KR20080074231A - 이중 특이성 항체 및 이의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

이중 특이성 항체 및 이의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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알버트 콜린슨
타리크 가여
조오지 아브게리노스
리처드 딕슨
제라 케이맥칼란
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아보트 러보러터리즈
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Abstract

본 발명은 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 항원에 대한 이중 특이성을 갖는 항체를 제공한다. 항체는 예를 들면, 전체 사람 항체, 재조합 항체, 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 바람직한 항체는 IL-1α 및 IL-1β에 대한 이중 특이성을 가지며, 시험관내 및 생체내에서 IL-1α 및 IL-1β 활성을 중화시킨다. 본 발명의 항체는 전체 길이 항체 또는 이의 항원-결합 부분일 수 있다. 본 발명의 항체를 제조하는 방법 및 이를 사용하는 방법이 또한 제공된다. 본 발명의 항체, 또는 항체 일부분은 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 항원(예를 들면, IL-1α 및 IL-1β)을 검출하고, (예를 들면, IL-1α 및/또는 IL-1β 활성이 유해한 질병으로 고통받는 사람 환자에서) 상기 항원의 활성을 억제하는데 유용하다.
이중 특이성 항체, 항체 라이브러리, 인터류킨-1α, 인터류킨-1β, 하이브리도마, 중증 복합 면역결핍증

Description

이중 특이성 항체 및 이의 제조 및 사용 방법 {Dual specificity antibodies and methods of making and using}
포유동물 면역계는 전체적으로, 수천억개의 상이한 항체 특이성으로 이루어진 항체 레퍼토리를 발현하는 B 임파구를 포함한다. 특정 항원에 대한 정상적인 면역 반응은 상기 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체의 상기 레퍼토리로부터의 선택과 관련이 있으며, 면역 반응의 성공은 적어도 부분적으로는, 항체 환경내 자극성 항원을 특이적으로 인식(및 궁극적으로는 제거)하고 다른 분자들은 "무시"하는 이러한 항체들의 능력에 기초한다.
하나의 특정 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항체의 유용성은 모노클로날 항체 기술의 개발을 초래하였다. 표준 하이브리도마 기술은 현재, 관심 대상의 항원에 대한 단일 특이성을 갖는 항체의 제조를 가능하게 한다. 보다 최근에, 재조합 항체 기술, 예를 들면, 시험관내 항체 라이브러리의 스크리닝 기술이 개발되었다. 이들 기술들은 또한 관심 대상의 항원에 대한 단일 특이성을 갖는 항체의 제조를 가능하게 한다.
단일 표적 항원에 대한 특이성을 갖는 항체는 적어도 특정 환경하에서는, 원치 않는 교차-반응성 또는 다른 항원에 대한 배경 수준의 결합을 나타낸다. 그러나, 이러한 교차-반응성 또는 배경 수준의 결합은 일반적으로 예견할 수 없는 것(즉, 항체가 어떤 항원과 교차-반응할 것인지를 예측하는 것은 불가능하다)이다. 또한, 이는 전형적으로 항체의 결합 능력의 극히 일부분(예를 들면, 전체 항체 결합의 1% 이하)만을 나타내며 전형적으로 고농도 항체(예를 들면, 특이적인 항원 결합을 관찰하는데 필요한 것 보다 1000배 이상의 농도)에서만 관찰되기 때문에, 이는 일반적으로 특이적 항원 결합과는 구분된다. 단백질의 구조적으로 관련된 패밀리에 속할 수 있는 수 개의 항원들이 존재하지만, 특정 패밀리 구성원에 대한 항체 반응은 매우 특이적이다. 또한, 동일한 수용체, 수용체 성분 또는 구조적으로 관련된 수용체에 결합하는 단백질 패밀리 구성원(예를 들면, IL-1 및 TNF 패밀리의 구성원들)의 수 개의 예들이 존재하지만, 상기 패밀리의 하나의 구성원에 대해서 생성된 모노클로날 항체는 다른 패밀리 구성원들에 대해서 높은 교차 반응성을 나타내지 않는다. 다양한 패밀리 구성원에 대한 MAb의 교차 반응성의 이러한 결여에는 두 가지 이유가 존재할 수 있다. 첫번째, 표준 하이브리도마 생산에서, 표적 항원에 대한 고특이성/고친화도를 갖는 단지 몇 개의 항체만을 찾아낸 후, 수 개의 선택된 항체의 교차 반응성 또는 배경 수준의 결합을 체크한다는 것이다. 두번째, 패밀리내 단백질들이 구조적으로 관련된다 할지라도, 이들은 배제적이고, 비중복의 면역우세 에피토프를 가질 수 있다는 것이다. 따라서, 전체 길이 단백질을 사용하여 생성된 MAb는 다른 구조적으로 관련된 단백질과 교차 반응하지 않을 수 있다.
또한, 다른 종내 동일한 기능성 항원에 특이적으로 결합하는 특정 종의 항원에 대해 생성된 모노클로날 항체의 예가 있다. 예를 들면, 항-마우스 X 항체는 사람으로부터의 항원 X에 용이하게 결합할 수 있다. 이는, 이들이 동일하지는 않더라도 상당한 서열 및 구조적 유사성을 공유하기 때문이다. 그러나, 상기 종-교차 반응성 항체는 "이중 특이성" 항체를 구성하지는 않는데, 이들이 상이한 종으로부터의 동일한 항원에 대해서 특이성을 갖기 때문이다.
따라서, 예견가능한 이중 또는 다중 특이성을 갖는 모노클로날 항체, 즉 두 개 이상의 상이한 항원에 대한 진정한 특이성을 갖는 항체가 여전히 요구된다.
본 발명은 두 개 이상의 구조적으로 관련되지만 상이한 항원들에 대한 이중 특이성을 갖는 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자들의 공통적인 구조 특성을 포함하는 항원을 제공하는 단계; 항체 레퍼토리를 상기 항원에 노출시키는 단계; 및 상기 항체 레퍼토리로부터 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하여 이중 특이성 항체를 수득하는 단계를 포함한다. 임상적 환경에서, 동일한 단백질 패밀리의 수 개의 구성원들이 질환 진행의 다양한 징후에 관여할 수 있다. 따라서, 동일한 단백질 패밀리의 구성원들에 결합하는 본 발명의 이중 특이성 항체를 사용하여 단백질 패밀리의 하나 이상의 구성원들의 기능을 차단하는 것은 질환 징후를 경감시키거나 상기 질환 진행 자체를 방해하는데 유익할 수 있다. 또한, 본 발명의 이중 특이성 항체는 구조적으로 관련된 항원을 검출하고, 구조적으로 관련된 항원을 정제하며, 구조적으로 관련된 항원과 관련된 진단 분석법에서 유용하다.
바람직한 구체적인 양태에서, 항원은 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자 사이에서 동일성의 연속적인 위상학적 영역에 기초하여 설계된다. 예를 들면, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자는 단백질일 수 있으며 항원은 두 개의 단백질 사이에서 동일성의 연속적인 위상학적 영역의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있다.
또 다른 구체적인 양태에서, 항원은 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자의 공통적인 폴드(fold)의 루프를 구조적으로 모사하는데 기초하여 설계된다. 예를 들면, 항원은 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 단백질의 공통적인 폴드의 루프를 구조적으로 모사하는 사이클릭 펩타이드일 수 있다.
또 다른 구체적인 양태에서, 항원은 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자의 교호(alternating) 및/또는 중복 부분을 함께 스플라이싱하는데 기초하여 된다. 예를 들면, 항원은 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 단백질의 교호 및/또는 중복 아미노산 서열을 함께 스플라이싱시켜 제조된 하이브리드 펩타이드일 수 있다.
또 다른 구체적인 양태에서, 항원은 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자 중 하나를 포함할 수 있으며, 상기 방법은 관련된 분자 둘 모두를 특이적으로 인식하는 항체를 선택하는 것과 관련된다.
본 발명의 방법에서, 항체 레퍼토리는 생체내에서 또는 시험관내에서 관심 대상의 항원에 노출시킬 수 있다. 예를 들면, 한 가지 구체적인 양태에서, 항원에 대한 상기 레퍼토리들의 노출은 항원으로 동물을 생체내 면역화시키는 것과 관련된다. 이러한 생체내 접근법은 추가로, 동물의 임파구로부터 일단의 하이브리도마를 제조하고, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 분비하는 하이브리도마를 선택하는 것과 관련될 수 있다. 면역화되는 동물은 예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 또는 염소, 또는 전술한 동물 중 하나의 유전자이식된(transgenic) 형태, 예를 들면, 사람 면역글로불린 유전자를 유전자이식시킨 마우스일 수 있으며, 결과적으로 상기 마우스는 항원성 자극이 있는 경우 사람 항체를 제조하게 된다. 면역화시킬 수 있는 또 다른 유형의 동물은 사람 말초 혈액 단핵구 세포(hu-PBMC-SCID 키메라 마우스) 또는 림프계 세포, 또는 이의 전구 세포로 재구성된 중증 복합 면역결핍성(SCID)을 갖는 마우스, 및 치명적인 전신 방사선조사로 처리하고, 중증 복합 면역결핍성(SCID) 마우스의 골수 세포로 방사능보호시킨 후, 기능성 사람 임파구를 생착(engraftment)시킨 마우스(트라이머라 시스템(trimera system))를 포함한다. 면역화시킬 수 있는 또 다른 유형의 동물은 이의 게놈이 관심 대상의 항원(들)을 암호화하는 내인성 유전자(들)에 대해서 "녹-아웃"되어, 관심 대상의 항원(들)로 면역화되는 경우, KO 동물이 상기 항원(들)을 외 인성으로 인식하게 되는 동물(예를 들면, 마우스)이다.
또 다른 구체적인 양태에서, 항체 레퍼토리는 항원을 사용하여 재조합 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 시험관내에서 항원에 노출시킨다. 재조합 항체 라이브러리는 예를 들면, 박테리오파아지의 표면, 효모 세포의 표면, 또는 세균 세포의 표면 상에서 발현될 수 있다. 다양한 구체적인 양태에서, 재조합 항체 라이브러리는 예를 들면, scFv 라이브러리 또는 Fab 라이브러리이다. 또 다른 구체적인 양태에서, 항체 레퍼토리는 RNA-단백질 융합체로서 발현된다.
이중 특이성 항체를 제조하는 또 다른 접근법은 항원으로 동물을 생체내 면역화시켜 항원에 대해 항체 레퍼토리를 노출시킨 후, 항원으로 동물의 림프계 세포로부터 제조된 재조합 항체 라이브러리를 시험관내 스크리닝시키는 것과 같은 생체내 및 시험관내 접근법의 병용과 관련된다. 또 다른 접근법은 항원으로 동물을 생체내 면역화시켜 항원에 대해 항체 레퍼토리를 노출시킨 후, 동물의 림프계 세포로부터 제조된 재조합 항체 라이브러리를 시험관내 친화도 성숙시키는 것과 관련된다. 또 다른 접근법은 항원으로 동물을 생체내 면역화시켜 항원에 대해 항체 레퍼토리를 노출시킨 후, 관심 대상의 항체를 분비하는 단일 항체 생산 세포를 선택하고 이러한 선택된 세포로부터 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA를 (예를 들면, PCR에 의해) 회수하며, 시험관내에서 포유동물 숙주 세포내에서 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 발현시켜(선택된 임파구 항체 방법, SLAM으로 인용됨), 선택 항체 유전자 서열의 추가의 선택 및 조작을 가능하게 하는 것과 관련된다. 또한, 추가로, 모노클로날 항체는 포유동물에서 중쇄 및 경쇄 항체 유전자를 발현시키고 필수적인 결합 특 이성을 갖는 항체를 분비하는 포유동물 세포를 선택함으로써 발현 클로닝으로 선택할 수 있다.
본 발명의 방법은 전체 사람 항체, 키메라 항체 및 CDR-이식된 항체, 및 이의 항원-결합 부분을 포함하는, 다양한 상이한 유형의 이중 특이성 항체를 제조하는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 방법에 따라서 제조된 이중 특이성 항체가 또한 제공된다. 본 발명의 바람직한 이중 특이성 항체는 인터류킨-1α 및 인터류킨-1β에 특이적으로 결합하는 것들이다. 상기 이중 특이성 항체는 IL-1α 또는 IL-1β를 이중-특이성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분과 접촉시켜, IL-1α 또는 IL-1β를 검출함을 포함하여, IL-1α 또는 IL-1β를 검출하는 방법에서 사용할 수 있다. 중화 이중 특이성 항체는 또한, IL-1α 또는 IL-1β를 이중-특이성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분과 접촉시켜, IL-1α 또는 IL-1β의 활성을 억제시킴을 포함하여, IL-1α 또는 IL-1β 활성을 억제하는 방법에서 사용할 수 있다. 상기 이중 특이성 항체는 또한, 인터류킨-1-관련된 질병으로 고통받는 환자에게 이중-특이성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 투여함을 포함하여, 인터류킨-1-관련된 질병을 치료하는 방법에서 사용할 수 있다.
또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명은, a) 제1 항원에 노출시켜 생성된 항체 레퍼토리로부터 재조합 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 A를 수득하는 단계; b) 제1 항원에 노출시켜 생성된 항체 레퍼토리로부터 재조합 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 B를 수득하는 단계; c) 제2 항원에 노출시켜 생성된 항체 레퍼토리로부터 재조합 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 C를 수 득하는 단계; d) 제2 항원에 노출시켜 생성된 항체 레퍼토리로부터 재조합 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 D를 수득하는 단계; 및 e) 재조합 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 A를 재조합 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 D와 혼합하여 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 X를 수득하고/하거나 재조합 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 C를 재조합 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 B와 혼합하여 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 Y를 수득하는 단계를 수행함으로써, 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 바로 위에서 전술한 방법은, 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 X를 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 Y와 혼합하여 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 Z를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
추가의 구체적인 양태에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 X, Y 및 Z에 대한 것이다.
또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 방법은 라이브러리 X, Y 및/또는 Z로부터 제1 및 제2 항원 모두에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 선택함으로써 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 확인하는 것이 가능하다.
추가의 구체적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법 중 하나로 제조되고/되거나 선택된 이중 특이적 항체에 관한 것이다.
또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명은 또한, 라이브러리 X, Y 및 Z의 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 각각의 구성원, 및 이중 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 전술한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터, 및 전술한 벡터로 형질감염된 숙주 세포에 관한 것이다.
바람직한 구체적인 양태에서, 제1 및 제2 항원은 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되며, 단, 제1 및 제2 항원은 동일하지는 않다. 추가의 구체적인 양태에서, 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드는 분비된 단백질 또는 표면 수용체이며, 분비된 단백질은 IFN, TNF, 인터류킨, IP-10, PF4, GRO, 9E3, EMAP-II, CSF, FGF 및 PDGF로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 구체적인 양태에서, 제1 항원은 IL-1α이고 제2 항원은 IL-1β이다.
본 발명은 이중 특이성 항체, 즉 두 개 이상의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자에 대한 특이성을 갖는 항체 생산을 위한 항원의 설계 및 사용, 뿐만 아니라 상기 이중 특이성 항체의 선택, 제조 및 사용에 관한 것이다. 본 발명의 항원의 구조적 관련성은 전체 항원(예를 들면, 단백질)에 대해서 또는 특정 구조적으로 관련된 영역에 대해서만 존재할 수 있다. 본 발명은 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자에 특이적으로 결합하는 이중-특이성 항체를 수득하는 방법을 제공하며, 이때, 상기 방법은 두 개 이상의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자의 공통적인 구조 특성을 포함하는 항원을 제공하는 단계, 상기 항원에 항체 레퍼토리를 노출시키는 단계, 및 상기 항체 레퍼토리로부터 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하여 이중 특이성 항체를 수득하는 단계와 관련된다.
본 발명은 본원에서 두 개의 상이하지만 관련된 항원의 인식 측면에서 기술되지만, 용어 "이중 특이성 항체"는 세 개, 네 개, 다섯 개 이상의 구조적으로 관련되지만 상이한 항원을 인식하는 항체 같은 두 개 이상의 상이하지만 관련된 항원을 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 것으로 의도된다는 것을 주지해야만 한다. 추가로, 용어 "상이하지만 구조적으로 관련된 항원"은, 전체 구조가 관련된 항원(예를 들면, 단백질) 뿐만 아니라 하나 이상의 구조적으로 관련된 영역을 공유하지만 그밖에는 비관련된 항원(예를 들면, 단백질)을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, "상이하지만 구조적으로 관련된" 항원은 예를 들면, 공통적인 전체 구조를 갖는 동일 단백질 패밀리의 구성원인 두 개의 단백질일 수 있거나, 예를 들면, 전체 구조가 유사하지 않지만(비관련되지만) 구조적으로 관련된 도메인을 각각 함유하는 두 개의 단백질일 수 있다.
