PL208069B1 - Sposób uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen - Google Patents

Sposób uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen

Info

Publication number
PL208069B1
PL208069B1 PL359995A PL35999501A PL208069B1 PL 208069 B1 PL208069 B1 PL 208069B1 PL 359995 A PL359995 A PL 359995A PL 35999501 A PL35999501 A PL 35999501A PL 208069 B1 PL208069 B1 PL 208069B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody
antigen
antibodies
animal
dual specificity
Prior art date
Application number
PL359995A
Other languages
English (en)
Other versions
PL359995A1 (pl
Inventor
Albert Collinson
Tariq Ghayur
George Avgerinos
Richard Dixon
Zehra Kaymakcalan
Original Assignee
Abbott Lab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Lab filed Critical Abbott Lab
Publication of PL359995A1 publication Critical patent/PL359995A1/pl
Publication of PL208069B1 publication Critical patent/PL208069B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/245—IL-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/545—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy sposobu uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen, które specyficznie wiąże dwa różne, lecz strukturalnie pokrewne białka.
System odpornościowy ssaków obejmuje limfocyty B, które wytwarzają repertuar przeciwciał składający się z setek miliardów różnych specyficzności przeciwciał. Prawidłowa odpowiedź immunologiczna wobec konkretnego antygenu obejmuje wybór ze wspomnianego repertuaru przeciwciał jednego lub więcej przeciwciał specyficznie wiążących antygen, i powodzenie odpowiedzi immunologicznej oparte jest, przynajmniej w części, na zdolności wspomnianych przeciwciał do specyficznego rozpoznawania (i ostatecznie eliminowania) stymulującego antygenu i „ignorowania” innych cząsteczek z otoczenia wspomnianych przeciwciał .
Użyteczność przeciwciał specyficznie rozpoznających jeden konkretny docelowy antygen doprowadziła do rozwoju technologii przeciwciał monoklonalnych. Standardowa technologia hybrydomy umożliwia obecnie wytwarzanie przeciwciał o pojedynczej specyficzności wobec konkretnego antygenu. Niedawno rozwinięto technikę wytwarzania przeciwciał rekombinowanych, taką jak technika przeszukiwania bibliotek przeciwciał in vitro. Techniki te umożliwiają wytwarzanie przeciwciał z pojedynczą specyficznością względem konkretnego antygenu.
Przeciwciała specyficzne wobec pojedynczego docelowego antygenu mogą, co najmniej w okreś lonych warunkach, wykazywać niekorzystną, krzyż ową reaktywność lub wiązanie niespecyficzne („tło”) do innych antygenów. Wspomniana reaktywność krzyżowa lub wiązanie niespecyficzne jest jednak nieprzewidywalne (tzn. nie można przewidzieć z którym antygenem konkretne przeciwciało będzie reagować krzyżowo). Ponadto, wiązanie to daje się rozróżnić zazwyczaj od specyficznego wiązania antygenu przez przeciwciało, ponieważ reprezentuje jedynie niewielką część zdolności przeciwciała do wiązania antygenu (np. 1% lub mniej całkowitej siły wiązania przeciwciała) i zazwyczaj obserwowane jest przy dużych stężeniach przeciwciała (np. 1000 krotnym lub wyższym, w porównaniu ze stężeniem niezbędnym do zaobserwowania zjawiska specyficznego wiązania antygenu). Jakkolwiek istnieją poszczególne antygeny, które należeć mogą do strukturalnie pokrewnej rodziny białek, odpowiedź wspomnianego przeciwciała względem konkretnego członka rodziny jest wysoce specyficzna. Ponadto istnieje szereg przykładów członków należących do konkretnej rodziny białek (np. członków rodzin IL-1 i TNF) które wiążą się z tym samym receptorem, składnikiem receptora czy ze strukturalnie pokrewnymi receptorami, jednak przeciwciała monoklonalne wytworzone przeciw jednemu członkowi takiej rodziny nie wykazują wysokiej reaktywności krzyżowej skierowanej wobec innych członków rodziny. Może być kilka przyczyn braku reaktywności krzyżowej przeciwciał monoklonalnych wobec różnych członków rodziny. Po pierwsze w standardowej procedurze hybrydomy poszukuje się jedynie nielicznych przeciwciał o wysokiej specyficzności/powinowactwie wobec docelowego antygenu i sprawdza się reaktywność krzyż ową lub wiązanie niespecyficzne kilku wybranych przeciwciał . Po drugie choć białka w obrębie rodziny są strukturalnie pokrewne, mogą one posiadać właściwe sobie jedynie, nie pokrywające się immunodominujące epitopy. Zatem przeciwciała monoklonalne wytworzone z zastosowaniem białka pełnej długości nie muszą wykazywać reaktywności krzyżowej z innymi, strukturalnie pokrewnymi białkami.
Znane są przykłady przeciwciał monoklonalnych wytworzonych przeciw antygenowi z jednego gatunku, które wiążą się specyficznie z funkcjonalnie takim samym antygenem, z innego gatunku. Na przykład przeciwciało X przeciw-mysie może łatwo reagować z ludzkim antygenem X. Dzieje się tak, ponieważ antygeny te łączą znaczące podobieństwa sekwencyjne i strukturalne, mimo że nie są identyczne. Jednakże wspomniana gatunkowa reaktywność krzyżowa przeciwciał nie stanowi „podwójnej specyficzności” przeciwciał, ponieważ wykazują one specyficzność wobec tego samego antygenu z róż nych gatunków organizmów.
Zatem istnieje zapotrzebowanie na przeciwciała monoklonalne posiadające przewidywalną podwójną lub wielokrotną specyficzność, to jest przeciwciała wykazujące prawdziwą specyficzność wobec dwu lub więcej antygenów.
Podsumowanie wynalazku
Wynalazek dotyczy sposobu uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen, które specyficznie wiąże dwa różne, lecz strukturalnie pokrewne białka, charakteryzującego się tym, że otrzymuje się antygen przez składanie ze sobą zachodzących na siebie części dwu różnych, lecz strukturalnie pokrewnych białek dla utworzenia peptydu hybrydowego, który to peptyd ma strukturę X-Y-Z, gdzie Y przedstawia region identyczny lub bardzo podobny dla obu poPL 208 069 B1 krewnych białek, X przedstawia region z jednego z pokrewnych białek, a Z przedstawia region z drugiego z pokrewnych białek; wystawia się repertuar przeciwciał na działanie tego antygenu; i przeprowadza się selekcję repertuaru przeciwciał, które specyficznie wiążą te dwie różne, lecz strukturalnie pokrewne białka, w celu otrzymania przeciwciała o podwójnej specyficzności.
Korzystnie repertuar przeciwciał wystawia się na działanie antygenu in vivo poprzez immunizację nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem.
Korzystniej sposób obejmuje ponadto przygotowanie panelu hybrydom z limfocytów zwierzęcia i wybieranie hybrydomy wydzielają cej przeciwciał o specyficznie wiążące dwa róż ne, lecz strukturalnie pokrewne białka cząsteczki.
Korzystnie zwierzę wybiera się z grupy obejmującej myszy, szczury, króliki i kozy.
Korzystnie jako zwierzę stosuje się mysz z wyłączonym genem pozbawioną endogennej wersji antygenu.
Korzystnie stosuje się zwierzę będące myszą transgeniczną pod względem ludzkich genów immunoglobulin i wytwarzające w wyniku stymulacji antygenowej ludzkie przeciwciała.
Korzystnie stosuje się zwierzę będące myszą z ostrym złożonym zespołem braku odporności odbudowanej za pomocą ludzkich obwodowych komórek jednojądrzastych lub komórek limfoidalnych, lub ich prekursorów.
Korzystnie stosuje się zwierzę będące myszą poddaną naświetleniu śmiertelną dawką promieniowania, następnie poddaną ochronie radiologicznej przez przeszczep komórek szpiku kostnego od myszy z ostrym złożonym zespołem braku odporności, a następnie przeszczepieniu ludzkich, funkcjonalnych limfocytów.
W korzystnej postaci repertuar przeciwciał wystawia się na dział anie antygenu in vitro przez przeszukiwanie biblioteki rekombinowanych przeciwciał z wykorzystaniem tego antygenu.
Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni bakteriofaga.
Także korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki drożdżowej.
Również korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki bakterii.
Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana jako produkty fuzyjne RNA-białko.
Także korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest biblioteką scFv lub biblioteką Fab.
W korzystnej postaci repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu przez immunizację in vivo zwierzęcia tym antygenem, a następnie przeszukiwanie in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia z użyciem tego antygenu.
W innej korzystnej postaci repertuar przeciwciał jest wystawiany na dział anie antygenu in vivo poprzez immunizację zwierzęcia tym antygenem, a następnie dojrzewanie powinowactwa in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia.
W kolejnej korzystnej postaci repertuar przeciwciał jest wystawiany na dział anie antygenu przez immunizację in vivo zwierzęcia tym antygenem, a następnie wybieranie pojedynczych komórek wydzielających przeciwciało wiążące antygen, i odzyskiwanie cDNA zmiennych regionów łańcucha lekkiego i ciężkiego z tych pojedynczych komórek.
Korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące w pełni ludzkim przeciwciałem.
Także korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem chimerycznym.
Korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem z przeszczepionym CDR.
W korzystnej postaci dwoma różnymi, lecz strukturalnie pokrewnymi białkami są interleukina-1a i interleukina-1 β.
Korzystniej jako antygen stosuje się antygen obejmujący sekwencję aminokwasową TKGGQDITDFQILENQ (Sek Id Nr 3).
Także korzystniej repertuar przeciwciał wystawia się na działanie antygenu in vivo, poprzez immunizowanie nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem.
Korzystniej ponadto przygotowuje panel hybrydom z limfocytów zwierzęcia i wybiera się hybrydomę wydzielającą przeciwciało specyficznie wiążące IL-1a i IL-1 β.
PL 208 069 B1
Korzystniej stosuje się zwierzę wybrane się z grupy obejmującej mysz, szczura, królika i kozę.
Także korzystniej stosuje się zwierzę będące myszą z wyłączonym genem, nie wytwarzającą
IL-Ια, IL-1 β lub IL-Ια i IL-1 β.
Korzystniej stosuje się zwierzę będące myszą transgeniczną pod względem ludzkich genów immunoglobulin i wytwarzające w wyniku stymulacji antygenowej ludzkie przeciwciała.
Korzystniej stosuje się zwierzę będące myszą z ostrym złożonym zespołem braku odporności odbudowanej za pomocą ludzkich obwodowych komórek jednojądrzastych lub komórek limfoidalnych, lub ich prekursorów.
Także korzystniej stosuje się zwierzę będące myszą poddaną naświetleniu śmiertelną dawką promieniowania, następnie poddaną ochronie radiologicznej przez przeszczep komórek szpiku kostnego od myszy z ostrym złożonym zespołem braku odporności, a następnie przeszczepieniu ludzkich, funkcjonalnych limfocytów lub ich prekursorów.
W korzystnej postaci repertuar przeciwciał wystawia si ę na dział anie antygenu in vitro przez przeszukiwanie biblioteki rekombinowanych przeciwciał z wykorzystaniem tego antygenu.
Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni bakteriofaga.
Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki drożdżowej.
Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki bakterii.
Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana jako produkty fuzyjne RNA-białko.
Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest biblioteką scFv lub biblioteką Fab.
W korzystnym sposobie repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu przez immunizację in vivo nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem, a następnie przeszukiwanie in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia z u ż yciem tego antygenu.
W innym korzystnym sposobie repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu in vivo poprzez immunizację nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem, a następnie dojrzewanie powinowactwa in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia.
W kolejnym korzystnym sposobie repertuar przeciwciał jest wystawiany na dział anie antygenu przez immunizację in vivo nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem, a następnie wybieranie pojedynczych komórek wydzielających przeciwciało wiążące antygen, i odzyskiwanie cDNA zmiennych regionów łańcucha lekkiego i ciężkiego z tych pojedynczych komórek.
Korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące w pełni ludzkim przeciwciałem.
Korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem chimerycznym.
Korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem z przeszczepionym CDR.
W warunkach klinicznych poszczególni członkowie tej samej rodziny białkowej mogą przyczyniać się do wystąpienia różnych objawów procesu chorobowego. Zatem, przeciwciało o podwójnej specyficzności może zostać wykorzystane do wiązania członków tej samej rodziny białkowej, w celu zablokowania funkcji więcej niż jednego członka rodziny, co może być korzystne przy usuwaniu objawów choroby lub przerywaniu samego procesu chorobowego. Ponadto przeciwciała o podwójnej specyficzności według wynalazku można wykorzystać do wykrywania strukturalnie pokrewnych antygenów, oczyszczania strukturalnie pokrewnych antygenów i w testach diagnostycznych obejmujących strukturalnie pokrewne antygeny.
Antygen może być zaprojektowany w oparciu o wspólny topologicznie obszar identyczności pomiędzy dwoma różnymi, lecz strukturalnie pokrewnymi cząsteczkami. Na przykład dwie różne lecz strukturalnie pokrewne strukturalnie cząsteczki mogą być białkami i antygen może być peptydem obejmującym sekwencje aminokwasową wspólnego topologicznie obszaru identyczności pomiędzy dwoma białkami.
Antygen może być także zaprojektowany w oparciu o strukturalne naśladowanie pętli wspólnego obszaru fałdowania dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek. Na przykład antygen
PL 208 069 B1 może być peptydem cyklicznym naśladującym strukturę pętli wspólnego obszaru topologicznej identyczności dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych białek.
Antygen może być także zaprojektowany w oparciu o połączone razem, ułożone na przemian lub pokrywające się części dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek, w celu wytworzenia cząsteczki hybrydowej. Na przykład antygen może być hybrydowym peptydem wytworzonym przez połączenie razem ułożonych na przemian lub pokrywających się sekwencji aminokwasowych dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych białek.
Repertuar przeciwciała może być wystawiony na działanie konkretnego antygenu in vivo albo in vitro. Na przykład wystawienie repertuaru przeciwciała na antygen obejmuje immunizowanie zwierzęcia in vivo przy pomocy antygenu. Wspomniany sposób in vivo może dalej obejmować otrzymanie zestawu hybrydom z limfocytów zwierzęcia i selekcjonowanie hybrydom które wydzielają przeciwciało które specyficznie wiąże dwa różne lecz strukturalnie pokrewne cząsteczki. Immunizowane zwierzę może być na przykład myszą, szczurem, królikiem lub kozą, lub wersją transgeniczną wspomnianych zwierząt, takim jak myszą będącą transgenem ludzkiego genu immunoglobulinowego, takim że wspomniana mysz wytwarza ludzkie przeciwciała w odpowiedzi na stymulację antygenową. Immunizowane mogą być również inne rodzaje zwierząt, obejmujące transgeniczną mysz z SCID wytworzoną z użyciem ludzkich obwodowych komórek jednojądrowych (chimerowa mysz hu-PBMC-SCID) lub komórek limfoidalnych lub ich prekursorów, i mysz poddaną działaniu letalnej dawki promieniowania jonizującego, traktowaną następnie komórkami szpiku myszy SCID, a następnie traktowaną ludzkimi limfocytami (system Trimera). Kolejny rodzaj immunizowanego zwierzęcia może obejmować np. nokautowaną mysz np. w wyniku rekombinacji homologicznej z endogennym genem lub genami, kodującymi antygen lub antygeny według wynalazku, gdzie po immunizacji antygen lub antygenami według wynalazku nokautowane zwierzę rozpoznaje antygen lub antygeny jako obce.
Repertuar przeciwciała może być wystawiony na działanie antygenu in vitro poprzez przeszukiwanie rekombinowanej biblioteki przeciwciała przy pomocy antygenu. Wspomniana rekombinowana biblioteka przeciwciała może być na przykład eksprymowana w bakteriofagu lub w komórkach drożdżowych lub w komórkach bakterii. Rekombinowana biblioteka przeciwciała jest na przykład biblioteką scFv lub biblioteką Fab. Biblioteki przeciwciała mogą być eksprymowane w postaci cząsteczek fuzyjnych RNA-białko.
Możliwe jest też połączenie wspomnianych sposobów in vivo oraz in vitro, takie jak wystawienie repertuaru przeciwciała na działanie antygenu poprzez immunizację zwierzęcia in vivo wspomnianym antygenem, a następnie przeszukiwanie in vitro rekombinowanej biblioteki przeciwciała uzyskanej z komórek limfoidalnych wspomnianego zwierzęcia przy pomocy antygenu. Moż liwe jest eksponowanie repertuaru przeciwciała na działanie antygenu poprzez immunizację in vivo zwierzęcia przy pomocy antygenu, a następnie selekcję pojedynczej komórki wytwarzającej przeciwciało, następnie uzyskanie cDNA regionu zmiennego łańcucha lekkiego i ciężkiego z wyselekcjonowanych komórek (np. techniką PCR) i ekspresję regionów zmiennych łańcucha lekkiego i ciężkiego w komórkach ssaczego gospodarza in vitro (określa się go jako sposób otrzymywania przeciwciała z selekcjonowanych limfocytów, SLAM, selected lymphocyte antibody method), umożliwiając tym samym dalszą selekcję i manipulowanie wybraną sekwencją genu kodującego przeciwciało. Kolejny sposób selekcjonowania przeciwciał monoklonalnych może obejmować ekspresję genów kodujących ciężki i lekki łańcuch przeciwciała w komórkach ssaczych i wybieranie komórek eksprymujących i wydzielających przeciwciało o pożądanej specyficzności.
Sposoby według wynalazku umożliwiają otrzymanie wielu różnych typów przeciwciał o podwójnej specyficzności, włączając w to przeciwciała w pełni ludzkie, przeciwciała chimerowe i przeciwciała chimerowe-CDR, oraz fragmenty wiążące antygen. Przeciwciało o podwójnej specyficzności można wykorzystać w sposobach wykrywania IL-Ια lub IL-1 β obejmujących kontaktowanie IL-Ια lub IL-1 β z przeciwciałem o podwójnej specyficzności, lub częścią wiążącą antygen wspomnianego przeciwciała, tak by prowadziło to do wykrycia IL-Ια lub IL-1 β. Przeciwciało neutralizujące o podwójnej specyficzności można zastosować również w sposobie hamowania aktywności IL-1a lub IL-1 β poprzez kontaktowanie IL-1a lub ^-1β z przeciwciałem o podwójnej specyficzności, lub częścią wiążącą antygen wspomnianego przeciwciała, tak by prowadziło to do hamowania aktywności IL-1a lub IL-1 β. Wspomniane przeciwciała o podwójnej specyficzności można również stosować w sposobach leczenia choroby w której istnieje patologia interleukiny 1, obejmujących podawanie choremu przeciwciała o podwójnej specyficzności lub części wiążącej antygen wspomnianego przeciwciała.
PL 208 069 B1
Szczegółowy opis wynalazku
Wynalazek wiąże się z projektowaniem i zastosowaniem antygenów do wytwarzania przeciwciał o podwójnej specyficznoś ci, to jest przeciwciał specyficznych wobec co najmniej dwu róż nych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek, jak również dostarcza sposobu wytwarzania przeciwciał o podwójnej specyficzności. Strukturalne pokrewieństwo antygenów może obejmować całą cząsteczkę antygenu (np. białka) lub jedynie pewne strukturalnie pokrewne regiony. Wynalazek dostarcza sposobu uzyskiwania przeciwciał o podwójnej specyficzności które specyficznie wiążą dwie różne lecz strukturalnie pokrewne cząsteczki, obejmującego:
dostarczenie antygenu obejmującego wspólne cechy strukturalne dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek eksponowanie repertuaru przeciwciał na antygen selekcjonowanie z repertuaru przeciwciała specyficznie wiążącego dwie różne lecz strukturalnie pokrewne cząsteczki, w celu uzyskania przeciwciała o podwójnej specyficzności.
Należy zwrócić uwagę, że choć wynalazek przedstawiony jest tu w terminach opisujących rozpoznawanie dwu różnych lecz pokrewnych antygenów, to termin „przeciwciało o podwójnej specyficzności” w zamierzeniu ma obejmować przeciwciała specyficznie rozpoznające nawet więcej niż dwa różne lecz pokrewne antygeny, takie jak przeciwciało rozpoznające trzy, cztery, pięć lub więcej strukturalnie pokrewnych lecz różnych antygenów. Ponadto termin „różne lecz strukturalnie pokrewne antygeny” w zamierzeniu obejmuje antygeny (np. białka) których ogólne struktury są pokrewne, jak również antygeny (np. białka) które łączy jeden lub więcej regionów strukturalnie pokrewnych, a które nie są pod innymi względami pokrewne. Zatem „różne lecz strukturalnie pokrewne” antygeny mogą być na przykład dwoma białkami należącymi do tej samej rodziny białek, charakteryzującymi się wspólną ogólną strukturą lub mogą być na przykład dwoma białkami których ogólna struktura nie jest do siebie podobna (nie jest pokrewna) lecz oba posiadają pokrewne strukturalnie domeny.
Do wytworzenia przeciwciał według wynalazku można zastosować różne rodzaje antygenów i róż ne sposoby otrzymywania przeciwcia ł , w celu uzyskania przeciwciał a o podwójnej specyficznoś ci, tak jak przedyskutowano to w szczegółach poniżej.
I. Przeciwciała o podwójnej specyficzności
W celu wytworzenia przeciwciała o podwójnej specyficznoś ci według wynalazku, wytwarza się przeciwciała skierowane przeciw antygenowi zdolnemu do wytworzenia przeciwciał o podwójnej specyficzności. Takie antygeny określa się dalej zasadniczo jako antygeny o podwójnej specyficzności. Można zastosować różne rodzaje antygenów o podwójnej specyficzności, a projektowanie różnych rodzajów antygenów o podwójnej specyficzności przedstawiono poniżej.
A. Przylegające topologiczne obszary identyczności
W konkretnej postaci antygen o podwójnej specyficzności obejmuje przylegający topologiczne obszar identyczności i/lub podobieństwa pomiędzy dwiema różnymi lecz strukturalnie pokrewnymi cząsteczkami, dla których powstaje przeciwciało o podwójnej specyficzności. Korzystnie wspomniany antygen obejmuje największy (np. najdłuższy) przylegający topologiczny obszar identyczności i/lub podobieństwa pomiędzy dwiema różnymi lecz strukturalnie pokrewnymi cząsteczkami. Korzystnie wspomniane dwie różne lecz strukturalnie pokrewne cząsteczki są białkami i antygen o podwójnej specyficzności obejmuje liniowy peptyd odpowiadający największemu (np. najdłuższemu) przylegającemu topologicznemu obszarowi identyczności i/lub podobieństwa obu wspomnianych białek. Użyteczny region identyczności/podobieństwa jest korzystnie regionem wiązania receptora lub ligandu, choć stosować można także inne regiony identyczności/podobieństwa.
W celu określenia przylegających topologicznych obszarów identyczności pomiędzy dwiema cząsteczkami (np. białkami), te dwie cząsteczki są porównywane (np. poprzez modelowanie homologiczne, porównywanie informacji strukturalnych lub uliniowienie sekwencji) i w ten sposób identyfikowane są regiony identyczne lub podobne. W przypadku białek, można zastosować algorytm porównywania w celu stworzenia optymalnego uliniowienia i zidentyfikowania największego (np. najdłuższego) przylegającego topologicznego obszaru identyczności i/lub podobieństwa pomiędzy dwoma białkami. Korzystnym, nie ograniczającym przykładem algorytmu matematycznego stosowanego do porównywania dwu sekwencji jest algorytm podany przez Karlina i Altschula (1990) PNAS 87: 2264-68, zmodyfikowany przez Karlina i Altschula (1993) PNAS 90: 5873-77. Algorytm taki stanowi część programów NBLAST i XBLAST Altschula i wsp (1990) J Mol Biol 215: 403-10. W celu uzyskania uliniowienia sekwencji z lukami do celów porównawczych, można stosować program Gapped BLAST, tak jak opisał to Altschul i wsp (1997) NAR 25(17): 3389-3402. Gdy stosuje się programy BLAST
PL 208 069 B1 i Gapped BLAST moż na stosować domyślne parametry odpowiednich programów (np. XBLAST i NBLAST). Por: http://www.ncbi.nml.nih.gov. Alternatywnym algorytmem matematycznym który moż na zastosować w tym samym celu jest program ALIGN podany przez Myersa i Millera (1988) Comput Appl Biosci 4: 11-17.
Gdy użyteczny region identyczności/podobieństwa zostanie wybrany, można następnie zsyntezować chemicznie antygen o podwójnej specyficzności odpowiadający wybranemu obszarowi. Na przykład w przypadku antygenów peptydowych peptyd może być zsyntezowany standardowymi sposobami syntezy peptydów. Antygen peptydowy może obejmować L aminokwasy. W innej postaci antygen peptydowy może w całości lub części składać się z D aminokwasów. Przykład projektowania antygenu o podwójnej specyficzności opartego na przylegającym topologicznym obszarze identyczności i/lub podobieństwa pomiędzy dwoma różnymi lecz strukturalnie pokrewnymi białkami opisany jest w szczegółach w przykładzie 1.
B. Peptydy cykliczne naśladujące pętlę strukturalną
Antygen o podwójnej specyficzności według wynalazku może obejmować cząsteczkę cykliczną, korzystnie peptyd cykliczny, naśladujący strukturalnie kluczową pętlę obszaru fałdowania dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek (np. białek) dla którego wytwarzane jest specyficzne przeciwciało. W celu otrzymania wspomnianego antygenu porównywane są struktury dwu pokrewnych cząsteczek i wyszukiwana jest identyczna strukturalnie pętla fałdowania, obecna w obu cząsteczkach. W celu zidentyfikowania wspomnianych pę tli i wspólnych strukturalnie obszarów fał dowania moż na stosować standardowe techniki modelowania i analizy krystalograficznej. Identyczne lub podobne regiony (np. sekwencje aminokwasowe wspólne dla obu cząsteczek) mogą zostać zidentyfikowane, a następnie można wyprowadzić sekwencję konsensusową dla regionów podobnych lecz nie identycznych. Cząsteczka liniowa (np. liniowy peptyd) projektowana jest w oparciu o wykryte podobieństwa i regiony identyczne a następnie wspomniana cząsteczka liniowa może być cyklizowana, w znany chemikom sposób, tak by stała się antygenem naśladującym tę kluczową pętlę. Na przykład na końcu liniowego peptydu można dodać prolinę i glicynę w celu umożliwienia cyklizacji peptydu. Przykład projektowania antygenu o podwójnej specyficzności w postaci peptydu cyklicznego naśladującego pętlę wspólną strukturalnie dla obu różnych lecz pokrewnych białek podaje Przykład 2.
C. Cząsteczki hybrydowe
Przeciwciało o podwójnej specyficzności według wynalazku może też obejmować cząsteczkę hybrydową, korzystnie peptyd hybrydowy, obejmujący ułożone na przemian lub pokrywające się części dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek (np. białek) dla których wytwarza się przeciwciała o podwójnej specyficzności. W celu wytworzenia tego typu antygenu, struktury dwu wspomnianych cząsteczek są najpierw porównywane, i identyfikowane są regiony pokrywające się (regiony identyczności), jak również regiony nieidentyczne obu cząsteczek. Następnie przygotowywana jest cząsteczka hybrydowa (np. peptyd hybrydowy, w przypadku gdy obie cząsteczki są białkami) korzystnie obejmująca regiony położone na przemian (np. sekwencje aminokwasowe) z każdej z dwu cząsteczek, jak również regiony pokrywające się, wspólne dla obu cząsteczek. Schematycznie wspomnianą cząsteczkę hybrydową można przedstawić następująco: X-Y-Z, gdzie Y przestawia region identyczności lub dużego podobieństwa dla obu pokrewnych cząsteczek (region pokrywający się), X przedstawia region z jednej z wspomnianych cząsteczek, a Z przedstawia region z drugiej z wspomnianych cząsteczek. Przykład projektowania antygenu o podwójnej specyficzności opartego na peptydzie hybrydowym obejmującym sekwencje dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych białek opisany jest szczegółowo w Przykładzie 3.
