BG66209B1 - Методи за получаване на антитела с двойна специфичност - Google Patents

Методи за получаване на антитела с двойна специфичност Download PDF

Info

Publication number
BG66209B1
BG66209B1 BG107483A BG10748303A BG66209B1 BG 66209 B1 BG66209 B1 BG 66209B1 BG 107483 A BG107483 A BG 107483A BG 10748303 A BG10748303 A BG 10748303A BG 66209 B1 BG66209 B1 BG 66209B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
antibody
antigen
animal
antibodies
library
Prior art date
Application number
BG107483A
Other languages
English (en)
Other versions
BG107483A (bg
Inventor
Albert Collinson
Tariq Ghayur
George Avgerinos
Richard Dixon
Zehra Kaymakcalan
Original Assignee
Abbott Laboratories
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Laboratories filed Critical Abbott Laboratories
Publication of BG107483A publication Critical patent/BG107483A/bg
Publication of BG66209B1 publication Critical patent/BG66209B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/245—IL-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/545—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

Предоставят се методи за получаване на антитела с двойна специфичност съгласно изобретението. Антителата или участъците на антитела съгласно изобретението се използват за откриване на два различни, но структурно свързани антигена (например IL-1алфа и IL-1бета) и за инхибиране на активността на антигените (например при субект човек, страдащ от нарушение, при което се определя IL-1алфа и/или IL-1бета активността.