하기 서브섹션에서 추가로 상세히 논의되는 바와 같이, 다양한 유형의 항원을 사용하여 본 발명의 항체를 유도할 수 있으며, 항체를 제조하는 다양한 방법을 사용하여 본 발명의 이중 특이성 항체를 수득할 수 있다.
I. 이중 특이성 항원
본 발명의 이중 특이성 항체를 제조하기 위해서, 항체는 이중 특이성 항체를 유도할 수 있는 항원에 대해서 생성된다. 상기 항원은 일반적으로 본원에서 이중 특이성 항원으로 인용된다. 다양한 상이한 유형의 이중 특이성 항원이 본 발명에서 사용될 수 있으며 다양한 유형의 이중 특이성 항원의 설계는 하기 서브섹션에서 추가로 기술된다.
A. 연속적인 위상학적 영역
한 가지 구체적인 양태에서, 본 발명의 이중 특이성 항원은 이중 특이성 항체가 생성되는, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자 사이에서 동일성 및/또는 유사성의 연속적인 위상학적 영역을 포함한다. 바람직하게는, 항원은 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자 사이에서 동일성 및/또는 유사성의 최대의(예를 들면, 최장의) 연속적인 위상학적 영역을 포함한다. 바람직하게는, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자는 단백질이며, 이중 특이성 항원은 두 개의 단백질 사이에서 동일성 및/또는 유사성의 최대의(예를 들면, 최장의) 연속적인 위상학적 영역에 상응하는 선형 펩타이드를 포함한다. 선택되는 동일성/유사성의 적합한 영역은 바람직하게는 수용체 또는 리간드 결합 영역이지만, 동일성/유사성의 다른 영역이 또한 사용될 수 있다.
두 개의 분자(예를 들면, 단백질) 사이에서 동일성의 연속적인 위상학적 영역을 측정하기 위해서, 두 개의 분자(예를 들면, 단백질)를 비교(예를 들면, 상동 성 모델링, 구조적 정보 또는 배열)하고, 동일한 또는 유사한 영역을 확인한다. 단백질의 경우, 배열 알고리듬을 사용하여 최적 배열을 생성시키고 두 개의 단백질 사이에서 동일성 및/또는 유사성의 최대의(예를 들면, 최장의) 연속적인 위상학적 영역을 확인할 수 있다. 두 개의 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리듬의 바람직한, 비제한적인 예는 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77]에서와 같이 변형된, 문헌[Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68]의 알고리듬이다. 상기 알고리듬은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 도입된다. 비교를 위한 갭화된 배열을 수득하기 위해서, 갭화된(Gapped) BLAST를 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25(17): 3389-3402]에 기술된 바와 같이 사용할 수 있다. BLAST 및 갭화된 BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들면, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 변수를 사용할 수 있다. 인터넷 사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 참조한다. 사용할 수 있는 대안적인 수학적 알고리듬은 문헌[Myers and Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17]에 기술된 ALIGN 프로그램에서 사용되는 것이다.
동일성/유사성의 적합한 영역이 선택되는 경우, 상기 영역에 상응하는 이중 특이성 항원은 화학적으로 합성할 수 있다. 예를 들면, 펩타이드 항원의 경우, 펩타이드는 표준 펩타이드 합성 방법에 의해 합성할 수 있다. 한 가지 구체적인 양태에서, 펩타이드 항원은 L-아미노산을 포함한다. 또 다른 구체적인 양태에서, 펩타이드 항원은 부분적으로 또는 전체적으로 D-아미노산으로 이루어질 수 있다. 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 단백질 사이에서 동일성 및/또는 유사성의 연속적인 위상학적 영역에 기초하는 이중 특이성 항원의 설계 예는 실시예 1에서 상세히 기술된다.
B. 구조적 루프를 모사하는 사이클릭 펩타이드
또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 이중 특이성 항원은 이중 특이성 항체가 생성되는, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자(예를 들면, 단백질)의 공통적인 폴드(fold)의 주요 루프를 구조적으로 모사하는 사이클릭 분자, 바람직하게는 사이클릭 펩타이드를 포함한다. 이러한 유형의 항원을 제조하기 위해서, 두 개의 관련된 분자의 구조를 비교하고 두 분자내에서 발견된 공통적인 폴드의 루프를 확인한다. 표준 분자 모델링 및 결정학적 분석을 사용하여 상기 루프 및 공통 폴드의 확인을 보조할 수 있다. 동일한 및 유사한 영역(예를 들면, 두 개의 단백질 사이의 아미노산 서열)을 확인하고 컨센서스 서열을 유사하지만 동일하지는 않은 영역에 대해서 설계할 수 있다. 선형 분자, 예를 들면, 선형 펩타이드는 이들의 유사하고 동일한 영역에 기초하여 설계하며, 이러한 선형 분자는 공지된 화학적 수단으로 폐환시켜 주요 루프를 모사하는 항원을 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 프롤린 및 글리신을 선형 펩타이드의 말단에 부가하여 펩타이드의 폐환화를 가능하게 할 수 있다. 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 단백질에 의해 공유되는 구조적 루프를 모사하는 사이클릭 펩타이드에 기초한 이중 특이성 항원의 설계 예는 실시예 2에서 상세히 기술된다.
C. 하이브리드 분자
또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 이중 특이성 항원은 이중 특이성 항체가 생성되는, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자(예를 들면, 단백질)의 교호 및/또는 중복 영역을 포함하는 하이브리드 분자, 바람직하게는 하이브리드 펩타이드를 포함한다. 이러한 유형의 항원을 제조하기 위해서, 두 개의 분자의 구조를 비교하고, 두 개의 분자 사이에서 중복 영역(즉, 동일성 영역) 뿐만 아니라 비동일성 영역을 확인한다. 바람직하게는, 두 개의 분자 각각으로부터의 교호 영역(예를 들면, 아미노산 서열) 뿐만 아니라 두 분자 모두에서 공통적인 중복 영역을 포함하는 하이브리드 분자(예를 들면, 두 개의 관련된 분자가 단백질인 경우, 하이브리드 펩타이드)를 제조한다. 도식적으로, 상기 하이브리드 분자는 X-Y-Z(이때, Y는 두 개의 관련된 분자 사이에서 동일한 또는 매우 유사한 영역(즉, 중복 영역)을 나타내고, X는 관련된 분자 중 하나로부터의 영역을 나타내며, Z는 관련된 분자의 다른 하나로부터의 영역을 나타낸다)로서 기술될 수 있다. 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 단백질의 서열들로 이루어진 하이브리드 펩타이드에 기초한 이중 특이성 항원의 설계 예는 실시예 3에서 상세히 기술된다.
또 다른 유형의 하이브리드 분자는 펩타이드가 전체 길이 단백질("표적" 단백질로 지칭됨)내로 도입되는 분자이다. 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 단백질의 기능성 영역, 예를 들면, 수용체 상호작용 영역을 나타내는 펩타이드를 선택한다. 상기 펩타이드는 본원에서 기능성 펩타이드로 지칭된다. 이후, 관련된 단백질 중 하나로부터의 기능성 펩타이드를 다른 관련된 단백질 또는 선택적으로, 비관련된 단백질의 전체 단백질 내로 도입시킨다. 예를 들면, IL-1α의 수용체 상호작용 영역에 상응하는 IL-1α의 펩타이드를 확인하고 IL-1α의 이러한 기능성 펩타이드를 전체 길이 IL-1β 단백질내로 도입하여 하이브리드 IL-1α/IL-1β 분자를 생성시킨다. 유사하게, IL-1β의 수용체 상호작용 영역에 상응하는 IL-1β의 펩타이드를 확인하고 IL-1β의 이러한 기능성 펩타이드를 전체 길이 IL-1α 단백질내로 도입하여 하이브리드 IL-1α/IL-1β 분자를 생성시킨다. 기능성 펩타이드의 관련된 전체 길이 단백질내로의 이러한 도입은 양 말단에서 기능성 펩타이드를 도입하여 기능성 펩타이드의 폴드-구조를 유지하게 한다.
IL-1α/IL-1β 하이브리드의 경우, 기능성 펩타이드는 바람직하게는, IL-1α및 IL-1β의 공통적인 폴드 구조를 나타내는 표적 영역내로 삽입된다(천연 아미노산을 대체한다). 상기 영역은 단백질의 전체 길이 상에서 확인될 수 있다(예를 들면, N-말단 영역에서, 단백질의 중간 영역에서, C 말단 영역에서). 추가로, 공통적인 IL-1α/IL-1β폴드 구조를 나타내는 기능성 펩타이드는 또한, 알부민 또는 특정 다른 천연 단백질 같은 무관한 단백질내로 삽입시킬 수 있다. 이러한 예에서, 펩타이드에 대한 바람직한 삽입 부위는 펩타이드가 목적하는 폴드 구조를 유지하게 하는 영역이다. 따라서, 삽입 부위는 단백질의 N-말단, 중간, C-말단 중 하나일 수 있다. 임의의 천연 표적 단백질내 펩타이드의 위치는 유도된 천연 단백질에 의해 펩타이드 상에 위치된 구조적 제한을 모사하도록 선택된다. 기능성 펩타이드는 표적 단백질에 단순히 삽입되어 기능성 펩타이드의 아미노산이 표적 단백질에 부가 될 수 있는 반면, 바람직하게는 기능성 펩타이드의 아미노산은 이를 삽입시키는 표적 단백질의 일부를 대체한다.
비제한적인 예로서, 하이브리드 분자는 IL-1α및 IL-1β에 대한 이중 특이성 항체를 생산하기 위한 이중 특이성 항원으로 사용하기 위해서 작제되며, 이때, IL-1α또는 IL-1β중 하나의 특정 구조적 요소에 상응하는 기능성 펩타이드는 등가의 구조적 위치내에서 전체 길이 IL-1β또는 IL-1α내로 도입된다. 선택된 하이브리드 분자는 IL-1β의 잔기 160 내지 176번을 IL-1α의 잔기 168 내지 184번으로 대체한다. 수득되는 분자는 하기 아미노산 서열을 가지며, 이때 치환된 IL-1α 서열(잔기 168 내지 184번)은 밑줄 표시한다:
APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFS MGAYKSSKDDAKITVIL GLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS (서열 번호 4).
상기 분자는 공개적으로 이용가능한 IL-1α및 IL-1βcDNA 서열을 사용한 표준 분자생물학 기술(예를 들면, 클로닝, 폴리머라제 연쇄 반응) 및 재조합 단백질 발현 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 하이브리드 cDNA를 제조하고, 적합한 발현 벡터내로 도입할 수 있으며, 폴리펩타이드는 적합한 숙주 세포내로 발현 벡터를 도입시킴으로써 발현시킬 수 있다.
D. 소수성 플롯에 기초한 펩타이드
또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 이중 특이성 항원은 고도로 항원성인 것으로 예견되는 펩타이드를 선택하기 위한 소수성 플롯에 기초하여 선택된다. 예를 들면, 펩타이드의 항원 지수는 문헌[Jameson and Wolf, CABIOS, 4(1), 181-186 (1988)]에 기술된 바와 같은 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 계산할 수 있다. 항체 결합을 위한 관심 대상 영역을 선택하여 항원성의 가능성을 최대화시킬 수 있다.
E. 항원-형질감염된 세포를 사용한 면역화
또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 이중 특이성 항체는 항원-형질감염된 세포(즉, 본 발명의 이중 특이성 항원이 항원-형질감염된 세포일 수 있다)를 사용한 면역화에 의해 제조된다. 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 항원 또는 이의 하이브리드 분자를 안정하게 발현하는 세포주를 생성시킬 수 있다. 예를 들면, IL-1α또는 IL-1β, 또는 IL-1α/IL-1β 하이브리드 분자(예를 들면, 서열 번호 4)를 안정하게 발현하는 세포주를 생성시킬 수 있다. 관심 대상의 분자를 세포로부터 분비시킬 수 있거나(가용성 단백질의 경우), 세포 표면 상에서 발현시킬 수 있다(수용체, 효소의 경우). 숙주 세포에 의한 항원의 발현을 가능하게 하는 숙주 세포내로의 유전자 전달은 형질감염법, 전기천공법, 세포 융합법, 리포펙션법(lipofection), 입자 충격법(particle bombardment), 미세주입법 또는 바이러스 감염을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 수 많은 통상적인 방법으로 달성할 수 있다. 이후, 관심 대상의 항원을 발현하는 세포주는 항체 생산을 위해서 관심 대상의 동물에게 하나 이상의 다양한 경로(복막내, 경피, 근육내 등)를 통해서 이식될 수 있다. 이후, 상기 세포는 관심 대상의 항원의 서방성 공급원으로서 작용한 다. 바람직하게는, 상기 세포는 전체 길이 단백질을 발현한다. 그러나, 항원성 단편이 또한 발현될 수 있다. 가용성 단백질의 경우, 상기 단백질은 바람직하게는 세포에 의해서 분비된다. 두 개의 밀접하게 관련된 수용체의 세포외 도메인에 대한 이중 특이성 항체를 생산하기 위해서, 상기 수용체들을 바람직하게는 세포 표면 상에서 발현시킨다.
F. 구조적으로 관련된 분자 중 하나를 사용한 면역화
또 다른 구체적인 양태에서, 이중 특이성 항원은 단순히, 이중 특이성 항체가 생성되는, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자들 중 하나일 수 있다. 두 개의 관련된 분자 중 하나를 면역화제로 사용하고 수득된 항체 레퍼토리를 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자 둘 모두에 결합하고, 보다 바람직하게는 이를 중화시키는 항체에 대하여 스크리닝한다. 예를 들면, IL-1α또는 IL-1β를 사용하여 면역화시킨 후, α/β 결합제에 대해, 보다 바람직하게는 중화제에 대해서 스크리닝할 수 있다. 상기 구체적인 양태에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역화하다"는 생체내 또는 시험관내에서 IL-1α또는 IL-1β 같은 항원에 항체 레퍼토리를 노출시키는 것을 포괄적으로 포함하는 것을 의미한다. 따라서, 상기 구체적인 양태는 IL-1α또는 IL-1β로 동물을 면역화시키고, 수득되는 항체들을 IL-1α 및 IL-1β 모두에 결합하는 항체를 선택하기 위해서 스크리닝하는 것을 포함할 뿐만 아니라, IL-1α 또는 IL-1β중 하나를 사용하여 시험관내에서 재조합 항체 라이브러리를 스크리닝한 후 IL-1α및 IL-1β 모두에 결합하는 재조합 항체를 선택하는 것을 포함한다.
II . 이중 특이성 항체의 제조 방법
본 발명의 이중 특이성 항체를 제조하기 위해서, 항체 레퍼토리(생체내 또는시험관내에서)를 이전 부분 I에서 기술된 바와 같이, 이중 특이성 항원에 노출시키고 적합한 이중 특이성 항체를 레퍼토리로부터 선택한다. 항원에 대한 항체 인식의 두 가지 요소는 구조적 인식 및 특정 분자 상호작용에 기초하는 친화도 성숙이다. 천연 면역 반응 동안, 구조적 모티프를 인식(예를 들면, 특정 패턴 인식 수용체에 의한 항원의 인식)하는 낮은 친화도 항체는 용이하게 생성되며, 천연 면역 반응의 초기에, 수 개의 클론에 대한 친화도를 증가시키기 위한 체세포 돌연변이가 뒤따른다. 다양한 생체내 및 시험관내 과정이 이러한 천연 현상을 모사하기 위해서 개발되어져 왔다. 낮은 친화도 이중 특이성 항체는 본원에 기술된 생체내 및 시험관내 방법 중 하나에 의해서 생성될 수 있으며, 보다 높은 친화도의 이중 특이성 MAb는 본원에 기술된 체세포 돌연변이유발 방법으로 제조할 수 있다. 또한, 높은 친화도의 이중 특이성 MAb를 최적화하기 위해서, 낮은 친화도 MAb와 목적하는 항원의 공-결정 구조를 제조할 수 있다. 수득된 구조적 정보는 본원에 기술된 바와 같이, 특정 분자 상호작용을 증강시키기 위하여 MAb의 특정 접촉 잔기를 변형(돌연변이)시킴으로써 추가의 친화도 증강을 유도할 수 있다.
생체내 접근법, 시험관내 접근법 또는 이 둘의 배합 방법을 사용한 이중 특이성 항체의 제조 방법은 하기 부분 I에서 추가로 상세히 기술된다.
