PT2463302E - Imunoglobulinas multivalentes modificadas na região de alça estrutural - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"IMUNOGLOBULINAS MULTIVALENTES MODIFICADAS NA REGIÃO DE ALÇA ESTRUTURAL" A presente invenção providencia uma imunoglobulina polivalente ou parte da mesma que se liga especificamente a, pelo menos, duas moléculas de superfície celular de uma única célula, com pelo menos uma modificação em, pelo menos, uma região de alça estrutural da dita imunoglobulina, determinando a ligação a um epítopo das ditas moléculas de superfície celular em que a imunoglobulina não modificada não liga significativamente ao dito epítopo.

Os anticorpos monoclonais são úteis em muitas aplicações terapêuticas, analíticas e diagnósticos. A estrutura de anticorpo básica será aqui explicada usando como exemplo uma imunoglobulina IgGl intacta. Duas cadeias pesadas (H) idênticas e duas leves (L) idênticas combinam para formar a molécula anticorpo em forma de Y. As cadeias pesadas têm cada uma delas quatro domínios. Os domínios amino-terminais variáveis (VH) estão nas pontas do Y. Estes são seguidos por três domínios constantes. CHI, CH2, e o C-terminal CH3, na base da haste do Y. Um curto conector, liga a cadeia pesada variável e regiões constantes. A articulação liga CH2 e CH3 (o fragmento Fc) ao restante do anticorpo (os fragmentos Fab) . Um fragmento Fc e dois fragmentos Fab idênticos podem ser produzidos por clivagem proteolítica da articulação numa molécula de anticorpo intacta. As cadeias leves são constituídas por dois domínios, variável (VL) e constante (CL), separados por um conector.

As ligações dissulfureto na região da articulação ligam as duas cadeias pesadas. As cadeias leves são acopladas às cadeias pesadas por ligações dissulfureto adicionais. As partes de hidratos de carbono ligadas por Asn são fixas em diferentes posições em domínios constantes dependendo da classe da imunoglobulina. Para IgGl, duas ligações dissulfureto na região da articulação, entre os pares Cys235 e Cys238, unem as duas cadeias pesadas. As cadeias leves são acopladas às cadeias pesadas por duas ligações dissulfureto adicionais, entre Cys229s nos domínios CHI e Cys214s nos domínios CL. As partes de hidratos de carbono são fixas a Asn306 de cada CH2, gerando uma protuberância pronunciada na haste do Y.

Estas características aprofundaram conseguências funcionais. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves (VH) e (VL) permanecem nas "pontas" do Y, onde estão posicionadas para reagir com o antígeno. Esta ponta da molécula é o lado no gual o N-terminal da seguência de aminoácido está localizado. A haste do Y projecta-se de uma forma a mediar eficazmente funções efectoras, tais como a activação de complemento e interacção com os receptores Fc, ou ADCC e ADCP. Os seus domínios CH2 e CH3 tornam-se salientes para facilitar a interacção com proteínas efectoras. 0 C-terminal da seguência de aminoácido está localizado no lado oposto da ponta, a gual pode ser denominada "parte inferior" do Y.

Dois tipos de cadeia leve, chamados lambda (λ) e kappa (κ) são encontrados nos anticorpos. Uma dada imunoglobulina ou tem cadeias κ ou cadeias λ, nunca uma de cada. Não foi encontrada nenhuma diferença funcional entre anticorpos com cadeias leves λ ou κ.

Cada domínio numa molécula de anticorpo tem uma estrutura semelhante de duas folhas beta colocadas juntamente uma contra outra numa barril beta antiparalelo comprimido. Esta estrutura conservada é chamada de dobra da imunoglobulina. A dobra da imunoglobulina de domínios constantes contém uma folha de 3 cadeias colocada contra uma folha de 4 folhas. A dobra é estabilizada por ligação de hidrogénio entre as cadeias beta de cada folha, por ligação hidrofóbica entre resíduos de folhas opostas no interior, e por uma ligação dissulfureto entre as folhas. A folha de 3 cadeias compreende cadeias C, F, e G, e a folha de 4 cadeias tem cadeias A, B, E, e D. As letras A até G denotam as posições sequenciais das cadeias beta ao longo da sequência de aminoácido da dobra da imunoglobulina. A dobra de domínios variáveis tem 9 cadeias betas colocadas em duas folhas de 4 e 5 cadeias. A folha de 5 cadeias é estruturalmente homóloga à folha de 3 cadeias de domínios constantes, mas contém as cadeias extra C' e C". As restantes cadeias (A, B, C, D, E, F, G) têm a mesma topologia e estrutura semelhante como as suas contrapartes em dobras de imunoglobulina em domínio constante. A ligação dissulfureto liga as cadeias B e F às folhas opostas, como nos domínios constantes.

Os domínios variáveis das cadeias de imunoglobulina leves e pesadas contêm três alças hipervariáveis, ou regiões determinantes de complementaridade (CDR). As três CDR de um aglomerado de domínio V (CDR1, CDR2, CDR3) numa extremidade do barril beta. As CDR são alças que ligam cadeias beta B-C, C'-C", e F-G da dobra de imunoglobulina. Os resíduos nas CDR variam de uma molécula de imunoglobulina para a seguinte, transmitindo a especificidade do antígeno para cada anticorpo.

Os domínios VL e VH nas pontas das moléculas de anticorpo são colocados juntamente, de tal forma que as 6 CDR (3 em cada domínio) cooperam na construção de uma superfície (ou cavidade) para ligação específica do antígeno. 0 local de ligação do antígeno natural de um anticorpo é, desta forma, composto por alças que ligam cadeias B-C, C'-C'', e F-G do domínio variável de cadeia leve e cadeias B-C, C'-C'r , e F-G do domínio variável de cadeia pesada.

As alças que não são alças CDR numa imunoglobulina nativa, ou não fazem parte da bolsa de ligação de antigeno como determinado pelas alças do CDR, não têm especificidade de ligação de antigeno ou ligação de epitopo, mas contribuem para a dobra correcta de toda a molécula de imunoglobulina e/ou as suas funções efectoras ou outras e são, por isso, chamadas de alças estruturais para efeitos desta invenção. Documentos da técnica anterior mostram gue a estrutura tipo imunoglobulina tem sido utilizada até agora para efeitos de manipulação do local de ligação de antigeno existente, por isso introduzindo novas propriedades de ligação. Contudo, até agora, apenas as regiões CDR foram criadas para a ligação de antigeno, por outras palavras, no caso da dobra da imunoglobulina, apenas o local de ligação de antigeno natural foi modificado no sentido de alterar a sua afinidade ou especificidade de ligação. Existe um vasto corpo de literatura, o gual descreve formatos diferentes de tais imunoglobulinas manipuladas, freguentemente expressas na forma de fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou fragmentos Fab, dispostos na superfície de partículas de fago ou soluvelmente expressas em vários sistemas de expressão procarióticos ou eucarióticos. 0 documento PCT/EP2006/050059 descreve um método para conceber uma imunoglobulina gue compreende uma modificação numa região de alça estrutural para obter novos locais de ligação de antigeno. Este método é amplamente aplicável a imunoglobulinas e pode ser usado para produzir uma série de imunoglobulinas que se destinam a uma variedade de antígenos. Ligantes polivalentes de alvos de superfície celular não são explicitamente descritos. 0 documento US2005/266000A1 descreve polipéptidos que compreendem um domínio de estrutura variável de cadeia pesada variante (VFR) . Um VFR é a parte da bolsa ou sulco de ligação do antigeno que pode contactar o antigeno. Os VFR fazem parte da região de alça da CDR e estão localizados num domínio variável no lado das alças da CDR para suportar a ligação de antígeno através da região de alça da CDR. As alças de estrutura, que não os VFR, não sofreram mutações para efeitos de concepção de um local de ligação de antígeno.

As proteínas de superfície celular associadas aos cancros humanos, podem ser alvos eficazes para terapia monoclonal. Os anticorpos podem obter respostas anti-tumorais por activação celular modular ou através de recrutamento do sistema imunitário. Alguns mAbs exercem parte do seu efeito na reticulação do alvo, que podem agrupar os alvos e resultam na activação, inibição, ou amplificação da sinalização celular, finalmente terminando em paragem celular e/ou apoptose para o alvo celular.

Tem sido demonstrado que alguns MAbs (anti-CD19, CD20, - CD21, e -CD22) que têm pouca ou nenhuma actividade anti-crescimento inerente nas linhas celulares de linfoma, podem ser convertidos em potentes agentes anti-tumorais ao usá-los como homodímeros tetravalentes. Estas actividades podem ser melhoradas in vivo através do recrutamento de células efectoras e/ou complemento. Outra estratégia usada para mAbs terapêuticos destina-se a unir um medicamento citotóxico ao mAb. Tal imunotoxina pode ligar-se à superfície celular alvo seguida por internalização, libertando o medicamento para matar a célula. Pode ser necessária agregação do alvo como um pré-requisito para a internalização.

Para melhorar a potência dos mAbs que exercem o seu efeito através da aglomeração das moléculas alvo, foram criados vários formatos Ab polivalentes. Foram criados os IgGs de comprimento total ligados de forma covalente que formam Abs tetravalentes e os IgM e IgG Abs que ocorrem de forma natural que imitam IgM e IgA poliméricos através do uso da sua extremidade secretora. Outro formato tetravalente foi criado ao adicionar Fab no C-terminal de cada cadeia H de um IgG de comprimento total.

Para melhorar a penetração no tumor, construtos mais pequenos que usam fragmentos Fv (scFv)2 de cadeia única (cada Fv consistindo de domínios leves variáveis e pesados variáveis ligados por ligantes peptídeos) têm sido unidos para formar complexos polivalentes. Tais construtos podem ter meias-vidas relativamente curtas (em comparação com aquelas dos mAbs de comprimento total), consequentemente, isto foi tratado ao adicionar estes multímeros sCFv aos fragmentos IgG Fc. Com scFv e formatos semelhantes é difícil controlar a formação do grau exacto de multimerização, isto é, dímeros, trímeros, tetrâmeros e complexos maiores podem formar-se em vários rácios dependendo do construto básico e método de expressão. 0 documento W02006/036834A descreve moléculas e métodos nos quais péptidos biologicamente activos são incorporados numa região de alça do domínio Fc. 0 documento WOOl/83525 A descreve uma fusão dos domínios Fc com péptidos biologicamente activos para aumentar as meias-vidas in vivo dos péptidos.

Adachi Masaaki et. ai. (Protein Science, Cambridge University Press, Cambridge, GB vol. 12, no. 10 (2003) 2125-2131) descreve a modificação de CL-CH1 para controlar a afinidade antígeno-anticorpo do Fv. O documento WO02/32925 A descreve bibliotecas de fragmentos de fibronectina com alças tipo CDR aleatórias nos domínios variáveis.

Qualquer um dos formatos conhecidos para produzir imunoglobulinas polivalentes tem certas desvantagens, sejam problemas de imunogenicidade, meia-vida in vivo ou produção. É objecto da presente invenção providenciar um sistema modular que permite conceber uma imunoglobulina polivalente alvo de acordo com a necessidade respectiva, para resolver problemas da técnica anterior.

Breve descrição da invenção: A presente invenção providencia domínios de imunoglobulina que ligam às proteínas de superfície celular através de alças estruturais modificadas para providenciar ligação adicional às moléculas de superfície celular, permitindo assim reticulação de receptores de superfície celular.

De acordo com a presente invenção, uma imunoglobulina polivalente, ou parte de ligação da mesma, é provida que se liga especificamente a, pelo menos, duas moléculas de superfície celular de célula única com pelo menos uma modificação em, pelo menos, uma região de alça estrutural da dita imunoglobulina, determinando ligação a um epítopo das ditas moléculas de superfície celular incluindo estruturas de propriedades antigénicas, localizadas numa única célula ou disponíveis numa população de células homogéneas, em que a imunoglobulina não modificada não liga significativamente ao dito epítopo.

De acordo com a presente invenção, a imunoglobulina polivalente inventiva pode ser ainda combinada com uma ou mais imunoglobulinas modificadas ou com imunoglobulinas não modificadas, ou partes das mesmas, para obter uma combinação de imunoglobulina.

Preferivelmente, a modificação do domínio da alça estrutural no nucleótido ou sequência de aminoácido é uma eliminação, uma substituição, uma inserção ou uma combinação das mesmas. A presente invenção também providencia um ácido nucleico que codifica a imunoglobulina inventiva ou parte da mesma e um método para conceber uma imunoglobulina polivalente de acordo com a invenção que compreende os passos de: - providenciar um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que compreende, pelo menos, uma região de alça estrutural, modificar, pelo menos um resíduo de nucleótido da dita região de alça estrutural , transferir o dito ácido nucleico modificado num sistema de expressão, expressar a dita imunoglobulina multivalente, contactar a imunoglobulina multivalente expressada com um epítopo, e determinar se a dita imunoglobulina multivalente se liga ao dito epítopo.

Adicionalmente, é provido o uso de imunoglobulina polivalente de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para uso terapêutico, por exemplo, para tratamento de células tumorais e células infectadas por patogéneo.

Descrição detalhada da invenção:

Os domínios de imunoglobulina modificada de acordo com a invenção podem ser usados como tal ou incorporados em vários formatos de anticorpos conhecidos, tais como anticorpos completos, Fabs, Fvs de cadeia simples, Fab2, minibodies e semelhantes para providenciar os locais de ligação adicionais para epítopos de superfície celular ou receptores.

Em particular, a presente invenção relaciona-se com um método para conceber uma imunoglobulina que se liga especificamente aos epítopos de antígenos. Através da modificação na região de alça estrutural, a imunoglobulina pode ser concebida para ligar ao epítopo. Numa forma de realização preferida, a imunoglobulina é ligada especificamente em, pelo menos, dois tais epítopos que diferem uns dos outros, que originam de ou imitando o mesmo antígeno ou antígenos diferentes.

Por exemplo, o método de acordo com a invenção refere-se à concepção de uma imunoglobulina que se liga especificamente a, pelo menos, um primeiro epítopo e que compreende, pelo menos, uma modificação em, pelo menos, uma região de alça estrutural da dita imunoglobulina, e que determina a ligação especifica da dita, pelo menos, uma região de alça a, pelo menos, um segundo epitopo, em que a região de alça estrutural não modificada (região não CDR) não liga especificamente ao dito, pelo menos, um segundo epitopo, que compreende os passos de: - providenciar um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que se liga especificamente a, pelo menos, um primeiro epitopo e que compreende, pelo menos, uma região de alça estrutural, modificar, pelo menos, um resíduo nucleótido de, pelo menos, uma das ditas regiões de alças codificadas pelo dito ácido nucleico, transferir o dito ácido nucleico modificado num sistema de expressão, expressar a dita imunoglobulina modificada, contactar a imunoglobulina modificada expressada com, pelo menos, um segundo epitopo, e determinar se a dita imunoglobulina modificada se liga especificamente ao segundo epitopo. 0 método de acordo com a invenção relaciona-se preferivelmente com, pelo menos, uma modificação em, pelo menos, uma região de alça estrutural da dita imunoglobulina, e determina a ligação específica de, pelo menos, uma região de alça a, pelo menos, uma molécula seleccionada do grupo que consiste de antígenos de superfície celular, em que a imunoglobulina que contém uma região de alça estrutural não modificada não se liga especificamente à dita, pelo menos, uma molécula. 0 termo "imunoglobulina" como aqui usado inclui a imunoglobulina ou partes, fragmentos ou derivados de imunoglobulinas. Assim, inclui um "peptídeo de domínio de imunoglobulina" a ser modificado de acordo com a presente invenção (como aqui usados, os termos imunoglobulina e anticorpo são intermutáveis), assim como os domínios de imunoglobulina ou partes da mesma que contêm uma alça estrutural, ou uma alça estrutural de tais domínios, tais como um mini-domínio. As imunoglobulinas podem ser usadas como peptídeos isolados ou como moléculas de combinação com outros peptídeos. Em alguns casos, é preferível usar uma alça estrutural modificada definida ou uma região de alça estrutural, ou partes da mesma, como moléculas isoladas para efeitos de ligação ou combinação. 0 "domínio de imunoglobulina" como aqui definido contém tais peptídeos ou polipéptidos de domínio de imunoglobulina que podem ter características de ligação específicas após modificar e conceber. Os peptídeos são homólogos às sequências de domínio de imunoglobulina e têm preferivelmente pelo menos 5 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 10 ou até mesmo, pelo menos, 50 ou 100 aminoácidos de comprimento, e constituem, pelo menos, parcialmente uma alça estrutural ou região de alça estrutural, ou a região de alça não CDR do domínio. Preferivelmente, os peptídeos excluem aquelas inserções que são consideradas aminoácidos não funcionais, regiões CDR híbridas ou quiméricas ou regiões do tipo CDR e/ou estruturas canónicas de regiões CDR. As características de ligação relacionam-se com a ligação, afinidade e avidez de epítopo específico.

Um derivado de uma imunoglobulina de acordo com a invenção é qualquer combinação de uma ou mais imunoglobulinas da invenção e/ou uma proteína de fusão, na qual qualquer domínio ou mini-domínio da imunoglobulina da invenção possa ser fundido em qualquer posição de uma ou mais outras proteínas (tais como outras imunoglobulinas, ligantes, proteínas de estrutura, enzimas, toxinas e similares). Um derivado da imunoglobulina da invenção pode também ser obtido por técnicas de recombinação ou ligação a outras substâncias por várias técnicas químicas tais como união covalente, interacção electrostática, ligação dissulfureto, etc.

As outras substâncias ligadas às imunoglobulinas podem ser lipidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, moléculas orgânicas e anorgânicas ou gualguer combinação dos mesmos (por ex., PEG, pró-fármacos ou medicamentos). Um derivado é também uma imunoglobulina com a mesma sequência de aminoácido mas realizada total ou parcialmente de aminoácidos não naturais ou quimicamente modificados.

As moléculas concebidas de acordo com a presente invenção serão úteis como proteínas isolada, assim como proteínas de fusão ou derivadas, mais tipicamente fundidas de tal forma para fazerem parte de estruturas de anticorpo maiores ou moléculas anticorpo completas, ou partes das mesmas tais como fragmentos Fab, fragmentos Fc, fragmentos Fv e outros. Será possível usar as proteínas concebidas para produzir moléculas, as quais são biespecíficas, triespecíficas e até mesmo possuir mais especificidades ao mesmo tempo, e será possível, ao mesmo tempo, para controlar e pré-seleccionar a valência da ligação ao mesmo tempo de acordo com os requisitos do uso planeado de tais moléculas.

