TWI307716B - Dual specificity antibodies and methods of making and using - Google Patents

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TWI307716B
TWI307716B TW090115948A TW90115948A TWI307716B TW I307716 B TWI307716 B TW I307716B TW 090115948 A TW090115948 A TW 090115948A TW 90115948 A TW90115948 A TW 90115948A TW I307716 B TWI307716 B TW I307716B
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Collinson Albert
W Dixon Richard
Ghayur Tariq
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1307716 五、發明説明（ ^_115948號專利申請案 •ίΛ說f叼畫·替換百m年1 q) 發明背f 哺乳動物免疫系統包括B淋巴細胞，其總共表現由數百數 兆個不同抗體專一性所組成的抗體譜（antibody repertoire) 。對特定抗原的正常免疫反應，涉及從該功能部分中選出 一或多個專一地與該抗原結合的抗體，且免疫反應的成功， 至少一部份是基於這些抗體專一地認出（且最後排除）刺激抗原 ’並"忽視”在抗體周遭其他分子的能力。 專一地認出一種特定抗原之抗體的效用，導致單株抗體 技術的發展。目前，標準融合瘤的技術，容許製備對感興 趣之抗原具有單一專一性的抗體。最近，已經發展了重組 抗體技術，像是篩選在活體外的抗體庫。這些技術亦容許 產製對感興趣之抗原具有單一專一性的抗體。 對單一標把抗原具有專一性的抗體，至少在某些環境下 ’可能對其他抗原顯示出不想要的交叉-反應性或背景結合 。然而，該交叉-反應性或背景結合通常是不可預測的（也 就是不可能預測那個抗原將與抗體進行交又-反應）。此外 ，這通常可與專一的抗原結合作用區別，因為它通常僅代 表極少部份的抗體結合能力（例如總抗體結合作用的1 %或 更少）’且通常僅在高抗體濃度下觀察到（例如比觀察到專 一性抗原結合所需之濃度更咼1 〇 〇 〇倍或更高）。雖然有數個 抗原’可能屬於在結構上有關聯的蛋白質家族，但抗體對 特疋豕私成員的反應仍是ill度專一的。此外，有數個蛋白 質家族成員的實例（例如IL-1和TNF家族的成員），其與相同 的受體、受體組份或在結構上有關聯的蛋白質結合，卻沒 -4- 71846-940126.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）
1307716 第090115948號專利申請案 中文說明耄#拖苜f<)4车1 qy 2 五、發明説明（ 有對-個家族成員升高，但對其他家族成員未顯示出高度 父又反應性的單株抗體。MAb，各種家族成員缺少交又_ 反應性’ ㈣因。首先，在標準融合瘤產製中， 僅對少數對標靶抗原具有高專一性/親和力的抗體進行搜 索，然後檢查少數選出之抗體的交又反應性或背景結合作 用。其次’雖然在家族中的蛋白質在結構上是有關聯的， 但它們可能具有獨特的、非-部份重叠的免疫優勢之抗原決 定位。因此，.藉著使用全長蛋白質而使其升高的MAbs，可 能不與其他在結構上有關聯的蛋白質產生交又反應。 亦有對一個物種的抗原升高，且將專一地與在其他物種 中相同功能之抗原結合的單株抗體的實例。例如，抗.老鼠 x抗體可迅速與得自人類的抗原X結合。4是因為它們共享 重要的序列和結構類似性，雖然它們是不相_。然而， 這類物種-交叉-反應性的抗體，並不構成"二元專一性"抗體 ，因為它們對的自不同物種的相同抗原具有專一性。 因此，仍f要具有可預測之二元或多元專一性的單株抗 體，也就是說，抗體對二或多個不同抗原具有真的專一性。 發明概尊 本發明提供製造對至少兩個在結構上_有關聯，但不同的 抗原具有一元專一性之抗體的方法。該方法通常涉及提供 抗原’其包括兩個不同的但在結構上有關聯之分子的共同 結構特徵；使抗體譜暴露在該抗原下；並從該譜中選出專 一地^與這兩個不同的但在結構上有關聯之分子結合的抗體 藉此獲得二元專一性抗體。在臨床環境中， -5- 71846-940l26.doc 本紙張尺度適用中® g家操準(CNS) A4規格(21GX297公董） !3〇7716 第090115948號專利申請案 中文說明書替換頁(93车 五、^明説明（3 相同家族蛋白質的數個成員可能提供疾病過程的各種徵候 因此使用本發明的二元專一性抗體，其與相同家族蛋 白質的成員結纟，阻斷該蛋白質家族一個以上成員的功能 ，可能有利於改善疾病徵候，或中斷該疾病本身的進行。 此外，這類本發明的二元專一性抗體，可用來檢測在結構 上有關聯的抗原，純化在結構上有關聯的抗原，並可用於 涉及在.纟σ構上有關聯之抗原的診斷測定。 在較佳的具體實施例中，以在兩個不同但在結構上有關 聯之刀子之間同一性的連結拓樸區域為基礎來設計抗原。 例如，兩個不同的但在結構上有關聯之分子可以是蛋白質 ，而抗原可以是肽，包括在這 鄰祐樸區域之胺基酸序列。蛋白質之間同-性的相 在另一個具體實施例中， 以在結構上模仿兩個不同但在 、、-D構上有關聯之分子的共同折 山> κ 7，、丨』折疊環為基礎來設計抗原。例 如抗原可以是環狀的肽，其在 ^ L B 在、口構上模仿兩個不同作在社 構上有關聯之蛋白質的共同折疊環。 在、、 在另一個具體實施例中， 聯之分子之六卷以將兩個不同但在結構上有關 Ρ又刀于之乂替及/或部份重疊 來今舛;^ ^ , 卩知接合在一起為基礎 不》又β·Ν凡原，產生雜種分子。例如 峨 個不同γ日在妹—μ t 几原可以是藉著將兩 之蛋白質的交替及/或部份重4 .s 氬造出的雜種肽。 在另一個具體實施例中，抗原可 上有關聯之分子的其令一個， ：兩個不同但在結構 出這兩個有關聯之分子的抗體。/涉及選擇專-地認 7l846-93l228.doc -6 - 1307716 第090115948號專利申請案 年月^修正
在本發明之方法中，可在活體内或在活體外將抗體譜暴 露在感興趣的抗原下。例如，在_個具體實施例中，使譜 暴露在抗原下涉及在活體内以該抗原免疫接種動物。在活 體内的方法可進-步涉及從動物的淋巴細胞中製備融合瘤 的名單’並選擇分泌專一地與兩個不同但在結構上有關聯 之分子結合之抗體的融合瘤。被免疫接種的動物可以是例 如老乳大鼠、兔子或山羊，或任何前述動物之基因轉殖 的版本，像是以人類免疫球蛋白基因轉殖的老鼠，使得當 抗原刺激時，該老鼠便製造人類的抗體，其他可免疫接種 的動物類型，包括帶有重症性聯合免疫缺陷病（SCid)的老 鼠，其已經利用人類的周圍血液單核細胞（hu_pBMc sciD 嵌合型老鼠）或淋巴細胞或其前驅細胞重建，且該老鼠已經 利用致命的整體照射處理過，接著利用重症性聯合免疫缺 陷病（SCID)老鼠之骨髓細胞的放射性保護（radi〇pr〇tecti〇n) 接著移植具有功能的人類淋巴細胞（Trimera系統）。可免 疫接種的其他類型動物是已經針對編碼感興趣之抗原（群） 的内源基因（群），"擊倒，，其基因組的動物（例如老鼠例如藉 著同種重組作用），其中當以感興趣之抗原（群）免疫接種時， 該KO動物便認出外來的抗原（群）。 在另一個具體實施例中，藉著以抗原篩選重組的抗體庫 ’在活體外使抗體譜暴露在該抗原之下。可在例如嗤菌P 表面上，或在酵母鹵細胞的表面上，或在細菌細胞的表面 上，表現重組的抗體庫。在種種不同的具體實施例中，重 組的抗體庫是例如scFv庫或Fab庫。在另一個具體實施例中 7l846-940126.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 第090115948號專利申請案
1307716 ’抗體庫是以RNA-蛋白質融合形式表現的。 另-個製備二元專-性抗體的方法，涉及在活體内和在 活體外方法的組合’像是藉著在活體内以抗原免疫接種動 物，使抗體譜暴露在該抗原之下，接著在活體外以該抗原 篩選從該動物之淋巴細胞來製備的重組抗體庫。另一種方 法涉及藉著在活體内以抗原免疫接種動物，使抗體譜暴露 在該抗原之下，接著是在活體外從該動物之淋巴細胞來製 備之重組抗體..庫的親和力成熟作用。另一種方法涉及藉著 在活體内以抗原免疫接種動物，使抗體譜暴露在該抗原之 下，接著選出分泌感興趣之抗體的單一抗體產生細胞，從 這些選出的細胞中（例如藉著PCR)回收重-和輕鏈可變區 cDNAs，並在活體外，在哺乳動物宿主細胞中表現該重_和 輕鏈可變區（稱為選擇淋巴細胞抗體法，或SLAM)，藉此容 許進一步選擇和操縱選出的抗體基因序列。更進一步，可 藉著表現選殖’藉著在哺乳動物細胞中表現重和輕鏈抗體 基因，並對分泌具有必要之結合親和力的抗體的哺乳動物 細胞進行選擇，來選擇單株抗體》 本發明之方法容許製備各種不同類型之二元專一性抗體 ’包括完全的人類抗體、嵌合型抗體和CDR-移植的抗體， 及其抗原·結合部份。亦提供根據本發明之方法製備的二元 專一性抗體。本發明較佳的二元專一性抗體是專一地結合 介白素-Ια和介白素-10者。可在檢測IL_1〇t4IL-ip的方法中 使用這類二元專一性抗體，包括使IL_ i α或IL-1 β與該二元 專一性抗體’或其抗原，結合部份接觸，而得以檢測IL-lct -8 - 71846-940126.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇 X 297公釐)
1307716 第090115948號專利申請案 一 中文說明當卷拖百(94车1 3丨) 五、發明説明（ 或IL-1 β。亦可在抑制il- 1 α或IL-1 β活性的方法中使用中和 二元專一性抗體，包括使〖L-1 α或IL-1 β與該二元專一性抗 體’或其抗原-結合部份接觸，而得以抑制IL-loc或IL-Ιβ之 活性。亦可在治療介白素-i-相關之障礙的方法中使用這類 二元專一性抗體，包括對罹患介白素-丨_相關之障礙的嗰體 投與該二元專一性抗體，或其抗原-結合部份。 在另一個具體實施例中，本發明提供藉著進行下列步驟 ’來製造抗體:或其抗原結合部份庫的方法： a)從由於暴露在第一個抗原下而產生的抗體譜中，獲得重 組的重鏈或其抗原結合部份庫A; b)從由於暴露在第一個抗 原下而產生的抗體譜中，獲得重組的輕鏈或其抗原結合部 份庫B ; c)從由於暴露在第二個抗原下而產生的抗體譜中， 獲得重組的重鏈或其抗原結合部份庫c ; d)從由於暴露在第 二個抗原下而產生的抗體譜中，獲得重組的輕鏈或其抗原 結合部份庫D ;以及e)將重組的重鏈或其抗原結合部份庫a與 重組的輕鏈或其抗原結合部份庫D混合，獲得抗體或其抗原結 合部份庫X，並/或將重組的重鏈或其抗原結合部份庫c與重組
的輕鏈或其抗原結合部份庫B混合，獲得抗體或其抗原結合 份庫Y。 D 〇 Q 在本發明另一個具體實施例中，本發明緊接前述的方法 尚包括將抗體或其抗原結合部份庫χ與抗體或其抗原結合 部份庫Υ混合，獲得抗體或其抗原結合部份庫冗的步驟。 在進一步的具體實施例中，本發明係針對抗體或其抗原 7l846-940126.doc · g 一 本紙張尺度it t ® B家辟(CNS) A说格(21GX 297公釐）-----------_____ 1307716 A7 B7 五、發明說明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 結合部份庫X、γ和z。 在另—個具體貪施例中，本發明之方法容許從庫X、Y及 /或Z中選擇與第一個和第二個抗原結合的抗體或其抗原結 合部份，來確認二元專一性抗體或其抗原結合部份。 在進一步的具體實施例中，本發明係針對藉著任何本發 明之方法，製造及/或選擇二元專—性抗體。 在另一個具體實施例中，本發明亦針對編碼庫χ、¥和2 中每個彳几體成員或其抗原結合邵份的核答酸序列；以及二 元專—性抗體或其抗原結合部份，包括前述之核苷酸序列 的載體，以及利用前述之載體轉移感染的宿主細胞。 在較佳的具體實施例中，該第—個和第二個抗原分別選 自包括蛋白質、多肽和肽，其限制條件爲該第一個和第二 個抗原不是相同的。在進一步的具體實施例中，該蛋白質 、多肽和肽是分泌性蛋白質或表面受體，且該分泌性蛋白 質係選自包括IFN、TNF、介白素、IIM 〇、PF4、GR〇、9E3 、emap-h、CSF、FGF和PDGF。在另—個較佳的具體實施 例中，第一個抗原爲IL-1 α，而第二個抗原爲IL_丨p。 明詳細説明 ‘ 本發明係關於設計和使用抗原，產生二元專—性的抗體 ，也就是對至少兩個不同但在結構上有關聯之分子具有專 -性的抗體’以及這類二元專一性抗體的選擇、製備和用 途。本發明之抗原的結構關係，遍及整個抗原（例如蛋白質） 或僅在某些在結構上有關聯的區域。本發明提供沪得二元 專-性抗體的方法，其專-地與兩個不同但在結關 請 先 閱讀 背 面 之 注
I 訂 線 -10-
1307716 第090115948號專利申 -色文說明當替拖百，〇4彳 五、發明説明（ 聯之分子結合，其中該方法涉及： 提供抗原’其包括兩個不同但在 共同結構特徵； ° 有關聯之分子的 使抗體譜暴露在該抗原之下；並 從該譜中選擇專一地與兩 子結合的抗體，藉此獲得二元專二性-抗上有關聯之分 應注意的是雖然在本文中從認出兩個不同但在結構上有 關聯之抗原的觀點來描述本發明， _ _ k哪鮮_疋專—性枯赠” 一詞企圖包括專一地認出比兩 f抗體 低又夕的不同但有關聯枋 原的抗體’像是認得三、四、五或更多個在結構上有關 但不同之抗原的抗體。此外，’,不同的但在結構上有關聯之 抗原"一詞企圖包括其整體結構相關的抗原（例如蛋白質）， 以及共享-或多個在結構上有關聯之區域，但其他方面無 關的抗原。因此，”不同的但在結構上有關聯之，，抗原，可 以是例如兩個蛋白質，其為相同蛋白質家族的成員，具有 共同的整體結構，或可以是例如兩個蛋白質，其整體結構 是不類似的（無關的），但分別含有在結構上有關聯的功能 部位。 可使用各種類型的抗原來誘發本發明之抗體，並可應用 各種製造抗體的方法’獲得 '本發明之二元專一性抗體，如 同在下列之細目中討論的細節。 I.二元鼻一性抗原 欲製備本發明之二元專一性抗體，使對抗能夠誘發二元 專一性抗體之抗原的抗體升高。在本文中，通常將這類抗 -11 71846-940l26.doc 本紙張尺度適用中國國家橾準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) 1307716
五、發明說明（9 原稱爲二元專—性 的二元專-s几”。 發明中可使用各種不同類型 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 頁 二1專=，並在下列的細目中進-步説明各種類 土 t 一 7C專—性抗原的設計。 A.相鄰的拓樸區域 在一個具體實施例中，本 _ 兩個不同但在結構上右二月專-性抗原包括在 有關聯炙分子之間同一性及/或類似 性的相鄰拓樸區域，-一 ^ ^ ^ 一儿專性柷體可對其升高。抗原最 、。、’個不同但在結構上有關聯之分子之間同一性及 或方貝似I1生的最大（例如最長的）相鄰拓H ^ @ h 兩個不同但在結構上有關聯之分子是蛋白質，且該二元專 -性抗：包括相當於在這兩個蛋白質之間同一性及/或類 似丨生的最大（例如最長）相鄰拓樸區域的直線肽。選擇同一 性/類似性的適當區域，最好是受體或配體結合區，雖然亦 可使用同一性/類似性的其他區域。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 欲判定在兩個分子（例如蛋白質）之間同一性的相鄰拓樸 區，比較這兩個分子（例如蛋白質）（例如同種性塑型、結構 資訊或排列成一直線），並確認相同或類似的區域。關於蛋 白質’可使用排列演算法，產生最適切地排列，並確認在 這兩個分子之間同一性及/或類似性的最大（例如最長）之相 鄰拓樸區。用來比較兩個序列之數學演算法的較佳、非-限制之實例是Karlin 和 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA U:2264-68 的演算法，按照 Karlin 和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci· USA Μ:5873-77 的修改。將這 類演算法併入 Altschul 等人（1990) J. Mol_ Biol. 215:403-10 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1307716 A7 B7 五、發明說明（1〇) 的NBLAST和XBLAST程式中。爲了比較的目的，欲獲得缺 口排歹，可按照在 Altschul 等人（1997) Nucleic Acids Research U (17):3389-3402 的描述，使用缺口的BLAST。 當使用BLAST和缺口的BLAST程式時，可使用個別程式 (例如XBLAST和NBLAST)的預’設參數。參見http:// www.ncbi.nlm_nih_g〇v。可使用的另一種數學演算法，是在 ALIGN程式中使用的，描述在Myers和Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17^。 當選出適當的同一性/類似性區域時，可以化學方式合成 相當於該區域的二元專一性抗原。例％，對肽抗原而言， 可藉著標準肽合成方法合成該肽。在_個具體實施例中， 肽抗原包括L胺基酸。在其他的具體實施例中，肽抗原可以 是部份地或全部地由D胺基酸所组成。在實⑷中將詳細地 描述以在兩㈤不同但在結構上有關聯之蛋白質之間的同一 性及/或類似性之相鄰拓樸區爲基礎，設計：元 的實例。 号注彳几屌 B ·環狀肽模仿結構環 在另一個具體實施例中，本發明 提壯八；^ , —兀寻—性抗原包括 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 但 環 比 二環狀肽，其在結構上模仿兩個不同 專：π分子(例如蛋白質)的共同折疊之餘匙 一兀專一性抗體可對其升高。欲製 較兩個相關分子的結構，並確認在這兩:二2的柷原，比 確 同折疊的環。可使用標準分子塑以U 2中找到之共 在 認這類的環和共同折疊。確認出相：:广分析’協助 J和類似的區域（例如 -13-x 297公釐） 1307716
