粉末、例えば凍結乾燥粉末である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、本発明のコンジュゲートまたは本発明の塩は、医薬組成物または製剤を調製するために、薬学的に許容され得る活性または不活性物質と混合されてもよい。医薬組成物の製剤化のための組成物および方法は、限定されるものではないが、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含む多くの基準に依存する。
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌されても、または滅菌フィルタにかけられてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装されるか、または凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のpHは、典型的には3~11、より好ましくは5~9または6~8、最も好ましくは7~8、例えば7~7.5であろう。得られた固体形態の組成物は、錠剤またはカプセルの密封パッケージなどのように、各々が上記の薬剤または薬剤群の固定量を含む複数の単回用量単位で包装され得る。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリームまたは軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブなどの柔軟な量の容器に包装され得る。
組成物
一態様において、本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、または本発明によるコンジュゲート、または本発明による塩と、希釈剤、溶媒、担体、塩および/またはアジュバントとを含む組成物を提供する。
一態様において、本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、または本発明によるコンジュゲート、または本発明による塩と、希釈剤、溶媒、担体、塩および/またはアジュバントとを含む組成物を提供する。
組成物は医薬組成物であり得る。
本発明によるオリゴヌクレオチドの製造方法
さらなる態様において、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドに含まれる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造するための方法を提供する。好ましくは、本方法は、ホスホロアミダイト化学を使用する(例えば、Caruthersら,1987,Methods in Enzymology第154巻第287~313頁を参照のこと)。
さらなる態様において、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドに含まれる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造するための方法を提供する。好ましくは、本方法は、ホスホロアミダイト化学を使用する(例えば、Caruthersら,1987,Methods in Enzymology第154巻第287~313頁を参照のこと)。
さらなる実施形態において、本方法は、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲーティング部分(リガンド)と反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることをさらに含む。
さらなる実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、および/またはアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造するための方法が提供される。
XBP1Δ4タンパク質
一態様において、本発明は、単離されたXBP1Δ4タンパク質を含む。
一態様において、本発明は、単離されたXBP1Δ4タンパク質を含む。
単離されたXBP1Δ4タンパク質は、哺乳動物タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、XBP1Δ4タンパク質は、ハムスター、マウスまたはヒトのタンパク質であり得る。
特定の実施形態において、単離されたXBP1Δ4タンパク質は、ハムスタータンパク質であり、配列番号7によってコードされる。
特定の実施形態において、単離されたXBP1Δ4タンパク質は、マウスタンパク質であり、配列番号596によってコードされる。
特定の実施形態において、単離されたXBP1Δ4タンパク質は、ヒトタンパク質であり、配列番号807によってコードされる。
本発明はまた、単離されたXBP1Δ4タンパク質の断片も企図する。
XBP1Δ4 mRNA
一態様において、本発明は、本発明の単離されたXBP1Δ4タンパク質をコードする単離されたmRNAを含む。
一態様において、本発明は、本発明の単離されたXBP1Δ4タンパク質をコードする単離されたmRNAを含む。
単離されたXBP1Δ4 mRNAは、哺乳動物タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、XBP1Δ4 mRNAは、ハムスター、マウスまたはヒトmRNAであり得る。
特定の実施形態において、単離されたXBP1Δ4 mRNAは、ハムスターmRNAであり、配列番号6によってコードされる。
特定の実施形態において、単離されたXBP1Δ4 mRNAは、マウスmRNAであり、配列番号595によってコードされる。
特定の実施形態において、単離されたXBP1Δ4 mRNAは、ヒトmRNAであり、配列番号806によってコードされる。
本発明はまた、単離されたXBP1Δ4 mRNAの断片も企図する。
本発明による化合物を使用してポリペプチドを産生する方法
本発明者らは、哺乳動物細胞においてXBP1Δ4の発現を誘導する化合物が、哺乳動物細胞において、特に抗体などの多量体ポリペプチドの異種発現タンパク質の組換え発現を増強するのに有用であることを同定した。
本発明者らは、哺乳動物細胞においてXBP1Δ4の発現を誘導する化合物が、哺乳動物細胞において、特に抗体などの多量体ポリペプチドの異種発現タンパク質の組換え発現を増強するのに有用であることを同定した。
上記で説明したように、XBP1sは、正しいタンパク質フォールディングを増強するように機能する機能的に活性なタンパク質である。本発明者らは、驚くべきことに、XBP1Δ4などのXBP1スプライスバリアントが、組換えポリペプチド産生方法において正しく折り畳まれたタンパク質の産生を増強することができることを決定した。
一態様において、本発明は、ポリペプチドを(組換え)産生するための方法であって、
a)XBP1を発現しておりかつポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、
b)細胞または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含み、
培養が、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、医薬組成物、タンパク質またはmRNAの存在下で少なくとも部分的に行われることを特徴とする、
方法を提供する。
a)XBP1を発現しておりかつポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、
b)細胞または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含み、
培養が、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、医薬組成物、タンパク質またはmRNAの存在下で少なくとも部分的に行われることを特徴とする、
方法を提供する。
好ましい一実施形態において、培養は、予備培養工程および本培養工程を含み、少なくとも予備培養工程は、本発明のオリゴヌクレオチドの存在下で行われる。
特定の実施形態において、本方法は、
a1)XBP1を発現しておりかつポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む培養培地中で増殖させて、第1の細胞集団を得る工程と、
a2)第1の細胞集団のアリコートを培養培地と混合して、第2の細胞集団を得る工程であって、任意に、培養培地が、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、第2の細胞集団を得る工程と、
a3)第2の細胞集団を培養して、第3の細胞集団を得る工程と、
b)第3の細胞培養の細胞および/または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含む。
a1)XBP1を発現しておりかつポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む培養培地中で増殖させて、第1の細胞集団を得る工程と、
a2)第1の細胞集団のアリコートを培養培地と混合して、第2の細胞集団を得る工程であって、任意に、培養培地が、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、第2の細胞集団を得る工程と、
a3)第2の細胞集団を培養して、第3の細胞集団を得る工程と、
b)第3の細胞培養の細胞および/または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含む。
特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも約5μM、少なくとも約10μM、少なくとも約15μM、少なくとも約20μM、少なくとも約25μM、少なくとも約30μM、少なくとも約35μM、少なくとも約40μM、少なくとも約45μM、少なくとも約50μMまたはそれを超える最終濃度まで添加される。好ましい一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約25μMの最終濃度まで添加される。
特定の実施形態において、哺乳動物細胞の増殖は、少なくとも約0.5×10E6細胞/mL、少なくとも約1×10E6細胞/mL、少なくとも約2×10E6細胞/mL、少なくとも約3×10E6細胞/mL、少なくとも約4×10E6細胞/mL、少なくとも約5×10E6細胞/mLまたはそれを超える開始細胞密度で行われる。特定の実施形態において、培養は、1×10E6~2×10E6細胞/mLの開始細胞密度で行われる。
特定の実施形態において、第2の細胞集団の培養は、少なくとも約0.5×10E6細胞/mL、少なくとも約1×10E6細胞/mL、少なくとも約2×10E6細胞/mL、少なくとも約3×10E6細胞/mL、少なくとも約4×10E6細胞/mL、少なくとも約5×10E6細胞/mL、少なくとも約10×10E6細胞/mL以上の開始細胞密度で行われる。特定の実施形態において、培養は、1×10E6~2×10E6細胞/mLの開始細胞密度で行われる。
特定の実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。
特定の実施形態において、細胞は、ハムスター細胞である。
特定の実施形態において、細胞は、CHO細胞、例えばCHO-K1細胞である。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、チャイニーズハムスターの卵巣に由来する上皮細胞株であり、生物学的および医学的研究において、ならびにモノクローナル抗体などの治療用タンパク質の産生において商業的にしばしば使用される。
いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞であり得る。
いくつかの実施形態において、細胞は、ニューロン細胞または脳細胞であり得る。
いくつかの実施形態において、細胞は、インビトロであり得る。インビトロ細胞は、例えば、iPSC細胞であり得る。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、Fab、好ましくは二重特異性Fab、融合ポリペプチドを含むFc領域、ヒト治療用ポリペプチドまたはサイトカインである。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、抗体である。ここで、抗体は、本明細書で提供される「抗体」の定義で論じられるように、任意の形態をとり得る。
特定の実施形態において、本発明の方法は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの非存在下で得られるタンパク質収量に対して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約1000%、少なくとも約200%、少なくとも約300%、少なくとも約400%、少なくとも約500%またはそれを超えるタンパク質収量の増加を提供する。
特定の実施形態において、収量の増加は、ポリペプチドの絶対量の増加を表す。他の実施形態において、収量の増加は、正しく折り畳まれたポリペプチドの量の増加を表す。本明細書において、ポリペプチドは、ポリペプチドの構造を見ることによって、またはポリペプチドの活性を決定することによって、正しく折り畳まれていると定義され得る。
処置
本明細書で使用される「処置」という用語は、既存の疾患(例えば、本明細書で言及される疾患または障害)の処置、または疾患の予防(prevention)、すなわち予防法(prophylaxis)の両方を指す。したがって、本明細書で言及される処置は、いくつかの実施形態において、予防的であり得ることが認識されよう。
本明細書で使用される「処置」という用語は、既存の疾患(例えば、本明細書で言及される疾患または障害)の処置、または疾患の予防(prevention)、すなわち予防法(prophylaxis)の両方を指す。したがって、本明細書で言及される処置は、いくつかの実施形態において、予防的であり得ることが認識されよう。
一態様において、本発明は、医学または治療に使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物または医薬組成物に関する。
いくつかの実施形態において、治療は、タンパク質病理学的疾患の処置または予防に関する。
別の態様において、本発明は、タンパク質病理学的疾患を処置するための医薬品の製造における本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物または医薬組成物の使用に関する。
別の態様において、本発明は、患者のタンパク質病理学的疾患を処置する方法であって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物または医薬組成物を患者に投与することを含む方法に関する。
タンパク質病理学的疾患
特定の実施形態において、本発明は、タンパク質病理学的疾患の処置または予防に関する。タンパク質病理学的疾患はまた、プロテオパチー、プロテイノパチー、タンパク質コンフォメーション障害、またはタンパク質ミスフォールディング疾患としても知られている。
特定の実施形態において、本発明は、タンパク質病理学的疾患の処置または予防に関する。タンパク質病理学的疾患はまた、プロテオパチー、プロテイノパチー、タンパク質コンフォメーション障害、またはタンパク質ミスフォールディング疾患としても知られている。
特定の実施形態において、タンパク質病理学的疾患は、プリオン病、タウオパチー、シヌクレイノパチー、アミロイドーシス、多系統萎縮症、TDP-43病態およびCAGリピート病から選択され得る。
特定の実施形態において、タンパク質病理学的疾患は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭葉変性症(FTLD)、アルツハイマー病、パーキンソン病、自閉症、海馬硬化性認知症、ダウン症候群、ハンチントン病、ポリグルタミン病、例えば脊髄小脳失調症3、ミオパシーおよび慢性外傷性脳症から選択され得る。
特定の実施形態において、以前の疾患は、クロイツフェルト・ヤコブ病であり得る。
特定の実施形態において、タウオパチーは、アルツハイマー病であり得る。
特定の実施形態において、シヌクレイノパチーは、パーキンソン病であり得る。
特定の実施形態において、TDP-43病態は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)前頭側頭葉変性症(FTLD)であり得る。
特定の実施形態において、CAGリピート病は、脊髄小脳失調症1型、脊髄小脳失調症2型(SCA2)および脊髄小脳失調症3型(SCA3、マチャド・ジョセフ病)を含む脊髄小脳失調症であり得る。
投与
本発明の化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、医薬組成物、タンパク質または核酸は、局所的に、または経腸的に、または非経口的に(例えば、静脈内、皮下、または筋肉内)投与され得る。
本発明の化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、医薬組成物、タンパク質または核酸は、局所的に、または経腸的に、または非経口的に(例えば、静脈内、皮下、または筋肉内)投与され得る。
特定の実施形態において、それは、治療のために投与されるアンチセンス核酸または医薬組成物である。
好ましい実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または注入を含む非経口経路によって投与される。
一実施形態において、アンチセンス核酸または医薬組成物は、静脈内投与される。
別の実施形態において、アンチセンス核酸または医薬組成物は、皮下投与される。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸または医薬組成物は、0.1~15mg/kg、例えば0.2~10mg/kg、例えば0.25~5mg/kgの用量で投与される。投与は、週に1回、2週に1回、3週に1回、または月に1回であり得る。
本発明の番号付けされた実施形態
1.XBP1を発現する細胞におけるXBP1スプライスバリアントの発現に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、アンチセンスオリゴヌクレオチドが8~40ヌクレオチド長であり、かつ哺乳動物XBP1プレmRNA転写物に相補的な8~40ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
1.XBP1を発現する細胞におけるXBP1スプライスバリアントの発現に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、アンチセンスオリゴヌクレオチドが8~40ヌクレオチド長であり、かつ哺乳動物XBP1プレmRNA転写物に相補的な8~40ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
2.XBP1スプライスバリアントがXBP1Δ4バリアントである、実施形態1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
3.連続ヌクレオチド配列が、ハムスターXBP1プレmRNA転写物(配列番号1)の少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的である、実施形態1または実施形態2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
4.連続ヌクレオチド配列が、配列番号1のヌクレオチド2960~3113からの少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的である、実施形態3に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
5.連続ヌクレオチド配列が、配列番号1のヌクレオチド2986~3018からの少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的である、実施形態4に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
6.連続ヌクレオチド配列が、配列番号299、配列番号301、配列番号302、配列番号304、配列番号305、配列番号306、配列番号307、配列番号308、配列番号309、配列番号310、配列番号314、配列番号316、配列番号317、配列番号318、配列番号319、配列番号323、配列番号325、配列番号327、配列番号328、配列番号330、配列番号331、配列番号332、配列番号333、配列番号334、配列番号336、配列番号337、配列番号385、配列番号386、配列番号387、配列番号388、配列番号390、配列番号391、配列番号392、配列番号393、配列番号394、配列番号395、配列番号396、配列番号397、配列番号398、配列番号399、配列番号401、配列番号402、配列番号419、配列番号431、配列番号432、配列番号433、配列番号434、配列番号438、配列番号439、配列番号440、配列番号441、配列番号442、配列番号449、配列番号484、配列番号485、配列番号486、配列番号487、配列番号488、配列番号489、配列番号490、配列番号491、配列番号492、配列番号493、配列番号494、配列番号495、配列番号496、配列番号497、配列番号498、配列番号499、配列番号500、配列番号501、配列番号502、配列番号503、配列番号505、配列番号506、配列番号507、配列番号508、配列番号509、配列番号510、配列番号511、配列番号512、配列番号513、配列番号515、配列番号517、配列番号520、配列番号572、配列番号573、配列番号576、配列番号577、配列番号588および配列番号589からなる群から選択される配列に相補的である、実施形態3に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
7.連続ヌクレオチド配列が、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号45、配列番号46、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号110、配列番号111、配列番号128、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号158、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号229、配列番号281、配列番号282、配列番号285、配列番号286、配列番号297および配列番号298からなる群から選択される、実施形態6に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
8.連続ヌクレオチド配列が、配列番号305、配列番号307、配列番号314、配列番号315、配列番号316、配列番号317、配列番号319、配列番号331、配列番号332、配列番号392、配列番号394、配列番号395、配列番号440、配列番号492、配列番号497、配列番号498、配列番号499、配列番号500、配列番号501、配列番号502、配列番号513および配列番号576からなる群から選択される配列に相補的である、実施形態3に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
9.連続ヌクレオチド配列が、配列番号14、配列番号16、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号28、配列番号40、配列番号41、配列番号101、配列番号103、配列番号104、配列番号149、配列番号201、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号222および配列番号285からなる群から選択される、実施形態8に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
10.連続ヌクレオチド配列が、配列番号314または配列番号315に相補的である、実施形態3に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
11.連続ヌクレオチド配列が、配列番号23または配列番号24である、実施形態10に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
12.連続ヌクレオチド配列が、マウスXBP1プレmRNA転写物(配列番号590)の少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的である、実施形態1または実施形態2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
13.連続ヌクレオチド配列が、配列番号590のヌクレオチド3560~3783からの少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的である、実施形態12に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
14.連続ヌクレオチド配列が、配列番号699、配列番号700、配列番号703、配列番号710、配列番号713、配列番号724、配列番号729、配列番号739、配列番号743、配列番号744、配列番号745、配列番号749、配列番号750、配列番号751、配列番号752、配列番号753、配列番号754、配列番号755、配列番号756、配列番号757、配列番号758、配列番号759、配列番号760、配列番号761、配列番号762、配列番号763、配列番号773、配列番号776、配列番号778、配列番号781、配列番号783、配列番号784、配列番号785、配列番号787、配列番号789、配列番号790、配列番号791、配列番号792、配列番号793、配列番号794、配列番号795、配列番号796、配列番号797、配列番号798、配列番号799および配列番号800からなる群から選択される配列に相補的である、実施形態12に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
15.連続ヌクレオチド配列が、配列番号597、配列番号598、配列番号601、配列番号608、配列番号611、配列番号622、配列番号627、配列番号637、配列番号641、配列番号642、配列番号643、配列番号647、配列番号648、配列番号649、配列番号650、配列番号651、配列番号652、配列番号653、配列番号654、配列番号655、配列番号656、配列番号657、配列番号658、配列番号659、配列番号660、配列番号661、配列番号671、配列番号674、配列番号676、配列番号679、配列番号681、配列番号682、配列番号683、配列番号685、配列番号687、配列番号688、配列番号689、配列番号690、配列番号691、配列番号692、配列番号693、配列番号694、配列番号695、配列番号696、配列番号697および配列番号698からなる群から選択される、実施形態14に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
16.連続ヌクレオチド配列が、配列番号710、配列番号754、配列番号756、配列番号757、配列番号758、配列番号759、配列番号760、配列番号791、配列番号792、配列番号794、配列番号795および配列番号797からなる群から選択される配列に相補的である、実施形態12に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
17.連続ヌクレオチド配列が、配列番号608、配列番号652、配列番号654、配列番号655、配列番号656、配列番号657、配列番号658、配列番号689、配列番号690、配列番号692、配列番号693および配列番号695からなる群から選択される、実施形態16に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
18.連続ヌクレオチド配列が、ヒトXBP1プレmRNA転写物(配列番号801)の少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的である、実施形態1または実施形態2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
19.連続ヌクレオチド配列が、配列番号801のヌクレオチド4338~4563からの少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的である、実施形態18に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
20.連続ヌクレオチド配列が、配列番号947、配列番号948、配列番号949、配列番号950、配列番号951および配列番号988からなる群から選択される配列に相補的である、実施形態18に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
21.連続ヌクレオチド配列が、配列番号854、配列番号855、配列番号856、配列番号857、配列番号858および配列番号895からなる群から選択される、実施形態21に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
22.連続ヌクレオチド配列が、配列番号951に相補的である、実施形態18に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
23.連続ヌクレオチド配列が、配列番号858である、実施形態22に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
24.アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、哺乳動物XBP1プレmRNA転写物に完全に相補的である、実施形態1~23のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
25.連続ヌクレオチド配列が、少なくとも12ヌクレオチド長である、実施形態1~24のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
26.連続ヌクレオチド配列が、12~16または12~18ヌクレオチド長である、実施形態25に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
27.連続ヌクレオチド配列が、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39または40ヌクレオチド長である、実施形態25に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
28.連続ヌクレオチド配列が、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ長さである、実施形態1~27のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
29.アンチセンスオリゴヌクレオチドが、単離、精製または製造される、実施形態1~28のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
30.アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、1つ以上の修飾ヌクレオチドまたは1つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、実施形態1~29のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
31.アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、1つ以上の修飾ヌクレオシド、例えば、2’-O-アルキル-RNA、2’-O-メチルRNA(2’-OMe)、2’-アルコキシ-RNA、2’-O-メトキシエチル-RNA(2’-MOE)、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-RNA、2’-フルオロ-DNA、アラビノ核酸(ANA)、2’-フルオロ-ANA、二環式ヌクレオシド類似体(LNA)、またはそれらの任意の組合せからなる群から独立して選択される1つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態1~30のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
