AT503889A1 - Neue multivalente immunglobuline - Google Patents

Description

Neue multivalente Immunglobuline

Kurze Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein multivalentes Immunglobulin oder einen Teil davon zur Verfügung, das spezifisch an mindestens zwei Zelloberflächenmoleküle einer einzelnen Zelle bindet, mit mindestens einer Veränderung in mindestens einer Strukturschleifenregion des Immunglobulins, das die Bindung zu einem Epitop des Zelloberflächenmoleküls festlegt, wobei das unveränderte Immunglobulin im wesentlichen nicht an das Epitop bindet.

Monoklonale Antikörper haben in vielen therapeutischen, diagnostischen und^ analytischen Applikationen Anwendung gefunden.

Die grundlegende Antikörperstruktur wird hier am Beispiel eines intakten IgGl Immunglobulins erklärt.

Zwei identische schwere (H) und zwei identische leichte (L) Ketten verbinden sich zur Bildung des Y-förmigen Antikörpermoleküls. Die schweren Ketten haben jeweils vier Domänen. Die aminoterminalen variablen Domänen (VH) bilden die Spitzen des Y. Darauf folgen drei konstante Domänen: CHI, CH2, und die carboxyterminale CH3 D^J^ne an der Basis des Y-Stamms. Ein kurzer Bereich, die Gelehkregion, verbindet die variablen und konstanten Regionen der schweren Kette. Die Gelenkregion verbindet CH2 und CH3 (das Fc Fragment) mit dem Rest des Antikörpers (den Fab Fragmenten). Durch proteolytische Spaltung der Gelenkregion in einem intakten Antikörpermolekül können ein Fc und zwei identische Fab Fragmente gebildet werden. Die leichten Ketten bauen sich aus zwei Domänen, variable (VL) und konstante (CL) auf, die durch eine Wechselregion getrennt sind.

NACHGEREICHT 1

Disulfidbrücken in der Gelenkregion verbinden die beiden schweren Ketten. Die leichten Ketten sind durch zusätzliche Disulfidbrücken an die schweren Ketten gekoppelt. Asn-verbundene Kohlehydratanteile werden an verschiedenen Positionen in den konstanten Domänen angeheftet, abhängig von der Iimnunglobulinklasse. Bei IgGl verbinden zwei Disulfidbindungen in der Gelenkregion, zwischen den Cys235 und Cys238 Paaren, die zwei schweren Ketten. Die leichten Ketten werden an die schweren Ketten durch zwei zusätzliche Disulfidbrücken gekoppelt, zwischen Cys229s in den CHI Domänen und Cys214s in den CL Domänen. Kohlehydratanteile werden an Asn306 jedes CH2 angehängt, wodurch eine ausgeprägte Ausbuchtung in dem Stamm des Y gebildet wird.

Diese Eigenschaften haben wesentliche funktionelle Konsequenzen.

Die variablen Regionen sowohl der schweren als auch der leichten Ketten (VH) und (VL) befinden sich an den Spitzen des Y, wo sie zur Reaktion mit dem Antigen positioniert sind. Diese Spitze des Moleküls stellt die Seite dar, an der sich der N-Terminus der Aminosäuresequenz befindet. Der Stamm des Y ragt gewissermaßen heraus zur wirksamen Vermittlung von Effektorfunktionen, wie etwa der Komplementaktivierung und der Wechselwirkung mit Fc Rezeptoren, oder ADCC und ADCP. Seine CH2 und CH3 Domänen beulen sich aus, um eine Wechselwirkung mit Effektormolekülen zu erleichtern. Der C-Terminus der Aminosäuresequenz befindet sich an der gegenüberliegenden Seite der Spitze, der als "Untergrund" des Y bezeichnet werden kann.

Zwei Arten der leichten Kette, genannt lambda (λ) und kappa (k),werden in Antikörpern gefunden. Ein gegebeness Immunglobulin hat entweder κ Ketten oder λ Ketten, niemals eines von jedem. Kein funktioneller Unterschied wurde zwischen Antikörpern die λ oder κ Ketten haben, gefunden. 2

NACHGEREICHT

Jede Domäne in einem Antikörpermolekül weist eine ähnliche Struktur von zwei Beta-Faltblättern auf, welche dicht gegeneinander in einem komprimierten antiparallelen Beta-Fass gepackt sind. Diese konservierte Struktur wird Immunglobulinfaltung genannt. Die Immunglobulinfaltung der konstanten Domänen enthält ein 3-strängiges Blatt das an ein 4-strängiges Blatt gepackt ist. Die Faltung ist durch Wasserstoffbindung zwischen den Beta Strängen eines jeden Blattes stabilisiert, durch hydrophobe Bindung zwischen Resten der gegenüberliegenden Blätter im Inneren, und durch Disulfidbindung zwischen den Blättern. Das 3-strängige Blatt enthält die Stränge C, F und G, und das 4-strängige Blatt die Stränge A, B, E und D. Die Buchstaben A bis G bezeichnen die abfolgenden Positionen der Beta Stränge entlang der Aminosäuresequenz der Immunglobulinfaltung.

Die Faltung der variablen Domänen weist 9 Beta-Stränge auf, die in zwei Faltblättern zu 4 und 5 Strängen angeordnet sind. Das 5-strängige Faltblatt ist zu dem 3-strängigen Faltblatt der konstanten Domänen strukturell homolog, enthält jedoch die zusätzlichen Stränge C' und C''. Die übrigen Stränge (A, B, C, D, E, F, G) weisen dieselbe Topologie und eine ähnliche Struktur auf, wie ihre Gegenspieler in den Immunglobulinfaltungen der konstanten Domäne. Eine Disulfidbrücke verbindet die Stränge B und F in gegenüberliegenden Faltblättern, wie in den konstanten Domänen.

Die variablen Domänen sowohl der leichten als auch der schweren Immunglobulinketten enthalten drei hypervariable Schleifen, oder Antikörperbindungsstellen (CDRs). Die drei CDRs einer V Domäne (CDR1, CDR2, CDR3) gruppieren sich an einem Ende des Beta-Fasses. Die CDRs sind Schleifen, welche die Beta-Stränge B-C, C'-C'' sowie F-G der

Iromunglobulinfaltung miteinander verbinden. Die Reste in den CDRs variieren von einem Iinmunglobulinmolekül zum nächsten, 3

NACHGEREICHT wodurch jedem Antikörper eine Antigenspezifität verliehen wird.

Die VL und VH Domänen an den Spitzen der Antikörpermoleküle sind dicht gepackt, so dass die 6 CDRs (3 auf jeder Domäne) zur Bildung einer Oberfläche (oder eines Hohlraums) zur antigenspezifischen Bindung Zusammenwirken. Die natürliche Antigenbindungsstelle eines Antikörpers setzt sich somit aus den Schleifen, welche die Stränge B-C, C'-C'' und F-G der variablen Domäne der leichten Kette und den Strängen B-C, C'-C'' und F-G der variablen Domäne der schweren Kette verbinden, zusammen.