Outro aspecto da presente invenção relaciona-se com uma imunoglobulina com, pelo menos, uma região de alça, caracterizada pelo facto de que, pelo menos, uma região de alça compreende, pelo menos, uma modificação de aminoácido formando, pelo menos, uma região de alça modificada, em que a dita, pelo menos, uma região de alça CH3 modificada se liga especif icamente a, pelo menos, um epítopo de um antígeno. É preferido combinar molecularmente, pelo menos, um domínio anticorpo modificado, o qual é ligado ao parceiro específico através de sequências não variáveis ou uma alça estrutural, com pelo menos uma outra molécula de ligação que pode ser um anticorpo, fragmento anticorpo, um receptor solúvel, um ligante ou outro domínio anticorpo modificado. A molécula que funciona como uma parte de um par de ligação que é especificamente reconhecido pela imunoglobulina de acordo com a invenção é preferivelmente seleccionada de um grupo que consiste de moléculas proteináceas, ácidos nucleicos e hidratos de carbono.

As regiões de alça das imunoglobulinas podem especificamente ligar a qualquer tipo de moléculas de ligação ou estruturas, em particular a antígenos, moléculas proteináceas, proteínas, peptídeos, polipéptidos, ácidos nucleicos, glicanos, hidratos de carbono, lípidos, pequenas moléculas orgânicas, moléculas anorgânicas, ou combinações ou fusões dos mesmos. É evidente, as imunoglobulinas modificadas podem compreender, pelo menos, duas alças ou regiões de alça em que cada uma das alças ou regiões de alça podem especificamente ligar a diferentes moléculas ou epítopos.

De acordo com a presente invenção, as regiões de ligação a antígenos ou locais de ligação de antígenos de todos os tipos de antígenos de superfície celular podem ser introduzidos numa alça estrutural de uma determinada estrutura anticorpo. 0 termo "antigénio", de acordo com a presente invenção, deve significar moléculas ou estruturas conhecidas para interagir ou capazes de interagir com a região de alça CDR de imunoglobulinas. As regiões de alças estruturais da técnica anterior que se referem a anticorpos nativos, não interagem com antigénios mas contribuem sim para a estrutura geral e/ou para a ligação de moléculas efectoras. Apenas durante a concepção de acordo com a invenção estrutural, as alças podem formar bolsas de ligação ao antigénio sem envolvimento de alças CDR ou a região CDR. 0 termo "antigénios de superfície celular", de acordo com a presente invenção, deve incluir todos os antigénios capazes de serem reconhecidos por uma estrutura de anticorpo na superfície de uma célula, e fragmentos de tais moléculas. "Antigénios de superfície celular" preferidos são aqueles antigénios, que já provaram ser ou que são capazes de serem imunológica ou terapeuticamente relevantes, especialmente aqueles para os quais foi testada a eficácia pré-clínica ou clínica. Aquelas moléculas de superfície celular são especificamente relevantes para os efeitos da presente invenção, que mediam a actividade de morte celular. Durante a ligação da imunoglobulina de acordo com a invenção a, pelo menos, duas daquelas moléculas de superfície celular, o sistema imune providencia citólise ou morte celular, deste modo podem ser providenciados meios potentes para atacar as células humanas.

Preferivelmente, o antigénio é seleccionado dos antigénios de superfície celular, incluindo receptores, em particular do grupo que consiste de quinases tirosina de receptor erbB (tais como EGFR, HER2, HER3 e HER4, mas não limitados a esses), moléculas da superfamília de receptor TNF, tal como receptor Apo-1, TNFR1, TNFR2, receptor de factor de crescimento nervoso NGFR, CD40, moléculas de superfície de célula-T, Receptores de célula-T, antigénio célula-T 0X40, receptor TACI, BCMA, Apo-3, DR4, DR5, DR6, receptores engodo, tais como DcRl, DcR2, CARI, HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-1, TNFL1, mas não são limitados a essas moléculas, antigénios de superfície de célula-B, tais como CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, antigénios de tumores sólidos ou células cancerígenas hematológicas, células de linfoma ou leucemia, outras células sanguíneas incluindo plaquetas sanguíneas, mas não limitado a estas moléculas.

De acordo com uma forma de realização preferida adicional, o antigénio ou a molécula que liga à região de alça estrutural é seleccionado do grupo que consiste de antigénios associados ao tumor, em particular EpCAM, glicoproteína-72 associada a tumor (TAG-72), antigénio CA 125 associado a tumor, antigénio de membrana específica de próstata (PSMA), antigénio associado a melanoma de elevado peso molecular (HMW-MAA), antigénio associado a tumor gue expressa hidratos de carbono relacionados com Lewis Y, antigénio carcinoembriónico (CEA), CEACAM5, HMFG PEM, mucina MUC1, MUC18 e antigénio de citogueratina associado a tumor, antigénios bacterianos, antigénios virais, alérgenos, moléculas IgE relacionadas com alergia, cKIT e Fc-epsilon-receptorl, IRp60, receptor IL-5, CCR3, receptor de eritrócitos (CRI), albumina de soro humano, albumina de soro de ratinho, albumina de soro de rato, Fc-gama-receptor FcRn neonatal, Fc-gama-receptor Fc-gama RI, Fc-gama-RII, Fc-gama RIII, Fc-alfa-receptor, Fc-epsilon-receptor, fluoresceina, lisozima, receptor 9 tipo-toll, eritropoetina, CD2, CD3, CD3E,CD4, CDll, CDlla, CD14, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33 (proteína p67), CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD64, CD80, CD147, GD3, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, LIF, OSM, interferão alfa, interferão beta, interferão gama; TNF-alfa,TNFbeta2, TNFalfa, TNFalfabeta, TNF-R1, TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L, 4-1 BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL,BAFF, LIGHT, VEG1, OX40L, TRAIL Receptor-1, Receptor de adenosina Al, Receptor beta linfotoxina, TACI, BAFFR, EPO; LFA-3, ICAM-1, ICAM-3, betal integrina, beta2 integrina, alfa4/beta7 integrina, alfa2 integrina, alfa3 integrina, alfa4 integrina, alfa5 integrina, alfa6 integrina, alfav integrina, alfaVbeta3 integrina, FGFR-3, Factor de Crescimento dos Queratinócitos, GM-CSF, M-CSF, RANKL, VLA-1, VLA-4, L-selectina, anti-id, E-selectina, HLA, HLA-DR, CTLA-4, receptor de célula-T, B7-1, B7-2, VNRintegrina, TGFbetal, TGFbeta2, eotaxinal, BLyS (Estimulador De Linfócito B) , complemento C5, IgE, IgA, IgD, IgM, IgG, factor VII, CBL, NCA 90, EG FR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB4), Factor de Tecido, VEGF, VEGFR, receptor de endotelina, VLA-4, hidratos de carbono tais como antigénios do grupo sanguíneo e hidratos de carbono relacionados, Glicosilação Galili, Gastrina, Receptores de gastrina, hidratos de carbono associados a tumor, Hapteno NP-cap ou NIP-cap, receptor alfa/beta de célula-T, E-selectina, P-glicoproteína, MRP3, MRP5, pi glutationa-S-transferase (proteínas com resistência a múltiplos fármacos), proteína de membrana grânulo alfa(GMP) 140, digoxina, Fosfatase Alcalina Placentária(PLAP) e Fosfatase Alcalina tipo PLAP testicular , receptor de transferrina, Heparanase I, miosina cardíaca humana, Glicoproteína Ilb/IIIa (GPIIb/IIIa) , glicoproteína de envelope gH do citomegalovírus humano (HCMV), HIV gpl20, HCMV, vírus RSV F sincicial respiratório, RSVF Fgp, VNRintegrina, Hep B gpl20, CMV, gpllbllla, HIV IIIB gpl20 V31oop, vírus sincicial respiratório (RSV) Fgp, glicoproteína gD do vírus do herpes simples (HSV), glicoproteína gB HSV, glicoproteína de envelope gB HCMV, toxina Clostridium perfringens e fragmentos dos mesmos.

As subestruturas de antigénios são normalmente referidas como "epítopos" (por ex., epítopos de célula-B, epítopos de célula-T), desde gue sejam imunologicamente relevantes, isto é, são também reconhecíveis por anticorpos naturais ou monoclonais. O termo "epítopo" de acordo com a presente invenção deve significar uma estrutura molecular gue pode completamente constituir um parceiro de ligação específico ou fazer parte de um parceiro de ligação específico para o domínio de ligação ou a imunoglobulina da presente invenção.

Quimicamente, um epítopo pode ser composto por um hidrato de carbono, um péptido, um ácido gordo, uma substância anorgânica ou derivados dos mesmos e quaisquer combinações dos mesmos. Se um epítopo é um péptido ou polipéptido, existirá normalmente, pelo menos, 3 aminoácidos, preferivelmente 8 a 50 aminoácidos, e mais preferivelmente entre cerca de 10-20 aminoácidos incluídos no péptido. Não existe nenhum limite superior critico para o comprimento do péptido, que pode compreender quase o comprimento total da sequência do polipéptido. Os epitopos podem ser lineares ou epitopos conformacionais. Um epitopo linear é compreendido por um único segmento de uma sequência primária de uma cadeia de polipéptido. Os epitopos lineares podem ser contíguos ou sobrepostos. Os epitopos conformacionais são compreendidos por aminoácidos trazidos em conjunto ao dobrar o polipéptido para formar uma estrutura terciária, e os aminoácidos não são necessariamente adjacentes um ao outro numa sequência linear.

Especificamente, os epitopos são, pelo menos, parte de moléculas diagnosticamente relevantes, isto é, a ausência ou presença de um epitopo numa amostra é qualitativamente ou quantitativamente correlacionado a uma doença, ou estado de saúde ou um estado de processo no fabrico, ou estado ambiental e alimentar. Os epitopos podem também fazer, pelo menos, parte de moléculas terapeuticamente relevantes, isto é, que podem ser destinadas por um domínio de ligação específica que altera o curso da doença.

Preferivelmente, os novos locais de ligação antigénio nas alças estruturais são introduzidos por substituição, eliminação e/ou inserção de um ou mais elementos na sequência da imunoglobulina, em particular na sequência de nucleótido.

De acordo com outra forma de realização preferida da presente invenção, a modificação de, pelo menos, um nucleótido resulta numa substituição, eliminação e/ou inserção da sequência de aminoácido da imunoglobulina codificada pelo dito ácido nucleico. A modificação de, pelo menos, uma região de alça pode resultar numa substituição, eliminação e/ou inserção de 1 ou mais nucleótidos ou aminoácidos, preferivelmente uma mutação de ponto, ou mesmo a mudança da totalidade das alças, mais preferivelmente a mudança de, pelo menos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, até 30 aminoácidos. Assim, a sequência modificada compreende aminoácidos não incluídos nas regiões conservadas das alças estruturais, os aminoácidos recentemente introduzidos que ocorrem naturalmente, mas estranhos ao local da modificação, ou substitutos de aminoácidos que ocorrem naturalmente. Quando o aminoácido estranho é seleccionado de um grupo específico de aminoácidos, tais como aminoácidos com polaridade específica, ou hidrofobicidade, uma biblioteca enriquecida no grupo específico de aminoácidos em posições aleatórias pode ser obtida de acordo com a invenção. Tais bibliotecas são também chamadas bibliotecas "focadas". A molécula de ácido nucleico aleatoriamente modificada pode compreender as unidades de repetição aqui identificadas, que codificam todos os aminoácidos naturalmente conhecidos ou um subconjunto dos mesmos. Aquelas bibliotecas que contêm sequências modificadas em que um subconjunto específico de aminoácidos é usado para efeitos de modificação são chamadas bibliotecas "focadas". O membro de tais bibliotecas tem uma probabilidade aumentada de um aminoácido de tal subconjunto na posição modificada, que é pelo menos duas vezes mais elevado que o normal, preferivelmente pelo menos 3 vezes ou pelo menos 4 vezes mais elevado. Tais bibliotecas têm também um número limitado ou inferior de membros de biblioteca, para que o número de membros de biblioteca actuais atinja o número de membros biblioteca teóricos. Em alguns casos, o número de membros de biblioteca de uma biblioteca focada não é inferior a 103 vezes o número teórico, preferivelmente não inferior a 102 vezes, mais preferivelmente não inferior a 10 vezes.

Uma biblioteca de acordo com a invenção pode ser designada como uma biblioteca dedicada que contém, pelo menos, 50% de formatos específicos, preferivelmente pelo menos 60%, mais preferido a pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, ou aqueles que consistem principalmente de formatos anticorpos específicos. Formatos anticorpos específicos são preferidos, de tal forma que a biblioteca preferida de acordo com a invenção é seleccionada do grupo que consiste de uma biblioteca VH, biblioteca VHH, biblioteca Vkappa, biblioteca Vlambda, biblioteca Fab, biblioteca CH1/CL e uma biblioteca CH3. As bibliotecas caracterizadas pelo conteúdo das moléculas de compósito, que contêm mais de um domínio anticorpo, tal como a biblioteca IgG ou biblioteca Fc, são especialmente preferidas. Outras bibliotecas preferidas são aquelas que contêm receptores célula-T, que formam bibliotecas receptoras de célula-T. Bibliotecas ainda mais preferidas são bibliotecas epítopo, em que a proteína de fusão compreende uma molécula com uma variante de um epítopo, também permitindo a selecção de moléculas competitivas com função de ligação similar, mas funcionalidade diferente. Exemplar é uma biblioteca TNFalfa, em que trímeros da proteína de fusão TNFalfa são exibidos por um único pacote genético.

Contudo, o número máximo de aminoácidos inseridos na região de alça de uma imunoglobulina pode preferivelmente não exceder o número de 30, preferivelmente 25, mais preferivelmente 20 aminoácidos no máximo. A substituição e a inserção dos aminoácidos ocorrem preferivelmente de forma aleatória ou semi-aleatória usando todos os aminoácidos possíveis ou uma selecção de aminoácidos preferidos para efeitos de aleatorização, por métodos conhecidos na técnica e como descrito no presente pedido de patente. O local da modificação pode ser numa alça estrutural única específica ou uma região de alça estrutural. Regiões de alça são normalmente compostas por pelo menos duas, preferivelmente em, pelo menos 3, ou pelo menos 4 alças que são adjacentes umas às outras, e as quais podem contribuir para a ligação de um antigénio através da formação de um local de ligação antigénio ou bolsa de ligação de antigénio. É preferido que um ou mais locais de modificação estejam localizados dentro de uma área de 10 aminoácidos, mais preferivelmente dentro de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 até 100 aminoácidos, em particular dentro de uma região estrutural para formar uma superfície ou bolsa onde o antigénio pode estericamente aceder às regiões de alça. A, pelo menos, uma região de alça é preferencialmente mutada ou modificada para produzir bibliotecas, preferencialmente por métodos de mutagénese aleatórios, semi-aleatórios ou, em particular, aleatórios direccionados ao local, em particular para eliminar, mudar ou introduzir insertos aleatoriamente gerados nas alças estruturais. Alternativamente preferido, é o uso de abordagens combinatoriais. Qualquer um dos métodos de mutagénese conhecidos pode ser usado, entre eles, mutagénese de cassete. Esses métodos podem ser usados para fazer modificações de aminoácido em posições desejadas da imunoglobulina da presente invenção. Em alguns casos, as posições são escolhidas aleatoriamente, por ex., com qualquer um dos possíveis aminoácidos ou uma selecção de aminoácidos preferidos para aleatorizar as sequências de alça, ou mudanças de aminoácidos são realizadas usando regras simplistas. Por exemplo, todos os resíduos podem ser mutados preferencialmente para especificar aminoácidos, tais como alanina, referido como aminoácidos ou análise de alanina. Tais métodos podem ser acoplados a mais abordagens concebidas sofisticadas que usam métodos de selecção para analisar níveis mais altos de diversidade de sequência.

Um método preferido de acordo com a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico aleatoriamente modificada que codifica uma imunoglobulina, domínio de imunoglobulina ou uma parte da mesma que compreende, pelo menos, uma unidade de repetição de um nucleótido dentro de uma região de codificação de alça estrutural com a sequência 5'-NNS-3', 5'-NNN-3', 5'-NNB-3' ou 5'-NNK-3'. Em algumas formas de realização, o ácido nucleico modificado compreende codões nucleótidos seleccionados do grupo de TMT, WMT, BMT, RMC, RMG, MRT, SRC, KMT, RST, YMT, MKC, RSA, RRC, NNK, NNN, NNS ou qualquer combinação dos mesmos (o código é de acordo com o IUPAC). A modificação da molécula de ácido nucleico pode ser executada ao introduzir os oligonucléotidos sintéticos num segmento maior do ácido nucleótido, ou por síntese de novo de uma molécula de ácido nucleico completa. A síntese de ácido nucleico pode ser executada com componentes básicos de trinucleótido que poderia reduzir o número de combinações de sequência sem sentido se um subconjunto de aminoácidos deve ser codificado (por ex., Yanez et ai. Nucleic Acids Res. (2004) 32:el58; Virnekas et ai. Nucleic Acids Res. (1994) 22:5600-5607). A molécula de ácido nucleico aleatoriamente modificada pode compreender as unidades de repetição acima identificadas, que codificam todos os aminoácidos naturalmente conhecidos.

Como bem conhecido da técnica, existe uma variedade de tecnologias de selecção que podem ser usadas para a identificação e isolamento de proteínas com certas características e afinidades de ligação, incluindo, por exemplo, tecnologias de descrição tais como phage display, ribosome display, cell surface display, e similares, como em baixo descrito. Métodos para produção e selecção de variantes de anticorpos são bem conhecidos na técnica. Os métodos gerais para a biologia, expressão, purificação e selecção molecular de anticorpos são descritos em Antibody Engineering, edited by Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; e Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr

Opin Chem Biol 5:683- 689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76.

Uma "alça estrutural" ou "alça não CDR", de acordo com a presente invenção, deve ser compreendida da seguinte forma: as imunoglobulinas são feitas de domínios com a chamada dobra da imunoglobulina. Na realidade, as folhas beta antiparalelas são ligadas por alças para formar um barril beta antiparalelo comprimido. Na região variável, algumas das alças dos domínios contribuem essencialmente para a especificidade do anticorpo, isto é, a ligação a um antigénio por um local de ligação natural de um anticorpo. Essas alças são chamadas de alças CDR. As alças CDR estão localizadas dentro da região de alça CDR, gue podem, em alguns casos, também ter uma região de estrutura variável (chamada "VFR") adjacente às alças CDR. É conhecido gue as VFR podem contribuir para a bolsa de ligação de antigénio de um anticorpo, que geralmente é principalmente determinada pelas alças CDR. Deste modo, aquelas VFR são consideradas como parte da região de alça CDR, e não seriam adequadamente usadas para o propósito da invenção. Contrariamente àquelas VFR dentro da região de alça CDR ou localizadas próximas das alças CDR, outras VFR de domínios variáveis seriam particularmente adequadas para serem usadas de acordo com a invenção. Aquelas são as alças estruturais das VFR localizadas no lado oposto da região de alça CDR, ou no lado do C-terminal de um domínio de imunoglobulina variável.

Todas as outras alças de domínios anticorpo contribuem bastante para a estrutura da molécula e/ou a função efectora. Essas alças são aqui definidas como "alças estruturais" ou alças não CDR, que também excluiriam quaisquer VFR dentro da região de alça CDR.