32.1つ以上の修飾ヌクレオシドが、糖修飾ヌクレオシドである、実施形態30または実施形態31に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
33.1つ以上の修飾ヌクレオシドが、二環式糖を含む、実施形態30~32のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
34.1つ以上の修飾ヌクレオシドが、親和性増強2’糖修飾ヌクレオシドである、実施形態30~32のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
35.1つ以上の修飾ヌクレオシドが、LNAヌクレオシド、例えば1つ以上のベータ-D-オキシLNAヌクレオシドである、実施形態30~34のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
36.アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、1つ以上の5’-メチル-シトシン核酸塩基を含む、実施形態1~35のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
37.アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合のうちの1つ以上が修飾されている、実施形態1~36のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
38.少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または約100%のヌクレオシド間結合が修飾されている、実施形態37に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
39.1つ以上の修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合を含む、実施形態37または実施形態38に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
40.アンチセンスオリゴヌクレオチドが、モルホリノ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態1~39のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
41.アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、アンチセンスオリゴヌクレオチドミックスマーまたはトータルマーであるか、またはそれらを含む、実施形態1~40のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
42.少なくとも1つのコンジュゲート部分に共有結合した、実施形態1~41のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
43.コンジュゲート部分が、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたはそれらの任意の組合せを含む、実施形態42に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
44.薬学的に許容され得る塩の形態である、実施形態1~43のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
45.塩が、ナトリウム塩、カリウム塩またはアンモニウム塩である、実施形態44に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
46.実施形態1~45のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
47.実施形態1~45のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩および/またはアジュバントとを含む、医薬組成物。
48.リン酸緩衝生理食塩水などの水性希釈剤または溶媒を含む、実施形態47に記載の医薬組成物。
49.単離されたXBP1Δ4タンパク質。
50.配列番号7、配列番号596または配列番号807の配列を含む、実施形態49に記載の単離されたXBP1Δ4タンパク質。
51.実施形態49または実施形態50によるXBP1Δ4タンパク質をコードする単離されたmRNA。
52.配列番号6、配列番号595または配列番号806の配列を含む、実施形態51に記載の単離されたmRNA。
53.ポリペプチドを産生するための方法であって、
a)XBP1を発現しておりかつポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、
b)細胞または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含み、
培養が、実施形態1~45のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態46に記載の組成物、実施形態47もしくは実施形態48に記載の医薬組成物、実施形態49もしくは実施形態50に記載のタンパク質、または実施形態51もしくは実施形態52に記載のmRNAの存在下で行われることを特徴とする、
方法。
a)XBP1を発現しておりかつポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、
b)細胞または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含み、
培養が、実施形態1~45のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態46に記載の組成物、実施形態47もしくは実施形態48に記載の医薬組成物、実施形態49もしくは実施形態50に記載のタンパク質、または実施形態51もしくは実施形態52に記載のmRNAの存在下で行われることを特徴とする、
方法。
54.a1)XBP1を発現しておりかつポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を、実施形態1~45のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む培養培地中で増殖させて、第1の細胞集団を得る工程と、
a2)第1の細胞集団のアリコートを培養培地と混合して、第2の細胞集団を得る工程であって、培養培地が、実施形態1~45のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを任意に含む、第2の細胞集団を得る工程と、
a3)第2の細胞集団を培養して、第3の細胞集団を得る工程と、
b)第3の細胞培養の細胞および/または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含む、実施形態53に記載の方法。
a2)第1の細胞集団のアリコートを培養培地と混合して、第2の細胞集団を得る工程であって、培養培地が、実施形態1~45のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを任意に含む、第2の細胞集団を得る工程と、
a3)第2の細胞集団を培養して、第3の細胞集団を得る工程と、
b)第3の細胞培養の細胞および/または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含む、実施形態53に記載の方法。
55.アンチセンスオリゴヌクレオチドが、25μM以上の最終濃度まで添加される、実施形態53または実施形態54に記載の方法。
56.増殖および/または培養が、1×10E6~2×10E6細胞/mLの開始細胞密度で行われる、実施形態53~55のいずれか1つに記載の方法。
57.開始細胞密度が約2×10E6細胞/mLである、実施形態56に記載の方法。
58.哺乳動物細胞がCHO細胞である、実施形態53~57のいずれか1つに記載の方法。
59.ポリペプチドが抗体である、実施形態53~58のいずれか1つに記載の方法。
60.医学に使用するための、実施形態1~45のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態46に記載の組成物、または実施形態47もしくは実施形態48に記載の医薬組成物。
61.タンパク質病理学的疾患を有する患者の処置に使用するための、実施形態1~45のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態46に記載の組成物、または実施形態47もしくは実施形態48に記載の医薬組成物。
62.タンパク質病理学的疾患がTDP-43病態を有する、実施形態61に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
63.タンパク質病理学的疾患が運動ニューロン疾患または前頭側頭葉変性症である、実施形態61または実施形態62に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
64.タンパク質病理学的疾患を処置するための医薬品の製造における、実施形態1~45のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態46に記載の組成物、または実施形態47もしくは実施形態48に記載の医薬組成物の使用。
65.疾患がTDP-43病態を有する、実施形態64に記載の使用。
66.疾患が運動ニューロン疾患または前頭側頭葉変性症である、実施形態64または実施形態65に記載の使用。
67.患者のタンパク質病理学的疾患を処置する方法であって、実施形態1~45のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態46に記載の組成物、または実施形態47もしくは実施形態48に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、方法。
68.疾患がTDP-43病態を有する、実施形態67に記載の方法。
69.疾患が運動ニューロン疾患または前頭側頭葉変性症である、実施形態67または実施形態68に記載の方法。
一般的な技術
組換えDNA技術
Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y,(1989)において説明されるように、標準的な方法を使用してDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。
組換えDNA技術
Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y,(1989)において説明されるように、標準的な方法を使用してDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、Geneart GmbH(レーゲンスブルク、ドイツ)での化学合成によって調製した。合成された遺伝子断片を、増殖/増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNAシーケンシングによって検証した。あるいは、短い合成DNA断片を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングするか、PCRを介して組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドは、metabion GmbH(プラネック-マルティンスリート、ドイツ)によって調製された。
所望の遺伝子セグメントを、Geneart GmbH(レーゲンスブルク、ドイツ)での化学合成によって調製した。合成された遺伝子断片を、増殖/増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNAシーケンシングによって検証した。あるいは、短い合成DNA断片を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングするか、PCRを介して組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドは、metabion GmbH(プラネック-マルティンスリート、ドイツ)によって調製された。
DNA配列決定
DNA配列を、MediGenomix GmbH(マルティンスリート、ドイツ)またはSequiServe GmbH(ファターシュテッテン、ドイツ)で行われた二本鎖シーケンシングによって決定した。
DNA配列を、MediGenomix GmbH(マルティンスリート、ドイツ)またはSequiServe GmbH(ファターシュテッテン、ドイツ)で行われた二本鎖シーケンシングによって決定した。
DNAおよびタンパク質配列分析および配列データ管理
EMBOSS(欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート)ソフトウェアパッケージおよびInvitrogenのVector NTIバージョン11.5またはGeneious primeを、配列の作成、マッピング、解析、アノテーション、および図示のために使用した。
EMBOSS(欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート)ソフトウェアパッケージおよびInvitrogenのVector NTIバージョン11.5またはGeneious primeを、配列の作成、マッピング、解析、アノテーション、および図示のために使用した。
試薬
特に明記されていない限り、すべての市販の化学物質、抗体、およびキットは、製造業者のプロトコルに従って提供された通りに使用した。
特に明記されていない限り、すべての市販の化学物質、抗体、およびキットは、製造業者のプロトコルに従って提供された通りに使用した。
タンパク質定量
精製された抗体および誘導体のタンパク質濃度を、Pace,ら,Protein Science 4(1995)2411-1423に従って、アミノ酸配列に基づいて計算されるモル吸光係数を用い、280nmでの光学密度(OD)を決定することによって決定した。
精製された抗体および誘導体のタンパク質濃度を、Pace,ら,Protein Science 4(1995)2411-1423に従って、アミノ酸配列に基づいて計算されるモル吸光係数を用い、280nmでの光学密度(OD)を決定することによって決定した。
上清中の抗体濃度決定
細胞培養物上清中の抗体の濃度を、プロテインAアガロースビーズ(Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ)による免疫沈降によって推定した。したがって、60μLのプロテインAアガロースビーズをTBS-NP40(50mM NaClおよび1%Nonidet-P40を補充した150mM Tris緩衝液、pH7.5)で3回洗浄した。その後、1~15mLの細胞培養物上清を、TBS-NP40中で予め平衡状態にしたプロテインAアガロースビーズに適用した。室温で1時間インキュベートした後、ビーズを、Ultrafree-MC-フィルタカラム(Amicon)上で、0.5mL TBS-NP40で1回、0.5mLの2xリン酸緩衝生理食塩水(2×PBS、Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ)で2回洗浄し、0.5mL 100mM クエン酸Na緩衝液(pH5.0)で4回、簡単に洗浄した。結合した抗体を、35μLのNuPAGE(登録商標)LDS試料緩衝液(Invitrogen)を加えることによって溶出させた。試料の半分をそれぞれNuPAGE(登録商標)試料還元剤と合わせ、または還元させず、70℃で10分間加熱した。その結果、5~30μlを4~12%NuPAGE(登録商標)Bis-Tris SDS-PAGEゲル(Invitrogen)(非還元SDS-PAGE用のMOPS緩衝液および還元SDS-PAGE用のNuPAGE(登録商標)抗酸化ランニング緩衝液添加剤(Invitrogen)を含むMES緩衝液を含む)に適用し、クーマシーブルーで染色した。
細胞培養物上清中の抗体の濃度を、プロテインAアガロースビーズ(Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ)による免疫沈降によって推定した。したがって、60μLのプロテインAアガロースビーズをTBS-NP40(50mM NaClおよび1%Nonidet-P40を補充した150mM Tris緩衝液、pH7.5)で3回洗浄した。その後、1~15mLの細胞培養物上清を、TBS-NP40中で予め平衡状態にしたプロテインAアガロースビーズに適用した。室温で1時間インキュベートした後、ビーズを、Ultrafree-MC-フィルタカラム(Amicon)上で、0.5mL TBS-NP40で1回、0.5mLの2xリン酸緩衝生理食塩水(2×PBS、Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ)で2回洗浄し、0.5mL 100mM クエン酸Na緩衝液(pH5.0)で4回、簡単に洗浄した。結合した抗体を、35μLのNuPAGE(登録商標)LDS試料緩衝液(Invitrogen)を加えることによって溶出させた。試料の半分をそれぞれNuPAGE(登録商標)試料還元剤と合わせ、または還元させず、70℃で10分間加熱した。その結果、5~30μlを4~12%NuPAGE(登録商標)Bis-Tris SDS-PAGEゲル(Invitrogen)(非還元SDS-PAGE用のMOPS緩衝液および還元SDS-PAGE用のNuPAGE(登録商標)抗酸化ランニング緩衝液添加剤(Invitrogen)を含むMES緩衝液を含む)に適用し、クーマシーブルーで染色した。
細胞培養物上清中の抗体の濃度を、アフィニティHPLCクロマトグラフィーによって定量的に測定した。簡単に説明すると、プロテインAに結合する抗体を含有する細胞培養物上清を、200mM KH2PO4、100mMクエン酸ナトリウム(pH7.4)中、Applied Biosystems Poros A/20カラムに適用し、Agilent HPLC 1100システムで、200mM NaCl、100mMクエン酸(pH2.5)を用いて溶出させた。溶出した抗体をUV吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。精製された標準IgG1抗体を、標準とした。
または、細胞培養物上清中の抗体および誘導体の濃度を、サンドイッチ-IgG-ELISAによって測定した。簡単に説明すると、StreptaWell High Bind Streptavidin A-96ウェルマイクロタイタープレート(Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ)を、100μL/ウェルのビオチン化抗ヒトIgG捕捉分子F(ab’)2<h-Fcγ>BI(Dianova)で、0.1μg/mLで室温で1時間かけて、または4℃で一晩かけてコーティングし、その後、200μL/ウェルのPBS、0.05% Tween(PBST、Sigma)を用いて3回洗浄した。その後、それぞれの抗体含有細胞培養物上清のPBS(Sigma)における100μL/ウェルの希釈系列をウェルに加え、室温で振盪機で1~2時間インキュベートした。ウェルを200μL/ウェルPBSTで3回洗浄し、結合した抗体を、室温で振盪機で1~2時間インキュベートすることにより、検出抗体として0.1μg/mLの100μL F(ab’)2<hFcγ>POD(Dianova)を用いて検出した。未結合の検出抗体を、200μL/ウェルのPBSTで3回洗浄することによって除去した。結合した検出抗体を、100μL ABTS/ウェルを添加し、続いてインキュベートすることによって検出した。吸光度の決定は、Tecan Fluor Spectrometerで、測定波長405nm(参照波長492nm)で行った。
CHO宿主細胞株の培養
CHO宿主細胞を、湿度85%、5%CO2の加湿インキュベーター内で37℃で培養した。それらを、300μg/mlのハイグロマイシンBと4μg/mlの第2の選択マーカーを含む独自のDMEM/F12ベースの培地で培養した。細胞を3日または4日ごとに0.3x10E6細胞/mlの濃度で総体積30mlに分割した。培養には、125mlの非バッフル三角振盪フラスコを使用した。振盪振幅5cm、150rpmで細胞を振盪した。Cedex HiRes Cell Counter(Roche)を用いて細胞数を決定した。細胞は、60日齢に達するまで、培養を続けた。
CHO宿主細胞を、湿度85%、5%CO2の加湿インキュベーター内で37℃で培養した。それらを、300μg/mlのハイグロマイシンBと4μg/mlの第2の選択マーカーを含む独自のDMEM/F12ベースの培地で培養した。細胞を3日または4日ごとに0.3x10E6細胞/mlの濃度で総体積30mlに分割した。培養には、125mlの非バッフル三角振盪フラスコを使用した。振盪振幅5cm、150rpmで細胞を振盪した。Cedex HiRes Cell Counter(Roche)を用いて細胞数を決定した。細胞は、60日齢に達するまで、培養を続けた。
形質転換10ベータコンピテント大腸菌細胞
形質転換のために、10ベータコンピテント大腸菌細胞を氷上で解凍した。その後、2μlのプラスミドDNAを細胞懸濁液に直接ピペットで移した。チューブをはじき、氷上に30分間置いた。その後、細胞を42℃の温かいサーマルブロックに入れ、厳密に30秒間熱ショックを与えた。その直後に、細胞を氷上で2分間冷却した。950μlのNEB10ベータ増殖培地を細胞懸濁液に加えた。細胞を37℃で1時間振盪しながらインキュベートした。次に、50~100μlを予め温めた(37℃)LB-Amp寒天プレートにピペットで移し、使い捨てスパチュラで広げた。プレートを37℃で一晩インキュベートした。プラスミドの組込みに成功しアンピシリンに対する耐性遺伝子を持っている細菌だけが、これらのプレート上で増殖可能である。翌日、単一コロニーを採取し、その後のプラスミド調製のためにLB-Amp培地で培養した。
形質転換のために、10ベータコンピテント大腸菌細胞を氷上で解凍した。その後、2μlのプラスミドDNAを細胞懸濁液に直接ピペットで移した。チューブをはじき、氷上に30分間置いた。その後、細胞を42℃の温かいサーマルブロックに入れ、厳密に30秒間熱ショックを与えた。その直後に、細胞を氷上で2分間冷却した。950μlのNEB10ベータ増殖培地を細胞懸濁液に加えた。細胞を37℃で1時間振盪しながらインキュベートした。次に、50~100μlを予め温めた(37℃)LB-Amp寒天プレートにピペットで移し、使い捨てスパチュラで広げた。プレートを37℃で一晩インキュベートした。プラスミドの組込みに成功しアンピシリンに対する耐性遺伝子を持っている細菌だけが、これらのプレート上で増殖可能である。翌日、単一コロニーを採取し、その後のプラスミド調製のためにLB-Amp培地で培養した。
細菌培養物
大腸菌の培養は、Luria Bertaniの略であるLB培地で行い、1ml/Lの100mg/mlアンピシリンを添加して、0.1mg/mlのアンピシリン濃度にした。異なるプラスミド調製量について、以下の量に単一の細菌コロニーを接種した。
大腸菌の培養は、Luria Bertaniの略であるLB培地で行い、1ml/Lの100mg/mlアンピシリンを添加して、0.1mg/mlのアンピシリン濃度にした。異なるプラスミド調製量について、以下の量に単一の細菌コロニーを接種した。
ミニプレップの場合、96ウェル2mlディープウェルプレートにウェルあたり1.5mlのLB-Amp培地を充填した。コロニーを採取し、つまようじを培地に押し込んだ。すべてのコロニーが採取されたとき、プレートを粘着性の空気多孔質膜で閉じた。プレートを37℃のインキュベーター中で200rpmの振盪速度で23時間インキュベートした。
ミニプレップの場合、15mlのチューブ(換気された蓋付き)に3.6mlのLB-Amp培地を充填し、細菌コロニーを均等に接種した。つまようじは取り除かずに、インキュベーションの間チューブ内に残した。96ウェルプレートと同様に、チューブを37℃、200rpmで23時間インキュベートした。
マキシプレップの場合、200mlのLB-Amp培地をオートクレーブ処理したガラス製の1L三角フラスコに充填し、約5時間経過した1mlの細菌の日中培養物を接種した。三角フラスコを紙栓で閉じ、37℃、200rpmで16時間インキュベートした。
プラスミド調製
ミニプレップの場合、50μlの細菌懸濁液を1mlのディープウェルプレートに移した。その後、細菌細胞をプレート内で3000rpm、4℃で5分間遠心分離した。上清を除去し、細菌ペレットを含むプレートをEpMotionに入れた。およそ90分後、操作を行い、溶出されたプラスミドDNAをさらなる使用のためにEpMotionから取り出すことができた。
ミニプレップの場合、50μlの細菌懸濁液を1mlのディープウェルプレートに移した。その後、細菌細胞をプレート内で3000rpm、4℃で5分間遠心分離した。上清を除去し、細菌ペレットを含むプレートをEpMotionに入れた。およそ90分後、操作を行い、溶出されたプラスミドDNAをさらなる使用のためにEpMotionから取り出すことができた。
ミニプレップの場合、15mlのチューブをインキュベーターから取り出し、3.6mlの細菌培養物を2つの2mlのエッペンドルフチューブに分割した。チューブを卓上マイクロ遠心機で6,800×gで室温で3分間遠心分離した。その後、ミニプレップを、製造業者の説明書に従ってQiagen QIAprep Spin Miniprep Kitを用いて実行した。プラスミドDNA濃度をNanodropで測定した。
マキシプレップは、Macherey-Nagel NucleoBond(登録商標)Xtra Maxi EF Kitを使用して、製造業者の説明書に従って実行した。DNA濃度をNanodropで測定した。
エタノール沈殿
DNA溶液の体積を2.5倍体積のエタノール100%と混合した。混合物を、-20℃で10分間インキュベートした。次に、DNAを14,000rpm、4℃で30分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、ペレットを70%エタノールで洗浄した。この場合も、チューブを14,000rpm、4℃で5分間遠心分離した。上清をピペッティングにより注意深く除去し、ペレットを乾燥させた。エタノールが蒸発したら、適量のエンドトキシンフリーの水を加えた。DNAを4℃で一晩、水に再溶解する時間を与えた。少量のアリコートを採取し、NanodropデバイスでDNA濃度を測定した。
DNA溶液の体積を2.5倍体積のエタノール100%と混合した。混合物を、-20℃で10分間インキュベートした。次に、DNAを14,000rpm、4℃で30分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、ペレットを70%エタノールで洗浄した。この場合も、チューブを14,000rpm、4℃で5分間遠心分離した。上清をピペッティングにより注意深く除去し、ペレットを乾燥させた。エタノールが蒸発したら、適量のエンドトキシンフリーの水を加えた。DNAを4℃で一晩、水に再溶解する時間を与えた。少量のアリコートを採取し、NanodropデバイスでDNA濃度を測定した。
分取抗体精製
抗体を、標準プロトコルを参照して、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔に述べると、抗体を、プロテインA Sepharoseカラム(GE healthcare)に適用し、PBSで洗浄した。抗体の溶出をpH2.8で達成した後、直ちに中和した。凝集したタンパク質を、PBSまたは150mM NaClを含む20mMヒスチジン緩衝液(pH6.0)中のサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200,GE Healthcare)によって単量体抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、(必要な場合)例えばMILLIPORE Amicon Ultra(30 MWCO)遠心濃縮機を使用して濃縮し、-20℃または-80℃で凍結保存した。これらの試料の一部を、例えばSDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)または質量分析によるその後のタンパク質解析および分析的特徴付けのために提供した。
抗体を、標準プロトコルを参照して、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔に述べると、抗体を、プロテインA Sepharoseカラム(GE healthcare)に適用し、PBSで洗浄した。抗体の溶出をpH2.8で達成した後、直ちに中和した。凝集したタンパク質を、PBSまたは150mM NaClを含む20mMヒスチジン緩衝液(pH6.0)中のサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200,GE Healthcare)によって単量体抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、(必要な場合)例えばMILLIPORE Amicon Ultra(30 MWCO)遠心濃縮機を使用して濃縮し、-20℃または-80℃で凍結保存した。これらの試料の一部を、例えばSDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)または質量分析によるその後のタンパク質解析および分析的特徴付けのために提供した。
SDS-PAGE
NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen)を、製造業者の説明書に従って、使用した。特に、10%または4~12%のNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis-TRIS Pre-Castゲル(pH6.4)、およびNuPAGE(登録商標)MES(還元型ゲル、NuPAGE(登録商標)抗酸化ランニング緩衝液添加剤を含む)またはMOPS(非還元型ゲル)ランニング緩衝液を使用した。
NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen)を、製造業者の説明書に従って、使用した。特に、10%または4~12%のNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis-TRIS Pre-Castゲル(pH6.4)、およびNuPAGE(登録商標)MES(還元型ゲル、NuPAGE(登録商標)抗酸化ランニング緩衝液添加剤を含む)またはMOPS(非還元型ゲル)ランニング緩衝液を使用した。
CE-SDS
純度および抗体完全性を、マイクロ流体Labchip技術(PerkinElmer、米国)を使用してCE-SDSによって分析した。したがって、製造業者の説明書に従ってHT Protein Express Reagent Kitを使用して、CE-SDS分析用の5μlの抗体溶液を調製し、HT Protein Express Chipを使用してLabchip GXIIシステムで分析した。Labchip GX Softwareを使用してデータを分析した。
純度および抗体完全性を、マイクロ流体Labchip技術(PerkinElmer、米国)を使用してCE-SDSによって分析した。したがって、製造業者の説明書に従ってHT Protein Express Reagent Kitを使用して、CE-SDS分析用の5μlの抗体溶液を調製し、HT Protein Express Chipを使用してLabchip GXIIシステムで分析した。Labchip GX Softwareを使用してデータを分析した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集およびオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、HPLCクロマトグラフィーによって行った。簡潔に述べると、プロテインA精製抗体を、Dionex Ultimate(登録商標)システムで300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4緩衝液(pH7.5)中のTosoh TSKgel G3000SWカラムに、またはDionex HPLC-Systemの2×PBS中のSuperdex 200カラム(GE Healthcare)に適用した。溶出した抗体をUV吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。BioRad Gel Filtration Standard 151-1901を標準とした。