五、發明說明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 兩個蛋白免之間的胺基酸序列），並可對類似但不相同的區 域設計一致序列。以這些類似和相同的區域爲基礎，設計 直線的分子，例如直線肽，然後可藉著已知的化學方法將 孩直線分子環化，產生模仿鑰匙環的抗原。例如，可將脯 胺酸和甘胺酸加在直線肽的末端，，容許該肽的環化作用。 在實例2中將詳細地描述以模仿由兩個不同但在結構上有 關聯之蛋白質共享之結構環的環狀肽爲基礎，設計二元專 一性抗原的實例。 C.雜種分子 在另一個具體貫施例中，本發明之二元專一性抗原包括 雜種分子，最好是雜種肽，其包括兩個不同但在結構上有 關聯之分子（例如蛋白質）的交替及/或部份重疊之區域，二 元專性抗體可對其升高。欲製備這類型的抗原，比較這 兩個分子的結構，並確認部份重疊的區域（也就是同一性之 區域），以及在這兩個分子之間不相同的區域。所製備之雜 種分子（例如雜種肽，當兩個相關分予是蛋白質時），最好 包括得自兩個分子之每一個的交替區域（例如胺基酸序列） 以及兩個分子共同的部份重疊區域。概括而言，可將這 類雜種分子描述爲，其中Y代表在兩個相關分子之 間的同一性或極類似之區域（也就是部份重疊之區域），乂代 表得自相關分子之一的區域，而z代表得自另一個相關分子 勺區域在貪例3中將詳細地描述以由兩個不同但在結構上 有關聯之蛋白質的序列所組成之融合肽爲基礎，設計二元 專一性抗原的實例。 -14- 本紙張尺度適用中_家標準（CNS)A4規格⑽x 297公餐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 敏 -------訂·!----I I線— 龥 1307716
五、發明說明（12) 其他類型的雜種分子是其中將壯壤 ”俨釦丨，疋a所、士厂， 知肽導入全長蛋白質（稱爲 ‘靶蛋白貝)中的雜種分子。選擇代表兩個不同但在 上有關聯之蛋白質之功能區域的月太，例如受體交互作用區 。在本文中將這類的肽稱爲功能性肽。然後將得自相關； :質之-的功能性肽，導入另一個相關蛋白質的全長蛋白 質内，或者導人無關的蛋白質内。例如，確認相當於Ha 之受體交互作用區的IL-la肽，並將該辽_1〇1的功能性肽導 入全長的IL-Ιβ蛋白質内，產生雜種的分子。同 '樣地，確認相當於IL-1P之受體交互作用區的α_ιρ肽，^ 將該IL-Ιβ的功能性肽導入全長的1]：_1〇1蛋白質内，產生雜 種的IL-la/IL-Ιβ分子。將功能性肽導入有關聯的全長蛋白 質内，迫使該功能性肽在兩端，並維持該功能性肽的折疊_ 結構。 在IL_ 1 a/IL-1 β雜種的案例中，最好將功能性肽插入（置換 天然的胺基酸）代表IL-1 a和IL-1 β之共同折疊結構的標靶區 内。這類區域可在蛋白質的整個長度中找到（例如在义終端 的區域、在蛋白質的中央、在C_終端的區域）。此外，亦可 將代表共同之IL-lot/IL-ip折疊結構的功能性肽插入無關的 蛋白質内，像是白蛋白或一些其他天然存在的蛋白質。在 該案例中，肽的較佳插入位置是容許該肽維持想要之折叠 結構的區域。因此，插入位置可以是在蛋白質的N_終端、 中央或C-終端。在任何天然存在的標靶蛋白質中選擇佈署 該肽之位置，以便模仿從其中衍生它之天然蛋白質安置的 結構拘束。可將功能性肽簡單地插入標靶蛋白質内，而得 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線- « 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1307716 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（13) 以將該功能性肽的胺基酸加至標革巴蛋白質内，最好是使功 能性肽的胺基酸置換插入它之標靶蛋白質的一部份。 作爲非-限制的實例，爲了用來作爲二元專一性抗原，使 對抗IL-1 α和IL-1 β的二元專一性抗體升高，建構雜種分子 ，其中將相當於IL-la或IL-Ιβ之特定結構元件的功能性肽 ，在相等的結構位置處，導入全長的IL-Ιβ或IL-la内。選 出的雜種分子，以IL-1 a的殘基1 68- 1 84置換IL-1 β的殘基 1 60-1 76。所得的分子具有下列的胺基酸序列，其中以下標 線標示經取代之IL-la序列（殘基168-184): APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQ VVFSMGAYKSSKDDAKITVILGLKEKNLYLSCVLKDDKP TLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPN WYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS (序列識別4號）。 可使用標準分子生物技術（例如選殖、聚合酶連鎖反應）， 使用可公開利用的IL-1 a和IL-1 β cDNA序列和重組的蛋白 質表現技術，來製備該分子。可製備雜種的cDNA，導入適 當的表現載體中，並可藉著將該表現載體導入適當的宿主 細胞内，表現該多肽。 D.以忌水性策略爲基礎的肽 在另一個具體實施例中，以忌水性策略爲基礎，選擇本 發明之二元專一性抗原，選出預測爲高抗原性的肽。例如 ，可使用的電腦軟體，像是由Jameson和Wolf (CABIOS, 4(1 ), 1 8 1- 1 86 (1988))描述的，來計算肽的抗原指標。可選 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線™ 籲 1307716
五、發明說明（μ 擇抗體結合的咸姐趣戸 。 使抗原性的可能性增加至極限 Ε·利用柷原-轉移感染的細胞免疫接種 的細胞)免疫接種動物，來製備：發明·:二 染 可產生穩定表現兩個 、眭抗肢。 雜M八i4 仁在結構上有關聯之抗原，或j： 雖株。例如，可產生穩定表現I—二 從:"二_種分子(例如序列識別4號)的細胞株。可 广田胞中分泌感興趣的分子（在可溶性蛋白質的案例中） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1或可在細胞表面表現感興趣的分子（在受體、酵素的案例 由）°可藉著許多傳統的方法，完成將基因遞送至宿主細胞 内，而容許由該宿主細胞表現抗原，這些傳統方法包括但 不限於轉移感染、電穿透作用、細胞融合、脂染作用、顆 粒撞擊、微量注射或病毒感染。然後可經由一或多個各種 路徑（腹腔内、皮下、肌肉内及其類似者），將表現感興趣 杬原的細胞株，移植到產製抗體的感興趣動物内。此時細 胞擔任感興趣之抗原的緩慢釋放來源。最好該細胞表現全 長的蛋白负。然而，亦可表現抗原之片段。至於可溶性蛋 白質，最好是由細胞分泌該蛋白質。欲產生兩個密切相關 焚體之細胞外功能郅位的二元專一性抗體，最好是在細胞 的表面上表現該受體。 F.利用一個在結構上有關聯之分子的免疫接種 在另一個具體貫施例中，二元專一性抗原單純地是兩個 -17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） 1307716 t3 15 五、發明説明（ 不同但在結構上有關聯的分子之一，二元專一性抗體對其 升高°使用兩個相關分子之一作為免疫原，然後就與兩個 不同但在結構上有關聯之分子兩者結合，更佳的是中和兩 者’來篩選所得的抗體譜。例如，可利用IL_丨α或IL_丨β免 疫接種’然後篩選α/β結合者，更佳的是中和者。當在本具 體實施例中使用時，”免疫接種”一詞企圖廣泛地包括使抗 體譜暴露在抗原之下’像是IL-Ια或IL-Ιβ，在活體内或在 活體外。因此，本具體實施例包括WIL_la4IL_ip免疫接 種動物’並篩選所得的升高抗體，選擇與11^_1〇1和11^1戸兩 者結合的那些抗體，以及利用IL-1 a或IL-1 β在活體外篩選 重組的抗體庫，然後選擇與IL-lcx和IL-Ιβ兩者結合的重組 抗體。 II.製造二元專一性抗體的方法 欲製備本發明之二元專一性抗體，使抗體譜暴露在按照 先前章節中之描述製備的二元專一性抗原之下（在活體内 或在活體外）’並從該譜中選擇適當的二元專一性抗體。抗 體認出抗原的兩個要素，是結構的辨認和以專一之分子交 互作用為基礎的親和力成熟。在天然的免疫反應期間，容 易發展出認得結構特徵的低親和力抗體（例如抗原被某些 圖案辨認受體認出），且事先在天然的免疫反應中，伴隨著 體細胞突變’以便增加少數純種系的親和力。已經發展出 各種在活體内和在活體外的方法，模仿該天然現象。可藉 著任何在本文中描述的在活體外和在活體内之方法，產生 低親和力的二元專一性抗體，並可藉著在本文中描述的體 -18- 71846-940126.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1)4. i · 2 G 泰 第〇9〇115948號專利申請年
1307716 細胞突變生成方法，製備高親和力的二元專一性MAbs。此 外，欲使高親和力之二元專一性MAbs發揮最大效用，可利 用想要的抗原製造低親和力MAbs的共同-結晶結構。所獲 得的結構資訊’可藉著使MAbs的特定接觸殘基改變（突 變）’增強特定的分子交互作用’如同在本文中描述的，而 進一步引導親和力的增強作用。 在下列的細目中，更詳細地描述使用在活體内之方法、在活 體外之方法’或兩者的組合，來製造二元專一性抗體的方法。 A.在活體内的方法 標準在活體内製備抗體的方法，是藉著以抗原免疫接種 適當的動物個體，藉此使在活體内的抗體譜暴露在該抗原 之下’接著從動物中.回收感興趣的抗體或抗體群。可改編 這類方法，藉著使用二元專一性抗原’製備二元專一性抗 聽’並選擇專一地認得兩個在結構上有關聯之感興趣分子 的抗體。可藉著以二元專一性抗原的免疫原製品，免疫接 種適當的個體（例如兔子、山羊、老鼠或其他哺乳動物，包 括這類動物的基因轉殖和擊倒版本），來製備二元專一性抗 體。適當的免疫原製品可含有，例如以化學方式合成或重 組表現的二元專一性抗原《該製品可進一步包括佐劑，像 是福瑞德（Freund’s)完全或不完全佐劑，或類似的免疫刺激 化合物。此外，當用來使抗體升高時，特別是藉著在活體外的 免疫接種時，可單獨使用本發明之二元專一性抗原，或更佳的 是使用帶有載劑蛋白質的共軛物。這類提高抗 71846-940126.doc - 19 - 本紙張尺度適用中國固家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1307716 A7 B7 五、發明說明（17 ) 體反應的方法是此項技藝中已熟知的。可與二元專一性抗 原結合之適當載劑蛋白質的實例，包括鎖孔血藍蛋白 (KLH)和白蛋白。 可從該個體中獲得產生抗體的細胞，並藉著標準技術用 來製備卓株抗體’像是最初由kohler和Milstein (1975 Nature 256:495-497)描述的融合瘤技術（亦參見Brown等人 (1981) J· Immunol 127:539-46; Brown 等人（1980) J Biol Chem 255:4980-83 ; Yeh 等人（1976) PANS 76:2927-31 ;以 及 Yeh等人（1982) Int. J. Cancer 29:269-75)。產製單株抗體 融合瘤的技術是已熟知的（通常參見R. H. Kenneth，in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980) ; E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402 ;M. L. Gefter等人（1977) Somatic Cell Genet·, 3:231-36) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 。簡言之，將永生不死的細胞株（通常爲融合瘤）與得自按 照上述，以二元專一性免疫原免疫接種之哺乳動物的淋巴 細胞（通常是脾臟細胞或淋巴結細胞或周圍金液淋巴細胞） 融合’並篩選所得之融合瘤細胞的培養物上清液，確認產 製對兩個不同但在結構上有關聯之感興趣分子具有二元專 性之早株抗體的融合瘤。爲了產製二元專一性單株抗體 之目的，可應用任何許多已熟知之用來融合淋巴細胞和永 生不死之細胞株的草案（參見，例如G. Galfre等人（1977)
Nature 266:550-52 ; Gefter 等人 Somatic Cell Genet.，在前 提及；Lerner, Yale J. Biol. Med.，在前提及；Kenneth， -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1307716 A7 B7 五、發明說明（18)
Monoclonal Antibodies，在前提及）。此外，普通的熟諳此 藝者應了解這類方法的許多變化，亦將是有用的。通常， 永生不死的細胞株（例如骨髓瘤細胞株），係衍生自與淋巴 細胞相同的哺乳動物物種。例如，可藉著將得自以本發明 之免疫原製品免疫接種的老鼠的淋·巴細胞，與永生不死的 老鼠細胞株融合’來製造老鼠的融合瘤。較佳的永生不死 細胞株是老鼠的骨髓瘤細胞株，其對含有次黃嘌呤、胺基 蝶呤和胸腺喊咬的培養基（” H A T培養基"）是敏感的。根據標 準技術’可使用§午多骨髓瘤細胞株的任一個作.爲融合夥伴 ，例如 P3-NSl/l-Ag4-l、P3-x63-Ag8_653 或 Sp2/0-Agl4 骨 髓瘤細胞株。這些骨髓瘤細胞株可獲自Americail Type
Culture Collection (ATCC)，Rockville, Md.。通常使用聚乙 二醇（"PEG")將對HAT敏感的老鼠骨髓瘤細胞與老鼠脾臟 細胞融合’其殺死未融合和未多產地融合的骨髓瘤細胞 (未融合的脾臟細胞在數天後死亡，因爲它們未被轉化）。 藉著就這類抗體篩選融合瘤培養物的上清液，例如使用標 準ELISA測定，選擇可專一地與這兩個相關分子結合的那 些抗體’來確認產生專一地認出兩個在結構上有關聯之感 興趣分子的單株抗體之融合瘤細胞。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 依據想要的抗體類型，可使用各種動物宿主進行在活體 内的免疫接種。可使用本身表現感興趣抗原（群）之内源版 本的宿主，或者可使用在感興趣抗原（群）之内源版本方面 已經有缺陷的宿主。例如’已經顯示當以某個蛋白質進行 免疫接種時，在誘發對該蛋白質之體液反應的相對應之内 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） '一 1307716 19 五、發明説明（ 源基因處，經由同種重組作用，使老 源蛋白質的（也就是”擊倒"老e ，，、、、特定之内 蛋白質m二Γ 因此可用來產製對抗該 蛋質的7親和力單株抗體(參見’例如心 吐祕ods 姐:231.237;Lunn M )