Inny rodzaj cząsteczki hybrydowej jest cząsteczką, w której peptyd został wprowadzony do białka o pełnej długości (dalej określanego jako białko docelowe). Peptydy wybrane są tak, by odpowiadały regionom funkcjonalnym dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych białek, na przykład, regionom oddziałującym z receptorem. Takie peptydy określane są dalej jako peptydy funkcjonalne. Funkcjonalny peptyd z jednego z pokrewnych białek może być następnie wprowadzony do innego, pokrewnego białka o pełnej długości, lub alternatywnie, do białka niepokrewnego. Na przykład peptyd IL-Ια odpowiadający regionowi oddziałującemu z receptorem IL-1a jest identyfikowany, i ten funkcjonalny peptyd
IL-1 α wprowadzany jest do białka o pełnej długości IL-1 β, w celu stworzenia białka hybrydowego IL-1a/lL-1e. Podobnie peptyd IL-1 β odpowiadający regionowi oddziałującemu z receptorem IL-1 β jest identyfikowany, i ten funkcjonalny peptyd IL-1e wprowadzany jest do białka o pełnej długości IL-1a, w celu stworzenia białka hybrydowego IL-1a/IL-1e. Wspomniane wprowadzenie funkcjonalnego peptydu do pokrewnego białka pełnej długości ogranicza peptyd funkcjonalny z obu końców i zachowuje strukturę fałdowania funkcjonalnego peptydu.
PL 208 069 B1
W przypadku cząsteczki hybrydowej IL-1 α/lL-l β peptyd funkcjonalny wprowadzany jest (zastępuje naturalne aminokwasy) w regionie docelowym odpowiadającej wspólnej strukturze przestrzennej IL-1 α i IL-1(< Wspomniane struktury można odszukać na całej długości białka (np. w regionie N-końcowym, w części środkowej i regionie C-końcowym). Ponadto funkcjonalne peptydy odpowiadające odpowiadającej wspólnej strukturze przestrzennej IL-WlL-^ można wprowadzić również do innych białek, takich jak albumina i niektórych innych naturalnie występujących białek. W takim przypadku korzystne miejsce wprowadzenia peptydu to region umożliwiający utrzymanie przez wprowadzany peptyd poprawnej struktury przestrzennej. Zatem miejsca wprowadzania peptydu mogą być regionem N-końcowym, regionem środkowym lub regionem C-końcowym białka. Miejsce wprowadzenia wspomnianych peptydów do naturalnie występującego białka docelowego dobrane jest tak, by naśladowało naturalne ograniczenia strukturalne, właściwe dla naturalnego białka z którego pochodzą wspomniane peptydy. Choć funkcjonalny peptyd może być po prostu wprowadzony do białka docelowego w taki sposób, że aminokwasy funkcjonalnego peptydu dodawane są do białka docelowego, to korzystnie aminokwasy funkcjonalnego peptydu zastępują część białka docelowego, do którego jest on wprowadzony.
Cząsteczka hybrydowa stosowana jest jako antygen o podwójnej specyficzności w celu wytworzenia przeciwciała o podwójnej specyficzności wobec IL-1a i IL-1 β, może być konstruowana tak, że funkcjonalny peptyd odpowiadający specyficznemu elementowi strukturalnemu albo IL-1a, albo IL-1 β wprowadzany jest do pełnej długości IL-1 β albo IL-1a w równoważnej pozycji strukturalnej. Wybrana cząsteczka hybrydowa zastępuje reszty 160-176 IL-1 β resztami 168-184 IL-1a. Powstająca cząsteczka ma następującą sekwencję aminokwasową, w której zastąpiona sekwencja IL-1a (reszty 168-184) jest podkreślona: APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMGAYKSSKD DAKITVILGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYI STSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS (Sek Id Nr 4)
Wspomnianą cząsteczkę można wytworzyć standardowymi metodami biologii molekularnej (np. klonowaniem, techniką PCR) stosując dostępne ogólnie sekwencje cDNA IL-1a i IL-1 β, i stosując techniki ekspresji rekombinowanego białka. Hybrydowy cDNA można uzyskać, wprowadzając cDNA do użytecznego wektora ekspresyjnego i eksprymując następnie polipeptyd przez wprowadzenie wektora ekspresyjnego do użytecznej komórki gospodarza.
D. Peptydy oparte na technice wykresów hydrofobowości
Antygen o podwójnej specyficzności można wybrać wybrany w oparciu o technikę wykresów hydrofobowości i wyboru peptydów z założenia wysoce antygenowych. Na przykład indeks antygenowości peptydów można wyliczyć posługując się programem przygotowanym przez Jamesona i Wolfa (CABIOS 4(1): 181-186, 1988). Regiony użyteczne do wiązania przeciwciał można wybrać maksymalizując tym samym prawdopodobieństwo antygenowości.
E. Immunizacja z wykorzystaniem komórek transfekowanych antygenem
Przeciwciało o podwójnej specyficzności może być otrzymywane przez immunizację komórkami transfekowanymi antygenem, (to jest antygeny o podwójnej specyficzności według wynalazku mogą być komórkami transfekowanymi antygenem). Można utworzyć linię komórkową która stabilnie eksprymuje dwa różne lecz strukturalnie pokrewne antygeny, lub cząsteczkę hybrydową. Można otrzymać na przykład linie komórkowe które stabilnie eksprymują IL-1a lub IL-1 β lub cząsteczkę hybrydową IL-1 a/lL-1 β (np. Sek Id Nr 4). Pożądane cząsteczki mogą być wydzielane z wspomnianych komórek (w przypadku białek rozpuszczalnych) lub mogą być wyrażane na powierzchni komórek (w przypadku receptorów czy enzymów). Dostarczenie genu do komórki gospodarza w celu umożliwienia ekspresji antygenu przez komórkę gospodarza można osiągnąć na wiele sposobów, włączając w to w sposób nieograniczający transfekcję, elektroporację, fuzję komórkową, lipofekcję, technikę bombardowania cząsteczkowego, mikroiniekcję lub infekcję wirusową). Linie komórkowe stabilnie eksprymującą antygen można przeszczepić na różne sposoby (dootrzewnowo, podskórnie, domięśniowo, lub podobnie) do organizmu pożądanego zwierzęcia w celu wytworzenia przeciwciał. Komórki mogą stanowić źródło wolno uwalnianego antygenu. Korzystnie komórki eksprymują białko o pełnej długości. Można jednak także eksprymować antygenowe fragmenty. W przypadku białek rozpuszczalnych, białka korzystnie są wydzielane z komórek. W celu wytworzenia przeciwciał o podwójnej specyficzności wobec pozakomórkowych domen dwu blisko pokrewnych receptorów, receptory powinny preferencyjnie ulegać ekspresji na powierzchni komórki.
PL 208 069 B1
F. Immunizacja jedną ze strukturalnie pokrewnych cząsteczek
Antygen o podwójnej specyficzności może być po prostu jedną z dwu różnych, lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek, dla którego wytwarzane są przeciwciała o podwójnej specyficzności. Jedna z dwu pokrewnych cząsteczek stosowana jest jako czynnik immunizacyjny i następnie wytworzony repertuar przeciwciał przeszukiwany jest pod kątem przeciwciał wiążących, i bardziej korzystnie neutralizujących, oba z dwu różnych, lecz pokrewnych strukturalnie cząsteczek. Na przykład można immunizować albo IL-1a albo IL-1 β i następnie poszukiwać przeciwciał wiążących α/β, i bardziej korzystnie, przeciwciał neutralizujących α/β. Termin „immunizacja” oznacza tu wystawienie repertuaru przeciwciał na antygen, taki jak IL-1a albo IL-1 β, in vivo albo in vitro. Zatem postać ta obejmuje immunizowanie zwierzęcia albo IL-1a albo IL-1 β i przeszukiwanie powstających przeciwciał w celu wyselekcjonowania przeciwciał wiążących zarówno IL-1a jak i IL-1 β, jak również przeszukiwanie rekombinowanej biblioteki przeciwciał in vitro z pomocą IL-1a albo IL-1 β i następnie selekcjonowanie rekombinowanych przeciwciał wiążących zarówno IL-1a jak i IL-1 β.
II. Sposoby tworzenia przeciwciał o podwójnej specyficzności
W celu wytworzenia przeciwciała o podwójnej specyficzności według wynalazku repertuar przeciwciał (in vivo lub in vitro) eksponowany jest na antygen o podwójnej specyficzności, otrzymany jak podano powyżej, i użyteczne przeciwciało o podwójnej specyficzności wybierane jest z wspomnianego repertuaru. Rozpoznawanie antygenu składa się z dwu elementów: rozpoznawania strukturalnego i dojrzewania powinowactwa w oparciu o specyficzne oddziaływania cząsteczkowe. W czasie naturalnej odpowiedzi immunologicznej, przeciwciała o niskim powinowactwie rozpoznające motywy strukturalne (np. rozpoznawanie antygenu przez receptory rozpoznające określone wzory strukturalne) powstają łatwo i na wczesnych etapach odpowiedzi immunologicznej, a następnie w wyniku mutacji somatycznych następuje zwiększenie powinowactwa niektórych klonów. Zaprojektowano różnorodne procesy in vivo i in vitro naśladujące to naturalne zjawisko. Przeciwciała o podwójnej specyficzności i niskim powinowactwie można tworzyć zarówno in vivo, jak i in vitro sposobami opisanymi powyżej, a przeciwciała monoklonalne o podwójnej specyficzności i wysokim powinowactwie można otrzymać drogą opisanej tu mutagenezy somatycznej. Ponadto w celu optymalizowania monoklonalnych przeciwciał o podwójnej, wysokiej specyficzności/podwójnej specyficzności i wysokim powinowactwie, można analizować struktury wykrystalizowanych wspólnie przeciwciał monoklonalnych z użytecznymi antygenami. Uzyskana w ten sposób informacja strukturalna może zostać następnie wykorzystana do wzmocnienia powinowactwa w wyniku zmiany (zmutowania) reszt przeciwciał monoklonalnych oddziałujących specyficznie z antygenem w celu wzmocnienia specyficznych oddziaływań cząsteczek, w sposób opisany.
Sposoby wytworzenia przeciwciał o podwójnej specyficzności z zastosowaniem sposobów in vivo, in vitro, lub połączenia obu sposobów, opisane są poniżej.
A. Sposoby in vivo
Standardowe sposoby in vivo otrzymywania przeciwciał obejmują immunizowanie użytecznego zwierzęcia antygenem i tym samym eksponowanie repertuaru przeciwciał in vivo na antygen, a następnie odzyskiwanie konkretnego przeciwciała lub przeciwciał z organizmu zwierzęcia. Sposób taki można zaadoptować do otrzymywania przeciwciał o podwójnej specyficzności, przez zastosowanie antygenu o podwójnej specyficzności a następnie selekcjonowanie przeciwciał pod kątem specyficznego rozpoznawania przez nie strukturalnie pokrewnych cząsteczek. Przeciwciała o podwójnej specyficzności można uzyskać immunizując użyteczne zwierzę (np. mysz, królika lub kozę lub innego ssaka, włączając w to ssaki transgeniczne lub nokautowane) immunogenną kompozycją antygenu o podwójnej specyficzności. Użyteczna immunogenna kompozycja może obejmować, na przykład, zsyntezowany chemicznie lub rekombinacyjnie eksprymowany antygen o podwójnej specyficzności. Kompozycja może ponadto obejmować adiuwant, taki jak kompletny lub niekompletny adiuwant Freunda, lub podobny składnik immunostymulujący. Ponadto, do wytworzenia przeciwciał, w szczególności techniką immunizacji in vivo stosuje się antygen o podwójnej specyficzności według wynalazku, osobno lub bardziej korzystnie jako koniugat z białkiem nośnikowym. Tego typu sposób stosowany do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej jest dobrze znany specjalistom. Przykłady użytecznych białek nośnikowych z którymi można połączyć antygen o podwójnej specyficzności obejmują hemocyjaninę KLH i albuminę.
Komórki wytwarzające przeciwciało można uzyskać ze zwierzęcia i stosować następnie do otrzymania przeciwciał monoklonalnych standardowymi technikami, takimi jak technika hybrydom opisana pierwotnie przez Kohlera i Milsteina (1975, Nature, 256: 495-497) (por. także Brown i wsp
PL 208 069 B1 (1981) J Immunol 127: 539-46; Brown i wsp (1980) J Biol Chem 255: 4980-83; Yeh i wsp (1976) PNAS 76: 2927-31; Yeh i wsp (1982) Int J Cancer 29: 269-75). Technologia wytwarzania przeciwciał monoklonalnych z wykorzystaniem hybrydom jest dobrze znana (patrz: RH Kenneth, Monoclonal antibodies: A new dimension in biological analyses, Plenum Publ Corp, NY (1980); EA Lerner (1981) Yale J Biol Med 54: 387-402; ML Grefter (1977) Somatic Cell Genet 3: 231-36). W skrócie: unieśmiertelniona linia komórkowa (zazwyczaj komórek szpiczaka) poddawana jest fuzji z limfocytami (grasicowymi lub z węzłów chłonnych lub obwodowymi) ze zwierzęcia immunizowanego antygenem o podwójnej specyficzności, jak opisano to powyżej, a następnie supernatant z hodowli komórkowej wytworzonych hybrydom przeszukiwany jest pod kątem występowania przeciwciał o podwójnej specyficzności, do dwu różnych ale strukturalnie pokrewnych cząsteczek, w celu wykrycia produkujących je hybrydom. W celu połączenia limfocytów i unieś miertelnionej linii komórkowej można zastosować dowolny protokół eksperymentalny, prowadzący do wytworzenia hybrydom produkujących przeciwciała monoklonalne o podwójnej specyficzności, (patrz np. G Galfre i wsp (1977) Nature 266: 550-52; Gefter i wsp. Somatic Cell Genet, op. cit.; Lerner Yale J Biol Med op. cit.; Kenneth, Monoclonal Antibodies, op. cit.). Ponadto specjaliście znane są użyteczne odmiany opisanych wyżej sposobów. Zazwyczaj unieśmiertelniona linia komórkowa (np. linia komórek szpiczaka) pochodzi z tego samego rodzaju zwierzęcia, z którego pochodzą limfocyty. Na przykład mysie hybrydomy można wytworzyć poprzez fuzję limfocytów z myszy immunizowanych kompozycją według wynalazku, z unieśmiertelnioną linią komórek mysich. Korzystna unieśmiertelniona linia komórek mysich to mysie komórki szpiczaka, wrażliwe na obecność w podłożu hodowlanym hipoksantyny, aminopteryny i tymidyny (podłoże HAT). Można zastosować dowolną linię komórek szpiczaka w procesie fuzji z wykorzystaniem standardowych sposobów (np. z wykorzystaniem linii P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 lub Sp2/O-Ag14). Wspomniane linie komórek szpiczaka można uzyskać z American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD. Zazwyczaj mysie komórki szpiczaka wrażliwe na podłoże HAT poddawane są fuzji z mysimi komórkami grasicowymi z wykorzystaniem glikolu polietylenowego (PEG). Powstające hybrydomy selekcjonowane są na podłożu HAT, w którym giną komórki które nie uległy połączeniu lub uległy niewłaściwemu połączeniu komórki szpiczaka (komórki grasicowe giną po kilku dniach, ponieważ nie uległy transformacji). Komórki hybrydom wytwarzające przeciwciała monoklonalne specyficznie rozpoznające dwie strukturalnie pokrewne pożądane cząsteczki według wynalazku można zidentyfikować przeszukując supernatant z hodowli komórek hybrydom pod kątem wytwarzania takich przeciwciał stosując np. standardowy test ELISA, w celu wyselekcjonowania przeciwciał specyficznie wiążących dwie pokrewne cząsteczki.
W zależności od rodzaju pożądanego przeciwciała do immunizacji in vivo można stosować różne organizmy zwierzęce. Można stosować organizm zwierzęcy, który sam z siebie wytwarza endogenną wersję pożądanego(-ych) antygenu(-ów) lub alternatywnie, gospodarz może być pozbawiony zdolności wytwarzania endogennej wersji pożądanego(-ych) antygenu(-ów). Na przykład wykazano, że myszy nie wytwarzające niektórych endogennych białek (myszy nokautowane, np. w wyniku rekombinacji homologicznej wygaszającej aktywność genu endogennego) rozwijają odporność humoralną na wspomniane, po immunizacji wspomnianym białkiem i mogą być zatem wykorzystane do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych o wysokim powinowactwie skierowanych przeciw wspomnianemu białku (por. np. Roes J i wsp (1995) J Immunol Methods 183, 231-237; Lunn MP i wsp (2000) J Neurochem 75, 404-412).
Dla wytwarzania przeciwciał innych niż ludzkie (np. skierowanych przeciw ludzkiemu antygenowi o podwójnej specyficzności), można stosować wiele różnych organizmów ssaków innych niż ludzie, jako użytecznych gospodarzy do wytwarzania przeciwciała, włączając w to w sposób nieograniczający myszy, szczury, króliki i kozy (lub wersje nokautowe wspomnianych organizmów), jakkolwiek myszy są organizmami preferowanymi w przypadku wytwarzania hybrydom. Ponadto dla wytwarzania całkowicie ludzkich przeciwciał skierowanych przeciw ludzkiemu antygenowi o podwójnej specyficzności można wykorzystać większość zwierząt, które eksprymują ludzki repertuar przeciwciał, włączając w to zwierzęta transgeniczne (np. myszy) transgenizowane ludzką immunoglobuliną, myszy chimerowe huPBMC-SCID oraz ludzko-mysie chimery radiacyjne, co zostanie przedyskutowane poniżej.
Zatem w jednej postaci zwierzę immunizowane antygenem o podwójnej specyficzności, jest korzystnie myszą, transgeniczną pod względem genu kodującego ludzką immunoglobulinę, taką iż wytwarza ludzkie przeciwciała po stymulacji antygenem. Do takiego zwierzęcia, najczęściej, wprowadzone są ludzkie geny kodujące lekki i ciężki łańcuch immunoglobulin w konfiguracji płodowej, przy czym endogenne loci tego zwierzęcia kodujące lekki i ciężki łańcuch immunoglobuliny są nieaktywne. Po
PL 208 069 B1 stymulacji antygenem (np. ludzkim antygenem) wytwarzane są przeciwciała pochodzące ze wspomnianych ludzkich sekwencji immunoglobuliny (tzn. ludzkie przeciwciała), i z limfocytów takiego zwierzęcia uzyskać można ludzkie przeciwciała monoklonalne standardowymi technikami otrzymywania hybrydom. Dalszy opis myszy transgenicznej z ludzkim transgenem immunoglobulinowym oraz zastosowanie wspomnianego zwierzęcia do wytwarzania ludzkich przeciwciał można znaleźć np. Patent US Nr 5,939,598, Publikacja PCT Nr WO 96/33735, Publikacja PCT Nr WO 96/34096, Publikacja PCT Nr WO 98/24893, Publikacja PCT Nr WO 99/53049 Abgenix Inc; Patent US Nr 5,545,806, Nr 5,569,825, Nr 5,625,126, Nr 5,633,425, Nr 5,661,016, Nr 5,770,429, Nr 5,814,318, Nr 5,877,397 i Publikacja PCT Nr WO 99/45962 Genopharm Inc, oraz MacQuitty JJ, Kay RM (1992) Science 257: 1188; Taylor LD i wsp (1992) NAR 20: 6287-95; Lonberg N i wsp (1994) Nature 368: 856-59; Lonberg N i Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13: 65-93; Harding FA i Lonberg N (1995) Ann NY Acad Sci 764: 536-46; Fishwild DM i wsp (1996) Nature Biotechnol 14: 845-51; Mendez MJ i wsp (1997) Nature Genet 15: 146-156; Green LL I Jakobovits A (1998) J Exp Med 188: 483-95; Green LL (1999) J Immunol Methods 231: 11-23; Yang XD i wsp (1999) J Leukoc Biol 66: 401-410; Galio ML i wsp (2000) Eur J Immunol 30: 543-40,
Zwierzę immunizowane antygenem o podwójnej specyficzności może być myszą z SCID, rekonstytuowaną z użyciem ludzkich obwodowych komórek jednojądrowych lub komórek limfoidalnych lub ich prekursorów. Wspomniana mysz chimerowa, określana jest skrótem hu-PBMC-SCID, wytwarza ludzkie immunoglobuliny w odpowiedzi na stymulację antygenem. Dla dalszego opisu wspomnianej myszy i wytwarzania przeciwciała por. np.: Leader KA i wsp (1992) Immunology 76: 229-234; Bombil F i wsp (1996) Immunobiol 195: 360-75; Murphy WJ i wsp (1996) Semin Immunol 8: 233-41; Herz U i wsp (1997) Int Arch Allergy Immunol 113: 150-152; Albert SE i wsp. (1997) J Immunol 159: 1393-1403; Nguyen H i wsp (1997) Microbiol Immunol 41: 901-907; Arai K i wsp (1998) J Immunol Methods 217: 79-85; Yoshinari K i Arai K (1998) Hybridoma 17: 41-45; Hutchins WA i wsp (1999) Hybridoma 18: 121-129; Murphy WJ i wsp (1999) Clin Immunol 90: 22-27; Smithson SL i wsp (1999) Mol Immunol 36: 113-124; Charmat S i wsp (1999) J Infect Diseases 180: 268-277; Heard C i wsp (1999) Molec Med 5: 35-45.
Zwierzę immunizowane przy pomocy antygenu o podwójnej specyficzności może być myszą traktowaną letalną dawką promieniowania, a następnie poddaną przeszczepowi komórek szpiku kostnego myszy z SCID, a następnie przeszczepieniu funkcjonalnych ludzkich limfocytów. Ten typ zwierzęcia chimerowego, określany mianem systemu Trimera, stosuje się do wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych przez immunizację wspomnianej myszy pożądanym antygenem a następnie otrzymanie przeciwciał monoklonalnych z zastosowaniem standardowych technik hybrydomy. Dalsze szczegóły można znaleźć np. w: Eren R i wsp (1998) Immunol 93: 154-161; Reisner Y i Dagan S (1998) Trends Biotechnol 16: 242-246; Ilan E i wsp (1999) Hepatology 29: 553-562; Bocher WO i wsp (1999) Immunology 96: 634-641.
B. Sposoby in vitro
Alternatywą do wytwarzania przeciwciał o podwójnej specyficzności w wyniku immunizacji in vivo oraz selekcji, jest przeszukiwanie rekombinowanych bibliotek kombinatoryjnych immunoglobuliny (np. bibliotek fagowych przeciwciał) z wykorzystaniem antygenu o podwójnej specyficzności, w celu wyizolowania składników biblioteki specyficznie wiążących dwie różne, lecz strukturalnie pokrewne pożądane cząsteczki. Zestawy odczynnikowe do tworzenia i przeszukiwania bibliotek fagowych dostępne są handlowo (np. Recombinant Phage Antibody System, Pharmacia Nr Kat 27-9400-01; SurfZAP(tm) Phage Display Kit, Stratagene Nr Kat 240612). W różnych postaciach biblioteka fagowa jest biblioteką scFv lub Fab. Technika fagowa do przeszukiwania bibliotek rekombinowanych przeciwciał opisana jest wyczerpująco w literaturze przedmiotu. Przykłady metod i związków szczególnie użytecznych do tworzenia i przeszukiwania bibliotek przeciwciał można znaleźć np. : McCafferty i wsp Publikacja Międzynarodowa Nr WO 92/01047, Patent US Nr 5,969,108 i EP 589,877 (w szczególności dla bibliotek scFv), Landner i wsp Patent US Nr 5,223,409, Nr 5,403,484, Nr 5,571,698, Nr 5,837,500 i EP 436,597 (przykładowo dla fuzji FpIII); Dower i wsp Publikacja Międzynarodowa Nr WO 91/17271, Patent US Nr 5,427,908, Patent US Nr 5,580,717 i EP 527,839 (w szczególności dla Fab); Winter i wsp Publikacja Międzynarodowa WO 92/20791 i EP 368,684 (w szczególności przedstawienie klonowania regionu zmiennego immunoglobuliny); Griffith i wsp Patent US Nr 5,885,793 i EP 589,877 (opisujące w szczególnoś ci izolowanie ludzkich przeciwciał przeciw ludzkim antygenom z wykorzystaniem rekombinowanych bibliotek); Garrard i wsp Publikacja Międzynarodowa Nr WO 92/09690 (opisująca w szczególności techniki ekspresji w fagach); Knappik i wsp Publikacja Międzynarodowa Nr WO
PL 208 069 B1
97/08320 (opisująca bibliotekę ludzkich rekombinowanych przeciwciał HuCal); Salfeld i wsp Publikacja
Międzynarodowa Nr WO 97/29131 (otrzymanie rekombinowanego ludzkiego przeciwciała skierowanego przeciw ludzkiemu antygenowi (ludzkiemu TNFa), jak również dojrzewanie in vitro powinowactwa rekombinowanego przeciwciała) i Salfeld i wsp US Zgłoszenie Tymczasowe Nr 60/126,603 (opisujące również wytworzenie ludzkiego rekombinowanego przeciwciała skierowanego przeciw ludzkiemu antygenowi (ludzkiej IL-12), jak również dojrzewanie in vitro powinowactwa rekombinowanego przeciwciała).
Inne opisy przeszukiwania biblioteki rekombinowanych przeciwciał można znaleźć w publikacjach naukowych, takich jak: Fuch i wsp (1991) Bio/Technology 9: 1370-72; Hay i wsp (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81-85; Huse i wsp (1992) Science 246: 1275-1281; Griffith i wsp (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins i wsp (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clarkson i wsp (1991) Nature 352: 624628; Gram i wsp (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad i wsp (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom i wsp (1991) NAR 19: 4133-4137; Barbas i wsp (1991) PNAS 88: 7978-7982; McCafferty i wsp (1990) Nature 348: 552-554; Knappik i wsp (2000) J Mol Biol 296, 57-86.
Alternatywą w stosunku do systemu bakteriofagowego jest eksprymowanie biblioteki rekombinowanych przeciwciał na powierzchni komórki drożdżowej lub bakteryjnej. Sposoby uzyskania i przeszukiwania bibliotek przeciwciał eksprymowanych na powierzchni komórki drożdżowej opisane są w Publikacji PCT WO 99/36569. Sposoby uzyskania i przeszukiwania bibliotek przeciwciał eksprymowanych na powierzchni komórki bakteryjnej opisane są w Publikacji PCT WO 98/49286.
Gdy pożądane przeciwciało zostanie zidentyfikowane w obrębie biblioteki kombinatoryjnej, DNA kodujące lekkie i ciężkie łańcuchy przeciwciała izolowane są standardowymi technikami biologii molekularnej, takimi jak amplifikacja techniką PCR z wybranego miejsca biblioteki (np. z faga). Sekwencje nukleotydowe genów lekkiego i ciężkiego łańcucha do których utworzyć można startery PCR są znane specjalistom. Na przykład wiele takich sekwencji zostało ujawnionych w: Kabat EA i wsp (1991) Sequences of proteins of immunological interest, Vth Ed US Dept of Health & Human Services, NIH Publ Nr 91-3242 oraz b bazie danych Vbase ludzkich sekwencji płodowych.
Przeciwciało, lub część przeciwciała, według wynalazku może zostać otrzymana poprzez ekspresję rekombinowanych genów kodujących łańcuch lekki i ciężki immunoglobuliny w komórce gospodarza. W celu rekombinacyjnego eksprymowania przeciwciała, komórka gospodarza transfekowana jest jednym lub większą liczbą rekombinowanych wektorów ekspresyjnych niosących fragmenty DNA kodujące łańcuchy lekki i ciężki przeciwciała, takiego iż łańcuchy lekki i ciężki eksprymowane są w komórce gospodarza, korzystnie, wydzielane są do podłoża hodowlanego w którym wzrasta komórka gospodarza, z którego to podłoża można odzyskać wspomniane przeciwciało. Do otrzymania genów kodujących lekki i ciężki łańcuch przeciwciał, włączenia tych genów do wektora ekspresyjnego i wprowadzenia wspomnianych wektorów do komórki gospodarza można stosować standardowe techniki rekombinowania DNA, takiej jak podane w: Sambrook, Fritsch i Maniatis (wyd) Molecular cloning: a laboratory manual. 2 wyd CSH, NY (1989), Ausubel FM (wyd) Current protocols in molecular biology, Greene Publ Ass (1989) oraz Patent US Nr 4,816,397 (Bross i wsp).
Gdy fragmenty DNA kodujące segmenty VH i VL pożądanego przeciwciała zostaną otrzymane, wspomnianymi fragmentami DNA można dalej manipulować stosując standardowe techniki rekombinowania DNA, na przykład przekształcając region zmienny genów w pełnej długości geny kodujące łańcuch przeciwciała, we fragment Fab czy gen scFv. Przy tych manipulacjach fragmenty DNA kodujące VL i VH są przyłączane w sposób umożliwiający działanie do innych fragmentów DNA kodujących inne białko, takiej jak stały region przeciwciała lub linker. Termin „przyłączane w sposób umożliwiający działanie” tu stosowany wskazuje iż dwa fragmenty DNA łączone są w taki sposób, iż sekwencje aminokwasowe kodowane przez wspomniane dwa fragmenty DNA tworzą ramkę odczytu.