抗体の凝集およびオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、HPLCクロマトグラフィーによって行った。簡潔に述べると、プロテインA精製抗体を、Dionex Ultimate(登録商標)システムで300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4緩衝液(pH7.5)中のTosoh TSKgel G3000SWカラムに、またはDionex HPLC-Systemの2×PBS中のSuperdex 200カラム(GE Healthcare)に適用した。溶出した抗体をUV吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。BioRad Gel Filtration Standard 151-1901を標準とした。
質量分析
この章では、二重特異性抗体の特徴付けを、それらの正しいアセンブリに重点を置いて説明する。予想される一次構造を、脱グリコシル化インタクト抗体、および特別な場合には脱グリコシル化/制限LysC消化抗体のエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)によって分析した。
この章では、二重特異性抗体の特徴付けを、それらの正しいアセンブリに重点を置いて説明する。予想される一次構造を、脱グリコシル化インタクト抗体、および特別な場合には脱グリコシル化/制限LysC消化抗体のエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)によって分析した。
抗体を、リン酸緩衝液またはTris緩衝液中、タンパク質濃度1mg/mlで、37℃で17時間までの時間、N-グリコシダーゼFを用いて脱グリコシル化した。制限LysC(Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ)消化は、Tris緩衝液(pH8)中、100μgの脱グリコシル化抗体を用いて、それぞれ室温で120時間または37℃で40分間行った。質量分析の前に、試料を、Sephadex G25カラム(GE Healthcare)でのHPLCによって脱塩した。合計質量を、TriVersa NanoMate source(Advion)が取り付けられたmaXis 4G UHR-QTOF MSシステム(Bruker Daltonik)でのESI-MSによって決定した。
実施例1:ハムスターXBP1 mRNAにおいてエクソンのスプライススキップを誘導して、天然にプロセシングされたXBP1タンパク質と同様に働くXBP1タンパク質模倣物を作製するためのオリゴヌクレオチドの同定。
CHOK1細胞をATCC細胞バンクから得て、ATCCガイドラインに従って増殖および維持した。XBP1 mRNA NM_001244047.1のエクソン4の周りの領域に相補的な40個のASOを、エクソン4のエクソンスキップを誘導する能力について試験した。
CHOK1細胞をATCC細胞バンクから得て、ATCCガイドラインに従って増殖および維持した。XBP1 mRNA NM_001244047.1のエクソン4の周りの領域に相補的な40個のASOを、エクソン4のエクソンスキップを誘導する能力について試験した。
5000個のCHOK1細胞を96ウェルプレートに播種し、6時間後、ASOを最終濃度5μMおよび25μMで細胞培地に直接添加した。細胞を培養し、6日後に回収し、全RNAを、製造業者の説明書に従ってQiagen製のRNeasy 96ウェルキットを使用して単離した。
Biorad製RT-qPCR用のiScript(商標)Advanced cDNA Synthesis Kitを使用してcDNAを生成した。相対的mRNA発現を、Biorad製のQX200 ddPCRシステムをBiorad製の自動液滴発生器AutoDGと共に用いて液滴デジタルPCRによって測定した。
PCRを、Biorad製のプローブ用のddPCRスーパーミックス(UTPなし)を使用して、製造業者の説明書に従って行った。
以下のプライマーおよびプローブを使用して、両方ともIDT technologiesから購入した、エクソン4のエクソンスキップを伴うmRNAの量(XBP1Δ4アッセイ)ならびにエクソン4および5の正常な連結を伴うmRNAの量(XBP1 WT)を測定した。XBP1 WTアッセイは、IRE-1プロセシングmRNAおよび非プロセシングmRNAの両方を検出した。
XBP1WTアッセイ:
プライマー2(GTTCCTCCAGATTGGCAG)
プライマー1(CCAGGAGTTAAGAACTCGC)
プローブ/HEX/CGGAGTCCA/ZEN/AGGGAAATGGAGTA/3IABkFQ/
プライマー2(GTTCCTCCAGATTGGCAG)
プライマー1(CCAGGAGTTAAGAACTCGC)
プローブ/HEX/CGGAGTCCA/ZEN/AGGGAAATGGAGTA/3IABkFQ/
XBP1Δ4アッセイ:
プライマー2(GTTCCTCCAGATTGGCAG)
プライマー1(CCAGGAGTTAAGAACTCGC)
/56-FAM/CGGAGTCCA/ZEN/AGTCTGATATCCTTTTG/3IABkFQ/
プライマー2(GTTCCTCCAGATTGGCAG)
プライマー1(CCAGGAGTTAAGAACTCGC)
/56-FAM/CGGAGTCCA/ZEN/AGTCTGATATCCTTTTG/3IABkFQ/
データを、Biorad製のQuantaSoft Analysis Proソフトウェアを使用して分析した。エクソン4のスキップを含むmRNAのパーセンタイルを、(concΔ4/(concΔ4+concWT))×100によって計算した。エクソン4スキップを伴うmRNAの正規パーセンタイルを、PBSのみで処理した14個の対照ウェルの平均から計算した。PBSウェルの平均は0.6%であった。データを表2に示す。
実施例2:ハムスターXBP1 mRNAにおいてエクソンのスプライススキップを誘導して、天然にプロセシングされたXBP1タンパク質と同様に働くXBP1タンパク質模倣物を作製するためのASOの同定、ここではエクソン4付近のより多くの配列をカバーする拡張ライブラリーを用いる。
CHOK1細胞をATCC細胞バンクから得て、ATCCガイドラインに従って増殖および維持した。XBP1 mRNA NM_001244047.1のエクソン4の周りの領域に相補的な251個のASOを、エクソン4のエクソンスキップを誘導する能力について試験した。
CHOK1細胞をATCC細胞バンクから得て、ATCCガイドラインに従って増殖および維持した。XBP1 mRNA NM_001244047.1のエクソン4の周りの領域に相補的な251個のASOを、エクソン4のエクソンスキップを誘導する能力について試験した。
3000個のCHOK1細胞を96ウェルプレートに播種し、24時間後、ASOを最終濃度5μMおよび25μMで細胞培地に直接添加した。細胞を6日後に回収し、全RNAを、製造業者の説明書に従ってQiagen製のRNeasy 96ウェルキットを使用して単離した。
Biorad製RT-qPCR用のiScript(商標)Advanced cDNA Synthesis Kitを使用してcDNAを生成した。相対的mRNA発現を、Biorad製のQX200 ddPCRシステムをBiorad製の自動液滴発生器AutoDGと共に用いて液滴デジタルPCRによって測定した。
PCRを、Biorad製のプローブ用のddPCRスーパーミックス(UTPなし)を使用して、製造業者の説明書に従って行った。
以下のプライマーおよびプローブを使用して、両方ともIDT technologiesから購入した、エクソン4のエクソンスキップを伴うmRNAの量(XBP1Δ4アッセイ)ならびにエクソン4および5の正常な連結を伴うmRNAの量(XBP1 WT)を測定した。XBP1 WTアッセイは、IRE-1プロセシングmRNAおよび非プロセシングmRNAの両方を検出した。
XBP1 WTアッセイ:
プライマー2(GTTCCTCCAGATTGGCAG)
プライマー1(CCAGGAGTTAAGAACTCGC)
プローブ/HEX/CGGAGTCCA/ZEN/AGGGAAATGGAGTA/3IABkFQ/
プライマー2(GTTCCTCCAGATTGGCAG)
プライマー1(CCAGGAGTTAAGAACTCGC)
プローブ/HEX/CGGAGTCCA/ZEN/AGGGAAATGGAGTA/3IABkFQ/
XBP1Δ4アッセイ:
プライマー2(GTTCCTCCAGATTGGCAG)
プライマー1(CCAGGAGTTAAGAACTCGC)、
/56-FAM/CGGAGTCCA/ZEN/AGTCTGATATCCTTTTG/3IABkFQ/
プライマー2(GTTCCTCCAGATTGGCAG)
プライマー1(CCAGGAGTTAAGAACTCGC)、
/56-FAM/CGGAGTCCA/ZEN/AGTCTGATATCCTTTTG/3IABkFQ/
データを、Biorad製のQuantaSoft Analysis Proソフトウェアを使用して分析した。エクソン4のスキップを含むmRNAのパーセンタイルを、(concΔ4/(concΔ4+concWT))×100によって計算した。エクソン4スキップを伴うmRNAの正規パーセンタイルを、PBSのみで処理した170個の対照ウェルの平均から計算した。PBSウェルの平均は0.1%であった。データを表3に示す。
実施例3-マウスXBP1 mRNAにおいてエクソンのスプライススキップを誘導して、天然にプロセシングされたXBP1タンパク質と同様に働くXBP1タンパク質模倣物を作製するためのASOの同定。
Ltk-11(ATCC(登録商標)CRL-10422(商標))細胞をATCC細胞バンクから得て、ATCCガイドラインに従って増殖および維持した。XBP1 mRNA NM_013842.3(配列番号2)のエクソン4の周りの領域に相補的な102個のASOを、エクソン4のエクソンスキップを誘導する能力について試験した。
Ltk-11(ATCC(登録商標)CRL-10422(商標))細胞をATCC細胞バンクから得て、ATCCガイドラインに従って増殖および維持した。XBP1 mRNA NM_013842.3(配列番号2)のエクソン4の周りの領域に相補的な102個のASOを、エクソン4のエクソンスキップを誘導する能力について試験した。
2000個のLTK細胞を96ウェルプレートに播種し、24時間後、ASOを最終濃度5μMおよび25μMで細胞培地に直接添加した。細胞を3日後に回収し、全RNAを、製造業者の説明書に従ってQiagen製のRNeasy 96ウェルキットを使用して単離した。
Biorad製RT-qPCR用のiScript(商標)Advanced cDNA Synthesis Kitを使用してcDNAを生成した。相対的mRNA発現を、Biorad製のQX200 ddPCRシステムをBiorad製の自動液滴発生器AutoDGと共に用いて液滴デジタルPCRによって測定した。
PCRを、Biorad製のプローブ用のddPCRスーパーミックス(UTPなし)を使用して、製造業者の説明書に従って行った。
以下のプライマーおよびプローブを使用して、両方ともIDT technologiesから購入した、エクソン4のエクソンスキップを伴うmRNAの量(XBP1デルタ4アッセイ)ならびにエクソン4および5の正常な連結を伴うmRNAの量(XBP1 WT)を測定した。XBP1 WTアッセイは、IRE-1プロセシングmRNAおよび非プロセシングmRNAの両方を検出した。
XBP1 WTアッセイ:
プライマー2(AGG GTC CAA CTT GTC C)
プライマー1(CTG GAT CCT GAC GAG GTT C)
プローブ/5HEX/CTT ACT CCA/ZEN/CTC CCC TTG GCC TCC A/3IABkFQ/
プライマー2(AGG GTC CAA CTT GTC C)
プライマー1(CTG GAT CCT GAC GAG GTT C)
プローブ/5HEX/CTT ACT CCA/ZEN/CTC CCC TTG GCC TCC A/3IABkFQ/
XBP1デルタ4アッセイ:
プライマー2(AGG GTC CAA CTT GTC C)
プライマー1(CTG GAT CCT GAC GAG GTT C)
/56-FAM/CCC AAA AGG/ZEN/ATA TCA GAC TTG GCC TCC A/3IABkFQ/
プライマー2(AGG GTC CAA CTT GTC C)
プライマー1(CTG GAT CCT GAC GAG GTT C)
/56-FAM/CCC AAA AGG/ZEN/ATA TCA GAC TTG GCC TCC A/3IABkFQ/
データを、Biorad製のQuantaSoft Analysis Proソフトウェアを使用して分析した。エクソン4のスキップを含むmRNAのパーセンタイルを、(concデルタ4/(concデルタ4+concWT))×100によって計算した。エクソン4スキップを伴うmRNAの正規パーセンタイルを、PBSのみで処理した61個の対照ウェルの平均から計算した。PBSウェルの平均は0.37%であり、標準偏差は0.17であった。データを表4に示す。
実施例4:ヒトXBP1 mRNAにおいてエクソンのスプライススキップを誘導して、天然にプロセシングされたXBP1タンパク質と同様に働くXBP1タンパク質模倣物を作製するためのASOの同定。
A459細胞をATCC細胞バンクから得て、ATCCガイドラインに従って増殖および維持した。XBP1 mRNA NM_005080.4(配列番号2)のエクソン4の周りの領域に相補的な100個のASOを、エクソン4のエクソンスキップを誘導する能力について試験した。
A459細胞をATCC細胞バンクから得て、ATCCガイドラインに従って増殖および維持した。XBP1 mRNA NM_005080.4(配列番号2)のエクソン4の周りの領域に相補的な100個のASOを、エクソン4のエクソンスキップを誘導する能力について試験した。
4000個のA549細胞を96ウェルプレートに播種し、24時間後、ASOを最終濃度25μMで細胞培地に直接添加した。細胞を3日後に回収し、全RNAを、製造業者の説明書に従ってQiagen製のRNeasy 96ウェルキットを使用して単離した。
Biorad製RT-qPCR用のiScript(商標)Advanced cDNA Synthesis Kitを使用してcDNAを生成した。相対的mRNA発現を、Biorad製のQX200 ddPCRシステムをBiorad製の自動液滴発生器AutoDGと共に用いて液滴デジタルPCRによって測定した。
PCRを、Biorad製のプローブ用のddPCRスーパーミックス(UTPなし)を使用して、製造業者の説明書に従って行った。
以下のプライマーおよびプローブを使用して、両方ともIDT technologiesから購入した、エクソン4のエクソンスキップを伴うmRNAの量(XBP14アッセイ)ならびにエクソン4および5の正常な連結を伴うmRNAの量(XBP1 WT)を測定した。XBP1 WTアッセイは、IRE-1プロセシングmRNAおよび非プロセシングmRNAの両方を検出した。
XBP1WTアッセイ:
プライマー2(CTG GGT CCA AGT TGT CCA GA)
プライマー1(ATG CCC TGG TTG CTG AAG)
プローブ/5HEX/TCA CTT CAT/ZEN/TCC CCT TGG CTT CCG C/3IABkFQ/
プライマー2(CTG GGT CCA AGT TGT CCA GA)
プライマー1(ATG CCC TGG TTG CTG AAG)
プローブ/5HEX/TCA CTT CAT/ZEN/TCC CCT TGG CTT CCG C/3IABkFQ/
XBP1Δ4アッセイ:
プライマー2(CTG GGT CCA AGT TGT CCA GA)
プライマー1(ATG CCC TGG TTG CTG AAG)
/56-FAM/CCA ACA GGA/ZEN/TAT CAG ACT TGG CTT CCG C/3IABkFQ/
プライマー2(CTG GGT CCA AGT TGT CCA GA)
プライマー1(ATG CCC TGG TTG CTG AAG)
/56-FAM/CCA ACA GGA/ZEN/TAT CAG ACT TGG CTT CCG C/3IABkFQ/
データを、Biorad製のQuantaSoft Analysis Proソフトウェアを使用して分析した。エクソン4のスキップを含むmRNAのパーセンタイルを、(concΔ4/(concΔ4+concWT))×100によって計算した。エクソン4スキップを伴うmRNAの正規パーセンタイルを、PBSのみで処理した40個の対照ウェルの平均から計算した。PBSウェルの平均は0.03%であり、標準偏差は0.05であった。データを表5に示す。
実施例5:標的化組込みのためのプラスミド作製
一般に、RMCE用のプラスミドを構築するために、抗体軽鎖および重鎖のそれぞれの発現カセットを、L3およびLoxFas配列に隣接する第1のベクターバックボーン、ならびにLoxFasおよび2L配列に隣接し、選択可能マーカーもさらに含む第2のベクターにクローニングした。Creリコンビナーゼプラスミド(Wong,E.T.,ら,Nucl.Acids Res.33(2005)e147;O’Gorman,S.,ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)14602-14607を参照)を、すべてのRMCEプロセスに使用した。
一般に、RMCE用のプラスミドを構築するために、抗体軽鎖および重鎖のそれぞれの発現カセットを、L3およびLoxFas配列に隣接する第1のベクターバックボーン、ならびにLoxFasおよび2L配列に隣接し、選択可能マーカーもさらに含む第2のベクターにクローニングした。Creリコンビナーゼプラスミド(Wong,E.T.,ら,Nucl.Acids Res.33(2005)e147;O’Gorman,S.,ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)14602-14607を参照)を、すべてのRMCEプロセスに使用した。
それぞれのポリペプチドをコードするcDNAを、遺伝子合成(Geneart、Life Technologies Inc.)によって生成した。37℃で1時間、合成cDNAおよびバックボーンベクターをHindIII-HFおよびEcoRI-HF(NEB)で消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離した。それぞれ挿入断片およびバックボーンのDNA断片を含むバンドをアガロースゲルから切り取り、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)を用いて抽出した。製造業者のプロトコルに従ってRapid Ligation Kit(Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ)を用いて、3:1の挿入断片/バックボーン比で、精製した挿入断片およびバックボーン断片をライゲーションした。次いで、ライゲーションアプローチを、熱ショックによってコンピテント大腸菌DH5αに形質転換し、37℃で1時間インキュベートした。その後、細胞を、選択のためにアンピシリンを含む寒天プレート上にプレーティングした。プレートを37℃で一晩インキュベートした。
翌日、クローンを採取し、ミニプレップまたはマキシプレップのために振盪しながら37℃で一晩インキュベートした。これは、EpMotion(登録商標)5075(Eppendorf)を用いて、またはそれぞれQIAprep Spin Mini-Prep Kit(Qiagen)/NucleoBond Xtra Maxi EF Kit(Macherey&Nagel)を用いて、実施した。すべての構築物を、配列の正確さを保証するために配列決定した。
第2のクローニング工程において、上に概説したのと同じ条件を用いて、生成したベクターをKpnI-HF/SalI-HFおよびSalI-HF/MfeI-HFで消化した。それぞれのRMCE(TI)TIバックボーンベクターをKpnI-HFおよびMfeI-HFで消化した。分離および抽出を、前述のように実施した。製造業者のプロトコルに従ってT4 DNAリガーゼ(NEB)を用いて、1:1:1の挿入断片/挿入断片/バックボーン比で、精製した挿入断片およびバックボーンのライゲーションを4℃で一晩実施した。その後、リガーゼを65℃で10分間不活性化した。前述のようにして、以下の工程を実施した。
実施例6:標的化組込みによる安定な細胞株の作製
TIランディング部位にGFP発現カセットを含むCHO TI宿主細胞を、DMEM/F12ベースの培地で、150rpmの一定の撹拌速度、標準的な加湿条件下(95%rH、37℃、および5%CO2)で、使い捨て125mlベント・シェイク・フラスコ内にて増殖させた。3~4日ごとに、細胞を、選択マーカー1および選択マーカー2を有効濃度で含有する既知組成培地に3×10E5細胞/mlの濃度で播種した。培養物の密度および生存率を、Cedex HiRes細胞カウンタ(F.Hoffmann-La Roche Ltd、バーゼル、スイス)で測定した。
TIランディング部位にGFP発現カセットを含むCHO TI宿主細胞を、DMEM/F12ベースの培地で、150rpmの一定の撹拌速度、標準的な加湿条件下(95%rH、37℃、および5%CO2)で、使い捨て125mlベント・シェイク・フラスコ内にて増殖させた。3~4日ごとに、細胞を、選択マーカー1および選択マーカー2を有効濃度で含有する既知組成培地に3×10E5細胞/mlの濃度で播種した。培養物の密度および生存率を、Cedex HiRes細胞カウンタ(F.Hoffmann-La Roche Ltd、バーゼル、スイス)で測定した。
安定なトランスフェクションのために、実施例5に従って生成された等モル量の第1および第2のベクターを混合した。5μgの混合物あたり1μgのCreコード核酸を添加した(すなわち、5μgのCre発現プラスミドまたはCre mRNAを25μgのベクター混合物に添加した)。
トランスフェクションの2日前に、TI宿主細胞を、4x10E5細胞/mlの密度で、新鮮な培地に播種した。トランスフェクションは、Nucleofector Kit V(Lonza、スイス)を使用して、製造業者のプロトコルに従ってNucleofectorデバイスで実施した。3×10E7細胞に、合計30μgの核酸混合物、すなわち30μgのプラスミド(5μgのCreプラスミドおよび25μgのベクター混合物)をトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、選択剤を含まない30mlの培地に播種した。
播種後5日目に、細胞を遠心分離し、組換え細胞を選択するために、選択剤1および選択剤2を有効濃度で含有する80mLの既知組成培地に、6x10E5細胞/mlの細胞密度で移した。分割せずに、この日以降、37℃、150rpm、5%CO2、および85%湿度で、細胞をインキュベートした。培養物の細胞密度および生存率を定期的にモニターした。培養物の生存率が再び増加し始めたとき、選択剤1および2の濃度を、以前に使用した量の約半分に減少させた。より詳細には、細胞の回収を促進するために、生存率が40%より高く、かつ生細胞密度(VCD)が0.5×10E6細胞/mLより高い場合は選択圧を下げた。したがって、4×10E5細胞/mlを遠心分離し、40mlの選択培地II(既知組成培地、1/2選択マーカー1および2)に再懸濁した。これらの細胞を以前と同じ条件で、かつこの場合も分割せずに、インキュベートした。
選択を開始してから10日後、細胞内GFPおよび細胞表面に結合した細胞外異種ポリペプチドの発現を測定するフローサイトメトリーによって、RMCEの成功を確認した。FACS染色のために、ヒト抗体の軽鎖および重鎖に対するAPC抗体(アロフィコシアニン標識F(ab’)2断片ヤギ抗ヒトIgG)を使用した。フローサイトメトリーは、BD FACS Canto IIフローサイトメータ(BD、ハイデルベルク、ドイツ)を使用して実施した。試料あたり1万事象を測定した。生細胞を、側方散乱(SSC)に対する前方散乱(FSC)のプロットでゲートした。生細胞ゲートは、トランスフェクトされていないTI宿主細胞で定義され、FlowJo 7.6.5 ENソフトウェア(TreeStar、オルテン、スイス)を用いて、すべての試料に適用された。GFPの蛍光を、FITCチャネル(488nmでの励起、530nmでの検出)で定量化した。抗体を、APCチャネル(645nmでの励起、660nmでの検出)で測定した。CHO親細胞、すなわちTI宿主細胞の作製に使用された細胞を、GFPおよび抗体発現に対するネガティブコントロールとして使用した。選択開始から14日後、生存率は90%を超え、選択は完了したとみなされた。
実施例7:FACSスクリーニング
FACS解析を実施して、トランスフェクションおよびRMCEの効率を調べた。トランスフェクトしたアプローチの4×10E5細胞を遠心分離し(1200rpm、4分)、1mLのPBSで2回洗浄した。PBSを用いる洗浄工程の後、ペレットを400μLのPBSに再懸濁し、FACSチューブ(セルストレーナーキャップ付きのFalcon(登録商標)Round-Bottom Tubes、Corning)に移した。FACS Canto IIを用いて測定を実施し、ソフトウェアFlowJoを用いてデータを解析した。
FACS解析を実施して、トランスフェクションおよびRMCEの効率を調べた。トランスフェクトしたアプローチの4×10E5細胞を遠心分離し(1200rpm、4分)、1mLのPBSで2回洗浄した。PBSを用いる洗浄工程の後、ペレットを400μLのPBSに再懸濁し、FACSチューブ(セルストレーナーキャップ付きのFalcon(登録商標)Round-Bottom Tubes、Corning)に移した。FACS Canto IIを用いて測定を実施し、ソフトウェアFlowJoを用いてデータを解析した。
実施例8:LNA添加による流加培養
すべての流加培養は、同じ独自の無血清、既知組成培地を用い、同じ培養および供給条件下で、振盪フラスコまたはAmbr15容器(Sartorius Stedim)中で実施した。
すべての流加培養は、同じ独自の無血清、既知組成培地を用い、同じ培養および供給条件下で、振盪フラスコまたはAmbr15容器(Sartorius Stedim)中で実施した。
この実施例において使用される組換え哺乳動物細胞を実施例6に記載の手順に従って得て、異種抗体(タンパク質1:抗体-多量体融合物)を発現させた。
細胞培養プロセスは、シードトレイン培養、続いて接種トレイン(N-2およびN-1培養物、前発酵)および主発酵(N)からなった。Ambr15のためのシードトレインおよび接種トレインを振盪フラスコ中で実施し、3日または4日毎に細胞を分割した。
配列番号23および配列番号24のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、初期の研究においてこれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドで観察された高レベルのエクソン4スキップのためにLNAとして選択した(実施例1参照)。
Ambr15中での(主)培養は、開始細胞密度約2×10E6細胞/mL、総体積13mlで行った。培養温度を制御し、N2ガス発生速度を一定に設定し、一定のDOを維持するようにPIDコントローラを介して酸素供給を調節し、撹拌速度を1200~1400rpm(下方撹拌)に設定し、pHをpH7.0に設定した。pH制御は、1M炭酸ナトリウム溶液をバイオリアクタに添加するか、CO2を散布することによって行った。バイオリアクタのpHスポットを、Ambr15の統合分析モジュールを用いて1日おきに再較正した。接種の1日前および培養中毎日、消泡剤を添加した。細胞を、グルコースコントロールと、所定の時点でボーラスとして加えられた2つの異なる供給物とを含む14日間の供給バッチプロセスで培養した。細胞数および生存率の測定は、Cedex HiRes(Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ)に従って行った。Cedex Bio HT Analyzer(Roche Diagnostics GmbH)を使用して、生成物および代謝産物の濃度を測定した。
N-1前培養の開始時(N-1)、接種日(d0)または接種後3日(d3)のLNA添加は、規定量の高濃度LNAストック溶液を添加することによってAmbr15の液体処理システムによって行った。
流加開始後14日目に、遠心分離(10分、1000rpmおよび10分、4000rpm)によって上清を回収し、濾過(0.22μm)によって清澄化した。UV検出を伴うプロテインAアフィニティクロマトグラフィーを使用して、14日目の力価を測定した。生成物の品質は、CaliperのLabchip(Caliper Life Sciences)によって決定した。
LNAのエクソン4スキップにおける任意の効率が、組換え力価の増加の効果を生じさせるのに十分であるように思われる。
実施例9:安定なXBP1Δ4発現を伴う流加培養-比較例
すべての流加培養は、同じ独自の無血清、既知組成培地を用い、振盪フラスコまたはAmbr15容器(Sartorius Stedim)中で実施した。
すべての流加培養は、同じ独自の無血清、既知組成培地を用い、振盪フラスコまたはAmbr15容器(Sartorius Stedim)中で実施した。
細胞培養プロセスは、シードトレイン培養、続いて接種トレイン(N-2およびN-1培養物、前発酵)および主発酵(N)からなった。Ambr15のためのシードトレインおよび接種トレインを振盪フラスコ中で実施し、3日または4日毎に細胞を分割した。
この実施例で使用される組換え哺乳動物細胞を実施例6に記載の手順に従って得て、異種抗体および配列番号7に示されるアミノ酸配列を有するXBP1スプライスバリアントXBP1Δ4を安定に発現させた。
Ambr15中での(主)培養は、開始細胞密度約2×10E6細胞/mL、総体積13mlで行った。培養温度を制御し、N2ガス発生速度を一定に設定し、一定のDOを維持するようにPIDコントローラを介して酸素供給を調節し、撹拌速度を1200~1400rpm(下方撹拌)に設定し、pHをpH7.0に設定した。pH制御は、1M炭酸ナトリウム溶液をバイオリアクタに添加するか、CO2を散布することによって行った。バイオリアクタのpHスポットを、Ambr15の統合分析モジュールを用いて1日おきに再較正した。接種の1日前および培養中毎日、消泡剤を添加した。細胞を、グルコースコントロールと、所定の時点でボーラスとして加えられた2つの異なる供給物とを含む14日間の供給バッチプロセスで培養した。細胞数および生存率の測定は、Cedex HiRes(Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ)に従って行った。Cedex Bio HT Analyzer(Roche Diagnostics GmbH)を使用して、生成物および代謝産物の濃度を測定した。
流加開始後14日目に、遠心分離(10分、1000rpmおよび10分、4000rpm)によって上清を回収し、濾過(0.22μm)によって清澄化した。UV検出を伴うプロテインAアフィニティクロマトグラフィーを使用して、14日目の力価を測定した。生成物の品質は、CaliperのLabchip(Caliper Life Sciences)によって決定した。
(表7)抗体(タンパク質1:抗体-多量体融合物)およびXBP1Δ4バリアントをコードする核酸で安定にトランスフェクトした組換え哺乳動物CHO細胞のAmbr15での14日間の流加培養の結果。exp.=実験数、eff.titer=有効力価(キャピラリー電気泳動またはSECによって決定される力価とメインピークの積)、rel.eff.titer=相対有効力価(exp.1に対して正規化された相対力価)。
実施例10:LNA添加による流加培養
上記の実施例8に記載したのと同じ流加培養の条件も本明細書で使用した。本実施例10~実施例8の唯一の違いは、発現タンパク質およびLNAの添加時間に関するものである。
上記の実施例8に記載したのと同じ流加培養の条件も本明細書で使用した。本実施例10~実施例8の唯一の違いは、発現タンパク質およびLNAの添加時間に関するものである。
同様に、本実施例で使用される組換えCHO細胞は、実施例6に記載の方法で得た。
タンパク質2:ヒトA-ベータタンパク質に結合する全長抗体およびヒトトランスフェリン受容体に結合するドメイン交換を有する追加の重鎖C末端Fab断片を含む二重特異性三価抗体(国際公開第2017/055540号参照)
単一クローンのデータ
単一クローンのデータ
化合物表
Helmアノテーションキー:
[LR](G)は、ベータ-D-オキシ-LNAグアニンヌクレオシドであり、
[LR](T)は、ベータ-D-オキシ-LNAチミンヌクレオシドであり、
[LR](A)は、ベータ-D-オキシ-LNAアデニンヌクレオシドであり、
