PL208069B1 - Sposób uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen - Google Patents

Sposób uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen

Info

Publication number
PL208069B1
PL208069B1 PL359995A PL35999501A PL208069B1 PL 208069 B1 PL208069 B1 PL 208069B1 PL 359995 A PL359995 A PL 359995A PL 35999501 A PL35999501 A PL 35999501A PL 208069 B1 PL208069 B1 PL 208069B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody
antigen
antibodies
animal
dual specificity
Prior art date
Application number
PL359995A
Other languages
English (en)
Other versions
PL359995A1 (pl
Inventor
Albert Collinson
Tariq Ghayur
George Avgerinos
Richard Dixon
Zehra Kaymakcalan
Original Assignee
Abbott Lab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Lab filed Critical Abbott Lab
Publication of PL359995A1 publication Critical patent/PL359995A1/pl
Publication of PL208069B1 publication Critical patent/PL208069B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/245—IL-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/545—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy sposobu uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen, które specyficznie wiąże dwa różne, lecz strukturalnie pokrewne białka.
System odpornościowy ssaków obejmuje limfocyty B, które wytwarzają repertuar przeciwciał składający się z setek miliardów różnych specyficzności przeciwciał. Prawidłowa odpowiedź immunologiczna wobec konkretnego antygenu obejmuje wybór ze wspomnianego repertuaru przeciwciał jednego lub więcej przeciwciał specyficznie wiążących antygen, i powodzenie odpowiedzi immunologicznej oparte jest, przynajmniej w części, na zdolności wspomnianych przeciwciał do specyficznego rozpoznawania (i ostatecznie eliminowania) stymulującego antygenu i „ignorowania” innych cząsteczek z otoczenia wspomnianych przeciwciał .
Użyteczność przeciwciał specyficznie rozpoznających jeden konkretny docelowy antygen doprowadziła do rozwoju technologii przeciwciał monoklonalnych. Standardowa technologia hybrydomy umożliwia obecnie wytwarzanie przeciwciał o pojedynczej specyficzności wobec konkretnego antygenu. Niedawno rozwinięto technikę wytwarzania przeciwciał rekombinowanych, taką jak technika przeszukiwania bibliotek przeciwciał in vitro. Techniki te umożliwiają wytwarzanie przeciwciał z pojedynczą specyficznością względem konkretnego antygenu.
Przeciwciała specyficzne wobec pojedynczego docelowego antygenu mogą, co najmniej w okreś lonych warunkach, wykazywać niekorzystną, krzyż ową reaktywność lub wiązanie niespecyficzne („tło”) do innych antygenów. Wspomniana reaktywność krzyżowa lub wiązanie niespecyficzne jest jednak nieprzewidywalne (tzn. nie można przewidzieć z którym antygenem konkretne przeciwciało będzie reagować krzyżowo). Ponadto, wiązanie to daje się rozróżnić zazwyczaj od specyficznego wiązania antygenu przez przeciwciało, ponieważ reprezentuje jedynie niewielką część zdolności przeciwciała do wiązania antygenu (np. 1% lub mniej całkowitej siły wiązania przeciwciała) i zazwyczaj obserwowane jest przy dużych stężeniach przeciwciała (np. 1000 krotnym lub wyższym, w porównaniu ze stężeniem niezbędnym do zaobserwowania zjawiska specyficznego wiązania antygenu). Jakkolwiek istnieją poszczególne antygeny, które należeć mogą do strukturalnie pokrewnej rodziny białek, odpowiedź wspomnianego przeciwciała względem konkretnego członka rodziny jest wysoce specyficzna. Ponadto istnieje szereg przykładów członków należących do konkretnej rodziny białek (np. członków rodzin IL-1 i TNF) które wiążą się z tym samym receptorem, składnikiem receptora czy ze strukturalnie pokrewnymi receptorami, jednak przeciwciała monoklonalne wytworzone przeciw jednemu członkowi takiej rodziny nie wykazują wysokiej reaktywności krzyżowej skierowanej wobec innych członków rodziny. Może być kilka przyczyn braku reaktywności krzyżowej przeciwciał monoklonalnych wobec różnych członków rodziny. Po pierwsze w standardowej procedurze hybrydomy poszukuje się jedynie nielicznych przeciwciał o wysokiej specyficzności/powinowactwie wobec docelowego antygenu i sprawdza się reaktywność krzyż ową lub wiązanie niespecyficzne kilku wybranych przeciwciał . Po drugie choć białka w obrębie rodziny są strukturalnie pokrewne, mogą one posiadać właściwe sobie jedynie, nie pokrywające się immunodominujące epitopy. Zatem przeciwciała monoklonalne wytworzone z zastosowaniem białka pełnej długości nie muszą wykazywać reaktywności krzyżowej z innymi, strukturalnie pokrewnymi białkami.
Znane są przykłady przeciwciał monoklonalnych wytworzonych przeciw antygenowi z jednego gatunku, które wiążą się specyficznie z funkcjonalnie takim samym antygenem, z innego gatunku. Na przykład przeciwciało X przeciw-mysie może łatwo reagować z ludzkim antygenem X. Dzieje się tak, ponieważ antygeny te łączą znaczące podobieństwa sekwencyjne i strukturalne, mimo że nie są identyczne. Jednakże wspomniana gatunkowa reaktywność krzyżowa przeciwciał nie stanowi „podwójnej specyficzności” przeciwciał, ponieważ wykazują one specyficzność wobec tego samego antygenu z róż nych gatunków organizmów.
Zatem istnieje zapotrzebowanie na przeciwciała monoklonalne posiadające przewidywalną podwójną lub wielokrotną specyficzność, to jest przeciwciała wykazujące prawdziwą specyficzność wobec dwu lub więcej antygenów.
Podsumowanie wynalazku
Wynalazek dotyczy sposobu uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen, które specyficznie wiąże dwa różne, lecz strukturalnie pokrewne białka, charakteryzującego się tym, że otrzymuje się antygen przez składanie ze sobą zachodzących na siebie części dwu różnych, lecz strukturalnie pokrewnych białek dla utworzenia peptydu hybrydowego, który to peptyd ma strukturę X-Y-Z, gdzie Y przedstawia region identyczny lub bardzo podobny dla obu poPL 208 069 B1 krewnych białek, X przedstawia region z jednego z pokrewnych białek, a Z przedstawia region z drugiego z pokrewnych białek; wystawia się repertuar przeciwciał na działanie tego antygenu; i przeprowadza się selekcję repertuaru przeciwciał, które specyficznie wiążą te dwie różne, lecz strukturalnie pokrewne białka, w celu otrzymania przeciwciała o podwójnej specyficzności.
Korzystnie repertuar przeciwciał wystawia się na działanie antygenu in vivo poprzez immunizację nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem.
Korzystniej sposób obejmuje ponadto przygotowanie panelu hybrydom z limfocytów zwierzęcia i wybieranie hybrydomy wydzielają cej przeciwciał o specyficznie wiążące dwa róż ne, lecz strukturalnie pokrewne białka cząsteczki.
Korzystnie zwierzę wybiera się z grupy obejmującej myszy, szczury, króliki i kozy.
Korzystnie jako zwierzę stosuje się mysz z wyłączonym genem pozbawioną endogennej wersji antygenu.
Korzystnie stosuje się zwierzę będące myszą transgeniczną pod względem ludzkich genów immunoglobulin i wytwarzające w wyniku stymulacji antygenowej ludzkie przeciwciała.
Korzystnie stosuje się zwierzę będące myszą z ostrym złożonym zespołem braku odporności odbudowanej za pomocą ludzkich obwodowych komórek jednojądrzastych lub komórek limfoidalnych, lub ich prekursorów.
Korzystnie stosuje się zwierzę będące myszą poddaną naświetleniu śmiertelną dawką promieniowania, następnie poddaną ochronie radiologicznej przez przeszczep komórek szpiku kostnego od myszy z ostrym złożonym zespołem braku odporności, a następnie przeszczepieniu ludzkich, funkcjonalnych limfocytów.
W korzystnej postaci repertuar przeciwciał wystawia się na dział anie antygenu in vitro przez przeszukiwanie biblioteki rekombinowanych przeciwciał z wykorzystaniem tego antygenu.
Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni bakteriofaga.
Także korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki drożdżowej.
Również korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki bakterii.
Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana jako produkty fuzyjne RNA-białko.
Także korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest biblioteką scFv lub biblioteką Fab.
W korzystnej postaci repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu przez immunizację in vivo zwierzęcia tym antygenem, a następnie przeszukiwanie in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia z użyciem tego antygenu.
W innej korzystnej postaci repertuar przeciwciał jest wystawiany na dział anie antygenu in vivo poprzez immunizację zwierzęcia tym antygenem, a następnie dojrzewanie powinowactwa in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia.
W kolejnej korzystnej postaci repertuar przeciwciał jest wystawiany na dział anie antygenu przez immunizację in vivo zwierzęcia tym antygenem, a następnie wybieranie pojedynczych komórek wydzielających przeciwciało wiążące antygen, i odzyskiwanie cDNA zmiennych regionów łańcucha lekkiego i ciężkiego z tych pojedynczych komórek.
Korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące w pełni ludzkim przeciwciałem.
Także korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem chimerycznym.
Korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem z przeszczepionym CDR.
W korzystnej postaci dwoma różnymi, lecz strukturalnie pokrewnymi białkami są interleukina-1a i interleukina-1 β.
Korzystniej jako antygen stosuje się antygen obejmujący sekwencję aminokwasową TKGGQDITDFQILENQ (Sek Id Nr 3).
Także korzystniej repertuar przeciwciał wystawia się na działanie antygenu in vivo, poprzez immunizowanie nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem.
Korzystniej ponadto przygotowuje panel hybrydom z limfocytów zwierzęcia i wybiera się hybrydomę wydzielającą przeciwciało specyficznie wiążące IL-1a i IL-1 β.
PL 208 069 B1
Korzystniej stosuje się zwierzę wybrane się z grupy obejmującej mysz, szczura, królika i kozę.
Także korzystniej stosuje się zwierzę będące myszą z wyłączonym genem, nie wytwarzającą
IL-Ια, IL-1 β lub IL-Ια i IL-1 β.
Korzystniej stosuje się zwierzę będące myszą transgeniczną pod względem ludzkich genów immunoglobulin i wytwarzające w wyniku stymulacji antygenowej ludzkie przeciwciała.
Korzystniej stosuje się zwierzę będące myszą z ostrym złożonym zespołem braku odporności odbudowanej za pomocą ludzkich obwodowych komórek jednojądrzastych lub komórek limfoidalnych, lub ich prekursorów.
Także korzystniej stosuje się zwierzę będące myszą poddaną naświetleniu śmiertelną dawką promieniowania, następnie poddaną ochronie radiologicznej przez przeszczep komórek szpiku kostnego od myszy z ostrym złożonym zespołem braku odporności, a następnie przeszczepieniu ludzkich, funkcjonalnych limfocytów lub ich prekursorów.
W korzystnej postaci repertuar przeciwciał wystawia si ę na dział anie antygenu in vitro przez przeszukiwanie biblioteki rekombinowanych przeciwciał z wykorzystaniem tego antygenu.
Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni bakteriofaga.
Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki drożdżowej.
Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki bakterii.
Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana jako produkty fuzyjne RNA-białko.
Korzystniej biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest biblioteką scFv lub biblioteką Fab.
W korzystnym sposobie repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu przez immunizację in vivo nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem, a następnie przeszukiwanie in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia z u ż yciem tego antygenu.
W innym korzystnym sposobie repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu in vivo poprzez immunizację nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem, a następnie dojrzewanie powinowactwa in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia.
W kolejnym korzystnym sposobie repertuar przeciwciał jest wystawiany na dział anie antygenu przez immunizację in vivo nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem, a następnie wybieranie pojedynczych komórek wydzielających przeciwciało wiążące antygen, i odzyskiwanie cDNA zmiennych regionów łańcucha lekkiego i ciężkiego z tych pojedynczych komórek.
Korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące w pełni ludzkim przeciwciałem.
Korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem chimerycznym.
Korzystnie uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem z przeszczepionym CDR.
W warunkach klinicznych poszczególni członkowie tej samej rodziny białkowej mogą przyczyniać się do wystąpienia różnych objawów procesu chorobowego. Zatem, przeciwciało o podwójnej specyficzności może zostać wykorzystane do wiązania członków tej samej rodziny białkowej, w celu zablokowania funkcji więcej niż jednego członka rodziny, co może być korzystne przy usuwaniu objawów choroby lub przerywaniu samego procesu chorobowego. Ponadto przeciwciała o podwójnej specyficzności według wynalazku można wykorzystać do wykrywania strukturalnie pokrewnych antygenów, oczyszczania strukturalnie pokrewnych antygenów i w testach diagnostycznych obejmujących strukturalnie pokrewne antygeny.
Antygen może być zaprojektowany w oparciu o wspólny topologicznie obszar identyczności pomiędzy dwoma różnymi, lecz strukturalnie pokrewnymi cząsteczkami. Na przykład dwie różne lecz strukturalnie pokrewne strukturalnie cząsteczki mogą być białkami i antygen może być peptydem obejmującym sekwencje aminokwasową wspólnego topologicznie obszaru identyczności pomiędzy dwoma białkami.
Antygen może być także zaprojektowany w oparciu o strukturalne naśladowanie pętli wspólnego obszaru fałdowania dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek. Na przykład antygen
PL 208 069 B1 może być peptydem cyklicznym naśladującym strukturę pętli wspólnego obszaru topologicznej identyczności dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych białek.
Antygen może być także zaprojektowany w oparciu o połączone razem, ułożone na przemian lub pokrywające się części dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek, w celu wytworzenia cząsteczki hybrydowej. Na przykład antygen może być hybrydowym peptydem wytworzonym przez połączenie razem ułożonych na przemian lub pokrywających się sekwencji aminokwasowych dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych białek.
Repertuar przeciwciała może być wystawiony na działanie konkretnego antygenu in vivo albo in vitro. Na przykład wystawienie repertuaru przeciwciała na antygen obejmuje immunizowanie zwierzęcia in vivo przy pomocy antygenu. Wspomniany sposób in vivo może dalej obejmować otrzymanie zestawu hybrydom z limfocytów zwierzęcia i selekcjonowanie hybrydom które wydzielają przeciwciało które specyficznie wiąże dwa różne lecz strukturalnie pokrewne cząsteczki. Immunizowane zwierzę może być na przykład myszą, szczurem, królikiem lub kozą, lub wersją transgeniczną wspomnianych zwierząt, takim jak myszą będącą transgenem ludzkiego genu immunoglobulinowego, takim że wspomniana mysz wytwarza ludzkie przeciwciała w odpowiedzi na stymulację antygenową. Immunizowane mogą być również inne rodzaje zwierząt, obejmujące transgeniczną mysz z SCID wytworzoną z użyciem ludzkich obwodowych komórek jednojądrowych (chimerowa mysz hu-PBMC-SCID) lub komórek limfoidalnych lub ich prekursorów, i mysz poddaną działaniu letalnej dawki promieniowania jonizującego, traktowaną następnie komórkami szpiku myszy SCID, a następnie traktowaną ludzkimi limfocytami (system Trimera). Kolejny rodzaj immunizowanego zwierzęcia może obejmować np. nokautowaną mysz np. w wyniku rekombinacji homologicznej z endogennym genem lub genami, kodującymi antygen lub antygeny według wynalazku, gdzie po immunizacji antygen lub antygenami według wynalazku nokautowane zwierzę rozpoznaje antygen lub antygeny jako obce.
Repertuar przeciwciała może być wystawiony na działanie antygenu in vitro poprzez przeszukiwanie rekombinowanej biblioteki przeciwciała przy pomocy antygenu. Wspomniana rekombinowana biblioteka przeciwciała może być na przykład eksprymowana w bakteriofagu lub w komórkach drożdżowych lub w komórkach bakterii. Rekombinowana biblioteka przeciwciała jest na przykład biblioteką scFv lub biblioteką Fab. Biblioteki przeciwciała mogą być eksprymowane w postaci cząsteczek fuzyjnych RNA-białko.
Możliwe jest też połączenie wspomnianych sposobów in vivo oraz in vitro, takie jak wystawienie repertuaru przeciwciała na działanie antygenu poprzez immunizację zwierzęcia in vivo wspomnianym antygenem, a następnie przeszukiwanie in vitro rekombinowanej biblioteki przeciwciała uzyskanej z komórek limfoidalnych wspomnianego zwierzęcia przy pomocy antygenu. Moż liwe jest eksponowanie repertuaru przeciwciała na działanie antygenu poprzez immunizację in vivo zwierzęcia przy pomocy antygenu, a następnie selekcję pojedynczej komórki wytwarzającej przeciwciało, następnie uzyskanie cDNA regionu zmiennego łańcucha lekkiego i ciężkiego z wyselekcjonowanych komórek (np. techniką PCR) i ekspresję regionów zmiennych łańcucha lekkiego i ciężkiego w komórkach ssaczego gospodarza in vitro (określa się go jako sposób otrzymywania przeciwciała z selekcjonowanych limfocytów, SLAM, selected lymphocyte antibody method), umożliwiając tym samym dalszą selekcję i manipulowanie wybraną sekwencją genu kodującego przeciwciało. Kolejny sposób selekcjonowania przeciwciał monoklonalnych może obejmować ekspresję genów kodujących ciężki i lekki łańcuch przeciwciała w komórkach ssaczych i wybieranie komórek eksprymujących i wydzielających przeciwciało o pożądanej specyficzności.
Sposoby według wynalazku umożliwiają otrzymanie wielu różnych typów przeciwciał o podwójnej specyficzności, włączając w to przeciwciała w pełni ludzkie, przeciwciała chimerowe i przeciwciała chimerowe-CDR, oraz fragmenty wiążące antygen. Przeciwciało o podwójnej specyficzności można wykorzystać w sposobach wykrywania IL-Ια lub IL-1 β obejmujących kontaktowanie IL-Ια lub IL-1 β z przeciwciałem o podwójnej specyficzności, lub częścią wiążącą antygen wspomnianego przeciwciała, tak by prowadziło to do wykrycia IL-Ια lub IL-1 β. Przeciwciało neutralizujące o podwójnej specyficzności można zastosować również w sposobie hamowania aktywności IL-1a lub IL-1 β poprzez kontaktowanie IL-1a lub ^-1β z przeciwciałem o podwójnej specyficzności, lub częścią wiążącą antygen wspomnianego przeciwciała, tak by prowadziło to do hamowania aktywności IL-1a lub IL-1 β. Wspomniane przeciwciała o podwójnej specyficzności można również stosować w sposobach leczenia choroby w której istnieje patologia interleukiny 1, obejmujących podawanie choremu przeciwciała o podwójnej specyficzności lub części wiążącej antygen wspomnianego przeciwciała.
PL 208 069 B1
Szczegółowy opis wynalazku
Wynalazek wiąże się z projektowaniem i zastosowaniem antygenów do wytwarzania przeciwciał o podwójnej specyficznoś ci, to jest przeciwciał specyficznych wobec co najmniej dwu róż nych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek, jak również dostarcza sposobu wytwarzania przeciwciał o podwójnej specyficzności. Strukturalne pokrewieństwo antygenów może obejmować całą cząsteczkę antygenu (np. białka) lub jedynie pewne strukturalnie pokrewne regiony. Wynalazek dostarcza sposobu uzyskiwania przeciwciał o podwójnej specyficzności które specyficznie wiążą dwie różne lecz strukturalnie pokrewne cząsteczki, obejmującego:
dostarczenie antygenu obejmującego wspólne cechy strukturalne dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek eksponowanie repertuaru przeciwciał na antygen selekcjonowanie z repertuaru przeciwciała specyficznie wiążącego dwie różne lecz strukturalnie pokrewne cząsteczki, w celu uzyskania przeciwciała o podwójnej specyficzności.
Należy zwrócić uwagę, że choć wynalazek przedstawiony jest tu w terminach opisujących rozpoznawanie dwu różnych lecz pokrewnych antygenów, to termin „przeciwciało o podwójnej specyficzności” w zamierzeniu ma obejmować przeciwciała specyficznie rozpoznające nawet więcej niż dwa różne lecz pokrewne antygeny, takie jak przeciwciało rozpoznające trzy, cztery, pięć lub więcej strukturalnie pokrewnych lecz różnych antygenów. Ponadto termin „różne lecz strukturalnie pokrewne antygeny” w zamierzeniu obejmuje antygeny (np. białka) których ogólne struktury są pokrewne, jak również antygeny (np. białka) które łączy jeden lub więcej regionów strukturalnie pokrewnych, a które nie są pod innymi względami pokrewne. Zatem „różne lecz strukturalnie pokrewne” antygeny mogą być na przykład dwoma białkami należącymi do tej samej rodziny białek, charakteryzującymi się wspólną ogólną strukturą lub mogą być na przykład dwoma białkami których ogólna struktura nie jest do siebie podobna (nie jest pokrewna) lecz oba posiadają pokrewne strukturalnie domeny.
Do wytworzenia przeciwciał według wynalazku można zastosować różne rodzaje antygenów i róż ne sposoby otrzymywania przeciwcia ł , w celu uzyskania przeciwciał a o podwójnej specyficznoś ci, tak jak przedyskutowano to w szczegółach poniżej.
I. Przeciwciała o podwójnej specyficzności
W celu wytworzenia przeciwciała o podwójnej specyficznoś ci według wynalazku, wytwarza się przeciwciała skierowane przeciw antygenowi zdolnemu do wytworzenia przeciwciał o podwójnej specyficzności. Takie antygeny określa się dalej zasadniczo jako antygeny o podwójnej specyficzności. Można zastosować różne rodzaje antygenów o podwójnej specyficzności, a projektowanie różnych rodzajów antygenów o podwójnej specyficzności przedstawiono poniżej.
A. Przylegające topologiczne obszary identyczności
W konkretnej postaci antygen o podwójnej specyficzności obejmuje przylegający topologiczne obszar identyczności i/lub podobieństwa pomiędzy dwiema różnymi lecz strukturalnie pokrewnymi cząsteczkami, dla których powstaje przeciwciało o podwójnej specyficzności. Korzystnie wspomniany antygen obejmuje największy (np. najdłuższy) przylegający topologiczny obszar identyczności i/lub podobieństwa pomiędzy dwiema różnymi lecz strukturalnie pokrewnymi cząsteczkami. Korzystnie wspomniane dwie różne lecz strukturalnie pokrewne cząsteczki są białkami i antygen o podwójnej specyficzności obejmuje liniowy peptyd odpowiadający największemu (np. najdłuższemu) przylegającemu topologicznemu obszarowi identyczności i/lub podobieństwa obu wspomnianych białek. Użyteczny region identyczności/podobieństwa jest korzystnie regionem wiązania receptora lub ligandu, choć stosować można także inne regiony identyczności/podobieństwa.
W celu określenia przylegających topologicznych obszarów identyczności pomiędzy dwiema cząsteczkami (np. białkami), te dwie cząsteczki są porównywane (np. poprzez modelowanie homologiczne, porównywanie informacji strukturalnych lub uliniowienie sekwencji) i w ten sposób identyfikowane są regiony identyczne lub podobne. W przypadku białek, można zastosować algorytm porównywania w celu stworzenia optymalnego uliniowienia i zidentyfikowania największego (np. najdłuższego) przylegającego topologicznego obszaru identyczności i/lub podobieństwa pomiędzy dwoma białkami. Korzystnym, nie ograniczającym przykładem algorytmu matematycznego stosowanego do porównywania dwu sekwencji jest algorytm podany przez Karlina i Altschula (1990) PNAS 87: 2264-68, zmodyfikowany przez Karlina i Altschula (1993) PNAS 90: 5873-77. Algorytm taki stanowi część programów NBLAST i XBLAST Altschula i wsp (1990) J Mol Biol 215: 403-10. W celu uzyskania uliniowienia sekwencji z lukami do celów porównawczych, można stosować program Gapped BLAST, tak jak opisał to Altschul i wsp (1997) NAR 25(17): 3389-3402. Gdy stosuje się programy BLAST
PL 208 069 B1 i Gapped BLAST moż na stosować domyślne parametry odpowiednich programów (np. XBLAST i NBLAST). Por: http://www.ncbi.nml.nih.gov. Alternatywnym algorytmem matematycznym który moż na zastosować w tym samym celu jest program ALIGN podany przez Myersa i Millera (1988) Comput Appl Biosci 4: 11-17.
Gdy użyteczny region identyczności/podobieństwa zostanie wybrany, można następnie zsyntezować chemicznie antygen o podwójnej specyficzności odpowiadający wybranemu obszarowi. Na przykład w przypadku antygenów peptydowych peptyd może być zsyntezowany standardowymi sposobami syntezy peptydów. Antygen peptydowy może obejmować L aminokwasy. W innej postaci antygen peptydowy może w całości lub części składać się z D aminokwasów. Przykład projektowania antygenu o podwójnej specyficzności opartego na przylegającym topologicznym obszarze identyczności i/lub podobieństwa pomiędzy dwoma różnymi lecz strukturalnie pokrewnymi białkami opisany jest w szczegółach w przykładzie 1.
B. Peptydy cykliczne naśladujące pętlę strukturalną
Antygen o podwójnej specyficzności według wynalazku może obejmować cząsteczkę cykliczną, korzystnie peptyd cykliczny, naśladujący strukturalnie kluczową pętlę obszaru fałdowania dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek (np. białek) dla którego wytwarzane jest specyficzne przeciwciało. W celu otrzymania wspomnianego antygenu porównywane są struktury dwu pokrewnych cząsteczek i wyszukiwana jest identyczna strukturalnie pętla fałdowania, obecna w obu cząsteczkach. W celu zidentyfikowania wspomnianych pę tli i wspólnych strukturalnie obszarów fał dowania moż na stosować standardowe techniki modelowania i analizy krystalograficznej. Identyczne lub podobne regiony (np. sekwencje aminokwasowe wspólne dla obu cząsteczek) mogą zostać zidentyfikowane, a następnie można wyprowadzić sekwencję konsensusową dla regionów podobnych lecz nie identycznych. Cząsteczka liniowa (np. liniowy peptyd) projektowana jest w oparciu o wykryte podobieństwa i regiony identyczne a następnie wspomniana cząsteczka liniowa może być cyklizowana, w znany chemikom sposób, tak by stała się antygenem naśladującym tę kluczową pętlę. Na przykład na końcu liniowego peptydu można dodać prolinę i glicynę w celu umożliwienia cyklizacji peptydu. Przykład projektowania antygenu o podwójnej specyficzności w postaci peptydu cyklicznego naśladującego pętlę wspólną strukturalnie dla obu różnych lecz pokrewnych białek podaje Przykład 2.
C. Cząsteczki hybrydowe
Przeciwciało o podwójnej specyficzności według wynalazku może też obejmować cząsteczkę hybrydową, korzystnie peptyd hybrydowy, obejmujący ułożone na przemian lub pokrywające się części dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek (np. białek) dla których wytwarza się przeciwciała o podwójnej specyficzności. W celu wytworzenia tego typu antygenu, struktury dwu wspomnianych cząsteczek są najpierw porównywane, i identyfikowane są regiony pokrywające się (regiony identyczności), jak również regiony nieidentyczne obu cząsteczek. Następnie przygotowywana jest cząsteczka hybrydowa (np. peptyd hybrydowy, w przypadku gdy obie cząsteczki są białkami) korzystnie obejmująca regiony położone na przemian (np. sekwencje aminokwasowe) z każdej z dwu cząsteczek, jak również regiony pokrywające się, wspólne dla obu cząsteczek. Schematycznie wspomnianą cząsteczkę hybrydową można przedstawić następująco: X-Y-Z, gdzie Y przestawia region identyczności lub dużego podobieństwa dla obu pokrewnych cząsteczek (region pokrywający się), X przedstawia region z jednej z wspomnianych cząsteczek, a Z przedstawia region z drugiej z wspomnianych cząsteczek. Przykład projektowania antygenu o podwójnej specyficzności opartego na peptydzie hybrydowym obejmującym sekwencje dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych białek opisany jest szczegółowo w Przykładzie 3.
