JP2024501662A - Ｘｂｐ１を標的とするオリゴヌクレオチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＸＢＰ１プレｍＲＮＡのスプライシングを変化させるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞、および哺乳動物タンパク質発現系、例えば異種タンパク質発現系におけるタンパク質発現のレベルおよび／または質を高めること、例えば、ＣＨＯ細胞における抗体発現を増強することにおける用途を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、タンパク質病理学的疾患の処置または予防のためなどの治療における用途を有する。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、ＸＢＰ１スプライスバリアントの発現を誘導するオリゴヌクレオチドに関する。そのようなオリゴヌクレオチドは、細胞におけるタンパク質発現のレベルおよび／または質を高め、哺乳動物タンパク質発現系、例えば異種タンパク質発現系において有用性を有することができる。オリゴヌクレオチドはまた、タンパク質病理学的疾患の処置または予防を含む治療的有用性を有する。
背景
Ｘ－ｂｏｘ結合タンパク質１であるＸＢＰ１は、タンパク質フォールディングおよび品質管理に関与する遺伝子を誘導することによってＥＲストレスへの適応を媒介する転写因子である。
ＸＢＰ１転写物は、発現がＩＲＥ１α（イノシトール要求酵素１アルファ）によって調節されるスプライスバリアントを含む異なるスプライス形態で存在する。哺乳動物細胞では、ＩＲＥ１αは、小胞体（ＥＲ）ストレス下でＸＢＰ１ ｍＲＮＡから２６ヌクレオチド断片を切除して、機能的に活性なＸＢＰ１ｓタンパク質をコードするスプライスバリアントを生成する。
２６ヌクレオチド断片の切除は、＋２のフレーム外事象をもたらし、活性なＸＢＰ１転写因子（ＸＢＰ－１Ｓ）の発現をもたらす。２６ヌクレオチド断片は、ＸＢＰ１成熟ｍＲＮＡのエクソン４に存在する。
Ｃａｉｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ２０１３；２９（３）：６９７－７０６）（非特許文献１）は、Ｘ－ｂｏｘ結合タンパク質（ＸＢＰ－１Ｓ）および小胞体オキシドレダクターゼ（ＥＲＯ１－Ｌα）の両方を発現するように操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＣＨＯＳ－ＸＥ．ＣＨＯＳ－ＸＥ細胞）について報告しており、これはＣＨＯＳ細胞と比較して抗体収量の増加（５．３～６．２倍）を提供する。
Ｔｏｎｇら（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０１２年１１月；１２３（３）：４０６－４１６）（非特許文献２）は、トランスジェニックラットにおける変異ＴＤＰ－４３の過剰発現について報告しており、これはニューロン喪失の前にユビキチンの顕著な凝集およびゴルジ複合体の断片化の喪失をもたらした。特に、ユビキチンの凝集およびゴルジ複合体の断片化の喪失の前に、ＸＢＰ１の枯渇および小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）の不活性化がさらに先行した。これは、異常なタンパク質フォールディングに関連する疾患（タンパク質病理学的疾患）、例えばＴＤＰ－４３病態を含む神経変性疾患、例えば前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）およびＡＬＳにおいて、ＸＢＰ１媒介ＵＰＲを回復または上方制御する必要があることを示している。
国際公開第２００３／８９６２２号（特許文献１）には、小胞体ストレス応答を調節するための新規な遺伝子、組成物および方法が開示されている。
国際公開第２０１９／００４９３９号（特許文献２）には、ｔ細胞の機能を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドが開示されている。
国際公開第２００８／０１６３５６号（特許文献３）には、乾癬に関連するヒト遺伝子の遺伝子マップが開示されている。
発明の目的
本発明者らは、驚くべきことに、活性ＸＢＰ１スプライスバリアントが、主にタンパク質病理学的疾患の処置に関連して、タンパク質産生の方法および治療方法において用途を有することを決定した。
本発明者らは、驚くべきことに、ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物の一部に相補的、例えば完全に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、活性なＸＢＰ１スプライスバリアントを作製することができることを決定した。このＸＰＢ１スプライスバリアントは、ＸＢＰ１Δ４スプライスバリアント（エクソン４が欠失したＸＢＰ１スプライスバリアント）であり得る。ＸＢＰ１エクソン４は、インビボでＩＲＥ１αによって切除される２６ヌクレオチド断片を含み、インビボＩＲＥ１α２６ヌクレオチド切除事象と同様に、エクソン４のスキップは＋２のフレーム外事象を導入する。
本発明は、組換え哺乳動物細胞におけるＸＢＰ１Δ４バリアントの生成または発現が、モノクローナル抗体などの異種発現タンパク質、特にそうでなければ発現が困難な異種発現タンパク質の発現増強をもたらすという知見に少なくとも部分的に基づく。ＸＢＰ１Δ４バリアントの発現により、哺乳動物細胞における品質が向上したタンパク質発現を得ることができる。
本発明は、哺乳動物細胞においてＸＢＰ１Δ４の生成または発現を誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの化合物が、哺乳動物細胞における異種発現タンパク質の組換え発現を増強するのに有用であるという知見に少なくとも部分的に基づく。特に、哺乳動物細胞においてＸＢＰ１Δ４の発現を誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの化合物は、哺乳動物細胞において正しく折り畳まれた異種発現タンパク質の組換え発現を増強するのに有用である。
本発明は、哺乳動物細胞においてＸＢＰ１Δ４の発現を誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、タンパク質病理学的疾患の処置に有用であるという知見に少なくとも部分的に基づく。
国際公開第２００３／８９６２２号 国際公開第２０１９／００４９３９号 国際公開第２００８／０１６３５６号
Ｃａｉｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ２０１３；２９（３）：６９７－７０６） Ｔｏｎｇら（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０１２年１１月；１２３（３）：４０６－４１６）
一態様によれば、本発明は、ＸＢＰ１を発現する細胞におけるＸＢＰ１スプライスバリアントの生成または発現に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが８～４０ヌクレオチド長であり、かつ哺乳動物ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物に相補的な８～４０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
ＸＢＰ１スプライスバリアントは、ＸＢＰ１Δ４バリアントであり得る。
連続ヌクレオチド配列は、ハムスターＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号１）の少なくとも１０個の連続ヌクレオチド、例えば、配列番号１のヌクレオチド２９６０～３１１３の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドまたは配列番号１のヌクレオチド２９８６～３０１８の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的であり得る。
連続ヌクレオチド配列は、配列番号２９９、配列番号３０１、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３１９、配列番号３２３、配列番号３２５、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３３１、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４１９、配列番号４３１、配列番号４３２、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４３８、配列番号４３９、配列番号４４０、配列番号４４１、配列番号４４２、配列番号４４９、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号４９５、配列番号４９６、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２、配列番号５０３、配列番号５０５、配列番号５０６、配列番号５０７、配列番号５０８、配列番号５０９、配列番号５１０、配列番号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５２０、配列番号５７２、配列番号５７３、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５８８および配列番号５８９からなる群から選択される配列に相補的であり得る。
連続ヌクレオチド配列は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１２８、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５８、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２９、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２９７および配列番号２９８からなる群から選択され得る。
連続ヌクレオチド配列は、マウスＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号５９０）の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的であり得る。
連続ヌクレオチド配列は、配列番号６９９、配列番号７００、配列番号７０３、配列番号７１０、配列番号７１３、配列番号７２４、配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４３、配列番号７４４、配列番号７４５、配列番号７４９、配列番号７５０、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、配列番号７５４、配列番号７５５、配列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配列番号７６０、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７７３、配列番号７７６、配列番号７７８、配列番号７８１、配列番号７８３、配列番号７８４、配列番号７８５、配列番号７８７、配列番号７８９、配列番号７９０、配列番号７９１、配列番号７９２、配列番号７９３、配列番号７９４、配列番号７９５、配列番号７９６、配列番号７９７、配列番号７９８、配列番号７９９および配列番号８００からなる群から選択される配列に相補的であり得る。
連続ヌクレオチド配列は、配列番号５９７、配列番号５９８、配列番号６０１、配列番号６０８、配列番号６１１、配列番号６２２、配列番号６２７、配列番号６３７、配列番号６４１、配列番号６４２、配列番号６４３、配列番号６４７、配列番号６４８、配列番号６４９、配列番号６５０、配列番号６５１、配列番号６５２、配列番号６５３、配列番号６５４、配列番号６５５、配列番号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６５９、配列番号６６０、配列番号６６１、配列番号６７１、配列番号６７４、配列番号６７６、配列番号６７９、配列番号６８１、配列番号６８２、配列番号６８３、配列番号６８５、配列番号６８７、配列番号６８８、配列番号６８９、配列番号６９０、配列番号６９１、配列番号６９２、配列番号６９３、配列番号６９４、配列番号６９５、配列番号６９６、配列番号６９７および配列番号６９７からなる群から選択され得る。
連続ヌクレオチド配列は、ヒトＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号８０１）の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的であり得る。
連続ヌクレオチド配列は、配列番号９４７、配列番号９４８、配列番号９４９、配列番号９５０、配列番号９５１および配列番号９８８からなる群から選択される配列に相補的であり得る。
連続ヌクレオチド配列は、配列番号８５４、配列番号８５５、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８および配列番号８９５からなる群から選択され得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、哺乳動物ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物に完全に相補的であり得る。
連続ヌクレオチド配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ長さであり得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、単離、精製または製造され得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、１つ以上の修飾ヌクレオチドまたは１つ以上の修飾ヌクレオシドを含み得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドミックスマーまたはトータルマーであり得るか、またはそれらを含み得る。
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのコンジュゲートおよび薬学的に許容され得る塩、ならびに本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物および医薬組成物を含む。
別の態様において、本発明は、単離されたＸＢＰ１Δ４タンパク質を提供する。
本発明の単離されたＸＢＰ１Δ４タンパク質は、配列番号７、配列番号５９６または配列番号８０７の配列を含み得る。
別の態様において、本発明は、本発明のＸＢＰ１Δ４タンパク質をコードする単離されたｍＲＮＡを提供する。
本発明の単離されたｍＲＮＡは、配列番号７、配列番号５９５または配列番号８０６の配列を含み得る。
別の態様において、本発明は、ポリペプチドを産生するための方法であって、
ａ）ＸＢＰ１を発現しておりかつポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）細胞または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含み、
培養が、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、医薬組成物、タンパク質またはｍＲＮＡの存在下で行われることを特徴とする、
方法を提供する。
本発明内で、本方法は、
ａ１）ＸＢＰ１を発現しておりかつポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む培養培地中で増殖させて、第１の細胞集団を得る工程と、
ａ２）第１の細胞集団のアリコートを、アンチセンスオリゴヌクレオチドを任意に含む培養培地と混合して、第２の細胞集団を得る工程と、
ａ３）第２の細胞集団を培養して、第３の細胞集団を得る工程と、
ｂ）第３の細胞培養の細胞および／または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含み得る。
本発明の方法内で、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２５μＭ以上の最終濃度まで添加され得る。
本発明の方法内で、第１の細胞集団をもたらす細胞は、０．５×１０Ｅ６～４×１０Ｅ６細胞／ｍＬの開始細胞密度で培養され得る。
本発明の方法内で、第２の細胞集団は、０．５×１０Ｅ６～１０×１０Ｅ６細胞／ｍＬの細胞密度を有し得る。
本発明の方法内で、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞であり得る。
本発明の方法内で、ポリペプチドは、抗体であり得る。
本発明の一態様は、多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法であって、
ａ）ＸＢＰ１バリアント、好ましい一実施形態において、ＸＢＰ１バリアントはＸＢＰ１Δ４である、の形成を誘導している本発明による核酸の存在下で、多量体ポリペプチドをコードし、ＸＢＰ１を発現している１つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）細胞または培養培地から多量体ポリペプチドを回収する工程と
を含む、方法である。
本発明のさらなる一態様は、多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法であって、
ａ）ＸＢＰ１ ｍＲＮＡにおいてエクソン４のスキップを誘導しており、それにより、＋２のフレーム外事象が導入される、本発明による核酸の存在下で、多量体ポリペプチドをコードし、ＸＢＰ１を発現している１つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）細胞または培養培地から多量体ポリペプチドを回収する工程と
を含む、方法である。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本方法は、
ａ１）ＸＢＰ１を発現しておりかつポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を、ＸＢＰ１バリアント、好ましい一実施形態において、ＸＢＰ１バリアントはＸＢＰ１Δ４である、の形成を誘導している本発明による核酸を含む培養培地中で増殖させて、第１の細胞集団を得る工程と、
ａ２）第１の細胞集団のアリコートを、ＸＢＰ１バリアントＸＢＰ１Δ４の形成を誘導している本発明による同じまたは異なる核酸を任意に含む培養培地と混合して、第２の細胞集団を得る工程と、
ａ３）第２の細胞集団を培養して、第３の細胞集団を得る工程と、
ｂ）第３の細胞培養の細胞および／または培養培地から多量体ポリペプチドを回収する工程と
を含む。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本方法は、
ａ１）ＸＢＰ１を発現しておりかつポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を、ＸＢＰ１ ｍＲＮＡにおいてエクソン４のスキップを誘導しており、それにより、＋２のフレーム外事象が導入される、本発明による核酸を含む培養培地中で増殖させて、第１の細胞集団を得る工程と、
ａ２）第１の細胞集団のアリコートを、ＸＢＰ１ ｍＲＮＡにおいてエクソン４のスキップを誘導しており、それにより、＋２のフレーム外事象が導入される、本発明による同じまたは異なる核酸を任意に含む培養培地と混合して、第２の細胞集団を得る工程と、
ａ３）第２の細胞集団を培養して、第３の細胞集団を得る工程と、
ｂ）第３の細胞培養の細胞および／または培養培地から多量体ポリペプチドを回収する工程と
を含む。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、ハムスターＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号１）の少なくとも１０個の連続ヌクレオチド、例えば、配列番号１のヌクレオチド２９６０～３１１３からの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドまたは配列番号１のヌクレオチド２９８６～３０１８からの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的である。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、ヒトＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号８０１）の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的である。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、配列番号２３または配列番号２４からなる群から選択される配列に相補的である。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、配列番号９４７、配列番号９４８、配列番号９４９、配列番号９５０、配列番号９５１および配列番号９８８からなる群から選択される配列に相補的である。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、配列番号８５４、配列番号８５５、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８および配列番号８９５からなる群から選択される。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、ＸＢＰ１バリアントは、配列番号７、配列番号５９６または配列番号８０７の配列を含む。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、ＸＢＰ１バリアントは、配列番号７、配列番号５９５または配列番号８０６の配列によってコードされる。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、２５μＭ以上の最終濃度まで添加される。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、第１の細胞集団をもたらす細胞は、０．５×１０Ｅ６～４×１０Ｅ６細胞／ｍＬの開始細胞密度で培養される。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、第２の細胞集団は、０．５×１０Ｅ６～１０×１０Ｅ６細胞／ｍＬの開始細胞密度を有する。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ細胞である。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、ＳＰ２／０細胞である。
多量体ポリペプチドの組換え産生のための方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、多量体ポリペプチドは、抗体である。特定の実施形態において、抗体は、二重特異性抗体である。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、ドメイン交換を有する全長抗体または抗体－多量体融合物である。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、三価二重特異性抗体である。特定の実施形態において、二重特異性三価抗体は、ドメイン交換および追加の重鎖Ｃ末端結合部位を有する全長抗体、またはドメイン交換を有する追加の重鎖Ｃ末端結合部位を有する全長抗体、またはＴ細胞二重特異性抗体である。特定の実施形態において、抗体は、二価または三価である。
本発明の一態様は、例えばモノクローナル抗体などの抗体の製造における、組換えタンパク質発現系によって産生される多量体ポリペプチドの収量または質を高めるための本発明による核酸の使用である。
本発明による核酸の使用のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
本発明による核酸の使用のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、ハムスターＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号１）の少なくとも１０個の連続ヌクレオチド、例えば、配列番号１のヌクレオチド２９６０～３１１３からの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドまたは配列番号１のヌクレオチド２９８６～３０１８からの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的である。
本発明による核酸の使用の方法のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、ヒトＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号８０１）の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的である。
本発明による核酸の使用のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、配列番号９４７、配列番号９４８、配列番号９４９、配列番号９５０、配列番号９５１および配列番号９８８からなる群から選択される配列に相補的である。
本発明による核酸の使用のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、配列番号８５４、配列番号８５５、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８および配列番号８９５からなる群から選択される。
本発明のさらなる一態様は、例えばモノクローナル抗体などの抗体の製造における、組換えタンパク質発現系によって産生される多量体ポリペプチドの収量または質を高めるための、エクソン４がスキップされ、＋２のフレーム外事象が導入される、ＸＢＰ１ ｍＲＮＡから得られるＸＢＰ１バリアントの使用である。
本発明のさらなる一態様は、例えばモノクローナル抗体などの抗体の製造における、組換えタンパク質発現系によって産生される多量体ポリペプチドの収量または質を高めるための、配列番号７、配列番号５９６または配列番号８０７の配列を含むＸＢＰ１バリアントの使用である。
先に概説した使用のすべての態様および実施形態の特定の実施形態において、本発明による核酸は、２５μＭ以上の最終濃度で使用される。
別の態様において、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、医薬組成物、タンパク質および／または単離されたｍＲＮＡの治療的適用を提供する。
一態様において、本発明は、医学または治療に使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、医薬組成物、タンパク質および／または単離されたｍＲＮＡを提供する。
別の態様において、本発明は、タンパク質病理学的疾患を処置するための医薬品の製造における本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、医薬組成物、タンパク質および／または単離されたｍＲＮＡの使用を提供する。
別の態様において、本発明は、タンパク質病理学的疾患を処置する方法であって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、医薬組成物、タンパク質および／または単離されたｍＲＮＡを投与することを含む方法を提供する。
本発明の治療的適用を通して、タンパク質病理学的疾患は、運動ニューロン疾患または前頭側頭葉変性症などのＴＤＰ－４３病態であり得る。
ヒトＸＢＰ１転写物ＸＢＰ１－２０７におけるＩＲＥ１媒介スプライシング事象の例示の図。 代替的なＩＲＥ１媒介スプライシング事象についての提案された機構の例示の図。 拡張されたＣ末端ドメインをコードするｍＲＮＡ ＸＢＰ１ｓをもたらす、ＸＢＰ１プレｍＲＮＡに対するＩＲＥ１媒介スプライシング事象の結果の例示の図。 エクソン４の除去がＩＲＥ１媒介スプライシング事象（ＸＢＰ１ｓ）に見られるＣ末端アミノ酸配列の大部分の保持をもたらすことを示す、ＸＢＰ１ｕ、ＸＢＰ１ｓおよびＸＢＰ１Δ４バリアントによってコードされるタンパク質のアラインメントの図。 ＸＢＰ１エクソン４スキップのためのスクリーニングアッセイ設計の図。 エクソン４のスキップを媒介するのに有効な化合物を同定する、配列番号１のヌクレオチド２９６０～３１１３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの最初のライブラリーススクリーンの図。 有効なエクソン４スプライススイッチング化合物、例えば配列番号２３および２４は、発現困難なｍＡｂを発現するＣＨＯ細胞の力価を増加させる。 オリゴヌクレオチドの活性を、配列番号２のエクソン４に沿ったそれらの位置に対して示す図。 重要な種にわたるエクソン４配列における保存を強調するＸＢＰ１ｓ（配列番号５、５９４および８０５）のアラインメントの図。 重要な種にわたるエクソン４配列における保存を強調するＸＢＰΔ４（配列番号７、５９６および８０７）のアラインメントの図。 ヒトＸＢＰ１ｓ（配列番号８０５）およびＸＢＰΔ４（配列番号８０７）のアラインメントの図。
定義
概要
本発明を実施するための有用な方法および技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第Ｉ～ＩＩＩ巻（１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．，およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，編，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第ＩおよびＩＩ巻（１９８５），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（編），Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，第２版，ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ；Ｎ．Ｙ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．，編，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第２版，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）に記載されている。
組換えＤＮＡ技術を使用することにより、核酸の誘導体の作製が可能になる。このような誘導体は、例えば、置換、改変、交換、欠失または挿入によって、個々のまたはいくつかのヌクレオチド位置で修飾され得る。修飾または誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって行われ得る。このような修飾は、当業者によって容易に行われ得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（１９９９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，およびＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ参照）。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈において特に明白な規定がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「１つの細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数のそのような細胞、および当業者に公知であるその等価物を含み、他も同様である。同様に、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」も、本明細書において互換的に使用され得る。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は互換的に使用され得ることにも留意すべきである。
用語「約」は、その後に続く数値の±２０％の範囲を意味する。一実施形態において、約という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を意味する。一実施形態において、「約」という用語は、その後に続く数値の±５％の範囲を意味する。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」も含む。
化合物
本明細書では、本発明の化合物の文脈において、「化合物」という用語は、ＸＢＰ１の発現または活性を調節することができる任意の分子、特にＸＢＰ１プレｍＲＮＡのスプライシングを調節してＸＢＰ１およびＸＢＰ１スプライスバリアント、例えばＸＢＰ１エクソン４を欠くｍＲＮＡの発現のレベルを増加させることができる任意の分子を意味する。本発明の特定の化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子、およびこのような核酸分子を含むコンジュゲートである。
組換え哺乳動物細胞
本明細書で使用される「組換え哺乳動物細胞」という用語は、ポリペプチドを発現することができる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を意味する。そのようなポリペプチドは、該哺乳動物細胞に対して内因性または異種（外因性）のポリペプチドであり得る。そのような組換え哺乳動物細胞は、そのような細胞の子孫を含む、１つ以上の外因性核酸が導入された細胞である。したがって、「異種ポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳動物細胞」という用語は、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ、異種ポリペプチドを発現することができる外因性ヌクレオチド配列を含む細胞を意味する。一実施形態において、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞は、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む細胞であり、この外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列および第２の組換え認識配列、ならびに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列との間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列はすべて異なっている。
そのような「組換え哺乳動物細胞」は、任意の規模で該目的の相同または異種ポリペプチドの産生に使用され得る。
形質転換細胞
外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞は、「形質転換細胞」である。この用語は、継代の回数に関わらず、初代形質転換細胞も、それに由来する子孫も含む。子孫は、例えば、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではなくてもよいが、突然変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物学的活性を有している変異子孫は、包含される。
単離
「単離された」組成物とは、その天然環境の成分から分離された組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動、ＣＥ－ＳＤＳ）法またはクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）法によって測定した場合に９５％または９９％を超える純度まで精製される。例えば、抗体の純度を評価するための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ ８４８（２００７）７９－８７を参照されたい。
「単離された」核酸は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外、または天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「単離された」ポリペプチドまたは抗体は、その天然環境の成分から分離されたポリペプチド分子または抗体分子を指す。
組込み部位
用語「組込み部位」は、外因性ヌクレオチド配列が挿入される、細胞ゲノム内の核酸配列を意味する。特定の実施形態において、組込み部位は、細胞ゲノム中の隣り合う２つのヌクレオチドの間にある。特定の実施形態において、組込み部位は、ヌクレオチド配列のストレッチを含む。特定の実施形態において、組込み部位は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内に位置している。特定の実施形態において、組込み部位は、哺乳動物細胞の内因性遺伝子内にある。
用語「ベクター」または「プラスミド」は、互換的に使用され得、本明細書で使用される場合、それが連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、およびベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
選択マーカー
本明細書で使用される場合、用語「選択マーカー」は、その遺伝子を有する細胞が、対応する選択剤の存在下でポジティブまたはネガティブに特異的に選択されることを可能にする遺伝子を意味する。例えば、限定するわけではないが、選択マーカーにより、その選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、各選択剤の存在下（選択的培養条件下）で、ポジティブに選択されることが可能になり得、形質転換されていない宿主細胞は、選択的培養条件下で増殖することも生存することもできないと考えられる。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、または二機能性であり得る。ポジティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞の選択が可能になり得るのに対し、ネガティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞を選択的に排除することが可能になり得る。選択マーカーは、宿主細胞において薬物に対する耐性を付与することができるか、または代謝もしくは異化の欠陥を補うことができる。原核細胞においては、とりわけ、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、またはクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を使用することができる。真核細胞において選択マーカーとして有用な耐性遺伝子としては、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、およびＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ））の遺伝子、ならびにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。さらなるマーカー遺伝子は、国際公開第９２／０８７９６号および国際公開第９４／２８１４３号に記載されている。
対応する選択剤の存在下での選択を容易にすることを超えて、選択マーカーは、別法として、普通は細胞に存在しない分子、例えば、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光性タンパク質（ＹＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光性タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅであり得る。例えば、コードされるポリペプチドが発する蛍光の検出または不在にそれぞれ基づいて、そのような分子を発現する細胞を、この遺伝子を内部に持たない細胞と区別することができる。
作動可能に連結
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、目的の様式でそれらが機能することを可能にする関係にある、２つ以上の成分の近接した配置を指す。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーがコード配列の転写を調節する役割を果たす場合、そのプロモーターおよび／またはエンハンサーはコード配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、「作動可能に連結されて」いるＤＮＡ配列は、単一の染色体上で近接し、隣り合っている。特定の実施形態において、例えば、１つの分泌リーダーと１つのポリペプチドといった２つのタンパク質のコード領域を結合する必要があるとき、これら配列は近接し、隣り合い、かつ同じリーディングフレームに存在する。特定の実施形態において、作動可能に連結されたプロモーターは、コード配列の上流に位置しており、かつコード配列に隣り合うことができる。特定の実施形態において、例えば、コード配列の発現を調節するエンハンサー配列に関して、２つの成分は、隣り合ってはいないが、作動可能に連結され得る。エンハンサーがコード配列の転写を増大させる場合、エンハンサーはコード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部、または下流に位置することができ、かつコード配列のプロモーターからかなり離れて位置することができる。作動可能な連結は、当該技術分野で公知の組換え法によって、例えば、ＰＣＲ方法を用いて、かつ／または好都合な制限部位でのライゲーションによって、達成され得る。好都合な制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の手順に従って使用することができる。内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、それが５’末端に非依存的な方法により内部位置でＯＲＦの翻訳を開始できる場合、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結されている。
外因性
本明細書で使用される場合、用語「外因性」は、あるヌクレオチド配列が特定の細胞に由来せず、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、または形質転換法によって該細胞に導入されることを示す。したがって、外因性ヌクレオチド配列は人工配列であり、この人工物は、例えば、起源が異なる部分配列の組合せ（例えば、ＳＶ４０プロモーターを有するリコンビナーゼ認識配列と緑色蛍光性タンパク質のコード配列との組合せは、人工核酸である）から、または配列（例えば、膜結合型受容体の細胞外ドメインのみをコードする配列もしくはｃＤＮＡ）の部分的な欠失もしくは核酸塩基の突然変異から、生じ得る。用語「内因性」は、細胞に由来するヌクレオチド配列を指す。「外因性」ヌクレオチド配列は、塩基組成が同一である「内因性」対応物を部分的に有し得るが、「外因性」配列は、例えば組換えＤＮＡ技術によって細胞に導入されている。
異種
本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、あるポリペプチドが特定の細胞に由来せず、それぞれのコードする核酸が、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、または形質転換法によって該細胞に導入されていることを示す。したがって、異種ポリペプチドは、それを発現する細胞に対して人工的なポリペプチドであり、そのため、そのポリペプチドが異なる細胞／生物に由来する天然に存在するポリペプチドであるか、または人工ポリペプチドであるかどうかに依存しない。
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者に一般に理解されるように定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子またはオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製および単離によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合には、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその修飾が言及される。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、人工のものであり、化学的に合成され、通常は精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどのヌクレオシド類似体とも呼ばれる１つ以上の修飾ヌクレオシドを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合のような、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「ＡＳＯ」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡでもｓｈＲＮＡでもない。いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖であり得る。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己内または自己間の相補性の程度がオリゴヌクレオチドの全長にわたって約５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重鎖）を形成することができるものと理解される。いくつかの実施形態において、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオシドを含まない。本開示の他の箇所に記載されるように、いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含む。特定の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの非修飾ヌクレオシドは、ＤＮＡヌクレオシドである。