Neurochem. 75.:404-412) 〇 1 ； ,種非-人類之哺乳動物均適合作為產 括但不限於老鼠'大鼠、免 J侣王° 然對融合瘤的產製而士 平（及其擊倒版本），雖 對广人ϋ 一皇 α ’老畋疋較佳的。此外，為了 == 抗原的完整-人類抗體，可使用表現人 的非-人類動物宿主。這類非-人類動物包括帶有 人類免疫球蛋白轉殖基因之基因轉殖 文了職嵌合型老鼠’以及人類/老鼠放射喪合體)， 在下文中分別進一步地討論。 因此，在-個具體實施例中，利用二元專 接種的動物是非-人類的哺乳動物，最好是老鼠，為了 的2球蛋白基因將其進行基因轉殖，使得在抗原刺激時 ’該非-人類的哺乳動物（例如老鼠）製造人類的抗體。在這 類動物中’通常將人類生殖種系組態之重和輕鍵免疫球蛋 的轉殖基因，導人已經經過設計的動物中，使得它内源 的重和輕鏈位點疋失活的。當以抗原刺激這類動物時(例如 =^貝抗原）’產生衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體（也 就疋人Θ抗體）’亚可藉著標準融合瘤技術，從這類動物的 淋巴細胞來製造人類的單株抗體。關於人類免疫球蛋白之 -22- 71846-940l26.doc 本紙張尺度朗巾關家標準(CNS) 297公爱） 1307716 A7 B7 五、發明說明（2〇 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 基因轉殖老鼠，及其在產製人類抗體中之用途的進一步説 明，參見例如Abgenix Inc.的美國專利第5,939,598號、PCT 公告第 WO 96/33735 號、PCT 公告第 WO 96/34096 號、PCT 公告第WO 98/24893號和PCT公告第WO 99/53049號，以及 Genpharm Inc.的美國專利第 5,545,&06號、第 5,569,825 號、 第 5,625,126號'第 5,633,425號、第 5,661,016號、第 5,770,429 號、第5,814,318號、第5,877,3 97號和PCT公告第WO 99/45962 號。亦參見 MacQuitty, J.J.和 Kay，R.M.(1992) Science 257:1 1 88 ; Taylor, L.D·等人（1 992) Nucleic Acids Res. 20:6287-6295 ; Lonberg, N.等人（1994) Nature 368:856-859 ; Lonberg，N_ 和 Huszar，D· (1995) Int. Rev. Immunol. 1 3:65-93 ; Harding, F.A.和 Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546 ; Fishwild，D.M.等人 (1996) Nature Biotechnology 14:845-85 1 ; Mendez，M.J.等 人（1997) Nature Genetics 146-156 ; Green, L.L.和 Jakobovits, A. (1998) J. Exp. Med. 1 88:483-495 ; Green, L.L. (1999) J. Immunol. Methods 23 1:1 1-23 ; Yang, X.D,等 人（1999) J. Leukoc. Biol· M:401-410 ; Gallo, M.L.等人 (2000) Eur. J. Immunol. 30:534-540。 在另一個具體實施例中，以二元專一性抗原免疫接種的 動物是帶有重症性聯合免疫缺陷病（SCID)，已經利用人類 周圍血液單核細胞或淋巴細胞或其前驅物重建的老鼠。已 經證實這類老鼠，稱爲hu-PBMC-SCID嵌合型老鼠，當以抗 原刺激時，產生人類免疫球蛋白反應。關於這些老鼠及其 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 請 先 閱讀 背 Φ 之 注 意 事 項 再 頁 1307716 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制^ 五、發明說明（21 ) 在抗體產製上之用途的進一步説明，參見例如Leader，Κ·Α· 等人（1 992) Immunology 76:229-234 ; Bombil，F.等人（1996) Immunobiol. 195:360-375 ; Murphy, W.J.等人（1996) Semin. Immunol. 8:23 3-241 ;Herz，U.等人（1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 1 13:150-152 ; Albert, S.E·等人（1 997) J. Immunol· 159:1393-1403 ； Nguyen, H.等人（1997) Microbiol. Immunol· 11:901-907 ; Arai, K.等人（1998) J. Immunol. Methods 211: 79-85 ; Yoshinari，K.和 Arai，K. ( 1 998) Hybridoma ϋ:41·45; Hutchins，W.A.等人（1999) Hybridoma 18:121-129 ; Murphy， W.J_ 等人（1999)(：1111.11111111111〇1.^0_:22-27;8111^115〇11，8丄· 等人（1999) Mol. Immunol. Chamat，S.等人 (1999) J. Infect. Diseases 1 80:268-277 ;以及 Heard, C·等人 (1999) Molec. Med. 5.:35-45 ° 在另一個具體實施例中，以二元專一性抗原免疫接種的 動物，是已經利用致命的整體照射處理過，接著利用重症 性聯合免疫缺陷病（SCID)老鼠之骨髓細胞的放射性保護， 接著移植具有功能之人類淋巴細胞的老鼠。已經使用這類 型的嵌合體，稱爲Trimera系統，藉著以感興趣之抗原免疫 接種老鼠，接著使用標準融合瘤技術製備單株抗體，來產 製人類的單株抗體。關於這些老鼠及其在抗體產製上之用 途的進一步説明，參見例如Eren，R.等人（1998) Immunology £1:154-161 ; Reisner, Υ·和 Dagan, S. (1998) Trends Biotechnol· M:242-246 ; Ilan，E.等人（1999) Hepatology 29:553-562;以及 Bocher，W.O.等人（1999) Immun〇i〇gy-24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1307716
五、發明說明（22 拉:634-64 1。 B ·在活體外的方法 製備二元專一性抗體的另一種選擇，係藉著在活體内的 免疫接種和選擇，可藉著以二元專—性抗原筛選重組的综 合免疫球蛋白庫（例如抗體噬菌體展示庫），確認並分離本 發明的二元專-性抗體，藉此分離專—地結合兩個在結構 上有關聯，但不同的感興趣分子之免疫球蛋白庫成員。產 製和篩選噬菌體展示庫的套組是市售的（例如pharmacia
Recombinant Phage Antibody System，目錄第 27-9400-01 號 ;以及 Stratagene SUrfZAPTM phage Display Kh，目錄第 2406 12號）。在各種具體實施例中，噬菌體展示庫是％〜庫 或Fab庫。在此項技藝中已經徹底地描述了篩選重組抗體庫 的喔菌體展示技術。特別適用於產製和篩選抗體展示庫之 方法和化合物的實例，可在例如McCafferty等人，國際公 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 告弟WO 92/01047號、美國專利第5,969,108號和歐洲專利 589,877说（特別描述scFv的展示）、Ladner等人，美國專利 第 5,223,409 號、第 5,403,484號，第5,571,698號，第5,837,500 號和歐洲專利436,597號（描述例如ρπΐ融合）；Dower等人， 國際公告第WO 9 1/17271號、美國專利第5,427,908號、美 國專利第5,580,717號和歐洲專利5 2 7,8 3 9號（特別描述F ab 的展示）；Winter等人，國際公告第w〇 92/20791號和歐洲 專利368,684號（特別描述免疫球蛋白可變功能部位序列的 選殖）；Griffiths等人，美國專利第5,885,793號和歐洲專利 589,877號（特別描述使用重組庫，對人類抗原之人類抗體 25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1307716 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 A7 B7 五、發明說明（23 ) 的分離）；Garrard等人，國際公告第w〇 92/〇969〇號（特別描 述噬菌體表現庫）；Knappik等人，國際公告第w〇 97/08320 號（指j述人類重組抗體庫HuCal) ; Salfeld等人，國際公告第 WO 97/29 1 3 1號（描述對人類抗原（人類腫瘤壞死因子α)之 重組人類抗體的製備，以及重组抗體之在活體外的親和力 成熟）’和Salfeld等人，美國臨時申請案第6〇/126,6〇3號（ 亦描述對人類柷原（人類介白素_ 12)之重组人類抗體的製備 ，以及重組抗體之在活體外的親和力成熟）中找到。 重組抗體庫篩選的其他説明，可在科學公告中找到，像 是 Fuchs 等人（1991) Bi〇/Technology 9:1370-1372 ; Hay 等人 (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85 ; Huse 等人（1989) Science 246:1275-1281 ; Griffiths 等人（1993) EMBO J 12:725-734，· Hawkins 等人（1992) J Mol Biol 226:889-896 ; Clarkson 等人（1991) Nature 352:624-628 ; Gram 等人（1992) PNAS 89.3576-3580 ; Garrad 等人（1991) Bio/Technology 9:1373-1377 ; Hoogenboom 等人（1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137 ; Barbas 等人（1991) PNAS 88:7978-7982 ; McCafferty 等人 Nature* (1990) 348:552-554;以及 Knappik 等人（2000) J. Mol. Biol. 296:57-86。 使用細菌噬菌體展示系統的另一種選擇，可在酵母菌細 胞或細菌細胞的表面上表現重組的抗體庫。製備和篩選在 酵母菌細胞表面表現之庫的方法，進一步描述在PCT公告 WO 99/36569號中。製備和篩選在細菌細胞表面表現之庫的 方法，進一步描述在PCT公告WO 98/49286中。 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ~ ~
1307716 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 --------------- 五、發明說明（24 ) ~ 一 一旦已經從综合庫中確認出感興趣的抗體，便可藉著標 T为子生物技術，分離編碼該抗體之輕和重鏈的DNAs，像 是藉著DNA的PCR擴大作用，在庫篩選過程的期間内，從 展不包裝（例如噬菌體）中分離。可從抗體輕和重鏈基因之 核首酸序列來製備PCR引子，是此項技藝中已知的。例如 ，在 Kabat，E.A.等人（1991) Sequences 〇f pr〇teins 〇f
Immun〇l0gical Interest，第 5版，u s 以叫加咖 〇f ^仙 and Human Services，NIH公告第 91_3242 號中，以及在 ”VbaSe”人類生殖種系序列資料庫中揭示了許多的這類序 列。 可藉著免疫球蛋白輕和重鏈基因在宿主細胞中的重組表 現，製備本發明之抗體或抗體部份。欲以重組方式表現抗 體’以一或多個帶有編碼該抗體之免疫球蛋白輕和重鏈的 DNA片段之重組表現載體，轉移感染宿主細胞，而得以在 該宿主細胞中表現該輕和重鏈，且最好是分泌至在其中培 養該宿主細胞的培養基中，可從該培養基中回收該抗體。 使用標準重組DNA方法學，獲得抗體之重和輕鏈基因，將 這些基因併入重組的表現載體内，並將該載體導入宿主細 胞内’像疋在 Sambrook, Fritsch和 Maniatis(編輯），Molecular Cloning; A Laboratory Manua卜第 2舨，Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)，Ausubel, F.M.等人（編輯），Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates, (1989)，以及在Boss等人的美國專利第4,81 6,397號中描述 的那些。 -27- 本紙張尺度適用+S®家標準（CNS)A4規格（210 X 297公楚了 Γ --------訂---------線—一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1307716 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（25 ) 一旦獲得編碼感興趣抗體之VH和VL斷片的DNA片段，可 進一步藉著標準重組DNA技術，來操縱這些DNA片段，例 如將可變區基因轉變爲全長的抗體鏈基因、Fab片段基因， 或scFv基因。在這些操縱中，以可操作之方式將編碼vL_ 或VH-的DNA片段與編碼其他蛋白·質的其他DNA片段連接 ’像是抗體丨互定區或有彈性的交聯劑。在這種關聯中使用，, 以可操作之方式連接"一詞，企圖意指連接兩個DNA片段， 使得由這兩個DNA片段編碼的胺基酸序列仍在架構中。 可藉著以可操作之方式，將編碼VH之DNA與編碼重鏈恆 定區（CHI、CH2和CH3)的其他DNA分子連接，將編碼VH_ 區的經過分離之DNA轉變成全長的重鏈基因。人類重鏈恆 定區基因的序列是此項技藝中已知的（參見例如，Kabat， E.A.,等人（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公告第91-3242號），並可藉著標準pcr擴大作 用獲得包括這些區域的〇>^八片段。重鏈恆定區可以是IgG1 、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或 IgD恆定區，但最 佳的疋IgGl或IgG4怪定區。至於pab片段重鏈基因，可以可 操作之方式’將編碼VH — 之DNa與僅編碼重鏈ch 1恆定區之 其他DNA分子連接。 可藉著以可操作之方式，將編碼VLi DNA與编碼輕鏈恆 疋區，CL的其他DNA分子連接，將編碼vl-區的經過分離 IDNA轉變成全長的輕鏈基因。人類輕鏈恆定區基因的序 列疋此項技藝中已知的（參見例如，Kabat, E. A.等人（丨99 1) ^ ^--------訂---------線II (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ->1 ^1 1· n n n n n n n I n I n - -28- 1307716 A7 B7 五、發明說明（26 )
Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版， U.S. Department of Health and Human Services，NIH公告 第9 1-3 242號），並可藉著標準PCR擴大作用獲得包括這些區 域的DNA片段。輕鏈‘f亙定區可以是κ或λ t互定區，但最佳 的是λ:恆定區。 欲創造scFv基因，以可操作之方式將編碼VH-和VL-之 DNA片段與編碼有彈性交聯劑的其他片段連接，例如編碼 胺基酸序列（Gly^Ser)3，而得以以相鄰之單鏈蛋白質的形 式，來表現VH和VL序列，並藉著有彈性的交聯劑連接Vl 和 VH 區（參見例如，Bird等人（1988) Science 242:42^-49^ ;