Die Schleifen, die in einem nativen Immunglobulin nicht CDR-Domänen sind, weisen keine Antigen-bindende oder Epitopbindende Spezifität auf, sondern tragen zur korrekten Gesamtfaltung des Immunglobulinmoleküls und/oder seiner Effektor- und anderer Funktionen bei und werden daher für den Zweck der Erfindung Strukturschleifen genannt.

Dokumente im Stand der Technik zeigen, dass das Immunglobulin-ähnliche Gerüst zum Zweck der Manipulation der bestehenden Antigen-Bindungsstelle verwendet wurde, wodurch neue Bindungseigenschaften eingeführt werden. Genauer wurden bisher die CDR Regionen zur Antigenbindung manipuliert, mit anderen Worten wurde im Fall der Immunglobulinfaltung nur die natürliche Antigen-Bindungsstelle verändert, um deren Bindungsaffinität oder -spezifität zu ändern. Es besteht eine Unmenge von Literatur, die unterschiedliche Formate solcher manipulierter Immunglobuline beschreibt, häufig in Form von einzelkettigen Fv Fragmenten (scFv) oder Fab Fragmente, entweder auf der Oberfläche von Phagenpartikeln präsentiert oder löslich in zahlreichen prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionssystemen exprimiert.

Mit humanen Krebsformen assoziierte Zelloberflächenproteine können effiziente Ziele für die monoklonale Therapie 4

NACHGEREICHT ··»··»* ···· darstellen. Antikörper können Antitumorantworten durch Modulieren der zellulären Aktivierung oder durch Verstärkung des Immunsystems auslösen.

Einige mAbs üben ihren Effekt durch Quervernetzen des Ziels aus, was die Ziele anhäuft (cluster) und in Aktivierung, Inhibierung oder Amplifikation des Zellsignals endet, wasletztendlich im Zellarrest und /oder Apoptose am Zellziel endet.

Es wurde gezeigt, dass manche MAbs (anti-CD19, -CD20, -CD21, and -CD22) die geringe oder keine inhärente Anti-Wachstumsaktivität auf Lymphomzelllinien zeigen, in starke Antitumoragenzien umgewandelt werden können indem sie als tetravalente Homodimere verwendet werden.

Diese Aktivitäten können in vivo durch das Anlocken von Effektorzellen und/oder Komplement verstärkt werden.

Eine andere für therapeutische mAbs verwendete Strategie ist, ein zytotoxisches Medikament an den mAb zu koppeln. Ein solches Immuntoxin kann an das Zelloberflächenziel binden, gefolgt durch Internalisierung, wobei das Medikament freigesetzt wird um die Zelle zu töten. Anhäufen des Targets als eine Voraussetzung für die Internalisierung kann notwendig sein.

Um die Potenz der mAbs, die ihren Effekt durch die Anhäufung von Zielmolekülen ausüben, zu erhöhen, wurden verschiedene multivalente Ab Ausführungen entworfen.

Kovalent verknüpfte Volllängen IgGs die tetravalente Abs bilden und natürlich auftretende IgM und IgG Abs, die polymerische IgM und IgA durch die Verwendung ihrer Sekretorischen Schlussstücke mimicken, wurden entworfen.

Eine andere tretravalente Ausführung wurde durch Zugabe von Fab an den C Terminus jeder H Kette eines Volllängen IgG entwickelt.

Um die Tumordurchdringung zu verbessern, wurden kleinere Konstrukte unter Verwendung von einzelkettigen Fv (scFv)2 Fragmenten (jedes Fv bestehend aus variablen leichten

NACHGEREICHT 5 und variablen schweren Domänen verbunden durch Peptidlinker) miteinander verbunden um multivalente Komplexe zu bilden.

Solche Konstrukte können relativ kurze Halbwertszeiten (verglichen mit jenen der Vollängen mAbs) haben, konsequenterweise wurde dies durch Verbinden dieser scFv Multimere an IgG Fc Fragmente adressiert. Mit scFv und ähnlichen Formaten ist es schwierig, die Bildung des genauen Multimerisierungsgrads zu kontrollieren, d.h. Dimere, Trimere, Tetramere und großer Komplexe können in unterschiedliche Anteilen abhängig vom Grundkonstrukt und Expressionsverfahren bilden.

Jedes der bekannten Formate zur Herstellung multivalenter Immunglobuline hat bestimmte Vorteile, sei es Immunogenität, in-vivo Halbwertszeit, Produktion.

Ein modulares System, das den Entwurf eines multivalenten Immunglobulins gemäß dem entsprechenden Bedürfnis erlaubt, kann diese Probleme lösen.

Kurze Beschreibung der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung stellt Immunglobulindomänen zur Verfügung, die durch veränderte Strukturschleifen an Zelloberflächenproteine binden, um eine zusätzliche Bindung an ein Zelloberflächenprotein zu ermöglichen, wodurch ein Quervernetzen von Zelloberflächenrezeptoren ermöglicht wird.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein multivalentes Immunglobulin oder ein Teil davon zur Verfügung gestellt, das spezifisch an mindestens zwei Zelloberflächenmoleküle einer einzelnen Zelle bindet, mit mindestens einer Veränderung in mindestens einer Strukturschleifenregion des Immunglobulins, welche das Binden an ein Epitop der Zelloberflächenmoleküle ermöglicht, wobei das unveränderte Immunglobulin im wesentlichen nicht an das Epitop bindet.

NACHGEREICHT 6

Die veränderte Strukturschleifenregion des erfindungsgemäßen Immunglobulins kann innerhalb der konstanten und/oder der variablen Domäne des Immunglobulins liegen.

Wenn die veränderte Strukturschleife innerhalb der konstanten Domäne liegt, ist sie bevorzugt innerhalb des CHI, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C, oder eines Teils davon.

In einer anderen Ausführungsform enthält die veränderte Strukturschleifenregion mindestens 6 Aminosäuremodifikationen.

In einer speziellen Ausführungsform kann das multivalente Immunglobulin veränderte Schleifenregionen eines CHI, eines CH2, eines CH3 oder eines CH4 humanen oder murinen Ursprungs umfassen, enthaltend mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 7 bis 21, Aminosäuren 25 bis 39, Aminosäuren 41 bis 81, Aminosäuren 83 bis 85, Aminosäuren 89 bis 103 oder Aminosäuren 106 bis 117.

Alternativ können die Schlaufenregionen des Igk-C oder Igl-C des Immunglobulins humanen Ursprungs mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 8 bis 18, Aminosäuren 27 bis 35, Aminosäuren 42 bis 78, Aminosäuren 83 bis 85, Aminosäuren 92 bis 100, Aminosäuren 108 bis 117 oder Aminosäuren 123 bis 126 enthalten. Alternativ können die Schleifenregionen des Immunglobulins von Igk-C oder Igl-C murinen Ursprungs sein, enthaltend mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 8 bis 20, Aminosäuren 26 bis 36, Aminosäuren 43 bis 79, Aminosäuren 83 bis 85, Aminosäuren 90 bis 101, Aminosäuren 108 bis 116 oder Aminosäuren 122 bis 125.