Wyizolowany DNA kodujący region VH może zostać przekształcony w gen kodujący pełnej długości łańcuch ciężki przez połączenie w sposób umożliwiający działanie DNA kodującego region VH, z inną cząsteczką DNA kodującą regiony stałe łańcucha ciężkiego (CH1, CH2 i CH3). Sekwencje genów kodujących ludzkie regiony stałe łańcucha ciężkiego są znane specjalistom (patrz np. Kabat EA (1991) Sequences of proteins of immunological interest, Vth Ed US Dept of Health & Human Services, NIH Publ Nr 91-3242) i fragmenty DNA obejmujące wspomniane regiony można otrzymać stosując standardową technikę PCR. Region stały łańcucha ciężkiego może pochodzić z regionu stałego IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM lub IgD, lecz korzystanie ze stałego regionu IgG1 lub IgG4. W przypadku fragmentu genu Fab łańcucha ciężkiego, DNA kodujący VH może zostać przyłączony w sposób umożliwiający działanie do innej cząsteczki DNA kodującej region stały CH1 łańcucha ciężkiego.
PL 208 069 B1
Wyizolowany DNA kodujący region VL może zostać przekształcony w gen pełnej długości kodujący łańcuch lekki (jak również gen fragmentu Fab łańcucha lekkiego) przez połączenie w sposób umożliwiający działanie fragmentu DNA kodującego VL z inną cząsteczką DNA kodującą region stały CL łańcucha lekkiego. Sekwencje genów regionów stałych łańcucha lekkiego są znane specjalistom (np. Kabat EA (1991) Sequences of proteins of immunological interest, wyd. 5, US Dept of Health & Human Services, NIH Publ Nr 91-3242) i fragmenty DNA obejmujące wspomniane regiony można uzyskać stosując standardowe techniki amplifikacji (PCR). Regiony stałe łańcucha lekkiego mogą być regionami stałymi kappa lub lambda, lecz korzystanie regionem stałym kappa.
W celu skonstruowania genu scFv, fragmenty DNA kodujące VH i VL są łączone w sposób umożliwiający działanie z innym fragmentem kodującym ruchomy linker np. kodującym sekwencje aminokwasową (Gly4-Ser)3, w taki sposób iż sekwencje VH i VL mogą być eksprymowane jako ciągłe, jednołańcuchowe białko, z regionami VL i VH połączonymi ruchomym linkerem (patrz np. Bird i wsp (1988) Science 242: 423-426; Suston i wsp (1988) PNAS 85, 5879-5883; McCafferty i wsp (1990) Nature 348, 552-554).
W celu eksprymowania rekombinowanych przeciwciał lub części przeciwciał według wynalazku, DNA kodujące część sekwencji lub pełnej długości łańcuch ciężki i lekki, uzyskane jak podano wyżej, mogą zostać wprowadzone do wektora ekspresyjnego, takiego by geny połączone były w sposób umożliwiający działanie z sekwencjami regulatorowymi właściwymi dla procesów transkrypcji i translacji. W tym kontekście, termin „połączone w sposób umożliwiający działanie” oznacza, że gen przeciwciała połączony jest z sekwencją wektora w taki sposób że transkrypcyjne i translacyjne sekwencje regulatorowe z wektora służą jako sekwencje regulatorowe transkrypcji i translacji wprowadzonego, wspomnianego genu. Wektor ekspresyjny i wspomniane sekwencje regulatorowe zostały wybrane tak, by były zgodne z komórką gospodarza. Gen kodujący lekki łańcuch przeciwciała i gen kodujący ciężki łańcuch przeciwciała mogą być wprowadzone do oddzielnych wektorów, lub najczęściej, oba wprowadzone są do tego samego wektora ekspresyjnego. Geny przeciwciała wprowadzane są do wektora ekspresyjnego metodami standardowymi (np. poprzez ligację z wykorzystaniem komplementarnych miejsc restrykcyjnych wektora i genu przeciwciała, lub za pomocą ligacji na tępe końce, w przypadku braku użytecznych miejsc restrykcyjnych). Przed wprowadzeniem sekwencji łańcucha ciężkiego i lekkiego, wektor ekspresyjny może nieść sekwencję kodującą region stały przeciwciała. Na przykład jeden sposób przekształcania sekwencji VH i VL w geny przeciwciała pełnej długości, polega na wprowadzeniu wspomnianych sekwencji do wektora ekspresyjnego kodującego odpowiednio region stały łańcucha ciężkiego i region stały łańcucha lekkiego, w taki sposób że segmenty VH przyłączony jest w sposób umożliwiający działanie z segmentem(-ami) CH w obrębie wektora, i segment VL przyłączony jest w sposób umożliwiający działanie z segmentem CL w obrębie wektora. Ponadto lub alternatywnie rekombinowany wektor ekspresyjny może kodować peptyd sygnalny, ułatwiający wydzielanie łańcucha przeciwciała z komórki gospodarza. Gen kodujący łańcuch przeciwciała może być sklonowany w wektorze takim, iż peptyd sygnalny przyłączony jest w ramce odczytu z końcem N genu kodującego łańcuch przeciwciała. Peptyd sygnalny może być peptydem sygnalnym właściwym dla immunoglobulin lub heterologicznym peptydem sygnalnym (to jest peptydem sygnalnym z białka innego niż immunoglobulina).
Oprócz genów kodujących łańcuch przeciwciała, rekombinowane wektory ekspresyjne według wynalazku mogą nieść sekwencje regulatorowe kontrolujące ekspresję genów kodujących łańcuch przeciwciała w komórkach gospodarza. Termin „sekwencje regulatorowe” obejmuje promotory, enhancery i inne elementy regulacyjne kontrolujące ekspresję (np. sygnały poliadenylacji), kontrolujące transkrypcję lub translację genów kodujących łańcuch przeciwciała. Wspomniane sekwencje regulatorowe opisane są na przykład w: Goeddel, Gene expression technology: Methods Enzymol 185, Acad Press, San Diego (1990). Specjaliści wiedzą, iż projektowanie wektora ekspresyjnego obejmującego sekwencje regulatorowe może zależeć od takich czynników jak wybór komórki gospodarza, poziom ekspresji pożądanego białka itp. Korzystne sekwencje regulatorowe właściwe dla komórek ssaczych obejmują wirusowe sekwencje zwiększające poziom ekspresji białka w komórkach ssaczych, takie jak promotory i/lub enhancery pochodzące z CMV (takie jak promotor/enhancer CMV), SV40 (takie jak promotor/enhancer SV40), adenowirusa (np. późny promotor AdMLP) i wirusa poliomy. Dalszy opis elementów regulatorowych pochodzących z wirusów i ich sekwencje znajdują się np. Patent US Nr 5,168,062, Stinski; Patent US Nr 4,510,245, Bell i wsp; Patent US Nr 4,968,615 Schaffner i wsp.
Oprócz genów kodujących łańcuch przeciwciała i sekwencji regulatorowych, rekombinowany wektor ekspresyjny według wynalazku może posiadać sekwencje dodatkowe, takie jak sekwencje
PL 208 069 B1 regulujące replikację wektora w komórce gospodarza (np. ori) i umożliwiające selekcję geny markerowe. Geny markerowe umożliwiające selekcję umożliwiają wybieranie komórek gospodarza do których został wprowadzony wspomniany wektor (por. np. Patent US Nr 4,399,216; 4,634,665; 5,179,017 Axel i wsp). Na przykład typowymi markerami selekcyjnymi są geny nadające komórce gospodarza do której wprowadzony został wektor, oporność na leki typu G418, higromycynę lub metotreksat. Korzystne genomy markerów selekcyjnych obejmują gen DHFR (reduktazy folianowej) (wykorzystywany w komórkach dhfr- w przypadku selekcji/amplifikacji przy użyciu metotreksatu) i gen neo (w przypadku selekcji G418).
W celu ekspresji łańcuchów lekkiego i ciężkiego, wektor(-y) ekspresyjny kodujący łańcuchy lekki i ciężki wprowadzony zostaje poprzez transfekcję do komórki gospodarza technikami standardowymi. Termin „transfekcja obejmuje szeroki zakres technik stosowanych zwykle do wprowadzania egzogennego DNA do prokariotycznych lub eukariotycznych komórek gospodarza np. elektroporację, metodę wapniową, zastosowanie DEAE-dekstranu i podobne sposoby. Choć możliwe jest teoretycznie eksprymowanie przeciwciała według wynalazku zarówno w komórce prokariotycznej, jak i eukariotycznej, korzystne jest eksprymowanie wspomnianego przeciwciała w komórce eukariotycznej, najkorzystniej korzystniej w komórce ssaczej, jest to korzystne z tego względu, iż w konkretnych komórkach eukariotycznych bardziej prawdopodobne w porównaniu z komórką prokariotyczną jest właściwe fałdowanie i wydzielanie białka w postaci biologicznie aktywnej. Ekspresja w komórce prokariotycznej genów kodujących przeciwciało może być nieefektywna gdy konieczne jest wytwarzanie dużych ilości aktywnego przeciwciała (Boss MA i Wood CR (1985) Immunol Today 6: 12-13).
Korzystne komórki ssacze, użyteczne do eksprymowania rekombinowanych przeciwciał według wynalazku to komórki CHO (włączając w to komórki CHO dhfr-, opisane przez Urlauba i Chasina (1980) PNAS 77: 4216-20, wykorzystujące marker selekcyjny DHFR np. tak jak opisano to w artykule RJ Kaufmana i PA Sharpa (1982) Mol Biol 159: 601-621), komórki NS0, komórki COS, komórki SP2. Gdy do komórki ssaczego gospodarza wprowadzony zostanie rekombinowany wektor ekspresyjny obejmujący geny przeciwciała, przeciwciała produkowane są podczas hodowli komórek gospodarza przez czas wystarczająco długi do ekspresji przeciwciała w komórce gospodarza, lub bardziej korzystnie, do wydzielenia przeciwciała do podłoża hodowlanego w którym wzrastają komórki gospodarza. Przeciwciała można odzyskać z pożywki hodowlanej stosując standardowe sposoby oczyszczania białek.
Komórka gospodarza może zostać również wykorzystana do wytwarzania części pełnego przeciwciała, takiego jak fragment Fab czy cząsteczka scFv. Jest zrozumiałe, że w ramach wynalazku można stosować odmiany opisanej wyżej procedury. Na przykład może okazać się pożądane aby transfekować komórkę gospodarza przy pomocy DNA kodującego albo łańcuch lekki, albo ciężki (lecz nie oba naraz) przeciwciała według wynalazku. Można również zastosować technologię rekombinacji DNA do usunięcia części lub całości DNA kodującego albo lekki albo ciężki łańcuch, który nie jest konieczny do wiązania pożądanego antygenu. Cząsteczki białka eksprymowane w oparciu o takie kadłubowe cząsteczki DNA są również przeciwciałami według wynalazku. Ponadto, stosując sprzęganie przeciwciała według wynalazku z drugim przeciwciałem, za pomocą standardowych technik sprzęgania chemicznego, można wytwarzać przeciwciała o podwójnej funkcji w których jeden łańcuch lekki lub jeden ciężki rozpoznają specyficznie antygen inny niż pożądany antygen.
Preferowany układ do rekombinacyjnej ekspresji przeciwciała lub części wiążącej antygen przeciwciała, według wynalazku, to rekombinowany wektor ekspresyjny kodujący zarówno łańcuch lekki, jak i ciężki przeciwciała, wprowadzony do komórek CHO dhfr- metodą transfekcji wapniowej. W obrębie rekombinowanego wektora ekspresyjnego geny kodujące łańcuch lekki i ciężki przeciwciała, przyłączone są w sposób umożliwiający działanie do enhancera CMV/promotora AdMLP w celu uzyskania wysokiej wydajności transkrypcji wspomnianych genów. Rekombinowany wektor ekspresyjny może obejmować również gen DHFR, umożliwiający selekcję i amplifikację komórek CHO transfekowanych wektorem, przy użyciu metotreksatu. Wyselekcjonowane transfektanty hodowane są w celu zapewnienia ekspresji łańcuchów lekkiego i ciężkiego przeciwciała, i odzyskania pełnego przeciwciała z podłoża hodowlanego. Do utworzenia rekombinowanego wektora ekspresyjnego, transfekcji komórek gospodarza, selekcji transfektantów, hodowli komórek gospodarza i odzyskania przeciwciała z podłoża hodowlanego stosowane są standardowe techniki biologii molekularnej. Wynalazek dostarcza ponadto sposobu syntezowania rekombinowanego przeciwciała według wynalazku przez hodowanie komórki gospodarza według wynalazku w użytecznym podłożu hodowlanym, do czasu gdy przeciwciało według wynalazku zostanie wytworzone. Sposób obejmuje ponadto izolowanie rekombinowanego przeciwciała z podłoża hodowlanego.
PL 208 069 B1
Oprócz przeszukiwania rekombinowanych bibliotek fagowych przeciwciała, stosować można inne sposoby znane specjalistom, do przeszukiwania dużych kombinatoryjnych bibliotek w celu identyfikacji przeciwciał o podwójnej specyficzności według wynalazku. Jednym z rodzajów alternatywnego układu ekspresyjnego, jest układ w którym rekombinowana biblioteka przeciwciała powstaje w wyniku ekspresji fuzantów RNA-białko, tak jak opisano to w: Publikacja PCT Nr WO 98/31700 Szostak i Roberts, oraz Roberts RW i Szostak JW (1997) PNAS 94: 12297-12302. We wspomnianym układzie tworzony jest kowalencyjny fuzant końca 3' mRNA i peptydu lub białka, powstającego w wyniku translacji in vitro syntetycznego mRNA kodującego puromycynę, antybiotyk wiążący się w miejscu peptydylowym. W ten sposób można wzbogacić bibliotekę mRNA o specyficzne frakcje (np. z biblioteki kombinatoryjnej) w oparciu o własności kodowanego białka lub peptydu (np. przeciwciała, jego części), takie jak wiązanie się przeciwciała lub jego części z antygenem o podwójnej specyficzności. Sekwencje nukleotydowe kodujące przeciwciało lub jego część można odzyskać w wyniku przeszukiwania wspomnianych bibliotek i eksprymować metodami rekombinacyjnymi jak podano to wyżej (np. w komórkach ssaczego gospodarza) i ponadto można poddać dalszemu dojrzewaniu powinowactwa, przez dodatkową rundę przeszukiwania fuzantów mRNA-peptydylowych, w których wprowadzane są dodatkowe mutacje w stosunku do pierwotnie wybranych sekwencji lub stosując inne sposoby dojrzewania powinowactwa rekombinowanych przeciwciał in vitro, jak opisano to powyżej.
C. Sposoby łączone
Przeciwciała o podwójnej specyficzności można otrzymać stosując połączenie sposobów in vivo i in vitro, takie jak sposoby w których antygen o podwójnej specyficzności oddziałuje z repertuarem przeciwciał in vivo w organizmie zwierzęcia gospodarza w celu stymulowania wytwarzania przeciwciał wiążących antygen o podwójnej specyficzności, ale gdzie dalsze etapy selekcji i/lub dojrzewania przeciwciała (to jest polepszania specyficzności) dokonują się z zastosowaniem jednej lub wielu technik in vitro.
Wspomniane połączenie metod może obejmować początkową immunizację organizmu zwierzęcego (np. myszy, królika, szczura, kozy czy wersji transgenicznej wymienionych organizmów lub myszy chimerowej) przy pomocy antygenu o podwójnej specyficzności w celu wywołania stymulacji odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw wspomnianemu antygenowi, a następnie otrzymanie i poszukiwanie biblioteki fagowej z zastosowaniem sekwencji immunoglobulin z limfocytów stymulowanych in vivo przez wystawienie na działanie antygenu o podwójnej specyficzności. Pierwszy etap wspomnianego połączonego sposobu można przeprowadzić tak, jak podano to w punkcie IIA powyżej, a drugi etap wspomnianego sposobu można przeprowadzić tak, jak podano to w punkcie IIB powyżej. Korzystne sposoby hiperimmunizowania zwierząt oraz przeszukiwanie bibliotek fagowych in vitro uzyskanych ze stymulowanych limfocytów obejmują sposób podane przez BioSite Inc np. w Publikacji PCT WO 98/47343, Publikacji PCT WO 91/17271, Patencie US Nr 5,427,908 i Patencie US Nr 5,580,717.
Połączony sposób może obejmować początkową immunizację organizmu zwierzęcego (np. myszy, królika, szczura, kozy czy wersji nokautowanej i/lub transgenicznej wymienionych organizmów lub myszy chimerowej) przy pomocy antygenu o podwójnej specyficzności w celu wywołania stymulacji odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw wspomnianemu antygenowi, a następnie selekcjonowanie limfocytów wytwarzających przeciwciała o pożądanej podwójnej specyficzności (np. poprzez przeglądanie hybrydom uzyskanych z immunizowanego zwierzęcia). Następnie izoluje się rearanżowane geny przeciwciała z wybranych klonów z zastosowaniem standardowych metod biologii molekularnej, takich jak RT-PCR, i poddaje się je dojrzewaniu powinowactwa in vitro, w celu zwiększenia zdolności do wiązania wyselekcjonowanego przeciwciała lub przeciwciał. Pierwszy etap wspomnianej procedury może zostać przeprowadzony tak, jak opisano to w punkcie IIA powyżej, podczas gdy etap drugi można przeprowadzić tak jak podano to w punkcie IIB powyżej, w szczególności stosując sposób dojrzewania powinowactwa in vitro opisany np. w Publikacji PCT WO 97/29131 i Publikacji PCT WO 00/56772.
W kolejnym sposobie rekombinowane przeciwciała otrzymuje się z pojedynczych, izolowanych limfocytów, stosując procedurę określaną w literaturze przedmiotu jako „selected lymphocyte antibody method” (SLAM), tak jak opisano to w Patencie US Nr 5,627,052, Publikacji PCT WO 92/02551 i Babcock JS i wsp (1996) PNAS 93: 7843-7848. W sposobie tym, zastosowanym w odniesieniu do przeciwciał o podwójnej specyficzności według wynalazku, zwierzę (np. mysz, szczur, królik, koza lub wersja transgeniczna wymienionych zwierząt lub mysz chimerowa) jest najpierw immunizowana in vivo za pomocą antygenu o podwójnej specyficzności w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej wobec wspomnianego antygenu i następnie selekcjonowaniu pojedynczych komórek wydzielających pożą16
PL 208 069 B1 dane przeciwciało np. specyficzne wobec antygenu o podwójnej specyficzności w teście płytkowej hemolizy zależnej od antygenu (np. antygen o podwójnej specyficzności lub strukturalnie pokrewne pożądane cząsteczki, sprzęgane są z owczymi erytrocytami z zastosowaniem linkera, takiego jak biotyna, co umożliwia identyfikację w teście płytkowej hemolizy, pojedynczej komórki wydzielającej przeciwciała o określonej specyficzności). Po zidentyfikowaniu komórek wydzielających pożądane przeciwciało, cDNA kodujące regiony zmienne łańcuchów lekkiego i ciężkiego uzyskiwane jest z komórek w drodze RT-PCR i wspomniane regiony zmienne są następnie eksprymowane, w połączeniu z odpowiednimi regionami stałymi immunoglobuliny (np. ludzkimi regionami stałymi) w komórkach ssaczych takich jak COS lub CHO. Komórki gospodarza transfekowane powielonymi sekwencjami immunoglobuliny, pochodzącymi z wybranych in vivo limfocytów, mogą być dalej analizowane i selekcjonowane in vitro, na przykład izolując spośród transfektantów komórki eksprymujące przeciwciała o podwójnej specyficzności z zastosowaniem płytek pokrytych antygenem. Powielone sekwencje immunoglobuliny mogą być poddawane dalszym manipulacjom in vitro, takim jak dojrzewanie powinowactwa in vitro, opisane powyżej.
Sposób łączony wytwarzania przeciwciała o podwójnej specyficzności może też obejmować następujące etapy. Najpierw zwierzę immunizowane jest w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej, pierwszym antygenem i drugie zwierze immunizowane jest drugim, różnym antygenem, przy czym korzystnie drugi antygen jest strukturalnie podobny do pierwszego antygenu. Następnie konstruowana jest biblioteka rekombinowanych łańcuchów ciężkich i biblioteka rekombinowanych łańcuchów lekkich z wykorzystaniem genów przeciwciał uzyskanych z pierwszego zwierzęcia i drugiego zwierzęcia, tak jak opisano to w punkcie IIB. Biblioteka łańcuchów ciężkich z wspomnianego zwierzęcia immunizowanego pierwszym antygenem, łączona jest z biblioteką łańcuchów lekkich uzyskana z wspomnianego drugiego zwierzęcia immunizowanego drugim antygenem, w celu utworzenia biblioteki antygenów X. Podobnie biblioteka łańcuchów ciężkich z wspomnianego zwierzęcia immunizowanego drugim antygenem, łączona jest z biblioteką łańcuchów lekkich uzyskaną z wspomnianego pierwszego zwierzęcia immunizowanego pierwszym antygenem, w celu utworzenia biblioteki antygenów Y. Dodatkowo biblioteki X i Y mogą być połączone by stworzyć bibliotekę XY. Przeciwciała o podwójnej specyficzności wiążące zarówno pierwszy, jak i drugi antygen można identyfikować i izolować z bibliotek X, Y i/lub XY.
III. Charakterystyka przeciwciał o podwójnej specyficzności
Wynalazek dostarcza sposobu otrzymywania przeciwciał o podwójnej specyficzności, jak również części wspomnianych przeciwciał. Przeciwciała lub ich części mogą być przeciwciałami izolowanymi. Przeciwciała lub ich części mogą być przeciwciałami neutralizującymi. Przeciwciała mogą obejmować przeciwciała monoklonalne i rekombinowane i ich części. Przeciwciała lub ich części mogą obejmować sekwencje aminokwasowe pochodzące całkowicie z pojedynczego gatunku, takie jak przeciwciało całkowicie ludzkie lub całkowicie mysie, lub ich części. Przeciwciało lub jego część może też być przeciwciałem chimerowym lub przeciwciałem chimerowym-CDR lub inną formą przeciwciała humanizowanego.
Termin „przeciwciało” oznacza tu cząsteczki immunoglobulin składające się z czterech łańcuchów polipeptydowych, dwu łańcuchów ciężkich (H) i dwu łańcuchów lekkich (L), połączonych między sobą wiązaniami dwusiarczkowymi. Każdy łańcuch ciężki składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (HCVR lub VH) i regionu stałego łańcucha ciężkiego. Region stały łańcucha ciężkiego składa się z trzech domen CH1, CH2 i CH3. Każdy łańcuch lekki składa się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego (LCVR lub VL) i regionu stałego łańcucha lekkiego. Region stały łańcucha lekkiego składa się z jednej domeny CL. Regiony VH i VL można podzielić na regiony nadzmienne, określane także jako regiony determinujące dopasowanie (complementarity determining regions, CDR), rozrzucone między regionami bardziej konserwatywnymi, określanymi mianem regionów zrębowych (framework regions, FR). Każdy region VH i VL składa się z trzech CDR i czterech FR, ułożonych poczynając od końca N do końca C w następującym porządku: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Termin „część wiążąca antygen” przeciwciała (lub „część przeciwciała”) oznacza jeden lub więcej fragmentów przeciwciała o podwójnej specyficzności, które zachowuje zdolność specyficznego wiązania dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych antygenów. Wykazano, iż funkcja wiązania antygenu przez przeciwciało może być pełniona przez fragmenty przeciwciała pełnej długości. Przykłady fragmentów wiążących objętych terminem „część wiążąca antygen” przeciwciała obejmuje (i) fragment Fab, jednowiążący fragment składający się z domen VL, VH, CL i CH; (ii) fragment F(ab')2 będący fragmentem dwuwiążącym składającym się z dwu fragmentów Fab połączonych mostkiem disiarczkowym w regionie zawiasowym; (iii) fragment Fd składający się z domen VH i CH1; (iv) fragment Fv
PL 208 069 B1 obejmujący domen VL i VH pojedynczego ramienia przeciwciała; (v) fragment dAb składający się z domen VH (Ward i wsp (1989) Nature 341, 544-546); (vi) izolowany region determinują cy dopasowanie (CDR). Ponadto, choć dwie domeny fragmentu Fv (VL i VH) kodowane są przez oddzielne geny, mogą być połączone, z wykorzystaniem technik rekombinacji DNA, z wykorzystaniem syntetycznego linkera, dzięki któremu tworzą one jeden łańcuch polipeptydowy w którym wspomniane regiony VH i VL tworzą jednowiążącą cząsteczkę (pojedynczy łańcuch FV, scFv; por: Bird i wsp (1988) Science 242, 423-426, Huston i wsp (1988) PNAS 85, 5879-5883). Takie przeciwciała jednołańcuchowe również obejmuje wspomniany termin „część wiążąca antygen” przeciwciała. Termin wspomniany obejmuje także inne rodzaje jednołańcuchowych przeciwciał, takie jak „diabodies” (diprzeciwciała). Diprzeciwciała to dwuwiążące, dwuspecyficzne przeciwciała w których domeny VH i VL eksprymowane są jako pojedynczy łańcuch, z wykorzystaniem linkera, który jest jednak zbyt krótki by możliwe było parowanie dwu domen tego samego łańcucha, co wymusza parowanie komplementarnych domen innego łańcucha i utworzenie tym samym dwu miejsc wiązania antygenu (patrz Holliger P i wsp. (1993) PNAS 90, 6444-6448; Poljak RJ i wsp (1994) Structure 2: 1121-1123).
Ponadto przeciwciało lub część wiążąca przeciwciała może być częścią większej cząsteczki immunoadhezyjnej, utworzonej w wyniku kowalencyjnego lub niekowalencyjnego połączenia przeciwciała lub części przeciwciała z jednym lub więcej białkami lub peptydami. Przykłady wspomnianych cząsteczek immunoadhezyjnych obejmują zastosowanie regionu rdzeniowego streptoawidyny w celu otrzymania cząsteczki tetramerowej scFv (Kipriyanow SM i wsp (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101) i zastosowanie reszt cystynowych, peptydu markerowego i metki histydynowej na końcu C w celu otrzymania dwuwiążących i biotynylowanych cząsteczek scFv (Kipriyanow SM i wsp (1994) Mol Immunol 31, 1047-1058). Części przeciwciała, takie jak Fab i części F(ab')2 można otrzymać z pełnych przeciwciał stosując konwencjonalne techniki, takie jak trawienie papainą lub pepsyną całych przeciwciał. Ponadto przeciwciała, części przeciwciała i cząsteczki immunoadhezyjne można otrzymać standardowymi technikami rekombinacji DNA.
Termin „izolowane przeciwciało o podwójnej specyficzności” oznacza tu przeciwciało o podwójnej specyficzności zasadniczo wolne od innych przeciwciał posiadających specyficzność wobec innych antygenów (np. izolowane przeciwciało specyficznie wiążące dwa różne lecz strukturalnie pokrewne antygeny lub strukturalnie pokrewne regiony w inny sposób nie pokrewnych antygenów, które jest zasadniczo wolne od przeciwciał specyficznie wiążących inne nie pokrewne antygeny). Ponadto izolowane przeciwciało o podwójnej specyficzności może być zasadniczo wolne od innych komórkowych substancji i/lub związków chemicznych.
Termin „przeciwciało neutralizujące” oznacza tu przeciwciało którego połączenie z konkretnym antygenem prowadzi do zahamowania biologicznej aktywności antygenu. Zahamowanie biologicznej aktywności antygenu można oceniać mierząc jeden lub więcej wskaźników biologicznej aktywności antygenu z wykorzystaniem użytecznego testu in vivo lub in vitro.
Termin „przeciwciało monoklinalne”: oznacza tu przeciwciało otrzymane z hybrydomy (np. przeciwciało wydzielane przez hybrydomy uzyskane w technologii hybrydom, takiej jak standardowa technika wytwarzania hybrydom Kohlera i Milsteina). Zatem przeciwciało według wynalazku o podwójnej specyficzności uzyskane z hybrydomy określane jest mianem przeciwciała monoklonalnego, pomimo że rozpoznaje więcej niż jeden pojedynczy antygen.
Termin „przeciwciało rekombinowane” oznacza przeciwciała otrzymane, eksprymowane, utworzone lub izolowane technikami rekombinacyjnymi, takimi jak system ekspresji przeciwciał wykorzystujący wektor ekspresyjny wprowadzony techniką transfekcji do komórki gospodarza, przeciwciała izolowane z biblioteki kombinatoryjnej rekombinowanych przeciwciał, przeciwciała izolowane ze zwierzęcia (np. myszy) transgenicznego pod względem ludzkich genów immunoglobulin (por. np. Taylor LD i wsp (1992) NAR 20: 6287-95) lub przeciwciał a otrzymane, eksprymowane lub wytworzone innymi sposobami obejmującymi składanie konkretnych genów immunoglobuliny (takie jak sekwencje ludzkiego genu immunoglobuliny) z innymi sekwencjami DNA. Przykłady rekombinowanych przeciwciał obejmują przeciwciała chimerowe, chimery CDR i przeciwciała humanizowane.
Termin „przeciwciało ludzkie” oznacza przeciwciała posiadające regiony stały i zmienny odpowiadające, lub pochodzące z ludzkich płodowych sekwencji immunoglobulinowych, tak jak podano to np. w: Kabat i wsp (patrz: Kabat i wsp (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interests, Vth Ed. US Dept of Health and Human Services, NIH Publ no. 91-3242). Przeciwciała ludzkie według wynalazku mogą także obejmować reszty aminokwasowe nie obecne w ludzkich sekwencjach płodowych genów immunoglobulin (np. w postaci mutacji wprowadzonych w miejsca przypadkowe lub
PL 208 069 B1 z wykorzystaniem mutagenezy kierowanej in vitro lub mutacji somatycznych in vivo) na przykład w regionach CDR lub w szczególności w regionie CDR3.
