CN103930445B - 双靶向 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于抗体的双靶向分子，且涉及用于生成这类双靶向分子的方法，包括基于文库的方法。

Description

双靶向
技术领域
本发明涉及基于抗体的双靶向分子，且涉及生成这种双靶向分子的方法，包括基于文库的方法。
发明背景
本发明涉及双特异性抗体或其功能片段的新型设计。
在文献中已报道了多种生成双特异性抗体分子的方法。这些方法可以分为两类：1）生成双特异性抗体形式，其中识别两个靶标或两个表位的两个互补位都位于由一个互补VH-VL配对形成的一个异源二聚抗体可变区内，并且都包含属于该互补VH-VL配对的CDR残基，和2）生成其它双特异性抗体形式，其中识别两个靶标或表位的两个互补位并不都位于由一个互补VH-VL配对形成的异源二聚抗体可变区内，并且并不都包含属于该同一互补VH-VL配对的CDR残基。
在第一类方法内，在文献中只描述了两种可预见地设计双特异性抗体分子的方法，并且在下面的[0014]至[0015]段中进行了详细的论述。然而要介绍本方法，首先要概述第二类方法。
第二类方法（其中识别两个靶标或表位的两个互补位并不都位于由一个互补VH-VL配对形成的一个异源质二聚抗体可变区内，并且并不都包含属于该同一互补VH-VL配对的CDR残基）构成多个前人工作的大部分内容，并且已描述了这种双特异性抗体的多种不同的实例。
在属于第二类方法的第一组实例中，通过化学连接或通过基因融合由一个或多个肽连接体结合有不同特异性的两个或多个抗体片段（包括Fab片段、单链Fv或单一抗体结构域）。在这组实例中公开的双特异性抗体形式包括以下：
a.双抗体（Perisic et al.,Structure.1994Dec15;2(12):1217-26;Kontermann,Acta Pharmacol Sin.2005Jan;26(1):1-9;Kontermann,Curr Opin Mol Ther.2010Apr;12(2):176-83.)
b.串联双抗体(TandAb)等(Cochlovius et al.,Cancer Res.2000Aug15;60(16):4336-41.)
c.对由肽连接体基因融合的不同靶标有特异性的单一结构域（e.g.Domantis:WO2008/096158;Ablynx:WO2007/112940)
d.其它（供参阅，参见：Enever et al.,Curr Opin Biotechnol.2009Aug;20(4):405-11.Epub2009Aug24.;Carter,Nat.Rev.Immunol.6,343(2006);P.Kufer et al.,Trends Biotechnol.22,238(2004)).
为了改善其在医学应用中的潜在的可用性，可以用多种技术延长上述双特异性抗体形式的体内血清半衰期，包括以下：
a.加入血清白蛋白或血清白蛋白结合体
b.聚乙二醇化(PEGylation)
c.通过基因融合如HAPylation(Schlapschy et al.,Protein Eng DesSel.2007Jun;20(6):273-84.Epub2007Jun26)或XTEN(Schellenberger,Nat.Biotechnology12(2009)1186)加入蛋白聚合物。
在这组实例中，包含抗体片段的双特异性抗体缺少Fc区，并因此通常不显示与初生Fc受体FcRn的天然结合，不表现全IgG抗体的天然效应子功能（ADCC和CDC，参考），并且通常不会被超抗原衍生的亲和树脂、如以对IgG抗体同样的方式对Fc区有特异性的蛋白A树脂纯化。缺少Fc区的结果是会限制可达到的血清半衰期、作为活性药物成分的可行性应用以及这种双特异性抗体的经济生产。
在属于第二类方法的第二组实例中，双特异性抗体包含类IgG分子和一个或几个额外附加的结合结构域或实体。这些抗体包括IgG-scFv融合蛋白，其中单链Fv已融合至重链或轻链的一端（加利福尼亚大学，Biogen Idec,CAT/MedImmune），和双可变结构域(dvd-IgG)分子，其中额外的VH结构域和连接体融合至重链的N末端，且额外的VL结构域和连接体融合至轻链的N端(Abbott)。通常，这些方法在构建体的生产、可及性和稳定性方面存在不足。
在属于第二类方法的第三组实例中，双特异性抗体包含以这样的方式生成或修饰的类IgG抗体，使得其在不加入进一步的结合结构域或实体的情况下表现两种特异性。这些抗体包括IgG分子，其中已修饰天然同型二聚体CH3结构域使其变成异源二聚体，例如使用设计的突起(Ridgway et al.,Protein Eng.1996Jul;9(7):617-21)、使用链交换(Daviset al.,Protein Eng Des Sel.2010Apr;23(4):195-202.Epub2010Feb4)或使用设计的相反变化(Novo Nordisk)，从而潜在地使两半的类IgG分子通过加到Fc区、通常是N-末端Fab区的结合实体而结合两个不同的靶标。该第三组实例中的抗体还包括IgG分子，其中修饰不天然参与抗原接触的一些结构环以结合另一靶标，除了通过可变区CDR环天然结合的一个以外，例如通过Fc区中的点突变（例如Xencor Fc结合FcgRIIb）或通过结构环的多样化（例如具有多样化的CH3结构域的f-star Mab2）。这些方法在稳定性、生产、化合价以及有限的亲和力/应用方面存在不足。
与第二类中双特异性抗体的所有上述实例相反，第一类中的双特异性抗体具有对两个靶标有特异性的两个互补位，这两个靶标都包含位于同一异源质二聚VH-VL抗体可变结构域内的CDR残基。本领域中仅描述了归于第一类的四种抗体分子。这四种类型中，第一种抗体不是真的双特异性抗体，因为其不能特异性识别两个不相关的靶标；第二种抗体是天然产生的，但由于还没有公开这类研究的实例，因此是否可以可预见地设计尚不可知，；以及根据出版物，只有第三类和第四类抗体可以被设计为对两个不相关靶标有特异性。归于第一类的四种抗体分子如下：
可交叉反应抗体具有与两个或多个结构相关的抗原或表位相对应的单一广谱特异性。对于这类抗体，这两种抗原在序列和结构上是相关的。例如，抗体可以与来自不同物种的相关靶标如鸡蛋清溶菌酶和火鸡溶菌酶交叉反应(WO92/01047)，或与处于不同状态或形式的相同靶标如半抗原和与载体共轭的半抗原交叉反应(Griffiths AD et al.EMBOJ199413:14 3245-60)。可以有目的地设计用于交叉反应的抗体。例如，已设计抗体以识别来自不同物种的两个相关的抗原（example Genentech:antibody binding humanLFA1engineered to also bind rhesus LFA1,resulting in successful drug Raptiva/Efalizumab）。同样地，WO02/02773描述了有“双特异性”的抗体分子。提及的抗体分子是针对多个结构相关的抗原培养或筛选的抗体，其具有可以适应两个或多个结构相关的靶标的单一结合特异性。然而如上所述，这些可交叉反应的抗体并不都真的双特异性抗体，且其并未都被设计(engineered)为特异性识别两种不相关靶标。