Weiters alternativ kann die konstante Domäne des Immunglobulins vom Kamel stammen, bevorzugt enthaltend mindestens eine veränderte konstante Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CHI, CH2 und CH3. Im besonderen enthalten die veränderten Schleifenregionen eines CHI, eines CH2 und/oder eines CH3 mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 8 bis 20, Aminosäuren 24 bis 39, 7

NACHGEREICHT

Aminosäuren 42 bis 78, Aminosäuren 82 bis 85, Aminosäuren 91 bis 103 oder Aminosäuren 108 bis 117.

Gemäß der Erfindung kann das erfindungsgemäße Immunglobulin eine Veränderung innerhalb der variablen Domäne enthalten, ausgewählt aus der Gruppe von VH, Vkappa, Vlambda, VHH und Kombinationen davon. Im besonderen enthalten sie mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 7 bis 21, Aminosäuren 25 bis 39, Aminosäuren 41 bis 81, Aminosäuren 83 bis 85, Aminosäuren 89 bis 103 oder Aminosäuren 106 bis 117, wobei die Nummerierung der Aminosäureposition der Domänen die des IMGT ist.

In einer alternativen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Immunglobulin dadurch gekennzeichnet, dass die Schleifenregionen des VH or Vkappa oder Vlambda humanen Ursprungs mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 8 bis 20, Aminosäuren 44 bis 50, Aminosäuren 67 bis 76 und Aminosäuren 89 bis 101, insbesondere die Aminosäurepositionen 12 bis 17, Aminosäurepositionen 45 bis 50, Aminosäurepositionen 69 bis 75 und Aminosäurepositionen 93 bis, 98 umfassen, wobei die Nummerierung der Aminosäureposition der Domänen die des IMGT ist.

Noch mehr spezifiziert, enthalten die Immunglobulin Schleifenregionen des VH murinen Ursprungs mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 6 bis 20, Aminosäuren 44 bis 52, Aminosäuren 67 bis 76 und Aminosäuren 92 bis 101 umfassen, wobei die Nummerierung der Aminosäureposition der Domänen die des IMGT ist und/oder die veränderten Schleifenregionen eines VHH vom Kamel enthalten mindestens eine Veränderung in den Aminosäuren 7 bis 18, Aminosäuren 43 bis 55, Aminosäuren 68 bis 75 und Aminosäuren 91 bis 101, wobei die Nummerierung der Aminosäureposition der Domänen der IMGT entspricht. -—

NACHGEREICHT 8

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das erfindungsgemäße multivalente Immunglobulin weiter mit einem oder mehreren veränderten Immunglobulinen oder mit unveränderten Immunglobulinen, oder Teilen davon kombiniert werden, um ein Kombinationsimmunglobulin zu erhalten.

Vorzugsweise ist die Modifikation der

Strukturschleifendomäne eine Deletion, Substitution, eine Insertion oder eine Kombination davon.

Die vorliegende Erfindung stellt auch eine das erfindungsgemäße Immunglobulin oder einen Teil davon kodierende Nukleinsäure zur Verfügung und ein Verfahren zur Manipulation eines erfindungsgemäßen multivalenten Immunglobulins, welches die Schritte umfasst: - Bereitstellung einer Nukleinsäure, die für ein

Immunglobulin kodiert, welche mindestens eine Strukturschleifenregion enthält,

Veränderung mindestens eines Nukleotidrests in den StrukturSchleifenregionen, Übertragung der veränderten Nukleinsäure in ein Expressionssystem,

Expression des multivalenten Immunglobulins, Kontaktierung des exprimierten multivalenten Immunglobulins mit einem Epitop,

Bestimmung, ob das multivalente Immunglobulin an das Epitop bindet.

Weiters wird die Verwendung des erfindungsgemäßen multivalenten Immunglobulins für die Herstellung eines Medikaments für die therapeutische Verwendung zur Verfügung gestellt, beispielsweise für die Behandlung von Tumorzellen und pathogen infizierter Zellen.

NACHGEREICHT 9

Genaue Beschreibung der Erfindung:

Die erfindungsgemäßen veränderten Immunglobulindomänen können in verschiedene bekannte Antikörperformate wie vollständige Antikörper, Fabs, einzelkettige Fvs, Fab2, Minibodies und ähnliche eingebaut werden, um zusätzliche Bindungsstellen für Zelloberflächenrezeptoren bereitzustellen.

Im besonderen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Manipulation von spezifisch an Epitope eines Antigens bindende Immunglobulinen. Durch die Veränderung in der Strukturschleifenregion kann das Immunglobulin so manipuliert werden, dass es an das Epitop bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform bindet das Immunglobulin spezifisch an mindestens zwei dieser Epitope, die sich voneinander unterscheiden, wobei beide dasselbe Antigen oder verschiedene Antigene darstellen.

Beispielsweise bezieht sich das erfindungsgemäße Verfahren auf die Manipulation eines Immunglobulins das spezifisch an mindestens ein erstes Epitop bindet und mindestens eine Veränderung in mindestens einer Strukturschleifenregion des Immunglobulins enthält und Nachweis der spezifischen Bindung der mindestens einen Schleifenregion an mindestens ein zweites Epitop, wobei das Epitop aus der Gruppe der Antigene wie oben erwähnt ausgewählt ist, wobei die unveränderte Strukturschleifenregion (nicht-CDR-Region) nicht spezifisch an das mindestens eine zweite Epitop bindet, welches die Schritte umfasst: - Bereitstellung einer Nukleinsäure, die für ein

NACHGEREICHT

Immunglobulin kodiert, das spezifisch an ein erstes Epitop bindet, welche mindestens eine strukturelle Schleifenregionen enthält, --—-- 10 • ·· · • · ♦ • · · • ♦ ♦ · · » • ♦♦· · · · • · · ··· ·

Veränderung mindestens eines Nukleotidrests in mindestens einer der Schleifenregionen die durch die Nukleinsäure kodiert wird, Übertragung der veränderten Nukleinsäure in ein ExpressionsSystem,

Expression des veränderten Immunglobulins,

Kontaktierung des exprimierten veränderten Immunglobulins mit mindestens einem zweiten Epitop, und Bestimmung, ob das veränderte Immunglobulin spezifisch an das zweite Epitop bindet.

Das erfindungsgemäße Verfahren bezieht sich vorzugsweise auf mindestens eine Veränderung in mindestens einer Strukturschleifenregion des Immunglobulins und den Nachweis der spezifischen Bindung von mindestens einer Schleifenregion an mindestens ein Molekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zelloberflächenantigenen, wobei das Immunglobulin das eine unveränderte Strukturschleifenregion enthält nicht spezifisch an das mindestens eine Molekül bindet.