特定の文脈において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと称され得る。
連続ヌクレオチド配列
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で「連続核酸塩基配列」という用語およびオリゴヌクレオチド「配列モチーフ」という用語と互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「配列モチーフ」という用語は、ヌクレオシド糖の化学的性質および／または設計とは無関係の核酸塩基の配列を表す。いくつかの実施形態において、核酸塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧは修飾され得、例えば、大文字Ｃは５－メチルシトシンベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり得、ＲＮＡ配列では、ＴはＵであり得る。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。連続ヌクレオチド配列は、標的核酸または標的配列に相補的であり、場合によっては完全に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの配列である。
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を含み、任意に、さらなるヌクレオチド、例えば、官能基（例えばコンジュゲート基）を連続ヌクレオチド配列に結合するのに使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であり得る。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的ではない。アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、それ自体としてアンチセンスオリゴヌクレオチドより長くなることはできないことと、アンチセンスオリゴヌクレオチドは連続ヌクレオチド配列より短くなることはできないことと、が理解される。
核酸
「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は、複数の核酸を包含することを意図している。いくつかの実施形態において、「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は、インビボまたはインビトロでの標的配列、例えばプレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡを指す。
この用語が標的配列中の核酸またはヌクレオチドを指す場合、核酸またはヌクレオチドは、細胞内に天然に存在する配列であり得る。いくつかの実施形態において、「核酸」または「ヌクレオチド」は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド中の配列を指す。この用語がアンチセンスオリゴヌクレオチド中の配列を指す場合、核酸またはヌクレオチドは、天然に存在しない、すなわち、化学的に合成される、酵素的に生成される、組換え産生される、またはそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の核酸またはヌクレオチドは、合成的または組換え的に産生されるが、天然に存在する配列またはその断片ではない。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の核酸またはヌクレオチドは、本来天然に存在しない少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含有するため、天然に存在しない。
「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は、単離された形態であるかまたはポリヌクレオチド中に存在する単一の核酸セグメント、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその類似体を指す。「核酸」または「ヌクレオチド」は、天然に存在する核酸または天然に存在しない核酸を含む。いくつかの実施形態において、「ヌクレオチド」、「単位」および「モノマー」という用語は、互換的に使用される。ヌクレオチドまたはモノマーの配列に言及する場合、言及されるものは、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵおよびその類似体などの塩基の配列であることが認識されるであろう。
この用語が核酸、またはポリペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸を指す場合、核酸またはヌクレオチドは、細胞内の天然に存在する配列または人工配列であり得る。いくつかの実施形態において、核酸は、合成的または組換え的に産生される。
ヌクレオチド
本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語は、糖部分、塩基部分、および共有結合基（結合基）、例えばリン酸またはホスホロチオエートヌクレオチド間結合基を含むグリコシドを指し、天然に存在するヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに本明細書で「ヌクレオチド類似体」とも呼ばれる修飾された糖および／または塩基部分を含む天然に存在しないヌクレオチドの両方を包含する。本明細書において、単一のヌクレオチド（単位）は、モノマーまたは核酸単位とも称され得る。特定の実施形態において、「ヌクレオチド類似体」という用語は、修飾糖部分を有するヌクレオチドを指す。修飾糖部分（例えば、ＬＮＡ）を有するヌクレオチドの非限定的な例は、本明細書の他の箇所に開示されている。いくつかの実施形態において、「ヌクレオチド類似体」という用語は、修飾核酸塩基部分を有するヌクレオチドを指す。修飾核酸塩基部分を有するヌクレオチドとしては、５－メチル－シトシン、イソシトシン、５－チオゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、プソイドイソシトシン、５－ブロモウラシル、５－プロピニル－ウラシル、チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２－チオチミン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、２，６－ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。当業者が認識するように、オリゴヌクレオチド（例えば、本明細書に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド）の５’末端ヌクレオチドは５’ヌクレオチド間結合基を含まないが、５’末端基を含み得る。
ヌクレオシド
本明細書で使用される「ヌクレオシド」という用語は、糖部分および塩基部分を含むグリコシドを指すために使用され、したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間のヌクレオチド間結合によって共有結合しているヌクレオチド単位を指す場合に使用され得る。バイオテクノロジーの分野では、「ヌクレオチド」という用語は、核酸モノマーまたは単位を指すために使用されることが多い。アンチセンスオリゴヌクレオチドの文脈において、「ヌクレオチド」という用語は、塩基単独、すなわち、シトシン（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、グアニン（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、アデニン（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、チミン（ＤＮＡ）およびウラシル（ＲＮＡ）を含む核酸塩基配列を指し得、糖骨格およびヌクレオチド間結合の存在は暗黙的である。同様に、特に１つ以上のヌクレオチド間結合基が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合、「ヌクレオチド」という用語は「ヌクレオシド」を指し得る。例えば、ヌクレオシド間の結合の存在または性質を特定する場合であっても、「ヌクレオチド」という用語が使用され得る。
ヌクレオチド長
本明細書で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の「ヌクレオチド長」または「長さ」という用語は、所与の配列中のヌクレオチド（モノマー）の総数を意味する。ヌクレオチドおよびヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成単位であり、本開示の目的のために、天然に存在するヌクレオチドおよびヌクレオシドと、天然に存在しないヌクレオチドおよびヌクレオシド（ヌクレオシド／ヌクレオチド類似体）との両方を含む。本来、ＤＮＡヌクレオチドおよびＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、互換的に「単位」または「モノマー」と称され得る。
修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」、または「ヌクレオシド類似体」という用語は、糖部分または（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって、同等のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ以上の修飾ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む。「修飾ヌクレオシド」という用語はまた、「ヌクレオシド類似体」、修飾「単位」、または修飾「モノマー」という用語と互換的に使用され得る。非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと称される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対合可能な場合には、依然としてＤＮＡまたはＲＮＡと称される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに使用され得る修飾ヌクレオシドの非限定的な例としては、ＬＮＡ、２’－Ｏ－ＭＯＥおよびモルホリノヌクレオシド類似体が挙げられる。他の修飾ヌクレオシドの例は、本開示の他の箇所に提供される。
高親和性修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される「高親和性修飾ヌクレオシド」は、オリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める修飾ヌクレオチドである。本開示の高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５～＋１２℃、場合によっては＋１．５～＋１０℃、他の場合では＋３～＋８℃の融解温度の上昇をもたらし得る。数多くの高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野で公知であり、例えば、多くの２’置換ヌクレオシドおよびロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２０３－２１３を参照されたい）。
修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを共に共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者に一般的に理解されるように定義される。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合のような、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書に開示される）またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも約５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％またはそれ以上のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合のすべてが、ホスホロチオエートである。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列のすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであるか、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。
核酸塩基
「核酸塩基」という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニンおよびグアニン）およびピリミジン（例えばウラシル、チミンおよびシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーションの際に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」とは、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、およびヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基と、天然に存在しないバリアントとの両方を指す。このようなバリアントは、例えば、Ｈｉｒａｏら（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第４５巻第２０５５頁およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載されている。
いくつかの実施形態において、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを修飾プリンまたはピリミジン、例えば置換プリンまたは置換ピリミジン、例えばイソシトシン、プソイドイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チオゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル、５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’－チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基に変えることにより修飾される。
核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基についての文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵにより示され得、各文字は、等価機能の修飾核酸塩基を任意に含み得る。例えば、特定の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃおよび５－メチルシトシンから選択される。任意に、ＬＮＡギャップマーについて、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
修飾オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、１つ以上の修飾ヌクレオシド（例えば、糖修飾ヌクレオシド）および／または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を表す。「キメラオリゴヌクレオチド」という用語は、修飾ヌクレオシド（例えば、糖修飾ヌクレオシド）およびＤＮＡヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。いくつかの実施形態において、本開示のＡＳＯは、キメラオリゴヌクレオチドである。
アルキル
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、１～８個の炭素原子（Ｃ１－８）を有する直鎖または分岐鎖アルキル基、特に１～６個の炭素原子（Ｃ１－６）を有する直鎖または分岐鎖アルキル基、より具体的には１～４個の炭素原子（Ｃ１－４）を有する直鎖または分岐鎖アルキル基を意味する。直鎖および分岐鎖Ｃ１－Ｃ８アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、異性体ペンチル、異性体ヘキシル、異性体ヘプチル、および異性体オクチル、特に、メチル、エチル、プロピル、ブチル、およびペンチルである。アルキルの特定の例は、メチルである。アルキルのさらなる例は、モノ、ジまたはトリフルオロメチル、エチルまたはプロピル、例えばシクロプロピル（ｃＰｒ）、またはモノ、ジまたはトリフルオロシクロプロピルである。
アルコキシ
用語「アルコキシ」は、単独または組み合わせて、式アルキル－Ｏ－の基を意味し、ここで、用語「アルキル」は、前に付与した意味、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ．ブトキシおよびｔｅｒｔ．ブトキシを意味する。特定の「アルコキシ」はメトキシである。
二環式糖
本明細書で使用される場合、「二環式糖」という用語は、４～７員環の２つの原子を連結して第２の環を形成し、二環式構造をもたらす架橋を含む４～７員環を含む修飾糖部分を指す。いくつかの実施形態において、架橋は、ＬＮＡヌクレオシドにおいて観察されるように、ヌクレオシド（すなわち、２’－４’架橋）のリボース糖環のＣ２’およびＣ４’を連結する。
エクソン
本明細書で使用される場合、本明細書で互換的に使用され得る「エクソン」または「エクソン領域」または「エクソン配列」という用語は、スプライシングおよび他のＲＮＡプロセシング後に、ＲＮＡに転写され、ＲＮＡの成熟形態、例えばｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）で表されるヌクレオチドの配列を含む核酸分子を指す。ｍＲＮＡは、作動可能に連結された１つ以上のエクソンを含む。いくつかの実施形態において、エクソンは、ポリペプチドまたはポリペプチドの一部をコードすることができる。いくつかの実施形態において、エクソンは、非翻訳配列、例えば翻訳調節配列を含み得る。
イントロン
「イントロン」または「イントロン領域」または「イントロン配列」という用語は、互換的に使用され得、ＲＮＡに転写され、次いで典型的にはスプライシングによってＲＮＡから除去されてＲＮＡの成熟形態、例えばｍＲＮＡを作製するヌクレオチドの配列を含む核酸分子を指す。いくつかの実施形態において、イントロンのヌクレオチド配列は成熟ＲＮＡに組み込まれず、イントロン配列またはその一部は翻訳されてポリペプチドに組み込まれない。スプライスドナーおよびアクセプターなどのスプライスシグナル配列は、ＲＮＡからイントロンを除去するために細胞のスプライシング機構によって使用される。いくつかの実施形態において、１つのスプライスバリアントにおけるイントロンは、別のバリアントにおけるエクソン（すなわち、スプライシングされた転写物中に存在する）であり得る。したがって、イントロン融合タンパク質をコードするスプライシングされたｍＲＮＡは、エクソンおよびイントロンを含み得る。
スプライシング
本明細書で使用される場合、「スプライシング」という用語は、プレｍＲＮＡ中のイントロンが除去され、エクソンが作動可能に連結されてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を作製するＲＮＡ成熟のプロセスを指す。
選択的スプライシング
本明細書で使用される場合、「選択的スプライシング」という用語は、遺伝子から複数のｍＲＮＡを産生するプロセスを指す。いくつかの実施形態において、選択的スプライシングは、遺伝子のすべてのエクソンよりも少ないエクソンを作動可能に連結すること、および／または遺伝子に由来するすべての転写物に存在しない１つ以上の選択的エクソンを作動可能に連結することを含み得る。
スプライス調節
本明細書で使用される「スプライス調節」という用語は、潜在的スプライシングを修正し、選択的スプライシングを調節し、オープンリーディングフレームを回復させ、タンパク質ノックダウンを誘導するために使用され得るプロセスを指す。本発明の文脈において、スプライス調節は、ＸＢＰ１プレｍＲＮＡの選択的スプライシングを調節してスプライスバリアントを生成するために使用され得る。例えば、スプライス調節は、ＸＢＰ１プレｍＲＮＡの選択的スプライシングを調節してＸＢＰ１Δ４ ｍＲＮＡを生成し、それによってＸＢＰ１Δ４タンパク質の発現を増強するために使用され得る。スプライス調節は、プレｍＲＮＡの異なるスプライス産物の定量的評価を可能にするＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）によってアッセイされ得る。本発明のいくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン４を含む成熟ＸＢＰ１ ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のレベルを低下させ、エクソン４を欠く成熟ＸＢＰ１ ｍＲＮＡ（ＸＢＰ１Δ４ ｍＲＮＡ）のレベルの発現を増加させるように、ＸＢＰ１プレｍＲＮＡのスプライシングを調節する。
コード領域
本明細書で使用される場合、互換的に使用され得る「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は典型的にはアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部と考えられ得る。ただし、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域（「ＵＴＲ」）などの任意の隣接配列はコード領域の一部ではない。コード領域の境界は、典型的には、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端の開始コドン、および得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端の翻訳終止コドンによって決定される。
非コード領域
本明細書で使用される「非コード領域」という用語は、コード領域ではないヌクレオチド配列を意味する。非コード領域の例としては、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域（「ＵＴＲ」）、非コードエクソンなどが挙げられるが、これらに限定されない。エクソンのいくつかは、各転写物の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）または３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の全体または一部であり得る。非翻訳領域は、転写物の効率的な翻訳、ならびに転写物の翻訳速度および半減期の制御にとって重要である。
領域
「領域」という用語は、ヌクレオチド配列の文脈で使用される場合、その配列の一部を指す。例えば、「ヌクレオチド配列内の領域」または「ヌクレオチド配列の相補体内の領域」という語句は、ヌクレオチド配列よりも短いが、それぞれ特定のヌクレオチド配列内またはヌクレオチド配列の相補体内に位置する少なくとも１０ヌクレオチドよりも長い配列を指す。「サブシーケンス」または「部分配列」という用語はまた、ヌクレオチド配列の領域を指し得る。
下流および上流
「下流」という用語は、ヌクレオチド配列に言及する場合、核酸またはヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列に対して３’側に位置することを意味する。特定の実施形態において、下流ヌクレオチド配列は、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写の開始部位の下流に位置する。
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態において、上流ヌクレオチド配列は、転写の開始点に先行する配列に関する。例えば、遺伝子のプロモーター配列は、転写の開始部位の上流に位置する。
調節領域
本明細書で使用される場合、「調節領域」という用語は、コード領域の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節領域は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ＵＴＲ、およびステムループ構造を含み得る。コード領域が真核細胞における発現を意図する場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に位置する。
標的配列
本明細書で使用される「標的配列」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指し、すなわち本発明の文脈において、哺乳動物のＸＢＰ１プレｍＲＮＡ配列は標的核酸であり、標的配列は、エクソン４のスプライシングを調節するために効果的に標的とされ得る標的核酸の領域であり、例えばＸＢＰ１エクソン４、ならびにＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物のエクソン４に隣接する領域５’および／または３’を含む。
例えば、本発明の場合、標的核酸は、ハムスターＸＢＰ１プレｍＲＮＡ（配列番号１、特に配列番号１のヌクレオチド２９６０～３１１３）、マウスＸＢＰ１プレｍＲＮＡ（配列番号５９０）またはヒトＸＢＰ１プレｍＲＮＡ（配列番号８０１）であり得る。
いくつかの実施形態において、標的配列は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列、または標的領域と称され得る。いくつかの実施形態において、標的配列は、単一のアンチセンスオリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば、本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドにより標的とされ得る標的核酸の好ましい領域を表し得る。
細胞または標的細胞
本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、標的核酸を発現する細胞を指す。いくつかの実施形態において、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞もしくはラット細胞、またはハムスター細胞、例えばＣＨＯ細胞、または霊長類細胞、例えばサル細胞もしくはヒト細胞を含む。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ＸＢＰ１標的核酸を発現しているトランスジェニック哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば異種発現を介してＸＢＰ１Δ４ ｍＲＮＡを発現しているトランスジェニック動物細胞である。
異種タンパク質発現におけるその一般的な使用のために、タンパク質発現方法で使用するための好ましい細胞は、ハムスター細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）であり、特に懸濁状態で増殖するＣＨＯ－Ｋ１細胞が好ましい。
神経変性障害における本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療的適用のために、標的細胞はニューロン細胞であり得る。
典型的には、本発明の標的細胞は、細胞内で成熟ＸＢＰ１ ｍＲＮＡにプロセシングされ、ＸＢＰ１－Ｅ４タンパク質（ＸＢＰｕとも呼ばれる）およびＸＢＰ１Δ４転写バリアントの両方の発現をもたらすＸＢＰ１プレｍＲＮＡを発現する。本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、ＸＢＰ１エクソン４を欠くＸＢＰ１ ｍＲＮＡの割合を増加させるためにＸＢＰ１プレｍＲＮＡのスプライシングを調節する。好適には、それによって、ＸＢＰ１－Ｅ４転写バリアントと比較して、ＸＢＰ１Δ４転写バリアントの発現を増加させることができる。
相補性
「相補性」または「核酸塩基相補性」という用語は、本明細書で互換的に使用され得、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対合能を表す。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。
オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでいてもよく、例えば５－メチルシトシンは、しばしばシトシンの代わりに用いられ、したがって、相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のワトソン・クリック塩基対合を包含することが理解されよう（例えば、Ｈｉｒａｏら（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第４５巻第２０５５頁およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１を参照されたい）。
用語「％相補的」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、標的配列または配列モチーフ）に対して相補的である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセント）を指す。したがって、相補性のパーセンテージは、２つの配列間（標的配列５’－３’と３’－５’からのオリゴヌクレオチド配列とを整列させた場合）で相補的である（ワトソン・クリック塩基対から）整列した核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。相補性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５’－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であるとみなされる）。
本発明内で、「相補的」という用語は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物に対して少なくとも約８０％相補的であるか、または少なくとも約９０％相補的であることを必要とする。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ハムスター（配列番号１）、マウス（配列番号５９０）またはヒト（配列番号８０１）ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％相補的であり得る。言い換えれば、いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ、２つ、３つまたはそれを超えるミスマッチを含んでいてもよく、ミスマッチは、その標的と塩基対を形成しない本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドである。
「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。
相補体
本明細書で使用される「相補体」という用語は、参照配列に相補的な配列を示す。相補性は、２つのＤＮＡまたはＲＮＡ配列間で共有される特性であるので、それらが互いに逆平行に整列されると、鏡を見て逆を見るのと同様に、配列中の各位置のヌクレオチド塩基が相補的になるように、相補性はＤＮＡ複製および転写の基本原理（ワトソン・クリック塩基対合）であることは周知である。したがって、例えば、５’－ＡＴＧＣ－３’の配列の相補体は、３’－ＴＡＣＧ－５’または５’－ＧＣＡＴ－３’と書かれ得る。本明細書で使用される「逆相補体」、「逆相補的」、および「逆相補性」という用語は、「相補体」、「相補的」、および「相補性」という用語と互換的である。
同一性
本明細書で使用される「同一性」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）と同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。
したがって、同一性のパーセンテージは、２つの配列（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列および参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって計算される。したがって、同一性のパーセンテージ＝（一致数×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージの計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であるとみなされる）。
本明細書で使用される場合、「相同」および「相同性」という用語は、「同一性」および「同一」という用語と互換的である。
天然に存在するバリアント
「天然に存在するバリアント」という用語は、定義された分類群、例えば哺乳動物、例えばマウス、ラット、チャイニーズハムスター、サルおよびヒトの中で天然に存在するＸＢＰ１ポリペプチド配列またはＸＢＰ１核酸配列（例えば、転写物）のバリアントを指す。典型的には、ポリヌクレオチドの「天然に存在するバリアント」に言及する場合、この用語はまた、染色体転座または重複によるＸＢＰ１をコードするゲノムＤＮＡの任意の対立遺伝子バリアント、およびＲＮＡ、例えばそれに由来するｍＲＮＡを包含し得る。「天然に存在するバリアント」はまた、ＸＢＰ１ ｍＲＮＡの選択的スプライシングに由来するバリアントを含み得る。特定のポリペプチド配列、例えばＸＢＰ１に言及する場合、この用語は、天然に存在する形態のタンパク質も含み、したがって、これは、例えば、翻訳時修飾または翻訳後修飾、例えばシグナルペプチド切断、タンパク質分解的切断、グリコシル化などによってプロセシングされ得る。いくつかの実施形態において、天然に存在するバリアントは、哺乳動物ＸＢＰ１標的核酸、例えば、配列番号１（ハムスター）、配列番号５９０（マウス）または配列番号８０１（ヒト）に示されるものに対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはそれを超える相同性を有する。いくつかの実施形態において、天然に存在するバリアントは、配列番号１のハムスターＸＢＰ１標的核酸に対して少なくとも９９％相同性を有する。いくつかの実施形態において、天然に存在するバリアントは、配列番号５９０のマウスＸＢＰ１標的核酸に対して少なくとも９９％相同性を有する。いくつかの実施形態において、天然に存在するバリアントは、配列番号８０１のヒトＸＢＰ１標的核酸に対して少なくとも９９％相同性を有する。
対応する
２つの別個の核酸またはヌクレオチド配列を参照する場合、本明細書で互換的に使用され得る「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」および「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ）」という用語は、相同性および／または機能性に基づいて互いに対応するまたは類似する配列の領域を明確にするために使用され得るが、特定の配列のヌクレオチドには異なる番号を付すことができる。例えば、遺伝子転写物の異なるアイソフォームは、ヌクレオチド配列の類似のまたは保存された部分を有することができ、そのナンバリングは、選択的スプライシングおよび／または他の修飾に基づいてそれぞれのアイソフォームにおいて異なり得る。さらに、核酸またはヌクレオチド配列を特徴付けるときに異なるナンバリングシステムを使用できることが認識されている（例えば、遺伝子転写物、および翻訳開始コドンから配列のナンバリングを開始するか、または５’ＵＴＲを含めるかどうか）。さらに、遺伝子または遺伝子転写物の異なるバリアントの核酸またはヌクレオチド配列は変化し得ることが認識されている。しかしながら、本明細書で使用される場合、核酸またはヌクレオチド配列の相同性および／または機能性を共有するバリアントの領域は、互いに「対応する」とみなされる。例えば、配列番号１（「参照配列」）のヌクレオチドＸ～Ｙに対応するＸＢＰ１転写物のヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチドＸ～Ｙと同一の配列または類似の配列を有するＸＢＰ１転写物配列（例えば、ＸＢＰ１プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）を指し、Ｘは開始部位であり、Ｙは終了部位である。当業者は、ＸＢＰ１転写物配列を配列番号１と整列させることによって、ＸＢＰ１転写物配列中の対応するＸおよびＹ残基を同定することができる。
ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される「ハイブリダイズ」または「ハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸鎖（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび標的核酸）が対向する鎖上の塩基対間に水素結合を形成することにより二重鎖を形成することと理解されるべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、度々、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される、融解温度（Ｔｍ）の観点から説明される。生理学的条件では、Ｔｍは、親和性に厳密に比例しない（ＭｅｒｇｎｙおよびＬａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５－５３７）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）によって反応の解離定数（Ｋｄ）に関連付けられ、式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水溶液濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃である反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合のΔＧ°は、ゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎら，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６－３８およびＨｏｌｄｇａｔｅら，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されているように、例えば等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法を使用することによって、実験的に測定され得る。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°はまた、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０－１４６５に記載されているように、Ｓｕｇｉｍｏｔｏら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６およびＭｃＴｉｇｕｅら，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５に記載されている適切に誘導した熱力学パラメータを使用して、最近接モデル（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｏｄｅｌ）を用いることにより数値的に推定され得る。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、および例えば－２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば－１２～－４０、例えば－１５～－３０ｋｃａｌ、または－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば－１８～－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で、標的核酸にハイブリダイズする。
転写物
本明細書で使用される「転写物」という用語は、ＤＮＡの転写によって合成され、プロセシング後にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、すなわち前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）になる一次転写物、およびプロセシングされたｍＲＮＡ自体を指し得る。「転写物」という用語は、「プレｍＲＮＡ」および「ｍＲＮＡ」と互換的に使用され得る。ＤＮＡ鎖が一次転写物に転写された後、新たに合成された一次転写物は、異なるタンパク質およびＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを生成するために、それらの成熟した機能的形態に変換されるようにいくつかの方法で修飾される。したがって、用語「転写物」は、エクソン、イントロン、５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲを含み得る。
発現
本明細書で使用される「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えばＲＮＡまたはポリペプチドを産生するプロセスを指す。これには、限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へのポリヌクレオチドの転写およびポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳が含まれる。発現は「遺伝子産物」をもたらす。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載の遺伝子産物には、転写後修飾、例えばポリアデニル化もしくはスプライシングを有する核酸、または翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、もしくはタンパク質分解的切断を有するポリペプチドがさらに含まれる。
化合物番号
本明細書で使用される「化合物番号（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｎｕｍｂｅｒ）」または「化合物番号（Ｃｏｍｐ Ｎｏ．）」という用語は、成分、例えばヌクレオシド（例えば、ＤＮＡ）、ヌクレオシド類似体（例えば、ＬＮＡ、例えば、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ）、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、またはＭＣ）および骨格構造（例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジエステル）の詳細な化学構造を有するヌクレオチド配列に与えられる固有の番号を指す。
配列番号への言及は、特定の核酸配列を含むが、いかなる設計または完全な化学構造も含まない。さらに、本明細書の実施例に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、代表的な設計を示すが、特に指示しない限り、示される特定の設計に限定されない。
対象
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後診断または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、飼育動物、家畜、スポーツ動物、および動物園動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマなどを含む）が含まれる。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
いくつかの実施形態において、対象は、タンパク質病理学的疾患に罹患しているか、またはタンパク質病理学的疾患を発症するリスクがあるヒトである。
医薬組成物
「医薬組成物」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ組成物が投与される対象に許容できないほどに有毒なさらなる成分を含有しない調製物を指す。そのような組成物は無菌であり得る。
タンパク質病理学的疾患
タンパク質病理学的疾患（プロテオパチー、プロテイノパチー、タンパク質コンフォメーション障害、またはタンパク質ミスフォールディング疾患としても知られている）には、プリオン病、例えばクロイツフェルト・ヤコブ病；タウオパチー、例えばアルツハイマー病；シヌクレイノパチー、例えばパーキンソン病；アミロイドーシス、多系統萎縮症；およびＴＤＰ－４３病態、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）；ＣＡＧリピート病、例えば脊髄小脳失調症、例えば脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）および脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３、マチャド・ジョセフ病）などの疾患が含まれる。
有効量
本明細書に開示される組成物（例えば、化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはそのコンジュゲートもしくは塩を含む組成物）の「有効量」は、具体的に述べられた目的を実行するのに十分な量を指す。「有効量」は、述べられた目的に関連して、経験的にかつ日常的な方法で決定され得る。
処置
「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置する（ｔｏ ｔｒｅａｔ）」または「緩和すること（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）」または「緩和する（ｔｏ ａｌｌｅｖｉａｔｅ）」などの用語は、（１）診断された病理学的状態もしくは障害の治癒、減速、症状の軽減、および／または進行の停止を行う治療的手段と、（２）標的病理学的状態または障害、例えばタンパク質病理学的疾患の発症を予防および／または減速する予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指す。したがって、処置が必要なものとしては、障害を既に有するもの、障害を有する傾向があるもの、および障害を予防する必要があるものが挙げられる。特定の実施形態において、患者が、例えば、疾患または障害に関連する症状の全体的、部分的、または一過性の緩和または排除を示す場合、対象は、本明細書で提供される方法に従って、本明細書の他の箇所に開示される疾患または状態に対して成功裏に「処置」される。