此外，有天然产生的多反应性自身抗体(Casali&Notkins,Ann.Rev.Immunol.7,515-531)。这些多反应性自身抗体具有识别不结构上不相关的至少两个（一般更多）不同抗原或表位的能力。还示出，在单克隆抗体上使用噬菌体展示技术对随机肽组分的选择将识别一些适合抗原结合位点的肽序列。一些序列高度相关，具有共有序列，然而其它的序列很不相同，并且已被称为模拟表位(Lane&Stephen,Current Opinion in Immunology,1993,5,268-271)。因此，很清楚一些异源二聚VH-VL抗体的结合位点具有与不同的且有时不相关的抗原结合的潜力。然而如上所述，这些多反应性抗体可以被发现但还不能使用本领域描述的可预见的方法有意地设计。
本领域中描述的一种方法涉及“二合一”抗体，其允许有意设计这样的双特异性抗体，，即通过都位于一个互补异质源二聚VH-VL配对内且都包含属于该互补VH-VL配对的CDR残基的互补位，其能够结合两个结构无关的靶标的两个双特异性抗体。使用有与以前的交叉反应设计法所不同的方法设计这些“二合一”抗体，以包含两个重叠互补位。WO2008/027236和Bostrom等(Bostrom et al.,Science.2009Mar20;323(5921):1610-4)已经描述了这些内容。在公开实例中，分离对一个靶标(HER2)有特异性的异源二聚VH-VL抗体可变区，并于其后重新多样化轻链以实现对第二靶标(VEGF或死亡受体5)的额外特异性。对于生成的抗体之一，结合的特征在于结构解析度，并且发现与一个抗体-抗原络合物中的HER2接触的VH和VL CDR残基有11/13，还与替代的抗体-抗原络合物中的VEGF接触。当公开的“二合一”抗体保留了对HER2的纳米摩尔级亲和力时，由Bostrom等公布的克隆中只有一个对额外靶标VEGF有300nM的纳米摩尔级亲和力，而四个其它克隆对额外靶标有微摩尔级亲和力。显然，当这种方法已实现与两个结构不相关的靶标的结合时，需要该两个靶标之间的表面相容性达到一定程度以启用两个重叠互补位的特异性。还没有详细描述这种“二合一”抗体对仅有的两个靶标有多高的特异性，以及是否能观察到可能由对位于两个互补位的重叠部分之间的侧链的构象柔性的需求引起的这些抗体的一般非特异性结合或“粘贴”。
本领域中描述的第二个方法涉及包含单结构域抗体互补对的抗体，其允许有意设计双特异性抗体，即通过都位于一个互补异源二聚VH-VL配对内且都包含属于该互补VH-VL配对的CDR残基的互补位，使其能够与两个结构无关的靶标结合。WO2003/002609和US2007/026482已描述异源质二聚VH-VL抗体，其中重链可变结构域识别一个靶标，且轻链可变结构域识别第二结构不相关的靶标，且其中具有不同特异性的两个单结构域结合到一个结合异源二聚VH-VL可变区中。在这些抗体的公开实例中，首先将单结构域分别筛选为不成对VH结构域或不成对VL结构域，以结合两个不相关的靶标，然后结合到对该两个靶标有特异性的结合异源二聚VH-VL可变结构域。
对于属于第一类双特异性抗体（能够通过都位于一个互补异源VH-VL配对内且都包含属于该互补VH-VL配对的CDR残基的两个互补位与两个靶标结合）的所有分子，不需要将额外的结构域或实体融合至IgG分子，不需要使IgG分子的结构环多样化，且不需要利用有限的异质双特异性Fc区以实现双特异性。这有几个潜在的优点：
减小了蛋白质稳定性降低的风险，因为不必使结构环多样化，且不必修饰恒定结构域界面，从而潜在地极大地改善了抗体的生物物理特性。
不需要潜在地易于蛋白水解或潜在地致免疫性的连接体，从而改善了抗体作为活性药物成分的可开发性。
不会出现不期望的VH和VL结构域配对，避免了表达期间包含错配的异源二聚VH-VL可变区的潜在副产物，因为只需要一个唯一的VH区和一个唯一的VL区。
不会降低不寻常的共价凝集体表达或生成，因为与传统的单特异性抗体相比，不需要额外的二硫键。
可以将在互补异源二聚VH-VL配对内包含两个互补位的双特异性异源二聚可变区与包括Fc区的不同的恒定结构域结合。这具有几个优点：
a.使用完全确立的方法，例如与传统的单特异性IgG的制备中使用的那些相同的方法，潜在地改善了制备。
b.在患者和动物模型中调节FcRn介导的血清半衰期。
c.自由选择与不同同种型有关的效应子功能，范围从本质上细胞无毒性惰性行为（例如在设计用于受体封阻的抗体中）到侵略性细胞毒性行为（例如在设计以杀死肿瘤细胞的抗体中）。
由与交叉反应设计相关的方法得到的“二合一”抗体的上述第三个实例的医学应用性，潜在地极大地受到对于CDR环内重叠的、至少部分共享的结合残基的两个不相关的靶标的竞争的限制。此外，首先实现对一个靶标有特异性的“二合一”抗体的固有顺序选择方法，随后重新多样化，然后发现对额外靶标有特异性的克隆，这是耗时且不可预测的，因为只有有限量的对第一靶标有特异性的抗体可以被重新多样化进可选择文库中，但不知道该第一特异性克隆中的哪个是最经得起检验以设计额外期望的特异性。最后，因为为了增加与一个靶标的结合对可变结构域序列的任何改进会潜在地引起对另一靶标的亲和力降低，这一事实使得“二合一”抗体的分离和亲和性成熟变得极为复杂。
因为一些负责与第一靶标结合的潜在的重要轻链CDR残基与一些负责与在最后的且紧密的双特异性异源二聚抗体可变区中的第二靶标结合的潜在重要重链CDR残基直接相邻，这一事实使得上述通过轻链CDR环残基结合一个靶标和通过重链CDR环残基结合另一靶标的上述四个实例变得极为复杂。这意味着在其结合状态，由于位阻，由这些抗体识别的第一靶标可以与由这些抗体识别的第二靶标竞争，因而潜在地限制了这些抗体的医学应用性。此外，如果这些抗体的轻链和重链通过US2007026482(Abbott Laboratories)的历史实例中描述的选择和筛选方法单独地分离，由于重链和轻链配对可能出现CDR中的构象变化，因此将它们结合到双特异性抗体可能会潜在地影响本来独立的结构域对结合的双特异性分子中的单个靶标的亲和力。最后，将预分离的VH和VL可变结构域与各种CDR环结合，可能会导致不可预料的抗体稳定性，因为
Figure BDA0000463154380000071
和Plückthun(1998)以及
Figure BDA0000463154380000072
等(2005)已描述了VH和VL结构域之间存在抗体重链和轻链的重要的相互作用和相互稳定。
相反，互补异源二聚VH-VL配对内包含两个互补位的双特异性异二聚源可变区可以用作抗体片段，如Fab片段或单链Fv，且不需要存在Fc区以实现其双特异性，这允许在没有哺乳类N-糖基化机制的情况下选择微生物生产，以及其在需要低分子量或短血清半衰期的治疗或诊断应用中的用途。
因此，尽管在互补异源二聚VH-VL配对中有两个互补位的方法有如此多的优点，但是到目前为止，以上描述的尝试的成功有限。
因此，仍然未满足提供用于包括在互补异源二聚VH-VL配对中有两个互补位的优点同时避免了现有技术构建体的问题的双特异性抗体的改进形式的需要。
本发明已提供了该问题的解决方案，即设计用于每个互补异源二聚VH-VL配对的两个互补位，其中每个互补位使用来自VH和VL结构域的CDR区的残基，到目前为止，这尚未被现有技术实现或暗示。
发明概述
本发明涉及双特异性抗体，其特征在于，每一互补异源二聚VH-VL配对具有两个互补位，其中每一互补位使用来自VH和VL结构域的CDR区的残基。