Huston 等人（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 赵:5879. 5883 ’ McCafferty等人，Nature ( 1 990) 3^8:552-554)。 欲表現本發明之重組抗體或抗體部份，可將按照上述獲 知的編碼邵份或全長之輕和重鏈的DNAs導入表現載體内 ，使得該基因以可操作之方式與轉錄和轉譯控制序列連接 關於此占’以可操作（方式連接"一詞企圖意指將抗體 土，連接到載體内，使得在該載體内的轉錄和轉譯控制序 供其調節該抗體基因之轉錄和轉譯的想要功能。 制序與所使用之表現宿主細胞相容的表現載體和表現控 Si二因和抗體重鏈基因插入不同的載 體内。藉著俨準、本（’將兩個基因插入相同的表現載 果未出現限制^置 補限制位置的連接作用，或是如 丄，則局鈍端的連接作用）。在插入輕或重 本紙張尺度適 -29- (210 X 297 公釐） [----------,%--------訂---------線 J (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1307716 A7 五、發明說明（27 ) 鏈序列 < 前，該表現載體可業已帶有抗體恆定區序列。例 如，一種將VH和VL序列轉變爲全長抗體基因的方法，是將 其插入業已分別編碼重鏈恆定和輕鏈恆定區的表現載體内 ，使得VH斷片以可操作之方式與載體内的CH斷片（群接 ，而VL斷片以可操作之方式與載體.内的CL斷片連接。額外 或另外地，重组表現載體可編碼信號肽，其有助於從宿 主細胞中分泌抗體鏈。可將抗體鏈選殖到載體内，以便在 架構中將該信號肽與抗體鏈基因的胺基終端連接。信號肽 可以是免疫球蛋白信號肽，或異種的信號肽（也就是得自非 -免疫球蛋白之蛋白質的信號肽）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 除了彳7L體鏈基因之外，本發明之重組表現載體亦帶有調 節序列，其控制杬體鏈基因在宿主細胞中的表現。"調節序 列”一詞企圖包括啓動基因、促進子和其他的表現控制元件 (例如聚腺苷酸化作用信號），其控制抗體鏈基因的轉綠或 轉譯作用。這類調節序列描述在例如G〇eddel; Expression Technology： Methods in Enzymology i85? Academic Press’ San Dieg〇, CA (199〇)中。熟諳此藝者將了 解表現載體的設計，包括可依據諸如待轉化之宿主細胞的 選擇、想要的蛋白質表現程度等等的因素來選擇調節序列 。對於哺乳動物宿主細胞表現而言，較佳的調節序列包括 病毒的元件，其指揮在哺乳動物細胞中以高程度表現蛋白 貝，像疋衍生自細胞巨大病毒（CMV)的啓動基因及/或促進 子（像是CMV啓動基因/促進子）、猿病毒4〇(SV4〇)(像是 SV40啓動基因/促進子）、腺病毒（例如腺病毒主要晚期啓動 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1307716 A7 I-------B7___ 五、發明說明（28 ) 基因（AdMLP))和多瘤病毒。關於病毒調節元件及其序列的 進一步説明，參見例如Stinski的美國專利第5,168 〇62號， Bell等人的美國專利第4,5 10,245號，以及Schaffner等人的 美國專利第4,968,61 5號。 除了抗體鏈基因和調節序列之外’，本發明之重組表現載 體亦可帶有額外的序列，像是調節載體在宿主細胞中複製 的序列（例如複製起點）和可選擇標記基因。可選擇標記基 因有助於選擇已經將該載體導入其内的宿主細胞（參見例 如，Axel等人的美國專利第4,399,216號、第4,634,665號， 和第5，1 79,0 1 7號）。例如，可選擇標記基因通常對已經在其 中導入該載體之宿主細胞，賦與對藥物的抵抗力，像是 04 1 8、潮黴素或胺甲碟呤。較佳的可選擇標記基因包括二 氫葉酸還原酶（DHFR)基因（用於dhfr_宿主細胞，利用胺甲碟 吟選擇/擴大作用），和neo基因（供G4 1 8選擇作用）。 爲了表現輕和重鏈，藉著標準技術將編碼重和輕鏈的表 現載體（群）轉移感染至宿主細胞内。各種形式的，，轉移感染 一詞，企圖包括經常用來將外源的DNA導入原核生物或眞 核生物宿主細胞内的各種技術，例如電穿透作用、嶙酸舞 沉澱法、DEAE-葡聚醣轉移感染及其類似者。雖然在理論 上有可能在原核生物或眞核生物宿主細胞中表現本發明之 & ta ’但在眞核生物細胞，且最好是哺乳動物宿主細胞中 表現抗體是最佳的，因爲這類眞核生物細胞，且特別是哺 礼動物細胞，比原核生物細胞更可能裝配和分泌經過適當 折® ’並具有免疫活性的抗體。已經報告了抗體基因的原 -31 - 本紙張尺度適w τ關家標準（CNS)A4規格⑽X 297公爱） r I ------I I --------•線 II (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1307716 A7 B7 五、發明說明（29 ) 核生物表現，對於產製高產量之活性抗體是無效的（Boss， Μ_Α·和 Wood, C.R. (1 985) Immunology Today 反：12-13)。 表現本發明之重組抗體的較佳哺乳動物宿主細胞，包括 中國倉鼠卵巢（CHO細胞）（包括dhfr-CHO細胞，描述在 Urlaub和 Chasin，（1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7_7： 4216-4220中，與DHFR可選擇標記一起使用，例如，如同 在 R.J. Kaufman和 P.A. Sharp (1 982) Mol. Biol. 159:601-621 中的描述）、NS 0骨髓瘤細胞、CO S細胞和SP2細胞。當將編 碼抗體基因之重組表現載體導入哺乳動物宿主細胞中時， 藉著培養該宿主細胞一段足以容許該抗體在宿主細胞中表 現，或更佳的是將該抗體分泌至宿主細胞在其中生長之培 養基中的時間，來產製抗體。可使用標準蛋白質純化方法 ’從培養基中回收該抗體。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 亦可使用產生完整抗體之邵份的宿主細胞，像是F ab片段 或scFv分子。將瞭解上文程序中的變化，亦在本發明的範 園内。例如，可能想要以編碼本發明抗體之輕鏈或重鏈 (但不是兩者）的DNA，來轉移感染宿主細胞。亦可使用重 組的DNA技術，移除二些或全部的编碼任一個輕和重鏈或 兩者的DNA，其對於與感興趣之抗原結合是不必要的。本 發明之抗體亦包括由這類截短之DNA分子表現的分子。此 外，亦可產製雙重功能的抗體，其中一個重和一個輕鏈是 本發明之抗體，而另一個重和輕鏈則對與感興趣之抗原不 同的柷原有專一性，藉著使本發明之抗體，藉著標準化學 交聯方法，與第二個抗體交聯。 -32- 1307716 A7 B7 五、發明說明（3〇 ) 在本發明之抗體，或其抗原-結合部份的重組表現之較佳 系統中，藉著磷酸鈣-調節之轉移感染作用，將編碼抗體重 鏈和抗體輕鏈兩者的重組表現載體，導入dhfr_CH〇細胞中 。在該重組表現載體中，抗體重和輕鏈基因分別以可操作 之方式與CMV促進子/AdMLP啓動|因調節元件連接，駕馭 高程度的基因轉錄作用。重組表現載體亦帶有DHFR基因， 其容許使用胺甲碟呤選擇/擴大作用，選擇已經以該載體轉 移感染的CHO細胞。培養選出的轉化宿主細胞，容許表現 抗體重和輕鏈，並從培養基中回收完整的抗體。使用標準 分子生物學技術，製備重組表現載體，轉移感染宿主細胞 ’選擇轉化物，培養宿主細胞，並從培養基中回收抗體。 本發明更進一步提供藉著在適當的培養基中培養本發明之 宿主細胞，直到合成本發明之重組抗體爲止，合成本發明 之重組抗體的方法。該方法尚包括從培養基中分離重組的 抗體。 藉著嗤菌體展示篩選重组抗體庫的另一種選擇，可應用 此項技藝中已知的，篩選大综合庫的其他方法學，確認本 發明之二元專一性抗體。表現系統的另一種選擇，一種是 其中以RN A -蛋白質融合之形式來表現重組的抗體庫，如同 在Szostak和Roberts的PCT公告第W〇 98/317〇〇號中，以及 在 Roberts，R.W.和 Szostak，J.W. (1997) Proc. Natl. Acad.
Sci· USA 12297-12302中描述的。在該系統中，在mRNA 和肽或蛋白質之間產生共價融合，該肽或蛋白質係藉著在 其3'末端帶有嘌呤黴素，一種肽基受體抗生素之合 -33- 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210x297公髮) 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 頁 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1307716
在活體外的轉譯作用編碼。因此，可從mRNAs的複合混合 物（例如综合庫）中增強特定的mRNA，依據編碼之肽或蛋白 質’例如抗體或其部份的性質，像是抗體或其部份與二元 專性抗原的結合作用。可藉著按照上述的重組方法（例如 在哺礼動物宿主細胞中），表現從篩選這類庫中回收之編碼 乂體或其部份的核酸序列，況且可藉著篩選mRNA-肽融合 的額外循環’使其接受進一步的親和力成熟，其中已經將 大變導入最初選出的序列（群）中，或按照上述，藉著在活 體外重組抗體之親和力成熟的其他方法。 C.綜合的方法 亦可使用在活體内和在活體外之方法的組合，製備本發 明之二元專一性抗體，像是其中在活體内，在宿主動物中 ’使二元專一性抗原一開始暴露在抗體譜下，刺激與該二 元專一性抗原結合之抗體的產生，但其中使用一或多種在 活體外的技術，完成進一步抗體選擇及/或成熟（也就是改 善）的方法。 在一個具體實施例中，這類綜合方法涉及首先以二元專 一性抗原免疫接種非-人類動物（例如老鼠、大鼠、兔子、 山羊或其基因轉殖版本’或嵌合型老鼠），刺激對抗該抗原 的抗體反應，接著使用得自在活體内藉著暴露在該 二元專 一性抗原下而刺激之淋巴細胞的免疫球蛋白序列，製備和 篩選嗟菌體展示抗體庫。可按照在上文IIA細目中的描述， 來經營該综合程序的第一個步驟，同時可按照在上文ΠΒ細 目中的描述，來經營該程序的第二個步驟。高度免疫非_ -34- 71846-940126.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X 297公釐) 1307716
五、發明說明（32) 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 fl 本 頁
人類動物’接著在活體外篩選從經過刺激之淋巴細胞製備 的噬菌體展示庫的較佳方法學，包括*BioSite Inc.描述的 那些’參見例如，PCT公告WO 98/47343、PCT公告WO 91/丨7271、美國專利第5,427,9〇8號和美國專利第5,580,717 號。 . 在另一個具體實施例中，综合方法涉及首先以二元專一 性抗原免疫接種非-人類動物（例如老鼠、大鼠、兔子、山 羊或其擊倒及/或基因轉殖版本，或嵌合型老鼠），刺激對 柷該抗原的抗體反應’並選擇產生具有想要的二元專一性 之抗體的淋巴細胞（例如藉著篩選從經過免疫接種之動物 來製備的融合瘤）。然後分離得自選出之純種系的再排列基 因（藉著標準選殖方法，像是逆轉錄酶_聚合酶連鎖反應）， 並接受在活體外的親和力成熟，藉此促進所選出之抗體或 抗體群的結合特性。可按照在上文ΠΑ細目中的描述，經營 琢程序的第一個步驟，同時按照在上文ΠΒ細目中的描述， 來經營該程序的第二個步驟，特別使用在活體外的親和力 成熟方法，像是在PCT公告WO 97/2913 1和PCT公告WO 00/5 67 72中描述的那些。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
在另一個综合方法中，從單一、經過分離的淋巴細胞中 ，使用在此項技藝中稱爲選擇淋巴細胞抗體法（SLAM)的程 序，產生重組抗體，按照在美國專利第5,627,〇52號、pCT 公告 WO 92/02551 ’ 和 Babcock, J.S.等人（1996) Pr〇c. Natl. Acad· Sci_ USA ϋ:7843-7848中的描述。在該方法中，因爲 應用本發明之一元專一性抗體’首先在活體内以二元專— -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1307716 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（33 性抗原免疫接種非-人類動物（例如老鼠、 ，， 氣、兔子、山 羊或其基因轉殖版本，或嵌合型老鼠），刺 '攻對柷該抗原的 抗W反應，然後使用抗原-專一的溶 七璐制 ^ θ •占判疋（例如使用 又聯刎，像疋生物素，將二元專一性抗原 十牙，或感興趣 之在結構上有關聯的分子與綿羊紅血球偶 " L . 内知，猎此容許使 用办血斑點測定，確認分泌帶有適當專—性 ^ 〈抗體的單一 細胞），選擇分泌感興趣抗體的單一細胞，例如對该二元專 二性抗原專—的。在確認分泌抗體的感興趣細胞=後，藉 著逆轉綠酶-PCR，再從該細胞中救出重_和輕-鏈可變^ cDNAs，然後可在哺乳動物宿主細胞中，像是c〇s或CHQ 細胞中，表現這些可變區（例如人類恆定區）。利用經過擴 大，衍生自在活體内選擇之淋巴細胞的免疫球蛋白序列轉 移感染宿主細胞，然後使其接受進一步的分析和在活體外 的選擇，例如淘洗經過轉移感染的細胞，以便分離表現具 有想要的二元專一性之抗體的細胞。可在活體外進一步操 縱經過擴大的免疫球蛋白序列，像是藉著在活體外的親和 力成熟，如同上述。 在另一個具體實施例中，產生二元專一性抗體的综合方 法涉及下列步驟。利用第—個抗原免疫接種第一個非_人類 動物，並以第二個不同的抗原免疫接種第二個非-人類動物 ’其中第二個抗原最好在結構上類似第一個抗原，以便刺 激在活體内的抗體反應。按照在ΠΒ章中的描述，分別從衍 生自第一個非-人類動物和第二個非-人類動物的抗體基因 中’建構重組的重鏈庫和重組的輕鏈庫。將得自以第—個 本紙張尺庳適用中國國家標準（CNS)Α4規格（21〇 X 297公爱） · I I --------訂----I---線丨秦 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -n ml u n f n I t ϋ n I n n n I I I . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1307716 五、發明說明（34) 抗原免疫接種之動&的重#庫與#自以帛二個抗原免疫接 種t動物的輕鏈庫混合，產生抗體庫X。同樣地，將得自 以第一個抗原免疫接種之動物的重鏈庫與得自以第一個抗 原免疫接種之動物的輕鏈庫混合，產生抗體庫γ。另外， 可混合庫X和Y，產生庫χγ。可從χ、γ及/或又¥庫中，確 認和分離與第一和第二個抗原結合的二元專一性抗體。 III ·定虫專一性抗體的转微 本發明提供二元專一性抗體，以及其抗體部份，其可根 據本發明之方法來製備。較佳的是，抗體或其部份是經過 分離的抗體。較佳的是，抗體或其部份是中和抗體。本發 明之抗體包括單株和重組抗體，及其部份。在各種具體實 施例中，抗體或其部份可包括完全衍生自單一物種的胺基 酸序列，像是完全的人類或完全的老鼠抗體，或其部份。 在其他的具體實施例中，抗體或其部份可以是嵌合型抗體 ，或CDR-移植的抗體，或其他形式的人類化抗體。 當在本文中使用”抗體” 一詞時，企圖意指免疫球蛋白分 子，其包括四個多肽鏈，兩個重（H)鏈和兩個輕（1^)鏈，藉 著二硫鍵互相連接。每個重鏈分別包括重鏈可變區（在本文 中縮寫爲HCVR或VH)和重鏈恆定區。重鏈恆定區包括三個 功能部位’ CHI、CH2和CH3。每個輕鏈包括輕鏈可變區 (在本文中縮寫爲LCVR或VL)和輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包 括一個功能部位C L。可將V Η和C L區進一步細分爲高變區 ，稱爲互補性決定區（CDR),有較受保護之區域點綴於其 中’稱爲骨架區（FR)。每個VH和VL分別由三個^)以和四 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）