Description

(54) МЕТОДИ ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА АНТИТЕЛА С ДВОЙНА СПЕЦИФИЧНОСТ
Предшестващо състояние на техниката
Имунната система на бозайниците включва В лимфоцити, които, в своята цялост, експресират разнообразие от антитела, които включват стотици милиарди различни специфичности на антитела. Нормалният имунен отговор на определен антиген включва избор от това разнообразие на едно, или повече антитела, които специфично свързват антигена, и успехът на имунния отговор се базира, поне отчасти, на способността на тези антитела специфично да разпознават (и изцяло да елиминират) стимулиращия антиген и “да игнорират” други молекули от заобикалящата среда на антителата.
Използването на антитела, които специфично разпознават точно определен антиген, води до развитието на технология на моноклонално антитяло. Стандартната хибридомна технология позволява сега получаването на антитела, притежаващи единична специфичност за представляващия интерес антиген. В последно време се развиха техники зарекомбинантно антитяло, като скрининг на библиотеки на in vitro антитела. Тези техники позволяват, също така, продуциране на антитела с единична специфичност за представляващия интерес антиген.
Антитела, притежаващи специфичност за единичен антиген мишена, поне при известни обстоятелства, проявяват нежелана кръстосана реактивност, или фоново свързване с други антигени. Тази кръстосана реактивност, или фоново свързване са непредсказуеми (т.е., не е възможно да се предскаже с кой антиген ще влезе в кръстосана реакция антитялото). Освен това, обикновено се отличава от свързването на специфичен антиген, тъй като характерно представлява само една малка част от способността за свързване на антитялото (например, 1%, или помалко от общото свързване на антитялото) и характерно се наблюдава единствено при високи концентрации на антитяло (например, 1000 пъти, или повече, концентрации, които изискват наблюдение на специфичното свързване на антигена). Въпреки че съществуват антигени, които могат да принадлежат на структурно свър зани семейства протеини, отговорът на антитялото към определен член на семейството е високо специфичен. В допълнение, съществуват примери на членове на семейства протеини (например, членове на IL-1 и TNF семейства), които се свързват към същия рецептор, към съставна част на рецептора, или към структурно свързани рецептори, при което моноклонални антитела срещу един член на семейството не проявяват висока кръстосана реактивност към други членове на семейството. Би могло да съществуват две причини за тази липса на кръстосана реактивност на Mabs спрямо различни членове на семейството. Първо, при стандартното получаване на хибридоми се търсят единствено някои антитела с висока специфичност/афинитет за антигена-цел, след което се проверява за кръстосана реактивност, или фоново свързване на няколкото избрани антитела. Второ, въпреки че протеините в семейството са структурно свързани, те могат да имат изключителни, неприпокриващи се имунодоминантни епитопи. Следователно, MAbs получени чрез използване на протеин с пълна дължина могат да не влизат в кръстосана реакция с други структурно свързани протеини.
Съществуват също така, примери за моноклонални антитела, получени срещу антиген от един вид, които специфично биха се свързали към същия функционален антиген в други видове. Например, антимише X антитяло лесно свързва човешки антиген X. Това се дължи на факта, че споделят значителна сходност на последователности и структурна сходност, въпреки че не са идентични. Въпреки това, такива антитела, влизащи в междувидова кръстосана реакция не съставят антителата с “двойна специфичност”, тъй като притежават специфичност за същия антиген от различни видове.
Следователно са необходими моноклонални антитела, притежаващи предсказуема двойна, или множествена специфичност, което представлява антитела, притежаващи предсказуема двойна, или същинска специфичност за два, или повече различни антигена.
Техническа същност на изобретението
Настоящото изобретение предоставя методи за получаване на антитела, притежаващи двойна специфичност за най-малко два струк50
66209 Bl турно свързани, но въпреки това различни антигена. Методът обикновено се състои в осигуряване на антитяло, което включва обща структурна характеристика на двете различни, но структурно свързани молекули; представяне на разнообразието от антитела на антигена; и избор от разнообразието на антитяло, което специфично свързва двете различни, но структурно свързани молекули към така полученото антитяло с двойна специфичност. При клиничните установки някои членове от същото семейство протеини могат да допринесат за различните симптоми на протичането на едно заболяване. Следователно, използването на антитяло с двойна специфичност съгласно изобретението, което свързва членове на едно и също семейство протеини, за блокиране на функциите на повече от един член от семейството протеини, може да бъде благотворно за облекчаване на болестните симптоми, или за прекъсване самия процес на заболяване. Освен това, такива антитела с двойна специфичност съгласно изобретението се използват за откриване на структурно свързани антигени, за пречистване на структурно свързани антигени, и при диагностичните изследвания, включващи структурно свързани антигени.
При един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, антигена се проектира на основата на съседен топологичен участък на идентичност между двете различни, но структурно свързани молекули. Например, двете различни, но структурно свързани молекули могат да бъдат протеини, и антигенът може да бъде пептид, включващ аминокиселинна последователност от съседния топологичен участък на идентичност между двата протеина.
При един друг вариант за изпълнение на изобретението, антигена се проектира на основата на структурно имитираща бримка на обичайно срещано нагъване на двете различни структурно свързани молекули. Например, антигенът може да бъде цикличен пептид, който структурно имитира бримка на обичайно срещано нагъване на двата различни структурно свързани протеина.
При един друг вариант за изпълнение на изобретението, антигена се проектира на основата на слепване заедно на редуващи се и/или припокриващи се участъци на двете различни, но структурно свързани молекули, за създава не на хибридна молекула. Например, антигенът може да е хибриден пептид, получен чрез слепване заедно на редуващи се и/или припокриващи се аминокиселинни последователности на два различни, но структурно свързани протеина.
В един друг вариант за изпълнение на изобретението, антигенът може да включва една, или повече различни, но структурно свързани молекули и методът обхваща избиране на антитела, които специфично разпознават и двете свързани молекули.
В метода на изобретението разнообразието на антителата може да бъде предоставено на действието на антигена, представляващ интерес in vivo или in vitro. Например, при един вариант за изпълнение, предоставянето на разнообразието на антителата на действието на антигена включва имунизиране на животно in vivo с антигена. Този in vivo подход може освен това да включва приготвянето на панел от хибридоми от лимфоцити на животното, и избиране на хибридома, която секретира антитяло, което специфично свързва двете различни, но структурно свързани молекули. Имунизираното животно може да бъде, например, мишка, плъх, заек, или коза, или трансгенна версия на което и да е от горепосочените животни, като мишка, която е трансгенна за човешки гени на имуноглобулин, така че мишката да произвежда човешките антитела при антигенно стимулиране. Друг вид животни, които могат да бъдат имунизирани, включват мишки с тежка комбинирана имунна недостатъчност (SCID), които могат да бъдат възстановени с моноядрени клетки от човешка периферна кръв (hu-PBMC-SCID химерна мишка), или лимфоидни клетки, или техни предшественици, и мишки, които са лекувани с летално общо телесно облъчване, последвано от защита срещу радиация с клетки от костен мозък на тежка комбинирана имунна недостатъчност (SCID) мишка, следвано от присаждане на функционални човешки лимфоцити (Trimera система). Друг вид животно, което може да бъде имунизирано, е животно (например, мишка), чийто геном “нокаутиран” (например, чрез хомоложна рекомбинация) за ендогенен(ни) ген(и), кодиращ(и) антигена(и), представляващ(и) интерес, където при имунизиране с антигена(ите), представляващ(и) интерес, “нокаутираното” животно разпознава антигена(ите) като чужд(и).
66209 Bl
При друг вариант за изпълнение на изобретението, разнообразието на антителата може да бъде предоставено на действието на антигена in vitro, чрез скриниране на библиотека на рекомбинантни антитела с антигена. Библиотеката на рекомбинантни антитела може, например, да се експресира на повърхността на бактериофаг, или на повърхността на дрождеви клетки, или на повърхността на бактериални клетки. При различни варианти за изпълнение библиотеката на рекомбинантни антитела е, например, scFv библиотека, или Fab библиотека. При друг вариант за изпълнение на изобретението, библиотеки на антитела се експресират като РНК-протеин сливания.
Друг подход за получаване на антитела с двойна специфичност включва комбиниране на in vivo и in vitro подходи, като разнообразието на антителата може да бъде предоставено на действието на антигена чрез in vivo имунизиране на животно с антигена, следвано от in vitro скриниране на библиотека на рекомбинантни антитела, получена от лимфоидни клетки на животното с антигена. Друг подход включва предоставяне на разнообразието на антитела на действието на антигена чрез in vivo имунизиране на животно с антигена, следвано от in vitro афинитетно узряване на библиотека на рекомбинантни антитела, получена от лимфоидни клетки на животното. Друг подход включва предоставяне на разнообразието на антитела на действието на антигена чрез in vivo имунизиране на животно с антигена, следвано от селекция на единично антитяло, продуциращо клетки, които секретират представляващо интерес антитяло, възстановяване на тежката и леката верига на вариабилната област на сДНК-и от тези избрани клетки (например, чрез PCR) и експресиране на тежката и леката верига на вариабилните области у клетки гостоприемници от бозайник in vitro (посочен като метод на избрано лимфоцитно антитяло, или SLAM), като по този начин се дава възможност за по-нататъшна селекция и обработване на селекционираните последователности на гена на антитялото. Освен това, моноклонални антитела могат да бъдат селекционирани чрез експресионно клониране чрез експресиране на гените на тежката и леката верига на антитялото у клетки на бозайник, и селекциониране на клетки на бозайник, които секретират антитяло, притежаващо необходимата специфичност на свързване.
Методите на изобретението позволяват получаването на различни видове антитела с двойна специфичност, включително напълно човешки антитела, химерни антитела, и CDR-присадени антитела и техни антиген свързващи участъци. Предоставят се, също така, антителата с двойна специфичност, получени съгласно метода на изобретението. Предпочитано антитяло с двойна специфичност, съгласно изобретението е такова, което специфично свързва интерлевкин-1алфа и интерлевкин-1бета. Такова антитяло с двойна специфичност може да се използва при методи за откриване на 1Ь-1алфа, или IL-16eTa, включващи довеждането в контакт на Ш-1алфа, или IL-16eTa с антитялото с двойна специфичност, или негов антиген свързващ участък, така че да бъде открит и IL-1 алфа, или IL-16eTa. Неутрализиращо антитяло с двойна специфичност също може да се използва при методи за инхибиране на 1Ь-1алфа, или IL-1 бета активност, включващи довеждането в контакт на ПИалфа, или 1Б-1бета с антитялото с двойна специфичност, или негов антиген свързващ участък, така че активността на Ш-1алфа, или IL-1 бета да се инхибира. Такива антитела с двойна специфичност могат да се използват също при методи за лечение на интерлевкин-1-свързано нарушение, включващи прилагане върху субекта, страдащ от интерлевкин-1-свързано нарушение, на антитяло с двойна специфичност, или негов антиген свързващ участък.
При един друг вариант за изпълнение, изобретението предоставя метод за получаване на библиотека на антитяло, или антиген свързващ негов участък, чрез осъществяване на следните етапи: а) получава се библиотека А на рекомбинантна тежка верига, или на антиген свързващ негов участък, от разнообразието на антитела, получена от предоставянето на първия антиген; Ь) получава се библиотека В на рекомбинантна лека верига, или на антиген свързващ негов участък, от разнообразието на антитела, получена от предоставянето на първия антиген; с) получава се библиотека С на рекомбинантна тежка верига, или на антиген свързващ негов участък, от разнообразието на антитела, получена от предоставянето на втория антиген; d) получава се библиотека D на рекомбинантна лека верига, или на антиген свързващ негов участък,
66209 Bl от разнообразието на антитела, получена от предоставянето на втория антиген; и е) комбиниране на библиотека А на рекомбинантна тежка верига, или на антиген свързващ негов участък, с библиотека D на рекомбинантна лека верига, или на антиген свързващ негов участък, до получаването на библиотека X на антитяло, или антиген свързващ негов участък, и/или комбиниране на библиотека С на рекомбинантна тежка верига, или на антиген свързващ негов участък, с библиотека В на рекомбинантна лека верига, или на антиген свързващ негов участък, до получаването на библиотека Y на антитяло, или на антиген свързващ негов участък.
При един друг вариант за изпълнение на настоящото изобретение, непосредствено предхождащия метод на изобретението може, освен това, да включва етапа на комбиниране на библиотека X на антитяло, или на антиген свързващ негов участък с библиотека Y на антитяло, или на антиген свързващ негов участък до получаването на библиотека Z на антитяло, или на антиген свързващ негов участък.
При един друг вариант за изпълнение, настоящото изобретение е насочено към библиотеки X, Y и Z на антитяло, или на антиген свързващ негов участък.
При един друг вариант за изпълнение, методът съгласно настоящото изобретение позволява идентифицирането на антитяло с двойна специфичност, на антиген свързващ негов участък чрез селекциониране от библиотеки X, Y и/ или Z на антитяло, или на антиген свързващ негов участък, който свързва както първия, така и втория антиген.
При един друг вариант за изпълнение, настоящото изобретение е насочено към антитялото с двойна специфичност; получено, или селекционирано по който и да е от методите на настоящото изобретение.
При един друг вариант за изпълнение, настоящото изобретение е насочено също така към нуклеотидната последователност; кодираща всеки член от библиотеки X, Y и Z на антитяло, или на антиген свързващ негов участък; както и до антитяло с двойна специфичност, или до негов антиген свързващ участък, до вектор включващ горепосочените нуклеотидни последователности, и до клетки трансфектирани с горепосочения вектор.
Съгласно предпочитан вариант за изпълнение на настоящото изобретение, първият и вторият антиген, се избират независимо от група, състояща се от протеини, полипептида и пептида, при условие, че първият и вторият антиген не са един и същ. При един друг вариант за изпълнение на настоящото изобретение, протеините, полипептидите и пептидите са секретирани протеини, или повърхностни рецептори, а секретирания протеин се избира от група, състояща се от IFN, TNF и интерлевкин, IP-10, PF4, GRO, 9ЕЗ, ЕМАР-П, CSF, FGF и PDGF. При друг предпочитан вариант за изпълнение на настоящото изобретение, първият антиген е IL-1 алфа, а вторият антиген е IL-1 бета.
Подробно описание на изобретението
Изобретението се отнася до проектирането и използването на антигени за генериране на антитела с двойна специфичност, т.е антитела, притежаващи специфичност за най-малко две различни, но структурно свързани молекули, така както и до селекцията, получаването и използването на такива антитела с двойна специфичност. Структурната връзка на антигените от изобретението може да е през целия антиген (например, протеин), или само в някои структурно свързани области. Изобретението предоставя метод за получаване на антитяло с двойна специфичност, което специфично свързва две различни, но структурно свързани молекули, при което методът включва:
предоставяне на антиген, който включва обща структурна характеристика;
предоставяне на многообразието на антитяло на антигена; и избор от многообразието на антитяло, което свързва две различни, но структурно свързани молекули, за да се получи по този начин антитялото с двойна специфичност.
Трябва да се отбележи, че, докато настоящото изобретение се описва като разпознаване на два различни, но свързани антигена, трябва да се разбира че терминът “антитяло с двойна специфичност” включва антитела, които специфично разпознават даже повече от два различни, но свързани антигена, такива като антитела, които разпознават три, четири, пет, или повече структурно свързани, но различни, антигени.
66209 Bl
Освен това терминът “различни, но структурно свързани антигени” се счита, че включва антигени (например, протеини), чиито общи структури са свързани, така както антигени (например, протеини), които делят една, или повече структурно свързани области, но иначе са несвързани. Следователно “различни, но структурно свързани” антигени могат да бъдат, например, два протеина, които са членове на едно и също семейство протеини, притежаващи обща цялостна структура, или могат да бъдат, например, два протеина, чиято цялостна структура е различна (несвързани), но всеки от тях включва структурно свързан домен.
Могат да се използват различни видове антигени, за да се предизвика антителата на изобретението и могат да се приложат различни методи за получаване на антитела за получаване на антитялото с двойна специфичност на изобретението, както се разглежда подробно подолу в следващите раздели.
I. Антигени с двойна специфичност
За да се получи антитялото с двойна специфичност от изобретението, антителата се добиват антитела срещу антиген, способен да предизвика антитела с двойна специфичност. В изобретението могат да се използват множество различни видове антигени с двойна специфичност, и в следващите подраздели се описва проектирането на различни видове антигени с двойна специфичност.
А. Съседни топологични области
При един вариант за изпълнение, антигена с двойна специфичност съгласно изобретението включва съседна топологична област на идентичност, и/или подобност между две различни, но структурно свързани молекули, към които трябва да се добие антитяло с двойна специфичност. За предпочитане, антигенът съдържа най-голямата (например, най-дългата) съседна топологична област на идентичност, и/или подобност между две различни, но структурно свързани молекули. За предпочитане, двете различни, но структурно свързани молекули са протеини, и антигенът с двойна специфичност включва линеен пептид, съответстващ на най-голямата (например, най-дългата) съседна топологична област на идентичност, и/или подобност между двата протеина. Подходящата област на идентичност/подобност, която се избира, е за предпочитане област, свързваща рецептор, или лиганд, въпреки че могат да се използват и други области на идентичност/подобност.
За да се определят съседни топологични области на идентичност между две молекули (например, протеини), двете молекули (например, протеини) се сравняват (например, хомоложно моделиране, структурна информация, или подреждане) и се идентифицират идентични, или подобни области. За протеините може да се използва алгоритъм на подреждане, за да се създаде оптимално подреждане, и да се идентифицира най-голямата (например, най-дългата) съседна топологична област на идентичност, и/или подобност между двата протеина. Предпочитан, неограничаващ пример за математичен алгоритъм, използван за сравняване на две последователности е алгоритъмът на Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, модифициран както в Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Един такъв алгоритъм се включва в NBLAST и XBLAST програмите на Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. За да се получи подреждане с дупки за сравнителни цели, може да се използва Gapped BLAST, както е описано от Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Reasearch 25(17):33893402. При използване на BLAST и Gapped BLAST програмите, могат да се използват параметрите по подразбиране на съответните програми (например, XBLAST и NBLAST). Виж http:// www.ncbi.nlm.nih.gov. Алтернативен математически алгоритъм, който може да бъде използван, е този, използван в ALIGN програмата, описана от Myers and Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17.
Когато се избере подходяща област на идентичност/подобност, антигенът с двойна специфичност, съответстващ на областта, може да се синтезира химически. Например, за пептидните антигени, пептида може да се синтезира чрез стандартни методи на пептиден синтез. При един вариант на изпълнение, пептидният антиген включва L аминокиселини. При други варианти на изпълнение, пептидният антиген може частично, или изцяло да бъде съставен от D аминокиселини. Пример за проектиране на антигена с двойна специфичност на базата на съседна топологична област на идентичност, и/или подобност между два различни, но структурно
66209 Bl свързани протеина се описва подробно в пример 1.
B. Циклични пептиди, имитиращи структурна бримка
При един друг вариант на изпълнение, антигенът с двойна специфичност съгласно изобретението включва циклична молекула, за предпочитане цикличен пептид, която структурно имитира бримка на обичайно срещано нагъване на двете различни структурно свързани молекули (например, протеини), към които антителата с двойна специфичност са добити. За получаването на такъв вид антиген, се сравняват структурите на двете свързани молекули и се идентифицира бримка на обичайно срещано нагъване на двете молекули. Може да се използва стандартен молекулярен анализ на моделиране и кристалографски анализ, за да се добави идентифициране на такива бримки на обичайно срещано прегъване. Идентифицират се идентични и подобни области (например, аминокиселинни последователности между два протеина) и може да се проектира консенсус последователност за подобни, но неидентични области. Линейна молекула, например, линеен пептид, се проектира на основата на тези подобни и идентични области, и тази линейна молекула може след това да бъде циклизирана чрез известни химични начини, за да се създаде антиген, имитиращ бримката. Например, може да се добави пролин и глицин към края на линейния пептид, за да се позволи циклизирането на пептида. Пример за проектиране на антигена с двойна специфичност на базата на цикличен пептид, имитиращ структурна бримка поделена от два различни, но структурно свързани протеина, се описва подробно в пример 2.
C. Хибридни молекули
При един друг вариант за изпълнение на настоящото изобретение, антигенът с двойна специфичност съгласно изобретението включва хибридна молекула, за предпочитане хибриден пептид, който включва редуващи се и/или припокриващи се участъци на двете различни, но структурно свързани молекули (протеини), към които са добити антителата с двойна специфичност. За да се получи такъв вид антиген, се сравняват структурите на двете молекули, и се идентифицират припокриващите се участъци (т.е., области на идентичност), така както и не идентичните области между двете молекули. Получава се хибридна молекула (например, хибриден пептид, когато двете свързани молекули са протеини), която за предпочитане да включва редуващи се участъци (например, аминокиселинни последователности) от всяка една от двете молекули, така както и припокриваща се област, която е обща за двете молекули. Една такава молекула може да се опише схематично като: X-YZ, където Y представлява област на идентичност, или на строга подобност между двете свързани молекули (т.е., припокриваща се област), X представлява област от една от свързаните молекули, и Z представлява област от другата от свързаните молекули. Пример за проектиране на антигена с двойна специфичност на базата на хибриден пептид, съставен от последователности на два различни, но структурно свързани протеина, се описва подробно в пример 3.
Друг вид хибридна молекула е такава, в която е бил въведен пептид в протеин с цяла дължина (отбелязван като протеин “мишена”). Избират се пептиди, които представляват функционални области на два различни, но структурно свързани протеина, например, области за взаимодействие на рецептора. Такива пептиди са предпочитани в настоящото като функционални пептиди. След това се въвежда функционален пептид на един от свързаните протеини в протеин с цяла дължина на другия свързан протеин, или алтернативно несвързан протеин. Идентифицира се, например, пептид от IL-1 алфа, съответстващ на област за взаимодействие на рецептора от 1Ь-1алфа, и този функционален пептид от IL-1 алфа се въвежда в IL-1 бета протеин с цяла дължина, за да бъде създадена хибридна IL-1 алфа/IL-1 бета молекула. Подобно, идентифицира се пептид от ПИбета, съответстващ на област за взаимодействие на рецептора от IL1 бета, и този функционален пептид от IL-1 бета, се въвежда в 1Ь-1алфа протеин с цяла дължина, за да бъде създадена хибридна IL-1 алфа/IL-1 бета молекула. Това въвеждане на функционалния пептид в свързания протеин с цяла дължина ограничава функционалния пептид в двата края, и поддържа нагънатата структура на пептида.
В случай на IL-1 алфа/IL-1 бета хибрид, функционалният пептид за предпочитане се инсертира (замества естествените аминокиселини) в област мишена, представляваща обичайно на
66209 Bl гънатите структури на IL-1 алфа и 1Ь-1бета. Такива области могат да бъдат открити по цялата дължина на протеина (например, в N-терминалната област, в средата на протеина, в С-терминалната област). Освен това, функционални пептиди, представляваща обичайно нагънатите IL1 алфа/IL-1 бета структури могат също така да бъдат инсерирани в ирелевантен протеин, като албумин, или някой друг естествено срещан в природата протеин. В този случай предпочитаният сайт за инсериране за пептида е област, която позволява пептида да поддържа желаната нагъната структура. Следователно, инсерционните сайтове могат да бъдат или при N-края, или в средата на протеина, или при С-края на протеина. Позиционирането на пептида, в който и да е естествено срещан в природата протеин се избира така, че да имитира структурните ограничения, поставени над него от нативния протеин, от който той произлиза. Докато функционалният пептид може просто да бъде инсериран в протеина мишена, така че аминокиселините на функционалния пептид да се добавят към протеина мишена, за предпочитане аминокиселините на функционалния пептид заместват участък от протеина мишена, в който той е инсериран.
Като неограничаващ пример се конструира хибридна молекула за използване като антиген с двойна специфичност за добиване на антитела с двойна специфичност за 1Ь-1алфа и IL1бета, при което функционален пептид, съответстващ на специфичен структурен елемент или на IL-1 алфа, или на IL-1 бета, се въвежда в IL-1 бета, или 1Ь-1алфа в цяла дължина в еквивалентната структурна позиция. Избраната хибридна молекула замества остатъци 160-176 на IL-1 бета с остатъци 168-184 на 1Ь-1алфа. Получената молекула притежава следната аминокиселинна последователност, в която заместените 1Ь-1алфа последователности (остатъци 168-184) са подчертани:
APVRSLNCTLRDSQQKSLVMAGPY ELKALHLQGQDMEQQWFS MGAYKSSKDDA KIW1LGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPK NYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFP NWYISTSQAENMPVFL GGTKGGQDIT DFTMQFVSS (SEQ ID NO: 4)
Тази молекула може да се получи при използване на стандартни техники от молекулярната биология (например клониране, полимеразна верижна реакция), при използване на обществено достъпните сДНК последователности на IL1 алфа и IL-1 бета, и техники на експресиране на рекомбинантен протеин. Хибридна сДНК може да се получи, да се въведе в подходящ експресионен вектор, и полипептида може да се експресира чрез въвеждане на експресионен вектор в подходяща клетка гостоприемник.
D. Пептиди на базата на участъци на хидрофобност
При друг вариант за изпълнение, антигена с двойна специфичност съгласно изобретението се избира на основата на участъци на хидрофобност, за да се изберат очакваните пептиди, така че да са високо антигенни. Например, антигени индекси на пептиди могат да се изчислят при използване на компютърен софтуер, както е описано от Wolf (CABIOSq 4(1), 181-186 (1988)). Представляващи интерес области за свързване на антитяло могат да се изберат, за да се увеличи до максимум вероятността за антигенност.
E. Имунизиране с клетки трансфектирани с антиген
При друг вариант за изпълнение, антитяло с двойна специфичност съгласно изобретението, се получава чрез имунизиране с клетки трансфектирани с антиген (т.е., антигените с двойна специфичност съгласно изобретението могат да бъдат клетки трансфектирани с антиген). Могат да се генерират клетъчни линии, които стабилно да експресират двата различни, но структурно свързани антигена, или техни хибридни молекула. Могат да се генерират, например, клетъчни линии, които стабилно да експресират 1Ь-1алфа, или 1Ь-1бета, или IL1 алфа/IL-1 бета хибридна молекула (например SEQ ID NO: 4). Представляващите интерес молекули могат да бъдат секретирани от клетките (в случай на разтворими протеини), или могат да се експресират на повърхността на клетките (в случай на рецептори, ензими). Доставянето на гени в клетката гостоприемник, което да позволи експресията на антигените от клетките гостоприемник може да се осъществи чрез голям брой конвенционални начини, включително, но без да се ограничава до, трансфекция, електропорация, клетъчно сливане, липофекция, бомбардиране с частици, микроинжектиране, или вирусно инфектиране. Клетъчните линии, които
66209 Bl експресират антигените, представляващи интерес, могат да се трансплантират по един или друг начин (интраперитонеално, подкожно, интрамускулно, и други подобни) в животно, представляващо интерес, за получаване на антитела. За предпочитане клетките експресират протеини с цяла дължина. Възможно е, също така, да се експресират и антигенни фрагменти. За разтворими протеини, протеините за предпочитане се секретират от клетките. За генериране на антитяло с двойна специфичност за извънклетъчния домен на два близко свързани рецептора, рецепторите за предпочитане се експресират върху клетъчната повърхност.
F. Имунизиране с една от структурно свързаните молекули
При друг вариант за изпълнение антигенът с двойна специфичност е просто един от двете различни, но структурно свързани молекули, към които трябва да се добият антитела с двойна специфичност. Една от двете свързани молекули се използва като средство за имунизиране, след което полученото множество антитела се скринира за антитела, които свързват, и по-предпочитано неутрализират, и двете от двете различни, но структурно свързани молекули. Например, някой може да имунизира или с IL1алфа, или с 1Ь-1бета, след което да скринира за алфа/бета байндери, и по-предпочитано неутрализатори. Както се използва в този вариант за изпълнение, терминът “имунизира” се счита, че широко обхваща предоставянето на множеството антитела на антигена, като IL-алфа, или 1Ь-1бета, както in vivo, така и in vitro. Следователно, този вариант за изпълнение обхваща имунизиране на животно или с IL-алфа, или IL-16eTa, и скриниране на получените антитела, добити за селекция на тези антитела, които свързват и IL-алфа, и Ш-1бета, така както и за скриниране на библиотека на рекомбинантно антитяло in vitro или с IL-алфа, или IL-1 бета, с последваща селекция на рекомбинантни антитела, които свързват и IL-алфа, и Ш-1бета.
II. Методи за получаване на антитела с двойна специфичност
За получаване на антитяло с двойна специфичност съгласно изобретението, множество антитела (както in vivo, така и in vitro) се добива за антиген с двойна специфичност, получен както е описано в предходния раздел, и от множест вото се избира подходящо антитяло с двойна специфичност. Двата елемента на разпознаване на антитяло от антиген са структурни елементи на разпознаване и са на основата на афинитет на узряване при специфични молекулярни взаимодействия. По време на естествения имунен отговор лесно се развиват антитела с нисък афинитет, които разпознават структурни мотиви (например разпознаването на един антиген от някои модели на рецептори за разпознаване), и в по-ранната фаза на имунния отговор това се следва от соматични мутации за увеличаване на афинитета на няколко клона. Развити са различни in vivo и in vitro методи за имитиране на този естествен феномен. Антитела с двойна специфичност с нисък афинитет могат да бъдат генерирани чрез който и да е от in vivo и in vitro методите, описани в настоящото, a Mabs с двойна специфичност с висок афинитет могат да бъдат получени чрез методи на соматичен мутагенез, описани в настоящото. Освен това, за да се оптимизира Mabs с двойна специфичност с висок афинитет, могат да се получат ко-кристални структури на Mabs с нисък афинитет с желаните антигени. Получената структурна информация може да насочва и друго усилване на афинитета чрез изменение (мутиране) специфичните контактни остатъци на Mabs, за да се засилят специфичните молекулярни взаимодействия, както е описано в настоящото.
Методи за получаване на антитела с двойна специфичност, които използват in vivo подходи, in vitro подходи, или тяхна комбинация, са описани подробно в следващите подраздели.
A. in vivo подходи