Inny rodzaj cząsteczki hybrydowej jest cząsteczką, w której peptyd został wprowadzony do białka o pełnej długości (dalej określanego jako białko docelowe). Peptydy wybrane są tak, by odpowiadały regionom funkcjonalnym dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych białek, na przykład, regionom oddziałującym z receptorem. Takie peptydy określane są dalej jako peptydy funkcjonalne. Funkcjonalny peptyd z jednego z pokrewnych białek może być następnie wprowadzony do innego, pokrewnego białka o pełnej długości, lub alternatywnie, do białka niepokrewnego. Na przykład peptyd IL-Ια odpowiadający regionowi oddziałującemu z receptorem IL-1a jest identyfikowany, i ten funkcjonalny peptyd
IL-1 α wprowadzany jest do białka o pełnej długości IL-1 β, w celu stworzenia białka hybrydowego IL-1a/lL-1e. Podobnie peptyd IL-1 β odpowiadający regionowi oddziałującemu z receptorem IL-1 β jest identyfikowany, i ten funkcjonalny peptyd IL-1e wprowadzany jest do białka o pełnej długości IL-1a, w celu stworzenia białka hybrydowego IL-1a/IL-1e. Wspomniane wprowadzenie funkcjonalnego peptydu do pokrewnego białka pełnej długości ogranicza peptyd funkcjonalny z obu końców i zachowuje strukturę fałdowania funkcjonalnego peptydu.
PL 208 069 B1
W przypadku cząsteczki hybrydowej IL-1 α/lL-l β peptyd funkcjonalny wprowadzany jest (zastępuje naturalne aminokwasy) w regionie docelowym odpowiadającej wspólnej strukturze przestrzennej IL-1 α i IL-1(< Wspomniane struktury można odszukać na całej długości białka (np. w regionie N-końcowym, w części środkowej i regionie C-końcowym). Ponadto funkcjonalne peptydy odpowiadające odpowiadającej wspólnej strukturze przestrzennej IL-WlL-^ można wprowadzić również do innych białek, takich jak albumina i niektórych innych naturalnie występujących białek. W takim przypadku korzystne miejsce wprowadzenia peptydu to region umożliwiający utrzymanie przez wprowadzany peptyd poprawnej struktury przestrzennej. Zatem miejsca wprowadzania peptydu mogą być regionem N-końcowym, regionem środkowym lub regionem C-końcowym białka. Miejsce wprowadzenia wspomnianych peptydów do naturalnie występującego białka docelowego dobrane jest tak, by naśladowało naturalne ograniczenia strukturalne, właściwe dla naturalnego białka z którego pochodzą wspomniane peptydy. Choć funkcjonalny peptyd może być po prostu wprowadzony do białka docelowego w taki sposób, że aminokwasy funkcjonalnego peptydu dodawane są do białka docelowego, to korzystnie aminokwasy funkcjonalnego peptydu zastępują część białka docelowego, do którego jest on wprowadzony.
Cząsteczka hybrydowa stosowana jest jako antygen o podwójnej specyficzności w celu wytworzenia przeciwciała o podwójnej specyficzności wobec IL-1a i IL-1 β, może być konstruowana tak, że funkcjonalny peptyd odpowiadający specyficznemu elementowi strukturalnemu albo IL-1a, albo IL-1 β wprowadzany jest do pełnej długości IL-1 β albo IL-1a w równoważnej pozycji strukturalnej. Wybrana cząsteczka hybrydowa zastępuje reszty 160-176 IL-1 β resztami 168-184 IL-1a. Powstająca cząsteczka ma następującą sekwencję aminokwasową, w której zastąpiona sekwencja IL-1a (reszty 168-184) jest podkreślona: APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMGAYKSSKD DAKITVILGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYI STSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS (Sek Id Nr 4)
Wspomnianą cząsteczkę można wytworzyć standardowymi metodami biologii molekularnej (np. klonowaniem, techniką PCR) stosując dostępne ogólnie sekwencje cDNA IL-1a i IL-1 β, i stosując techniki ekspresji rekombinowanego białka. Hybrydowy cDNA można uzyskać, wprowadzając cDNA do użytecznego wektora ekspresyjnego i eksprymując następnie polipeptyd przez wprowadzenie wektora ekspresyjnego do użytecznej komórki gospodarza.
D. Peptydy oparte na technice wykresów hydrofobowości
Antygen o podwójnej specyficzności można wybrać wybrany w oparciu o technikę wykresów hydrofobowości i wyboru peptydów z założenia wysoce antygenowych. Na przykład indeks antygenowości peptydów można wyliczyć posługując się programem przygotowanym przez Jamesona i Wolfa (CABIOS 4(1): 181-186, 1988). Regiony użyteczne do wiązania przeciwciał można wybrać maksymalizując tym samym prawdopodobieństwo antygenowości.
E. Immunizacja z wykorzystaniem komórek transfekowanych antygenem
Przeciwciało o podwójnej specyficzności może być otrzymywane przez immunizację komórkami transfekowanymi antygenem, (to jest antygeny o podwójnej specyficzności według wynalazku mogą być komórkami transfekowanymi antygenem). Można utworzyć linię komórkową która stabilnie eksprymuje dwa różne lecz strukturalnie pokrewne antygeny, lub cząsteczkę hybrydową. Można otrzymać na przykład linie komórkowe które stabilnie eksprymują IL-1a lub IL-1 β lub cząsteczkę hybrydową IL-1 a/lL-1 β (np. Sek Id Nr 4). Pożądane cząsteczki mogą być wydzielane z wspomnianych komórek (w przypadku białek rozpuszczalnych) lub mogą być wyrażane na powierzchni komórek (w przypadku receptorów czy enzymów). Dostarczenie genu do komórki gospodarza w celu umożliwienia ekspresji antygenu przez komórkę gospodarza można osiągnąć na wiele sposobów, włączając w to w sposób nieograniczający transfekcję, elektroporację, fuzję komórkową, lipofekcję, technikę bombardowania cząsteczkowego, mikroiniekcję lub infekcję wirusową). Linie komórkowe stabilnie eksprymującą antygen można przeszczepić na różne sposoby (dootrzewnowo, podskórnie, domięśniowo, lub podobnie) do organizmu pożądanego zwierzęcia w celu wytworzenia przeciwciał. Komórki mogą stanowić źródło wolno uwalnianego antygenu. Korzystnie komórki eksprymują białko o pełnej długości. Można jednak także eksprymować antygenowe fragmenty. W przypadku białek rozpuszczalnych, białka korzystnie są wydzielane z komórek. W celu wytworzenia przeciwciał o podwójnej specyficzności wobec pozakomórkowych domen dwu blisko pokrewnych receptorów, receptory powinny preferencyjnie ulegać ekspresji na powierzchni komórki.
PL 208 069 B1
F. Immunizacja jedną ze strukturalnie pokrewnych cząsteczek
Antygen o podwójnej specyficzności może być po prostu jedną z dwu różnych, lecz strukturalnie pokrewnych cząsteczek, dla którego wytwarzane są przeciwciała o podwójnej specyficzności. Jedna z dwu pokrewnych cząsteczek stosowana jest jako czynnik immunizacyjny i następnie wytworzony repertuar przeciwciał przeszukiwany jest pod kątem przeciwciał wiążących, i bardziej korzystnie neutralizujących, oba z dwu różnych, lecz pokrewnych strukturalnie cząsteczek. Na przykład można immunizować albo IL-1a albo IL-1 β i następnie poszukiwać przeciwciał wiążących α/β, i bardziej korzystnie, przeciwciał neutralizujących α/β. Termin „immunizacja” oznacza tu wystawienie repertuaru przeciwciał na antygen, taki jak IL-1a albo IL-1 β, in vivo albo in vitro. Zatem postać ta obejmuje immunizowanie zwierzęcia albo IL-1a albo IL-1 β i przeszukiwanie powstających przeciwciał w celu wyselekcjonowania przeciwciał wiążących zarówno IL-1a jak i IL-1 β, jak również przeszukiwanie rekombinowanej biblioteki przeciwciał in vitro z pomocą IL-1a albo IL-1 β i następnie selekcjonowanie rekombinowanych przeciwciał wiążących zarówno IL-1a jak i IL-1 β.
II. Sposoby tworzenia przeciwciał o podwójnej specyficzności
W celu wytworzenia przeciwciała o podwójnej specyficzności według wynalazku repertuar przeciwciał (in vivo lub in vitro) eksponowany jest na antygen o podwójnej specyficzności, otrzymany jak podano powyżej, i użyteczne przeciwciało o podwójnej specyficzności wybierane jest z wspomnianego repertuaru. Rozpoznawanie antygenu składa się z dwu elementów: rozpoznawania strukturalnego i dojrzewania powinowactwa w oparciu o specyficzne oddziaływania cząsteczkowe. W czasie naturalnej odpowiedzi immunologicznej, przeciwciała o niskim powinowactwie rozpoznające motywy strukturalne (np. rozpoznawanie antygenu przez receptory rozpoznające określone wzory strukturalne) powstają łatwo i na wczesnych etapach odpowiedzi immunologicznej, a następnie w wyniku mutacji somatycznych następuje zwiększenie powinowactwa niektórych klonów. Zaprojektowano różnorodne procesy in vivo i in vitro naśladujące to naturalne zjawisko. Przeciwciała o podwójnej specyficzności i niskim powinowactwie można tworzyć zarówno in vivo, jak i in vitro sposobami opisanymi powyżej, a przeciwciała monoklonalne o podwójnej specyficzności i wysokim powinowactwie można otrzymać drogą opisanej tu mutagenezy somatycznej. Ponadto w celu optymalizowania monoklonalnych przeciwciał o podwójnej, wysokiej specyficzności/podwójnej specyficzności i wysokim powinowactwie, można analizować struktury wykrystalizowanych wspólnie przeciwciał monoklonalnych z użytecznymi antygenami. Uzyskana w ten sposób informacja strukturalna może zostać następnie wykorzystana do wzmocnienia powinowactwa w wyniku zmiany (zmutowania) reszt przeciwciał monoklonalnych oddziałujących specyficznie z antygenem w celu wzmocnienia specyficznych oddziaływań cząsteczek, w sposób opisany.
Sposoby wytworzenia przeciwciał o podwójnej specyficzności z zastosowaniem sposobów in vivo, in vitro, lub połączenia obu sposobów, opisane są poniżej.
A. Sposoby in vivo
Standardowe sposoby in vivo otrzymywania przeciwciał obejmują immunizowanie użytecznego zwierzęcia antygenem i tym samym eksponowanie repertuaru przeciwciał in vivo na antygen, a następnie odzyskiwanie konkretnego przeciwciała lub przeciwciał z organizmu zwierzęcia. Sposób taki można zaadoptować do otrzymywania przeciwciał o podwójnej specyficzności, przez zastosowanie antygenu o podwójnej specyficzności a następnie selekcjonowanie przeciwciał pod kątem specyficznego rozpoznawania przez nie strukturalnie pokrewnych cząsteczek. Przeciwciała o podwójnej specyficzności można uzyskać immunizując użyteczne zwierzę (np. mysz, królika lub kozę lub innego ssaka, włączając w to ssaki transgeniczne lub nokautowane) immunogenną kompozycją antygenu o podwójnej specyficzności. Użyteczna immunogenna kompozycja może obejmować, na przykład, zsyntezowany chemicznie lub rekombinacyjnie eksprymowany antygen o podwójnej specyficzności. Kompozycja może ponadto obejmować adiuwant, taki jak kompletny lub niekompletny adiuwant Freunda, lub podobny składnik immunostymulujący. Ponadto, do wytworzenia przeciwciał, w szczególności techniką immunizacji in vivo stosuje się antygen o podwójnej specyficzności według wynalazku, osobno lub bardziej korzystnie jako koniugat z białkiem nośnikowym. Tego typu sposób stosowany do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej jest dobrze znany specjalistom. Przykłady użytecznych białek nośnikowych z którymi można połączyć antygen o podwójnej specyficzności obejmują hemocyjaninę KLH i albuminę.
Komórki wytwarzające przeciwciało można uzyskać ze zwierzęcia i stosować następnie do otrzymania przeciwciał monoklonalnych standardowymi technikami, takimi jak technika hybrydom opisana pierwotnie przez Kohlera i Milsteina (1975, Nature, 256: 495-497) (por. także Brown i wsp
PL 208 069 B1 (1981) J Immunol 127: 539-46; Brown i wsp (1980) J Biol Chem 255: 4980-83; Yeh i wsp (1976) PNAS 76: 2927-31; Yeh i wsp (1982) Int J Cancer 29: 269-75). Technologia wytwarzania przeciwciał monoklonalnych z wykorzystaniem hybrydom jest dobrze znana (patrz: RH Kenneth, Monoclonal antibodies: A new dimension in biological analyses, Plenum Publ Corp, NY (1980); EA Lerner (1981) Yale J Biol Med 54: 387-402; ML Grefter (1977) Somatic Cell Genet 3: 231-36). W skrócie: unieśmiertelniona linia komórkowa (zazwyczaj komórek szpiczaka) poddawana jest fuzji z limfocytami (grasicowymi lub z węzłów chłonnych lub obwodowymi) ze zwierzęcia immunizowanego antygenem o podwójnej specyficzności, jak opisano to powyżej, a następnie supernatant z hodowli komórkowej wytworzonych hybrydom przeszukiwany jest pod kątem występowania przeciwciał o podwójnej specyficzności, do dwu różnych ale strukturalnie pokrewnych cząsteczek, w celu wykrycia produkujących je hybrydom. W celu połączenia limfocytów i unieś miertelnionej linii komórkowej można zastosować dowolny protokół eksperymentalny, prowadzący do wytworzenia hybrydom produkujących przeciwciała monoklonalne o podwójnej specyficzności, (patrz np. G Galfre i wsp (1977) Nature 266: 550-52; Gefter i wsp. Somatic Cell Genet, op. cit.; Lerner Yale J Biol Med op. cit.; Kenneth, Monoclonal Antibodies, op. cit.). Ponadto specjaliście znane są użyteczne odmiany opisanych wyżej sposobów. Zazwyczaj unieśmiertelniona linia komórkowa (np. linia komórek szpiczaka) pochodzi z tego samego rodzaju zwierzęcia, z którego pochodzą limfocyty. Na przykład mysie hybrydomy można wytworzyć poprzez fuzję limfocytów z myszy immunizowanych kompozycją według wynalazku, z unieśmiertelnioną linią komórek mysich. Korzystna unieśmiertelniona linia komórek mysich to mysie komórki szpiczaka, wrażliwe na obecność w podłożu hodowlanym hipoksantyny, aminopteryny i tymidyny (podłoże HAT). Można zastosować dowolną linię komórek szpiczaka w procesie fuzji z wykorzystaniem standardowych sposobów (np. z wykorzystaniem linii P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 lub Sp2/O-Ag14). Wspomniane linie komórek szpiczaka można uzyskać z American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD. Zazwyczaj mysie komórki szpiczaka wrażliwe na podłoże HAT poddawane są fuzji z mysimi komórkami grasicowymi z wykorzystaniem glikolu polietylenowego (PEG). Powstające hybrydomy selekcjonowane są na podłożu HAT, w którym giną komórki które nie uległy połączeniu lub uległy niewłaściwemu połączeniu komórki szpiczaka (komórki grasicowe giną po kilku dniach, ponieważ nie uległy transformacji). Komórki hybrydom wytwarzające przeciwciała monoklonalne specyficznie rozpoznające dwie strukturalnie pokrewne pożądane cząsteczki według wynalazku można zidentyfikować przeszukując supernatant z hodowli komórek hybrydom pod kątem wytwarzania takich przeciwciał stosując np. standardowy test ELISA, w celu wyselekcjonowania przeciwciał specyficznie wiążących dwie pokrewne cząsteczki.
W zależności od rodzaju pożądanego przeciwciała do immunizacji in vivo można stosować różne organizmy zwierzęce. Można stosować organizm zwierzęcy, który sam z siebie wytwarza endogenną wersję pożądanego(-ych) antygenu(-ów) lub alternatywnie, gospodarz może być pozbawiony zdolności wytwarzania endogennej wersji pożądanego(-ych) antygenu(-ów). Na przykład wykazano, że myszy nie wytwarzające niektórych endogennych białek (myszy nokautowane, np. w wyniku rekombinacji homologicznej wygaszającej aktywność genu endogennego) rozwijają odporność humoralną na wspomniane, po immunizacji wspomnianym białkiem i mogą być zatem wykorzystane do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych o wysokim powinowactwie skierowanych przeciw wspomnianemu białku (por. np. Roes J i wsp (1995) J Immunol Methods 183, 231-237; Lunn MP i wsp (2000) J Neurochem 75, 404-412).
Dla wytwarzania przeciwciał innych niż ludzkie (np. skierowanych przeciw ludzkiemu antygenowi o podwójnej specyficzności), można stosować wiele różnych organizmów ssaków innych niż ludzie, jako użytecznych gospodarzy do wytwarzania przeciwciała, włączając w to w sposób nieograniczający myszy, szczury, króliki i kozy (lub wersje nokautowe wspomnianych organizmów), jakkolwiek myszy są organizmami preferowanymi w przypadku wytwarzania hybrydom. Ponadto dla wytwarzania całkowicie ludzkich przeciwciał skierowanych przeciw ludzkiemu antygenowi o podwójnej specyficzności można wykorzystać większość zwierząt, które eksprymują ludzki repertuar przeciwciał, włączając w to zwierzęta transgeniczne (np. myszy) transgenizowane ludzką immunoglobuliną, myszy chimerowe huPBMC-SCID oraz ludzko-mysie chimery radiacyjne, co zostanie przedyskutowane poniżej.
Zatem w jednej postaci zwierzę immunizowane antygenem o podwójnej specyficzności, jest korzystnie myszą, transgeniczną pod względem genu kodującego ludzką immunoglobulinę, taką iż wytwarza ludzkie przeciwciała po stymulacji antygenem. Do takiego zwierzęcia, najczęściej, wprowadzone są ludzkie geny kodujące lekki i ciężki łańcuch immunoglobulin w konfiguracji płodowej, przy czym endogenne loci tego zwierzęcia kodujące lekki i ciężki łańcuch immunoglobuliny są nieaktywne. Po
PL 208 069 B1 stymulacji antygenem (np. ludzkim antygenem) wytwarzane są przeciwciała pochodzące ze wspomnianych ludzkich sekwencji immunoglobuliny (tzn. ludzkie przeciwciała), i z limfocytów takiego zwierzęcia uzyskać można ludzkie przeciwciała monoklonalne standardowymi technikami otrzymywania hybrydom. Dalszy opis myszy transgenicznej z ludzkim transgenem immunoglobulinowym oraz zastosowanie wspomnianego zwierzęcia do wytwarzania ludzkich przeciwciał można znaleźć np. Patent US Nr 5,939,598, Publikacja PCT Nr WO 96/33735, Publikacja PCT Nr WO 96/34096, Publikacja PCT Nr WO 98/24893, Publikacja PCT Nr WO 99/53049 Abgenix Inc; Patent US Nr 5,545,806, Nr 5,569,825, Nr 5,625,126, Nr 5,633,425, Nr 5,661,016, Nr 5,770,429, Nr 5,814,318, Nr 5,877,397 i Publikacja PCT Nr WO 99/45962 Genopharm Inc, oraz MacQuitty JJ, Kay RM (1992) Science 257: 1188; Taylor LD i wsp (1992) NAR 20: 6287-95; Lonberg N i wsp (1994) Nature 368: 856-59; Lonberg N i Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13: 65-93; Harding FA i Lonberg N (1995) Ann NY Acad Sci 764: 536-46; Fishwild DM i wsp (1996) Nature Biotechnol 14: 845-51; Mendez MJ i wsp (1997) Nature Genet 15: 146-156; Green LL I Jakobovits A (1998) J Exp Med 188: 483-95; Green LL (1999) J Immunol Methods 231: 11-23; Yang XD i wsp (1999) J Leukoc Biol 66: 401-410; Galio ML i wsp (2000) Eur J Immunol 30: 543-40,
Zwierzę immunizowane antygenem o podwójnej specyficzności może być myszą z SCID, rekonstytuowaną z użyciem ludzkich obwodowych komórek jednojądrowych lub komórek limfoidalnych lub ich prekursorów. Wspomniana mysz chimerowa, określana jest skrótem hu-PBMC-SCID, wytwarza ludzkie immunoglobuliny w odpowiedzi na stymulację antygenem. Dla dalszego opisu wspomnianej myszy i wytwarzania przeciwciała por. np.: Leader KA i wsp (1992) Immunology 76: 229-234; Bombil F i wsp (1996) Immunobiol 195: 360-75; Murphy WJ i wsp (1996) Semin Immunol 8: 233-41; Herz U i wsp (1997) Int Arch Allergy Immunol 113: 150-152; Albert SE i wsp. (1997) J Immunol 159: 1393-1403; Nguyen H i wsp (1997) Microbiol Immunol 41: 901-907; Arai K i wsp (1998) J Immunol Methods 217: 79-85; Yoshinari K i Arai K (1998) Hybridoma 17: 41-45; Hutchins WA i wsp (1999) Hybridoma 18: 121-129; Murphy WJ i wsp (1999) Clin Immunol 90: 22-27; Smithson SL i wsp (1999) Mol Immunol 36: 113-124; Charmat S i wsp (1999) J Infect Diseases 180: 268-277; Heard C i wsp (1999) Molec Med 5: 35-45.
Zwierzę immunizowane przy pomocy antygenu o podwójnej specyficzności może być myszą traktowaną letalną dawką promieniowania, a następnie poddaną przeszczepowi komórek szpiku kostnego myszy z SCID, a następnie przeszczepieniu funkcjonalnych ludzkich limfocytów. Ten typ zwierzęcia chimerowego, określany mianem systemu Trimera, stosuje się do wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych przez immunizację wspomnianej myszy pożądanym antygenem a następnie otrzymanie przeciwciał monoklonalnych z zastosowaniem standardowych technik hybrydomy. Dalsze szczegóły można znaleźć np. w: Eren R i wsp (1998) Immunol 93: 154-161; Reisner Y i Dagan S (1998) Trends Biotechnol 16: 242-246; Ilan E i wsp (1999) Hepatology 29: 553-562; Bocher WO i wsp (1999) Immunology 96: 634-641.
B. Sposoby in vitro
Alternatywą do wytwarzania przeciwciał o podwójnej specyficzności w wyniku immunizacji in vivo oraz selekcji, jest przeszukiwanie rekombinowanych bibliotek kombinatoryjnych immunoglobuliny (np. bibliotek fagowych przeciwciał) z wykorzystaniem antygenu o podwójnej specyficzności, w celu wyizolowania składników biblioteki specyficznie wiążących dwie różne, lecz strukturalnie pokrewne pożądane cząsteczki. Zestawy odczynnikowe do tworzenia i przeszukiwania bibliotek fagowych dostępne są handlowo (np. Recombinant Phage Antibody System, Pharmacia Nr Kat 27-9400-01; SurfZAP(tm) Phage Display Kit, Stratagene Nr Kat 240612). W różnych postaciach biblioteka fagowa jest biblioteką scFv lub Fab. Technika fagowa do przeszukiwania bibliotek rekombinowanych przeciwciał opisana jest wyczerpująco w literaturze przedmiotu. Przykłady metod i związków szczególnie użytecznych do tworzenia i przeszukiwania bibliotek przeciwciał można znaleźć np. : McCafferty i wsp Publikacja Międzynarodowa Nr WO 92/01047, Patent US Nr 5,969,108 i EP 589,877 (w szczególności dla bibliotek scFv), Landner i wsp Patent US Nr 5,223,409, Nr 5,403,484, Nr 5,571,698, Nr 5,837,500 i EP 436,597 (przykładowo dla fuzji FpIII); Dower i wsp Publikacja Międzynarodowa Nr WO 91/17271, Patent US Nr 5,427,908, Patent US Nr 5,580,717 i EP 527,839 (w szczególności dla Fab); Winter i wsp Publikacja Międzynarodowa WO 92/20791 i EP 368,684 (w szczególności przedstawienie klonowania regionu zmiennego immunoglobuliny); Griffith i wsp Patent US Nr 5,885,793 i EP 589,877 (opisujące w szczególnoś ci izolowanie ludzkich przeciwciał przeciw ludzkim antygenom z wykorzystaniem rekombinowanych bibliotek); Garrard i wsp Publikacja Międzynarodowa Nr WO 92/09690 (opisująca w szczególności techniki ekspresji w fagach); Knappik i wsp Publikacja Międzynarodowa Nr WO
PL 208 069 B1
97/08320 (opisująca bibliotekę ludzkich rekombinowanych przeciwciał HuCal); Salfeld i wsp Publikacja
Międzynarodowa Nr WO 97/29131 (otrzymanie rekombinowanego ludzkiego przeciwciała skierowanego przeciw ludzkiemu antygenowi (ludzkiemu TNFa), jak również dojrzewanie in vitro powinowactwa rekombinowanego przeciwciała) i Salfeld i wsp US Zgłoszenie Tymczasowe Nr 60/126,603 (opisujące również wytworzenie ludzkiego rekombinowanego przeciwciała skierowanego przeciw ludzkiemu antygenowi (ludzkiej IL-12), jak również dojrzewanie in vitro powinowactwa rekombinowanego przeciwciała).
Inne opisy przeszukiwania biblioteki rekombinowanych przeciwciał można znaleźć w publikacjach naukowych, takich jak: Fuch i wsp (1991) Bio/Technology 9: 1370-72; Hay i wsp (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81-85; Huse i wsp (1992) Science 246: 1275-1281; Griffith i wsp (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins i wsp (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clarkson i wsp (1991) Nature 352: 624628; Gram i wsp (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad i wsp (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom i wsp (1991) NAR 19: 4133-4137; Barbas i wsp (1991) PNAS 88: 7978-7982; McCafferty i wsp (1990) Nature 348: 552-554; Knappik i wsp (2000) J Mol Biol 296, 57-86.
Alternatywą w stosunku do systemu bakteriofagowego jest eksprymowanie biblioteki rekombinowanych przeciwciał na powierzchni komórki drożdżowej lub bakteryjnej. Sposoby uzyskania i przeszukiwania bibliotek przeciwciał eksprymowanych na powierzchni komórki drożdżowej opisane są w Publikacji PCT WO 99/36569. Sposoby uzyskania i przeszukiwania bibliotek przeciwciał eksprymowanych na powierzchni komórki bakteryjnej opisane są w Publikacji PCT WO 98/49286.
Gdy pożądane przeciwciało zostanie zidentyfikowane w obrębie biblioteki kombinatoryjnej, DNA kodujące lekkie i ciężkie łańcuchy przeciwciała izolowane są standardowymi technikami biologii molekularnej, takimi jak amplifikacja techniką PCR z wybranego miejsca biblioteki (np. z faga). Sekwencje nukleotydowe genów lekkiego i ciężkiego łańcucha do których utworzyć można startery PCR są znane specjalistom. Na przykład wiele takich sekwencji zostało ujawnionych w: Kabat EA i wsp (1991) Sequences of proteins of immunological interest, Vth Ed US Dept of Health & Human Services, NIH Publ Nr 91-3242 oraz b bazie danych Vbase ludzkich sekwencji płodowych.
Przeciwciało, lub część przeciwciała, według wynalazku może zostać otrzymana poprzez ekspresję rekombinowanych genów kodujących łańcuch lekki i ciężki immunoglobuliny w komórce gospodarza. W celu rekombinacyjnego eksprymowania przeciwciała, komórka gospodarza transfekowana jest jednym lub większą liczbą rekombinowanych wektorów ekspresyjnych niosących fragmenty DNA kodujące łańcuchy lekki i ciężki przeciwciała, takiego iż łańcuchy lekki i ciężki eksprymowane są w komórce gospodarza, korzystnie, wydzielane są do podłoża hodowlanego w którym wzrasta komórka gospodarza, z którego to podłoża można odzyskać wspomniane przeciwciało. Do otrzymania genów kodujących lekki i ciężki łańcuch przeciwciał, włączenia tych genów do wektora ekspresyjnego i wprowadzenia wspomnianych wektorów do komórki gospodarza można stosować standardowe techniki rekombinowania DNA, takiej jak podane w: Sambrook, Fritsch i Maniatis (wyd) Molecular cloning: a laboratory manual. 2 wyd CSH, NY (1989), Ausubel FM (wyd) Current protocols in molecular biology, Greene Publ Ass (1989) oraz Patent US Nr 4,816,397 (Bross i wsp).
Gdy fragmenty DNA kodujące segmenty VH i VL pożądanego przeciwciała zostaną otrzymane, wspomnianymi fragmentami DNA można dalej manipulować stosując standardowe techniki rekombinowania DNA, na przykład przekształcając region zmienny genów w pełnej długości geny kodujące łańcuch przeciwciała, we fragment Fab czy gen scFv. Przy tych manipulacjach fragmenty DNA kodujące VL i VH są przyłączane w sposób umożliwiający działanie do innych fragmentów DNA kodujących inne białko, takiej jak stały region przeciwciała lub linker. Termin „przyłączane w sposób umożliwiający działanie” tu stosowany wskazuje iż dwa fragmenty DNA łączone są w taki sposób, iż sekwencje aminokwasowe kodowane przez wspomniane dwa fragmenty DNA tworzą ramkę odczytu.