因而，在第一方面，本发明涉及抗体或其功能片段，其包含由重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域组成的至少一个可变结合结构域，其中所述结合结构域包含两个不相关表位的两个互补位，其中(i)每一互补位与其表位的结合并不阻止其他互补位与其各自表位同时结合，且其中(ii)两个互补位均包含来自至少一个VH CDR的至少一个残基和来自至少一个VL CDR的至少一个残基。
在第二方面，本发明涉及编码本发明的抗体或其功能片段的核酸序列。
在第三方面，本发明涉及包含本发明的核酸序列的载体。
在第四方面，本发明涉及包含本发明的核酸序列或本发明的载体的宿主细胞。
在第五方面，本发明涉及产生本发明的抗体或其功能片段的方法，包括以下步骤：在体外或由合适的宿主细胞表达本发明的核酸序列或本发明的载体，所述宿主细胞包括本发明的宿主细胞。
在第六方面，本发明涉及抗体或其功能片段的集合，其中所述集合包括抗体可变结构域序列的多样化集合，其中(i)使来自Lib1位置的至少3个CDR残基多样化，条件是至少一个多样化的残基位于VH结构域内，且至少一个多样化的位置位于VL结构域内，且其中来自Lib2位置的残基没有被多样化；或(ii)使来自Lib2位置的至少3个CDR残基多样化，条件是至少一个多样化的残基位于VH结构域内，且至少一个多样化的位置位于VL结构域内，且其中来自Lib1位置的残基没有被多样化。
在第七方面，本发明涉及产生双特异性抗体分子或其功能片段的方法，包括以下步骤：
a.产生抗体分子或其功能片段的第一集合，每一抗体分子或其功能片段都包含异源二聚VH-VL可变结构域，其中在选自Lib1组的至少3个CDR位置具有多样性，条件是至少一个多样化残基位于VH结构域内且至少一个多样化的位置位于VL结构域内，并且其中来自Lib2的残基没有被多样化；
b.从所述第一集合中筛选对第一靶标或表位有特异性的第一抗体分子或其功能片段；
c.产生抗体分子或其功能片段的第二集合，每一抗体分子或其功能片段都包含异源二聚VH-VL可变结构域，其中在选自Lib2组的至少3个CDR位置具有多样性，条件是至少一个多样化残基位于VH结构域内且至少一个多样化的位置位于VL结构域内，并且其中来自Lib1的残基没有被多样化；
d.从所述第二集合中筛选对第二靶标或表位有特异性的第二抗体分子或其功能片段；以及
e.产生编码包含异源二聚VH-VL可变区的第三抗体分子或其功能片段的核酸序列，其中所述第三抗体分子或其功能片段包含第一抗体分子或其功能片段中Lib1位置的组中存在的至少3个残基，其中至少一个残基位于VH结构域内且至少一个残基位于VL结构域内，并且其中所述第三抗体分子或其功能片段还包含第二抗体分子或其功能片段中Lib2位置的组中存在的至少3个残基，其中至少一个残基位于VH结构域内且至少一个残基位于VL结构域内。
在第八方面，本发明涉及产生双特异性抗体分子或其功能片段的方法，包括以下步骤：
a.产生抗体分子或其功能片段的第一集合，每一包含异源二聚VH-VL可变区，其中在选自Lib1组的至少3个CDR位置具有多样性，条件是至少一个多样化的残基位于VH结构域内且至少一个多样化的残基位于VL结构域内，并且其中来自Lib2位置的残基没有被多样化；
b.从所述第一次集合中筛选对第一靶标或表位有特异性的第一抗体分子或其功能片段；
c.产生抗体分子或其功能片段的第二集合，每一抗体分子或其功能片段都包含异源二聚VH-VL可变区，其通过以下方式进行：在选自Lib2的组的至少3个CDR位置引入多样性，使得所述第一抗体分子或其功能片段多样化，条件是至少一个多样化的残基位于VH结构域内且至少一个多样化的残基位于VL结构域内，并且其中来自Lib1的残基没有被多样化；
d.从所述第二集合中筛选对第二靶标或表位有特异性的第二抗体分子或其功能片段；以及
e.可选地，在具有以下修饰的情况下，实施步骤a至d，通过使选自Lib2组的至少3个CDR位置多样化来产生步骤a的第一集合，并在步骤c中，在选自Lib1组的至少3个CDR位置使所述第一抗体分子或其抗体片段多样化。
在第九方面，本发明涉及包含抗体分子或其功能片段的药物组合物，并任选地包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
附图说明
下面的图1示出优选CDR位置的列表，其中在本发明的一些实施方案中的抗体文库中的所有位置或子集应多样化(A)；框架区中优选的可选的增强位置的列表，其在本发明的一些实施方案中的抗体文库中也可以被多样化(B)；以及优选CDR位置的列表，其中在本发明的所有文库中，所有位置或子集优选保持不变，即都位于Lib1残基被多样化的文库中和Lib2残基被多样化的文库中。
下面的图2以示意图的方式示出该新型双特异性抗体的发现过程，使用俯视（空中）图示出首先在代表Lib1和Lib2CDR残基的两个区中分别是如何使异源二聚VH-VL抗体支架多样化的；这产生了分别筛选以获得两个抗体克隆的两个文库，其中第一克隆通过第一互补位结合第一靶标或表位，且第二克隆通过第二互补位结合第二靶标或表位；根据本发明，然后通过将在第一抗体克隆中的Lib1位置中筛选的靶标-特异性残基引入到第二抗体克隆，或通过将在第二抗体克隆中的Lib2位置中筛选的靶标-特异性残基引入到第一抗体克隆，将这些克隆结合进双特异性抗体。图2还以示意图的方式示出从俯视（空中）图中可见的框架区中的本发明的那些潜在的增强残基的位置。
图3示出我们已测试的四种优选的文库设计(文库Lib D1L1、Lib D1L2、Lib D1H1和Lib D1H2)。我们生成这四种文库中的每一个，作为编码具有示出的VH3-VK1配对作为异源二聚VH-VL支架的人Fab片段的合成基因的库。每个文库中的合成基因在以单一字母代码显示特定氨基酸的位置中是不变的，且在标记为“X”的位置是多样化的。该四个文库每一个都生成为噬菌体展示库，并使用本领域中已知的标准方法针对几种抗原分类。从这四个文库中选择的抗体克隆已结合进如图4详述的双特异性抗体中。图3进一步示出了三种额外优选的文库设计(Lib D1H3、Lib D2L1和Lib D2H1)。
图4给出根据本发明生成的双特异性抗体序列的实例。
图5示出图4公开的抗体的特异性，通过抗MBP抗GST双靶向克隆HM2LG1的ELISA分析证明。
图6示出阐明本发明的双特异性构建体的高特异性的BiacoreTM数据。
图7示出针对VEGF和IL6的亲本抗体和双特异性抗体的BiacoreTM分析。
图8示出阐明两个靶标独立共结合本发明的双特异性构建体的BiacoreTM信息：A:GMCSF+抗体+IL6的共结合;B:抗LC+抗体+IL6的共结合
发明详述
与以前的方法相比，迄今为止本发明用于构建双特异性抗体的特殊性尚不为人所知，其可能在于对于每一互补异源二聚VH-VL配对具有两个互补位，其中每一互补位使用来自VH和VL结构域的CDR区的残基。
因而，在第一方面，本发明涉及抗体或其功能片段，其包含由重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域组成的至少一个可变结合结构域，其中所述结合结构域包含对于两个不相关的表位的两个互补位，其中(i)每一互补位与其表位的结合并不阻止其他互补位与其各自表位同时结合，且其中(ii)两个互补位均包含来自至少一个VH CDR的至少一个残基和来自至少一个VL CDR的至少一个残基。