[LR]([5meC]は、ベータ-D-オキシ-LNA5-メチルシトシンヌクレオシドであり、
[dR](G)は、DNAグアニンヌクレオシドであり、
[dR](T)は、DNAチミンヌクレオシドであり、
[dR](A)は、DNAアデニンヌクレオシドであり、
[dR]([C]は、DNAシトシンヌクレオシドであり、
[mR](G)は、2’-O-メチルRNAグアニンヌクレオシドであり、
[mR](U)は、2’-O-メチルRNA DNAウラシルヌクレオシドであり、
[mR](A)は、2’-O-メチルRNA DNAアデニンヌクレオシドであり、
[mR]([C]は、2’-O-メチルRNA DNAシトシンヌクレオシドであり、
[sP]は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
Helmアノテーションキー:
[LR](G)は、ベータ-D-オキシ-LNAグアニンヌクレオシドであり、
[LR](T)は、ベータ-D-オキシ-LNAチミンヌクレオシドであり、
[LR](A)は、ベータ-D-オキシ-LNAアデニンヌクレオシドであり、
[LR]([5meC]は、ベータ-D-オキシ-LNA5-メチルシトシンヌクレオシドであり、
[dR](G)は、DNAグアニンヌクレオシドであり、
[dR](T)は、DNAチミンヌクレオシドであり、
[dR](A)は、DNAアデニンヌクレオシドであり、
[dR]([C]は、DNAシトシンヌクレオシドであり、
[mR](G)は、2’-O-メチルRNAグアニンヌクレオシドであり、
[mR](U)は、2’-O-メチルRNA DNAウラシルヌクレオシドであり、
[mR](A)は、2’-O-メチルRNA DNAアデニンヌクレオシドであり、
[mR]([C]は、2’-O-メチルRNA DNAシトシンヌクレオシドであり、
[sP]は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
配列
ハムスター
配列番号1:ハムスターXBP1遺伝子
ATGGTGGTGGTGGCAGCGTCGCCGAGCGCGGCCACGGCGGCCCCGAAAGTACTGCTTCTATCGGGCCAGCCCGCCGCGGACGGCCGGGCGCTGCCACTCATGGTTCCAGGCTCGCGGGCAGCAGGGTCCGAGGCGAACGGGGCGCCACAGGCTCGCAAGCGGCAGCGCCTCACGCACCTGAGCCCGGAGGAGAAGGCGCTGCGGAGgtgggctcggcgggcggggcggcaaggccgggcatgggaccctttctcgtgtggcggtcgggagggctctgtggggtggcgtagatgagcctctagtacctatttctggagggaggcacggagctgaggtgacagcccctccgaaggtctgcttagtctgtgtcggggagtctaacacttgtcagacgggacctgacgctcagccctctgtgaatgcttgctcttcttggaggacccatggcagggtccgctctggctgttgttgcagccgcttgggaacttaacactgggatccgagtcaccatcctccggcagcccgagttgagcttggggagggacggttggtagcgcccccgccgccttcacggagcctgttggacagaatcggaactagaaagccgcgggggaggagggaagatgcttatgacgcaacgggaatgtgtgtcagcccggtggtaaaataagactcgagtggacagcaacatgggagagaatcgagcaagtcttcaaggcccacgggcagaaaagctgtggtttttgtctttttgagaggaggagcctcagaatgtgtttaccactgtttagtcttattctgtaaagtcagcgaaagcaccagctggccacatttacaaatgaagatacaggaaagctgaagatgactcggttcgttatgtgccctgtcttccttcagGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGCCCGAGATCGAAAGAAAGCCCGGATGAGCGAGCTGGAACAGCAAGTGGTGGATTTGGAAGAAGAGgtaaagggatttaaggccatgctttcttctctgcccattctaagctgctgcagccctttagaatacaactaaagtgccatttaaagtttaactagcttagcagataggtggtgaaggcagacatgactcactcctgacagctagatactatcgatagaagttgctcagagattagccaggtcagatagatcctggcttaaccttcagtactcttgctcttgccaaaggctcactagaattgccttccttctagggttctcttgttatctaatctgagcaagggctattgttttaaaagttttaatcatcagctggttcttagaagaaatgtgggtcatatcagtagcagtttaaaaaaaatattttgttaggtatagcccaccattcccactttgtttttatactcagcatacagagtattaggacattttcaaacagcgtgttttagttaattgattcttcctgccattttccctacacccccagtatccttttaccttctcttggacttctagttgttttttaaggccttacacacatttacatccattcatatgcattcacactctcacacacagtaaggtctacatatgcaagaaactcttggttctgtttgggccacctcacttaaaatatttaacaaatctacacatcttcctgccaacttctattttctttatagccgagtaacattcttctgtgcacatgtaccatattttcatctgtttcattggtgtctcccaattgctggtgttacaggcatgagccacccatgctagttttatgtagagctggaggctgaacccagggcttcatgtgtagtagggcaagcactcttaccaactgatctacaccattagccaccagtgttgcaacagttatgaacgactgcatatgcacagaatttatcagttcaatgaggaaaccaactgtaacaaatcacgttttaatagcctcttctggattttcttacagAACCAAAAACTTCTGTTAGAAAATCAGCTTTTGAGAGAGAAAACTCATGGCCTTGTAATTGAGAACCAGGAGTTAAGAACTCGCTTGGGAATGGATGTGCTGACTACTGAAGAGGCTCCAGAGACGGAGTCCAAGgtaaatcttatgagacttggttgtgacatgaacggattgtatttgtgatcccaacctctatcaagccttccttttctcttttccttcttttgagacagggtcttaatttcttaattttggatggtcttgaaattgtatcagttttatggcctctgcctccaaagtaatggaactagacatgtgccaccatgcctagctgatcagtcttgaaaatttctccacatttccaacagacctgttcagtcttcagtgactcattcttcaagtgtgtaatgaagtgttactaagccctaataatcctaataatttacatagctctctcagaataagtgctaacaccagtagccagcaagctataccatgcaggcatcaaatagaatgagactgtaagggctagtcagatttgggagattttgatcttgttttgagacagagtctctgtatataattaacccaggttggctttggactcatcctctggccatagcctcccaggtgctgggattttaggcactacaattggcttgtttcctggacttttgacagccctcatgtggcctaggttggtcttaaacttgatatgttagctgataattctgtctctgctttccaagtgttaagatacgggcacatactactttatctggcggagttatgtaggcatggtgtttgtgtacatgagtatcttactaaatctggagctaggctggtggctagcaaatcctggtgatcctcttgtctctgtctccctcagtgttggggttatacaggcacaactgtcatgctccaaattttacattgatgcttgcctaacaagcaggcttatgctctgagccacctcccatagcctggtgtgcatttccttggagtgttccctcactttggtctttccttccagGGAAATGGAGTAAGGCCGGTGGCCGGGTCTGCTGAGTCCGCAGcactcagactacgtgcacctctgcagCAGGTGCAGGCCCAGTTGTCACCTCCCCAGAACATCTTCCCATGGATTCTGACACTGTTGACTCTTCAGACTCCGAGgtagagcttgtttgccttactaaagcactgtgtaagattggctcattctgtagtatatatatgatgtgtgacatgcctagccaggcaaatggagaaagaagttagtattggtagggttaggggtaagcagtcactttcttaatttccagtggtttaggtcatggagtcgggagaagctgttctgatgggtgtgtccttcgatctgacagcataaggcctaactgacattgtggaactcagtactaagtgtttctggtagaccatcacattctaatagtgaactttttttgtcttacctcttgcagTCTGATATCCTTTTGGGCATTCTGGACAAGTTGGACCCTGTCATGTTTTTCAAATGTCCATCCCCAGAGTCTGCCAATCTGGAGGAACTCCCAGAGGTCTACCCAGGACCTAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACCTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTCATTCGCTTTGACCATGTATACACCAAGCCTCTAGTCTTAGAGATCCCTTCTGAGACAGAGAGTCAAACTAATGTGGTAGTGAAAATTGAGGAAGCACCTCTCAGCTCTTCAGAGGAGGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGAAAGAACCTTTGGAAGAAGACTTCATTCCAGAGCCGGGCATCTCAAACCTGCTTTCATCCAGCCACTGTCTGAAACCATCTTCCTGCCTGCTGGATGCTTATAGTGACTGTGGATATGAGGGCTCCCCTTCTCCCTTCAGTGACATGTCTTCTCCACTTGGTATAGACCATTCTTGGGAGGACACTTTTGCCAATGAACTCTTTCCCCAGCTAATTAGTGTCTAA
ハムスター
配列番号1:ハムスターXBP1遺伝子
ATGGTGGTGGTGGCAGCGTCGCCGAGCGCGGCCACGGCGGCCCCGAAAGTACTGCTTCTATCGGGCCAGCCCGCCGCGGACGGCCGGGCGCTGCCACTCATGGTTCCAGGCTCGCGGGCAGCAGGGTCCGAGGCGAACGGGGCGCCACAGGCTCGCAAGCGGCAGCGCCTCACGCACCTGAGCCCGGAGGAGAAGGCGCTGCGGAGgtgggctcggcgggcggggcggcaaggccgggcatgggaccctttctcgtgtggcggtcgggagggctctgtggggtggcgtagatgagcctctagtacctatttctggagggaggcacggagctgaggtgacagcccctccgaaggtctgcttagtctgtgtcggggagtctaacacttgtcagacgggacctgacgctcagccctctgtgaatgcttgctcttcttggaggacccatggcagggtccgctctggctgttgttgcagccgcttgggaacttaacactgggatccgagtcaccatcctccggcagcccgagttgagcttggggagggacggttggtagcgcccccgccgccttcacggagcctgttggacagaatcggaactagaaagccgcgggggaggagggaagatgcttatgacgcaacgggaatgtgtgtcagcccggtggtaaaataagactcgagtggacagcaacatgggagagaatcgagcaagtcttcaaggcccacgggcagaaaagctgtggtttttgtctttttgagaggaggagcctcagaatgtgtttaccactgtttagtcttattctgtaaagtcagcgaaagcaccagctggccacatttacaaatgaagatacaggaaagctgaagatgactcggttcgttatgtgccctgtcttccttcagGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGCCCGAGATCGAAAGAAAGCCCGGATGAGCGAGCTGGAACAGCAAGTGGTGGATTTGGAAGAAGAGgtaaagggatttaaggccatgctttcttctctgcccattctaagctgctgcagccctttagaatacaactaaagtgccatttaaagtttaactagcttagcagataggtggtgaaggcagacatgactcactcctgacagctagatactatcgatagaagttgctcagagattagccaggtcagatagatcctggcttaaccttcagtactcttgctcttgccaaaggctcactagaattgccttccttctagggttctcttgttatctaatctgagcaagggctattgttttaaaagttttaatcatcagctggttcttagaagaaatgtgggtcatatcagtagcagtttaaaaaaaatattttgttaggtatagcccaccattcccactttgtttttatactcagcatacagagtattaggacattttcaaacagcgtgttttagttaattgattcttcctgccattttccctacacccccagtatccttttaccttctcttggacttctagttgttttttaaggccttacacacatttacatccattcatatgcattcacactctcacacacagtaaggtctacatatgcaagaaactcttggttctgtttgggccacctcacttaaaatatttaacaaatctacacatcttcctgccaacttctattttctttatagccgagtaacattcttctgtgcacatgtaccatattttcatctgtttcattggtgtctcccaattgctggtgttacaggcatgagccacccatgctagttttatgtagagctggaggctgaacccagggcttcatgtgtagtagggcaagcactcttaccaactgatctacaccattagccaccagtgttgcaacagttatgaacgactgcatatgcacagaatttatcagttcaatgaggaaaccaactgtaacaaatcacgttttaatagcctcttctggattttcttacagAACCAAAAACTTCTGTTAGAAAATCAGCTTTTGAGAGAGAAAACTCATGGCCTTGTAATTGAGAACCAGGAGTTAAGAACTCGCTTGGGAATGGATGTGCTGACTACTGAAGAGGCTCCAGAGACGGAGTCCAAGgtaaatcttatgagacttggttgtgacatgaacggattgtatttgtgatcccaacctctatcaagccttccttttctcttttccttcttttgagacagggtcttaatttcttaattttggatggtcttgaaattgtatcagttttatggcctctgcctccaaagtaatggaactagacatgtgccaccatgcctagctgatcagtcttgaaaatttctccacatttccaacagacctgttcagtcttcagtgactcattcttcaagtgtgtaatgaagtgttactaagccctaataatcctaataatttacatagctctctcagaataagtgctaacaccagtagccagcaagctataccatgcaggcatcaaatagaatgagactgtaagggctagtcagatttgggagattttgatcttgttttgagacagagtctctgtatataattaacccaggttggctttggactcatcctctggccatagcctcccaggtgctgggattttaggcactacaattggcttgtttcctggacttttgacagccctcatgtggcctaggttggtcttaaacttgatatgttagctgataattctgtctctgctttccaagtgttaagatacgggcacatactactttatctggcggagttatgtaggcatggtgtttgtgtacatgagtatcttactaaatctggagctaggctggtggctagcaaatcctggtgatcctcttgtctctgtctccctcagtgttggggttatacaggcacaactgtcatgctccaaattttacattgatgcttgcctaacaagcaggcttatgctctgagccacctcccatagcctggtgtgcatttccttggagtgttccctcactttggtctttccttccagGGAAATGGAGTAAGGCCGGTGGCCGGGTCTGCTGAGTCCGCAGcactcagactacgtgcacctctgcagCAGGTGCAGGCCCAGTTGTCACCTCCCCAGAACATCTTCCCATGGATTCTGACACTGTTGACTCTTCAGACTCCGAGgtagagcttgtttgccttactaaagcactgtgtaagattggctcattctgtagtatatatatgatgtgtgacatgcctagccaggcaaatggagaaagaagttagtattggtagggttaggggtaagcagtcactttcttaatttccagtggtttaggtcatggagtcgggagaagctgttctgatgggtgtgtccttcgatctgacagcataaggcctaactgacattgtggaactcagtactaagtgtttctggtagaccatcacattctaatagtgaactttttttgtcttacctcttgcagTCTGATATCCTTTTGGGCATTCTGGACAAGTTGGACCCTGTCATGTTTTTCAAATGTCCATCCCCAGAGTCTGCCAATCTGGAGGAACTCCCAGAGGTCTACCCAGGACCTAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACCTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTCATTCGCTTTGACCATGTATACACCAAGCCTCTAGTCTTAGAGATCCCTTCTGAGACAGAGAGTCAAACTAATGTGGTAGTGAAAATTGAGGAAGCACCTCTCAGCTCTTCAGAGGAGGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGAAAGAACCTTTGGAAGAAGACTTCATTCCAGAGCCGGGCATCTCAAACCTGCTTTCATCCAGCCACTGTCTGAAACCATCTTCCTGCCTGCTGGATGCTTATAGTGACTGTGGATATGAGGGCTCCCCTTCTCCCTTCAGTGACATGTCTTCTCCACTTGGTATAGACCATTCTTGGGAGGACACTTTTGCCAATGAACTCTTTCCCCAGCTAATTAGTGTCTAA
配列番号2:ハムスターXbp1-202(Xbp-1u)
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ATGGTGGTGGTGGCAGCGGCGCCGAGCGCGGCCACGGCGGCCCCGAAAGTACTGCTTCTATCGGGCCAGCCCGCCGCGGACGGCCGGGCGCTGCCACTCATGGTTCCAGGCTCGCGGGCAGCAGGGTCCGAGGCGAACGGGGCGCCACAGGCTCGCAAGCGGCAGCGCCTCACGCACCTGAGCCCGGAGGAGAAGGCGCTGCGGAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGCCCGAGATCGAAAGAAAGCCCGGATGAGCGAGCTGGAACAGCAAGTGGTGGATTTGGAAGAAGAGAACCAAAAACTTCTGTTAGAAAATCAGCTTTTGAGAGAGAAAACTCATGGCCTTGTAATTGAGAACCAGGAGTTAAGAACTCGCTTGGGAATGGATGTGCTGACTACTGAAGAGGCTCCAGAGACGGAGTCCAAGGGAAATGGAGTAAGGCCGGTGGCCGGGTCTGCTGAGTCCGCAGCACTCAGACTACGTGCACCTCTGCAGCAGGTGCAGGCCCAGTTGTCACCTCCCCAGAACATCTTCCCATGGATTCTGACACTGTTGACTCTTCAGACTCCGAGTCTGATATCCTTTTGGGCATTCTGGACAAGTTGGACCCTGTCATGTTTTTCAAATGTCCATCCCCAGAGTCTGCCAATCTGGAGGAACTCCCAGAGGTCTACCCAGGACCTAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACCTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTCATTCGCTTTGACCATGTATACACCAAGCCTCTAGTCTTAGAGATCCCTTCTGAGACAGAGAGTCAAACTAATGTGGTAGTGAAAATTGAGGAAGCACCTCTCAGCTCTTCAGAGGAGGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGAAAGAACCTTTGGAAGAAGACTTCATTCCAGAGCCGGGCATCTCAAACCTGCTTTCATCCAGCCACTGTCTGAAACCATCTTCCTGCCTGCTGGATGCTTATAGTGACTGTGGATATGAGGGCTCCCCTTCTCCCTTCAGTGACATGTCTTCTCCACTTGGTATAGACCATTCTTGGGAGGACACTTTTGCCAATGAACTCTTTCCCCAGCTAATTAGTGTCTAA
配列番号3:配列番号2からのハムスター予測タンパク質
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MVVVAAAPSAATAAPKVLLLSGQPAADGRALPLMVPGSRAAGSEANGAPQARKRQRLTHLSPEEKALRRKLKNRVAAQTARDRKKARMSELEQQVVDLEEENQKLLLENQLLREKTHGLVIENQELRTRLGMDVLTTEEAPETESKGNGVRPVAGSAESAALRLRAPLQQVQAQLSPPQNIFPWILTLLTLQTPSLISFWAFWTSWTLSCFSNVHPQSLPIWRNSQRSTQDLVPYQPPFLCQWGPHQPSWKPLMNSFALTMYTPSL
配列番号4:ハムスターXbp1-201(Xbp-1s)
ATGGTGGTGGTGGCAGCGTCGCCGAGCGCGGCCACGGCGGCCCCGAAAGTACTGCTTCTATCGGGCCAGCCCGCCGCGGACGGCCGGGCGCTGCCACTCATGGTTCCAGGCTCGCGGGCAGCAGGGTCCGAGGCGAACGGGGCGCCACAGGCTCGCAAGCGGCAGCGCCTCACGCACCTGAGCCCGGAGGAGAAGGCGCTGCGGAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGCCCGAGATCGAAAGAAAGCCCGGATGAGCGAGCTGGAACAGCAAGTGGTGGATTTGGAAGAAGAGAACCAAAAACTTCTGTTAGAAAATCAGCTTTTGAGAGAGAAAACTCATGGCCTTGTAATTGAGAACCAGGAGTTAAGAACTCGCTTGGGAATGGATGTGCTGACTACTGAAGAGGCTCCAGAGACGGAGTCCAAGGGAAATGGAGTAAGGCCGGTGGCCGGGTCTGCTGAGTCCGCAGCAGGTGCAGGCCCAGTTGTCACCTCCCCAGAACATCTTCCCATGGATTCTGACACTGTTGACTCTTCAGACTCCGAGTCTGATATCCTTTTGGGCATTCTGGACAAGTTGGACCCTGTCATGTTTTTCAAATGTCCATCCCCAGAGTCTGCCAATCTGGAGGAACTCCCAGAGGTCTACCCAGGACCTAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACCTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTCATTCGCTTTGACCATGTATACACCAAGCCTCTAGTCTTAGAGATCCCTTCTGAGACAGAGAGTCAAACTAATGTGGTAGTGAAAATTGAGGAAGCACCTCTCAGCTCTTCAGAGGAGGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGAAAGAACCTTTGGAAGAAGACTTCATTCCAGAGCCGGGCATCTCAAACCTGCTTTCATCCAGCCACTGTCTGAAACCATCTTCCTGCCTGCTGGATGCTTATAGTGACTGTGGATATGAGGGCTCCCCTTCTCCCTTCAGTGACATGTCTTCTCCACTTGGTATAGACCATTCTTGGGAGGACACTTTTGCCAATGAACTCTTTCCCCAGCTGATTAGTGTCTAA
ATGGTGGTGGTGGCAGCGTCGCCGAGCGCGGCCACGGCGGCCCCGAAAGTACTGCTTCTATCGGGCCAGCCCGCCGCGGACGGCCGGGCGCTGCCACTCATGGTTCCAGGCTCGCGGGCAGCAGGGTCCGAGGCGAACGGGGCGCCACAGGCTCGCAAGCGGCAGCGCCTCACGCACCTGAGCCCGGAGGAGAAGGCGCTGCGGAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGCCCGAGATCGAAAGAAAGCCCGGATGAGCGAGCTGGAACAGCAAGTGGTGGATTTGGAAGAAGAGAACCAAAAACTTCTGTTAGAAAATCAGCTTTTGAGAGAGAAAACTCATGGCCTTGTAATTGAGAACCAGGAGTTAAGAACTCGCTTGGGAATGGATGTGCTGACTACTGAAGAGGCTCCAGAGACGGAGTCCAAGGGAAATGGAGTAAGGCCGGTGGCCGGGTCTGCTGAGTCCGCAGCAGGTGCAGGCCCAGTTGTCACCTCCCCAGAACATCTTCCCATGGATTCTGACACTGTTGACTCTTCAGACTCCGAGTCTGATATCCTTTTGGGCATTCTGGACAAGTTGGACCCTGTCATGTTTTTCAAATGTCCATCCCCAGAGTCTGCCAATCTGGAGGAACTCCCAGAGGTCTACCCAGGACCTAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACCTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTCATTCGCTTTGACCATGTATACACCAAGCCTCTAGTCTTAGAGATCCCTTCTGAGACAGAGAGTCAAACTAATGTGGTAGTGAAAATTGAGGAAGCACCTCTCAGCTCTTCAGAGGAGGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGAAAGAACCTTTGGAAGAAGACTTCATTCCAGAGCCGGGCATCTCAAACCTGCTTTCATCCAGCCACTGTCTGAAACCATCTTCCTGCCTGCTGGATGCTTATAGTGACTGTGGATATGAGGGCTCCCCTTCTCCCTTCAGTGACATGTCTTCTCCACTTGGTATAGACCATTCTTGGGAGGACACTTTTGCCAATGAACTCTTTCCCCAGCTGATTAGTGTCTAA
配列番号5:配列番号4からのハムスター予測タンパク質
MVVVAASPSAATAAPKVLLLSGQPAADGRALPLMVPGSRAAGSEANGAPQARKRQRLTHLSPEEKALRRKLKNRVAAQTARDRKKARMSELEQQVVDLEEENQKLLLENQLLREKTHGLVIENQELRTRLGMDVLTTEEAPETESKGNGVRPVAGSAESAAGAGPVVTSPEHLPMDSDTVDSSDSESDILLGILDKLDPVMFFKCPSPESANLEELPEVYPGPSSLPASLSLSVGTSSAKLEAINELIRFDHVYTKPLVLEIPSETESQTNVVVKIEEAPLSSSEEDHPEFIVSVKKEPLEEDFIPEPGISNLLSSSHCLKPSSCLLDAYSDCGYEGSPSPFSDMSSPLGIDHSWEDTFANELFPQLISV
MVVVAASPSAATAAPKVLLLSGQPAADGRALPLMVPGSRAAGSEANGAPQARKRQRLTHLSPEEKALRRKLKNRVAAQTARDRKKARMSELEQQVVDLEEENQKLLLENQLLREKTHGLVIENQELRTRLGMDVLTTEEAPETESKGNGVRPVAGSAESAAGAGPVVTSPEHLPMDSDTVDSSDSESDILLGILDKLDPVMFFKCPSPESANLEELPEVYPGPSSLPASLSLSVGTSSAKLEAINELIRFDHVYTKPLVLEIPSETESQTNVVVKIEEAPLSSSEEDHPEFIVSVKKEPLEEDFIPEPGISNLLSSSHCLKPSSCLLDAYSDCGYEGSPSPFSDMSSPLGIDHSWEDTFANELFPQLISV
配列番号6:ハムスターXBP1?4
ATGGTGGTGGTGGCAGCGGCGCCGAGCGCGGCCACGGCGGCCCCGAAAGTACTGCTTCTATCGGGCCAGCCCGCCGCGGACGGCCGGGCGCTGCCACTCATGGTTCCAGGCTCGCGGGCAGCAGGGTCCGAGGCGAACGGGGCGCCACAGGCTCGCAAGCGGCAGCGCCTCACGCACCTGAGCCCGGAGGAGAAGGCGCTGCGGAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGCCCGAGATCGAAAGAAAGCCCGGATGAGCGAGCTGGAACAGCAAGTGGTGGATTTGGAAGAAGAGAACCAAAAACTTCTGTTAGAAAATCAGCTTTTGAGAGAGAAAACTCATGGCCTTGTAATTGAGAACCAGGAGTTAAGAACTCGCTTGGGAATGGATGTGCTGACTACTGAAGAGGCTCCAGAGACGGAGTCCAAGTCTGATATCCTTTTGGGCATTCTGGACAAGTTGGACCCTGTCATGTTTTTCAAATGTCCATCCCCAGAGTCTGCCAATCTGGAGGAACTCCCAGAGGTCTACCCAGGACCTAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACCTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTCATTCGCTTTGACCATGTATACACCAAGCCTCTAGTCTTAGAGATCCCTTCTGAGACAGAGAGTCAAACTAATGTGGTAGTGAAAATTGAGGAAGCACCTCTCAGCTCTTCAGAGGAGGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGAAAGAACCTTTGGAAGAAGACTTCATTCCAGAGCCGGGCATCTCAAACCTGCTTTCATCCAGCCACTGTCTGAAACCATCTTCCTGCCTGCTGGATGCTTATAGTGACTGTGGATATGAGGGCTCCCCTTCTCCCTTCAGTGACATGTCTTCTCCACTTGGTATAGACCATTCTTGGGAGGACACTTTTGCCAATGAACTCTTTCCCCAGCTAATTAGTGTCTAA