As moléculas de ácido nucleico que codificam as imunoglobulinas modificadas (e sempre incluídas em toda a especificação na sua totalidade em baixo: Fragmentos de imunoglobulina ou derivados) podem ser clonadas em células hospedeiras, expressas e testadas em termos das suas especificidades de ligação. Estas práticas são realizadas usando procedimentos bem conhecidos, e uma variedade de métodos gue podem ser usados na presente invenção são descritos em Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 3.sup.rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001), e Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). Os ácidos nucleicos que codificam as imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser incorporados num vector de expressão no sentido de expressar as ditas imunoglobulinas. Os vectores de expressão compreendem normalmente uma imunoglobulina operavelmente ligada que é colocada numa relação funcional, com sequências de controlo ou regulatórias, marcadores seleccionáveis, quaisquer parceiros de fusão, e/ou elementos adicionais. As imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser produzidas ao cultivar uma célula hospedeira transformada com ácido nucleico, preferivelmente um vector de expressão contendo ácido nucleico que codifica as imunoglobulinas modificadas, sob as condições adequadas para induzir ou causar expressão das imunoglobulinas modificadas. Os métodos para introduzir moléculas de ácido nucleico exógeno num hospedeiro são bem conhecidos na técnica, e vão variar com o hospedeiro usado. Claro que também podem ser usados sistemas de expressão acelulares ou sem células para a expressão de imunoglobulinas modificadas. O termo "sistema de expressão" refere-se a moléculas de ácido nucleico que contêm umas sequências de codificação desejadas e sequências de controlo numa ligação operável, para que as hospedeiras transformadas ou transfectadas com essas sequências sejam capazes de produzir as proteínas codificadas. No sentido de efectuar a transformação, o sistema de expressão pode ser incluído num vector; contudo, o ADN relevante pode então também ser integrado no cromossoma hospedeiro.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o sistema de expressão compreende um vector. Qualquer vector de expressão conhecido da técnica pode ser usado para este fim como adequado. A imunoglobulina modificada é preferivelmente expressa num hospedeiro, preferivelmente numa célula bacteriana, levedura, célula vegetal, numa célula animal ou numa planta ou animal.

Uma ampla variedade de células hospedeiras adequadas pode ser usada para expressar a imunoglobulina modificada, incluindo mas não limitadas a células mamíferas (células animais) ou células vegetais), bactérias (por ex., Bacillus subtilis, Escherichia coli), células de insecto, e levedura (por ex., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae) . Por exemplo, uma variedade de linhas celulares que podem ser usadas na presente invenção é descrita no catálogo de linha celular ATCC, disponível a partir da American Type Culture. Além disso, também as plantas e animais podem ser usados como hospedeiros para a expressão da imunoglobulina de acordo com a presente invenção. A expressão, assim como os vectores de transfecção ou cassetes, podem ser seleccionados de acordo com o hospedeiro usado.

Claro que também podem ser usados sistemas de expressão de proteína sem células ou acelulares.

Plataformas de expressão de proteína de transcrição/translação in vitro, que produzem quantidades suficientes de proteína, oferecem muitas vantagens de uma expressão proteica sem células, eliminando a necessidade de passos difíceis a montante ou a jusante (por ex., transformação, cultivo ou lise de células hospedeiras) normalmente associados a sistemas de expressão com base em célula.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, as imunoglobulinas modificadas são purificadas ou isoladas após expressão. As imunoglobulinas podem ser isoladas ou purificadas numa variedade de formas conhecidas dos especialistas da técnica. Os métodos de purificação padrão incluem técnicas cromatográficas, incluindo cromatografia de afinidade, cromatografia de troca de iões ou hidrofóbica, electroforética, imunológica, precipitação, diálise, filtração, concentração, e técnicas de cromatofocagem. A purificação é muitas vezes permitida por um parceiro de fusão particular. Por exemplo, os anticorpos podem ser purificados ao usar resina de glutationa se for usada uma fusão GST, cromatografia de afinidade Ni+2 se for usada uma marcação His ou anticorpo anti-flag imobilizada se for usada uma marcação flag. Para orientação geral em técnicas de purificação adeguadas, ver Antibody Purification: Principles and Practice, 3.sup.rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994. É evidente que também é possível expressar as imunoglobulinas modificadas de acordo com a presente invenção na superfície de um hospedeiro, em particular na superfície de uma bactéria, insecto ou célula de levedura ou na superfície de fagos ou vírus.

As imunoglobulinas modificadas podem ser analisadas usando uma variedade de métodos, incluindo mas não limitado àqueles usados em ensaios in vitro, in vivo e ensaios com base em células e tecnologias de selecção. A automação e tecnologias de análise de alto rendimento podem ser utilizadas nos procedimentos de análise. A análise pode utilizar um parceiro de fusão ou marcação, por exemplo uma enzima, uma marcação imune, marcação isotópica, ou marcação de pequena célula tal como uma tinta fluorescente ou colorimétrica ou uma molécula luminogénica.

Numa forma de realização preferida, as propriedades funcionais e/ou biofísicas das imunoglobulinas são analisadas num ensaio in vitro. Numa forma de realização preferida, o anticorpo é seleccionado para funcionalidade, por exemplo a sua capacidade de catalisar uma reacção ou a sua afinidade de ligação ao seu alvo.

Os ensaios podem empregar uma variedade de métodos de detecção incluindo, mas não limitado a, marcações cromogénicas, fluorescentes, luminescentes ou isotópicas.

Como é conhecido da técnica, um subconjunto de métodos de análise são aqueles que seleccionam membros favoráveis de uma biblioteca. Os métodos são aqui referidos como "métodos de selecção" e aqueles métodos são úteis na presente invenção para análise de imunoglobulinas modificadas. Quando as bibliotecas de imunoglobulinas são seleccionadas usando um método de selecção, apenas aqueles membros de uma biblioteca que são favoráveis, que cumprem alguns critérios de selecção, são propagados, isolados e/ou observados. Como será apreciado, porque apenas as variantes mais adequadas são observadas, tais métodos permitem a análise de bibliotecas que são maiores que aquelas seleccionáveis por métodos que ensaiam a adequação individualmente dos membros de biblioteca. A selecção é permitida por qualquer método, técnica, ou parceiro de fusão que liga, covalente ou não covalentemente, o fenótipo de imunoglobulina com o seu genótipo, que é a função de um anticorpo com o ácido nucleico que o codifica. Por exemplo, o uso de phage display como um método de selecção é permitido pela fusão dos membros de biblioteca à proteína de gene III. Desta forma, a selecção ou isolamento de imunoglobulinas modificadas que cumprem alguns critérios, por exemplo afinidade de ligação para o alvo da imunoglobulina, também selecciona ou isola o ácido nucleico que o codifica. Uma vez isolado, o gene ou genes que codificam as imunoglobulinas podem então ser amplificados. Este processo de isolamento e amplificação, referido como selecção, pode ser repetido, permitindo variantes anticorpo favoráveis na biblioteca a ser melhorada. A sequenciação do ácido nucleico do ácido nucleico em anexo no final permite a identificação do gene.

Uma variedade de métodos de selecção é conhecida na técnica que podem ser utilizados na presente invenção para analisar bibliotecas de imunoglobulina. Estas incluem, mas não são limitadas a, phage display (Phage display of peptides and antibodies: a laboratory manual, Kay et al., 1996, Academic Press, San Diego, Calif., 1996; Low-man et al. , 1991, Biochemistry 30:10832-10838; Smith, 1985, Science 228:1315-1317) e os seus derivados tais como infecção de fago selectiva (Malmborg et al., 1997, J Mol Biol 273:544-551), fago de infecção selectiva (Krebber et al. , 1997, J Mol Biol 2 68:619-630), e selecção de infecciosidade retardada (Benhar et al., 2000, J Mol Biol 301:893-904), cell surface display (Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399) tais como display em bactérias (Georgiou et al. , 1997, Nat Biotechnol 15:29-34; Georgiou et al., 1993, Trends Biotechnol 11:6-10; Lee et al., 2000, Nat Biotechnol 18:645-648; Jun et al., 1998, Nat Biotechnol 16:576-80), levedura (Boder & Wittrup, 2000, Methods Enzymol 328:430-44; Boder & Wittrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553- 557), e células mamíferas (Whitehorn et al., 1995, Bio/technology 13:1215-1219), assim como tecnologias de display in vitro (Amstutz et al. , 2001, Curr Opin Biotechnol 12:400-405) tal como polysome display (Mattheakis et al. , 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:9022-9026), ribosome display (Hanes et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:4937-4942), mRNA display (Roberts & Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:12297-12302; Nemoto et al., 1997, FEBS Lett 414:405- 408), e sistema de display de inactivação de ribossoma (Zhou et al., 2002, J Am Chem Soc 124, 538-543).

Outros métodos de selecção que podem ser usados na presente invenção incluem métodos que não se baseiam no display, tais como métodos in vivo, incluindo mas não limitado à expressão periplásmica e análise citométrica (Chen et al., 2001, Nat Biotechnol 19:537-542), o estudo de complementação de fragmento anticorpo (Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:10340-10344; Pelletier et al. , 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:12141-12146), e a selecção de dois híbridos em levedura (Fields & Song, 1989, Nature 340:245-246) usado no modo de selecção (Visintin et al. , 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:11723-11728) . Numa forma de realização alternativa é permitida a selecção por um parceiro de fusão que liga a uma sequência específica no vector de expressão, deste modo ligando covalente ou não covalentemente o parceiro de fusão e associado ao membro de biblioteca variante Fc com o ácido nucleico que os codifica.

Numa forma de realização alternativa, a selecção in vivo pode ocorrer se a expressão do anticorpo transmitir algum crescimento, reprodução ou vantagem de sobrevivência à célula.

Um subconjunto de métodos de selecção referido com métodos de "evolução direccionada" são aqueles que incluem a conjugação ou cultura das sequências favoráveis durante a selecção, algumas vezes com a incorporação de novas mutações. Como será apreciado por aqueles peritos na técnica, os métodos de evolução direccionada podem facilitar a identificação das sequências mais favoráveis numa biblioteca, e podem aumentar a diversidade de sequências que são analisadas. Vários métodos de evolução direccionada são conhecidos na técnica que podem ser utilizados na presente invenção para seleccionar variantes de anticorpo, incluindo mas não limitado a transposição de ADN (PCT WO 00/42561 A3; PCT WO 01/70947 A3), transposição de exões (Patente americana n° 6,365,377; Kolkman & Stemmer, 2001, Nat Biotechnol 19:423-428), transposição de família (Crameri et al. , 1998, Nature 391:288-291; Patente americana n° 6,376,246), RACHITT.TM. (Coco et al. , 2001, Nat Bio-technol 19:354-359; PCT WO 02/06469), STEP e iniciação aleatória para recombinação in vitro (Zhao et ai., 1998, Nat Biotechnol 16:258-261; Shao et ai., 1998, Nucleic Acids Res 26:681-683), montagem de genes mediada por exonuclease (Patente americana n° 6,352,842; Patente americana n° 6,361,974), Gene Site Saturation Mutagenesis.TM. (Patente americana n° 6,358,709), Gene Reassembly.TM. (Patente americana n° 6,358,709), SCRATCHY (Lutz et ai., 2001, Proc Natl Acad Sei USA 98:11248-11253), métodos de fragmentação de ADN (Kikuchi et al., Gene 236:159-167), transposição de ADN de cadeia simples (Kikuchi et al., 2000, Gene 243:133-137), e AMEsystem.TM. tecnologia de concepção de anticorpo de evolução direccionada (Applied Molecular Evolution) (Patente americana n° 5,824,514; Patente americana n° 5,817,483; Patente americana n° 5,814,476; Patente americana n° 5,763,192; Patente americana n° 5,723,323).

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção a ligação especifica da imunoglobulina modificada para a molécula é determinada por um ensaio de ligação seleccionado a partir do grupo que consiste de ensaios imunológicos, preferivelmente ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA), ensaios de ressonância plasmónica superficial, espectroscopia de ressonância magnética nuclear de diferença de transferência de saturação, espectroscopia de ressonância magnética nuclear de NOE (trNOE), ensaios competitivos, ensaios de ligação de tecido, ensaios de ligação de célula viva e ensaios de extracto celular.

Os ensaios de ligação podem ser realizados usando uma variedade de métodos conhecidos da técnica, incluindo mas não limitado a ensaios com base em FRET (Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência) e BRET (Transferência de Energia de Ressonância de Bioluminescência), AlphaScreenTM (Ensaio Homogéneo Amplificado da Proximidade Luminescente), Ensaio de

Cintilação por Proximidade, ELISA (Ensaio de Imunoabsorção Enzimática), SPR (Ressonância Plasmónica Superficial, também conhecido como BIACORETM), calorimetria de titulação isotérmica, calorimetria diferencial de análise, electroforese de gel e cromatografia incluindo filtração por gel. Estes e outros métodos podem ter a vantagem de algum parceiro de fusão ou marcação. A imunoglobulina modificada é preferencialmente conjugada com uma marcação ou molécula repórter, seleccionada do grupo que consiste de moléculas orgânicas, marcações enzimáticas, marcações radioactivas, marcações coloridas, marcações fluorescentes, marcações cromogénicas, marcações luminescentes, haptenos, digoxigenina, biotina, complexos metais, metais, ouro coloidal e misturas dos mesmos. As imunoglobulinas modificadas conjugadas com marcações ou moléculas repórter podem ser usadas, por exemplo, em métodos de diagnóstico. A imunoglobulina modificada pode ser conjugada com outras moléculas que permitem a simples detecção do dito conjugado, por exemplo, ensaios de ligação (por ex., ELISA) e estudos de ligação.

Numa forma de realização preferida, as variantes de anticorpo são seleccionadas usando um ou mais ensaios celulares ou in vivo. Para tais ensaios, as imunoglobulinas modificadas purificadas ou não purificadas são normalmente adicionadas exogenamente de tal forma que as células são expostas a imunoglobulinas individuais ou conjuntos de imunoglobulinas que pertencem a uma biblioteca. Esses ensaios são normalmente, mas não sempre, baseados na função da imunoglobulina; isto é, a capacidade do anticorpo para ligar o seu alvo e mediado algum evento bioquímico, por exemplo função efectora, inibição de ligação de ligante/receptor, apoptose, e similares. Tais ensaios envolvem muitas vezes a monitorização da resposta de células para o anticorpo, por exemplo sobrevivência celular, morte celular, mudança na morfologia celular, ou activação transcricional tal como expressão celular de um gene natural ou gene repórter. Por exemplo, tais ensaios podem medir a capacidade das variantes de anticorpo para obter ADCC, ADCP ou CDC. Para algumas células ou componentes adicionais de ensaios, que é uma adição às células alvo, pode ser necessário ser adicionado, por exemplo, complemento de soro, ou células efectoras tais como monócitos sanguíneos periféricos (PBMCs), células NK, macrófagos, e similares. Tais células adicionais podem ser de qualquer organismo, preferivelmente humanos, ratinho, rato, coelho e macaco. As imunoglobulinas podem provocar apoptose de certas linhas celulares que expressam o alvo, ou podem mediar o ataque nas células alvo por células imunes que foram adicionadas ao ensaio. Os métodos para monitorizar a morte celular ou viabilidade são conhecidos da técnica, e incluem o uso de tintas, imunoquímica, citoquímica e reagentes radioactivos. Por exemplo, ensaios com marcação de caspase podem permitir que a apoptose seja medida e absorver ou libertar substratos radioactivos ou tintas fluorescentes tais como o azul alamar, podem permitir o crescimento celular ou activação a ser monitorizada.

Numa forma de realização preferida, o ensaio de citotoxicidade com base em DELFIART EuTDA (Perkin Elmer, MA) pode ser usado. Alternativamente, as células alvo mortas ou danificadas podem ser monitorizadas pela medição da libertação de um ou mais componentes intracelulares naturais, por exemplo lactato desidrogenase. A activação transcricional pode também servir como um método para a função de testar em ensaios celulares. Neste caso, a resposta pode ser monitorizada ao testar os genes naturais ou imunoglobulinas que podem ser regulados de forma ascendente, por exemplo a libertação de certas interleucinas pode ser medida, ou alternativamente a leitura pode ser via uma construção em repórter. Os ensaios celulares podem também envolver a medição de alterações morfológicas de células como uma resposta à presença de imunoglobulinas modificadas. Os tipos de células para tais ensaios podem ser procarióticas ou eucarióticas, e uma variedade de linhas celulares que são conhecidas da técnica podem ser usadas. Alternativamente, as selecções celulares são executadas usando células que foram transformadas ou transfectadas com ácidos nucleicos que codificam as variantes. Isto é, variantes anticorpos não são adicionadas exogenamente às células. Por exemplo, numa forma de realização, a selecção celular utiliza cell surface display. Um parceiro de fusão pode ser usado que permite o display de imunoglobulinas modificadas na superfície das células (Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399).

Numa forma de realização preferida, a imunogenicidade das imunoglobulinas modificadas pode ser determinada experimentalmente usando um ou mais ensaios celulares. Numa forma de realização preferida, os ensaios de activação de célula-T ex vivo são usados para quantificar experimentalmente a imunogenicidade. Nestes métodos, as células que apresentam antigénio e células-T naives dos doadores correspondentes são desafiadas uma ou mais vezes com um péptido ou anticorpo total de interesse. Então, a activação de célula-T pode ser detectada usando um número de métodos, por exemplo ao monitorizar a produção de citocinas ou medindo a absorção de timidina tritiada. Na maioria das formas de realização preferidas, são monitorizadas usando ensaios Elispot (Schmittel et. al., 2000, J. Immunol. Meth., 24: 17-24).

As propriedades biológicas das imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser caracterizadas ex vivo na célula, tecido, e todas as experiências de organismo. Como é conhecido da técnica, os medicamentos são muitas vezes testados in vivo em animais, incluindo mas não limitado a ratinhos, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos e macacos, no sentido de medir a eficácia do medicamento para o tratamento face ao modelo de doença, ou para medir farmacocinéticos, farmacodinâmicos, toxicidade e outras propriedades do medicamento. Os animais podem ser referidos como modelos de doença. As terapêuticas são muitas vezes testadas em ratinhos, incluindo mas não limitado a ratinhos sem pêlo, ratinhos SCID, ratinhos com xenotransplantes e ratinhos transgénicos (incluindo knockins e knockouts). Tal experimentação pode providenciar dados significativos para a determinação do potencial do anticorpo a ser usado como terapêutica com a meia-vida adequada, função efectora, actividade apoptótica, actividade citotóxica ou citolítica. Qualquer organismo, preferencialmente mamíferos, pode ser usado para testar. Por exemplo, devido à sua semelhança com os humanos, os primatas, macacos podem ser modelos de doença adequados, e assim podem ser usados para testar a eficácia, toxicidade, farmacocinéticos, farmacodinâmicos, meia-vida ou outras propriedades das imunoglobulinas modificadas da presente invenção. Testes das substâncias em humanos são necessários, em último lugar, para aprovação como medicamentos, e assim claro, estas experiências são contempladas. Assim, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser testadas em humanos para determinar a sua eficácia terapêutica, toxicidade, imunogenicidade, propriedade farmacocinéticas e/ou outras propriedades clínicas. Especialmente aquelas imunoglobulinas polivalentes de acordo com a invenção que ligam à célula única através de, pelo menos, dois antigénios de superfície, preferivelmente ligação de, pelo menos, três estruturas que reticulam células alvo, será considerada actividade pró-apoptótica e exercer actividade apoptótica durante o targeting e reticulação celular. A ligação polivalente providencia uma associação relativamente grande dos parceiros de ligação, também chamada reticulação, que é um pré-requisito para a apoptose.

As imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser úteis numa ampla variedade de produtos de anticorpo. Numa forma de realização, o anticorpo variante da presente invenção é usado para terapia ou profilaxia, por ex. , como uma imunoterapia activa ou passiva, para utilização preparativa, industrial ou analítica, como um diagnóstico, um composto industrial ou um reagente de pesquisa, preferencialmente uma terapêutica. A imunoglobulina modificada ou variante anticorpo pode ser usada numa composição anticorpo que é monoclonal ou policlonal. Numa forma de realização preferida, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são usadas para capturar ou matar células alvo que suportam o antigénio alvo, por exemplo células cancerígenas. Numa forma de realização alternativa, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são usadas para bloquear, antagonizar ou agonizar o antigénio alvo, por exemplo ao antagonizar uma citocina ou receptor de citocina.

Numa forma de realização alternativamente preferida, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são usadas para bloquear, antagonizar, ou agonizar factores de crescimento ou receptores de factor de crescimento e assim mediar a morte das células alvo que suportam ou necessitam do antigénio alvo.

Numa forma de realização alternativamente preferida, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são usadas para bloquear, antagonizar ou agonizar enzimas e substrato de enzimas.

As imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser usadas para vários efeitos terapêuticos, preferivelmente para imunoterapia activa ou passiva.

Especificamente, a imunoglobulina de acordo com a presente invenção ou obtida por um método de acordo com a presente invenção, pode ser usada para a preparação de uma vacina para imunização activa. Deste modo, a imunoglobulina é usada como uma substância antigénica para formular uma vacina ou usada para fishing ou capturar estruturas antigénicas ex vivo ou in vivo para utilização numa formulação de vacina.

Numa forma de realização preferida, um anticorpo compreendendo as imunoglobulinas modificadas é administrado a um paciente para tratar um distúrbio especifico. Um "paciente" para os efeitos da presente invenção inclui humanos e outros animais, preferivelmente mamíferos, e mais preferivelmente humanos. Por "distúrbio específico" aqui significa um distúrbio que pode ser melhorado ao administrar uma composição farmacêutica que compreende uma imunoglobulina modificada da presente invenção.

Numa forma de realização, uma imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção é o único agente terapeuticamente activo administrado a um paciente. Alternativamente, a imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção é administrada em combinação com um ou mais agentes terapêuticos, incluindo mas não limitado a agentes citotóxicos, agentes quimioterapêuticos, citocinas, agentes inibidores de crescimento, agentes anti-hormonais, inibidores de quinase, agentes anti-angiogénicos, cardioprotectores ou outros agentes terapêuticos. As imunoglobulinas modificadas podem ser administradas concomitamente com um ou mais outros regimes terapêuticos. Por exemplo, uma variante anticorpo da presente invenção pode ser administrada ao paciente juntamente com quimioterapia, terapia de radiação, ou quimioterapia e terapia de radiação em conjunto. Numa forma de realização, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser administradas em conjunto com um ou mais anticorpos, que podem ou não compreender uma variante anticorpo da presente invenção. De acordo com outra forma de realização da invenção, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção e uma ou mais terapias anticancerigenas são usadas para tratar células cancerígenas ex vivo. E contemplado gue tal tratamento ex vivo possa ser útil no transplante de medula óssea e particularmente, transplante de medula óssea autóloga. É evidentemente contemplado que os anticorpos da invenção podem ser usados em combinação com ainda outras técnicas terapêuticas, tais como cirurgia.

Uma variedade de outros agentes terapêuticos pode ser útil para administração em imunoglobulinas modificadas da presente invenção. Numa forma de realização, a imunoglobulina modificada é administrada com um agente anti-angiogénico, que é um componente que bloqueia, ou interfere com alguns niveis, o desenvolvimento de vasos sanguíneos. 0 factor anti-angiogénico pode, por exemplo, ser uma pequena molécula ou uma proteína, por exemplo um anticorpo, molécula de fusão Fc ou citocina, que liga a um factor de crescimento ou receptor de factor de crescimento envolvido na promoção de angiogénese. 0 factor anti-angiogénico aqui preferido é um anticorpo que liga a um Factor de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF). Numa forma de realização alternativa, a imunoglobulina modificada é administrada com um agente terapêutico que induz ou melhora a resposta imune adaptativa, por exemplo, um anticorpo que tem como alvo CTLA-4. Numa forma de realização alternativa, a imunoglobulina modificada é administrada com um inibidor de quinase tirosina, a qual é uma molécula que inibe de alguma forma a actividade quinase tirosina de uma quinase de tirosina. Numa forma de realização preferida, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são administradas com uma citocina. Por "citocina" como aqui usada significa um termo genérico para proteínas libertadas por uma população celular que age noutra célula como mediadora intercelular incluindo quimiocinas.

As composições farmacêuticas são contempladas em que imunoglobulinas modificadas da presente invenção e um ou mais agentes terapeuticamente activas são formulados. Formulações estáveis das variantes de anticorpo da presente invenção são preparadas para armazenamento ao misturar a dita imunoglobulina com o grau desejado de pureza com portadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais, excipientes ou estabilizadores (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. As formulações a serem usadas para administração in vivo são preferencialmente estéreis. Isto é rapidamente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéril ou outros métodos. As imunoglobulinas modificadas e outros agentes terapeuticamente activos aqui descritos podem também ser formulados como imunolipossomas e/ou colocado em microcápsulas. A administração da composição farmacêutica que compreende uma imunoglobulina modificada da presente invenção, preferivelmente na forma de uma solução aquosa estéril, pode ser efectuada de várias formas, incluindo, mas não limitado a, oralmente, subcutaneamente, intravenosamente, intranasalmente, intraopticamente, transdermicamente, mucosamente, topicamente (por ex., géis, salves, loções, cremes, etc.), intraperitonealmente, intramuscularmente, intrapulmonar (por ex., AERx™ tecnologia comercialmente disponível da Aradigm, ou sistema de administração pulmonar Inhance™ comercialmente disponível de Inhale Therapeutics), vaginalmente, parenteralmente, rectalmente ou intraocularmente.

Como aqui usado, o termo "especificamente ligado" refere-se a uma reacção de ligação que é determinativa do ligante cognato de interesse numa população heterogénea de moléculas. Deste modo, sob condições designadas (por ex., condições de imunoensaio no caso de uma imunoglobulina, o anticorpo especificado liga a um "alvo" particular e não liga numa guantidade significativa a outras moléculas presentes numa amostra. Comparável às CDR de anticorpos, as regiões de alça estrutural modificadas são partes de proteína gue ligam antigénio, estrutura ou molécula, e não antigénios, como tal.

Outro aspecto da invenção refere-se a um método para produzir uma imunoglobulina ou uma preparação farmacêutica da mesma que compreende pelo menos uma modificação na região de alça estrutural da dita imunoglobulina e determinando a ligação da dita imunoglobulina a um epítopo de um antigénio, em que a imunoglobulina não modificada não liga significativamente ao dito epítopo, que compreende os passos de: - providenciar um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que compreende, pelo menos, uma região de alça, modificar pelo menos um resíduo de nucleótido de, pelo menos, uma dita região de alça, transferir o dito ácido nucleico modificado num sistema de expressão, expressar a dita imunoglobulina modificada, contactar a imunoglobulina modificada expressa com um epítopo, determinar se a dita imunoglobulina modificada liga ao dito epítopo, e providenciar a ligação de imunoglobulina modificada ao dito epítopo e opcionalmente acabando-a para uma preparação farmacêutica.

Numa forma de realização preferida, a imunoglobulina de acordo com a invenção é um anticorpo biespecífico ou um anticorpo de cadeia simples biespecífico. Ainda preferido é que a imunoglobulina compreende um domínio biespecífico, ou uma parte do mesmo, incluindo um mini-domínio.

Em particular, a presente invenção refere-se a um método para produzir uma imunoglobulina multiespecífica que se liga especificamente a, pelo menos, uma primeira molécula ou uma preparação farmacêutica da mesma, que compreende, pelo menos, uma modificação em, pelo menos, uma região de alça estrutural da dita imunoglobulina, e determinando a ligação especifica da dita, pelo menos, uma região de alça a, pelo menos, uma segunda molécula, a qual é um antigénio tal como seleccionado do grupo que consiste de alérgenos, antigénios associados ao tumor, auto-antigénios, enzimas, antigénios bacterianos, antigénios fúngicos, antigénios protozoários e antigénios virais, em que a imunoglobulina que continha uma região de alça estrutural não modificada não liga especificamente à dita, pelo menos, uma segunda molécula, que compreende os passos de: - providenciar um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que liga especificamente a, pelo menos, uma primeira molécula que compreende, pelo menos, uma região de alça estrutural, modificar pelo menos um resíduo nucleótido de, pelo menos, uma das ditas regiões de alça codificadas pelo dito ácido nucleico, transferir o dito ácido nucleico modificado num sistema de expressão, expressar a dita imunoglobulina modificada, contactar a imunoglobulina modificada expressa com a dita, pelo menos, uma segunda molécula, e determinar se a dita imunoglobulina modificada se liga especificamente à segunda molécula, e providenciar a imunoglobulina modificada que liga especificamente à dita, pelo menos, segunda molécula e opcionalmente acabando-a para uma preparação farmacêutica. A concepção de mais de uma especificidade para um membro de um par de ligação específico é preferida (Kufer et al. (2004) Trends in Biotechnology vol. 22 pages 238-244) . Várias tentativas têm sido feitas para produzir anticorpos multiespecificos, por ex., biespecificos ou fragmentos de anticorpos. Um problema na produção de anticorpos biespecificos feitos a partir de duas cadeias de polipéptidos diferentes (cadeia pesada e leve) é a necessidade de expressar guatro cadeias diferentes (duas cadeias pesadas e duas leves) numa célula que resulta num número de várias combinações que devem ser separadas da molécula biespecifica desejada na mistura. Devido à sua semelhança, a separação destas moléculas é difícil e dispendiosa. Várias técnicas têm sido usadas para minimizar a ocorrência de tais combinações não desejadas (Carter (2001) Journal of Immunological Methods, vol 248, pages 7-15) .

Uma solução para o problema é a produção de uma cadeia de polipéptido com duas especificidades, como por ex., dois scFvs ligados um ao outro, ou a produção dos chamados diabodies. Tem-se mostrado que tais moléculas estão bem longe da dobra de uma molécula natural e são notoriamente difíceis de produzir (Le-Gall et al. (2004) Protein Engineering, Design & Selection vol 17 pages 357-366) .

Outro problema da presente concepção de anticorpos biespecificos é o facto de que mesmo se os anticorpos forem bivalentemente ligados ao seu parceiro de ligação respectivo (por ex., IgG), o anticorpo biespecífico resultante é monovalente para cada um dos parceiros de ligação respectivos.

As moléculas multiespecificas preferidas da presente invenção resolvem estes problemas: A expressão de uma molécula biespecifica com uma cadeia polipeptídica é possível (um domínio Ig modificado com duas especificidades de ligação, ver secção exemplo) , a qual é mais fácil de atingir do que a expressão de duas cadeias polipeptideas de anticorpo (Cabilly et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3273-3277 (1984)) .

Também pode ser produzido como uma molécula tipo anticorpo (isto é, feito de duas cadeias polipeptidicas, homidiméricas ou heterodiméricas), devido ao facto de que a segunda especificidade está localizada na parte não variável da molécula, não sendo necessárias duas cadeias leve e pesada diferentes. Deste modo, não há a possibilidade de combinação errada das duas cadeias.

Um anticorpo da presente invenção pode consistir de uma cadeia pesada e uma cadeia leve, que forma em conjunto uma região variável que liga a um parceiro de ligação especifico por uma primeira especificidade. A segunda especificidade pode ser formada por uma alça modificada de quaisquer alças estruturais de cadeia pesada ou cadeia leve. 0 local de ligação também pode ser formado por mais de uma alça não CDR que pode ser estruturalmente próximos (na cadeia pesada ou na cadeia leve ou em ambas as cadeias). 0 anticorpo modificado ou derivado pode ser um anticorpo completo ou um fragmento de anticorpo (por ex., Fab, CH1-CH2, CH2-CH3, Fc, com ou sem a região de articulação).

Pode ser ligado de forma mono ou polivalente ao mesmo, ou parceiros de ligação diferentes, ou mesmo com diferente valência para os diferentes parceiros de ligação, dependendo da concepção.

Como existe um número de várias alças disponíveis para selecção e concepção de um local de ligação específico nas regiões não CDR de cadeias pesadas e leves, é possível conceber derivados de anticorpos com ainda mais do que duas especificidades sem os problemas acima mencionados.

Os domínios de ligação específicos dentro de uma cadeia polipeptídica podem ser ligados com ou sem um ligante peptídico. A região de alça estrutural modificada da dita imunoglobulina inventiva pode estar dentro do domínio constante e/ou variável da dita imunoglobulina. No caso em gue a alça estrutural modificada está dentro do domínio constante, ela está preferivelmente dentro de CHI, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C ou uma parte dos mesmos.

De acordo com uma forma de realização da presente invenção, a imunoglobulina é de origem humana ou murina.

Uma vez que a imunoglobulina modificada pode ser utilizada para vários fins, em particular em composições farmacêuticas, a imunoglobulina é preferivelmente de origem humana ou murina. Obviamente, a imunoglobulina modificada pode também ser imunoglobulina humanizada ou quimérica.

De acordo com outra forma de realização preferida da presente invenção, a imunoglobulina humana é seleccionada do grupo que consiste de IgAl, IgA2, IgD, IgE, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM. A imunoglobulina murina é preferivelmente seleccionada do grupo que consiste de IgA, IgD, IgE, IgGl, IgG2A, IgG2B, IgG2C, IgG3 e IgM. A imunoglobulina modificada pode ser derivada de uma das classes de imunoglobulina acima identificadas, e estruturalmente alteradas depois. A imunoglobulina compreende preferivelmente uma cadeia pesada ou leve da imunoglobulina ou uma parte da mesma. Tanto a molécula heterodimérica ou uma homodimérica pode ser preferivelmente provida para efeitos da invenção, assim como imunoglobulinas monoméricas. A imunoglobulina modificada pode compreender uma cadeia leve e/ou pesada, e pelo menos um domínio variável e/ou constante. A imunoglobulina de acordo com a presente invenção compreende preferivelmente, pelo menos, um domínio constante e/ou, pelo menos, um variável da imunoglobulina ou uma parte da mesma que inclui um mini-domínio.

Um domínio constante é uma unidade de dobra da imunoglobulina da parte constante de uma molécula de imunoglobulina, também referida como um domínio da região constante (por ex., CHI, CH2, CH3, CH4, Ck, Cl).

Um domínio variável é uma unidade de dobra de imunoglobulina da parte variável de uma imunoglobulina também referida como um domínio da região variável (por ex., Vh, Vk, VI, Vd).

Uma imunoglobulina preferida de acordo com a invenção consiste de um domínio constante seleccionado a partir do grupo que consiste de CHI, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C, ou uma parte ou combinações dos mesmos, incluindo um mini-domínio, com pelo menos uma região de alça, e é caracterizada pelo facto de que a dita, pelo menos uma região de alça compreende, pelo menos uma modificação de aminoácido que forma, pelo menos uma região de alça modificada, em que a dita, pelo meno uma região de alça modificada liga especificamente a, pelo menos um epítopo de um antigénio. A imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção pode compreender um ou mais domínios constantes (por ex., dois, três, quatro, cinco, seis, dez domínios). Se mais do que um domínio estiver presente na imunoglobulina modificada, esses domínios podem ser do mesmo tipo ou tipos variantes (por ex., CH1-CH1-CH2, CH3-CH3, região Fc,(CH2)2-(CH3)2). Claro que também a ordem dos domínios únicos podem ser de qualquer tipo (por ex., CH1-CH3-CH2, CH4-CH1-CH3-CH2).

De acordo com outra forma de realização preferida da presente invenção, as regiões de alça modificadas de CHI, CH2, CH3 e CH4 compreendem aminoácidos 7 a 21, aminoácidos 25 a 39, aminoácidos 41 a 81, aminoácidos 83 a 85, aminoácidos 89 a 103 e aminoácidos 106 a 117.

De acordo com qualquer outra forma de realização da presente invenção, os resíduos de aminoácidos das posições 15 a 17, 29 a 34, 85,4 a 85,3, 92 a 94, 97 a 98 e/ou 108 a 110 de CH3 são modificados.

As regiões de alça de Igk-C e Igl-C de origem humana compreendem preferivelmente os aminoácidos 8 a 18, aminoácidos 27 a 35, aminoácidos 42 a 78, aminoácidos 83 a 85, aminoácidos 92 a 100, aminoácidos 108 a 117 e aminoácidos 123 a 126.

As regiões de alça de Igk-C e Igl-C de origem murina compreendem preferivelmente os aminoácidos 8 a 20, aminoácidos 26 a 36, aminoácidos 43 a 79, aminoácidos 83 a 85, aminoácidos 90 a 101, aminoácidos 108 a 116 e aminoácidos 122 a 125.

De acordo com uma forma de realização especifica, a imunoglobulina de acordo com a invenção pode conter uma modificação dentro do domínio variável, que é selecionada a partir do grupo de VH, Vkappa, Vlambda, VHH e combinações das mesmas. Mais especificamente, elas compreendem pelo menos uma modificação dentro dos aminoácidos 7 a 21, aminoácidos 25 a 39, aminoácidos 41 a 81, aminoácidos 83 a 85, aminoácidos 89 a 103 ou aminoácidos 106 a 117, onde a numeração da posição dos aminoácidos dos domínios é aquela do IMGT.

Outra imunoglobulina preferida de acordo com a invenção consiste num domínio variável de uma cadeia pesada ou leve, ou uma parte da mesma incluindo um mini-domínio, com pelo menos uma região de alça, preferivelmente uma região de alça estrutural, e é caracterizada pelo facto de que a dita pelo menos uma região de alça compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos formando pelo menos uma região de ansa modificada, em que a dita pelo menos uma região de alça modificada se liga especif icamente a pelo menos um epítopo de um antigénio.

Numa forma de realização alternativa, a imunoglobulina de acordo com a invenção é caracterizada pelo facto de que as regiões de alça de VH ou Vkappa ou Vlambda de origem humana compreendem pelo menos uma modificação dentro dos aminoácidos 8 a 20, aminoácidos 44 a 50, aminoácidos 67 a 76 e aminoácidos 89 a 101, mais preferivelmente posições de aminoácidos 12 a 17, posições de aminoácidos 45 a 50, posições de aminoácidos 69 a 75 e posições de aminoácidos 93 a 98, onde a numeração da posição dos aminoácidos dos domínios é aquela do IMGT.