Стандартен in vivo подход за получаване на антитела е чрез имунизиране на подходящ животински субект с антиген, като по този начин се предоставя in vivo множеството антитела на антиген, последвано от възстановяване на представляващо интерес антитяло, или представляващи интерес антитела от животното. Такъв подход може да се приспособи към получаването на антитела с двойна специфичност, чрез използване на антиген с двойна специфичност, и селекциониране за антитела, които специфично разпознават двете структурно свързани молекули, представляващи интерес. Антитела с двойна специфичност могат да се получат чрез имунизиране на подходящ субект (например,
66209 Bl заек, коза, мишка, или друг бозайник, включително трансгенни и knockout версии на такива бозайници) с имуногенен състав на антиген с двойна специфичност. Един подходящ имуногенен състав може да съдържа, например, химически синтезиран, или рекомбинантно експресиран антиген с двойна специфичност. Съставът може, също така, да включва добавка, такава като Freund’s цялостна, или нецялостна добавка, или подобно имуностимулиращо съединение. Освен това, когато се използва за добиване на антитела, по-специално in vivo имунизация, антиген с двойна специфичност съгласно изобретението може да се използва самостоятелно, или по-предпочитано се използва като конюгат с носител протеин. Такъв подход за засилване отговорите на антитяло е добре известен в областта на техниката. Примерите за подходящи протеини носители, към които антиген с двойна специфичност може да се конюгира, включват keyhole limpet хемоцианин (KLH) и албумин.
Антитела-продуциращи клетки могат да се получат от субекта и да се използват за получаване на моноклонални антитела чрез стандартни техники, такива като техниката хибридома, оригинално описана от Kohler and Milstein (1975), Nature 256: 495-497) (виж, също така, Brown et al. (1981) J. Immunol. 127&539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31; и Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 19:269-75). Технологията за получаване на хибридоми на моноклонално антитяло е добре известна (виж R. Н. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M. L. Getter et al. (1977) Somatic Cell Genet., 3:231-36). Накратко, еднаимортализирана клетъчна линия (характерно миелома) се слива към лимфоцити (характерно спленоцити, или клетки от лимфен възел, или лимфоцити от периферна кръв) от бозайник, имунизиран с имуноген с двойна специфичност, както е описано по-горе, и супернатантата на културата от получените хибридома клетки се скринират, за да се идентифицира хибридома, продуцираща моноклонално антитяло с двойна специфичност за двете различни, но структурно свързани молекули, представляващи интерес. Който и да е от много добре известните протоколи, използвани за сли ване на лимфоцити и имортализирани клетъчни линии може да се приложи за целите на генериране на моноклонални антитела с двойна специфичност (виж, например, G. Galfre et al. (1977) Nature 266:550-52; Gefter et al. Somatic Cell Genet., цитирано по-горе; Lerner, Yale J. Biol. Med., цитирано по-горе; Uenneth, Monoclonal Antibodies, цитирано по-горе). Освен това, всеки специалист в областта на техниката ще прецени, че съществуват много вариации на такива методи, които също могат да се използват. Характерно, имортализирана клетъчна линия (например, клетъчна линия миелома) е производна от същите видове бозайници както лимфоцитите. Например, миши хибридоми могат да се получат чрез сливане на лимфоцити от мишки, имунизирани с имуногенен състав съгласно изобретението с имортализирана миша клетъчна линия. Предпочитани имортализирани клетъчни линии са миши миелома клетъчни линии, които са чувствителни към културална среда, съдържаща хипоксантин, аминоптерин и тимидин (“НАТ среда”). Които и да са от многото миеломни клетъчни линии могат да се използват като партньор за сливане съгласно стандартни техники, например, P3-NS/l-Ag4-l, РЗx63-Ag8,653, или Sp2/O-Agl4 миеломни линии. Тези миеломни линии са достъпни чрез American Type Culture Collection *ATCC), Rockville, Md. Характерно, НАТ-чувствителни миши миеломни клетки се сливат към миши спленоцити, използвайки полиетилен гликол (“PEG”). Хибридома клетки, получени от сливането след това се селекционират, използвайки НАТ среда, която убива несляти и непродуктивно сляти миеломни клетки (несляти спленоцити се оцветяват след няколко дни, понеже те не са трансформирани). Хибридома клетки, продуциращи моноклонални антитела, които специфично разпознават двете структурно свързани молекули, представляващи интерес, се идентифицират чрез скриниране на супернатантите на хибридома културата за такива антитела, например, като се използва стандартно изследване ELISA, за да се изберат тези антитела, които специфично могат да свързват двете свързани молекули.
В зависимост от вида на желаното антитяло, различни животни гостоприемници могат да се използват за in vivo имунизация. Може
66209 Bl да се използва гостоприемник, който самият експресира ендогенна версия на антигена(ите), представляващ(и) интерес, или, алтернативно, може да се използва гостоприемник, който е направен с недостатъчност в ендогенна версия на антигена(ите) представляващ(и) интерес. Например, показано е, че мишки, направени с недостатъчност за посочен ендогенен протеин чрез хомоложно рекомбиниране на съответния ендогенен ген (т.е., “Knockout” мишки) извличат хуморален отговор към протеина, когато са имунизирани с него, и по този начин могат да бъдат използвани за продуцирането на моноклонални антитела с висок афинитет към протеина (виж, например, Roes, J. et al. (1995) J. Immunol. Methods 183:231-237; Lunn, Μ. P. et al. (2000) J. Neurochem. 75:404-412).
За получаване на нечовешки антитела (например, срещу човешки антиген с двойна специфичност), различни бозайници, различни от човек, са подходящи като гостоприемници за продуциране на антитела, включително, но без да се ограничава от, мишки, плъхове, зайци и кози (и техни knockout версии), въпреки че мишките са предпочитани за продуциране на хибридоми. Освен това, за продуциране на изцяло човешки антитела срещу човешки антиген с двойна специфичност, могат да се използват гостоприемници животни различни от човек, които експресират множество човешки антитела. Такива животни различни от човек включват трансгенни животни (например, мишки), носещи трансгени на човешки имуноглобулин, huPBMC-SCID химерни мишки, и човек/мишка радиационни химери, всеки един от които се дискутира по-долу.
Така, съгласно един вариант за изпълнение на изобретението, животното, което се имунизира с антиген с двойна специфичност е бозайник, различен от човек, за предпочитане мишка, която е трансгенна за трансгени на човешки имуноглобулин, такива, които бозайника, различен от човек (например, мишка) превръща в човешки антитела след антигенно стимулиране. При такива животни, характерно, се внася конфигурация на трансгени на тежка и лека верига на имуноглобулин от човешка зародишна линия в животни, които са били проектирани така, че техните ендогенни локоси на тежка и лека верига са инактивирани. При антигенно стимулиране на такива животни (например, с човешки антиген), се продуцират антитела, производни на човешки имуноглобулинни последователности (т.е., човешки антитела), и човешки моноклонални антитела могат да се получат от лимфоцити на такива животни чрез стандартни хибридома технологии. За допълнително описание на трансгени мишки с човешки имуноглобулин и на тяхното използване при продуцирането на човешки антитела, виж, например, US Patent No. 5,939,598, РСТ Publication No. WO 1996/033735, PCT Publication No. WO 1996/034096, PCT Publication No. WO 1998/024893 и PCT Publication No. WO 1999/053049 to Abgenix Inc., и US Patent No. 5,545,806, No. 5,625,126, No. 5,633,425, No. 5,661,016, No. 5,770,429, No. 5,814,318, No. 5,877,397, и PCT Publication No. WO 1999/045962 to Genpharm Inc. Виж, също така, MacQuitty, J. J. and Kay, R. M. (1992) Science 257:1188; Taylor, L. D. et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:6287-6295; Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368:856-859; Lonberg, N. et Huszar, D. (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93; Hurding, F. A. and Lonberg N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546; Fiahild, D. M. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851; Mendez, M. J. et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Green, L. L. and Jakobovits, A. (1998) J. Exp. Med. 188:483-495; Green, L. L. (1999) J. Immunol. Methods 231:11-23; Yang, X. D. et al. (1999) J. Leukoc. Biol. 66:401-410; Gallo, M. L. et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30:534-540.
Съгласно друг вариант за изпълнение на изобретението, животното, което се имунизира с антиген с двойна специфичност е мишка с тежка комбинирана имунонедостатъчност (SDID), която е пресъздадена с мононуклеарни клетки от човешка периферна кръв, или лимфоидни клетки, или техни прекурсори. За такива мишки, които се отнасят като hu-PBMC-ACID химерни мишки, е показано, че при антигенно стимулиране продуцират човешки имуноглобулин отговори. За допълнително описание на тези мишки и на тяхното използване в генерирането на антитела, виж, например, Leader, К. A. et al. (1992) Immunology 76:229-234; Bombil, F. et al. (1996) Immunobiol. 195:360-375; Murphy, W. J. et al. (1996) Semin. Immunol. 8:233-241; Herz, U. et al. (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113:ISO152; Albert, S. E. et al. (1997) J. Immunol.
66209 Bl
159:1393-1403; Nguyen, H. et al. (1997) Microbiol. Immunol. 41:901-907; Arai, K. et al. (1998) J. Immunol. Methods 217:79-85; Yoshinari, K. and Arai, K. (1998) Hybridoma 17:41-45; Hutchians, W. A. et al. (1999) Hybridoma 18:121 -129; Murphu, W. J. et al. (1999) Clin. Immunol. 90:22-27; Smithson, S. L. et al. (1999) Mol. Immunol. 36:113124; Chamat, et al. (1999) J. Infect. Diseases 180:268-277; и Heard, C. et al. (1999) Molec. Med. 5:35-45.
Съгласно друг вариант за изпълнение на изобретението, животното, което се имунизира с антиген с двойна специфичност е мишка, на която е приложена летална доза радиоактивно облъчване върху цялото тяло, последвано от защита срещу радиоактивно облъчване с клетки от костен мозък от мишка с тежка комбинирана имунонедостатьчност (SDID), последвано от присаждане на функционални човешки лимфоцити. Този вид химери, смятани за система Trimera, са използвани за продуциране на човешки моноклонални антитела чрез имунизация на мишки с антиген представляващи интерес, последвано от получаване на моноклонални антитела, използвайки стандартна хибридомна технология. За допълнително описание на тези мишки и на тяхното използване в генерирането на антитела, виж, например, Eren, R. et al. (1998) Immunology 93:154-161; Reisner, Y. and Dagan, S. (1998) Trends Biotechnol. 16:242-246; Ilan, E. et al. (1999) Hepatology 29:553-562; и Bocher, W. O. et al. (1999) Immunology 96:634-641.
B. in vitro подходи
Алтернативно на получаването на антитяло с двойна специфичност чрез in vivo имунизация и селекция, антитяло с двойна специфичност съгласно изобретението може да се идентифицира и да се изолира чрез скриниране на библиотека на рекомбинантен комбинаторен имуноглобулин (например, антитяло на библиотека изобразяваща фаг) с антиген с двойна специфичност, като чрез това да се изолират членове на имуноглобулинова библиотека, които се свързват специфично към двете структурно свързани, но различни молекули, представляващи интерес. Набори за генериране и скриниране на библиотеки изобразяващи фаг са достъпни посредством търговската мрежа (например, the Pharmacia Recombinant Phage System, Catalog No. 27-940001; и the Stratagene SurfZAP™ Phage Display kit,
Catalog No. 240612). Съгласно различни варианти за изпълнение, библиотеката изобразяваща фаг е scFv библиотека, или Fab библиотека. Изобразяващата фаг техника за скриниране на библиотеки нарекомбинантни антитела е описана обстойно в областта на техниката. Примери за методи и съединения, особено отзивчиви за използване при генериране и скриниране на библиотека изобразяваща антитяло може да се намерят в, например, McCafferty et al. International Publication No. WO 1992/001047, US Patent No. 5,969,108 и EP 589,877 (описващ по-специално изобразяване на scFv), Ladner et al. US Patent No. 5,223,409, No. 5,403,484, No. 5,571,698, No. 5,837,500, и EP 436,597 (описващ, например, pill сливане); Dower et al. International Publication No. WO 1991/017271, US Patent No. 5,427,908, US Patent No. 5,580,717, и EP 527,839 (описващ по-специално изобразяване на Fab); Winter et al. International Publication No. WO 1992/020791, и EP 368,684 (описващ по-специално клониране на последователностите на вариабилния домен на имуноглобулина); Griffiths et al. US Patent No. 5,885,793, и EP 589,877 (описващ по-специално изолиране на човешки антигени, използвайки рекомбинантни библиотеки); Garrard et al. International Publication No. WO 1992/009690 (описващ поспециално техники на експресиране на фаг); Knappik et al. International Publication No. WO 1997/008320 (описващ по-специално библиотеката на човешко рекомбинантно антитяло HuCal); Salfeld et al. International Publication No. WO 1997/029131 (описващ получаването на човешко рекомбинантно антитяло към човешки антиген (човешки тумор некрозис фактор алфа), така както и in vitro афинитетно узряване на рекомбинантно антитяло) и Salfeld et al. US Provisional Application No. 60/126,603, също така описващ получаването на човешко рекомбинантно антитяло към човешки антиген (човешки интерлевкин 12), така както in vitro афинитетно узряване на рекомбинантно антитяло).
Други описания за скриниране на библиотека на рекомбинантно антитяло е намерено в научни публикации, такива като Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al.
66209 Bl (1991) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1991) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/ Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982; McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554; и Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol. 296:57-86.
Алтернативно на използването на системи изобразяващи бактериофаги, библиотеки на рекомбинантно антитяло могат да бъдат експресирани върху повърхността на дрождеви клетки, или бактериални клетки. Методи за получаване и скриниране и скриниране на библиотеки, експресирани върху повърхността на дрождеви клетки се описват също така в РСТ Publication No. WO 1999/036569. Методи за получаване и скриниране и скриниране на библиотеки, експресирани върху повърхността на бактериални клетки се описват също така в РСТ Publication No. WO 1998/049286.
След като антитяло, представляващо интерес, се идентифицира от комбинаторна библиотека, ДНКи, кодиращи леките и тежките вериги на антитялото се изолират чрез стандартни техники на молекулярната биология, такива като PCR амплифициране на ДНК от изобразяващия пакет (например, фаг), изолиран по време на метода на скриниране на библиотеката. Известни са от областта на техниката нуклеотидни последователности от гени на лека и тежка верига на антитяло, от които могат да се получат PCR праймери. Например, много такива последователности са описани в Fabat, Е. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91 -3242, и в “ Vbase” данни за човешка последователност на зародишна линия.
Антитяло или участък от антитяло, съгласно изобретението, може да се получи чрез рекомбинантно експресиране на гените на леката и тежката верига на имуноглобулина в клетка гостоприемник. За да се експресира едно антитяло рекомбинантно, клетка гостоприемник се трансфекгира с един, или с няколко рекомбинантни експресионни вектори, носещи ДНК фрагменти кодиращи лека и тежка верига на имуноглобулина на антитялото, така че леката и тежката верига се експресират в клетката гостоприемник, и, за предпочитане, се секретират в средата, в която се култивират клетките гостоприемници, от която среда могат да се извлекат антителата. Използват се стандартни методологии за рекомбинантна ДНК, за да се получат гени на лека и тежка верига на антитялото, да се инкорпорират тези гени в рекомбинантни експресионни вектори, и да се въведат векторите в клетки гостоприемници, такива като тези, описани в Sambrook, Fritsh and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds), Current Protocols on Molecular Biology, Green Publishing Assocoates, (1989) и в US Patent No. 4,816,397, от Boss et al.
След като вече се получат ДНК фрагменти кодиращи VH и VL сегментите на антитялото, представляващи интерес, тези ДНК фрагменти могат след това да се обработят чрез стандартни техники за рекомбинантна ДНК, например, да се конвертират гените на вариабилната област до гени на антитяло с пълна дължина на веригата, до гени на Fab фрагмент, или до scFv ген. При тези обработвания, ДНК фрагмент кодиращ VL, или VH се свързва операционно към друг ДНК фрагмент, кодиращ друг протеин, такъв като константна област на антитяло, или гъвкав линкер. Терминът “операционно свързан”, така както се използва в този контекст, означава, че двата ДНК фрагмента са свързани по такъв начин, че аминокиселинната последователност, кодирана от двата ДНК фрагмента остава в рамка.
Изолираната ДНК, кодираща VH областта може да бъде конвертирана в ген на тежка верига в цяла дължина чрез операционно свързване на VH-кодиращата ДНК към друга ДНК молекула, кодираща константни области на тежка верига (CH, СН2 и СНЗ). Последователностите на човешки гени от константна област на тежка верига са известни в областта на техниката (виж, например, Kabat Е. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) и ДНК фрагменти, обхващащи тези области, могат да се получат чрез стандартно PCR усилване. Константната област на тежката верига може да бъде IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgD константна област, но най-предпочитано е IgGl, или IgG4 константна област. За гена на Fab фрагмента на
66209 Bl тежка верига, VH-кодиращата ДНК може операционно да бъде свързана към друга ДНК молекула, кодираща само константната област СН1 на тежката верига.
Изолираната ДНК, кодираща VL областта може да бъде конвертирана в ген на лека верига с цяла дължина (така както и гена на Fab на лека верига) чрез операционно свързване на VL-koдиращата ДНК към друга ДНК молекула, кодираща константна област на леката верига, CL. Последователностите на човешки гени от константна област на лека верига са известни в областта на техниката (виж, например, Kabat Е. А., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) и ДНК фрагменти, обхващащи тези области, могат да се получат чрез стандартно PCR усилване. Константна област на леката верига може да бъде капа, или ламбда константна област, но най-предпочитано е капа константна област.
За създаване на scFv ген, VH- и VL-кодиращите ДНК фрагменти са операционно свързани към друг фрагмент, кодиращ гъвкав линкер, например, кодиращ аминокиселинната последователност (Gly4-Ser)3, такъв, че VH и VL последователностите могат да бъдат експресирани като съседен протеин с единична верига, с VL и VH областите присъединени към гъвкавия линкер (виж, например, Bird et al. (1988) Science 242:243-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554).
За експресиране на рекомбинантни антитела, или на участъци от антитела съгласно изобретението, ДНКи кодиращи частични, или с цяла дължина леки и тежки вериги, получени както се описва по-горе, могат да се инсерират в експресионни вектори, по такъв начин, че гените да са операционно свързани към транскрипционни и транслационни контролни последователности. В този контекст, терминът “операционно свързан” означава, че ген на антитяло е лигиран във вектор, така че транскрипционни и транслационни контролни последователности във вектора изпълняват тяхната предназначена функция за регулиране на транскрибирането и на транслирането на гена на антитялото. Експресионният вектор и експресионните конт ролни последователности се избират така, че да са съвместими с експресирането на използваната клетка. Генът на леката верига на антитялото и генът на тежката верига на антитялото могат да се инсерират в отделни вектори, или, похарактерно, двата гена се инсерират в един и същи експресионен вектор. Гените на антитялото се инсерират в експресионния вектор чрез стандартни методи (например, свързване на комплементарни рестрикционни сайтове във фрагмент от гена и вектор на антитялото, или свързване на тъп край, ако не присъстват рестрикционни сайтове). Преди инсерирането на последователностите на леката и тежката верига, експресионният вектор може вече да носи последователности на константна област на антитялото. Например, един подход за конвертиране на VH и VL последователностите в гени на антитяло с пълна дължина, е те да бъдат инсерирани в експресионни вектори вече кодиращи константни области на тежката верига и константни области на леката верига, съответно, така че VH сегментът е свързан операционно към СН сегмента(ите) във вектора, и VL сегментът е свързан операционно към CL сегмента във вектора. Освен това, или алтернативно, рекомбинантният експресионен вектор може да кодира сигнален пептид, който улеснява секретирането на веригата на антитялото от клетка гостоприемник. Генът на веригата на антитялото може да бъде клониран във вектора, така че сигналният пептид да се свърже в рамка към амино терминуса на гена на веригата на антитялото. Сигналният пептид може да е имуноглобулинов сигнален пептид, или хетероложен сигнален пептид (т.е., сигнален пептид от не-имуноглобулинов протеин).
Освен това, към гените на веригата на антитялото, рекомбинантните експресионни вектори съгласно изобретението носят регулаторни последователности, които контролират експресирането на гените на веригата на антитялото в клетка гостоприемник. Терминът “регулаторна последователност” включва промотори, енхансери и други елементи за контролиране на експресията (например, сигнали за полиаденилиране), които контролират транскрипцията, или транслирането на гените на веригата на антитялото. Такива регулаторни последователности са описани, например, в
66209 Bl
Goeddel; Gene Expretion Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Специалистите в областта на техниката ще преценят, че проектирането на експресионния вектор, включително изборът на регулаторни последователности, може да зависи от такива фактори, като изборът на клетката гостоприемник, която да се трансформира, от нивото на експресиране на желания протеин, и т. н. Предпочитани регулаторни последователности за експресията на клетка гостоприемник на бозайник включват жизнеспособни елементи, които водят до високи нива на експресиране на протеин в клетки на бозайник, такива като промотори и/или усилватели, произлизащи от цитомегаловирус (CMV) (такива като CMV промотор/ усилвател), Simian Virus 40 (SV40) (такива като SV40 промотор/усилвател), аденовирус, (например, главният късен промотор на аденовирус (AdMLP)) и полиома. За повече подробности за вирусни регулаторни елементи, и техни последователности, виж, например, US Patent No. 5,168,062 от Stinski, US Patent No. 4,510,245 от Bell et al. и US Patent No. 4,968,615 от Schaffner etal.
В допълнение към гените на веригата на антитялото и регулаторните последователности, рекомбинантният експресионен вектор съгласно изобретението може да носи допълнителни последователности, такива като последователности, които регулират репликацията на вектора в клетки гостоприемници (например, начала на репликация) и избираеми маркерни гени. Избираемите маркерни гени улесняват селекцията на клетки гостоприемници, в които е въведен вектора (виж, например, US Patent Nos. 4,399,216, 4,634,665 и 5,179,017, всичките от Axel et al.). Например, характерно избираемият маркерен ген придава резистентност към лекарства, такива като G418, хигромицин, или метотрексат, на клетка гостоприемник, в която векторът е въведен. Предпочитани избираеми маркерни гени включват гена на дихидрофолат редуктаза (DHFR) (за използване в dhfr клетки гостоприемници с метотрексат селекция/ усилване) и пео гена (за G418 селекция).
За експресия на леката и тежката верига, експресионният(те) вектор(и) кодиращ(и) тежката и леката верига се трансфектират в клетка гостоприемник чрез стандартни техники.
Различните форми на термина “трансфектиране” са предназначени да обхващат голямо разнообразие от техники, обичайно използвани за въвеждане на екзогенна ДНК в прокариотна, или еукариотна клетка гостоприемник, например, електропорация, калций-фосфорно утаяване, DEAE-декстран трансфектиране и други подобни. Въпреки че теоретично е възможно да се експресират антителата съгласно изобретението или в прокариотни, или в еукариотни клетки гостоприемници, експресиране на антитела в еукариотни клетки, и най за предпочитане клетки гостоприемници от бозайник, е найпредпочитаното, понеже такива еукариотни клетки, и по-специално клетки от бозайник, са по-подходящи, отколкото прокариотни клетки да се събират и да секретират правилно нагънато и имунологично активно антитяло. За прокариотно експресиране на гени на антитяло е докладвано, че е неефективно за продуциране на високи добиви на активно антитяло (Boss, М. A. and Wood, С. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
Предпочитани клетки гостоприемници от бозайници за експресиране на рекомбинантните антитела съгласно изобретението включват Chinese Hamster Ovary (СНО клетки) (включително dhfr-СНО клетки, описани в Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, използвани c DHFR избираем маркер, например, както се описва в R. J. Kaufman and Р. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601621), NSO миелома клетки и SP2 клетки. Когато рекомбинантни експресионни вектори, кодиращи гени на антитяло се въвеждат в клетки гостоприемници на бозайник, антителата се продуцират чрез култивиране на клетките гостоприемници в продължение на достатъчно дълъг период от време, за да се даде възможност за експресиране на антитялото на клетките гостоприемници, или, по-предпочитано, за секретиране на антитялото в културалната среда, в която са прераснали клетките гостоприемници. Антитела могат да се възстановят из културалната среда, използвайки стандартни методи за пречистване на протеин.
Клетки гостоприемници могат също така да се използват за продуциране на участъци от интактни антитела, такива като Fab фрагменти, или scFv молекули. Трябва да се разбере, че ва
66209 Bl риациите на горната процедура влизат в обхвата на настоящото изобретение. Например, може да е желателно да се трансфектира клетка гостоприемник с ДНК, кодираща или леката верига, или тежката верига (но не и двете) на антитяло съгласно това изобретение. Технология за рекомбинантна ДНК може също така да се използва, за да се отнеме малко от, или цялата ДНК кодираща която и да е от двете, било леката, било тежката вериги, която не е необходимо да се свързва към антигените, представляващи интерес. Молекулите, експресирани от такива окастрени ДНК молекули също така се обхващат от антителата съгласно изобретението. Освен това, могат да бъдат продуцирани бифункционални антитела, в които една тежка и една лека верига са антитяло съгласно изобретението, а другата тежка и лека верига са специфични за антиген, различен от антигените, представляващи интерес, чрез кръстосано свързване на антитяло съгласно изобретението към второ антитяло чрез стандартни химични методи за кръстосано свързване.
Съгласно предпочитана система за рекомбинантно експресиране на антитяло, или антигенсвързващ негов участък, съгласно изобретението, рекомбинантен експресионен вектор, кодиращ както тежката верига на антитялото, така и леката верига на антитялото, се въвежда в dhfr-CHO клетки чрез калций фосфор-медиирано трансфектиране. В рекомбинантния експресионен вектор, всяка една от тежката и леката верига на гените на антитялото са операционно свързани към CMV усилвател/AdMLP промотор регулаторни елементи, за довеждане до високи нива на транскрибиране нагоните. Рекомбинантният експресионен вектор също така носи DHFR ген, който позволява селекцията на СНО клетки, които са били трансфектирани с вектора, използвайки метотрексат селекция/амплификация. Избраните трансформирани клетки гостоприемници се култивират, за да се даде възможност за експресията на тежката и леката верига на антитялото, и се извлича интактно антитяло от културалната среда. Стандартни молекулярни биологични техники се използват за получаването на рекомбинантния експресионен вектор, за да се трансфектират клетките гостоприемници, за да се изберат трансформанти, за да се култивират клетките гостоприемници, и да се възстанови антитялото от културалната среда. Освен това, изобре тението предоставя метод за синтезиране на рекомбинантно антитяло съгласно изобретението чрез култивиране на клетка гостоприемник съгласно изобретението в подходяща културална среда, докато се синтезира рекомбинантно антитяло съгласно изобретението. Методът може, също така, да съдържа изолиране на рекомбинантното антитяло от културалната среда.
Алтернативно на скриниране на библиотеки на рекомбинантно антитяло чрез изобразяване на фаг, могат да се приложат други методики, известни в областта на техниката за скриниране големи комбинаторни библиотеки, за идентифицирането на антитела с двойна специфичност съгласно изобретението. Един вид на алтернативна експресионна система е такава, в която библиотека на рекомбинантно антитяло се експресира със сливания на РНК-протеин, както се описва в РСТ Publication No. WO 1998/031700 от Szostak and Roberts, и в Roberts, R. W. and Szostak, J. W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302. В тази система, се създава ковалентно сливане между тРНК и пептида, или протеина, който той кодира чрез in vitro транслация на синтетични тРНК, които носят пуромицин, пептидил акцептор антибиотик, на неговия 3' край. Така, специфична тРНК може да бъде обогатена от комплексна смес от тРНКи (например, комбинаторна библиотека), на базата на свойствата на кодирания пептид, или протеин, например, антитяло, или негов участък, такава като свързваща антитялото, или негов участък, към антиген с двойна специфичност. Последователности от нуклеинова киселина кодиращи антитела, или техни участъци, възстановени от скриниране на такива библиотеки, могат да бъдат експресирани чрез рекомбинантни начини, както е описано по-горе (например, в клетки гостоприемници на бозайник), и, освен това, могат да бъдат подложени на следващо афинитетно узряване чрез допълнителни кръгове на скриниране на mPHK-пептид сливания, при които са въведени мутации в оригинално избрана(и) последователност(и), или чрез други методи за афинитетно узряване in vitro на рекомбинантни антитела, както се описва по-горе.
С. Комбинирани подходи
Антитела с двойна специфичност съгласно изобретението могат, също така, да се получат, използвайки комбинирането на in vivo
66209 Bl и in vitro подходи, такива като методи, при които антиген с двойна специфичност се предоставя оригинално на множество антитела in vivo в гостоприемник животно, за да стимулира продуцирането на антитела, които свързват антигена с двойна специфичност, но където следваща селекция и/или узряване на антитяло (т.е., подобрение), се осъществява, използвайки една, или повече in vitro техники.
Съгласно един вариант за изпълнение на изобретението, такъв комбиниран метод обхваща първо имунизиране на животно, различно от човек (например, мишка, плъх, заек, коза, или тяхна трансгенна версия, или химерна мишка) с антиген с двойна специфичност, за да се стимулира отговор на антитяло срещу антигена, последвано от получаване и скриниране на библиотека на антитяло изобразяваща фаг, използвайки имуноглобулинови последователности от лимфоцити, стимулирани in vivo чрез излагане на действието на антигена с двойна специфичност. Първият етап на тази комбинирана процедура може да се проведе както е описано в подсекция ПА по-горе, докато вторият етап на тази процедура може да се проведе както е описано в подсекция ИВ по-горе. Предпочитани методики за хиперимунизиране на животни различни от човек, последвано от in vitro скриниране на библиотеки изобразяващи фаг, получени от стимулиране на лимфоцити включват тези, описани от BioSite Inc., виж, например, РСТ Publication WO 1998/047343, РСТ Publication WO 1991/017271, US Patent No. 5,427,908 и ; US Patent No. 5,580,717.
Съгласно друг вариант за изпълнение на изобретението, комбинираният метод обхваща първо имунизиране на животно, различно от човек (например, мишка, плъх, заек, коза, или негова knockout и/или трансгенна версия, или химерна мишка) с антиген с двойна специфичност, за да се стимулира антитяло отговор срещу антигена, и селекция на лимфоцити, които са продуциращи антитела, имащи желаната двойна специфичност (например, чрез скриниране хибридоми, получени от имунизираните животни). Пренаредените гени на антитялото от избраните клони след това се изолират (чрез стандартни методи за клониране, такива като верижна реакция на обратна транскриптазаполимераза), и се подлагат на in vitro афинитет но узряване, като по този начин се улесняват свойствата за свързване на избраното антитяло, или антитела. Първият етап на тази процедура може да се проведе както е описано в подсекция ПА по-горе, докато вторият етап на тази процедура може да се проведе както е описано в подсекция ПВ по-горе, по-специално използвайки РСТ Publication WO 1997/029131, и РСТ Publication WO 2000/056772.