Wyizolowany DNA kodujący region VH może zostać przekształcony w gen kodujący pełnej długości łańcuch ciężki przez połączenie w sposób umożliwiający działanie DNA kodującego region VH, z inną cząsteczką DNA kodującą regiony stałe łańcucha ciężkiego (CH1, CH2 i CH3). Sekwencje genów kodujących ludzkie regiony stałe łańcucha ciężkiego są znane specjalistom (patrz np. Kabat EA (1991) Sequences of proteins of immunological interest, Vth Ed US Dept of Health & Human Services, NIH Publ Nr 91-3242) i fragmenty DNA obejmujące wspomniane regiony można otrzymać stosując standardową technikę PCR. Region stały łańcucha ciężkiego może pochodzić z regionu stałego IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM lub IgD, lecz korzystanie ze stałego regionu IgG1 lub IgG4. W przypadku fragmentu genu Fab łańcucha ciężkiego, DNA kodujący VH może zostać przyłączony w sposób umożliwiający działanie do innej cząsteczki DNA kodującej region stały CH1 łańcucha ciężkiego.
PL 208 069 B1
Wyizolowany DNA kodujący region VL może zostać przekształcony w gen pełnej długości kodujący łańcuch lekki (jak również gen fragmentu Fab łańcucha lekkiego) przez połączenie w sposób umożliwiający działanie fragmentu DNA kodującego VL z inną cząsteczką DNA kodującą region stały CL łańcucha lekkiego. Sekwencje genów regionów stałych łańcucha lekkiego są znane specjalistom (np. Kabat EA (1991) Sequences of proteins of immunological interest, wyd. 5, US Dept of Health & Human Services, NIH Publ Nr 91-3242) i fragmenty DNA obejmujące wspomniane regiony można uzyskać stosując standardowe techniki amplifikacji (PCR). Regiony stałe łańcucha lekkiego mogą być regionami stałymi kappa lub lambda, lecz korzystanie regionem stałym kappa.
W celu skonstruowania genu scFv, fragmenty DNA kodujące VH i VL są łączone w sposób umożliwiający działanie z innym fragmentem kodującym ruchomy linker np. kodującym sekwencje aminokwasową (Gly4-Ser)3, w taki sposób iż sekwencje VH i VL mogą być eksprymowane jako ciągłe, jednołańcuchowe białko, z regionami VL i VH połączonymi ruchomym linkerem (patrz np. Bird i wsp (1988) Science 242: 423-426; Suston i wsp (1988) PNAS 85, 5879-5883; McCafferty i wsp (1990) Nature 348, 552-554).
W celu eksprymowania rekombinowanych przeciwciał lub części przeciwciał według wynalazku, DNA kodujące część sekwencji lub pełnej długości łańcuch ciężki i lekki, uzyskane jak podano wyżej, mogą zostać wprowadzone do wektora ekspresyjnego, takiego by geny połączone były w sposób umożliwiający działanie z sekwencjami regulatorowymi właściwymi dla procesów transkrypcji i translacji. W tym kontekście, termin „połączone w sposób umożliwiający działanie” oznacza, że gen przeciwciała połączony jest z sekwencją wektora w taki sposób że transkrypcyjne i translacyjne sekwencje regulatorowe z wektora służą jako sekwencje regulatorowe transkrypcji i translacji wprowadzonego, wspomnianego genu. Wektor ekspresyjny i wspomniane sekwencje regulatorowe zostały wybrane tak, by były zgodne z komórką gospodarza. Gen kodujący lekki łańcuch przeciwciała i gen kodujący ciężki łańcuch przeciwciała mogą być wprowadzone do oddzielnych wektorów, lub najczęściej, oba wprowadzone są do tego samego wektora ekspresyjnego. Geny przeciwciała wprowadzane są do wektora ekspresyjnego metodami standardowymi (np. poprzez ligację z wykorzystaniem komplementarnych miejsc restrykcyjnych wektora i genu przeciwciała, lub za pomocą ligacji na tępe końce, w przypadku braku użytecznych miejsc restrykcyjnych). Przed wprowadzeniem sekwencji łańcucha ciężkiego i lekkiego, wektor ekspresyjny może nieść sekwencję kodującą region stały przeciwciała. Na przykład jeden sposób przekształcania sekwencji VH i VL w geny przeciwciała pełnej długości, polega na wprowadzeniu wspomnianych sekwencji do wektora ekspresyjnego kodującego odpowiednio region stały łańcucha ciężkiego i region stały łańcucha lekkiego, w taki sposób że segmenty VH przyłączony jest w sposób umożliwiający działanie z segmentem(-ami) CH w obrębie wektora, i segment VL przyłączony jest w sposób umożliwiający działanie z segmentem CL w obrębie wektora. Ponadto lub alternatywnie rekombinowany wektor ekspresyjny może kodować peptyd sygnalny, ułatwiający wydzielanie łańcucha przeciwciała z komórki gospodarza. Gen kodujący łańcuch przeciwciała może być sklonowany w wektorze takim, iż peptyd sygnalny przyłączony jest w ramce odczytu z końcem N genu kodującego łańcuch przeciwciała. Peptyd sygnalny może być peptydem sygnalnym właściwym dla immunoglobulin lub heterologicznym peptydem sygnalnym (to jest peptydem sygnalnym z białka innego niż immunoglobulina).
Oprócz genów kodujących łańcuch przeciwciała, rekombinowane wektory ekspresyjne według wynalazku mogą nieść sekwencje regulatorowe kontrolujące ekspresję genów kodujących łańcuch przeciwciała w komórkach gospodarza. Termin „sekwencje regulatorowe” obejmuje promotory, enhancery i inne elementy regulacyjne kontrolujące ekspresję (np. sygnały poliadenylacji), kontrolujące transkrypcję lub translację genów kodujących łańcuch przeciwciała. Wspomniane sekwencje regulatorowe opisane są na przykład w: Goeddel, Gene expression technology: Methods Enzymol 185, Acad Press, San Diego (1990). Specjaliści wiedzą, iż projektowanie wektora ekspresyjnego obejmującego sekwencje regulatorowe może zależeć od takich czynników jak wybór komórki gospodarza, poziom ekspresji pożądanego białka itp. Korzystne sekwencje regulatorowe właściwe dla komórek ssaczych obejmują wirusowe sekwencje zwiększające poziom ekspresji białka w komórkach ssaczych, takie jak promotory i/lub enhancery pochodzące z CMV (takie jak promotor/enhancer CMV), SV40 (takie jak promotor/enhancer SV40), adenowirusa (np. późny promotor AdMLP) i wirusa poliomy. Dalszy opis elementów regulatorowych pochodzących z wirusów i ich sekwencje znajdują się np. Patent US Nr 5,168,062, Stinski; Patent US Nr 4,510,245, Bell i wsp; Patent US Nr 4,968,615 Schaffner i wsp.
Oprócz genów kodujących łańcuch przeciwciała i sekwencji regulatorowych, rekombinowany wektor ekspresyjny według wynalazku może posiadać sekwencje dodatkowe, takie jak sekwencje
PL 208 069 B1 regulujące replikację wektora w komórce gospodarza (np. ori) i umożliwiające selekcję geny markerowe. Geny markerowe umożliwiające selekcję umożliwiają wybieranie komórek gospodarza do których został wprowadzony wspomniany wektor (por. np. Patent US Nr 4,399,216; 4,634,665; 5,179,017 Axel i wsp). Na przykład typowymi markerami selekcyjnymi są geny nadające komórce gospodarza do której wprowadzony został wektor, oporność na leki typu G418, higromycynę lub metotreksat. Korzystne genomy markerów selekcyjnych obejmują gen DHFR (reduktazy folianowej) (wykorzystywany w komórkach dhfr- w przypadku selekcji/amplifikacji przy użyciu metotreksatu) i gen neo (w przypadku selekcji G418).
W celu ekspresji łańcuchów lekkiego i ciężkiego, wektor(-y) ekspresyjny kodujący łańcuchy lekki i ciężki wprowadzony zostaje poprzez transfekcję do komórki gospodarza technikami standardowymi. Termin „transfekcja obejmuje szeroki zakres technik stosowanych zwykle do wprowadzania egzogennego DNA do prokariotycznych lub eukariotycznych komórek gospodarza np. elektroporację, metodę wapniową, zastosowanie DEAE-dekstranu i podobne sposoby. Choć możliwe jest teoretycznie eksprymowanie przeciwciała według wynalazku zarówno w komórce prokariotycznej, jak i eukariotycznej, korzystne jest eksprymowanie wspomnianego przeciwciała w komórce eukariotycznej, najkorzystniej korzystniej w komórce ssaczej, jest to korzystne z tego względu, iż w konkretnych komórkach eukariotycznych bardziej prawdopodobne w porównaniu z komórką prokariotyczną jest właściwe fałdowanie i wydzielanie białka w postaci biologicznie aktywnej. Ekspresja w komórce prokariotycznej genów kodujących przeciwciało może być nieefektywna gdy konieczne jest wytwarzanie dużych ilości aktywnego przeciwciała (Boss MA i Wood CR (1985) Immunol Today 6: 12-13).
Korzystne komórki ssacze, użyteczne do eksprymowania rekombinowanych przeciwciał według wynalazku to komórki CHO (włączając w to komórki CHO dhfr-, opisane przez Urlauba i Chasina (1980) PNAS 77: 4216-20, wykorzystujące marker selekcyjny DHFR np. tak jak opisano to w artykule RJ Kaufmana i PA Sharpa (1982) Mol Biol 159: 601-621), komórki NS0, komórki COS, komórki SP2. Gdy do komórki ssaczego gospodarza wprowadzony zostanie rekombinowany wektor ekspresyjny obejmujący geny przeciwciała, przeciwciała produkowane są podczas hodowli komórek gospodarza przez czas wystarczająco długi do ekspresji przeciwciała w komórce gospodarza, lub bardziej korzystnie, do wydzielenia przeciwciała do podłoża hodowlanego w którym wzrastają komórki gospodarza. Przeciwciała można odzyskać z pożywki hodowlanej stosując standardowe sposoby oczyszczania białek.
Komórka gospodarza może zostać również wykorzystana do wytwarzania części pełnego przeciwciała, takiego jak fragment Fab czy cząsteczka scFv. Jest zrozumiałe, że w ramach wynalazku można stosować odmiany opisanej wyżej procedury. Na przykład może okazać się pożądane aby transfekować komórkę gospodarza przy pomocy DNA kodującego albo łańcuch lekki, albo ciężki (lecz nie oba naraz) przeciwciała według wynalazku. Można również zastosować technologię rekombinacji DNA do usunięcia części lub całości DNA kodującego albo lekki albo ciężki łańcuch, który nie jest konieczny do wiązania pożądanego antygenu. Cząsteczki białka eksprymowane w oparciu o takie kadłubowe cząsteczki DNA są również przeciwciałami według wynalazku. Ponadto, stosując sprzęganie przeciwciała według wynalazku z drugim przeciwciałem, za pomocą standardowych technik sprzęgania chemicznego, można wytwarzać przeciwciała o podwójnej funkcji w których jeden łańcuch lekki lub jeden ciężki rozpoznają specyficznie antygen inny niż pożądany antygen.
Preferowany układ do rekombinacyjnej ekspresji przeciwciała lub części wiążącej antygen przeciwciała, według wynalazku, to rekombinowany wektor ekspresyjny kodujący zarówno łańcuch lekki, jak i ciężki przeciwciała, wprowadzony do komórek CHO dhfr- metodą transfekcji wapniowej. W obrębie rekombinowanego wektora ekspresyjnego geny kodujące łańcuch lekki i ciężki przeciwciała, przyłączone są w sposób umożliwiający działanie do enhancera CMV/promotora AdMLP w celu uzyskania wysokiej wydajności transkrypcji wspomnianych genów. Rekombinowany wektor ekspresyjny może obejmować również gen DHFR, umożliwiający selekcję i amplifikację komórek CHO transfekowanych wektorem, przy użyciu metotreksatu. Wyselekcjonowane transfektanty hodowane są w celu zapewnienia ekspresji łańcuchów lekkiego i ciężkiego przeciwciała, i odzyskania pełnego przeciwciała z podłoża hodowlanego. Do utworzenia rekombinowanego wektora ekspresyjnego, transfekcji komórek gospodarza, selekcji transfektantów, hodowli komórek gospodarza i odzyskania przeciwciała z podłoża hodowlanego stosowane są standardowe techniki biologii molekularnej. Wynalazek dostarcza ponadto sposobu syntezowania rekombinowanego przeciwciała według wynalazku przez hodowanie komórki gospodarza według wynalazku w użytecznym podłożu hodowlanym, do czasu gdy przeciwciało według wynalazku zostanie wytworzone. Sposób obejmuje ponadto izolowanie rekombinowanego przeciwciała z podłoża hodowlanego.
PL 208 069 B1
Oprócz przeszukiwania rekombinowanych bibliotek fagowych przeciwciała, stosować można inne sposoby znane specjalistom, do przeszukiwania dużych kombinatoryjnych bibliotek w celu identyfikacji przeciwciał o podwójnej specyficzności według wynalazku. Jednym z rodzajów alternatywnego układu ekspresyjnego, jest układ w którym rekombinowana biblioteka przeciwciała powstaje w wyniku ekspresji fuzantów RNA-białko, tak jak opisano to w: Publikacja PCT Nr WO 98/31700 Szostak i Roberts, oraz Roberts RW i Szostak JW (1997) PNAS 94: 12297-12302. We wspomnianym układzie tworzony jest kowalencyjny fuzant końca 3' mRNA i peptydu lub białka, powstającego w wyniku translacji in vitro syntetycznego mRNA kodującego puromycynę, antybiotyk wiążący się w miejscu peptydylowym. W ten sposób można wzbogacić bibliotekę mRNA o specyficzne frakcje (np. z biblioteki kombinatoryjnej) w oparciu o własności kodowanego białka lub peptydu (np. przeciwciała, jego części), takie jak wiązanie się przeciwciała lub jego części z antygenem o podwójnej specyficzności. Sekwencje nukleotydowe kodujące przeciwciało lub jego część można odzyskać w wyniku przeszukiwania wspomnianych bibliotek i eksprymować metodami rekombinacyjnymi jak podano to wyżej (np. w komórkach ssaczego gospodarza) i ponadto można poddać dalszemu dojrzewaniu powinowactwa, przez dodatkową rundę przeszukiwania fuzantów mRNA-peptydylowych, w których wprowadzane są dodatkowe mutacje w stosunku do pierwotnie wybranych sekwencji lub stosując inne sposoby dojrzewania powinowactwa rekombinowanych przeciwciał in vitro, jak opisano to powyżej.
C. Sposoby łączone
Przeciwciała o podwójnej specyficzności można otrzymać stosując połączenie sposobów in vivo i in vitro, takie jak sposoby w których antygen o podwójnej specyficzności oddziałuje z repertuarem przeciwciał in vivo w organizmie zwierzęcia gospodarza w celu stymulowania wytwarzania przeciwciał wiążących antygen o podwójnej specyficzności, ale gdzie dalsze etapy selekcji i/lub dojrzewania przeciwciała (to jest polepszania specyficzności) dokonują się z zastosowaniem jednej lub wielu technik in vitro.
Wspomniane połączenie metod może obejmować początkową immunizację organizmu zwierzęcego (np. myszy, królika, szczura, kozy czy wersji transgenicznej wymienionych organizmów lub myszy chimerowej) przy pomocy antygenu o podwójnej specyficzności w celu wywołania stymulacji odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw wspomnianemu antygenowi, a następnie otrzymanie i poszukiwanie biblioteki fagowej z zastosowaniem sekwencji immunoglobulin z limfocytów stymulowanych in vivo przez wystawienie na działanie antygenu o podwójnej specyficzności. Pierwszy etap wspomnianego połączonego sposobu można przeprowadzić tak, jak podano to w punkcie IIA powyżej, a drugi etap wspomnianego sposobu można przeprowadzić tak, jak podano to w punkcie IIB powyżej. Korzystne sposoby hiperimmunizowania zwierząt oraz przeszukiwanie bibliotek fagowych in vitro uzyskanych ze stymulowanych limfocytów obejmują sposób podane przez BioSite Inc np. w Publikacji PCT WO 98/47343, Publikacji PCT WO 91/17271, Patencie US Nr 5,427,908 i Patencie US Nr 5,580,717.
Połączony sposób może obejmować początkową immunizację organizmu zwierzęcego (np. myszy, królika, szczura, kozy czy wersji nokautowanej i/lub transgenicznej wymienionych organizmów lub myszy chimerowej) przy pomocy antygenu o podwójnej specyficzności w celu wywołania stymulacji odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw wspomnianemu antygenowi, a następnie selekcjonowanie limfocytów wytwarzających przeciwciała o pożądanej podwójnej specyficzności (np. poprzez przeglądanie hybrydom uzyskanych z immunizowanego zwierzęcia). Następnie izoluje się rearanżowane geny przeciwciała z wybranych klonów z zastosowaniem standardowych metod biologii molekularnej, takich jak RT-PCR, i poddaje się je dojrzewaniu powinowactwa in vitro, w celu zwiększenia zdolności do wiązania wyselekcjonowanego przeciwciała lub przeciwciał. Pierwszy etap wspomnianej procedury może zostać przeprowadzony tak, jak opisano to w punkcie IIA powyżej, podczas gdy etap drugi można przeprowadzić tak jak podano to w punkcie IIB powyżej, w szczególności stosując sposób dojrzewania powinowactwa in vitro opisany np. w Publikacji PCT WO 97/29131 i Publikacji PCT WO 00/56772.
W kolejnym sposobie rekombinowane przeciwciała otrzymuje się z pojedynczych, izolowanych limfocytów, stosując procedurę określaną w literaturze przedmiotu jako „selected lymphocyte antibody method” (SLAM), tak jak opisano to w Patencie US Nr 5,627,052, Publikacji PCT WO 92/02551 i Babcock JS i wsp (1996) PNAS 93: 7843-7848. W sposobie tym, zastosowanym w odniesieniu do przeciwciał o podwójnej specyficzności według wynalazku, zwierzę (np. mysz, szczur, królik, koza lub wersja transgeniczna wymienionych zwierząt lub mysz chimerowa) jest najpierw immunizowana in vivo za pomocą antygenu o podwójnej specyficzności w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej wobec wspomnianego antygenu i następnie selekcjonowaniu pojedynczych komórek wydzielających pożą16
PL 208 069 B1 dane przeciwciało np. specyficzne wobec antygenu o podwójnej specyficzności w teście płytkowej hemolizy zależnej od antygenu (np. antygen o podwójnej specyficzności lub strukturalnie pokrewne pożądane cząsteczki, sprzęgane są z owczymi erytrocytami z zastosowaniem linkera, takiego jak biotyna, co umożliwia identyfikację w teście płytkowej hemolizy, pojedynczej komórki wydzielającej przeciwciała o określonej specyficzności). Po zidentyfikowaniu komórek wydzielających pożądane przeciwciało, cDNA kodujące regiony zmienne łańcuchów lekkiego i ciężkiego uzyskiwane jest z komórek w drodze RT-PCR i wspomniane regiony zmienne są następnie eksprymowane, w połączeniu z odpowiednimi regionami stałymi immunoglobuliny (np. ludzkimi regionami stałymi) w komórkach ssaczych takich jak COS lub CHO. Komórki gospodarza transfekowane powielonymi sekwencjami immunoglobuliny, pochodzącymi z wybranych in vivo limfocytów, mogą być dalej analizowane i selekcjonowane in vitro, na przykład izolując spośród transfektantów komórki eksprymujące przeciwciała o podwójnej specyficzności z zastosowaniem płytek pokrytych antygenem. Powielone sekwencje immunoglobuliny mogą być poddawane dalszym manipulacjom in vitro, takim jak dojrzewanie powinowactwa in vitro, opisane powyżej.
Sposób łączony wytwarzania przeciwciała o podwójnej specyficzności może też obejmować następujące etapy. Najpierw zwierzę immunizowane jest w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej, pierwszym antygenem i drugie zwierze immunizowane jest drugim, różnym antygenem, przy czym korzystnie drugi antygen jest strukturalnie podobny do pierwszego antygenu. Następnie konstruowana jest biblioteka rekombinowanych łańcuchów ciężkich i biblioteka rekombinowanych łańcuchów lekkich z wykorzystaniem genów przeciwciał uzyskanych z pierwszego zwierzęcia i drugiego zwierzęcia, tak jak opisano to w punkcie IIB. Biblioteka łańcuchów ciężkich z wspomnianego zwierzęcia immunizowanego pierwszym antygenem, łączona jest z biblioteką łańcuchów lekkich uzyskana z wspomnianego drugiego zwierzęcia immunizowanego drugim antygenem, w celu utworzenia biblioteki antygenów X. Podobnie biblioteka łańcuchów ciężkich z wspomnianego zwierzęcia immunizowanego drugim antygenem, łączona jest z biblioteką łańcuchów lekkich uzyskaną z wspomnianego pierwszego zwierzęcia immunizowanego pierwszym antygenem, w celu utworzenia biblioteki antygenów Y. Dodatkowo biblioteki X i Y mogą być połączone by stworzyć bibliotekę XY. Przeciwciała o podwójnej specyficzności wiążące zarówno pierwszy, jak i drugi antygen można identyfikować i izolować z bibliotek X, Y i/lub XY.
III. Charakterystyka przeciwciał o podwójnej specyficzności
Wynalazek dostarcza sposobu otrzymywania przeciwciał o podwójnej specyficzności, jak również części wspomnianych przeciwciał. Przeciwciała lub ich części mogą być przeciwciałami izolowanymi. Przeciwciała lub ich części mogą być przeciwciałami neutralizującymi. Przeciwciała mogą obejmować przeciwciała monoklonalne i rekombinowane i ich części. Przeciwciała lub ich części mogą obejmować sekwencje aminokwasowe pochodzące całkowicie z pojedynczego gatunku, takie jak przeciwciało całkowicie ludzkie lub całkowicie mysie, lub ich części. Przeciwciało lub jego część może też być przeciwciałem chimerowym lub przeciwciałem chimerowym-CDR lub inną formą przeciwciała humanizowanego.
Termin „przeciwciało” oznacza tu cząsteczki immunoglobulin składające się z czterech łańcuchów polipeptydowych, dwu łańcuchów ciężkich (H) i dwu łańcuchów lekkich (L), połączonych między sobą wiązaniami dwusiarczkowymi. Każdy łańcuch ciężki składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (HCVR lub VH) i regionu stałego łańcucha ciężkiego. Region stały łańcucha ciężkiego składa się z trzech domen CH1, CH2 i CH3. Każdy łańcuch lekki składa się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego (LCVR lub VL) i regionu stałego łańcucha lekkiego. Region stały łańcucha lekkiego składa się z jednej domeny CL. Regiony VH i VL można podzielić na regiony nadzmienne, określane także jako regiony determinujące dopasowanie (complementarity determining regions, CDR), rozrzucone między regionami bardziej konserwatywnymi, określanymi mianem regionów zrębowych (framework regions, FR). Każdy region VH i VL składa się z trzech CDR i czterech FR, ułożonych poczynając od końca N do końca C w następującym porządku: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Termin „część wiążąca antygen” przeciwciała (lub „część przeciwciała”) oznacza jeden lub więcej fragmentów przeciwciała o podwójnej specyficzności, które zachowuje zdolność specyficznego wiązania dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych antygenów. Wykazano, iż funkcja wiązania antygenu przez przeciwciało może być pełniona przez fragmenty przeciwciała pełnej długości. Przykłady fragmentów wiążących objętych terminem „część wiążąca antygen” przeciwciała obejmuje (i) fragment Fab, jednowiążący fragment składający się z domen VL, VH, CL i CH; (ii) fragment F(ab')2 będący fragmentem dwuwiążącym składającym się z dwu fragmentów Fab połączonych mostkiem disiarczkowym w regionie zawiasowym; (iii) fragment Fd składający się z domen VH i CH1; (iv) fragment Fv
PL 208 069 B1 obejmujący domen VL i VH pojedynczego ramienia przeciwciała; (v) fragment dAb składający się z domen VH (Ward i wsp (1989) Nature 341, 544-546); (vi) izolowany region determinują cy dopasowanie (CDR). Ponadto, choć dwie domeny fragmentu Fv (VL i VH) kodowane są przez oddzielne geny, mogą być połączone, z wykorzystaniem technik rekombinacji DNA, z wykorzystaniem syntetycznego linkera, dzięki któremu tworzą one jeden łańcuch polipeptydowy w którym wspomniane regiony VH i VL tworzą jednowiążącą cząsteczkę (pojedynczy łańcuch FV, scFv; por: Bird i wsp (1988) Science 242, 423-426, Huston i wsp (1988) PNAS 85, 5879-5883). Takie przeciwciała jednołańcuchowe również obejmuje wspomniany termin „część wiążąca antygen” przeciwciała. Termin wspomniany obejmuje także inne rodzaje jednołańcuchowych przeciwciał, takie jak „diabodies” (diprzeciwciała). Diprzeciwciała to dwuwiążące, dwuspecyficzne przeciwciała w których domeny VH i VL eksprymowane są jako pojedynczy łańcuch, z wykorzystaniem linkera, który jest jednak zbyt krótki by możliwe było parowanie dwu domen tego samego łańcucha, co wymusza parowanie komplementarnych domen innego łańcucha i utworzenie tym samym dwu miejsc wiązania antygenu (patrz Holliger P i wsp. (1993) PNAS 90, 6444-6448; Poljak RJ i wsp (1994) Structure 2: 1121-1123).
Ponadto przeciwciało lub część wiążąca przeciwciała może być częścią większej cząsteczki immunoadhezyjnej, utworzonej w wyniku kowalencyjnego lub niekowalencyjnego połączenia przeciwciała lub części przeciwciała z jednym lub więcej białkami lub peptydami. Przykłady wspomnianych cząsteczek immunoadhezyjnych obejmują zastosowanie regionu rdzeniowego streptoawidyny w celu otrzymania cząsteczki tetramerowej scFv (Kipriyanow SM i wsp (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101) i zastosowanie reszt cystynowych, peptydu markerowego i metki histydynowej na końcu C w celu otrzymania dwuwiążących i biotynylowanych cząsteczek scFv (Kipriyanow SM i wsp (1994) Mol Immunol 31, 1047-1058). Części przeciwciała, takie jak Fab i części F(ab')2 można otrzymać z pełnych przeciwciał stosując konwencjonalne techniki, takie jak trawienie papainą lub pepsyną całych przeciwciał. Ponadto przeciwciała, części przeciwciała i cząsteczki immunoadhezyjne można otrzymać standardowymi technikami rekombinacji DNA.
Termin „izolowane przeciwciało o podwójnej specyficzności” oznacza tu przeciwciało o podwójnej specyficzności zasadniczo wolne od innych przeciwciał posiadających specyficzność wobec innych antygenów (np. izolowane przeciwciało specyficznie wiążące dwa różne lecz strukturalnie pokrewne antygeny lub strukturalnie pokrewne regiony w inny sposób nie pokrewnych antygenów, które jest zasadniczo wolne od przeciwciał specyficznie wiążących inne nie pokrewne antygeny). Ponadto izolowane przeciwciało o podwójnej specyficzności może być zasadniczo wolne od innych komórkowych substancji i/lub związków chemicznych.
Termin „przeciwciało neutralizujące” oznacza tu przeciwciało którego połączenie z konkretnym antygenem prowadzi do zahamowania biologicznej aktywności antygenu. Zahamowanie biologicznej aktywności antygenu można oceniać mierząc jeden lub więcej wskaźników biologicznej aktywności antygenu z wykorzystaniem użytecznego testu in vivo lub in vitro.
Termin „przeciwciało monoklinalne”: oznacza tu przeciwciało otrzymane z hybrydomy (np. przeciwciało wydzielane przez hybrydomy uzyskane w technologii hybrydom, takiej jak standardowa technika wytwarzania hybrydom Kohlera i Milsteina). Zatem przeciwciało według wynalazku o podwójnej specyficzności uzyskane z hybrydomy określane jest mianem przeciwciała monoklonalnego, pomimo że rozpoznaje więcej niż jeden pojedynczy antygen.
Termin „przeciwciało rekombinowane” oznacza przeciwciała otrzymane, eksprymowane, utworzone lub izolowane technikami rekombinacyjnymi, takimi jak system ekspresji przeciwciał wykorzystujący wektor ekspresyjny wprowadzony techniką transfekcji do komórki gospodarza, przeciwciała izolowane z biblioteki kombinatoryjnej rekombinowanych przeciwciał, przeciwciała izolowane ze zwierzęcia (np. myszy) transgenicznego pod względem ludzkich genów immunoglobulin (por. np. Taylor LD i wsp (1992) NAR 20: 6287-95) lub przeciwciał a otrzymane, eksprymowane lub wytworzone innymi sposobami obejmującymi składanie konkretnych genów immunoglobuliny (takie jak sekwencje ludzkiego genu immunoglobuliny) z innymi sekwencjami DNA. Przykłady rekombinowanych przeciwciał obejmują przeciwciała chimerowe, chimery CDR i przeciwciała humanizowane.
Termin „przeciwciało ludzkie” oznacza przeciwciała posiadające regiony stały i zmienny odpowiadające, lub pochodzące z ludzkich płodowych sekwencji immunoglobulinowych, tak jak podano to np. w: Kabat i wsp (patrz: Kabat i wsp (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interests, Vth Ed. US Dept of Health and Human Services, NIH Publ no. 91-3242). Przeciwciała ludzkie według wynalazku mogą także obejmować reszty aminokwasowe nie obecne w ludzkich sekwencjach płodowych genów immunoglobulin (np. w postaci mutacji wprowadzonych w miejsca przypadkowe lub
PL 208 069 B1 z wykorzystaniem mutagenezy kierowanej in vitro lub mutacji somatycznych in vivo) na przykład w regionach CDR lub w szczególności w regionie CDR3.