Vorzusweise ist das Antigen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus erbB Rezeptor Tyrosine Kinasen (wie etwa EGFR, HER2, HER3 und HER4, aber nicht aus diese beschränkt), Moleküle aus der TNF-Rezeptor Superfamilie, wie Apo-1 Rezeptor, TNFR1, TNFR2, Nervenwachsumsfaktorrezeptor NGFR, CD40, T-Zellantigen 0X40, TACI-Rezeptor, BCMA, Apo-3, DR4, DR5, DR6, Decoy Rezeptoren ,wie DcRl, DcR2, CAR1, HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-1, TNFL1 aber nicht auf diese Moleküle beschränkt, B-Zelloberflächenantigene, wie etwa CD10, CD19, CD20, CD21, CD22 aber nicht auf diese Moleküle beschränkt.

Die Bezeichnung "Immunglobulin" wie hierin verwendet umfasst Immunglobuline oder Teile oder Fragmente von 11

NACHGEREICHT

• · · · · · • ··· · · · • · · ··· ·

Immunglobulinen. Er umfasst somit ein "Peptid einer Immunglobulindomäne", das erfindungsgemäß verändert werden soll (wie hierin verwendet sind die Begriffe Immunglobulin und Antikörper austauschbar) sowie Immunglobulindomänen oder Teile davon, die eine Strukturschleife enthalten, sowie eine Strukturschleife aus diesen Domänen. Die Immunglobuline können als isolierte Peptide oder als Kombinationsmoleküle mit anderen Peptiden verwendet werden. In einigen Fällen ist es vorzuziehen, eine definierte veränderte Strukturschleife oder eine Strukturschleifenregion oder Teile davon als isolierte Moleküle für Bindungs- oder Kombinationszwecke zu verwenden. Die " Immunglobulindomäne" wie hierin definiert enthält solche Immunglobulindomänen oder Polypeptide, welche nach Veränderung und Manipulation spezifische Bindungseigenschaften aufweisen können. Die Peptide sind zu Sequenzen von Immunglobulindomänen homolog und sind vorzugsweise mindestens 5 Aminosäuren lang, besonders bevorzugt mindestens 10 oder sogar mindestens 50 oder 100 Aminosäuren lang und bilden mindestens teilweise die Strukturschleifenregion oder die nicht-CDR-Region der Domäne. Vorzugsweise schließen die Peptide solche Insertionen aus, die als nicht funktionsfähige Aminosäuren angesehen werden, hybride oder Chimäre CDR-Regionen oder CDR-ähnliche Regionen und/oder kanonische Strukturen von CDR-Regionen. Die Bindungseigenschaften beziehen sich auf spezifische Epitopbindung, Affinität und Avidität.

Es versteht sich das die Bezeichnung "Immunglobulin", "verändertes Immunglobulin" sowie "erfindungsgemäßes Immunglobulin" ebenso Immunglobulinderivate umfasst. Ein Derivat ist jede Kombination von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Immunglobulinen und/oder ein Fusionsprotein, bei dem jede beliebige Domäne oder Minidomäne des erfindungsgemäß erhaltenen Immunglobulins an jeder beliebigen Position mit einem oder mehreren Proteinen 12

NACHGEREICHT (wie andere Immunglobuline, Liganden, Gerüstproteine,

Enzyme, Toxine, und ähnliche) fusioniert sein kann. Ein Derivat des Immunglobulins der Erfindung kann auch durch Bindung mit anderen Substanzen durch verschiedene chemische Techniken wie etwa kovalente Koppelung, elektrostatische Wechselwirkung, Disulfidbindung etc. erhalten werden.

Die anderen an das Immunglobulin gebundenen Substanzen können Lipide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, organische und anorganische Moleküle oder beliebige Kombinationen davon sein (z.B. PEG, Vorläufermedikamente oder Medikamente). Ein Derivat ist auch ein Immunglobulin mit derselben Aminosäuresequenz, welches aber vollständig oder teilweise aus nicht natürlichen oder chemisch veränderten Aminosäuren hergestellt ist.

Die erfindungsgemäß manipulierten Moleküle sind als Einzelproteine wie auch als Fusionsproteine oder Derivate nützlich, typischerweise auf solche Weise fusioniert, dass sie Teile von größeren Antikörperstrukturen oder vollständigen Antikörpermolekülen oder Teilen davon sind wie Fab Fragmente, Fc Fragmente, Fv Fragmente und weitere. Es ist möglich die manipulierten Proteine zur Herstellung von Molekülen zu verwenden, die bispezifisch, trispezifisch sind und die sogar gleichzeitig mehr Spezifitäten tragen können und es wird möglich, gleichzeitig die Valenz der Bindung zu kontrollieren und vorauszuwählen, gemäß der Anforderungen der geplanten Verwendung dieser Moleküle.

Erfindungsgemäß können Bindungsregionen an Antigene oder Antigenbindungsstellen aller Arten von Zelloberflächenantigenen in die Strukturschleifenregion einer gegebenen Antikörperstruktur eingeführt werden. nachgereicht 13

Die Bezeichnung "Antigen" wie in der vorliegenden Erfindung verwendet soll Moleküle oder Strukturen bezeichnen, die bekanntermaßen mit der CDR Schleifenregion von Immunglobulinen interagieren. Strukturschleifenregionen gemäß Stand der Technik interagieren nicht mit Antigenen sondern tragen zur allgemeinen Struktur und/oder Bindung an Effektormoleküle bei.

Der Begriff „Zelloberflächenantigene" gemäß der vorliegenden Erfindung soll alle Zelloberflächenantigene beinhalten die durch eine Antikörperstruktur erkannt werden können, und Fragmente solcher Moleküle (insbesondere Unterstrukturen, allgemein als „Epitope" bezeichnet(z.B. B-Zellepitope, T-Zellepitope)), so lange sie immunologisch relevant sind, d.h. erkennbar durch natürliche oder monoklonale Antikörper.

Die Bezeichnung "Epitop" wie hierin erfindungsgemäß verwendet bedeutet eine molekulare Struktur, die einen spezifischen Bindungspartner vollständig bilden kann oder die ein Teil eines spezifischen Bindungspartners an eine Bindungsstelle eines erfindungsgemäßen Immunglobulins ist.

Chemisch kann ein Epitop entweder aus einem Kohlenhydrat, einem Peptid, einer Fettsäure, einer anorganischen Substanz oder Derivaten davon oder jeglicher Kombinationen davon bestehen. Wenn ein Epitop ein Polypeptid ist, umfasst es für gewöhnlich mindestens 3 Aminosäuren, vorzugsweise 8 bis 50 Aminosäuren und besonders bevorzugt zwischen etwa 10-20 Aminosäuren im Peptid. Es gibt keine kritische Obergrenze der Länge des Peptids, das beinahe die volle Länge der Polypeptidsequenz eines Proteins umfassen könnte. Epitope können entweder lineare oder konformative Epitope sein. Ein lineares Epitop umfasst ein einzelnes Segment einer Primärsequenz einer Polypeptidkette. Lineare Epitope können zusammenhängend oder überlappend sein. Konformative Epitope umfassen Aminosäuren, die durch Faltung

NACHGEREICHT 14 ······· · · · · • · · · 4 ··· · · · • · ·» *· · ··· · des Polypeptids zur Bildung einer Tertiärstruktur zusammengeführt wurden und die Aminosäuren sind nicht notwendigerweise in der linearen Sequenz benachbart.