抗体
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に示されている。
本明細書で使用される場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）において説明されるＫａｂａｔナンバリングシステムによりナンバリングされ、本明細書では「Ｋａｂａｔによるナンバリング」と称される。具体的には、Ｋａｂａｔ，ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔナンバリングシステム（第６４７～６６０頁を参照されたい）は、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、Ｋａｂａｔ，ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（第６６１～７２３頁を参照されたい）は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３であって、本明細書では、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング」と称することによってさらに明確にされている）に使用される。
本明細書での「抗体」という用語は、最も広義に使用され、全長抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体－抗体断片－融合物ならびにそれらの組合せを含む様々な抗体構造を包含するが、これらに限定されない。
天然抗体
「天然抗体」という用語は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）とそれに続く３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を有し、それにより、第１の重鎖定常ドメインと第２の重鎖定常ドメインとの間にヒンジ領域が配置される。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）とそれに続く軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。
全長抗体
「全長抗体」という用語は、天然抗体の構造と実質的に類似した構造を有する抗体を意味する。全長抗体は、それぞれがＮ末端からＣ末端の方向に、軽鎖可変領域および軽鎖定常ドメインを含む２つの全長抗体軽鎖、ならびにそれぞれがＮ末端からＣ末端の方向に、重鎖可変領域、第１の重鎖定常ドメイン、ヒンジ領域、第２の重鎖定常ドメイン、および第３の重鎖定常ドメインを含む、２つの全長抗体重鎖を含む。天然抗体とは対照的に、全長抗体は、１つ以上の追加のｓｃＦｖ、または重鎖もしくは軽鎖Ｆａｂ断片、または、全長抗体の異なる鎖の１つ以上の末端にコンジュゲートしているが各末端には１つの断片のみであるｓｃＦａｂなどのさらなる免疫グロブリンドメインを含んでもよい。これらのコンジュゲートもまた、全長抗体という用語により包含される。
抗体結合部位
「抗体結合部位」という用語は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの対を意味する。抗原への適切な結合を確実にするために、これらの可変ドメインは同族の可変ドメインであり、すなわち一緒に属する。抗体結合部位は、少なくとも３つのＨＶＲ（例えば、ＶＨＨの場合）または３～６つのＨＶＲ（例えば、天然に存在する、すなわち、ＶＨ／ＶＬ対を有する従来の抗体の場合）を含む。一般に、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基が、結合部位を形成する。これらの残基は通常、抗体重鎖可変ドメインと対応する抗体軽鎖可変ドメインの対に含まれる。抗体の抗原結合部位は、「超可変領域」または「ＨＶＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」領域は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、領域ＦＲ１、ＨＶＲ１、ＦＲ２、ＨＶＲ２、ＦＲ３、ＨＶＲ３、およびＦＲ４を含む。特に、重鎖可変ドメインのＨＶＲ３領域は、抗原結合に最も寄与し、抗体の結合特異性を定義する領域である。「機能的結合部位」は、その標的に特異的に結合することができる。「特異的に結合する」という用語は、インビトロアッセイにおいて、一実施形態では結合アッセイにおいて、その標的への結合部位の結合を意味する。そのような結合アッセイは、結合事象が検出され得る限り、任意のアッセイであり得る。例えば、抗体を表面に結合させ、該抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、結合アッセイである。あるいは、ブリッジングＥＬＩＳＡを使用することができる。
超可変領域
「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、超可変的な配列（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）であり、かつ／または構造的に定義されるループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ／または抗原に接触する残基（「抗原接触」）を含有するアミノ酸残基ストレッチを含む、抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、重鎖可変ドメインＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、軽鎖可変ドメインＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。
ＨＶＲには、次のものが含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）９０１－９１７）、
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２）、
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、および９３～１０１（Ｈ３）に生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍらＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））、ならびに
（ｄ）アミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）、および９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）の組合せ。
別段の指示がない限り、ＨＶＲ残基および可変ドメインの他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、上記のＫａｂａｔらに従ってナンバリングされている。
抗体クラス
抗体の「クラス」は、定常ドメインまたは定常領域、好ましくはその重鎖が持つＦｃ領域の種類を指す。抗体には、次の５種類の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかを、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けてもよい。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
重鎖定常領域
「重鎖定常領域」という用語は、定常ドメイン、すなわち、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖の領域を意味する。一実施形態において、ヒトＩｇＧ定常領域は、重鎖のＡｌａ１１８からカルボキシル末端に及ぶ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。しかし、定常領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、または存在していなくてもよい（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。「定常領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合することができる２つの重鎖定常領域を含む二量体を意味する。
重鎖Ｆｃ領域
「重鎖Ｆｃ領域」という用語は、少なくとも一部のヒンジ領域（中央および下部ヒンジ領域）、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ａｓｐ２２１またはＣｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端に及ぶ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。したがって、Ｆｃ領域は定常領域よりも小さいが、Ｃ末端部分はそれと同一である。しかしながら、重鎖Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもよく、または存在しなくてもよい（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。「Ｆｃ領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合することができる２つの重鎖Ｆｃ領域を含む二量体を意味する。
抗体の定常領域、より正確にはＦｃ領域（および同様に定常領域）は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、Ｃ３活性化、およびＦｃ受容体結合に直接関与している。補体系に対する抗体の影響は、特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ領域における規定の結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は、先行技術で公知であり、例えば、Ｌｕｋａｓ，Ｔ．Ｊ．，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）２５５５－２５６０；Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．，およびＣｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７－９１７；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ら，Ｎａｔｕｒｅ ２８８（１９８０）３３８－３４４；Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．，ら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５－１００４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．，ら．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８－４１８４；Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．，ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２００１）１２１６１－１２１６８；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．，ら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９－３２４；および欧州特許第０３０７４３４号において記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９である（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３の抗体は通常、補体活性化、Ｃ１ｑ結合およびＣ３活性化を示すのに対し、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑと結合せず、Ｃ３を活性化しない。「抗体のＦｃ領域」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。
モノクローナル抗体
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得るバリアント抗体は例外であり、かかるバリアントは一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない種々の技術によって作製されてもよい。
価数
「価数」という用語は、本出願内で使用される場合、抗体内の特定数の結合部位の存在を意味する。したがって、「二価」、「四価」および「六価」という用語は、抗体内のそれぞれ２個の結合部位、４個の結合部位および６個の結合部位の存在を意味する。
単一特異性抗体
「単一特異性抗体」は、単一の結合特異性を有する、すなわち、１つの抗原に特異的に結合する抗体を意味する。単一特異性抗体は、全長抗体もしくは抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）またはそれらの組合せ（例えば、全長抗体と追加のｓｃＦｖまたはＦａｂ断片）として調製され得る。単一特異性抗体は、一価である必要はない。すなわち、単一特異性抗体は、１つの抗原に特異的に結合する１つを超える結合部位を含んでもよい。例えば、天然抗体は、単一特異性であるが二価である。
多重特異性抗体
「多重特異性抗体」は、同じ抗原または２つの異なる抗原上の少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体を意味する。多重特異性抗体は、全長抗体もしくは抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）またはそれらの組合せ（例えば、全長抗体と追加のｓｃＦｖまたはＦａｂ断片）として調製され得る。多重特異性抗体は、少なくとも二価であり、すなわち、２つの抗原結合部位を含む。さらに、多重特異性抗体は、少なくとも二重特異性である。したがって、二価の二重特異性抗体は、多重特異性抗体の最も単純な形態である。２つ、３つまたはより多く（例えば、４つ）の機能的な抗原結合部位を有する操作された抗体も報告されている（例えば、米国特許出願公開第２００２／０００４５８７号を参照）。
特定の実施形態において、抗体は、多重特異性抗体、例えば、少なくとも二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原またはエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態において、１つの結合特異性は第１の抗原に対するものであり、他は、異なる第２の抗原に対するものである。特定の実施形態において、多重特異性抗体は、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。多重特異性抗体を使用して、抗原を発現する細胞に細胞毒性剤を局在化させてもよい。
多重特異性抗体は、全長抗体または抗体－抗体断片－融合物として調製され得る。
多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．およびＣｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０５（１９８３）５３７－５４０、国際公開第９３／０８８２９号、ならびにＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．１０（１９９１）３６５５－３６５９を参照）、および「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の改変（国際公開第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体もしくは断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、およびＢｒｅｎｎａｎ，Ｍ．，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（１９８５）８１－８３を参照）；ロイシンジッパーを使用した二重特異性抗体の産生（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（１９９２）１５４７－１５５３を参照）；軽鎖のミスペアリング問題を回避するための、一般的な軽鎖技術の使用（例えば、国際公開第９８／５０４３１号を参照）；二重特異性抗体断片を作製するための特定の技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）６４４４－６４４８を参照）；および、例えばＴｕｔｔ，Ａ．，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）６０－６９に記載されている三重特異性抗体の調製により作製されてもよい。
例えば、「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」を含む３つ以上の抗原結合部位を有する操作された抗体、またはＤＶＤ－Ｉｇも本明細書に含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号および国際公開第２００８／０２４７１５号を参照）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、および国際公開第２０１３／０２６８３１号に見出され得る。二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、「二重作用Ｆａｂ」または「ＤＡＦ」もまた含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号および国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照）。
多重特異性抗体はまた、同じ抗原特異性の１つ以上の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称の形で、すなわちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号および国際公開第２０１５／１５０４４７号を参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（国際公開第２００９／０８０２５３号を参照）または完全なＦａｂアーム（国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号を参照、Ｓｃｈａｅｆｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８（２０１１）１１８７－１１９１、およびＫｌｅｉｎら，ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－１０２０も参照）を交換することによっても提供され得る。一態様において、多重特異性抗体はクロスＦａｂ断片を含む。「クロスＦａｂ断片」または「ｘＦａｂ断片」または「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。クロスＦａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域１（ＣＨ１）とで構成されるポリペプチド鎖、および重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるポリペプチド鎖を含む。非対称Ｆａｂアームはまた、荷電または非荷電アミノ酸突然変異をドメインインターフェースに導入して正しいＦａｂペアリングを指示することによって操作され得る。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照。
抗体または断片はまた、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号または国際公開第２０１０／１４５７９３号に記載されている多重特異性抗体であり得る。
抗体またはその断片はまた、国際公開第２０１２／１６３５２０号に開示されるような多重特異性抗体であってもよい。
多重特異性抗体の様々なさらなる分子フォーマットが当技術分野で公知であり、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）９５－１０６を参照）。
二重特異性抗体は、一般に、同じ抗原上の２つの異なる重複しないエピトープまたは異なる抗原上の２つのエピトープに特異的に結合する抗体分子である。
複合体（多重特異性）抗体は、以下のものである。
－ ドメイン交換を有する全長抗体：
第１のＦａｂ断片および第２のＦａｂ断片を含む多重特異性ＩｇＧ抗体であって、第１のＦａｂ断片において、
ａ）ＣＨ１およびＣＬドメインのみが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含む）；ｂ）ＶＨおよびＶＬドメインのみが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含む）；または
ｃ）ＣＨ１およびＣＬドメインが互いに置き換えられ、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＬドメインを含む）；および
第２のＦａｂ断片は、ＶＬおよびＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含む；
ドメイン交換を有する全長抗体は、ＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖と、ＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖とを含み得、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号または国際公開第２０１３／０９６２９１号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、第１重鎖および修飾された第２重鎖のヘテロ二量体化を支援するために、両ＣＨ３ドメインは、それぞれのアミノ酸置換によって、相補的な様式で操作されている、多重特異性ＩｇＧ抗体；
－ ドメイン交換および追加の重鎖Ｃ末端結合部位を有する全長抗体：
多重特異性ＩｇＧ抗体であって、
ａ）全長抗体軽鎖と全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの全長抗体であって、全長重鎖と全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１の抗原に特異的に結合する、１つの全長抗体と、
ｂ）１つの追加のＦａｂ断片であって、追加のＦａｂ断片が全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、追加のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、１つの追加のＦａｂ断片と、を含み、
第２の抗原に特異的に結合する追加のＦａｂ断片が、ｉ）ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられている、またはｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含むか、またはｉｉ）一本鎖Ｆａｂ断片である、多重特異性ＩｇＧ抗体；
－ １アーム一本鎖フォーマット（＝１アーム一本鎖抗体）：
第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖カッパ定常ドメイン）
－ 軽鎖／重鎖の組合せ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）
－ 重鎖（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）；
－ ２アーム一本鎖抗体：
第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－ 軽鎖／重鎖１の組合せ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
－ 軽鎖／重鎖２の組合せ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）；
－ 共通の軽鎖二重特異性抗体：
第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン）
－ 重鎖１（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
－ 重鎖２（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）；
－ Ｔ細胞二重特異性抗体：
ドメイン交換を有する追加の重鎖Ｎ末端結合部位を有する全長抗体であって、
－ 第１および第２のＦａｂ断片であって、第１および第２のＦａｂ断片の各結合部位が第１の抗原に特異的に結合する、第１および第２のＦａｂ断片と、
－ 第３のＦａｂ断片であって、第３のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合し、第３のＦａｂ断片が、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片と、
－ 第１のＦｃ領域ポリペプチドと第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含むＦｃ領域と、を含み、
第１のＦａｂ断片および第２のＦａｂ断片は、それぞれ、重鎖断片および全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている、全長抗体；
－ 抗体－多量体融合物であって、
（ａ）抗体重鎖および抗体軽鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体重鎖ＣＨ１ドメインまたは抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、および抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、および第１のポリペプチドが抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、または第１のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドと、を含み、
（ｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ｂ）の第１の融合ポリペプチド、（ｉｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ａ）の抗体軽鎖、および（ｉｉｉ）（ｂ）の第１の融合ポリペプチドと（ｂ）の第２の融合ポリペプチドが、それぞれ互いに独立して、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
抗体重鎖および抗体軽鎖の可変ドメインが、抗原に特異的に結合する結合部位を形成する、抗体－多量体融合物。
「ノブ・イントゥー・ホール」二量体化モジュールおよび抗体操作におけるその使用は、Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．；Ｒｉｄｇｗａｙ Ｊ．Ｂ．Ｂ．；Ｐｒｅｓｔａ Ｌ．Ｇ．：Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第２巻，第１号，１９９６年２月，第７３～７３（１）頁に記載されている。
抗体の重鎖のＣＨ３ドメインは、「ノブ・イントゥー・ホール」技術によって改変され得る。これは、例えば、国際公開第９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７－６２１；およびＭｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７－６８１に、いくつかの例を伴って詳細に記載されている。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を改変して、これら２つのＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を増加させ、それによってそれらを含むポリペプチドのヘテロ二量体化を増加させる。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインのそれぞれは「ノブ」であり得、他方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入はさらに、ヘテロ二量体を安定化させ（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１；Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．，ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６－３５）、収量を増加させる。
（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインの変異Ｔ３６６Ｗは、「ノブ変異」または「変異ノブ」として表され、（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインの変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖは、「ホール変異」または「変異ホール」として表される（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。ＣＨ３ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋も、例えば、「ノブ変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ変異を導入すること（「ノブ－ｃｙｓ－変異」または「変異ノブ－ｃｙｓ」と表記）、および「ホール変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異を導入すること（「ホール－ｃｙｓ－変異」または「変異ホール－ｃｙｓ」と表記）により、使用することができる（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）。
ドメインクロスオーバー
「ドメインクロスオーバー」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１断片とその対応する同族の抗体軽鎖との対において、すなわち抗体Ｆａｂ（断片－抗原結合）において、少なくとも１つの重鎖ドメインが、その対応する軽鎖ドメインによって置換されており、その逆も同様である、という点について、ドメイン配列が天然抗体の配列から逸脱していることを意味する。ドメインクロスオーバーは、一般的に３種類あり、（ｉ）ＣＨ１およびＣＬドメインのクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列（またはＶＨ－ＣＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン配列を有する全長抗体重鎖）がもたらされるもの、（ｉｉ）ＶＨおよびＶＬドメインのドメインクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされるもの、ならびに（ｉｉｉ）完全な軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）および完全なＶＨ－ＣＨ１重鎖断片のドメインクロスオーバー（「Ｆａｂクロスオーバー」）であって、ドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＨ１ドメイン配列を有する軽鎖がもたらされ、ドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＬドメイン配列を有する重鎖断片がもたらされるもの（上述のすべてのドメイン配列は、Ｎ末端からＣ末端への方向で示されている）がある。
互いに置き換えられた
本明細書で使用される場合、対応する重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインに関して「互いに置き換えられた」という用語は、上述のドメインクロスオーバーを指す。そのため、ＣＨ１およびＣＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目（ｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバー、ならびに結果として生じる重鎖および軽鎖ドメイン配列を指す。したがって、ＶＨおよびＶＬが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目（ｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指し、またＣＨ１およびＣＬドメインが「互いに置き換えられ」、かつＶＨおよびＶＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目（ｉｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指す。ドメインクロスオーバーを含む二重特異性抗体は、例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、およびＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８（２０１１）１１１８７－１１１９２において報告されている。このような抗体は、一般にＣｒｏｓｓＭａｂと呼ばれる。
多重特異性抗体はまた、一実施形態において、上記の項目（ｉ）で述べたＣＨ１およびＣＬドメインのドメインクロスオーバー、または上記の項目（ｉｉ）で述べたＶＨおよびＶＬドメインのドメインクロスオーバー、または上記の項目（ｉｉｉ）で述べたＶＨ－ＣＨ１およびＶＬ－ＶＬドメインのドメインクロスオーバーのいずれかを含む、少なくとも１つのＦａｂ断片を含む。ドメインクロスオーバーを伴う多重特異性抗体の場合、同じ抗原に特異的に結合するＦａｂは、同じドメイン配列であるように構築される。そのため、ドメインクロスオーバーを伴う１つを超えるＦａｂが、多重特異性抗体に含まれる場合、該Ｆａｂは、同じ抗原に特異的に結合する。
ヒト化
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基、およびヒトＦＲからのアミノ酸残基を含む抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むものであり、それにおいて、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する少なくとも一部の抗体定常領域を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
組換え抗体
「組換え抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、組換え細胞などの組換え手段により調製、発現、作製または単離されたすべての抗体（キメラ、ヒト化およびヒト）を意味する。これには、ＮＳ０、ＨＥＫ、ＢＨＫ、羊膜細胞、ＣＨＯ細胞などの組換え細胞から単離された抗体が含まれる。
抗体断片
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指し、すなわちそれは、機能的な断片である。抗体断片の例としては、以下に限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性Ｆａｂ、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｃＦａｂ）が挙げられる。
組換え法
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように、組換え法および組成物を使用して産生され得る。これらの方法のために、抗体をコードする１つ以上の単離された核酸が提供される。
一態様において、抗体を作製する方法が提供され、本方法は、上記で提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意に、抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することと、を含み、少なくとも１つの培養工程は、本発明による化合物の存在下で行われる。
抗体の組換え産生に関しては、例えば、上述の抗体をコードする核酸が単離され、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞内での発現のために、１つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離および配列決定され得るか、または組換え法によって産生され得るか、または化学合成によって得られ得る。
組換え哺乳動物細胞
通常、例えば治療用抗体のような目的のポリペプチドの組換え大量産生のためには、該ポリペプチドを安定に発現し分泌する細胞が必要とされる。
この細胞は、「組換え哺乳動物細胞」または「組換え産生細胞」であり、このような細胞を作製するために使用される方法は「細胞株開発」と呼ばれる。細胞株開発方法の第１の工程において、例えばＣＨＯ細胞などの好適な宿主細胞に、該目的のポリペプチドの発現に好適な核酸配列をトランスフェクトする。第２の工程において、目的のポリペプチドを安定に発現する細胞を、目的のポリペプチドをコードする核酸と共にコトランスフェクトしておいた選択マーカーの共発現に基づいて選択する。
ポリペプチドをコードする核酸、すなわちコード配列は、構造遺伝子と呼ばれる。このような構造遺伝子は、純粋なコード情報である。したがって、その発現にはさらなる調節エレメントが必要である。したがって、通常、構造遺伝子はいわゆる発現カセットに組み込まれる。発現カセットが哺乳動物細胞において機能的となるために必要とされる最小限の調節エレメントは、構造遺伝子の上流、すなわち５’側に位置する、該哺乳動物細胞において機能的なプロモーター、および構造遺伝子の下流、すなわち３’側に位置する、該哺乳動物細胞において機能的なポリアデニル化シグナル配列である。プロモーター、構造遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列は、作動可能に連結された形態で並べられる。
目的のポリペプチドが、異なる（単量体）ポリペプチド、例えば、抗体または複合体抗体フォーマットなどから構成されるヘテロ多量体ポリペプチドである場合、単一の発現カセットが必要であるだけでなく、含まれる構造遺伝子が異なる多数の発現カセット、すなわち、ヘテロ多量体ポリペプチドの異なる（単量体）ポリペプチドのそれぞれに対して少なくとも１つの発現カセットが必要である。例えば、全長抗体は、軽鎖の２つのコピーおよび重鎖の２つのコピーを含むヘテロ多量体ポリペプチドである。したがって、全長抗体は、２つの異なるポリペプチドから構成される。したがって、全長抗体の発現のためには２つの発現カセット、すなわち軽鎖のための１つおよび重鎖のための１つが必要とされる。例えば、全長抗体が二重特異性抗体である場合、すなわち、抗体が２つの異なる抗原に特異的に結合する２つの異なる結合部位を含む場合、２つの軽鎖および２つの重鎖もまた互いに異なる。したがって、このような二重特異性全長抗体は、４つの異なるポリペプチドで構成されているため、４つの発現カセットが必要となる。
発現ベクター
目的のポリペプチドのための発現カセットは、一般に、１つ以上のいわゆる「発現ベクター」に組み込まれる。「発現ベクター」は、細菌細胞中で該ベクターを増幅し、かつ含まれる構造遺伝子を哺乳動物細胞中で発現させるのに必要とされるすべてのエレメントを提供する核酸である。典型的には、発現ベクターは、例えば大腸菌の場合、複製開始点および原核生物選択マーカー、さらには真核生物選択マーカー、ならびに目的の構造遺伝子の発現に必要とされる発現カセットを含む、原核生物プラスミド増殖単位を含む。「発現ベクター」は、哺乳動物細胞に発現カセットを導入するための輸送運搬体である。
発現しようとするポリペプチドが複雑であるほど、必要とされる異なる発現カセットの数もまた多くなる。本質的に、発現カセットの数と共に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる核酸のサイズも大きくなる。同時に、発現ベクターのサイズも大きくなる。しかし、ベクターのサイズの実用的な上限は約１５ｋｂｐの範囲にあり、それを上回ると、操作および処理の効率が著しく落ちる。この問題は、２つ以上の発現ベクターを用いることによって対処され得る。それにより、発現カセットは、それぞれが発現カセットの一部のみを含む異なる発現ベクター間で分割され得、その結果サイズの縮小がもたらされる。
細胞株開発
例えば多重特異性抗体などの異種ポリペプチドを発現する組換え細胞を生成するための細胞株開発（ＣＬＤ）は、目的の異種ポリペプチドの発現および産生に必要なそれぞれの発現カセットを含む核酸のランダム組込み（ＲＩ）または標的化組込み（ＴＩ）のいずれかを使用する。
ＲＩを使用すると、一般に、複数のベクターまたはその断片が、同一または異なる遺伝子座で細胞のゲノムに組み込まれる。
ＴＩを使用すると、一般に、異なる発現カセットを含む導入遺伝子の単一コピーが、宿主細胞のゲノムの所定の「ホットスポット」に組み込まれる。
ＲＩ ＣＬＤとは違って、標的化組込み（ＴＩ）ＣＬＤは、細胞のゲノム中の所定の「ホットスポット」に、異なる発現カセットを含む導入遺伝子を導入する。また、この導入は、所定の比率の発現カセットを用いる。その結果、この理論に拘束されるわけではないが、ヘテロ多量体ポリペプチドの異なるポリペプチドのすべてが、同じ（または少なくとも同程度であり、わずかに異なるだけの）速度かつ適切な比率で発現される。
また、所定のコピー数および所定の組込み部位が与えられたとすると、ＴＩによって得られる組換え細胞は、ＲＩによって得られる細胞と比べて、優れた安定性を有しているはずである。さらに、選択マーカーは、適切なＴＩを有する細胞を選択するためだけに使用され、高レベルの導入遺伝子発現を示す細胞を選択するためには使用されないことから、メトトレキサート（ＭＴＸ）またはメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）のような選択剤の突然変異誘発性が原因の一部である配列バリアント（ＳＶ）が生じる可能性を最小限にするために、突然変異誘発性の低いマーカーを適用してよい。
（グリコシル化された）抗体の発現に好適な宿主細胞は、一般に、例えば脊椎動物などの多細胞生物に由来する。
宿主細胞
懸濁液中で増殖するように適合された任意の哺乳動物細胞株を、本発明による方法で使用することができる。さらに、組込み法とは無関係に、すなわち、ＲＩおよびＴＩの場合、任意の哺乳動物宿主細胞を使用することができる。
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ヒト羊膜細胞（例えば、Ｗｏｅｌｆｅｌ，Ｊ．ら，ＢＭＣ Ｐｒｏｃ．５（２０１１）Ｐ１３３に記載のＣＡＰ－Ｔ細胞）；ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９－７４）に記載のＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３－２５２）に記載のＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ら，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４－６８に記載の）；ＭＲＣ５細胞；およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）４２１６－４２２０）、および、骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０が挙げられる。
抗体産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．およびＷｕ，Ａ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２４８巻，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００４）、第２５５～２６８頁を参照されたい。
一実施形態において、哺乳動物宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４など）、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、リンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０細胞）、またはヒト羊膜細胞（例えば、ＣＡＰ－Ｔなど）である。好ましい一実施形態において、哺乳動物（宿主）細胞は、ＣＨＯ細胞である。
標的化組込みにより、哺乳動物細胞ゲノムの所定の部位に外因性ヌクレオチド配列が組み込まれることが可能になる。特定の実施形態において、標的化組込みは、ゲノムおよび組み込まれる外因性ヌクレオチド配列に存在する１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を認識するリコンビナーゼによって媒介される。特定の実施形態において、標的化組込みは、相同組換えによって媒介される。
組換え認識配列
「組換え認識配列」（ＲＲＳ）は、リコンビナーゼによって認識され、リコンビナーゼに媒介された組換え事象のために必要かつ十分である、ヌクレオチド配列である。ＲＲＳを用いて、ヌクレオチド配列中の組換え事象が起こると考えられる位置を定めることができる。
特定の実施形態において、ＲＲＳは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、ＲＲＳは、ＦＬＰリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、ＲＲＳは、Ｂｘｂ１インテグラーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、ＲＲＳは、φＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。