本文使用的术语“抗体”指免疫球蛋白(Ig)分子，其被定义为属于IgG、IgM、IgE、IgA或IgD类（或其任何子类）的蛋白，其包括所有常规上已知的抗体及其功能片段。抗体/免疫球蛋白分子的“功能片段”在此被定义为保留抗原结合区的抗体/免疫球蛋白分子的片段（例如IgG的可变区）。抗体的“抗原结合区”通常存在于抗体分子的一个或多个高变区（或互补决定区，“CDR”）中，即CDR-1、CDR-2和/或CDR-3区；然而，可变“框架”区在抗原结合中还起着重要作用，例如为CDR提供支架。优选地，“抗原结合区”至少包含可变轻链(VL)的4-103的氨基酸残基和可变重链(VH)的5-109的氨基酸残基，更优选为VL的3-107的氨基酸残基和VH的4-111的氨基酸残基，且特别优选的是完整的VL和VH链（VL的氨基酸位置1-109和VH的氨基酸位置1-113；根据WO97/08320编号）。用于本发明的优选的抗体分子的种类是IgG。
本发明的“功能片段”包括F(ab')2片段、Fab片段、scFv或包含单一免疫球蛋白可变结构域或单一结构域抗体多肽的构建体，例如单一重链可变结构域或单一轻链可变结构域。可以将F(ab')2或Fab工程化为使CH1和CL结构域之间发生的分子间二硫化物相互作用最小化或完全去除。
可以通过免疫动物或者由重组抗体文库衍生抗体，重组抗体文库包括基于已经经由电脑模拟（in silicon）设计的且由合成产生的核酸编码的氨基酸序列的抗体文库。例如通过分析人类序列的数据库并利用从其中获得的数据设计多肽序列，来实现经由电脑模拟设计抗体序列。用于设计和获得经由电脑模拟产生的序列的方法，例如描述于Knappik etal.,J.Mol.Biol.(2000)296:57；Krebs et al.,J.Immunol.Methods.(2001)254:67；和Knappik等人发表的美国专利No.6300064。
在本发明的上下文中，术语“双特异性抗体分子”指包括抗体分子的功能片段的抗体分子，其包含针对两个不同的靶生物分子或者存在于一个靶生物分子或存在于两个不同的分子上（例如在靶生物分子和第二生物分子上）的两个不同的表位的特异性结合位点。
当结合分子能够区别靶生物分子和一个或多个对照分子时，由于结合特异性是相对的特性而不是绝对的，因此本文使用的结合分子对靶标例如靶生物分子（或这类生物分子的表位）有“特异性”、“特异性识别”或“特异性结合”。在最普遍的方式中（且没有提及确定的对照下），“特异性结合”指结合分子区别目标靶生物分子和不相关的生物分子的能力，如同例如根据本领域已知的特异性测定法确定的。这样的方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA试验和肽扫描。例如，可以进行标准ELISA试验。可以通过标准的彩色显影（例如用第二抗体与辣根过氧化物和四甲基联苯胺与过氧化氢）(e.g.secondaryantibody with horseradish peroxide and tetramethyl benzidine withhydrogenperoxide)进行评分。通过光密度，例如在450nm下的光密度对某些孔内的反应评分。典型背景（=阴性反应）可以为约0.1OD；典型的阳性反应可以为约1OD。这意味着阳性评分和阴性评分之间的比为10倍或更高。通常，不是使用单一对照生物分子而是一组约3-5个不相关的生物分子，例如奶粉、BSA、转铁蛋白等，来进行结合特异性的确定。
在本发明的背景下，术语“约(about)”或“大约(approximately)”意指给定值或范围的90%和110%之间。
然而，“特异性结合”还可以指结合分子区别靶生物分子和用作对照点的一个或多个密切相关的生物分子的能力。此外，“特异性结合”可以涉及结合分子区别它的靶抗原的不同部分的能力，例如靶生物分子的不同结构域、区或表位，或者区别靶生物分子的一个或多个关键氨基酸残基或氨基酸残基片段的能力。
在本发明的上下文中，术语“互补位”指给定抗体分子的靶和抗体分子之间的特异性结合所必需的部分。互补位可以是连续的，即由抗体分子中存在的相邻的氨基酸残基形成；或者可以是不连续的，即由氨基酸残基的基本序列诸如位于氨基酸残基的CDR的氨基酸序列中的不同位置的、但在抗体分子采用的三维结构中极为贴近的氨基酸残基形成。
在本发明的背景下，术语“表位”指给定靶的靶和抗体之间的特异性结合所必需的部分。表位可以是连续的，即由靶中存在的相邻的结构要素形成；或者是不连续的，即由靶的基本序列诸如作为靶的蛋白的氨基酸序列中的不同位置的、但在天然环境例如体液中靶所采用的三维结构中处于极为贴近的结构要素形成。
在一个实施方案中，抗体或其功能片段是双特异性抗体。
在本发明的抗体或其功能片段的另外的实施方案中，其他条件相同，在同时存在两个表位的情况下每一互补位与其各自表位的结合量是在缺少另一表位的情况下达到的结合量的至少25%。
在本发明的抗体或其功能片段的另外的实施方案中，结合量是至少50%，特别是至少75%，更特别是至少90%。
在本发明的抗体或其功能片段的另外的实施方案中，第一互补位包含来自VL结构域的CDR1和CDR3的残基和来自VH结构域的CDR2的残基，且第二互补位包含来自VH结构域的CDR1和CDR3的残基和来自VL结构域的CDR2的残基。
在具体的实施方案中，抗体或其功能片段是人抗体或其功能片段。
在其他实施方案中，本发明的抗体或其功能片段是基于人VH3家族重链序列和人Vκ1族轻链序列。
在其他实施方案中，本发明的抗体或其功能片段是基于人VH3家族重链序列和人Vλ1族轻链。
在其他实施方案中，本发明的抗体或其功能片段选自单链Fv片段、Fab片段和IgG。
在本发明的抗体或其功能片段的另外的实施方案中，可以通过使Lib1或Lib2位置的其中之一发生突变来打破与一个表位的结合，同时保持与另一表位的结合完整。
在该背景下，短语“打破结合(binding..[is]..knocked out)”指与表位的亲和力降低至少10倍（例如从1nM至10nM）的情况，且短语“保持结合完整(binding..is keptintact)”指与表位的亲和力最多降低3倍（例如从1nM至3nM）的情况。
在具体的这类实施方案中，可以通过使VL位置27或VH位置61的其中之一发生突变或者通过使Lib2位置的VL位置56或VH位置28的其中之一发生突变，来打破与表位的结合。
在具体的这类实施方案中，当残基选自D、N、E和Q时，可以通过使[0066]部分列出的残基的其中之一突变为R，来打破与表位的结合；当残基不同于D、N、E或Q时，可以通过使这类残基突变为D来打破与表位的结合。
在另一方面，本发明涉及包含含有一条可变轻链和一条可变重链的至少一个抗体可变结构域的结合分子，其中所述抗体可变结构域至少与第一靶标和第二靶标结合，其中所述抗体可变结构域与所述第一靶标的结合独立于所述抗体可变结构域与所述第二靶标的结合，反之亦然，并且其中所述第一靶标和第二靶标既不是抗独特型(anti-idiotypic)抗体，也不是非生理型多肽，例如用于表位作图的多肽类。
在本发明的背景下，抗体可变结构域与一个靶标的结合“独立于”与另一靶标的结合，其他条件相同时，在同时存在两个靶标的情况下第一互补位与其相应表位（第一靶标）的结合量是在缺少另一靶标的情况下达到的结合量的至少25%。特别的是，结合量是至少50%，特别是至少75%，更特别是至少90%。