Rekombinowane przeciwciała ludzkie według wynalazku posiadają regiony zmienne i mogą ponadto obejmować regiony stałe, pochodzące z płodowych ludzkich sekwencji immunoglobulinowych (por: Kabat i wsp (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interests, Vth Ed. US Dept of Health and Human Services, NIH Publ no. 91-3242). Rekombinowane ludzkie przeciwciała mogą być poddawane mutagenezie in vitro (lub gdy stosuje się zwierzę transgeniczne pod względem ludzkich sekwencji Ig, mutagenezie somatycznej in vivo), a zatem sekwencje aminokwasowe regionów VH i VL rekombinowanych przeciwciał są sekwencjami pochodzącymi z ludzkich płodowych sekwencji VH i VL, które mogą nie występować naturalnie w płodowym repertuarze ludzkich przeciwciał in vitro. W konkretnych postaciach wspomniane rekombinowane przeciwciał a tworzone są w wyniku selektywnej mutagenezy, mutagenezy powrotnej lub obu sposobów.
Termin „mutacja powrotna odnosi się do procesu w którym niektóre lub wszystkie aminokwasy zmutowane somatycznie przeciwciała ludzkiego zastąpione zostają odpowiednimi resztami z homologicznej sekwencji płodowej przeciwciała. Sekwencje łańcucha lekkiego i ciężkiego ludzkiego przeciwciała według wynalazku są uliniowione z sekwencjami płodowymi obecnymi w bazie danych VBASE w celu zidentyfikowania sekwencji o najwyższej homologii. Różnice w sekwencji ludzkiego przeciwciała według wynalazku zostają następnie zmutowane tak, by dawały na powrót sekwencję płodową, poprzez mutowanie konkretnych pozycji nukleotydowych odpowiadających wspomnianym resztom aminokwasowym. Rola odgrywana w wiązaniu pośrednim lub bezpośrednim antygenu przez poszczególne reszty aminokwasowe, zidentyfikowane jako reszty kandydujące do mutagenezy powrotnej, powinna zostać określona i reszty aminokwasowe, o których wiadomo że wpływają na wspomniane wiązanie nie powinny być poddane mutagenezie. W celu zmniejszenia ilości reszt aminokwasowych poddawanych mutagenezie powrotnej, należy zidentyfikować jako cel mutagenezy te reszty aminokwasowe które okazują się być różne przy porównaniu z najbliższą sekwencją płodową lecz identyczne z odpowiednimi resztami aminokwasowymi w drugiej sekwencji płodowej, przy założeniu że druga sekwencja płodowa jest identyczna lub kolinearna z sekwencją ludzkiego przeciwciała według wynalazku na obszarze co najmniej 10, korzystnie 12 aminokwasów, z obu stron badanego aminokwasu. Mutacje powrotne można wprowadzać na dowolnym etapie optymalizacje przeciwciała.
Termin „przeciwciało chimerowe” oznacza przeciwciało obejmujące sekwencje regionu zmiennego lekkiego i ciężkiego przeciwciała z jednego gatunku i sekwencje regionu stałego z innego gatunku, takie jak posiadające regiony zmienne z mysiego łańcucha lekkiego i ciężkiego przyłączone do ludzkiego regionu stałego.
Termin „przeciwciało chimerowe-CDR” oznacza przeciwciała obejmujące sekwencje regionu zmiennego łańcucha lekkiego i ciężkiego z jednego gatunku w obrębie których sekwencje jednego lub więcej regionów CDR VH lub/i VL zostały zastąpione sekwencjami CDR z innego gatunku, takie jak przeciwciała posiadające mysie regiony zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego, w których jeden lub więcej mysich regionów CDR (np. CDR3) zostało zastąpionych ludzkimi sekwencjami CDR.
Termin „przeciwciało humanizowane” odnosi się do przeciwciał obejmujących sekwencje regionu zmiennego łańcucha lekkiego i ciężkiego pochodzące ze zwierzęcia (np. myszy) w których co najmniej część sekwencji VH i/lub VL została zmieniona, tak by przypominała sekwencje ludzką tzn. bardziej przypominała ludzkie sekwencje płodowe regionów zmiennych. Jednym rodzajem przeciwciał humanizowanych są przeciwciała chimerowe-CDR, w których wprowadzono ludzkie sekwencje CDR w obręb zwierzęcych sekwencji VH i VL, zastępując zwierzęce sekwencje CDR.
Jednym ze sposobów pomiaru kinetyki wiązania jest pomiar powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Termin „powierzchniowy rezonans plazmonowy” tu stosowany odnosi się do zjawiska optycznego, umożliwiającego analizę w czasie rzeczywistym oddziaływań biospecyficznych poprzez wykrywanie zmian w stężeniu białek w obrębie macierzy biosensora, na przykład z wykorzystaniem systemu BIAcore (Pharmacia Biosensors AB). Dla dalszych szczegółów por: Jonsson U i wsp (1993) Ann Biol Clin 51: 19-26; Jonsson U i wsp (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson B i wsp (1995) J Mol Recogn 8: 125-131, Johnsson B i wsp (1991) Anal Biochem 198: 268-277.
Termin „Koff” stosowany poniżej oznacza stałą szybkości dysocjacji przeciwciała z kompleksu antygen/przeciwciało.
Termin „Kd” stosowany poniżej oznacza stałą dysocjacji konkretnego kompleksu antygenprzeciwciało.
PL 208 069 B1
Przeciwciała o podwójnej specyficzności otrzymywane sposobem według wynalazku uzyskane są w dowolny opisany sposób uzyskiwania przeciwciał podanych w podsekcji II powyżej. Przeciwciała o podwójnej specyficzności mogą być skierowane przeciw zasadniczo dowolnym, strukturalnie pokrewnym antygenom, choć przeciwciała o podwójnej specyficzności według wynalazku specyficznie wiążą IL-1a i IL-1 β, i można je uzyskać z wykorzystaniem antygenu o podwójnej specyficzności, takiego jaki opisano w przykładach 1-4. Według wynalazku można zastosować inne strukturalnie pokrewne antygeny, obejmujące członków rodziny kaspaz, rodziny cytokin, takich jak członków rodziny IL-1 (np. IL-1/lL-18), członków rodziny TNF (np. TNFα/TNFβ), członków rodziny IL-6, interferony, członków rodziny TGFβ, członków rodziny EGF, członków rodziny FGF, członków rodziny PDGF, członków rodziny VEGF, członków rodziny angiopoetyny, członków rodziny białek morfogenicznych kości, proteinaz pozakomórkowych (metaloproteinaz) i członków rodziny receptorów cytokin, takich jak członków rodziny receptora IL-1, członków rodziny receptora TNF, członków rodziny receptora TGFβ, członków rodziny receptora EGF, członków rodziny receptora FGF, członków rodziny receptora PDGF, członków rodziny receptora VEGF, członków rodziny receptora angiopoetyny.
Przeciwciała o podwójnej specyficzności otrzymywane sposobem według wynalazku mogą wykazywać jednakową zdolność wiązania dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych antygenów, przeciwciała o podwójnej specyficzności otrzymywane sposobem według wynalazku mogą wiązać się preferencyjnie z jednym z dwu wspomnianych antygenów, i nadal posiadać podwójną specyficzność wobec dwu strukturalnie pokrewnych antygenów w porównaniu z antygenami nie pokrewnymi. Aktywność wiązania wspomnianych przeciwciał o podwójnej specyficzności do wspomnianych strukturalnie pokrewnych antygenów, jak również innych nie pokrewnych strukturalnie antygenów, można mierzyć w standardowym teście in vitro, takim jak ELISA lub BIAcore. Korzystnie, stosunek wartości Kd przeciwciała dla strukturalnie nie pokrewnym antygenom do wartości Kd przeciwciała skierowanego przeciw strukturalnie pokrewnym antygenom powinien wynosić co najmniej 3, korzystniej co najmniej 5, bardziej korzystnie 10, jeszcze korzystniej stosunek ten powinien wynosić co najmniej 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 lub 1000.
Różnica pomiędzy wiązaniem niespecyficznym (tworzącym tło) a specyficznym wiązaniem dotyczy poziomu lub stopnia. Na przykład wiązanie niespecyficzne jest na niskim poziomie np. gdy wynosi mniej niż 5%, bardziej korzystnie mniej niż 3%, jeszcze korzystniej około 0,1-1%, podczas gdy specyficzna reaktywność krzyżowa lub podwójna specyficzność jest na wyższym poziomie np. gdy jest większa niż 1%, korzystniej większa niż 3%, jeszcze korzystniej większa niż 5%, i najkorzystniej większa niż 10%. Ponadto wartość IC50 przeciwciała o podwójnej specyficzności wobec docelowego antygenu korzystnie jest bliska wartościom ED50 antygenów w danym bioteście.
Przeciwciało o podwójnej specyficzności lub jego część wiążąca antygen, otrzymywane sposobem według wynalazku jest korzystnie wybrane tak, by miało korzystne wartości kinetyki wiązania (np. wysokie powinowactwo, niską dysocjację, niską wartość Koff, wysoką zdolność neutralizującą) wobec jednego lub korzystnie obu wspomnianych antygenów z którymi wiąże się specyficznie. Na przykład przeciwciało o podwójnej specyficzności lub jego część może wiązać jeden lub korzystniej oba strukturalnie pokrewne antygeny ze stałą Koff o wartości 0.1 s-1 lub niższą, korzystniej ze stałą Koff o wartości 1x10-2 s-1 lub niższą, bardziej korzystnie ze stałą Koff o wartości 1x10-3 s-1 lub niższą, jeszcze korzystniej ze stałą Koff o wartości 1x10-4 s-1 lub niższą, najkorzystniej ze stałą Koff o wartości 1x10-5 s-1 lub niższą, oznaczaną sposobem pomiaru powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Alternatywnie lub dodatkowo przeciwciało o podwójnej specyficzności lub jego część, może hamować aktywność jednego lub korzystnie obu wspomnianych strukturalnie pokrewnych antygenów ze stałą IC50 równą 1x10-6M lub mniejszą, korzystniej ze stałą IC50 równą 1x10-7M lub mniejszą, jeszcze korzystniej ze stałą IC50 równą 1x10-8M lub mniejszą, korzystniej ze stałą IC50 równą 1x10-9M lub mniejszą, jeszcze korzystniej ze stałą IC50 równą 1x10-10M lub mniejszą, najkorzystniej ze stałą IC50 równą 1x10-11M lub mniejszą. Korzystnie stała IC50 powinna być mierzona z zastosowaniem czułego biotestu, w którym wartość stałej IC50 powinna być bliska wartości ED50 dla antygenu stosowanego we wspomnianym teście.
Można sporządzać kompozycje farmaceutyczne obejmujące przeciwciało o podwójnej specyficzności lub część wiążącą antygen wspomnianego przeciwciała, w użytecznym farmaceutycznie nośniku. Kompozycja farmaceutyczna może ponadto obejmować co najmniej jeden dodatkowy czynnik leczniczy np. jeden lub więcej czynników leczniczych do leczenia choroby w której zastosowanie przeciwciała o podwójnej specyficzności jest korzystne. Na przykład, gdy przeciwciało o podwójnej specyficzności wiąże specyficznie IL-1a i IL-1 β, kompozycja farmaceutyczna może obejmować ponadto jeden lub więcej czynników leczniczych do leczenia choroby, w której patogenna jest aktywność IL-1.
PL 208 069 B1
Wspomniane przeciwciało i część wiążąca antygen przeciwciała otrzymywane sposobem według wynalazku może stanowić składnik kompozycji farmaceutycznej użytecznej do podania pacjentowi. Typowo, kompozycja farmaceutyczna obejmuje przeciwciało lub część przeciwciała według wynalazku i farmaceutycznie użyteczny nośnik. Termin „farmaceutycznie użyteczny nośnik” obejmuje dowolny i wszystkie rozpuszczalniki, ośrodki dyspergujące, substancje powlekające, przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, środki izotoniczne i opóźniające absorpcję i podobne, które są zgodne fizjologicznie. Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych nośników obejmują wodę, sól fizjologiczną, sól fizjologiczną buforowaną fosforanami, dekstrozę, glicerol, etanol i podobne środki lub ich kombinacje. W wielu przypadkach korzystne jest włączenie jest do kompozycji czynnika izotonicznego na przykład cukrów, polialkoholi takich jak mannitol, sorbitol, lub chlorku sodu. Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki mogą ponadto obejmować mniejsze ilości substancji pomocniczych, takich jak substancje zwilżające lub środki emulgujące, konserwanty lub bufory, zwiększające termin przydatności do stosowania lub efektywność przeciwciała lub części przeciwciała.
Wspomniane przeciwciała lub części przeciwciała otrzymywane sposobem według wynalazku mogą stanowić część kompozycji farmaceutycznej użytecznej do podawania pozajelitowego. Przeciwciało lub część przeciwciała przygotowana jest jako roztwór do iniekcji obejmujący 0,1-250 mg/ml przeciwciała. Roztwór do wstrzyknięć może obejmować albo płynną albo liofilizowaną postać dawkowaną w fiolce ze szkła flintowego lub bursztynowego, ampułce lub strzykawce. Bufor może być buforem L-histydynowym (1-50 mM), korzystnie 5-10 mM, o pH 5,0-7,0 (korzystnie 6,0). Inne użyteczne bufory obejmują w sposób nieograniczający, bursztynian sodowy, cytrynian sodowy, fosforan sodowy lub fosforan potasowy. Chlorek sodowy można stosować do modyfikowania toksyczności roztworu w stężeniach 0-300 mM (korzystnie 150 mM w przypadku płynnej postaci dawkowanej). Krioprotektanty można dodawać do liofilizowanej postaci dawkowanej, zasadniczo 0-10% sacharozy (korzystnie 0,5-1,0%). Inne użyteczne krioprotektanty obejmują trehalozę i laktozę. Wypełniacze które można włączać do liofilizowanych postaci dawkowanych to zasadniczo 1-10% mannitol (korzystnie 2-4%). Stabilizatory można stosować zarówno w przypadku płynnej i liofilizowanej postaci dawkowanej, zasadniczo 1-50 mM L-metioninę (korzystnie 5-10 mM). Inne użyteczne wypełniacze obejmują glicynę, argininę (0-0,5%), polisorbinian-80 (korzystnie 0,005-0,01%). Dodatkowo dodawać można substancje powierzchniowo czynne, w sposób nieograniczający może to być polisorbinian 20 i BRIJ.
Kompozycja może występować w wielu postaciach. Obejmują one, na przykład, płynną, półstałą lub stałą postać dawkowaną, taką jak roztwory płynne (np. roztwory do infuzji i wstrzyknięć), zawiesiny lub dyspersje, tabletki, pigułki, proszki, liposomy i czopki. Korzystna postać zależy od sposobu podawania i zastosowania leczniczego. Typową kompozycją są roztwory do wstrzyknięć lub infuzji, takie jak kompozycje podobne do tych stosowanych w pasywnym uodparnianiu ludzi innymi przeciwciałami. Korzystny sposób podawania to podawanie pozajelitowe (np. dożylne, podskórne, dootrzewnowe, domięśniowe). Przeciwciało może być podawane w postaci wstrzyknięcia lub infuzji dożylnej. Przeciwciało może też być podawane w postaci wstrzyknięcia domięśniowego lub podskórnego.
Kompozycje lecznicze muszą być sterylne i stabilne w warunkach w których są wytwarzane i składowane. Kompozycje mogą mieć postać roztworu, mikroemulsji, dyspersji, liposomu lub innych uporządkowanych struktur użytecznych do uzyskania wysokiego stężenia leku. Sterylne roztwory do wstrzyknięć można uzyskać przez włączenie składnika aktywnego (np. przeciwciała lub części przeciwciała) w użytecznej ilości do odpowiedniego rozpuszczalnika wraz z jednym lub kilkoma składnikami dodatkowymi, wymienionymi wyżej, jeśli jest to pożądane, a następnie sterylizacji przez filtrację. Ogólnie, roztwory rozproszone przygotowane są przez włączenie składnika aktywnego do sterylnego nośnika obejmującego podstawowy ośrodek dyspergujący i użyteczne dodatkowe składniki, wybrane z tych wymienionych powyżej. W przypadku sterylnych, liofilizowanych proszków do przygotowania sterylnych roztworów do wstrzyknięć, możliwe jest suszenie pod próżnią i suszenie rozpyłowe, prowadzące do powstania proszku ze składnika aktywnego oraz pożądanych składników dodatkowych, z sterylizowanych przez filtrację roztworów. Prawidłową płynność roztworu można uzyskać na przykład przez dodanie substancji rodzaju lecytyny, poprzez uzyskanie cząstek o właściwych rozmiarach w przypadku dyspersji i poprzez użycie substancji powierzchniowo czynnych. Przedłużoną absorpcję kompozycji przeznaczonej do wstrzyknięć można uzyskać na przykład poprzez dodanie składnika opóźniającego absorpcję, na przykład soli monostearynianowych i żelatyny.
Wspomniane przeciwciało i część przeciwciała otrzymywane sposobem według wynalazku można podawać na wiele sposobów znanych specjalistom, w zależności od konkretnych zastosowań leczniczych, korzystny sposób podawania to wstrzyknięcie podskórne, wstrzyknięcie dożylne lub infuPL 208 069 B1 zja. Jest wiadome specjalistom, że konkretna droga i/lub sposób podawania różnią się w zależności od pożądanych rezultatów. Wspomniany składnik aktywny może być przygotowany z nośnikiem, który chroni składnik aktywny przed szybkim uwalnianiem, w preparacie o regulowanym uwalnianiu, która może obejmować implanty, plastry przezskórne i mikrokapsułki. Stosować można ulegające biodegradacji, biokompatybilne polimery, takie jak octan etylenowy winylu, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Wiele sposobów przygotowania takich postaci jest opatentowanych i znanych specjalistom (patrz np. Sustained and controlled release drug delivery systems, JR Robinson wyd. Marcel Dekker Inc, NY 1978).
Przeciwciało lub część przeciwciała otrzymywane sposobem według wynalazku może być podawane doustnie, na przykład, w obojętnym rozcieńczalniku lub w przyswajalnym, jadalnym nośniku. Wspomniany składnik (i inne dodatki, jeśli jest to konieczne) mogą być zawarte w miękkich lub twardych kapsułkach żelatynowych, sprasowane w postaci tabletek, lub włączone bezpośrednio do diety pacjenta. W przypadku podawania doustnego wspomniany składnik może być połączony z zaróbkami i stosowany w postaci tabletek, tabletek podpoliczkowych, pastylek/kołaczyków, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, opłatków i podobnych. W celu podawania składnika według wynalazku w inny sposób niż dojelitowy, może okazać się konieczne pokrycie wspomnianego składnika lub podawanie wspomnianego składnika wraz z materiałem którego celem jest zapobieżenie inaktywacji wspomnianego składnika.
Dodatkowe składniki aktywne mogą być również włączane to kompozycji. W pewnych postaciach przeciwciało lub część przeciwciała według wynalazku włączana jest do receptury i/lub podawana jest łącznie z jednym, lub większą ilością dodatkowych środków leczniczych, użytecznych w leczeniu schorzenia związanego z patogenną aktywnością IL-1. Na przykład przeciwciała o podwójnej specyficzności skierowane przeciw IL-1 a/lL-1 β lub części przeciwciała według wynalazku mogą stanowić część receptury i/lub być podawane łącznie z jednym lub większą ilością dodatkowych przeciwciał wiążących inną substancję docelową (np. przeciwciał wiążących inne cytokiny lub wiążące się z cząsteczkami zlokalizowanymi na powierzchni komórkowej). Ponadto jedno lub więcej przeciwciał według wynalazku stosować można w połączeniu z dwoma lub więcej wymienionymi środkami leczniczymi. Wspomniana kombinowana terapia może wykorzystywać skutecznie niskie dawki podawanych środków leczniczych, pozwalając unikać w ten sposób możliwego wpływu toksycznego lub komplikacji towarzyszących różnego typu sposobom leczenia z wykorzystaniem pojedynczego składnika.
IV. Zastosowanie przeciwciał o podwójnej specyficzności
Ze względu na zdolność wiązania dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych antygenów, przeciwciała o podwójnej specyficzności lub ich części, otrzymywane sposobem według wynalazku można zastosować do wykrywania jednego albo obu wspomnianych antygenów (np. w próbce materiału biologicznego, takiego jak osocze lub surowica), w konwencjonalnym teście immunologicznym, takim jak test ELISA i test radioimmunologiczny (RIA) lub w technikami immunohistochemicznymi. Możliwy jest sposób wykrywania antygenu w próbce materiału biologicznego, obejmujący kontaktowanie próbki materiału biologicznego z przeciwciałem o podwójnej specyficzności lub częścią przeciwciała według wynalazku, które to przeciwciało rozpoznaje wspomniany antygen i wykrywa albo przeciwciało (lub część przeciwciała) związane z antygenem albo niezwiązane przeciwciało (lub część przeciwciała), i tym samym wykrywa wspomniany antygen w wspomnianej próbce materiału biologicznego. Wspomniane przeciwciało jest bezpośrednio lub pośrednio wyznakowane substancją, dzięki której można wykrywać związane lub niezwiązane przeciwciało. Użyteczne substancje umożliwiające wykrywanie obejmują różnorodne enzymy, grupy prostetyczne, materiały fluorescencyjne, materiały luminescencyjne i materiały radioaktywne. Przykłady użytecznych enzymów obejmują peroksydazę z chrzanu, alkaliczną fosfatazę, betagalaktozydazę lub acetylocholinestrazę; przykłady użytecznych grup prostetycznych obejmują kompleks streptoawidyny/biotyny i awidyny/biotyny; przykłady użytecznych materiałów fluorescencyjnych obejmują umbeliferon, fluoresceinę, izocyjanian fluoresceiny, rodaminę, dichlorotriazynyloaminofluoresceinę, chlorek dansylu lub fikoerytrynę; przykłady materiałów luminescencyjnych obejmują luminol i przykłady materiałów radioaktywnych obejmują 125I, 131I, 35S, lub 3H.
Alternatywną do znakowania przeciwciała, jest sposób w którym wspomniany antygen(-eny) mogą być wykrywane w płynach biologicznych w kompetycyjny test radioimmunologiczny z wykorzystaniem standardów antygenowych znakowanych wykrywalnymi substancjami i nieznakowanym przeciwciałem o podwójnej specyficzności specyficznym wobec wspomnianego antygenu(-ów). We wspomnianym teście, próbka materiału biologicznego, wspomniany znakowany standard antygenowy i przeciwciało o podwójnej specyficzności mieszane są i następnie określana jest ilość znakowanego
PL 208 069 B1 standardu antygenowego związanego z wspomnianym nieznakowanym przeciwciałem. Ilość antygenu w próbce materiału biologicznego jest odwrotnie proporcjonalna do ilości znakowanego standardu antygenowego związanego z nieznakowanym przeciwciałem.
Przeciwciało o podwójnej specyficzności może rozpoznawać specyficznie IL-1 α i IL-1 β i powyższe sposoby można stosować do wykrywania IL-1a i/lub IL-1 β. Możliwe jest wykrywanie IL-1a lub IL-1 β w próbce biologicznego materiału lub tkance obejmujące kontaktowanie próbki materiału biologicznego lub tkanki, w której może znajdować się IL-1a lub IL-1 β z przeciwciałem o podwójnej specyficzności lub częścią wiążącą antygen wspomnianego przeciwciała, otrzymanego sposobem według wynalazku i wykrywanie IL-1a lub IL-1 β w próbce biologicznego materiału lub tkance. Próbką biologicznego materiału może być np. próbka in vitro, taką jak próbka komórek, tkanek lub płynów ustrojowych (np. krwią, osoczem, moczem, śliną itp.) ponadto tkanka może być tkanką znajdującą się in vivo np. tkanką uwidocznioną dzięki zastosowaniu technik wizualizacji in vivo wspomnianej tkanki (np. z zastosowaniem wyznakowanych przeciwciał).
Przeciwciała o podwójnej specyficzności otrzymane sposobem według wynalazku mogą być stosowane do celów diagnostycznych. Przeciwciało według wynalazku można stosować w teście diagnostycznym in vitro, takim jak test laboratoryjny wykrywający pożądany antygen(-y) lub test powszechnego użytku służący wykrywaniu pożądanego antygenu(-ów). Przykłady znanych dobrze testów in vitro obejmują test ELISA, RIA, Western blot i podobne. Przeciwciało otrzymane sposobem według wynalazku można stosować w teście diagnostycznym in vivo, takim jak test obrazowania in vivo. Na przykład wspomniane przeciwciało można wyznakować dającą się wykrywać substancją wykrywalną in vivo, a następnie podać pacjentowi wyznakowane przeciwciało, i wyznakowane przeciwciało wykrywać w teście in vivo, umożliwiając tym samym obrazowanie in vivo.
Przeciwciała o podwójnej specyficzności otrzymane sposobem według wynalazku specyficznie rozpoznające IL-1a i IL-1 β można stosować w testach diagnostycznych do wykrywania IL-1a i/lub IL-1 β do celów diagnostycznych, na przykład w przypadku diagnozowania chorób przebiegających z odczynem zapalnym, jak również w przypadku samoistnych poronień. Ze względu na konkretny rodzaj choroby przeciwciała o podwójnej specyficzności wobec IL-1a/lL-1 β według wynalazku stosować można do celów diagnostycznych w dowolnym rodzaju schorzenia opisanego powyżej ze względu na lecznicze zastosowanie wspomnianych przeciwciał (patrz poniżej), takich jak schorzenia w których aktywność IL-1 jest czynnikiem patogennym, co przedyskutowano poniżej.
Przeciwciała o podwójnej specyficzności lub części przeciwciała korzystnie są zdolne do neutralizowania, zarówno in vitro, jak in vivo, aktywności wspomnianych antygenów, z którymi się wiążą. Wspomniane przeciwciała i części przeciwciał mogą być stosowane do hamowania aktywności wspomnianych antygenów np. w hodowli komórkowej obejmującej wspomniane antygeny lub w organizmie pacjenta lub w organizmie zwierzęcym posiadającym wspomniane antygeny z którymi wspomniane przeciwciała o podwójnej specyficzności według wynalazku mogą oddziaływać. Możliwe jest hamowanie aktywności antygenu obejmujące kontaktowanie wspomnianego antygenu z przeciwciałem o podwójnej specyficzności lub częścią przeciwciała według wynalazku co prowadzi do zahamowania aktywności antygenu. Przeciwciało o podwójnej specyficzności wiąże IL-1a i IL-1 β i możliwe jest hamowanie aktywności IL-1a i/lub IL-1 β przez kontaktowanie IL-1a i/lub IL-1 β z przeciwciałem o podwójnej specyficzności lub jego częścią. Aktywność IL-1a i/lub IL-1 β można hamować na przykład in vitro. Na przykład do hodowli komórkowej zawierającej lub przypuszczalnie zawierającej IL-1a i/lub IL-1 β, można dodać przeciwciało lub część przeciwciała według wynalazku w celu zahamowania aktywności IL-1 α i/lub IL-1 β we wspomnianej hodowli. Alternatywnie aktywność IL-1a i/lub IL-1 β można hamować in vivo, w organizmie pacjenta.
Możliwe jest hamowanie aktywności antygenu w organizmie pacjenta cierpiącego na chorobę w której aktywność wspomnianego antygenu jest patogenna. Możliwe jest hamowanie aktywności antygenu w organizmie pacjenta cierpiącego na taką chorobę, obejmujące podawanie pacjentowi przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części, tak by aktywność antygenu w organizmie chorego została zahamowana. Korzystnie wspomniany antygen jest ludzkim antygenem, a pacjent jest osobą ludzką. Przeciwciało można podawać pacjentowi w celach leczniczych. Ponadto przeciwciało otrzymane sposobem według wynalazku można podawać zwierzęciu eksprymującemu antygen z którym wiąże się wspomniane przeciwciało w celach weterynaryjnych lub w przypadku stosowania zwierząt będących modelami chorób ludzkich. W tym ostatnim przypadku zwierzęta takie można stosować do oceny efektów terapii z wykorzystaniem przeciwciał według wynalazku (np. do testowania dawki, sposobu i czasu podawania).
PL 208 069 B1
Przeciwciało o podwójnej specyficzności wiąże IL-1a i IL-1 β i możliwe jest hamowanie aktywności IL-1 w organizmie pacjenta, na przykład pacjenta cierpiącego na schorzenie w którym aktywność IL-1 jest patogenna. Stosowany termin „schorzenie w którym aktywność IL-1 jest patogenna” oznacza schorzenia i inne upośledzenia funkcji organizmu w których przebiegu obecność IL-1 (co obejmuje IL-1 α i IL-1 β) w organizmie pacjenta cierpiącego na wspomnianą chorobę jest lub podejrzewa się, że jest albo odpowiedzialna za patofizjologię choroby albo jest czynnikiem przyczyniającym się do zaostrzenia choroby. Stosownie, choroba w której przebiegu aktywność IL-1 jest patogenna jest chorobą w której zahamowanie aktywności IL-1 (to jest IL-1a i IL-1 β, osobno lub razem) przypuszczalnie wpłynie na złagodzenie objawów i/lub postępów wspomnianej choroby. Wspomniane choroby mogą objawiać się na przykład wzrostem stężenia IL-1 w płynach ustrojowych pacjenta cierpiącego na wspomnianą chorobę (np. zwiększonym stężeniem IL-1 w osoczu, surowicy, płynie maziowym itd. pacjenta), które to stężenia można wykrywać na przykład stosując przeciwciało skierowane przeciw IL-1, opisane powyżej.