ＲＲＳがＬｏｘＰ部位である特定の実施形態において、細胞は、組換えを行うためにＣｒｅリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＦＲＴ部位である特定の実施形態において、細胞は、組換えを行うためにＦＬＰリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＢｘｂ１ ａｔｔＰ部位またはＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位である特定の実施形態において、細胞は、組換えを行うためにＢｘｂ１インテグラーゼを必要とする。ＲＲＳがφＣ３１ ａｔｔＰ部位またはφＣ３１ ａｔｔＢ部位である特定の実施形態において、細胞は、組換えを行うためにφＣ３１インテグラーゼを必要とする。これらのリコンビナーゼは、これらの酵素のコード配列を含む発現ベクターを用いて、またはタンパク質もしくはｍＲＮＡとして細胞中に導入され得る。
ＴＩに関して、ゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれた、本明細書に記載のランディング部位を含む、ＴＩに好適な任意の既知または将来の哺乳動物宿主細胞を、本発明において使用することができる。このような細胞は、哺乳動物ＴＩ宿主細胞と呼ばれる。特定の実施形態において、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、本明細書に記載のランディング部位を含む、ハムスター細胞、ヒト細胞、ラット細胞、またはマウス細胞である。好ましい一実施形態において、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。特定の実施形態において、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、ゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれた、本明細書に記載のランディング部位を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ Ｋ１細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ ＤＵＫＸＢ－１１細胞、ＣＨＯ Ｋ１Ｓ細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞である。
特定の実施形態において、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、組み込まれたランディング部位を含み、ランディング部位は、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含む。ＲＲＳは、リコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、またはφＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。ＲＲＳは、互いに独立して、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、およびφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択され得る。複数のＲＲＳが存在しなければならない場合、同一でないＲＲＳが選択される限りにおいて、各配列の選択は他方に依存する。
特定の実施形態において、ランディング部位は、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、ＲＲＳは、リコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、組み込まれたランディング部位は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。特定の実施形態において、組み込まれたランディング部位は、３つのＲＲＳを含み、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置する。特定の好ましい実施形態において、３つのＲＳＳはすべて異なる。特定の実施形態において、ランディング部位は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および第３のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含み、かつ第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳおよび／または第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態において、ランディング部位は、さらに第２の選択マーカーを含み、かつ第１および第２の選択マーカーは異なる。特定の実施形態において、ランディング部位は、第３の選択マーカーおよび内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）もさらに含み、該ＩＲＥＳは該第３の選択マーカーに作動可能に連結されている。第３の選択マーカーは、第１または第２の選択マーカーとは異なり得る。
本発明は、以下ＣＨＯ細胞で例示されるが、これは本発明を例示するためにのみ提示され、限定として解釈されるべきではない。本発明の真の範囲は、特許請求の範囲に記載されている。
本発明による方法における使用に好適な例示的な哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、そのゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれたランディング部位を有するＣＨＯ細胞であり、ランディング部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼに媒介されたＤＮＡ組換えのための３つの異種特異的ｌｏｘＰ部位を含む。
この例では、異種特異的ｌｏｘＰ部位は、Ｌ３、ＬｏｘＦａｓ、および２Ｌであり（例えば、Ｌａｎｚａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．７（２０１２）８９８－９０８；Ｗｏｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７を参照）、その際、Ｌ３および２Ｌはランディング部位の５’末端および３’末端にそれぞれ隣接し、ＬｏｘＦａｓはＬ３部位と２Ｌ部位の間に位置している。ランディング部位は、ＩＲＥＳを介した選択マーカーの発現を蛍光性ＧＦＰタンパク質の発現に結び付けて、ポジティブ選択によってランディング部位を安定化すること、ならびにトランスフェクションおよびＣｒｅ組換え後に該部位が存在しないものを選択すること（ネガティブ選択）を可能にする、バイシストロン性単位をさらに含む。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、ＲＭＣＥ反応をモニターするのに役立つ。
先の段落で概説したようにランディング部位がこのように編成されていることによって、２つのベクター、例えば、いわゆる、Ｌ３部位およびＬｏｘＦａｓ部位を有するフロントベクターならびにＬｏｘＦａｓ部位および２Ｌ部位を有するバックベクターの同時組込みが可能になる。ランディング部位に存在するものとは異なる、選択マーカー遺伝子の機能的エレメントは、両方のベクター間に分配され得、プロモーターおよび開始コドンはフロントベクター上に位置し得るのに対し、コード領域およびポリＡシグナルはバックベクター上に位置している。両方のベクターに由来する該核酸の正しいリコンビナーゼ媒介組込みのみが、それぞれの選択剤に対する耐性を誘導する。
通常、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれるランディング部位を含む哺乳動物細胞であって、該ランディング部位が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列および第２の組換え認識配列、ならびに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なっている、ランディング部位を含む哺乳動物細胞である。
選択マーカーは、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、およびＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ならびにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され得る。また、選択マーカーは、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光性タンパク質（ＹＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光性タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ６、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅからなる群から選択される蛍光性タンパク質であり得る。
外因性ヌクレオチド配列は、特定の細胞に由来しないが、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、または形質転換法などによって該細胞に導入され得るヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、哺乳動物細胞のゲノム中の１つ以上の組込み部位に組み込まれた少なくとも１つのランディング部位を含む。特定の実施形態において、ランディング部位は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の１つ以上の組込み部位に組み込まれる。
特定の実施形態において、組み込まれたランディング部位は、少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態において、組み込まれたランディング部位は、第１、第２および第３のＲＲＳ、ならびに少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態において、選択マーカーは、第１と第２のＲＲＳの間に位置している。特定の実施形態において、２つのＲＲＳは、少なくとも１つの選択マーカーに隣接する。すなわち、第１のＲＲＳが選択マーカーの５’（上流）に位置し、第２のＲＲＳが選択マーカーの３’（下流）に位置している。特定の実施形態において、第１のＲＲＳは選択マーカーの５’末端と隣り合っており、第２のＲＲＳは、選択マーカーの３’末端に隣り合っている。特定の実施形態において、ランディング部位は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および第３のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第３のＲＲＳの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含む。
特定の実施形態において、選択マーカーは第１と第２のＲＲＳの間に位置しており、かつこれら２つの隣接ＲＲＳは互いに異なる。特定の好ましい実施形態において、第１の隣接ＲＲＳはＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、第２の隣接ＲＲＳはＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。特定の実施形態において、ＬｏｘＰ Ｌ３配列は選択マーカーの５’に位置しており、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列は選択マーカーの３’に位置している。特定の実施形態において、第１の隣接ＲＲＳは野生型ＦＲＴ配列であり、第２の隣接ＲＲＳは変異ＦＲＴ配列である。特定の実施形態において、第１の隣接ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態において、第１の隣接ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態において、２つのＲＲＳは、同じ向きに位置決めされている。特定の実施形態において、２つのＲＲＳは、両方が順方向または逆方向に向いている。特定の実施形態において、２つのＲＲＳは、反対の向きに位置決めされている。
特定の実施形態において、組み込まれたランディング部位は、２つのＲＳＳが隣接する、第１の選択マーカーおよび第２の選択マーカーを含み、該第１の選択マーカーは該第２の選択マーカーとは異なる。特定の実施形態において、２つの選択マーカーのどちらも、互いに独立して、グルタミン合成酵素選択マーカー、チミジンキナーゼ選択マーカー、ＨＹＧ選択マーカー、およびピューロマイシン耐性選択マーカーからなる群から選択される。特定の実施形態において、組み込まれたランディング部位は、チミジンキナーゼ選択マーカーおよびＨＹＧ選択マーカーを含む。特定の実施形態において、第１の選択マーカーは、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、およびＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ならびにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され、第２の選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ蛍光性タンパク質からなる群から選択される。特定の実施形態において、第１の選択マーカーはグルタミン合成酵素選択マーカーであり、第２の選択マーカーはＧＦＰ蛍光性タンパク質である。特定の実施形態において、両方の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは異なっている。
特定の実施形態において、選択マーカーは、プロモーター配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、選択マーカーは、ＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態において、選択マーカーは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに作動可能に連結されている。
標的化組込み
本発明による組換え哺乳動物細胞を作製するための１つの方法は、標的化組込み（ＴＩ）である。
標的化組込みでは、哺乳動物ＴＩ宿主細胞のゲノム中の特定の遺伝子座に外因性核酸を導入するために部位特異的組換えが用いられる。これは、ゲノムにおける組込み部位の配列が外因性核酸と交換される酵素プロセスである。このような核酸交換を行うために使用される１つの系は、Ｃｒｅ－ｌｏｘ系である。交換を触媒する酵素はＣｒｅリコンビナーゼである。交換される配列は、ゲノム内および外因性核酸内の２つのｌｏｘ（Ｐ）部位の位置によって定義される。これらのｌｏｘ（Ｐ）部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識される。他に必要とされるものはなく、すなわち、ＡＴＰなども必要とされない。元々、Ｃｒｅ－ｌｏｘ系はバクテリオファージＰ１で発見された。
Ｃｒｅ－ｌｏｘ系は、哺乳動物、植物、細菌、および酵母など、異なる細胞型で機能する。
一実施形態において、異種ポリペプチドをコードする外因性核酸は、単一または二重リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）によって哺乳動物ＴＩ宿主細胞に組み込まれている。それにより、組換えＣＨＯ細胞などの組換え哺乳動物細胞が得られ、その中で、定義された特異的な発現カセット配列が単一の遺伝子座でゲノムに組み込まれ、それが次に異種ポリペプチドの効率的な発現および産生をもたらす。
Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ部位特異的組換え系は、多くの生物学的実験系において広く使用されている。Ｃｒｅリコンビナーゼは、３４ｂｐのＬｏｘＰ配列を認識する３８ｋＤａの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼである。ＣｒｅリコンビナーゼはバクテリオファージＰ１に由来し、チロシンファミリーの部位特異的リコンビナーゼに属する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＬｏｘＰ配列間の分子内組換えと分子間組換えの両方を媒介することができる。ＬｏｘＰ配列は、２つの１３ｂｐインバートリピートに隣接する８ｂｐの非パリンドロームコア領域から構成される。Ｃｒｅリコンビナーゼは１３ｂｐリピートに結合し、それによって８ｂｐのコア領域内での組換えを媒介する。Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ媒介組換えは、高い効率で起こり、他のいかなる宿主因子も必要としない。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で同じ方向に配置されている場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介組換えは、２つのＬｏｘＰ配列の間に位置するＤＮＡ配列を共有結合で閉じた環として切り取るであろう。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で逆方向の位置に配置されている場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介組換えは、２つの配列の間に位置するＤＮＡ配列の向きを反転するであろう。２つのＬｏｘＰ配列が２つの異なるＤＮＡ分子上にあり、１つのＤＮＡ分子が環状である場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介組換えにより、環状ＤＮＡ配列の組込みがもたらされるであろう。
一致ＲＲＳ
用語「一致ＲＲＳ」とは、２つのＲＲＳ間で組換えが起こることを示す。特定の実施形態において、２つの一致ＲＲＳは同じである。特定の実施形態において、どちらのＲＲＳも、野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態において、どちらのＲＲＳも、変異ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態において、どちらのＲＲＳも、野生型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態において、どちらのＲＲＳも、変異ＦＲＴ配列である。特定の実施形態において、２つの一致ＲＲＳは、異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、第１の一致ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の一致ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態において、第１の一致ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列であり、第２の一致ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列である。
２プラスミドＲＭＣＥ
「２プラスミドＲＭＣＥ」戦略または「二重ＲＭＣＥ」は、２つのベクターの組合せを使用する場合、本発明による方法で用いられる。例えば、限定されるものではないが、組み込まれたランディング部位は、３つのＲＲＳ、例えば、第３のＲＲＳ（「ＲＲＳ３」）が第１のＲＲＳ（「ＲＲＳ１」）と第２のＲＲＳ（「ＲＲＳ２」）の間に存在する配置を含み得、一方、第１のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含み、第２のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第３のＲＲＳおよび第２のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含む。
２プラスミドＲＭＣＥ戦略では、３つのＲＲＳ部位を使用して、２つの独立したＲＭＣＥを同時に実行することを含む。したがって、２プラスミドＲＭＣＥ戦略を用いる哺乳動物ＴＩ宿主細胞のランディング部位は、第１のＲＲＳ部位（ＲＲＳ１）に対しても第２のＲＲＳ部位（ＲＲＳ２）に対しても交差活性を有していない第３のＲＲＳ部位（ＲＲＳ３）を含む。標的化される２つのプラスミドは、効率的な標的化のために同じ隣接ＲＲＳ部位を必要とし、一方のプラスミド（フロント）にはＲＲＳ１およびＲＲＳ３が隣接し、他方（バック）にはＲＲＳ３およびＲＲＳ２が隣接している。さらに、２プラスミドＲＭＣＥでは、２つの選択マーカーが必要とされる。１つの選択マーカー発現カセットは、２つの部分に分割された。フロントプラスミドは、プロモーターとそれに続く開始コドンおよびＲＲＳ３配列を含む。バックプラスミドは、開始コドン（ＡＴＧ）を欠き、選択マーカーコード領域のＮ末端に融合されたＲＲＳ３配列を有する。融合タンパク質のインフレーム翻訳、すなわち作動可能な連結を確実にするために、ＲＲＳ３部位と選択マーカー配列の間に追加のヌクレオチドを挿入する必要がある場合がある。両方のプラスミドが正確に挿入された場合にのみ、選択マーカーの完全な発現カセットが組み立てられ、したがって、各選択剤に対する耐性が細胞に与えられる。
２プラスミドＲＭＣＥは、リコンビナーゼによって触媒される、標的ゲノム遺伝子座内の２つの異種特異的ＲＲＳとドナーＤＮＡ分子の間の二重組換えクロスオーバー事象を伴う。２プラスミドＲＭＣＥは、フロントベクターおよびバックベクターに由来する組み合わせられたＤＮＡ配列のコピーを、哺乳動物ＴＩ宿主細胞ゲノムの所定の遺伝子座に導入するように設計されている。ＲＭＣＥは、原核生物ベクターの配列が哺乳動物ＴＩ宿主細胞ゲノム内に導入されず、したがって、宿主の免疫または防御機構の望まれない誘発を低減および／または防止するように、実行され得る。ＲＭＣＥ手順は、複数のＤＮＡ配列を用いて繰り返され得る。
特定の実施形態において、標的化組込みは、２回のＲＭＣＥによって実現され、その際、２つの異なるＤＮＡ配列が両方とも、哺乳動物ＴＩ宿主細胞に一致するＲＲＳのゲノムの所定の部位に組み込まれ、各ＤＮＡ配列は、ヘテロ多量体ポリペプチドの一部分および／または２つの異種特異的ＲＲＳが隣接する少なくとも１つの選択マーカーもしくはその一部分をコードする、少なくとも１つの発現カセットを含む。特定の実施形態において、標的化組込みは、複数回のＲＭＣＥによって実現され、その際、複数のベクターに由来するＤＮＡ配列がすべて、哺乳動物ＴＩ宿主細胞のゲノムの所定の部位に組み込まれ、各ＤＮＡ配列は、ヘテロ多量体ポリペプチドの一部分および／または２つの異種特異的ＲＲＳが隣接する少なくとも１つの選択マーカーもしくはその一部分をコードする、少なくとも１つの発現カセットを含む。特定の実施形態において、選択マーカーは、一部が第１のベクターにおいてコードされ、一部が第２のベクターにおいてコードされ得、その結果、二重ＲＭＣＥによって両方が正確に組み込まれた場合にのみ、その選択マーカーの発現が可能になる。
特定の実施形態において、リコンビナーゼ媒介組換えによる標的化組込みにより、原核生物ベクターに由来する配列を含まずに、宿主細胞ゲノムの１つ以上の所定の組込み部位に、選択マーカーおよび／または多量体ポリペプチドの異なる発現カセットが組み込まれる。
一実施形態のように、ノックアウトは、異種ポリペプチドをコードする外因性核酸の導入前またはその後のいずれでも実施され得ることが指摘されなければならない。
発明の詳細な説明
ＸＢＰ１エクソン４は、＋２のフレーム外事象を導入し、ＸＢＰ１ｓを産生するために、インビボでＩＲＥ１αによって切除される２６ヌクレオチド断片を含む。本発明者らは、エクソン４のスキップも＋２のフレーム外事象を導入し、機能性タンパク質を産生することを決定した。エクソン４のスキップは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して達成され得る。本発明に従ってエクソン４をスキップすることによって、ＩＲＥ１αによって切除された２６ヌクレオチド断片と比較して、１４６ｂｐのはるかに大きいヌクレオチド断片がプレｍＲＮＡから除去される。したがって、本発明によるＸＢＰ１Δ４は、インビボスプライシングされたＸＢＰ１に等しくない。
本発明者らはまた、哺乳動物細胞におけるＸＢＰ１Δ４バリアントの生成または発現が、モノクローナル抗体などの異種発現タンパク質、特にそうでなければ発現が困難な異種発現タンパク質の組換え発現増強をもたらすことを同定した。これは、ＸＢＰ１Δ４バリアントの生成または発現が哺乳動物細胞におけるタンパク質発現の質の向上をもたらすことを示している。
本発明は、ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物の一部に相補的、例えば完全に相補的な特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを開示し、利用する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＸＢＰ１転写物中のＸＢＰ１エクソン４の包含を減少させる（切除を増強する）ことができる。それにより、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＸＢＰ１Δ４バリアントの発現またはその発現増強をもたらす。
本発明者らは、哺乳動物細胞におけるＸＢＰ１Δ４バリアントの生成または発現がタンパク質発現の増強をもたらすことを同定した。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えばモノクローナル抗体などの抗体の製造において、異種タンパク質発現系から産生されるタンパク質の収量または質を高めるために使用されてもよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、タンパク質病理学的疾患の処置および予防において治療的有用性を有する。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
一態様において、本発明は、ＸＢＰ１を発現する細胞におけるＸＢＰ１スプライスバリアントの発現に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、アンチセンスオリゴヌクレオチドが８～４０ヌクレオチド長であり、かつ哺乳動物ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物に相補的な８～４０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
本発明の特定の実施形態において、ＸＢＰ１スプライスバリアントは、＋２のフレーム外事象を有する。
特定の実施形態において、ＸＢＰ１スプライスバリアントは、ＸＢＰ１Δ４である。
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが８～４０ヌクレオチド長であり、かつ哺乳動物ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物に相補的、例えば完全に相補的な少なくとも１２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが８～４０ヌクレオチド長であり、かつ哺乳動物ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物に相補的、例えば完全に相補的な１２～１６ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが１２～１６ヌクレオチド長であり、哺乳動物ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物に相補的、例えば完全に相補的な１２～１６ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが８～４０ヌクレオチド長であり、かつ哺乳動物ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物に相補的、例えば完全に相補的な１２～１８ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ヌクレオチド長であり得る。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、８～４０、１２～４０、１２～２０、１０～２０、１４～１８、１２～１８または１６～１８ヌクレオチド長である。
連続ヌクレオチド配列は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１２ヌクレオチド長、例えば１２～１６または１２～１８ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ長さである。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列からなる。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸の領域または標的配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％相補的である、８～４０ヌクレオチド長の連続配列を含む。言い換えれば、いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ、２つ、３つまたはそれを超えるミスマッチを含んでいてもよく、ミスマッチは、その標的と塩基対を形成しない本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドである。
オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が標的配列の領域と完全に相補的（１００％相補的）である場合が有利である。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、単離、精製または製造される。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチドまたは１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ、二環式ヌクレオシド類似体（ＬＮＡ）、またはそれらの任意の組合せからなる群から独立して選択される１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾ヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾ヌクレオシドは、二環式糖を含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾ヌクレオシドは、親和性増強２’糖修飾ヌクレオシドである。
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、１つ以上の５’－メチル－シトシン核酸塩基を含む。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合のうちの１つ以上が修飾されている。
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合を含む。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％のヌクレオシド間結合が修飾されている。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、固体粉末形態、例えば凍結乾燥粉末の形態である。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する追加の開示は、本開示を通して提供される。
標的
本明細書に記載されるように、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＸＢＰ１スプライスバリアント、例えばＸＢＰ１Δ４バリアントの発現を引き起こすために、ＸＢＰ１ ｍＲＮＡ配列を標的とする。
本明細書で使用される場合、用語「ＸＢＰ１Δ４」とは、エクソン４を欠くＸＢＰ１転写物（ＸＢＰ１Δ４バリアント）、またはＸＢＰ１エクソン４によってコードされるアミノ酸を欠くＸＢＰ１タンパク質を指す。ＸＢＰ１Δ４バリアントの重要な特徴は、エクソン４の欠失およびＸＢＰ１コード配列における＋２フレームシフトの導入が生じており、その結果、（ＩＲＥ１によって誘導される）ＸＢＰ１のＸＢＰ１ｓバリアントのＣ末端領域と相同なＣ末端領域を有するＸＢＰ１Δ４バリアントの発現がもたらされることである。
特定の実施形態において、ＸＢＰ１Δ４タンパク質は、ＸＢＰ１エクソン４によってコードされるペプチド配列のすべてまたは本質的にすべてを欠く。
本明細書で使用される「標的」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズ／結合する遺伝子の転写物（すなわち、「ＸＢＰ１」）を指すために使用される。
ＸＢＰ１は、Ｘ－ｂｏｘ結合タンパク質１、ＴＲＥＢ－５、ＴＲＥＢ５、ＸＢＰ－１およびＸＢＰ２としても知られている。
本発明のオリゴヌクレオチドの標的は、ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物である。ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物は、好ましくは哺乳動物ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物である。
いくつかの実施形態において、哺乳動物ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物は、ハムスターＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物である。
ハムスターＸＢＰ１プレｍＲＮＡ配列を配列番号１に列挙する。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、ハムスターＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号１）の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的である。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド２９６０～３１１３からの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的であり得る。
他の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド２９８６～３０１８からの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的であり得る。
いくつかの実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、ハムスターＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号１）の少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個または少なくとも１７個の連続ヌクレオチドに相補的である。
他の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号２９９、配列番号３０１、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３１９、配列番号３２３、配列番号３２５、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３３１、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４１９、配列番号４３１、配列番号４３２、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４３８、配列番号４３９、配列番号４４０、配列番号４４１、配列番号４４２、配列番号４４９、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号４９５、配列番号４９６、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２、配列番号５０３、配列番号５０５、配列番号５０６、配列番号５０７、配列番号５０８、配列番号５０９、配列番号５１０、配列番号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５２０、配列番号５７２、配列番号５７３、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５８８および配列番号５８９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に相補的であり得る。
他の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号３０５、配列番号３０７、配列番号３１４、配列番号３１５、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１９、配列番号３３１、配列番号３３２、配列番号３９２、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号４４０、配列番号４９２、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２、配列番号５１３および配列番号５７６からなる群から選択されるヌクレオチド配列に相補的であり得る。
他の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号３１４または配列番号３１５に相補的であり得る。
いくつかの実施形態において、哺乳動物ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物は、マウスＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物である。
マウスＸＢＰ１プレｍＲＮＡを配列番号５９０に列挙する。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、マウスＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号５９０）の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的である。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号５９０のヌクレオチド３５６０～３７８３からの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的であり得る。
いくつかの実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、マウスＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号５９０）の少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個または少なくとも１７個の連続ヌクレオチドに相補的である。
他の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号６９９、配列番号７００、配列番号７０３、配列番号７１０、配列番号７１３、配列番号７２４、配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４３、配列番号７４４、配列番号７４５、配列番号７４９、配列番号７５０、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、配列番号７５４、配列番号７５５、配列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配列番号７６０、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７７３、配列番号７７６、配列番号７７８、配列番号７８１、配列番号７８３、配列番号７８４、配列番号７８５、配列番号７８７、配列番号７８９、配列番号７９０、配列番号７９１、配列番号７９２、配列番号７９３、配列番号７９４、配列番号７９５、配列番号７９６、配列番号７９７、配列番号７９８、配列番号７９９および配列番号８００からなる群から選択されるヌクレオチド配列に相補的であり得る。
他の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号７１０、配列番号７５４、配列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配列番号７６０、配列番号７９１、配列番号７９２、配列番号７９４、配列番号７９５および配列番号７９７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に相補的であり得る。
いくつかの実施形態において、哺乳動物ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物は、ヒトＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物である。
ヒトＸＢＰ１プレｍＲＮＡを配列番号８０１に列挙する。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、ヒトＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号８０１）の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的である。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号８０１のヌクレオチド４３３８～４５６３からの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的であり得る。
いくつかの実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、ヒトＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号８０１）の少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個または少なくとも１７個の連続ヌクレオチドに相補的である。
他の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号９４７、配列番号９４８、配列番号９４９、配列番号９５０、配列番号９５１および配列番号９８８からなる群から選択されるヌクレオチド配列に相補的であり得る。
他の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号９５１に相補的であり得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチド配列
連続ヌクレオチド配列は、ハムスターＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号１）の一部に相補的であり得る。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１２８、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５８、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２９、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２９７および配列番号２９８からなる群から選択され得る。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４０、配列番号４１、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１４９、配列番号２０１、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２２２および配列番号２８５からなる群から選択され得る。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号２３または配列番号２４であり得る。
連続ヌクレオチド配列は、マウスＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号５９０）の一部に相補的であり得る。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号５９７、配列番号５９８、配列番号６０１、配列番号６０８、配列番号６１１、配列番号６２２、配列番号６２７、配列番号６３７、配列番号６４１、配列番号６４２、配列番号６４３、配列番号６４７、配列番号６４８、配列番号６４９、配列番号６５０、配列番号６５１、配列番号６５２、配列番号６５３、配列番号６５４、配列番号６５５、配列番号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６５９、配列番号６６０、配列番号６６１、配列番号６７１、配列番号６７４、配列番号６７６、配列番号６７９、配列番号６８１、配列番号６８２、配列番号６８３、配列番号６８５、配列番号６８７、配列番号６８８、配列番号６８９、配列番号６９０、配列番号６９１、配列番号６９２、配列番号６９３、配列番号６９４、配列番号６９５、配列番号６９６、配列番号６９７および配列番号６９８からなる群から選択され得る。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号６０８、配列番号６５２、配列番号６５４、配列番号６５５、配列番号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６８９、配列番号６９０、配列番号６９２、配列番号６９３および配列番号６９５からなる群から選択され得る。