Speziell stellen Epitope mindestens einen Anteil diagnostisch relevanter Moleküle dar, d.h. die Abwesenheit oder Gegenwart eines Epitops in einer Probe steht qualitativ oder quantitativ in Beziehung mit entweder einer Krankheit oder dem Gesundheitszustand oder einem Verfahrensstatus bei einem Herstellungsverfahren oder einem Umwelt- oder Nahrungsstatus. Epitope können auch mindestens ein Teil von therapeutisch relevanten Molekülen sein, d.h. Moleküle, die von der spezifischen Bindungsdomäne angesteuert werden können, was den Verlauf der Krankheit ändert.

Bevorzugte "Zelloberflächenantigene" sind solche Antigene, die bereits nachweislich immunologisch relevant sind oder therapeutisch relevant sein können, besonders solche, für die eine klinische Wirksamkeit getestet wurde.

Bevorzugt werden die neuen Antigenbindungsstellen in den Strukturschleifen durch Substitution, Deletion und/oder Insertion des durch die ausgewählte Nukleinsäure kodierten Immunglobulins.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung führt die Veränderung mindestens eines Nukleotids zu einer Substitution, Deletion und/oder Insertion des durch die Nukleinsäure kodierten Immunglobulins kodiert.

Die Veränderung von mindestens einer Schleifenregion kann zu einer Substitution, Deletion und/oder Insertion von 1 oder mehreren Aminosäuren führen, bevorzugt zu einer Punktmutation, Austausch ganzer Schleifen, weiter bevorzugt zum Tausch von mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 bis zu 30 Aminosäuren.

| NACHGEREICHT 15

Ein bevorzugtes Verfahren zur Einführung von Veränderungen ist die ortsgerichtete Zufallsmutation. Durch dieses Verfahren werden eine oder mehrere spezifische Aminosäurereste der Schleifen ausgetauscht oder eingeführt unter Verwendung von zufällig erzeugten Insertionen in diese Strukturschleifen. Alternativ wird die Verwendung von kombinatorischen Ansätzen bevorzugt.

Die mindestens eine Schleifenregion wird vorzugsweise mutiert oder verändert durch Zufalls-, Semi-Zufalls- oder insbesondere ortsgerichtete Zufallsmutageneseverfahren.

Diese Verfahren können verwendet werden um an gewünschten Stellen des Immunglobulins der vorliegenden Erfindung Aminosäureveränderungen herzustellen. In diesen Fällen werden die Stellen zufällig gewählt oder es werden Aminosäureänderungen unter Verwendung von bestimmten Regeln ausgeführt. Beispielsweise können bestimmte Reste zu Alanin mutiert werden, was als Alanin Scanning bezeichnet wird. Diese Verfahren können mit weiter ausgeklügelten Manipulationsverfahren kombiniert werden, um Selektionsverfahren zum Screening von höheren Graden an Sequenzdiversität bereitzustellen.

Ein bevorzugtes Verfahren gemäß der Erfindung bezieht sich auf das zufällig veränderte Nukleinsäuremolekül das mindestens eine Nukelotidwiederholungseinheit mit der Sequenz 5'-NNS-3', 5'-NNN-3'oder 5'- NNK-3' enthält.

Das zufällig veränderte Nukleinsäuremolekül kann die oben angegebenen Wiederholungseinheiten umfassen, die für sämtliche bekannten natürlicherweise vorkommenden Aminosäuren kodieren.

Wie im Stand der Technik hinlänglich bekannt, gibt es eine Vielzahl von Selektionstechnologien, die für die Identifizierung und Isolierung von Proteinen mit bestimmten Bindungsmerkmalen und Affinitäten verwendet werden können, die beispielsweise Präsentationstechnologien wie etwa 16

NACHGEREICHT

Phagenpräsentation, Ribosomenpräsentation, Zelloberflächenpräsentation und ähnliche, wie unten beschrieben umfassen. Verfahren zur Herstellung und zum Screening von Antikörpervarianten sind im Stand der Technik hinlänglich bekannt. Allgemeine Verfahren der Molekularbiologie, Expression, Aufreinigung und des Screenings von Antikörpern werden in Antibody Engineering, herausgegeben von Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001 sowie Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol. 5: 683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng. 2: 339-76 beschrieben.

Eine erfindungsgemäße "Strukturschleife" oder "nicht CDR-Schleife" muss auf folgende Weise verstanden werden: Immunglobuline werden von Domänen mit einer sogenannten Immunglobulinfaltung gebildet. Im wesentlichen werden antiparallele Beta-Faltblätter durch Schleifen verbunden, um ein komprimiertes antiparalleles Beta-Fass zu bilden. In der variablen Region tragen einige der Schleifen der Domänen im wesentlichen zur Spezifität des Antikörpers bei, d.h. der Bindung an ein Antigen. Diese Schleifen werden CDR-Schleifen genannt. Alle weiteren Schleifen von variablen Domänen eines Antikörpers tragen eher zur Struktur des Moleküls und/oder Effektorfunktionen bei. Diese Schleifen werden hierin als Strukturschleifen oder nicht-CDR-Schleifen definiert.

Die Nukleinsäuremoleküle, welche für die veränderten Immunglobuline kodieren (wobei davon über die gesamte Beschreibung umfasst sind: Immunglobulinfragmente), können in Wirtszellen kloniert, exprimiert und auf ihre Bindungsspezifitäten hin getestet werden. Diese Vorgehensweisen werden unter Verwendung hinlänglich bekannter Verfahren durchgeführt, und eine Vielzahl von Methoden, die in der vorliegenden Anmeldung Verwendung finden können, werden in Molecular Cloning—A Laboratory 17 [nachgerÜcht ······· · « · · • · ·· ····· ι · • · · · e · · «·· · • · ··«·· · ·

Manual, 3.sup.rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001) sowie Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons) beschrieben. Die Nukleinsäuren, welche für die veränderten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung kodieren, können in einen Expressionsvektor eingeführt werden, um die Immunglobuline zu exprimieren. Expressionsvektoren umfassen typischerweise ein Immunglobulin, das in operativer Weise - das heisst, in einem funktionellen Verhältnis positioniert - mit Kontroll-oder regulatorischen Sequenzen, selektierbaren Markern, beliebigen Fusionspartnern und/oder zusätzlichen Elementen verbunden ist. Die veränderten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung können durch Kultivierung einer mit einer Nukleinsäure, vorzugsweise einem Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure enthält, die für die veränderten Immunglobuline kodiert, transformierten Wirtszelle unter den geeigneten Bedingungen zur Induktion oder Hervorrufung der Expression des veränderten Immunglobulins hergestellt werden. Die Verfahren zur Einführung exogener Nukleinsäuremoleküle in eine Wirtszelle sind im Stand der Technik hinlänglich bekannt und variieren je nach dem verwendeten Wirt. Es können selbstverständlich ebenso nichtzelluläre oder zellfreie Expressionssysteme für die Expression veränderter Immunglobuline eingesetzt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die veränderten Immunglobuline nach der Expression aufgereinigt oder isoliert. Veränderte Immunglobuline können auf eine Vielzahl dem Fachmann bekannter Weisen isoliert oder aufgereinigt weden. Übliche Aufreinigungsverfahren umfassen chromatographische Techniken, elektrophoretische, immunologische, Präzipitations-, Dialyse-, Filtrations-, Konzentrations- und chromatographische Fokussierungstechniken. Die Aufreinigung kann häufig durch einen bestimmten Fusionspartner ermöglicht werden. Beispielsweise können Antikörper unter Verwendung