A. 생체내 접근법
항체를 제조하기 위한 표준 생체내 접근법은 적합한 동물 피험체를 항원으로 면역화시켜 생체내 항체 레퍼토리를 항원에 노출시킨 후, 동물로부터 관심 대상의 항체 또는 항체들을 회수하는 것이다. 상기 접근법은 이중 특이성 항원을 사용한 이중 특이성 항체의 제조 및 관심 대상의 두 개의 구조적으로 관련된 분자를 특이적으로 인식하는 항체의 선택에 적용시킬 수 있다. 이중 특이성 항체는 적합한 피험체(예를 들면, 토끼, 염소, 마우스 또는 다른 포유동물, 및 상기 포유동물의 유전자이식된 형태 및 녹아웃 형태를 포함)를 이중 특이성 항원의 면역원성 제제로 면역화시킴으로써 제조할 수 있다. 적합한 면역원성 제제는 예를 들면, 화학적으로 합성되거나 재조합적으로 발현된 이중 특이성 항원을 함유할 수 있다. 상기 제제는 프로인트(Freund) 완전 또는 불완전 애주번트, 또는 유사한 면역자극성 화합물 같은 애주번트를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 항체를 생성하기 위해서 사용하는 경우, 특히 생체내 면역화에 의해서 항체를 생성하는 경우, 본 발명의 이중 특이성 항원은 단독으로 사용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 운반체 단백질과의 접합체로서 사용될 수 있다. 항체 반응을 증강시키기 위한 상기 접근법은 당해 분야에 잘 공지되어져 있다. 이중 특이성 항원이 접합될 수 있는 적합한 운반체 단백질의 예는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 알부민을 포함한다.
항체 생산 세포는 피험체로부터 수득하여 문헌[Kohler and Milstein (1975, Nature 256: 495-497), 또한 참조: Brown et al. (1981) J. Immunol 127: 539-46; Brown et al. (1980) J Biol Chem 255: 4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76: 2927-31; and Yeh et al. (1982) Int J. Cancer 29: 269-75]에 최초로 기술된 하이브리도마 기술 같은 표준 기술로 모노클로날 항체를 제조하는데 사용할 수 있다. 모노클로날 항체 하이브리도마를 생산하는 기술은 잘 공지되어져 있다[일반적으로 참조: R.H. Kenneth, Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E.A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54: 387-402; M.L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet., 3: 231-36]. 간략하면, 불멸 세포주(전형적으로는 골수종)를 상기 기술된 바와 같은 이중 특이성 면역원으로 면역화시킨 포유동물로부터의 임파구(전형적으로 비장세포 또는 림프절 세포 또는 말초 혈액 임파구)에 융합시키고, 수득된 하이브리도마 세포의 배양 상등액을 스크리닝하여 관심 대상의 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자에 대한 이중 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 확인한다. 임파구 및 불멸화된 세포주를 융합시키는데 사용되는 수 많은 잘 공지된 프로토콜 중 하나를 이중 특이성 모노클로날 항체를 생산하는데 적용시킬 수 있다[예를 들면, 참조: G. Galfre et al. (1977) Nature 266: 550-52; Gefter et al. Somatic Cell Genet., 상기 인용됨; Lerner, Yale J. Biol. Med., 상기 인용됨; Kenneth, Monoclonal Antibodies, 상기 인용됨]. 또한, 통상적인 숙련자는 또한 유용할 수 있는 상기 방법들의 수 많은 변형들이 존재한다는 것을 이해할 것이다. 전형적으로, 불멸 세포주(예를 들면, 골수종 세포주)를 임파구와 동일한 포유동물 종으로부터 유도한다. 예를 들면, 쥐의 하이브리도마는 본 발명의 면역원성 제제로 면역화시킨 마우스로부터의 임파구를 불멸화된 마우스 세포주와 융합시켜 제조할 수 있다. 바람직한 불멸화 세포주는 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 배양 배지("HAT 배지")에 감수성인 마우스 골수종 세포주이다. 수 많은 골수종 세포주, 예를 들면, P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 또는 Sp2/O-Ag14 골수종 세포주 중 하나를 표준 기술에 따라서 융합 상대로 사용할 수 있다. 이러한 골수종 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD)로부터 이용가능하다. 전형적으로, HAT-감수성 마우스 골수종 세포를 폴리에틸렌 글리콜("PEG")을 사용하여 마우스 비장 세포에 융합시킨다. 이후, 융합으로부터 수득되는 하이브리도마 세포는 융합되지 않고 비생산적으로 융합된 골수종 세포를 사멸시키는(비융합된 비장 세포는 이들이 형질전환되지 않았기 때문에 수 일내에 사멸한다) HAT 배지를 사용하여 선택한다. 관심 대상의 두 개의 구조적으로 관련된 분자를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 예를 들면, 표준 ELISA 분석법을 사용하여 상기 항체에 대해여 하이브리도마 배양 상등액을 스크리닝하여, 두 개의 관련된 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 선택함으로써 확인한다.
목적하는 항체 유형에 따라서, 다양한 동물 숙주를 생체내 면역화에 사용할 수 있다. 관심 대상의 항원(들)의 내인성 형태(version)를 스스로 발현하는 숙주를 사용할 수 있거나, 대안으로, 관심 대상의 항원(들)의 내인성 형태에 결함이 생긴 숙주를 사용할 수 있다. 예를 들면, 상응하는 내인성 유전자에서 상동성 재조합을 통해 특정 내인성 단백질에 대해 결함성인 마우스(즉, "녹아웃" 마우스)는 이 를 사용하여 면역화시키는 경우 상기 단백질에 대해서 체액성 반응을 나타내며 따라서, 상기 단백질에 대한 고친화도 모노클로날 항체의 생산에 사용할 수 있는 것으로 나타났다[예를 들면, 참조: Roes, J. et al. (1995) J. Immunol. Methods 183: 231-237; Lunn, M.P. et al. (2000) J. Neurochem. 75: 404-412].
비-사람 항체(예를 들면, 사람 이중 특이성 항원에 대한)의 제조를 위해서, 다양한 비-사람 포유동물이 항체 생산을 위한 숙주로서 적합하며, 이는 마우스, 랫트, 토끼 및 염소(및 이의 녹아웃 형태)를 포함하지만 이에 제한되지는 않으며, 마우스가 하이브리도마 생산에 바람직하다. 추가로, 사람 이중 특이성 항원에 대한 전체 사람 항체의 생산을 위해서, 사람 항체 레퍼토리를 발현하는 숙주 비-사람 동물을 사용할 수 있다. 상기 비-사람 동물은 사람 면역글로불린 이식 유전자를 갖는 유전자이식된 동물(예를 들면, 마우스), hu-PBMC-SCID 키메라 마우스, 및 사람/마우스 방사선조사 키메라를 포함하며, 이들 각각은 하기에 추가로 논의된다.
따라서, 한 가지 구체적인 양태에서, 이중 특이성 항원으로 면역화시킨 동물은 사람 면역글로불린 유전자로 이식되어 비-사람 포유동물(예를 들면, 마우스)이 항원성 자극시 사람 항체를 생산하는 비-사람 포유동물, 바람직하게는 마우스이다. 상기 동물에서, 전형적으로, 사람 배주 형태의 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 이식 유전자가 유전자조작된 동물내로 도입되어, 이의 내인성 중쇄 및 경쇄 좌위가 불활성화된다. 상기 동물에 대한 항원성 자극시(예를 들면, 사람 항원을 사용한), 사람 면역글로불린 서열로부터 유도된 항체(즉, 사람 항체)가 생산되며, 사람 모노클로날 항체가 표준 하이브리도마 기술에 의해서 상기 동물의 임파구로부터 제조될 수 있다. 사람 면역글로불린 유전자이식된 마우스 및 사람 항체의 생산에서의 이의 사용에 대한 추가의 기술은 예를 들면, 문헌[미국 특허 제5,939,598호, PCT 공개공보 WO 제96/33735호, PCT 공개공보 WO 제96/34096호, PCT 공개공보 WO 제98/24893호 및 PCT 공개공보 WO 제99/53049호(Abgenix Inc.에 허여됨), 및 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호, 제5,770,429호, 제5,814,318호, 제5,877,397호, 및 PCT 공개공보 WO 제99/45962호(Genpharm Inc.에 허여됨); 또한 문헌 참조: MacQuitty, J.J. and Kay, R.M. (1992) Sciences 257: 1188; Taylor, L.D. et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 6287-6295; Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368: 856-859; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Int. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding, F.A. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764: 536-546; Fishwild, D.M. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; Mendez, M.J. et al. (1997) Nature Genetics 15: 146-156; Green, L.L. and Jakobovits, A. (1998) J. Exp. Med. 188: 483-495; Green, L.L. (1999) J. Immunol. Methods 231: 11-23; Yang, X.D. et al. (1999) J. Leukoc. Biol. 66: 401-410; Galo, M.L. et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30: 534-540]을 참조한다.
또 다른 구체적인 양태에서, 이중 특이성 항원으로 면역화시킨 동물은 사람 말초 혈액 단핵구 세포 또는 림프계 세포 또는 이의 전구 세포로 재구성한 중증 복합 면역결핍증(SCID)을 갖는 마우스이다. hu-PBMC-SCID 키메라 마우스로 명명된 상기 마우스는 항원성 자극시 사람 면역글로불린 반응을 생성하는 것으로 입증되었 다. 상기 마우스 및 항체 생산에서의 이의 사용에 대한 추가의 기술에 대해서는 문헌[예를 들면, 참조: Leader, K.A. et al. (1992) Immunology 76: 229-234; Bombil, F. et al. (1996) Immunobiol. 195: 360-375; Murphy, W.J. et a. (1996) Semin. Immunol. 8: 233-241; Herz, U. et al. (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113: 150-152; Albert, S.E. et al. (1997) J. Immunol. 159: 1393-1403; Nguyen, H. et al. (1997) Microbiol. Immunol. 41: 901-907; Arai, K. et al. (1998) J. Immunol. Methods 217: 79-85; Yoshinari, K. and Arai, K. (1998) Hybridoma 17: 41-45; Hutchins, W.A. et al. (1999) Hybridoma 18: 121-129; Murphy, W.J. et al. (1999) Clin. Immunol. 90: 22-27; Smithson, S.L. et al. (1999) Mol. Immunol. 36: 113-124; Chamat, S. et al. (1999) J. Infect. Diseases 180: 268-277; and Heard, C. et al. (1999) Molec. Med. 5: 35-45]을 참조한다.
또 다른 구체적인 양태에서, 이중 특이성 항원으로 면역화시킨 동물은 치명적인 전신 방사선조사로 처리한 후 중증 복합 면역결핍증(SCID) 마우스의 골수 세포로 방사선보호시킨 후, 기능성 사람 임파구를 생착시킨 마우스이다. 트라이머라 시스템으로 명명된 이러한 유형의 키메라를 사용하여, 마우스를 관심 대상의 항원으로 면역화시킨 후 표준 하이브리도마 기술을 사용하여 모노클로날 항체를 제조함으로써, 사람 모노클로날 항체를 생산해 왔다. 상기 마우스 및 항체 생산에서 이의 사용에 대한 추가의 기술을 위해서는, 예를 들면, 문헌[Eren, R. et al. (1998) Immunology 93: 154-161; Reisner, Y and Dagan, S. (1998) Trends Biotechnol. 16: 242-246; Ilan, E. et al. (1999) Hepatology 29: 553-562; and Bocher, W.O. et al. (1999) Immunology 96: 634-641]을 참조한다.
B. 시험관내 접근법
생체내 면역화 및 선택에 의해 이중 특이성 항체를 제조하는 대안으로, 본 발명의 이중 특이성 항체는 이중 특이성 항원으로 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리(예를 들면, 항체 파아지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝하여 관심 대상의 두 개의 구조적으로 관련되지만 상이한 분자에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 라이브러리 구성원을 분리함으로써 동정하고 분리할 수 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 키트는 시판중이다(예를 들면, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; Stratagene SurfZAPTM Phage Display Kit, Catalog No. 240612). 다양한 구체적인 양태에서, 파아지 디스플레이 라이브러리는 scFv 라이브러리 또는 Fab 라이브러리이다. 재조합 항체 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파아지 디스플레이 기술은 당해 분야에 광범위하게 기술되어져 있다. 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는데 특히 유용한 방법 및 화합물의 예는 예를 들면, 문헌[McCafferty et al., 국제공개공보 WO 제92/01047호, 미국 특허 제5,969,108호 및 EP 제589,877호(특히, scFv의 디스플레이에 대해서 기술함); Ladner et al., 미국 특허 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,571,698호, 제5,837,500호 및 EP 제436,597호(예를 들면, pIII 융합을 기술함); Doweret al., 국제공개공보 WO 제91/17271호, 미국 특허 제5,427,908호, 미국 특허 제5,580,717호 및 EP 제527,839호(특히, Fab의 디스플레이에 대해서 기술함); Winter et al., 국제공개공보 WO 제92/20791호 및 EP 제368,684호(특히, 면역글로불린 가변 도메인 서열의 클로닝을 기술함); Griffiths et al., 미국 특허 제5,885,793호 및 EP 제589,877호(특히, 재조합 라이브러리를 사용한 사람 항원에 대한 사람 항체의 분리를 기술함); Garrard et al., 국제공개공보 WO 제92/09690호(특히, 파아지 발현 기술을 기술함); Knappik et al., 국제공개공보 WO 제97/08320호(사람 재조합 항체 라이브러리 Hucal을 기술함); Salfeld et al., 국제공개공보 WO 제97/29131호(사람 항원(사람 종양 괴사 인자 알파)에 대한 재조합 사람 항체의 제조 뿐만 아니라 재조합 항체의 시험관내 친화도 성숙을 기술함); 및 Salfeld et al., 미국 가출원 제60/126,603호(또한, 사람 항원(사람 인터류킨-12)에 대한 재조합 사람 항체의 제조 뿐만 아니라 재조합 항체의 시험관내 친화도 성숙을 기술함]에서 확인할 수 있다.
재조합 항체 라이브러리 스크리닝에 대한 다른 기술은 문헌[Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982; McCafferty et al. Nature (1990) 348: 552-554; and Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol. 296: 57-86] 같은 과학 간행물에서 확인할 수 있다.
박테리오파아지 디스플레이 시스템의 사용에 대한 대안으로, 재조합 항체 라이브러리를 효모 세포 또는 세균 세포의 표면 상에서 발현시킬 수 있다. 효모 세포의 표면 상에서 발현된 라이브러리의 제조 및 스크리닝 방법은 추가로 문헌[PCT 공개공보 WO 제99/36569호]에 기술되어져 있다. 세균 세포 표면 상에서 발현된 라이브러리의 제조 및 스크리닝 방법은 문헌[PCT 공개공보 WO 제98/49286호]에 추가로 기술되어져 있다.
일단, 관심 대상의 항체가 조합 라이브러리로부터 확인되는 경우, 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA를 라이브러리 스크리닝 과정 동안 분리된 디스플레이 팩키지(예를 들면, 파아지)로부터의 DNA의 PCR 증폭에 의한 것과 같은, 표준 분자생물학 기술로 분리한다. 이로부터 PCR 프라이머를 제조할 수 있는 항체 경쇄 및 중쇄 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 당해 분야에 공지되어져 있다. 예를 들면, 수 많은 상기 서열들이 문헌[Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 및 "Vbase" 사람 배주(germline) 서열 데이터베이스에서 기술되어져 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 일부분은 숙주 세포에서 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현에 의해서 제조할 수 있다. 항체를 재조합적으로 발현시키기 위해서, 숙주 세포를 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 단편을 갖는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질감염시켜, 경쇄 및 중쇄가 숙주 세 포에서 발현되게 하고, 바람직하게는 숙주 세포를 배양하는 배지내로 분비되게 하며, 배지로부터 항체를 회수할 수 있다. 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. et al. (eds) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) and U.S. Patent No. 4,816,397 by Boss et al.]에 기술된 바와 같이, 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 수득하고, 이들 유전자를 재조합 발현 벡터내로 도입한 후 상기 벡터를 숙주 세포내로 도입시킬 수 있다.
일단 관심 대상의 항체의 VH 및 VL 절편을 암호화하는 DNA 단편이 수득되면, 이러한 DNA 단편들은 추가로, 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작되어 다양한 가변 영역 유전자들이 전체 길이 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환될 수 있다. 이러한 조작에서, VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편을 항체 불변 영역 또는 유연한 링커(flexible linker)같은 또 다른 단백질을 암호화하는 또 다른 DNA 단편에 작동적으로 결합된다. 본원 내용에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동적으로 결합된"은 두 개의 DNA 단편이 결합되어 상기 두 개의 DNA 단편에 의해 암호화되는 아미노산 서열이 프레임내에 유지되는 것을 의미한다.