訂 線 1307716 A7 B7 五、發明說明（35 ) 個FRs所組成，以下列順序從胺基_終端排列至羧基_終端： FR卜 CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。 當在本文中使用抗體的”抗原結合部份”（或單純的”抗體 部份”）一詞時，意指一或多個二元專一性抗體的片段，其 保留專一地與兩個不同但在結構上，有關聯之抗原結合的能 力。已經顯示可藉著全長抗體的片段，執行抗體的抗原結 合功能。在抗體的”抗原結合部份”一詞中包括之結合片段 的實例，包括⑴Fab片段，由VL、VH、CL*CH1功能部位 的單價片段所組成；（iOFQb，)2片段，包括在絞鏈區藉著二 硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段；（iii) Fd片段，由 和CH 1功能郅位所組成；（iv) fv片段，由抗體之單臂的VL 和VH功能部位所組成；dAb片段（Ward等人，（1989) Nature 1^1:544-546)，其由VH功能部位所組成；以及（vi) 經過分離的互補性決定區（CDR)。此外，雖然Fv片段的兩 個功能部位，VL和VH，係由不同的基因編碼.，但可使用重 組的方法，藉著合成的交聯劑將其連接，該交聯劑能夠以 單一蛋白質鏈的形式製造它們，其中VL和Vh區配對，而形 成單價的分子（稱爲單鏈Fv(scFv);參見例如，Bird等人 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ( 1988) Science Ml:423-426 ;以及Huston 等人（1988) Pr〇c. Natl _ Acad. S ci. USA ϋ: 5879-5883)。亦企圖將這類單鏈抗 體包含在抗體的”抗原結合部份” 一詞中。亦包括其他形式 的單鏈抗體，像是雙元體（diabodies)。雙元體是二價的雙 重專一性的抗體’其中在單一多肽鏈上表現VH和VL功能部 位，但使用的交聯劑太短，以致於不容許在相同鏈上的兩 -38- 本紙張尺度適用巾®國家標準（CNS)A4規格（21G X 297公髮)— ' ' 1307716 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _____B7____ 五、發明說明（36 ) 個功能部位之間配對，藉此集中使功能部位與另一個鏈的 互補功能部位配對，並產生兩個抗原結合位置（參見例如
Holliger，P.等人（1993) Proc. Natl. Acad. Sci· USA 90^： 6444-6448 ; Poljak, R.J·,等人（1994) Structure m 2 1 -1 1 23) o 此外，抗體或其抗原結合部份可以是藉著抗體或抗體部 份與一或多個其他蛋白質或肽的共價或非共價結合，而形 成之較大免疫黏附（immunoadhesion)分子的一部份。這類免 疫黏附分子的實例，包括使用鏈黴菌抗生物素蛋白核心區 ，來製造的四聚scFv分子（Kipriyanov，S.M.，等人（1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)，以及使用半 胱胺酸殘基，標記肽和C-終端聚組胺酸標籤，製造的二價 和生物素基化之scFv分子（Kipriyanov, S.M.,等人（1994)
Mol. Immunol. 11:1047-105 8)。可從整個抗體中，使用傳統 的技術，像是分別以木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗體 ，來製備抗體部份，像是Fab和F(ab')2片段。此外，亦可使 用標準重組DNA技術，獲得抗體、抗體部份和免疫黏附分 〇 ‘ 當在本文中使用”經過分離的二元專一性抗體”一詞時， 企圖意指實質上不含具有不同抗原專一性之其他抗體的二 元專一性抗體（例如經過分離的抗體，專一地與兩個不同但 在結構上有關聯之抗原，或其他無關抗原的在結構上有關 聯之區域結合，但實質上不含專一地與其他無關抗原結合 的抗體）。此外’經過分離的二元專一性抗體可以實質上不 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公楚) '~~ (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂·. -線- 1307716 A7 B7 五、發明說明（37 ) 含其他的細胞物質及/或化學物質。 、當在本文中使用”中和抗體"一詞時，企圖意指其與特定 柷原的結合作用，導致抑制該抗原之生物活性的抗體。可 藉著使用適當的活體外或活體内測定，測量—或多=該抗 原又生物活性的指示劑，來評估該抗原之生物活性的抑 作用。 當在本文中使用”單株抗體”一詞時，企圖意指融合瘤-衍 生的抗體（也就是由藉著融合瘤技術，像是標準和 MUstein融合瘤方法學製備之融合瘤分泌的抗體）。因此， 本發明之融合瘤衍生的二元專一性抗體仍意指單株抗體， 雖然它具有對單一抗原以上的抗原專一性。 重组柷體”之片語意指藉著重組方法製備、表現、產生 或分離的抗體，像是使用轉移感染至宿主細胞内之重組表 現載體表現的抗體，從重組的综合抗體庫中分離的抗體， 仗基因轉殖人類免疫球蛋白基因之動物（例如老鼠）中分離 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 的杬體（參見例如，Taylor, L.D.，等人（1992) Nucl. Acids Res· 20:62 8 7-6295)，或藉著任何其他涉及將特定的免疫球 蛋白基因序列（像是人‘類免疫球蛋白基因序列）接合至其他 DNA序列内的方法，來製備、表現、產生或分離的抗體。 重組抗體的實例包括嵌合型、CDR-移殖的和人類化的抗體 〇 人類抗體”一詞意指具有相當於或衍生自人類生殖種系 免疫球蛋白序列之可變和怪定區的抗體，如同由例如Kabat 等人描述的（參見 Kabat等人（1991) Sequences of Proteins -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^4. 1-2 (¾¾. Β7祕无 1307716 第090115948號專利申請案 --中文說明當卷拖苜似1玍1曰、 五、發明説明（38 ) of Immunological Interest，第 5 版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH公告第 91-324.2號）。然而， 本發明之人類抗體可包括並非由人類生殖種系免疫球蛋白 序列編碼的胺基酸殘基（例如藉著在活體外的隨機或指定 位置之突變生成作用，或藉著在活體内之體細胞突變導入 的突變），例如在CDRs或在特定的CDR3中。 本發明之重組人類抗體具有衍生自人類生殖種系之免疫 球蛋白序列的可變區，並亦可包括恆定區（參見Kabat，E.A., 等人（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest ’第 5版 ’ U.S. Department of Health and Human Services, NIH公告第91-3242號）。然而，在某些具體實施例中，使這 類重組的人類抗體接受在活體外的突變生成作用（或當使 用以人類Ig序列基因轉殖的動物時，接受在活體内的體細 胞突變生成作用），並因此該重組抗體的VH和VL區之胺基 酸序列，雖然是衍生自並與人類生殖種系VH和VL序列有關 的序列’但並非在活體内天然存在於人類抗體生殖種系譜 中的。然而’在某些具體實施例中’這類重組抗體為選擇 性突變生成作用或回復突變或兩者的結果。 回復突變'’一詞意指其中以得自同種的生殖種系抗體序 列之相對應的生殖種系殘基’置換人類抗體的一些或全部 體細胞突變之胺基酸的過程。分別將本發明之人類抗體的 重和輕鏈序列’與在VBASE資料庫中的生殖種系序列排成 一直線’以便確認具有最高同種性的序列。藉著使編碼這 類不同胺基酸的限定核苷酸位置突變，使在本發明之人类員 71846-940126.doc - 41 -
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五、發明說明（39 抗體中的差異恢復成生殖種系序列。因此確認爲回復突變 〈候選者的每個胺基酸的角&，應該就在抗原結合作用中 的直接或間接角色加以調查，並在突變之後，發現會影塑 類抗體之任何想要特徵的任何胺基酸，均不應包含在^ 後的人類k體中。欲將接受回復突變之胺基酸的數目減至 最少，可«發現與最密切之生殖㈣序列不Θ，但與在 第二個生殖種系序列中相對應之胺基酸相同的那些胺基酸 位置，其限制條件爲第二個生殖種系序列是與本發明之人 類抗體序列，在問題胺基酸的兩邊，至少有10個胺基酸， 最好是12個胺基酸是相同的和聯合線性的（c〇Hnear)。回復 大受可出現在抗體最優化的任何階段。 "嵌合型抗體"一詞意指包括得自一個物種的重和輕鏈可 k區序列，和得自另一個物種之恆定區序列的抗體，像是 與人類怪定區連接的老鼠重和輕鏈可變區。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 CDR-移植之抗體” 一詞意指包括得自一個物種的重和 輕鏈可變區序列，但其中以另一個物種的CDR序列置換一 或多個VH及/或VL的CDR區之序列的抗體，像是具有老鼠 重和輕鏈可變區，其中已經以人類Cdr序列置換一或多個 老鼠CDRs(例如CDR3)的抗體。
π人類化的抗體”一詞意指包括得自非_人類物種（例如老 鼠）之重和輕鏈可變區序列，但其中已經將至少一部份的 VH及/或VL序列改變成更"像-人類的"，也就是較類似人類 生殖種系可變序列的抗體。一種類型的人類化抗體是CDR-移植的抗體，其中將人類CDR序列導入非-人類的VH和VL -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1307716 A7
五、發明說明（4〇 ) 序列中，置換相對應的非人類CDR序列。 一種測量抗體之結合動力學的方式是藉著表面質粒基因 組共振。當在本文中使用"表面質粒基因组共振”一詞時， 意指容許藉著檢測在生物感應器基質中蛋白質濃度上的改 變’例如使用 BIAcore 系統（Pharmacia Bi〇sens()1· ABs Uppsala，Sweden and Piscataway，NJ)，分析即時生物專一 性之交互作用的光學現象。至於進一步的説明，參見 Wnsson，U.,等人（1993) Ann_ Bi〇1. CHn 红:19 26;】恤議， U·,等人（1991) Biotechniques 1 1:620-627 ; johnss〇n，B,等 人（1995) J. Mol. Recognit.及：125_131 ;以及 J〇hnns〇n, B , 等人（1 99 1) Anal. Biochem. 198:268-277。 當在本文中使用”Koff"—詞時，企圖意指抗體從抗體/抗 原複合物中解離的關閉速率常數。 當在本文中使用"Kd”一詞時，企圖意指特定抗體_抗原交 互作用的解離常數。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 可使用任何在上文細目Π中描述之各種製備抗體的方法 ，來製備本發明之二元專一性抗體。本發明之二元專一性 抗體基本上可對抗任何在結構上有關聯之抗原，雖然較佳 的本發明夂二兀專—性抗體是專一地結合1以和IL_ W的 那些，可使用諸如在實例〗_4中描述的那些二元專一性抗原 來製備之。可應用在本發明中的其他在結構上有關聯之抗 原’包括但不限於卡斯佩酶（caspase)家族成員、細胞分裂 素冢族，像是IL-1家族成員（例如IL_1/IL_18)、tnf家族成 員（例如TNFa/TNFp)、IL-6家族成貞、干擾素、TGFp家族 -43- 本紙張尺度剌中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 χ挪公髮） 1307716
發明說明（41 =貝、e^f家族成員、FGF家族成員、PDGF家族成員、 豕族成貝、血管生成素（Angiopoietin)家族成員、骨形態發 生蛋白質、分泌性蛋白酶（金屬_蛋白酶），以及細胞分裂素 受體豕族’像是IL小受體家族成員、TNF•受體家族成員、 TGFP文體家族成員、EGF受體家放成員、fgf受體家族成 員、PDGF受體家族成員、VEGF受體家族成員，以及血管 生成素受體家族成員。 本發明之二元專一性抗體，可對與其結合的兩個不同但 在結構上有關聯之抗原展現相等的結合活性，或者該二元 專-性抗體可較優先與兩個抗原之一結合，但與無關的抗 原相比較，仍對這兩個相關抗原具有專一性。可使用標準 在活體外的免疫測定，像是ELISA4BIAc〇re分析，評估二 元專性杬體對在結構上有關聯之抗原，以及對無關抗原 的結合活性。較佳的是，抗體對在結構上無關之抗原的Kd ，對抗體對在結構上有關聯之抗體的Kd之比例，應該至少 是3，更佳的是該比例應該至少是5，再更佳的是該比例應 琢至少是10，或再更佳的是該比例應該至少是5〇、1〇〇、2〇〇 、300 、 400 ' 500 、 600 、 700 、 800 、 900或1〇00 。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 從定量的觀點來看，在背景結合與二元專一性之間的差 異是一個含量或程度。例如，背景結合是在低値，例如低 於5 %，更佳的是低於3 %，而最佳的是大約〇.丨_ 1 %，而專一 的交叉反應性或二元專一性結合作用是在較高的値，例如 超過1%，較佳的是超過3%，更佳的是超過5%，而再更佳 的是超過10%。另外，在特定的生物測定中，二元專一性 -44 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1307716 A7 B7 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 五、發明説明（42) 抗to對標靶抗原的IC5〇最好接近該抗原的。 最好選擇本發明之二元專—性抗體，或其抗原結合部份 ，對於一個，更佳的是對兩個其將專一結合的抗原，具有 心要的結合動力學（例如高親和力，低解離，慢的關閉速率 二強的中和活性）。例如，二元專一性抗體或其部份，可藉 =表面貝粒基因組共振的判定，以〇丨秒J或更低的速率 系數’#父佳的是丨X丨〇_2秒-i或更低的k。^速率常數，更佳的 疋1 1 〇秒或更低的k。η、速率常數，再更佳的是1 X 1 〇-4秒-1 或更低的1^。„速率常數，或再更佳的是1>；1〇.5秒_,或更低的 koff速率常數，與一個，更佳的是兩個在結構上有關聯之抗 原結f。或者或另外地，二元專一性抗體或其部份，可以 1 10 更低的IC5〇，較佳的是以丨x 1〇-7 M或更低的IC5〇
，更佳的是以1 X 1〇·8 M或更低的IC5G，再更佳的是以丨x 1〇·9 M 或更低的ICw，再更佳的是以lxl〇-IQ M或更低的IC5Q，或再 更佳的是以1 xio-ii M或更低的IC：5Q，抑制一個，更佳的是 兩個在結構上有關聯之抗原的活性。最好是使用敏感的生 物"、彳疋測f ICw，其中Ι(：5〇値應該接近抗原在該測定中的 ed50 値。 人本發明亦提供包括本發明之二元專一性抗體或其抗原結 13 4铋，以及在藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。本發 明之醫.藥組合物尚可包括至少一種額外的治療劑，例如〆 或夕個用來冶療其中使用該二元專—性抗體有益於改善該 章是之障礙的額外治療劑。例如，當二元專一性抗體專/ 地結合IL-1 α和IL-1 β時，該醫藥组合物尚可包括一或多個 -45- 本紙張尺度g) ----------Λ— (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 五 1307716 發明說明（43 用來治療其中u活性爲有害之障礙的額外治療劑。 :將本發明之抗體或抗體_部份併入適合對個體投藥之 邱合物中。通常醫藥組合物包括本發明之抗體或抗體 a和在藥學上可接受的载劑。當在本文中使用"在藥學上 可接受的載劑'’時，包括任何和所肴的溶劑、分散介質、塗 =、抗細菌和抗眞菌劑、等張和吸收延遲劑及其類似物， :在生理學上是可相容的。在藥學上可接受之載劑的實例 括或夕個水、生理鹽水、嶙酸缓衝之生理鹽水、右旋 糖'甘油、乙醇及其類似物，以及其組合。在許多情況下 :在琢組合物中最好將包括等張劑，例如糖、多元醇，像 是甘硌糖s享&梨糖醇或氯化鈉。在藥學上可接受的載劑 尚:包括微量的輔助物質，像是濕潤劑或乳化劑、防腐劑 或緩衝洛夜，其促進抗體或抗體部份的儲存壽命或效力。 可將本發月之抗體或抗體_部份併入適合非經腸投藥的 醫藥組合物巾。較佳的是，將以含有〇1_25〇毫克/毫升抗體 的可注射溶液之形式，製備抗體或抗體_部份。可注射溶液 可^在堅硬或黃褐色小瓶、安叛或預裝填之注射筒中的 液態或冷滚乾燥之劑量形式所組成。緩衝溶液可以是^組 胺酸（1-50 mM)，最好是5_1〇囊，在pH 5 〇_7〇(最佳的是 PH 6.0)。其他適合的缓衝溶液包括但不限於琥珀酸鈉、檸 檬酸鈉、噚酸鈉或磷酸鉀。可使用氣化鈉修改濃度在 之溶液的毒性（液態劑量形式最好是150 mM)。在冷凍乾 燥的1开v式中可包括低溫防護劑，原則 上是0-10%蔗糖（最佳的是0.5-L0%)。其他適當的低溫防護 -46 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 項 f 訂 線 1307716