As regiões de alça estrutural do domínio variável da imunoglobulina de origem humana, conforme possivelmente selecionadas para propósitos de modificação de acordo com a invenção compreendem, preferivelmente, aminoácidos 8 a 20, aminoácidos 44 a 50, aminoácidos 67 a 76 e aminoácidos 89 a 101.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, as regiões de alça estrutural do domínio variável da imunoglobulina de origem murina, conforme possivelmente selecionadas para propósitos de modificação de acordo com a invenção compreendem aminoácidos 6 a 20, aminoácidos 44 a 52, aminoácidos 67 a 76 e aminoácidos 92 a 101. A imunoglobulina de acordo com a invenção é, preferivelmente, também de origem de camelo. Os anticorpos de camelo compreendem apenas uma cadeia pesada e têm a mesma afinidade de antigénio que os anticorpos normais consistindo em cadeias leves e pesadas. Consequentemente, os anticorpos de camelo são muito menores do que, por exemplo, anticorpos humanos, o que lhes permite penetrar em tecidos densos para atingir o antigénio, onde as proteínas maiores não podem. Além disso, a simplicidade comparativa, afinidade e especificidade elevadas e o potencial para atingir e interagir com sítios ativos, os anticorpos de cadeias pesadas do camelo apresentam vantagens sobre os anticorpos comuns na conceção, produção e aplicação de compostos clinicamente valiosos. A imunoglobulina de origem de camelo ou camelídeo compreende preferivelmente pelo menos um domínio constante selecionado a partir do grupo que consiste em CHI, CH2 e CH3. De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, as regiões de alça de CHI, CH2 e CH3 da imunoglobulina de camelo compreendem os aminoácidos 8 a 20, aminoácidos 24 a 39, aminoácidos 42 a 78, aminoácidos 82 a 85, aminoácidos 91 a 103 e aminoácidos 108 a 117.

Ainda mais especificado, as regiões de alça de imunoglobulina de VH de origem murina compreendem pelo menos uma modificação dentro dos aminoácidos 6 a 20, aminoácidos 44 a 52, aminoácidos 67 a 76 e aminoácidos 92 a 101, onde a numeração da posição dos aminoácidos dos domínios é aquela do IMGT. As regiões de alça modificadas de um VHH de origem de camelídeo compreendem, preferivelmente, pelo menos, uma modificação dentro dos aminoácidos 7 a 18, aminoácidos 43 a 55, aminoácidos 68 a 75 e aminoácidos 91 a 101, onde a numeração da posição dos aminoácidos dos domínios é aquela da IMGT.

As regiões de aminoácidos acima identificadas das respectivas imunoglobulinas são regiões de alça especificadas como sendo adequadas para propósitos de modificação de acordo com a invenção.

Ainda outro aspecto da presente invenção relaciona-se com um método para ligar e/ou detectar especificamente uma molécula que compreende os passos de: (a) Contactar uma imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção ou uma imunoglobulina modificada obtida por um método de acordo com a presente invenção com uma amostra teste suspeita de conter a dita molécula, e (b) Detectar a formação potencial de um complexo de imunoglobulina específica/molécula.

Outro aspecto da presente invenção relaciona-se com um método para isolar especificamente uma molécula que compreende os passos de: (a) Contactar a imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção ou uma imunoglobulina obtida por um método de acordo com a presente invenção com uma amostra gue contém a dita molécula, (b) Separar o complexo de imunoglobulina/molécula especifica formada, e (c) Opcionalmente isolar a molécula do dito complexo.

As imunoglobulinas de acordo com a presente invenção podem ser usadas para isolar especificamente moléculas de uma amostra. Se as imunoglobulinas multiespecificas são usadas, mais do gue uma molécula pode ser isolada de uma amostra. É especialmente vantajoso usar imunoglobulinas modificadas em tais métodos porgue permite, por ex., gerar uma matriz com uma superfície homogénea com guantidades definidas de parceiros de ligação (isto é, imunoglobulinas modificadas) imobilizadas no mesmo gue é capaz de ligar às moléculas a serem isoladas. Em contraste do mesmo, se forem usados parceiros de ligação monoespecificos não pode ser gerada gualguer matriz homogénea porgue os parceiros de ligação únicos se não ligam com a mesma eficiência à matriz.

Outro aspecto da presente invenção relaciona-se com um método para atingir um composto para um alvo que compreende os passos de: (a) Contactar a imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção ou uma imunoglobulina modificada obtida por um método de acordo com a presente invenção capaz de se ligar, especificamente, ao dito composto, (b) Administrar o complexo imunoglobulina/composto ao alvo.

As imunoglobulinas modificadas de acordo com a presente invenção podem ser usada para administrar, pelo menos, um composto ligado às CDR e/ou regiões de alça modificadas a um alvo. Tais imunoglobulinas podem ser usadas para atingir substâncias terapêuticas para um local de acção preferido no curso do tratamento de uma doença.

Outro aspecto da presente invenção relaciona-se com a utilização de uma imunoglobulina de acordo com a presente invenção ou obtida através de um método de acordo com a presente invenção para a preparação de uma biblioteca de proteína de imunoglobulinas. Outras biblioteca de acordo com a invenção contêm, não só, uma variedade de proteínas ou proteínas de fusão, pacotes genéticos, mas também precursores de proteínas, ácidos nucleicos, ribossomas, células, vírus, fagos e outros sistemas de biblioteca, os quais expressam informação de codificação de proteínas e/ou as proteínas como tal.

Outro aspecto da presente invenção relaciona-se com uma biblioteca de proteína compreendendo uma imunoglobulina de acordo com a presente invenção ou obtida por um método de acordo com a presente invenção.

Os métodos preferidos para construir a dita biblioteca podem ser encontrados acima e nos exemplos. A biblioteca de acordo com a presente invenção pode ser usada para identificar imunoglobulinas que se ligam a uma molécula distinta.

Em particular, a presente invenção relaciona-se com a utilização de uma biblioteca compreendendo uma proteína de acordo com a presente invenção ou obtida através de um método de acordo com a presente invenção para a preparação de derivados de imunoglobulina.

Uma imunoglobulina existente pode ser alterada para introduzir locais de ligação de antigénio em qualquer domínio ou mini-domínio usando uma biblioteca de proteína do respectivo domínio de, pelo menos, 10, preferencialmente 100, mais preferencialmente 1000, mais preferencialmente 10 000, mais preferencialmente 100 000, mais preferencialmente mais de 1 000 000 domínios variantes ou mini-domínios com, pelo menos, uma alça modificada, em particular uma ou mais alças estruturais. 0 número de membros de uma biblioteca pode ser ainda mais elevado, na maioria dos casos até 1012, com alguns sistemas de display, tais como ribosome display, o número pode ser ainda mais elevado do que esse. A biblioteca é então filtrada em termos de união para o antigénio específico. Após caracterização molecular para as propriedades desejadas, o domínio ou mini-domínio seleccionado é clonado na imunoglobulina original através de técnicas de engenharia genética, de modo a que substitua a região do tipo selvagem. Alternativamente, apenas a codificação de ADN para as alças ou codificação para os aminoácidos mutados podem ser trocadas para obter uma imunoglobulina com o local de ligação adicional para o antigénio específico. A escolha do local para a alça estrutural específica para antigénio mutada é dependente da estrutura da imunoglobulina original e do objectivo de local de ligação adicional. Se, por exemplo, a molécula original for uma imunoglobulina completa que necessite de ser inserida num local de ligação de antigénio adicional sem perturbação de uma função efectora, as alças a serem modificadas seriam seleccionadas de diferentes domínios distantes de CH2 e CH3, os quais são parceiros de ligação naturais para moléculas Fc-efectoras. Se a imunoglobulina original for um fragmento Fab, é possível a modificação de alças em domínios constantes das cadeias leves ou cadeias pesadas, ou respectivos domínios variáveis. Para gerar uma biblioteca podemos preparar bibliotecas de moléculas originais mutantes que têm mutações em uma ou mais alças estruturais de um ou mais domínios. A selecção com moléculas originais mutadas completas pode ter algumas vantagens na medida que a selecção para a ligação de antigénio com uma alça estrutural modificada irá aplicar as modificações estericamente vantajosas se testadas também para outras propriedades que a imunoglobulina deve agora mostrar. Em particular, a biblioteca Fc é preferida, por exemplo, com locais de ligação na região de alça C-terminal. 0 requisito de dimensão (isto é, o número de proteínas variantes) de uma biblioteca de proteína de um domínio ou mini-domínio mutado, ou uma molécula de fusão de um domínio, é dependente da tarefa. Em geral, uma biblioteca para gerar novamente um local de ligação de antigénio necessita de ser maior do que a biblioteca usada para modificar ainda mais um local de ligação de antigénio criado já existente, feito a partir uma alça estrutural modificada (por exemplo, para melhorar a afinidade ou alterar a especificidade fina para o antigénio). A presente invenção também se relaciona com uma biblioteca de imunoglobulina ou biblioteca de ácido nucleico, compreendendo uma pluralidade de imunoglobulina, por exemplo, um domínio variável ou constante, um mini-domínio e/ou, pelo menos, uma região de alça estrutural contida num mini-domínio, ou moléculas de ácido nucleico que codificam o mesmo. A biblioteca contém membros com diferentes modificações, em que a pluralidade é definida pelas modificações na, pelo menos, uma região de alça estrutural. A biblioteca de ácido nucleico inclui, preferencialmente, pelo menos, 10 diferentes membros com uma diferença na sequência nucleótida para obter, pelo menos, um aminoácido diferente (resultando numa troca de aminoácido), e mais preferencialmente inclui, pelo menos 100, mais preferencialmente 1 000 ou 10 000 membros diferentes (por exemplo, criados por estratégias de aleatorização ou técnicas combinatórias). Ainda mais números de membros individuais diversificados, tais como, pelo menos, 1000000 ou, pelo menos, 10000000 são também preferidos.

Um outro aspecto da invenção é a combinação de duas imunoglobulinas, domínios ou mini-domínios diferentes seleccionados de, pelo menos, duas bibliotecas de acordo com a invenção, de modo a gerar imunoglobulinas multiespecíficas. Estas imunoglobulinas especificas seleccionadas podem ser combinadas entre si e com outras moléculas, de forma semelhante aos componentes básicos, para conceber a disposição óptima dos domínios ou mini-domínios para obter as propriedades desejadas. Por exemplo, uma molécula baseada em Fc pode ser usada como tal, com propriedades de ligação de antigénio, como um portador para outros motivos de ligação ou como um componente básico para criar uma imunoglobulina com domínios constantes ou variáveis, ou de outro modo, combinados com apenas domínios constantes, tais como moléculas Fc multiméricas, preferencialmente com 2, 3 ou 4 locais de ligação de antigénio.

Além disso, uma ou mais imunoglobulinas modificadas de acordo com a invenção podem ser produzidas em vários ou em todos os diferentes locais de uma proteína, sem destruição da estrutura da proteína. Através de tal técnica de "transposição de domínio", as novas bibliotecas são criadas, as quais podem novamente ser seleccionadas para as propriedades desejadas.

Preferencialmente, a imunoglobulina de acordo com a presente invenção é composta por, pelo menos, dois domínios de imunoglobulina, ou parte da mesma, incluindo um mini-domínio, e cada domínio contém, pelo menos, um local de ligação de antigénio.

Também preferida é uma imunoglobulina de acordo com a invenção, a qual compreende, pelo menos, um domínio da região constante e/ou, pelo menos, um domínio da região variável da imunoglobulina, ou uma parte da mesma, incluindo um mini-domínio. Assim, os domínios variáveis, os quais são, por exemplo modificados na região C-terminal, ou o domínio variável ligado a uma região CHI modificada, por exemplo, um mini-domínio modificado CHI é uma das formas de realização preferidas. A biblioteca preferida contém, imunoglobulinas de acordo com a invenção, seleccionadas do grupo que consiste dos domínios de uma imunoglobulina, míni-domínios ou derivados dos mesmos.

Uma forma de realização preferida da presente invenção é uma molécula de ligação para um antigénio (antigénios, molécula de ligação) compreendendo, pelo menos, um domínio de imunoglobulina e uma região de alça estrutural modificada de acordo com a presente invenção para se ligar ao antigénio, em que a dita molécula de ligação não compreende o domínio variável do anticorpo. Pode compreender outras partes utilizáveis para actividades de anticorpo (por exemplo, tais como regiões naturais ou modificadas efectoras (sequências); contudo, falta a região de ligação natural dos anticorpos, isto é, os domínios variáveis ou alças CDR, incluindo alças VFR dentro da região CDR, na sua posição natural. As moléculas de ligação de antigénio de acordo com a presente invenção, tem as vantagens descritas acima para as presentes moléculas; no entanto, sem as actividades de ligação específicas dos anticorpos mediados por alças CDR; contudo, com uma actividade recém-introduzida de ligação específica na região de alça estrutural.

Preferencialmente, estas moléculas de ligação de antigénio de acordo com a presente invenção compreendem CHI, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C e combinações das mesmas; as ditas combinações compreendem, pelo menos, preferencialmente, pelo menos, quatro, especialmente seis domínios constantes e, pelo menos, uma alça estrutural ou uma região de alça modificada de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, estas regiões de alça estrutural são ligadas através da região de alça estrutural modificada de acordo com a presente invenção, ou as alças estruturais estando naturalmente presentes entre os dois ditos domínios constantes. Uma forma de realização destas moléculas de ligação de antigénio, de acordo com a presente invenção, consiste de uma região Fc de um anticorpo com, pelo menos, uma modificação numa alça estrutural de acordo com a presente invenção. Também para as moléculas de ligação de antigénio, de acordo com a presente invenção, é preferido que os novos locais de ligação de antigénio nas alças estruturais sejam introduzidos por tecnologias de aleatorização, isto é, ao alterar um ou mais resíduos aminoácidos da alça por técnicas de aleatorização, ou por introduzir insertos gerados aleatoriamente em tais alças estruturais. Alternativamente, é preferida a utilização de abordagens combinatórias. Preferencialmente, os locais de ligação de antigénio nas alças estruturais modificadas são seleccionados de bibliotecas adequadas.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção relaciona-se com uma imunoglobulina modificada tendo um local de ligação de antigénio para providenciar uma especificidade estranha à imunoglobulina não modificada e incorporada em uma ou mais alças estruturais. 0 termo "estranho" significa que o antigénio não é reconhecido pela região de ligação CDR específica ou outras regiões de ligação naturais ou intrínsecas da imunoglobulina. Um parceiro de ligação estranho, mas não o parceiro de ligação natural de uma imunoglobulina, pode então ser ligado pelo local de ligação de antigénio recém-formado por uma alça estrutural, isto significa que um parceiro de ligação natural, tal como um receptor-Fc ou um efector do sistema imune, não é considerado ser ligado pelo local de ligação de antigénio estranho à imunoglobulina não modificada.

As imunoglobulinas preferidas de acordo com a presente invenção compreendem, pelo menos, dois locais de ligação de antigénio, o primeiro local ligando-se a um primeiro epítopo e o segundo local ligando-se a um segundo epítopo.

De acordo com uma forma de realização preferida, a presente imunoglobulina compreende, pelo menos, duas regiões de alça, a primeira região de alça ligando-se a um primeiro epítopo, e uma segunda região de ligação de alça ligando-se a um segundo epítopo. Tanto, pelo menos, a primeira ou, pelo menos, segunda região de alça, ou ambas podem conter uma alça estrutural. As imunoglobulinas de acordo com a presente invenção incluem os fragmentos das mesmas, conhecidas na técnica como sendo funcionais, as quais contêm os elementos essenciais de acordo com a presente invenção: a alça estrutural ou região de alça modificada de acordo com a presente invenção. A imunoglobulina preferida de acordo com a invenção compreende um domínio que tem, pelo menos, 50% de homologia com o domínio não modificado. O termo "homologia" indica que os polipéptidos têm os mesmos resíduos ou resíduos conservados numa posição correspondente à posição na sua estrutura primária, secundária ou terciária. O termo também se estende a duas ou mais sequências nucleótidas que codificam os polipéptidos homólogos. "Domínio de imunoglobulina homóloga" significa um domínio de imunoglobulina de acordo com a invenção tendo, pelo menos, cerca de 50% de identidade de sequência de aminoácido relativamente a uma sequência de domínio de imunoglobulina de sequência nativa de comprimento total, ou quaisquer outros fragmentos de uma sequência de domínio de imunoglobulina de comprimento total como aqui descrito. Preferencialmente, um domínio de imunoglobulina homóloga terá, pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência de aminoácido, preferencialmente, pelo menos, cerca de 55% de identidade de sequência de aminoácido, mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 60% de identidade de sequência de aminoácido, mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 65% de identidade de sequência de aminoácido, mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 70% de identidade de sequência de aminoácido, mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 75% de identidade de sequência de aminoácido, mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácido, mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 85% de identidade de sequência de aminoácido, mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácido, mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 95% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de domínio de imunoglobulina nativa, ou qualquer outro fragmento especificamente definido de uma sequência de domínio de imunoglobulina de comprimento total como aqui descrita. "Percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácido" relativamente às sequências de domínio de imunoglobulina aqui identificadas é definido como a porcentagem de resíduos de aminoácido numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácido na sequência de domínio de imunoglobulina específica, após alinhar a sequência e introduzir espaços, se necessário, para conseguir uma porcentagem de sequência de identidade máxima, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade da sequência. O alinhamento para efeitos de determinar a porcentagem de identidade de sequência de aminoácido, pode ser conseguido de várias formas que estão dentro da competência da técnica, por exemplo, usando software informático publicamente disponível tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueles com experiência na técnica podem determinar parâmetros adequados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para conseguir alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências que estão a ser comparadas.

Os valores de porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácido podem ser obtidos como descrito em baixo usando o programa informático WU-BLAST-2 (Altschul et ai., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996). A maioria dos parâmetros de pesguisa do WU-BLAST-2 é definida pelos valores por defeito. Agueles não definidos em valores por defeito, por exemplo, os parâmetros ajustáveis, são definidos com os seguintes valores: overlap span=l, overlap fraction=0.125, word threshold (T)=ll, e scoring matrix=BLOSUM62. Quando é utilizado o WU-BLAST—2, é determinado um valor de sequência de % de aminoácido ao dividir (a) o número de resíduos de aminoácido idênticos correspondentes entre a sequência de aminoácido do domínio de interesse da imunoglobulina tendo uma sequência derivada do domínio de imunoglobulina nativa e a sequência de aminoácido de comparação de interesse (isto é, a sequência face à qual o domínio de imunoglobulina de interesse está a ser comparada, o qual pode ser um domínio de imunoglobulina não modificada) como determinado por WU-BLAST-2 por (b) o número total de resíduos aminoácidos das partes não aleatorizadas do domínio de imunoglobulina de interesse. Por exemplo, na declaração "um polipéptido" compreendendo "uma sequência de aminoácido A, a qual tem, ou tendo, pelo menos, 80% de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido B", a sequência de aminoácido A é a sequência de aminoácido de comparação de interesse e a sequência de aminoácido B é a sequência de aminoácido do domínio de imunoglobulina ou interesse.