VH 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VH-암호화 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 결합시켜 전체 길이 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 사람 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 분야에 공지되어져 있으며[예를 들면, 참조: Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], 상기 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해서 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있으며, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-암호화 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 결합될 수 있다.
VL 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VL-암호화 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 결합시켜 전체 경쇄 유전자(뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 사람 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 분야에 공지되어져 있으며[예를 들면, 참조: Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편들은 표준 PCR 증폭에 의해서 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 카파 불변 영역이다.
scFv 유전자를 생성시키기 위해서, VH- 및 VL-암호화 DNA 단편들은 유연한 링커를 암호화하는, 예를 들면, 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 암호화하는 또 다른 단편에 작동적으로 결합시켜, VH 및 VL 서열은 유연한 링커에 의해 결합된 VL 및 VH 영역을 갖는, 연속적인 단일 쇄 단백질로서 발현시킬 수 있다[예를 들면, 참조: Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554].
본 발명의 재조합 항체 또는 항체 일부분을 발현시키기 위해서, 상기 기술된 바와 같이 수득된, 부분적인 또는 전체 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA를 발현 벡터내로 삽입시켜, 유전자가 전사 또는 해독 조절 서열에 작동적으로 결합되도록 한다. 이러한 내용에서, 용어 "작동적으로 결합된"은 항체 유전자가 벡터에 결합되어, 벡터내 전사 및 해독 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 해독을 조절하는 이의 의도된 기능을 수행하는 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포에 적합한(compatible) 것을 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자를 별개의 벡터에 삽입시킬 수 있거나, 보다 전형적으로는, 두 개의 유전자 모두를 동일한 발현 벡터내로 삽입시킨다. 항체 유전자를 표준 방법으로 발현 벡터내로 삽입시킨다(예를 들면, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적인 제한 부위의 결합, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 평활말단 결합). 경쇄 또는 중쇄 서열의 삽입에 앞서, 발현 벡터는 이미 항체 불변 영역 서열을 가질 수 있다. 예를 들면, VH 및 VL 서열을 전체 길이 항체 유전자로 전환시키는 한 가지 접근법은 이들을 이미 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 각각 암호화하는 발현 벡터내로 삽입하여, VH 절편이 벡터내에서 CH 절편에 작동적으로 결합되게 하고 VL 절편이 벡터내에서 CL 절편에 작동적으로 결합되게 하는 것이다. 부가적으로 또는 선택적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 촉진시키는 시그날 펩타이드를 암호화할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 벡터내로 클로닝하여 시그 날 펩타이드가 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 프레임내에서 결합되게 할 수 있다. 시그날 펩타이드는 면역글로불린 시그날 펩타이드 또는 이종성 시그날 펩타이드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 시그날 펩타이드)일 수 있다.
항체 쇄 유전자 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포내에서 항체 쇄 유전자의 발현을 조절하는 조절성 서열을 갖는다. 용어 "조절성 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 해독을 조절하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소(예를 들면, 폴리아데닐화 시그날)을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 조절성 서열은 예를 들면, 문헌[Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기술되어져 있다. 조절성 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계는 형질전환시키고자 하는 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자들에 따라 결정될 수 있음을 당업자는 숙지할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절성 서열은 포유동물에서 고수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 인자들, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(CMV)(CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40(SV40)(SV40프로모터/인핸서), 아데노바이러스(예를 들면, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유도된 프로모터/인핸서를 포함한다. 바이러스성 조절 요소 및 이의 서열에 대한 추가의 기술에 대해서는, 예를 들면, 문헌[미국 특허 제5,168,062호, Stinski에 허여됨; 미국 특허 제4,510,245호, Bell 등에게 허여됨; 및 미국 특허 제4,968,615호, Schaffner 등에게 허여됨]을 참조한다.
항체 쇄 유전자 및 조절성 서열 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 복제를 조절하는 서열(예를 들면, 복제 오리진) 및 선택가능한 마커 유전자 같은 부가적인 서열을 가질 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입되는 숙주 세포의 선택을 촉진시킨다[예를 들면, 참조: 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호, 모두 Axel 등에 허여됨]. 예를 들면, 전형적으로, 선택가능한 마커 유전자는 벡터를 도입시킨 숙주 세포 상에서 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트 같은 약제에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선택가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭으로 dhfr- 숙주 세포에서 사용함) 및 neo 유전자(G418 선택용)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해서, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)을 표준 기술로 숙주 세포내로 형질감염시킨다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 외인성 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포내로 도입하기 위해 사용된 광범위하게 다양한 기술, 예를 들면, 전기천공법, 칼슘-포스페이트 침전법, DEAE-덱스트란 형질감염법 등을 포함하는 것으로 의도된다. 이론적으로, 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 본 발명의 항체를 발현시키기는 것이 가능하지만, 진핵생물 세포에서의 항체 발현, 및 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서의 항체 발현이 가장 바람직한데, 이는 상기 진핵생물 세포, 및 특히 포유동물 세포는 원핵생물 세포에 비해 적합하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 보다 더 잘 조립하고 분비하기 때문이다. 항체 유전자의 원핵생물 분비는 활성 항체의 고수율 생산에 비효과적인 것으로 보고되어져 왔다[Boss, M.A. and Wood, C.R. (1985) Immunology Today 6: 12-13].
본 발명의 재조합 항체를 발현하는 바람직한 포유동물 숙주 세포는 중국산 햄스터 난소(CHO 세포)[문헌(Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220)에 기술되고, 예를 들면, 다음 문헌(R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621)에 기술된 바와 같은 DHFR 선택가능한 마커를 사용하는, dhfr- CHO 세포 포함], NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포내로 도입되는 경우, 항체는, 숙주 세포내에서 항체가 발현되거나 보다 바람직하게는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지내로 항체가 분비되기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양시킴으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
숙주 세포는 또한, Fab 단편 또는 scFv 분자 같은 완전한 항체의 일부를 생산하는데 사용할 수 있다. 상기 과정상의 변형들이 본 발명의 범위내에 속한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 항체의 경쇄 또는 중쇄(둘 모두는 아님)를 암호화하는 DNA로 숙주 세포를 형질감염시키는 것이 바람직할 것이다. 재조합 DNA 기술을 또한 사용하여, 관심 대상의 항원에 대한 결합에 불필요한 경쇄 및 중쇄 중 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 DNA 중 일부 또는 모두를 제거할 수 있다. 상기 절두된(truncated) DNA 분자로부터 발현된 분자는 또한, 본 발명의 항체에 포함된다. 또한, 본 발명의 항체를 표준 화학적 가교결합 방법으로 제2 항체에 가교결합시킴으로써, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄는 본 발명의 항체이고 다른 중쇄 및 경쇄는 관심 대상의 항원이 아닌 다른 항원에 특이적인 이기능성 항체가 생산될 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 부분의 재조합 발현을 위한 바람직한 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 모두를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 칼슘 포스페이트-매개된 형질감염법으로 dhfr- CHO 세포내로 도입시킨다. 재조합 발현 벡터내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자 각각을 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소에 작동적으로 결합시켜 유전자의 고 수준 전사를 유도시킨다. 재조합 발현 벡터는 또한 DHFR 유전자를 가지며, 이는 메토트렉세이트 선택/증폭을 사용하여 상기 벡터로 형질감염된 CHO 세포의 선택을 가능하게 한다. 선택된 형질전환체 숙주 세포를 배양하여 항체 중쇄 및 경쇄의 발현을 가능하게 하며, 완전한 항체를 배양 배지로부터 회수한다. 표준 분자생물학 기술을 사용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고 형질전환체를 선택하고 숙주 세포를 배양하여 배양 배지로부터 항체를 회수한다. 또한 추가로, 본 발명은 본 발명의 재조합 항체가 합성될 때까지 적합한 배양 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양함으로써 본 발명의 재조합 항체를 합성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 추가로 배양 배지로부터 재조합체를 분리하는 것을 포함할 수 있다.
파아지 디스플레이에 의한 재조합 항체 라이브러리의 스크리닝에 대한 대안으로, 거대 조합 라이브러리를 스크리닝하는 당해 분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 본 발명의 이중 특이성 항체를 확인할 수 있다. 한 가지 유형의 대안의 발현 시스템은 재조합 항체 라이브러리가 문헌[PCT 공개공보 WO 제98/31700호(Szostak and Roberts), 및 문헌: R.W. and Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12297-12302]에 기술된 바와 같이, RNA-단백질 융합체로서 발현되는 것이다. 상기 시스템에서, 공유결합 융합체가 mRNA 및 펩타이드 또는 단백질 사이에서 생성되며, 이는 3' 말단에서 펩티딜 수용체 항생제인 푸로마이신을 갖는 합성 mRNA의 시험관내 해독에 의해 암호화된다. 따라서, 특정 mRNA는 암호화된 펩타이드 또는 단백질, 예를 들면, 항체 또는 이의 일부분의 특성, 예를 들면, 항체 또는 이의 일부분의 이중 특이성 항원에 대한 결합에 기초하여, mRNA의 복합 혼합물(예를 들면, 복합 라이브러리)로부터 농축될 수 있다. 상기 라이브러리의 스크리닝으로부터 회수되는 항체, 또는 이의 일부분을 암호화하는 핵산 서열은 상기 기술된 바와 같은 재조합 방법으로 발현될 수 있으며(예를 들면, 포유동물 숙주 세포에서), 또한, 돌연변이가 최초 선택된 서열(들)에 도입된 mRNA-펩타이드 융합체의 스크리닝의 추가적인 반복에 의해서, 또는 상기 기술된 바와 같이, 재조합 항체의 시험관내 친화도 성숙의 또 다른 방법에 의해서 추가의 친화도 성숙에 적용될 수 있다.
C. 혼용 접근법
본 발명의 이중 특이성 항체는, 이중 특이성 항원이 숙주 동물내에서 생체내 항체 레퍼토리에 최초 노출되어 이중 특이성 항원에 결합하는 항체의 생산을 자극하는 방법 같은 생체내 및 시험관내 접근법의 혼용으로 제조할 수 있으며, 이때, 추가의 항체 선택 및/또는 성숙(즉, 개선)은 하나 이상의 시험관내 기술을 사용하여 달성된다.
한 가지 구체적인 양태에서, 상기 혼용 방법은 우선, 비-사람 동물(예를 들 면, 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 또는 이의 유전자이식 형태, 또는 키메라 마우스)을 이중 특이성 항원으로 면역화시켜 항원에 대한 항체 반응을 자극한 후, 이중 특이성 항원에 노출시켜 생체내에서 자극된 임파구로부터 면역글로불린 서열을 사용하여 파아지 디스플레이 항체 라이브러리를 제조 및 스크리닝하는 것과 관련된다. 상기 혼용 과정의 첫 번째 단계는 상기 서브섹션 IIA에서와 같이 수행될 수 있는 반면, 상기 과정의 두 번째 단계는 상기 서브섹션 IIB에서와 같이 수행될 수 있다. 비사람 동물의 과면역화 이후 자극된 임파구로부터 제조된 파아지 디스플레이 라이브러리의 시험관내 스크리닝을 위한 바람직한 방법은 제조원(BioSite Inc.)에 의해 기술된 것과 같은 방법을 포함하며, 예를 들면, 문헌[PCT 공개공보 WO 제98/47343호, PCT 공개공보 WO 제91/17271호, 미국 특허 제5,427,908호 및 미국 특허 제5,580,717호]을 참조한다.
또 다른 구체적인 양태에서, 혼용 방법은 우선, 비-사람 동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 또는 이의 녹아웃 및/또는 유전자이식 형태, 또는 키메라 마우스)을 이중 특이성 항원으로 면역화시켜 항원에 대한 항체 반응을 자극하고 목적하는 이중 특이성을 갖는 항체를 생산하는 임파구를 선택(예를 들면, 면역화된 동물로부터 제조된 하이브리도마를 스크리닝하여)하는 것과 관련된다. 이후, 선택된 클론으로부터 재배열된 항체 유전자를 분리하고(역 전사효소-폴리머라제 연쇄 반응 같은 표준 클로닝 기술에 의해), 시험관내 친화도 성숙에 적용하여 이로써, 선택된 항체 또는 항체들의 결합 특성을 증강시킨다. 상기 과정의 제1 단계는 상기 서브섹션 IIA에 기술된 바와 같이 수행할 수 있는 반면, 상기 과정의 제2 단계 는 상기 서브섹션 IIB에 기술된 바와 같이 수행할 수 있으며, 특히 문헌[PCT 공개공보 WO 제97/29131호 및 PCT 공개공보 WO 제00/56772호]에 기술된 바와 같은 시험관내 친화도 성숙을 사용하여 수행할 수 있다.
또 다른 혼용 방법에서, 재조합 항체는 문헌[미국 특허 제5,627,052호, PCT 공개공보 WO 제92/02551호 및 문헌: Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-7848]에 기술된 바와 같이, 선택된 임파구 항체 방법(SLAM) 같은 당해 분야에서 인용되는 방법을 사용하여 단일의 분리된 임파구로부터 생성된다. 상기 방법에서, 본 발명의 이중 특이성 항체에 적용되는 바와 같이, 비-사람 동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 또는 이의 유전자이식 형태, 또는 키메라 마우스)을 우선 생체내에서 이중 특이성 항원으로 면역화시켜 항원에 대한 항체 반응을 자극시킨 후, 관심 대상의 항체를 분비하는, 예를 들면, 이중 특이성 항원에 특이적인 항체를 분비하는 단일 세포를 항원-특이적 용혈성 플라크 분석(예를 들면, 이중 특이성 항원 그 자체, 또는 관심 대상의 구조적으로 관련된 분자를 바이오틴 같은 링커를 사용하여 양(羊)의 적혈구에 커플링시켜 용혈 플라크 분석법을 사용하여 적합한 특이성을 갖는 항체를 분비하는 단일 세포를 동정한다)으로 선택한다. 관심 대상의 항체 분비 세포를 확인한 후, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA를 역전사효소-PCR로 상기 세포로부터 수득하고 이러한 가변 영역을 COS 또는 CHO 세포 같은 포유동물 숙주 세포에서 적합한 면역글로불린 불변 영역(예를 들면, 사람 불변 영역)과 관련하여 발현시킬 수 있다. 이후, 생체내 선택된 임파구로부터 유도된, 증폭된 면역글로불린 서열로 형질감염시킨 숙주 세포는 추가로 분 석하거나, 예를 들면, 목적하는 이중 특이성을 갖는 항체를 발현하는 세포를 분리하기 위해 형질감염된 세포를 추림으로써, 시험관내에서 선택할 수 있다. 증폭된 면역글로불린 서열은 상기 기술된 바와 같이 시험관내 친화도 성숙에 의해서, 추가로 시험관내에서 조작할 수 있다.
또 다른 구체적인 양태에서, 이중 특이성 항체를 생산하는 혼용 방법은 하기 단계들과 관련된다. 제1 비-사람 동물을 제1 항원으로 면역화시키고 제2 비-사람 동물을 제2의 상이한 항원으로 면역화시키며, 이때, 바람직하게는, 제2 항원은 제1 항원과 구조적으로 유사하여, 생체내에서 항체 반응을 자극시킬 수 있다. 서브섹션 IIB에서 각각 기술된 바와 같이, 재조합 중쇄 라이브러리 및 재조합 경쇄 라이브러리를 제1 비-사람 동물 및 제2 비-사람 동물로부터 유도된 항체 유전자로부터 작제한다. 제1 항원으로 면역화시킨 동물로부터의 중쇄 라이브러리를 제2 항원으로 면역화시킨 동물로부터의 경쇄 라이브러리와 혼합하여 항체 라이브러리 X를 생성시킨다. 유사하게, 제2 항원으로 면역화시킨 동물로부터의 중쇄 라이브러리를 제1 항원으로 면역화시킨 동물로부터의 경쇄 라이브러리와 혼합하여 항체 라이브러리 Y를 생성시킨다. 부가적으로, 라이브러리 X 및 Y를 혼합하여 라이브러리 XY를 생성시킬 수 있다. 제1 및 제2 항원 모두에 결합하는 이중 특이성 항체를 확인하고 X, Y 및/또는 XY 라이브러리로부터 분리한다.