連続ヌクレオチド配列は、ヒトＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号８０１）の一部に相補的であり得る。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号８５４、配列番号８５５、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８および配列番号８９５からなる群から選択され得る。
特定の実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号８５８であり得る。
いくつかの実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ長さである。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列からなる。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列である。
本発明はまた、その少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個または少なくとも１７個の連続ヌクレオチドの断片を含む、連続ヌクレオチド配列の断片を企図する。
アンチセンスオリゴヌクレオチド活性
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるものなどの哺乳動物ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物のスプライシングを調節する。いくつかの実施形態において、哺乳動物ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物のスプライシングを調節することにより、特定のＸＢＰ１バリアントの発現および／または活性を調節することができる。
理論に拘束されることを望むものではないが、スプライス調節オリゴヌクレオチドは、典型的には、分解機構（ＲＮａｓｅＨまたはＲＩＳＣ媒介阻害など）を介するのではなく、占有ベースの機構を介して作用する。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞におけるエクソン４を含むＸＢＰ１ ｍＲＮＡ転写物の発現（例えば、数）を低減または阻害することができる。本明細書では、エクソン４を含むＸＢＰ１ ｍＲＮＡ転写物をＸＢＰ１－Ｅ４と呼ぶ。
本明細書で使用される転写物の発現を「低減する」または「阻害する」という用語は、（例えば、ＸＢＰ１－Ｅ４ ｍＲＮＡの発現を低減または阻害し、それによってＸＢＰ１－Ｅ４タンパク質の発現を低減することによって）標的細胞におけるＸＢＰ１－Ｅ４タンパク質の量または活性を阻害または低減するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力の全体的な用語として理解されるべきである。
活性の阻害は、ＸＢＰ１－Ｅ４ ｍＲＮＡのレベル（例えば、数）を測定することによって、または細胞におけるＸＢＰ１－Ｅ４タンパク質のレベル（例えば、数）もしくは活性を測定することによって、決定され得る。したがって、発現の阻害は、インビトロまたはインビボで決定され得る。スプライス調節は、細胞におけるＸＢＰ１－Ｅ４転写物（例えば、ｍＲＮＡ）またはそのコードされるタンパク質の発現（例えば、数）の阻害をもたらし得ることが理解されよう。特定の実施形態において、ＸＢＰ１－Ｅ４転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の発現（例えば、数）は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない対応する細胞と比較して、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％またはそれを超えて低減される。
本明細書で使用される場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない対応する細胞」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する前の同じ細胞、または同じ細胞型（しかし、同じ細胞ではない）を指し得る。
したがって、いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞を処理すると、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理前の同じ細胞におけるＸＢＰ１－Ｅ４転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の発現と比較して、細胞におけるＸＢＰ１－Ｅ４転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の発現が低減される（例えば、少なくとも約１０％または少なくとも約２０％）。
他の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞を処理すると、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理を受けていない同じ細胞型におけるＸＢＰ１－Ｅ４転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の発現と比較して、細胞におけるＸＢＰ１－Ｅ４転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の発現が低減される（例えば、少なくとも約１０％または少なくとも約２０％）。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞におけるエクソン４を欠くＸＢＰ１ ｍＲＮＡ転写物の発現（例えば、数）を増加させるまたは増強することができる。本明細書では、エクソン４を欠くＸＢＰ１ ｍＲＮＡ転写物をＸＢＰ１Δ４と呼ぶ。
本明細書で使用される転写物の発現を「増加させる」という用語は、（例えば、ＸＢＰ１Δ４ ｍＲＮＡの発現を増加させ、それによってＸＢＰ１Δ４タンパク質の発現を増加させることによって）標的細胞におけるＸＢＰ１Δ４タンパク質の量または活性を増加させるまたは増強するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力の全体的な用語として理解されるべきである。
活性の増加は、ＸＢＰ１Δ４ ｍＲＮＡのレベル（例えば、数）を測定することによって、または細胞におけるＸＢＰ１Δ４タンパク質のレベル（例えば、数）もしくは活性を測定することによって、決定され得る。したがって、発現の増加は、インビトロまたはインビボで決定され得る。スプライス調節は、細胞におけるＸＢＰ１Δ４転写物（例えば、ｍＲＮＡ）またはそのコードされるタンパク質の発現（例えば、数）の増加をもたらし得ることが理解されよう。特定の実施形態において、ＸＢＰ１Δ４転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の発現（例えば、数）は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない対応する細胞と比較して、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％またはそれを超えて増加または増強される。ＸＢＰ１Δ４転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の発現（例えば、数）は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない対応する細胞と比較して、少なくとも約１％または少なくとも約５％増加または増強されることが好ましい。
本明細書で使用される場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない対応する細胞」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する前の同じ細胞、または同じ細胞型（しかし、同じ細胞ではない）を指し得る。
したがって、いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞を処理すると、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理前の同じ細胞におけるＸＢＰ１Δ４転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の発現と比較して、細胞におけるＸＢＰ１Δ４転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の発現が増加または増強される（例えば、少なくとも約１０％または少なくとも約２０％）。
他の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞を処理すると、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理を受けていない同じ細胞型におけるＸＢＰ１Δ４転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の発現と比較して、細胞におけるＸＢＰ１Δ４転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の発現が増加または増強される（例えば、少なくとも約１０％または少なくとも約２０％）。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞において発現される代替的なＸＢＰ１スプライスバリアントの比率を変化させることができる。例えば、ＸＢＰ１Δ４の発現の増加または増強は、ＸＢＰ１Δ４／ＸＢＰ１Ｅ４転写物の発現比の増加をもたらす。
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない細胞の対応する比と比較して、ＸＢＰ１Δ４／ＸＢＰ１Ｅ４ ｍＲＮＡ転写物の発現比を増加させることができる。特定の実施形態において、ＸＢＰ１－Ｅ４ ｍＲＮＡ転写物の発現に対するＸＢＰ１Δ４ ｍＲＮＡ転写物の発現の比は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない細胞の対応する比と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍またはそれを超えて増加する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない細胞の対応する比と比較して、ＸＢＰ１Δ４／ＸＢＰ１Ｅ４タンパク質の発現比を増加させることができる。特定の実施形態において、ＸＢＰ１－Ｅ４タンパク質の発現に対するＸＢＰ１Δ４タンパク質の発現の比は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない細胞の対応する比と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍またはそれを超えて増加する。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｉ）標的細胞におけるＸＢＰ１Δ４ ｍＲＮＡまたはＸＢＰ１Δ４タンパク質の量を増加させること、およびｉｉ）標的細胞におけるＸＢＰ１－Ｅ４ ｍＲＮＡおよびＸＢＰ１－Ｅ４タンパク質の量を減少させることの両方が可能である。
異なる転写物（例えば、ＸＢＰ１－Ｅ４対ＸＢＰ１Δ４）の比の変化は、ｍＲＮＡレベルまたは対応するタンパク質産物のレベルを比較することによって測定され得る。ＸＢＰ１に対して産生されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む、ＸＢＰ１－Ｅ４およびＸＢＰ１Δ４のタンパク質レベルをアッセイするために使用され得る抗ＸＢＰ１抗体。
オリゴヌクレオチド設計
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体の両方を含むヌクレオチド配列を含み得、ギャップマー、ブロックマー、ミックスマー、ヘッドマー、テールマーまたはトータルマーの形態であり得る。
一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１６個、または少なくとも１７個の修飾ヌクレオシドを含む。
本明細書で使用される「ギャップマー」という用語は、１つ以上の親和性増強修飾ヌクレオシド（隣接部（ｆｌａｎｋ））が５’および３’に隣接するＲＮａｓｅ Ｈ動員オリゴヌクレオチドの領域（ギャップ）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。「ヘッドマー」および「テールマー」という用語は、１つの隣接部が欠損している、すなわちオリゴヌクレオチドの１つの末端のみが親和性増強修飾ヌクレオシドを含む、ＲＮａｓｅＨを動員することができるオリゴヌクレオチドである。ヘッドマーの場合、３’隣接部が欠損しており（すなわち、５’隣接部が、親和性増強修飾ヌクレオシドを含む）、テールマーの場合、５’隣接部が欠損している（すなわち、３’隣接部が、親和性増強修飾ヌクレオシドを含む）。「ＬＮＡギャップマー」という用語は、少なくとも１つの親和性増強修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドであるギャップマーオリゴヌクレオチドである。「混合ウィングギャップマー」という用語は、隣接部領域が、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドおよび少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシドまたは非ＬＮＡ修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも１つの２’置換された修飾ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、および２’－フルオロ－ＡＮＡヌクレオシドを含むＬＮＡギャップマーを指す。
「ミックスマー」と呼ばれる他の「キメラ」アンチセンスオリゴヌクレオチドは、（ｉ）ＲＮａｓｅによって認識および切断可能なＤＮＡモノマーまたはヌクレオシド類似体モノマーと、（ｉｉ）非ＲＮａｓｅ動員ヌクレオシド類似体モノマーとの交互組成物からなる。
「トータルマー」は、天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のみを含む一本鎖ＡＳＯである。
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５～＋１２℃、より好ましくは＋１．５～＋１０℃、最も好ましくは＋３～＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。数多くの高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野で公知であり、例えば、多くの２’置換ヌクレオシドおよびロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２０３－２１３を参照されたい）。
糖修飾
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖部分、すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。
リボース糖部分の修飾を有する数多くのヌクレオシドが、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善することを主な目的として作製されてきた。
そのような修飾には、例えばヘキソース環（ＨＮＡ）または二環式環（典型的には、リボース環（ＬＮＡ）上のＣ２とＣ４炭素の間にバイラジカル架橋を有する）、または典型的にはＣ２とＣ３炭素の間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）または三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、糖部分が例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルホリノ核酸の場合には非糖部分で置き換えられているヌクレオシドも含まれる。
糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を、水素以外の基、またはＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシド中に天然に存在する２’－ＯＨ基に変更することによってなされる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’、または５’位で導入され得る。
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨもしくは－ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）、またはリボース環の２’炭素と第２の炭素との間に架橋を形成できる２’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’バイラジカル架橋）ヌクレオシドである。
実際、２’糖置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、数多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、増強された結合親和性および／または増大されたヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドにもたらし得る。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡおよび２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２０３－２１３、およびＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１９，９３７を参照されたい。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの例示である。
Figure 2024501662000001
本発明に関して、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡのような２’架橋ヌクレオシドを含まない。
ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、該ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合するビラジカル（「２’－４’架橋」とも呼ばれる）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限または固定する。これらのヌクレオシドはまた、文献において、架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の増強（二重鎖の安定化）に関連している。これは、オリゴヌクレオチド／相補二重鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定され得る。
非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９号、Ｍｏｒｉｔａら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３－７６，ＳｅｔｈらＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，第７５（５）巻第１５６９～８１頁、およびＭｉｔｓｕｏｋａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８、およびＳｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，５９，９６４５－９６６７に開示されている。
さらなる非限定的な例示的ＬＮＡヌクレオシドを、スキーム１に開示する。
スキーム１：
Figure 2024501662000002
特定のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）およびＥＮＡである。
特定の有利なＬＮＡは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである。
モルホリノオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノヌクレオシドを含むか、またはモルホリノヌクレオシドからなる（すなわち、モルホリノオリゴマーであり、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）として）。スプライス調節モルホリノオリゴヌクレオチドは、臨床使用が承認されており、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置に使用される、ＤＭＤのフレームシフト変異を標的とする３０ｎｔモルホリノオリゴヌクレオチドである、エテプリルセンを参照のこと。モルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、以下の４つの連続するモルホリノヌクレオチドの説明に示されるように、ホスホロジアミデート基を介して連結されたメチレンモルホリン環など、リボースではなく６員のモルホリン環に結合した核酸塩基を有する。
Figure 2024501662000003
いくつかの実施形態において、本発明のモルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、２０～４０モルホリノヌクレオチド長、例えば、２５～３５モルホリノヌクレオチド長であり得る。
ＲＮａｓｅ Ｈの活性および動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性とは、相補的ＲＮＡ分子との二重鎖にあるときにＲＮａｓｅ Ｈを動員する能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのインビトロ方法を提供し、これはＲＮａｓｅＨを動員する能力の決定に使用され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドが、相補的標的核酸配列が提供された場合に、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中のすべてのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期速度の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％または２０％超のｐｍｏｌ／ｌ／分で測定された初期速度を有する場合に、このオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅ Ｈを動員することができるとみなされる。ＲＨａｓｅ Ｈ活性の決定に使用するために、組換えＲＮａｓｅ Ｈ１が、Ｌｕｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ、Ｌｕｃｅｒｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能である。
ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシド、典型的には高親和性２’糖修飾ヌクレオシド、例えば２－Ｏ－ＭＯＥおよび／またはＬＮＡを含む領域が５’および３’に隣接するＤＮＡヌクレオシド（典型的には少なくとも５または６個の連続するＤＮＡヌクレオシド）の領域を含むギャップマーオリゴヌクレオチドと同様に、ＲＮａｓｅＨを効果的に動員することが公知である。スプライシングの効果的な調節のために、プレｍＲＮＡの分解は望ましくなく、したがって、標的のＲＮａｓｅＨ分解を回避することが好ましい。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨ動員ギャップマーオリゴヌクレオチドではない。
ＲＮａｓｅＨ動員は、オリゴヌクレオチド中の連続ＤＮＡヌクレオチドの数を制限することによって回避され得るので、ミックスマーおよびトータルマー設計が使用され得る。好都合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、３個を超える連続ＤＮＡヌクレオシドを含まない。さらに好都合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、４個を超える連続ＤＮＡヌクレオシドを含まない。さらに好都合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、２個を超える連続ＤＮＡヌクレオシドを含まない。
ミックスマーおよびトータルマー
スプライス調節のために、ＲＮＡａｓｅＨを動員しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することがしばしば有利である。ＲＮａｓｅＨ活性はＤＮＡヌクレオチドの連続配列を必要とするので、アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ活性は、３個を超えるか、または４個を超える連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することによって達成され得る。これは、２’糖修飾ヌクレオシドなどの糖修飾ヌクレオシドと、１、２もしくは３個のＤＮＡヌクレオシドなどのＤＮＡヌクレオシドの短い領域とを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオシド領域をミックスマー設計で使用することによって達成され得る。ミックスマーは、本明細書において、１つおきの設計によって例示され、ここではヌクレオシドが１個のＬＮＡヌクレオシドと１個のＤＮＡヌクレオシドとを交互に繰り返し、例えばＬＤＬＤＬＤＬＤＬＤＬＤＬＤＬＬであり、５’および３’末端ＬＮＡヌクレオシドを伴い；ならびに２つおきの設計によって例示され、例えばＬＤＤＬＤＤＬＤＤＬＤＤＬＤＤＬであり、２つおきのヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである。
トータルマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドを含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列であり、例えば、治療的使用のための効果的なスプライス調節因子であると報告されている完全ＭＯＥホスホロチオエート、例えばＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭ（Ｍ＝２’－Ｏ－ＭＯＥ）などの２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドのみを含んでもよい。
あるいは、ミックスマーは、ＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬなどの修飾ヌクレオシドの混合物を含んでいてもよく、式中、Ｌ＝ＬＮＡおよびＭ＝２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドである。
有利には、ミックスマーおよびトータルマー中のヌクレオシド間ヌクレオシドはホスホロチオエートであってもよく、またはミックスマー中のヌクレオシド結合の大部分はホスホロチオエートであってもよい。ミックスマーおよびトータルマーは、例として、ホスホジエステルまたはホスホロジチオエートなどの他のヌクレオシド間結合を含み得る。
オリゴヌクレオチド内の領域Ｄ’またはＤ”
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばミックスマーまたはトータルマー領域、ならびにさらに５’および／または３’ヌクレオシドを含むか、またはそれからなり得る。さらなる５’および／または３’ヌクレオシドは、標的核酸に相補的、例えば完全に相補的であってもよく、または相補的、例えば完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる５’および／または３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’およびＤ”と称され得る。
領域Ｄ’またはＤ”の付加は、連続ヌクレオチド配列、例えばミックスマーまたはトータルマーをコンジュゲート部分または別の官能基に連結する目的のために使用され得る。連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分と連結するために使用される場合、それは生体切断可能なリンカーとして働くことができる。あるいは、それはエキソヌクレアーゼ保護を提供するために、または合成もしくは製造を容易にするために使用されてもよい。
領域Ｄ’またはＤ”は、独立して、１、２、３、４または５個の追加のヌクレオチドを含むか、またはそれからなり、標的核酸に対して相補的であっても、相補的でなくてもよい。ＦもしくはＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの糖修飾ヌクレオチドではなく、またはこれらの塩基修飾バージョンでもない。Ｄ’またはＤ”領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る（リンカーの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態において、追加の５’および／または３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合されており、ＤＮＡまたはＲＮＡである。領域Ｄ’またはＤ”としての使用に好適なヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これには例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドが含まれる。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカーの使用は国際公開第ＷＯ２０１５／１１３９２２号に開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物を単一のオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。
一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミックスマーまたはトータルマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’および／またはＤ”を含む。
いくつかの実施形態において、領域Ｄ’またはＤ”とミックスマーまたはトータルマー領域との間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。
コンジュゲート
本発明は、少なくとも１つのコンジュゲート部分に共有結合したアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、これは本発明のコンジュゲートと称され得る。
本明細書で使用される「コンジュゲート」という用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第３の領域）に共有結合したアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。コンジュゲート部分は、任意に領域Ｄ’またはＤ”などのリンカー基を介して、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合していてもよい。
オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびそれらの合成については、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，編，Ｃｈ．１６，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２００１およびＭａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００２，１２，１０３の包括的総説でも報告されている。
いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分は、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたはそれらの任意の組合せを含み得る。
いくつかの実施形態において、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートはプロドラッグである。ここで、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、コンジュゲート部分は核酸分子から切断され得る。
リンカー
結合またはリンカーは、１つ以上の共有結合を介して目的の１つの化学基またはセグメントを目的の別の化学基またはセグメントに連結する、２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接または連結部分（例えば、リンカーまたはテザー）を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合され得る。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えば、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列（領域Ａ）に共有結合する役割を果たす。
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のコンジュゲートまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、任意に、標的核酸に対して相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列（領域Ａまたは第１の領域）と、コンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）との間に位置するリンカー領域（第２の領域または領域Ｂおよび／または領域Ｙ）を含み得る。
領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常遭遇するまたは遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか、またはそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化もしくは還元条件、または薬剤などの化学条件、ならびに哺乳動物の細胞で見られるまたは遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素または加水分解酵素またはヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態において、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断を受けやすい。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、少なくとも２つの連続ホスホジエステル結合を含むＤＮＡヌクレオシドなどの１～５個のヌクレオシドを含む。ホスホジエステルを含有する生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号により詳細に記載されている。
領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａまたは第１の領域）に共有結合する役割を果たすリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位またはアミノアルキル基などの反復単位の鎖構造またはオリゴマーを含み得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の領域エレメントＡ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｙ－Ｃ、Ａ－Ｙ－Ｂ－ＣまたはＡ－Ｙ－Ｃから構築され得る。いくつかの実施形態において、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６～Ｃ１２アミノアルキル基を含むＣ２～Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。いくつかの実施形態において、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。
薬学的な塩
本発明は、薬学的に許容され得る塩の形態である、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。「薬学的に許容され得る塩」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的有効性および特性を保持する従来の酸付加塩または塩基付加塩を指す。
いくつかの実施形態において、薬学的に許容され得る塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはアンモニウム塩であり得る。
本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明によるコンジュゲートの薬学的に許容され得るナトリウム塩を提供する。
本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明によるコンジュゲートの薬学的に許容され得るカリウム塩を提供する。
本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明によるコンジュゲートの薬学的に許容され得るアンモニウム塩を提供する。
医薬組成物
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明のコンジュゲートまたは本発明の塩と、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、および／またはアジュバントとを含む、医薬組成物を提供する。
薬学的に許容され得る希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容され得る塩には、限定するものではないが、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれる。いくつかの実施形態において、薬学的に許容され得る希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施形態において、核酸分子は、５０～３００μＭの溶液の濃度で薬学的に許容され得る希釈剤中で使用される。
本発明での使用に好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，第１７版，１９８５に見られる。薬物送達の方法の簡単な総説については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３，１９９０）を参照されたい。国際公開第２００７／０３１０９１号は、薬学的に許容され得る希釈剤、担体およびアジュバントの好適な好ましいさらなる例を提供している（参照により本明細書に組み込まれる）。好適な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組合せ、プロドラッグ製剤もまた、国際公開第２００７／０３１０９１号に提供されている。
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明のコンジュゲートと、薬学的に許容され得る塩とを含む、医薬組成物を提供する。例えば、塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはアンモニウム塩などの金属カチオンを含み得る。
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明のコンジュゲートまたは本発明の薬学的に許容され得る塩と、水性希釈剤または溶媒とを含む、本発明による医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、本発明のコンジュゲート、またはその薬学的に許容され得る塩は、固体形態、例えば粉末、例えば凍結乾燥粉末である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、本発明のコンジュゲートまたは本発明の塩は、医薬組成物または製剤を調製するために、薬学的に許容され得る活性または不活性物質と混合されてもよい。医薬組成物の製剤化のための組成物および方法は、限定されるものではないが、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含む多くの基準に依存する。
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌されても、または滅菌フィルタにかけられてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装されるか、または凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３～１１、より好ましくは５～９または６～８、最も好ましくは７～８、例えば７～７．５であろう。得られた固体形態の組成物は、錠剤またはカプセルの密封パッケージなどのように、各々が上記の薬剤または薬剤群の固定量を含む複数の単回用量単位で包装され得る。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリームまたは軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブなどの柔軟な量の容器に包装され得る。
組成物
一態様において、本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、または本発明によるコンジュゲート、または本発明による塩と、希釈剤、溶媒、担体、塩および／またはアジュバントとを含む組成物を提供する。
組成物は医薬組成物であり得る。
本発明によるオリゴヌクレオチドの製造方法
さらなる態様において、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドに含まれる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造するための方法を提供する。好ましくは、本方法は、ホスホロアミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１５４巻第２８７～３１３頁を参照のこと）。
さらなる実施形態において、本方法は、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲーティング部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることをさらに含む。
さらなる実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、および／またはアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造するための方法が提供される。
ＸＢＰ１Δ４タンパク質
一態様において、本発明は、単離されたＸＢＰ１Δ４タンパク質を含む。
単離されたＸＢＰ１Δ４タンパク質は、哺乳動物タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、ＸＢＰ１Δ４タンパク質は、ハムスター、マウスまたはヒトのタンパク質であり得る。
特定の実施形態において、単離されたＸＢＰ１Δ４タンパク質は、ハムスタータンパク質であり、配列番号７によってコードされる。
特定の実施形態において、単離されたＸＢＰ１Δ４タンパク質は、マウスタンパク質であり、配列番号５９６によってコードされる。
特定の実施形態において、単離されたＸＢＰ１Δ４タンパク質は、ヒトタンパク質であり、配列番号８０７によってコードされる。
本発明はまた、単離されたＸＢＰ１Δ４タンパク質の断片も企図する。
ＸＢＰ１Δ４ ｍＲＮＡ
一態様において、本発明は、本発明の単離されたＸＢＰ１Δ４タンパク質をコードする単離されたｍＲＮＡを含む。
単離されたＸＢＰ１Δ４ ｍＲＮＡは、哺乳動物タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、ＸＢＰ１Δ４ ｍＲＮＡは、ハムスター、マウスまたはヒトｍＲＮＡであり得る。
特定の実施形態において、単離されたＸＢＰ１Δ４ ｍＲＮＡは、ハムスターｍＲＮＡであり、配列番号６によってコードされる。
特定の実施形態において、単離されたＸＢＰ１Δ４ ｍＲＮＡは、マウスｍＲＮＡであり、配列番号５９５によってコードされる。
特定の実施形態において、単離されたＸＢＰ１Δ４ ｍＲＮＡは、ヒトｍＲＮＡであり、配列番号８０６によってコードされる。
本発明はまた、単離されたＸＢＰ１Δ４ ｍＲＮＡの断片も企図する。
本発明による化合物を使用してポリペプチドを産生する方法
本発明者らは、哺乳動物細胞においてＸＢＰ１Δ４の発現を誘導する化合物が、哺乳動物細胞において、特に抗体などの多量体ポリペプチドの異種発現タンパク質の組換え発現を増強するのに有用であることを同定した。
上記で説明したように、ＸＢＰ１ｓは、正しいタンパク質フォールディングを増強するように機能する機能的に活性なタンパク質である。本発明者らは、驚くべきことに、ＸＢＰ１Δ４などのＸＢＰ１スプライスバリアントが、組換えポリペプチド産生方法において正しく折り畳まれたタンパク質の産生を増強することができることを決定した。
一態様において、本発明は、ポリペプチドを（組換え）産生するための方法であって、
ａ）ＸＢＰ１を発現しておりかつポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）細胞または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含み、
培養が、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、医薬組成物、タンパク質またはｍＲＮＡの存在下で少なくとも部分的に行われることを特徴とする、
方法を提供する。