五、發明說明（44) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 剑包括海藻糖和乳糖。冷凍乾燥的劑量形式中可包括填充 劑，原則上是1-10%甘露糖醇（最佳的是2_4%)。在液態和冷 凍乾燥的劑量形式兩者中，均可使用穩定劑，原則上是〗_50 mM L-曱硫胺酸（最佳的是5-1 〇 mM)。其他適當的填充劑包 括甘胺酸、精胺酸，可包括〇_0.05%的多乙氧基醚_8〇(最佳 的疋0 ·005-0 ·0 1 %)。額外的表面活性劑包括但不限於多乙氧 基醚20和BRIJ表面活性劑。 本發明之組合物可以是各種形式的。這些包括，例如液 體、半固體和固體的劑量形式，像是液態溶液（例如可注射 和輸液的溶液）、分散液或懸浮液、錠劑、藥丸、散劑、微 脂粒和栓劑。較佳的形式依賴想要的投藥模式和治療應用 。代表性的較佳組合物是可注射或可輸液溶液的形式，像 是類似用來以其他抗原被動免疫人類的那些的組合物。較 佳的投藥模式是非經腸的（例如靜脈内、皮下、腹腔内、肌 肉内）。在較佳的具體實施例中，藉著靜脈内輸液或注射投 與抗體。在另一個較佳的具體實施例中，藉著肌肉内或皮 下注射投與抗體。 冶療组合物通常在製造和儲存的條件下必須是無菌和穩 定=。可以溶液、微滴乳狀液、分散液、微脂粒或其他適 合向藥物濃度的定購結構來調配組合物。可藉著以所需之 3量，將活性组合物（也就是抗體或抗體部份）併入適當的 浴劑中，其按照需要帶有上文列舉的成份之一或其组合， 接著進行滅菌過濾，來製備無菌的可注射溶液。一般而言 ，藉著將活性化合物併入無菌媒劑中，其含有基本的分散 -47· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 太 · 線- 1307716 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
A7 五、發明說明（45) 介質，以及上文列舉那些中的所需之 散液。在以滅菌的冷$ 伤，來製備分 的案例中，較佳的製t = f來製備減菌之可注射溶液 先前減菌-過滤的溶=噴霧乾燥，從其 成份的散劑。可唯拉a、、 .刀任何額外的想要 u 了維持溶視的適當流動性 如卵磷脂之類的塗料，在八 知耆使用諸 顆粒大小，胖著1面tr 例中藉著維持需要的 包人… 性劑的使用。可藉著在组合物中 包：延：吸收之製劑，例如單硬脂酸鹽類 = 注射組合物的延長吸收。 导致了 可藉著此項技藝中已知的各種方法，投與本發明之抗俨 和抗體-部份，雖然對許多治療應用而言，較佳的投藥路； 式是皮下注射、靜脈内注射或輸液。熟諳此藝者應瞭角; 投=路fe及/或模式將依據想要的結果而改變。在某些具 3a貫施例中，可製備帶有載劑的活性化合物，其將保護該 化合物免於快速釋放，像是控制釋放的調配物，包括植入 物經皮貼片和微量包膠的遞送系統。可使用生物可降解 、生物可相容的聚合物，像是乙晞乙酸乙酯、聚酐類、聚 乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。製備這類調配物 的許多方法是取得專利的，或通常爲熟諳此藝者已知的。 參見’例如 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. R〇binson，編輯，Marcel Dekker，Inc·, New York, 1978。 在某些具體實施例中，可口服投與本發明之抗體或抗體 邵份’例如，帶有惰性稀釋劑或可吸收之食用載劑。亦可 -48 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ,(請先閲讀背面之注意事頃导gibf) --線. 1307716
、發明說明（奶 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將化合物（如果兩迅 而要’和其他的成份）封入硬或軟殼的明膠 膠囊中’壓成1定劑，或直接併入個體的飲食中。爲了口服 治療劑的招 n , 、 可爿T化合物與賦形劑合併，並在可攝取的 鍵劑、口本片、1、、 ° 、糖叙、膠囊、她劑、懸浮液、糖漿、糯米 '氏囊州及其類似物的形式中使用。.欲藉著非經腸投藥以外 勺方式投舁本發明之化合物，可能必須以保護其免於失活 的物貝塗覆化合物，或與其共同-投藥。 亦可爿Ί·補充的活性化合物併入該組合物中。在某些具體 實她例中，可將本發明之抗體或抗體部份與一或多種額外 的’口療劑共同碉配並/或共同投藥，其可用來治療其中IL-1 活性疋有害的障礙。例如，可將本發明之抗H a/IL_} ρ 一疋專一性抗體或抗體部份，與一人 的額外抗體嶋，與其他細胞分裂素結合或與：::1二 子m &的抗)共同凋配，並/或共同投藥。此外，本發明 的或夕種杬fa亦可與二或多種前述的治療劑併用。這類 :合治療可有利地使用較低之劑量來投與治療劑，因此避 免了與各種單-治療有關的可能毒性或併發症。 抗體的 洽 假使本奩明之一元專一性抗體或其部份具有與兩個不同 但在結構上有關聯之抗原結合的能力’便可用來檢測這些 抗體中的任一個或兩者（例如在生物試樣中，像是血清或血 漿），使用傳統的免疫測定，像是酵素連結的免疫吸附測定 (ELISA)，放射性免疫測定（RIA)或組織免疫组織化學法。 本發明提供在生物試樣中檢測抗原的方法，包括使生物試 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) ¾ 太 訂： 線· 1307716 A7 _____B7 五、發明說明（47 ) 樣與本發明之二元專一性抗體或抗體部份接觸，其專—地 認出抗原，並檢測與該抗原結合之抗體（或抗體部份）或未 結合的抗體（或抗體部份），藉此檢測在該生物試樣中的抗 原。以可檢測物質直接或間接標示抗體，有助於檢測已結 合或未結合的抗體。適當的可檢測'物質包括各種酵素、輔 基、螢光物質、發光物質和放射性物質。適當酵素的實例 包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖甞酶或乙酿膽 鹼酯酶；適當之輔基複合物的實例包括鏈黴菌抗生物素蛋 白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；適當之螢光物質的實例 包括繳形酮、螢光素、勞光素異硫代氰酸酿、若丹明 (rhodamine)、二氣三嗪胺（dichlorotriazinylamine)榮光素、 丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光物質之實例包括魯米諾；而適 當之放射性物質的實例包括1251、1311、35s或3H。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 標示抗體的另一種選擇，可藉著競爭放射性免疫測定， 利用以可檢測物質標示的抗原標準物，和對該抗原（群）專 一的未標示之二元專一性抗體，測定在生物流體中的抗原 (群）。在該測定中，混合生物試樣、已標示之抗原標準物 和二元專一性抗體，並判定與未標示之抗體結合的已標示 抗原標準物之含。在生物試樣中之抗原的含量與已與未 標示之抗體結合的已標示之抗原標準物的含量成反比。 在較佳的具體實施例中，二元專一性抗體專—地認出 IL -1 α和IL -1 β，並使用前述的檢測方法來檢測〗L _ 1 α及/或 IL-1 β。因此，本發明更提供在生物試樣或組織中檢測IL_ j ^ 或IL -1 β的方法’包括使懷疑含有IL -1 α或IL -1 β的生物試樣 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) -- IS07716 玉、發明說明（妨） 或組織，與本發明之二 — 觸，並檢測在該生物試或 ^ 或其抗原結合部份接 試樣可以是例如在活我中的“或江，。生物 (例如血液、血浆、尿細胞、組織或體液 測的組織亦可以是在個體中在 二此，進行檢 =體亀織攝―織(例如 ，發明疋一 7C專—性抗體亦可用於診斷目的 體實施例中，在活f妹在個具 像疋在實驗室測定中，柃 抗骨且’ 檢測感興趣的抗原（群），或是名昭 顧測試時，檢測感興趣 — … 訂 在活體外測定的實例，包=ΓΑ)。使用抗體之已確立的 其類似物。在另一個且4 :S、RIAS、西方墨點法及 中，使用本發明二=:中，在活體内的診斷測定 抗像疋在活體内的攝影測試。例如 可利用此夠在活體内檢測到的可檢測物質來標示抗體， 線 :將已標示之抗體投與個體’並可在活體内檢測已標示之 抗，籍此容許進行在活體内的攝影。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 爲了診斷目的’可在診斷測定中，使用專-地認得IL_la 和1 ^的本發明之二元專一性抗體，檢測IL-1 a及/或IL-1 β 例如在各種炎症疾病和障礙中，以及在胎兒的自發性吸 收作用（spontaneous res〇rpti〇n)中。關於特定類型的疾病和 障礙，爲了診|斤之目的，可在任何本文中描述的疾病/障礙 :，使用本發明之二元專一性抗_IL_ia/IL_lj3抗體，關於這 :員柷te的冶療用途（參見下文），像是其中IL_丨活性是有害的 -51 -297公釐） 1307716 A7 五、發明說明（49) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印1 障礙，在下文中進一步討論。 本發明 < 二元專一性抗體或抗體部份，最好能夠中和， 在活體外和在活體内，與其結合之抗原的活性。因此，可 使用這類本發明之抗體和抗體部f分’抑制抗原的活性，例 如在含有該抗原的細胞培養甲，或在具有與本發明之二元 專-性抗體產生反應之抗原的人類個體或其他的哺乳：物 個體中。在-個具體實施例中，本發明提供抑制抗原活性 的方法，包括使該抗原與本發明之二元專„性抗體或抗體 邵份接觸，而得以抑制該抗原之活性。在較佳的具體實施 例中，該二元專一性抗體與比_1〇1和仄_1(3結合，且該方法 爲藉著使IL-la及/或IL_1P與該二元專—性抗體或其部份接 觸，抑制乩-“及/或比-”活性的方法。例如，可在活㉟外 抑制比-la及/或仏-邓的活性。例如，在含有或懷疑含有 IL-la及/或比-”的細胞培養物中，可將本發明之抗體或抗 體部份，加至培養基中，以便抑制在培養物中的化七及/ 或IL-Ιβ活性。或者，可在活體内在個體中抑制iL_ia及/或 IL-1 β的活性。 在另-個具體實施例中，本發明提供在個體中抑制抗原 活性的方法，該個體罹患其中該抗原活性是有害的障礙‘。 本發明提供在羅患這類障礙之個體中抑制抗原活性的方法 ，琢万法包括對該個體投與本發明之二元專一性抗體或抗 體部份，而得以在該個體中抑制抗原之活性。較佳的是， 該抗原爲人類抗原，且該個體是人類個體。可爲了治療之 目的，將本發明之抗體投與人類個體。此外，亦可爲；獸 (請先閱讀背面之注意事項再本頁)
-»·1 n Lr I 太 訂· 線· 52 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1307716 五、發明說明（5〇) 醫目的，或作爲人類疾病之動物模式，將本發明之抗體投 與表現與該抗體結合之抗原的非_人類哺乳動物。關_者 ，可使用這類動物模式來評估本發明之抗體的治療效力 (例如測試劑量和投藥的時間經過）。 較佳的是，二元專一性抗體與化結合， 個體中抑制抗原活性的方法，是在個體中抑⑽q活性的 万法’例如罹患其中ΙΙΜ活性是有害之障礙的個體。 本又中使用"其中！Ld活性是有害的障礙詞時，企二包 * I已一1不1。“其包括IL_1MtiIL-1P兩者)出現在罹 ^障礙〈個體中，或懷疑IL]已成爲該障礙之病理生理 學上的原因，或促成該障礙惡化之因素的疾病和其他障礙 。因此，其中^活性是有害的障礙，爲其中預期心活性 (也就疋Ua和α_1β任—個或兩者）之抑制作用，可緩和今 障礙（徵候及/或前進的障礙。例如，可： 之個體的生物流體中，纽-1濃度上的增加(例！:在: 的血清、血浆'滑膜液等等中，如濃度上的"口 障 可使用例如按照上述之抗剔抗體來檢測，而證；這類、 礙。 ‘ ν、 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 的 濕 節 病與二種/及免疫和炎症元件之疾病有關聯 病理子上，扮决重要的角色。這些疾病包 性關節炎'骨關節炎、青少年慢性關節炎万d 炎 '牛皮癖性關節炎、反應性關節炎、脊椎關/性關節 性紅斑性狼瘡、克隆氏（crohn,s)症、潰癌性結=、，身 性腸病、騰島素依賴性糖尿病、甲狀腺炎、氣喘，過= _____ -53- 本紙張尺度適用中國國家標準―規格（21G_X 297公楚| - 1307716 經濟部中央標準局員工消費合作杜印装 A7 五、發明説明（51) =牛皮癬、硬皮病性皮炎、移植物對宿主的疾病、器 官“的排斥、與态盲移植有關的急性或慢性免疫疾病、 類肉瘤病、關節硬化、散布性血管内凝血，、川崎氏 (K_akilS)症、格瑞福氏（GraVe|s)症、腎病徵侯群、慢性 ^欲候群、威格諾氏{Wegener,s)肉芽腫病、漢馬克-薛尼 ^^enoch-Schoemein)紫斑病、腎臟的顯微鏡下脈管炎、 k性王動性肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、中毒性休克徵 候群、敗血病徵候群 '惡病質、傳染病、寄生蟲病、後天 免疫不全徵候群、急性橫貫性脊髓炎、亨丁頓氏舞蹈症、 帕金森氏症、早老性癡呆徵候群、猝發、 硬化、溶血性貧血、惡性、心衰竭、心肌梗塞、二： (Add1SOn's)症、偶發的多腺體缺陷第i型和多腺體缺陷第η 型、薛密特氏（Schmidt's)徵候群、成人（急性）呼吸緊迫徵候 群、禿髮、侷限性禿髮、血清反應陰性的關節病、關節病 、雷特氏（Reiter’s)症、牛皮癖性關節病、潰瘍性結腸性關 節病、腸病性滑膜炎、與衣原體屬、耶爾森氏菌屬和沙門 氏桿菌屬有關的關節病、脊椎關節病、動脈粥樣硬化性疾 病/動脈粥樣硬化、特應性過敏反應、自體免疫性大疱性疾 病、尋常性天疱瘡、落葉性天疱瘡、類天疱瘡、線性IgA 病、自體免疫性溶血性貧血、考馬斯（C〇ombs)陽性溶血性 貧血、後天惡性貧血、青少年惡性貧血 '肌痛性腦炎/皇家 自由（Royal Free)病、慢性黏膜皮膚念珠菌病、巨大細胞動 脈炎、原發性硬化性肝炎、隱原性自體免疫性肝炎、後天 免疫不全症徵候群、後天免疫不全相關疾病、C型肝炎、普 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公着） . %! (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、ΐΤ 1307716