18 ·· * • · · · · · • ··· · · · • · · *·· · eines Glutathionharzes aufgereinigt werden, wenn eine GST-Fusion eingesetzt wird, einer Ni2+-Affinitätschromatographie, wenn ein His-Tag eingesetzt wird oder eines immobulisierten Anti-flag Antikörpers, wenn ein Flag-Tag verwendet wird. Für eine allgemeine Anleitung in geeigneten

Aufreinigungstechniken siehe z.B."Antibody Purification: Principles and Practice", 1994, 3. Auflage, Springer-Science. Es ist selbstverständlich ebenso möglich die erfindungsgemäßen veränderten Immunglobuline auf der Oberfläche eines Wirts zu exprimieren, insbesondere auf der Oberfläche einer bakteriellen, Insekten- oder Hefezelle oder auf der Oberfläche von Phagen oder Viren.

Veränderte Immunglobuline der Erfindung können unter Verwendung einer Vielzahl von Methoden gescreent werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf solche, die in vitro Nachweisverfahren, in vivo Nachweisverfahren und Nachweisverfahren auf Zellbasis sowie Selektionstechnologien verwenden. Automatisierte Screeningtechnologien und solche mit hohem Durchsatz können in den Screeningverfahren eingesetzt werden. Das Screening kann die Verwendung eines Fusionspartners oder einer Markierung einsetzen, beispielsweise eines Enzyms, einer Immunmarkierung, einer isotopischen Markierung oder einer Markierung mit einem kleinen Molekül, wie etwa einem fluoreszierenden oder kalorimetrischen Farbstoff oder einem luminogenen Molekül.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die funktionellen oder biophysikalischen Eigenschaften der Immunglobuline in einem in vitro Nachweisverfahren gescreent. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper auf Funktionalität hin gescreent, beispielsweise seine Fähigkeit, eine Reaktion zu katalysieren oder seine Bindungsaffinität mit dem Zielmolekül.

Nachweisverfahren können eine Vielzahl von Nachweismethoden einsetzen, einschließlich aber nie 19 chromgene, fluoreszierende, lumineszierende oder isotopische Markierungen.

Wie im Stand der Technik bekannt, selektieren einige Screeningverfahren auf vorteilhafte Mitglieder einer Biobliothek. Die Verfahren werden hierin als "Selektionsverfahren" bezeichnet, und diese Verfahren finden in der vorliegenden Erfindung zum Screening veränderter Immunglobuline Verwendung. Wenn Immunglobulinbibliotheken unter Verwendung eines Selektionsverfahrens gescreent werden, werden nur solche Mitglieder einer Bibliothek, die vorteilhaft sind, das heißt, die einige Selektionskriterien erfüllen, vermehrt, isoliert und/oder beobachtet. Wie geschätzt werden wird, da nur die tauglichsten Varianten beobachtet werden, erlauben solche Verfahren die Durchforstung von Bibliotheken, welche größer als solche sind, welche die Tauglichkeit von Bibliotheksmitgliedern individuell nachweisen. Die Selektion wird durch jedes beliebige Verfahren, jede Technik oder jeden Fusionspartner ermöglicht, welche, kovalent oder nicht kovalent, den Phänotyp des Immunglobulins mit dessen Genotyp verbinden, das heisst die Funktion eines Antikörpers mit der Nukleinsäure, welche für diesen kodiert. Beispielsweise wird die Verwendung einer Phagenpräsentation als Selektionsverfahren durch die Fusion von Bibliotheksmitgliedern an das Protein des Gens III ermöglicht. Auf diese Weise selektiert oder isoliert die Selektion oder Isolation veränderter Immunglobuline, welche einige Kriterien erfüllen, beispielsweise die Bindungsffinität gegenüber dem Zielmolekül des Immunglobulins, ebenso die Nukleinsäure, welche für diese kodiert. Einmal isoliert können das Gen oder die Gene, welche für die veränderten Immunglobuline kodieren, amplifiziert werden. Dieses Verfahren der Isolierung und Amplifikation, als Panning bezeichnet, kann wiederholt werden, wobei die Anreicherung von vorteilhaften Varianten 20

NACHGEREICHT variabler Domänen von Antikörpern ermöglicht wird. Die Nukleinsäuresequenzierung der angehefteten Nukleinsäure gestattet schließlich die Identifikation des Gens.

Im Stand der Technik sind eine Vielzahl von Verfahren bekannt, die in der vorliegenden Erfindung zum Screening von Bibliotheken von Immunglobulinen Anwendung finden können.

Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Phagenpräsentation (Phage display of peptides and antibodies: a laboratory manual, Kay et al., 1996, Academic Press, San Diego, Calif., 1996; Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10838; Smith, 1985, Science 228: 1315-1317) und dessen Abarten wie etwa selektive Phageninfektion (Malmborg et al., 1997, J Mol Biol. 273: 544-551), selektiv infiziöser Phage (Krebber et al., 1997, J Mol Biol. 268: 619-630) und Panning mit verzögerter Infektivität (Benhar et al., 2000, J Mol Biol. 301: 893-904), Zelloberflächenpräsentation (Wittrup, 2001, Curr Opin Biotechnol., 12: 395-399) wie etwa Präsentation auf Bakterien- (Georgiou et al., 1997, Nat Biotechnol. 15: 29-34; Georgiou et al., 1993, Trends Biotechnol. 11: 6-10; Lee et al., 2000, Nat Biotechnol. 18: 645-648; Jun et al., 1998,

Nat Biotechnol. 16: 576-80), Hefe- (Boder & Wittrup, 2000, Methods Enzymol. 328: 430-44; Boder & Wittrup, 1997, Nat Biotechnol. 15: 553-557) und Säugetierzellen (Whitehorn et al., 1995, Bio/technology 13: 1215-1219) sowie in vitro Präsentationstechniken (Amstutz et al., 2001, Curr Opin Biotechnol. 12: 400-405) wie etwa Polysomenpräsentation (Mattheakis et al., 1994, Proc Natl Acad Sei. USA 91: 9022-9026), Ribosomenpräsentation (Hanes et al., 1997, Proc Natl Acad Sei. USA 94: 4937-4942), mRNS Präsentation (Roberts & Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sei. USA 94: 12297-12302;

Nemoto et al., 1997, FEBS Lett. 414: 405-408) und das Ribosomeninaktivierungs-Präsentationssystem (Zhou et al., 2002, J Am Chem Soc. 124, 538-543) .