好ましい一実施形態において、培養は、予備培養工程および本培養工程を含み、少なくとも予備培養工程は、本発明のオリゴヌクレオチドの存在下で行われる。
特定の実施形態において、本方法は、
ａ１）ＸＢＰ１を発現しておりかつポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む培養培地中で増殖させて、第１の細胞集団を得る工程と、
ａ２）第１の細胞集団のアリコートを培養培地と混合して、第２の細胞集団を得る工程であって、任意に、培養培地が、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、第２の細胞集団を得る工程と、
ａ３）第２の細胞集団を培養して、第３の細胞集団を得る工程と、
ｂ）第３の細胞培養の細胞および／または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含む。
特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１５μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約２５μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約３５μＭ、少なくとも約４０μＭ、少なくとも約４５μＭ、少なくとも約５０μＭまたはそれを超える最終濃度まで添加される。好ましい一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約２５μＭの最終濃度まで添加される。
特定の実施形態において、哺乳動物細胞の増殖は、少なくとも約０．５×１０Ｅ６細胞／ｍＬ、少なくとも約１×１０Ｅ６細胞／ｍＬ、少なくとも約２×１０Ｅ６細胞／ｍＬ、少なくとも約３×１０Ｅ６細胞／ｍＬ、少なくとも約４×１０Ｅ６細胞／ｍＬ、少なくとも約５×１０Ｅ６細胞／ｍＬまたはそれを超える開始細胞密度で行われる。特定の実施形態において、培養は、１×１０Ｅ６～２×１０Ｅ６細胞／ｍＬの開始細胞密度で行われる。
特定の実施形態において、第２の細胞集団の培養は、少なくとも約０．５×１０Ｅ６細胞／ｍＬ、少なくとも約１×１０Ｅ６細胞／ｍＬ、少なくとも約２×１０Ｅ６細胞／ｍＬ、少なくとも約３×１０Ｅ６細胞／ｍＬ、少なくとも約４×１０Ｅ６細胞／ｍＬ、少なくとも約５×１０Ｅ６細胞／ｍＬ、少なくとも約１０×１０Ｅ６細胞／ｍＬ以上の開始細胞密度で行われる。特定の実施形態において、培養は、１×１０Ｅ６～２×１０Ｅ６細胞／ｍＬの開始細胞密度で行われる。
特定の実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。
特定の実施形態において、細胞は、ハムスター細胞である。
特定の実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞、例えばＣＨＯ－Ｋ１細胞である。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、チャイニーズハムスターの卵巣に由来する上皮細胞株であり、生物学的および医学的研究において、ならびにモノクローナル抗体などの治療用タンパク質の産生において商業的にしばしば使用される。
いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞であり得る。
いくつかの実施形態において、細胞は、ニューロン細胞または脳細胞であり得る。
いくつかの実施形態において、細胞は、インビトロであり得る。インビトロ細胞は、例えば、ｉＰＳＣ細胞であり得る。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、Ｆａｂ、好ましくは二重特異性Ｆａｂ、融合ポリペプチドを含むＦｃ領域、ヒト治療用ポリペプチドまたはサイトカインである。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、抗体である。ここで、抗体は、本明細書で提供される「抗体」の定義で論じられるように、任意の形態をとり得る。
特定の実施形態において、本発明の方法は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの非存在下で得られるタンパク質収量に対して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１０００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％またはそれを超えるタンパク質収量の増加を提供する。
特定の実施形態において、収量の増加は、ポリペプチドの絶対量の増加を表す。他の実施形態において、収量の増加は、正しく折り畳まれたポリペプチドの量の増加を表す。本明細書において、ポリペプチドは、ポリペプチドの構造を見ることによって、またはポリペプチドの活性を決定することによって、正しく折り畳まれていると定義され得る。
処置
本明細書で使用される「処置」という用語は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患または障害）の処置、または疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防法（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される処置は、いくつかの実施形態において、予防的であり得ることが認識されよう。
一態様において、本発明は、医学または治療に使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物または医薬組成物に関する。
いくつかの実施形態において、治療は、タンパク質病理学的疾患の処置または予防に関する。
別の態様において、本発明は、タンパク質病理学的疾患を処置するための医薬品の製造における本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物または医薬組成物の使用に関する。
別の態様において、本発明は、患者のタンパク質病理学的疾患を処置する方法であって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物または医薬組成物を患者に投与することを含む方法に関する。
タンパク質病理学的疾患
特定の実施形態において、本発明は、タンパク質病理学的疾患の処置または予防に関する。タンパク質病理学的疾患はまた、プロテオパチー、プロテイノパチー、タンパク質コンフォメーション障害、またはタンパク質ミスフォールディング疾患としても知られている。
特定の実施形態において、タンパク質病理学的疾患は、プリオン病、タウオパチー、シヌクレイノパチー、アミロイドーシス、多系統萎縮症、ＴＤＰ－４３病態およびＣＡＧリピート病から選択され得る。
特定の実施形態において、タンパク質病理学的疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、自閉症、海馬硬化性認知症、ダウン症候群、ハンチントン病、ポリグルタミン病、例えば脊髄小脳失調症３、ミオパシーおよび慢性外傷性脳症から選択され得る。
特定の実施形態において、以前の疾患は、クロイツフェルト・ヤコブ病であり得る。
特定の実施形態において、タウオパチーは、アルツハイマー病であり得る。
特定の実施形態において、シヌクレイノパチーは、パーキンソン病であり得る。
特定の実施形態において、ＴＤＰ－４３病態は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）であり得る。
特定の実施形態において、ＣＡＧリピート病は、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）および脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３、マチャド・ジョセフ病）を含む脊髄小脳失調症であり得る。
投与
本発明の化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、医薬組成物、タンパク質または核酸は、局所的に、または経腸的に、または非経口的に（例えば、静脈内、皮下、または筋肉内）投与され得る。
特定の実施形態において、それは、治療のために投与されるアンチセンス核酸または医薬組成物である。
好ましい実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または注入を含む非経口経路によって投与される。
一実施形態において、アンチセンス核酸または医薬組成物は、静脈内投与される。
別の実施形態において、アンチセンス核酸または医薬組成物は、皮下投与される。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸または医薬組成物は、０．１～１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５～５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与は、週に１回、２週に１回、３週に１回、または月に１回であり得る。
本発明の番号付けされた実施形態
１．ＸＢＰ１を発現する細胞におけるＸＢＰ１スプライスバリアントの発現に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、アンチセンスオリゴヌクレオチドが８～４０ヌクレオチド長であり、かつ哺乳動物ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物に相補的な８～４０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
２．ＸＢＰ１スプライスバリアントがＸＢＰ１Δ４バリアントである、実施形態１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３．連続ヌクレオチド配列が、ハムスターＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号１）の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的である、実施形態１または実施形態２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４．連続ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド２９６０～３１１３からの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的である、実施形態３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５．連続ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド２９８６～３０１８からの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的である、実施形態４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６．連続ヌクレオチド配列が、配列番号２９９、配列番号３０１、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３１９、配列番号３２３、配列番号３２５、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３３１、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４１９、配列番号４３１、配列番号４３２、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４３８、配列番号４３９、配列番号４４０、配列番号４４１、配列番号４４２、配列番号４４９、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号４９５、配列番号４９６、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２、配列番号５０３、配列番号５０５、配列番号５０６、配列番号５０７、配列番号５０８、配列番号５０９、配列番号５１０、配列番号５１１、配列番号５１２、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５２０、配列番号５７２、配列番号５７３、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５８８および配列番号５８９からなる群から選択される配列に相補的である、実施形態３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７．連続ヌクレオチド配列が、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１２８、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５８、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２９、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２９７および配列番号２９８からなる群から選択される、実施形態６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
８．連続ヌクレオチド配列が、配列番号３０５、配列番号３０７、配列番号３１４、配列番号３１５、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１９、配列番号３３１、配列番号３３２、配列番号３９２、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号４４０、配列番号４９２、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２、配列番号５１３および配列番号５７６からなる群から選択される配列に相補的である、実施形態３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
９．連続ヌクレオチド配列が、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号４０、配列番号４１、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１４９、配列番号２０１、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２２２および配列番号２８５からなる群から選択される、実施形態８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１０．連続ヌクレオチド配列が、配列番号３１４または配列番号３１５に相補的である、実施形態３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１１．連続ヌクレオチド配列が、配列番号２３または配列番号２４である、実施形態１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１２．連続ヌクレオチド配列が、マウスＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号５９０）の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的である、実施形態１または実施形態２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１３．連続ヌクレオチド配列が、配列番号５９０のヌクレオチド３５６０～３７８３からの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的である、実施形態１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１４．連続ヌクレオチド配列が、配列番号６９９、配列番号７００、配列番号７０３、配列番号７１０、配列番号７１３、配列番号７２４、配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４３、配列番号７４４、配列番号７４５、配列番号７４９、配列番号７５０、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、配列番号７５４、配列番号７５５、配列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配列番号７６０、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７７３、配列番号７７６、配列番号７７８、配列番号７８１、配列番号７８３、配列番号７８４、配列番号７８５、配列番号７８７、配列番号７８９、配列番号７９０、配列番号７９１、配列番号７９２、配列番号７９３、配列番号７９４、配列番号７９５、配列番号７９６、配列番号７９７、配列番号７９８、配列番号７９９および配列番号８００からなる群から選択される配列に相補的である、実施形態１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１５．連続ヌクレオチド配列が、配列番号５９７、配列番号５９８、配列番号６０１、配列番号６０８、配列番号６１１、配列番号６２２、配列番号６２７、配列番号６３７、配列番号６４１、配列番号６４２、配列番号６４３、配列番号６４７、配列番号６４８、配列番号６４９、配列番号６５０、配列番号６５１、配列番号６５２、配列番号６５３、配列番号６５４、配列番号６５５、配列番号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６５９、配列番号６６０、配列番号６６１、配列番号６７１、配列番号６７４、配列番号６７６、配列番号６７９、配列番号６８１、配列番号６８２、配列番号６８３、配列番号６８５、配列番号６８７、配列番号６８８、配列番号６８９、配列番号６９０、配列番号６９１、配列番号６９２、配列番号６９３、配列番号６９４、配列番号６９５、配列番号６９６、配列番号６９７および配列番号６９８からなる群から選択される、実施形態１４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１６．連続ヌクレオチド配列が、配列番号７１０、配列番号７５４、配列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、配列番号７６０、配列番号７９１、配列番号７９２、配列番号７９４、配列番号７９５および配列番号７９７からなる群から選択される配列に相補的である、実施形態１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１７．連続ヌクレオチド配列が、配列番号６０８、配列番号６５２、配列番号６５４、配列番号６５５、配列番号６５６、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６８９、配列番号６９０、配列番号６９２、配列番号６９３および配列番号６９５からなる群から選択される、実施形態１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１８．連続ヌクレオチド配列が、ヒトＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号８０１）の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的である、実施形態１または実施形態２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１９．連続ヌクレオチド配列が、配列番号８０１のヌクレオチド４３３８～４５６３からの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的である、実施形態１８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２０．連続ヌクレオチド配列が、配列番号９４７、配列番号９４８、配列番号９４９、配列番号９５０、配列番号９５１および配列番号９８８からなる群から選択される配列に相補的である、実施形態１８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２１．連続ヌクレオチド配列が、配列番号８５４、配列番号８５５、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８および配列番号８９５からなる群から選択される、実施形態２１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２２．連続ヌクレオチド配列が、配列番号９５１に相補的である、実施形態１８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２３．連続ヌクレオチド配列が、配列番号８５８である、実施形態２２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２４．アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、哺乳動物ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物に完全に相補的である、実施形態１～２３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２５．連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１２ヌクレオチド長である、実施形態１～２４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２６．連続ヌクレオチド配列が、１２～１６または１２～１８ヌクレオチド長である、実施形態２５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２７．連続ヌクレオチド配列が、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ヌクレオチド長である、実施形態２５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２８．連続ヌクレオチド配列が、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ長さである、実施形態１～２７のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２９．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、単離、精製または製造される、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３０．アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、１つ以上の修飾ヌクレオチドまたは１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１～２９のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３１．アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、１つ以上の修飾ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ、二環式ヌクレオシド類似体（ＬＮＡ）、またはそれらの任意の組合せからなる群から独立して選択される１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３２．１つ以上の修飾ヌクレオシドが、糖修飾ヌクレオシドである、実施形態３０または実施形態３１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３３．１つ以上の修飾ヌクレオシドが、二環式糖を含む、実施形態３０～３２のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３４．１つ以上の修飾ヌクレオシドが、親和性増強２’糖修飾ヌクレオシドである、実施形態３０～３２のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３５．１つ以上の修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシド、例えば１つ以上のベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドである、実施形態３０～３４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３６．アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、１つ以上の５’－メチル－シトシン核酸塩基を含む、実施形態１～３５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３７．アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合のうちの１つ以上が修飾されている、実施形態１～３６のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３８．少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％のヌクレオシド間結合が修飾されている、実施形態３７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３９．１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合を含む、実施形態３７または実施形態３８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４０．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、モルホリノ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態１～３９のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４１．アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、アンチセンスオリゴヌクレオチドミックスマーまたはトータルマーであるか、またはそれらを含む、実施形態１～４０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４２．少なくとも１つのコンジュゲート部分に共有結合した、実施形態１～４１のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４３．コンジュゲート部分が、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたはそれらの任意の組合せを含む、実施形態４２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４４．薬学的に許容され得る塩の形態である、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４５．塩が、ナトリウム塩、カリウム塩またはアンモニウム塩である、実施形態４４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４６．実施形態１～４５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
４７．実施形態１～４５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩および／またはアジュバントとを含む、医薬組成物。
４８．リン酸緩衝生理食塩水などの水性希釈剤または溶媒を含む、実施形態４７に記載の医薬組成物。
４９．単離されたＸＢＰ１Δ４タンパク質。
５０．配列番号７、配列番号５９６または配列番号８０７の配列を含む、実施形態４９に記載の単離されたＸＢＰ１Δ４タンパク質。
５１．実施形態４９または実施形態５０によるＸＢＰ１Δ４タンパク質をコードする単離されたｍＲＮＡ。
５２．配列番号６、配列番号５９５または配列番号８０６の配列を含む、実施形態５１に記載の単離されたｍＲＮＡ。
５３．ポリペプチドを産生するための方法であって、
ａ）ＸＢＰ１を発現しておりかつポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）細胞または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含み、
培養が、実施形態１～４５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態４６に記載の組成物、実施形態４７もしくは実施形態４８に記載の医薬組成物、実施形態４９もしくは実施形態５０に記載のタンパク質、または実施形態５１もしくは実施形態５２に記載のｍＲＮＡの存在下で行われることを特徴とする、
方法。
５４．ａ１）ＸＢＰ１を発現しておりかつポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を、実施形態１～４５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む培養培地中で増殖させて、第１の細胞集団を得る工程と、
ａ２）第１の細胞集団のアリコートを培養培地と混合して、第２の細胞集団を得る工程であって、培養培地が、実施形態１～４５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを任意に含む、第２の細胞集団を得る工程と、
ａ３）第２の細胞集団を培養して、第３の細胞集団を得る工程と、
ｂ）第３の細胞培養の細胞および／または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含む、実施形態５３に記載の方法。
５５．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２５μＭ以上の最終濃度まで添加される、実施形態５３または実施形態５４に記載の方法。
５６．増殖および／または培養が、１×１０Ｅ６～２×１０Ｅ６細胞／ｍＬの開始細胞密度で行われる、実施形態５３～５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．開始細胞密度が約２×１０Ｅ６細胞／ｍＬである、実施形態５６に記載の方法。
５８．哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態５３～５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．ポリペプチドが抗体である、実施形態５３～５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．医学に使用するための、実施形態１～４５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態４６に記載の組成物、または実施形態４７もしくは実施形態４８に記載の医薬組成物。
６１．タンパク質病理学的疾患を有する患者の処置に使用するための、実施形態１～４５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態４６に記載の組成物、または実施形態４７もしくは実施形態４８に記載の医薬組成物。
６２．タンパク質病理学的疾患がＴＤＰ－４３病態を有する、実施形態６１に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６３．タンパク質病理学的疾患が運動ニューロン疾患または前頭側頭葉変性症である、実施形態６１または実施形態６２に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６４．タンパク質病理学的疾患を処置するための医薬品の製造における、実施形態１～４５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態４６に記載の組成物、または実施形態４７もしくは実施形態４８に記載の医薬組成物の使用。
６５．疾患がＴＤＰ－４３病態を有する、実施形態６４に記載の使用。
６６．疾患が運動ニューロン疾患または前頭側頭葉変性症である、実施形態６４または実施形態６５に記載の使用。
６７．患者のタンパク質病理学的疾患を処置する方法であって、実施形態１～４５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態４６に記載の組成物、または実施形態４７もしくは実施形態４８に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、方法。
６８．疾患がＴＤＰ－４３病態を有する、実施形態６７に記載の方法。
６９．疾患が運動ニューロン疾患または前頭側頭葉変性症である、実施形態６７または実施形態６８に記載の方法。
一般的な技術
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ，（１９８９）において説明されるように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ（レーゲンスブルク、ドイツ）での化学合成によって調製した。合成された遺伝子断片を、増殖／増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡシーケンシングによって検証した。あるいは、短い合成ＤＮＡ断片を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングするか、ＰＣＲを介して組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドは、ｍｅｔａｂｉｏｎ ＧｍｂＨ（プラネック－マルティンスリート、ドイツ）によって調製された。
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列を、ＭｅｄｉＧｅｎｏｍｉｘ ＧｍｂＨ（マルティンスリート、ドイツ）またはＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ ＧｍｂＨ（ファターシュテッテン、ドイツ）で行われた二本鎖シーケンシングによって決定した。
ＤＮＡおよびタンパク質配列分析および配列データ管理
ＥＭＢＯＳＳ（欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート）ソフトウェアパッケージおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン１１．５またはＧｅｎｅｉｏｕｓ ｐｒｉｍｅを、配列の作成、マッピング、解析、アノテーション、および図示のために使用した。
試薬
特に明記されていない限り、すべての市販の化学物質、抗体、およびキットは、製造業者のプロトコルに従って提供された通りに使用した。
タンパク質定量
精製された抗体および誘導体のタンパク質濃度を、Ｐａｃｅ，ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４（１９９５）２４１１－１４２３に従って、アミノ酸配列に基づいて計算されるモル吸光係数を用い、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を決定することによって決定した。
上清中の抗体濃度決定
細胞培養物上清中の抗体の濃度を、プロテインＡアガロースビーズ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）による免疫沈降によって推定した。したがって、６０μＬのプロテインＡアガロースビーズをＴＢＳ－ＮＰ４０（５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１％Ｎｏｎｉｄｅｔ－Ｐ４０を補充した１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５）で３回洗浄した。その後、１～１５ｍＬの細胞培養物上清を、ＴＢＳ－ＮＰ４０中で予め平衡状態にしたプロテインＡアガロースビーズに適用した。室温で１時間インキュベートした後、ビーズを、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＭＣ－フィルタカラム（Ａｍｉｃｏｎ）上で、０．５ｍＬ ＴＢＳ－ＮＰ４０で１回、０．５ｍＬの２ｘリン酸緩衝生理食塩水（２×ＰＢＳ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）で２回洗浄し、０．５ｍＬ １００ｍＭ クエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．０）で４回、簡単に洗浄した。結合した抗体を、３５μＬのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えることによって溶出させた。試料の半分をそれぞれＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料還元剤と合わせ、または還元させず、７０℃で１０分間加熱した。その結果、５～３０μｌを４～１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のＭＯＰＳ緩衝液および還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化ランニング緩衝液添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＭＥＳ緩衝液を含む）に適用し、クーマシーブルーで染色した。
細胞培養物上清中の抗体の濃度を、アフィニティＨＰＬＣクロマトグラフィーによって定量的に測定した。簡単に説明すると、プロテインＡに結合する抗体を含有する細胞培養物上清を、２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｏｒｏｓ Ａ／２０カラムに適用し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システムで、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭクエン酸（ｐＨ２．５）を用いて溶出させた。溶出した抗体をＵＶ吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。精製された標準ＩｇＧ１抗体を、標準とした。
または、細胞培養物上清中の抗体および誘導体の濃度を、サンドイッチ－ＩｇＧ－ＥＬＩＳＡによって測定した。簡単に説明すると、ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ａ－９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を、１００μＬ／ウェルのビオチン化抗ヒトＩｇＧ捕捉分子Ｆ（ａｂ’）２＜ｈ－Ｆｃγ＞ＢＩ（Ｄｉａｎｏｖａ）で、０．１μｇ／ｍＬで室温で１時間かけて、または４℃で一晩かけてコーティングし、その後、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ）を用いて３回洗浄した。その後、それぞれの抗体含有細胞培養物上清のＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）における１００μＬ／ウェルの希釈系列をウェルに加え、室温で振盪機で１～２時間インキュベートした。ウェルを２００μＬ／ウェルＰＢＳＴで３回洗浄し、結合した抗体を、室温で振盪機で１～２時間インキュベートすることにより、検出抗体として０．１μｇ／ｍＬの１００μＬ Ｆ（ａｂ’）２＜ｈＦｃγ＞ＰＯＤ（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いて検出した。未結合の検出抗体を、２００μＬ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄することによって除去した。結合した検出抗体を、１００μＬ ＡＢＴＳ／ウェルを添加し、続いてインキュベートすることによって検出した。吸光度の決定は、Ｔｅｃａｎ Ｆｌｕｏｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで、測定波長４０５ｎｍ（参照波長４９２ｎｍ）で行った。
ＣＨＯ宿主細胞株の培養
ＣＨＯ宿主細胞を、湿度８５％、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で３７℃で培養した。それらを、３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢと４μｇ／ｍｌの第２の選択マーカーを含む独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地で培養した。細胞を３日または４日ごとに０．３ｘ１０Ｅ６細胞／ｍｌの濃度で総体積３０ｍｌに分割した。培養には、１２５ｍｌの非バッフル三角振盪フラスコを使用した。振盪振幅５ｃｍ、１５０ｒｐｍで細胞を振盪した。Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて細胞数を決定した。細胞は、６０日齢に達するまで、培養を続けた。
形質転換１０ベータコンピテント大腸菌細胞
形質転換のために、１０ベータコンピテント大腸菌細胞を氷上で解凍した。その後、２μｌのプラスミドＤＮＡを細胞懸濁液に直接ピペットで移した。チューブをはじき、氷上に３０分間置いた。その後、細胞を４２℃の温かいサーマルブロックに入れ、厳密に３０秒間熱ショックを与えた。その直後に、細胞を氷上で２分間冷却した。９５０μｌのＮＥＢ１０ベータ増殖培地を細胞懸濁液に加えた。細胞を３７℃で１時間振盪しながらインキュベートした。次に、５０～１００μｌを予め温めた（３７℃）ＬＢ－Ａｍｐ寒天プレートにピペットで移し、使い捨てスパチュラで広げた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。プラスミドの組込みに成功しアンピシリンに対する耐性遺伝子を持っている細菌だけが、これらのプレート上で増殖可能である。翌日、単一コロニーを採取し、その後のプラスミド調製のためにＬＢ－Ａｍｐ培地で培養した。
細菌培養物
大腸菌の培養は、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉの略であるＬＢ培地で行い、１ｍｌ／Ｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを添加して、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリン濃度にした。異なるプラスミド調製量について、以下の量に単一の細菌コロニーを接種した。
（表１）大腸菌の培養の容量
Figure 2024501662000004
ミニプレップの場合、９６ウェル２ｍｌディープウェルプレートにウェルあたり１．５ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地を充填した。コロニーを採取し、つまようじを培地に押し込んだ。すべてのコロニーが採取されたとき、プレートを粘着性の空気多孔質膜で閉じた。プレートを３７℃のインキュベーター中で２００ｒｐｍの振盪速度で２３時間インキュベートした。
ミニプレップの場合、１５ｍｌのチューブ（換気された蓋付き）に３．６ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地を充填し、細菌コロニーを均等に接種した。つまようじは取り除かずに、インキュベーションの間チューブ内に残した。９６ウェルプレートと同様に、チューブを３７℃、２００ｒｐｍで２３時間インキュベートした。
マキシプレップの場合、２００ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地をオートクレーブ処理したガラス製の１Ｌ三角フラスコに充填し、約５時間経過した１ｍｌの細菌の日中培養物を接種した。三角フラスコを紙栓で閉じ、３７℃、２００ｒｐｍで１６時間インキュベートした。
プラスミド調製
ミニプレップの場合、５０μｌの細菌懸濁液を１ｍｌのディープウェルプレートに移した。その後、細菌細胞をプレート内で３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上清を除去し、細菌ペレットを含むプレートをＥｐＭｏｔｉｏｎに入れた。およそ９０分後、操作を行い、溶出されたプラスミドＤＮＡをさらなる使用のためにＥｐＭｏｔｉｏｎから取り出すことができた。
ミニプレップの場合、１５ｍｌのチューブをインキュベーターから取り出し、３．６ｍｌの細菌培養物を２つの２ｍｌのエッペンドルフチューブに分割した。チューブを卓上マイクロ遠心機で６，８００×ｇで室温で３分間遠心分離した。その後、ミニプレップを、製造業者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて実行した。プラスミドＤＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。
マキシプレップは、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｘｔｒａ Ｍａｘｉ ＥＦ Ｋｉｔを使用して、製造業者の説明書に従って実行した。ＤＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。
エタノール沈殿
ＤＮＡ溶液の体積を２．５倍体積のエタノール１００％と混合した。混合物を、－２０℃で１０分間インキュベートした。次に、ＤＮＡを１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、ペレットを７０％エタノールで洗浄した。この場合も、チューブを１４，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上清をピペッティングにより注意深く除去し、ペレットを乾燥させた。エタノールが蒸発したら、適量のエンドトキシンフリーの水を加えた。ＤＮＡを４℃で一晩、水に再溶解する時間を与えた。少量のアリコートを採取し、ＮａｎｏｄｒｏｐデバイスでＤＮＡ濃度を測定した。
分取抗体精製