I變異型免疫不全(普通變異型 心肌病、女性m I、土低广球蛋白血症）、擴張型 w 孕 卵巢功能衰竭、卵巢功能早衰、％ 維性肺病、隱原性纖維性肺、、包…… ''歲 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ==、細性肺病有關的結缔组織疾病、與肺病 k,型結缔組織疾病、與間.質性肺病有關的全身性 肖間質性肺病有關的風濕性關節炎、與肺病有關 =身性紅斑性狼瘡、與肺病有關的皮肌炎/多肌炎、盘肺 ，有關的許葛瑞氏（㈣⑽IS)症 '與肺病有關的強直性脊椎 -、脈官炎的彌漫性肺病、與肺病有關的含鐵血黃素沉著 I㈣引起的間質性肺病、放射性纖維化、阻塞性細支 乳官炎、慢性嗜曙紅細胞性肺炎、淋巴細胞浸潤肺病、感 染後的間質性肺病、痛風性關節炎、自體免疫性肝炎、第】 型自=免疫肝炎(；典型的自體免疫性或狼瘡樣肝炎）、第2型 自體免疫性肝炎（抗_LKM抗體肝炎）、自冑免疫調節的低血 糖、/型胰島素抵抗力帶有黑棘皮病' 副曱狀腺功能不足、 與器耳移植有關的急性免疫疾病、與器官移植有關的慢性 免疫疾病、骨關節炎、原發性硬化性膽管炎、牛皮癬第工 型、牛皮癬第2型、特發性白血球減少症、自體免疫性嗜中 性白血球減少症、未另列出的腎病、腎小球性腎炎、腎臟 的頒彳政鏡下脈管炎、萊姆病、盤狀紅斑性狼瘡、男性不孕 ，特發性或未另列出的、精子的自體免疫性、多發性硬化 症（所有的亞型）、交感性眼炎、繼發於結缔組織疾病的肺 间血壓、古德巴斯特氏（G〇〇dpasture,s)徵候群、結節性多動 脈炎的肺臟顯露、急性風濕熱、風濕性脊椎炎、斯帝爾氏 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4规格（210 X 297公釐） 1307716 A7 B7 五、發明說明（53 (Still’s)症、全身性硬化症、許葛瑞氏症、高安 氏（Takayasuis)症/動脈炎、自體免疫性血小板減少症、特發 性血小板減少症、自體免疫性甲狀腺病、甲狀腺機能亢進 、甲狀腺腫的自體免疫性甲狀腺功能不足（橋本氏 (Hashimoto’s)症）、萎縮性自體免疫性甲狀腺功能不足、原 發性黏液水腫（myxoedema)、晶狀體性葡萄膜炎、原發性脈 管炎、白瘢風、中樞神經系統的疾病（例如抑鬱、精神分裂 猛、早老性癡呆徵候群、帕金森氏症等等）、急性和慢性疼 痛和脂質不平衡。可使用本發明之人類抗體和抗體部份，、 來治療罹患自體免疫性疾病的人類，特別是與炎症，包括 風濕性脊椎炎、過敏 '自體免疫性糖尿病、自體免疫性 萄膜炎有關的那些。 較佳的是可使用本發明之IL_la/IL_lp二元專一性抗體或 其抗原結合部份，來治療風濕性關節炎、克隆氏症、|發 性硬化症、胰島素依賴性糖尿病和牛皮癬。 本發明之IL-la/IL_ip二元專一性抗體或抗體部份，亦可 與-或多種額外的治療劑—起投藥，用來㈣自體免疫和 炎症疾病。 ‘ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 可單獨使用或併用本發明之抗體，或其抗原結合部份， 來治療這類疾病。請瞭解本發明之抗體或其抗原結合^ ’可單獨使用或與附加之製劑，例如治療劑併用，由熟: 此藝者就其想要的目的來選擇該附加之製劑。例如，附： 之製劑可以是由此項技藝承認可用4治療待藉著本發明^ 抗體治療之疾病或病況的治療劑。附加之製劑亦可以是= -56 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 1307716 _____ A7
五、發明說明（54) 與治療性組合物有南丨以 衫響组合物黏相 戈利性質之製才丨 的製劑。 q <表釗，例如， 更暸解將包含在本發明内…，θ =那些組合。下文陳逑的製劑僅：了；其想要目, :限制之。爲本發明之-部份的組合，並^ 月豆和至少一種選自下列— 乂疋本發明之古 括-種以上的附如製劑，例如二或：：劑。孩組合亦可έ 該組合得爾可執行其想要：能：组：：製劑，以❹ 較佳的組合是非_類固醇的消炎藥 ，< ，其包括像異丁苯丙酸（ib ^ ，耶稱爲NSAID; 物。其他較佳的组人θ二：X_2抑制劑之類的藥 j、-且口疋皮質類固醇， (prednisolone);當盘太| nEI、』、 氧皮質酉弓 ，可精者逐漸減少所需之類固醇的劑量，降低或 二=使用類固酵之副作用。可與本發明之抗體或= Μ"“，風濕性關節炎之治療劑的未加以限制之實例， 包括下列：細胞分裂素抑制性消炎藥（群）(CSAiDs);其他 人類細胞分裂素或生長因子的抗體或拮抗劑，例如TNF、 LT、IL-2、IL-6、IL-7‘、IL-8、IL-12、IL-13、IL-16、IL-li 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF。本發明之抗體或其抗 原結合部份’亦可與對抗細胞表面分子之抗體混合，該細 胞表面分子像是 CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、 CD30、CD40、CD45、CD69、CD80 (B7.1)、CD86 (B7.2 、匸090或其配體，包括〇0154(呂卩39或004 01〇。 較佳組合的治療劑可在不同地點干擾自體免疫和後續的 -57 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1307716 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 五、發明說明（55) 炎症級聯’較佳的實例包括TNF拮抗劑，像是嵌合型、人 類化或人類TNF抗體、D2E7、（PCT公告第w〇 97/29131號） 、CA2 (RemicadeTM)、CDP 571、CDP 870、唐松草胺 (Thalidamide)和可溶性P55或P75 TNF受體、其衍生物p75 TNFRlgG (EnbrelTM)或 p55TNFRlgG (Lenercept)，還有 TNFα轉變酵素（TACE)抑制劑；同樣地，基於相同的理由， IL-1抑制劑（介白素-1 _轉變酵素抑制劑，IL_丨RA等等）亦可 能是有效的。其他較佳的組合包括介白素丨丨。另外較佳的 組合是自體免疫反應的其他關鍵性角色，其可能平行地， 依據IL-1功能或與其一起作用；特佳的組合是〖卜以及/或 IL-18拮抗劑，包括IL_12及/或比_18抗體，或可溶性比_12 及/或IL-18受體，或IL-12及/或IL-18結合蛋白質。已經顯示 IL-1 2和IL-18具有部份重疊但不同的功能，而兩者之拮抗劑 的組合可能是最有效的。另一種較佳的組合是未-枯竭之抗 -CD4抑制劑。另一種較佳的組合包括共同-刺激路徑cD8〇 (B7_l)或CD86 (B7.2)的拮抗劑，包括抗體' 可溶性受體或 拮抗劑配體。 本發明之抗體或其抗原結合部份，亦可與諸如胺甲碟呤 、6-MP、（硝基）咪唑硫嘌呤、硫酸醯水楊嗪（siHphasaiazine) 、美沙拉嗪（mesalazine)、奥沙拉嗪（〇isalazine)、氯喳 (chloroquinine)/ 羥氣喳（hydroxychloroquine)、青黴胺 (pencillamine)、金硫蘋果酸鹽（aurothi〇maiate)(肌肉内和口 服）、（硝基）咪唑硫嘌呤、可曲辛（cochicine)、皮質類固醇 (口服、吸入或局部注射）、p_2腎上腺受體激動劑（舒喘寧 -58-
(請先閱讀背面之注意事項再^寫本頁) ¾ 士 •線- 1307716 A7 ____ B7 五、發明説明（56) (salbutamol)、特布他林（terbuta丨ine)、沙美特羅（salmeteral)) 、^嗓吟素（命驗、氣茶驗（aminophylline))、色甘酸鹽 (cromoglycate)、茶？羅米（ned〇cromii)、酮替芬（ketotifen) 、異丙托銨（ipratropium)和氧托銨（oxitr〇pium)、環孢靈、 FK5 06、雷帕黴素、黴酚酸嗎啉乙酯（myc〇phen〇late m〇fetil) 、黎氟諾胺（leflunomide)、NSAIDs，例如異丁苯丙酸，皮 質類固醇，像是脱氫皮質醇、磷酸二酯酶抑制劑、腺嘌呤 核苷激動劑、抗凝血劑、補體抑制劑、腎上腺素能製劑， 干擾由原發炎（proinflammatory)細胞分裂素發送信號之製 劑’像是 TNFa或 IL-1 (例如 IRAK、NIK、IKK、p38 或 MAP 激酶抑制劑）’ IL-1 β轉變酵素抑制劑、TNFa轉變酵素 (TACE)抑制劑、T-細胞發送信號抑制劑，像是激酶抑制劑 、金屬蛋白酶抑制劑、硫酸醯水楊嗪、（硝基）咪唑硫嘌 呤、基嘌呤、血管收縮素轉變酵素抑制劑、可溶性細 胞刀友素受體及其衍生物（例如可溶性p5 5或p75 TNF受體 和衍生物P75 TNFRIgG (Enbreiw和p55 TNFRIgG (Lenercept)) 經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ，sIL-lRI、SIL-1RII、SIL-6R),以及消炎的細胞分裂素 (例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFp)之類的製劑混合 。較佳的組合包括胺甲碟呤或黎氟諾胺，而在中等或嚴重 的風濕性關節炎之案例中爲環孢靈。 可與本發明之抗體或抗體部份混合的炎症性腸病治療劑 I非限制實例包括下列：布德諾.（buden〇side);表皮生長 Η予，皮貝類固醇，環孢I ;硫酸酿水楊嗪；胺基水楊酸 酯；6-巯基嘌呤；（硝基）咪唑硫嘌呤；甲硝唑（metr〇nidaz〇ie) -59- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公楚）
經濟部智慧財產局員工消費合作社印制π 1307716 五、發明說明（57) ;月曰肪氧合酶抑制劑；間-胺基水楊酸（1^^13111111£);奥沙 拉嗪；巴薩拉唑（balsalazide);抗氧化劑；血栓虎 (thr〇mb〇Xane)抑制劑；IL-1受體拮抗劑；抗-IL-Ιβ單株抗體 ，抗-IL-6單株抗體’·生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；吡啶 基-咪唑化合物；其他人類細胞分裂素或生長因子的抗體或 插抗劑，例如 TNF、LT、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8 ' IL-12
、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和 PDGF 。本發明之抗體可與對抗細胞表面分子之抗體混合，像是 CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45 、CD69、CD90或其配體。本發明之抗體或其抗原結合部份 ，亦可與諸如胺甲碟呤、環孢靈、FK5〇6、雷帕黴素、黴 酚酸嗎啉乙酯、黎氟諾胺、NSAIDs，例如異丁苯丙酸，皮 質類固醇，像是脱氫皮質醇、磷酸二酯酶抑制劑、腺嗓呤 核苷激動劑、抗凝血劑、補體抑制劑、腎上腺素能製劑， 干擾由原發炎細胞分裂素發送信號之製劑，像是ΤΝρα或 IL-1 (例如 IRAK、ΝΙΚ、ΙΚΚ、Ρ3 8 或 MAP激酶抑制劑），IL_ i ρ 轉變酵素抑制劑、TNFcx轉變酵素抑制劑、T_細胞發送信號 抑制劑，像是激酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、硫酸醯水 楊嗪、（硝基）咪唑硫嘌呤、6 -疏基嘌呤、血管收縮素轉變 酵素抑制劑、可溶性細胞分裂素受體及其衍生物（例如可 溶性 ρ5 5或 P7 5 TNF受體，sIL-lRI、sIL-lRH、sIL_6R)，以 及消炎的細胞分裂素（例如IL-4、IL-10、IL_U、IL_13# TGFp)之類的製劑混合。 可與抗體或抗原結合部份混合之克隆氏症治療劑的較佳 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐〉 I n · - — — — — III ^ «II I I — — — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1307716 A7 五、發明說明（58
實例包括下列：TNF拮抗劑，例如抗_TNF抗體、D2E7 (pcT
公告第 WO 97/29131號）、CA2 (RemicadeTM)、cdp 571、 TNFR-Ig 構染體（p75TNFRIgG (EnbrelTM)和 p55TNFRIgG (Lenercept))抑制劑，以及PDE4抑制劑。本發明之抗體或其 抗原結合部份，可與皮質類固醇混，合，例如布德諾赛和地 塞米松。本發明之抗體或其抗原結合部份，亦可與諸如硫 酸酿水楊嗪、5 -胺基水楊酸和奥沙拉嗪之類的製劑，以及 干擾原發炎細胞分裂素，像是比-丨之合成或作用的製劑混 合，例如IL-Ιβ轉變酵素抑制劑或IL_lra。本發明之抗體或 其抗原結合部份亦可與T細胞發送信號抑制劑併用，例如酪 胺酸激酶抑制劑6-巯基嘌呤。本發明之抗體或其抗原結合 部份亦可與IL-1 I混合。 可與本發明之抗體或抗體部份混合之多發性硬化症治療 劑的非限制實例包括下列：皮質類固醇；脱氫皮質醇；甲 基脫氫皮質醇；（硝基）咪唑硫嘌呤；環磷醯胺；環孢靈； 胺甲碟呤，4-胺基吡啶；替托尼定（tizanidine);干擾素 (AV〇neX ; Bi〇gen);干擾素_Plb (Betaseron; Chiron/Berlex) ’共聚物 1 (Cop-1 ;可帕松（C〇pax〇ne) ; Teva
Industries，Inc·);比重高的氧；靜脈内的免疫球蛋白；克 拉派拜（clabdbine);對其他人類細胞分裂素或生長因子的 抗體或拮抗劑，例如 TNF、LT、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、 IL-12、IL-15、IL-16、IL-18、ΕΜΑΡ-Π、GM-CSF、FGF和 PDGF °本發明之抗體或其抗原結合部份，可與對抗細胞表 面分予之抗體混合，像是CD2、CD3、CD4、CD8、CD25 -61 - 本紙張尺度適用中_豕辨（CNS)A4規格（2·1() χ 2
頁 I I I I ! 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1307716 A7 B7 五、發明說明（59) 、CD28、CD30' CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90 或其配體。本發明之抗體或其抗原結合部份，亦可與諸如 胺甲碟吟、環孢靈、FK506、雷帕黴素、黴酚酸嗎啉乙醋 、黎氟諾胺、NSAIDs，例如異丁苯丙酸、c〇x_2抑制劑、 皮質類固醇，像是脱氫皮質醇、磷，酸二酯酶抑制劑、腺嘌 呤核苷激動劑、抗凝血劑 '補體抑制劑、腎上腺素能製劑 ，干擾由原發炎細胞分裂素發送信號之製劑，像是TNFa或 IL-1(例如 IRAK、NIK、IKK、p3^MAI^^^"|Uf|j)，iL, 轉變酵素抑制劑、TACE抑制劑、丁_細胞發送信號抑制劑， 像是激酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、硫酸醯水楊·嗦、 (硝基）咪唑硫嘌呤、6-酼基嘌呤、血管收縮素轉變酵素抑制 劑、可溶性細胞分裂素受體及其衍生物（例如可溶性p55或 P75 TNF 受體、sIL.1RI、sIL_1RII、siL 6R)，以及消炎的 細胞分裂素（例如IL-4、IL_丨〇、1£_13和TGFp)之類的製劑混 合。 可與本發明之抗體或抗體部份混合之多發性硬化症治療 劑的較佳實例包括干擾素，例如IFN(Ha*iFNpib ;可帕 松、皮質類固醇、IL-1抑制劑、TNF抑制劑，以及對cD4〇 配體和CD80的抗體。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之醫藥組合物可包括，，在治療上有效之含量，，或，， 在預防上有效之含量”的本發明之抗體或抗體部份。"在治 療上有效之含量"意指在劑量上和所需的期間内，有效達到 想要（治療結果的含量。在治療上有效之含量的抗體或抗 體部份，可根據諸如個體的疾病狀態 '年齡、性別和體重 ____-62- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4 ^格（210 X 297公董） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制^ 1307716
五、發明說明（6〇 ) <頒的因素，以及抗體或抗體部份在個體 應的能力而改變。在治療上有效之含量亦二；= 的毒性或Μ影響，重於在治療上有利影響 間:二在預防上有效之含量”意指在劑量上和所需的期 二’有效達到想要之預防結果的含量。通常，因爲在個 =使用預p方性劑量，是在疾病之前或是在較早的階段， 因此在預防上有效之含量將低於在治療上有效之含量。 可調整劑量攝生法，以提供最適切的想要反應（例如治療 5、預防的反應）。例如，可投與單一團塊，在一段時間内投 與數個分開的劑量，或按照治療狀態的追切指示，按比例 降低或增加劑量。冑了易於投藥和劑量的均-，以劑量單 位形式調配非經腸組合物是特別有利的。當在本文中使用 浏量單位形式時，意指在物理上的個別單位，適合作爲待 /口療之哺乳動物個體的單位劑量；每個單位含有與所需之 藥學載劑結合的預定含量之活性化合物，經過計算其；產 生想要的治療效果。藉著並直接依據（a)活性化合物之獨特 特徵和欲獲得之特定治療或預防的效果，以及（b)在調配技 藝中的先天限制，像是活性化合物在個體中的敏感性處理 ’來指足本發明之劑量單位形式的規格。 本發明之抗體或抗體部份的代表性而非限制之在治療上 或在預防上有效之含量的範圍，是0.1-20毫克/公斤，更佳 的疋1 -10毫克/公斤。注意到劑量値可隨著待緩和之病況的 類型和嚴重性而改變。更瞭解對任何特定的個體而言，將 在一段時間内根據個體的需要，以及投與該組合物或監督 -63- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）