ATGGTGGTGGTGGCAGCGGCGCCGAGCGCGGCCACGGCGGCCCCGAAAGTACTGCTTCTATCGGGCCAGCCCGCCGCGGACGGCCGGGCGCTGCCACTCATGGTTCCAGGCTCGCGGGCAGCAGGGTCCGAGGCGAACGGGGCGCCACAGGCTCGCAAGCGGCAGCGCCTCACGCACCTGAGCCCGGAGGAGAAGGCGCTGCGGAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGCCCGAGATCGAAAGAAAGCCCGGATGAGCGAGCTGGAACAGCAAGTGGTGGATTTGGAAGAAGAGAACCAAAAACTTCTGTTAGAAAATCAGCTTTTGAGAGAGAAAACTCATGGCCTTGTAATTGAGAACCAGGAGTTAAGAACTCGCTTGGGAATGGATGTGCTGACTACTGAAGAGGCTCCAGAGACGGAGTCCAAGTCTGATATCCTTTTGGGCATTCTGGACAAGTTGGACCCTGTCATGTTTTTCAAATGTCCATCCCCAGAGTCTGCCAATCTGGAGGAACTCCCAGAGGTCTACCCAGGACCTAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACCTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTCATTCGCTTTGACCATGTATACACCAAGCCTCTAGTCTTAGAGATCCCTTCTGAGACAGAGAGTCAAACTAATGTGGTAGTGAAAATTGAGGAAGCACCTCTCAGCTCTTCAGAGGAGGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGAAAGAACCTTTGGAAGAAGACTTCATTCCAGAGCCGGGCATCTCAAACCTGCTTTCATCCAGCCACTGTCTGAAACCATCTTCCTGCCTGCTGGATGCTTATAGTGACTGTGGATATGAGGGCTCCCCTTCTCCCTTCAGTGACATGTCTTCTCCACTTGGTATAGACCATTCTTGGGAGGACACTTTTGCCAATGAACTCTTTCCCCAGCTAATTAGTGTCTAA
配列番号7:配列番号6からのハムスター予測タンパク質
MVVVAAAPSAATAAPKVLLLSGQPAADGRALPLMVPGSRAAGSEANGAPQARKRQRLTHLSPEEKALRRKLKNRVAAQTARDRKKARMSELEQQVVDLEEENQKLLLENQLLREKTHGLVIENQELRTRLGMDVLTTEEAPETESKSDILLGILDKLDPVMFFKCPSPESANLEELPEVYPGPSSLPASLSLSVGTSSAKLEAINELIRFDHVYTKPLVLEIPSETESQTNVVVKIEEAPLSSSEEDHPEFIVSVKKEPLEEDFIPEPGISNLLSSSHCLKPSSCLLDAYSDCGYEGSPSPFSDMSSPLGIDHSWEDTFANELFPQLISV
MVVVAAAPSAATAAPKVLLLSGQPAADGRALPLMVPGSRAAGSEANGAPQARKRQRLTHLSPEEKALRRKLKNRVAAQTARDRKKARMSELEQQVVDLEEENQKLLLENQLLREKTHGLVIENQELRTRLGMDVLTTEEAPETESKSDILLGILDKLDPVMFFKCPSPESANLEELPEVYPGPSSLPASLSLSVGTSSAKLEAINELIRFDHVYTKPLVLEIPSETESQTNVVVKIEEAPLSSSEEDHPEFIVSVKKEPLEEDFIPEPGISNLLSSSHCLKPSSCLLDAYSDCGYEGSPSPFSDMSSPLGIDHSWEDTFANELFPQLISV
マウス
配列番号590:マウスXBP1遺伝子
CTAGGGTAAAACCGTGAGACTCGGTCTGGAAATCTGGCCTGAGAGGACAGCCTGGCAATCCTCAGCCGGGGTGGGGACGTCTGCCGAAGATCCTTGGACTCCAGCAACCAGTGGTCGCCACCGTCCATCCACCCTAAGGCCCAGTTTGCACGGCGGAGAACAGCTGTGCAGCCACGCTGGACACTCACCCCGCCCGAGTTGAGCCCGCCCCCGGGACTACAGGACCAATAAGTGATGAATATACCCGCGCGTCACGGAGCACCGGCCAATCGCGGACGGCCACGACCCTAGAAAGGCTGGGCGCGGCAGGAGGCCACGGGGCGGTGGCGGCGCTGGCGTAGACGTTTCCTGGCTATGGTGGTGGTGGCAGCGGCGCCGAGCGCGGCCACGGCGGCCCCCAAAGTGCTACTCTTATCTGGCCAGCCCGCCTCCGGCGGCCGGGCGCTGCCGCTCATGGTACCCGGTCCGCGGGCAGCAGGGTCGGAGGCGAGCGGGACACCGCAGGCTCGCAAGCGGCAGCGGCTCACGCACCTGAGCCCGGAGGAGAAAGCGCTGCGGAGGTGGGCCCGGCGGGCAAGGCTGGGGCGCGGGGCGGCAGGACTGGGATTGGGACTCTCTCGTGTGTGCCAGCTGGTGGGCTCCGTACGGTGGGTTAGATTCACCTCTAGTGTCTAACCTGGGAAGCGGAGCTGAGGGGGATGCCCCTCCGAAGGTCTGCGTCGGGGGTGTGTGCAGGAGCTCCCGACACAGGCACAGAAGAAGGTGCCCGACGCCCAGTCCTCTGTAAATGCTCGCTCTTTGTGGTCGTAGGGTAGGAACCGCTCCAGCTGTCATTGCAGCCACTTGGGAACCCCACCCTGGGAACCGAGTCCACAGCGTCCGGCATCCCGAGAGTTTGGCTTGGGGAGGGACAGTTGGTAGCGTCCCCGCCGCCTTCACGGATATCGCTCTAGCAAGGAGCCTGTGGGACGGAATTGGACCCAGAAAGTAGCGGGGGAGGAGGGAAGAAGCATATGACGCAACGGGAATGTATCAGCCCGGTGGTAAAATGAGATCCGGGTGGACAGCCGCACGGGAGAGAATCAAGCAAGTCTTCAAGGCCTGTGGATAGAAAGCAGCGTGTGTATGCGTGTGCGTGTGCGTTTTGATAGGAGCTTTAAGCGTGTTTACTTGCTAAGCCTTATTCTGTAAAGTCAACGAAAGCACCAGCTGGCCACGTCTACAAATGAAGACACATGAAAGCTGGAGATGACTCAGTTATGTTCCCTGTCTCCTCCCCAAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGCTCGAGATAGAAAGAAAGCCCGGATGAGCGAGCTGGAGCAGCAAGTGGTGGATTTGGAAGAAGAGGTAAAGGGACTTCAGGCCATGCTTTCATCCCATCCATATCAGGGCCCATCCTAAACTGCTTCAGCCCTTTAGAATACAACCCAAAGTGCCATTTAAAGTTTAACCAGCCTAGCAGATAGGCCGTGAAAGCAGACGTGACTCACCCTGGCCTGCCCTCCCCTCGGAGATTAGCCAGGTTGGATAGATCATTGGTTGCTTAAGCTGTAGCGCCGCCTGTCTTTGCCAAAGGCTCACTAACGCTGCCCTTCCTTCTGGGATCCCCCCCCCCCCGCGCGCCCCCAATCCTCCCACCCTCTGTATCCTTTCTGCTGTCAGTGCCCTTTTGTGCCCCTCCACCCCGGCATCCTTTTACCCTTTGGGGAGTTATTTTAGTTTCTAAGTTAAGTTTAGTTAACTTTAGCTATTTCTAGCGTTTCTAGGCATTGCCACATTTACGTCCATTTATATGCGCACGTGCGCCCTGGTTTGAGTTTGGGTCACCTCACTTTGTAATACACTTTCCAAATTTATACATTTTCCCTGCTAGTTTCCTTTCTCTATACAGGCGAGTGGTACCTCACTGTGTGTGCACCCCACTTTCACGGTTCTCTGGGCATCTGTGCTCAGCATCTAGGCTGCCACCATTTCTTTGCCATTGGACCACTACCACTTGCACCAACACTTGCCATTTCAAGACAGGATGGTGAATTATTTAAAGATTATTTTTAGATAGGGTCTTAGGTTGGCCTGTAACTCATGGCATGCCTCCTGTTTTACCATGCTGACATTACAGGCAGTGAACCACCTTGCCATACTTTTTTTTTTTAAAGGTAGTGTATTAACACAACTGTAAATTCAAGCTGCAAGTGACCTTTTTTTTTGGCTGAAATCTGCGAGTAGTACTTGTAGGCATTATGTTGTTTCTGTCACCATTGAAAACACTTTTGTTTTCTTCAGAGATTGGCCTTGAATAAACTTGCTTCTCCCGCCTCAGCCTGCTTGAGTGTTCAATGGCATTTTTGGGGGGACAGCTTGATGTCTCCCAGGCTGTGCTCTAACTTGCTGTGTAGCCAAAGATGACCCCAAATTTGTTTCTCTTGCTGCTATGTCCCAGGTGCTGGGATTACAGTTTATGCAGAGCTGAAGATGGAGCCCAGGGCTGCAAGCCTGGGAGGGCAGGCCTTCTCCCAACTCCTCTGTCCCATTAGCCACCGGTGACAGAATGGCTGTGACCCGCACCAGCAGGGAAACAGCTGGAGCAGAACTTGCAGTGGATTCTTTAGTGACGGAACCACACGGTCTAACCGCACGGCCTCTTATGTGATTCCTTACAGAACCACAAACTCCAGCTAGAAAATCAGCTTTTACGGGAGAAAACTCACGGCCTTGTGGTTGAGAACCAGGAGTTAAGAACACGCTTGGGAATGGACACGCTGGATCCTGACGAGGTTCCAGAGGTGGAGGCCAAGGTAAGTATTGGGAGACCTGGCTGCAGCACTACCTGGCTGCAGGTTTGTGTTCTGGACCTCCAATCAAATCCTTTTCTCTTTTCCTTTATGAGACAAGGTCTTAATGTCTAATTTTGGCTGGTCTTGAACTTGTGTCAGTTCTTTTGCTTCTAAGTAGTAGGACTATAAGCACCTGCCCCTGTGCCTAGCTGAGGAATCCTGAATTTTCCCTGTTTCCTTGAACTAAACTTATGATCTTCTTGCCTTAGCCTTCCAAGCGCTGGAATTACATGCATGAACAAGTGGTTTGTTTCTTGGCTTTTTTGGGGGATAGGGTGTCATGTAGTCCAGGTTGGCCTCAAACTTGCTCTGTAGCTGATAATCCTACCTCCACCTTCCAGATGTTACCATTACAGGCAGATGTTCCTTTGTGTGGTTATGTAGGTGTGTATGTGTACATGGGTGTGGGTTTATACACATCTCTGCTTACGTACAGAGGCCTAAGGAGCATATAGATGTCTTGCCCTAGCACTGTCCACCCTGCTCCTCTGCAGCAGAGTGTCTCACTGAATCTGGGGCTAGGCAGGTGGACAGCAAGCCCTGGTGAACTTCCTGTTTCTGCCTCCCTTGATGCTGAGGATTTGAACTTGGGTCTTCAGGATTGTACAGCAAGCACATTATATTCAGAGCCACCTCCCCAGTTCCTTTCGAGCCCTTTGAGGAGCAGAGACTCACAGCTACCCAGCATGTATATCCTTGGCAACTTTTACTCACTGTGGTCTTTCCTTCCAGGGGAGTGGAGTAAGGCTGGTGGCCGGGTCTGCTGAGTCCGCAGCACTCAGACTATGTGCACCTCTGCAGCAGGTGCAGGCCCAGTTGTCACCTCCCCAGAACATCTTCCCATGGACTCTGACACTGTTGCCTCTTCAGATTCTGAGGTAGAGCTTATTCTGTAGCCTAAGTGGCGTGTGACACGCTTAGCCAGGCAAACGGAGAAGTTAGTATTGGTGGGGTTAGGATTAAGCACTTTCCTAGTCTGCTTAAGTGGATGGAGTAGGGGGAAACTGTTCCGTGGGTGGGTCCTATGATCTGAGAGCATAAGTCTGGTGGATGGCTGGGTCCTGTGATCTGAGAGTGTAAGCCCTAAGTAACATTGTGGAACCCAGTACTAAAAGTATTTCTGGTAGACTGTCACATTCATTCTAATAGTGAACTCTTTTGTGTTTTGCCTCTTGTAGTCTGATATCCTTTTGGGCATTCTGGACAAGTTGGACCCTGTCATGTTTTTCAAATGTCCTTCCCCAGAGTCTGCTAGTCTGGAGGAACTCCCAGAGGTCTACCCAGAAGGACCTAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACCTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTCATTCGTTTTGACCATGTATACACCAAGCCTCTAGTTTTAGAGATCCCCTCTGAGACAGAGAGTCAAACTAACGTGGTAGTGAAAATTGAGGAAGCACCTCTAAGCTCTTCAGAAGAGGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGAAAGAGCCTTTGGAAGATGACTTCATCCCAGAGCTGGGCATCTCAAACCTGCTTTCATCCAGCCATTGTCTGAGACCACCTTCTTGCCTGCTGGACGCTCACAGTGACTGTGGATATGAGGGCTCCCCTTCTCCCTTCAGTGACATGTCTTCTCCACTTGGTACAGACCACTCCTGGGAGGATACTTTTGCCAATGAACTTTTCCCCCAGCTGATTAGTGTCTAAAGAGCCACATAACACTGGGCCCCTTTCCCTGACCATCACATTGCCTAGAGGATAGCATAGGCCTGTCTCTTTCGTTAAAAGCCAAAGTAGAGGCTGTCTGGCCTTAGAAGAATTCCTCTAAAGTATTTCAAATCTCATAGATGACTTCCAAGTATTGTCGTTTGACACTCAGCTGTCTAAGGTATTCAAAGGTATTCCAGTACTACAGCTTTTGAGATTCTAGTTTATCTTAAAGGTGGTAGTATACTCTAAATCGCAGGGAGGGTCATTTGACAGTTTTTTCCCAGCCTGGCTTCAAACTATGTAGCCGAGGCTAGGCAGAAACTTCTGACCCTCTTGACCCCACCTCCCAAGTGCTGGGCTTCACCAGGTGTGCACCTCCACACCTGCCCCCCCGACATGTCAGGTGGACATGGGATTCATGAATGGCCCTTAGCATTTCTTTCTCCACTCTCTGCTTCCCAGGTTTCGTAACCTGAGGGGGCTTGTTTTCCCTTATGTGCATTTTAAATGA
AGATCAAGAATCTTTGTAAAATGATGAAAATTTACTATGTAAATGCTTGATGGATCTTCTTGCTAGTGTAGCTTCTAGAAGGTGCTTTCTCCATTTATTTAAAACTACCCTTGCAATTAAAAAAAAAGCAACACAGCGTCCTGTTCTGTGATTTCTAGGGCTGTTGTAATTTCTCTTTATTGTTGGCTAAAGGAGTAATTTATCCAACTAAAGTGAGCATACCACTTTTTAAAGTCA
配列番号590:マウスXBP1遺伝子
CTAGGGTAAAACCGTGAGACTCGGTCTGGAAATCTGGCCTGAGAGGACAGCCTGGCAATCCTCAGCCGGGGTGGGGACGTCTGCCGAAGATCCTTGGACTCCAGCAACCAGTGGTCGCCACCGTCCATCCACCCTAAGGCCCAGTTTGCACGGCGGAGAACAGCTGTGCAGCCACGCTGGACACTCACCCCGCCCGAGTTGAGCCCGCCCCCGGGACTACAGGACCAATAAGTGATGAATATACCCGCGCGTCACGGAGCACCGGCCAATCGCGGACGGCCACGACCCTAGAAAGGCTGGGCGCGGCAGGAGGCCACGGGGCGGTGGCGGCGCTGGCGTAGACGTTTCCTGGCTATGGTGGTGGTGGCAGCGGCGCCGAGCGCGGCCACGGCGGCCCCCAAAGTGCTACTCTTATCTGGCCAGCCCGCCTCCGGCGGCCGGGCGCTGCCGCTCATGGTACCCGGTCCGCGGGCAGCAGGGTCGGAGGCGAGCGGGACACCGCAGGCTCGCAAGCGGCAGCGGCTCACGCACCTGAGCCCGGAGGAGAAAGCGCTGCGGAGGTGGGCCCGGCGGGCAAGGCTGGGGCGCGGGGCGGCAGGACTGGGATTGGGACTCTCTCGTGTGTGCCAGCTGGTGGGCTCCGTACGGTGGGTTAGATTCACCTCTAGTGTCTAACCTGGGAAGCGGAGCTGAGGGGGATGCCCCTCCGAAGGTCTGCGTCGGGGGTGTGTGCAGGAGCTCCCGACACAGGCACAGAAGAAGGTGCCCGACGCCCAGTCCTCTGTAAATGCTCGCTCTTTGTGGTCGTAGGGTAGGAACCGCTCCAGCTGTCATTGCAGCCACTTGGGAACCCCACCCTGGGAACCGAGTCCACAGCGTCCGGCATCCCGAGAGTTTGGCTTGGGGAGGGACAGTTGGTAGCGTCCCCGCCGCCTTCACGGATATCGCTCTAGCAAGGAGCCTGTGGGACGGAATTGGACCCAGAAAGTAGCGGGGGAGGAGGGAAGAAGCATATGACGCAACGGGAATGTATCAGCCCGGTGGTAAAATGAGATCCGGGTGGACAGCCGCACGGGAGAGAATCAAGCAAGTCTTCAAGGCCTGTGGATAGAAAGCAGCGTGTGTATGCGTGTGCGTGTGCGTTTTGATAGGAGCTTTAAGCGTGTTTACTTGCTAAGCCTTATTCTGTAAAGTCAACGAAAGCACCAGCTGGCCACGTCTACAAATGAAGACACATGAAAGCTGGAGATGACTCAGTTATGTTCCCTGTCTCCTCCCCAAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGCTCGAGATAGAAAGAAAGCCCGGATGAGCGAGCTGGAGCAGCAAGTGGTGGATTTGGAAGAAGAGGTAAAGGGACTTCAGGCCATGCTTTCATCCCATCCATATCAGGGCCCATCCTAAACTGCTTCAGCCCTTTAGAATACAACCCAAAGTGCCATTTAAAGTTTAACCAGCCTAGCAGATAGGCCGTGAAAGCAGACGTGACTCACCCTGGCCTGCCCTCCCCTCGGAGATTAGCCAGGTTGGATAGATCATTGGTTGCTTAAGCTGTAGCGCCGCCTGTCTTTGCCAAAGGCTCACTAACGCTGCCCTTCCTTCTGGGATCCCCCCCCCCCCGCGCGCCCCCAATCCTCCCACCCTCTGTATCCTTTCTGCTGTCAGTGCCCTTTTGTGCCCCTCCACCCCGGCATCCTTTTACCCTTTGGGGAGTTATTTTAGTTTCTAAGTTAAGTTTAGTTAACTTTAGCTATTTCTAGCGTTTCTAGGCATTGCCACATTTACGTCCATTTATATGCGCACGTGCGCCCTGGTTTGAGTTTGGGTCACCTCACTTTGTAATACACTTTCCAAATTTATACATTTTCCCTGCTAGTTTCCTTTCTCTATACAGGCGAGTGGTACCTCACTGTGTGTGCACCCCACTTTCACGGTTCTCTGGGCATCTGTGCTCAGCATCTAGGCTGCCACCATTTCTTTGCCATTGGACCACTACCACTTGCACCAACACTTGCCATTTCAAGACAGGATGGTGAATTATTTAAAGATTATTTTTAGATAGGGTCTTAGGTTGGCCTGTAACTCATGGCATGCCTCCTGTTTTACCATGCTGACATTACAGGCAGTGAACCACCTTGCCATACTTTTTTTTTTTAAAGGTAGTGTATTAACACAACTGTAAATTCAAGCTGCAAGTGACCTTTTTTTTTGGCTGAAATCTGCGAGTAGTACTTGTAGGCATTATGTTGTTTCTGTCACCATTGAAAACACTTTTGTTTTCTTCAGAGATTGGCCTTGAATAAACTTGCTTCTCCCGCCTCAGCCTGCTTGAGTGTTCAATGGCATTTTTGGGGGGACAGCTTGATGTCTCCCAGGCTGTGCTCTAACTTGCTGTGTAGCCAAAGATGACCCCAAATTTGTTTCTCTTGCTGCTATGTCCCAGGTGCTGGGATTACAGTTTATGCAGAGCTGAAGATGGAGCCCAGGGCTGCAAGCCTGGGAGGGCAGGCCTTCTCCCAACTCCTCTGTCCCATTAGCCACCGGTGACAGAATGGCTGTGACCCGCACCAGCAGGGAAACAGCTGGAGCAGAACTTGCAGTGGATTCTTTAGTGACGGAACCACACGGTCTAACCGCACGGCCTCTTATGTGATTCCTTACAGAACCACAAACTCCAGCTAGAAAATCAGCTTTTACGGGAGAAAACTCACGGCCTTGTGGTTGAGAACCAGGAGTTAAGAACACGCTTGGGAATGGACACGCTGGATCCTGACGAGGTTCCAGAGGTGGAGGCCAAGGTAAGTATTGGGAGACCTGGCTGCAGCACTACCTGGCTGCAGGTTTGTGTTCTGGACCTCCAATCAAATCCTTTTCTCTTTTCCTTTATGAGACAAGGTCTTAATGTCTAATTTTGGCTGGTCTTGAACTTGTGTCAGTTCTTTTGCTTCTAAGTAGTAGGACTATAAGCACCTGCCCCTGTGCCTAGCTGAGGAATCCTGAATTTTCCCTGTTTCCTTGAACTAAACTTATGATCTTCTTGCCTTAGCCTTCCAAGCGCTGGAATTACATGCATGAACAAGTGGTTTGTTTCTTGGCTTTTTTGGGGGATAGGGTGTCATGTAGTCCAGGTTGGCCTCAAACTTGCTCTGTAGCTGATAATCCTACCTCCACCTTCCAGATGTTACCATTACAGGCAGATGTTCCTTTGTGTGGTTATGTAGGTGTGTATGTGTACATGGGTGTGGGTTTATACACATCTCTGCTTACGTACAGAGGCCTAAGGAGCATATAGATGTCTTGCCCTAGCACTGTCCACCCTGCTCCTCTGCAGCAGAGTGTCTCACTGAATCTGGGGCTAGGCAGGTGGACAGCAAGCCCTGGTGAACTTCCTGTTTCTGCCTCCCTTGATGCTGAGGATTTGAACTTGGGTCTTCAGGATTGTACAGCAAGCACATTATATTCAGAGCCACCTCCCCAGTTCCTTTCGAGCCCTTTGAGGAGCAGAGACTCACAGCTACCCAGCATGTATATCCTTGGCAACTTTTACTCACTGTGGTCTTTCCTTCCAGGGGAGTGGAGTAAGGCTGGTGGCCGGGTCTGCTGAGTCCGCAGCACTCAGACTATGTGCACCTCTGCAGCAGGTGCAGGCCCAGTTGTCACCTCCCCAGAACATCTTCCCATGGACTCTGACACTGTTGCCTCTTCAGATTCTGAGGTAGAGCTTATTCTGTAGCCTAAGTGGCGTGTGACACGCTTAGCCAGGCAAACGGAGAAGTTAGTATTGGTGGGGTTAGGATTAAGCACTTTCCTAGTCTGCTTAAGTGGATGGAGTAGGGGGAAACTGTTCCGTGGGTGGGTCCTATGATCTGAGAGCATAAGTCTGGTGGATGGCTGGGTCCTGTGATCTGAGAGTGTAAGCCCTAAGTAACATTGTGGAACCCAGTACTAAAAGTATTTCTGGTAGACTGTCACATTCATTCTAATAGTGAACTCTTTTGTGTTTTGCCTCTTGTAGTCTGATATCCTTTTGGGCATTCTGGACAAGTTGGACCCTGTCATGTTTTTCAAATGTCCTTCCCCAGAGTCTGCTAGTCTGGAGGAACTCCCAGAGGTCTACCCAGAAGGACCTAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACCTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTCATTCGTTTTGACCATGTATACACCAAGCCTCTAGTTTTAGAGATCCCCTCTGAGACAGAGAGTCAAACTAACGTGGTAGTGAAAATTGAGGAAGCACCTCTAAGCTCTTCAGAAGAGGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGAAAGAGCCTTTGGAAGATGACTTCATCCCAGAGCTGGGCATCTCAAACCTGCTTTCATCCAGCCATTGTCTGAGACCACCTTCTTGCCTGCTGGACGCTCACAGTGACTGTGGATATGAGGGCTCCCCTTCTCCCTTCAGTGACATGTCTTCTCCACTTGGTACAGACCACTCCTGGGAGGATACTTTTGCCAATGAACTTTTCCCCCAGCTGATTAGTGTCTAAAGAGCCACATAACACTGGGCCCCTTTCCCTGACCATCACATTGCCTAGAGGATAGCATAGGCCTGTCTCTTTCGTTAAAAGCCAAAGTAGAGGCTGTCTGGCCTTAGAAGAATTCCTCTAAAGTATTTCAAATCTCATAGATGACTTCCAAGTATTGTCGTTTGACACTCAGCTGTCTAAGGTATTCAAAGGTATTCCAGTACTACAGCTTTTGAGATTCTAGTTTATCTTAAAGGTGGTAGTATACTCTAAATCGCAGGGAGGGTCATTTGACAGTTTTTTCCCAGCCTGGCTTCAAACTATGTAGCCGAGGCTAGGCAGAAACTTCTGACCCTCTTGACCCCACCTCCCAAGTGCTGGGCTTCACCAGGTGTGCACCTCCACACCTGCCCCCCCGACATGTCAGGTGGACATGGGATTCATGAATGGCCCTTAGCATTTCTTTCTCCACTCTCTGCTTCCCAGGTTTCGTAACCTGAGGGGGCTTGTTTTCCCTTATGTGCATTTTAAATGA
AGATCAAGAATCTTTGTAAAATGATGAAAATTTACTATGTAAATGCTTGATGGATCTTCTTGCTAGTGTAGCTTCTAGAAGGTGCTTTCTCCATTTATTTAAAACTACCCTTGCAATTAAAAAAAAAGCAACACAGCGTCCTGTTCTGTGATTTCTAGGGCTGTTGTAATTTCTCTTTATTGTTGGCTAAAGGAGTAATTTATCCAACTAAAGTGAGCATACCACTTTTTAAAGTCA
配列番号591:マウスXbp1、転写バリアント1、(IRE1プロセシングされていないmRNA)
CTAGGGTAAAACCGTGAGACTCGGTCTGGAAATCTGGCCTGAGAGGACAGCCTGGCAATCCTCAGCCGGGGTGGGGACGTCTGCCGAAGATCCTTGGACTCCAGCAACCAGTGGTCGCCACCGTCCATCCACCCTAAGGCCCAGTTTGCACGGCGGAGAACAGCTGTGCAGCCACGCTGGACACTCACCCCGCCCGAGTTGAGCCCGCCCCCGGGACTACAGGACCAATAAGTGATGAATATACCCGCGCGTCACGGAGCACCGGCCAATCGCGGACGGCCACGACCCTAGAAAGGCTGGGCGCGGCAGGAGGCCACGGGGCGGTGGCGGCGCTGGCGTAGACGTTTCCTGGCTATGGTGGTGGTGGCAGCGGCGCCGAGCGCGGCCACGGCGGCCCCCAAAGTGCTACTCTTATCTGGCCAGCCCGCCTCCGGCGGCCGGGCGCTGCCGCTCATGGTACCCGGTCCGCGGGCAGCAGGGTCGGAGGCGAGCGGGACACCGCAGGCTCGCAAGCGGCAGCGGCTCACGCACCTGAGCCCGGAGGAGAAAGCGCTGCGGAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGCTCGAGATAGAAAGAAAGCCCGGATGAGCGAGCTGGAGCAGCAAGTGGTGGATTTGGAAGAAGAGAACCACAAACTCCAGCTAGAAAATCAGCTTTTACGGGAGAAAACTCACGGCCTTGTGGTTGAGAACCAGGAGTTAAGAACACGCTTGGGAATGGACACGCTGGATCCTGACGAGGTTCCAGAGGTGGAGGCCAAGGGGAGTGGAGTAAGGCTGGTGGCCGGGTCTGCTGAGTCCGCAGCACTCAGACTATGTGCACCTCTGCAGCAGGTGCAGGCCCAGTTGTCACCTCCCCAGAACATCTTCCCATGGACTCTGACACTGTTGCCTCTTCAGATTCTGAGTCTGATATCCTTTTGGGCATTCTGGACAAGTTGGACCCTGTCATGTTTTTCAAATGTCCTTCCCCAGAGTCTGCTAGTCTGGAGGAACTCCCAGAGGTCTACCCAGAAGGACCTAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACCTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTCATTCGTTTTGACCATGTATACACCAAGCCTCTAGTTTTAGAGATCCCCTCTGAGACAGAGAGTCAAACTAACGTGGTAGTGAAAATTGAGGAAGCACCTCTAAGCTCTTCAGAAGAGGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGAAAGAGCCTTTGGAAGATGACTTCATCCCAGAGCTGGGCATCTCAAACCTGCTTTCATCCAGCCATTGTCTGAGACCACCTTCTTGCCTGCTGGACGCTCACAGTGACTGTGGATATGAGGGCTCCCCTTCTCCCTTCAGTGACATGTCTTCTCCACTTGGTACAGACCACTCCTGGGAGGATACTTTTGCCAATGAACTTTTCCCCCAGCTGATTAGTGTCTAAAGAGCCACATAACACTGGGCCCCTTTCCCTGACCATCACATTGCCTAGAGGATAGCATAGGCCTGTCTCTTTCGTTAAAAGCCAAAGTAGAGGCTGTCTGGCCTTAGAAGAATTCCTCTAAAGTATTTCAAATCTCATAGATGACTTCCAAGTATTGTCGTTTGACACTCAGCTGTCTAAGGTATTCAAAGGTATTCCAGTACTACAGCTTTTGAGATTCTAGTTTATCTTAAAGGTGGTAGTATACTCTAAATCGCAGGGAGGGTCATTTGACAGTTTTTTCCCAGCCTGGCTTCAAACTATGTAGCCGAGGCTAGGCAGAAACTTCTGACCCTCTTGACCCCACCTCCCAAGTGCTGGGCTTCACCAGGTGTGCACCTCCACACCTGCCCCCCCGACATGTCAGGTGGACATGGGATTCATGAATGGCCCTTAGCATTTCTTTCTCCACTCTCTGCTTCCCAGGTTTCGTAACCTGAGGGGGCTTGTTTTCCCTTATGTGCATTTTAAATGAAGATCAAGAATCTTTGTAAAATGATGAAAATTTACTATGTAAATGCTTGATGGATCTTCTTGCTAGTGTAGCTTCTAGAAGGTGCTTTCTCCATTTATTTAAAACTACCCTTGCAATTAAAAAAAAAGCAACACAGCGTCCTGTTCTGTGATTTCTAGGGCTGTTGTAATTTCTCTTTATTGTTGGCTAAAGGAGTAATTTATCCAACTAAAGTGAGCATACCACTTTTTAAAGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