NACHGEREICHT P 21

Weitere Selektionsverfahren, die in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können, umfassen Verfahren, die nicht auf Präsentation beruhen, wie etwa in vivo Verfahren einschließlich aber nicht beschränkt auf periplasmatische Expression und cytometrisches Screening (Chen et al., 2001, Nat Biotechnol. 19: 537-542), den Antikörperfragment-Komplementierungsnachweis (Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sei. USA 91: 10340-10344; Pelletier et al., 1998, Proc Natl Acad Sei. USA 95: 12141-12146) und das Two-Hybrid-Screening in Hefe (Fields & Song, 1989, Nature 340: 245-246) verwendet im Selektionsmodus (Visintin et al., 1999, Proc Natl Acad Sei. USA 96: 11723-11728). In einer alternativen Ausführungsform wird die Selektion durch einen Fusionspartner ermöglicht, der an eine spezifische Sequenz auf dem Expressionsvektor bindet, wodurch der Fusionspartner und das zugehörige Mitglied der Immunglobulin-Bibliothek kovalent oder nicht-kovalent mit der Nukleinsäure, welche für diese kodiert, und damit assoziierte Mitgleider der Fc Variantenbibliothek mit der Nukleinsäure, welche für diese kodiert, verbunden werden. In einer alternativen Ausführungsform kann es zu einer in vivo Selektion kommen, wenn die Expression des Antikörpers der Zelle irgendeinen Wachstums-, Reproduktions- oder Überlebensvorteil vermittelt.

Eine Auswahl an Selektionsverfahren werden als "gerichtete Evolution" bezeichnet, die das Paaren oder Hervorbringen von bevorzugten Sequenzen während der Selektion, manchmal unter Einfügung von neuen Mutationen einschließen. Wie vom Fachmann geschätzt werden wird, können die gerichteten Evolutionsverfahren die Identifizierung der am meisten bevorzugten Sequenzen in einer Bibliothek erleichtern und die Verschiedenartigkeit der gescreenten Sequenzen erhöhen. Im Stand der Technik sind eine Anzahl gerichteter Evolutionsverfahren bekannt, welche in der 22

NACHGEREICHT vorliegenden Erfindung zur Erzeugung und zum Screening von Varianten von Antikörpern Anwendung finden können, einschließlich aber nicht beschränkt auf DNA-Shuffling (PCT WOOO/42561; PCT W001/70947), Exon-Shuffling (U.S. Pat. No. 6,365,377; Kolkmann & Stemmer, 2001, Nat Biotechnol. 19: 423-428), Familien-Shuffling (Crameri et al., 1998, Nature 391: 288-291 U.S. Pat. No. 6,376,246), RACHITT.TM. (Coco et al., 2001, Nat Biotechnol 19:354-359; PCT WO 02/06469)), STEP und Zufallspriming durch in vitro Rekombination (Zhao et al., 1998, Nat Biotechnol. 16: 258-261; Shao et al., 1998, Nucleic Acid Res. 26: 681-683), Exonuklease vermittelter Genaufbau (U.S. Patentschrift Nr. 6,352,842; U.S. Patentschrift Nr. 6,361,974), Genort Sättigungsmutagenese (U.S. Patentschrift Nr. 6,358,709), Genwiederaufbau (U.S. Patentschrift Nr. 6,358,709), SCRATCHY (Lutz et al., 2001, Proc Natl Acad Sei. USA 98: 11248-11253), DNS Fragmentierungsverfahren (Kikuchi et al., Gene 236: 159-167), einzelsträngiges DNS-Shuffling (Kikuchi et al., 2000, Gene 243: 133-137 sowie AMEsystem.TM, Antikörpermanipulationstechnologie durch direkte Evolution (Angewandte Molekulare Evolution) (U.S. Patentschrift Nr. 5,824,514; U.S. Patentschrift Nr. 5,817,483; U.S. Patentschrift Nr. 5,814,476; U.S. Patentschrift Nr. 5,763,192; U.S. Patentschrift Nr. 5,723,323.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden

Antikörpervarianten unter Verwendung von einem oder mehreren auf Zellen basierenden oder in vivo Nachweisverfahren gescreent. Bei solchen Nachweisverfahren werden typischerweise aufgereinigte oder nicht-aufgereinigte veränderte Immunglobuline von außen zugegeben, so dass Zellen individuellen Immunglobulinen oder Pools von Immunogobulinen, die zu einer Bibliothek gehören, ausgesetzt sind. Diese Nachweisverfahren beruhen typischerweise, aber nicht immer, auf der gewünschten Funktion des Immunglobulins, das heisst, der Fähigkeit des Antikörpers, 23 [nachgereicht] an sein Zielmolekül zu binden und ein biochemisches Ereignis zu vermitteln, beispielsweise eine Effektorfunktion, Liganden/Rezeptor Bindungshemmung, Apoptose und ähnliche. Solche Nachweisverfahren umfassen oftmals die Überwachung der Zellantwort auf den Antikörper, beispielsweise das Überleben der Zelle, den Zelltod, die Veränderung in der zellulären Morphologie oder die transkriptioneile Aktivierung, wie etwa die zelluläre Expression eines natürlichen Gens oder eines Reportergens. Solche Nachweisverfahren können beispielsweise die Fähigkeit von Antikörpervarianten messen, ADCC, ADCP oder CDC hervorzurufen. Bei einigen Nachweisverfahren kann es erforderlich sein, zusätzliche Zellen oder Bestandteile hinzuzufügen, das heisst zusätzlich zu den Zielzellen, beispielsweise Serumkomplement oder Effektorzellen wie etwa periphere Blutmonozyten (PBMCs), NK Zellen, Makrophagen und ähnliche. Solche zusätzlichen Zellen können von einem beliebigen Organismus stammen, vorzugsweise vom Menschen, Mäusen, der Ratte, dem Kaninchen und dem Affen. Immunglobuline können die Apoptose bestimmter Zelllinien verursachen, welche das Zielmolekül exprimieren, oder sie können den Angriff auf Zielzellen durch Immunzellen vermitteln, welche dem Nachweisverfahren zugegeben wurden. Verfahren zur Überwachung von Zelltod oder -lebensfähigkeit sind im Stand der Technik bekannt und umfassen die Verwendung von Farbstoffen, immunchemischen, zytochemischen und radioaktiven Reagenzien. Beispielsweise können Caspase-Färbungsnachweise die Messung von Apoptose ermöglichen, und die Aufnahme oder Freisetzung von radioaktiven Substraten oder fluoreszierenden Farbstoffen wie Alamarblau können es ermöglichen, das Zellwachstum oder die Zellaktivierung zu überwachen.