III. 이중 특이성 항체의 특성
본 발명은 이중 특이성 항체 뿐만 아니라, 본 발명의 방법에 따라 제조할 수 있는 이의 항체 일부분을 제공한다. 바람직하게는, 항체, 또는 이의 일부분은 분리된 항체이다. 바람직하게는, 항체, 또는 이의 일부분은 중화 항체이다. 본 발명의 항체는 모노클로날 및 재조합 항체, 및 이의 일부분을 포함한다. 다양한 구체적인 양태에서, 항체, 또는 이의 일부분은 전체 사람 또는 전체 마우스 항체, 또는 이의 일부분 같은 전적으로 단일 종으로부터 유도된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체적인 양태에서, 항체, 또는 이의 일부분은 키메라 항체 또는 CDR-이식된 항체 또는 사람화된 항체의 다른 형태일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 네 개의 폴리펩타이드 쇄, 이황화 결합에 의해 상호간에 연결된 두 개의 중쇄(H) 및 두 개의 경쇄(L)로 이루어진 면역글로불린 분자를 의미한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 추가로 골격 영역(FR)으로 명명된 보다 보존된 영역이 산재하는, 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명된 초가변성 영역으로 세분된다. 각각의 VH 및 VL은 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 이루어지며, 다음 순서로 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 항체의 "항원-결합 부분"(또는 단순히 "항체 일부분")은 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 이중 특이성 항체의 하나 이상의 단편에 관한 것이다. 항체의 항 원-결합 기능은 전체 길이 항체의 단편들에 의해서 달성될 수 있는 것으로 나타났다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"내에 포함되는 결합 단편들의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 일가 단편인 Fab 단편, (ii) 힌지(hinge) 영역에서 이황화 결합에 의해 결합된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편인 F(ab')2 단편, (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편[Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546], 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 추가로, Fv 단편의 두 개의 도메인, VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 이들을 단일 단백질 쇄로서 제조할 수 있게 하는 합성 링커에 의해 결합시켜, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 일가 분자를 형성하도록 할 수 있다[단일 쇄 Fv(scFv)로 공지됨; 예를 들면, 문헌 참조: Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883]. 상기 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분"내에 포함되는 것으로 의도된다. 이원항체(diabody) 같은 단일 쇄 항체의 다른 형태가 또한 포함된다. 이원항체는 이가의 이특이성 항체이며, 이때, VH 및 VL 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄 상에서 발현되지만, 동일 쇄 상에서 두 개의 도메인 사이에서 쌍을 형성하기에는 짧은 링커를 사용함으로써 상기 도메인들이 또 다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 형성하도록 하여 두 개의 항원 결합 부위를 생성하게 한다[예를 들면, 참조: Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J. et al. (1994) Structure 2: 1121- 1123].
또한 추가로, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항체 또는 항체 일부분이 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드와 공유결합 또는 비공유결합에 의해 형성한 보다 큰 면역부착(immunoadhesion) 분자의 일부일 수 있다. 상기 면역부착 분자의 예는 스트렙트아비딘 코어 영역을 사용하여 테트라머성 scFv 분자를 제조하는 것[Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridoma 6: 93-101] 및 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그를 사용하여 이가성 바이오티닐화된 scFv 분자를 제조하는 것[Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058]을 포함한다. Fab 및 F(ab')2 단편 같은 항체 일부분은 각각, 전체 항체의 파파인 또는 펩신 절단 같은 통상적인 기술을 사용하여 전체 항체로부터 제조할 수 있다. 또한, 항체, 항체 일부분 및 면역부착 분자는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "분리된 이중 특이성 항체"는 상이한 항원성 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 비함유된 이중 특이성 항체(예를 들면, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 항원 또는 그밖에 비관련된 항원의 구조적으로 관련된 영역에 특이적으로 결합하지만, 다른 비관련된 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 비함유된 분리된 항체)를 의미한다. 또한, 분리된 이중 특이성 항체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 비함유할 수 있다.
사용되는 바와 같이, "중화 항체"는 이의 특정 항원에 대한 결합이 항원의 생물학적 활성의 억제를 초래하는 항체를 의미한다. 항원의 생물학적 활성에 대한 이러한 억제는 적합한 시험관내 또는 생체내 분석법을 사용하여 항원의 생물학적 활성의 지표 하나 이상을 측정함으로써 평가할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "모노클로날 항체"는 하이브리도마-유도된 항체(예를 들면, 표준 코흘러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein) 하이브리도마 방법 같은 하이브리도마 기술로 제조된 하이브리도마로부터 분비된 항체)를 의미한다. 따라서, 본 발명의 하이브리도마-유도된 이중 특이성 항체는, 또한 단일 항원 이상에 대해서 항원성 특이성을 갖을 수 있지만, 여전히 모노클로날 항체로서 인용된다.
구절 "재조합 항체"는 숙주 세포에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합 조합 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 사람 면역글로불린 유전자를 유전자이식시킨[예를 들면, 참조: Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295] 동물(예를 들면, 마우스)로부터 분리된 항체 같은 재조합 방법으로 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체, 또는 특정 면역글로불린 유전자 서열(예를 들면, 사람 면역글로불린 유전자 서열)의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱과 관련된 다른 임의의 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 의미한다. 재조합 항체의 예는 키메라, CDR-이식된 및 사람화된 항체를 포함한다.
용어 "사람 항체"는 예를 들면, 문헌[참조: Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]에 의해 기술된 바와 같은 사람 배주(germline) 면역글로불린 서열에 상응하거나 이로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 의미한다. 그러나, 본 발명의 사람 항체는 예를 들면, CDR 및 특정 CDR3에서, 사람 배주 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들면, 시험관내 랜덤 또는 부위-특이적인 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해서 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 사람 항체는 가변 영역을 가지며, 또한 사람 배주 면역글로불린 서열로부터 유도된 불변 영역을 포함할 수 있다[참조: Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]. 그러나, 특정 구체적인 양태에서, 상기 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는, 사람 Ig 서열을 유전자이식한 동물을 사용하는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용하며, 결과적으로, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 사람 배주 VH 및 VL 서열로부터 유도되거나 이와 관련되지만, 생체내에서 사람 항체 배주 레퍼토리내에 천연적으로 존재할 수 없는 서열이다. 그러나, 특정 구체적인 양태에서, 상기 재조합 항체는 선택적인 돌연변이유발 또는 역돌연변이 또는 이 둘 모두의 결과이다.
용어 "역돌연변이"는 사람 항체의 체세포적으로 돌연변이된 아미노산 서열 일부 또는 전부를 상동성 배주 항체 서열로부터 상응하는 배주 잔기로 교체하는 방법을 의미한다. 본 발명의 사람 항체의 중쇄 및 경쇄 서열을 VBASE 데이터베이스내 배주 서열과 개별적으로 배열하여 최고의 상동성을 갖는 서열을 확인한다. 본 발명의 사람 항체내 차이점은 상기 상이한 아미노산을 암호화하는 정의된 뉴클레오타이드 위치를 돌연변이시킴으로써 배주 서열로 복귀시킨다. 역돌연변이를 위한 후보로서 이렇게 확인된 각각의 아미노산의 역할을 항원 결합에서의 직접적인 또는 간접적인 역할에 대해서 조사해야 하며, 사람 항체의 임의의 바람직한 특성에 영향을 미치는 돌연변이 후에 발견되는 임의의 아미노산은 최종 사람 항체내에 포함되지 않아야 한다. 역돌연변이시키는 아미노산 수를 최소화하기 위해서, 가장 밀접한 배주 서열과 상이하지만 제2 배주 서열내 아미노산과 동일하거나 상응하는 것으로 확인된 아미노산 위치들은 유지시킬 수 있지만, 단 제2 배주 서열은 당해 아미노산의 양쪽에서 10개 이상, 바람직하게는 12개의 아미노산에 대해서 본 발명의 사람 항체의 서열과 동일하거나 동일 선상에 있어야 한다. 역돌연변이는 항체 최적화의 모든 단계에서 일어날 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 한 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 및 다른 종으로부터의 불변 영역 서열을 포함하는 항체, 예를 들면, 사람 불변 영역에 결합된 쥐의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 의미한다.
용어 "CDR-이식된 항체"는 한 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, VH 및/또는 VL의 CDR 영역 하나 이상의 서열이 또 다른 종의 CDR 서열로 교체된 항체, 예를 들면, 쥐의 CDR 하나 이상(예를 들면, CDR3)이 사람 CDR 서열로 교체된, 쥐의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 의미한다.
용어 "사람화된 항체"는 비-사람 종(예를 들면, 마우스)로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, 이때, VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부는 보다 "사람-유형"으로 변형된, 즉 사람 배주 가변 서열과 보다 유사한 항체를 의미한다. 한 가지 유형의 사람화된 항체는 사람 CDR 서열이 비-사람 VH 및 VL 서열내로 도입 되어 상응하는 비사람 CDR 서열이 교체된 CDR-이식된 항체이다.
항체의 결합 역학(binding kinetics)을 측정하는 한 가지 방법은 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)에 의한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표면 플라스몬 공명"은 예를 들면, BIAcore 시스템(제조원: Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 바이오센서 매트릭스내 단백질 농도의 변화를 검출함으로써 실시간 생체특이적인 상호작용을 분석하는 것을 가능하게 하는 광학 현상을 의미한다. 추가의 기술에 대해서는, 문헌[Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B, et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; and Johnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277]을 참조한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Koff"는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 오프율 상수(off rate constant)를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 의미한다.
본 발명의 이중 특이성 항체는 상기 서브섹션 II에서 기술된 항체를 제조하기 위한 다양한 방법 중 하나를 사용하여 제조된다. 본 발명의 이중 특이성 항체는 필수적으로 임의의 구조적으로 관련된 항원에 대해서 지시될 수 있지만, 본 발명의 바람직한 이중 특이성 항체는 IL-1α 및 IL-1β에 특이적으로 결합하는 항체 이며, 이는 실시예 1 내지 4에서 기술된 바와 같은 이중 특이성 항원을 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명에 적용될 수 있는 다른 구조적으로 관련된 항원은 카스파제 패밀리 구성원, 사이토킨 패밀리, 예를 들면, IL-1 패밀리 구성원(예를 들면, IL-1/IL-18), TNF 패밀리 구성원(예를 들면, TNFα/TNFβ), IL-6 패밀리 구성원, 인터페론, TGFβ 패밀리 구성원, EGF 패밀리 구성원, FGF 패밀리 구성원, PDGF 패밀리 구성원, VEGF 패밀리 구성원, 안지오포이에틴 패밀리 구성원, 골 형태형성 단백질, 분비된 프로테아제(메탈로-프로테이나제), 및 사이토킨 수용체 패밀리, 예를 들면, IL-1-수용체 패밀리 구성원, TNF-수용체 패밀리 구성원, TGFβ수용체 패밀리 구성원, EGF 수용체 패밀리 구성원, FGF 수용체 패밀리 구성원, PDGF 수용체 패밀리 구성원, VEGF 수용체 패밀리 구성원 및 안지오포이에틴 수용체 패밀리 구성원을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 이중 특이성 항체는 상기 항체가 결합하는 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 항원에 대한 동등한 결합 활성을 나타낼 수 있거나, 이중 특이성 항체는 두 개의 항원 중 하나에 보다 우선적으로 결합할 수 있으며, 또한 비관련된 항원과 비교하여 여전히 두 개의 관련된 항원에 대한 특이성을 갖는다. 이중 특이성 항체의 구조적으로 관련된 항원 뿐만 아니라 비관련된 항원에 대한 결합 활성은 ELISA 또는 BIAcore 분석 같은 표준 시험관내 면역분석법을 사용하여 평가할 수 있다. 바람직하게는, 구조적으로 비관련된 항원에 대한 항체의 Kd 대 구조적으로 관련된 항원에 대한 항체의 Kd의 비율은 3 이상이어야 하며, 보다 바람직하게는 상기 비율은 5이상, 보다 더 바람직하게는 10 이상, 보다 더 바람직하게는 상기 비율은 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 이상이어야 한다.
정량적 측면에서, 배경 수준의 결합 및 이중 특이성 사이의 차이점은 1 등급 또는 1도이다. 예를 들면, 배경 수준의 결합은 예를 들면, 5% 미만, 보다 바람직하게는 3% 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 1% 정도로 낮은 반면, 특정 교차-반응성 또는 이중 특이성 결합은 1% 초과, 보다 바람직하게는 3% 초과, 보다 더 바람직하게는 5% 초과 및 보다 더욱더 바람직하게는 10% 초과 정도로 보다 더 높다. 부가적으로, 바람직하게는, 표적 항원에 대한 이중 특이성 항체의 IC50은 제시된 생물 검정법에서 항원의 ED50과 밀접하다.
본 발명의 이중 특이성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 바람직하게는, 항체가 특이적으로 결합하는 항원 중 하나, 및 보다 바람직하게는 항원 둘 모두에 대하여 바람직한 결합 역학(예를 들면, 높은 친화도, 낮은 해리, 느린 해리 속도, 강한 중화 활성)을 갖도록 선택된다. 예를 들면, 이중 특이성 항체, 또는 이의 일부분은 표면 플라스몬 공명으로 측정한 바와 같이, 0.1s-1 이하의 Koff율 상수, 보다 바람직하게는 1 x 10-2s-1 이하의 Koff율 상수, 보다 더 바람직하게는 1 x 10-3s-1 이하의 Koff율 상수, 보다 더 바람직하게는 1 x 10-4s-1 이하의 Koff율 상수, 또는 보다 더 바람직하게는 1 x 10-5s-1 이하의 Koff율 상수로, 구조적으로 관련된 항원 중 하나 및 보다 바람직하게는 항원 둘 모두에 결합할 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로, 이중 특이성 항체 또는, 이의 일부분은 1 x 10-6M 이하의 IC50, 보다 바람직하게는 1 x 10-7M 이하의 IC50, 보다 더 바람직하게는 1 x 10-8M 이하의 IC50, 보다 더 바람직하게는 1 x 10-9M 이하의 IC50, 보다 더 바람직하게는 1 x 10-10M 이하의 IC50, 또는 보다 더욱더 바람직하게는 1 x 10-11M 이하의 IC50으로, 구조적으로 관련된 항원 중 하나 및 보다 바람직하게는 항원 둘 모두의 활성을 억제할 수 있다. 바람직하게는 IC50은 민감한 생물 검정법을 사용하여 측정되어야 하며, 이때, IC50 값은 상기 검정법에서 항원의 ED50 값에 밀접해야 한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 이중 특이성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 추가로 하나 이상의 부가적인 치료제, 예를 들면, 이중 특이성 항체의 사용이 질병의 경감에 유익한 질병을 치료하기 위한 하나 이상의 부가적인 치료제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 이중 특이성 항체가 IL-1α 및 IL-1β에 특이적으로 결합하는 경우, 약제학적 조성물은 IL-1 활성이 유해한 질병을 치료하기 위한 하나 이상의 부가적인 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 항체들 및 항체-일부분은 환자에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물내로 도입시킬 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또 는 항체 일부분 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는 용매, 분산 매질, 피복제, 항미생물제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 및 생리학적으로 적합한 것 등의 일부 및 전부를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 하나 이상의 물, 염수, 인산염 완충된 염수, 덱트로오스, 글리세롤, 에탄올 등 뿐만 아니라 이의 혼합물을 포함한다. 수 많은 경우에, 조성물내에 등장성 제제, 예를 들면, 당, 다가 알콜, 예를 들면, 만니톨, 솔비톨, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제 같은 보조 물질 최소량을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 항체 또는 항체 일부분의 보존 수명 또는 효능을 증강시킨다.
본 발명의 항체 또는 항체 일부분은 비경구적 투여에 적합한 약제학적 조성물내로 도입시킬 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 항체 일부분은 0.1 내지 250㎎/㎖ 항체를 함유하는 주사가능한 용액으로 제조될 것이다. 주사가능한 용액은 플린트(flint) 또는 호박 바이알(amber vial), 앰풀 또는 예비-충전된 주사기내 액체 또는 동결건조된 형태 중 하나로 구성될 수 있다. 완충액은 pH 5.0 내지 7.0(최적으로는 pH 6.0)에서 L-히스티딘(1 내지 50mM), 최적으로는 5 내지 10mM일 수 있다. 다른 적합한 완충액은 나트륨 석시네이트, 나트륨 시트레이트, 나트륨 포스페이트 또는 칼륨 포스페이트를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 염화나트륨은 0 내지 300mM(액체 투여형의 경우 최적으로 150mM)의 농도에서 용액의 중독성을 변형시키는데 사용할 수 있다. 동결보호제(cryoprotectant)가 동결건조된 투 여형에 포함될 수 있으며, 주로 0 내지 10% 슈크로오스(최적으로는 0.5 내지 1.0%)이다. 다른 적합한 동결보호제는 트레할로오스 및 락토오스를 포함한다. 증량제가 동결건조된 투여형에 포함될 수 있으며, 주로 1 내지 10% 만니톨(최적으로는 2 내지 4%)이다. 안정화제가 액체 및 동결건조된 투여형에 사용될 수 있으며, 주로 1 내지 50mM L-메티오닌(최적으로는 5 내지 10mM)이다. 다른 적합한 증량제는 글리신, 아르기닌을 포함하며, 0 내지 0.05% 폴리솔베이트-80(최적으로는 0.005 내지 0.01%)으로 포함될 수 있다. 부가적인 계면활성제는 폴리솔베이트 20 및 BRIJ 계면활성제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태로 존재할 수 있다. 이들은 예를 들면, 액체 용액(예를 들면, 주사가능한 및 주입가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 산제, 리포좀 및 좌제 같은 액체, 반-고체, 및 고체 투여형을 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 투여 형식 및 치료학적 적용에 따라 결정된다. 전형적인 바람직한 조성물은 다른 항체를 사용한 사람의 수동 면역에서 사용되는 것과 유사한 조성물 같은, 주사가능한 또는 주입가능한 용액의 형태이다. 바람직한 투여 형식은 비경구적(예를 들면, 정맥내, 피하내, 복강내, 근육내)이다. 바람직한 구체적인 양태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사로 투여된다. 또 다른 바람직한 구체적인 양태에서, 항체는 근육내 또는 피하내 주사로 투여된다.