Rekombinowane przeciwciała ludzkie według wynalazku posiadają regiony zmienne i mogą ponadto obejmować regiony stałe, pochodzące z płodowych ludzkich sekwencji immunoglobulinowych (por: Kabat i wsp (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interests, Vth Ed. US Dept of Health and Human Services, NIH Publ no. 91-3242). Rekombinowane ludzkie przeciwciała mogą być poddawane mutagenezie in vitro (lub gdy stosuje się zwierzę transgeniczne pod względem ludzkich sekwencji Ig, mutagenezie somatycznej in vivo), a zatem sekwencje aminokwasowe regionów VH i VL rekombinowanych przeciwciał są sekwencjami pochodzącymi z ludzkich płodowych sekwencji VH i VL, które mogą nie występować naturalnie w płodowym repertuarze ludzkich przeciwciał in vitro. W konkretnych postaciach wspomniane rekombinowane przeciwciał a tworzone są w wyniku selektywnej mutagenezy, mutagenezy powrotnej lub obu sposobów.
Termin „mutacja powrotna odnosi się do procesu w którym niektóre lub wszystkie aminokwasy zmutowane somatycznie przeciwciała ludzkiego zastąpione zostają odpowiednimi resztami z homologicznej sekwencji płodowej przeciwciała. Sekwencje łańcucha lekkiego i ciężkiego ludzkiego przeciwciała według wynalazku są uliniowione z sekwencjami płodowymi obecnymi w bazie danych VBASE w celu zidentyfikowania sekwencji o najwyższej homologii. Różnice w sekwencji ludzkiego przeciwciała według wynalazku zostają następnie zmutowane tak, by dawały na powrót sekwencję płodową, poprzez mutowanie konkretnych pozycji nukleotydowych odpowiadających wspomnianym resztom aminokwasowym. Rola odgrywana w wiązaniu pośrednim lub bezpośrednim antygenu przez poszczególne reszty aminokwasowe, zidentyfikowane jako reszty kandydujące do mutagenezy powrotnej, powinna zostać określona i reszty aminokwasowe, o których wiadomo że wpływają na wspomniane wiązanie nie powinny być poddane mutagenezie. W celu zmniejszenia ilości reszt aminokwasowych poddawanych mutagenezie powrotnej, należy zidentyfikować jako cel mutagenezy te reszty aminokwasowe które okazują się być różne przy porównaniu z najbliższą sekwencją płodową lecz identyczne z odpowiednimi resztami aminokwasowymi w drugiej sekwencji płodowej, przy założeniu że druga sekwencja płodowa jest identyczna lub kolinearna z sekwencją ludzkiego przeciwciała według wynalazku na obszarze co najmniej 10, korzystnie 12 aminokwasów, z obu stron badanego aminokwasu. Mutacje powrotne można wprowadzać na dowolnym etapie optymalizacje przeciwciała.
Termin „przeciwciało chimerowe” oznacza przeciwciało obejmujące sekwencje regionu zmiennego lekkiego i ciężkiego przeciwciała z jednego gatunku i sekwencje regionu stałego z innego gatunku, takie jak posiadające regiony zmienne z mysiego łańcucha lekkiego i ciężkiego przyłączone do ludzkiego regionu stałego.
Termin „przeciwciało chimerowe-CDR” oznacza przeciwciała obejmujące sekwencje regionu zmiennego łańcucha lekkiego i ciężkiego z jednego gatunku w obrębie których sekwencje jednego lub więcej regionów CDR VH lub/i VL zostały zastąpione sekwencjami CDR z innego gatunku, takie jak przeciwciała posiadające mysie regiony zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego, w których jeden lub więcej mysich regionów CDR (np. CDR3) zostało zastąpionych ludzkimi sekwencjami CDR.
Termin „przeciwciało humanizowane” odnosi się do przeciwciał obejmujących sekwencje regionu zmiennego łańcucha lekkiego i ciężkiego pochodzące ze zwierzęcia (np. myszy) w których co najmniej część sekwencji VH i/lub VL została zmieniona, tak by przypominała sekwencje ludzką tzn. bardziej przypominała ludzkie sekwencje płodowe regionów zmiennych. Jednym rodzajem przeciwciał humanizowanych są przeciwciała chimerowe-CDR, w których wprowadzono ludzkie sekwencje CDR w obręb zwierzęcych sekwencji VH i VL, zastępując zwierzęce sekwencje CDR.
Jednym ze sposobów pomiaru kinetyki wiązania jest pomiar powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Termin „powierzchniowy rezonans plazmonowy” tu stosowany odnosi się do zjawiska optycznego, umożliwiającego analizę w czasie rzeczywistym oddziaływań biospecyficznych poprzez wykrywanie zmian w stężeniu białek w obrębie macierzy biosensora, na przykład z wykorzystaniem systemu BIAcore (Pharmacia Biosensors AB). Dla dalszych szczegółów por: Jonsson U i wsp (1993) Ann Biol Clin 51: 19-26; Jonsson U i wsp (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson B i wsp (1995) J Mol Recogn 8: 125-131, Johnsson B i wsp (1991) Anal Biochem 198: 268-277.
Termin „Koff” stosowany poniżej oznacza stałą szybkości dysocjacji przeciwciała z kompleksu antygen/przeciwciało.
Termin „Kd” stosowany poniżej oznacza stałą dysocjacji konkretnego kompleksu antygenprzeciwciało.
PL 208 069 B1
Przeciwciała o podwójnej specyficzności otrzymywane sposobem według wynalazku uzyskane są w dowolny opisany sposób uzyskiwania przeciwciał podanych w podsekcji II powyżej. Przeciwciała o podwójnej specyficzności mogą być skierowane przeciw zasadniczo dowolnym, strukturalnie pokrewnym antygenom, choć przeciwciała o podwójnej specyficzności według wynalazku specyficznie wiążą IL-1a i IL-1 β, i można je uzyskać z wykorzystaniem antygenu o podwójnej specyficzności, takiego jaki opisano w przykładach 1-4. Według wynalazku można zastosować inne strukturalnie pokrewne antygeny, obejmujące członków rodziny kaspaz, rodziny cytokin, takich jak członków rodziny IL-1 (np. IL-1/lL-18), członków rodziny TNF (np. TNFα/TNFβ), członków rodziny IL-6, interferony, członków rodziny TGFβ, członków rodziny EGF, członków rodziny FGF, członków rodziny PDGF, członków rodziny VEGF, członków rodziny angiopoetyny, członków rodziny białek morfogenicznych kości, proteinaz pozakomórkowych (metaloproteinaz) i członków rodziny receptorów cytokin, takich jak członków rodziny receptora IL-1, członków rodziny receptora TNF, członków rodziny receptora TGFβ, członków rodziny receptora EGF, członków rodziny receptora FGF, członków rodziny receptora PDGF, członków rodziny receptora VEGF, członków rodziny receptora angiopoetyny.
Przeciwciała o podwójnej specyficzności otrzymywane sposobem według wynalazku mogą wykazywać jednakową zdolność wiązania dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych antygenów, przeciwciała o podwójnej specyficzności otrzymywane sposobem według wynalazku mogą wiązać się preferencyjnie z jednym z dwu wspomnianych antygenów, i nadal posiadać podwójną specyficzność wobec dwu strukturalnie pokrewnych antygenów w porównaniu z antygenami nie pokrewnymi. Aktywność wiązania wspomnianych przeciwciał o podwójnej specyficzności do wspomnianych strukturalnie pokrewnych antygenów, jak również innych nie pokrewnych strukturalnie antygenów, można mierzyć w standardowym teście in vitro, takim jak ELISA lub BIAcore. Korzystnie, stosunek wartości Kd przeciwciała dla strukturalnie nie pokrewnym antygenom do wartości Kd przeciwciała skierowanego przeciw strukturalnie pokrewnym antygenom powinien wynosić co najmniej 3, korzystniej co najmniej 5, bardziej korzystnie 10, jeszcze korzystniej stosunek ten powinien wynosić co najmniej 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 lub 1000.
Różnica pomiędzy wiązaniem niespecyficznym (tworzącym tło) a specyficznym wiązaniem dotyczy poziomu lub stopnia. Na przykład wiązanie niespecyficzne jest na niskim poziomie np. gdy wynosi mniej niż 5%, bardziej korzystnie mniej niż 3%, jeszcze korzystniej około 0,1-1%, podczas gdy specyficzna reaktywność krzyżowa lub podwójna specyficzność jest na wyższym poziomie np. gdy jest większa niż 1%, korzystniej większa niż 3%, jeszcze korzystniej większa niż 5%, i najkorzystniej większa niż 10%. Ponadto wartość IC50 przeciwciała o podwójnej specyficzności wobec docelowego antygenu korzystnie jest bliska wartościom ED50 antygenów w danym bioteście.
Przeciwciało o podwójnej specyficzności lub jego część wiążąca antygen, otrzymywane sposobem według wynalazku jest korzystnie wybrane tak, by miało korzystne wartości kinetyki wiązania (np. wysokie powinowactwo, niską dysocjację, niską wartość Koff, wysoką zdolność neutralizującą) wobec jednego lub korzystnie obu wspomnianych antygenów z którymi wiąże się specyficznie. Na przykład przeciwciało o podwójnej specyficzności lub jego część może wiązać jeden lub korzystniej oba strukturalnie pokrewne antygeny ze stałą Koff o wartości 0.1 s-1 lub niższą, korzystniej ze stałą Koff o wartości 1x10-2 s-1 lub niższą, bardziej korzystnie ze stałą Koff o wartości 1x10-3 s-1 lub niższą, jeszcze korzystniej ze stałą Koff o wartości 1x10-4 s-1 lub niższą, najkorzystniej ze stałą Koff o wartości 1x10-5 s-1 lub niższą, oznaczaną sposobem pomiaru powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Alternatywnie lub dodatkowo przeciwciało o podwójnej specyficzności lub jego część, może hamować aktywność jednego lub korzystnie obu wspomnianych strukturalnie pokrewnych antygenów ze stałą IC50 równą 1x10-6M lub mniejszą, korzystniej ze stałą IC50 równą 1x10-7M lub mniejszą, jeszcze korzystniej ze stałą IC50 równą 1x10-8M lub mniejszą, korzystniej ze stałą IC50 równą 1x10-9M lub mniejszą, jeszcze korzystniej ze stałą IC50 równą 1x10-10M lub mniejszą, najkorzystniej ze stałą IC50 równą 1x10-11M lub mniejszą. Korzystnie stała IC50 powinna być mierzona z zastosowaniem czułego biotestu, w którym wartość stałej IC50 powinna być bliska wartości ED50 dla antygenu stosowanego we wspomnianym teście.
Można sporządzać kompozycje farmaceutyczne obejmujące przeciwciało o podwójnej specyficzności lub część wiążącą antygen wspomnianego przeciwciała, w użytecznym farmaceutycznie nośniku. Kompozycja farmaceutyczna może ponadto obejmować co najmniej jeden dodatkowy czynnik leczniczy np. jeden lub więcej czynników leczniczych do leczenia choroby w której zastosowanie przeciwciała o podwójnej specyficzności jest korzystne. Na przykład, gdy przeciwciało o podwójnej specyficzności wiąże specyficznie IL-1a i IL-1 β, kompozycja farmaceutyczna może obejmować ponadto jeden lub więcej czynników leczniczych do leczenia choroby, w której patogenna jest aktywność IL-1.
PL 208 069 B1
Wspomniane przeciwciało i część wiążąca antygen przeciwciała otrzymywane sposobem według wynalazku może stanowić składnik kompozycji farmaceutycznej użytecznej do podania pacjentowi. Typowo, kompozycja farmaceutyczna obejmuje przeciwciało lub część przeciwciała według wynalazku i farmaceutycznie użyteczny nośnik. Termin „farmaceutycznie użyteczny nośnik” obejmuje dowolny i wszystkie rozpuszczalniki, ośrodki dyspergujące, substancje powlekające, przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, środki izotoniczne i opóźniające absorpcję i podobne, które są zgodne fizjologicznie. Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych nośników obejmują wodę, sól fizjologiczną, sól fizjologiczną buforowaną fosforanami, dekstrozę, glicerol, etanol i podobne środki lub ich kombinacje. W wielu przypadkach korzystne jest włączenie jest do kompozycji czynnika izotonicznego na przykład cukrów, polialkoholi takich jak mannitol, sorbitol, lub chlorku sodu. Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki mogą ponadto obejmować mniejsze ilości substancji pomocniczych, takich jak substancje zwilżające lub środki emulgujące, konserwanty lub bufory, zwiększające termin przydatności do stosowania lub efektywność przeciwciała lub części przeciwciała.
Wspomniane przeciwciała lub części przeciwciała otrzymywane sposobem według wynalazku mogą stanowić część kompozycji farmaceutycznej użytecznej do podawania pozajelitowego. Przeciwciało lub część przeciwciała przygotowana jest jako roztwór do iniekcji obejmujący 0,1-250 mg/ml przeciwciała. Roztwór do wstrzyknięć może obejmować albo płynną albo liofilizowaną postać dawkowaną w fiolce ze szkła flintowego lub bursztynowego, ampułce lub strzykawce. Bufor może być buforem L-histydynowym (1-50 mM), korzystnie 5-10 mM, o pH 5,0-7,0 (korzystnie 6,0). Inne użyteczne bufory obejmują w sposób nieograniczający, bursztynian sodowy, cytrynian sodowy, fosforan sodowy lub fosforan potasowy. Chlorek sodowy można stosować do modyfikowania toksyczności roztworu w stężeniach 0-300 mM (korzystnie 150 mM w przypadku płynnej postaci dawkowanej). Krioprotektanty można dodawać do liofilizowanej postaci dawkowanej, zasadniczo 0-10% sacharozy (korzystnie 0,5-1,0%). Inne użyteczne krioprotektanty obejmują trehalozę i laktozę. Wypełniacze które można włączać do liofilizowanych postaci dawkowanych to zasadniczo 1-10% mannitol (korzystnie 2-4%). Stabilizatory można stosować zarówno w przypadku płynnej i liofilizowanej postaci dawkowanej, zasadniczo 1-50 mM L-metioninę (korzystnie 5-10 mM). Inne użyteczne wypełniacze obejmują glicynę, argininę (0-0,5%), polisorbinian-80 (korzystnie 0,005-0,01%). Dodatkowo dodawać można substancje powierzchniowo czynne, w sposób nieograniczający może to być polisorbinian 20 i BRIJ.
Kompozycja może występować w wielu postaciach. Obejmują one, na przykład, płynną, półstałą lub stałą postać dawkowaną, taką jak roztwory płynne (np. roztwory do infuzji i wstrzyknięć), zawiesiny lub dyspersje, tabletki, pigułki, proszki, liposomy i czopki. Korzystna postać zależy od sposobu podawania i zastosowania leczniczego. Typową kompozycją są roztwory do wstrzyknięć lub infuzji, takie jak kompozycje podobne do tych stosowanych w pasywnym uodparnianiu ludzi innymi przeciwciałami. Korzystny sposób podawania to podawanie pozajelitowe (np. dożylne, podskórne, dootrzewnowe, domięśniowe). Przeciwciało może być podawane w postaci wstrzyknięcia lub infuzji dożylnej. Przeciwciało może też być podawane w postaci wstrzyknięcia domięśniowego lub podskórnego.
Kompozycje lecznicze muszą być sterylne i stabilne w warunkach w których są wytwarzane i składowane. Kompozycje mogą mieć postać roztworu, mikroemulsji, dyspersji, liposomu lub innych uporządkowanych struktur użytecznych do uzyskania wysokiego stężenia leku. Sterylne roztwory do wstrzyknięć można uzyskać przez włączenie składnika aktywnego (np. przeciwciała lub części przeciwciała) w użytecznej ilości do odpowiedniego rozpuszczalnika wraz z jednym lub kilkoma składnikami dodatkowymi, wymienionymi wyżej, jeśli jest to pożądane, a następnie sterylizacji przez filtrację. Ogólnie, roztwory rozproszone przygotowane są przez włączenie składnika aktywnego do sterylnego nośnika obejmującego podstawowy ośrodek dyspergujący i użyteczne dodatkowe składniki, wybrane z tych wymienionych powyżej. W przypadku sterylnych, liofilizowanych proszków do przygotowania sterylnych roztworów do wstrzyknięć, możliwe jest suszenie pod próżnią i suszenie rozpyłowe, prowadzące do powstania proszku ze składnika aktywnego oraz pożądanych składników dodatkowych, z sterylizowanych przez filtrację roztworów. Prawidłową płynność roztworu można uzyskać na przykład przez dodanie substancji rodzaju lecytyny, poprzez uzyskanie cząstek o właściwych rozmiarach w przypadku dyspersji i poprzez użycie substancji powierzchniowo czynnych. Przedłużoną absorpcję kompozycji przeznaczonej do wstrzyknięć można uzyskać na przykład poprzez dodanie składnika opóźniającego absorpcję, na przykład soli monostearynianowych i żelatyny.
Wspomniane przeciwciało i część przeciwciała otrzymywane sposobem według wynalazku można podawać na wiele sposobów znanych specjalistom, w zależności od konkretnych zastosowań leczniczych, korzystny sposób podawania to wstrzyknięcie podskórne, wstrzyknięcie dożylne lub infuPL 208 069 B1 zja. Jest wiadome specjalistom, że konkretna droga i/lub sposób podawania różnią się w zależności od pożądanych rezultatów. Wspomniany składnik aktywny może być przygotowany z nośnikiem, który chroni składnik aktywny przed szybkim uwalnianiem, w preparacie o regulowanym uwalnianiu, która może obejmować implanty, plastry przezskórne i mikrokapsułki. Stosować można ulegające biodegradacji, biokompatybilne polimery, takie jak octan etylenowy winylu, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Wiele sposobów przygotowania takich postaci jest opatentowanych i znanych specjalistom (patrz np. Sustained and controlled release drug delivery systems, JR Robinson wyd. Marcel Dekker Inc, NY 1978).
Przeciwciało lub część przeciwciała otrzymywane sposobem według wynalazku może być podawane doustnie, na przykład, w obojętnym rozcieńczalniku lub w przyswajalnym, jadalnym nośniku. Wspomniany składnik (i inne dodatki, jeśli jest to konieczne) mogą być zawarte w miękkich lub twardych kapsułkach żelatynowych, sprasowane w postaci tabletek, lub włączone bezpośrednio do diety pacjenta. W przypadku podawania doustnego wspomniany składnik może być połączony z zaróbkami i stosowany w postaci tabletek, tabletek podpoliczkowych, pastylek/kołaczyków, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, opłatków i podobnych. W celu podawania składnika według wynalazku w inny sposób niż dojelitowy, może okazać się konieczne pokrycie wspomnianego składnika lub podawanie wspomnianego składnika wraz z materiałem którego celem jest zapobieżenie inaktywacji wspomnianego składnika.
Dodatkowe składniki aktywne mogą być również włączane to kompozycji. W pewnych postaciach przeciwciało lub część przeciwciała według wynalazku włączana jest do receptury i/lub podawana jest łącznie z jednym, lub większą ilością dodatkowych środków leczniczych, użytecznych w leczeniu schorzenia związanego z patogenną aktywnością IL-1. Na przykład przeciwciała o podwójnej specyficzności skierowane przeciw IL-1 a/lL-1 β lub części przeciwciała według wynalazku mogą stanowić część receptury i/lub być podawane łącznie z jednym lub większą ilością dodatkowych przeciwciał wiążących inną substancję docelową (np. przeciwciał wiążących inne cytokiny lub wiążące się z cząsteczkami zlokalizowanymi na powierzchni komórkowej). Ponadto jedno lub więcej przeciwciał według wynalazku stosować można w połączeniu z dwoma lub więcej wymienionymi środkami leczniczymi. Wspomniana kombinowana terapia może wykorzystywać skutecznie niskie dawki podawanych środków leczniczych, pozwalając unikać w ten sposób możliwego wpływu toksycznego lub komplikacji towarzyszących różnego typu sposobom leczenia z wykorzystaniem pojedynczego składnika.
IV. Zastosowanie przeciwciał o podwójnej specyficzności
Ze względu na zdolność wiązania dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych antygenów, przeciwciała o podwójnej specyficzności lub ich części, otrzymywane sposobem według wynalazku można zastosować do wykrywania jednego albo obu wspomnianych antygenów (np. w próbce materiału biologicznego, takiego jak osocze lub surowica), w konwencjonalnym teście immunologicznym, takim jak test ELISA i test radioimmunologiczny (RIA) lub w technikami immunohistochemicznymi. Możliwy jest sposób wykrywania antygenu w próbce materiału biologicznego, obejmujący kontaktowanie próbki materiału biologicznego z przeciwciałem o podwójnej specyficzności lub częścią przeciwciała według wynalazku, które to przeciwciało rozpoznaje wspomniany antygen i wykrywa albo przeciwciało (lub część przeciwciała) związane z antygenem albo niezwiązane przeciwciało (lub część przeciwciała), i tym samym wykrywa wspomniany antygen w wspomnianej próbce materiału biologicznego. Wspomniane przeciwciało jest bezpośrednio lub pośrednio wyznakowane substancją, dzięki której można wykrywać związane lub niezwiązane przeciwciało. Użyteczne substancje umożliwiające wykrywanie obejmują różnorodne enzymy, grupy prostetyczne, materiały fluorescencyjne, materiały luminescencyjne i materiały radioaktywne. Przykłady użytecznych enzymów obejmują peroksydazę z chrzanu, alkaliczną fosfatazę, betagalaktozydazę lub acetylocholinestrazę; przykłady użytecznych grup prostetycznych obejmują kompleks streptoawidyny/biotyny i awidyny/biotyny; przykłady użytecznych materiałów fluorescencyjnych obejmują umbeliferon, fluoresceinę, izocyjanian fluoresceiny, rodaminę, dichlorotriazynyloaminofluoresceinę, chlorek dansylu lub fikoerytrynę; przykłady materiałów luminescencyjnych obejmują luminol i przykłady materiałów radioaktywnych obejmują 125I, 131I, 35S, lub 3H.
Alternatywną do znakowania przeciwciała, jest sposób w którym wspomniany antygen(-eny) mogą być wykrywane w płynach biologicznych w kompetycyjny test radioimmunologiczny z wykorzystaniem standardów antygenowych znakowanych wykrywalnymi substancjami i nieznakowanym przeciwciałem o podwójnej specyficzności specyficznym wobec wspomnianego antygenu(-ów). We wspomnianym teście, próbka materiału biologicznego, wspomniany znakowany standard antygenowy i przeciwciało o podwójnej specyficzności mieszane są i następnie określana jest ilość znakowanego
PL 208 069 B1 standardu antygenowego związanego z wspomnianym nieznakowanym przeciwciałem. Ilość antygenu w próbce materiału biologicznego jest odwrotnie proporcjonalna do ilości znakowanego standardu antygenowego związanego z nieznakowanym przeciwciałem.
Przeciwciało o podwójnej specyficzności może rozpoznawać specyficznie IL-1 α i IL-1 β i powyższe sposoby można stosować do wykrywania IL-1a i/lub IL-1 β. Możliwe jest wykrywanie IL-1a lub IL-1 β w próbce biologicznego materiału lub tkance obejmujące kontaktowanie próbki materiału biologicznego lub tkanki, w której może znajdować się IL-1a lub IL-1 β z przeciwciałem o podwójnej specyficzności lub częścią wiążącą antygen wspomnianego przeciwciała, otrzymanego sposobem według wynalazku i wykrywanie IL-1a lub IL-1 β w próbce biologicznego materiału lub tkance. Próbką biologicznego materiału może być np. próbka in vitro, taką jak próbka komórek, tkanek lub płynów ustrojowych (np. krwią, osoczem, moczem, śliną itp.) ponadto tkanka może być tkanką znajdującą się in vivo np. tkanką uwidocznioną dzięki zastosowaniu technik wizualizacji in vivo wspomnianej tkanki (np. z zastosowaniem wyznakowanych przeciwciał).
Przeciwciała o podwójnej specyficzności otrzymane sposobem według wynalazku mogą być stosowane do celów diagnostycznych. Przeciwciało według wynalazku można stosować w teście diagnostycznym in vitro, takim jak test laboratoryjny wykrywający pożądany antygen(-y) lub test powszechnego użytku służący wykrywaniu pożądanego antygenu(-ów). Przykłady znanych dobrze testów in vitro obejmują test ELISA, RIA, Western blot i podobne. Przeciwciało otrzymane sposobem według wynalazku można stosować w teście diagnostycznym in vivo, takim jak test obrazowania in vivo. Na przykład wspomniane przeciwciało można wyznakować dającą się wykrywać substancją wykrywalną in vivo, a następnie podać pacjentowi wyznakowane przeciwciało, i wyznakowane przeciwciało wykrywać w teście in vivo, umożliwiając tym samym obrazowanie in vivo.
Przeciwciała o podwójnej specyficzności otrzymane sposobem według wynalazku specyficznie rozpoznające IL-1a i IL-1 β można stosować w testach diagnostycznych do wykrywania IL-1a i/lub IL-1 β do celów diagnostycznych, na przykład w przypadku diagnozowania chorób przebiegających z odczynem zapalnym, jak również w przypadku samoistnych poronień. Ze względu na konkretny rodzaj choroby przeciwciała o podwójnej specyficzności wobec IL-1a/lL-1 β według wynalazku stosować można do celów diagnostycznych w dowolnym rodzaju schorzenia opisanego powyżej ze względu na lecznicze zastosowanie wspomnianych przeciwciał (patrz poniżej), takich jak schorzenia w których aktywność IL-1 jest czynnikiem patogennym, co przedyskutowano poniżej.
Przeciwciała o podwójnej specyficzności lub części przeciwciała korzystnie są zdolne do neutralizowania, zarówno in vitro, jak in vivo, aktywności wspomnianych antygenów, z którymi się wiążą. Wspomniane przeciwciała i części przeciwciał mogą być stosowane do hamowania aktywności wspomnianych antygenów np. w hodowli komórkowej obejmującej wspomniane antygeny lub w organizmie pacjenta lub w organizmie zwierzęcym posiadającym wspomniane antygeny z którymi wspomniane przeciwciała o podwójnej specyficzności według wynalazku mogą oddziaływać. Możliwe jest hamowanie aktywności antygenu obejmujące kontaktowanie wspomnianego antygenu z przeciwciałem o podwójnej specyficzności lub częścią przeciwciała według wynalazku co prowadzi do zahamowania aktywności antygenu. Przeciwciało o podwójnej specyficzności wiąże IL-1a i IL-1 β i możliwe jest hamowanie aktywności IL-1a i/lub IL-1 β przez kontaktowanie IL-1a i/lub IL-1 β z przeciwciałem o podwójnej specyficzności lub jego częścią. Aktywność IL-1a i/lub IL-1 β można hamować na przykład in vitro. Na przykład do hodowli komórkowej zawierającej lub przypuszczalnie zawierającej IL-1a i/lub IL-1 β, można dodać przeciwciało lub część przeciwciała według wynalazku w celu zahamowania aktywności IL-1 α i/lub IL-1 β we wspomnianej hodowli. Alternatywnie aktywność IL-1a i/lub IL-1 β można hamować in vivo, w organizmie pacjenta.
Możliwe jest hamowanie aktywności antygenu w organizmie pacjenta cierpiącego na chorobę w której aktywność wspomnianego antygenu jest patogenna. Możliwe jest hamowanie aktywności antygenu w organizmie pacjenta cierpiącego na taką chorobę, obejmujące podawanie pacjentowi przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części, tak by aktywność antygenu w organizmie chorego została zahamowana. Korzystnie wspomniany antygen jest ludzkim antygenem, a pacjent jest osobą ludzką. Przeciwciało można podawać pacjentowi w celach leczniczych. Ponadto przeciwciało otrzymane sposobem według wynalazku można podawać zwierzęciu eksprymującemu antygen z którym wiąże się wspomniane przeciwciało w celach weterynaryjnych lub w przypadku stosowania zwierząt będących modelami chorób ludzkich. W tym ostatnim przypadku zwierzęta takie można stosować do oceny efektów terapii z wykorzystaniem przeciwciał według wynalazku (np. do testowania dawki, sposobu i czasu podawania).
PL 208 069 B1
Przeciwciało o podwójnej specyficzności wiąże IL-1a i IL-1 β i możliwe jest hamowanie aktywności IL-1 w organizmie pacjenta, na przykład pacjenta cierpiącego na schorzenie w którym aktywność IL-1 jest patogenna. Stosowany termin „schorzenie w którym aktywność IL-1 jest patogenna” oznacza schorzenia i inne upośledzenia funkcji organizmu w których przebiegu obecność IL-1 (co obejmuje IL-1 α i IL-1 β) w organizmie pacjenta cierpiącego na wspomnianą chorobę jest lub podejrzewa się, że jest albo odpowiedzialna za patofizjologię choroby albo jest czynnikiem przyczyniającym się do zaostrzenia choroby. Stosownie, choroba w której przebiegu aktywność IL-1 jest patogenna jest chorobą w której zahamowanie aktywności IL-1 (to jest IL-1a i IL-1 β, osobno lub razem) przypuszczalnie wpłynie na złagodzenie objawów i/lub postępów wspomnianej choroby. Wspomniane choroby mogą objawiać się na przykład wzrostem stężenia IL-1 w płynach ustrojowych pacjenta cierpiącego na wspomnianą chorobę (np. zwiększonym stężeniem IL-1 w osoczu, surowicy, płynie maziowym itd. pacjenta), które to stężenia można wykrywać na przykład stosując przeciwciało skierowane przeciw IL-1, opisane powyżej.