Outro aspecto da presente invenção relaciona-se com um kit de parceiros de ligação contendo (a) uma imunoglobulina modificada tendo um local estranho de ligação de antigénio para a imunoglobulina incorporada em uma ou mais alças estruturais CH3, e (b) uma molécula de união contendo um epítopo do dito antigénio.

Tal molécula de união deste kit, de acordo com a presente invenção, pode ser usada como agente de captura para identificar a especificidade de ligação da imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção. Ao utilizar a molécula de ligação deste kit de acordo com a presente invenção, a potência das imunoglobulinas de acordo com a presente invenção pode ser determinada. A potência como agui definida é a propriedade de ligação da molécula modificada para o seu antigénio. A ligação pode ser determinada guantitativamente e/ou gualitativamente em termos de especificidade e/ou afinidade e/ou avidez, como usada para efeitos de controlo de gualidade.

As propriedades de ligação das moléculas de acordo com a invenção obtidas após modificação podem ainda ser afinadas através de técnicas padrão, tais como maturação de afinidade. Deste modo a sequência nucleótida, dentro ou à volta do local de ligação de antigénio, é ainda trocada para modular as propriedades de ligação.

Além disso, a molécula de união de um kit de acordo com a presente invenção pode ser usada para seleccionar a imunoglobulina modificada com a potência adequada de acordo com a presente invenção de uma biblioteca que consiste de, pelo menos, 10, preferencialmente, pelo menos, 100, mais preferencialmente, pelo menos 1000, mais preferencialmente, pelo menos, 10000, especialmente, pelo menos 100000 imunoglobulinas com diferentes modificações nas alças estruturais.

Os exemplos mostraram que uma das caracteristicas chave é conceber esses domínios ou regiões de imunoglobulina, as quais não estão normalmente envolvidas nas funções intrínsecas desejáveis de um anticorpo, tais como ligação de antigénio. Assim, modificar em regiões que não a região CDR, incluindo aquelas alças adjacentes às alças CDR de um anticorpo, preservaria a sua função de ligação de antigénio. Foi observado que a dobra específica dos domínios de imunoglobulina permite a introdução de mutações aleatórias em regiões as quais são estruturalmente análogas às CDR, mas diferentes em posição e sequência. As regiões identificadas pela presente invenção são, como CDR, regiões de alça que ligam as cadeias beta da dobra da imunoglobulina.

Mais especif icamente, é aqui descrito que ao introduzir mutações, por exemplo, mutações aleatórias nas alças que ligam as cadeias beta A-B e E-F do domínio humano IgGl CH3, foram seleccionados domínios CH3 mutados que se ligam especificamente a receptores tipo-Toll de 9-péptidos (TLR-9) ou a lisossoma de ovo de galinha, que são um péptido e uma proteína, respectivamente, que não são normalmente reconhecidas e ligadas por domínios CH3 humanos de IgGl. As mutações introduzidas por nós incluem mutações, nas quais os resíduos de aminoácido seleccionados na sequência do tipo selvagem foram substituídos por resíduos escolhidos aleatoriamente, e também incluem inserções de resíduos de aminoácido extra nas alças acima mencionadas.

Por analogia, os domínios de imunoglobulina de quaisquer classes de imunoglobulinas e de imunoglobulinas de quaisquer espécies são receptivos a este tipo de concepção. Além disso, não só as alças específicas indicadas na presente invenção podem ser manipuladas, mas quaisquer cadeias beta de ligação de alça em domínios de imunoglobulina podem ser manipulados do mesmo modo.

Os domínios de imunoglobulina criados de qualquer organismo e a partir de qualquer classe de imunoglobulina podem ser produzidos de acordo com a presente invenção, quer como tal (como domínios únicos), ou como parte de uma molécula maior. Por exemplo, pode ser parte de uma imunoglobulina intacta, o que deste modo poderia ter as suas regiões de ligação de antigénio "normais" formadas por 6 CDR e a nova região de ligação de antigénio criada. Deste modo, uma imunoglobulina multiespecífica, por exemplo, biespecífica, poderá ser gerada. Os domínios de imunoglobulina criados podem também fazer parte de gualguer proteína de fusão. A utilização destes domínios de imunoglobulina criados é o campo geral da utilização das imunoglobulinas.

Excepto onde indicado de outro modo, toda a numeração das seguências de aminoácido das imunoglobulinas está de acordo com o esquema de numeração IMGT (IMGT, the international ImMunoGeneTics information system@imgt.cines.fr; http://imgt.cines.fr; Lefranc et al. , 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212; Ruiz et al. , 2000 Nucleic Acids Res. 28: 219-221; Lefranc et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29: 207- 209; Lefranc et al. , 2003, Nucleic Acids Res. 31: 307-310; Lefranc et al. , 2005, Dev Comp Immunol 29:185-203). SEQ ID No .1

.PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG S FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGKAAA SEQ ID No. 2 ccatggcccc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgtgac gagctcnnsn nsnnscaagt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc ttaccgtgnn snnsnnsagg tggnnsnnsg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctccgggt aaagcggccg ca // 1 SEQ ID No.3

MAPREPQVYTLPPSRDELXXXQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVXXXRWXXGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLS PGKAAA SEQ ID No.4 cttgccatgg ccccccgaga accacaggtg tac SEQ ID No.5 agtcgagctc gtcacgggat gggggcaggg SEQ ID No.6 gtacgagctc nnsnnsnnsc aagtcagcct gacctgcctg g SEQ ID No.7 tgocaagctt gctgtagagg aagaaggagc eg SEQ ID No.8 tgccaagctt accgtgnnsn nsnnsaggtg gnnsnnsggg aaegtettet catgctccg SEQ ID No.9 agttgcggcc gctttacccg gagacaggga gag SEQ ID No.10

MAPREPQVYTLPPSRDELXXXQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGS FFLYS KLTVXXXXXXRWXXGNVFS CSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKAAA SEQ ID No.11 ccatggcccc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgtgac gagctcnnsn nsnnscaagt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc ttaccgtgnn snnsnnsnns nnsnnsaggt ggnnsnnsgg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg tctccgggta aagcggccgc a SEQ ID No.12 tgccaagctt accgtgnnsn nsnnsnnsnn snnsaggtgg nnsnnsggga acgtcttctc atgctccg SEQ ID No.13

MAPREPQVYTLPPSRDELXXXQVSLTCLVK

GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS

DGSFFLYSKLTVXXXXXXXXRWXXGNVFSCSV

MHEALHNHYTQKSLSLSPGKAAA SEQ ID No.14 ccatggcccc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgtgac gagctcnnsn nsnnscaagt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc ttaccgtgnn snnsnnsnns nnsnnsnnsn nsaggtggnn snnsgggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaagc ggccgca SEQ ID No .15 tgccaagctt accgtgnnsn nsnnsnnsnn snnsnnsnns aggtggnnsn nsgggaacgt cttctcatgc tccg

Exemplo 1 Construção da biblioteca CH3 e phage surface display A estrutura de cristal de um fragmento IgGl Fc, z qual é publicado na Base de Dados Brookhaven como entrada lOQO.pdb foi usada como ajuda na concepção do domínio CH3 mutado. A sequência que foi usada como a base para a construção da biblioteca CH3 é indicada na SEQ ID N° . 1.

Nesta sequência, o primeiro aminoácido corresponde à Prolina 343 da cadeia A da base de dados Brookhaven entrada loqo.pdb. 0 último resíduo obtido em loqo.pdb é Serina 102 da SEQ ID N°.1. Após análise detalhada da estrutura do loqo.pdb, e através da inspecção visual dos resíduos que formam as alças que ligam as cadeias beta, foi decidido aleatorizar os resíduos 17, 18 e 19, os quais fazem parte da alça que liga a cadeia beta A-B, assim como 71, 72, 73, 76 e 77, que fazem parte da alça que liga a cadeia beta E-F da SEQ ID N°. 1. O gene criado foi produzido por uma série de reacções PCR seguidas por ligação dos resultantes produtos PCR. Para facilitar a ligação, alguns dos codões da sequência de nucleótido que codifica a SEQ ID N° . 1 foram modificados para produzir locais de restrição sem alterar as sequências de aminoácido (mutações silenciosas). Para inserção no vector de clonagem pHENl (Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11;19 (15):4133-7. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G.) na estrutura com o sinal de secreção pelB, foram anexados resíduos de nucleótido extra codificando Met-Ala na extremidade 5' da sequência para criar um local de restrição Ncol. Para os resultados aleatorizados, o codão NNS (código IUPAC, em que S significa C ou G) foi o escolhido, o qual codifica todos os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente, mas evita 2 de 3 codões de stop. A sequência criada é indicada como sequência nucleótida na SEQ ID N° . 2 e como sequência de aminoácido na SEQ ID N° . 3. A Letra X na SEQ ID N° . 3 denota resíduos de aminoácido aleatorizados. As sequências dos iniciadores PCR usados para montagem do domínio CH3 mutado são indicadas na SEQ ID N°. 4 até 9. O cDNA da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 3D6 (Felgenhauer M, Kohl J, Ruker F. Nucleotide sequences of the cDNAs encoding the V-regions of H- and L-chains of a human mono-lonal antibody specific to HIV-l-gp41. Nucleic Acids Res. 1990 Aug 25;18 (16):4927.) foi usado como modelo para as reacções PCR. Os 3 produtos PCR foram digeridos com Saci e/ou Hindlll, respectivamente e ligado em conjunto. 0 produto de ligação foi ainda mais digerido com Ncol e Not I e ligado no vector fagomídeo de surface display pHenl, o qual foi previamente digerido com Ncol e NotI. Um número de clones seleccionados foi controlado por análise de restrição e por sequenciação de ADN e foi descoberto conterem o inserto como planeado, incluindo as sequências aleatorizadas inseridas correctamente. Para os seguintes passos da preparação do fago foram seguidos os protocolos padrão. Resumidamente, a mistura de ligação foi transformada em células E.coli TG1 por electroporação. Subsequentemente, as partículas de fago foram salvas das células E.coli TG1 com fago ajudante M13-K07. As partículas de fago foram precipitadas de um supernadante de cultura com PEG/NaCl em dois passos, dissolvidas em água e usadas para selecção ao peneirar ou, alternativamente, foram armazenadas a 80 °C negativos.

Exemplo 2: - Construção de biblioteca CH3+3

Esta biblioteca foi construída e clonada do mesmo modo que a biblioteca CH3. A sequência de aminoácido do construto é indicada na SEQ ID N°.10, a sequência nucleótida correspondente na SEQ ID N° . 11, e os iniciadores usados para construção foram SEQ ID N°. 4-7, SEQ ID N°. 9 e SEQ ID N°. 12.

Exemplo 3 Construção da biblioteca CH3+5

Esta biblioteca foi construída e clonada do mesmo modo que a biblioteca CH3. A sequência de aminoácido do construto é indicada na SEQ ID N°. 13, a sequência nucleótida correspondente na SEQ ID N° . 14, e os iniciadores usados para construção foram SEQ ID N°. 4-7, SEQ ID N°. 9 e SEQ ID N°. 15.

Exemplo 4 Construção de uma biblioteca CHI

Na biblioteca de IgCl CHI humano, Ser93, Ser94, Ser95, Gly98, Thr99 e GlnlOO foram aleatorizados e 3 resíduos aleatórios inseridos adicionalmente usando mutagénese aleatória direccionada ao local. O Leu96 não foi mutado. Em outra biblioteca de IgCl CHI humano, Pro92, Ser93, Ser94, Ser95 Leu96 ThrlOl, Gly98, Thr99 e GlnlOO foram aleatorizados e 3 resíduos aleatórios inseridos adicionalmente usando mutagénese aleatória direccionada ao local. A codificação dos genes das bibliotecas foi clonada na estrutura com o líder pelB no N-terminal e na estrutura com proteína III do fago fd no C-terminal, usando os locais

de restrição Ncol e Notl do vector fagomídeo pHENl. A preparação das partículas de fago, selecção e selecção de clones de ligação específicos foi realizada usando procedimentos padrão.

Seguência da biblioteca:

Seguência nucleótida da primeira biblioteca CHI:

1 GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCACCCT CCTCCAAGAG CACCTCTGGG GGCACAGCGG CCCTGG5CTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC 101 CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA GGACTCTACT CCCTCAGCAG 201 CGTGGTGACC GTGCCCNNSN NSNHSTTGNN SNNSHNSNNS NNSNNSACCT ACATCTGCAA CGTGAATCAC AAGCCCAGCA ACACCAAGGT GGACAAGAAA 301 GTTGAGCCCA AATCTGCGGC CGCA

Sequência de aminoácidos da primeira biblioteca CHI:

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAASTKGP5VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSI.SSWTVPXXXLXXXXXXTYICNVNHKP5NTKVDK

KVEPKSAAA

Seguência nucleótida da segunda biblioteca CHI:

1 GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCACCCT CCTCCAAGAG CACCTCTGGG GGCACAGCAG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC

101 CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT GCAGTCCTCA GGACTCTACT CCCTCAGCAG 201 CGTGGTGACC GTGNNSNNSN NSNNSNNSNN SNNSNNSNNS NNSNNSNNST ACATCTGCAA CGTGAATCAC AAGCCCAGCA ACACCAAGGT GGACAAGAAA 301 GTTGAGCCCA AATCTGCGGC CGCT

Seguência de aminoácidos da segunda biblioteca CHI:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCIiVKDYFPEPVTVSWNSGAI/TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVXXXXXXXXXXXXYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSAAA

Exemplo 4 Construção de uma biblioteca CL

Na biblioteca de IgGl CL humana, Ser92, Lys93, Ala94, Asp95, Glu97, Lys98 e His99 foram aleatorizados e 3 resíduos aleatórios foram inseridos adicionalmente entre o Serl6 e Glyl7 usando mutagénese aleatória direccionada ao local. A codificação dos genes para as bibliotecas foi clonada na estrutura com o líder pelB no N-terminal e na estrutura com a proteína III a partir do fago fd no C-terminal usando os locais de restrição Ncol e Notl do vector fagomídeo pHENl. A preparação das partículas de fago, selecção e selecção de clones de ligação específicos foi realizada usando procedimentos padrão.

Seguência nucleótida da biblioteca CL:

1 GTGGCTGCAC CATCTGTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTNNSNNS NNSGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT 101 ATCCCAGAGA GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA 201 CAGCCTCAGG TCGACCCTGA CGCTGNNSNN SNNSNNSTAC NNSNKSNNSA AAGTCTACGC CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA 301 aagagcttca acaggggaga g

Sequência de aminoácido da biblioteca CL:

VAAPSVFIFPPSDEQLKSXXXGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLRSTLTLXXXXYXXXKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE

Exemplo 5 Selecção do CH3 - biblioteca do fago no péptido RplO-L

Foram realizadas 3 rondas de selecção. As placas activadas com maleimida (Pierce) foram revestidas com urn péptido sintético RplO-L, representando um mimotopo de marcador molecular de célula-B CD20 (Perosa et ai. Ann NY Acad Sci. (2005) 51:672-83) . A sua sequência de aminoácido deduzida é como se segue: ITPWPHWLERSS. 200 μΐ da seguinte solução foram adicionados por poço: PBS, pH=7,2, com as seguintes concentrações de péptidos dissolvidos:

Ia ronda de selecção : 100 pg/ml 2a ronda de selecção : 100 yg/ml 3a ronda de selecção : 50 pg/ml. A incubação foi realizada durante a noite a 4 °C, seguida por bloqueio com 10 pg/ml de cisteína-HCl em PBS, com 200 μΐ por poço durante 2 h à temperatura ambiente. A biblioteca de surface display phage, contendo concentrações iguais de fago das bibliotecas CH3, CH3+3, CH3+5 e CH3+7, foi então deixada a reagir com o péptido ligado ao adicionar suspensão de fago e 2% de BSA-PBS até 200 μΐ, seguido por incubação durante 45 min. com agitação e 90 min. sem agitação à temperatura ambiente.

As partículas de fago não unidas foram lavadas do seguinte modo:

após a Ia ronda de selecção : 15x200 μΐ T-PBS, 5x200 μΐ T- PBS

após a Ia ronda de selecção : 15x200 μΐ T-PBS, 10x200 μΐ T- PBS após a Ia ronda de selecção : 20x200 μΐ T-PBS, 20x200 μΐ T- PBS. A eluição de partículas unidas foi realizada ao adicionar 200 μΐ por poço de 0,1 M de glicina, pH=2,2, e incubação com agitação durante 30 min. à temperatura ambiente. Subsequentemente, a suspensão de fago foi neutralizada ao adicionar 60 μΐ 2M Tris-base, seguido pela infecção de células E.coli TGI ao misturar 10 ml de cultura de crescimento exponencial com 0,5 ml de fago eluido e incubação durante 30 min. a 37 °C. Finalmente, as bactérias infectadas foram colocadas em meio TYE com 1% de glucose e 100 pg/ml de ampicilina, e incubadas a 30 °C durante a noite.

Resultados da selecção do CH3 - biblioteca do fago no péptido RplO-L

Titulações do fago_

Exemplo 6 Clonagem de clones seleccionados para expressão solúvel.

As seguências de domínio CH3 de codificações alteradas, contidas dentro das partículas de fago eluídas, foram amplificadas em lote com PCR. Após restrição com Ncol e NotI, foram inseridas em pNOTBAD (Vector pBAD da

Invitrogen com local Notl subsequentemente inserido). Após transformação em E.coli E104, as células foram seleccionadas no meio TYE com 1% de glucose e 100 pg/ml de ampicilina a 30 °C.

Expressão solúvel de clones seleccionados e selecção

Foram cultivadas 4x96 colónias de ampicilina resistente em 200 μΐ de meio 2xYT com ampicilina em placas de microtitulação num agitador durante a noite a 30 °C. Foram então induzidas em L-arabinose adicionada à concentração de 0,1%. Após outra incubação durante a noite, as células foram recolhidas ao centrifugar 15 min. a 2000 rpm, à temperatura ambiente e as suas proteínas de periplasma foram libertadas ao suspender novamente em 100 μΐ de solução-tampão de Na-borato (160 mM Na-borato, 200 mM NaCl, pH=8,0) e incubação durante, pelo menos, 6 horas.

Para selecção, 4 placas de maleimida foram cobertas com uma solução de 100 pg/ml de 50 pg/ml de péptido RplO-L, dissolvido em PBS, pH=7,2, durante a noite a 4 °C. As placas foram blogueadas com 10 pg/ml de cisteína-HCl em PBS, com 200 μΐ por poço durante 2 h, à temperatura ambiente. A proteína periplásmica libertada foi então deixada a reagir com o péptido ligado ao adicionar 50 μΐ de lisato e 50 μΐ de 2% de BSA-PBS, seguido por uma incubação durante a noite, à temperatura ambiente. A ligação das proteínas marcadas por his foi revelada por incubação de 90 min. com uma solução de anticorpos de 100 μΐ por poço, face à tetra-his (QIAgen) , diluído 1:1000 em 1% de BSA-PBS, e uma incubação de 90 min. com uma solução de 100 μΐ por poço de anticorpos de cabra anti-ratinho, marcados com HRP (Sigma), diluído 1:1000 em 1% de BSA-PBS. Foram observados sinais após a adição de substrato OPD (3 mg/ml) em solução-tampão Na-citrato/fosfato, pH=4,5 e 0,4 μΐ/ml H2O2. A reacção foi parada ao adicionar 100 μΐ de 1,25 M H2SO4.