Interleukina I pełni kluczową rolę w patologii związanej z wieloma chorobami obejmującymi odpowiedź zapalną i immunologiczną organizmu. Wspomniane choroby obejmują reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, młodzieńcze przewlekłe zapalenie stawów, zapalenie stawów związane z chorobą z Lyme, łuszczycowe zapalenie stawów, zespół Reitera, zapalenie stawów kręgosłupa, toczeń rumieniowaty układowy, chorobę Crohna, wrzodziejące zapalenie jelita grubego, stan zapalny jelita grubego/nieswoiste zapalenie jelit, cukrzycę insulino-zależną, zapalenie tarczycy, astmę, choroby alergiczne, łuszczycę, zapalenie i twardzinę skóry, reakcje przeszczepu skierowaną przeciw gospodarzowi, odrzucanie przeszczepu, ostrą lub przewlekłą chorobę immunologiczną związaną z przeszczepianiem narządu, miażdżycę tętnic, sarkoidozę, rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe, chorobę Kawasaki, chorobę Grave'a, zespół nerczycowy, zespół przewlekłego zmęczenia, ziarniak Wegener'a, plamicę Henocha-Schoenleina, mikroskopowe zapalenie naczyń nerek, przewlekłe aktywne zapalenie wątroby, zapalenie błony naczyniowej oka, wstrząs septyczny, zespół szoku toksycznego, zespół posocznicowy, kacheksję, choroby zakaźne, choroby pasożytnicze, zespół nabytego upośledzenia odporności, ostre poprzeczne zapalenie rdzenia, pląsawicę Huntingtona, chorobę Pakinsona, chorobę Alzheimera, udar, pierwotną marskość żółciową wątroby, anemię hemolityczną, złośliwości, niewydolność serca, zawał mięśnia sercowego, chorobę Addisona, sporadyczną niedoczynność wielogruczołową typu I i II, zespół Schmidta, zespół (ostrej) niewydolności oddechowej dorosłych, łysienie, łysienie plackowate, surowiczoujemną artropatię, artropatię, chorobę Reitera, artropatię łuszczycową, wrzodziejącą artropatię jelit, enteropatyczne zapalenie błony maziowej, artropatie związane z zakażeniem chlamydią, yersinią i salmonellą, artropatię kręgosłupa, alergię atopową, autoimmunologiczną chorobę pęcherzową skóry, pęcherzycę zwykłą, pęcherzycę liściastą, pemfigoid, chorobę linijną IgA, autoimmunologiczną anemię hemolityczną, anemię hemolityczną z odczynem Coombsa, nabytą złośliwą anemię, młodzieńczą złośliwą anemię, zapalenie mózgu z mialgią, przewiekłą kandydozę śluzówek i skóry, zapalenie tętnicy skroniowej olbrzymiokomórkowe, pierwotne stwardniające zapalenie wątroby, kryptogenne autoimmnunologiczne zapalenie wątroby, zespół nabytego niedoboru odporności, choroby towarzyszące nabytemu upośledzeniu odporności, zapalenie wątroby typu C, pospolity zmienny niedobór odporności (pospolity zmienny niedobór gammaglobulin we krwi), kardiomiopatię rozstrzeniową, bezpłodność u kobiet, niewydolność jajników, przedwczesna niewydolność jajników, chorobę płuc związana z włóknieniem, kryptogenne włókniejące zapalenie pęcherzyków płucnych, pozapalną śródmiąższową chorobę płuc, śródmiąższowe zapalenie płuc, śródmiąższową chorobę płuc związaną z mieszaną chorobą tkanki łącznej, śródmiąższową chorobę płuc związaną z twardziną układową, chorobę płuc związaną z reumatoidalnym zapaleniem stawów, toczniem rumieniowatym, zapaleniem skórnomięśniowym/wielomięśniowym, chorobą Sjogrena, zesztywniającym zapaleniem stawów kręgosłupa, dyfuzyjną chorobę płuc związaną z zapaleniem naczyń, chorobę płuc związaną z hemosyderozą, śródmiąższową chorobę płuc związaną z reakcją na leki, zwłóknienie wywołane napromieniowaniem, zapalenie oskrzelików zarostowe, przewlekłe eozynofilowe zapalenie płuc, chorobę płuc z naciekiem limfocytarnym, pozakażeniową śródmiąższową chorobę płuc, ostre dnawe zapalenie stawów, zapalenie wątroby autoimmunologiczne (typu I - klasyczne autoimmunologiczne lub toczniowe zapalenie wątroby oraz typu II - zapalenie wątroby z przeciwciałami anty-LKM), hipoglikemię autoimmunologiczną, odporność na insulinę typu B z rogowaceniem ciemnym, niedoczynność przytarczyc, ostre powikłania poprzeszczepowe, gościec zwyradniający, stwardniejące zapalenie dróg żółciowych, neutropenię autoimmunologiczną, łuszczycę typu 1 i 2, idiopatyczną leukopenię, autoimmunologiczną neutropenię, chorobę nerek NOS, zapalenie kłębuszków
PL 208 069 B1 nerkowych, mikroskopowe zapalenie naczyń nerki, chorobę z Lyme, toczeń rumieniowaty dyskowy, niepłodność męska (idiopatyczna, NOS), autoimmunizację plemników, stwardnienie rozsiane wszystkich podtypów, współczulne zapalenie naczyniówki, nadciśnienie płucne wtórne do schorzenia tkanki łącznej, zespół Goodpasture'a, guzkowate zapalenie tętnic (objawy płucne), gorączkę reumatoidalną ostrą, zwyrodnienie kręgów, chorobę Stilla, zespół Sjogrena, chorobę/zapalenie tętnic Takayashu, trombocytopenię autoimmunologiczną i idiopatyczną, autoimmunologiczną chorobę tarczycy, nadczynność tarczycy, autoimmunologiczną niedoczynność tarczycy z wolem (chorobę Hashimoto), atroficzną autoimmunologiczną niedoczynność tarczycy, pierwotny obrzęk śluzowaty, zapalenie błony naczyniowej oka związane z zaćmą, pierwotne zapalenie naczyń, bielactwo nabyte, schorzenia centralnego układu nerwowego (np. depresja, schizofrenia, choroba Alzheimera Parkinsona itp.), ostry i przewlekły ból, zaburzenia przemiany lipidowej. Ludzkie przeciwciała i części przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku można stosować do leczenia pacjentów cierpiących na choroby autoimmunologiczne, w szczególności te związane ze stanem zapalnym, reumatoidalnym zapaleniem stawów kręgosłupa, alergią, cukrzycą autoimmunologiczną i autoimmunologicznym zapaleniem błony naczyniowej oka.
Korzystnie przeciwciała o podwójnej specyficzności skierowane przeciw IL-1a/lL-1 β otrzymane sposobem według wynalazku lub części wiążące antygen wspomnianych przeciwciał można stosować w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów, choroby Crohna, stwardnienia rozsianego, cukrzycy zależnej od insuliny, łuszczycy.
Przeciwciała o podwójnej specyficzności skierowane przeciw IL-1 a/lL-1 β według wynalazku lub części wiążące antygen wspomnianych przeciwciał, można podawać z jednym lub z większą liczbą środków leczniczych użytecznych w leczeniu chorób autoimmunologicznych i przebiegających ze stanem zapalnym.
Przeciwciała według wynalazku lub część wiążąca antygen przeciwciał można stosować osobno lub w kompozycji, do leczenia wspomnianych chorób. Zrozumiałe jest, że przeciwciała według wynalazku lub część wiążąca antygen wspomnianych przeciwciał może być stosowana osobno lub w kompozycji z dodatkowymi środkami np. środkiem leczniczym, np. czynnikiem dodatkowym wybranym przez specjalistę w zamierzonym celu. Na przykład dodatkowy środek może być środkiem leczniczym o którym wiadomo że jest użyteczny w leczeniu choroby lub cechy poddawanej leczeniu przez podawanie przeciwciała według wynalazku. Dodatkowy środek może być również środkiem nadającym korzystne cechy kompozycji leczniczej np. może być środkiem wpływającym na lepkość kompozycji.
Wyżej wspomniane kompozycje mogą obejmować wspomniane przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku i co najmniej jeden dodatkowy środek np. dwa lub trzy dodatkowe środki.
Kompozycje mogą zawierać nie-steroidowe leki przeciwzapalne (NSAIDS), które obejmują leki takie jak ibuprofen i inhibitory Cox-2. Inne kombinacje obejmują kortykosteroidy włączając w to prednisolon; dobrze znane efekty uboczne stosowania steroidów można ograniczyć lub nawet wyeliminować poprzez zmniejszenie dawki steroidu wymaganego do leczenia pacjentów, przy stosowaniu kompozycji z przeciwciałami skierowanymi przeciw IL-1 według wynalazku. Przykłady czynników leczniczych do stosowania przy reumatoidalnym zapaleniu stawów, z którymi można łączyć przeciwciało otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążącą antygen przeciwciała, obejmują: leki przeciwzapalne hamujące cytokiny (CSAID), przeciwciała lub antagonistów innych ludzkich cytokin lub czynników wzrostowych, na przykład: TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, GM-CSF, FGF i PDGF. Przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążąca antygen wspomnianych przeciwciał mogą być łączone z przeciwciałami rozpoznającymi cząsteczki zlokalizowane na powierzchni komórek, takimi jak CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90 i ich ligandy, włączając w to CD154 (gp39 lub CD40L).
Przydatne kombinacje środków leczniczych mogą przerywać w różnych punktach kaskadę autoimmunologiczną i kaskadę stanu zapalnego: korzystne przykłady obejmują agonistów TNF takich jak chimerowe, humanizowane lub ludzkie przeciwciała anty-TNF, D2E7 (Publikacja PCT Nr WO 97/29131), CA2 (Remicade™), CDP 571, CDP 870, Thalidamide i rozpuszczalne receptory TNF p55 lub p75, ich pochodne (p75TNRF1gG (Enbrel™) lub p55TNFR1gG (Lenercept), i również inhibitory enzymu konwertującego TNFa (TACE); podobnie inhibitory IL-1 (inhibitory enzymu konwertującego IL-1, IL-1RA itp), które mogą być użyteczne z tych samych powodów. Inne przydatne kombinacje obejmują interleukinę 11. Kolejne przydatne kombinacje obejmują środki odgrywające istotną rolę w odpowiedzi autoimmunologicznej, które to środki mogą oddziaływać równolegle do, zależnie od lub wspólnie z funkcją IL-1; szczególnie korzystni są antagoniści IL-12 i/lub IL-18 włączając w to przeciwciała
PL 208 069 B1
IL-12 i/lub IL-18 lub rozpuszczalne receptory IL-12 i/lub IL-18, lub białka wiążące IL-12 i/lub IL-18. Wykazano, że IL-12 i IL-18 mają pokrywające się choć różne funkcje i połączenie różnych antagonistów może być najbardziej skuteczne. Kolejna przydatna kombinacja obejmuje nie zubażające inhibitory antyCD4. Kolejne przydatne zastosowanie obejmuje antagonistów szlaku kostymulacji CD80 (B7.1) lub CD86 (B7.2) włączając w to przeciwciała, rozpuszczalne receptory lub ligandy antagonistyczne.
Przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążąca antygen wspomnianych przeciwciał, może tworzyć kombinację ze środkami takimi jak metotreksat, 6-MP, azatiopryna, sulfasalazyna, mesalazyna, chlorochinina/hydroksychlorochina olsalazyny, penicylamina, aurotiojabłczan (podawany domięśniowo lub doustnie), azatiopryna, kolchicyna, kortykosteroidy (podawane doustnie, wziewnie, i przez lokalne wstrzyknięcia), agonistów receptorów beta-2-adrenergicznych (salbutamol, terbutalina, salmeteral), ksantyny (teofilina, aminofilina), kromoglikan, nedokromil, ketotifen, ipratropium, oksytropium, cyklosporyna, FK506, rapamycyna, mykofenolan mofetylu, leflunomid, różne NSAID, na przykład ibuprofen, kortykosteroidy takie jak prednisolon, inhibitory fosfodiesterazy, agoniści adenozyny, środki przeciwkrzepliwe, inhibitory dopełniacza, środki adrenergiczne, środki upośledzające drogę przekazywania sygnałów związanych ze stanem zapalnym przez cytokiny prozapalne takie jak TNFa lub IL-1 (np. inhibitory kinaz IRAK, NIK, IKK, p38 lub MAP), inhibitory enzymu konwertującego IL-1 β, inhibitory enzymu konwertującego TNFa (TACE), inhibitory szlaku sygnałowego komórek T, takie jak inhibitory kinazy, inhibitory metaloproteinazy, sulfasalazyna, azatiopryna, 6-merkaptoputyny, inhibitor konwertazy angiotensyny, rozpuszczalne receptory cytokin i ich pochodne (np. rozpuszczalne receptory TNF p55 lub p75 i ich pochodne p75TNRF1gG (Enbrel™) lub p55TNFR1gG (Lenercept), sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, i cytokiny przeciwzapalne (np. IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 i TGFe). Korzystne kombinacje obejmują metotreksat lub leflunomid i w przypadku umiarkowanej lub ostrej postaci reumatoidalnego zapalenia stawów cyklosporynę.
Przykłady środków leczniczych stosowanych w stanie zapalnym jelita, z którymi przeciwciało otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążąca antygen, może występować w kombinacji obejmują: budenozyd, EGF, kortykosteroidy, cyklosporynę, sulfasalazynę, aminosalicylany, 6-merkaptopurynę, azatioprynę, metronidazol, inhibitory lipoksygenazy, mesalaminę, olsalazynę, balsalazyd, przeciwutleniacze, inhibitory tromboksanu, antagonistów receptora IL-1, przeciwciała monoklonalne anty-IL-1 β, przeciwciała monoklonalne anty-IL-6, czynniki wzrostowe, inhibitory elastazy, związki pyridynylo-imidazolowe, przeciwciała skierowane przeciw lub antagonistów innych ludzkich cytokin lub czynników wzrostowych, na przykład, TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-16, IL-18, EMAP-II, GMCSF, FGF i PDGF. Przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku można łączyć z przeciwciałami skierowanymi przeciw cząsteczkom powierzchniowym, takim jak CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 i ich ligandy. Przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążąca antygen wspomnianych przeciwciał, mogą być również łączone z czynnikami takimi jak metotreksat, cyklosporyna, FK506, rapamycyna, mykofenolan mofetylu, leflunomid, związki NSAID, na przykład ibuprofen, kortykosteroidy takie jak prednisolon, inhibitory fosfodiesterazy, agoniści adenozyny, środki przeciwkrzepliwe, inhibitory dopełniacza, środki adrenergiczne, środki zakłócające drogę przekazywania sygnałów cytokin prozapalnych, takich jak TNFa lub IL-1 (np. inhibitory kinaz IRAK, NIK, IKK, p38 czy MAP), inhibitory konwertazy IL-1 β, inhibitory konwertazy TNFa, inhibitory szlaku sygnałowego komórek T, takie jak inhibitory kinazy, inhibitory meteloproteinazy, sulfasalazyna, azatiopryna, 6-merkaptopuryny, inhibitory konwertazy angiotensyny, rozpuszczalne receptory cytokin i ich pochodne (np. rozpuszczalne receptory p55 lub p75 TNF, sIL-1R1, sIL-1RII, sIL-6R) i cytokiny przeciwzapalne (np. IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 i TGFe).
Przydatne przykłady środków leczniczych w przypadku choroby Crohna, z którymi można łączyć przeciwciało lub część wiążącą antygen przeciwciała obejmują: antagonistów TNF, na przykład przeciwciała anty-TNF, D2E7 (Publikacja PCT Nr WO 97/29131), CA2 (Remicade™), CDP 571, konstrukty TNFR-Ig, (p75TNFRIgG (Enbrel™) i p55TNFRIgG Lenercept) inhibitory i inhibitory PDE4. Przeciwciała lub część wiążąca antygen wspomnianych przeciwciał według wynalazku może być łączona z kortykosteroidami, na przykład budenozydem i deksametazonem. Przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążąca antygen przeciwciała mogą być łączone ze środkami takimi jak sulfasalazyna, kwas 5-aminosalicylowy, i olsalazyna, i środkami, które przeszkadzają syntezie lub działaniu cytokin prozapalnych takich jak IL-1, na przykład z inhibitorami konwertazy IL-1e i IL-1ra. Przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążącą antygen można stosować również do zahamowania szlaku sygnalnego komórek T, na przykład stosując inhibitory kinazy
PL 208 069 B1 tyrozynowej (6-merkaptopuryny). Przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążąca antygen przeciwciał może być łączona z IL-11.
Przydatne przykłady środków leczniczych stosowanych w stwardnieniu rozsianym, z którymi można łączyć przeciwciało otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążącą antygen przeciwciała obejmują: kortykosteroidy, prednisolon, metyloprednisolon, azatioprynę, cyklofosfamid, cyklosporynę, metotreksat, 4-aminopirydynę, tyzanidynę, interferon-βΙ a (Avonex; Biogen), interferon-eib (Betasteron; Chiron/Berlex), Copolymer 1 (Cop-1; Copaxone, Teva Pharmac Industries Inc); tlen pod zwiększonym ciśnieniem, podawane dożylnie immunoglobuliny, klabrydynę, przeciwciała skierowane przeciw lub antagonistów ludzkich cytokin lub czynników wzrostowych, na przykład TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GMCSF, FGF i PDGF.
Przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku lub część wiążąca antygen wspomnianych przeciwciał mogą być łączone z przeciwciałami skierowanymi przeciw cząsteczkom zlokalizowanym na powierzchni komórek, takim jak CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 lub ich ligandom. Wspomniane przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku lub części wiążące antygen wspomnianych przeciwciał, można również łączyć ze środkami takimi jak metotreksat, cyklosporyna, FK506, rapamycyna, mykofenolan mofetylu, lefulunomid, związkami NSAID na przykład ibuprofenem, inhibitorami Cox-2, kortykosteroidami takimi jak prednisolon, inhibitorami fosfodiesterazy, agonistami adenozyny, środkami przeciwkrzepliwymi, inhibitorami dopełniacza, środkami adrenergicznymi, środkami zakłócającymi szlak sygnałowy cytokin prozapalnych takich jak TNFa lub IL-1 (np. inhibitory kinaz IRAK, NIK, IKK, p38 lub MAP), inhibitorami konwertazy IL-1 β, inhibitorami TACE, inhibitorami szlaków sygnałowych komórek T takimi jak inhibitory kinazy, inhibitory metaloproteinazy, sulfasalazyna, azatiopryna, 6-merkaptopuryny, inhibitory konwertazy angiotensyny, rozpuszczalne receptory cytokin i ich pochodne (np. rozpuszczalne receptory p55 lub p75 TNF, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R) i cytokiny przeciwzapalne (np. IL-4, IL-10, IL-13 i TGFe).
Korzystne przykłady środków leczniczych stosowanych w leczeniu stwardnienia rozsianego obejmujące wspomniane przeciwciało lub część wiążącą antygen wspomnianego przeciwciała można łączyć ze środkami obejmującymi interferon β, na przykład INFe1a i INFe1b, kopakson, kortykosteroidy, inhibitory IL-1, inhibitory TNF i przeciwciała skierowane przeciw ligandowi CD40 i CD80.
Kompozycje farmaceutyczne mogą obejmować „skuteczną leczniczo dawkę” lub „skuteczną profilaktycznie dawkę” wspomnianego przeciwciała lub części wiążącej antygen przeciwciała otrzymanych sposobem według wynalazku. Termin „skuteczna leczniczo dawka” oznacza skuteczną ilość w dawce i stosowaną przez okres niezbędny do osiągnięcia pożądanego leczniczo efektu. Leczniczo skuteczna ilość przeciwciała lub części przeciwciała może wahać się w zależności od czynników takich jak: stopień choroby, wiek, płeć i ciężar pacjenta, i w zależności od zdolności wspomnianego przeciwciała lub jego części do wywoływania pożądanej odpowiedzi u pacjenta. Ilość skuteczna leczniczo jest tą dawką, przy której uboczne działanie toksyczne lub szkodliwe dawki wspomnianego przeciwciała lub części przeciwciała jest mniejsze od korzystnego efektu leczniczego. Termin „skuteczna profilaktycznie dawka” oznacza ilość skuteczną w dawce i stosowaną przez okres niezbędny do osiągnięcia pożądanego profilaktycznego działania. Typowo, dawka profilaktyczna stosowana jest u pacjentów przed rozwojem choroby lub na wczesnych etapach rozwoju choroby, dawka skuteczna profilaktycznie jest niższa od dawki efektywnej leczniczo.
Sposób dawkowania można optymalizować dla osiągnięcia optymalnej odpowiedzi leczniczej (np. odpowiedzi profilaktycznej lub leczniczej). Na przykład podać można pojedynczą dawkę leku, kilka podzielonych dawek leku w ciągu pewnego okresu czasu, lub dawkę można proporcjonalnie zmniejszyć lub zwiększyć w zależności od konkretnej sytuacji leczniczej. Szczególnie korzystne jest przygotowanie kompozycji pozajelitowych w postaci dawek jednostkowych leku łatwych w zastosowaniu i umożliwiających jednolite podawanie. Dawki leku oznaczają tu fizyczne porcje stosowane jako dawki jednostkowe dla pacjentów lub zwierząt modelowych, którzy lub które poddawane są leczeniu; każda jednostka (dawka) obejmuje określoną ilość czynnika aktywnego wyliczoną tak by osiągnąć zamierzony efekt leczniczy, w połączeniu z nośnikiem użytecznym farmaceutycznie. Dokładne określenie formy dawki leczniczej według wynalazku ma na celu i bezpośrednio zależy od charakterystycznych właściwości składnika czynnego i efektu leczniczego lub profilaktycznego który ma zostać osiągnięty oraz od ograniczeń właściwych związkom takim, jak związek aktywny w leczeniu.
Przykłady leczniczo lub profilaktycznie skutecznych ilości przeciwciała lub jego części otrzymanych sposobem według wynalazku obejmują 0,1-20 mg/kg, bardziej korzystnie 1-10 mg/kg. Wielkość dawki zależy od rodzaju i stopnia ostrości objawów choroby, którą poddaje się leczeniu. Jest ponadto
PL 208 069 B1 zrozumiałe, że dla każdego pacjenta, należy ustalić specyficzne dawkowanie w zależności od stanu jego zdrowia i klinicznej oceny prowadzonej przez specjalistę.
P r z y k ł a d 1: Projektowanie antygenu o podwójnej specyficzności w oparciu o przylegający topologicznie obszar identyczności.
W przykładzie tym określony zostaje największy wspólny topologicznie obszar identyczności pomiędzy dwoma różnymi lecz strukturalnie pokrewnymi białkami, IL-1a i IL-1 β, w celu zaprojektowania antygenu o podwójnej specyficzności w celu wytworzenia specyficznych przeciwciał rozpoznających IL-1a i IL-1 β. W celu porównania wspomnianych dwu białek zastosowano algorytm BLAST umożliwiający pomiar tendencji do zastępowania konkretnej reszty aminokwasowej inną w regionach podobnych strukturalnie bądź funkcjonalnie. Wspomniana analiza umożliwia identyfikację najdłuższych przylegających regionów topologicznej identyczności pomiędzy IL-1a i IL-1 β by możliwe było stworzenie liniowego peptydu jako antygenu o podwójnej specyficzności. Wspomniany peptyd, najlepiej spełniający wymienione cechy posiada następującą sekwencje aminokwasową:
NEAQNITDF (Sek Id Nr 1) * *****
Gwiazdka (*) wskazuje reszty identyczne w obu białkach, a inne reszty są wysoce podobne wg algorytmu BLAST. Na przykład lizyna często podstawia argininę w homologicznych białkach, lecz nie zastępuje fenyloalaniny. Peptyd o Sek Id Nr 1 jest hybrydą, o sekwencji wziętej z dwu różnych fragmentów struktury biegnących w przeciwnych kierunkach, tak więc inne możliwe przedstawienie wspomnianego epitopu wygląda następująco:
dNdEdAdQNITDF gdzie „d” oznacza resztę aminokwasu w formie D. Zarówno wersje L aminokwasowe wspomnianego peptyd, jak i wersje częściowo podstawione resztami D aminokwasów można zsyntezować metodami standardowymi. Następnie peptyd zostaje skonjugowany z białkiem nośnikowym (np. KLH lub albuminą) i taki skonjugowany peptyd stosowany jest do selekcjonowania przeciwciał in vitro albo in vivo.
P r z y k ł a d 2: Projektowanie antygenu o podwójnej specyficzności naśladującego wspólną pętlę strukturalną
W tym przykładzie peptyd cykliczny, naśladujący strukturalnie kluczową pętlę obszaru fałdowania dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych białek IL-1a i IL-1 β został wytworzony w celu zastosowania jako antygen o podwójnej specyficzności w celu wytworzenia przeciwciał o podwójnej specyficzności wobec IL-1a i IL-1 β. Wybrana pętla obejmuje reszty 168-184 IL-1a i reszty 160-176 IL-1 β. Sekwencja konsensusowa wygląda następująco:
cyklo-MAFLRANQNNGKISVAL (PG) (Sek Id Nr 2) cbcccccccc**c*b
Gwiazdka (*) oznacza reszty identyczne dla IL-1a i IL-1 β, c wskazuje reszty konsensusowe tzn. reszty podobne dla IL-1a i IL-1 β, lecz nie obecne w konkretnym miejscu w żadnym z wspomnianych białek, b wskazuje że nie istnieje wyraźna zgodność dla konkretnej reszty pomiędzy IL-1a i IL-1 β. Wspomniany liniowy peptyd syntezowany jest standardowymi sposobami syntezy chemicznej. W celu cyklizacji peptydu, dodawane są reszty prolinowa i glicynowa. Wspomniany cykliczny peptyd można syntezować z wykorzystaniem standardowych warunków sprzęgania przy wysokim stężeniu N,N-dimetyloformamidu (1 mg/ml). Reakcje prowadzi się w temperaturze pokojowej stosując nadmiar odczynnika sprzęgającego, takiego jak heksafluorofosforan benzotriazol-1-iloksotrispirolidynofosfoniowy (PyBOP, 2 równoważniki) i dwuwęglanu sodowego (10 równoważników). Peptyd jest następnie sprzęgany z białkiem nośnikowym (np. KLH lub albuminą) i wspomniany sprzężony peptyd stosowany jest do selekcji przeciwciał in vitro lub in vivo.
P r z y k ł a d 3: Projektowanie antygenu o podwójnej specyficzności w oparciu o peptyd hybrydowy
W tym przykładzie peptyd hybrydowy obejmujący ułożone na przemian lub pokrywające się części dwu różnych lecz strukturalnie pokrewnych białek, IL-1a i IL-1 β, skonstruowany został w celu zastosowania jako antygen o podwójnej specyficzności do wytworzenia przeciwciał o podwójnej specyficzności rozpoznających IL-1a i ^-1β. W celu wytworzenia wspomnianego peptydu hybrydowego identyfikowane są ułożone na przemian lub pokrywające się sekwencje aminokwasowe IL-1a i IL-1 β, i łączone w celu utworzenia następującego peptydu:
TKGGQDITDFQILENQ (Sek Id Nr 3) bbbbbbbbbb aaaaaaaaaa
PL 208 069 B1
W powyższym peptydzie a i b wskazują z którego białka pochodzą reszty aminokwasowe (a = IL-1 α i b = IL-1 β). Motyw ITDF (Sek Id Nr 4) jest wspólny dla obu białek i został on włączony do peptydu hybrydowego. Ponadto, peptyd hybrydowy oparty jest o sekwencje z C końca obu białek, o którym wiadomo że jest antygenowy w odniesieniu do przeciwciał neutralizujących dla obu białek. Peptyd hybrydowy syntezowany jest standardowymi technikami syntezy chemicznej, a następnie sprzęgany z białkiem nośnikowym (np. KLH lub albuminą) i sprzężony peptyd stosowany jest do selekcji przeciwciał in vitro lub in vivo.
P r z y k ł a d 4: Wytwarzanie przeciwciał o podwójnej specyficzności wobec IL-1a i IL-1 β NEAQNITDF (Sek Id Nr 1) cyklo-MAFLRANQNNGKISVAL (PG) (Sek Id Nr 2)
TKGGQDITDFQILENQ (Sek Id Nr 3)
Peptydy oznaczone Sek Id Nr 1, 2 i 3 sprzęgnięto z KLH i immunizowano nimi poszczególne króliki. Surowice uzyskane z królików immunizowanych poszczególnymi, trzema peptydami wykazywały dobra odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw wspomnianym peptydom. Jednak tylko surowica uzyskana z królika immunizowanego peptydem o Sek Id Nr 3 była zdolna do wiązania zarówno białko IL-1a jak i białko IL-1 β.
Pięć myszy (BA119-BA123) immunizowano wstrzykując podskórnie peptyd o Sek Id Nr 3, skoniugowany z KLH oraz z dodatkiem niekompletnego adiuwantu Freunda (FIA) raz co trzy tygodnie, łącznie trzy razy, a następnie dwa razy dożylnie peptydem o Sek Id Nr 3 skoniugowanym z KLH. Od każdej z myszy pobierano krew 10 dni po każdej immunizacji i określano miano przeciwciała stosując test ELISA. Komórki grasicy z myszy BA119 i BA123 poddawano fuzji z komórkami szpiczaka linii P3X36Ag8.653 jak opisano to w punkcie IIA i uzyskane fuzanty wysiewano po jednej komórce na studzienkę w płytce 96-studzienkowej, stosując metodę rozcieńczeń. Wzrastające klony hybrydom testowano pod względem produkcji IgG i IgM standardowym testem ELISA w celu wyselekcjonowania klonów wytwarzających przeciwciało. Z fuzantów z myszy BA123 uzyskano 945 klonów. Supernatanty z 355 klonów testowane testem ELISA wykazały aktywność wiązania IL-1a, IL-1 β lub obu IL-1a i IL-1 β.
# klonów specyficzność antygenu (wobec pełnej długości IL-1a i/lub IL-1 β) izotyp
249 tylko IL-1 a IgG
19 tylko IL-1a IgM
15 tylko IL-1P IgG
2 tylko IL-1P IgM
57 IL-1a i IL-1P IgG
13 IL-1a i IL-1P IgM
Lista sekwencji
NEAQNITDF (Sek Id Nr 1) cyklo-MAFLRANQNNGKISVAL (PG) (Sek Id Nr 2)
TKGGQDITDFQILENQ (Sek Id Nr 3)
APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMGAYKSSKDDAKITVILGLKEKNL
YLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLG
GTKGGQDITDFTMQFVSS