Interleukina I pełni kluczową rolę w patologii związanej z wieloma chorobami obejmującymi odpowiedź zapalną i immunologiczną organizmu. Wspomniane choroby obejmują reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, młodzieńcze przewlekłe zapalenie stawów, zapalenie stawów związane z chorobą z Lyme, łuszczycowe zapalenie stawów, zespół Reitera, zapalenie stawów kręgosłupa, toczeń rumieniowaty układowy, chorobę Crohna, wrzodziejące zapalenie jelita grubego, stan zapalny jelita grubego/nieswoiste zapalenie jelit, cukrzycę insulino-zależną, zapalenie tarczycy, astmę, choroby alergiczne, łuszczycę, zapalenie i twardzinę skóry, reakcje przeszczepu skierowaną przeciw gospodarzowi, odrzucanie przeszczepu, ostrą lub przewlekłą chorobę immunologiczną związaną z przeszczepianiem narządu, miażdżycę tętnic, sarkoidozę, rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe, chorobę Kawasaki, chorobę Grave'a, zespół nerczycowy, zespół przewlekłego zmęczenia, ziarniak Wegener'a, plamicę Henocha-Schoenleina, mikroskopowe zapalenie naczyń nerek, przewlekłe aktywne zapalenie wątroby, zapalenie błony naczyniowej oka, wstrząs septyczny, zespół szoku toksycznego, zespół posocznicowy, kacheksję, choroby zakaźne, choroby pasożytnicze, zespół nabytego upośledzenia odporności, ostre poprzeczne zapalenie rdzenia, pląsawicę Huntingtona, chorobę Pakinsona, chorobę Alzheimera, udar, pierwotną marskość żółciową wątroby, anemię hemolityczną, złośliwości, niewydolność serca, zawał mięśnia sercowego, chorobę Addisona, sporadyczną niedoczynność wielogruczołową typu I i II, zespół Schmidta, zespół (ostrej) niewydolności oddechowej dorosłych, łysienie, łysienie plackowate, surowiczoujemną artropatię, artropatię, chorobę Reitera, artropatię łuszczycową, wrzodziejącą artropatię jelit, enteropatyczne zapalenie błony maziowej, artropatie związane z zakażeniem chlamydią, yersinią i salmonellą, artropatię kręgosłupa, alergię atopową, autoimmunologiczną chorobę pęcherzową skóry, pęcherzycę zwykłą, pęcherzycę liściastą, pemfigoid, chorobę linijną IgA, autoimmunologiczną anemię hemolityczną, anemię hemolityczną z odczynem Coombsa, nabytą złośliwą anemię, młodzieńczą złośliwą anemię, zapalenie mózgu z mialgią, przewiekłą kandydozę śluzówek i skóry, zapalenie tętnicy skroniowej olbrzymiokomórkowe, pierwotne stwardniające zapalenie wątroby, kryptogenne autoimmnunologiczne zapalenie wątroby, zespół nabytego niedoboru odporności, choroby towarzyszące nabytemu upośledzeniu odporności, zapalenie wątroby typu C, pospolity zmienny niedobór odporności (pospolity zmienny niedobór gammaglobulin we krwi), kardiomiopatię rozstrzeniową, bezpłodność u kobiet, niewydolność jajników, przedwczesna niewydolność jajników, chorobę płuc związana z włóknieniem, kryptogenne włókniejące zapalenie pęcherzyków płucnych, pozapalną śródmiąższową chorobę płuc, śródmiąższowe zapalenie płuc, śródmiąższową chorobę płuc związaną z mieszaną chorobą tkanki łącznej, śródmiąższową chorobę płuc związaną z twardziną układową, chorobę płuc związaną z reumatoidalnym zapaleniem stawów, toczniem rumieniowatym, zapaleniem skórnomięśniowym/wielomięśniowym, chorobą Sjogrena, zesztywniającym zapaleniem stawów kręgosłupa, dyfuzyjną chorobę płuc związaną z zapaleniem naczyń, chorobę płuc związaną z hemosyderozą, śródmiąższową chorobę płuc związaną z reakcją na leki, zwłóknienie wywołane napromieniowaniem, zapalenie oskrzelików zarostowe, przewlekłe eozynofilowe zapalenie płuc, chorobę płuc z naciekiem limfocytarnym, pozakażeniową śródmiąższową chorobę płuc, ostre dnawe zapalenie stawów, zapalenie wątroby autoimmunologiczne (typu I - klasyczne autoimmunologiczne lub toczniowe zapalenie wątroby oraz typu II - zapalenie wątroby z przeciwciałami anty-LKM), hipoglikemię autoimmunologiczną, odporność na insulinę typu B z rogowaceniem ciemnym, niedoczynność przytarczyc, ostre powikłania poprzeszczepowe, gościec zwyradniający, stwardniejące zapalenie dróg żółciowych, neutropenię autoimmunologiczną, łuszczycę typu 1 i 2, idiopatyczną leukopenię, autoimmunologiczną neutropenię, chorobę nerek NOS, zapalenie kłębuszków
PL 208 069 B1 nerkowych, mikroskopowe zapalenie naczyń nerki, chorobę z Lyme, toczeń rumieniowaty dyskowy, niepłodność męska (idiopatyczna, NOS), autoimmunizację plemników, stwardnienie rozsiane wszystkich podtypów, współczulne zapalenie naczyniówki, nadciśnienie płucne wtórne do schorzenia tkanki łącznej, zespół Goodpasture'a, guzkowate zapalenie tętnic (objawy płucne), gorączkę reumatoidalną ostrą, zwyrodnienie kręgów, chorobę Stilla, zespół Sjogrena, chorobę/zapalenie tętnic Takayashu, trombocytopenię autoimmunologiczną i idiopatyczną, autoimmunologiczną chorobę tarczycy, nadczynność tarczycy, autoimmunologiczną niedoczynność tarczycy z wolem (chorobę Hashimoto), atroficzną autoimmunologiczną niedoczynność tarczycy, pierwotny obrzęk śluzowaty, zapalenie błony naczyniowej oka związane z zaćmą, pierwotne zapalenie naczyń, bielactwo nabyte, schorzenia centralnego układu nerwowego (np. depresja, schizofrenia, choroba Alzheimera Parkinsona itp.), ostry i przewlekły ból, zaburzenia przemiany lipidowej. Ludzkie przeciwciała i części przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku można stosować do leczenia pacjentów cierpiących na choroby autoimmunologiczne, w szczególności te związane ze stanem zapalnym, reumatoidalnym zapaleniem stawów kręgosłupa, alergią, cukrzycą autoimmunologiczną i autoimmunologicznym zapaleniem błony naczyniowej oka.
Korzystnie przeciwciała o podwójnej specyficzności skierowane przeciw IL-1a/lL-1 β otrzymane sposobem według wynalazku lub części wiążące antygen wspomnianych przeciwciał można stosować w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów, choroby Crohna, stwardnienia rozsianego, cukrzycy zależnej od insuliny, łuszczycy.
Przeciwciała o podwójnej specyficzności skierowane przeciw IL-1 a/lL-1 β według wynalazku lub części wiążące antygen wspomnianych przeciwciał, można podawać z jednym lub z większą liczbą środków leczniczych użytecznych w leczeniu chorób autoimmunologicznych i przebiegających ze stanem zapalnym.
Przeciwciała według wynalazku lub część wiążąca antygen przeciwciał można stosować osobno lub w kompozycji, do leczenia wspomnianych chorób. Zrozumiałe jest, że przeciwciała według wynalazku lub część wiążąca antygen wspomnianych przeciwciał może być stosowana osobno lub w kompozycji z dodatkowymi środkami np. środkiem leczniczym, np. czynnikiem dodatkowym wybranym przez specjalistę w zamierzonym celu. Na przykład dodatkowy środek może być środkiem leczniczym o którym wiadomo że jest użyteczny w leczeniu choroby lub cechy poddawanej leczeniu przez podawanie przeciwciała według wynalazku. Dodatkowy środek może być również środkiem nadającym korzystne cechy kompozycji leczniczej np. może być środkiem wpływającym na lepkość kompozycji.
Wyżej wspomniane kompozycje mogą obejmować wspomniane przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku i co najmniej jeden dodatkowy środek np. dwa lub trzy dodatkowe środki.
Kompozycje mogą zawierać nie-steroidowe leki przeciwzapalne (NSAIDS), które obejmują leki takie jak ibuprofen i inhibitory Cox-2. Inne kombinacje obejmują kortykosteroidy włączając w to prednisolon; dobrze znane efekty uboczne stosowania steroidów można ograniczyć lub nawet wyeliminować poprzez zmniejszenie dawki steroidu wymaganego do leczenia pacjentów, przy stosowaniu kompozycji z przeciwciałami skierowanymi przeciw IL-1 według wynalazku. Przykłady czynników leczniczych do stosowania przy reumatoidalnym zapaleniu stawów, z którymi można łączyć przeciwciało otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążącą antygen przeciwciała, obejmują: leki przeciwzapalne hamujące cytokiny (CSAID), przeciwciała lub antagonistów innych ludzkich cytokin lub czynników wzrostowych, na przykład: TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, GM-CSF, FGF i PDGF. Przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążąca antygen wspomnianych przeciwciał mogą być łączone z przeciwciałami rozpoznającymi cząsteczki zlokalizowane na powierzchni komórek, takimi jak CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90 i ich ligandy, włączając w to CD154 (gp39 lub CD40L).
Przydatne kombinacje środków leczniczych mogą przerywać w różnych punktach kaskadę autoimmunologiczną i kaskadę stanu zapalnego: korzystne przykłady obejmują agonistów TNF takich jak chimerowe, humanizowane lub ludzkie przeciwciała anty-TNF, D2E7 (Publikacja PCT Nr WO 97/29131), CA2 (Remicade™), CDP 571, CDP 870, Thalidamide i rozpuszczalne receptory TNF p55 lub p75, ich pochodne (p75TNRF1gG (Enbrel™) lub p55TNFR1gG (Lenercept), i również inhibitory enzymu konwertującego TNFa (TACE); podobnie inhibitory IL-1 (inhibitory enzymu konwertującego IL-1, IL-1RA itp), które mogą być użyteczne z tych samych powodów. Inne przydatne kombinacje obejmują interleukinę 11. Kolejne przydatne kombinacje obejmują środki odgrywające istotną rolę w odpowiedzi autoimmunologicznej, które to środki mogą oddziaływać równolegle do, zależnie od lub wspólnie z funkcją IL-1; szczególnie korzystni są antagoniści IL-12 i/lub IL-18 włączając w to przeciwciała
PL 208 069 B1
IL-12 i/lub IL-18 lub rozpuszczalne receptory IL-12 i/lub IL-18, lub białka wiążące IL-12 i/lub IL-18. Wykazano, że IL-12 i IL-18 mają pokrywające się choć różne funkcje i połączenie różnych antagonistów może być najbardziej skuteczne. Kolejna przydatna kombinacja obejmuje nie zubażające inhibitory antyCD4. Kolejne przydatne zastosowanie obejmuje antagonistów szlaku kostymulacji CD80 (B7.1) lub CD86 (B7.2) włączając w to przeciwciała, rozpuszczalne receptory lub ligandy antagonistyczne.
Przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążąca antygen wspomnianych przeciwciał, może tworzyć kombinację ze środkami takimi jak metotreksat, 6-MP, azatiopryna, sulfasalazyna, mesalazyna, chlorochinina/hydroksychlorochina olsalazyny, penicylamina, aurotiojabłczan (podawany domięśniowo lub doustnie), azatiopryna, kolchicyna, kortykosteroidy (podawane doustnie, wziewnie, i przez lokalne wstrzyknięcia), agonistów receptorów beta-2-adrenergicznych (salbutamol, terbutalina, salmeteral), ksantyny (teofilina, aminofilina), kromoglikan, nedokromil, ketotifen, ipratropium, oksytropium, cyklosporyna, FK506, rapamycyna, mykofenolan mofetylu, leflunomid, różne NSAID, na przykład ibuprofen, kortykosteroidy takie jak prednisolon, inhibitory fosfodiesterazy, agoniści adenozyny, środki przeciwkrzepliwe, inhibitory dopełniacza, środki adrenergiczne, środki upośledzające drogę przekazywania sygnałów związanych ze stanem zapalnym przez cytokiny prozapalne takie jak TNFa lub IL-1 (np. inhibitory kinaz IRAK, NIK, IKK, p38 lub MAP), inhibitory enzymu konwertującego IL-1 β, inhibitory enzymu konwertującego TNFa (TACE), inhibitory szlaku sygnałowego komórek T, takie jak inhibitory kinazy, inhibitory metaloproteinazy, sulfasalazyna, azatiopryna, 6-merkaptoputyny, inhibitor konwertazy angiotensyny, rozpuszczalne receptory cytokin i ich pochodne (np. rozpuszczalne receptory TNF p55 lub p75 i ich pochodne p75TNRF1gG (Enbrel™) lub p55TNFR1gG (Lenercept), sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, i cytokiny przeciwzapalne (np. IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 i TGFe). Korzystne kombinacje obejmują metotreksat lub leflunomid i w przypadku umiarkowanej lub ostrej postaci reumatoidalnego zapalenia stawów cyklosporynę.
Przykłady środków leczniczych stosowanych w stanie zapalnym jelita, z którymi przeciwciało otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążąca antygen, może występować w kombinacji obejmują: budenozyd, EGF, kortykosteroidy, cyklosporynę, sulfasalazynę, aminosalicylany, 6-merkaptopurynę, azatioprynę, metronidazol, inhibitory lipoksygenazy, mesalaminę, olsalazynę, balsalazyd, przeciwutleniacze, inhibitory tromboksanu, antagonistów receptora IL-1, przeciwciała monoklonalne anty-IL-1 β, przeciwciała monoklonalne anty-IL-6, czynniki wzrostowe, inhibitory elastazy, związki pyridynylo-imidazolowe, przeciwciała skierowane przeciw lub antagonistów innych ludzkich cytokin lub czynników wzrostowych, na przykład, TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-16, IL-18, EMAP-II, GMCSF, FGF i PDGF. Przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku można łączyć z przeciwciałami skierowanymi przeciw cząsteczkom powierzchniowym, takim jak CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 i ich ligandy. Przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążąca antygen wspomnianych przeciwciał, mogą być również łączone z czynnikami takimi jak metotreksat, cyklosporyna, FK506, rapamycyna, mykofenolan mofetylu, leflunomid, związki NSAID, na przykład ibuprofen, kortykosteroidy takie jak prednisolon, inhibitory fosfodiesterazy, agoniści adenozyny, środki przeciwkrzepliwe, inhibitory dopełniacza, środki adrenergiczne, środki zakłócające drogę przekazywania sygnałów cytokin prozapalnych, takich jak TNFa lub IL-1 (np. inhibitory kinaz IRAK, NIK, IKK, p38 czy MAP), inhibitory konwertazy IL-1 β, inhibitory konwertazy TNFa, inhibitory szlaku sygnałowego komórek T, takie jak inhibitory kinazy, inhibitory meteloproteinazy, sulfasalazyna, azatiopryna, 6-merkaptopuryny, inhibitory konwertazy angiotensyny, rozpuszczalne receptory cytokin i ich pochodne (np. rozpuszczalne receptory p55 lub p75 TNF, sIL-1R1, sIL-1RII, sIL-6R) i cytokiny przeciwzapalne (np. IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 i TGFe).
Przydatne przykłady środków leczniczych w przypadku choroby Crohna, z którymi można łączyć przeciwciało lub część wiążącą antygen przeciwciała obejmują: antagonistów TNF, na przykład przeciwciała anty-TNF, D2E7 (Publikacja PCT Nr WO 97/29131), CA2 (Remicade™), CDP 571, konstrukty TNFR-Ig, (p75TNFRIgG (Enbrel™) i p55TNFRIgG Lenercept) inhibitory i inhibitory PDE4. Przeciwciała lub część wiążąca antygen wspomnianych przeciwciał według wynalazku może być łączona z kortykosteroidami, na przykład budenozydem i deksametazonem. Przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążąca antygen przeciwciała mogą być łączone ze środkami takimi jak sulfasalazyna, kwas 5-aminosalicylowy, i olsalazyna, i środkami, które przeszkadzają syntezie lub działaniu cytokin prozapalnych takich jak IL-1, na przykład z inhibitorami konwertazy IL-1e i IL-1ra. Przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążącą antygen można stosować również do zahamowania szlaku sygnalnego komórek T, na przykład stosując inhibitory kinazy
PL 208 069 B1 tyrozynowej (6-merkaptopuryny). Przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążąca antygen przeciwciał może być łączona z IL-11.
Przydatne przykłady środków leczniczych stosowanych w stwardnieniu rozsianym, z którymi można łączyć przeciwciało otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążącą antygen przeciwciała obejmują: kortykosteroidy, prednisolon, metyloprednisolon, azatioprynę, cyklofosfamid, cyklosporynę, metotreksat, 4-aminopirydynę, tyzanidynę, interferon-βΙ a (Avonex; Biogen), interferon-eib (Betasteron; Chiron/Berlex), Copolymer 1 (Cop-1; Copaxone, Teva Pharmac Industries Inc); tlen pod zwiększonym ciśnieniem, podawane dożylnie immunoglobuliny, klabrydynę, przeciwciała skierowane przeciw lub antagonistów ludzkich cytokin lub czynników wzrostowych, na przykład TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GMCSF, FGF i PDGF.
Przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążąca antygen wspomnianych przeciwciał mogą być łączone z przeciwciałami skierowanymi przeciw cząsteczkom zlokalizowanym na powierzchni komórek, takim jak CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 lub ich ligandom. Wspomniane przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku lub części wiążące antygen wspomnianych przeciwciał, można również łączyć ze środkami takimi jak metotreksat, cyklosporyna, FK506, rapamycyna, mykofenolan mofetylu, lefulunomid, związkami NSAID na przykład ibuprofenem, inhibitorami Cox-2, kortykosteroidami takimi jak prednisolon, inhibitorami fosfodiesterazy, agonistami adenozyny, środkami przeciwkrzepliwymi, inhibitorami dopełniacza, środkami adrenergicznymi, środkami zakłócającymi szlak sygnałowy cytokin prozapalnych takich jak TNFa lub IL-1 (np. inhibitory kinaz IRAK, NIK, IKK, p38 lub MAP), inhibitorami konwertazy IL-1 β, inhibitorami TACE, inhibitorami szlaków sygnałowych komórek T takimi jak inhibitory kinazy, inhibitory metaloproteinazy, sulfasalazyna, azatiopryna, 6-merkaptopuryny, inhibitory konwertazy angiotensyny, rozpuszczalne receptory cytokin i ich pochodne (np. rozpuszczalne receptory p55 lub p75 TNF, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R) i cytokiny przeciwzapalne (np. IL-4, IL-10, IL-13 i TGFe).
Korzystne przykłady środków leczniczych stosowanych w leczeniu stwardnienia rozsianego obejmujące wspomniane przeciwciało lub część wiążącą antygen wspomnianego przeciwciała można łączyć ze środkami obejmującymi interferon β, na przykład INFe1a i INFe1b, kopakson, kortykosteroidy, inhibitory IL-1, inhibitory TNF i przeciwciała skierowane przeciw ligandowi CD40 i CD80.
Kompozycje farmaceutyczne mogą obejmować „skuteczną leczniczo dawkę” lub „skuteczną profilaktycznie dawkę” wspomnianego przeciwciała lub części wiążącej antygen przeciwciała otrzymanych sposobem według wynalazku. Termin „skuteczna leczniczo dawka” oznacza skuteczną ilość w dawce i stosowaną przez okres niezbędny do osiągnięcia pożądanego leczniczo efektu. Leczniczo skuteczna ilość przeciwciała lub części przeciwciała może wahać się w zależności od czynników takich jak: stopień choroby, wiek, płeć i ciężar pacjenta, i w zależności od zdolności wspomnianego przeciwciała lub jego części do wywoływania pożądanej odpowiedzi u pacjenta. Ilość skuteczna leczniczo jest tą dawką, przy której uboczne działanie toksyczne lub szkodliwe dawki wspomnianego przeciwciała lub części przeciwciała jest mniejsze od korzystnego efektu leczniczego. Termin „skuteczna profilaktycznie dawka” oznacza ilość skuteczną w dawce i stosowaną przez okres niezbędny do osiągnięcia pożądanego profilaktycznego działania. Typowo, dawka profilaktyczna stosowana jest u pacjentów przed rozwojem choroby lub na wczesnych etapach rozwoju choroby, dawka skuteczna profilaktycznie jest niższa od dawki efektywnej leczniczo.
Sposób dawkowania można optymalizować dla osiągnięcia optymalnej odpowiedzi leczniczej (np. odpowiedzi profilaktycznej lub leczniczej). Na przykład podać można pojedynczą dawkę leku, kilka podzielonych dawek leku w ciągu pewnego okresu czasu, lub dawkę można proporcjonalnie zmniejszyć lub zwiększyć w zależności od konkretnej sytuacji leczniczej. Szczególnie korzystne jest przygotowanie kompozycji pozajelitowych w postaci dawek jednostkowych leku łatwych w zastosowaniu i umożliwiających jednolite podawanie. Dawki leku oznaczają tu fizyczne porcje stosowane jako dawki jednostkowe dla pacjentów lub zwierząt modelowych, którzy lub które poddawane są leczeniu; każda jednostka (dawka) obejmuje określoną ilość czynnika aktywnego wyliczoną tak by osiągnąć zamierzony efekt leczniczy, w połączeniu z nośnikiem użytecznym farmaceutycznie. Dokładne określenie formy dawki leczniczej według wynalazku ma na celu i bezpośrednio zależy od charakterystycznych właściwości składnika czynnego i efektu leczniczego lub profilaktycznego który ma zostać osiągnięty oraz od ograniczeń właściwych związkom takim, jak związek aktywny w leczeniu.
Przykłady leczniczo lub profilaktycznie skutecznych ilości przeciwciała lub jego części otrzymanych sposobem według wynalazku obejmują 0,1-20 mg/kg, bardziej korzystnie 1-10 mg/kg. Wielkość dawki zależy od rodzaju i stopnia ostrości objawów choroby, którą poddaje się leczeniu. Jest ponadto
PL 208 069 B1 zrozumiałe, że dla każdego pacjenta, należy ustalić specyficzne dawkowanie w zależności od stanu jego zdrowia i klinicznej oceny prowadzonej przez specjalistę.
P r z y k ł a d 1: Projektowanie antygenu o podwójnej specyficzności w oparciu o przylegający topologicznie obszar identyczności.
W przykładzie tym określony zostaje największy wspólny topologicznie obszar identyczności pomiędzy dwoma różnymi lecz strukturalnie pokrewnymi białkami, IL-1a i IL-1 β, w celu zaprojektowania antygenu o podwójnej specyficzności w celu wytworzenia specyficznych przeciwciał rozpoznających IL-1a i IL-1 β. W celu porównania wspomnianych dwu białek zastosowano algorytm BLAST umożliwiający pomiar tendencji do zastępowania konkretnej reszty aminokwasowej inną w regionach podobnych strukturalnie bądź funkcjonalnie. Wspomniana analiza umożliwia identyfikację najdłuższych przylegających regionów topologicznej identyczności pomiędzy IL-1a i IL-1 β by możliwe było stworzenie liniowego peptydu jako antygenu o podwójnej specyficzności. Wspomniany peptyd, najlepiej spełniający wymienione cechy posiada następującą sekwencje aminokwasową:
NEAQNITDF (Sek Id Nr 1) * *****
Gwiazdka (*) wskazuje reszty identyczne w obu białkach, a inne reszty są wysoce podobne wg algorytmu BLAST. Na przykład lizyna często podstawia argininę w homologicznych białkach, lecz nie zastępuje fenyloalaniny. Peptyd o Sek Id Nr 1 jest hybrydą, o sekwencji wziętej z dwu różnych fragmentów struktury biegnących w przeciwnych kierunkach, tak więc inne możliwe przedstawienie wspomnianego epitopu wygląda następująco:
dNdEdAdQNITDF gdzie „d” oznacza resztę aminokwasu w formie D. Zarówno wersje L aminokwasowe wspomnianego peptyd, jak i wersje częściowo podstawione resztami D aminokwasów można zsyntezować metodami standardowymi. Następnie peptyd zostaje skonjugowany z białkiem nośnikowym (np. KLH lub albuminą) i taki skonjugowany peptyd stosowany jest do selekcjonowania przeciwciał in vitro albo in vivo.
P r z y k ł a d 2: Projektowanie antygenu o podwójnej specyficzności naśladującego wspólną pętlę strukturalną
W tym przykładzie peptyd cykliczny, naśladujący strukturalnie kluczową pętlę obszaru fałdowania dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych białek IL-1a i IL-1 β został wytworzony w celu zastosowania jako antygen o podwójnej specyficzności w celu wytworzenia przeciwciał o podwójnej specyficzności wobec IL-1a i IL-1 β. Wybrana pętla obejmuje reszty 168-184 IL-1a i reszty 160-176 IL-1 β. Sekwencja konsensusowa wygląda następująco:
cyklo-MAFLRANQNNGKISVAL (PG) (Sek Id Nr 2) cbcccccccc**c*b
Gwiazdka (*) oznacza reszty identyczne dla IL-1a i IL-1 β, c wskazuje reszty konsensusowe tzn. reszty podobne dla IL-1a i IL-1 β, lecz nie obecne w konkretnym miejscu w żadnym z wspomnianych białek, b wskazuje że nie istnieje wyraźna zgodność dla konkretnej reszty pomiędzy IL-1a i IL-1 β. Wspomniany liniowy peptyd syntezowany jest standardowymi sposobami syntezy chemicznej. W celu cyklizacji peptydu, dodawane są reszty prolinowa i glicynowa. Wspomniany cykliczny peptyd można syntezować z wykorzystaniem standardowych warunków sprzęgania przy wysokim stężeniu N,N-dimetyloformamidu (1 mg/ml). Reakcje prowadzi się w temperaturze pokojowej stosując nadmiar odczynnika sprzęgającego, takiego jak heksafluorofosforan benzotriazol-1-iloksotrispirolidynofosfoniowy (PyBOP, 2 równoważniki) i dwuwęglanu sodowego (10 równoważników). Peptyd jest następnie sprzęgany z białkiem nośnikowym (np. KLH lub albuminą) i wspomniany sprzężony peptyd stosowany jest do selekcji przeciwciał in vitro lub in vivo.
P r z y k ł a d 3: Projektowanie antygenu o podwójnej specyficzności w oparciu o peptyd hybrydowy
W tym przykładzie peptyd hybrydowy obejmujący ułożone na przemian lub pokrywające się części dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych białek, IL-1a i IL-1 β, skonstruowany został w celu zastosowania jako antygen o podwójnej specyficzności do wytworzenia przeciwciał o podwójnej specyficzności rozpoznających IL-1a i ^-1β. W celu wytworzenia wspomnianego peptydu hybrydowego identyfikowane są ułożone na przemian lub pokrywające się sekwencje aminokwasowe IL-1a i IL-1 β, i łączone w celu utworzenia następującego peptydu:
TKGGQDITDFQILENQ (Sek Id Nr 3) bbbbbbbbbb aaaaaaaaaa
PL 208 069 B1
W powyższym peptydzie a i b wskazują z którego białka pochodzą reszty aminokwasowe (a = IL-1 α i b = IL-1 β). Motyw ITDF (Sek Id Nr 4) jest wspólny dla obu białek i został on włączony do peptydu hybrydowego. Ponadto, peptyd hybrydowy oparty jest o sekwencje z C końca obu białek, o którym wiadomo że jest antygenowy w odniesieniu do przeciwciał neutralizujących dla obu białek. Peptyd hybrydowy syntezowany jest standardowymi technikami syntezy chemicznej, a następnie sprzęgany z białkiem nośnikowym (np. KLH lub albuminą) i sprzężony peptyd stosowany jest do selekcji przeciwciał in vitro lub in vivo.
P r z y k ł a d 4: Wytwarzanie przeciwciał o podwójnej specyficzności wobec IL-1a i IL-1 β NEAQNITDF (Sek Id Nr 1) cyklo-MAFLRANQNNGKISVAL (PG) (Sek Id Nr 2)
TKGGQDITDFQILENQ (Sek Id Nr 3)
Peptydy oznaczone Sek Id Nr 1, 2 i 3 sprzęgnięto z KLH i immunizowano nimi poszczególne króliki. Surowice uzyskane z królików immunizowanych poszczególnymi, trzema peptydami wykazywały dobra odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw wspomnianym peptydom. Jednak tylko surowica uzyskana z królika immunizowanego peptydem o Sek Id Nr 3 była zdolna do wiązania zarówno białko IL-1a jak i białko IL-1 β.
Pięć myszy (BA119-BA123) immunizowano wstrzykując podskórnie peptyd o Sek Id Nr 3, skoniugowany z KLH oraz z dodatkiem niekompletnego adiuwantu Freunda (FIA) raz co trzy tygodnie, łącznie trzy razy, a następnie dwa razy dożylnie peptydem o Sek Id Nr 3 skoniugowanym z KLH. Od każdej z myszy pobierano krew 10 dni po każdej immunizacji i określano miano przeciwciała stosując test ELISA. Komórki grasicy z myszy BA119 i BA123 poddawano fuzji z komórkami szpiczaka linii P3X36Ag8.653 jak opisano to w punkcie IIA i uzyskane fuzanty wysiewano po jednej komórce na studzienkę w płytce 96-studzienkowej, stosując metodę rozcieńczeń. Wzrastające klony hybrydom testowano pod względem produkcji IgG i IgM standardowym testem ELISA w celu wyselekcjonowania klonów wytwarzających przeciwciało. Z fuzantów z myszy BA123 uzyskano 945 klonów. Supernatanty z 355 klonów testowane testem ELISA wykazały aktywność wiązania IL-1a, IL-1 β lub obu IL-1a i IL-1 β.
# klonów specyficzność antygenu (wobec pełnej długości IL-1a i/lub IL-1 β) izotyp
249 tylko IL-1 a IgG
19 tylko IL-1a IgM
15 tylko IL-1P IgG
2 tylko IL-1P IgM
57 IL-1a i IL-1P IgG
13 IL-1a i IL-1P IgM
Lista sekwencji
NEAQNITDF (Sek Id Nr 1) cyklo-MAFLRANQNNGKISVAL (PG) (Sek Id Nr 2)
TKGGQDITDFQILENQ (Sek Id Nr 3)
APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMGAYKSSKDDAKITVILGLKEKNL
YLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLG
GTKGGQDITDFTMQFVSS