CTAGGGTAAAACCGTGAGACTCGGTCTGGAAATCTGGCCTGAGAGGACAGCCTGGCAATCCTCAGCCGGGGTGGGGACGTCTGCCGAAGATCCTTGGACTCCAGCAACCAGTGGTCGCCACCGTCCATCCACCCTAAGGCCCAGTTTGCACGGCGGAGAACAGCTGTGCAGCCACGCTGGACACTCACCCCGCCCGAGTTGAGCCCGCCCCCGGGACTACAGGACCAATAAGTGATGAATATACCCGCGCGTCACGGAGCACCGGCCAATCGCGGACGGCCACGACCCTAGAAAGGCTGGGCGCGGCAGGAGGCCACGGGGCGGTGGCGGCGCTGGCGTAGACGTTTCCTGGCTATGGTGGTGGTGGCAGCGGCGCCGAGCGCGGCCACGGCGGCCCCCAAAGTGCTACTCTTATCTGGCCAGCCCGCCTCCGGCGGCCGGGCGCTGCCGCTCATGGTACCCGGTCCGCGGGCAGCAGGGTCGGAGGCGAGCGGGACACCGCAGGCTCGCAAGCGGCAGCGGCTCACGCACCTGAGCCCGGAGGAGAAAGCGCTGCGGAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGCTCGAGATAGAAAGAAAGCCCGGATGAGCGAGCTGGAGCAGCAAGTGGTGGATTTGGAAGAAGAGAACCACAAACTCCAGCTAGAAAATCAGCTTTTACGGGAGAAAACTCACGGCCTTGTGGTTGAGAACCAGGAGTTAAGAACACGCTTGGGAATGGACACGCTGGATCCTGACGAGGTTCCAGAGGTGGAGGCCAAGGGGAGTGGAGTAAGGCTGGTGGCCGGGTCTGCTGAGTCCGCAGCACTCAGACTATGTGCACCTCTGCAGCAGGTGCAGGCCCAGTTGTCACCTCCCCAGAACATCTTCCCATGGACTCTGACACTGTTGCCTCTTCAGATTCTGAGTCTGATATCCTTTTGGGCATTCTGGACAAGTTGGACCCTGTCATGTTTTTCAAATGTCCTTCCCCAGAGTCTGCTAGTCTGGAGGAACTCCCAGAGGTCTACCCAGAAGGACCTAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACCTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTCATTCGTTTTGACCATGTATACACCAAGCCTCTAGTTTTAGAGATCCCCTCTGAGACAGAGAGTCAAACTAACGTGGTAGTGAAAATTGAGGAAGCACCTCTAAGCTCTTCAGAAGAGGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGAAAGAGCCTTTGGAAGATGACTTCATCCCAGAGCTGGGCATCTCAAACCTGCTTTCATCCAGCCATTGTCTGAGACCACCTTCTTGCCTGCTGGACGCTCACAGTGACTGTGGATATGAGGGCTCCCCTTCTCCCTTCAGTGACATGTCTTCTCCACTTGGTACAGACCACTCCTGGGAGGATACTTTTGCCAATGAACTTTTCCCCCAGCTGATTAGTGTCTAAAGAGCCACATAACACTGGGCCCCTTTCCCTGACCATCACATTGCCTAGAGGATAGCATAGGCCTGTCTCTTTCGTTAAAAGCCAAAGTAGAGGCTGTCTGGCCTTAGAAGAATTCCTCTAAAGTATTTCAAATCTCATAGATGACTTCCAAGTATTGTCGTTTGACACTCAGCTGTCTAAGGTATTCAAAGGTATTCCAGTACTACAGCTTTTGAGATTCTAGTTTATCTTAAAGGTGGTAGTATACTCTAAATCGCAGGGAGGGTCATTTGACAGTTTTTTCCCAGCCTGGCTTCAAACTATGTAGCCGAGGCTAGGCAGAAACTTCTGACCCTCTTGACCCCACCTCCCAAGTGCTGGGCTTCACCAGGTGTGCACCTCCACACCTGCCCCCCCGACATGTCAGGTGGACATGGGATTCATGAATGGCCCTTAGCATTTCTTTCTCCACTCTCTGCTTCCCAGGTTTCGTAACCTGAGGGGGCTTGTTTTCCCTTATGTGCATTTTAAATGAAGATCAAGAATCTTTGTAAAATGATGAAAATTTACTATGTAAATGCTTGATGGATCTTCTTGCTAGTGTAGCTTCTAGAAGGTGCTTTCTCCATTTATTTAAAACTACCCTTGCAATTAAAAAAAAAGCAACACAGCGTCCTGTTCTGTGATTTCTAGGGCTGTTGTAATTTCTCTTTATTGTTGGCTAAAGGAGTAATTTATCCAACTAAAGTGAGCATACCACTTTTTAAAGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
配列番号592:マウスX-box結合タンパク質1アイソフォームXBP1(U)
MVVVAAAPSAATAAPKVLLLSGQPASGGRALPLMVPGPRAAGSEASGTPQARKRQRLTHLSPEEKALRRKLKNRVAAQTARDRKKARMSELEQQVVDLEEENHKLQLENQLLREKTHGLVVENQELRTRLGMDTLDPDEVPEVEAKGSGVRLVAGSAESAALRLCAPLQQVQAQLSPPQNIFPWTLTLLPLQILSLISFWAFWTSWTLSCFSNVLPQSLLVWRNSQRSTQKDLVPYQPPFLCQWGPHQPSWKPLMNSFVLTMYTPSL
MVVVAAAPSAATAAPKVLLLSGQPASGGRALPLMVPGPRAAGSEASGTPQARKRQRLTHLSPEEKALRRKLKNRVAAQTARDRKKARMSELEQQVVDLEEENHKLQLENQLLREKTHGLVVENQELRTRLGMDTLDPDEVPEVEAKGSGVRLVAGSAESAALRLCAPLQQVQAQLSPPQNIFPWTLTLLPLQILSLISFWAFWTSWTLSCFSNVLPQSLLVWRNSQRSTQKDLVPYQPPFLCQWGPHQPSWKPLMNSFVLTMYTPSL
配列番号593:マウスX-box結合タンパク質1(Xbp1)、転写バリアント2、mRNA
CTAGGGTAAAACCGTGAGACTCGGTCTGGAAATCTGGCCTGAGAGGACAGCCTGGCAATCCTCAGCCGGGGTGGGGACGTCTGCCGAAGATCCTTGGACTCCAGCAACCAGTGGTCGCCACCGTCCATCCACCCTAAGGCCCAGTTTGCACGGCGGAGAACAGCTGTGCAGCCACGCTGGACACTCACCCCGCCCGAGTTGAGCCCGCCCCCGGGACTACAGGACCAATAAGTGATGAATATACCCGCGCGTCACGGAGCACCGGCCAATCGCGGACGGCCACGACCCTAGAAAGGCTGGGCGCGGCAGGAGGCCACGGGGCGGTGGCGGCGCTGGCGTAGACGTTTCCTGGCTATGGTGGTGGTGGCAGCGGCGCCGAGCGCGGCCACGGCGGCCCCCAAAGTGCTACTCTTATCTGGCCAGCCCGCCTCCGGCGGCCGGGCGCTGCCGCTCATGGTACCCGGTCCGCGGGCAGCAGGGTCGGAGGCGAGCGGGACACCGCAGGCTCGCAAGCGGCAGCGGCTCACGCACCTGAGCCCGGAGGAGAAAGCGCTGCGGAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGCTCGAGATAGAAAGAAAGCCCGGATGAGCGAGCTGGAGCAGCAAGTGGTGGATTTGGAAGAAGAGAACCACAAACTCCAGCTAGAAAATCAGCTTTTACGGGAGAAAACTCACGGCCTTGTGGTTGAGAACCAGGAGTTAAGAACACGCTTGGGAATGGACACGCTGGATCCTGACGAGGTTCCAGAGGTGGAGGCCAAGGGGAGTGGAGTAAGGCTGGTGGCCGGGTCTGCTGAGTCCGCAGCAGGTGCAGGCCCAGTTGTCACCTCCCCAGAACATCTTCCCATGGACTCTGACACTGTTGCCTCTTCAGATTCTGAGTCTGATATCCTTTTGGGCATTCTGGACAAGTTGGACCCTGTCATGTTTTTCAAATGTCCTTCCCCAGAGTCTGCTAGTCTGGAGGAACTCCCAGAGGTCTACCCAGAAGGACCTAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACCTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTCATTCGTTTTGACCATGTATACACCAAGCCTCTAGTTTTAGAGATCCCCTCTGAGACAGAGAGTCAAACTAACGTGGTAGTGAAAATTGAGGAAGCACCTCTAAGCTCTTCAGAAGAGGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGAAAGAGCCTTTGGAAGATGACTTCATCCCAGAGCTGGGCATCTCAAACCTGCTTTCATCCAGCCATTGTCTGAGACCACCTTCTTGCCTGCTGGACGCTCACAGTGACTGTGGATATGAGGGCTCCCCTTCTCCCTTCAGTGACATGTCTTCTCCACTTGGTACAGACCACTCCTGGGAGGATACTTTTGCCAATGAACTTTTCCCCCAGCTGATTAGTGTCTAAAGAGCCACATAACACTGGGCCCCTTTCCCTGACCATCACATTGCCTAGAGGATAGCATAGGCCTGTCTCTTTCGTTAAAAGCCAAAGTAGAGGCTGTCTGGCCTTAGAAGAATTCCTCTAAAGTATTTCAAATCTCATAGATGACTTCCAAGTATTGTCGTTTGACACTCAGCTGTCTAAGGTATTCAAAGGTATTCCAGTACTACAGCTTTTGAGATTCTAGTTTATCTTAAAGGTGGTAGTATACTCTAAATCGCAGGGAGGGTCATTTGACAGTTTTTTCCCAGCCTGGCTTCAAACTATGTAGCCGAGGCTAGGCAGAAACTTCTGACCCTCTTGACCCCACCTCCCAAGTGCTGGGCTTCACCAGGTGTGCACCTCCACACCTGCCCCCCCGACATGTCAGGTGGACATGGGATTCATGAATGGCCCTTAGCATTTCTTTCTCCACTCTCTGCTTCCCAGGTTTCGTAACCTGAGGGGGCTTGTTTTCCCTTATGTGCATTTTAAATGAAGATCAAGAATCTTTGTAAAATGATGAAAATTTACTATGTAAATGCTTGATGGATCTTCTTGCTAGTGTAGCTTCTAGAAGGTGCTTTCTCCATTTATTTAAAACTACCCTTGCAATTAAAAAAAAAGCAACACAGCGTCCTGTTCTGTGATTTCTAGGGCTGTTGTAATTTCTCTTTATTGTTGGCTAAAGGAGTAATTTATCCAACTAAAGTGAGCATACCACTTTTTAAAGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
CTAGGGTAAAACCGTGAGACTCGGTCTGGAAATCTGGCCTGAGAGGACAGCCTGGCAATCCTCAGCCGGGGTGGGGACGTCTGCCGAAGATCCTTGGACTCCAGCAACCAGTGGTCGCCACCGTCCATCCACCCTAAGGCCCAGTTTGCACGGCGGAGAACAGCTGTGCAGCCACGCTGGACACTCACCCCGCCCGAGTTGAGCCCGCCCCCGGGACTACAGGACCAATAAGTGATGAATATACCCGCGCGTCACGGAGCACCGGCCAATCGCGGACGGCCACGACCCTAGAAAGGCTGGGCGCGGCAGGAGGCCACGGGGCGGTGGCGGCGCTGGCGTAGACGTTTCCTGGCTATGGTGGTGGTGGCAGCGGCGCCGAGCGCGGCCACGGCGGCCCCCAAAGTGCTACTCTTATCTGGCCAGCCCGCCTCCGGCGGCCGGGCGCTGCCGCTCATGGTACCCGGTCCGCGGGCAGCAGGGTCGGAGGCGAGCGGGACACCGCAGGCTCGCAAGCGGCAGCGGCTCACGCACCTGAGCCCGGAGGAGAAAGCGCTGCGGAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGCTCGAGATAGAAAGAAAGCCCGGATGAGCGAGCTGGAGCAGCAAGTGGTGGATTTGGAAGAAGAGAACCACAAACTCCAGCTAGAAAATCAGCTTTTACGGGAGAAAACTCACGGCCTTGTGGTTGAGAACCAGGAGTTAAGAACACGCTTGGGAATGGACACGCTGGATCCTGACGAGGTTCCAGAGGTGGAGGCCAAGGGGAGTGGAGTAAGGCTGGTGGCCGGGTCTGCTGAGTCCGCAGCAGGTGCAGGCCCAGTTGTCACCTCCCCAGAACATCTTCCCATGGACTCTGACACTGTTGCCTCTTCAGATTCTGAGTCTGATATCCTTTTGGGCATTCTGGACAAGTTGGACCCTGTCATGTTTTTCAAATGTCCTTCCCCAGAGTCTGCTAGTCTGGAGGAACTCCCAGAGGTCTACCCAGAAGGACCTAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACCTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTCATTCGTTTTGACCATGTATACACCAAGCCTCTAGTTTTAGAGATCCCCTCTGAGACAGAGAGTCAAACTAACGTGGTAGTGAAAATTGAGGAAGCACCTCTAAGCTCTTCAGAAGAGGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGAAAGAGCCTTTGGAAGATGACTTCATCCCAGAGCTGGGCATCTCAAACCTGCTTTCATCCAGCCATTGTCTGAGACCACCTTCTTGCCTGCTGGACGCTCACAGTGACTGTGGATATGAGGGCTCCCCTTCTCCCTTCAGTGACATGTCTTCTCCACTTGGTACAGACCACTCCTGGGAGGATACTTTTGCCAATGAACTTTTCCCCCAGCTGATTAGTGTCTAAAGAGCCACATAACACTGGGCCCCTTTCCCTGACCATCACATTGCCTAGAGGATAGCATAGGCCTGTCTCTTTCGTTAAAAGCCAAAGTAGAGGCTGTCTGGCCTTAGAAGAATTCCTCTAAAGTATTTCAAATCTCATAGATGACTTCCAAGTATTGTCGTTTGACACTCAGCTGTCTAAGGTATTCAAAGGTATTCCAGTACTACAGCTTTTGAGATTCTAGTTTATCTTAAAGGTGGTAGTATACTCTAAATCGCAGGGAGGGTCATTTGACAGTTTTTTCCCAGCCTGGCTTCAAACTATGTAGCCGAGGCTAGGCAGAAACTTCTGACCCTCTTGACCCCACCTCCCAAGTGCTGGGCTTCACCAGGTGTGCACCTCCACACCTGCCCCCCCGACATGTCAGGTGGACATGGGATTCATGAATGGCCCTTAGCATTTCTTTCTCCACTCTCTGCTTCCCAGGTTTCGTAACCTGAGGGGGCTTGTTTTCCCTTATGTGCATTTTAAATGAAGATCAAGAATCTTTGTAAAATGATGAAAATTTACTATGTAAATGCTTGATGGATCTTCTTGCTAGTGTAGCTTCTAGAAGGTGCTTTCTCCATTTATTTAAAACTACCCTTGCAATTAAAAAAAAAGCAACACAGCGTCCTGTTCTGTGATTTCTAGGGCTGTTGTAATTTCTCTTTATTGTTGGCTAAAGGAGTAATTTATCCAACTAAAGTGAGCATACCACTTTTTAAAGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
配列番号594:X-box結合タンパク質1アイソフォームXBP1(S)
MVVVAAAPSAATAAPKVLLLSGQPASGGRALPLMVPGPRAAGSEASGTPQARKRQRLTHLSPEEKALRRKLKNRVAAQTARDRKKARMSELEQQVVDLEEENHKLQLENQLLREKTHGLVVENQELRTRLGMDTLDPDEVPEVEAKGSGVRLVAGSAESAAGAGPVVTSPEHLPMDSDTVASSDSESDILLGILDKLDPVMFFKCPSPESASLEELPEVYPEGPSSLPASLSLSVGTSSAKLEAINELIRFDHVYTKPLVLEIPSETESQTNVVVKIEEAPLSSSEEDHPEFIVSVKKEPLEDDFIPELGISNLLSSSHCLRPPSCLLDAHSDCGYEGSPSPFSDMSSPLGTDHSWEDTFANELFPQLISV
MVVVAAAPSAATAAPKVLLLSGQPASGGRALPLMVPGPRAAGSEASGTPQARKRQRLTHLSPEEKALRRKLKNRVAAQTARDRKKARMSELEQQVVDLEEENHKLQLENQLLREKTHGLVVENQELRTRLGMDTLDPDEVPEVEAKGSGVRLVAGSAESAAGAGPVVTSPEHLPMDSDTVASSDSESDILLGILDKLDPVMFFKCPSPESASLEELPEVYPEGPSSLPASLSLSVGTSSAKLEAINELIRFDHVYTKPLVLEIPSETESQTNVVVKIEEAPLSSSEEDHPEFIVSVKKEPLEDDFIPELGISNLLSSSHCLRPPSCLLDAHSDCGYEGSPSPFSDMSSPLGTDHSWEDTFANELFPQLISV
配列番号595:マウスXBP1デルタ4 mRNA
CTAGGGTAAAACCGTGAGACTCGGTCTGGAAATCTGGCCTGAGAGGACAGCCTGGCAATCCTCAGCCGGGGTGGGGACGTCTGCCGAAGATCCTTGGACTCCAGCAACCAGTGGTCGCCACCGTCCATCCACCCTAAGGCCCAGTTTGCACGGCGGAGAACAGCTGTGCAGCCACGCTGGACACTCACCCCGCCCGAGTTGAGCCCGCCCCCGGGACTACAGGACCAATAAGTGATGAATATACCCGCGCGTCACGGAGCACCGGCCAATCGCGGACGGCCACGACCCTAGAAAGGCTGGGCGCGGCAGGAGGCCACGGGGCGGTGGCGGCGCTGGCGTAGACGTTTCCTGGCTATGGTGGTGGTGGCAGCGGCGCCGAGCGCGGCCACGGCGGCCCCCAAAGTGCTACTCTTATCTGGCCAGCCCGCCTCCGGCGGCCGGGCGCTGCCGCTCATGGTACCCGGTCCGCGGGCAGCAGGGTCGGAGGCGAGCGGGACACCGCAGGCTCGCAAGCGGCAGCGGCTCACGCACCTGAGCCCGGAGGAGAAAGCGCTGCGGAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGCTCGAGATAGAAAGAAAGCCCGGATGAGCGAGCTGGAGCAGCAAGTGGTGGATTTGGAAGAAGAGAACCACAAACTCCAGCTAGAAAATCAGCTTTTACGGGAGAAAACTCACGGCCTTGTGGTTGAGAACCAGGAGTTAAGAACACGCTTGGGAATGGACACGCTGGATCCTGACGAGGTTCCAGAGGTGGAGGCCAAGTCTGATATCCTTTTGGGCATTCTGGACAAGTTGGACCCTGTCATGTTTTTCAAATGTCCTTCCCCAGAGTCTGCTAGTCTGGAGGAACTCCCAGAGGTCTACCCAGAAGGACCTAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACCTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTCATTCGTTTTGACCATGTATACACCAAGCCTCTAGTTTTAGAGATCCCCTCTGAGACAGAGAGTCAAACTAACGTGGTAGTGAAAATTGAGGAAGCACCTCTAAGCTCTTCAGAAGAGGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGAAAGAGCCTTTGGAAGATGACTTCATCCCAGAGCTGGGCATCTCAAACCTGCTTTCATCCAGCCATTGTCTGAGACCACCTTCTTGCCTGCTGGACGCTCACAGTGACTGTGGATATGAGGGCTCCCCTTCTCCCTTCAGTGACATGTCTTCTCCACTTGGTACAGACCACTCCTGGGAGGATACTTTTGCCAATGAACTTTTCCCCCAGCTGATTAGTGTCTAAAGAGCCACATAACACTGGGCCCCTTTCCCTGACCATCACATTGCCTAGAGGATAGCATAGGCCTGTCTCTTTCGTTAAAAGCCAAAGTAGAGGCTGTCTGGCCTTAGAAGAATTCCTCTAAAGTATTTCAAATCTCATAGATGACTTCCAAGTATTGTCGTTTGACACTCAGCTGTCTAAGGTATTCAAAGGTATTCCAGTACTACAGCTTTTGAGATTCTAGTTTATCTTAAAGGTGGTAGTATACTCTAAATCGCAGGGAGGGTCATTTGACAGTTTTTTCCCAGCCTGGCTTCAAACTATGTAGCCGAGGCTAGGCAGAAACTTCTGACCCTCTTGACCCCACCTCCCAAGTGCTGGGCTTCACCAGGTGTGCACCTCCACACCTGCCCCCCCGACATGTCAGGTGGACATGGGATTCATGAATGGCCCTTAGCATTTCTTTCTCCACTCTCTGCTTCCCAGGTTTCGTAACCTGAGGGGGCTTGTTTTCCCTTATGTGCATTTTAAATGAAGATCAAGAATCTTTGTAAAATGATGAAAATTTACTATGTAAATGCTTGATGGATCTTCTTGCTAGTGTAGCTTCTAGAAGGTGCTTTCTCCATTTATTTAAAACTACCCTTGCAATTAAAAAAAAAGCAACACAGCGTCCTGTTCTGTGATTTCTAGGGCTGTTGTAATTTCTCTTTATTGTTGGCTAAAGGAGTAATTTATCCAACTAAAGTGAGCATACCACTTTTTAAAGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
CTAGGGTAAAACCGTGAGACTCGGTCTGGAAATCTGGCCTGAGAGGACAGCCTGGCAATCCTCAGCCGGGGTGGGGACGTCTGCCGAAGATCCTTGGACTCCAGCAACCAGTGGTCGCCACCGTCCATCCACCCTAAGGCCCAGTTTGCACGGCGGAGAACAGCTGTGCAGCCACGCTGGACACTCACCCCGCCCGAGTTGAGCCCGCCCCCGGGACTACAGGACCAATAAGTGATGAATATACCCGCGCGTCACGGAGCACCGGCCAATCGCGGACGGCCACGACCCTAGAAAGGCTGGGCGCGGCAGGAGGCCACGGGGCGGTGGCGGCGCTGGCGTAGACGTTTCCTGGCTATGGTGGTGGTGGCAGCGGCGCCGAGCGCGGCCACGGCGGCCCCCAAAGTGCTACTCTTATCTGGCCAGCCCGCCTCCGGCGGCCGGGCGCTGCCGCTCATGGTACCCGGTCCGCGGGCAGCAGGGTCGGAGGCGAGCGGGACACCGCAGGCTCGCAAGCGGCAGCGGCTCACGCACCTGAGCCCGGAGGAGAAAGCGCTGCGGAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGCTCGAGATAGAAAGAAAGCCCGGATGAGCGAGCTGGAGCAGCAAGTGGTGGATTTGGAAGAAGAGAACCACAAACTCCAGCTAGAAAATCAGCTTTTACGGGAGAAAACTCACGGCCTTGTGGTTGAGAACCAGGAGTTAAGAACACGCTTGGGAATGGACACGCTGGATCCTGACGAGGTTCCAGAGGTGGAGGCCAAGTCTGATATCCTTTTGGGCATTCTGGACAAGTTGGACCCTGTCATGTTTTTCAAATGTCCTTCCCCAGAGTCTGCTAGTCTGGAGGAACTCCCAGAGGTCTACCCAGAAGGACCTAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACCTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTCATTCGTTTTGACCATGTATACACCAAGCCTCTAGTTTTAGAGATCCCCTCTGAGACAGAGAGTCAAACTAACGTGGTAGTGAAAATTGAGGAAGCACCTCTAAGCTCTTCAGAAGAGGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGAAAGAGCCTTTGGAAGATGACTTCATCCCAGAGCTGGGCATCTCAAACCTGCTTTCATCCAGCCATTGTCTGAGACCACCTTCTTGCCTGCTGGACGCTCACAGTGACTGTGGATATGAGGGCTCCCCTTCTCCCTTCAGTGACATGTCTTCTCCACTTGGTACAGACCACTCCTGGGAGGATACTTTTGCCAATGAACTTTTCCCCCAGCTGATTAGTGTCTAAAGAGCCACATAACACTGGGCCCCTTTCCCTGACCATCACATTGCCTAGAGGATAGCATAGGCCTGTCTCTTTCGTTAAAAGCCAAAGTAGAGGCTGTCTGGCCTTAGAAGAATTCCTCTAAAGTATTTCAAATCTCATAGATGACTTCCAAGTATTGTCGTTTGACACTCAGCTGTCTAAGGTATTCAAAGGTATTCCAGTACTACAGCTTTTGAGATTCTAGTTTATCTTAAAGGTGGTAGTATACTCTAAATCGCAGGGAGGGTCATTTGACAGTTTTTTCCCAGCCTGGCTTCAAACTATGTAGCCGAGGCTAGGCAGAAACTTCTGACCCTCTTGACCCCACCTCCCAAGTGCTGGGCTTCACCAGGTGTGCACCTCCACACCTGCCCCCCCGACATGTCAGGTGGACATGGGATTCATGAATGGCCCTTAGCATTTCTTTCTCCACTCTCTGCTTCCCAGGTTTCGTAACCTGAGGGGGCTTGTTTTCCCTTATGTGCATTTTAAATGAAGATCAAGAATCTTTGTAAAATGATGAAAATTTACTATGTAAATGCTTGATGGATCTTCTTGCTAGTGTAGCTTCTAGAAGGTGCTTTCTCCATTTATTTAAAACTACCCTTGCAATTAAAAAAAAAGCAACACAGCGTCCTGTTCTGTGATTTCTAGGGCTGTTGTAATTTCTCTTTATTGTTGGCTAAAGGAGTAATTTATCCAACTAAAGTGAGCATACCACTTTTTAAAGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
配列番号596:XBP1デルタ4 mRNAによって産生されると予測されるタンパク質
MVVVAAAPSAATAAPKVLLLSGQPASGGRALPLMVPGPRAAGSEASGTPQARKRQRLTHLSPEEKALRRKLKNRVAAQTARDRKKARMSELEQQVVDLEEENHKLQLENQLLREKTHGLVVENQELRTRLGMDTLDPDEVPEVEAKSDILLGILDKLDPVMFFKCPSPESASLEELPEVYPEGPSSLPASLSLSVGTSSAKLEAINELIRFDHVYTKPLVLEIPSETESQTNVVVKIEEAPLSSSEEDHPEFIVSVKKEPLEDDFIPELGISNLLSSSHCLRPPSCLLDAHSDCGYEGSPSPFSDMSSPLGTDHSWEDTFANELFPQLISV
MVVVAAAPSAATAAPKVLLLSGQPASGGRALPLMVPGPRAAGSEASGTPQARKRQRLTHLSPEEKALRRKLKNRVAAQTARDRKKARMSELEQQVVDLEEENHKLQLENQLLREKTHGLVVENQELRTRLGMDTLDPDEVPEVEAKSDILLGILDKLDPVMFFKCPSPESASLEELPEVYPEGPSSLPASLSLSVGTSSAKLEAINELIRFDHVYTKPLVLEIPSETESQTNVVVKIEEAPLSSSEEDHPEFIVSVKKEPLEDDFIPELGISNLLSSSHCLRPPSCLLDAHSDCGYEGSPSPFSDMSSPLGTDHSWEDTFANELFPQLISV
ヒト
配列番号801:ヒトXBP1遺伝子