Съгласно друг един комбиниран метод, рекомбинантни антитела се генерират от единични, изолирани лимфоцити, използвайки процедура, известна в областта на техниката като метода на избраното лимфоцитно антитяло (SLAM), както се описва в US Patent No. 5,627,052, РСТ Publication WO 1992/002551 и Babcock, J. S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848. Съгласно този метод, както се прилага върху антитялото с двойна специфичност съгласно изобретението, животно, различно от човек (например, мишка, плъх, заек, коза, или негова трансгенна версия, или химерна мишка) първо се имунизира in vivo с антиген с двойна специфичност, за да се стимулира антитяло отговор срещу антигена, и след това се селекционират единични клетки, секретиращи антитела, представляващи интерес, например, специфични за антигена с двойна специфичност, използвайки изследване на специфична за антиген хемолитична плака (например, самият антиген с двойна специфичност, или структурно свързаните молекули, представляващи интерес, се присъединяват, като овчи червени кръвни клетки, използвайки линкер, такъв като биотин, като чрез това се дава възможност за идентифициране на единични клетки, които секретират антитела с подходяща специфичност, използвайки изследването на хемолитична плака). След идентифициране на секретиращите антитела клетки, представляващи интерес, сДНКи на вариабилна област на тежка и лека верига се освобождават от клетките чрез обратна транскриптаза-PCR, и тези вариабилни области могат след това да се експресират, в контекста на подходящи имуноглобулин константни области (например, човешки константни области), в клетки гостоприемници на бозайник, такива като COS, или СНО клетки. Клетките гостоприемници, трансфектирани с усилени имуноглобулинови последователности, произлизащи от in vivo селекционирани
66209 Bl лимфоцити, могат след това да претърпят следващ анализ и селекциониране in vitro, например, чрез получаване натрансфектираните клетки, за да се изолират клетки, експресиращи антитела, имащи желаната двойна специфичност. Усилените имуноглобулинови последователности след това могат да се обработят in vitro, като например in vitro афинитетно узряване, както се описва погоре.
Съгласно друг вариант за изпълнение на изобретението, комбинираният метод за продуциране на антитяло с двойна специфичност обхваща следните етапи. Първо животно, различно от човек се имунизира с първи антиген, и второ животно, различно от човек се имунизира с втори различен антиген, където за предпочитане вторият антиген структурно е подобен на първия антиген, за да се стимулира антитяло отговор in vivo. Конструират се рекомбинантна библиотека на тежка верига и рекомбинантна библиотека на лека верига от гени на антитяло, производни на първото животно, различно от човек, и на второто животно, различно от човек, съответно, както се описва в секция ПВ. Библиотеката на тежка верига от животното, имунизирано с първия антиген се комбинира с библиотеката на лека верига от животното, имунизирано с втория антиген животното, за да се генерира библиотека X. Similarly на антитяло, библиотеката на тежка верига от животното, имунизирано с втория антиген се комбинира с библиотеката на лека верига от животното, имунизирано с първия антиген животното, за да се генерира библиотека Y. Additionally на антитяло, библиотеки X и Y могат да се комбинират, за да се генерира библиотека XY. Антитела с двойна специфичност, които свързват и първия, и втория антиген, могат да се идентифицират, и да се изолират от X, Y и/или XY библиотеки.
III. Характеристики на антитела с двойна специфичност
Изобретението предоставя антитела с двойна специфичност, така както и участъци от такива антитела, които могат да се получат съгласно методите на изобретението. За предпочитане, антителата, или участъците от тях, са изолирани антитела. За предпочитане, антителата, или участъците от тях, са неутрализиращи антитела. Антителата съгласно изобретението включват моноклонални и рекомбинантни антитела, и участъ ци от тях. Съгласно различни варианти за изпълнение на изобретението, антитялото, или неговия участък, може да съдържа аминокиселинна последователност, произлизаща изцяло от единични видове, такива като изцяло човешки, или изцяло мише антитяло, или неговия участък. Съгласно други варианти за изпълнение на изобретението, антитялото, или неговия участък, може да бъде химерно антитяло, или CDR-присадено антитяло, или друго от хуманизирано антитяло.
Терминът “антитяло”, така както се използва тук, се отнася до молекули имуношобулин, които се съдържат в четири полипептидни вериги, две тежки (Н) вериги и две леки (L) вериги, взаимно съединени чрез дисулфидни връзки. Всяка тежка верига се състои от вариабилна област на тежка верига (съкратено тук като НС VR, или VH) и константна област на тежка верига. Константната област на тежката верига се състои от три домена, CHI, СН2 и СНЗ. Всяка лека верига се състои от вариабилна област на лека верига (съкратено тук като LCVR или VL) и константна област на лека верига. Константната област на леката верига се състои от един домен, CL. Областите VH и VL могат след това да подразделят на области с хипервариабилност, наречени с термина области определящи комплементарността (CDR), с разпръснати между тях области, които са посъхранени, наречени с термина области на рамката (FR). Всяка една от VH и VL се състои от три CDR и от четири FR, подредени от аминотерминала към карбокситерминала в следния ред: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Терминът “антиген-свързващ участък” на антитяло (или просто “участък от антитяло”), както се използва тук, се отнася до един, или повече фрагменти на антитяло с двойна специфичност, които запазват способността да свързват специфично два различни, но структурно свързани антигена. Беше показано, че антиген-свързващата функция на едно антитяло може да се осъществи посредством фрагменти на антитяло с пълна дължина. Примери за свързващи фрагменти, които се обхващат от термина “антиген-свързващ участък” на антитяло включват (i) Fab фрагмент, моновалентен фрагмент, състоящ се от VL, VH, CL и СН1 домени; (ii) F(ab’)2 фрагмент, бивалентен фрагмент, съдържащ два
66209 Bl
Fab фрагмента, свързани c дисулфиден мост при hinge областта; (iii) Fd фрагмент, състоящ се от VH и СН1 домени; (vi) Fv фрагмент, състоящ се от VL и VH домени на единично рамо на антитяло., (v) dAb фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), който се състои от VH домен; и (vi) изолирана област; определяща комплементарност (CDR). Освен това, въпреки че двата домена на Fv фрагмента, VL и VH, са кодирани от различни гени, те могат да се съединят, използвайки рекомбинантни методи, посредством синтетичен линкер, който дава възможност те да бъдат получени като единична протеинова верига, в която VL и VH областите се сдвояват, като образуват моновалентни молекули (известни като Fv (scFv) с единична верига; виж, например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883. Такива антитела c единична верига също се обхващат от термина “антигенсвързващ участък” на антитяло. Други форми на антитела с единична верига, такива като диантитела също се обхващат. Диантителата са двувалентни, двойно специфични антитела, в които VH и VL домените се експресират на единична полипептидна верига, но използвайки линкер, който е достатъчно къс, за да позволи сдвояването между двата домена на същата верига, като по този начин домените се заставят да се сдвояват с комплементарни домени от друга верига, и да се създадат два антиген свързващи сайта (виж, например, Holliger, Е, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-123644802, Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).
Също така, антитяло, или антиген-свързващ негов участък може да бъде участък от поголеми имуноадхезионни молекули, образувани чрез ковалентно, или нековалентно асоцииране на антитялото, или участъците от антитялото, с един, или повече други протеини, или пептиди. Примерите за такива имуноадхезионни молекули включват използване на област със сърцевина стрептавидин, за да се получи тетрамерна scFv молекула (Kipriyanov, S. М., et al. (1995) Hum Antibodies and Hybridomas 6:93-101), и използване на цистеинов остатък, на пептиден маркер и на С-терминална полихистидинова опашка, за да се образуват бивалентни и биотинилирани scFv молекули (Kipriyanov, S. М., et al. (1994) Mol. Immunobiol. 31:1047-1058). Участъци от антитяло, такива като Fab и F(ab’)2 фрагменти, могат да се получат от цяло антитяло, използвайки конвенционални техники, такива като папаиново, или пепсиново, усвояване съответно, на цяло антитяло. Освен това, антитела, участъци от антитела и имуноадхезионни молекули могат да се получат, използвайки стандартни рекомбинантни ДНК техники.
“Изолирано антитяло с двойна специфичност”, както се използва тук, се отнася до антитяло с двойна специфичност, което по същество свободно от други антитела, имащи различни антигенни специфичности (например, изолирано антитяло, което специфично свързва два различни, но структурно свързани антигена, или структурно свързани области на иначе несвързани антигени). Освен това, изолирано антитяло с двойна специфичност може да бъде по същество свободно от други клетъчни продукти и/или вещества.
“Неутрализиращо антитяло”, както се използва, се отнася до антитяло, чието свързване към специален антиген води до инхибиране на биологичната активност на антигена. Това инхибиране на биологичната активност на антигена може да се оцени чрез измерване на един, или на повече индикатори за биологичната активност на антигена, използвайки подходящо in vitro, или in vivo изследване.
“Моноклонално антитяло”, както се използва тук, се отнася до произлизащо от хибридома антитяло (например, антитяло, секретирано от хибридома, получена чрез хибридомна технология, такава като стандартната хибридомна методика на Kohler and Milstein). Така, произлизащо от хибридома антитяло с двойна специфичност съгласно изобретението се отнася също и като моноклонално антитяло, въпреки че то има антигенна специфичност за повече от единичен антиген.
Изразът “рекомбинантно антитяло” се отнася до антитела, които се получават, експресират, и се създават, или се изолират посредством рекомбинантни начини, такива като антитела експресирани, използвайки рекомбинантен експресионен вектор, трансфектиран в клетка гостоприемник, антитела изолирани от рекомбинантна, комбинативна библиотека на антитяло, антитела изолирани от животно (например, мишка), което е трансгенно за гени на човешки
66209 Bl имуноглобулин, (виж, например, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acida Res. 20:6287-6295), или антитела, получени, експресирани, създадени, или изолирани посредством едни или други начини, които включват снаждане на определени последователности наимуноглобулиновия ген (такива като човешки последователности на имуноглобулиновия ген) към други ДНК последователности. Примерите за рекомбинантни антитела включват химерни, CDR-присадени и хуманизирани антитела.
Терминът “човешко антитяло” се отнася до антитела, имащи вариабилни и константни области, съответстващи на, или произлизащи от, имуноглобулинови последователности на човешка зародишна линия, както се описва, например, от Rabat et al. (виж Rabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Departement of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Човешките антитела съгласно изобретението, обаче, могат да включват аминокиселинни остатъци, некодирани от имуноглобулинови последователности на човешка зародишна линия (например, мутации, въведени посредством случайни, или сайт-специфични мутагенези in vitro, или посредством соматична мутация in vivo), например в CDRs и поспециално в CDR3.
Рекомбинантните човешки антитела съгласно изобретението имат вариабилни области, и могат също така да включват константни области, произлизащи от имуноглобулинови последователности на човешка зародишна линия (виж Rabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Departement of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Съгласно някои варианти за изпълнение на изобретението, обаче, такива рекомбинантни човешки антитела се подлагат на in vitro мутагенеза (или, когато се използва животно, трансгенно за човешки Ig последователности, на in vivo соматична мутагенеза) и така аминокиселинните последователности на VH и VL областите на рекомбинантните антитела са последователности, които, когато са производни от, и са свързани с последователности на VH и VL на човешка зародишна линия, може да не съществува естествено в природата в човешка зародишна линия на множество антитела in vivo. Съгласно някои варианти за изпълнение на изобретението, обаче, такива рекомбинантни човешки антитела се получават в резултат на селективна мутагенеза, или обратна мутация, или и двете.
Терминът “обратна мутация” се отнася до метод, при който някои, или всичките соматично мутирали амино киселини на човешко антитяло се заместват със съответните остатъци от зародишна линия на хомоложна последователност на антитяло на зародишна линия. Последователности на тежката и леката верига на човешко антитяло съгласно изобретението се подреждат отделно от последователностите зародишна линия в VBASE база данни, за да се идентифицират последователностите с най-висока хомоложност. Различията в човешко антитяло съгласно изобретението са връщането към последователност на зародишната линия чрез мутиране на определени нуклеотидни позиции, кодиращи такава аминокиселина. Ролята на всяка една от аминокиселините така идентифицирани като кандидати за обратна мутация трябва да се изследва за директна, или индиректна роля в свързването на антиген, и която и да е амино киселина, намерена след мутиране да влияе върху която и да е характеристика на човешко антитяло, не би трябвало да се включва в крайното човешко антитяло. За да се сведе до минимум броят на аминокиселините, подложени на обратна мутация, онези аминокиселинни позиции, за които е установено, че са различни от най-близката последователност на зародишна линия, но идентична на съответната аминокиселина във втора последователност на зародишна линия може да остане, при условие че втората последователност на зародишна линия е идентична и колинеарна на последователността на човешкото антитяло съгласно изобретението за най-малко 10, за предпочитане 12 аминокиселини, от двете страни на аминокиселината, за която става въпрос. Обратна мутация може да се появи във всеки етап на оптимизиране на антитяло.
Терминът “химерно антитяло” се отнася до антитела, които съдържат последователности на вариабилна област на тежка и лека верига от едни видове, и последователности на константна област от други видове, такива като антитела, имащи миши тежка и лека верига на вариабилни области, свързани към човешки кон
66209 Bl стантни области.
Терминът “CDR-присадено антитяло” се отнася до антитела, които съдържат последователности с тежка и лека верига на вариабилна област от едни видове, но в които последователностите на един, или повече от CDR областите на VH и/или VL са заместени с CDR последователности на други видове, такива като антитела, имащи миши тежка и лека верига на вариабилни области, в които един, или повече от мишите CDRs (например, CDR3) са били заместени с човешки CDR последователности.
Терминът “хуманизирано антитяло” се отнася до антитела, които съдържат последователности с тежка и лека верига на вариабилна област от видове различни от човек (например, мишка), но в които най-малко участък от VH и/ или VL последователностите са изменени, да са повече “човекоподобни”, т.е., по-подобни на вариабилни последователности на зародишна човешка линия germline. Един вид хуманизирано антитяло е CDR-присадено антитяло, в което човешки CDR последователности са въведени в различни от човешки VH и VL последователности, за да заместват съответните CDR последователности, различни от човешките.
Един начин за измерване кинетиката на свързване на антитяло чрез повърхностен плазмен резонанс. Терминът “повърхностен плазмен резонанс”, както се използва тук, се отнася до оптически феномен, който дава възможност да се анализира реалното време на биоспецифични взаимодействия чрез откриване на изменения в концентрациите на протеин в биосензорна матрица, например, използвайки система с ШАсърцевина Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ). За допълнителни описания, виж Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Jonsson, B., et al. (1995) Mol. Recognit. 8:125-131; и Jonsson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.
Терминът “Koff”, както се използва тук, се отнася до off скоростната константа за дисоцииране на антитяло от антитяло/антиген комплекса.
Терминът “Ка”, както се използва тук, се отнася до дисоциационната константа на определено взаимодействие антитяло-антиген.
Антителата с двойна специфичност съгласно изобретението се получават, използвайки който и да е от различните методи за получаване на антитела, описан в подраздел II по-горе. Антителата с двойна специфичност съгласно изобретението могат да се насочат срещу по същество които и да са структурно свързани антигени, въпреки че предпочитани антитела с двойна специфичност съгласно изобретението са тези, които специфично свързват 1Ь-1алфа и IL1бета, които могат да се получат, използвайки антиген с двойна специфичност като тези, описани в примери 1-4. Други структурно свързани антигени, които могат да се приложат към настоящото изобретение включват, но не се ограничават до членове на семейството на каспазите, до семейството на цитокините, такива като членове на семейство IL-1 (например, IL-1/IL-18), до членове на семейството TNF (например, ТИРалфа/ЮТбета), членове на семейство IL-6, интерферони, членове на семейство TGF6eTa, членове на семейство EGF, членове на семейство FGF, членове на семейство PDGF, членове на семейство VEGF, членове на семейство ангиопротеини, костни морфогенни протеини, секретирани протеинази (металопротеинази), и на семейства на цитокин рецептори, такива като членове на семейство IL-1-рецептор, членове на семейство INF-рецептори, членове на семейство TGF6eTa рецептор, членове на семейство EGF рецептор, членове на семейство FGF рецептор, членове на семейство PDGF рецептор, VEGF рецептор, и членове на семейство на ангиопротеин рецептор.
Антитялото с двойна специфичност съгласно изобретението може да прояви също така, активност на свързване по отношение на двата различни, но структурно свързани антигена, към които те се свързват, или, алтернативно, антителата с двойна специфичност могат да се свързват по-предпочитано към един от двата антигена, като въпреки това имат специфичност спрямо двата свързани антигена, в сравнение с несвързани антигени. Свързващата активност на антителата с двойна специфичност спрямо структурно свързаните антигени, така както и спрямо несвързани антигени, може да се оцени, използвайки стандартни in vitro имуноизследвания, такива като ELISA, или BIAcore анализи. За предпочитане, съотношението Kd на антитяло спрямо структурно несвързани антигени към Kd на антитяло спрямо структурно свързани
66209 Bl антигени, би трябвало да е най-малко 3, даже попредпочитано, съотношението би трябвало да е най-малко 5, даже по-предпочитано, съотношението би трябвало да е най-малко 10, и даже попредпочитано, съотношението би трябвало да е най-малко 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000.
Количествено, разликата между фона на свързване и антителата с двойна специфичност е ниво, или степен. Например, фона на свързване е на ниско ниво, например, по-малко от 5%, попредпочитано по-малко от 3%, и найпредпочитано, приблизително 0,1 - 1%, докато специфична кръстосана реактивност, или свързване с двойна специфичност е на по-високо ниво, например, по-голямо от 1%, по-предпочитано поголямо от 3%, даже по-предпочитано по-голямо от 5%, и по-предпочитано по-голямо от 10%. Освен това, за предпочитане 1С50 на антитяло с двойна специфичност за антигени мишени, е близко до ED50s на антигените за дадено биоизследване.
Антитяло с двойна специфичност, или негов антиген-свързващ участък, съгласно изобретението, за предпочитане се избира така, че да има желаните кинетики на свързване (например, висок афинитет, ниска дисоциация, малка off-скорост, силна неутрализираща активност) за един, а по-предпочитано за двата, от антигените, към които се свързва специфично. Например, антитялото с двойна специфичност, или негов участък, може да свързва един, а попредпочитано двата от структурно свързаните антигена с Koff скоростна константа 0,1 s ', или помалка, по-предпочитано Koff скоростна константа 1 х 10'2s·’, или по-малка, даже по-предпочитано Koff скоростна константа 1 х lO ’s1, или по-малка, даже по-предпочитано Koff скоростна константа 1 х lOV1, или по-малка, или още по-предпочитано Koff скоростна константа 1 х lO^s1, или помалка, както се определя чрез повърхностен плазмен резонанс. Алтернативно, или допълнително, антитялото с двойна специфичност; или негов участък, може да инхибира активността на един, а по-предпочитано двата структурно свързани антигена с 1С50 от порядъка на 1 х 10'6М, или по-малка, даже по-предпочитано с 1С50 от порядъка на 1 х 107М, или по-малка, даже по-предпочитано с 1С50 от порядъка на 1 х 10’8М, или помалка, даже по-предпочитано с 1С50 от порядъка на 1 х 10_9М, или по-малка, даже по-предпочитано с 1С50 от порядъка на 1 х 10'10М, или помалка, или още по-предпочитано с 1С50 от порядъка на 1 х 1011 М, или по-малка. За предпочитане, 1С50 трябва да се измери, използвайки чувствително биоизследване, кьдето 1С50 стойностите са близко до ED50 стойността на антигена за изследването.
Изобретението също така предоставя фармацевтични състави, съдържащи антитяло с двойна специфичност, или негов антиген-свързващ участък, съгласно изобретението, и фармацевтично приемлив носител. Фармацевтичният състав съгласно изобретението може, също така, да съдържа най-малко едно допълнително терапевтично средство, например, едно, или повече терапевтични средства за лечение на смущения, при които използването на антитяло с двойна специфичност е благоприятно за подобряване на смущението. Например, когато антитялото с двойна специфичност специфично свързва IL1алфа и 1Ь-1бета, фармацевтичният състав може също така да включва едно, или повече терапевтични средства за лечение на смущения, при които IL-1 активност е определяща.
Антителата и участъците от антитела съгласно изобретението могат да бъдат включени във фармацевтични състави, подходящи за приложение върху субект. Характерно, фармацевтичният състав съдържа антитяло, или участък от антитяло съгласно изобретението, и фармацевтично приемлив носител. Както се използва тук, “фармацевтично приемлив носител” включва които и да са, и всички разтворители, дисперсни среди, покрития, антибактериални и противогъбични средства, изотонични и елиминиращи абсорбирането средства, и други подобни, които са физиологично съвместими. Примерите за фармацевтично приемливи носители включват един, или повече като, вода, физиологичен разтвор, фосфатно буфериран физиологичен разтвор, декстроза, глицерол, етанол и други подобни, така както и техни комбинации. В много случаи, за предпочитане е в състава да се включват изотонични средства, например, захари, полиалкохоли, такива като манитол, сорбитол или натриев хлорид. Фармацевтично приемливи носители могат, освен това, да съдържат минимални количества спомагателни вещества, такива като омокрящи, или емулгиращи средства,
66209 Bl консерванти, или буфери, които улесняват живота на обвивката, или ефикасността на антитялото, или участъкът от антитялото.
Антителата и участъците от антитела съгласно изобретението могат да бъдат включени във фармацевтичен състав, подходящи за парентерално приложение. Характерно, антитялото или участъците от антитялото трябва да се получат под формата на разтвор за инжектиране, съдържащ 0,1 - 250 mg/ml антитяло. Разтворът за инжектиране може да се състои или от течна, или от лиофилизирана форма за еднократно дозиране във флакон от флинтово стъкло, или в кехлибарен флакон, ампула, или предварително запечатана спринцовка. Буферът може да бъде L-хистидин (1-50 тМ), оптимално 5-10 тМ, при pH 5,0 до 7,0 (оптимално pH 6,0). Други подходящи буфери включват, но без да се ограничават до, натриев сукцинат, натриев цитрат, натриев фосфат, или калиев фосфат. Натриев хлорид може да се използва за модифициране токсичността на разтвора при концентрация от 0 - 300 тМ (оптимално 150 тМ за течна форма за еднократно дозиране). Криозащитни средства могат също така да се включат за лиофилизирана форма за еднократно дозиране, по принцип от 0 -10 % захароза (оптимално 0,5 -1,0 %). Други подходящи криозащитни средства включват трехалоза и лактоза. Могат да се включат средства придаващи обем за лиофилизирана форма за еднократно дозиране, по принцип от 1 -10 % манитол (оптимално 2-4 %). Стабилизатори могат да се използват и в двете, както в течната, така и в лиофилизирана форма за еднократно дозиране, по принцип от 1-150 тМ L-метионин (оптимално 5-10 тМ). Други подходящи средства придаващи обем включват глицин, аргинин, могат да бъдат включени като 0 - 0,05 % полисорбат80 (оптимално 0,005 - 0,01 %). Допълнително повърхностно активни вещества включват, но без да се ограничават до, полисорбат 20 и BRIJ повърхностно активни вещества.
Съставите съгласно това изобретение могат да бъдат в многообразие от форми. Те включват, например, течни, полутвърди и твърди форми за еднократно дозиране, такива като течни разтвори (например, инжекционни и инфузионни разтвори), дисперсни системи, или суспензии, таблетки, пилюли, прахове, липозоми и супозитории. Предпочитаната форма зави си от начина на прилагане и от терапевтичното приложение. Характерно предпочитани състави са под формата на инжекционни, или инфузионни разтвори, такива като състави, подобни на тези, използвани при пасивно имунизиране на хора с други антитела. Предпочитан начин на приложение е парентерален (например, интравенозно, подкожно, интраперитонеално, интрамускулно). Съгласно предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, антитялото се прилага чрез интравенозна инфузия, или инжектиране. Съгласно друг предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, антитялото се прилага чрез интрамускулно или подкожно инжектиране.
Терапевтичните състави характерно трябва да бъдат стерилни и стабилни в условията на получаване и на съхраняване на склад. Съставите могат да бъдат под формата на лекарствени форми като разтвори, микроемулсии, дисперсни системи, липозоми, или други структури, подходящи за лекарство с висока концентрация. Стерилни инжекционни разтвори могат да се получат, като се инкорпорира активното съединение (т.е., антитяло, или участък от антитяло) в необходимото количество, в подходящ разтворител, с един, или с комбинация от съставни части, изброени по-горе, както се изисква, последвано от стерилизиране чрез филтруване. Обикновено, дисперсионни системи се получават, като се инкорпорира активното съединение в стерилен вехикулум, който съдържа основна дисперсна среда, и другите необходими съставни части от тези, изброени по-горе. Когато се касае до стерилни, лиофилизирани прахове за получаването на стерилни инжекционни разтвори, предпочитаните методи за получаване са вакуум сушене и спрей-сушене, при което се получава прах от активната съставна част, плюс която и да е допълнителна желана съставна част от предварително стерилно-филтруван разтвор. Собствената текливост на разтвор може да се поддържа, например, чрез използването на покриващи средства, такива като лецитин, чрез поддържане на необходимата големина на частичките, в случай на дисперсия, и чрез използване на повърхностно активни вещества. Продължително абсорбиране на инжектируеми състави може да се преустанови, чрез включване в състава на средство, което елиминира
66209 Bl абсорирането, например, моностеаратни соли и желатин.
Антителата и участъците на антитела съгласно настоящото изобретение, могат да се прилагат чрез различни методи, известни в областта на техниката, въпреки че за много терапевтични приложения, предпочитаният начин/начин на приложение е подкожно инжектиране, интравенозно инжектиране, или инфузия. Както ще се отбележи от специалистите в областта на техниката, начинът/или начин на приложение, зависи от желаните резултати. Съгласно някои варианти за изпълнение на изобретението, активното съединение може да се получи с носител, който ще защитава съединението срещу бързо освобождаване, такива като лекарствена форма с контролирано освобождаване, включващо импланти, трансдермални пластири, и микрокапсулирани системи за доставяне. Могат да се използват биоразграждащи се, биосъвместими полимери, такива като етилен винил ацетат, полианхидриди, полигликолова киселина, колаген, полиортоестери, и полимлечна киселина. Много методи за получаването на такива лекарствени форми са патентовани или обикновено са известни на специалистите в областта на техниката. Виж, например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Съгласно някои варианти за изпълнение на изобретението, антитяло, или участък от антитяло съгласно изобретението може да се прилага орално, например, с инертен разредител, или с асимилируем носител, който може да се яде. Съединението (и други съставни части, при желание) може също така да се затвори в желатинова капсула с твърда или с мека обвивка, пресована във вид на таблетка, или инкорпорирана директно в диетата на субекта. За орално приложение, съединенията могат да бъдат инкорпорирани с инертни пълнители, и използвани под формата на таблетки за поглъщане, на таблетки за устата, до пастили, до капсули, до еликсири, до суспензии, до сиропи, до вафли, и други подобни. За да се приложи съединение съгласно изобретението приложение, различно от парентералното, може да е необходимо да се покрие съединението със, или да се съприлага съединението с, продукт, който да предотвратява неговото инактивиране.
Допълнително активни съединения могат също така да се инкорпорират в съставите. Съгласно някои варианти за изпълнение на изобретението, антитяло, или участък от антитяло съгласно изобретението се получава под формата на лекарствена форма заедно с, и/или се прилага заедно с, едно, или повече добавъчни терапевтични средства, които са полезни за лечение на заболявалия, при които 1L-1 активността е вредна. Например, анти-1Ь-1алфаЛЬ-1бета антитела с двойна специфичност, или участъци от антитяло, съгласно изобретението, могат да се приготвят в лекарствена форма заедно с, и/ или се прилага заедно с, едно, или повече добавъчни антитела, които свързват други мишени (например, антитела, които свързват други цитокини, или които свързват молекули от клетъчната повърхност). Освен това, едно, или повече антитела съгласно изобретението могат да се използват в комбинация с две, или повече от горепосочените терапевтични средства. Такива комбинирани терапии могат благоприятно да използват ниски дози от прилаганите терапевтични средства, като по този начин се избягват възможните токсичности, или усложнения, свързани с различните монотерапии.
IV. Използвания на антитела с двойна специфичност
Като се има предвид тяхната способност да се свързват към различни структурно свързани антигени, антителата с двойна специфичност, или техни участъци, съгласно изобретението, могат да се използват за откриване на единия, или на двата от тези антигени (например, биологична проба като серум, или плазма), при използване на конвенционално имунно изследване, като ензим свързани имуносорбентни изследвания (ELISA), радиоимуноизследване (RIA), или тъканна имунохистохимия. Изобретението предоставя метод за откриване на антитяло в биологична проба, който включва привеждане в контакт на биологична проба с антитяло с двойна специфичност, или участък от антитяло съгласно изобретението, което специфично разпознава антигена, и се открива или антитялото (или участък от антитяло), свързано с антигена, или несвързано антитяло (или участък от антитяло), за да се открие по този начин антигена в биологичната проба. Антитялото е директно, или ин
66209 Bl директно маркирано с вещество за откриване, за да се улесни откриването на свързаното, или несвързаното антитяло. Подходящи вещества за откриване включват различни ензими, простетични групи, флуоресцентни продукти, луминесцентни продукти и радиоактивни продукти. Примери за подходящи ензим и антитяло с двойна специфичност участък от антитяло съгласно изобретението, свързано с антигена, или несвързано антитяло вещества за откриване включват пероксидаза от хрян, алкална фосфатаза, бетагалактозидаза, или ацетилхолинестераза; примери за подходящи комплекси на простетични групи включват стрептавидин/биотин и авидин/ биотин; примери за подходящи флуоресцентни продукти, включително умбелиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлоротриазиниламин флуоресцеин, дансил хлорид, или фикоеритрин; примери за луминесцентни продукти включват луминол; и примери за подходящи радиоактивни продукти включват 1251, 131I, 35S или 3Н.
Алтернативно на белязаното антитяло, антигена(и) могат да се изследват в биологични течности чрез конкурентно радиоимунно изследване, при използване на антигенни стандартни образци, белязани с вещество за откриване и небелязано антитяло с двойна специфичност, специфично за антигена(ите). При това изследване биологичната проба, белязаните антигенни стандартни образци, и антитялото с двойна специфичност се комбинират, и се определя количеството маркиран антиген стандартен образец, свързан към немаркираното антитяло. Количеството на антигена в биологичната проба е обратно пропорционално на количеството маркиран антиген стандартен образец, свързан към немаркираното антитяло.
При един предпочитан вариант за изпълнение, антитялото с двойна специфичност специфично разпознава 1Ь-1алфа и 1Ь-1бета, и се използват горните методи на определяне, за да се определят 1Ь-1алфа и/или 1Ь-1бета. В съответствие, изобретението предоставя освен това метод за определяне на 1Ь-1алфа или IL1бета в биологична проба или тъкан, който включва привеждане в контакт на биологична проба или тъкан, за които се предполага, че съдържат IL-1 алфа или IL-1 бета с антитяло с двойна специфичност, или антиген-свързващ негов участък, съгласно изобретението, и се определя IL-1 алфа или IL-1 бета, в биологична проба или тъкан. Биологичната проба може да е, например, in vitro проба, като клетъчна проба, тъканна, или телесна течност (например, кръв, плазма, урина, слюнка и други). Освен това, откритата тъкан може да е тъкан, която in vivo е локализирана в субект, например, тъкан, която е визуализирана чрез in vivo изображение на тъканта (например, използвайки белязано антитяло).