Claims (41)

1. Sposób uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen, które specyficznie wiąże dwa różne, lecz strukturalnie pokrewne białka, znamienny tym, że:
otrzymuje się antygen przez składanie ze sobą zachodzących na siebie części dwu różnych, lecz strukturalnie pokrewnych białek dla utworzenia peptydu hybrydowego, który to peptyd ma strukturę X-Y-Z, gdzie Y przedstawia region identyczny lub bardzo podobny dla obu pokrewnych białek,
PL 208 069 B1
X przedstawia region z jednego z pokrewnych białek, a Z przedstawia region z drugiego z pokrewnych białek;
wystawia się repertuar przeciwciał na działanie tego antygenu; i przeprowadza się selekcję repertuaru przeciwciał, które specyficznie wiążą te dwie różne, lecz strukturalnie pokrewne białka, w celu otrzymania przeciwciała o podwójnej specyficzności.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że repertuar przeciwciał wystawia się na działanie antygenu in vivo poprzez immunizację nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że obejmuje ponadto przygotowanie panelu hybrydom z limfocytów zwierzęcia i wybieranie hybrydomy wydzielającej przeciwciało specyficznie wiążące dwa różne, lecz strukturalnie pokrewne białka cząsteczki.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że zwierzę wybiera się z grupy obejmującej myszy, szczury, króliki i kozy.
5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako zwierzę stosuje się mysz z wyłączonym genem pozbawioną endogennej wersji antygenu.
6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się zwierzę będące myszą transgeniczna pod względem ludzkich genów immunoglobulin i wytwarzające w wyniku stymulacji antygenowej ludzkie przeciwciała.
7. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się zwierzę będące myszą z ostrym złożonym zespołem braku odporności odbudowanej za pomocą ludzkich obwodowych komórek jednojądrzastych lub komórek limfoidalnych, lub ich prekursorów.
8. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się zwierzę będące myszą poddaną naświetleniu śmiertelną dawką promieniowania, następnie poddaną ochronie radiologicznej przez przeszczep komórek szpiku kostnego od myszy z ostrym złożonym zespołem braku odporności, a następnie przeszczepieniu ludzkich, funkcjonalnych limfocytów.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że repertuar przeciwciał wystawia się na działanie antygenu in vitro przez przeszukiwanie biblioteki rekombinowanych przeciwciał z wykorzystaniem tego antygenu.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni bakteriofaga.
11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki drożdżowej.
12. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki bakterii.
13. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana jako produkty fuzyjne RNA-białko.
14. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest biblioteką scFv lub biblioteką Fab.
15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu przez immunizację in vivo zwierzęcia tym antygenem, a następnie przeszukiwanie in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia z użyciem tego antygenu.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu in vivo poprzez immunizację zwierzęcia tym antygenem, a następnie dojrzewanie powinowactwa in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia.
17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu przez immunizację in vivo zwierzęcia tym antygenem, a następnie wybieranie pojedynczych komórek wydzielających przeciwciało wiążące antygen, i odzyskiwanie cDNA zmiennych regionów łańcucha lekkiego i ciężkiego z tych pojedynczych komórek.
18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące w pełni ludzkim przeciwciałem.
19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem chimerycznym.
20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem z przeszczepionym CDR.
PL 208 069 B1
21. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dwoma różnymi, lecz strukturalnie pokrewnymi białkami są interleukina-1 α i interleukina-1 β.
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że jako antygen stosuje się antygen obejmujący sekwencję aminokwasową TKGGQDITDFQILENQ (Sek Id Nr 3).
23. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że repertuar przeciwciał wystawia się na działanie antygenu in vivo, poprzez immunizowanie nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem.
24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że ponadto przygotowuje panel hybrydom z limfocytów zwierzęcia i wybiera się hybrydomę wydzielającą przeciwciało specyficznie wiążące IL-1 α i IL-1 β.
25. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że stosuje się zwierzę wybrane się z grupy obejmującej mysz, szczura, królika i kozę.
26. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że stosuje się zwierzę będące myszą z wyłączonym genem, nie wytwarzającą IL-1a, IL-1 β lub IL-1a i IL-1 β.
27. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że stosuje się zwierzę będące myszą transgeniczna pod względem ludzkich genów immunoglobulin i wytwarzające w wyniku stymulacji antygenowej ludzkie przeciwciała.
28. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że stosuje się zwierzę będące myszą z ostrym złożonym zespołem braku odporności odbudowanej za pomocą ludzkich obwodowych komórek jednojądrzastych lub komórek limfoidalnych, lub ich prekursorów.
29. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że stosuje się zwierzę będące myszą poddaną naświetleniu śmiertelną dawką promieniowania, następnie poddaną ochronie radiologicznej przez przeszczep komórek szpiku kostnego od myszy z ostrym złożonym zespołem braku odporności, a następnie przeszczepieniu ludzkich, funkcjonalnych limfocytów lub ich prekursorów.
30. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że repertuar przeciwciał wystawia się na działanie antygenu in vitro przez przeszukiwanie biblioteki rekombinowanych przeciwciał z wykorzystaniem tego antygenu.
31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni bakteriofaga.
32. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki drożdżowej.
33. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki bakterii.
34. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana jako produkty fuzyjne RNA-białko.
35. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest biblioteką scFv lub biblioteką Fab.
36. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu przez immunizację in vivo nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem, a następnie przeszukiwanie in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia z użyciem tego antygenu.
37. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu in vivo poprzez immunizację nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem, a następnie dojrzewanie powinowactwa in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia.
38. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu przez immunizację in vivo nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem, a następnie wybieranie pojedynczych komórek wydzielających przeciwciało wiążące antygen, i odzyskiwanie cDNA zmiennych regionów łańcucha lekkiego i ciężkiego z tych pojedynczych komórek.
39. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące w pełni ludzkim przeciwciałem.
40. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem chimerycznym.
41. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem z przeszczepionym CDR.
PL359995A 2000-06-29 2001-06-28 Sposób uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen PL208069B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21537900P 2000-06-29 2000-06-29
PCT/US2001/020755 WO2002002773A2 (en) 2000-06-29 2001-06-28 Dual specificity antibodies and methods of making and using