抗体を、標準プロトコルを参照して、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔に述べると、抗体を、プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出をｐＨ２．８で達成した後、直ちに中和した。凝集したタンパク質を、ＰＢＳまたは１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）中のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって単量体抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、（必要な場合）例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し、－２０℃または－８０℃で凍結保存した。これらの試料の一部を、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）または質量分析によるその後のタンパク質解析および分析的特徴付けのために提供した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者の説明書に従って、使用した。特に、１０％または４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）、およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元型ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化ランニング緩衝液添加剤を含む）またはＭＯＰＳ（非還元型ゲル）ランニング緩衝液を使用した。
ＣＥ－ＳＤＳ
純度および抗体完全性を、マイクロ流体Ｌａｂｃｈｉｐ技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、米国）を使用してＣＥ－ＳＤＳによって分析した。したがって、製造業者の説明書に従ってＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを使用して、ＣＥ－ＳＤＳ分析用の５μｌの抗体溶液を調製し、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｈｉｐを使用してＬａｂｃｈｉｐ ＧＸＩＩシステムで分析した。Ｌａｂｃｈｉｐ ＧＸ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してデータを分析した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集およびオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。簡潔に述べると、プロテインＡ精製抗体を、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ（登録商標）システムで３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．５）中のＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに、またはＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍの２×ＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶出した抗体をＵＶ吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ １５１－１９０１を標準とした。
質量分析
この章では、二重特異性抗体の特徴付けを、それらの正しいアセンブリに重点を置いて説明する。予想される一次構造を、脱グリコシル化インタクト抗体、および特別な場合には脱グリコシル化／制限ＬｙｓＣ消化抗体のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）によって分析した。
抗体を、リン酸緩衝液またはＴｒｉｓ緩衝液中、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌで、３７℃で１７時間までの時間、Ｎ－グリコシダーゼＦを用いて脱グリコシル化した。制限ＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）消化は、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）中、１００μｇの脱グリコシル化抗体を用いて、それぞれ室温で１２０時間または３７℃で４０分間行った。質量分析の前に、試料を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＨＰＬＣによって脱塩した。合計質量を、ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅ ｓｏｕｒｃｅ（Ａｄｖｉｏｎ）が取り付けられたｍａＸｉｓ ４Ｇ ＵＨＲ－ＱＴＯＦ ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）でのＥＳＩ－ＭＳによって決定した。
実施例１：ハムスターＸＢＰ１ ｍＲＮＡにおいてエクソンのスプライススキップを誘導して、天然にプロセシングされたＸＢＰ１タンパク質と同様に働くＸＢＰ１タンパク質模倣物を作製するためのオリゴヌクレオチドの同定。
ＣＨＯＫ１細胞をＡＴＣＣ細胞バンクから得て、ＡＴＣＣガイドラインに従って増殖および維持した。ＸＢＰ１ ｍＲＮＡ ＮＭ＿００１２４４０４７．１のエクソン４の周りの領域に相補的な４０個のＡＳＯを、エクソン４のエクソンスキップを誘導する能力について試験した。
５０００個のＣＨＯＫ１細胞を９６ウェルプレートに播種し、６時間後、ＡＳＯを最終濃度５μＭおよび２５μＭで細胞培地に直接添加した。細胞を培養し、６日後に回収し、全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙ ９６ウェルキットを使用して単離した。
Ｂｉｏｒａｄ製ＲＴ－ｑＰＣＲ用のｉＳｃｒｉｐｔ（商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用してｃＤＮＡを生成した。相対的ｍＲＮＡ発現を、Ｂｉｏｒａｄ製のＱＸ２００ ｄｄＰＣＲシステムをＢｉｏｒａｄ製の自動液滴発生器ＡｕｔｏＤＧと共に用いて液滴デジタルＰＣＲによって測定した。
ＰＣＲを、Ｂｉｏｒａｄ製のプローブ用のｄｄＰＣＲスーパーミックス（ＵＴＰなし）を使用して、製造業者の説明書に従って行った。
以下のプライマーおよびプローブを使用して、両方ともＩＤＴ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した、エクソン４のエクソンスキップを伴うｍＲＮＡの量（ＸＢＰ１Δ４アッセイ）ならびにエクソン４および５の正常な連結を伴うｍＲＮＡの量（ＸＢＰ１ ＷＴ）を測定した。ＸＢＰ１ ＷＴアッセイは、ＩＲＥ－１プロセシングｍＲＮＡおよび非プロセシングｍＲＮＡの両方を検出した。
ＸＢＰ１ＷＴアッセイ：
プライマー２（ＧＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧ）
プライマー１（ＣＣＡＧＧＡＧＴＴＡＡＧＡＡＣＴＣＧＣ）
プローブ／ＨＥＸ／ＣＧＧＡＧＴＣＣＡ／ＺＥＮ／ＡＧＧＧＡＡＡＴＧＧＡＧＴＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／
ＸＢＰ１Δ４アッセイ：
プライマー２（ＧＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧ）
プライマー１（ＣＣＡＧＧＡＧＴＴＡＡＧＡＡＣＴＣＧＣ）
／５６－ＦＡＭ／ＣＧＧＡＧＴＣＣＡ／ＺＥＮ／ＡＧＴＣＴＧＡＴＡＴＣＣＴＴＴＴＧ／３ＩＡＢｋＦＱ／
データを、Ｂｉｏｒａｄ製のＱｕａｎｔａＳｏｆｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏソフトウェアを使用して分析した。エクソン４のスキップを含むｍＲＮＡのパーセンタイルを、（ｃｏｎｃΔ４／（ｃｏｎｃΔ４＋ｃｏｎｃＷＴ））×１００によって計算した。エクソン４スキップを伴うｍＲＮＡの正規パーセンタイルを、ＰＢＳのみで処理した１４個の対照ウェルの平均から計算した。ＰＢＳウェルの平均は０．６％であった。データを表２に示す。
（表２）エクソン４スキップを伴うＸｂｐ１ ｍＲＮＡの％。
Figure 2024501662000005
Figure 2024501662000006
実施例２：ハムスターＸＢＰ１ ｍＲＮＡにおいてエクソンのスプライススキップを誘導して、天然にプロセシングされたＸＢＰ１タンパク質と同様に働くＸＢＰ１タンパク質模倣物を作製するためのＡＳＯの同定、ここではエクソン４付近のより多くの配列をカバーする拡張ライブラリーを用いる。
ＣＨＯＫ１細胞をＡＴＣＣ細胞バンクから得て、ＡＴＣＣガイドラインに従って増殖および維持した。ＸＢＰ１ ｍＲＮＡ ＮＭ＿００１２４４０４７．１のエクソン４の周りの領域に相補的な２５１個のＡＳＯを、エクソン４のエクソンスキップを誘導する能力について試験した。
３０００個のＣＨＯＫ１細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間後、ＡＳＯを最終濃度５μＭおよび２５μＭで細胞培地に直接添加した。細胞を６日後に回収し、全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙ ９６ウェルキットを使用して単離した。
Ｂｉｏｒａｄ製ＲＴ－ｑＰＣＲ用のｉＳｃｒｉｐｔ（商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用してｃＤＮＡを生成した。相対的ｍＲＮＡ発現を、Ｂｉｏｒａｄ製のＱＸ２００ ｄｄＰＣＲシステムをＢｉｏｒａｄ製の自動液滴発生器ＡｕｔｏＤＧと共に用いて液滴デジタルＰＣＲによって測定した。
ＰＣＲを、Ｂｉｏｒａｄ製のプローブ用のｄｄＰＣＲスーパーミックス（ＵＴＰなし）を使用して、製造業者の説明書に従って行った。
以下のプライマーおよびプローブを使用して、両方ともＩＤＴ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した、エクソン４のエクソンスキップを伴うｍＲＮＡの量（ＸＢＰ１Δ４アッセイ）ならびにエクソン４および５の正常な連結を伴うｍＲＮＡの量（ＸＢＰ１ ＷＴ）を測定した。ＸＢＰ１ ＷＴアッセイは、ＩＲＥ－１プロセシングｍＲＮＡおよび非プロセシングｍＲＮＡの両方を検出した。
ＸＢＰ１ ＷＴアッセイ：
プライマー２（ＧＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧ）
プライマー１（ＣＣＡＧＧＡＧＴＴＡＡＧＡＡＣＴＣＧＣ）
プローブ／ＨＥＸ／ＣＧＧＡＧＴＣＣＡ／ＺＥＮ／ＡＧＧＧＡＡＡＴＧＧＡＧＴＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／
ＸＢＰ１Δ４アッセイ：
プライマー２（ＧＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧ）
プライマー１（ＣＣＡＧＧＡＧＴＴＡＡＧＡＡＣＴＣＧＣ）、
／５６－ＦＡＭ／ＣＧＧＡＧＴＣＣＡ／ＺＥＮ／ＡＧＴＣＴＧＡＴＡＴＣＣＴＴＴＴＧ／３ＩＡＢｋＦＱ／
データを、Ｂｉｏｒａｄ製のＱｕａｎｔａＳｏｆｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏソフトウェアを使用して分析した。エクソン４のスキップを含むｍＲＮＡのパーセンタイルを、（ｃｏｎｃΔ４／（ｃｏｎｃΔ４＋ｃｏｎｃＷＴ））×１００によって計算した。エクソン４スキップを伴うｍＲＮＡの正規パーセンタイルを、ＰＢＳのみで処理した１７０個の対照ウェルの平均から計算した。ＰＢＳウェルの平均は０．１％であった。データを表３に示す。
（表３）２ライブラリーのエクソン４スキップを伴うＸｂｐ１ ｍＲＮＡの％。
Figure 2024501662000007
Figure 2024501662000008
Figure 2024501662000009
Figure 2024501662000010
Figure 2024501662000011
Figure 2024501662000012
Figure 2024501662000013
実施例３－マウスＸＢＰ１ ｍＲＮＡにおいてエクソンのスプライススキップを誘導して、天然にプロセシングされたＸＢＰ１タンパク質と同様に働くＸＢＰ１タンパク質模倣物を作製するためのＡＳＯの同定。
Ｌｔｋ－１１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１０４２２（商標））細胞をＡＴＣＣ細胞バンクから得て、ＡＴＣＣガイドラインに従って増殖および維持した。ＸＢＰ１ ｍＲＮＡ ＮＭ＿０１３８４２．３（配列番号２）のエクソン４の周りの領域に相補的な１０２個のＡＳＯを、エクソン４のエクソンスキップを誘導する能力について試験した。
２０００個のＬＴＫ細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間後、ＡＳＯを最終濃度５μＭおよび２５μＭで細胞培地に直接添加した。細胞を３日後に回収し、全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙ ９６ウェルキットを使用して単離した。
Ｂｉｏｒａｄ製ＲＴ－ｑＰＣＲ用のｉＳｃｒｉｐｔ（商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用してｃＤＮＡを生成した。相対的ｍＲＮＡ発現を、Ｂｉｏｒａｄ製のＱＸ２００ ｄｄＰＣＲシステムをＢｉｏｒａｄ製の自動液滴発生器ＡｕｔｏＤＧと共に用いて液滴デジタルＰＣＲによって測定した。
ＰＣＲを、Ｂｉｏｒａｄ製のプローブ用のｄｄＰＣＲスーパーミックス（ＵＴＰなし）を使用して、製造業者の説明書に従って行った。
以下のプライマーおよびプローブを使用して、両方ともＩＤＴ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した、エクソン４のエクソンスキップを伴うｍＲＮＡの量（ＸＢＰ１デルタ４アッセイ）ならびにエクソン４および５の正常な連結を伴うｍＲＮＡの量（ＸＢＰ１ ＷＴ）を測定した。ＸＢＰ１ ＷＴアッセイは、ＩＲＥ－１プロセシングｍＲＮＡおよび非プロセシングｍＲＮＡの両方を検出した。
ＸＢＰ１ ＷＴアッセイ：
プライマー２（ＡＧＧ ＧＴＣ ＣＡＡ ＣＴＴ ＧＴＣ Ｃ）
プライマー１（ＣＴＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＡＣ ＧＡＧ ＧＴＴ Ｃ）
プローブ／５ＨＥＸ／ＣＴＴ ＡＣＴ ＣＣＡ／ＺＥＮ／ＣＴＣ ＣＣＣ ＴＴＧ ＧＣＣ ＴＣＣ Ａ／３ＩＡＢｋＦＱ／
ＸＢＰ１デルタ４アッセイ：
プライマー２（ＡＧＧ ＧＴＣ ＣＡＡ ＣＴＴ ＧＴＣ Ｃ）
プライマー１（ＣＴＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＡＣ ＧＡＧ ＧＴＴ Ｃ）
／５６－ＦＡＭ／ＣＣＣ ＡＡＡ ＡＧＧ／ＺＥＮ／ＡＴＡ ＴＣＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＧＣＣ ＴＣＣ Ａ／３ＩＡＢｋＦＱ／
データを、Ｂｉｏｒａｄ製のＱｕａｎｔａＳｏｆｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏソフトウェアを使用して分析した。エクソン４のスキップを含むｍＲＮＡのパーセンタイルを、（ｃｏｎｃデルタ４／（ｃｏｎｃデルタ４＋ｃｏｎｃＷＴ））×１００によって計算した。エクソン４スキップを伴うｍＲＮＡの正規パーセンタイルを、ＰＢＳのみで処理した６１個の対照ウェルの平均から計算した。ＰＢＳウェルの平均は０．３７％であり、標準偏差は０．１７であった。データを表４に示す。
（表４）ＸＢＰ１エクソン４スプライススキップの％
Figure 2024501662000014
Figure 2024501662000015
Figure 2024501662000016
実施例４：ヒトＸＢＰ１ ｍＲＮＡにおいてエクソンのスプライススキップを誘導して、天然にプロセシングされたＸＢＰ１タンパク質と同様に働くＸＢＰ１タンパク質模倣物を作製するためのＡＳＯの同定。
Ａ４５９細胞をＡＴＣＣ細胞バンクから得て、ＡＴＣＣガイドラインに従って増殖および維持した。ＸＢＰ１ ｍＲＮＡ ＮＭ＿００５０８０．４（配列番号２）のエクソン４の周りの領域に相補的な１００個のＡＳＯを、エクソン４のエクソンスキップを誘導する能力について試験した。
４０００個のＡ５４９細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間後、ＡＳＯを最終濃度２５μＭで細胞培地に直接添加した。細胞を３日後に回収し、全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙ ９６ウェルキットを使用して単離した。
Ｂｉｏｒａｄ製ＲＴ－ｑＰＣＲ用のｉＳｃｒｉｐｔ（商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用してｃＤＮＡを生成した。相対的ｍＲＮＡ発現を、Ｂｉｏｒａｄ製のＱＸ２００ ｄｄＰＣＲシステムをＢｉｏｒａｄ製の自動液滴発生器ＡｕｔｏＤＧと共に用いて液滴デジタルＰＣＲによって測定した。
ＰＣＲを、Ｂｉｏｒａｄ製のプローブ用のｄｄＰＣＲスーパーミックス（ＵＴＰなし）を使用して、製造業者の説明書に従って行った。
以下のプライマーおよびプローブを使用して、両方ともＩＤＴ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した、エクソン４のエクソンスキップを伴うｍＲＮＡの量（ＸＢＰ１４アッセイ）ならびにエクソン４および５の正常な連結を伴うｍＲＮＡの量（ＸＢＰ１ ＷＴ）を測定した。ＸＢＰ１ ＷＴアッセイは、ＩＲＥ－１プロセシングｍＲＮＡおよび非プロセシングｍＲＮＡの両方を検出した。
ＸＢＰ１ＷＴアッセイ：
プライマー２（ＣＴＧ ＧＧＴ ＣＣＡ ＡＧＴ ＴＧＴ ＣＣＡ ＧＡ）
プライマー１（ＡＴＧ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＴＧ ＣＴＧ ＡＡＧ）
プローブ／５ＨＥＸ／ＴＣＡ ＣＴＴ ＣＡＴ／ＺＥＮ／ＴＣＣ ＣＣＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＣＣＧ Ｃ／３ＩＡＢｋＦＱ／
ＸＢＰ１Δ４アッセイ：
プライマー２（ＣＴＧ ＧＧＴ ＣＣＡ ＡＧＴ ＴＧＴ ＣＣＡ ＧＡ）
プライマー１（ＡＴＧ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＴＧ ＣＴＧ ＡＡＧ）
／５６－ＦＡＭ／ＣＣＡ ＡＣＡ ＧＧＡ／ＺＥＮ／ＴＡＴ ＣＡＧ ＡＣＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＣＣＧ Ｃ／３ＩＡＢｋＦＱ／
データを、Ｂｉｏｒａｄ製のＱｕａｎｔａＳｏｆｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏソフトウェアを使用して分析した。エクソン４のスキップを含むｍＲＮＡのパーセンタイルを、（ｃｏｎｃΔ４／（ｃｏｎｃΔ４＋ｃｏｎｃＷＴ））×１００によって計算した。エクソン４スキップを伴うｍＲＮＡの正規パーセンタイルを、ＰＢＳのみで処理した４０個の対照ウェルの平均から計算した。ＰＢＳウェルの平均は０．０３％であり、標準偏差は０．０５であった。データを表５に示す。
（表５）ＸＢＰ１エクソン４スキップの％
Figure 2024501662000017
Figure 2024501662000018
Figure 2024501662000019
実施例５：標的化組込みのためのプラスミド作製
一般に、ＲＭＣＥ用のプラスミドを構築するために、抗体軽鎖および重鎖のそれぞれの発現カセットを、Ｌ３およびＬｏｘＦａｓ配列に隣接する第１のベクターバックボーン、ならびにＬｏｘＦａｓおよび２Ｌ配列に隣接し、選択可能マーカーもさらに含む第２のベクターにクローニングした。Ｃｒｅリコンビナーゼプラスミド（Ｗｏｎｇ，Ｅ．Ｔ．，ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（１９９７）１４６０２－１４６０７を参照）を、すべてのＲＭＣＥプロセスに使用した。
それぞれのポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、遺伝子合成（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）によって生成した。３７℃で１時間、合成ｃＤＮＡおよびバックボーンベクターをＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦおよびＥｃｏＲＩ－ＨＦ（ＮＥＢ）で消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離した。それぞれ挿入断片およびバックボーンのＤＮＡ断片を含むバンドをアガロースゲルから切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。製造業者のプロトコルに従ってＲａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を用いて、３：１の挿入断片／バックボーン比で、精製した挿入断片およびバックボーン断片をライゲーションした。次いで、ライゲーションアプローチを、熱ショックによってコンピテント大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、細胞を、選択のためにアンピシリンを含む寒天プレート上にプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
翌日、クローンを採取し、ミニプレップまたはマキシプレップのために振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。これは、ＥｐＭｏｔｉｏｎ（登録商標）５０７５（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、またはそれぞれＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ－Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）／ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍａｘｉ ＥＦ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ）を用いて、実施した。すべての構築物を、配列の正確さを保証するために配列決定した。
第２のクローニング工程において、上に概説したのと同じ条件を用いて、生成したベクターをＫｐｎＩ－ＨＦ／ＳａｌＩ－ＨＦおよびＳａｌＩ－ＨＦ／ＭｆｅＩ－ＨＦで消化した。それぞれのＲＭＣＥ（ＴＩ）ＴＩバックボーンベクターをＫｐｎＩ－ＨＦおよびＭｆｅＩ－ＨＦで消化した。分離および抽出を、前述のように実施した。製造業者のプロトコルに従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、１：１：１の挿入断片／挿入断片／バックボーン比で、精製した挿入断片およびバックボーンのライゲーションを４℃で一晩実施した。その後、リガーゼを６５℃で１０分間不活性化した。前述のようにして、以下の工程を実施した。
実施例６：標的化組込みによる安定な細胞株の作製
ＴＩランディング部位にＧＦＰ発現カセットを含むＣＨＯ ＴＩ宿主細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地で、１５０ｒｐｍの一定の撹拌速度、標準的な加湿条件下（９５％ｒＨ、３７℃、および５％ＣＯ２）で、使い捨て１２５ｍｌベント・シェイク・フラスコ内にて増殖させた。３～４日ごとに、細胞を、選択マーカー１および選択マーカー２を有効濃度で含有する既知組成培地に３×１０Ｅ５細胞／ｍｌの濃度で播種した。培養物の密度および生存率を、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ細胞カウンタ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ、バーゼル、スイス）で測定した。
安定なトランスフェクションのために、実施例５に従って生成された等モル量の第１および第２のベクターを混合した。５μｇの混合物あたり１μｇのＣｒｅコード核酸を添加した（すなわち、５μｇのＣｒｅ発現プラスミドまたはＣｒｅ ｍＲＮＡを２５μｇのベクター混合物に添加した）。
トランスフェクションの２日前に、ＴＩ宿主細胞を、４ｘ１０Ｅ５細胞／ｍｌの密度で、新鮮な培地に播種した。トランスフェクションは、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖ（Ｌｏｎｚａ、スイス）を使用して、製造業者のプロトコルに従ってＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイスで実施した。３×１０Ｅ７細胞に、合計３０μｇの核酸混合物、すなわち３０μｇのプラスミド（５μｇのＣｒｅプラスミドおよび２５μｇのベクター混合物）をトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、選択剤を含まない３０ｍｌの培地に播種した。
播種後５日目に、細胞を遠心分離し、組換え細胞を選択するために、選択剤１および選択剤２を有効濃度で含有する８０ｍＬの既知組成培地に、６ｘ１０Ｅ５細胞／ｍｌの細胞密度で移した。分割せずに、この日以降、３７℃、１５０ｒｐｍ、５％ＣＯ２、および８５％湿度で、細胞をインキュベートした。培養物の細胞密度および生存率を定期的にモニターした。培養物の生存率が再び増加し始めたとき、選択剤１および２の濃度を、以前に使用した量の約半分に減少させた。より詳細には、細胞の回収を促進するために、生存率が４０％より高く、かつ生細胞密度（ＶＣＤ）が０．５×１０Ｅ６細胞／ｍＬより高い場合は選択圧を下げた。したがって、４×１０Ｅ５細胞／ｍｌを遠心分離し、４０ｍｌの選択培地ＩＩ（既知組成培地、１／２選択マーカー１および２）に再懸濁した。これらの細胞を以前と同じ条件で、かつこの場合も分割せずに、インキュベートした。
選択を開始してから１０日後、細胞内ＧＦＰおよび細胞表面に結合した細胞外異種ポリペプチドの発現を測定するフローサイトメトリーによって、ＲＭＣＥの成功を確認した。ＦＡＣＳ染色のために、ヒト抗体の軽鎖および重鎖に対するＡＰＣ抗体（アロフィコシアニン標識Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ）を使用した。フローサイトメトリーは、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ、ハイデルベルク、ドイツ）を使用して実施した。試料あたり１万事象を測定した。生細胞を、側方散乱（ＳＳＣ）に対する前方散乱（ＦＳＣ）のプロットでゲートした。生細胞ゲートは、トランスフェクトされていないＴＩ宿主細胞で定義され、ＦｌｏｗＪｏ ７．６．５ ＥＮソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、オルテン、スイス）を用いて、すべての試料に適用された。ＧＦＰの蛍光を、ＦＩＴＣチャネル（４８８ｎｍでの励起、５３０ｎｍでの検出）で定量化した。抗体を、ＡＰＣチャネル（６４５ｎｍでの励起、６６０ｎｍでの検出）で測定した。ＣＨＯ親細胞、すなわちＴＩ宿主細胞の作製に使用された細胞を、ＧＦＰおよび抗体発現に対するネガティブコントロールとして使用した。選択開始から１４日後、生存率は９０％を超え、選択は完了したとみなされた。
実施例７：ＦＡＣＳスクリーニング
ＦＡＣＳ解析を実施して、トランスフェクションおよびＲＭＣＥの効率を調べた。トランスフェクトしたアプローチの４×１０Ｅ５細胞を遠心分離し（１２００ｒｐｍ、４分）、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを用いる洗浄工程の後、ペレットを４００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳチューブ（セルストレーナーキャップ付きのＦａｌｃｏｎ（登録商標）Ｒｏｕｎｄ－Ｂｏｔｔｏｍ Ｔｕｂｅｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩを用いて測定を実施し、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏを用いてデータを解析した。
実施例８：ＬＮＡ添加による流加培養
すべての流加培養は、同じ独自の無血清、既知組成培地を用い、同じ培養および供給条件下で、振盪フラスコまたはＡｍｂｒ１５容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）中で実施した。
この実施例において使用される組換え哺乳動物細胞を実施例６に記載の手順に従って得て、異種抗体（タンパク質１：抗体－多量体融合物）を発現させた。
細胞培養プロセスは、シードトレイン培養、続いて接種トレイン（Ｎ－２およびＮ－１培養物、前発酵）および主発酵（Ｎ）からなった。Ａｍｂｒ１５のためのシードトレインおよび接種トレインを振盪フラスコ中で実施し、３日または４日毎に細胞を分割した。
配列番号２３および配列番号２４のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、初期の研究においてこれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドで観察された高レベルのエクソン４スキップのためにＬＮＡとして選択した（実施例１参照）。
Ａｍｂｒ１５中での（主）培養は、開始細胞密度約２×１０Ｅ６細胞／ｍＬ、総体積１３ｍｌで行った。培養温度を制御し、Ｎ２ガス発生速度を一定に設定し、一定のＤＯを維持するようにＰＩＤコントローラを介して酸素供給を調節し、撹拌速度を１２００～１４００ｒｐｍ（下方撹拌）に設定し、ｐＨをｐＨ７．０に設定した。ｐＨ制御は、１Ｍ炭酸ナトリウム溶液をバイオリアクタに添加するか、ＣＯ２を散布することによって行った。バイオリアクタのｐＨスポットを、Ａｍｂｒ１５の統合分析モジュールを用いて１日おきに再較正した。接種の１日前および培養中毎日、消泡剤を添加した。細胞を、グルコースコントロールと、所定の時点でボーラスとして加えられた２つの異なる供給物とを含む１４日間の供給バッチプロセスで培養した。細胞数および生存率の測定は、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）に従って行った。Ｃｅｄｅｘ Ｂｉｏ ＨＴ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）を使用して、生成物および代謝産物の濃度を測定した。
Ｎ－１前培養の開始時（Ｎ－１）、接種日（ｄ０）または接種後３日（ｄ３）のＬＮＡ添加は、規定量の高濃度ＬＮＡストック溶液を添加することによってＡｍｂｒ１５の液体処理システムによって行った。
流加開始後１４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍおよび１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を回収し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。ＵＶ検出を伴うプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを使用して、１４日目の力価を測定した。生成物の品質は、ＣａｌｉｐｅｒのＬａｂｃｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって決定した。
ＬＮＡのエクソン４スキップにおける任意の効率が、組換え力価の増加の効果を生じさせるのに十分であるように思われる。
（表６）Ａｍｂｒ１５における１４日間の流加培養の結果；Ｎ－１＝前発酵の開始時のＬＮＡ添加；ｄ０＝０日目、すなわち主発酵の開始時のＬＮＡ添加；ｄ３＝主発酵の３日目のＬＮＡ添加。
Figure 2024501662000020
実施例９：安定なＸＢＰ１Δ４発現を伴う流加培養－比較例
すべての流加培養は、同じ独自の無血清、既知組成培地を用い、振盪フラスコまたはＡｍｂｒ１５容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）中で実施した。
細胞培養プロセスは、シードトレイン培養、続いて接種トレイン（Ｎ－２およびＮ－１培養物、前発酵）および主発酵（Ｎ）からなった。Ａｍｂｒ１５のためのシードトレインおよび接種トレインを振盪フラスコ中で実施し、３日または４日毎に細胞を分割した。
この実施例で使用される組換え哺乳動物細胞を実施例６に記載の手順に従って得て、異種抗体および配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＸＢＰ１スプライスバリアントＸＢＰ１Δ４を安定に発現させた。
Ａｍｂｒ１５中での（主）培養は、開始細胞密度約２×１０Ｅ６細胞／ｍＬ、総体積１３ｍｌで行った。培養温度を制御し、Ｎ２ガス発生速度を一定に設定し、一定のＤＯを維持するようにＰＩＤコントローラを介して酸素供給を調節し、撹拌速度を１２００～１４００ｒｐｍ（下方撹拌）に設定し、ｐＨをｐＨ７．０に設定した。ｐＨ制御は、１Ｍ炭酸ナトリウム溶液をバイオリアクタに添加するか、ＣＯ２を散布することによって行った。バイオリアクタのｐＨスポットを、Ａｍｂｒ１５の統合分析モジュールを用いて１日おきに再較正した。接種の１日前および培養中毎日、消泡剤を添加した。細胞を、グルコースコントロールと、所定の時点でボーラスとして加えられた２つの異なる供給物とを含む１４日間の供給バッチプロセスで培養した。細胞数および生存率の測定は、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）に従って行った。Ｃｅｄｅｘ Ｂｉｏ ＨＴ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）を使用して、生成物および代謝産物の濃度を測定した。
流加開始後１４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍおよび１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を回収し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。ＵＶ検出を伴うプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを使用して、１４日目の力価を測定した。生成物の品質は、ＣａｌｉｐｅｒのＬａｂｃｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって決定した。
（表７）抗体（タンパク質１：抗体－多量体融合物）およびＸＢＰ１Δ４バリアントをコードする核酸で安定にトランスフェクトした組換え哺乳動物ＣＨＯ細胞のＡｍｂｒ１５での１４日間の流加培養の結果。ｅｘｐ．＝実験数、ｅｆｆ．ｔｉｔｅｒ＝有効力価（キャピラリー電気泳動またはＳＥＣによって決定される力価とメインピークの積）、ｒｅｌ．ｅｆｆ．ｔｉｔｅｒ＝相対有効力価（ｅｘｐ．１に対して正規化された相対力価）。
Figure 2024501662000021
実施例１０：ＬＮＡ添加による流加培養
上記の実施例８に記載したのと同じ流加培養の条件も本明細書で使用した。本実施例１０～実施例８の唯一の違いは、発現タンパク質およびＬＮＡの添加時間に関するものである。
同様に、本実施例で使用される組換えＣＨＯ細胞は、実施例６に記載の方法で得た。
タンパク質１：抗体－多量体融合物
プールのデータ：
Figure 2024501662000022
単一クローンのデータ
Figure 2024501662000023
タンパク質２：ヒトＡ－ベータタンパク質に結合する全長抗体およびヒトトランスフェリン受容体に結合するドメイン交換を有する追加の重鎖Ｃ末端Ｆａｂ断片を含む二重特異性三価抗体（国際公開第２０１７／０５５５４０号参照）
単一クローンのデータ
Figure 2024501662000024
タンパク質３：ドメイン交換を有する四価二重特異性抗体
単一クローンのデータ
Figure 2024501662000025
化合物表
Ｈｅｌｍアノテーションキー：
［ＬＲ］（Ｇ）は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（Ｔ）は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡチミンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（Ａ）は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（［５ｍｅＣ］は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ５－メチルシトシンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ｇ）は、ＤＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ｔ）は、ＤＮＡチミンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ａ）は、ＤＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（［Ｃ］は、ＤＮＡシトシンヌクレオシドであり、
［ｍＲ］（Ｇ）は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ｍＲ］（Ｕ）は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ ＤＮＡウラシルヌクレオシドであり、
［ｍＲ］（Ａ）は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ ＤＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ｍＲ］（［Ｃ］は、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ ＤＮＡシトシンヌクレオシドであり、
［ｓＰ］は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
Figure 2024501662000026
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Figure 2024501662000087
配列
ハムスター
配列番号１：ハムスターＸＢＰ１遺伝子
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配列番号２：ハムスターＸｂｐ１－２０２（Ｘｂｐ－１ｕ）
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配列番号３：配列番号２からのハムスター予測タンパク質
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配列番号４：ハムスターＸｂｐ１－２０１（Ｘｂｐ－１ｓ）
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配列番号５：配列番号４からのハムスター予測タンパク質
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配列番号６：ハムスターＸＢＰ１？４
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配列番号７：配列番号６からのハムスター予測タンパク質
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マウス
配列番号５９０：マウスＸＢＰ１遺伝子
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配列番号５９１：マウスＸｂｐ１、転写バリアント１、（ＩＲＥ１プロセシングされていないｍＲＮＡ）
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配列番号５９２：マウスＸ－ｂｏｘ結合タンパク質１アイソフォームＸＢＰ１（Ｕ）
ＭＶＶＶＡＡＡＰＳＡＡＴＡＡＰＫＶＬＬＬＳＧＱＰＡＳＧＧＲＡＬＰＬＭＶＰＧＰＲＡＡＧＳＥＡＳＧＴＰＱＡＲＫＲＱＲＬＴＨＬＳＰＥＥＫＡＬＲＲＫＬＫＮＲＶＡＡＱＴＡＲＤＲＫＫＡＲＭＳＥＬＥＱＱＶＶＤＬＥＥＥＮＨＫＬＱＬＥＮＱＬＬＲＥＫＴＨＧＬＶＶＥＮＱＥＬＲＴＲＬＧＭＤＴＬＤＰＤＥＶＰＥＶＥＡＫＧＳＧＶＲＬＶＡＧＳＡＥＳＡＡＬＲＬＣＡＰＬＱＱＶＱＡＱＬＳＰＰＱＮＩＦＰＷＴＬＴＬＬＰＬＱＩＬＳＬＩＳＦＷＡＦＷＴＳＷＴＬＳＣＦＳＮＶＬＰＱＳＬＬＶＷＲＮＳＱＲＳＴＱＫＤＬＶＰＹＱＰＰＦＬＣＱＷＧＰＨＱＰＳＷＫＰＬＭＮＳＦＶＬＴＭＹＴＰＳＬ
配列番号５９３：マウスＸ－ｂｏｘ結合タンパク質１（Ｘｂｐ１）、転写バリアント２、ｍＲＮＡ
ＣＴＡＧＧＧＴＡＡＡＡＣＣＧＴＧＡＧＡＣＴＣＧＧＴＣＴＧＧＡＡＡＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＡＡＴＣＣＴＣＡＧＣＣＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＣＧＴＣＴＧＣＣＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＴＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＣＣＡＣＣＣＴＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＣＧＧＣＧＧＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＧＣＴＧＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＣＣＧＣＣＣＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＧＧＡＣＴＡＣＡＧＧＡＣＣＡＡＴＡＡＧＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡＣＣＣＧＣＧＣＧＴＣＡＣＧＧＡＧＣＡＣＣＧＧＣＣＡＡＴＣＧＣＧＧＡＣＧＧＣＣＡＣＧＡＣＣＣＴＡＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＧＧＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＣＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＣＧＴＴＴＣＣＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＡＣＴＣＴＴＡＴＣＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＧＴＡＣＣＣＧＧＴＣＣＧＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＧＡＧＣＧＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＧＧＣＴＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＡＣＧＣＡＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＣＡＧＡＧＴＡＧＣＡＧＣＧＣＡＧＡＣＴＧＣＴＣＧＡＧＡＴＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＧＧＡＴＧＡＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＧＧＡＴＴＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＡＡＣＴＣＣＡＧＣＴＡＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＴＴＴＡＣＧＧＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＴＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＡＧＴＴＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＴＧＧＧＡＡＴＧＧＡＣＡＣＧＣＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＣＧＡＧＧＴＴＣＣＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＴＡＡＧＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＣＴＧＣＴＧＡＧＴＣＣＧＣＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＧＴＴＧＴＣＡＣＣＴＣＣＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＴＧＧＡＣＴＣＴＧＡＣＡＣＴＧＴＴＧＣＣＴＣＴＴＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＧＴＣＴＧＡＴＡＴＣＣＴＴＴＴＧＧＧＣＡＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＣＡＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＴＣＴＧＣＴＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＣＴＡＧＴＴＣＣＴＴＡＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＧＴＣＡＧＴＧＧＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＣＴＣＡＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＣＣＡＴＧＴＡＴＡＣＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＴＡＧＴＴＴＴＡＧＡＧＡＴＣＣＣＣＴＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＧＴＣＡＡＡＣＴＡＡＣＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＡＡＡＴＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＡＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＣＣＴＴＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＣＴＴＣＡＴＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＣＡＡＡＣＣＴＧＣＴＴＴＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＧＣＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＡＴＧＡＧＧＧＣＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＧＡＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＣＡＣＴＣＣＴＧＧＧＡＧＧＡＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＴＧＡＡＣＴＴＴＴＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧＡＴＴＡＧＴＧＴＣＴＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＡＴＡＡＣＡＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＧＣＣＴＡＧＡＧＧＡＴＡＧＣＡＴＡＧＧＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＣＧＴＴＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＴＡＧＡＧＧＣＴＧＴＣＴＧＧＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＴＴＣＡＡＡＴＣＴＣＡＴＡＧＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＧＴＣＧＴＴＴＧＡＣＡＣＴＣＡＧＣＴＧＴＣＴＡＡＧＧＴＡＴＴＣＡＡＡＧＧＴＡＴＴＣＣＡＧＴＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＴＡＧＴＴＴＡＴＣＴＴＡＡＡＧＧＴＧＧＴＡＧＴＡＴＡＣＴＣＴＡＡＡＴＣＧＣＡＧＧＧＡＧＧＧＴＣＡＴＴＴＧＡＣＡＧＴＴＴＴＴＴＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＴＴＣＡＡＡＣＴＡＴＧＴＡＧＣＣＧＡＧＧＣＴＡＧＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＧＡＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＧＴＧＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＧＡＣＡＴＧＴＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＴＧＧＧＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＧＧＣＣＣＴＴＡＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＴＣＧＴＡＡＣＣＴＧＡＧＧＧＧＧＣＴＴＧＴＴＴＴＣＣＣＴＴＡＴＧＴＧＣＡＴＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＴＧＴＡＡＡＡＴＧＡＴＧＡＡＡＡＴＴＴＡＣＴＡＴＧＴＡＡＡＴＧＣＴＴＧＡＴＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＣＴＡＧＴＧＴＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡＡＡＣＴＡＣＣＣＴＴＧＣＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＣＣＴＧＴＴＣＴＧＴＧＡＴＴＴＣＴＡＧＧＧＣＴＧＴＴＧＴＡＡＴＴＴＣＴＣＴＴＴＡＴＴＧＴＴＧＧＣＴＡＡＡＧＧＡＧＴＡＡＴＴＴＡＴＣＣＡＡＣＴＡＡＡＧＴＧＡＧＣＡＴＡＣＣＡＣＴＴＴＴＴＡＡＡＧＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