Антителата с двойна специфичност съгласно изобретението също така могат да се използват за диагностични цели. Съгласно един вариант за изпълнение, антитяло съгласно изобретението се използва в диагностично изследване in vitro, като при лабораторен тест за откриване на антиген(и) представлявайки) интерес, или като тест за безопасност, за откриване на антиген(и) представлявайки) интерес. Примери за вече установени in vitro изследвания, използващи антитела, включват ELISAs, RIAs, Western blots и други подобни. При един друг вариант за изпълнение, антитялото съгласно изобретението се използва за диагностично изследване in vivo, като in vivo тест за изображение. Например, антитялото може да бъде маркирано с вещество за откриване, което може да бъде открито in vivo, маркираното антитяло може да се приложи на субект, и белязаното антитяло може да се открие in vivo, като по този начин се позволява in vivo изображение.
Антителата с двойна специфичност съгласно изобретението, които специфично разпознава IL-1 алфа и IL-1 бета, могат да се използват при диагностично изследване за откриване на IL1алфа и/или ПИбета, за диагностични цели, например, при голям брой инфекциозни заболявалия и нарушения, така както и при спонтанна резорбция на зародиши. С оглед специфичните видове заболявалия и нарушения, анти-1Ь-1алфа/ IL-1 бета антителата с двойна специфичност съгласно изобретението могат да се използват за диагностични цели в което и да е от тук описаните заболявания/нарушения с оглед терапевтичното използване на такива антитела (виж подолу), като нарушения, при които се определя IL-1 активност, разисквано по-долу.
Антителата с двойна специфичност и участъци на антитела съгласно изобретението са способни да неутрализират, както in vitro, така и in
66209 Bl vivo, активността на антигените, към които се свързват. В съответствие такива антитела и участъци на антитела съгласно изобретението могат да се използват за инхибиране на активността на антигените, например, в клетъчна култура, съдържаща антигени, или при хора, или при други бозайници, притежаващи антигени, с които реагира антитялото с двойна специфичност съгласно изобретението. При един вариант за изпълнение изобретението предоставя метод за инхибиране на антигенна активност, който включва привеждане в контакт на антигена с антитяло е двойна специфичност, или участъци на антитяло съгласно изобретението, така че да се инхибира антигенната активност. При един предпочитан вариант за изпълнение антитялото с двойна специфичност свързва 1Ь-1алфа и 1Е-1бета, и методът е метод за инхибиране на IL-1 алфа и/или IL-1 бета активност чрез привеждане в контакт на IL-1 алфа и/или 1Ь-1бета с антитялото с двойна специфичност, или негови участъци. 1Ь-1алфа и/ или 1Ь-1бета активността може да се инхибира, например, in vitro. Например, в клетъчна култура, съдържаща, или за която се подозира, че съдържа IL-1 алфа и/или IL-1 бета, антитяло, или участък от антитяло съгласно изобретението, може да се добави към културалната среда, за да инхибира 1Ь-1алфа и/или 1Ь-1бета активността на културата. Алтернативно, IL-1 алфа и/или IL-1 бета активността може да се инхибира in vivo при субект.
При един вариант за изпълнение изобретението предоставя метод за инхибиране на антигенна активност при субект, страдащ от нарушение, при което тази антигенна активност е вредна. Изобретението предоставя методи за инхибиране на антигенна активност при субект, страдащ от такова нарушение, който метод включва прилагане върху субекта на антитяло с двойна специфичност, или участък от антитяло съгласно изобретението, така че да се инхибира антигенната активност в субекта. За предпочитане антигенът е човешки антиген, а субектът е човек. Антитяло съгласно изобретението може да се приложи върху човек за терапевтични цели. Освен това, антитяло съгласно изобретението може да се приложи на бозайник, който не е човек, който експресира антиген, с който се свързва антитялото, за ветеринарни цели, или като животински модел на заболяване при хората. С оглед последното, такива животински модели могат да се използват за оценяване на терапевтичната ефикасност на антителата съгласно изобретението (например, тестване на дози и време за провеждане на курс за лечение).
За предпочитане, антитялото с двойна специфичност свързва 1Ь-1алфа и 1Ь-1бета, и методът за инхибиране на антигенна активност в субект е метод за инхибиране на IL-1 активност в субект, например, в субект, страдащ от нарушение, при което IL-1 активността е вредна. Както се използва в настоящото терминът “нарушение, при което IL-1 активността е вредна” се счита, че включва заболявания и други нарушения, при които е показано, или се предполага, че присъствието на IL-1 (който включва както 1Ь-1алфа, така и 1Ь-1бета) в субект, страдащ от нарушението, е отговорно за патофизиологията на нарушението, или е фактор, който спомага за влошаването на нарушението. В съответствие, нарушение, при които IL-1 активността е вредна, е нарушение, при което инхибирането на IL-1 активността (едното, или и двете от 1Ь-1алфа, и 1Ь-1бета), се очаква да облекчи симптомите и/или прогресирането на нарушението. Такива нарушения могат да бъдат установени, например, чрез повишаване на концентрацията на IL-1 в биологична течност на субект, страдащ от нарушението (например, повишаване на концентрацията на IL1 в серум, плазма, синовиална течност и т.н. на субекта), която може да се установи, например, при използване на анти-IL-l антитяло, както е описано по-горе.
Интерлевкин 1 играе критична роля в патология, асоциирана с множество заболявания, обхващащи имунни и възпалителни елементи. Тези заболявания включват, но без да се ограничават до, ревматоиден артрит, остеоартрит, младежки хроничен артрит, артрит на Lyme, псориазисен артрит, реактивен артрит, спондилоартропатия, системен еритоматозен лупус, болест на Крон, язвен колит, възпалително заболяване на червата, инсулин зависим диабет, тироидит, астма, алергични болести, псориазис, дерматит на склеродермата, болест graft versus host, отхвърляне на трансплантирани органи, остро, или хронично имунно заболяване, асоциирано с трансплантация на органи, саркоидоза, атеросклероза, дисеминирана вътресъдова
66209 Bl коагулация, болест на Kawasaki, болест на Grave, нефротичен синдром, синдром на хронична умора, грануломатоза на Wegener, HenochSchoenlein purpurea, микроскопични васкулити на бъбреците, хроничен активен хепатит, увеит, септичен шок, синдром на токсичен шок, синдром на сепсис, кахексия, инфекциозни заболявалия, паразитни заболявалия, синдром на придобита имунна недостатъчност, остър трансверсален миелит; хорея на Huntington, болест на Паркинсон, болест на Алцхаймер, удар, първична цироза на жлъчката, хемолитична анемия, злокачествени болести, слабо сърце, инфаркт на миокарда, болест на Addison, спорадично заболяване, полигландуларна недостатъчност от тип I и полигландуларна недостатъчност от тип И, синдром на Шмид, синдром на остро респираторно страдание (при възрастни), алопеция, алопеция ареата, серонегативна артопатия, артопатия, болест на Reiter, псориазисна артропатия, артропатия с язвен колит, ентеропатичен синовит, хламидия, артропатия асоциирана с иерзиния и салмонела, спондилоартропатия, атероматозно заболяване/артериосклероза, атопична алергия, автоимунно булозно (мехурчесто) заболяване, пемфигус вулгарис, пемфигоид, линеарен IgA заболяване, автоимунна хемолитична анемия, позитивна хемолитична анемия на Coombs, придобита злокачествена анемия, младежка злокачествена анемия, миалгичен енцефалит/Royal Free Disease, кандидомикозана кожата и слизестите ципи, артерит на гигантски клетки, първичен склерозиращ хепатит, криптогенен автоимунен хепатит, болест на синдром на придобита имунна недостатъчност, болести свързани с придобита имунна недостатъчност, хепатит С, обща изменена имунонедостатъчност (обща променлива хипогамаглобулинемия), разширена кардиомиопатия, безплодие у жените, отслабване на яйчниците, преждевременно отслабване на яйчниците, фиброзно заболяване на белите дробове, криптогенен фиброзиращ алвеолит, следвъзпалително интерстициално заболяване на белите дробове, интерстициален пневмонит, заболяване на белите дробове асоциирано със заболяване на съединителната тъкан, заболяване на белите дробове асоциирано със заболяване на смесена съединителна тъкан, интерстициално заболяване на белите дробове асоциирано със системна склероза, интерстициално заболяване на белите дробове асоциирано с ревматоиден артрит, заболяване на белите дробове асоциирано със системен еритематозен лупус, заболяване на белите дробове асоциирано с анкилозиращ спондилит (болест на Бехтерев), дифузно васкуларно заболяване на белите дробове, заболяване на белите дробове асоциирано с хемосидероза, интерстициално заболяване на белите дробове индуцирано от лекарствени средства, радиационна фиброза, облитериращ бронхиолит, хронична еозинофилна пневмония, лимфоцитно инфилтрирационно заболяване на белите дробове, постинфекционно интерстициално заболяване на белите дробове, подагричен артрит; автоимунен хепатит, тип-1 автоимунен хепатит (класически автоимунен, или лупоиден хепатит), тип-2 автоимунен хепатит (анти-LKM антитяло хепатит), автоимунно медиирана хипогликемия, тип В устойчивост на инсулин с папиларопигментна дистрофия на кожата, хипопаратироидизъм, остро имунно заболяване асоциирано с трансплантация на органи, хронично имунно заболяване асоциирано с трансплантация на органи, остеоартроза, първичен склерозиращ холангит, псориазис тип 1, псориазис тип 2, идиопатична левкопения, автоимунна неутропения, NOS бъбречно заболяване, гломерулонефритиди, бъбречен микроскопичен васкулит, лаймска болест, дискоиден еритематозен лупус, идиопатично, или NOS безплодие у мъжете, автоимунитет на спермата, мултиплена склероза (всички подвидове), симпатикова офталмия, пулмонарна хипертония вторична вследствие на заболяване на съединителна тъкан, синдром на Goodpasture, пулмонарна проява на нодозен полиартерит, остра ревматична треска, ревматоиден спондилит, болест на Still, системна склероза, синдром на Sjorgen, болест на Takayasu/артерит, автоимунна тромбоцитопения, идиопатична тромбоцитопения, автоимунно тироидно заболяване, хипертириоидизъм, автоимунна хипотириоидна гуша (болест на Hashimoto), атрофична автоимунен хипертириоидизъм, първична миксоедема, факогенен увеит, първичен васкулит, витилиго, заболяване на централната нервна система (например, депресия, шизофрения, Алцхаймер, Паркинсон и т.н.), остра и хронична болка, и липиден дисбаланс. Човешките антитела и участъци на антитела съгласно изобретението, могат да се използват за
66209 Bl лечение на хора, страдащи от автоимунни заболявания, по-специално асоциираните с възпаление болести, включително ревматоиден спондилит, алергия, автоимунен диабет, автоимунен увеит.
За предпочитане, антителата с двойна специфичност 1Ь-алфа/1Ь-1бета съгласно изобретението, или антиген-свързващи техни участъци, се използват за лечение на ревматоиден артрит, на болестта на Крон, на мултиплена склероза, на инсулин зависим диабет, захарна болест и псориазис.
Антитяло с двойна специфичност IL-алфа/ IL-1 бета или участък от антитяло, съгласно изобретението, също така може да се прилага с едно, или повече терапевтични средства, използвани при лечението на автоимунни и възпалителни заболявания.
Антителата съгласно изобретението, или антиген-свързващи техни участъци, могат да се използват самостоятелно, или в комбинация, за лечение на такива заболявания. Трябва да се разбере, че антителата съгласно изобретението, или антиген-свързващи техни участъци могат да се използват самостоятелно, или в комбинация с допълнително средство, например, терапевтично средство, допълнително средство, което се избира от лекуващия лекар за постигане на определена цел. Например допълнително средство може да е терапевтично средство, признато в областта на техниката като такова, което е полезно при лечение на заболяванията, или състоянията, които се лекуват от антитялото съгласно изобретението. Допълнително средство може, също така, да е средство, което придава благоприятен атрибут на терапевтичния състав, например, средство, което влияе на вискозитета на състава.
Трябва също така да се разбере, че комбинациите, които трябва да се включат в това изобретение са тези комбинации, които са полезни за постигане на определените за тях цели. Средствата, посочени по-долу са илюстративни за целите, и не са предназначени да са ограничаващи. Комбинациите, които са част от това изобретение, могат да са антителата съгласно изобретението, и най-малко едно допълнително средство, избрано от изброените по-долу. Комбинацията може, също така, да включва повече от едно допълнително средство, например, две, или три допълнителни средства, ако комбинацията е такава, че образуваният състав може да изпълни предназначените си функции.
Предпочитани комбинации е(са) нестероидно(и) и противовъзпалително(и) лекарство(а), също така наричани като NSAIDS, които включват лекарства като ибупрофен и СОХ-2 инхибитори. Други предпочитани комбинации са кортикостероиди, включващи преднизолон; добре известните странични ефекти при използване на стероид могат да се намалят, или даже да се елиминират чрез стесняване на необходимата стероидна доза, когато се лекуват пациенти в комбинация с анти-IL-l антителата съгласно това изобретение. Неограничаващи примери на терапевтични средства за ревматоиден артрит, с които антитяло, или участък от антитяло съгласно изобретението, може да се комбинира, включват следните: цитокин супресиращо(и) и противовъзпалително(и) лекарство(а) (CSAIDs); антибоди за, или антагонисти на други човешки цитокини, или растежни фактори, например, TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, ЕМАР-П, GM-CSF, FGF и PDGF. Антителата съгласно изобретението, или антиген-свързващи техни участъци, могат да се комбинират с антитела на молекули от клетъчната повърхност, такива като CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (В7.1), CD86 (В7.2), CD90, или техни лиганди, включващи CD 154 (dp39, или CD40L).
Предпочитани комбинации на терапевтични средства могат да интерферират като различни точки в автоимунната и последващата възпалителна каскада; предпочитаните примери включват TNF антагонисти като химерни, хуманизирани, или човешки TNF антитела, D2E7, (РСТ Publication WO 1997/029131), СА2 (Remicade™), CDP 571, CDP 870, Талидамид и разтворими р55, или р75 TNF рецептори, техни производни (p75TNFRIgG (Enbrel™), или p55TNFRIgG (Lenercept), и също така инхибитори на ПЧРалфа конвертиращ ензим (ТАСЕ); подобни на IL-1 инхибитори на (интерлевкин-1 конвертиращ ензим, IL- 1RA и т.н.) могат да бъдат ефективни поради същата причина. Други предпочитани комбинации включват интерлевкин 11. И още една предпочитана комбинация е друг играещ ключова роля в автоимунния
66209 Bl отговор, който може да действа успоредно на, в зависимост от, или в съгласие с IL-1 функция; особено предпочитани са IL-12 и/или IL-18 антагонисти, включващи IL-12 и/или IL-18 антитела, или разтворими IL-12 и/или IL-18 рецептори, или IL-12 и/или IL-18 свързващи протеини. Показано е, че IL-12 и IL-18 имат припокриващи се, но различни функции, и комбинации на антагонисти с двата могат да бъдат найефективни. И още една предпочитана комбинация са неизчерпващи анти-СО4 инхибитори. И още една предпочитана комбинация включва антагонисти на ко-стимулаторния биосинтетичен път CD80 (В7.1), или CD86 (В7.2) включващи антитела, разтворими рецептори, или антагонистични лиганди.
Антителата съгласно изобретението, или антиген-свързващи техни участъци, могат също така да се комбинират със средства, такива като метотрексат, 6-МР, азатиоприн сулфасалазин, мезалазин, олсалазин, хлорохинин/хидроксихлорокин, пенициламин, ауротиомалат (интрамускулно и орално), азатиоприн, кохицин, кортикостероиди (орално, инхалирани и локално инжектиране), бета-2-адренорецептор агонисти (салбуматол, тербуталин, салметерал), ксантини (теофилин, аминофилин), кромоглицат, недокромил, кетотифен, ипратропиум и окситропиум, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолат мотетил, лефлуномид, NSAIDs, например, ибупрофен, кортикостероиди, такива като преднизолон, фосфодиестераза инхибитори, аденозин агонисти, антитромбоцитни средства, комплемант инхибитори, адренержични средства, средства, които интерферират, като сигнализират чрез проинфламаторни цитокини, такива като ТОТалфа, или IL-1 (например, IRAK, NIK, IKK, рЗ 8, или MAP киназа инхибитори), IL1бета конвертиращ ензим инхибитори, ТТЧРалфа конвертиращ ензим (ТАСЕ) инхибитори, Т-клетъчни сигнализиращи инхибитори, такива като киназа инхибитори, металопротеиназа инхибитори, сулфасалазин, азатиоприн, 6меркаптопурини, ангиотенсин конвертиращ ензим инхибитори, рецептори на разтворим цитокин и негови производни (например, разтворим р55, или р75 TNF рецептори и производните p75TNFRlgG (Enbrel™ и p55TNFRlgG (Lenercept)), sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R) и противовъзпалителни цитокини (например, IL-4, IL10, IL-11, IL-13, и TGF6eTa). Предпочитани комбинации включват метотрексат, или лефлуномид и в случаи на умерени, или тежки ревматоидни артрити, циклоспорин.
Неограничаващи примери на терапевтични средства за възпалителни заболявания на червата, с които антитяло, или участък от антитяло съгласно изобретението, може да се комбинира, включват следните: буденозид; епидермален растежен фактор; кортикостероиди; циклоспорин, сулфасалазин; аминосалицилати; 6-меркаптопурин; азатиоприн; метронидазол; липоксигеназа инхибитори; мезаламин; олсалазин; балсалазид; антиоксиданти; тромбоксан инхибитори; антагонисти HaIL-Ι рецептор; анти-1Е-1бета моноклонални антитела; анти-Ш-6 моноклонални антитела; растежни фактори; инхибитори на еластаза; пиридинил-имидазолови съединения; антитела на, или антагонисти задруги човешки цитокини, или растежни фактори, например, THF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL8-, IL12, IL15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF и PDGF. Антитела съгласно изобретението, или антиген-свързващи техни участъци могат да се комбинират с антитела на молекули от клетъчната повърхност, такива като CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90, или техни лиганди. Антителата съгласно изобретението, или антиген-свързващите техни участъци, могат също така да се комбинират със средства, такива като метотрексат, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолат мофетил, лефлуномид, NSAIDs, например, ибупрофен, кортикостероиди, такива като преднизолон, инхибитори на фосфодиестераза, агонисти на аденозин, антитромбоцитни средства, инхибитори на комплемента, адренергични средства, средства, които интерферират, като сигнализират чрез проинфламаторни цитокини, такива като ТЪШалфа, или IL-1 (например, IRAK, NIK, IKK, рЗ 8 или MAP киназа инхибитори), инхибитори на IL-1 бета конвертиращ ензим, инхибитори на Т№алфа конвертиращ ензим, инхибитори на сигнала на Т-клетките, такива като инхибитори на киназа, инхибитори на металопротеиназа, сулфасалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурини, инхибитори на ангиотенсин конвертиращ ензим, рецептори на разтворим цитокин и негови производни (например, разтворим р55, или р75 TNF рецептори, sIL-lRI, sIL-lRII, SIL-6R) и проти
66209 Bl вовъзпалителни цитокини (например, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGF6eTa).
Предпочитани примери на терапевтични средства за болест на Крон, в които едно антитяло, или антиген-свързваща участък от антитяло може да се комбинира, включват следните: TNF антагонисти, например, анти-TNF антитела, D2E7, (РСТ Publication WO 1997/029131), СА2 (Remicade™), CDP 571, TNFR-Ig структури (p75TNFRIgG (Enbrel™), и p55TNFRIgG (Lenercept) инхибитори, и PDE4 инхибитори. Антитела, или антиген-свързващи техни участъци съгласно изобретението, или антиген-свързващи техни участъци, могат да се комбинират с кортикостероиди, например, буденозид и дексаметазон. Антитела съгласно изобретението, или антиген-свързващи техни участъци, могат също така да се комбинират със средства, такива като сулфасалазин, 5-аминосалицилова киселина и олсалазин, и със средства, които интерферират със синтеза, или с действие на проинфламаторни цитокини, такива като IL-1, например, инхибитори на IL-1 бета конвертиращ ензим и IL1га. Антитела съгласно изобретението, или антиген-свързващи техни участъци, могат също така да се използват с инхибитори на сигнала на Тклетките, например, 6-меркаптопурини като инхибитори на тирозинкиназа. Антитела съгласно изобретението, или антиген-свързващи техни участъци, могат да се комбинират с IL-11.
Неограничаващи примери на терапевтични средства за мултиплена склероза, с които антитяло, или участък от антитяло съгласно изобретението, може да се комбинира, включват следните: преднизолон; метилпреднизолон; азатиоприн; циклофосфамид; циклоспорин; метотрексат; 4-аминопиридин; тизанидин; интерферон-бета1а (авонекс; биоген); интерферонбета1Ь (бетасерон; хирон/берлекс); съполимер 1 (сор-1; копаксон; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); хипербарен кислород; интравенозен имуноглобулин; клабрибин; антитела на, или антагонисти на други човешки цитокини, или растежни фактори, например, THF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL8, IL-12, IL15, IL-16, IL-18, ЕМАР-П, GM-CSF, FGF и PDGF. Антитела съгласно изобретението, или антиген-свързващи техни участъци, могат да се комбинират с антитела на молекули от клетъчната повърхност, такива като CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40,
CD45, CD69, CD86, CD90, или техни лиганди. Антителата съгласно изобретението, или антигенсвързващите техни участъци могат също така да се комбинират със средства, такива като метотрексат, циклоспорин, FK.506, рапамицин, микофенолат мофетил, лефлуномид, NSAIDs, например, ибупрофен, СОХ-2 инхибитори, кортикостероиди, такива като преднизолон, инхибитори на фосфодиестераза, агонисти на аденозин, антитромбоцитни средства, инхибитори на комплемента, адренергични средства, средства, които интерферират, като сигнализират чрез проинфламаторни цитокини, такива като ЮТалфа, или IL-1 (например, IRAK, NIK, IKK, рЗ8, или MAP киназа инхибитори), инхибитори на IL-16eTa конвертиращ ензим, ТАСЕ инхибитори, инхибитори на сигнала Т-клетките, такива като инхибитори на киназа, инхибитори наметалопротеиназа, сулфасалазин, азатиоприн, 6-меркапто-пурини, инхибитори наангиотенсин конвертиращ ензим, рецептори на разтворим цитокин и техни производни (например, разтворим р55, или р75 TNF рецептори, sIL-lRI, sIL1RII, sUL-6R) и противовъзпалителни цитокини (например, IL-4, IL-10, IL-13 и TGF6eTa).
Предпочитани примери на терапевтични средства за мултиплена склероза, в които антитялото, или антиген-свързващия негов участък, могат да се комбинират така, че да включват интерферон-бета, например, IFN5eTala и IFN6eTalb; копаксон, кортикостероиди, IL-1 инхибитори, TNF инхибитори, и антитела към CD40 лиганда и CD80.
Фармацевтичните състави съгласно изобретението могат да включват “терапевтично ефективно количество”, или “профилактично ефективно количество” от антитяло, или участък от антитяло съгласно изобретението. “Терапевтично ефективно количество” се отнася до ефективно количество, при необходими дозирания и периоди от време, за постигане на желания терапевтичен резултат. Терапевтично ефективно количество от антитяло, или участък от антитяло може да варира в зависимост от фактори, такива като състояние на заболяването, възраст, пол, и тегло на индивида, и способността на антитялото, или на участъкът от антитяло да извлича желан отговор в индивида. Терапевтично ефективно количество е също така това, при което каквато и да е токсичност,
66209 Bl или вредни ефекти на антитялото, или на участъците от антитяло се превишават от терапевтично благоприятните ефекти. “Профилактично ефективно количество” се отнася до ефективно количество, при необходими дозирания и периоди от време, за постигане на желания профилактичен резултат. Характерно, профилактична доза се използва при субект преди, или на поранен етап на заболяване, профилактично ефективното количество трябва да бъде по-малко от терапевтично ефективното количество.
Схемите на дозиране могат да се регулират така, че да се осигури оптималния желан отговор (например, терапевтичен, или профилактичен отговор). Например, може да се приложи единична голяма таблетка, могат да се приложат няколко отделни форми за единично дозиране за определено време, или дозата може пропорционално да се намали, или да се повиши, както се посочва от изискванията на терапевтичната ситуация. Особено благоприятно е да се приготвят парентерални състави в единични форми за еднократно дозиране за лесно приложение и еднообразие на дозирането. Единични форми за еднократно дозиране, както се използват тук, се отнасят до физически дискретни единици, подходящи като единни дози за субекти бозайници, които трябва да се лекуват; всяка една единица съдържа предварително определено количество от активно съединение, изчислено да продуцира желания терапевтичен ефект, заедно с необходимия фармацевтичен носител. Специфицирането за единичните форми за еднократно дозиране съгласно изобретението са продиктувани от, и директно зависят от (а) уникалните характеристики на активното съединение, и от специалния терапевтичен, или профилактичен ефект, който трябва да се постигне, и (Ь) от присъщото ограничение в областта на техниката при получаването на такова активно съединение за лечението на чувствителност у индивиди.
Един примерен, неограничаващ обхват на терапевтично, или профилактично ефективно количество от антитяло, или участък от антитяло съгласно изобретението е 0,1 - 20 mg/kg, по-предпочитано 1-10 mg/kg. Трябва да се отбележи, че стойностите на дозите могат да варират в зависимост от вида и от това колко тежко е състоянието, което трябва да се облекчи. Трябва да се отбележи, освен това, че за всеки един специален субект, трябва да се регулират специфични схеми на дозиране за определено време, съгласно необходимостта на индивида, и от професионалната преценка на лицето, което прилага, или наблюдаващо прилагането на съставите, и че обхватите на дозиране, посочени тук са само примерни, и не са предназначени да ограничават обхвата, или практиката на защитения състав.
Настоящото изобретение също така се илюстрира посредством следващите примери, които не представляват ограничение по никакъв начин. Съдържанието на всички цитирани справки, включително литературни справки, издадени патенти, и публикувани патентни заявки, както се цитират в това описание, са специално включени за справка.
Примери за изпълнение на изобретението
Пример 1. Проектиране антиген с двойна специфичност на базата на съседна топологична област на идентичност
В този пример, най-голямата съседна топологична област на идентичност между два различни, но структурно свързани протеина, IL1 алфа и IL-1 бета, се определя като основа за проектиране на антиген с двойна специфичност, за добиване на антитела с двойна специфичност към 1Ь-1алфа и IL-16eTa. Използва се BLAST алгоритъма, за сравняване на двата протеина, и се предоставя един за измерване на тенденцията на един остатък да замести друг, в подобна структурни, или функционални области. Този анализ дава възможност за идентифицирането на най-голямата съседна топологична област на идентичност между IL-1 алфа и IL-1 бета, и да се изтегли тази област с които и да са разумни интервали на подобие, за да се създаде линеен пептид, който служи като антиген с двойна специфичност. Пептидът, който най-добре отговаря на тези критерии има аминокиселинна последователност, както следва:
NEAQNITDF (SEQ ID NO: 1)
Звездичката (*) посочва идентични остатъци в двата протеина, а другите остатъци са много подобни съгласно BLAST алгоритъма. Например, лизин често ще замества аргинин в хомоложни протеини, но не фенилаланин. Този пептид на SEQ ID NO: 1 е хибрид, взет от две
66209 Bl различни секции на структурите, които се пропускат в противоположни посоки, така друго разумно представяне на този епитоп е:
DNdRdAdQNITDF (където префиксът “d” показва, че аминокиселинният остатък е D аминокиселинен остатък). И двете, и версията на L амино киселина на пептида, и версията на частично заместени D аминокиселинни остатъци се синтезират чрез стандартни химични методи. След това пептида се присъединява към протеин носител (например, KLH, или албумин), и присъединения пептид се използва за избор на антитела чрез in vitro, или in vivo методи.
Пример 2. Проектиране на антиген с двойна специфичност на базата на цикличен пептид, който подражава бримка на обичайно нагъване
В този пример, цикличен пептид, който структурно подражава ключова бримка на обичайно нагъване между два различни, но структурно свързани протеина, 1Ь-1алфа и 1Ь-1бета, се конструира за използване като антиген с двойна специфичност, за добиване на антитела с двойна специфичност към 1Ь-1алфа и 1Ь-1бета. Избраната бримка представлява остатъци 168-184 на 1Ь-1алфа и остатъци 160-176 на 1Ь-1бета. Консенсус последователността е:
Цикло-MAFLRANQNNGKISVAL (PG) (SEQ ID NO: 2) *cbcccccccc**c*b*
Звездичката (*) посочва идентични остатъци между 1Ь-1алфа и 1Ь-1бета, с посочва консенсусни остатъци, тоест, остатъци, подобни на 1Ь-1алфа и 1Ь-1бета, но не присъстващи актуално на това местоположение в един от двата протеина, a b посочва, че няма ясен консенсусен остатък, така че се запазва идентичността на IL1 бета последователност. Линейният пептид се синтезира чрез стандартни химични методи. За циклизирането на този пептид се прибавят пролинов и глицинов остатък. Цикличният пептид може да се синтезира, като се използват условия за присъединяване при голямо разреждане наНИ-диметилформамид (1 mg/ml). Протичат прототипни реакции при стайна температура, използвайки излишък от присъединяващ реактив, такъв като бензотриазол-1 -ил-окси-трис-пиролидино-фосфониев хексафлуоро фосфат (РуВОР; 2 eq) и натриев бикарбонат (10 eq). След това пептида се конюгира към носител протеин (например, KLH, или албумин), и конюгирания пептид се използва, за да се изберат антитела чрез in vitro или in vivo методи.
Пример 3. Проектиране на антиген с двойна специфичност на базата на хибриден пептид.
В този пример хибриден пептид, който включва променливи, или припокриващи се последователности от два различни, но структурно свързани протеина, 1Ь-1алфаи 1Ь-1бета, се конструира за използване като антиген с двойна специфичност, за добиване на антитела с двойна специфичност към 1Ь-1алфа и ПИбета. За да се създаде хибридния пептид, променливи и припокриващи се аминокиселинни последователности на 1Ь-1алфа и 1Ь-1бета се идентифицират, и се снаждат заедно, за да се генерира следния пептид:
TKGGQDITDFQILENQ (SEQ ID No: 3) bbbbbbbbbb а-тата и b-тата посочват кой протеин е източникът на остатъците (а = 1Ь-1алфа; b = IL1бета). ITDF (SEQ ID No: 4) мотива, общ за двата протеина, се включва в хибридния пептид. Освен това, този хибриден пептид фокусира върху последователности от карбокси термини на двата протеина, за които е известно, че антигенни за неутрализиращи антитела в двата протеина. Хибридният пептид се синтезира посредством стандартни химически синтетични методи. След това пептидът се конюгира към носител протеин (например, KLH, или албумин), и конюгирания пептид се използва, за да се изберат антитела чрез in vitro, или in vivo методи.
Пример 4. Генериране на антитела с двойна специфичност към 1Ь-1алфа и 1Ь-1бета.
NEAQNITDF (SEQ ID NO: 1)
Uhkho-MAFLRANQNNGKISVAL(PG) (SEQ ID NO: 2)
TKGGQDITDFQILENQ (SEQ ID NO: 3)
Пептиди SEQ ID NO: 1,2 и 3 се конюгират c KLH и се имунизират отделни зайци. Антисерум от зайци, имунизирани с всеки един от трите пептида, показва добър отговор на антитяло срещу пептида, използван като антиген. Обаче, само антисерум от заек, имунизиран с пептид на SEQ ID NO: 3 е способен да свърже IL-1 алфа и IL-1 бета протеин.
Пет мишки (ВА119 - ВА123) се имунизират подкожно с пептид на SEQ ID NO: 3, коню66209 Bl гиран c KLH плюс непълна добавка на Freund (FIA), веднъж на всеки три седмици общо три пъти, последвано от две интравенозни усилвания с пептид SEQ ID NO: 3, конюгиран с KLH. На всяка мишка се взима кръв 10 дни след вся- 5 ка имунизация, и титъра на антителата се определя посредством ELISA. Клетки от далак на мишки ВА119 и ВА123 съответно, се сливат с клетъчна линия миелома P3X36Ag8.653, както се описва в раздел ПА, и получените слети клетки се посяват при една клетка на ямка, в някол ко 96-ямкови блюда, използвайки ограничаващо разреждане. Хибридомни клонове, които прерастват, първо се изследват за продуциране на IgG и IgM, чрез стандартно ELISA, за да се идентифицират антитела-продуциращи клона. Изолират се общо 945 клона от сливане на мишки #ВА123. Супернатантата от 355 клони, изследвани с ELISA, показват антиген свързваща активност към IL-1 алфа, IL-16eTa, или и за двата IL-1 алфа и IL-1 бета.
# на клона Специфичност на антиген (срещу IL-1a и/или IL-1 β с цяла дължина) Изотоп
249 само IL-1a IgG
19 само IL-1a IgM
15 само IL-1 β IgG
2 само IL-1 β IgM
57 IL-1 а и β IgG
13 IL-1a и β IgM
Еквиваленти
Специалистите в областта на техниката познават, или са в състояние да установят, използвайки само рутинен експеримент, повече еквиваленти към специфичните варианти за изпълнение на изобретението, описани тук. Такива еквиваленти се обхващат от следващите патентни претенции.