치료학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건하에서 멸균되어야하고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 미세유액, 분산제, 리포좀 또는 고농도의 약제에 적합한 다른 정연한 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능한 용액은 필요한 양 으로 활성 화합물(즉, 항체 또는 항체 일부분)을 적합한 용매 중에서 상기 무수히 언급된 성분들 중 하나 또는 이의 배합물과 함께 도입하고, 경우에 따라서 여과 멸균시킴으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본적인 분산 매질 및 경우에 따라 상기 무수히 언급된 것들로부터의 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클내로 활성 화합물을 도입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균, 동결건조된 산제의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 + 이전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 부가적인 바람직한 성분들의 산제를 생산하는 진공 건조 및 분무-건조법이다. 용액의 적합한 유동성은 예를 들면, 레시틴 같은 피복물을 사용함으로써, 분산제의 경우 필요한 입자 크기를 유지시킴으로써, 및 계면활성제를 사용함으로써 유지시킬 수 있다. 주사가능한 조성물의 지연된 흡수는 조성물내에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 야기시킬 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체 일부분은 당해 분야에 공지된 다양한 방법으로 투여할 수 있지만, 수 많은 치료학적 적용에 있어서, 바람직한 투여 경로/방식은 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이다. 당해 분야의 숙련자가 이해할 수 있는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 목적하는 결과에 따라서 결정될 것이다. 특정 구체적인 양태에서, 활성 화합물은 화합물이 신속하게 방출되는 것을 방지하는 담체와 함께 제조될 수 있으며, 예를 들면, 임플란트, 경피 패치, 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 조절된 방출 제형으로 제조될 수 있다. 생분해가능한, 생체적합성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 상기 제형을 제조하는 수 많은 방법들이 특허되어져 있거나 일반적으로 당해 분야의 숙련자에게 공지되어져 있다. 예를 들면, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
특정 구체적인 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부분은 예를 들면, 불활성 희석제 또는 동화가능한 섭취가능한 담체와 함께 경구적으로 투여될 수 있다. 화합물(및 경우에 따라, 다른 성분)은 또한, 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐내에 포함되거나, 정제로 압축되거나, 환자의 음식내로 직접적으로 도입될 수 있다. 경구 치료학적 투여에 있어서, 화합물은 부형제와 함께 도입되어 소화가능한 정제, 구강 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘릭서제, 현탁제, 시럽제, 웨이퍼제 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구적 투여 이외의 방법으로 본 발명의 화합물을 투여하기 위해서, 화합물을 화합물의 불활성화를 방지하는 물질로 피복하거나, 이러한 물질과 공동투여하는 것이 필요하다.
보충적 활성 화합물이 또한 조성물내로 도입될 수 있다. 특정 구체적인 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부분은 IL-1 활성이 유해한 질병을 치료하는데 유용한 하나 이상의 부가적인 치료학적 제제와 공동제형화 및/또는 공동투여된다. 예를 들면, 본 발명의 항-IL-1α/IL-1β 이중 특이성 항체, 또는 항체 일부분을 다른 표적에 결합하는 하나 이상의 부가적인 항체(예를 들면, 다른 사이토킨에 결합하거나 세포 표면 분자에 결합하는 항체)와 공동제형화 및/또는 공동투여할 수 있다. 추가로, 본 발명의 하나 이상의 항체는 전술한 치료제 하나 이상과 병용하여 사용할 수 있다. 상기 병용 치료법은 유리하게는 보다 낮은 투여량의 투여되는 치료제를 사용할 수 있으며, 결과적으로 다양한 단일치료법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.
IV. 이중 특이성 항체의 사용
두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 항원에 결합하는 능력을 고려할 때, 본 발명의 이중 특이성 항체 또는 이의 일부분은, 효소 결합된 면역흡착 분석법(ELISA), 방사면역분석법(RIA) 또는 조직 면역조직화학법 같은 통상적인 면역분석법을 사용하여, 이들 항원(예를 들면, 혈청 또는 혈장 같은 생물학적 샘플에서) 중 하나 또는 이들 모두를 검출하는데 사용할 수 있다. 본 발명은 생물학적 샘플을 상기 항원을 특이적으로 인식하는 본 발명의 이중 특이성 항체 또는 항체 일부분과 접촉시키고, 항원에 결합한 항체 또는 비결합된 항체(또는 항체 일부분)을 검출함으로써 생물학적 샘플내에서 항원을 검출함을 포함하여, 생물학적 샘플에서 항원을 검출하는 방법을 제공한다. 항체는 결합된 또는 비결합된 항체의 검출을 촉진시키기 위하여 검출가능한 기질로 직접적으로 또는 간접적으로 표지시킨다. 적합한 검출가능한 물질은 다양한 효소, 보철 그룹, 형광 물질, 냉광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하고, 적합한 보철 그룹 복합체의 예는 스트렙토아비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하며, 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민, 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 파미코에리트린을 포함하고, 냉광 물질의 예는 루미놀을 포함하며, 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 35S 및 3H를 포함한다.
항체를 표지하는 대안으로, 항원(들)을, 검출가능한 물질로 표지된 항원 표준물 및 당해 항원(들)에 특이적인 비표지된 이중 특이성 항체를 사용하는 경쟁 방사면역분석법으로 생물학적 유체에서 분석할 수 있다. 상기 분석법에서, 생물학적 샘플, 표지된 항원 표준물 및 이중 특이성 항체를 혼합하고 비표지된 항체에 결합된 표지된 항원 표준물의 양을 측정한다. 생물학적 샘플내에서 항원의 양은 비표지된 항체에 결합된 표지된 항원 표준물의 양과 반비례한다.
바람직한 구체적인 양태에서, 이중 특이성 항체는 IL-1α 및 IL-1β를 특이적으로 인식하며 전술한 검출 방법을 사용하여 IL-1α 및/또는 IL-1β를 검출한다. 따라서, 본 발명은 IL-1α 또는 IL-1β를 함유하는 것으로 생각되는 생물학적 샘플 또는 조직을 본 발명의 이중 특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분과 접촉시키고 생물학적 샘플 또는 조직에서 IL-1α 또는 IL-1β를 검출함을 포함하여, 생물학적 샘플 또는 조직에서 IL-1α 또는 IL-1β를 검출하는 방법을 제공한다. 생물학적 샘플은 예를 들면, 세포, 조직 또는 체액(예를 들면, 혈액, 혈장, 뇨, 타액 등)의 샘플 같은 시험관내 샘플일 수 있다. 또한, 검출된 조직은 환자에서 생체내에 위치하는 조직, 예를 들면, 조직의 생체내 영상화(예를 들면, 표지된 항체)에 의해 가시화된 조직일 수 있다.
본 발명의 이중 특이성 항체는 또한 진단 목적으로 사용할 수 있다. 한 가지 구체적인 양태에서, 본 발명의 항체는 관심 대상의 항원(들)을 검출하기 위한 실험실 시험 또는 관심 대상의 항원(들)을 검출하기 위한 치료 시험 측면과 같이, 시험관내 진단 분석법에서 사용된다. 항체를 사용하는 잘-확립된 시험관내 분석법의 예는 ELISA, RIA, 웨스턴 블롯 등을 포함한다. 또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 항체는 생체내 영상화 시험 같은 생체내 진단 분석법에서 사용된다. 예를 들면, 항체는 생체내 검출될 수 있는 검출가능한 물질로 표지될 수 있고, 표지된 항체는 환자에게 투여될 수 있으며, 표지된 항체는 생체내에서 검출되어 생체내 영상화를 가능하게 한다.
IL-1α 및 IL-1β를 특이적으로 인식하는 본 발명의 이중 특이성 항체는 진단적 목적으로, 예를 들면, 다양한 염증 질환 및 질병에서 뿐만 아니라 태아의 자연발생적 재흡수에서 IL-1α 및/또는 IL-1β를 검출하기 위한 진단 분석법에서 사용할 수 있다. 특정 유형의 질환 및 질병과 관련하여, 본 발명의 이중 특이성 항IL-1α/IL-1β 항체를 상기 항체의 치료학적 사용(하기 참조)와 관련하여 하기 추가로 논의되는 IL-1 활성이 유해한 질병 같은, 본원에서 기술된 질환/질병 중 하나에서 진단 목적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 이중 특이성 항체 및 항체 일부분은 바람직하게는, 이들이 결합되는 항원의 시험관내 및 생체내 활성 모두를 중화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 항체 및 항체 일부분은 예를 들면, 항원을 함유하는 세포 배양물, 또는 본 발명의 이중 특이성 항체가 반응하는 항원을 갖는 사람 환자 또는 다른 포유동물 환 자에서, 항원의 활성을 억제하는데 사용할 수 있다. 한 가지 구체적인 양태에서, 본 발명은 항원을 본 발명의 이중 특이성 항체 또는 항체 일부분과 접촉시켜 항원 활성을 억제함을 포함하는 항원 억제 방법을 제공한다. 바람직한 구체적인 양태에서, 이중 특이성 항체는 IL-1α 및 IL-1β에 결합하고 상기 방법은 IL-1α 및/또는 IL-1β를 이중 특이성 항체 또는 이의 일부분과 접촉시킴으로써 IL-1α 및/또는 IL-1β 활성을 억제하는 방법이다. IL-1α 및/또는 IL-1β 활성은 예를 들면, 시험관내에서 억제시킬 수 있다. 예를 들면, IL-1α 및/또는 IL-1β를 함유하거나 함유하는 것으로 생각되는 세포 배양물에서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부분을 상기 배양 배지에 부가하여 배양물에서 IL-1α 및/또는 IL-1β 활성을 억제할 수 있다. 대안으로, IL-1α 및/또는 IL-1β 활성은 환자에서 생체내에서 억제할 수 있다.
또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명은 항원 활성이 유해한 질병으로부터 고통받는 환자에서 항원 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 환자에게 본 발명의 이중 특이성 항체 또는 항체 일부분을 투여하여 환자에서 항원 활성을 억제시킴을 포함하여, 상기 질환으로부터 고통받는 환자에서 항원 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 항원은 사람 항원이며 환자는 사람 환자이다. 본 발명의 항체는 치료학적 목적으로 사람 환자에게 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 항체가 수의학적 목적으로 결합하는 항원을 발현하는 비-사람 포유동물에게 또는 사람 질환의 동물 모델로서 투여될 수 있다. 후자와 관련하여, 상기 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료학적 효능을 평가하는데 유용할 수 있다(예를 들 면, 투여량 시험 및 투여 경과 시간).
바람직하게는, 이중 특이성 항체는 IL-1α 및 IL-1β에 결합하며 환자에서 항원 활성을 억제하는 방법은 환자에서, 예를 들면, IL-1 활성이 유해한 질병으로부터 고통받는 환자에서 IL-1 활성을 억제하는 방법이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "IL-1 활성이 유해한 질병"은 상기 질병으로 고통받는 환자에서 IL-1의 존재(이는 IL-1α 및 IL-1β 모두를 포함한다)가 상기 질병의 병리생리학에 관여하거나 상기 질병을 악화시키는 인자인 것으로 나타나거나 의심되는 질환 및 다른 질병을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, IL-1 활성이 유해한 질병은 IL-1 활성(즉, IL-1α 및 IL-1β 중 하나 또는 모두)의 억제가 상기 증후군 및/또는 질병의 진행을 경감시킬 것으로 예견되는 질병이다. 상기 질병은 예를 들면, 상기 질병으로 고통받는 환자의 생물학적 유체에서 IL-1의 농도 증가(예를 들면, 환자의 혈청, 혈장, 활액 등에서 IL-1의 농도 증가)에 의해서 입증될 수 있으며, 이는 예를 들면, 상기 기술된 바와 같은 항-IL-1 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
인터류킨 1은 면역 및 염증성 요소들과 관련된 다양한 질환과 관련된 병리에서 결정적인 역할을 수행한다. 이러한 질병은 류마티스성 관절염, 골관절염, 유년기 만성 관절염, 라임(Lyme) 관절염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 척추관절증, 전신성 낭창성 홍반, 크론씨병, 궤양성 결장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기 질환, 건선, 피부염, 피부경화증, 이식편-대-숙주 질환, 기관 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 사르코이드증, 죽상경화증, 파종 혈관내 응고, 가와사키 질환, 그레이브 질환, 신장증 후군, 만성피로증후군, 베게너 육아종증, 헤노흐-쇼엔라인 자반증, 신장의 미세혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충 질환, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡축 척수염, 헌팅톤 무도병, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 졸중, 1차 담즙성 간경변, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전, 심근경색, 애디슨병, 산발성 다선성 결함 제I형 및 다선성 결함 제II형, 슈미트 증후군, 성인성(급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 원형탈모증, 혈청음성 관절증, 관절증, 라이터 증후군, 건선성 관절증, 궤양성 결장염 관절증, 장질환성 활액막염, 클라미디아증, 예르시니아 및 살모넬라 관련된 관절증, 척추관절증, 죽종성 질환/죽상경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽 천포창, 유사 천포창, 선형 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 쿰브스 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 유년기 악성 빈혈, 근육성 뇌염/로얄 프리 질환, 만성 점막피부 칸디다증, 거대세포 동맥염, 1차 경화성 간염, 잠재성 자가면역성 간염, 후천성 면역결핍 질환 증후군, 후천성 면역결핍 관련 질환, C형 간염, 공통 가변 면역결핍증(공통 가변성 저감마글로불린혈증), 팽창성 심근증, 여성 불임, 난소 이상, 조기성숙 난소 이상, 섬유성 폐 질환, 잠재성 섬유증 폐포염, 염증후 간질성 폐 질환, 간질성 폐염, 결합조직병 관련된 간질성 폐 질환, 혼합 결합조직병 관련 폐 질환, 전신계 경화 관련된 간질성 폐 질환, 류마티스성 관절염 관련된 간질성 폐 질환, 전신계 홍반성 낭창 관련된 폐 질환, 피부근육염/다발근육염 관련된 폐 질환, 스조그렌 질환(Sjogren's disease) 관련된 폐 질환, 강직척추염 관련된 폐 질환, 맥관염 확산 폐 질환, 혈철소증 관련된 폐 질환, 약제-유도된 간질성 폐 질환, 방사선 섬유증, 폐쇄기관지염, 만성 호산성 폐렴, 임파구 침투 폐 질환, 감염후 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가면역성 간염, 1형 자가면역성 간염(전통적인 자가면역 또는 루프성 간염), 2형 자가면역성 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개된 저혈당증, 흑색가시세포증과 관련된 B형 인슐린 내성, 부갑상선항진증, 기관 이식과 관련된 급성 면역 질환, 기관 이식과 관련된 만성 면역 질환, 골관절염, 1차 경화성 담관염, 1형 건선, 2형 건선, 특발성 백혈구감소증, 자가면역성 호중구감소증, 신장 질환 NOS, 사구체신염, 신장의 미세 맥관염, 림(lyme) 질환, 원반형 낭창성 홍반, 남성 불임 특발성 또는 NOS, 장자 자가면역, 다발성 경화증(모든 아형), 교감성 안염, 결합조직 질환에 속발성 폐동맥고혈압, 굿페스처 질환(Goodpasture's disease), 결절다발동맥염의 폐 소견, 급성 류마티스열, 류마티스성 척추염, 스틸 질환(Still's disease), 전신피부 경화증, 스조르그렌 증후군, 타카야스 질환/동맥염, 자가면역 저혈소판증, 특발성 저혈소판증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선과다증, 갑상선종 자가면역 갑상선저하증(하시모토 질환), 위축 자가면역 갑상선저하증, 1차 점액부종, 수정체성 포도막염, 1차 맥관염, 백반증, 중추신경계 질환(예를 들면, 우울증, 정신분열증, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환 등), 급성 및 만성 통증, 및 지질 불균형을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 사람 항체, 및 항체 일부분을 사용하여 자가면역 질환, 특히 류마티스성 척추염, 알레르기, 자가면역 당뇨, 자가면역 포도막염을 포함하는 염증과 관련된 질환으로부터 고통받는 사람을 치료할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 IL-1α/IL-1β 이중 특이성 항체 또는 이의 항원- 결합 부분을 사용하여, 류마티스성 관절염, 크론씨병, 다발성 경화증, 인슐린 의존성 진성 당뇨병 및 건선을 치료한다.