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL359995A1 PL359995A1 (pl) 2004-09-06
PL208069B1 true PL208069B1 (pl) 2011-03-31

Family

ID=22802758

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL359995A PL208069B1 (pl) 2000-06-29 2001-06-28 Sposób uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen

Country Status (27)

Country Link
US (5) US7491516B2 (pl)
EP (4) EP2386575A3 (pl)
JP (2) JP4955185B2 (pl)
KR (2) KR20080074231A (pl)
CN (3) CN102120773B (pl)
AT (1) ATE420958T1 (pl)
AU (1) AU2001271636A1 (pl)
BG (1) BG66209B1 (pl)
BR (1) BR0112026A (pl)
CA (1) CA2411374C (pl)
CZ (1) CZ2003291A3 (pl)
DE (1) DE60137421D1 (pl)
EC (1) ECSP024409A (pl)
ES (1) ES2319866T3 (pl)
HK (1) HK1055316A1 (pl)
HU (1) HUP0301002A3 (pl)
IL (3) IL153567A0 (pl)
MX (1) MXPA02012867A (pl)
NO (1) NO20026239L (pl)
NZ (1) NZ523080A (pl)
PE (1) PE20020132A1 (pl)
PL (1) PL208069B1 (pl)
SK (1) SK1152003A3 (pl)
TW (2) TWI307716B (pl)
UY (1) UY26807A1 (pl)
WO (1) WO2002002773A2 (pl)
ZA (1) ZA200210109B (pl)