在具体的实施方案中，所述第一靶标和第二靶标均是生理上相关的靶标和/或其表位，包括疾病相关的靶标，例如癌相关的抗原、细胞表面受体、细胞因子和/或其他信号分子。
在第二方面，本发明涉及编码本发明的抗体或其功能片段的核酸序列。
在第三方面，本发明涉及包含本发明的核酸序列的载体。
在第四方面，本发明涉及包含本发明的核酸序列或本发明的载体的宿主细胞。
在第五方面，本发明涉及用于产生本发明的抗体或其功能片段的方法，包括以下步骤：在体外或从合适的宿主细胞表达本发明的核酸序列或本发明的载体，所述宿主细胞包括本发明的宿主细胞。
在第六方面，本发明涉及抗体或其功能片段的集合，其中所述集合包括抗体可变结构域序列的多样化集合，其中(i)使来自Lib1位置的至少3个CDR残基多样化，条件是至少一个多样化的残基位于VH结构域内，且至少一个多样化的位置位于VL结构域内，且其中来自Lib2位置的残基没有被多样化；或(ii)使来自Lib2位置的至少3个CDR残基多样化，条件是至少一个多样化的残基位于VH结构域内，且至少一个多样化的位置位于VL结构域内，且其中来自Lib1位置的残基没有被多样化。
在第六方面的实施方案中，本发明涉及抗体或其功能片段的集合，其中在(i)的情况下，使VL结构域的CDR1和CDR3和VH的CDR2中的每一个至少一个残基多样化，或者在(ii)的情况下，使VH结构域的CDR1和CDR3和VL的CDR2中的每一个至少一个残基多样化。
在第六方面的另一实施方案中，本发明涉及抗体或其功能片段的集合，其中在(i)的情况下，额外地使所述可变结合结构域中的Lib1E位置的至少一个残基多样化，和/或在(ii)的情况下，额外地使所述可变结合结构域中的Lib2E位置的至少一个残基多样化。
在第七方面，本发明涉及产生双特异性抗体分子或其功能片段的方法，包括以下步骤：
a.产生抗体分子或其功能片段的第一集合，每个抗体分子或其功能片段均包含异源二聚VH-VL可变结构域，其在选自Lib1组的至少3个CDR位置具有多样性，条件是至少一个多样化的残基位于VH结构域内且至少一个多样化的位置位于VL结构域内，并且其中来自Lib2位置的残基没有被多样化；
b.从所述第一集合中筛选对第一靶标或表位有特异性的第一抗体分子或其功能片段；
c.产生抗体分子或其功能片段的第二集合，每个抗体分子或其功能片段均包含异源二聚VH-VL可变区，其在选自Lib2组的至少3个CDR位置具有多样性，条件是至少一个多样化的残基位于VH结构域内且至少一个多样化的位置位于VL结构域内，并且来自Lib1位置的残基没有被多样化；
d.从所述第二集合中筛选对第二靶标或表位有特异性的第二抗体分子或其功能片段；以及
e.产生编码包含异源二聚VH-VL可变区的第三抗体分子或其功能片段的核酸序列，其中所述第三抗体分子或其功能片段包含第一抗体分子或其功能片段中Lib1位置的组中存在的至少3个残基，其中至少一个残基位于VH结构域内且至少一个残基位于VL结构域内，并且所述第三抗体分子或其功能片段还包含第二抗体分子或其功能片段中Lib2位置的组中存在的至少3个残基，其中至少一个残基位于VH结构域内且至少一个残基位于VL结构域内。
在第八方面，本发明涉及产生双特异性抗体分子或其功能片段的方法，包括以下步骤：
a.产生抗体分子或其功能片段的第一集合，每个抗体分子或其功能片段均包含异源二聚VH-VL可变区，其在选自Lib1组的至少3个CDR位置具有多样性，条件是至少一个多样化的残基位于VH结构域内且至少一个多样化的残基位于VL结构域内，并且其中来自Lib2位置的残基没有被多样化；
b.从所述第一次集合中筛选对第一靶标或表位有特异性的第一抗体分子或其功能片段；
c.产生抗体分子或其功能片段的第二集合，每个抗体分子或其功能片段均包含异源二聚VH-VL可变结构域，其通过以下方式进行：在选自Lib2组的至少3个CDR位置引入多样性使得所述第一抗体分子或其功能片段多样化，条件是至少一个多样化的残基位于VH结构域内且至少一个多样化的位置位于VL结构域内，并且其中来自Lib1位置的残基没有被多样化；
d.从所述第二集合中筛选对第二靶标或表位有特异性的第二抗体分子或其功能片段；以及
e.可选地，在具有以下变化的情况下实施步骤a至d，通过使选自Lib2组的至少3个CDR位置多样化来产生步骤a的第一集合，并且在选自Lib1组的至少3个CDR位置中使步骤c中的所述第一抗体分子或其抗体片段多样化。
在第七方面和第八方面的某些实施方案中，本发明涉及方法，其还包括以下步骤：
f.在宿主细胞中表达步骤a至e中产生的核酸序列或者将核酸翻译成代表所述第三抗体分子或其功能片段的蛋白质。
在某些这类实施方案中，本发明涉及方法，其中具有选自Lib1组的多样性的任何所述集合，包括在选自Lib1E组的至少一个增强位置的额外的多样性，和/或其中具有选自Lib1组的多样性的任何所述集合，包括在选自Lib2E组的至少一个增强(enhancing)位置的额外的多样性。
在某些这类实施方案中，本发明涉及方法，其中所述第一集合与选自Lib D1L1、Lib D1L2和Lib D2L1的文库相同，或者所述第一集合来源于具有在Lib D1L1、Lib D1L2或Lib D2L1存在多样化位置且在框架区具有90%以上序列同一性、特别是95%以上序列同一性的这类文库；并且其中所述第一集合与选自Lib D1H1、Lib D1H2、Lib D1H3和Lib D2H1的文库相同，或者所述第一集合来源于具有在Lib D1H1、Lib D1H2、Lib D1H3或Lib D2H1存在多样化位置且在框架区具有90%以上序列同一性、特别是95%以上序列同一性的这类文库。
在某些这类实施方案中，所述抗体分子或其功能片段选自单链Fv片段、Fab片段和IgG。
在第九方面，本发明涉及包含抗体分子或其功能片段的药物组合物，并任选地包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。所述组合物可以配制成例如一日一次给药、一日两次给药或者一日三次给药。
就本发明的组合物所使用的短语“药物上可接受的”指这类组合物的分子实体和其他成分，当施用至哺乳动物（例如人）时，其是生理上可容许的且通常不产生不良反应。术语“药学上可接受的”也可以意味着由联邦或国家政府的管理机构所认同的，或者在用于哺乳动物、更具体是用于人类的美国药典（U.S.Pharmacopeia）或其他普遍认可的药典中所列出的。
在本发明的背景下，术语“约(about)”或“大约(approximately)”意指给定值或范围的90%和110%之间。
适用于本发明的药物组合物的术语“载体”指稀释剂、赋形剂或介质，其与活性化合物（例如双特异性抗体片段）一起施用。这样的药学上的载体可以是无菌液体，例如水、盐溶液、葡萄糖水溶液、水性甘油溶液，和油类，其包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。合适的药学上的载体描述于A.R.Gennaro的“Remington's Pharmaceutical Sciences”(雷明顿药物学)第20版。
本发明的活性成分（例如双特异性抗体片段）或者组合物可以用于治疗至少一种疾病或紊乱，其中所述治疗适合于或者合适地制备成用于本文公开的特定给药方式（例如一日一次、一日两次或一日三次给药）。为此，包装说明书和/或病患信息含有相应的信息。