GCTGGGCGGCTGCGGCGCGCGGTGCGCGGTGCGTAGTCTGGAGCTATGGTGGTGGTGGCAGCCGCGCCGAACCCGGCCGACGGGACCCCTAAAGTTCTGCTTCTGTCGGGGCAGCCCGCCTCCGCCGCCGGAGCCCCGGCCGGCCAGGCCCTGCCGCTCATGGTGCCAGCCCAGAGAGGGGCCAGCCCGGAGGCAGCGAGCGGGGGGCTGCCCCAGGCGCGCAAGCGACAGCGCCTCACGCACCTGAGCCCCGAGGAGAAGGCGCTGAGGAGGTGGGCGAGGGGCCGGGGTCTGGGGCCAGATCTGAAGCCGGGACTAGGGACAGGGGCAGGGGCAGGGGCTGGGAGCGGGGACCCAGCACTGGCCGCCCCGCAGGGCTCCGTCGCCTTTGGCCTGGCGGGTCGGTGCCAGCGTGGCGCGGGGCGGGGCAGGAAGCCCGGACTGACCGGATCCGCCACGCTGGGAACCTAGGGCGGCCCAGGGCTCTTTTCTGTACTTTTTAACTCTCTCGTTAGAGATGACCAGAGCTGGGGATGCGGGCACCTGTCTTCCAGGCCCTCTTGCTGTGTGGCCGCAGACTGGTGGTTCAGCCTCTTAACTCGGACATGAGGTCGAATAATCTGTTTTGGTTTACTGCTATTTCTGGAGAGGCGCGGAGCTGAAATAACAGAGCTGTTGAAAGGGCTGGGAATTCTGCGAGGCTCACTGGTCTAGCTCAGTATCTGCGTTCTTAAAATGGAACCTACTTCATGAGGTCTTTGGGGAGATTGAGACTTGGATATAATGTGCCTAGCACTTAGTCCTCCGTAAATGTTCACTCTTTTGTGATCATTGTGCCTTCTGTGATTTATGAAGTGTCTCTTCTGAGTTAATTCTTTTAAAAAAAAAAGTGTCTCCTCCAACAGACACGGACCCATCAGCAGGTCACTGCCTAGGATCTCAACACTAGAGATCAGGGAGTGGCATCAGCCTCTCCCTTTTCTAAATTGGACTGGGGGACGGAGGGTTGATGTCATAGCAAGATTGCAGCCTTCACTAGATTAATGAGGCCAGGTTGGATCCTGTTTAAGAGAACTGGAGACAGGAAGCAGCGGGGGAATAGATGGGGAAAGAGGAAAGTTCCTTATGATGCAAGATGAATAGTGTGTGTGTCCAGCCCCAGTGCTGTGACGGGGATGAGTCTGAGGTGGACGGATGATGCAATATAGGAGAGAATAAAGCAGGTCTTCGAGCTAGATTGACAGAAGACTGTATTTTTTATTTTGTTTTATTGAGGGGAGGAGCCTGAAGTGTATTTTATCATTAGTCTGTCTTATACTGTAAATAAAAATGAAAGCACCAGCTGGTAAAGTTTTCAAATAAAGACATAAATAAGGTTTGATATGACTCAGTGTGGTATGTTCCTTCTCTTCCTAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCTCAGACTGCCAGAGATCGAAAGAAGGCTCGAATGAGTGAGCTGGAACAGCAAGTGGTAGATTTAGAAGAAGAGGTAAAACTACTTAAGGTCAAACTCTTTTATCCATTGTATACCCTTCCTTGGTGAATGTTCTGATATTTGCTTCCCATCCCAAGTTGTTTCAGCCCCTATTAGAATACAATTGAATATATGATTAAAAGTTAAACTAGGCTGGGCATGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGCCTGAGTTGGGCAGATCACTTGAAGCCAGCAGTTTGAGACCAGCCTAGCCAACATGGTAAAATCCCGTCTCTACCCAAAAATATACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCCAAGCGTGAGTGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGTTGAGGTGGGAGGATTGTTTGAACCTGGGAGAGGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCGCACCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGTGAGACTCTGTCTCAAGAAAAAAAAAAAAAGTTTGCTGGGCACCGGGGCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGTGGGTAGATAACTTGAGATCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGACCAACGTGGTGAAACCCCATCTCTATTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGTGTCGTGGCAGGCACCTGTAATCCCAGCTGCTCCGGAGGCTGACGCAGGAGAATCACTTGAACCCAGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCACGAGATCATGCCACTGCACTCCAGTCTGGGCGACAGAGCAAAAACCCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGTTAATCTAAGTTAGGACAGAGAGTTGGTGAAGTGGTGAAGCTTGTTGAGGGCAGAAGTGATTGACTTTGTGGCATTTGGTGCTAGATGTATCTCAAAGTAGATGGATTTAACAATGTTTATTGAGTTTGTAGTAAGAAATTAGCAAGGGCTAATAGGAAATAATTGCTTAAACTTTACATTCTTCCTGGCATGGCCAGAAATTCACTAAAGGTTCCTTTCCCCCTCTAGGGTCCACCTGTTAATCAATCTTAAATTGTTGCCAATTACACATCTTGAATACATAGAGATTATTTATATTGTTTTTTTAACCCCTTGGTCAATTTGCATATATTGAGCTTTTTAAAGTTTTAATCATTAGTTGGTTCTTCTAAGAATCATGAGTCAGGAGCAGGGATTTTTTTTAACTTATTTTGGATTTATAGTCACCACTACCACTTTTATTATTACCTGCCAGTTCAAGATAGTTATTTATTTTTATTTTATATTATTATTATTATTATTATCATCATCATTATTTTGAGATGGAGTCTCACTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCAATCTCGGCTCACTGCAACCTCTGCCTCCCAGGTTCAAGCAATTCTCCCTGCTTCAGCCTCCAGATTAGCTGGGATTACAGGCACCCCTCACCACATCCAGCTAATTTTTGGATTTTTTAGTAGAGATGGGGGTTTGCCATGTTGGCCAGGCTGGTTTTGAACTCTTGACCTCAGGTGATCCACCTGCCTTGGCCTCCCAAAGTGTTAGGATTACAAGTGTGAGCCACCGAGCCTGGCCAAGATAGTTTAAAAAAAAAATTATATCTACATTAAAGCCACAAGTCACCCTTTGCTGAAGTCAGTATTAGTAGTTGGAAGCAGTGTGTTATTCTTGACCCCATGAAGTGGCACTTATTAAGTAGCTTGCTTTTCCATAATTATGGCCTAGCTTTTTAAAACCTACTATGAACACCACAAGCATAGAGTTTTCCAAAAGTTCAAGAAGGAAAGGAAACCAATTATACTGAATCAGGTAGATTCTTAACTGAAATAATTAGATGTTTTAATAGCCTCTTATGAACTTTCTTCCAGAACCAAAAACTTTTGCTAGAAAATCAGCTTTTACGAGAGAAAACTCATGGCCTTGTAGTTGAGAACCAGGAGTTAAGACAGCGCTTGGGGATGGATGCCCTGGTTGCTGAAGAGGAGGCGGAAGCCAAGGTAAATCATCTCCTTTATTTGGTGCCTCATGTGAGTACTGGTTCCAAGTGACATGACCCAGCGATTATGTTTACAGTCTGGACTTCTGATCAAGAGCGTTCTTGAAATTTTCCTTCAGTTTTAAGACATTTTCATGCAGGCAGAGTGTTCTTCCCCTAAAGGCACTTGACACTCATTTTTTAAGTGTGTAGTGAACAGTACTAAGATCTAATAATGAAAACAAGTTACATGGCTCCCTAAGAACAAGTACTAACAAATGCAGTAGCCAACAAGATTACCATGCAATCATTAAGGAGAACCAAAGTAAGAGAGCCACTCAAACCAGATTTTGAACGCTACTAAAATTAAAGTAGTTCTTTGATGAATATGAATGAGTAGGGAAAGGATTCTTTGTAATAGTGATACCTCTGTGGTAAGAGAAGGGTGGTATGTGAGTTTTAGTCTACAGATTATGGCAAATTCAGTGACAACAATCAAATGGTCTAAGATTGACAGTAGCACAGTTTTACTCTGTGAAGGTAATGTTCAGGACAAATTTCAAGAAAACTAGAAAACCATTCTTTACAGCTGAAATCTTTCCCTAACCATTGTTATTTCCACTTTTAAGTCCTCAAGAGATGAGAAAAGGGAGGTAAGGCTTCCTTATACATTTCCTGCACAATGAAACATTTTTCCTCCTCCAGGCAAAGATTCAAGCAGAACTGGCAAATATCTTATCTTGCTCTTCTCAATAATAATAATGTTGTTAGATAATAAAGTTCTATAGCAATTTAACCCTAGAATCTTTTTGAAAAGTAATTCTTTAAAGTTGAGAATCACAGCTGTCTAGCAAGCATTTCCTTGGGCACTTGAAGCTGTTTATTCACTTTGGTCTTTCCTCCCAGGGGAATGAAGTGAGGCCAGTGGCCGGGTCTGCTGAGTCCGCAGCACTCAGACTACGTGCACCTCTGCAGCAGGTGCAGGCCCAGTTGTCACCCCTCCAGAACATCTCCCCATGGATTCTGGCGGTATTGACTCTTCAGATTCAGAGGTAGGGATCATTCTGACTTATTAAAGAGCTATATAACCAGTTAATTCCATCTGTTTGATGCTTGACATCCCTAACTAGACAGATGAGGGTTGAAGTTAGTTTTTGGTGGGGTTGGAGGTGAACATCAACTACCTTCCTAGTTCCAGGTAATATAGAACATGGAGTGAAGTGTAGATAAATGGGTCTGGTGGGTCCCGAGGTCATCTTATCACATAATGACTAATTTACATTATGGAACCCAGTACAAAGTGTTCCAGTTAGATTTTCCATTGTATTCTGACAGTTGTACTTCATTTAATTTTTGCCTCTTACAGTCTGATATCCTGTTGGGCATTCTGGACAACTTGGACCCAGTCATGTTCTTCAAATGCCCTTCCCCAGAGCCTGCCAGCCTGGAGGAGCTCCCAGAGGTCTACCCAGAAGGACCCAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACGTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTAATTCGTTTTGACCACATATATACCAAGCCCCTAGTCTTAGAGATACCCTCTGAGACAGAGAGCCAAGCTAATGTGGTAGTGAAAATCGAGGAA
GCACCTCTCAGCCCCTCAGAGAATGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGGAAGAACCTGTAGAAGATGACCTCGTTCCGGAGCTGGGTATCTCAAATCTGCTTTCATCCAGCCACTGCCCAAAGCCATCTTCCTGCCTACTGGATGCTTACAGTGACTGTGGATACGGGGGTTCCCTTTCCCCATTCAGTGACATGTCCTCTCTGCTTGGTGTAAACCATTCTTGGGAGGACACTTTTGCCAATGAACTCTTTCCCCAGCTGATTAGTGTCTAAGGAATGATCCAATACTGTTGCCCTTTTCCTTGACTATTACACTGCCTGGAGGATAGCAGAGAAGCCTGTCTGTACTTCATTCAAAAAGCCAAAATAGAGAGTATACAGTCCTAGAGAATTCCTCTATTTGTTCAGATCTCATAGATGACCCCCAGGTATTGTCTTTTGACATCCAGCAGTCCAAGGTATTGAGACATATTACTGGAAGTAAGAAATATTACTATAATTGAGAACTACAGCTTTTAAGATTGTACTTTTATCTTAAAAGGGTGGTAGTTTTCCCTAAAATACTTATTATGTAAGGGTCATTAGACAAATGTCTTGAAGTAGACATGGAATTTATGAATGGTTCTTTATCATTTCTCTTCCCCCTTTTTGGCATCCTGGCTTGCCTCCAGTTTTAGGTCCTTTAGTTTGCTTCTGTAAGCAACGGGAACACCTGCTGAGGGGGCTCTTTCCCTCATGTATACTTCAAGTAAGATCAAGAATCTTTTGTGAAATTATAGAAATTTACTATGTAAATGCTTGATGGAATTTTTTCCTGCTAGTGTAGCTTCTGAAAGGTGCTTTCTCCATTTATTTAAAACTACCCATGCAATTAAAAGGTACAATGCA
配列番号801:ヒトXBP1遺伝子
GCTGGGCGGCTGCGGCGCGCGGTGCGCGGTGCGTAGTCTGGAGCTATGGTGGTGGTGGCAGCCGCGCCGAACCCGGCCGACGGGACCCCTAAAGTTCTGCTTCTGTCGGGGCAGCCCGCCTCCGCCGCCGGAGCCCCGGCCGGCCAGGCCCTGCCGCTCATGGTGCCAGCCCAGAGAGGGGCCAGCCCGGAGGCAGCGAGCGGGGGGCTGCCCCAGGCGCGCAAGCGACAGCGCCTCACGCACCTGAGCCCCGAGGAGAAGGCGCTGAGGAGGTGGGCGAGGGGCCGGGGTCTGGGGCCAGATCTGAAGCCGGGACTAGGGACAGGGGCAGGGGCAGGGGCTGGGAGCGGGGACCCAGCACTGGCCGCCCCGCAGGGCTCCGTCGCCTTTGGCCTGGCGGGTCGGTGCCAGCGTGGCGCGGGGCGGGGCAGGAAGCCCGGACTGACCGGATCCGCCACGCTGGGAACCTAGGGCGGCCCAGGGCTCTTTTCTGTACTTTTTAACTCTCTCGTTAGAGATGACCAGAGCTGGGGATGCGGGCACCTGTCTTCCAGGCCCTCTTGCTGTGTGGCCGCAGACTGGTGGTTCAGCCTCTTAACTCGGACATGAGGTCGAATAATCTGTTTTGGTTTACTGCTATTTCTGGAGAGGCGCGGAGCTGAAATAACAGAGCTGTTGAAAGGGCTGGGAATTCTGCGAGGCTCACTGGTCTAGCTCAGTATCTGCGTTCTTAAAATGGAACCTACTTCATGAGGTCTTTGGGGAGATTGAGACTTGGATATAATGTGCCTAGCACTTAGTCCTCCGTAAATGTTCACTCTTTTGTGATCATTGTGCCTTCTGTGATTTATGAAGTGTCTCTTCTGAGTTAATTCTTTTAAAAAAAAAAGTGTCTCCTCCAACAGACACGGACCCATCAGCAGGTCACTGCCTAGGATCTCAACACTAGAGATCAGGGAGTGGCATCAGCCTCTCCCTTTTCTAAATTGGACTGGGGGACGGAGGGTTGATGTCATAGCAAGATTGCAGCCTTCACTAGATTAATGAGGCCAGGTTGGATCCTGTTTAAGAGAACTGGAGACAGGAAGCAGCGGGGGAATAGATGGGGAAAGAGGAAAGTTCCTTATGATGCAAGATGAATAGTGTGTGTGTCCAGCCCCAGTGCTGTGACGGGGATGAGTCTGAGGTGGACGGATGATGCAATATAGGAGAGAATAAAGCAGGTCTTCGAGCTAGATTGACAGAAGACTGTATTTTTTATTTTGTTTTATTGAGGGGAGGAGCCTGAAGTGTATTTTATCATTAGTCTGTCTTATACTGTAAATAAAAATGAAAGCACCAGCTGGTAAAGTTTTCAAATAAAGACATAAATAAGGTTTGATATGACTCAGTGTGGTATGTTCCTTCTCTTCCTAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCTCAGACTGCCAGAGATCGAAAGAAGGCTCGAATGAGTGAGCTGGAACAGCAAGTGGTAGATTTAGAAGAAGAGGTAAAACTACTTAAGGTCAAACTCTTTTATCCATTGTATACCCTTCCTTGGTGAATGTTCTGATATTTGCTTCCCATCCCAAGTTGTTTCAGCCCCTATTAGAATACAATTGAATATATGATTAAAAGTTAAACTAGGCTGGGCATGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGCCTGAGTTGGGCAGATCACTTGAAGCCAGCAGTTTGAGACCAGCCTAGCCAACATGGTAAAATCCCGTCTCTACCCAAAAATATACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCCAAGCGTGAGTGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGTTGAGGTGGGAGGATTGTTTGAACCTGGGAGAGGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCGCACCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGTGAGACTCTGTCTCAAGAAAAAAAAAAAAAGTTTGCTGGGCACCGGGGCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGTGGGTAGATAACTTGAGATCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGACCAACGTGGTGAAACCCCATCTCTATTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGTGTCGTGGCAGGCACCTGTAATCCCAGCTGCTCCGGAGGCTGACGCAGGAGAATCACTTGAACCCAGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCACGAGATCATGCCACTGCACTCCAGTCTGGGCGACAGAGCAAAAACCCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGTTAATCTAAGTTAGGACAGAGAGTTGGTGAAGTGGTGAAGCTTGTTGAGGGCAGAAGTGATTGACTTTGTGGCATTTGGTGCTAGATGTATCTCAAAGTAGATGGATTTAACAATGTTTATTGAGTTTGTAGTAAGAAATTAGCAAGGGCTAATAGGAAATAATTGCTTAAACTTTACATTCTTCCTGGCATGGCCAGAAATTCACTAAAGGTTCCTTTCCCCCTCTAGGGTCCACCTGTTAATCAATCTTAAATTGTTGCCAATTACACATCTTGAATACATAGAGATTATTTATATTGTTTTTTTAACCCCTTGGTCAATTTGCATATATTGAGCTTTTTAAAGTTTTAATCATTAGTTGGTTCTTCTAAGAATCATGAGTCAGGAGCAGGGATTTTTTTTAACTTATTTTGGATTTATAGTCACCACTACCACTTTTATTATTACCTGCCAGTTCAAGATAGTTATTTATTTTTATTTTATATTATTATTATTATTATTATCATCATCATTATTTTGAGATGGAGTCTCACTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCAATCTCGGCTCACTGCAACCTCTGCCTCCCAGGTTCAAGCAATTCTCCCTGCTTCAGCCTCCAGATTAGCTGGGATTACAGGCACCCCTCACCACATCCAGCTAATTTTTGGATTTTTTAGTAGAGATGGGGGTTTGCCATGTTGGCCAGGCTGGTTTTGAACTCTTGACCTCAGGTGATCCACCTGCCTTGGCCTCCCAAAGTGTTAGGATTACAAGTGTGAGCCACCGAGCCTGGCCAAGATAGTTTAAAAAAAAAATTATATCTACATTAAAGCCACAAGTCACCCTTTGCTGAAGTCAGTATTAGTAGTTGGAAGCAGTGTGTTATTCTTGACCCCATGAAGTGGCACTTATTAAGTAGCTTGCTTTTCCATAATTATGGCCTAGCTTTTTAAAACCTACTATGAACACCACAAGCATAGAGTTTTCCAAAAGTTCAAGAAGGAAAGGAAACCAATTATACTGAATCAGGTAGATTCTTAACTGAAATAATTAGATGTTTTAATAGCCTCTTATGAACTTTCTTCCAGAACCAAAAACTTTTGCTAGAAAATCAGCTTTTACGAGAGAAAACTCATGGCCTTGTAGTTGAGAACCAGGAGTTAAGACAGCGCTTGGGGATGGATGCCCTGGTTGCTGAAGAGGAGGCGGAAGCCAAGGTAAATCATCTCCTTTATTTGGTGCCTCATGTGAGTACTGGTTCCAAGTGACATGACCCAGCGATTATGTTTACAGTCTGGACTTCTGATCAAGAGCGTTCTTGAAATTTTCCTTCAGTTTTAAGACATTTTCATGCAGGCAGAGTGTTCTTCCCCTAAAGGCACTTGACACTCATTTTTTAAGTGTGTAGTGAACAGTACTAAGATCTAATAATGAAAACAAGTTACATGGCTCCCTAAGAACAAGTACTAACAAATGCAGTAGCCAACAAGATTACCATGCAATCATTAAGGAGAACCAAAGTAAGAGAGCCACTCAAACCAGATTTTGAACGCTACTAAAATTAAAGTAGTTCTTTGATGAATATGAATGAGTAGGGAAAGGATTCTTTGTAATAGTGATACCTCTGTGGTAAGAGAAGGGTGGTATGTGAGTTTTAGTCTACAGATTATGGCAAATTCAGTGACAACAATCAAATGGTCTAAGATTGACAGTAGCACAGTTTTACTCTGTGAAGGTAATGTTCAGGACAAATTTCAAGAAAACTAGAAAACCATTCTTTACAGCTGAAATCTTTCCCTAACCATTGTTATTTCCACTTTTAAGTCCTCAAGAGATGAGAAAAGGGAGGTAAGGCTTCCTTATACATTTCCTGCACAATGAAACATTTTTCCTCCTCCAGGCAAAGATTCAAGCAGAACTGGCAAATATCTTATCTTGCTCTTCTCAATAATAATAATGTTGTTAGATAATAAAGTTCTATAGCAATTTAACCCTAGAATCTTTTTGAAAAGTAATTCTTTAAAGTTGAGAATCACAGCTGTCTAGCAAGCATTTCCTTGGGCACTTGAAGCTGTTTATTCACTTTGGTCTTTCCTCCCAGGGGAATGAAGTGAGGCCAGTGGCCGGGTCTGCTGAGTCCGCAGCACTCAGACTACGTGCACCTCTGCAGCAGGTGCAGGCCCAGTTGTCACCCCTCCAGAACATCTCCCCATGGATTCTGGCGGTATTGACTCTTCAGATTCAGAGGTAGGGATCATTCTGACTTATTAAAGAGCTATATAACCAGTTAATTCCATCTGTTTGATGCTTGACATCCCTAACTAGACAGATGAGGGTTGAAGTTAGTTTTTGGTGGGGTTGGAGGTGAACATCAACTACCTTCCTAGTTCCAGGTAATATAGAACATGGAGTGAAGTGTAGATAAATGGGTCTGGTGGGTCCCGAGGTCATCTTATCACATAATGACTAATTTACATTATGGAACCCAGTACAAAGTGTTCCAGTTAGATTTTCCATTGTATTCTGACAGTTGTACTTCATTTAATTTTTGCCTCTTACAGTCTGATATCCTGTTGGGCATTCTGGACAACTTGGACCCAGTCATGTTCTTCAAATGCCCTTCCCCAGAGCCTGCCAGCCTGGAGGAGCTCCCAGAGGTCTACCCAGAAGGACCCAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACGTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTAATTCGTTTTGACCACATATATACCAAGCCCCTAGTCTTAGAGATACCCTCTGAGACAGAGAGCCAAGCTAATGTGGTAGTGAAAATCGAGGAA
GCACCTCTCAGCCCCTCAGAGAATGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGGAAGAACCTGTAGAAGATGACCTCGTTCCGGAGCTGGGTATCTCAAATCTGCTTTCATCCAGCCACTGCCCAAAGCCATCTTCCTGCCTACTGGATGCTTACAGTGACTGTGGATACGGGGGTTCCCTTTCCCCATTCAGTGACATGTCCTCTCTGCTTGGTGTAAACCATTCTTGGGAGGACACTTTTGCCAATGAACTCTTTCCCCAGCTGATTAGTGTCTAAGGAATGATCCAATACTGTTGCCCTTTTCCTTGACTATTACACTGCCTGGAGGATAGCAGAGAAGCCTGTCTGTACTTCATTCAAAAAGCCAAAATAGAGAGTATACAGTCCTAGAGAATTCCTCTATTTGTTCAGATCTCATAGATGACCCCCAGGTATTGTCTTTTGACATCCAGCAGTCCAAGGTATTGAGACATATTACTGGAAGTAAGAAATATTACTATAATTGAGAACTACAGCTTTTAAGATTGTACTTTTATCTTAAAAGGGTGGTAGTTTTCCCTAAAATACTTATTATGTAAGGGTCATTAGACAAATGTCTTGAAGTAGACATGGAATTTATGAATGGTTCTTTATCATTTCTCTTCCCCCTTTTTGGCATCCTGGCTTGCCTCCAGTTTTAGGTCCTTTAGTTTGCTTCTGTAAGCAACGGGAACACCTGCTGAGGGGGCTCTTTCCCTCATGTATACTTCAAGTAAGATCAAGAATCTTTTGTGAAATTATAGAAATTTACTATGTAAATGCTTGATGGAATTTTTTCCTGCTAGTGTAGCTTCTGAAAGGTGCTTTCTCCATTTATTTAAAACTACCCATGCAATTAAAAGGTACAATGCA
配列番号802:ヒトX-box結合タンパク質1(XBP1)、転写バリアント1、mRNA(IRE1によってプロセシングされていない)
GCTGGGCGGCTGCGGCGCGCGGTGCGCGGTGCGTAGTCTGGAGCTATGGTGGTGGTGGCAGCCGCGCCGAACCCGGCCGACGGGACCCCTAAAGTTCTGCTTCTGTCGGGGCAGCCCGCCTCCGCCGCCGGAGCCCCGGCCGGCCAGGCCCTGCCGCTCATGGTGCCAGCCCAGAGAGGGGCCAGCCCGGAGGCAGCGAGCGGGGGGCTGCCCCAGGCGCGCAAGCGACAGCGCCTCACGCACCTGAGCCCCGAGGAGAAGGCGCTGAGGAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCTCAGACTGCCAGAGATCGAAAGAAGGCTCGAATGAGTGAGCTGGAACAGCAAGTGGTAGATTTAGAAGAAGAGAACCAAAAACTTTTGCTAGAAAATCAGCTTTTACGAGAGAAAACTCATGGCCTTGTAGTTGAGAACCAGGAGTTAAGACAGCGCTTGGGGATGGATGCCCTGGTTGCTGAAGAGGAGGCGGAAGCCAAGGGGAATGAAGTGAGGCCAGTGGCCGGGTCTGCTGAGTCCGCAGCACTCAGACTACGTGCACCTCTGCAGCAGGTGCAGGCCCAGTTGTCACCCCTCCAGAACATCTCCCCATGGATTCTGGCGGTATTGACTCTTCAGATTCAGAGTCTGATATCCTGTTGGGCATTCTGGACAACTTGGACCCAGTCATGTTCTTCAAATGCCCTTCCCCAGAGCCTGCCAGCCTGGAGGAGCTCCCAGAGGTCTACCCAGAAGGACCCAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACGTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTAATTCGTTTTGACCACATATATACCAAGCCCCTAGTCTTAGAGATACCCTCTGAGACAGAGAGCCAAGCTAATGTGGTAGTGAAAATCGAGGAAGCACCTCTCAGCCCCTCAGAGAATGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGGAAGAACCTGTAGAAGATGACCTCGTTCCGGAGCTGGGTATCTCAAATCTGCTTTCATCCAGCCACTGCCCAAAGCCATCTTCCTGCCTACTGGATGCTTACAGTGACTGTGGATACGGGGGTTCCCTTTCCCCATTCAGTGACATGTCCTCTCTGCTTGGTGTAAACCATTCTTGGGAGGACACTTTTGCCAATGAACTCTTTCCCCAGCTGATTAGTGTCTAAGGAATGATCCAATACTGTTGCCCTTTTCCTTGACTATTACACTGCCTGGAGGATAGCAGAGAAGCCTGTCTGTACTTCATTCAAAAAGCCAAAATAGAGAGTATACAGTCCTAGAGAATTCCTCTATTTGTTCAGATCTCATAGATGACCCCCAGGTATTGTCTTTTGACATCCAGCAGTCCAAGGTATTGAGACATATTACTGGAAGTAAGAAATATTACTATAATTGAGAACTACAGCTTTTAAGATTGTACTTTTATCTTAAAAGGGTGGTAGTTTTCCCTAAAATACTTATTATGTAAGGGTCATTAGACAAATGTCTTGAAGTAGACATGGAATTTATGAATGGTTCTTTATCATTTCTCTTCCCCCTTTTTGGCATCCTGGCTTGCCTCCAGTTTTAGGTCCTTTAGTTTGCTTCTGTAAGCAACGGGAACACCTGCTGAGGGGGCTCTTTCCCTCATGTATACTTCAAGTAAGATCAAGAATCTTTTGTGAAATTATAGAAATTTACTATGTAAATGCTTGATGGAATTTTTTCCTGCTAGTGTAGCTTCTGAAAGGTGCTTTCTCCATTTATTTAAAACTACCCATGCAATTAAAAGGTACAATGCA