Claims (66)

  1. Патентни претенции
    1. Метод за получаване на двойно специфично антитяло или негова антиген-свързваща част, което специфично свързва два различни, но структурно сродни белтъка, характеризиращ 45 се с това, че включва: осигуряване на антиген, аранжиран на базата на специфичен сплайсинг на припокриващи се части от два различни, но структурно сродни белтъка, за създаване на хибриден пептид, като въпросният пептид има структура X-Y-Z, кьдето Y представлява регион на идентичност или силно подобие между два сродни 35 белтъка, X представлява регион от единия от сродните белтъци и Z представлява регион от другия от сродните белтъци; експониране на пул от антитела на антигена; и подбор от пула на антитяло, което специфично свързва два различни, но структурно сродни белтъка, за получаване на двойно специфичното антитяло.
  2. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че пулът от антитела се експонира на антигена in vivo чрез имунизиране на нехуманоидно животно с антигена.
  3. 3. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че се изготвя панел от хибридоми от лимфоцити на животното и се подбира хибридома, която секретира антитяло, което специфично свързва две различни, но структур
    66209 Bl но сродни молекули.
  4. 4. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че животното е избрано от група, състояща се от мишки, плъхове, зайци и кози.
  5. 5. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че животното е нокаут мишка, дефицитна по ендогенната версия на антигена.
  6. 6. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че животното е мишка, която е трансгенна по гените за човешки имуноглобулин, така че мишката синтезира човешки антитела при антигенна стимулация.
  7. 7. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че животното е мишка с остра комбинирана имунна недостатъчност (ОКИН), която се възстановява с помощта на човешки мононуклеарни клетки от периферна кръв или лимфоидни клетки или техни предшественици.
  8. 8. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че животното е мишка, която е третирана с летална като цяло за тялото радиация, последвано от радиозащита с клетки от костен мозък на мишка с остра комбинирана имунна недостатъчност (ОКИН), последвано от присаждане на функционални човешки лимфоцити.
  9. 9. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че пулът от антитела се експонира на антигена in vitro чрез скриниране на библиотека от рекомбинантни антитела с антигена.
  10. 10. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че библиотеката от рекомбинантни антитела се експресира по повърхността набактериофаг.
  11. 11. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че библиотеката от рекомбинантни антитела се експресира по повърхността на дрождева клетка.
  12. 12. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че библиотеката от рекомбинантни антитела се експресира по повърхността на бактериална клетка.
  13. 13. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че библиотеката от рекомбинантни антитела се експресира като слети РНКбелтък.
  14. 14. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че библиотеката от рекомбинантни антитела е scFv библиотека или Fab библиотека.
  15. 15. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че пулът от антитела се експонира на антигена чрез in vivo имунизиране на нехуманоидно животно с антигена, последвано от in vitro скрининг на библиотека от рекомбинантни антитела, изготвена от лимфоидни клетки на животното с антигена.
  16. 16. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че пулът от антитела се експонира на антигена чрез in vivo имунизиране на нехуманоидно животно с антигена, последвано от in vitro афинитетно зреене на библиотеката от рекомбинантни антитела, изготвена от лимфоидни клетки на животното.
  17. 17. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че пулът от антитела се експонира на антигена чрез in vivo имунизиране на нехуманоидно животно с антигена, последвано от подбор на единични клетки, секретиращи антитела, които свързват антигена и получаване от единичните клетки на кДНК от тежко- и лековерижни вариабилни региони.
  18. 18. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че двойно-специфичното антитяло е изцяло човешко антитяло.
  19. 19. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че двойно-специфичното антитяло е химерно антитяло.
  20. 20. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че двойно-специфичното антитяло е CDR-присадено антитяло.
  21. 21. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че двата различни, но структурно сродни белтъка са интерлевкин-1 алфа и интерлевкин-1 бета.
  22. 22. Метод съгласно претенция 21, харак- теризиращ се с това, че антигенът представлява аминокиселинна последователност
    TKGGQDITDFQILENQ (SEQ ID NO: 3).
  23. 23. Метод съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че пулът от антитела се експонира на антигена in vivo чрез имунизиране на нехуманоидно животно с антигена.
  24. 24. Метод съгласно претенция 23, характеризиращ се с това, че се изготвя панел от хибридоми от лимфоцити на животното и се подбира хибридома, която секретира антитяло, което специфично свързва 1Ь-1алфа и 1Ь-1бета.
  25. 25. Метод съгласно претенция 23, харак
    66209 Bl теризиращ се с това, че животното е избрано от група, състояща се от мишки, плъхове, зайци и кози.
  26. 26. Метод съгласно претенция 23, характеризиращ се с това, че животното е нокаут мишка, дефицитна по IL-1 алфа, IL-1 бета или едновременно по 1Ь-1алфа и 1Ь-1бета.
  27. 27. Метод съгласно претенция 23, характеризиращ се с това, че животното е мишка, която е трансгенна по гените за човешки имуноглобулин, така че мишката синтезира човешки антитела при антигенна стимулация.
  28. 28. Метод съгласно претенция 23, характеризиращ се с това, че животното е мишка с остра комбинирана имунна недостатъчност (ОКИН), която се възстановява с помощта на човешки мононуклеарни клетки от периферна кръв или лимфоидни клетки или техни предшественици.
  29. 29. Метод съгласно претенция 23, характеризиращ се с това, че животното е мишка, която е третирана с летална като цяло за тялото радиация, последвано от радиозащита с клетки от костен мозък на мишка с остра комбинирана имунна недостатъчност (ОКИН), последвано от присаждане на функционални човешки лимфоцити или техни предшественици.
  30. 30. Метод съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че пулът от антитела се експонира на антигена in vitvo чрез скриниране на библиотека от рекомбинантни антитела с антигена.
  31. 31 Метод съгласно претенция 30, характеризиращ се с това, че библиотеката от рекомбинантни антитела се експресира по повърхността на бактериофаг.
  32. 32. Метод съгласно претенция 30, характеризиращ се с това, че библиотеката от рекомбинантни антитела се експресира по повърхността на дрождева клетка.
  33. 33. Метод съгласно претенция 30, характеризиращ се с това, че библиотеката от рекомбинантни антитела се експресира по повърхността на бактериална клетка.
  34. 34. Метод съгласно претенция 30, характеризиращ се с това, че библиотеката от рекомбинантни антитела се експресира като слети РНКбелтьк.
  35. 35. Метод съгласно претенция 30, характеризиращ се с това, че библиотеката от рекомбинантни антитела е scFv библиотека или Fab библиотека.
  36. 36. Метод съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че пулът от антитела се експонира на антигена чрез in vivo имунизиране на животно с антигена, последвано от in vitro скрининг на библиотека от рекомбинантни антитела, изготвена от лимфоидни клетки на животното с антигена.
  37. 37. Метод съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че пулът от антитела се експонира на антигена чрез in vivo имунизиране на животно с антигена, последвано от in vitro афинитетно зреене на библиотеката от рекомбинантни антитела, изготвена от лимфоидни клетки на животното.
  38. 38. Метод съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че пулът от антитела се експонира на антигена чрез in vivo имунизиране на животно с антигена, последвано от подбор на единични клетки, секретиращи антитела, които свързват антигена, и получаване от единичните клетки на кДНК от тежко- и лековерижни вариабилни региони.
  39. 39. Метод съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че двойно-специфичното антитяло е изцяло човешко антитяло.
  40. 40. Метод съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че двойно-специфичното антитяло е химерично антитяло.
  41. 41. Метод съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че двойно-специфичното антитяло е CDR-присадено антитяло.
  42. 42. Метод за получаване на двойно специфично антитяло, което специфично свързва интерлевкин-1 алфа и интерлевкин-1 бета, характеризиращ се с това, че включва: осигуряване на антиген с аминокиселинна последователност TKGGQDITDFQILENQ (SEQ ID NO: 3); експониране на пула от антитела на антигена; и подбор от пула на антитяло, което специфично свързва 1Ь-1алфа и 1Ь-1бета, за получаване на двойно специфичното антитяло, като въпросното двойно специфично антитяло не е изцяло мише антитяло.
  43. 43. Метод съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че антигенът е аранжиран на основата на непрекъсната топологична област на идентичност между IL-1 алфа и IL-1 бета.
  44. 44. Метод съгласно претенция 43, характеризиращ се с това, че антигенът е с аминоки
    66209 Bl селинна последователност NEAQNITDF (SEQ ID NO: 1) или dNdEdAdQNITDF.
  45. 45. Метод съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че антигенът е аранжиран на основата на структурна мимикрия на примката от общото за 1Ь-1алфа и 1Ь-1бета вгъване.
  46. 46. Метод съгласно претенция 45, характеризиращ се с това, че антигенът е цикличен пептид с аминокиселинни последователност ЦиклоMAFLRANQNNGKISVAL(PG) (SEQ ID NO: 2).
  47. 47. Метод съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че антигенът е с аминокиселинна последователност
    APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPY ELKALIILQGQDMEQQVVFSM GAYKSSKDDAKITVLLGLK EKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKN YPKKKMEKRF VFNKLEINNKLEFE SAQFPNWYISTSQA ENMPVFLGGTKG GQDITDFTMQFVSS (SEQ ID N0: 4).
  48. 48. Метод съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че пулът от антитела се експонира на антигена in vivo чрез имунизиране на животно с антигена.
  49. 49. Метод съгласно претенция 48, характеризиращ се с това, че се изготвя панел от хибридоми от лимфоцити на животното и се подбира хибридома, която секретира антитяло, което специфично свързва 1Ь-1алфа и 1Ь-1бета.
  50. 50. Метод съгласно претенция 48, характеризиращ се с това, че животното е избрано от група, състояща се от мишки, плъхове, зайци и кози.
  51. 51. Метод съгласно претенция 48, характеризиращ се с това, че животното е нокаут мишка, дефицитна по 1Ь-1алфа, 1Ь-1бета или едновременно по 1Ь-1алфа и IL-16eTa.
  52. 52. Метод съгласно претенция 48, характеризиращ се с това, че животното е мишка, която е трансгенна по гените за човешки имуноглобулин, така че мишката синтезира човешки антитела при антигенна стимулация.
  53. 53. Метод съгласно претенция 48, характеризиращ се с това, че животното е мишка с остра комбинирана имунна недостатъчност (ОКИН), която се възстановява с помощта на човешки мононуклеарни клетки от периферна кръв или лимфоидни клетки или техни предшественици.
  54. 54. Метод съгласно претенция 48, характеризиращ се с това, че животното е мишка, която е третирана с летална за тялото като цяло радиация, последвано от радиозащита с клетки от костен мозък на мишка с остра комбинирана имунна недостатъчност (ОКИН), последвано от присаждане на функционални човешки лимфоцити или техни предшественици.
  55. 55. Метод съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че пулът от антитела се експонира на антигена in vitvo чрез скриниране на библиотека от рекомбинантни антитела с антигена.
  56. 56. Метод съгласно претенция 55, характеризиращ се с това, че библиотеката от рекомбинантни антитела се експресира по повърхността на бактериофаг.
  57. 57. Метод съгласно претенция 55, характеризиращ се с това, че библиотеката от рекомбинантни антитела се експресира по повърхността на дрождева клетка.
  58. 58. Метод съгласно претенция 55, характеризиращ се с това, че библиотеката от рекомбинантни антитела се експресира по повърхността на бактериална клетка.
  59. 59. Метод съгласно претенция 55, характеризиращ се с това, че библиотеката от рекомбинантни антитела се експресира като слети РНК-белтък.
  60. 60. Метод съгласно претенция 55, характеризиращ се с това, че библиотеката от рекомбинантни антитела е scFv библиотека или Fab библиотека.
  61. 61. Метод съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че пулът от антитела се експонира на антигена чрез in vivo имунизиране на животно с антигена, последвано от in vitro скрининг на библиотека от рекомбинантни антитела, изготвена от лимфоидни клетки на животното с антигена.
  62. 62. Метод съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че пулът от антитела се експонира на антигена чрез in vivo имунизиране на животно с антигена, последвано от in vitro афинитетно зреене на библиотеката от рекомбинантни антитела, изготвена от лимфоидни клетки на животното.
  63. 63. Метод съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че пулът от антитела се експонира на антигена чрез in vivo имунизиране
    66209 Bl на животно с антигена, последвано от подбор на единични клетки, секретиращи антитела, които свързват антигена и получаване от единичните клетки на кДНК от тежко- и лековерижни вариабилни региони. 5
  64. 64. Метод съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че двойно-специфичното антитяло е изцяло човешко антитяло.
  65. 65. Метод съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че двойно-специфичното антитяло е химерно антитяло.
  66. 66. Метод съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че двойно-специфичното антитяло е CDR-присадено антитяло.
BG107483A 2000-06-29 2003-01-21 Методи за получаване на антитела с двойна специфичност BG66209B1 (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21537900P 2000-06-29 2000-06-29
PCT/US2001/020755 WO2002002773A2 (en) 2000-06-29 2001-06-28 Dual specificity antibodies and methods of making and using