本发明的活性成分（例如双特异性抗体分子或其片段）或组合物可以用于制备治疗至少一种疾病或紊乱的药物，其中所述药物适合于或合适地制备为用于本文公开的特定给药方式（例如一日一次、一日两次或一日三次给药）。为此，包装说明书和/或病患信息含有相应的信息。
实施例
以下实施例说明本发明但不限制其范围。
虽然以上描述的第一类双特异性抗体分子（具有对两个靶标有特异性的两个互补位，所述的两个靶标均包含位于同一异源二聚VH-VL抗体可变区内的CDR残基）提供了如上所述的一些可能的益处，但我们假设可以产生完全新颖的抗体分子种类，其属于第一类抗体分子，但是完全不同于以上所述的文献中已报道的四个实例。我们假设通过寻找完全新颖的方法，能够在对属于第一类抗体的有意工程化方面相比以上所述的实例取得一些显著的改进。该假设考虑如上所述的之前的方法在抗体作为活性药物成分的发展中存在一些重要的潜在局限性的事实。
根据本发明，我们描述了一类完全新颖的双特异性抗体，其解决了这些问题并具有意想不到的且显著的优势。我们推断，可以在异源二聚抗体的VH-VL可变区内设计两个不同的互补位，每一个都包含来自重链和轻链的CDR残基，但是并不重叠且优选相互之间不紧密相邻，从而避免一个结合位点的突变引起的另一结合位点的构形改变，并且从而降低两个靶标之间在结合抗体方面的竞争的可能性（通过使处于它们的结合态时两个靶标之间可能的空间位阻最小）。我们还推断，通过首先建立两个合成抗体库，其中每一个都处于紧密的(packed)异源二聚VH-VL配对的背景下，可以设计这类新的抗体分子，其中在一个抗体库中可以使第一组（Lib1）重链和轻链CDR位置多样化，并且在另一抗体库中可以使不同的、不重叠的组（Lib2）的重链和轻链CDR位置多样化。我们得出，如果可以建立这样的文库，且针对两个不相关的靶标成功地进行平行筛选，那么通过将筛选过程中在Lib1位置筛选出的针对第一靶标的特定残基引入具有筛选过程中在Lib2位置筛选出的针对第二靶标的特定残基的抗体克隆，可以潜在地快速产生双特异性抗体。反之亦然，我们还得出，如果可以建立这样的文库，且针对两个不同的靶标成功地进行筛选，那么通过将筛选过程中在Lib2位置筛选出的针对第二靶标的特定残基引入具有筛选过程中在Lib1位置筛选出的针对第一靶标的特定残基的抗体克隆，可以潜在地产生双特异性抗体。我们推断，通过在限定紧密的VH-VL配对的相同或高度相似的支架内建立这两种文库，会非常有助于将来自限定第一特异性的第一抗体的一组残基引入第二特异性的第二抗体中。
在本发明中，我们证明我们已经成功地实施了本发明，产生了针对两个完全不相关的靶标的几种双特异性异源二聚VH-VL抗体。重要的是，快速产生了该抗体且该抗体仅对两个靶标具有高度特异性，这表明其并不与额外的不相关的靶标结合。惊人的是，所产生的双特异性抗体不仅显示高生物物理稳定性（其并没有被通过轻链CDR环残基与一个靶标结合且通过重链CDR环残基与另一靶标结合的抗体所证明），而且，即使相比于产生的“二合一”抗体所使用的支架和相比于确立的作为市售药物中活性成分的单特异性抗体克隆，也显示出极其高的生物物理稳定性。最后，仍出人意料地，使用针对GM-CSF和TNF-α的双特异性抗体的实例，我们能够证明，提供参与TNF-α的结合的推定的互补位的Lib1结合区内CDR位置中的单一保守型点突变基本上废除了与TNF-α的结合，同时保持与GM-CSF的结合完整；并且提供参与GM-CSF的结合的推定的互补位的Lib2结合区内CDR位置中不同的单一保守型点突变基本上废除了与GM-CSF的结合，同时保持与TNF-α的结合完整。这表明本发明的抗体的确可以高特异性结合两个不相关的靶标，而不是通过一般的“粘贴”，并且与本领域已知的上述双特异性抗体相反，设计为不重叠的互补位的两个结合位点基本上独立地起作用，尽管它们都位于一个异源二聚VH-VL可变区中且尽管它们都包含属于同一异源二聚可变区的CDR残基。因此本发明的抗体相比现有技术的双特异性抗体具有主要优势。
在本发明的优选实施方案中，优选的发现方法包括以下步骤：(1)基于相同或高度相似的异源二聚VH-VL抗体支架，通过使第一文库和第二文库中不同的CDR位置多样化，来产生一对文库；(2)任选地还包括使这两个文库的一个或两个中的VH-VL支架中所选的框架位置多样化，以潜在地提高从这两个文库筛选的克隆的结合特性；(3)针对两个靶标分子或表位独立地筛选这两个文库，并且表征结合体以鉴定具有期望特性的靶标特异性抗体克隆或表位特异性抗体克隆；(4)将从一个文库筛选的且对第一靶标或表位有特异性的抗体克隆中多样化位置中筛选的所有残基或残基的子集（优选大多数残基但不少于3个残基）引入从另一文库筛选的且对第二靶标或表位有特异性的靶标特异性抗体克隆中。为了以最佳方式实施该方法，一些关键残基组起重要作用。
通过检查计算模拟的异源二聚VH-VL抗体的分子模型且通过对没有特异性的未经筛选的异源二聚VH-VL抗体“模拟物”进行诱变（数据未显示），我们得到可以潜在地被多样化以形成针对第一靶标（Lib1残基）的第一潜在结合位点的一列CDR残基，以及可以潜在地被多样化以形成针对第二靶标（Lib2残基）的第二潜在结合位点的一列CDR残基。我们还得到，位于抗体框架区中的一列潜在的优化残基，其在折叠的抗体分子中非常靠近Lib1或Lib2CDR残基，并且其可以潜在地被多样化以改变特性且提高包含Lib1CDR残基的第一互补位与第一靶标（Lib1E优化残基）的结合和提高包含Lib2CDR残基的第二互补位与第二靶标（Lib2E优化残基）的结合。最后，我们得到，优选将在两个文库中的保持相同或非常相似的一列CDR残基，以维持两个文库中抗体分子的中央核心区紧密性不变(invariantpacking)，其还将存在于所有组合的双特异性抗体克隆中，其包含一组靶标-1-特异性Lib1与任选地包含Lib1E残基，以及一组靶标-2-特异性Lib2与任选地包含Lib2E残基。我们得出，该紧密地不变的核心区将相互遮蔽两个结合位点，使得针对第一靶标的第一互补位一定程度上免受由针对第二靶标的第二互补位的变化所引起的不利的构象影响。确实，我们已经能够证明，通过来源于亲本克隆的结合的双特异性抗体克隆，使亲本抗体克隆的亲和力和结合动力学通常密切匹配。实施例8示出使用示例的抗原VEGF和IL6，其中具有38nM亲和力的亲本抗体IL6P与具有11nM亲和力的亲本抗体VEGFP结合，以产生对IL6具有40nM亲和力和对VEGF有7.8nM亲和力的双特异性抗体VH6L。这两个结合位点的这种出奇高的独立性水平使得对它们亲和性成熟成为可能，并且同时在某种程度上对“二合一”抗体（以上的第三个以前的实例）或双特异性配对单结构域异源二聚体（以上的第四个以前的实例）亲和性成熟是不可能的。我们还得出，不变的核心区可以获得两个结合位点之间的间隔，这潜在地使它们能够独立地结合两个靶标，而没有由重叠互补位或由第一结合靶标和第二结合靶标之间的空间位阻引起的竞争。确实，使用示例的抗原GMCSF和IL6，我们已经能够证明，对于本发明的新种类的双特异性抗体分子，针对一些结合的克隆，两个抗原与单个VH-VL可变区的共结合是可能的。而且，实施例9示出第二抗原与可变区共结合的亲和力可以不依赖于第一抗原的存在或缺乏。对于其他类型的以前的双特异性抗体而言，实现与同一VH-VL可变区共结合的可能性和可能独立的共结合亲和力尚未得到证明，这代表了本发明的新抗体的独特优势。在一些新的双特异性抗体中，可以通过实施例10列出的那些类似突变来进一步证明独立的结合行为。在这样的抗体中，可以通过在Lib1位置进行点突变来打破或极大地降低对第一靶标的亲和性，同时保持对第二靶标的亲和性完整，反之亦然，通过在Lib2位置进行点突变打破或极大地降低对第二靶标的亲和性，同时保持对第一靶标的亲和性完整。