Resultados de selecção para ligar RplO-L num único poço por clone._

Reacção Anterior

Os clones gue revelem um sinal positivo foram cultivados em 20 ml de 2xYT com ampicilina, a 30 °C durante a noite. Depois foram inoculados 1:20 em meio novo, e após 3 h a 30 °C foram induzidos com concentração final de 0,1% de L-arabinose, e deixados para expressar o dominio CH3 recombinante durante a noite a 16 °C. O periplasma das células expressantes foi então lisado em 1 ml de solução-tampão de Na-borato, pH=8,0, durante um mínimo de 6 h. O extracto periplásmico foi deixado a reagir com o péptido RplO-L e a ligação foi revelada exactamente como acima descrito.

Resultados de selecção para ligação de RplO-L

Clonagem de clones seleccionados para expressão solúvel em pET27b

As sequências de codificação de domínio CH3 alteradas, contidas dentro dos clones que produziram um sinal significativo da ligação a RplO-L, foram amplificadas com PCR. Após restrição com Ncol e Notl, foram inseridas em pET27b (Novagen). Após transformação em E.coli BL21 (DE3), as células transformadas foram seleccionadas no meio TYE com 1% de glucose e 50 yg/ml de canamicina a 30 °C.

Os clones que revelam um sinal positivo foram cultivados em 20 ml de meio M9ZB com 2% de glucose e canamicina, a 30 °C durante a noite. Foram inoculados 1:20 em meio novo, e após 3 h a 30 °C foram induzidos com meio contendo 1% de glicerina em vez de glucose, canamicina e lmM IPTG, e deixados a expressar o domínio CH3 recombinante a 16 °C durante a noite. 0 periplasma das células expressantes foi então lisado em 1 ml de solução-tampão de Na-borato, pH=8,0, durante um mínimo de 6 h. 0 extracto periplásmico foi analisado para a presença da proteína recombinante com western blotting e detecção com anticorpos anti tetra-his (QIAgen).

Sequências nucleótidas e sequências proteicas inferidas de clones de ligação CD-20

Sequência proteica de clone D83 de biblioteca CH3+3 específica CD20 (numeração IMGT) 15-17 92-94

MAPREPQVYTLPPSRDELAPPQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV

DLV 97-98

HVARWMVGNVFSCSVMHÈALHNHYTQKSLSLSPGKAAA

Análise de ligação do CD-20, expresso em células, usando FACS

Aproximadamente 105 células Daudi foram lavadas com PBS (800 rpm, 5 min., temperatura ambiente) e o domínio CH3 recombinante em 1% de BSA-PBS foi deixado a ligar durante 2h em gelo. As células foram lavadas novamente em PBS e depois foram deixadas a reagir com 2 pg/ml de anticorpo anti penta His-Alexa Fluor 488 (QIAgen), diluídas em 1% de BSA-PBS, durante 30 minutos em gelo. Após lavar, as células foram analisadas em FACS. As células não marcadas, do domínio do tipo selvagem CH3 e linha celular K562 foram usadas como controlos.

Exemplo 7 ISOLAMENTO DE CHI - antigénio CD20 de ligação de proteínas mutantes

Foram realizadas 3 rondas de selecção. As placas activadas por maleimida (Pierce) foram revestidas com um péptido sintético, representando um mimotopo de marcador molecular célula-B CD20. 200 μΐ da seguinte solução foram adicionados por poço: PBS, pH=7,2, com as seguintes concentrações de péptidos dissolvidos:

Ia ronda de selecção : 100 pg/ml 2a ronda de selecção : 100 yg/ml 3a ronda de selecção : 50 pg/ml. A incubação foi realizada durante a noite a 4 °C, seguida por bloqueio com 10 yg/ml de cisteína-HCl em PBS, com 200 μΐ por poço durante 2 h, à temperatura ambiente. A biblioteca de surface display phage, mostrando domínio CHI mutado, foi então deixada a reagir com o péptido ligado ao adicionar suspensão de fago e 2% de BSA-PBS até 200 μΐ, seguido por incubação durante 45 min. com agitação e 90 min. sem agitar, à temperatura ambiente.

As partículas de fago não ligadas foram lavadas do seguinte modo:

após a Ia ronda de selecção : 10x200 μΐ T-PBS, 5x200 μΐ T-PBS

após a Ia ronda de selecção : 15x200 μΐ T-PBS, 10x200 μΐ T-PBS após a Ia ronda de selecção : 20x200 μΐ T-PBS, 20x200 μΐ T-PBS. A eluição de partículas ligadas foi realizada ao adicionar 200 μI por poço de 0,1 M de glicina/ pH=2,2, e incubação com agitação durante 30 min., à temperatura ambiente. Subseguentemente, a suspensão de fago foi neutralizada ao adicionar 60 μΐ 2M Tris-base, seguido pela infecção de células E.coli TG1 ao misturar 10 ml de cultura de crescimento exponencial com 0,5 ml de fago eluido e incubação durante 30 min. a 37 °C. Finalmente, as bactérias infectadas foram colocadas em meio TYE com 1% de glucose e 100 pg/ml de ampicilina, e incubadas a 30 °C durante a noite.

Resultados da selecção do CHI - biblioteca de fago em péptido RplO-L

Titulações de fago

Clonagem dos clones seleccionados para expressão solúvel

Seguências de codificação de dominio CHI alteradas, contidas dentro de partículas de fago eluidas, foram amplificadas em lote com PCR. Após restrição com Ncol e Notl, foram inseridos em pNOTBAD (Invitrogen vector pBAD com local Notl inserido subseguentemente). Após transformação em E.coli E104, as células foram seleccionadas em meio TYE com 1% de glucose e 100 pg/ml de ampicilina a 30 °C.

Expressão solúvel de clones seleccionados e selecção 4x96 de colónias resistentes a ampicilina foram cultivados num meio de 200 μΐ 2xYT com ampicilina em placas de microtitulação num agitador durante a noite a 30 °C.

Foram então induzidos com L-arabinose adicionado na concentração final de 0,1%. Após outra incubação durante a noite, as células foram recolhidas ao centrifugar 15 minutos a 2000 rpm à temperatura ambiente e suas proteínas de periplasma foram libertadas ao ressuspender em 100 μΐ de solução-tampão Na-borato (160 mM Na-borato, 200 mM NaCl, pH=8, 0) e incubação durante, pelo menos, 6 horas.

Para selecção, 4 placas de maleimida foram revestidas com 100 pg/ml de uma solução de 50 pg/ml de péptido RplO-L, dissolvida em PBS, pH=7,2, durante a noite a 4 °C. As placas foram então bloqueadas com 10 yg/ml de cisteína-HCl em PBS, com 200 μΐ por poço durante 2 h, à temperatura ambiente. A proteína periplásmica libertada foi então deixada a reagir com o péptido de ligação ao adicionar 50 μΐ de lisato e 50 μΐ de 2% de BSA-PBS, seguido por uma incubação durante a noite, à temperatura ambiente. A ligação da proteína marcada por his foi revelada por uma incubação de 90 minutos com 100 μΐ por solução de poço de anticorpos contra tetra-his (QIAgen), diluídos 1:1000 em 1% de BSA-PBS, e uma incubação de 90 minutos com 100 μΐ por solução de poço de anticorpos de cabra anti-ratinho, marcados com HRP. (Sigma), diluídos em 1:1000 em 1% de BSA-PBS. Foram observados sinais após a adição de substrato OPD (3 mg/ml) em solução-tampão Na-citrato/fosfato, pH=4,5, e 0,4 μΐ/ml H202. A reacção foi interrompida com a adição de 100 μΐ de 1,25 M H2S04.

Resultados de selecção para ligação de RplO-L num poço único por clone

Reacção Anterior

Os clones que revelam um sinal positivo foram cultivados em 20 ml de 2xYT com ampicilina, a 30 °C durante a noite. Depois, foram inoculados 1:20 num meio novo, e após 3 h a 30 °C foram induzidos com uma concentração final de 0,1% de L-arabinose, e deixados a expressar o domínio CHI recombinante durante a noite a 16 °C. O periplasma das células expressantes foi então lisado em 1 ml de solução -tampão de Na-borato, pH=8,0, durante um mínimo de 6 h. O extracto periplásmico foi deixado a reagir com péptido RplO-L e a ligação foi revelada exactamente como acima descrito.

Resultados de selecção para ligação de RplO-L

Clonagem de clones seleccionados para expressão solúvel em pET27b

Sequências que codificam o domínio CHI alteradas, contidas nos clones que produzem um sinal significativo na ligação a RplO-L, foram amplificadas com PCR. Após restrição com Ncol e Notl, foram inseridos em pET27b (Novagen). Após transformação em E.coli BL21 (DE3), as células transformadas foram seleccionadas em meio TYE com 1% de glucose e 50 yg/ml de ampicilina a 30 °C.

Clones revelando um sinal positivo foram cultivados num meio de 20 ml de M9ZB com 2% de glucose e canamicina, a 30 °C durante a noite. Depois, foram inoculados 1:20 num meio novo, e após 3 h a 30 °C foram induzidos com um meio com 1% de glicerina em vez de glucose, canamicina e lmM IPTG, e deixados a expressar o domínio CHI recombinante durante a noite a 16 °C. O periplasma das células de expressão foi então lisado em 1 ml de solução - tampão Na-borato, pH=8,0, durante um mínimo de 6 h. O extracto periplásmico foi analisado para a presença de proteína recombinante com western blotting e detecção com anticorpos anti tetra-his (QIAgen).

Sequência de SMID CHI específico CD20, clone C45 LOCUS C45 324 bp ds-DNA SYN 4-JUL-2006 1 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg εΐ ggcacagcag ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 121 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct gcagtcctca 1B1 ggactctact ecctcagcag cgtggtgacc gtggcccctc tgggtgttgg tgggcatctc 241 gtcctgcact acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 301 gttgagccca aatctgcggc cgct // ENTRADA C45 5 10 IS 20 25 30

1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK 31 DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS 61 GLYSLSSVVTVAPLGVGGHLVLHYICNVNH 91 KPSNTKVDKKVEPKSAAA

Análise de ligação de CD20 expressa nas células, usando FACS

Aproximadamente 105 células Daudi foram lavadas com PBS (800 rpm, 5 min., temperatura ambiente) e o domínio CH3 recombinante em 1% de BSA-PBS foi deixado a ligar durante 2h em gelo. As células foram lavadas novamente com PBS e deixadas a reagir com 2 pg/ml de anticorpo anti-penta His-Alexa Fluor 488 (QIAgen), diluídas em 1% de BSA-PBS, durante 30 minutos em gelo. Após lavagem, as células foram analisadas em FACS. Células não marcadas, domínio CHI do tipo selvagem e linha celular K562 foram usados como controlos. EXEMPLO 8 ISOLAMENTO DE CL - antigénio CD2 0 de ligação de proteínas mutantes

Foram executadas 3 rondas de selecção. Placas activadas por maleimida (Pierce) foram revestidas com um péptido sintético, representando um mimotopo de marcador molecular célula-B CD20. 200 μΐ da seguinte solução foram adicionados por poço: PBS, pH-7,2, com as seguintes concentrações do péptido dissolvido: 1 ronda de selecção : 100 pg/ml 2 ronda de selecção : 100 yg/ml 3 ronda de selecção : 50 pg/ml. A incubação realizou-se durante a noite a 4 °C, seguida por bloqueio com 10 yg/ml de cisteína-HCl em PBS, com 200 μΐ por poço durante 2 h, à temperatura ambiente. A biblioteca de surface display phage, que mostra domínio CL mutado, foi então deixada a reagir com o péptido ligado ao adicionar suspensão de fago e 2% de BSA-PBS até 200 μΐ, seguido por incubação durante 45 min. com agitação e 90 min. sem agitação, à temperatura ambiente.

Partículas de fago não ligadas foram lavadas do seguinte modo:

Após a Ia ronda de selecção: 10x200 μΐ T-PBS, 5x200 μΐ

T-PBS

Após a Ia ronda de selecção: 15x200 μΐ T-PBS, 10x200

μΐ T-PBS

Após a Ia ronda de selecção: 20x200 μΐ T-PBS, 20x200 μΐ T-PBS. A eluição de partículas de ligação foi executada ao adicionar 200 μI por poço de 0,1 M de glicina, pH=2,2, e incubação com agitação durante 30 min., à temperatura ambiente. Subseguentemente, a suspensão de fago foi neutralizada pela adição de 60 μΐ de 2M Tris-base, seguido pela infecção de células E.coli TG1 ao misturar 10 ml de cultura de crescimento exponencial com 0, 5 ml de fago eluido e incubação durante 30 min a 37 °C. Finalmente, as bactérias infectadas foram transferidas para placas em meio TYE com 1% de glucose e 100 pg/ml de ampicilina, e incubadas a 30 °C durante a noite.

Resultados da selecção do CL- biblioteca de fago em péptido RplO-L

Titulações de Fago

Clonagem dos clones seleccionados para expressão solúvel

Seguências de codificação de domínio CL alteradas, contidas dentro de partículas de fago eluidas, foram amplificadas em lote com PCR. Após restrição com NcoJ e Not T, foram inseridas em pNOTBAD (Invitrogen vector pBAD com local Notl inserido subseguentemente). Após transformação em E.coli E104, as células foram seleccionadas em meio TYE com 1% de glucose e 100 pg/ml de ampicilina a 30 °C.

Expressão solúvel de clones seleccionados e selecção 4x96 de colónias resistentes a ampicilina foram cultivados num meio de 200 μΐ de 2xYT com ampicilina em placas de microtitulação num agitador durante a noite a 30 °C. Foram então induzidos com L-arabinose adicionada à concentração final de 0,1%. Após outra incubação durante a noite, as células foram recolhidas ao centrifugar 15 minutos a 2000 rpm à temperatura ambiente e suas proteínas de periplasma foram libertadas ao ressuspender em 100 μΐ de solução-tampão Na-borato (160 mM Na-borato, 200 mM NaCl, pH=8, 0) e incubação durante, pelo menos 6 horas.

Para selecção, 4 placas de maleimida foram revestidas com 100 pg/ml de uma solhão de 50 pg/ml de péptido RplO-L, dissolvida em PBS, pH=7,2, durante a noite a 4 °C. As placas foram então bloqueadas com 10 yg/ml de cisteína-HCl em PBS, com 200 μΐ por poço durante 2 h à temperatura ambiente. A proteína periplásmica libertada foi então deixada a reagir com o péptido ligado ao adicionar 50 μΐ de lisato e 50 μΐ de 2% de BSA-PBS, seguido por uma incubação durante a noite, à temperatura ambiente. A ligação da proteína marcada por his foi revelada por uma incubação de 90 minutos com 100 μΐ por solução de poço de anticorpos contra tetra-his (QIAgen), diluídos em 1:1000 de 1% de BSA-PBS, e uma incubação de 90 minutos com 100 μΐ por solução de poço de anticorpos de cabra anti-ratinho, marcados com HRP (Sigma), diluídos em 1:1000 em 1% de BSA-PBS. Foram observados sinais após a adição de substrato OPD (3 mg/ml) em solução-tampão Na-citrato/fosfato, pH=4,5, e 0,4 μΐ/ml H2O2. A reacção foi interrompida com a adição de 100 μΐ de 1,25 M H2S04.

Resultados de selecção para ligação de RplO-L num poço único por clone

Reacção Anterior

Os clones que revelam um sinal positivo foram cultivados em 20 ml de 2xYT com ampicilina, a 30 °C durante a noite. Depois, foram inoculados 1:20 num meio novo, e após 3 h a 30 °C foram induzidos com uma concentração final de 0,1% de L-arabinose, e deixados a expressar o domínio CL recombinante durante a noite a 16 °C. O periplasma das células expressantes foi então lisado em 1 ml de solução -tampão de Na-borato, pH=8,0, durante um mínimo de 6 h. O extracto periplásmico foi deixado a reagir com péptido RplO-L e a ligação foi revelada exactamente como acima descrito.

Resultados de selecção para ligação do RplO-L

Clonagem de clones seleccionados para expressão solúvel em pET27b

Sequências que codificam domínio CL alteradas, contidas nos clones que produzem um sinal significativo na ligação a RplO-L, foram amplificadas com PCR. Após restrição com Ncol e Notl, foram inseridas em pET27b (Novagen). Após transformação em E.coli BL21 (DE3), as células transformadas foram seleccionadas em meio TYE com 1% de glucose e 50 yg/ml de canamicina a 30 °C.