본 발명의 IL-1α/IL-1β 이중 특이성 항체 또는 항체 일부분은 또한, 자가면역 및 염증성 질환의 치료에서 유용한 하나 이상의 부가적인 치료제와 함께 투여할 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 부분은 상기 질환을 치료하기 위해서 단독으로 또는 병용하여 사용할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 단독으로, 또는 이의 의도된 목적에 따라 숙련자에 의해 선택되는 부가적인 제제, 예를 들면, 치료제와 병용하여 사용할 수 있다는 것을 이해해야만 한다. 예를 들면, 부가제는 본 발명의 항체로 치료되는 질환 또는 상태를 치료하는데 유용한 것으로 당해 분야에 인식되어져 있는 치료제일 수 있다. 부가제는 또한, 치료학적 조성물에 유익한 특성을 부여하는 제제, 예를 들면, 조성물의 점도에 영향을 미치는 제제일 수 있다.
본 발명내에 포함되는 배합물은 이의 의도된 목적에 유용한 배합물임을 추가로 이해해야만 한다. 하기 나타낸 제제들은 예시를 위한 것으로 이로써 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 일부분인 배합물은 본 발명의 항체 및 하기 목록으로부터 선택되는 하나 이상의 부가제일 수 있다. 배합물은 또한, 배합물이 형성된 조성물이 이의 의도된 기능을 수행할 수 있게 하는 한, 하나 이상의 부가제, 예를 들면, 두 개 또는 세 개의 부가제를 포함할 수 있다.
바람직한 배합물은 이부프로펜 및 COX-2 억제제 같은 약제를 포함하는 NSAID 로 또한 지칭되는 비-스테로이드성 소염제(들)이다. 다른 바람직한 배합물은 프레드니솔론을 포함하는 코르티코스테로이드이며, 스테로이드 사용의 잘 공지된 부작용들은 본 발명의 항-IL-1 항체와 병용하여 환자를 치료하는 경우, 필요한 스테로이드 투여량을 줄임으로써 감소시키거나 보다 더 제거시킬 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항체 일부분과 병용할 수 있는 류마티스성 관절염 치료제의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 사이토킨 억제성 소염제(들)(CSAID); 다른 사람 사이토킨 또는 성장 인자, 예를 들면, TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF에 대한 항체 또는 길항제. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 세포 표면 분자, 예를 들면, CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD90, 또는 CD154(gp39 또는 CD40L)를 포함하는 이의 리간드에 대한 항체들과 병용할 수 있다.
치료제의 바람직한 배합물은 상이한 지점에서 자가면역 및 후속적인 염증성 연쇄증폭반응을 방해할 수 있으며, 바람직한 예는 키메라, 사람화된 또는 사람 TNF 항체 같은 TNF 길항제, D2E7[PCT 공개공보 WO 제97/29131호], CA2(RemicadeTM), CDP 571, CDP 870, 탈리다마이드 및 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, 이의 유도체 (p75TNFRIgG(EnbrelTM) 또는 p55TNFRIgG(Lenercept)), 및 또한, TNFα전환 효소(TACE) 억제제를 포함하며, 유사하게 IL-1 억제제(인터류킨-1-전환 효소 억제제, IL-1RA 등)가 동일한 이유로 효과적일 수 있다. 다른 바람직한 배합물은 인터류킨 11을 포함한다. 또 다른 바람직한 배합물은 IL-1 기능에 의존적이거나 이와 협력 하여 유사하게 작용할 수 있는 자가면역 반응의 주요 작용인자들이며, 특히 바람직한 것은 IL-12 및/또는 IL-18 항체 또는 가용성 IL-12 및 IL-18 수용체, 또는 IL-12 및/또는 IL-18 결합 단백질을 포함하는 IL-12 및/또는 IL-18 길항제이다. IL-12 및 IL-18은 중복성이지만 독특한 기능을 가지며 이 둘 모두에 대한 길항제 배합물이 가장 효과적일 수 있는 것으로 나타났다. 또 다른 바람직한 배합물은 비-고갈성 항-CD4 억제제이다. 다른 바람직한 배합물은 항체, 가용성 수용체 또는 길항제 리간드를 포함하는 공동-자극 경로 CD80(B7.1) 또는 CD86(B7.2)의 길항제를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 또한, 메토트렉세이트, 6-MP, 아자티오프린 설파살라진, 메살라진, 올살라진, 클로로퀴닌/하이드록시클로로퀴닌, 펜실라민, 오로티오말레이트(근육내 및 경구), 아자티오프린, 코치신, 코르티코스테로이드(경구, 흡입 및 국부 주사), 베타-2-아드레노수용체 길항제(살부타몰, 테르부탈린, 살메테랄), 크산틴(테오필린, 아미노필린), 크로모글리케이트, 네도크로밀, 케토티펜, 이프라트로퓸 및 옥시트로퓸, 사이클로스포린, FK506, 라파미신, 미코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예를 들면, 이부프로펜, 프레드니솔론 같은 코르티코스테로이드, 포스포디에스터라제 억제제, 아데노신 길항제, 항혈소판제, 보체 억제제, 아드레날린작용제, TNFα또는 IL-1 같은 염증성 사이토킨에 의한 신호전달을 방해하는 제제(예를 들면, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β전환 효소 억제제, TNFα전환 효소(TACE) 억제제, 키나제 억제제 같은 T-세포 신호전달 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오 프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토킨 수용체 및 이의 유도체[예를 들면, 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체 및 유도체 (p75TNFRIgG(EnbrelTM) 및 p55TNFRIgG(Lenercept)), sIL-RI, sIL-1RII, sIL-6R] 및 소염성 사이토킨(예를 들면, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ)와 배합될 수 있다. 바람직한 배합물은 메토트렉세이트 또는 레플루노마이드를 포함하며, 경미하거나 심각한 류마티스성 관절염의 경우에는 사이클로스포린이 바람직하다.
본 발명의 항체, 또는 항체 일부분과 함께 병용할 수 있는 염증성 장 질환 치료제의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 부데노사이드, 표피 성장 인자, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 설파살라진, 아미노살리실레이트, 6-머캅토퓨린, 아자티오프린, 메트로니다졸, 리폭시게나제 억제제, 메살라민, 올살라진, 발살라진, 항산화제, 트롬복산 억제제, IL-1 수용체 길항제, 항-IL-1β 모노클로날 항체, 항-IL-6 모노클로날 항체, 성장 인자, 엘라스타제 억제제, 피리디닐-이미다졸 화합물, 다른 사람 사이토킨 또는 성장 인자, 예를 들면, TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, 및 PDGF에 대한 항체 또는 길항제. 본 발명의 항체는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 같은 세포 표면 분자 또는 이의 리간드에 대한 항체와 병용할 수 있다. 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 부분은 또한, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예를 들면, 이부프로펜, 프레드니솔론 같은 코르티코스테로이드, 포스포디에스터라제 억제제, 아데노신 길항제, 항혈소판제, 보체 억제제, 아드레날린작용 제, TNFα 또는 IL-1 같은 염증성 사이토킨에 의한 신호전달을 방해하는 제제(예를 들면, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β전환 효소 억제제, TNFα 전환 효소 억제제, 키나제 억제제 같은 T-세포 신호전달 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토킨 수용체 및 이의 유도체(예를 들면, 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sIL-RI, sIL-RII, sIL-6R) 및 소염성 사이토킨(예를 들면, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ) 같은 제제와 병용할 수 있다.
항체 또는 이의 항원 결합 부분과 병용할 수 있는 크론씨병 치료제의 바람직한 예는 다음을 포함한다: TNF 길항제, 예를 들면, 항-TNF 항체, D2E7[PCT 공개공보 WO 제97/29131호], CA2(RemicadeTM), CDP 571, TNFR-Ig 작제물[p75TNFRIgG(EnbrelTM) 및 p55TNFRIgG(Lenercept)] 억제제 및 PDE4 억제제. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 코르티코스테로이드, 예를 들면, 부데노사이드 및 덱사메타손과 병용할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 또한 설파살라진, 5-아미노살리실산 및 올살라진 같은 제제, 및 IL-1 같은 염증성 사이토킨의 합성 또는 작용을 방해하는 제제, 예를 들면, IL-1β 전환 효소 억제제 및 IL-1ra와 병용할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 또한 T 세포 신호전달 억제제, 예를 들면, 티로신 키나제 억제제 6-머캅토퓨린과 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 IL-11과 병용할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 일부분과 병용할 수 있는 다발성 경화증 치료제의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 코르티코스테로이드, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 4-아미노피리딘, 티자니딘, 인터페론-β1a(Avonex, 제조원: Biogen), 인터페론-1βb(Betaseron; 제조원: Chiron/Berlex), 공중합체 1(Cop-1, Copaxone, 제조원: Teva Pharmaceutical Industries, Inc.), 고압 산소, 정맥내 면역글로불린, 콜라브리빈, 다른 사람 사이토킨 또는 성장 인자, 예를 들면, TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, 및 PDGF에 대한 항체 또는 길항제. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 같은 세포 표면 분자 또는 이의 리간드에 대한 항체와 병용할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 또한, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예를 들면, 이부프로펜, COX-2 억제제, 프레드니솔론 같은 코르티코스테로이드, 포스포디에스터라제 억제제, 아데노신 길항제, 항혈소판제, 보체 억제제, 아드레날린작용제, TNFα또는 IL-1 같은 염증성 사이토킨에 의한 신호전달을 방해하는 제제(예를 들면, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β전환 효소 억제제, TACE 억제제, 키나제 억제제 같은 T-세포 신호전달 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토킨 수용체 및 이의 유도체(예를 들면, 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R) 및 소염성 사 이토킨(예를 들면, IL-4, IL-10, IL-13 및 TGFβ) 같은 제제와 병용할 수 있다.
항체 또는 이의 항원 결합 부분과 병용할 수 있는 다발성 경화증 치료제의 바람직한 예는 인터페론-β, 예를 들면, IFNβ1a 및 IFNβ1b, 코팍손, 코르티코스테로이드, IL-1 억제제, TNF 억제제, 및 CD40 리간드 및 CD80에 대한 항체를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"의 본 발명의 항체 또는 항체 일부분을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 필요한 투여량 및 시간 동안, 목적하는 치료 결과를 달성하기 위한 양을 의미한다. 항체 또는 항체 일부분의 치료학적 유효량은 질환 상태, 연령, 성별, 및 개개인의 체중 및 개인에서 목적하는 반응을 나타내는 항체 또는 항체 일부분의 능력 같은 인자들에 따라서 다양할 수 있다. 치료학적 유효량은 또한, 항체 또는 항체 일부분의 독성 효과 또는 유해한 효과 보다 치료학적으로 유익한 효과가 더 뛰어난 효과이다. "예방학적 유효량"은 필요한 투여량 및 시간 동안, 목적하는 예방 결과를 달성하기 위한 양을 의미한다. 전형적으로, 예방학적 투여량은 질환의 초기 단계에서 또는 이에 앞서서 환자에서 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량 보다 더 적을 것이다.
투여 방법은 최적의 목적하는 반응(예를 들면, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들면, 단일 1회 주사로 투여될 수 있거나, 수회의 분할된 투여량이 시간 경과에 따라서 투여될 수 있거나, 투여량은 치료학적 상황의 필요성에 따라서 지시되는 바와 같이 비율적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여량의 투여 및 균일화가 용이한 투여 단위 형태로 비경구적 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 바와 같은 투여 단위 형태는 치료하고자 하는 포유동물 환자에 대한 단일 투여형으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 목적하는 치료학적 효과를 생성하도록 계산된 예정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 세부 사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성하고자 하는 치료학적 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개개인에서 치료 감수성을 위해서 상기 활성 화합물을 혼합하는 분야의 내재하는 제한에 의해서 및 직접적으로 이들에 따라서 지시된다.
본 발명의 항체 또는 항체 일부분의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 대한 예시적인 비제한적인 범위는 0.1 내지 20㎎/㎏, 보다 바람직하게는 1 내지 10㎎/㎏이다. 투여량 값은 경감시키고자 하는 상태의 유형 및 중증도에 따라서 다양할 것이라는 것을 주지해야 한다. 추가로, 임의의 특정 환자에 있어서, 특정 투여 방법은 개인적인 필요성 및 조성물을 투여하는 사람 또는 투여를 감독하는 사람의 전문가적 판단에 따라서 시간 경과에 따라서 조절되어야 하며, 본원에서 나타낸 투여량 범위는 단지 예시적인 것으로 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것은 아니라는 것을 이해해야 한다.
본 발명은 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 것은 아닌 하기 실시예로서 추가로 예시된다. 본원 전반에 걸쳐 인용되는 바와 같은, 학문적 참조 문헌, 허여된 특허 및 공개된 특허원을 포함하는 모든 인용된 참조 문헌은 이로써 본원에 참 조 문헌으로써 명백히 도입되는 것이다.
실시예 1
동일성의 연속적인 위상학적 영역에 기초한 이중 특이성 항원의 설계
본 실시예에서, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 단백질, IL-1α 및 IL-1β 사이에서 동일성의 최대 연속적인 위상학적 영역을 IL-1α 및 IL-1β에 대한 이중 특이성 항체를 생성시키기 위한 이중 특이성 항원을 설계하기 위한 기초로서 결정하였다. BLAST 알고리듬을 사용하여 상기 두 단백질을 비교하여, 하나의 잔기가 유사한 구조적 또는 기능적 영역에서 다른 잔기를 대체하는 경향을 측정하는 것이 가능하게 되었다. 이러한 분석법은 IL-1α 및 IL-1β사이에서 동일성의 최대 연속적인 위상학적 영역을 확인하고, 상기 영역을 이중 특이성 항원으로 작용하는 선형 펩타이드를 제조하기 위한 임의의 합리적인 유사성의 신장물로 신장시키는 것을 가능하게 하였다. 상기 기준에 가장 부합하는 펩타이드는 하기 아미노산 서열을 갖는다.
Figure 112008054436879-PAT00001
(서열 번호 1)
표(*)는 BLAST 알고리듬에 따른 두 개의 단백질 모두에서의 동일한 잔기를 나타내며 다른 잔기들은 매우 유사하다. 예를 들면, 라이신은 종종 상동성 단백질에서 아르기닌을 대체하지만, 페닐알라닌을 대체하지는 않는다. 서열 번호 1의 이 러한 펩타이드는 반대 방향으로 향하는 구조의 두 개의 상이한 부분으로부터 취해진 하이브리드이며, 따라서, 이러한 에피토프의 또 다른 적합한 대표예는
dNdEdAdQNITDF(이때, "d"는 아미노산 잔기가 D 아미노산 잔기임을 나타내는접두사이다)이다. 펩타이드의 L 아미노산 형태 및 D 아미노산 형태로 부분적으로 치환된 형태 모두는 표준 화학 방법으로 합성된다. 이후, 상기 펩타이드는 운반체 단백질(예를 들면, KLH 또는 알부민)에 접합되어 접합된 펩타이드가 시험관내 및 생체내 방법에서 항체를 선택하는데 사용된다.
실시예 2
공통적인 폴드의 루프를 모사하는 사이클릭 펩타이드 상에 기초한 이중 특이성 항원의 설계
본 실시예에서, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 단백질, IL-1α 및 IL-1β 사이에서 공통적인 폴드의 주요 루프를 구조적으로 모사하는 사이클릭 펩타이드를 IL-1α 및 IL-1β에 대한 이중 특이성 항체를 생성시키기 위한 이중 특이성 항원으로서 사용하기 위해 작제하였다. 선택된 루프는 IL-1α의 잔기 168 내지 184번 및 IL-1β의 잔기 160 내지 176번을 나타낸다. 컨센서스 서열은 다음과 같다.