Claims (41)

1. Sposób uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen, które specyficznie wiąże dwa różne, lecz strukturalnie pokrewne białka, znamienny tym, że:
otrzymuje się antygen przez składanie ze sobą zachodzących na siebie części dwu różnych, lecz strukturalnie pokrewnych białek dla utworzenia peptydu hybrydowego, który to peptyd ma strukturę X-Y-Z, gdzie Y przedstawia region identyczny lub bardzo podobny dla obu pokrewnych białek,
PL 208 069 B1
X przedstawia region z jednego z pokrewnych białek, a Z przedstawia region z drugiego z pokrewnych białek;
wystawia się repertuar przeciwciał na działanie tego antygenu; i przeprowadza się selekcję repertuaru przeciwciał, które specyficznie wiążą te dwie różne, lecz strukturalnie pokrewne białka, w celu otrzymania przeciwciała o podwójnej specyficzności.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że repertuar przeciwciał wystawia się na działanie antygenu in vivo poprzez immunizację nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że obejmuje ponadto przygotowanie panelu hybrydom z limfocytów zwierzęcia i wybieranie hybrydomy wydzielającej przeciwciało specyficznie wiążące dwa różne, lecz strukturalnie pokrewne białka cząsteczki.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że zwierzę wybiera się z grupy obejmującej myszy, szczury, króliki i kozy.
5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako zwierzę stosuje się mysz z wyłączonym genem pozbawioną endogennej wersji antygenu.
6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się zwierzę będące myszą transgeniczna pod względem ludzkich genów immunoglobulin i wytwarzające w wyniku stymulacji antygenowej ludzkie przeciwciała.
7. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się zwierzę będące myszą z ostrym złożonym zespołem braku odporności odbudowanej za pomocą ludzkich obwodowych komórek jednojądrzastych lub komórek limfoidalnych, lub ich prekursorów.
8. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się zwierzę będące myszą poddaną naświetleniu śmiertelną dawką promieniowania, następnie poddaną ochronie radiologicznej przez przeszczep komórek szpiku kostnego od myszy z ostrym złożonym zespołem braku odporności, a następnie przeszczepieniu ludzkich, funkcjonalnych limfocytów.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że repertuar przeciwciał wystawia się na działanie antygenu in vitro przez przeszukiwanie biblioteki rekombinowanych przeciwciał z wykorzystaniem tego antygenu.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni bakteriofaga.
11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki drożdżowej.
12. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki bakterii.
13. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana jako produkty fuzyjne RNA-białko.
14. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest biblioteką scFv lub biblioteką Fab.
15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu przez immunizację in vivo zwierzęcia tym antygenem, a następnie przeszukiwanie in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia z użyciem tego antygenu.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu in vivo poprzez immunizację zwierzęcia tym antygenem, a następnie dojrzewanie powinowactwa in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia.
17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu przez immunizację in vivo zwierzęcia tym antygenem, a następnie wybieranie pojedynczych komórek wydzielających przeciwciało wiążące antygen, i odzyskiwanie cDNA zmiennych regionów łańcucha lekkiego i ciężkiego z tych pojedynczych komórek.
18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące w pełni ludzkim przeciwciałem.
19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem chimerycznym.
20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem z przeszczepionym CDR.
PL 208 069 B1
21. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dwoma różnymi, lecz strukturalnie pokrewnymi białkami są interleukina-1 α i interleukina-1 β.
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że jako antygen stosuje się antygen obejmujący sekwencję aminokwasową TKGGQDITDFQILENQ (Sek Id Nr 3).
23. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że repertuar przeciwciał wystawia się na działanie antygenu in vivo, poprzez immunizowanie nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem.
24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że ponadto przygotowuje panel hybrydom z limfocytów zwierzęcia i wybiera się hybrydomę wydzielającą przeciwciało specyficznie wiążące IL-1 α i IL-1 β.
25. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że stosuje się zwierzę wybrane się z grupy obejmującej mysz, szczura, królika i kozę.
26. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że stosuje się zwierzę będące myszą z wyłączonym genem, nie wytwarzającą IL-1a, IL-1 β lub IL-1a i IL-1 β.
27. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że stosuje się zwierzę będące myszą transgeniczna pod względem ludzkich genów immunoglobulin i wytwarzające w wyniku stymulacji antygenowej ludzkie przeciwciała.
28. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że stosuje się zwierzę będące myszą z ostrym złożonym zespołem braku odporności odbudowanej za pomocą ludzkich obwodowych komórek jednojądrzastych lub komórek limfoidalnych, lub ich prekursorów.
29. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że stosuje się zwierzę będące myszą poddaną naświetleniu śmiertelną dawką promieniowania, następnie poddaną ochronie radiologicznej przez przeszczep komórek szpiku kostnego od myszy z ostrym złożonym zespołem braku odporności, a następnie przeszczepieniu ludzkich, funkcjonalnych limfocytów lub ich prekursorów.
30. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że repertuar przeciwciał wystawia się na działanie antygenu in vitro przez przeszukiwanie biblioteki rekombinowanych przeciwciał z wykorzystaniem tego antygenu.
31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni bakteriofaga.
32. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki drożdżowej.
33. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana na powierzchni komórki bakterii.
34. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest eksprymowana jako produkty fuzyjne RNA-białko.
35. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że biblioteka rekombinowanych przeciwciał jest biblioteką scFv lub biblioteką Fab.
36. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu przez immunizację in vivo nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem, a następnie przeszukiwanie in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia z użyciem tego antygenu.
37. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu in vivo poprzez immunizację nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem, a następnie dojrzewanie powinowactwa in vitro biblioteki rekombinowanych przeciwciał utworzonej z komórek limfoidalnych tego zwierzęcia.
38. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że repertuar przeciwciał jest wystawiany na działanie antygenu przez immunizację in vivo nie będącego człowiekiem zwierzęcia tym antygenem, a następnie wybieranie pojedynczych komórek wydzielających przeciwciało wiążące antygen, i odzyskiwanie cDNA zmiennych regionów łańcucha lekkiego i ciężkiego z tych pojedynczych komórek.
39. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące w pełni ludzkim przeciwciałem.
40. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem chimerycznym.
41. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że uzyskuje się przeciwciało o podwójnej specyficzności będące przeciwciałem z przeszczepionym CDR.
PL359995A 2000-06-29 2001-06-28 Sposób uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen PL208069B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21537900P 2000-06-29 2000-06-29
PCT/US2001/020755 WO2002002773A2 (en) 2000-06-29 2001-06-28 Dual specificity antibodies and methods of making and using