Clones revelando um sinal positivo foram cultivados num meio de 20 ml de M9ZB com 2% de glucose e canamicina, a 30 °C durante a noite. Depois foram inoculados 1:20 em meio novo, e após 3 h a 30 °C foram induzidos com meio contendo 1% de glicerina em vez de glucose, canamicina e 1 mM IPTG, e deixados a expressar o domínio CL recombinante durante a noite a 16 °C. O periplasma das células expressantes foi então lisado em 1 ml de solução-tampão Na-borato, pH=8,0, durante o mínimo de 6 h. O extracto periplásmico foi analisado para a presença de proteína recombinante com western blotting e detecção com anticorpos anti tetra-his (QIAgen). EXEMPLO 9: Clonagem, expressão e caracterização de um Fcab de ligação a integrina O péptido CRGDCL potencialmente cíclico foi originalmente isolado por Koivunen et ai 1993 (J. Biol. Chem. 1993 Sep 25; 268(27):20205-10) de uma biblioteca de péptido com 6 aminoácidos expressado em fago filamentoso e mostrou inibir a ligação de fago que expressa RGD para integrina ανβι ou adesão de células que expressam ανβι à fibronectina. O péptido também inibiu a adesão celular mediada pelas integrinas ανβι, ανβ3 e ανβ5·

Inserimos a sequência GCRGDCL na alça estrutural (a alça "EF") do domínio CH3 do IgGl humano. Para esse efeito, os resíduos Asp92 e Lys 93 (numeração IMGT) foram mutados para Gly e Leu respectivamente, e os 5 resíduos CRGDC foram inseridos entre esses resíduos mutados 92 e 93 para criar a alça com o motivo RGD com ligação à integrina, usando as técnicas de clonagem padrão. No C-terminal do inserto, a sequência foi fundida na estrutura com a estrutura de múltipla clonagem do vector para que a marcação HSV e marcação His sejam anexos de forma C-terminal à proteína recombinante. 0 nome desta proteína recombinante Fcab-RGD4, ou RGD4 curto. A sequência de ADN que codifica Fcab-RGD4 e a tradução em sequência de aminoácido são mostradas em baixo. +3MKY t t, t T . A- A '.A G .L.i- L.LAA Q P Ά M AM A %S' 3Γν8

1 ATGAAATACC TGCTGCCGAC CGCTGCTGCT GGTCTGCTGC TCCTCGCGGC CCAGCCGGCG ATGGpÇÃTGG CCGAGCCCAA ATCTTGTGAC AAAÃCTCACA TACTTTATGG ACGACGGCTG GCGACGACGA CCAGACGACG AGGAGCGCCG GGTCGGCCGC TACCGGTACC GGCTCGGGTT TAGAACACTG TTTTGAGTGT +3 Ϊ". "‘•j·. P-, .¾ !^~Τ7Έ~ I». 0ferf > .s· · L·. f -·> · > . k'"p'~'r d t"~ ιΓ ,.ii':7~s r' t ,p~.~g

101 CAfGCCCACC'G'TG'ctcÃGH'ÍcTGÃAcfcc'TGGGGGGACC''GTCÃGTCTTC cfcTTCCCCcRAAAACCCAA'tGACACCCÍtdTGAfcTCCC GGACCCCTGA GTACGGGTGG CACGGGTCGT GGACTTGAGG ACCCCCCTGG CAGTCAGAAG GAGAAGGGGG GTTTTGGGTT CCTGTGGGAG TACTAGAGGG CCTGGGGACT

+3 \T"fr~C TXT· ψ-'sFZ D V· ·3"~Η "y P~P ITht vTT3?~TTip; ~Ϋ"τ; V Lpt'ljrGy r'E~-''v" &r~MGÃVlt''r~l'~K~..~B 201 GGTcÃcATGc gtggtggtgg'ãcgtgXgcca*cgaagaccct“gaggtcaagt tcãàctggta cgtggAcggc^GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCG CCAGTGTACG CACCACCACC TGCACTCGGT GCTTCTGGGA CTCCAGTTCA AGTTGACCAT GGACCTGCCG CACCTCCACG TATTACGGTT CTGTTTCGGC

+3 r ’ è~""e ~-õ*~y iivs’~~T'rO'": v~v^~s~t.rr"Í':'T',nr~rii,: h 301 CGGGAGGÃGC “ÀGTÃCÃACAg'CACGTACCGT GTGGTCAGCG'TCCTCACCGT CCTGCACCAG GÃCTGGCTGA ATGGCAAGGA GtAcAAGTGC AAGGTCTCCA GCCCTCCTCG TCATGTTGTC GTGCATGGCA CACCAGTCGC AGGAGTGGCA GGACGTGGTC CTGACCGACT TACCGTTCCT CATGTTCACG TTCCAGAGGT +3 if f Γ .TgTTc· Fr ·κ>'':6ΤΓ'&Νιρ·. gr-;g'.;iQ'"C,ry—TT'S-'.l>' ""E ΟΤΟΐΚ'

401 ÃCÃÃÃGCCCT CCCÃGCCCCC‘ aTCGAGAÃÃa'cCATCTCCAA AGCCÃaÃGGG CAGCCCCGÃG ÍÕTccACAGGI· GTAÇACCCTG cccccatccc gggatgagct TGTTTCGGGA GGGTCGGGGG TAGCTCTTTT GGTAGAGGTT TCGGTTTCCC GTCGGGGCTC TTGGTGTCCA CATGTGGGAC GGGGGTAGGG CCCTACTCGA

+3 T.lk 7k-,' a" V S ',T~jc'·'·itl VT.Stis~t-7r:slvi'ITTA-yp"·1ε'·~nVn""y soí gaccãagaac cAggtcàgcc" tgacctgcct"ggtcãaaggc*"ttctatccca gcgãcãtcgc' cgtggágtgg^gagagcÃatg‘ggcagccggã GÃÃCAÃCTAC

CTGGTTCTTG GTCCAGTCGG ACTGGACGGA CCAGTTTCCG AAGATAGGGT CGCTGTAGCG GCACCTCACC CTCTCGTTAC CCGTCGGCCT CTTGTTGATG 601 ggctccttct c^cttácc eíeiiSPrêSTC^i»fetc*ga6ca<3g tggcagcagg

TTCTGGTGCG GAGGGCACGA CCTGAGGCTG CCGAGGAAGA AGGAGATGTC GTTCGAATGG CACCCAACGG CGCCACTAAC AGACTCGTCC ACCGTCGTCC +3 so 'tf Tyi’VF'Vs a a alei

701 GGAACGTCTf tTCÃTFcTtF GTGÃtGCÃTG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCÀGAAGÃ GCCTCTCCCT_GTCTCCGGGT AaAGCGGCCG'SACTCGAGAT ccttgcagaa gagtacgagg cactacgtac TCCGAGACGT gttggtgatg TGCGTCTTCT cggagaggga CAGAGGCCCA tttcgccggc GTGAGCTCTA 001 CAAACGGGCT aIÍícAGCCAG AACTCGCCCC GSAMU^CTC'^(%T6TCG AGcSBcA^IÍHfÂBÀc

GTTTGCCCGA TCGGTCGGTC TTGAGCGGGG CCTTCTGGGG CTCCTACAGC TCGTGGTGGT GGTGGTGGTG

As sequências que codificam Fcab-RGD4 e Fcab-wt, respectivamente, foram introduzidas no vector de expressão mamífera pCEP4 através de técnicas de clonagem convencionais. As células HEK 293 foram transientemente transfectadas com estes plasmídeos de expressão e Fcab que contém o meio de cultura colhido após 3 dias e após uma semana. Os Fcabs foram purificados via uma coluna de Proteína A e eluição acídica da coluna, seguidos por uma neutralização imediata. Os Fcabs foram dialisados contra PBS e testados em ELISA para ligação à integrina ανβ3 humana (Chemicon).

Para a integrina ELISA, 1 pg/ml ανβ3 humana, integrina em PBS foi revestida durante a noite em placas Maxisorp e blogueada durante 1 h com BSA em PBS contendo 1 mM Ca2+. Fcab-RGD4 e Fcab-wt, respectivamente, foram deixados a ligar durante 1 h em várias diluições começando em 10 pg/ml de proteína purificada. Foram detectados Fcabs ligados por proteína A marcada com HRP e TMB como um substrato. A ligação de RGD4 à integrina (linha vermelha) resultou em sinais significativos de 10 yg/ml de proteína até 0,16 pg/ml. Como controlos negativos, RGD4 não ligou à placa na ausência da integrina (linha cinzenta), nem o Fcab-wt ligou à placa revestida de integrina (linha verde). A ligação da integrina mAb LM609 ανβ3 anti-humana do ratinho comercial (Chemicon; linha azul) serviu como um controlo positivo.

Tabela: Dados do ELISA demonstrando a ligação de RGD4 e LM609 a integrina ανβ3 humana. As várias proteínas foram testadas em concentrações como indicado na primeira coluna que resulta em sinais em 450 nm nas filas respectivas. Valores para HEK produzido e proteína A purificada Fcab-RGD4 que liga à integrina são mostrados na segunda coluna, o controlo negativo Fcab-wt na terceira, e controlo em branco de revestimento Fcab-RGD4 na quarta coluna. Os valores para ligação de integrina anti ανβ3 mAb LM609 de ratinho são mostrados na última coluna.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • EP 2006050059 W [0012] • US 2005266000 Ai [0013] • WO 2006036834 A [0018] • WO 0183525 A [0019] • WO 0232925 A [0021] • WO 0042561A3 A3 [0078] • WO 0170947A3 A [0078] • US 6365377 B [0078] • US 6376246 B [0078] • WO 0206469 A [0078] • US 6352842 B [0078] • US 6361974 B [0078] • US 6358709 B [0078] • US 5824514 A [0078] • US 5817483 A [0078] • US 5814476 A [0078] • US 5763192 A [0078] • US 5723323 A [0078]

Documentos de não patente citados na descrição • ADACHI MASAAKI et al. Protein Science. Cambridge University Press, 2003, vol. 12, 2125-2131 [0020] • YANEZ et al. Nucleic Acids Res., 2004, vol. 32, el58 [0059] • VIRNEKAS et al. Nucleic Acids Res., 1994, vol. 22, 5600- 5607 [0059] • Antibody Engineering. Springer-Verlag, 2001 [0061] • HAYHURST ; GEORGIOU. Curr Opin Chem Biol, 2001, vol. 5, 683-689 [0061] • MAYNARD ; GEORGIOU. Annu Rev Biomed Eng, 2000, vol. 2, 339-76 [0061] • Molecular Cloning-A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 [0064] • Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons [0064] • SCOPES. Antibody Purification: Principles and Practice.

Springer-Verlag, 1994, vol. 3 [0070] • KAY et al. Phage display of peptides and antibodies: a laboratory manual. Academic Press, 1996 [0075] • LOW-MAN et al. Biochemistry, 1991, vol. 30, 10832-10838 [0075] • SMITH. Science, 1985, vol. 228, 1315-1317 [0075] • MALMBORG et al. J Mol Biol, 1997, vol. 273, 544-551 [0075] • KREBBER et al. J Mol Biol, 1997, vol. 268, 619-630 [0075] • BENHAR et al. J Mol Biol, 2000, vol. 301, 893-904 [0075] • WITRRUP. Curr Opin Biotechnol, 2001, vol. 12, 395-399 [0075] [0084] • GEORGIOU et al. Nat Biotechnol, 1997, vol. 15, 29-34 [0075] • GEORGIOU et al. Trends Biotechnol, 1993, vol. 11, 6-10 [0075] • LEE et al. Nat Biotechnol, 2000, vol. 18, 645-648 [0075] • JUN et al. Nat Biotechnol, 1998, vol. 16, 576-80 [0075] • BODER; WITTRUP. Methods Enzymol, 2000, vol. 328, 430-44 [0075] • BODER; WITTRUP. Nat Biotechnol, 1997, vol. 15, 553-557 [0075] • WHITEHORN et al. Bio/technology, 1995, vol. 13, 1215-1219 [0075] • AMSTUTZ et al. Curr Opin Biotechnol, 2001, vol. 12, 400- 405 [0075] • MATTHEAKIS et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, vol. 91, 9022-9026 [0075] • HANES et al. Proc Natl Acad Scl USA, 1997, vol. 94, 4937-4942 [0075] • ROBERTS; SZOSTAK. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, vol. 94, 12297-12302 [0075] • NEMOTO et al. FEES Lett, 1997, vol. 414, 405-408 [0075] • ZHOU et al. J Am Chem Soc, 2002, vol. 124, 538-543 [0075] • CHEN et al. Nat Biotechnol, 2001, vol. 19, 537-542 [0076] • JOHNSSON ; VARSHAVSKY. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, vol. 91, 10340-10344 [0076] • PELLETIER et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, vol. 95, 12141-12146 [0076] • FIELDS; SONG. Nature, 1989, vol. 340, 245-246 [0076] • VISINTIN et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, vol. 96, 11723-11728 [0076] • KOLKMAN ; STEMMER. Nat Biotechnol, 2001, vol. 19, 423-428 [0078] • CRAMERI et al. Nature, 1998, vol. 391, 288-291 [0078] • COCO et al. Nat Bio-technol, 2001, vol. 19, 354-359 [0078] • ZHAO et al. Nat Biotechnol, 1998, vol. 16, 258-261 [0078] • SHAO et al. Nucleic Acids Res, 1998, vol. 26, 681-683 [0078] • LUTZ et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, vol. 98, 11248-11253 [0078] • KIKUCHI et al. Gene, vol. 236, 159-167 [0078] • KIKUCHI et al. Gene, 2000, vol. 243, 133-137 [0078] • SCHMITTEL. J. Immunol. Meth., 2000, vol. 24, 17-24 [0085] • Remington's Pharmaceutical Sciences. 1980 [0095] • KUFER et al. Trends in Biotechnology, 2004, vol. 22, 238 244 [0101] • CARTER. Journal of Immunological Methods, 2001, vol. 248, 7-15 [0102] • LE-GALL et al. Protein Engineering. Design & Selection, 2004, vol. 17, 357-366 [0103] • CABILLY et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 3273-3277 [0105] • ALTSCHUL et al. Methods in Enzymology, 1996, vol. 266, 460-480 [0166] • LEFRANC et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system@imgt.cines.fr. Nucleic Acids Res., 1999, vol. 27, 209-212, http://imgt.cines.fr [0176] • RUIZ et al. Nucleic Acids Res., 2000, vol. 28, 219-221 [0176] • LEFRANC et al. Nucleic Acids Res., 2001, vol. 29, 207-209 [0176] • LEFRANC et al. Nucleic Acids Res., 2003, vol. 31, 307-310 [0176] • LEFRANC et al. Dev Comp Immunol, 2005, vol. 29, 185-203 [0176] • HOOGENBOOM HR ; GRIFFITHS AD ; JOHNSON KS ; CHISWELL DJ ; HUDSON P ; WINTER G. Multi- subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Acids Res., 11 August 1991, vol. 19, 4133-7 [0178] • FELGENHAUER M ; KOHL J ; RUKER F. Nucleotide sequences of the cDNAs encoding the V-regions of H- and L-chains of a human mono-lonal antibody specific to HIV-l-gp41. Nucleic Acids Res., 25 August 1990, vol. 18 (16), 4927 [0179] • PEROSA et al. Ann N Y Acad Sci., 2005, vol. 51, 672-83 [0185] • KOIVUNEN et al. J. Biol. Chem., 25 September 1993, vol. 268 (27), 20205-10 [0241]

Lisboa, 15 de Junho de 2015

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma imunoglobulina multivalente, ou parte da mesma, que liga especif icamente a, pelo menos duas moléculas de superfície celular de uma única célula com pelo menos uma modificação em, pelo menos uma região de alça estrutural da dita imunoglobulina determinando ligação a um epítopo das ditas moléculas de superfície celular, em que a região de alça estrutural modificada está dentro de um domínio constante da dita imunoglobulina e a modificação é uma deleção, uma substituição, uma inserção ou uma combinação das mesmas, e em que a imunoglobulina não modificada não se liga significativamente ao dito epítopo.
2. 2. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 1, em que a região de alça estrutural modificada está dentro de CHI, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C, ou uma parte dos mesmos.
3. 3. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo facto de que a região de alça estrutural modificada compreende, pelo menos, 6 modificações de aminoácidos.
4. 4. Imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de que as regiões de alça modificadas de um CHI, um CH2, um CH3 ou um CH4 de origem humana ou murina compreendem, pelo menos, uma modificação dentro dos aminoácidos 7 a 21, aminoácidos 25 a 39, aminoácidos 41 a 81, aminoácidos 83 a 85, aminoácidos 89 a 103 ou aminoácidos 106 a 117.
5. 5. Imunoglobulina de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de que as regiões de alça de Igk-C ou Igl-C de origem humana compreendem pelo menos uma modificação dentro dos aminoácidos 8 a 18, aminoácidos 27 a 35, aminoácidos 42 a 78, aminoácidos 83 a 85, aminoácidos 92 a 100, aminoácidos 108 a 117 ou aminoácidos 123 a 126.
6. 6. Imunoglobulina de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de que as regiões de alça de Igk-C ou Igl-C de origem murina compreendem pelo menos uma modificação dentro dos aminoácidos 8 a 20, aminoácidos 26 a 36, aminoácidos 43 a 79, aminoácidos 83 a 85, aminoácidos 90 a 101, aminoácidos 108 a 116 ou aminoácidos 122 a 125.
7. 7. Imunoglobulina de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de que o domínio constante da imunoglobulina é de origem de camelídeo.
8. 8. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo facto de que a imunoglobulina compreende pelo menos um domínio constante modificado selecionado a partir do grupo que consiste em CHI, CH2 e CH3.
9. 9. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo facto de que as regiões de alça modificadas de um CHI, um CH2 e/ou um CH3 compreendem pelo menos uma modificação dentro dos aminoácidos 8 a 20, aminoácidos 24 a 39, aminoácidos 42 a 78, aminoácidos 82 a 85, aminoácidos 91 a 103 ou aminoácidos 108 a 117.
10. 10. Imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo facto de que a imunoglobulina modificada é adicionalmente combinada com uma ou mais imunoglobulinas modificadas ou com imunoglobulinas não modificadas, ou partes das mesmas, para obter uma imunoglobulina de combinação.
11. 11. Ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina ou parte da mesma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
12. 12. Método para conceber uma imunoglobulina multivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, que compreende as etapas de: - providenciar um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que compreende pelo menos uma região de alça estrutural dentro de um domínio constante, - modificar pelo menos um resíduo de nucleótido da dita região de alça estrutural, - transferir o dito ácido nucleico modificado num sistema de expressão, - expressar a dita imunoglobulina multivalente, contactar a imunoglobulina multivalente expressa com um epítopo, e determinar se a dita imunoglobulina multivalente se liga ao dito epítopo.
13. 13. Método para fabricar uma imunoglobulina multivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou uma preparação farmacêutica da mesma, e determinar a ligação da dita imunoglobulina a um epítopo de um antigénio, em que a imunoglobulina não modificada não se liga significativamente ao dito epítopo, compreendendo as etapas de: - providenciar um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que compreende pelo menos uma região de alça estrutural dentro de um domínio constante, - modificar pelo menos um resíduo de nucleótido de pelo menos uma das ditas regiões de alça estruturais, - transferir o dito ácido nucleico modificado num sistema de expressão, - expressar a dita imunoglobulina modificada, - contactar a imunoglobulina modificada expressa com um epitopo, - determinar se a dita imunoglobulina modificada se liga ao dito epitopo, e providenciar a imunoglobulina modificada que se liga ao dito epitopo e opcionalmente acabando-a para uma preparação farmacêutica.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a imunoglobulina se liga especificamente a pelo menos uma primeira molécula e compreende pelo menos uma modificação em pelo menos uma região de alça estrutural da dita imunoglobulina, e o método compreende determinar a ligação especifica da dita pelo menos uma região de alça estrutural a pelo menos uma segunda molécula em que a imunoglobulina contendo uma região de alça estrutural não modificada não se liga especif icamente à dita pelo menos uma segunda molécula, compreendendo as etapas de: - providenciar um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que se liga especificamente a pelo menos uma primeira molécula que compreende pelo menos uma região de alça estrutural dentro de um domínio constante, - modificar pelo menos um resíduo de nucleótido de pelo menos uma das ditas regiões de alça estruturais codificadas pelo dito ácido nucleico, - transferir o dito ácido nucleico modificado num sistema de expressão, - expressar a dita imunoglobulina modificada, - contactar a imunoglobulina modificada expressa com a dita pelo menos uma segunda molécula, e - determinar se a dita imunoglobulina modificada se liga especificamente à segunda molécula, e providenciar a imunoglobulina modificada que se liga especificamente à dita pelo menos uma segunda molécula e opcionalmente acabando-a para uma preparação farmacêutica.
15. 15. Uma imunoglobulina multivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 para utilização como um medicamento.
16. 16. Uma imunoglobulina multivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que uma imunoglobulina multivalente é biespecífica. Lisboa, 15 de Junho de 2015