1307716 A7 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 社 印 製 五、發明說明（61 ) 該組合物之投藥者的專業判斷，來調整特定的劑量攝生法 网而在本文中陳述之劑量範圍僅是最具代表性的，並非企 圖限制提出申請之组合物的範圍或實行。 =著下列的實例進-步解釋本發明。，不應將其解釋爲 二任何万式來加以限制。將所有提及之參考文獻的内容， =在本申請案之中提及的文獻參考、發行的專利和公開 的專利申請案，明確地以引用的方式併入本文中。 宜Ai:以同一性之相鄰拓樸區域爲基礎，設計二元專一 性抗原 在本實例中，判定在兩個不同但在結構上有關聯之蛋白 質之間同一性的最大相鄰拓樸區域，作爲設 計二元專-性抗原的基礎，其使二元專—性抗體飢七和 IL-Ιβ升高。使用BLAST演算法比較這兩個蛋白質，並容許 測量在類似的結構或功能區，以一個殘基置換另一個的傾 向。該分析容許確認在IL_la*IL_1(3之間同—性的最大相 鄰拓樸區域，並利用類似性之任何合理的伸張來延伸該區 域，以便產生直線的肽，作爲二元專—性抗原。最適合這 些k準的肽具有如下的胺基酸序列： NEAQNITDF (序列識別〗號） 星號Γ)代表根據BLAST演算法，在兩個蛋白質中相同的 基’而其他的殘基則是極類似的。例如，在同種的蛋白 中’離胺酸通常將取代精胺酸，但不取代苯丙胺酸。序 殘 質 列
頁 I I訂 線 [_____ - 64 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格⑵G x 297公变 1307716 A7 B7 五、發明說明（62) 識別1號的肽是雜化物，取自兩段不同的結構，其以相反的 方向進行，所以該抗原決定位的其他合理的代表爲：
dNdEdAdQNITDF (其中”d”字首表示該胺基酸殘基爲‘D胺基酸殘基）。藉著標 準化學方法合成該肽的L胺基酸版本和部份以D胺基酸殘 基取代的版本。然後使該肽與載體蛋白質（例如KLH或白蛋 白）結合’並藉著在活體外或在活體内的方法，使用已結合 的肽來選擇抗體。 實經~2 :以模仿共同折疊之環的環狀肽爲基礎，設計二元 專一性抗原 在本實例中，爲了用來作爲二元專一性抗原，以便使二 元專一性抗體對IL-1 α和IL-1 β升高，建構在結構上模仿在 兩個不同但在結構上有關聯之蛋白質， 的共同折疊之鑰匙環的環狀肽。封閉的環代表11_1〇〇的殘基 168-184和IL-Ιβ的殘基160-176。一致序列爲： 環-MAFLRANQNNGKISVAL (PG)(序列識別 2號） cbcccccccc c b 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 星號Γ)代表在IL-loc和IL-Ιβ之間相同的殘基，c代表一致殘 基’也就是類似IL-loc和IL-Ιβ的殘基，但在任一個蛋白質 中並非實際上出現在該位置處，而b表示沒有明確一致的殘 基，以便保留IL -1 β序列的同一性。藉著標準化學合成法合 成直線的肽。欲將該肽環化，加入脯胺酸和甘胺酸殘基。 -65- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）' 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制取 1307716
五、發明說明（63 可使用標準偶聯條件，以在N，N_二曱基甲醯胺（1毫克/亳升） 中的高度稀釋，合成環狀的肽。在室溫下使用過量的偶聯 劑’像是苯并三峻小基_氧基_三_㈣读_鱗六氣蹲酸： (PyB〇p ; 2當量）和碳酸氫鈉（1〇當量），進行原型的反應。 然後使該肽與載劑蛋白質（例如KLH或白蛋白）結合，並藉 著在活體外或在活體内的方法，使用已結合的肽來選擇杧 體。 & 复:以雜種肽爲基礎，設計二元專一性抗原 在本實例中，爲了用來作爲二元專一性抗原，以便使二 元專一性抗體對IL-la和IL-Ιβ升高，建構包括兩個不同但 在結構上有關聯之蛋白質，IL-1 IL_丨β之交替或部份重 疊序列的雜種肽。欲產生雜種肽，確認IL_la*IL_ip的交 替或部份重疊之胺基酸序列，並接合在一起，產生下列的 肽： TKGGQDITDFQILENQ (序列識別 3號） b b b b b b bbbb aaaaaaaaaa a和b代表那一個蛋白質爲殘基的來源（^江」^ ; b = iL-ip) 。在雜種肽中包括兩個蛋白質共同的ITDF(序列識別4號） 主遞。此外，該雜種肽集中在得自兩個蛋白質之幾基終端 的序列，已知在兩個蛋白質中，其對中和抗體而言是抗原 性的。藉著標準化學合成法合成雜種肽。然後使該肽與載 劑蛋白質（例如KLH或白蛋白）結合，並藉著在活體外或在 -66- 本纸張尺Ϊ適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ' '~'
1307716 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（64) 活體内的方法，使用已結合的肽來選擇抗體。 實例4 : 產製對抗IL-1 α和IL-1 β的二元專一性抗體 NEAQNITDF (序列識別1號） 環-MAFLRANQNNGKISVAL(PG).(序列識別 2號） TKGGQDITDFQILENQ (序列識別 3號） 使序列識別1、2和3號的肽與KLH結合，並免疫接種個別 的兔子。得自以三個肽分別免疫接種之兔子的抗血清，顯 示對用來作爲抗原之肽，有良好的抗體反應。然而，僅有 得自以序列識別3號之肽免疫接種之兔子的抗血清，能夠與 IL-lot蛋白質和IL-Ιβ蛋白質兩者結合。 每三週一次，以與KLH結合之序列識別3號的肽加上福瑞 德不完全佐劑（FIA)皮下接種五隻老鼠（BA1 19-BA123)，總 共三次’接著以與KLH結合之序列識別3號的肽靜脈内補強 兩次。在每次免疫接種之後十天，對每隻老鼠採血，並藉 著E LIS A判足抗體力價。按照在第j I a章中的描述，將得自 老鼠BA119和BA123·^脾臟細胞，分別與骨髓瘤細胞株 P3X36Ag8.653融合，並使用限制稀釋，以每孔1個細胞將 所得的融合細胞播種在數個96-孔培養盤上。首先藉著標準 ELISA，就IgG和IgM的產製，測定融合瘤純種系的生長， 確認產生抗體的純種系。從老鼠#BA123的融合中，分離出 總共945個純種系。在EUSA中測試得自355個純種系的上 清液，顯示對^^«、江-“或比-“和比-”兩者的抗原結合 活性。 -67- 1本紙張尺度遍用中國國家標準（CNS)A4規格（21G X 297公祭 ------—
1307716 A7 B7 五、發明說明（65 ) ；
I
#純種系编號 抗原專一性（對全長的IL-la及 / 或IL-Ιβ) 同型物 249 僅有IL-la IgG 19 僅有IL-la . IgM 15 僅有IL-Ιβ IgG 2 僅有IL-Ιβ IgM 57 IL-la和 β IgG 13 IL _ 1 a 和 β IgM (請先閱讀背面之注意事項再本頁) rtf — ···· — — — — 同等物 訂 熟諳此藝者將承認或能夠確定僅使用例行的實驗，在本 文中描述本發明之特定具體實施例的許多同等物。企圖將 這類同等物包含在下列的申請專利範圍中。 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1307716 第090115948號專利申請案 中文說明書替換頁Θ4年1月、 五、發明説明（66 ) % 修正 年月相 序列表 <110>美商亞培公司 <120〉二元專一性之抗體及其製法及用途 <140> TW 090115948 <141> 2001-06-29 <150> US 60/215,379 <151> 2000-06-29 <160〉 4 <170> Patentln version 3.1 <210〉 1 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>二元專一性抗體 <400> 1
Asn Glu Ala Gin Asn lie Thr Asp Phe 1 5 <210〉 2 <211> 18 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 一元序列 71846-940126.doc - 69 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1307716 第090115948號專利申請案 A? _中文說明書替換頁(94年1月)_51 五、發明説明（67 ) <220〉 <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is Pro or Gly <400〉 2
Met Ala Phe Leu Arg Ala Asn Gin Asn Asn Gly Lys lie Ser Val Ala 1 5 10 15
Leu Xaa <210〉 3 <211> 16 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223>雜種肽 <400> 3
Thr Lys Gly Gly Gin Asp lie Thr Asp Phe Gin He Leu Glu Asn Gin 15 10 15 <210> 4 <211〉 153 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>雜種肽 <400〉 4
Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gin Gin Lys 15 10 15 71846-940126.doc - 70 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1307716 第090115948號專利申請案 A7 _中文說明書替換百(94年1月）_51 五、發明説明（68 )
Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gin 20 25 30
Gly Gin Asp Met Glu Gin Gin Val Val Phe Ser Met Gly Ala Tyr Lys 35 40 45
Ser Ser Lys Asp Asp Ala Lys lie Thr Val lie Leu Gly Leu Lys Glu 50 55 60
Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu 65 70 75 80
Gin Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu 85 90 95
Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys lie Glu He Asn Asn Lys Leu Glu Phe 100 105 110
Glu Ser Ala Gin Phe Pro Asn Trp Tyr lie Ser Thr Ser Gin Ala Glu 115 120 125
Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gin Asp lie Thr 130 135 140
Asp Phe Thr Met Gin Phe Val Ser Ser 145 150 71846-940126.doc -71 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)

Claims (1)

  1. I307ils6n5948號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(97年5月）
    六、申請專利範圍 1. 一種獲得專一地結合介白素- Ια和介白素-ΐβ之二元專一 性抗體的方法，該方法包括： 提供抗原，其中該抗原包含胺基酸序列 TKGGQDITDFQILENQ(SEQ ID N0:3)； 使抗體譜（antibody repertoire)暴露在該抗原之下；並 從該抗體譜中選擇專一地結合IL-la和IL-1 β的抗體， 措此獲付一元專'~~性抗體’其中該二元專·—性抗體不為 完整之老鼠抗體。 2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中藉著以該抗原免疫 接種動物，在活讀内使該抗體譜暴’露在該抗原之下。 3 ·根據申請專利範圍第1項之方法，'其進一步.包含由動物淋 巴細胞製備一群融合瘤，及選擇可分泌會與IL_丨α和 IL-1 β專一地結合的抗體之融合瘤。 4. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該動物係選自老鼠 、大鼠、兔子和山羊所姐成之群。 5. 根據申請專利範圍第4項之方法，其中該動物係几_丨α、 IL-1 β或IL-la與IL-Ιβ兩者缺乏之擊倒（knockout)老鼠。 6_根據申請專利範圍第4項之方法，其中該動物係經人類免 疫球蛋白基因轉殖的老鼠’因此該老鼠經抗原刺激會製 造人類抗體。 7 ·根據申請專利範圍第4項之方法，其中該動物係帶有重症 性聯合免疫缺陷病（SCID)的老鼠’其已經利用人類的乃 圍血液單核細胞或淋巴細胞或其前驅細胞重建。 8.根據申請專利範圍第4項之方法’其中該動物係且經利用 71846-970529.doc
    1307716 t、申請專利範園 致命的整體照射處理，接著利用重症性聯合免疫缺陷病 —)老鼠之，月.髓細胞放射性保護（radioprotection)，接 著移植具有功迠的人類淋巴細胞或其前驅細胞的老鼠。 根據申明專利範圍第1項之方法，其中藉著以該抗原篩選 重，·且抗體庫’在活體外使抗體譜暴露在該抗原之下。 10·根據u利範圍第9項之方法，其中該重組抗體庫係表 現於噬菌體表面上。 11·根射請專㈣圍第9項之方法，其中該重組抗體庫係表 現於酵母菌細胞表面上。 12.根據申请專利範圍第9項之方法，其中該重組抗體庫係表 現於細菌細胞表面上。 根據申β月專利範圍第9項之方法，其中該重組抗體庫係以 RNA-蛋白質融合物表現。 14·根據中請專利！^第9項之方法’其中該重組抗體庫係為 scFv庫或 Fab庫。 .. 15·根據申請專利範圍第1項之方法，其中藉著在活體内以抗 原免疫接種動物，使抗體譜暴露在該抗原之下，接著在 活體外以該抗原篩選從該動物之淋巴細胞製備的重組抗 體庫。 根據申請專利範圍第β之方法，其中藉著在活體内 原免疫接種動物，使抗體譜暴露在該抗原之下，接^ 活體外將從該動物之淋巴細胞製備之重組抗體庫進行^ 和力成熟作用。 心叮親 Π.根據申請專利範圍第】項之方法，其中藉著在活體内以抗 71846-970529.doc 本紙張尺度適财@ @家鮮(CNS) A4規格(21GX297公 A8 B8 C8 D8 1307716 --_ a、申請專利範圍 原免疫接種動物，使抗體譜暴露在該抗原之下，接著選 刀必了與該抗.原結合抗體的單一細胞，從該單一細胞 中回收重-和輕鏈可變區cDNAs。 18="專利範圍第1項之方法，其中該二元專-性抗體 1糸為完全人類抗體。 19.根據申請專利範圍第1項之方法，其中該二元專一性抗體 係為嵌合抗體。 寻几體 If申請專利範圍第1項之方法，其中該二元專-性抗體 糸為CDR·移植抗體。 21·:種單株抗體或其抗原結合部分，其中該單株抗體或其 几原結合部分可與胺基酸序列TKGGQDITDFQILENO (seq iDN0:3)結合。 Q ENQ 22.根據申請專利範圍第21項之單株抗體或其抗原結合部分 ’其中該單株抗體或其抗原結合部分係完全人類型。 狂根據申請專利範圍第21項之單株抗體或其抗原結合部分 ’其中該單株抗體或其抗原結合部分係嵌合型。 24.根^申請專利範圍第23項之單株抗體或其抗原結合部分 ，其包含老鼠可變區胺基酸序列及人類恆定區胺基酸序 列。 25·根據中請專利範圍第21項之單株抗體或其抗原結合部分 ’其中該單株抗體或其抗原結合部分係CDR-移植型。 26.根據申請專利範圍第25項之單株抗體或其抗原结合部分 ’其包含含有—或多個老鼠CDR之人類重及輕鏈可變序 列0 71846-970529.doc 8 8 8 8 ABCD 1307716 、申請專利範圍 27. 根據申請專利範圍第25項之單株抗體或其抗原結合部分 ，其包含含有一或多個人類CDR之老鼠重及輕鏈可變序 列。 28. 根據申請專利範圍第2 1項之單株抗體或其抗原結合部分 ，其中該單株抗體或其抗原結合部分係人類化型。 71846-970529.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱)
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