配列番号５９４：Ｘ－ｂｏｘ結合タンパク質１アイソフォームＸＢＰ１（Ｓ）
ＭＶＶＶＡＡＡＰＳＡＡＴＡＡＰＫＶＬＬＬＳＧＱＰＡＳＧＧＲＡＬＰＬＭＶＰＧＰＲＡＡＧＳＥＡＳＧＴＰＱＡＲＫＲＱＲＬＴＨＬＳＰＥＥＫＡＬＲＲＫＬＫＮＲＶＡＡＱＴＡＲＤＲＫＫＡＲＭＳＥＬＥＱＱＶＶＤＬＥＥＥＮＨＫＬＱＬＥＮＱＬＬＲＥＫＴＨＧＬＶＶＥＮＱＥＬＲＴＲＬＧＭＤＴＬＤＰＤＥＶＰＥＶＥＡＫＧＳＧＶＲＬＶＡＧＳＡＥＳＡＡＧＡＧＰＶＶＴＳＰＥＨＬＰＭＤＳＤＴＶＡＳＳＤＳＥＳＤＩＬＬＧＩＬＤＫＬＤＰＶＭＦＦＫＣＰＳＰＥＳＡＳＬＥＥＬＰＥＶＹＰＥＧＰＳＳＬＰＡＳＬＳＬＳＶＧＴＳＳＡＫＬＥＡＩＮＥＬＩＲＦＤＨＶＹＴＫＰＬＶＬＥＩＰＳＥＴＥＳＱＴＮＶＶＶＫＩＥＥＡＰＬＳＳＳＥＥＤＨＰＥＦＩＶＳＶＫＫＥＰＬＥＤＤＦＩＰＥＬＧＩＳＮＬＬＳＳＳＨＣＬＲＰＰＳＣＬＬＤＡＨＳＤＣＧＹＥＧＳＰＳＰＦＳＤＭＳＳＰＬＧＴＤＨＳＷＥＤＴＦＡＮＥＬＦＰＱＬＩＳＶ
配列番号５９５：マウスＸＢＰ１デルタ４ ｍＲＮＡ
ＣＴＡＧＧＧＴＡＡＡＡＣＣＧＴＧＡＧＡＣＴＣＧＧＴＣＴＧＧＡＡＡＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＡＡＴＣＣＴＣＡＧＣＣＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＣＧＴＣＴＧＣＣＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＴＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＣＣＡＣＣＣＴＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＣＧＧＣＧＧＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＧＣＴＧＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＣＣＧＣＣＣＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＧＧＡＣＴＡＣＡＧＧＡＣＣＡＡＴＡＡＧＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡＣＣＣＧＣＧＣＧＴＣＡＣＧＧＡＧＣＡＣＣＧＧＣＣＡＡＴＣＧＣＧＧＡＣＧＧＣＣＡＣＧＡＣＣＣＴＡＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＧＧＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＣＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＣＧＴＴＴＣＣＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＡＣＴＣＴＴＡＴＣＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＧＴＡＣＣＣＧＧＴＣＣＧＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＧＡＧＣＧＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＧＧＣＴＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＡＣＧＣＡＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＣＡＧＡＧＴＡＧＣＡＧＣＧＣＡＧＡＣＴＧＣＴＣＧＡＧＡＴＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＧＧＡＴＧＡＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＧＧＡＴＴＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＡＡＣＴＣＣＡＧＣＴＡＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＴＴＴＡＣＧＧＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＴＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＡＧＴＴＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＴＧＧＧＡＡＴＧＧＡＣＡＣＧＣＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＣＧＡＧＧＴＴＣＣＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＴＣＴＧＡＴＡＴＣＣＴＴＴＴＧＧＧＣＡＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＣＡＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＴＣＴＧＣＴＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＣＴＡＧＴＴＣＣＴＴＡＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＧＴＣＡＧＴＧＧＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＣＴＣＡＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＣＣＡＴＧＴＡＴＡＣＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＴＡＧＴＴＴＴＡＧＡＧＡＴＣＣＣＣＴＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＧＴＣＡＡＡＣＴＡＡＣＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＡＡＡＴＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＡＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＣＣＴＴＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＣＴＴＣＡＴＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＣＡＡＡＣＣＴＧＣＴＴＴＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＧＣＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＡＴＧＡＧＧＧＣＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＧＡＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＣＡＣＴＣＣＴＧＧＧＡＧＧＡＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＴＧＡＡＣＴＴＴＴＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧＡＴＴＡＧＴＧＴＣＴＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＡＴＡＡＣＡＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＧＣＣＴＡＧＡＧＧＡＴＡＧＣＡＴＡＧＧＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＣＧＴＴＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＴＡＧＡＧＧＣＴＧＴＣＴＧＧＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＴＴＣＡＡＡＴＣＴＣＡＴＡＧＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＧＴＣＧＴＴＴＧＡＣＡＣＴＣＡＧＣＴＧＴＣＴＡＡＧＧＴＡＴＴＣＡＡＡＧＧＴＡＴＴＣＣＡＧＴＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＴＡＧＴＴＴＡＴＣＴＴＡＡＡＧＧＴＧＧＴＡＧＴＡＴＡＣＴＣＴＡＡＡＴＣＧＣＡＧＧＧＡＧＧＧＴＣＡＴＴＴＧＡＣＡＧＴＴＴＴＴＴＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＴＴＣＡＡＡＣＴＡＴＧＴＡＧＣＣＧＡＧＧＣＴＡＧＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＧＡＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＧＴＧＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＧＡＣＡＴＧＴＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＴＧＧＧＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＧＧＣＣＣＴＴＡＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＴＣＧＴＡＡＣＣＴＧＡＧＧＧＧＧＣＴＴＧＴＴＴＴＣＣＣＴＴＡＴＧＴＧＣＡＴＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＴＧＴＡＡＡＡＴＧＡＴＧＡＡＡＡＴＴＴＡＣＴＡＴＧＴＡＡＡＴＧＣＴＴＧＡＴＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＣＴＡＧＴＧＴＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡＡＡＣＴＡＣＣＣＴＴＧＣＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＣＣＴＧＴＴＣＴＧＴＧＡＴＴＴＣＴＡＧＧＧＣＴＧＴＴＧＴＡＡＴＴＴＣＴＣＴＴＴＡＴＴＧＴＴＧＧＣＴＡＡＡＧＧＡＧＴＡＡＴＴＴＡＴＣＣＡＡＣＴＡＡＡＧＴＧＡＧＣＡＴＡＣＣＡＣＴＴＴＴＴＡＡＡＧＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
配列番号５９６：ＸＢＰ１デルタ４ ｍＲＮＡによって産生されると予測されるタンパク質
ＭＶＶＶＡＡＡＰＳＡＡＴＡＡＰＫＶＬＬＬＳＧＱＰＡＳＧＧＲＡＬＰＬＭＶＰＧＰＲＡＡＧＳＥＡＳＧＴＰＱＡＲＫＲＱＲＬＴＨＬＳＰＥＥＫＡＬＲＲＫＬＫＮＲＶＡＡＱＴＡＲＤＲＫＫＡＲＭＳＥＬＥＱＱＶＶＤＬＥＥＥＮＨＫＬＱＬＥＮＱＬＬＲＥＫＴＨＧＬＶＶＥＮＱＥＬＲＴＲＬＧＭＤＴＬＤＰＤＥＶＰＥＶＥＡＫＳＤＩＬＬＧＩＬＤＫＬＤＰＶＭＦＦＫＣＰＳＰＥＳＡＳＬＥＥＬＰＥＶＹＰＥＧＰＳＳＬＰＡＳＬＳＬＳＶＧＴＳＳＡＫＬＥＡＩＮＥＬＩＲＦＤＨＶＹＴＫＰＬＶＬＥＩＰＳＥＴＥＳＱＴＮＶＶＶＫＩＥＥＡＰＬＳＳＳＥＥＤＨＰＥＦＩＶＳＶＫＫＥＰＬＥＤＤＦＩＰＥＬＧＩＳＮＬＬＳＳＳＨＣＬＲＰＰＳＣＬＬＤＡＨＳＤＣＧＹＥＧＳＰＳＰＦＳＤＭＳＳＰＬＧＴＤＨＳＷＥＤＴＦＡＮＥＬＦＰＱＬＩＳＶ
ヒト
配列番号８０１：ヒトＸＢＰ１遺伝子
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配列番号８０２：ヒトＸ－ｂｏｘ結合タンパク質１（ＸＢＰ１）、転写バリアント１、ｍＲＮＡ（ＩＲＥ１によってプロセシングされていない）
ＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＧＣＧＧＴＧＣＧＣＧＧＴＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＡＡＣＣＣＧＧＣＣＧＡＣＧＧＧＡＣＣＣＣＴＡＡＡＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＴＣＧＧＧＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＡＧＣＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＧＣＧＣＧＣＡＡＧＣＧＡＣＡＧＣＧＣＣＴＣＡＣＧＣＡＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＡＡＧＧＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＣＡＧＡＧＴＡＧＣＡＧＣＴＣＡＧＡＣＴＧＣＣＡＧＡＧＡＴＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＣＴＣＧＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＡＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＴＧＣＴＡＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＴＴＴＡＣＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＡＧＴＴＡＡＧＡＣＡＧＣＧＣＴＴＧＧＧＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＡＴＧＡＡＧＴＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＣＴＧＣＴＧＡＧＴＣＣＧＣＡＧＣＡＣＴＣＡＧＡＣＴＡＣＧＴＧＣＡＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＧＴＴＧＴＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＴＧＧＡＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＴＴＧＡＣＴＣＴＴＣＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＴＣＴＧＡＴＡＴＣＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＧＡＣＣＣＡＧＴＣＡＴＧＴＴＣＴＴＣＡＡＡＴＧＣＣＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＴＡＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＧＴＣＡＧＴＧＧＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＣＴＡＡＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＣＣＡＣＡＴＡＴＡＴＡＣＣＡＡＧＣＣＣＣＴＡＧＴＣＴＴＡＧＡＧＡＴＡＣＣＣＴＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＴＡＡＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＴＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＴＣＧＴＴＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＡＴＣＴＣＡＡＡＴＣＴＧＣＴＴＴＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＴＴＡＣＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＧＧＧＧＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣＣＣＡＴＴＣＡＧＴＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＴＴＧＧＴＧＴＡＡＡＣＣＡＴＴＣＴＴＧＧＧＡＧＧＡＣＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＡＧＣＴＧＡＴＴＡＧＴＧＴＣＴＡＡＧＧＡＡＴＧＡＴＣＣＡＡＴＡＣＴＧＴＴＧＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＴＡＣＴＴＣＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＴＡＧＡＧＡＧＴＡＴＡＣＡＧＴＣＣＴＡＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＡＴＴＴＧＴＴＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＧＡＴＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＴＡＴＴＧＴＣＴＴＴＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＴＣＣＡＡＧＧＴＡＴＴＧＡＧＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＡＡＧＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＡＴＡＡＴＴＧＡＧＡＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＡＡＧＡＴＴＧＴＡＣＴＴＴＴＡＴＣＴＴＡＡＡＡＧＧＧＴＧＧＴＡＧＴＴＴＴＣＣＣＴＡＡＡＡＴＡＣＴＴＡＴＴＡＴＧＴＡＡＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＡＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＧＡＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＡＴＧＡＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＡＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＧＴＴＴＴＡＧＧＴＣＣＴＴＴＡＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＴＡＡＧＣＡＡＣＧＧＧＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＴＧＴＡＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＡＴＡＧＡＡＡＴＴＴＡＣＴＡＴＧＴＡＡＡＴＧＣＴＴＧＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＡＧＴＧＴＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＧＧＴＧＣＴＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡＡＡＣＴＡＣＣＣＡＴＧＣＡＡＴＴＡＡＡＡＧＧＴＡＣＡＡＴＧＣＡ
配列番号８０３：ヒトＸ－ｂｏｘ結合タンパク質１アイソフォームＸＢＰ１（Ｕ）
ＭＶＶＶＡＡＡＰＮＰＡＤＧＴＰＫＶＬＬＬＳＧＱＰＡＳＡＡＧＡＰＡＧＱＡＬＰＬＭＶＰＡＱＲＧＡＳＰＥＡＡＳＧＧＬＰＱＡＲＫＲＱＲＬＴＨＬＳＰＥＥＫＡＬＲＲＫＬＫＮＲＶＡＡＱＴＡＲＤＲＫＫＡＲＭＳＥＬＥＱＱＶＶＤＬＥＥＥＮＱＫＬＬＬＥＮＱＬＬＲＥＫＴＨＧＬＶＶＥＮＱＥＬＲＱＲＬＧＭＤＡＬＶＡＥＥＥＡＥＡＫＧＮＥＶＲＰＶＡＧＳＡＥＳＡＡＬＲＬＲＡＰＬＱＱＶＱＡＱＬＳＰＬＱＮＩＳＰＷＩＬＡＶＬＴＬＱＩＱＳＬＩＳＣＷＡＦＷＴＴＷＴＱＳＣＳＳＮＡＬＰＱＳＬＰＡＷＲＳＳＱＲＳＴＱＫＤＰＶＰＹＱＰＰＦＬＣＱＷＧＲＨＱＰＳＷＫＰＬＭＮ
配列番号８０４：ヒトＸ－ｂｏｘ結合タンパク質１（ＸＢＰ１）、転写バリアント２、ｍＲＮＡ（ＩＲＥ１によってプロセシングされた）
ＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＧＣＧＧＴＧＣＧＣＧＧＴＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＡＡＣＣＣＧＧＣＣＧＡＣＧＧＧＡＣＣＣＣＴＡＡＡＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＴＣＧＧＧＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＡＧＣＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＧＣＧＣＧＣＡＡＧＣＧＡＣＡＧＣＧＣＣＴＣＡＣＧＣＡＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＡＡＧＧＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＣＡＧＡＧＴＡＧＣＡＧＣＴＣＡＧＡＣＴＧＣＣＡＧＡＧＡＴＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＣＴＣＧＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＡＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＴＧＣＴＡＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＴＴＴＡＣＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＡＧＴＴＡＡＧＡＣＡＧＣＧＣＴＴＧＧＧＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＡＴＧＡＡＧＴＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＣＴＧＣＴＧＡＧＴＣＣＧＣＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＧＴＴＧＴＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＴＧＧＡＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＴＴＧＡＣＴＣＴＴＣＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＴＣＴＧＡＴＡＴＣＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＧＡＣＣＣＡＧＴＣＡＴＧＴＴＣＴＴＣＡＡＡＴＧＣＣＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＴＡＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＧＴＣＡＧＴＧＧＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＣＴＡＡＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＣＣＡＣＡＴＡＴＡＴＡＣＣＡＡＧＣＣＣＣＴＡＧＴＣＴＴＡＧＡＧＡＴＡＣＣＣＴＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＴＡＡＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＴＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＴＣＧＴＴＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＡＴＣＴＣＡＡＡＴＣＴＧＣＴＴＴＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＴＴＡＣＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＧＧＧＧＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣＣＣＡＴＴＣＡＧＴＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＴＴＧＧＴＧＴＡＡＡＣＣＡＴＴＣＴＴＧＧＧＡＧＧＡＣＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＡＧＣＴＧＡＴＴＡＧＴＧＴＣＴＡＡＧＧＡＡＴＧＡＴＣＣＡＡＴＡＣＴＧＴＴＧＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＴＡＣＴＴＣＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＴＡＧＡＧＡＧＴＡＴＡＣＡＧＴＣＣＴＡＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＡＴＴＴＧＴＴＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＧＡＴＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＴＡＴＴＧＴＣＴＴＴＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＴＣＣＡＡＧＧＴＡＴＴＧＡＧＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＡＡＧＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＡＴＡＡＴＴＧＡＧＡＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＡＡＧＡＴＴＧＴＡＣＴＴＴＴＡＴＣＴＴＡＡＡＡＧＧＧＴＧＧＴＡＧＴＴＴＴＣＣＣＴＡＡＡＡＴＡＣＴＴＡＴＴＡＴＧＴＡＡＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＡＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＧＡＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＡＴＧＡＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＡＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＧＴＴＴＴＡＧＧＴＣＣＴＴＴＡＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＴＡＡＧＣＡＡＣＧＧＧＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＴＧＴＡＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＡＴＡＧＡＡＡＴＴＴＡＣＴＡＴＧＴＡＡＡＴＧＣＴＴＧＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＡＧＴＧＴＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＧＧＴＧＣＴＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡＡＡＣＴＡＣＣＣＡＴＧＣＡＡＴＴＡＡＡＡＧＧＴＡＣＡＡＴＧＣＡ
配列番号８０５：ヒトＸ－ｂｏｘ結合タンパク質１アイソフォームＸＢＰ１（Ｓ）
ＭＶＶＶＡＡＡＰＮＰＡＤＧＴＰＫＶＬＬＬＳＧＱＰＡＳＡＡＧＡＰＡＧＱＡＬＰＬＭＶＰＡＱＲＧＡＳＰＥＡＡＳＧＧＬＰＱＡＲＫＲＱＲＬＴＨＬＳＰＥＥＫＡＬＲＲＫＬＫＮＲＶＡＡＱＴＡＲＤＲＫＫＡＲＭＳＥＬＥＱＱＶＶＤＬＥＥＥＮＱＫＬＬＬＥＮＱＬＬＲＥＫＴＨＧＬＶＶＥＮＱＥＬＲＱＲＬＧＭＤＡＬＶＡＥＥＥＡＥＡＫＧＮＥＶＲＰＶＡＧＳＡＥＳＡＡＧＡＧＰＶＶＴＰＰＥＨＬＰＭＤＳＧＧＩＤＳＳＤＳＥＳＤＩＬＬＧＩＬＤＮＬＤＰＶＭＦＦＫＣＰＳＰＥＰＡＳＬＥＥＬＰＥＶＹＰＥＧＰＳＳＬＰＡＳＬＳＬＳＶＧＴＳＳＡＫＬＥＡＩＮＥＬＩＲＦＤＨＩＹＴＫＰＬＶＬＥＩＰＳＥＴＥＳＱＡＮＶＶＶＫＩＥＥＡＰＬＳＰＳＥＮＤＨＰＥＦＩＶＳＶＫＥＥＰＶＥＤＤＬＶＰＥＬＧＩＳＮＬＬＳＳＳＨＣＰＫＰＳＳＣＬＬＤＡＹＳＤＣＧＹＧＧＳＬＳＰＦＳＤＭＳＳＬＬＧＶＮＨＳＷＥＤＴＦＡＮＥＬＦＰＱＬＩＳＶ
配列番号８０６：ヒトＸ－ｂｏｘ結合タンパク質１（ＸＢＰ１）デルタ４バリアント
ＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＧＣＧＧＴＧＣＧＣＧＧＴＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＡＡＣＣＣＧＧＣＣＧＡＣＧＧＧＡＣＣＣＣＴＡＡＡＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＴＣＧＧＧＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＡＧＣＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＧＣＧＣＧＣＡＡＧＣＧＡＣＡＧＣＧＣＣＴＣＡＣＧＣＡＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＡＡＧＧＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＣＡＧＡＧＴＡＧＣＡＧＣＴＣＡＧＡＣＴＧＣＣＡＧＡＧＡＴＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＣＴＣＧＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＡＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＴＧＣＴＡＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＴＴＴＡＣＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＡＧＴＴＡＡＧＡＣＡＧＣＧＣＴＴＧＧＧＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＡＡＧＴＣＴＧＡＴＡＴＣＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＧＡＣＣＣＡＧＴＣＡＴＧＴＴＣＴＴＣＡＡＡＴＧＣＣＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＴＡＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＧＴＣＡＧＴＧＧＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＣＴＡＡＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＣＣＡＣＡＴＡＴＡＴＡＣＣＡＡＧＣＣＣＣＴＡＧＴＣＴＴＡＧＡＧＡＴＡＣＣＣＴＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＴＡＡＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＴＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＴＣＧＴＴＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＡＴＣＴＣＡＡＡＴＣＴＧＣＴＴＴＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＴＴＡＣＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＧＧＧＧＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣＣＣＡＴＴＣＡＧＴＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＴＴＧＧＴＧＴＡＡＡＣＣＡＴＴＣＴＴＧＧＧＡＧＧＡＣＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＡＧＣＴＧＡＴＴＡＧＴＧＴＣＴＡＡＧＧＡＡＴＧＡＴＣＣＡＡＴＡＣＴＧＴＴＧＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＴＡＣＴＴＣＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＴＡＧＡＧＡＧＴＡＴＡＣＡＧＴＣＣＴＡＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＡＴＴＴＧＴＴＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＧＡＴＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＴＡＴＴＧＴＣＴＴＴＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＴＣＣＡＡＧＧＴＡＴＴＧＡＧＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＡＡＧＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＡＴＡＡＴＴＧＡＧＡＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＡＡＧＡＴＴＧＴＡＣＴＴＴＴＡＴＣＴＴＡＡＡＡＧＧＧＴＧＧＴＡＧＴＴＴＴＣＣＣＴＡＡＡＡＴＡＣＴＴＡＴＴＡＴＧＴＡＡＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＡＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＧＡＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＡＴＧＡＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＡＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＧＴＴＴＴＡＧＧＴＣＣＴＴＴＡＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＴＡＡＧＣＡＡＣＧＧＧＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＴＧＴＡＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＡＴＡＧＡＡＡＴＴＴＡＣＴＡＴＧＴＡＡＡＴＧＣＴＴＧＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＡＧＴＧＴＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＧＧＴＧＣＴＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡＡＡＣＴＡＣＣＣＡＴＧＣＡＡＴＴＡＡＡＡＧＧＴＡＣＡＡＴＧＣＡ
配列番号８０７：ＸＢＰ１デルタ４ ｍＲＮＡ転写物（配列番号５６２）由来のヒト予測アミノ酸配列
ＭＶＶＶＡＡＡＰＮＰＡＤＧＴＰＫＶＬＬＬＳＧＱＰＡＳＡＡＧＡＰＡＧＱＡＬＰＬＭＶＰＡＱＲＧＡＳＰＥＡＡＳＧＧＬＰＱＡＲＫＲＱＲＬＴＨＬＳＰＥＥＫＡＬＲＲＫＬＫＮＲＶＡＡＱＴＡＲＤＲＫＫＡＲＭＳＥＬＥＱＱＶＶＤＬＥＥＥＮＱＫＬＬＬＥＮＱＬＬＲＥＫＴＨＧＬＶＶＥＮＱＥＬＲＱＲＬＧＭＤＡＬＶＡＥＥＥＡＥＡＫＳＤＩＬＬＧＩＬＤＮＬＤＰＶＭＦＦＫＣＰＳＰＥＰＡＳＬＥＥＬＰＥＶＹＰＥＧＰＳＳＬＰＡＳＬＳＬＳＶＧＴＳＳＡＫＬＥＡＩＮＥＬＩＲＦＤＨＩＹＴＫＰＬＶＬＥＩＰＳＥＴＥＳＱＡＮＶＶＶＫＩＥＥＡＰＬＳＰＳＥＮＤＨＰＥＦＩＶＳＶＫＥＥＰＶＥＤＤＬＶＰＥＬＧＩＳＮＬＬＳＳＳＨＣＰＫＰＳＳＣＬＬＤＡＹＳＤＣＧＹＧＧＳＬＳＰＦＳＤＭＳＳＬＬＧＶＮＨＳＷＥＤＴＦＡＮＥＬＦＰＱＬＩＳＶ

Claims (15)

  1. 多量体ポリペプチドを組換え産生するための方法であって、
    ａ）ＸＢＰ１を発現しておりかつ前記多量体ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、
    ｂ）前記細胞または培養培地から前記多量体ポリペプチドを回収する工程と
    を含み、
    前記培養が、ＸＢＰ１バリアントＸＢＰ１Δ４の形成を誘導しているアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下で行われることを特徴とする、
    方法。
  2. ａ１）ＸＢＰ１を発現しておりかつ前記ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を含む哺乳動物細胞を、前記ＸＢＰ１バリアントＸＢＰ１Δ４の形成を誘導しているアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む培養培地中で増殖させて、第１の細胞集団を得る工程と、
    ａ２）前記第１の細胞集団のアリコートを培養培地と混合して、第２の細胞集団を得る工程であって、前記培養培地が、前記ＸＢＰ１バリアントＸＢＰ１Δ４の形成を誘導している前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを任意に含む、第２の細胞集団を得る工程と、
    ａ３）前記第２の細胞集団を培養して、第３の細胞集団を得る工程と、
    ｂ）前記第３の細胞培養の前記細胞および／または前記培養培地から前記ポリペプチドを回収する工程と
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが８～４０ヌクレオチド長であり、かつ哺乳動物ＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物に相補的な８～４０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１～２のいずれか一項に記載の方法。
  4. 前記連続ヌクレオチド配列が、ハムスターＸＢＰ１プレｍＲＮＡ転写物（配列番号１）の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに相補的であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  5. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１２８、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５８、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２９、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２９７および配列番号２９８からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記連続ヌクレオチド配列が、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ長さであることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、１つ以上の修飾ヌクレオチドまたは１つ以上の修飾ヌクレオシドを含むことを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、１つ以上の修飾ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルロ－ＲＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ、二環式ヌクレオシド類似体（ＬＮＡ）、またはそれらの任意の組合せからなる群から独立して選択される１つ以上の修飾ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの前記連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合のうちの１つ以上が修飾されていることを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド内の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％の前記ヌクレオシド間結合が修飾されていることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  11. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２５μＭ以上の最終濃度まで添加されることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記培養が、１×１０Ｅ６～２×１０Ｅ６細胞／ｍＬの開始細胞密度で行われることを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記開始細胞密度が約２×１０Ｅ６細胞／ｍＬであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞であることを特徴とする、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記多量体ポリペプチドが抗体であることを特徴とする、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
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