Families Citing this family (172)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0996725A1 (en) * 1997-06-27 2000-05-03 Human Genome Sciences, Inc. Human nk-3 related prostate specific gene-1
DE60137421D1 (de) * 2000-06-29 2009-03-05 Abbott Lab Antikörper mit zwei spezifizitäten und verfahren zur deren herstellung und verwendung
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
DE60237282D1 (de) * 2001-06-28 2010-09-23 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
GB0115841D0 (en) 2001-06-28 2001-08-22 Medical Res Council Ligand
US9028822B2 (en) 2002-06-28 2015-05-12 Domantis Limited Antagonists against TNFR1 and methods of use therefor
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
US20070104710A1 (en) * 2002-06-28 2007-05-10 Domants Limited Ligand that has binding specificity for IL-4 and/or IL-13
US20060002935A1 (en) 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
ES2368733T3 (es) 2002-07-18 2011-11-21 Merus B.V. Producción recombinante de mezclas de anticuerpos.
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
US20050271660A1 (en) * 2002-09-06 2005-12-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Nebulization of monoclonal antibodies for treating pulmonary diseases
GB0230201D0 (en) * 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Retargeting
US20110223168A1 (en) * 2002-12-27 2011-09-15 Greg Winter Ligand that has binding specificity for il-4 and/or il-13
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
CA2527694C (en) 2003-05-30 2015-07-14 Hendricus Renerus Jacobus Mattheus Hoogenboom Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
AU2005207003C1 (en) * 2004-01-20 2013-06-13 Humanigen, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
EP1737971B1 (en) * 2004-01-20 2017-08-16 Merus N.V. Mixtures of binding proteins
TWI439284B (zh) * 2004-04-09 2014-06-01 Abbvie Biotechnology Ltd 用於治療ＴＮＦα相關失調症之多重可變劑量療法
US7790405B2 (en) 2004-04-26 2010-09-07 Centocor, Inc. Solution phase biopanning method using engineered decoy proteins
US7514539B2 (en) 2004-04-26 2009-04-07 Centocor, Inc. Epitope directed selection of antibodies to murine tissue factor
SI1747015T1 (sl) * 2004-04-26 2012-11-30 Janssen Biotech Inc Postopek biopanninga raztopinske faze z uporabo genetsko proizvedenih vabnih proteinov
CA2569240A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Domantis Limited Drug fusion comprising a polypeptide drug and an immunoglobulin heavy chain variable domain specific for serum albumin
EP1851245B1 (en) 2005-01-26 2012-10-10 Amgen Fremont Inc. Antibodies against interleukin-1 beta
KR100675791B1 (ko) * 2005-02-04 2007-02-02 제주대학교 산학협력단 육상어류양식장용 자동먹이공급시스템
WO2006120230A2 (en) 2005-05-12 2006-11-16 Crucell Holland B.V. Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof
EP1893645A1 (en) * 2005-06-23 2008-03-05 Crucell Holland B.V. Optimization of west nile virus antibodies
DK1912675T3 (en) 2005-07-25 2014-03-24 Emergent Product Dev Seattle B-cell reduction using specific and cd37-cd20-specific binding molecules
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP2500356A3 (en) 2005-08-19 2012-10-24 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
RU2515108C2 (ru) 2005-08-19 2014-05-10 Эббви Инк Иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами и его применения
US8906864B2 (en) 2005-09-30 2014-12-09 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Binding domains of proteins of the repulsive guidance molecule (RGM) protein family and functional fragments thereof, and their use
EP1940880A2 (en) * 2005-10-14 2008-07-09 Novo Nordisk A/S Treating diabetes using inhibitors of il-1
AU2007238677B2 (en) * 2006-04-14 2011-03-10 Novartis Ag Use of IL-I antibodies for treating ophthalmic disorders
KR101508390B1 (ko) 2006-06-06 2015-04-08 크루셀 홀란드 비.브이. 포도상구균에 대한 사멸활성을 갖는 인간결합분자 및 그것의 용도
JP2009539413A (ja) 2006-06-12 2009-11-19 トゥルビオン・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド エフェクター機能を有する単鎖多価結合タンパク質
CA2659745A1 (en) * 2006-08-02 2008-02-07 California Institute Of Technology Methods and systems for detecting and/or sorting targets
EP2471816A1 (en) * 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
RU2554747C9 (ru) * 2006-12-20 2015-10-20 Ксома (Сша) Ллс Способы лечения il-1бета-зависимых заболеваний
EP2114443A4 (en) * 2006-12-29 2011-08-10 Abbott Lab IL-1A / IL-1B ANTIBODY WITH DOUBLE SPECIFICITY
EP2679996A1 (en) 2007-05-31 2014-01-01 AbbVie Inc. Biomarkers predictive of the responsiveness to TNF-alfa inhibitors in autoimmune disorders
EP2195341B1 (en) 2007-09-26 2017-03-22 UCB Biopharma SPRL Dual specificity antibody fusions
JP2011506614A (ja) 2007-12-17 2011-03-03 ダイアックス コーポレーション Ｍｍｐ−１４結合タンパク質を含む、骨溶解性障害を処置するための組成物および方法
US8962803B2 (en) 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
US8008445B2 (en) 2008-03-03 2011-08-30 Dyax Corp. Metalloproteinase 9 binding proteins
US8013125B2 (en) * 2008-03-03 2011-09-06 Dyax Corp. Metalloproteinase 9 and metalloproteinase 2 binding proteins
ES2368700T3 (es) 2008-04-11 2011-11-21 Emergent Product Development Seattle, Llc Agente inmunoterapéutico para cd37 y combinación con un agente quimioterapéutico bifuncional del mismo.
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
SG190572A1 (en) 2008-04-29 2013-06-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2726087A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2010153578A (ru) 2008-06-03 2012-07-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение
RU2011104348A (ru) 2008-07-08 2012-08-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом против простагландина е2 и их применение
KR101705911B1 (ko) 2008-09-03 2017-02-10 제넨테크, 인크. 다중특이적 항체
US8377429B2 (en) * 2008-09-05 2013-02-19 Xoma Technology Ltd. Methods for improvement of beta cell function with anti-IL-1β antibodies or fragments thereof
EP2326347A4 (en) * 2008-09-12 2013-03-06 Xbiotech Inc TARGETING PATHOGENIC MONOCYTES
HUE033438T2 (en) 2008-09-26 2017-11-28 Ucb Biopharma Sprl Biological products
EP2196476A1 (en) 2008-12-10 2010-06-16 Novartis Ag Antibody formulation
KR20110110349A (ko) * 2009-01-29 2011-10-06 아보트 러보러터리즈 Ｉｌ-1 결합 단백질
EP2810652A3 (en) 2009-03-05 2015-03-11 AbbVie Inc. IL-17 binding proteins
CA2756244A1 (en) * 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
CN101957365B (zh) * 2009-07-21 2013-08-07 卫生部北京医院 检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白g双特异性抗体的试剂盒
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
EP3029070A1 (en) 2009-08-29 2016-06-08 AbbVie Inc. Therapeutic dll4 binding proteins
KR20120060877A (ko) * 2009-09-01 2012-06-12 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
GB201005063D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
US8398966B2 (en) * 2009-10-15 2013-03-19 Abbvie Inc. IL-1 binding proteins
AU2010306677B2 (en) 2009-10-15 2013-05-23 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
SG181563A1 (en) 2009-12-08 2012-07-30 Abbott Gmbh & Co Kg Monoclonal antibodies against the rgm a protein for use in the treatment of retinal nerve fiber layer degeneration
EP2523974A4 (en) * 2010-01-12 2013-11-06 Oncomed Pharm Inc WNT BINDING AGENTS AND USES THEREOF
EP2542582A4 (en) 2010-03-02 2013-12-04 Abbvie Inc THERAPEUTIC PROTEINS LINKING TO DLL4
ES2617777T5 (es) * 2010-04-23 2022-10-13 Hoffmann La Roche Producción de proteínas heteromultiméricas
SI2571532T1 (sl) 2010-05-14 2017-10-30 Abbvie Inc. Proteini, ki vežejo IL-1
WO2012006500A2 (en) 2010-07-08 2012-01-12 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
KR20130100118A (ko) 2010-08-03 2013-09-09 아비에 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
BR112013003279A2 (pt) * 2010-08-13 2016-06-14 Genentech In “métodos para tratar uma doença, método para neutralizar ou bloquear a atividade de il-1ß e/ou il-18, anticorpo, usos de um anticorpo e usos de um anticorpo monoclonal”
CA2809433A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
KR20130133247A (ko) 2010-12-21 2013-12-06 애브비 인코포레이티드 Ｉｌ-1-알파 및 -베타 이특이적 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
CN103596591B (zh) * 2011-02-08 2016-08-24 Abbvie公司 骨关节炎和疼痛的治疗
WO2012163521A1 (en) 2011-05-27 2012-12-06 Dutalys Removal of monomeric targets
EP2726510B1 (en) 2011-05-27 2023-03-08 F. Hoffmann-La Roche AG Dual targeting
AU2012274461A1 (en) 2011-06-20 2014-01-16 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-erbB3 antibody
WO2013059439A2 (en) 2011-10-21 2013-04-25 Dyax Corp. Combination therapy comprising an mmp-14 binding protein
RU2014121043A (ru) 2011-10-24 2015-12-10 Эббви Инк. Биспецифические иммуносвязывающие средства, направленные против tnf и il-17
MX2014004977A (es) 2011-10-24 2014-09-11 Abbvie Inc Inmunoaglutinantes dirigidos contra esclerostina.
WO2013078135A2 (en) * 2011-11-21 2013-05-30 Abbott Laboratories Il-1 binding proteins
RU2482181C1 (ru) * 2011-12-07 2013-05-20 Учреждение Российской академии медицинских наук Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина РАМН Клеточная линия d11 множественной миеломы человека, используемая для гибридомной технологии
CA2855570A1 (en) 2011-12-14 2013-06-20 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
US10118958B2 (en) 2011-12-14 2018-11-06 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
KR101963230B1 (ko) 2011-12-26 2019-03-29 삼성전자주식회사 복수개의 단일 항체를 포함하는 단백질 복합체
TW201333033A (zh) 2011-12-30 2013-08-16 Abbvie Inc 雙可變域免疫球蛋白及其用途
TW201333035A (zh) 2011-12-30 2013-08-16 Abbvie Inc 針對ｉｌ－１３及／或ｉｌ－１７之雙特異性結合蛋白
MY176695A (en) 2012-01-27 2020-08-19 Abbvie Inc Composition and method for the diagnosis and treatment of diseases associated with neurite degeneration
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
MX360109B (es) 2012-04-20 2018-10-23 Merus Nv Metodos y medios para la produccion de moleculas de tipo ig.
WO2014011955A2 (en) 2012-07-12 2014-01-16 Abbvie, Inc. Il-1 binding proteins
KR101911438B1 (ko) 2012-10-31 2018-10-24 삼성전자주식회사 이중 특이 항원 결합 단백질 복합체 및 이중 특이 항체의 제조 방법
CA2890263C (en) 2012-11-01 2020-03-10 Abbvie Inc. Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
SG10201802044RA (en) * 2012-11-01 2018-05-30 Abbvie Inc Stable dual variable domain immunoglobulin protein formulations
JP2016501881A (ja) 2012-12-04 2016-01-21 アッヴィ・インコーポレイテッド 血液脳関門（ｂｂｂ）を透過する二重特異性結合タンパク質
EP2938634A2 (en) 2012-12-28 2015-11-04 AbbVie Inc. Dual specific binding proteins having a receptor sequence
US9856319B2 (en) 2012-12-28 2018-01-02 Abbvie Inc. Monovalent binding proteins
US9915665B2 (en) 2012-12-28 2018-03-13 Abbvie Inc. High-throughput system and method for identifying antibodies having specific antigen binding activities
EP2948475A2 (en) 2013-01-23 2015-12-02 AbbVie Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
WO2014144280A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17
US9469686B2 (en) 2013-03-15 2016-10-18 Abbott Laboratories Anti-GP73 monoclonal antibodies and methods of obtaining the same
EP2970457A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 AbbVie Inc. Dual specific binding proteins directed against tnf
ES2753419T3 (es) 2013-06-07 2020-04-08 Univ Duke Inhibidores del factor H del complemento
CN103308697B (zh) * 2013-06-09 2014-11-26 卫生部北京医院 检测抗丙型肝炎病毒编码的非结构蛋白ns3和ns5的天然双特异性抗体的试剂盒
US9879081B2 (en) 2013-06-25 2018-01-30 Samsung Electronics Co., Ltd. Protein complex, bispecific antibody including the protein complex, and method of preparation thereof
KR20160055275A (ko) 2013-09-17 2016-05-17 유니버시티 헬스 네트워크 시스 ｒｇｍａ/네오제닌 상호작용 또는 지질 래프트에 대해 지시되는 제제 및 치료 방법에서의 이의 용도
BR112016006502A2 (pt) * 2013-09-30 2017-09-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Método para a produção de molécula de ligação de antígeno usando-se fago auxiliar modificado
CN105849124B (zh) 2013-12-20 2022-04-12 豪夫迈·罗氏有限公司 双重特异性抗体
WO2015191783A2 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Abbvie Inc. Biomarkers for inflammatory disease and methods of using same
WO2015191934A2 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Abbvie Inc. Blood-brain barrier (bbb) penetrating dual specific binding proteins for treating brain and neurological diseases
EP2985294A1 (en) 2014-08-14 2016-02-17 Deutsches Krebsforschungszentrum Recombinant antibody molecule and its use for target cell restricted T cell activation
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
JP6655302B2 (ja) * 2015-05-29 2020-02-26 デンカ生研株式会社 被検対象の検出方法並びにそのための免疫測定器具及びモノクローナル抗体
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
US20170073420A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 Abbvie Inc. Methods for treating relapsing forms of multiple sclerosis
EP3352760A4 (en) 2015-09-21 2019-03-06 Aptevo Research and Development LLC CD3 BINDING POLYPEPTIDES
KR102146319B1 (ko) 2015-10-02 2020-08-25 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd1 및 tim3에 특이적인 이중특이성 항체
JP6734919B2 (ja) 2015-10-02 2020-08-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 同時結合を測定するための細胞ベースのｆｒｅｔアッセイ法
US11219645B2 (en) 2015-11-18 2022-01-11 Duke University Tumor infiltrating lymphocytes for treatment of cancer
PL3365368T3 (pl) 2016-03-11 2023-08-21 Scholar Rock, Inc. Immunoglobuliny wiążące tgfbeta1 i ich zastosowanie
JP2019517480A (ja) 2016-06-01 2019-06-24 アッヴィ・インコーポレイテッド 脊髄損傷及び疼痛を処置するための抗ＲＧＭａ（Ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａ）アンタゴニスト抗体
EP3519824A1 (en) 2016-10-03 2019-08-07 Abbott Laboratories Improved methods of assessing uch-l1 status in patient samples
WO2018129329A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Scholar Rock, Inc. ISOFORM-SPECIFIC, CONTEXT-PERMISSIVE TGFβ1 INHIBITORS AND USE THEREOF
US11016092B2 (en) 2017-03-23 2021-05-25 Abbott Laboratories Methods for aiding in the diagnosis and determination of the extent of traumatic brain injury in a human subject using the early biomarker ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1
LT3606946T (lt) 2017-04-03 2022-10-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-pd-1 antikūno imunokonjugatai su mutantiniu il-2 arba su il-15
KR102346336B1 (ko) 2017-04-05 2022-01-04 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd1 및 lag3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체
US10877048B2 (en) 2017-04-15 2020-12-29 Abbott Laboratories Methods for aiding in the hyperacute diagnosis and determination of traumatic brain injury in a human subject using early biomarkers
US10877038B2 (en) 2017-04-28 2020-12-29 Abbott Laboratories Methods for aiding in the hyperacute diagnosis and determination of traumatic brain injury using early biomarkers on at least two samples from the same human subject
US10865238B1 (en) 2017-05-05 2020-12-15 Duke University Complement factor H antibodies
AU2018272054A1 (en) 2017-05-25 2019-09-26 Abbott Laboratories Methods for aiding in the determination of whether to perform imaging on a human subject who has sustained or may have sustained an injury to the head using early biomarkers
JP7269183B2 (ja) 2017-05-30 2023-05-08 アボット・ラボラトリーズ 心臓トロポニンｉを使用する、ヒト対象における軽度外傷性脳損傷を診断及び査定する一助となるための方法
WO2019010131A1 (en) 2017-07-03 2019-01-10 Abbott Laboratories IMPROVED METHODS FOR MEASURING CARBOXY TERMINATION HYDROLASE LEVELS OF UBIQUITIN L1 IN BLOOD
GB201711208D0 (en) 2017-07-12 2017-08-23 Iontas Ltd Ion channel inhibitors
AU2018363922A1 (en) 2017-11-08 2020-05-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Bispecific antibody which binds to CD40 and EpCAM
BR112020010085A2 (pt) 2017-12-09 2020-10-13 Abbott Laboratories métodos para auxiliar no diagnóstico e avaliar uma lesão cerebral traumática em um indivíduo humano usando uma combinação de gfap e uch-l1
US11022617B2 (en) 2017-12-09 2021-06-01 Abbott Laboratories Methods for aiding in the diagnosis and evaluation of a subject who has sustained an orthopedic injury and that has or may have sustained an injury to the head, such as mild traumatic brain injury (TBI), using glial fibrillary acidic protein (GFAP) and/or ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 (UCH-L1)
JP7437303B2 (ja) 2017-12-29 2024-02-22 アボット・ラボラトリーズ 外傷性脳損傷を診断及び査定するための、新規のバイオマーカー及び方法
WO2020014473A1 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Scholar Rock, Inc. TGFβ1 INHIBITORS AND USE THEREOF
PL3677278T3 (pl) 2018-07-11 2022-02-28 Scholar Rock, Inc. Selektywne względem izoformy inhibitory tgfbeta1 i ich zastosowanie
MX2021000347A (es) 2018-07-11 2021-04-19 Scholar Rock Inc Inhibidores de tgf?1 selectivos de isoforma, de alta afinidad y usos de los mismos.
MX2021007797A (es) 2018-12-28 2021-10-26 Kyowa Kirin Co Ltd Anticuerpo biespecifico que se une al receptor de transferrina (tfr).
EP3931573A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 Abbott Laboratories Methods for predicting major adverse cardiovascular events in subjects with coronary artery disease
JPWO2020230901A1 (pl) 2019-05-15 2020-11-19
JPWO2020230899A1 (pl) 2019-05-15 2020-11-19
AU2021205440A1 (en) 2020-01-11 2022-09-01 Scholar Rock,Inc. TGF-beta inhibitors and use thereof
WO2021142427A1 (en) 2020-01-11 2021-07-15 Scholar Rock, Inc. TGFβ INHIBITORS AND USE THEREOF
WO2021211331A1 (en) 2020-04-13 2021-10-21 Abbott Point Of Care Inc. METHODS, COMPLEXES AND KITS FOR DETECTING OR DETERMINING AN AMOUNT OF A ß-CORONAVIRUS ANTIBODY IN A SAMPLE
CN111793131A (zh) * 2020-05-11 2020-10-20 廊坊天光生物技术有限公司 一种用于检测血清中pf4含量的抗体对及其用途
US20220043000A1 (en) 2020-08-04 2022-02-10 Abbott Laboratories Methods and kits for detecting sars-cov-2 protein in a sample
CA3198161A1 (en) 2020-12-01 2022-06-09 Beth MCQUISTON Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi
WO2023102384A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Abbott Laboratories Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi
WO2022147147A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Abbott Laboratories Methods for determining sars-cov-2 antigen and anti-sars-cov-2 antibody in a sample
WO2022204581A2 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and use thereof
AU2022279156A1 (en) 2021-05-18 2023-11-02 Abbott Laboratories Methods of evaluating brain injury in a pediatric subject
WO2022256723A2 (en) 2021-06-03 2022-12-08 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and therapeutic use thereof
CA3222291A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 Jaime MARINO Methods of diagnosing or aiding in diagnosis of brain injury caused by acoustic energy, electromagnetic energy, an over pressurization wave, and/or blast wind
WO2023288277A1 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Scholar Rock, Inc. Ltbp complex-specific inhibitors of tgfb1 and uses thereof
WO2023019019A2 (en) * 2021-08-13 2023-02-16 Abwiz Bio, Inc. Humanization, affinity maturation, and optimization methods for proteins and antibodies
WO2023034777A1 (en) 2021-08-31 2023-03-09 Abbott Laboratories Methods and systems of diagnosing brain injury
AU2022354059A1 (en) 2021-09-30 2024-03-28 Abbott Laboratories Methods and systems of diagnosing brain injury
WO2023114978A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Abbott Laboratories Systems and methods for determining uch-l1, gfap, and other biomarkers in blood samples
WO2023129942A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 Abbott Laboratories Use of biomarkers to determine sub-acute traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography (ct) scan that is negative for a tbi or no head ct scan
WO2023150652A1 (en) 2022-02-04 2023-08-10 Abbott Laboratories Lateral flow methods, assays, and devices for detecting the presence or measuring the amount of ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 and/or glial fibrillary acidic protein in a sample
WO2024006876A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Abbott Laboratories Magnetic point-of-care systems and assays for determining gfap in biological samples
WO2024059708A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Abbott Laboratories Biomarkers and methods for differentiating between mild and supermild traumatic brain injury

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US126603A (en) 1872-05-07 Improvement in machines for sawing staves
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
FR2577377B1 (fr) * 1985-02-21 1989-06-16 Albaret Sa Procede pour eviter le patinage d'un tracteur equipe d'un relevage hydraulique avec un outil enfoui dans le sol, et equipement de tracteur pour mettre en oeuvre ce procede
US4772685A (en) * 1985-10-02 1988-09-20 Merck & Co., Inc. Immunogenic peptides of human interleukin-1 and the corresponding anti-peptide antibodies
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
DE768377T1 (de) 1988-09-02 1998-01-02 Dyax Corp Herstellung und Auswahl von Rekombinantproteinen mit verschiedenen Bindestellen
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
DK1024191T3 (da) 1991-12-02 2008-12-08 Medical Res Council Fremstilling af autoantistoffer fremvist på fag-overflader ud fra antistofsegmentbiblioteker
ATE261493T1 (de) * 1992-05-22 2004-03-15 Univ Montana State Antikörper mit spezifikäten gegen mehrere adhäsionsmoleküle
US5622701A (en) * 1994-06-14 1997-04-22 Protein Design Labs, Inc. Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin
NZ288997A (en) * 1994-06-24 1999-01-28 Immunex Corp Controlled release pharmaceutical formulation comprising polypeptide encapsulated in alginate
ES2304786T3 (es) 1995-04-27 2008-10-16 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos anti-il-8 humanos, derivados a partir de xenoratones inmunizados.
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
EP0859841B1 (en) 1995-08-18 2002-06-19 MorphoSys AG Protein/(poly)peptide libraries
RU2270030C2 (ru) 1996-02-09 2006-02-20 Абботт Байотекнолоджи эЛтиди. СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО TNFα (ВАРИАНТЫ), ПРИМЕНЕНИЕ ВЫДЕЛЕННОГО АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩЕГО ФРАГМЕНТА В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА (ВАРИАНТЫ) И ВЫДЕЛЕННОЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО ИЛИ ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ
US6300065B1 (en) 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
IL119587A (en) 1996-11-07 2000-12-06 Univ Ramot Method of preparing and for obtaining bimolecular interactions
DK1500329T3 (da) 1996-12-03 2012-07-09 Amgen Fremont Inc Humane antistoffer, der specifikt binder TNF-alfa
WO1998031700A1 (en) 1997-01-21 1998-07-23 The General Hospital Corporation Selection of proteins using rna-protein fusions
WO1998047343A2 (en) 1997-04-04 1998-10-29 Biosite Diagnostics, Inc. Antibodies or binding protein libraries displayed on phage, cells, or other replicatable genetic packages
AU7171098A (en) 1997-05-01 1998-11-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Directed evolution of enzymes and antibodies
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
US6680380B1 (en) 1998-09-18 2004-01-20 Schering Corporation Nucleic acids encoding mammalian interleukin-1ζ, related reagents and methods
KR101222450B1 (ko) 1999-03-25 2013-01-16 애보트 게엠베하 운트 콤파니 카게 사람 ｉｌ-12에 결합하는 사람 항체 및 이의 제조방법
GB0001448D0 (en) 2000-01-21 2000-03-08 Novartis Ag Organic compounds
DE60137421D1 (de) 2000-06-29 2009-03-05 Abbott Lab Antikörper mit zwei spezifizitäten und verfahren zur deren herstellung und verwendung
DE60237282D1 (de) 2001-06-28 2010-09-23 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
PT1517921E (pt) 2002-06-28 2006-09-29 Domantis Ltd Ligandos duplamente especificos com semi-vida no soro aumentada
TW200730539A (en) 2005-12-01 2007-08-16 Domantis Ltd Noncompetitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1
EP2114443A4 (en) 2006-12-29 2011-08-10 Abbott Lab IL-1A / IL-1B ANTIBODY WITH DOUBLE SPECIFICITY

Also Published As

Publication number Publication date
EP1297142B1 (en) 2009-01-14
HUP0301002A3 (en) 2005-12-28
US20140378666A1 (en) 2014-12-25
EP2386575A2 (en) 2011-11-16
US7491516B2 (en) 2009-02-17
PL359995A1 (pl) 2004-09-06
CA2411374C (en) 2012-10-30
EP2899210A3 (en) 2015-11-18
CN102120773B (zh) 2013-07-24
US20140155579A1 (en) 2014-06-05
CN1451043A (zh) 2003-10-22
WO2002002773A2 (en) 2002-01-10
IL153567A0 (en) 2003-07-06
BR0112026A (pt) 2003-05-20
ZA200210109B (en) 2004-03-12
IL203955A (en) 2011-09-27
JP2012031178A (ja) 2012-02-16
AU2001271636A1 (en) 2002-01-14
HUP0301002A2 (hu) 2003-07-28
CN102120773A (zh) 2011-07-13
JP4955185B2 (ja) 2012-06-20
HK1055316A1 (en) 2004-01-02
US20150175694A1 (en) 2015-06-25
TW200516083A (en) 2005-05-16
PE20020132A1 (es) 2002-03-04
US20030040083A1 (en) 2003-02-27
CA2411374A1 (en) 2002-01-10
NO20026239D0 (no) 2002-12-27
IL153567A (en) 2010-11-30
NO20026239L (no) 2003-02-27
KR20030014288A (ko) 2003-02-15
EP2042518A3 (en) 2009-04-08
CZ2003291A3 (cs) 2003-05-14
KR100919593B1 (ko) 2009-09-29
NZ523080A (en) 2004-11-26
EP2042518A2 (en) 2009-04-01
BG107483A (bg) 2003-09-30
BG66209B1 (bg) 2012-04-30
JP2004502428A (ja) 2004-01-29
DE60137421D1 (de) 2009-03-05
EP1297142A2 (en) 2003-04-02
ES2319866T3 (es) 2009-05-14
US8475766B2 (en) 2013-07-02
ECSP024409A (es) 2003-02-06
CN101525384A (zh) 2009-09-09
US20090232736A1 (en) 2009-09-17
TWI307716B (en) 2009-03-21
WO2002002773A3 (en) 2002-08-22
ATE420958T1 (de) 2009-01-15
KR20080074231A (ko) 2008-08-12
EP2386575A3 (en) 2011-11-30
MXPA02012867A (es) 2003-09-05
SK1152003A3 (en) 2003-07-01
UY26807A1 (es) 2002-01-31
EP2899210A2 (en) 2015-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL208069B1 (pl) Sposób uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen
JP6499132B2 (ja) ＦｃＲｎに対する抗体及びその使用
KR100951067B1 (ko) 사람 인터류킨-18에 결합하는 항체 및 이를 제조하고사용하는 방법
AU2007202323C1 (en) Dual specificity antibodies and methods of making and using
AU2013203432A1 (en) Dual specificity antibodies and methods of making and using
AU2012200225A1 (en) Dual specificity antibodies and methods of making and using

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
VDSO Invalidation of derivated patent or utility model

Ref document number: 389141

Country of ref document: PL

Kind code of ref document: A1

LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20140628