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG107483A BG107483A (bg) 2003-09-30
BG66209B1 true BG66209B1 (bg) 2012-04-30

Family

ID=22802758

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG107483A BG66209B1 (bg) 2000-06-29 2003-01-21 Методи за получаване на антитела с двойна специфичност

Country Status (27)

Country Link
US (5) US7491516B2 (bg)
EP (4) EP1297142B1 (bg)
JP (2) JP4955185B2 (bg)
KR (2) KR100919593B1 (bg)
CN (3) CN101525384A (bg)
AT (1) ATE420958T1 (bg)
AU (1) AU2001271636A1 (bg)
BG (1) BG66209B1 (bg)
BR (1) BR0112026A (bg)
CA (1) CA2411374C (bg)
CZ (1) CZ2003291A3 (bg)
DE (1) DE60137421D1 (bg)
EC (1) ECSP024409A (bg)
ES (1) ES2319866T3 (bg)
HK (1) HK1055316A1 (bg)
HU (1) HUP0301002A3 (bg)
IL (3) IL153567A0 (bg)
MX (1) MXPA02012867A (bg)
NO (1) NO20026239L (bg)
NZ (1) NZ523080A (bg)
PE (1) PE20020132A1 (bg)
PL (1) PL208069B1 (bg)
SK (1) SK1152003A3 (bg)
TW (2) TW200516083A (bg)
UY (1) UY26807A1 (bg)
WO (1) WO2002002773A2 (bg)
ZA (1) ZA200210109B (bg)