GCTGGGCGGCTGCGGCGCGCGGTGCGCGGTGCGTAGTCTGGAGCTATGGTGGTGGTGGCAGCCGCGCCGAACCCGGCCGACGGGACCCCTAAAGTTCTGCTTCTGTCGGGGCAGCCCGCCTCCGCCGCCGGAGCCCCGGCCGGCCAGGCCCTGCCGCTCATGGTGCCAGCCCAGAGAGGGGCCAGCCCGGAGGCAGCGAGCGGGGGGCTGCCCCAGGCGCGCAAGCGACAGCGCCTCACGCACCTGAGCCCCGAGGAGAAGGCGCTGAGGAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCTCAGACTGCCAGAGATCGAAAGAAGGCTCGAATGAGTGAGCTGGAACAGCAAGTGGTAGATTTAGAAGAAGAGAACCAAAAACTTTTGCTAGAAAATCAGCTTTTACGAGAGAAAACTCATGGCCTTGTAGTTGAGAACCAGGAGTTAAGACAGCGCTTGGGGATGGATGCCCTGGTTGCTGAAGAGGAGGCGGAAGCCAAGGGGAATGAAGTGAGGCCAGTGGCCGGGTCTGCTGAGTCCGCAGCACTCAGACTACGTGCACCTCTGCAGCAGGTGCAGGCCCAGTTGTCACCCCTCCAGAACATCTCCCCATGGATTCTGGCGGTATTGACTCTTCAGATTCAGAGTCTGATATCCTGTTGGGCATTCTGGACAACTTGGACCCAGTCATGTTCTTCAAATGCCCTTCCCCAGAGCCTGCCAGCCTGGAGGAGCTCCCAGAGGTCTACCCAGAAGGACCCAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACGTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTAATTCGTTTTGACCACATATATACCAAGCCCCTAGTCTTAGAGATACCCTCTGAGACAGAGAGCCAAGCTAATGTGGTAGTGAAAATCGAGGAAGCACCTCTCAGCCCCTCAGAGAATGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGGAAGAACCTGTAGAAGATGACCTCGTTCCGGAGCTGGGTATCTCAAATCTGCTTTCATCCAGCCACTGCCCAAAGCCATCTTCCTGCCTACTGGATGCTTACAGTGACTGTGGATACGGGGGTTCCCTTTCCCCATTCAGTGACATGTCCTCTCTGCTTGGTGTAAACCATTCTTGGGAGGACACTTTTGCCAATGAACTCTTTCCCCAGCTGATTAGTGTCTAAGGAATGATCCAATACTGTTGCCCTTTTCCTTGACTATTACACTGCCTGGAGGATAGCAGAGAAGCCTGTCTGTACTTCATTCAAAAAGCCAAAATAGAGAGTATACAGTCCTAGAGAATTCCTCTATTTGTTCAGATCTCATAGATGACCCCCAGGTATTGTCTTTTGACATCCAGCAGTCCAAGGTATTGAGACATATTACTGGAAGTAAGAAATATTACTATAATTGAGAACTACAGCTTTTAAGATTGTACTTTTATCTTAAAAGGGTGGTAGTTTTCCCTAAAATACTTATTATGTAAGGGTCATTAGACAAATGTCTTGAAGTAGACATGGAATTTATGAATGGTTCTTTATCATTTCTCTTCCCCCTTTTTGGCATCCTGGCTTGCCTCCAGTTTTAGGTCCTTTAGTTTGCTTCTGTAAGCAACGGGAACACCTGCTGAGGGGGCTCTTTCCCTCATGTATACTTCAAGTAAGATCAAGAATCTTTTGTGAAATTATAGAAATTTACTATGTAAATGCTTGATGGAATTTTTTCCTGCTAGTGTAGCTTCTGAAAGGTGCTTTCTCCATTTATTTAAAACTACCCATGCAATTAAAAGGTACAATGCA
配列番号803:ヒトX-box結合タンパク質1アイソフォームXBP1(U)
MVVVAAAPNPADGTPKVLLLSGQPASAAGAPAGQALPLMVPAQRGASPEAASGGLPQARKRQRLTHLSPEEKALRRKLKNRVAAQTARDRKKARMSELEQQVVDLEEENQKLLLENQLLREKTHGLVVENQELRQRLGMDALVAEEEAEAKGNEVRPVAGSAESAALRLRAPLQQVQAQLSPLQNISPWILAVLTLQIQSLISCWAFWTTWTQSCSSNALPQSLPAWRSSQRSTQKDPVPYQPPFLCQWGRHQPSWKPLMN
MVVVAAAPNPADGTPKVLLLSGQPASAAGAPAGQALPLMVPAQRGASPEAASGGLPQARKRQRLTHLSPEEKALRRKLKNRVAAQTARDRKKARMSELEQQVVDLEEENQKLLLENQLLREKTHGLVVENQELRQRLGMDALVAEEEAEAKGNEVRPVAGSAESAALRLRAPLQQVQAQLSPLQNISPWILAVLTLQIQSLISCWAFWTTWTQSCSSNALPQSLPAWRSSQRSTQKDPVPYQPPFLCQWGRHQPSWKPLMN
配列番号804:ヒトX-box結合タンパク質1(XBP1)、転写バリアント2、mRNA(IRE1によってプロセシングされた)
GCTGGGCGGCTGCGGCGCGCGGTGCGCGGTGCGTAGTCTGGAGCTATGGTGGTGGTGGCAGCCGCGCCGAACCCGGCCGACGGGACCCCTAAAGTTCTGCTTCTGTCGGGGCAGCCCGCCTCCGCCGCCGGAGCCCCGGCCGGCCAGGCCCTGCCGCTCATGGTGCCAGCCCAGAGAGGGGCCAGCCCGGAGGCAGCGAGCGGGGGGCTGCCCCAGGCGCGCAAGCGACAGCGCCTCACGCACCTGAGCCCCGAGGAGAAGGCGCTGAGGAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCTCAGACTGCCAGAGATCGAAAGAAGGCTCGAATGAGTGAGCTGGAACAGCAAGTGGTAGATTTAGAAGAAGAGAACCAAAAACTTTTGCTAGAAAATCAGCTTTTACGAGAGAAAACTCATGGCCTTGTAGTTGAGAACCAGGAGTTAAGACAGCGCTTGGGGATGGATGCCCTGGTTGCTGAAGAGGAGGCGGAAGCCAAGGGGAATGAAGTGAGGCCAGTGGCCGGGTCTGCTGAGTCCGCAGCAGGTGCAGGCCCAGTTGTCACCCCTCCAGAACATCTCCCCATGGATTCTGGCGGTATTGACTCTTCAGATTCAGAGTCTGATATCCTGTTGGGCATTCTGGACAACTTGGACCCAGTCATGTTCTTCAAATGCCCTTCCCCAGAGCCTGCCAGCCTGGAGGAGCTCCCAGAGGTCTACCCAGAAGGACCCAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACGTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTAATTCGTTTTGACCACATATATACCAAGCCCCTAGTCTTAGAGATACCCTCTGAGACAGAGAGCCAAGCTAATGTGGTAGTGAAAATCGAGGAAGCACCTCTCAGCCCCTCAGAGAATGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGGAAGAACCTGTAGAAGATGACCTCGTTCCGGAGCTGGGTATCTCAAATCTGCTTTCATCCAGCCACTGCCCAAAGCCATCTTCCTGCCTACTGGATGCTTACAGTGACTGTGGATACGGGGGTTCCCTTTCCCCATTCAGTGACATGTCCTCTCTGCTTGGTGTAAACCATTCTTGGGAGGACACTTTTGCCAATGAACTCTTTCCCCAGCTGATTAGTGTCTAAGGAATGATCCAATACTGTTGCCCTTTTCCTTGACTATTACACTGCCTGGAGGATAGCAGAGAAGCCTGTCTGTACTTCATTCAAAAAGCCAAAATAGAGAGTATACAGTCCTAGAGAATTCCTCTATTTGTTCAGATCTCATAGATGACCCCCAGGTATTGTCTTTTGACATCCAGCAGTCCAAGGTATTGAGACATATTACTGGAAGTAAGAAATATTACTATAATTGAGAACTACAGCTTTTAAGATTGTACTTTTATCTTAAAAGGGTGGTAGTTTTCCCTAAAATACTTATTATGTAAGGGTCATTAGACAAATGTCTTGAAGTAGACATGGAATTTATGAATGGTTCTTTATCATTTCTCTTCCCCCTTTTTGGCATCCTGGCTTGCCTCCAGTTTTAGGTCCTTTAGTTTGCTTCTGTAAGCAACGGGAACACCTGCTGAGGGGGCTCTTTCCCTCATGTATACTTCAAGTAAGATCAAGAATCTTTTGTGAAATTATAGAAATTTACTATGTAAATGCTTGATGGAATTTTTTCCTGCTAGTGTAGCTTCTGAAAGGTGCTTTCTCCATTTATTTAAAACTACCCATGCAATTAAAAGGTACAATGCA
GCTGGGCGGCTGCGGCGCGCGGTGCGCGGTGCGTAGTCTGGAGCTATGGTGGTGGTGGCAGCCGCGCCGAACCCGGCCGACGGGACCCCTAAAGTTCTGCTTCTGTCGGGGCAGCCCGCCTCCGCCGCCGGAGCCCCGGCCGGCCAGGCCCTGCCGCTCATGGTGCCAGCCCAGAGAGGGGCCAGCCCGGAGGCAGCGAGCGGGGGGCTGCCCCAGGCGCGCAAGCGACAGCGCCTCACGCACCTGAGCCCCGAGGAGAAGGCGCTGAGGAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCTCAGACTGCCAGAGATCGAAAGAAGGCTCGAATGAGTGAGCTGGAACAGCAAGTGGTAGATTTAGAAGAAGAGAACCAAAAACTTTTGCTAGAAAATCAGCTTTTACGAGAGAAAACTCATGGCCTTGTAGTTGAGAACCAGGAGTTAAGACAGCGCTTGGGGATGGATGCCCTGGTTGCTGAAGAGGAGGCGGAAGCCAAGGGGAATGAAGTGAGGCCAGTGGCCGGGTCTGCTGAGTCCGCAGCAGGTGCAGGCCCAGTTGTCACCCCTCCAGAACATCTCCCCATGGATTCTGGCGGTATTGACTCTTCAGATTCAGAGTCTGATATCCTGTTGGGCATTCTGGACAACTTGGACCCAGTCATGTTCTTCAAATGCCCTTCCCCAGAGCCTGCCAGCCTGGAGGAGCTCCCAGAGGTCTACCCAGAAGGACCCAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACGTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTAATTCGTTTTGACCACATATATACCAAGCCCCTAGTCTTAGAGATACCCTCTGAGACAGAGAGCCAAGCTAATGTGGTAGTGAAAATCGAGGAAGCACCTCTCAGCCCCTCAGAGAATGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGGAAGAACCTGTAGAAGATGACCTCGTTCCGGAGCTGGGTATCTCAAATCTGCTTTCATCCAGCCACTGCCCAAAGCCATCTTCCTGCCTACTGGATGCTTACAGTGACTGTGGATACGGGGGTTCCCTTTCCCCATTCAGTGACATGTCCTCTCTGCTTGGTGTAAACCATTCTTGGGAGGACACTTTTGCCAATGAACTCTTTCCCCAGCTGATTAGTGTCTAAGGAATGATCCAATACTGTTGCCCTTTTCCTTGACTATTACACTGCCTGGAGGATAGCAGAGAAGCCTGTCTGTACTTCATTCAAAAAGCCAAAATAGAGAGTATACAGTCCTAGAGAATTCCTCTATTTGTTCAGATCTCATAGATGACCCCCAGGTATTGTCTTTTGACATCCAGCAGTCCAAGGTATTGAGACATATTACTGGAAGTAAGAAATATTACTATAATTGAGAACTACAGCTTTTAAGATTGTACTTTTATCTTAAAAGGGTGGTAGTTTTCCCTAAAATACTTATTATGTAAGGGTCATTAGACAAATGTCTTGAAGTAGACATGGAATTTATGAATGGTTCTTTATCATTTCTCTTCCCCCTTTTTGGCATCCTGGCTTGCCTCCAGTTTTAGGTCCTTTAGTTTGCTTCTGTAAGCAACGGGAACACCTGCTGAGGGGGCTCTTTCCCTCATGTATACTTCAAGTAAGATCAAGAATCTTTTGTGAAATTATAGAAATTTACTATGTAAATGCTTGATGGAATTTTTTCCTGCTAGTGTAGCTTCTGAAAGGTGCTTTCTCCATTTATTTAAAACTACCCATGCAATTAAAAGGTACAATGCA
配列番号805:ヒトX-box結合タンパク質1アイソフォームXBP1(S)
MVVVAAAPNPADGTPKVLLLSGQPASAAGAPAGQALPLMVPAQRGASPEAASGGLPQARKRQRLTHLSPEEKALRRKLKNRVAAQTARDRKKARMSELEQQVVDLEEENQKLLLENQLLREKTHGLVVENQELRQRLGMDALVAEEEAEAKGNEVRPVAGSAESAAGAGPVVTPPEHLPMDSGGIDSSDSESDILLGILDNLDPVMFFKCPSPEPASLEELPEVYPEGPSSLPASLSLSVGTSSAKLEAINELIRFDHIYTKPLVLEIPSETESQANVVVKIEEAPLSPSENDHPEFIVSVKEEPVEDDLVPELGISNLLSSSHCPKPSSCLLDAYSDCGYGGSLSPFSDMSSLLGVNHSWEDTFANELFPQLISV
MVVVAAAPNPADGTPKVLLLSGQPASAAGAPAGQALPLMVPAQRGASPEAASGGLPQARKRQRLTHLSPEEKALRRKLKNRVAAQTARDRKKARMSELEQQVVDLEEENQKLLLENQLLREKTHGLVVENQELRQRLGMDALVAEEEAEAKGNEVRPVAGSAESAAGAGPVVTPPEHLPMDSGGIDSSDSESDILLGILDNLDPVMFFKCPSPEPASLEELPEVYPEGPSSLPASLSLSVGTSSAKLEAINELIRFDHIYTKPLVLEIPSETESQANVVVKIEEAPLSPSENDHPEFIVSVKEEPVEDDLVPELGISNLLSSSHCPKPSSCLLDAYSDCGYGGSLSPFSDMSSLLGVNHSWEDTFANELFPQLISV
配列番号806:ヒトX-box結合タンパク質1(XBP1)デルタ4バリアント
GCTGGGCGGCTGCGGCGCGCGGTGCGCGGTGCGTAGTCTGGAGCTATGGTGGTGGTGGCAGCCGCGCCGAACCCGGCCGACGGGACCCCTAAAGTTCTGCTTCTGTCGGGGCAGCCCGCCTCCGCCGCCGGAGCCCCGGCCGGCCAGGCCCTGCCGCTCATGGTGCCAGCCCAGAGAGGGGCCAGCCCGGAGGCAGCGAGCGGGGGGCTGCCCCAGGCGCGCAAGCGACAGCGCCTCACGCACCTGAGCCCCGAGGAGAAGGCGCTGAGGAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCTCAGACTGCCAGAGATCGAAAGAAGGCTCGAATGAGTGAGCTGGAACAGCAAGTGGTAGATTTAGAAGAAGAGAACCAAAAACTTTTGCTAGAAAATCAGCTTTTACGAGAGAAAACTCATGGCCTTGTAGTTGAGAACCAGGAGTTAAGACAGCGCTTGGGGATGGATGCCCTGGTTGCTGAAGAGGAGGCGGAAGCCAAGTCTGATATCCTGTTGGGCATTCTGGACAACTTGGACCCAGTCATGTTCTTCAAATGCCCTTCCCCAGAGCCTGCCAGCCTGGAGGAGCTCCCAGAGGTCTACCCAGAAGGACCCAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACGTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTAATTCGTTTTGACCACATATATACCAAGCCCCTAGTCTTAGAGATACCCTCTGAGACAGAGAGCCAAGCTAATGTGGTAGTGAAAATCGAGGAAGCACCTCTCAGCCCCTCAGAGAATGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGGAAGAACCTGTAGAAGATGACCTCGTTCCGGAGCTGGGTATCTCAAATCTGCTTTCATCCAGCCACTGCCCAAAGCCATCTTCCTGCCTACTGGATGCTTACAGTGACTGTGGATACGGGGGTTCCCTTTCCCCATTCAGTGACATGTCCTCTCTGCTTGGTGTAAACCATTCTTGGGAGGACACTTTTGCCAATGAACTCTTTCCCCAGCTGATTAGTGTCTAAGGAATGATCCAATACTGTTGCCCTTTTCCTTGACTATTACACTGCCTGGAGGATAGCAGAGAAGCCTGTCTGTACTTCATTCAAAAAGCCAAAATAGAGAGTATACAGTCCTAGAGAATTCCTCTATTTGTTCAGATCTCATAGATGACCCCCAGGTATTGTCTTTTGACATCCAGCAGTCCAAGGTATTGAGACATATTACTGGAAGTAAGAAATATTACTATAATTGAGAACTACAGCTTTTAAGATTGTACTTTTATCTTAAAAGGGTGGTAGTTTTCCCTAAAATACTTATTATGTAAGGGTCATTAGACAAATGTCTTGAAGTAGACATGGAATTTATGAATGGTTCTTTATCATTTCTCTTCCCCCTTTTTGGCATCCTGGCTTGCCTCCAGTTTTAGGTCCTTTAGTTTGCTTCTGTAAGCAACGGGAACACCTGCTGAGGGGGCTCTTTCCCTCATGTATACTTCAAGTAAGATCAAGAATCTTTTGTGAAATTATAGAAATTTACTATGTAAATGCTTGATGGAATTTTTTCCTGCTAGTGTAGCTTCTGAAAGGTGCTTTCTCCATTTATTTAAAACTACCCATGCAATTAAAAGGTACAATGCA
GCTGGGCGGCTGCGGCGCGCGGTGCGCGGTGCGTAGTCTGGAGCTATGGTGGTGGTGGCAGCCGCGCCGAACCCGGCCGACGGGACCCCTAAAGTTCTGCTTCTGTCGGGGCAGCCCGCCTCCGCCGCCGGAGCCCCGGCCGGCCAGGCCCTGCCGCTCATGGTGCCAGCCCAGAGAGGGGCCAGCCCGGAGGCAGCGAGCGGGGGGCTGCCCCAGGCGCGCAAGCGACAGCGCCTCACGCACCTGAGCCCCGAGGAGAAGGCGCTGAGGAGGAAACTGAAAAACAGAGTAGCAGCTCAGACTGCCAGAGATCGAAAGAAGGCTCGAATGAGTGAGCTGGAACAGCAAGTGGTAGATTTAGAAGAAGAGAACCAAAAACTTTTGCTAGAAAATCAGCTTTTACGAGAGAAAACTCATGGCCTTGTAGTTGAGAACCAGGAGTTAAGACAGCGCTTGGGGATGGATGCCCTGGTTGCTGAAGAGGAGGCGGAAGCCAAGTCTGATATCCTGTTGGGCATTCTGGACAACTTGGACCCAGTCATGTTCTTCAAATGCCCTTCCCCAGAGCCTGCCAGCCTGGAGGAGCTCCCAGAGGTCTACCCAGAAGGACCCAGTTCCTTACCAGCCTCCCTTTCTCTGTCAGTGGGGACGTCATCAGCCAAGCTGGAAGCCATTAATGAACTAATTCGTTTTGACCACATATATACCAAGCCCCTAGTCTTAGAGATACCCTCTGAGACAGAGAGCCAAGCTAATGTGGTAGTGAAAATCGAGGAAGCACCTCTCAGCCCCTCAGAGAATGATCACCCTGAATTCATTGTCTCAGTGAAGGAAGAACCTGTAGAAGATGACCTCGTTCCGGAGCTGGGTATCTCAAATCTGCTTTCATCCAGCCACTGCCCAAAGCCATCTTCCTGCCTACTGGATGCTTACAGTGACTGTGGATACGGGGGTTCCCTTTCCCCATTCAGTGACATGTCCTCTCTGCTTGGTGTAAACCATTCTTGGGAGGACACTTTTGCCAATGAACTCTTTCCCCAGCTGATTAGTGTCTAAGGAATGATCCAATACTGTTGCCCTTTTCCTTGACTATTACACTGCCTGGAGGATAGCAGAGAAGCCTGTCTGTACTTCATTCAAAAAGCCAAAATAGAGAGTATACAGTCCTAGAGAATTCCTCTATTTGTTCAGATCTCATAGATGACCCCCAGGTATTGTCTTTTGACATCCAGCAGTCCAAGGTATTGAGACATATTACTGGAAGTAAGAAATATTACTATAATTGAGAACTACAGCTTTTAAGATTGTACTTTTATCTTAAAAGGGTGGTAGTTTTCCCTAAAATACTTATTATGTAAGGGTCATTAGACAAATGTCTTGAAGTAGACATGGAATTTATGAATGGTTCTTTATCATTTCTCTTCCCCCTTTTTGGCATCCTGGCTTGCCTCCAGTTTTAGGTCCTTTAGTTTGCTTCTGTAAGCAACGGGAACACCTGCTGAGGGGGCTCTTTCCCTCATGTATACTTCAAGTAAGATCAAGAATCTTTTGTGAAATTATAGAAATTTACTATGTAAATGCTTGATGGAATTTTTTCCTGCTAGTGTAGCTTCTGAAAGGTGCTTTCTCCATTTATTTAAAACTACCCATGCAATTAAAAGGTACAATGCA
配列番号807:XBP1デルタ4 mRNA転写物(配列番号562)由来のヒト予測アミノ酸配列
MVVVAAAPNPADGTPKVLLLSGQPASAAGAPAGQALPLMVPAQRGASPEAASGGLPQARKRQRLTHLSPEEKALRRKLKNRVAAQTARDRKKARMSELEQQVVDLEEENQKLLLENQLLREKTHGLVVENQELRQRLGMDALVAEEEAEAKSDILLGILDNLDPVMFFKCPSPEPASLEELPEVYPEGPSSLPASLSLSVGTSSAKLEAINELIRFDHIYTKPLVLEIPSETESQANVVVKIEEAPLSPSENDHPEFIVSVKEEPVEDDLVPELGISNLLSSSHCPKPSSCLLDAYSDCGYGGSLSPFSDMSSLLGVNHSWEDTFANELFPQLISV
MVVVAAAPNPADGTPKVLLLSGQPASAAGAPAGQALPLMVPAQRGASPEAASGGLPQARKRQRLTHLSPEEKALRRKLKNRVAAQTARDRKKARMSELEQQVVDLEEENQKLLLENQLLREKTHGLVVENQELRQRLGMDALVAEEEAEAKSDILLGILDNLDPVMFFKCPSPEPASLEELPEVYPEGPSSLPASLSLSVGTSSAKLEAINELIRFDHIYTKPLVLEIPSETESQANVVVKIEEAPLSPSENDHPEFIVSVKEEPVEDDLVPELGISNLLSSSHCPKPSSCLLDAYSDCGYGGSLSPFSDMSSLLGVNHSWEDTFANELFPQLISV
Claims (15)
- 多量体ポリペプチドを組換え産生するための方法であって、
a)XBP1を発現しておりかつ前記多量体ポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、
b)前記細胞または培養培地から前記多量体ポリペプチドを回収する工程と
を含み、
前記培養が、XBP1バリアントXBP1Δ4の形成を誘導しているアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下で行われることを特徴とする、
方法。 - a1)XBP1を発現しておりかつ前記ポリペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を、前記XBP1バリアントXBP1Δ4の形成を誘導しているアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む培養培地中で増殖させて、第1の細胞集団を得る工程と、
a2)前記第1の細胞集団のアリコートを培養培地と混合して、第2の細胞集団を得る工程であって、前記培養培地が、前記XBP1バリアントXBP1Δ4の形成を誘導している前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを任意に含む、第2の細胞集団を得る工程と、
a3)前記第2の細胞集団を培養して、第3の細胞集団を得る工程と、
b)前記第3の細胞培養の前記細胞および/または前記培養培地から前記ポリペプチドを回収する工程と
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが8~40ヌクレオチド長であり、かつ哺乳動物XBP1プレmRNA転写物に相補的な8~40ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項1~2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記連続ヌクレオチド配列が、ハムスターXBP1プレmRNA転写物(配列番号1)の少なくとも10個の連続ヌクレオチドに相補的であることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号45、配列番号46、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号110、配列番号111、配列番号128、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号158、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号229、配列番号281、配列番号282、配列番号285、配列番号286、配列番号297および配列番号298からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記連続ヌクレオチド配列が、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ長さであることを特徴とする、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、1つ以上の修飾ヌクレオチドまたは1つ以上の修飾ヌクレオシドを含むことを特徴とする、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、1つ以上の修飾ヌクレオシド、例えば、2’-O-アルキル-RNA、2’-O-メチルRNA(2’-OMe)、2’-アルコキシ-RNA、2’-O-メトキシエチル-RNA(2’-MOE)、2’-アミノ-DNA、2’-フルロ-RNA、2’-フルオロ-DNA、アラビノ核酸(ANA)、2’-フルオロ-ANA、二環式ヌクレオシド類似体(LNA)、またはそれらの任意の組合せからなる群から独立して選択される1つ以上の修飾ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの前記連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合のうちの1つ以上が修飾されていることを特徴とする、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド内の少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または約100%の前記ヌクレオシド間結合が修飾されていることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、25μM以上の最終濃度まで添加されることを特徴とする、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養が、1×10E6~2×10E6細胞/mLの開始細胞密度で行われることを特徴とする、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記開始細胞密度が約2×10E6細胞/mLであることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞がCHO細胞であることを特徴とする、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多量体ポリペプチドが抗体であることを特徴とする、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
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AU2003234198A1 (en) | 2002-04-22 | 2003-11-03 | University Of Michigan | Novel genes, compositions, and methods for modulating the unfolded protein response |
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CA2528418A1 (en) * | 2003-06-11 | 2004-12-23 | Biogen Idec Ma Inc. | Method to increase protein production in culture |
US7514237B2 (en) * | 2004-09-02 | 2009-04-07 | Wyeth | Systems and methods for protein production |
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US8592562B2 (en) | 2008-01-07 | 2013-11-26 | Amgen Inc. | Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects |
WO2010008860A1 (en) * | 2008-06-23 | 2010-01-21 | President And Fellows Of Harvard College | Modulation of neurodegenerative disease by modulating xbp-1 activity |
WO2010036698A1 (en) | 2008-09-24 | 2010-04-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides |
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