Figure 112008054436879-PAT00002
(서열 번호 2)
표(*)는 IL-1α 및 IL-1β사이의 동일한 잔기를 나타내며, c는 컨센서스 잔기, 즉 IL-1α 및 IL-1β에 유사하지만 각각의 단백질에서 상기 부위에서 실질적으로 존재하지는 않는 잔기를 나타내며, b는 어떠한 명백한 컨센서스 서열도 존재하지 않는다는 것을 나타내며 따라서, IL-1β 서열 동일성이 유지되었다. 선형 펩타이드는 표준 화학 합성 방법으로 합성된다. 상기 펩타이드를 폐환시키기 위해서, 프롤린 및 글리신 잔기를 부가한다. 사이클릭 펩타이드를 N,N-디메틸포름아미드내에서 고 희석물(1㎎/㎖)로서 표준 커플링 조건을 사용하여 합성할 수 있다. 표준 반응을 실온에서 과량의 커플링화제, 예를 들면, 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로 포스페이트(PyBOP; 2당량) 및 중탄산나트륨(10당량)을 사용하여 수행한다. 이후, 상기 펩타이드를 운반체 단백질(예를 들면, KLH 또는 알부민)에 접합시키고 접합된 펩타이드를 사용하여 시험관내 또는 생체내 방법으로 항체를 선택하는데 사용한다.
실시예 3
하이브리드 펩타이드에 기초한 이중 특이성 항원의 설계
본 실시예에서, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 단백질, IL-1α 및 IL-1β의 교호 또는 중복 서열을 포함하는 하이브리드 펩타이드를 IL-1α 및 IL-1β에 대한 이중 특이성 항체를 생성시키기 위한 이중 특이성 항원으로서 사용하기 위하여 작제하였다. 하이브리드 펩타이드를 제조하기 위해서, IL-1α 및 IL-1β의 교호 및 중복 아미노산 서열을 확인하고 함께 스플라이싱시켜 하기 펩타이드를 제 조하였다:
Figure 112008054436879-PAT00003
(서열 번호 3)
a 및 b는 어떠한 단백질이 잔기(a=IL-1α; b=IL-1β)의 공급원인지를 나타낸다. 두 단백질 모두에 공통적인 ITDF(서열 번호 4) 모티프가 하이브리드 펩타이드내에 포함되었다. 또한, 상기 하이브리드 펩타이드는 두 단백질 모두의 카복시 말단으로부터의 서열에 집중되며, 이는 또한, 두 단백질 모두에서 항체를 중화시키기 위한 항원성인 것으로 공지되어져 있다. 하이브리드 펩타이드는 표준 화학 합성 방법으로 합성된다. 이후, 상기 펩타이드는 운반체 단백질(예를 들면, KLH 또는 알부민)에 접합시키고, 접합된 펩타이드를 시험관내 또는 생체내 방법에 의해 항체를 선택하는데 사용한다.
실시예 4
IL-1α 및 IL-1β에 대한 이중 특이성 항체의 생산
NEAQNITDF (서열 번호 1)
사이클로-MAFLRANQNNGKISVAL(PG) (서열 번호 2)
TKGGQDITDFQILENQ (서열 번호 3)
서열 번호 1, 2 및 3의 펩타이드를 KLH에 접합시키고 개개의 토끼를 면역화시킨다. 각각의 상기 세 개의 펩타이드로 면역화시킨 토끼로부터의 항혈청은 항원으로 사용된 펩타이드에 대한 우수한 항체 반응을 나타냈다. 그러나, 서열 번호 3의 펩타이드로 면역화시킨 토끼로부터의 항혈청만이 IL-1α 단백질 및 IL-1β단백질 모두에 결합할 수 있었다.
5마리의 마우스(BA119 내지 BA123)를 KLH와 함께 접합시킨 서열 번호 3의 펩타이드 + 프로인트 불완전 애주번트(FIA)로 매 3주 마다 한번씩 전체 3회 피하로 면역화시키고, KLH와 함께 접합시킨 서열 번호 3의 펩타이드로 2회 정맥내 부스팅시켰다. 각각의 마우스를 각각의 면역화 10일 후에 채혈하고 항체 역가를 ELISA로 측정하였다. 마우스 BA119 및 BA123 각각으로부터의 비장 세포를 섹션 IIA에 기술된 바와 같은 골수종 세포주 P3X36Ag8.653에 융합시키고, 수득된 융합 세포를 제한 희석을 사용하여 수 개의 96-웰 플레이트내 각각의 웰 당 1개 세포로 접종하였다. 성장하는 하이브리도마 클론을 우선 표준 ELISA에 의해 IgG 및 IgM 생산에 대해서 분석하여 항체-생산 클론을 확인하였다. 마우스 # BA123 융합체로부터 전체 945개 클론이 분리되었다. ELISA에서 시험된 355개 클론으로부터의 상등액은 IL-1α, IL-1β, 또는 IL-1α 및 IL-1β둘 모두에 대해서 항원 결합 활성을 나타내었다.
클론 수 항원 특이성(전체 길이 IL-1α 및/또는 IL-1β에 대한) 동형
249 IL-1α 단독 IgG
19 IL-1α 단독 IgM
15 IL-1β 단독 IgG
2 IL-1β 단독 IgM
57 IL-1α 및 IL-1β IgG
13 IL-1α 및 IL-1β IgM
등가물
당해 분야의 숙련자는 일상적인 실험법만을 사용하여, 본원에 기술된 본 발명의 특정 구체적인 양태들에 대한 수 많은 등가물을 인식하고 확인할 수 있을 것이다. 상기 등가물들은 하기 특허청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
<110> Abbott Laboratories <120> Dual specificity antibodies and methods of making and using <130> BBC-083/A/KR <150> US 60/215,379 <151> 2000-06-29 <160> 4 <170> KOPATIN 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dual specificity antigen <400> 1 Asn Glu Ala Gln Asn Ile Thr Asp Phe 1 5 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is Pro or Gly <400> 2 Met Ala Phe Leu Arg Ala Asn Gln Asn Asn Gly Lys Ile Ser Val Ala 1 5 10 15 Leu Xaa <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hybrid peptide <400> 3 Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln 1 5 10 15 <210> 4 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hybrid peptide <400> 4 Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys 1 5 10 15 Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln 20 25 30 Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Gly Ala Tyr Lys 35 40 45 Ser Ser Lys Asp Asp Ala Lys Ile Thr Val Ile Leu Gly Leu Lys Glu 50 55 60 Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu 85 90 95 Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe 100 105 110 Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu 115 120 125 Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr 130 135 140 Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 145 150

Claims (41)

  1. 인터류킨-1α 및 인터류킨-1β에 특이적으로 결합하는 이중-특이성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분.
  2. 제1항에 있어서, 표면 플라스몬 공명으로 측정한 바와 같이, 0.1s-1 이하의 Koff율 상수로 인터류킨-1α에 결합하거나, 1 x 10-5M 이하의 IC50으로 인터류킨-1α의 활성을 억제하는 이중-특이성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분.
  3. 제1항에 있어서, 표면 플라스몬 공명으로 측정한 바와 같이, 0.1s-1 이하의 Koff율 상수로 인터류킨-1β에 결합하거나, 1 x 10-5M 이하의 IC50으로 인터류킨-1β의 활성을 억제하는 이중-특이성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분.
  4. IL-1α 및 IL-1β의 공통적인 구조 특성을 포함하고 IL-1α 및 IL-1β 사이의 동일성의 연속적인 위상학적 영역에 기초하여 설계되는 항원을 제공하는 단계, 상기 항원에 항체 레퍼토리를 노출시키는 단계, 및 항체 레퍼토리로부터 IL-1α 및 IL-1β에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하여 이중 특이성 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 인터류킨-1α 및 인터류킨-1β에 특이적으로 결합하는 이중-특이성 항체를 수득하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 항원이 아미노산 서열 NEAQNITDF(서열 번호 1) 또는 dNdEdAdQNITDF를 포함하는 방법.
  6. IL-1α 및 IL-1β의 공통적인 구조 특성을 포함하고 IL-1α 및 IL-1β의 공통적인 폴드(fold)의 루프를 구조적으로 모사하는 것에 기초하여 설계되는 항원을 제공하는 단계, 상기 항원에 항체 레퍼토리를 노출시키는 단계, 및 항체 레퍼토리로부터 IL-1α 및 IL-1β에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하여 이중 특이성 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 인터류킨-1α 및 인터류킨-1β에 특이적으로 결합하는 이중-특이성 항체를 수득하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 항원이 아미노산 서열 사이클로-MAFLRANQNNGKISVAL(PG)(서열 번호 2)을 포함하는 사이클릭 펩타이드인 방법.
  8. IL-1α 및 IL-1β의 공통적인 구조 특성을 포함하고 IL-1α 및 IL-1β의 중복 부분을 함께 스플라이싱하여 하이브리드 분자를 생성시키는데 기초하여 설계되는 항원을 제공하는 단계, 상기 항원에 항체 레퍼토리를 노출시키는 단계, 및 항체 레퍼토리로부터 IL-1α 및 IL-1β에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하여 이중 특이성 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 인터류킨-1α 및 인터류킨-1β에 특이적으 로 결합하는 이중-특이성 항체를 수득하는 방법.
  9. IL-1α 및 IL-1β의 공통적인 구조 특성을 포함하는 아미노산 서열 APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFS MGAYKSSKDDAKITVIL GLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS (서열 번호 4)를 포함하는 항원을 제공하는 단계, 상기 항원에 항체 레퍼토리를 노출시키는 단계, 및 항체 레퍼토리로부터 IL-1α 및 IL-1β에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하여 이중 특이성 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 인터류킨-1α 및 인터류킨-1β에 특이적으로 결합하는 이중-특이성 항체를 수득하는 방법.
  10. IL-1α 및 IL-1β의 공통적인 구조 특성을 포함하는 항원을 제공하는 단계, 상기 항원에 항체 레퍼토리를 노출시키는 단계, 및 항체 레퍼토리로부터 IL-1α 및 IL-1β에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하여 이중 특이성 항체를 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능한, 인터류킨-1α 및 인터류킨-1β에 특이적으로 결합하는 이중-특이성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분.
  11. 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자의 공통적인 구조 특성을 포함하며 이들 분자 사이에서 동일성의 연속적인 위상학적 영역에 기초하여 설계되는 항원을 제공하는 단계, 상기 항원에 항체 레퍼토리를 노출시키는 단계, 및 상기 레퍼토리로부터 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자에 특이적으로 결합하는 항 체를 선택하여 이중 특이성 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자에 특이적으로 결합하는 이중-특이성 항체를 수득하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자가 단백질이고 항원이 두 개의 단백질 사이에서 동일성의 연속적인 위상학적 영역의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드인 방법.
  13. 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자의 공통적인 구조 특성을 포함하고 당해 두 개의 분자의 공통적인 폴드의 루프를 구조적으로 모사하는 것을 기초하여 설계되는 항원을 제공하는 단계, 상기 항원에 항체 레퍼토리를 노출시키는 단계, 및 상기 레퍼토리로부터 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하여 이중 특이성 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자에 특이적으로 결합하는 이중-특이성 항체를 수득하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자가 단백질이고 항원이 두 개의 단백질의 공통적인 폴드의 루프를 구조적으로 모사하는 사이클릭 펩타이드인 방법.
  15. 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자의 공통적인 구조 특성을 포함하고 이들 두 개 분자의 중복 부분을 함께 스플라이싱하여 하이브리드 분자를 제조하는데 기초하여 설계되는 항원을 제공하는 단계, 상기 항원에 항체 레퍼토리를 노출시키는 단계, 및 상기 레퍼토리로부터 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하여 이중 특이성 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자에 특이적으로 결합하는 이중-특이성 항체를 수득하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자가 단백질이고 항원이 두 개의 단백질의 중복 아미노산 서열을 함께 스플라이싱하여 제조된 하이브리드 펩타이드인 방법.
  17. 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자의 공통적인 구조 특성을 포함하고 이들 두 개 분자중 하나가 항원인 당해 항원을 제공하는 단계, 상기 항원에 항체 레퍼토리를 노출시키는 단계, 및 상기 레퍼토리로부터 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하여 이중 특이성 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자에 특이적으로 결합하는 이중-특이성 항체를 수득하는 방법.
  18. 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자의 공통적인 구조 특성을 포함하 는 항원을 제공하는 단계, 상기 항원에 항체 레퍼토리를 노출시키는 단계, 및 상기 레퍼토리로부터 두 개의 상이하지만 구조적으로 관련된 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하여 이중 특이성 항체를 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 이중-특이성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분.
  19. 제1항의 이중-특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는, 인터류킨-1-관련된 질병을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, IL-1-관련된 질병이 염증성 질병인 약제학적 조성물.
  21. 제19항에 있어서, IL-1-관련된 질병이 자가면역 질병인 약제학적 조성물.
  22. 제19항에 있어서, IL-1-관련된 질병이 류마티스성 관절염, 크론씨병, 다발성 경화증, 인슐린 의존성 진성 당뇨병 및 건선으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  23. a) 제1 항원에 노출시켜 생성된 항체 레퍼토리로부터 재조합 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 A를 수득하는 단계; b) 제1 항원에 노출시켜 생성된 항체 레퍼토리로부터 재조합 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 B를 수득하는 단계; c) 제2 항원에 노출시켜 생성된 항체 레퍼토리로부터 재조합 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 C를 수득하는 단계; d) 제2 항원에 노출시켜 생성된 항체 레퍼토리로부터 재조합 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 D를 수득하는 단계; 및 e) 재조합 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 A를 재조합 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 D와 혼합하여 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 X를 수득하고/하거나 재조합 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 C를 재조합 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 B와 혼합하여 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 Y를 수득하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리를 제조하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 X를 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 Y와 혼합하여 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 Z를 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리를 제조하는 방법.
  25. 제23항의 방법에 따라 제조된 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 X.
  26. 제23항의 방법에 따라 제조된 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 Y.
  27. 제24항의 방법에 따라 제조된 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 Z.
  28. a) 제1 항원에 노출시켜 생성된 항체 레퍼토리로부터 재조합 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 A를 수득하는 단계; b) 제1 항원에 노출시켜 생성된 항체 레퍼토리로부터 재조합 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 B를 수득하는 단계; c) 제2 항원에 노출시켜 생성된 항체 레퍼토리로부터 재조합 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 C를 수득하는 단계; d) 제2 항원에 노출시켜 생성된 항체 레퍼토리로부터 재조합 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 D를 수득하는 단계; e) 재조합 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 A를 재조합 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 D와 혼합하여 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 X를 수득하고/하거나 재조합 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 C를 재조합 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 B와 혼합하여 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 Y를 수득하는 단계; 및 f) 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 X 및/또는 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 Y로부터 제1 및 제2 항원 모두에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 선택하는 단계를 포함하는, 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 제조 방법.
  29. 제28항의 방법으로 제조된 이중 특이성 항체.
  30. a) 제1 항원에 노출시켜 생성된 항체 레퍼토리로부터 재조합 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 A를 수득하는 단계; b) 제1 항원에 노출시켜 생성된 항체 레퍼토리로부터 재조합 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 B를 수득하 는 단계; c) 제2 항원에 노출시켜 생성된 항체 레퍼토리로부터 재조합 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 C를 수득하는 단계; d) 제2 항원에 노출시켜 생성된 항체 레퍼토리로부터 재조합 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 D를 수득하는 단계; e) 재조합 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 A를 재조합 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 D와 혼합하여 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 X를 수득하고/하거나 재조합 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 C를 재조합 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 B와 혼합하여 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 Y를 수득하는 단계; f) 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 X를 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 Y와 혼합하여 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 Z를 수득하는 단계; 및 g) 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 Z로부터 제1 및 제2 항원 모두에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 선택하는 단계를 포함하는, 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제조하는 방법.
  31. 제30항에 따른 방법으로 제조된 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  32. 제23항, 제28항 또는 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 항원이 각각, 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되며, 단 제1 및 제2 항원이 동일하지 않은 방법.
  33. 제32항에 있어서, 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드가 분비된 단백질 또는 표면 수용체인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 분비된 단백질이 IFN, TNF, 인터류킨, IP-10, PF4, GRO, 9E3, EMAP-II, CSF, FGF 및 PDGF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 제1 항원이 IL-1α이고, 제2 항원이 IL-1β인 방법.
  36. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 또는 라이브러리들의 각각의 구성원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
  37. 제29항 또는 제31항에 따른 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
  38. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분 라이브러리 또는 라이브러리들의 구성원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
  39. 제29항 또는 제31항에 따른 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
  40. 제38항의 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
  41. 제39항의 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
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