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL359995A1 PL359995A1 (pl) 2004-09-06
PL208069B1 true PL208069B1 (pl) 2011-03-31

Family

ID=22802758

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL359995A PL208069B1 (pl) 2000-06-29 2001-06-28 Sposób uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen

Country Status (26)

Country Link
US (5) US7491516B2 (pl)
EP (4) EP2386575A3 (pl)
JP (2) JP4955185B2 (pl)
KR (2) KR20080074231A (pl)
CN (3) CN101525384A (pl)
AT (1) ATE420958T1 (pl)
AU (1) AU2001271636A1 (pl)
BG (1) BG66209B1 (pl)
BR (1) BR0112026A (pl)
CA (1) CA2411374C (pl)
CZ (1) CZ2003291A3 (pl)
DE (1) DE60137421D1 (pl)
EC (1) ECSP024409A (pl)
ES (1) ES2319866T3 (pl)
HU (1) HUP0301002A3 (pl)
IL (3) IL153567A0 (pl)
MX (1) MXPA02012867A (pl)
NO (1) NO20026239L (pl)
NZ (1) NZ523080A (pl)
PE (1) PE20020132A1 (pl)
PL (1) PL208069B1 (pl)
SK (1) SK1152003A3 (pl)
TW (2) TWI307716B (pl)
UY (1) UY26807A1 (pl)
WO (1) WO2002002773A2 (pl)
ZA (1) ZA200210109B (pl)