实施例1：文库的构建
从GeneArt购得用于Lib1D1L1和Lib D1H1文库的合成基因库，而从SloningBiotechnology购得用于D1L2和D1H2文库的合成基因库。将全部的四个文库克隆到新构建的噬菌体展示载体，其是通以下方式由主干pUC19构建的：将M13源、驱动抗体重链和轻链表达的两个合成的核糖体结合位点以及编码将驱动抗体多肽分泌的两个信号肽的合成基因添加到大肠杆菌周质、人CH1和CK恒定结构域以及与人CH1恒定结构域C-末端融合的M13蛋白III的截短的C-末端部分。将文库转化至TG1大肠杆菌细胞以产生4个文库，每一文库都具有转化的109种多样性。通过(Barbas et al.,Phage Display:A Laboratory Manual（噬菌体显示：实验室手册）,Cold Spring Harbour Laboratory Press,1st ed.,2001;Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual（分子克隆：实验室手册）,Cold SpringHarbour Laboratory Press,3rd ed.,2001)描述的使用M13KO7辅助噬菌体和标准的分子生物学方法，从转化的TG1大肠杆菌细胞来产生作为噬菌体展示多样化的Fab片段的文库的四个文库。
实施例2：淘选(Panning)
按照标准的淘选过程(Barbas et al.,Phage Display:A Laboratory Manual（噬菌体展示，实验室手册）,Cold Spring Harbour Laboratory Press,1st ed.,2001;Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual（分子克隆：实验室手册）,ColdSpring Harbour Laboratory Press,3rd ed.,2001)，可以从噬菌体上-Fab颗粒(Fab-on-phage particles)的文库筛选针对固定的靶标MBP和GST的结合体。
实施例3：筛选
可以通过感染细菌宿主细胞来救援(rescued)实施例2淘选的噬菌体颗粒(Barbaset al.,Phage Display:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour LaboratoryPress,1st ed.,2001;Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbour Laboratory Press,3rd ed.,2001)。从各自的克隆中表达Fab蛋白，并测试其针对靶标MPB和GST的特异性结合。下一步骤中使用阳性命中样品（positive hits）来克隆双特异性构建体。
实施例4：双特异性抗体的克隆
基于所需的氨基酸序列设计抗体基因，并从GeneArt或DNA2.0购得合成基因或和合成基因片段。根据制造商的说明，通过PCR或重叠PCR使用聚合酶Pwo Master（从Roche购得）和编码所需的点突变的合成寡核苷酸（从Thermo Fisher Scientific购得），来产生编码具有点突变的抗体变体的基因。通过修饰从New England Biolabs购得的质粒pUC19来产生大肠杆菌Fab表达载体。通过将驱动抗体重链和轻链表达的两个合成的核糖体结合位点、驱动抗体链分泌的两个合成的信号肽序列添加到大肠杆菌周质和潜在地能产生单链的一个M13噬菌体来源中，来修饰pUC19主干。根据制造商的说明，通过限制性酶切使用限制性内切酶（从Roche购得）将合成的抗体基因、合成的抗体基因片段和编码点突变的PCR生成的抗体基因的变体克隆入该大肠杆菌Fab表达载体，之后使用LigaFast（从Promega购得）连接。将连接反应转化至购自Stratagene或Zymoresearch的感受态TG1大肠杆菌细胞中。
实施例5：抗体的表达和纯化
在补充有羧苄青霉素和葡萄糖（从VWR购得）的LB和TB固体和液体培养基（从CarlRoth购得）中生长具有Fab表达构建体的TG1大肠杆菌克隆。在震荡培养箱中的锥形烧瓶中，使液体培养物进行抗体表达，过夜，并且通过向生长培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，从Carl Roth）进行诱导。通过对表达培养物的离心分离来澄清含有分泌的Fab片段的培养物上清液。为澄清的培养物上清液补充1%体积的链霉素/青霉素溶液（从PAALaboratories购得）、2%体积的1M pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷（从VWR购得）和0.4%体积的STREAMLINE r蛋白A树脂（从GE Healthcare购得）。将补充后的培养物上清液在滚动培养箱中孵化3小时或过夜，以达到Fab片段与蛋白A树脂的结合。然后将树脂转移到重力流柱，使用30柱床体积pH为7.4的2x PBS（从Invitrogen购得）洗涤一次，使用5柱床体积含有10mMpH为6.8的三羟甲基氨基甲烷和100mM的NaCl的缓冲液（从VWR购得）洗涤一次，并使用含有10mM pH为3的柠檬酸和100mM NaCl的缓冲液（从VWR购得）洗脱。通过加入8%体积的1M pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷来中和洗脱的Fab片段。根据制造商的说明，使用NAP-5脱盐柱（illustra NAP-5desalting columns，从GE Healthcare购得）将中和的纯化Fab片段的缓冲液更换为纯的1x PBS pH7.4(含有1.06mM KH2PO4、2.97mM Na2HPO4-7H2O、155.17mM NaCl且没有其他的补充剂;Invitrogen catalogue No.10010056)。
实施例6：抗体稳定性测定
使用差示扫描量热法(DSC)确定纯化的缓冲液更换的Fab片段在pH为7.4的1x PBS(Invitrogen catalogue No.10010056)中的生物物理稳定性。对于所有的测定，使用配备有自动进样器且由VPViewer2000CapDSC软件（来自MicroCal）控制的毛细管细胞微热量计。扫描针对不含抗体的纯缓冲液(1x PBS pH7.4;Invitrogen catalogue No.10010056)的所有Fab片段。设定扫描参数以分析从32℃至105℃和115℃之间的温度窗口，预扫描恒温器2分钟、后扫描恒温器0分钟，没有收获。将扫描率设定为250℃/h(小时)用于筛选应用，设定为60℃/h(小时)用于重新分析最稳定的结合突变体。采用筛选模式（扫描率为250℃/h(小时)）比采用重新分析模式（扫描率为60℃/h(小时)）确定的Fab片段的绝对的解链温度高3.7℃至4.5℃，但是采用两种模式时克隆的排列是相同的。使用Origin7.0软件（来自MicroCal）在PBS基准减法(PBS reference subtraction)后确定Fab片段的解链温度。