Families Citing this family (175)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999000498A1 (en) * 1997-06-27 1999-01-07 Human Genome Sciences, Inc. Human nk-3 related prostate specific gene-1
EP1297142B1 (en) 2000-06-29 2009-01-14 Abbott Laboratories Dual specificity antibodies and methods of making and using
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
DE60237282D1 (de) * 2001-06-28 2010-09-23 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
GB0115841D0 (en) 2001-06-28 2001-08-22 Medical Res Council Ligand
US20060002935A1 (en) 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
US9028822B2 (en) 2002-06-28 2015-05-12 Domantis Limited Antagonists against TNFR1 and methods of use therefor
US20070104710A1 (en) * 2002-06-28 2007-05-10 Domants Limited Ligand that has binding specificity for IL-4 and/or IL-13
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
CA2965865C (en) 2002-07-18 2021-10-19 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
US20050271660A1 (en) 2002-09-06 2005-12-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Nebulization of monoclonal antibodies for treating pulmonary diseases
US20110223168A1 (en) * 2002-12-27 2011-09-15 Greg Winter Ligand that has binding specificity for il-4 and/or il-13
GB0230201D0 (en) * 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Retargeting
EP2395016A3 (en) 2003-05-30 2012-12-19 Merus B.V. Design and use of paired variable regions of specific binding molecules
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
DK1737971T3 (da) * 2004-01-20 2017-11-13 Merus Nv Blandinger af bindingsproteiner
AU2005207003C1 (en) * 2004-01-20 2013-06-13 Humanigen, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
TWI439284B (zh) * 2004-04-09 2014-06-01 Abbvie Biotechnology Ltd 用於治療ＴＮＦα相關失調症之多重可變劑量療法
US7790405B2 (en) 2004-04-26 2010-09-07 Centocor, Inc. Solution phase biopanning method using engineered decoy proteins
US7514539B2 (en) 2004-04-26 2009-04-07 Centocor, Inc. Epitope directed selection of antibodies to murine tissue factor
JP5017097B2 (ja) * 2004-04-26 2012-09-05 セントカー・インコーポレーテツド 設計デコイタンパク質を用いる溶液相バイオパニング方法
MXPA06014031A (es) 2004-06-01 2007-10-08 Domantis Ltd Anticuerpos de fusion biespecificos con vida media de serica mejorada.
EP1851245B1 (en) 2005-01-26 2012-10-10 Amgen Fremont Inc. Antibodies against interleukin-1 beta
KR100675791B1 (ko) * 2005-02-04 2007-02-02 제주대학교 산학협력단 육상어류양식장용 자동먹이공급시스템
CA2608058C (en) 2005-05-12 2013-09-10 Crucell Holland B.V. Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof
WO2006136601A1 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 Crucell Holland B.V. Optimization of west nile virus antibodies
SI1912675T1 (sl) 2005-07-25 2014-07-31 Emergent Product Development Seattle, Llc zmanjšanje števila celic B z uporabo molekul, ki se specifično vežejo na CD37 in CD20
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP2500356A3 (en) 2005-08-19 2012-10-24 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
MY169746A (en) 2005-08-19 2019-05-14 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
JP2009510002A (ja) 2005-09-30 2009-03-12 アボット ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフト 反発誘導分子（ｒｇｍ）タンパク質ファミリーのタンパク質の結合ドメイン、及びその機能的断片、及びそれらの使用
EP1940880A2 (en) * 2005-10-14 2008-07-09 Novo Nordisk A/S Treating diabetes using inhibitors of il-1
KR20110079922A (ko) * 2006-04-14 2011-07-11 노파르티스 아게 안과 장애 치료를 위한 ｉｌ－1 항체의 용도
AU2007255384B2 (en) * 2006-06-06 2012-09-27 Crucell Holland B.V. Human binding molecules having killing activity against staphylococci and uses thereof
CA2654317A1 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Single-chain multivalent binding proteins with effector function
AU2007281479A1 (en) * 2006-08-02 2008-02-07 California Institute Of Technology Methods and systems for detecting and/or sorting targets
WO2008027236A2 (en) * 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
RU2554747C9 (ru) * 2006-12-20 2015-10-20 Ксома (Сша) Ллс Способы лечения il-1бета-зависимых заболеваний
US8324350B2 (en) 2006-12-29 2012-12-04 Abbott Laboratories Dual-specific IL-1α/IL-1β antibodies
WO2008150491A2 (en) 2007-05-31 2008-12-11 Abbott Laboratories BIOMARKERS PREDICTIVE OF THE RESPONSIVENESS TO TNFα INHIBITORS IN AUTOIMMUNE DISORDERS
EP2195341B1 (en) 2007-09-26 2017-03-22 UCB Biopharma SPRL Dual specificity antibody fusions
WO2009079585A2 (en) 2007-12-17 2009-06-25 Dyax Corp. Compositions and methods for treating osteolytic disorders comprising mmp-14 binding proteins
US8962803B2 (en) 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
WO2009111508A2 (en) * 2008-03-03 2009-09-11 Dyax Corp. Metalloproteinase 9 and metalloproteinase 2 binding proteins
WO2009111450A2 (en) 2008-03-03 2009-09-11 Dyax Corp. Metalloproteinase 9 binding proteins
PT2132228E (pt) 2008-04-11 2011-10-11 Emergent Product Dev Seattle Imunoterapia de cd37 e sua combinação com um quimioterápico bifuncional
CA2722466A1 (en) 2008-04-29 2009-11-05 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
EP2297209A4 (en) 2008-06-03 2012-08-01 Abbott Lab IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
UY31861A (es) 2008-06-03 2010-01-05 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
WO2010006060A2 (en) * 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2324061B1 (en) 2008-09-03 2017-04-12 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific antibodies
US8377429B2 (en) * 2008-09-05 2013-02-19 Xoma Technology Ltd. Methods for improvement of beta cell function with anti-IL-1β antibodies or fragments thereof
CA2737056C (en) * 2008-09-12 2018-10-30 Xbiotech Inc. Targeting pathogenic monocytes
EA201100527A1 (ru) 2008-09-26 2011-10-31 Юсб Фарма С.А. Биологические продукты
EP2196476A1 (en) * 2008-12-10 2010-06-16 Novartis Ag Antibody formulation
TW201031421A (en) * 2009-01-29 2010-09-01 Abbott Lab IL-1 binding proteins
BRPI1013688A8 (pt) 2009-03-05 2017-02-14 Abbott Lab Proteínas de ligação de il-17.
RU2598248C2 (ru) * 2009-04-02 2016-09-20 Роше Гликарт Аг Полиспецифичные антитела, включающие антитела полной длины и одноцепочечные фрагменты fab
CN101957365B (zh) * 2009-07-21 2013-08-07 卫生部北京医院 检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白g双特异性抗体的试剂盒
TW201109438A (en) * 2009-07-29 2011-03-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP3029070A1 (en) 2009-08-29 2016-06-08 AbbVie Inc. Therapeutic dll4 binding proteins
NZ598929A (en) 2009-09-01 2014-05-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
GB201005063D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
TW201119676A (en) * 2009-10-15 2011-06-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
MX2012004412A (es) * 2009-10-15 2012-05-08 Abbott Lab Proteinas de union a il-1.
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
JP5951498B2 (ja) 2009-12-08 2016-07-13 アッヴィ・ドイチュラント・ゲー・エム・ベー・ハー・ウント・コー・カー・ゲー 網膜神経線維層変性の治療に使用するためのｒｇｍａタンパク質に対するモノクローナル抗体
US20130045209A1 (en) * 2010-01-12 2013-02-21 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. WNT-Binding Agents and Uses Thereof
EP3680253A3 (en) 2010-03-02 2020-09-30 AbbVie Inc. Therapeutic dll4 binding proteins
CA2796633C (en) * 2010-04-23 2020-10-27 Genentech, Inc. Production of heteromultimeric proteins
MY161302A (en) 2010-05-14 2017-04-14 Abbvie Inc IL-1 binding proteins
WO2012006500A2 (en) 2010-07-08 2012-01-12 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
JP2013537415A (ja) 2010-08-03 2013-10-03 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
KR20130100125A (ko) * 2010-08-13 2013-09-09 제넨테크, 인크. 질환의 치료를 위한, ＩＬ-1β 및 ＩＬ-18에 대한 항체
AU2011293253B2 (en) 2010-08-26 2014-12-11 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
PE20141060A1 (es) 2010-12-21 2014-09-26 Abbvie Inc Inmunoglobulinas de dominio variable dual biespecificas de il-1 alfa y beta y su uso
MX341578B (es) * 2011-02-08 2016-08-25 Abbvie Inc Tratamiento de la osteoartritis y del dolor.
EP2726506A1 (en) 2011-05-27 2014-05-07 Dutalys Removal of monomeric targets
CN103930445B (zh) 2011-05-27 2021-03-09 豪夫迈·罗氏有限公司 双靶向
WO2012176779A1 (ja) 2011-06-20 2012-12-27 協和発酵キリン株式会社 抗ｅｒｂＢ３抗体
WO2013059439A2 (en) 2011-10-21 2013-04-25 Dyax Corp. Combination therapy comprising an mmp-14 binding protein
WO2013063095A1 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Abbvie Inc. Immunobinders directed against sclerostin
CA2853114A1 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Abbvie Inc. Bispecific immunobinders directed against tnf and il-17
SG11201402533YA (en) * 2011-11-21 2014-09-26 Abbvie Inc Il-1 binding proteins
RU2482181C1 (ru) * 2011-12-07 2013-05-20 Учреждение Российской академии медицинских наук Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина РАМН Клеточная линия d11 множественной миеломы человека, используемая для гибридомной технологии
CN107459576A (zh) 2011-12-14 2017-12-12 艾伯维德国有限责任两合公司 用于诊断和治疗铁相关病症的组合物和方法
JP6336397B2 (ja) 2011-12-14 2018-06-06 アッヴィ・ドイチュラント・ゲー・エム・ベー・ハー・ウント・コー・カー・ゲー 鉄関連障害を診断および治療するための組成物および方法
KR101963230B1 (ko) 2011-12-26 2019-03-29 삼성전자주식회사 복수개의 단일 항체를 포함하는 단백질 복합체
US20130171059A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2861610A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against il-13 and/or il-17
NZ625403A (en) 2012-01-27 2016-03-31 Abbvie Inc Composition and method for diagnosis and treatment of diseases associated with neurite degeneration
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
AU2013249985B2 (en) 2012-04-20 2017-11-23 Merus N.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
UY34905A (es) 2012-07-12 2014-01-31 Abbvie Inc Proteínas de unión a il-1
KR101911438B1 (ko) 2012-10-31 2018-10-24 삼성전자주식회사 이중 특이 항원 결합 단백질 복합체 및 이중 특이 항체의 제조 방법
NZ707641A (en) 2012-11-01 2016-09-30 Abbvie Inc Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
SG11201503324WA (en) * 2012-11-01 2015-05-28 Abbvie Inc Stable dual variable domain immunoglobulin protein formulations
CA2890455A1 (en) 2012-12-04 2014-06-12 Abbvie, Inc. Blood-brain barrier (bbb) penetrating dual specific binding proteins
US9915665B2 (en) 2012-12-28 2018-03-13 Abbvie Inc. High-throughput system and method for identifying antibodies having specific antigen binding activities
WO2014106001A2 (en) 2012-12-28 2014-07-03 Abbvie, Inc. Dual specific binding proteins having a receptor sequence
US9856319B2 (en) 2012-12-28 2018-01-02 Abbvie Inc. Monovalent binding proteins
EP2948475A2 (en) 2013-01-23 2015-12-02 AbbVie Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
US9469686B2 (en) 2013-03-15 2016-10-18 Abbott Laboratories Anti-GP73 monoclonal antibodies and methods of obtaining the same
WO2014144299A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST TNFα
TW201512219A (zh) 2013-03-15 2015-04-01 Abbvie Inc 針對ＩＬ－１β及／或ＩＬ－１７之雙特異性結合蛋白
WO2014197885A2 (en) 2013-06-07 2014-12-11 Duke University Inhibitors of complement factor h
CN103308697B (zh) * 2013-06-09 2014-11-26 卫生部北京医院 检测抗丙型肝炎病毒编码的非结构蛋白ns3和ns5的天然双特异性抗体的试剂盒
US9879081B2 (en) 2013-06-25 2018-01-30 Samsung Electronics Co., Ltd. Protein complex, bispecific antibody including the protein complex, and method of preparation thereof
CA2923772A1 (en) 2013-09-17 2015-03-26 University Health Network (Uhn): Technology Development And Commercialization Agents directed against a cis rgma/neogenin interaction or lipid rafts and use of the same in methods of treatment
MX2016003617A (es) 2013-09-30 2016-07-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo para producir molecula de enlace al antigeno usando fago auxiliar modificado.
BR112016011027A2 (pt) 2013-12-20 2017-12-05 Genentech Inc método de produção de um anticorpo, anticorpos, composição farmacêutica, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método de tratamento de asma e método de tratamento de um distúrbio
CN106471117A (zh) 2014-05-06 2017-03-01 豪夫迈·罗氏有限公司 使用哺乳动物细胞产生异多聚体蛋白
US20160000936A1 (en) 2014-06-10 2016-01-07 Abbvie Inc. Biomarkers for inflammatory disease and methods of using same
WO2015191934A2 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Abbvie Inc. Blood-brain barrier (bbb) penetrating dual specific binding proteins for treating brain and neurological diseases
EP2985294A1 (en) 2014-08-14 2016-02-17 Deutsches Krebsforschungszentrum Recombinant antibody molecule and its use for target cell restricted T cell activation
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
JP6655302B2 (ja) * 2015-05-29 2020-02-26 デンカ生研株式会社 被検対象の検出方法並びにそのための免疫測定器具及びモノクローナル抗体
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
MX2018003040A (es) 2015-09-11 2018-04-11 Abbvie Inc Metodos para el tratamiento de formas recurrentes de esclerosis multiple.
EP3352760A4 (en) 2015-09-21 2019-03-06 Aptevo Research and Development LLC CD3 BINDING POLYPEPTIDES
UA124925C2 (en) 2015-10-02 2021-12-15 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
JP6734919B2 (ja) * 2015-10-02 2020-08-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 同時結合を測定するための細胞ベースのｆｒｅｔアッセイ法
WO2017087784A1 (en) 2015-11-18 2017-05-26 Duke University Tumor infiltrating lymphocytes for treatment of cancer
JP2019509737A (ja) 2016-03-11 2019-04-11 スカラー ロック インコーポレイテッドＳｃｈｏｌａｒ Ｒｏｃｋ，Ｉｎｃ． ＴＧＦβ１結合性免疫グロブリンおよびその使用
US20170349653A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Abbvie Inc. Methods for treating spinal cord injury and pain
BR112019006706A2 (pt) 2016-10-03 2019-06-25 Abbott Lab métodos melhorados para avaliar o estado de gfap em amostras de paciente
MX2019008197A (es) 2017-01-06 2019-09-11 Scholar Rock Inc Inhibidores de tgfb1 permisivos del contexto, espicificos de isoformas y uso de los mismos.
JP7346300B2 (ja) 2017-03-23 2023-09-19 アボット・ラボラトリーズ 早期バイオマーカーであるユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼｌ１を使用する、ヒト対象における外傷性脳損傷の程度の診断及び決定の一助となるための方法
PE20191494A1 (es) 2017-04-03 2019-10-21 Hoffmann La Roche Inmunoconjugados de un anticuerpo anti-pd-1 con un il-2 mutante o con il-15
TWI690538B (zh) 2017-04-05 2020-04-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 特異性結合至pd1至lag3的雙特異性抗體
EP3610268A1 (en) 2017-04-15 2020-02-19 Abbott Laboratories Methods for aiding in the hyperacute diagnosis and determination of traumatic brain injury in a human subject using early biomarkers
CN110603449A (zh) 2017-04-28 2019-12-20 雅培实验室 用同一人受试者的至少两种样品的早期生物标记物帮助超急性诊断确定创伤性脑损伤的方法
US10865238B1 (en) 2017-05-05 2020-12-15 Duke University Complement factor H antibodies
CA3078725A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 Abbott Laboratories Methods for aiding in the determination of whether to perform imaging on a human subject who has sustained or may have sustained an injury to the head using early biomarkers
AU2018275236A1 (en) 2017-05-30 2019-10-31 Abbott Laboratories Methods for aiding in diagnosing and evaluating a mild traumatic brain injury in a human subject using cardiac troponin I
EP3649474A1 (en) 2017-07-03 2020-05-13 Abbott Laboratories Improved methods for measuring ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 levels in blood
GB201711208D0 (en) 2017-07-12 2017-08-23 Iontas Ltd Ion channel inhibitors
WO2019093342A1 (ja) 2017-11-08 2019-05-16 協和発酵キリン株式会社 ＣＤ４０とＥｐＣＡＭに結合するバイスペシフィック抗体
CN110892266A (zh) 2017-12-09 2020-03-17 雅培实验室 使用gfap和uch-l1的组合辅助诊断和评价人类受试者中创伤性脑损伤的方法
BR112019028254A2 (pt) 2017-12-09 2020-07-14 Abbott Laboratories métodos para ajudar no diagnóstico e avaliação de um paciente que sofreu uma lesão ortopédica e que sofreu ou pode ter sofrido uma lesão na cabeça, tal como uma lesão cerebral traumática (lct) leve, usando a proteína ácida fibrilar glial (gfap) e/ou a hidrolase carbóxi-terminal da ubiquitina l1 (uch-l1)
EP3732489A1 (en) 2017-12-29 2020-11-04 Abbott Laboratories Novel biomarkers and methods for diagnosing and evaluating traumatic brain injury
MX2021000347A (es) 2018-07-11 2021-04-19 Scholar Rock Inc Inhibidores de tgf?1 selectivos de isoforma, de alta afinidad y usos de los mismos.
HRP20212034T1 (hr) 2018-07-11 2022-04-01 Scholar Rock, Inc. Izoformno selektivni inhibitori tgfbeta1 i njihove uporabe
WO2020014473A1 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Scholar Rock, Inc. TGFβ1 INHIBITORS AND USE THEREOF
CA3125316A1 (en) 2018-12-28 2020-07-02 Kyowa Kirin Co., Ltd. Bispecific antibody binding to tfr
EP3931573A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 Abbott Laboratories Methods for predicting major adverse cardiovascular events in subjects with coronary artery disease
EP3971293A4 (en) 2019-05-15 2023-02-08 Kyowa Kirin Co., Ltd. BISPECIFIC ANTIBODIES CAPABLE OF BINDING TO CD40 AND GPC3
KR20220008820A (ko) 2019-05-15 2022-01-21 쿄와 기린 가부시키가이샤 Cd40과 fap에 결합하는 이중 특이적 항체
EP4087649A1 (en) 2020-01-11 2022-11-16 Scholar Rock, Inc. Tgfbeta inhibitors and use thereof
EP4087659A2 (en) 2020-01-11 2022-11-16 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and use thereof
EP4136459A1 (en) 2020-04-13 2023-02-22 Abbott Laboratories Methods, complexes and kits for detecting or determining an amount of a ss-coronavirus antibody in a sample
CN111793131A (zh) * 2020-05-11 2020-10-20 廊坊天光生物技术有限公司 一种用于检测血清中pf4含量的抗体对及其用途
US20220043000A1 (en) 2020-08-04 2022-02-10 Abbott Laboratories Methods and kits for detecting sars-cov-2 protein in a sample
WO2022119841A1 (en) 2020-12-01 2022-06-09 Abbott Laboratories Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi
WO2023102384A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Abbott Laboratories Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi
WO2022147147A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Abbott Laboratories Methods for determining sars-cov-2 antigen and anti-sars-cov-2 antibody in a sample
WO2022204581A2 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and use thereof
BR112023024169A2 (pt) 2021-05-18 2024-02-06 Abbott Lab Métodos para avaliar lesão cerebral em um indivíduo pediátrico
EP4348260A2 (en) 2021-06-03 2024-04-10 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and therapeutic use thereof
JP2024521476A (ja) 2021-06-14 2024-05-31 アボット・ラボラトリーズ 音響エネルギー、電磁エネルギー、過圧波及び／又は爆風により引き起こされる脳損傷の診断法又は診断の一助となる方法
US20240301073A1 (en) 2021-07-14 2024-09-12 Scholar Rock, Inc. LTBP COMPLEX-SPECIFIC INHIBITORS OF TGFb1 AND USES THEREOF
JP2024530527A (ja) * 2021-08-13 2024-08-21 アブウィズ バイオ，インコーポレイテッド タンパク質及び抗体のヒト化、親和性成熟、及び最適化のための方法
CN118715440A (zh) 2021-08-31 2024-09-27 雅培实验室 诊断脑损伤的方法和系统
AU2022339759A1 (en) 2021-08-31 2024-03-07 Abbott Laboratories Methods and systems of diagnosing brain injury
AU2022354059A1 (en) 2021-09-30 2024-03-28 Abbott Laboratories Methods and systems of diagnosing brain injury
EP4448179A1 (en) 2021-12-17 2024-10-23 Abbott Laboratories Systems and methods for determining uch-l1, gfap, and other biomarkers in blood samples
AU2023216317A1 (en) 2022-02-04 2024-09-05 Abbott Laboratories Lateral flow methods, assays, and devices for detecting the presence or measuring the amount of ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 and/or glial fibrillary acidic protein in a sample
WO2024006876A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Abbott Laboratories Magnetic point-of-care systems and assays for determining gfap in biological samples
WO2024059708A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Abbott Laboratories Biomarkers and methods for differentiating between mild and supermild traumatic brain injury
WO2024187051A1 (en) 2023-03-07 2024-09-12 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors for use for treating resistant or unresponsive cancer in patients
WO2024211475A1 (en) 2023-04-04 2024-10-10 Abbott Laboratories Use of biomarkers to determine whether a subject has sustained, may have sustained or is suspected of sustaining a subacute acquired brain injury (abi)

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US126603A (en) 1872-05-07 Improvement in machines for sawing staves
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
FR2577377B1 (fr) * 1985-02-21 1989-06-16 Albaret Sa Procede pour eviter le patinage d'un tracteur equipe d'un relevage hydraulique avec un outil enfoui dans le sol, et equipement de tracteur pour mettre en oeuvre ce procede
US4772685A (en) * 1985-10-02 1988-09-20 Merck & Co., Inc. Immunogenic peptides of human interleukin-1 and the corresponding anti-peptide antibodies
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
AU4308689A (en) 1988-09-02 1990-04-02 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
AU665190B2 (en) 1990-07-10 1995-12-21 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
DE69333447T2 (de) 1992-05-22 2009-09-10 Montana State University, Bozeman Antikörper mit spezifikäten gegen mehrere adhäsionsmoleküle
US5622701A (en) * 1994-06-14 1997-04-22 Protein Design Labs, Inc. Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin
JPH10503179A (ja) * 1994-06-24 1998-03-24 イミュネックス・コーポレーション 放出制御性ポリペプチド組成物および炎症性腸疾患の治療方法
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2229043C (en) 1995-08-18 2016-06-07 Morphosys Gesellschaft Fur Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
CN103275221B (zh) 1996-02-09 2016-08-17 艾伯维生物技术有限公司 结合人TNFα的人抗体
US6300065B1 (en) 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
IL119587A (en) 1996-11-07 2000-12-06 Univ Ramot Method of preparing and for obtaining bimolecular interactions
KR20080059467A (ko) 1996-12-03 2008-06-27 아브게닉스, 인크. 복수의 ｖｈ 및 ｖｋ 부위를 함유하는 사람 면역글로불린유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된항체
DE69835143T2 (de) 1997-01-21 2007-06-06 The General Hospital Corp., Boston Selektion von proteinen mittels rns-protein fusionen
AU8755798A (en) 1997-04-04 1998-11-13 Biosite Diagnostics Incorporated Polyvalent and polyclonal libraries
WO1998049286A2 (en) 1997-05-01 1998-11-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Directed evolution of enzymes and antibodies
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
US6680380B1 (en) * 1998-09-18 2004-01-20 Schering Corporation Nucleic acids encoding mammalian interleukin-1ζ, related reagents and methods
TR200501367T2 (tr) 1999-03-25 2005-09-21 Abbott Gmbh & Co. Kg Beşeri IL-12'yi bağlayan beşeri antikorlar ve bunları üretmek için yöntemler.
GB0001448D0 (en) 2000-01-21 2000-03-08 Novartis Ag Organic compounds
EP1297142B1 (en) 2000-06-29 2009-01-14 Abbott Laboratories Dual specificity antibodies and methods of making and using
DE60237282D1 (de) 2001-06-28 2010-09-23 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
DK1517921T3 (da) * 2002-06-28 2006-10-09 Domantis Ltd Immunglobulin-enkeltvariable antigen-bindende domæner og dobbeltspecifikke konstruktioner deraf
KR20080077238A (ko) 2005-12-01 2008-08-21 도만티스 리미티드 인터루킨 1 수용체 타입 1에 결합하는 비경쟁적 도메인항체 포맷
US8324350B2 (en) * 2006-12-29 2012-12-04 Abbott Laboratories Dual-specific IL-1α/IL-1β antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002002773A3 (en) 2002-08-22
US7491516B2 (en) 2009-02-17
BR0112026A (pt) 2003-05-20
NZ523080A (en) 2004-11-26
CN101525384A (zh) 2009-09-09
JP2004502428A (ja) 2004-01-29
US20150175694A1 (en) 2015-06-25
ES2319866T3 (es) 2009-05-14
IL153567A (en) 2010-11-30
IL153567A0 (en) 2003-07-06
EP1297142B1 (en) 2009-01-14
CN102120773B (zh) 2013-07-24
HK1055316A1 (en) 2004-01-02
EP2386575A2 (en) 2011-11-16
TWI307716B (en) 2009-03-21
US20140155579A1 (en) 2014-06-05
US20090232736A1 (en) 2009-09-17
CN102120773A (zh) 2011-07-13
IL203955A (en) 2011-09-27
AU2001271636A1 (en) 2002-01-14
US20140378666A1 (en) 2014-12-25
EP2899210A2 (en) 2015-07-29
JP4955185B2 (ja) 2012-06-20
CN1451043A (zh) 2003-10-22
DE60137421D1 (de) 2009-03-05
EP2899210A3 (en) 2015-11-18
EP2042518A2 (en) 2009-04-01
KR100919593B1 (ko) 2009-09-29
CA2411374A1 (en) 2002-01-10
CZ2003291A3 (cs) 2003-05-14
ECSP024409A (es) 2003-02-06
KR20080074231A (ko) 2008-08-12
BG107483A (bg) 2003-09-30
EP2386575A3 (en) 2011-11-30
PL208069B1 (pl) 2011-03-31
WO2002002773A2 (en) 2002-01-10
UY26807A1 (es) 2002-01-31
EP1297142A2 (en) 2003-04-02
SK1152003A3 (en) 2003-07-01
ZA200210109B (en) 2004-03-12
MXPA02012867A (es) 2003-09-05
PL359995A1 (en) 2004-09-06
HUP0301002A2 (hu) 2003-07-28
ATE420958T1 (de) 2009-01-15
NO20026239L (no) 2003-02-27
HUP0301002A3 (en) 2005-12-28
KR20030014288A (ko) 2003-02-15
NO20026239D0 (no) 2002-12-27
PE20020132A1 (es) 2002-03-04
JP2012031178A (ja) 2012-02-16
CA2411374C (en) 2012-10-30
EP2042518A3 (en) 2009-04-08
TW200516083A (en) 2005-05-16
US20030040083A1 (en) 2003-02-27
US8475766B2 (en) 2013-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4955185B2 (ja) 二重特異性抗体ならびに作製方法および使用方法
JP6518917B2 (ja) 抗ｃｄ４０抗体およびその使用
KR100951067B1 (ko) 사람 인터류킨-18에 결합하는 항체 및 이를 제조하고사용하는 방법
PT2423230E (pt) Membro de ligação para o recetor de gm-csf
BRPI0721125A2 (pt) Anticorpos humanos que se ligam a il-12 humana e métodos para produção
AU2007202323C1 (en) Dual specificity antibodies and methods of making and using
AU2013203432A1 (en) Dual specificity antibodies and methods of making and using
AU2012200225A1 (en) Dual specificity antibodies and methods of making and using