Families Citing this family (181)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2295303A1 (en) * 1997-06-27 1999-01-07 Human Genome Sciences Inc. Human nk-3 related prostate specific gene-1
PL208069B1 (pl) * 2000-06-29 2011-03-31 Abbott Lab Sposób uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
WO2003002609A2 (en) * 2001-06-28 2003-01-09 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
GB0115841D0 (en) 2001-06-28 2001-08-22 Medical Res Council Ligand
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
US20070104710A1 (en) * 2002-06-28 2007-05-10 Domants Limited Ligand that has binding specificity for IL-4 and/or IL-13
US9028822B2 (en) 2002-06-28 2015-05-12 Domantis Limited Antagonists against TNFR1 and methods of use therefor
US20060002935A1 (en) 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
PT1523496E (pt) 2002-07-18 2011-09-29 Merus B V Produção de misturas de anticorpos de forma recombinante
US20050271660A1 (en) 2002-09-06 2005-12-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Nebulization of monoclonal antibodies for treating pulmonary diseases
GB0230201D0 (en) * 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Retargeting
US20110223168A1 (en) * 2002-12-27 2011-09-15 Greg Winter Ligand that has binding specificity for il-4 and/or il-13
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
CA2527694C (en) 2003-05-30 2015-07-14 Hendricus Renerus Jacobus Mattheus Hoogenboom Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
US7981843B2 (en) * 2004-01-20 2011-07-19 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
AU2005205412B2 (en) 2004-01-20 2011-08-11 Merus N.V. Mixtures of binding proteins
TW201705980A (zh) * 2004-04-09 2017-02-16 艾伯維生物技術有限責任公司 用於治療ＴＮＦα相關失調症之多重可變劑量療法
US7790405B2 (en) 2004-04-26 2010-09-07 Centocor, Inc. Solution phase biopanning method using engineered decoy proteins
JP5017097B2 (ja) * 2004-04-26 2012-09-05 セントカー・インコーポレーテツド 設計デコイタンパク質を用いる溶液相バイオパニング方法
US7514539B2 (en) 2004-04-26 2009-04-07 Centocor, Inc. Epitope directed selection of antibodies to murine tissue factor
JP2008500830A (ja) 2004-06-01 2008-01-17 ドマンティス リミテッド 増加した血清半減期を有する二重特異性融合抗体
WO2006081139A2 (en) 2005-01-26 2006-08-03 Abgenix, Inc. Antibodies against interleukin-1 beta
KR100675791B1 (ko) * 2005-02-04 2007-02-02 제주대학교 산학협력단 육상어류양식장용 자동먹이공급시스템
ATE507242T1 (de) * 2005-05-12 2011-05-15 Crucell Holland Bv Wirtszellenspezifische bindungsmoleküle, die dazu in der lage sind, viren zu neutralisieren, und anwendungen davon
WO2006136601A1 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 Crucell Holland B.V. Optimization of west nile virus antibodies
SG155912A1 (en) 2005-07-25 2009-10-29 Trubion Pharmaceuticals Inc B-cell reduction using cd37-specific and cd20-specific binding molecules
KR20140053410A (ko) 2005-08-19 2014-05-07 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP2500355A3 (en) 2005-08-19 2012-10-24 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1928905B1 (de) 2005-09-30 2015-04-15 AbbVie Deutschland GmbH & Co KG Bindungsdomänen von proteinen der repulsive guidance molecule (rgm) proteinfamilie und funktionale fragmente davon sowie deren verwendung
WO2007042524A2 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Novo Nordisk A/S Treating diabetes using inhibitors of il-1
RU2008144802A (ru) * 2006-04-14 2010-05-20 Новартис АГ (CH) Применение антител против ил-1 для лечения глазных расстройств
MX2008014977A (es) * 2006-06-06 2008-12-05 Crucell Holland Bv Moleculas de union humanas que tienen actividad exterminadora contra estafilococos y uso de las mismas.
AU2007257692B2 (en) 2006-06-12 2013-11-14 Aptevo Research And Development Llc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
US20090017455A1 (en) * 2006-08-02 2009-01-15 Kwong Gabriel A Methods and systems for detecting and/or sorting targets
ES2399075T3 (es) 2006-08-30 2013-03-25 Genentech, Inc. Anticuerpos multiespecíficos
AU2007333635B2 (en) * 2006-12-20 2014-02-20 Xoma (Us) Llc Treatment of IL-1-beta related diseases
EP2114443A4 (en) * 2006-12-29 2011-08-10 Abbott Lab IL-1A / IL-1B ANTIBODY WITH DOUBLE SPECIFICITY
WO2008150491A2 (en) 2007-05-31 2008-12-11 Abbott Laboratories BIOMARKERS PREDICTIVE OF THE RESPONSIVENESS TO TNFα INHIBITORS IN AUTOIMMUNE DISORDERS
JP5592792B2 (ja) 2007-09-26 2014-09-17 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 二重特異性抗体の融合体
JP2011506614A (ja) 2007-12-17 2011-03-03 ダイアックス コーポレーション Ｍｍｐ−１４結合タンパク質を含む、骨溶解性障害を処置するための組成物および方法
US8962803B2 (en) 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
EP2262529A4 (en) 2008-03-03 2013-05-08 Dyax Corp METALLOPROTEINASE BINDING PROTEINS 9
AU2009221916A1 (en) * 2008-03-03 2009-09-11 Dyax Corp. Metalloproteinase 9 and metalloproteinase 2 binding proteins
PT2132228E (pt) 2008-04-11 2011-10-11 Emergent Product Dev Seattle Imunoterapia de cd37 e sua combinação com um quimioterápico bifuncional
AU2009241589B2 (en) 2008-04-29 2013-10-10 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
RU2010153580A (ru) 2008-06-03 2012-07-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двумя вариабельными доменами и их применение
UY31861A (es) * 2008-06-03 2010-01-05 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
WO2010006060A2 (en) * 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2547596C2 (ru) 2008-09-03 2015-04-10 Дженентек, Инк. Полиспецифические антитела
JP2012502058A (ja) * 2008-09-05 2012-01-26 ゾーマ テクノロジー リミテッド β細胞機能の改善のための方法
AU2009291536B2 (en) * 2008-09-12 2012-08-16 Xbiotech Inc. Targeting pathogenic monocytes
EA201100527A1 (ru) 2008-09-26 2011-10-31 Юсб Фарма С.А. Биологические продукты
EP2196476A1 (en) 2008-12-10 2010-06-16 Novartis Ag Antibody formulation
BRPI1007371A2 (pt) * 2009-01-29 2018-03-27 Abbott Lab proteínas de ligação a il-1
EP3235509A1 (en) 2009-03-05 2017-10-25 AbbVie Inc. Il-17 binding proteins
JP5501439B2 (ja) * 2009-04-02 2014-05-21 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 完全長抗体と単鎖Ｆａｂフラグメントとを含む多重特異的抗体
CN101957365B (zh) * 2009-07-21 2013-08-07 卫生部北京医院 检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白g双特异性抗体的试剂盒
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
CA2771575A1 (en) 2009-08-29 2011-03-03 Abbott Laboratories Therapeutic dll4 binding proteins
SG178602A1 (en) * 2009-09-01 2012-04-27 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
GB201005063D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
KR20140015139A (ko) * 2009-10-15 2014-02-06 애브비 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
RU2012119788A (ru) * 2009-10-15 2013-11-20 Эбботт Лэборетриз Связывающие il-1 белки
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
BR112012013734A2 (pt) 2009-12-08 2017-01-10 Abbott Gmbh & Co Kg anticorpos monoclonais contra a proteína rgm a para uso no tratamento da degeneração da camada de fibras nervosas da retina.
EP2523974A4 (en) * 2010-01-12 2013-11-06 Oncomed Pharm Inc WNT BINDER AND APPLICATIONS THEREOF
UA112743C2 (uk) 2010-03-02 2016-10-25 Еббві Інк. Терапевтичний dll4-зв'язувальний білок
MX346731B (es) * 2010-04-23 2017-03-30 Genentech Inc * Producción de proteínas heteromultiméricas.
MY161302A (en) 2010-05-14 2017-04-14 Abbvie Inc IL-1 binding proteins
US20120009196A1 (en) 2010-07-08 2012-01-12 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
CA2807014A1 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
MX2013001267A (es) * 2010-08-13 2013-04-10 Genentech Inc ANTICUERPOS A IL-1ß E EIL-18 PARA TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD.
SG187938A1 (en) 2010-08-26 2013-04-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
MY163368A (en) 2010-12-21 2017-09-15 Abbvie Inc Il-1-alpha and -beta bispecific dual variable domain immunoglobulins and their use
RU2015134562A (ru) * 2011-02-08 2018-12-24 Эббви Инк. Лечение остеоартрита и боли
AU2012265156B2 (en) 2011-05-27 2017-01-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Dual targeting
US20140255405A1 (en) 2011-05-27 2014-09-11 Dutalys Removal of Monomeric Targets
EP2722343A4 (en) 2011-06-20 2014-12-17 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd ANTI-ERBB3 ANTIBODIES
US10314909B2 (en) 2011-10-21 2019-06-11 Dyax Corp. Combination therapy comprising an MMP-14 binding protein
AU2012328917B2 (en) 2011-10-24 2017-05-25 Abbvie Inc. Bispecific immunobinders directed against TNF and IL-17
US8999331B2 (en) 2011-10-24 2015-04-07 Abbvie Inc. Immunobinders directed against sclerostin
PE20141941A1 (es) * 2011-11-21 2014-12-28 Abbvie Inc Proteinas que pueden unirse a la il-1
RU2482181C1 (ru) * 2011-12-07 2013-05-20 Учреждение Российской академии медицинских наук Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина РАМН Клеточная линия d11 множественной миеломы человека, используемая для гибридомной технологии
MX356933B (es) 2011-12-14 2018-06-20 Abbvie Deutschland Composicion y metodo para el diagnostico y tratamiento de trastornos relacionados con hierro.
EP3800200A1 (en) 2011-12-14 2021-04-07 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
KR101963230B1 (ko) 2011-12-26 2019-03-29 삼성전자주식회사 복수개의 단일 항체를 포함하는 단백질 복합체
US20130171059A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CN104159920A (zh) 2011-12-30 2014-11-19 艾伯维公司 针对il-13和/或il-17的双重可变结构域免疫球蛋白
RS57603B1 (sr) 2012-01-27 2018-11-30 Abbvie Deutschland Sastav i metod za dijagnozu i tretiranje bolesti povezanih sa degeneracijom neurita
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
CN107383197B (zh) 2012-04-20 2021-12-10 美勒斯公司 用于产生免疫球蛋白样分子的方法和手段
UY34905A (es) 2012-07-12 2014-01-31 Abbvie Inc Proteínas de unión a il-1
KR101911438B1 (ko) 2012-10-31 2018-10-24 삼성전자주식회사 이중 특이 항원 결합 단백질 복합체 및 이중 특이 항체의 제조 방법
MX2015005495A (es) * 2012-11-01 2016-01-22 Abbvie Inc Formulaciones de proteina de inmunoglobulina del dominio variable dual estable.
PE20151179A1 (es) 2012-11-01 2015-09-12 Abbvie Inc Inmunoglobulinas de dominio variable dual anti-vegf/dll4 y usos de las mismas
BR112015012014A2 (pt) 2012-12-04 2017-07-11 Abbvie Inc proteínas de ligação específicas duais penetrando a barreira hematoencefálica (bbb)
US9856319B2 (en) 2012-12-28 2018-01-02 Abbvie Inc. Monovalent binding proteins
WO2014106015A2 (en) 2012-12-28 2014-07-03 Abbvie, Inc. Multivalent binding protein compositions
US20140219913A1 (en) * 2012-12-28 2014-08-07 Abbvie, Inc. Dual Specific Binding Proteins Having a Receptor Sequence
EP2948475A2 (en) 2013-01-23 2015-12-02 AbbVie Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
TW201446800A (zh) 2013-03-15 2014-12-16 Abbvie Inc 針對ＴＮＦα之雙特異性結合蛋白
US9469686B2 (en) 2013-03-15 2016-10-18 Abbott Laboratories Anti-GP73 monoclonal antibodies and methods of obtaining the same
US9062108B2 (en) 2013-03-15 2015-06-23 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against IL-1 and/or IL-17
JP6581572B2 (ja) 2013-06-07 2019-09-25 デューク ユニバーシティ 補体因子ｈ阻害薬
CN103308697B (zh) * 2013-06-09 2014-11-26 卫生部北京医院 检测抗丙型肝炎病毒编码的非结构蛋白ns3和ns5的天然双特异性抗体的试剂盒
US9879081B2 (en) 2013-06-25 2018-01-30 Samsung Electronics Co., Ltd. Protein complex, bispecific antibody including the protein complex, and method of preparation thereof
CN105793284A (zh) 2013-09-17 2016-07-20 大学健康网络(Uhn):技术开发和商业化公司 针对顺式RGMa/再生蛋白相互作用或脂筏的试剂及其在治疗方法中的应用
CN105765063B (zh) * 2013-09-30 2021-05-07 中外制药株式会社 应用改变的辅助噬菌体制备抗原结合分子的方法
KR102597804B1 (ko) 2013-12-20 2023-11-07 제넨테크, 인크. 이중 특이적 항체
BR112016024462B1 (pt) 2014-05-06 2022-12-27 Genentech, Inc Métodos para a preparação de um anticorpo
US20160000936A1 (en) 2014-06-10 2016-01-07 Abbvie Inc. Biomarkers for inflammatory disease and methods of using same
WO2015191934A2 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Abbvie Inc. Blood-brain barrier (bbb) penetrating dual specific binding proteins for treating brain and neurological diseases
EP2985294A1 (en) 2014-08-14 2016-02-17 Deutsches Krebsforschungszentrum Recombinant antibody molecule and its use for target cell restricted T cell activation
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
JP6655302B2 (ja) * 2015-05-29 2020-02-26 デンカ生研株式会社 被検対象の検出方法並びにそのための免疫測定器具及びモノクローナル抗体
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
BR112018004867A2 (pt) 2015-09-11 2018-10-16 Abbvie Deutschland métodos para tratamento das formas recorrentes de esclerose múltipla
EP3352760B1 (en) 2015-09-21 2026-03-11 Aptevo Research and Development LLC Cd3 binding polypeptides
MY192202A (en) 2015-10-02 2022-08-06 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
EP3356821B1 (en) 2015-10-02 2019-10-23 H. Hoffnabb-La Roche Ag Cellular based fret assay for the determination of simultaneous binding
WO2017087784A1 (en) 2015-11-18 2017-05-26 Duke University Tumor infiltrating lymphocytes for treatment of cancer
KR20180122397A (ko) 2016-03-11 2018-11-12 스칼러 락, 인크. TGFβ1-결합 이뮤노글로불린 및 그의 용도
CN118403155A (zh) 2016-06-01 2024-07-30 艾伯维公司 用于治疗脊髓损伤和疼痛的抗反义导向分子a（rgma）拮抗性抗体
EP3515494B1 (en) 2016-09-26 2026-02-25 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Regulators of b cell-mediated immunosuppression
MX2019003473A (es) 2016-10-03 2019-10-15 Abbott Lab Metodos mejorados para evaluar el estado de ubiquitin carboxi-terminal hidrolasa l1 (uch-l1) en muestras de pacientes.
MX2019008197A (es) 2017-01-06 2019-09-11 Scholar Rock Inc Inhibidores de tgfb1 permisivos del contexto, espicificos de isoformas y uso de los mismos.
JP7346300B2 (ja) 2017-03-23 2023-09-19 アボット・ラボラトリーズ 早期バイオマーカーであるユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼｌ１を使用する、ヒト対象における外傷性脳損傷の程度の診断及び決定の一助となるための方法
KR102461885B1 (ko) 2017-04-03 2022-11-03 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-pd-1 항체와 돌연변이 il-2 또는 il-15의 면역접합체
US11285207B2 (en) 2017-04-05 2022-03-29 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies specifically binding to PD1 and LAG3
CN110546513A (zh) 2017-04-15 2019-12-06 雅培实验室 使用早期生物标记物帮助超急性诊断和确定人类受试者中的创伤性脑损伤的方法
AU2018256845B2 (en) 2017-04-28 2024-03-14 Abbott Laboratories Methods for aiding in the hyperacute diagnosis and determination of traumatic brain injury using early biomarkers on at least two samples from the same human subject
US10865238B1 (en) 2017-05-05 2020-12-15 Duke University Complement factor H antibodies
CN110651190A (zh) 2017-05-25 2020-01-03 雅培实验室 用早期生物标记物帮助确定是否对已遭受或可能已遭受头部损伤的人受试者执行成像的方法
WO2018222783A1 (en) 2017-05-30 2018-12-06 Abbott Laboratories Methods for aiding in diagnosing and evaluating a mild traumatic brain injury in a human subject using cardiac troponin i and early biomarkers
WO2019010131A1 (en) 2017-07-03 2019-01-10 Abbott Laboratories IMPROVED METHODS FOR MEASURING CARBOXY TERMINATION HYDROLASE LEVELS OF UBIQUITIN L1 IN BLOOD
GB201711208D0 (en) 2017-07-12 2017-08-23 Iontas Ltd Ion channel inhibitors
EP3708589A4 (en) 2017-11-08 2021-08-11 Kyowa Kirin Co., Ltd. BIS SPECIFIC ANTIBODY BINDING TO CD40 AND EPCAM
JP7344801B2 (ja) 2017-12-09 2023-09-14 アボット・ラボラトリーズ グリア原線維性酸性タンパク質（ｇｆａｐ）及び／又はユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼｌ１（ｕｃｈ－ｌ１）を使用する、整形外科損傷を負っており、軽度外傷性脳損傷（ｔｂｉ）などの頭部への損傷を負ったか又は負った可能性がある対象についての診断及び査定の一助となるための方法
CN110892266A (zh) 2017-12-09 2020-03-17 雅培实验室 使用gfap和uch-l1的组合辅助诊断和评价人类受试者中创伤性脑损伤的方法
JP7437303B2 (ja) 2017-12-29 2024-02-22 アボット・ラボラトリーズ 外傷性脳損傷を診断及び査定するための、新規のバイオマーカー及び方法
KR102891320B1 (ko) 2018-07-11 2025-11-28 스칼러 락, 인크. 고친화도, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제 및 그의 용도
SI3677278T1 (sl) 2018-07-11 2022-01-31 Scholar Rock, Inc. Izoformno selektivni zaviralci TGFBETA1 in uporaba le-teh
EP3820896A1 (en) 2018-07-11 2021-05-19 Scholar Rock, Inc. TGFbeta1 INHIBITORS AND USE THEREOF
TWI873112B (zh) 2018-12-28 2025-02-21 日商協和麒麟股份有限公司 與TfR結合之雙專一性抗體
US11079395B2 (en) 2019-03-01 2021-08-03 Abbott Laboratories Methods for predicting major adverse cardiovascular events in subjects with coronary artery disease
CA3140385A1 (en) 2019-05-15 2020-11-19 Kyowa Kirin Co., Ltd. Bispecific antibody binding to cd40 and fap
US12466891B2 (en) 2019-05-15 2025-11-11 Kyowa Kirin Co., Ltd. Bispecific antibody binding to CD40 and GPC3
IL294650A (en) 2020-01-11 2022-09-01 Scholar Rock Inc Tgfbeta inhibitors and use thereof
JP2023511255A (ja) 2020-01-11 2023-03-17 スカラー ロック インコーポレイテッド ＴＧＦ－β阻害剤及びその使用
EP4136459A1 (en) 2020-04-13 2023-02-22 Abbott Laboratories Methods, complexes and kits for detecting or determining an amount of a ss-coronavirus antibody in a sample
CN111793131A (zh) * 2020-05-11 2020-10-20 廊坊天光生物技术有限公司 一种用于检测血清中pf4含量的抗体对及其用途
WO2021231798A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Disc Medicine, Inc. Anti-hemojuvelin (hjv) antibodies for treating myelofibrosis
EP4193149A1 (en) 2020-08-04 2023-06-14 Abbott Laboratories Improved methods and kits for detecting sars-cov-2 protein in a sample
WO2022119841A1 (en) 2020-12-01 2022-06-09 Abbott Laboratories Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi
WO2023102384A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Abbott Laboratories Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi
WO2022147147A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Abbott Laboratories Methods for determining sars-cov-2 antigen and anti-sars-cov-2 antibody in a sample
WO2022204581A2 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and use thereof
EP4341699A1 (en) 2021-05-18 2024-03-27 Abbott Laboratories Methods of evaluating brain injury in a pediatric subject
EP4348260A2 (en) 2021-06-03 2024-04-10 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and therapeutic use thereof
EP4356129A1 (en) 2021-06-14 2024-04-24 Abbott Laboratories Methods of diagnosing or aiding in diagnosis of brain injury caused by acoustic energy, electromagnetic energy, an over pressurization wave, and/or blast wind
US20240301073A1 (en) 2021-07-14 2024-09-12 Scholar Rock, Inc. LTBP COMPLEX-SPECIFIC INHIBITORS OF TGFb1 AND USES THEREOF
US20240352445A1 (en) * 2021-08-13 2024-10-24 Abwiz Bio, Inc. Humanization, affinity maturation, and optimization methods for proteins and antibodies
CN118715440A (zh) 2021-08-31 2024-09-27 雅培实验室 诊断脑损伤的方法和系统
AU2022339759A1 (en) 2021-08-31 2024-03-07 Abbott Laboratories Methods and systems of diagnosing brain injury
EP4409294A1 (en) 2021-09-30 2024-08-07 Abbott Laboratories Methods and systems of diagnosing brain injury
AU2022413677A1 (en) 2021-12-17 2024-06-27 Abbott Laboratories Systems and methods for determining uch-l1, gfap, and other biomarkers in blood samples
KR20240139074A (ko) 2022-02-04 2024-09-20 애벗트 라보라토리이즈 샘플에서 유비퀴틴 카르복시-말단 히드롤라제 l1 및/또는 신경교 섬유성 산성 단백질의 존재를 검출하거나 또는 그의 양을 측정하기 위한 측면 유동 방법, 검정 및 기기
WO2024006876A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Abbott Laboratories Magnetic point-of-care systems and assays for determining gfap in biological samples
KR20250068723A (ko) 2022-09-15 2025-05-16 아보트 러보러터리즈 경증 및 초경증 외상성 뇌 손상을 구분하기 위한 바이오마커 및 방법
WO2024187051A1 (en) 2023-03-07 2024-09-12 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors for use for treating resistant or unresponsive cancer in patients
WO2024211475A1 (en) 2023-04-04 2024-10-10 Abbott Laboratories Use of biomarkers to determine whether a subject has sustained, may have sustained or is suspected of sustaining a subacute acquired brain injury (abi)
WO2024226971A1 (en) 2023-04-28 2024-10-31 Abbott Point Of Care Inc. Improved assays, cartridges, and kits for detection of biomarkers, including brain injury biomarkers
WO2025108551A1 (en) 2023-11-23 2025-05-30 Mabylon Ag Multispecific anti-allergen antibodies and uses thereof
WO2025109206A1 (en) 2023-11-22 2025-05-30 Mabylon Ag Multispecific anti-allergen antibodies and uses thereof
WO2025230857A1 (en) 2024-05-01 2025-11-06 Abbott Laboratories Improved methods for determining cardiac myosin binding protein c in biological samples

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US126603A (en) 1872-05-07 Improvement in machines for sawing staves
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
FR2577377B1 (fr) * 1985-02-21 1989-06-16 Albaret Sa Procede pour eviter le patinage d'un tracteur equipe d'un relevage hydraulique avec un outil enfoui dans le sol, et equipement de tracteur pour mettre en oeuvre ce procede
US4772685A (en) * 1985-10-02 1988-09-20 Merck & Co., Inc. Immunogenic peptides of human interleukin-1 and the corresponding anti-peptide antibodies
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
EP1997891A1 (en) 1988-09-02 2008-12-03 Dyax Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0585287B1 (en) 1990-07-10 1999-10-13 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1992002551A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69133476T2 (de) 1990-08-29 2006-01-05 GenPharm International, Inc., Palo Alto Transgene Mäuse fähig zur Produktion heterologer Antikörper
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
EP1340811A3 (en) 1992-05-22 2003-11-19 Montana State University Antibodies with specificity for multiple adhesion molecules
US5622701A (en) * 1994-06-14 1997-04-22 Protein Design Labs, Inc. Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin
AU698393B2 (en) * 1994-06-24 1998-10-29 Immunex Corporation Controlled release polypeptide compositions and methods of treating inflammatory bowel disease
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DK1143006T3 (da) 1995-08-18 2008-07-14 Morphosys Ip Gmbh Vektorer/DNA-sekvenser fra humane kombinatoriske antistofbiblioteker
DE122004000003I2 (de) 1996-02-09 2007-03-29 Abbott Biotech Ltd Humane Antikörper welche an humanen TNFalpha Binden
US6300065B1 (en) 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
IL119587A (en) 1996-11-07 2000-12-06 Univ Ramot Method of preparing and for obtaining bimolecular interactions
JP4215172B2 (ja) 1996-12-03 2009-01-28 アムジェン フレモント インク． 複数のＶ▲下Ｈ▼およびＶ▲下κ▼領域を含むヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック哺乳動物、ならびにそれから産生される抗体
PT971946E (pt) 1997-01-21 2006-11-30 Gen Hospital Corp Selecção de proteínas utilizando fusões arn-proteína
JP2002514919A (ja) 1997-04-04 2002-05-21 バイオサイト ダイアグノスティックス，インコーポレイテッド 多価ライブラリーおよびポリクローナルライブラリー
WO1998049286A2 (en) 1997-05-01 1998-11-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Directed evolution of enzymes and antibodies
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
US6680380B1 (en) * 1998-09-18 2004-01-20 Schering Corporation Nucleic acids encoding mammalian interleukin-1ζ, related reagents and methods
HUP0200575A3 (en) 1999-03-25 2004-11-29 Abbott Gmbh & Co Kg Human antibodies that bind human il-12 and methods for producing
GB0001448D0 (en) 2000-01-21 2000-03-08 Novartis Ag Organic compounds
PL208069B1 (pl) 2000-06-29 2011-03-31 Abbott Lab Sposób uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen
WO2004003019A2 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Domantis Limited Immunoglobin single variant antigen-binding domains and dual-specific constructs
WO2003002609A2 (en) 2001-06-28 2003-01-09 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
AU2006321364B2 (en) 2005-12-01 2011-11-10 Domantis Limited Noncompetitive domain antibody formats that bind Interleukin 1 Receptor type 1
EP2114443A4 (en) * 2006-12-29 2011-08-10 Abbott Lab IL-1A / IL-1B ANTIBODY WITH DOUBLE SPECIFICITY

Also Published As

Publication number Publication date
KR20080074231A (ko) 2008-08-12
EP1297142B1 (en) 2009-01-14
ATE420958T1 (de) 2009-01-15
DE60137421D1 (de) 2009-03-05
EP2042518A3 (en) 2009-04-08
KR100919593B1 (ko) 2009-09-29
PE20020132A1 (es) 2002-03-04
HUP0301002A3 (en) 2005-12-28
JP2004502428A (ja) 2004-01-29
US20140378666A1 (en) 2014-12-25
NZ523080A (en) 2004-11-26
NO20026239L (no) 2003-02-27
SK1152003A3 (en) 2003-07-01
NO20026239D0 (no) 2002-12-27
HUP0301002A2 (hu) 2003-07-28
PL359995A1 (pl) 2004-09-06
EP2042518A2 (en) 2009-04-01
IL153567A0 (en) 2003-07-06
IL153567A (en) 2010-11-30
BG107483A (bg) 2003-09-30
ZA200210109B (en) 2004-03-12
ES2319866T3 (es) 2009-05-14
CN101525384A (zh) 2009-09-09
US20090232736A1 (en) 2009-09-17
CN1451043A (zh) 2003-10-22
CN102120773A (zh) 2011-07-13
TWI307716B (en) 2009-03-21
US20030040083A1 (en) 2003-02-27
US8475766B2 (en) 2013-07-02
EP1297142A2 (en) 2003-04-02
JP4955185B2 (ja) 2012-06-20
EP2386575A2 (en) 2011-11-16
JP2012031178A (ja) 2012-02-16
WO2002002773A2 (en) 2002-01-10
EP2899210A3 (en) 2015-11-18
CZ2003291A3 (cs) 2003-05-14
UY26807A1 (es) 2002-01-31
US20140155579A1 (en) 2014-06-05
IL203955A (en) 2011-09-27
BR0112026A (pt) 2003-05-20
CN102120773B (zh) 2013-07-24
AU2001271636A1 (en) 2002-01-14
MXPA02012867A (es) 2003-09-05
ECSP024409A (es) 2003-02-06
CA2411374A1 (en) 2002-01-10
EP2899210A2 (en) 2015-07-29
KR20030014288A (ko) 2003-02-15
TW200516083A (en) 2005-05-16
BG66209B1 (bg) 2012-04-30
HK1055316A1 (en) 2004-01-02
US7491516B2 (en) 2009-02-17
CA2411374C (en) 2012-10-30
US20150175694A1 (en) 2015-06-25
EP2386575A3 (en) 2011-11-30
WO2002002773A3 (en) 2002-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL208069B1 (pl) Sposób uzyskiwania przeciwciała o podwójnej specyficzności lub jego części wiążącej antygen
JP2022115960A (ja) ＦｃＲｎに対する抗体及びその使用
AU2007202323C1 (en) Dual specificity antibodies and methods of making and using
KR20120011898A (ko) 사람 인터류킨-１８에 결합하는 항체 및 이를 제조하고 사용하는 방법
AU2013203432A1 (en) Dual specificity antibodies and methods of making and using
AU2012200225A1 (en) Dual specificity antibodies and methods of making and using
HK1164336A (en) Dual specificity antibodies and methods of making and using
HK1055316B (en) Dual specificity antibodies and methods of making and using

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
VDSO Invalidation of derivated patent or utility model

Ref document number: 389141

Country of ref document: PL

Kind code of ref document: A1

LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20140628