实施例7：抗体特异性测定
为了测定从Lib1和Lib2文库筛选的抗体针对一个靶标的特异性和所设计的双特异性抗体与两个靶标结合的特异性，使用标准化方法进行酶联免疫吸附试验(ELISA)。简言之，通过涂覆溶解在1x PBS中的链霉亲和素、结合PBS-T(0.3%Tween-20溶解在1x PBS中)中的20nM的生物素化的靶标(GST、MBP、HEL或VEGF)和用PBS-T中的5%的脱脂奶粉封阻，来制备Nunc Maxisorp孔板。在微量滴定板中加入作为可溶的Fab片段的表达抗体克隆的50μl大肠杆菌TG1培养物上清液，之后使用山羊抗-人κ轻链多克隆抗体（σ）或对与可溶的Fab表达构建体中重链的C-末端融合的链球菌-II标签有特异性的小鼠抗链球菌标签抗体(IBA)来检测结合的Fab片段。使用HRP-标记的第三代抗体检测第二抗体。使用TMB基质(KPL)进行ELISA，并且使用Victor板读数器（Victor plate reader，从PerkinElmer购得）设定为450nm来量化信号。发现分泌到大肠杆菌培养物上清液的模拟物1Fab没有结合四个靶标中的任何一个，Fab LG1（已经从Lib D1L1筛选）仅结合GST，Fab HM2（已经从Lib D1H1筛选）仅结合MBP，以及Fab DT3（其组合存在于Fab LG1和HM2中的所有靶标特异性残基）仅结合GST和MBP。没有克隆结合对照靶标HEL或VEGF（图5）。使用用于每一Fab的两个独立的克隆加倍进行试验。
实施例8：亲本抗体和双特异性抗体的亲和力
筛选针对人VEGF(Peprotech产品目录编号100-20)和人IL6(Peprotech产品目录编号200-06)的抗体文库。在分离的亲本抗体克隆中，将IL6P和VEGFP结合到双特异性抗体克隆VH6L。图4示出VH6L的序列，其示出在轻链的氨基酸4位的额外的点突变。为了评价亲本抗体和双特异性抗体的亲和力，进行BiacoreTM分析从而分析IL6P、VH6L和VEGFP的结合行为。为此，使用胺结合将抗-轻链捕获抗体固定在CM5芯片上，结果是12000RU。捕获Fab片段至400-500RU的水平，并且使从0至450nM浓度系列的IL6和VEGF经过芯片。如图7所示，克隆IL6P与IL6结合，但不与VEGF结合；克隆VEGFP与VEGF结合，但不与IL6结合，并且组合的克隆VH6L与IL6和VEGF都结合。如表1所示，亲本抗体和双特异性抗体对靶标的亲和力类似。IL6P和VH6L的离解常数KD分别是38nM和40nM，并且VEGFP和VH6L的离解常数分别是11nM和7.8nM。
表1.亲和力测定
配体 样品 ka Kd KD
IL6P IL6 1.1E+05 4.1E-03 3.8E-08
VH6L IL6 1.2E+05 4.7E-03 4.0E-08
VEGFP IL6 N/A N/A NB
IL6P VEGF N/A N/A NB
VH6L VEGF 9.5E+04 7.4E-04 7.8E-09
VEGFP VEGF 1.1E+05 1.1E-03 1.1E-08
实施例9：两个抗原与同一VH-VL可变区的共结合
为了证明本发明的双特异性抗体可以通过同一VH-VL可变区同时结合两个不同的抗原，使用对人GMCSF和人IL6有特异性的双特异性抗体克隆GH6L进行BiacoreTM试验。图4示出GH6L的序列，其示出在轻链的氨基酸4位的额外的点突变。使用具有GH6L重链和轻链以及信号肽cDNA的标准哺乳动物表达载体，通过HEK293-6E细胞的瞬时转染以人IgG1形式表达抗体。使用蛋白A树脂亲和性纯化表达的IgG。对于BiacoreTM分析，使用胺结合将GMCSF(Peprotech产品目录编号300-03)或抗-轻链捕获抗体固定在CM5芯片上，分别产生4000RU固定的GMCSF和12000RU固定的抗-轻链捕获抗体。
将GH6L捕获在制备的表面上，在浓度系列的IL6(Peprotech产品编号200-06)经过的每种情况下，使用BIAevaluation软件分析数据。由图8A可知，被捕获到GMCSF上的GH6L能够结合IL6。注入GMCSF的对照试验并未产生显示IL6结合信号的信号，该信号是由于同时结合同一VH-VL可变区，而不是由于结合与芯片表面上GMCSF无相互作用的GH6L的自由臂。在图8B中，通过通用的抗-轻链捕获抗体捕获GH6L，以测定不存在GMCSF的情况下GH6L的IL6结合亲和力。比较图8A和图8B可知，不管GH6L是否结合GMSCF，GH6L都以相似的亲和力结合IL6。
实施例10：独立结合行为
对于本发明的几种双特异性抗体，可以使用位于Lib1或Lib2结合区内的单个残基的定点诱变示出两个结合位点的独立的行为。在一个例子中，对针对靶标A和靶标B的双特异性抗体克隆进行突变。
通过将单个保守型LCDR3点突变H93Y并入提供参与靶标A结合的推定的互补位的Lib1结合区，很大程度上废除(abolished)了对靶标A的亲和力，同时保持对靶标B的亲和力完整。
在另一方面，通过将单个保守型LCDR2点突变W56Y并入提供参与靶标B结合的推定的互补位的抗体克隆的Lib2结合区，完全废除了对靶标B的亲和力，同时保持对靶标A的亲和力完整。
在另一个例子中，对针对靶标C和靶标D的双特异性抗体克隆进行突变。通过将单个保守型LCDR1点突变N27D并入提供参与靶标C结合的推定的互补位的Lib1结合区，很大程度上废除了对靶标C的亲和力，同时保持对靶标D的亲和力完整。
在另一方面，通过将单个保守型LCDR1点突变L28D或单个保守型LCDR2点突变Y56D并入提供参与靶标D结合的推定的互补位的第二抗体的Lib2结合区，废除了对靶标D的亲和力，同时保持对靶标C的亲和力完整。
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本发明并不限于本文描述的具体实施方案的范围。事实上，从上述描述中可知，除了本文描述的那些之外的本发明的各种修改，对本领域技术人员将是显而易见的。这些修改意图涵盖在所附权利要求的范围内。
按照相应的专利法，本文引用的所有的专利、申请、出版物、试验方法、文献和其他资料通过引用尽可能地并入本文。
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Claims (5)

1.特异性结合VEGF和IL6的抗体Fab片段，其包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域，所述重链可变(VH)结构域具有SEQ ID NO:29的序列，所述轻链可变(VL)结构域具有SEQ ID NO:26的序列。
2.核酸序列，其编码权利要求1所述的抗体Fab片段。
3.载体，其包含权利要求2所述的核酸序列。
4.宿主细胞，其包含权利要求2所述的核酸序列或权利要求3所述的载体。
5.产生权利要求1所述的抗体Fab片段的方法，包括以下步骤：在体外或由合适的宿主细胞表达权利要求2所述的核酸序列或权利要求3所述的载体，所述宿主细胞包括权利要求4所述的宿主细胞。
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