NACHGEREICHT

In einer bevorzugten Ausführungsform kann der DELFIART EuTDA-basierende Zytotoxizitätsassay (Perkin Eimer, MA) verwendet werden. 24

Alternativ können tote oder beschädigte Zellen durch Messung der Freisetzung eines oder mehrerer natürlicher intrazellulärer Bestandteile überwacht werden, z.B. der Lactatdehydrogenase. Die transkriptionelle Aktivierung kann auch als ein Verfahren zum Nachweis der Funktion in Nachweisverfahren auf Zellbasis dienen. In diesem Fall kann die Antwort durch Nachweis von natürlichen Genen oder Immunglobulinen überwacht werden, welche aufreguliert sein können, beispielsweise kann die Freisetzung bestimmter Interleukine gemessen werden oder alternativ kann die Auswertung durch ein Reportersystem erfolgen. Nachweisverfahren auf Zellbasis können auch die Messung morphologischer Veränderungen von Zellen als Antwort auf die Anwesenheit veränderter Immunglobuline umfassen. Die Zelltypen für solche Nachweisverfahren können prokaryotisch oder eukaryotisch sein, und es kann eine Anzahl von im Stand der Technik bekannten Zelllinien eingesetzt werden. Alternativ können Screeningverfahren auf Zellbasis durchgeführt werden unter Verwendung von Zellen, die mit Nukleinsäuren transformiert oder transfiziert wurden, welche für die Varianten kodieren. Zum Beispiel nützt das Screening auf Zellbasis die Zelloberflächenpräsentation. Es kann ein Fusionspartner eingesetzt werden, welcher die Präsentation veränderter Immunglobuline auf der Oberfläche von Zellen ermöglicht (Witrup, 2001, Curr Opin Biotechnol. 12: 395-399) .

In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Immuno-genität der veränderten Immunglobuline experimentell bestimmt werden unter Verwendung eines oder mehrerer auf Zellen basierender Nachweisverfahren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden ex vivo T-Zellaktivierungs-Nachweisverfahren verwendet, um die Immunogenität experimentell zu quantifizieren. Bei diesem Verfahren werden Antigen-präsentierende Zellen und naive T-Zellen von passenden Spendern mit einem Peptid oder einem ganzen 25

NACHGEREICHT

Antikörper des Interesses ein oder mehrere Male herausgefordert· Die T-Zellaktivierung kann dann unter Verwendung einer Anzahl von Verfahren nachgewiesen werden, z.B. durch Überwachung der Cytokinfreisetzung oder Messung der Aufnahme von Tritium-markiertem Thymidin. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform wird die Herstellung von Interferon gamma unter Verwendung von Elispot Nachweisverfahren überwacht (Schmittei et al., 2000, J Immunol Meth., 24: 17-24).

Die biologischen Eigenschaften der veränderten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung können in Zell-, Gewebs- und Gesamtorganismusexperimenten gekennzeichnet werden. Wie im Stand der Technik bekannt, werden Medikamente häufig an Tieren getestet, einschließlich aber nicht beschränkt auf Mäuse, Ratten, Kaninchen, Hunde, Katzen,

Schweine und Affen, um die Wirksamkeit eines Medikaments zur Behandlung gegen eine Krankheit oder ein Krankheitsmodell zu messen oder die pharmakokinetischen Eigenschaften, die Toxizität und weitere Eigenschaften eines Medikaments zu messen. Die Tiere können als Krankheitsmodelle bezeichnet werden. Therapeutika werden häufig an Mäusen getestet, einschließlich aber nicht beschränkt auf nackte Mäuse, SCID Mäuse, Xenograft-Mäuse und transgene Mäuse (einschließlich genetischer Knock-in und Knock-out Mutanten). Solche Experimente können aussagekräftige Daten zur Bestimmung des Potentials der Antikörpers, als Therapeutikum verwendet zu werden, bereitstellen. Es kann jeder beliebige Organismus, vorzugsweise Säugetiere, zum Testen verwendet werden. Auf Grund ihrer genetischen Ähnlichkeit mit Menschen, können Affen geeignete therapeutische Modelle sein und können somit verwendet werden, um die Wirksamkeit, Toxizität, pharmakokinetischen Eigenschaften oder eine weitere Eigenschaft der veränderten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung zu testen. Das Testen von Medikamentenanwärtern an Menschen ist

26 NACHGEREICHT am häufigsten zur Zulassung als Therapeutika erforderlich, und somit werden diese Experimente selbstverständlich in Betracht gezogen. Die veränderten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung können folglich an Menschen getestet werden, um deren therapeutische Wirksamkeit, Toxizität, Immunogenität, pharmakokinetische Eigenschaften und/oder weitere klinische Eigenschaften zu bestimmen.

Die veränderten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung können in einem weiten Bereich von Antikörperprodukten Anwendung finden. In einer Ausführungsform wird die Antikörpervariante der vorliegenden Erfindung zur Therapie oder Prophylaxe, zur präparativen oder analytischen Verwendung, als Diagnostikum, industrielle Verbindung oder als Forschungsreagens, vorzugsweise als Therapeutikum verwendet. Die Antikörpervariante kann in einer Antikörperzusammensetzung Anwendung finden, die monoklonal oder polyklonal ist. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die veränderten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung verwendet, um Zielzellen zu töten, welche das Zielantigen tragen, beispielsweise Krebszellen.

In einer alternativen Ausführungsform werden die veränderten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung verwendet, um das Zielantigen zu blockieren, diesem entgegen zu wirken oder mit diesem zu wirken, beispielsweise durch Entgegenwirken gegenüber einem Cytokin oder Cytokinrezeptor. In einer alternativ bevorzugten Ausführungsform werden die veränderten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung verwendet, um das Zielantigen zu blockieren, diesem entgegen zu wirken oder mit dem Zielantigen zu wirken und die Zielzellen zu töten, welche das Zielantigen tragen.

In einer alternativ bevorzugten Ausführungsform werden die veränderten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung verwendet, um Wachstumsfaktoren oder Rezeptoren von Wachstumfaktoren zu blockieren, diesen entgegen zu wirken 27

NACHGEREICHT oder mit diesen zu wirken und die Zielzellen zu töten, welche das Zielantigen tragen oder benötigen.

In einer alternativ bevorzugten Ausführungsform werden die veränderten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung verwendet, um Enzyme oder Substrate von Enzymen zu blockieren, diesen entgegen zu wirken oder mit diesen zu wirken

Die veränderten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung können für zahlreiche therapeutische Zwecke verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Antikörper, welcher die veränderten Immunglobulinen umfasst, einem Patienten verabreicht, um eine spezifische Erkrankung zu behandeln. Ein "Patient" im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst sowohl Menschen als auch andere Tiere, vorzugsweise Säugetiere und besonders bevorzugt Menschen.

Mit "spezifischer Erkrankung" wird hierin eine Erkrankung bezeichnet, die durch Zugabe einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche ein verändertes Immunglobulin der vorliegenden Erfindung umfasst, gelindert werden kann.

In einer Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes verändertes Immunglobulin das einzige therapeutisch aktive Agens, das dem Patienten verabreicht wird. Alternativ wird das erfindungsgemäße veränderte Immunglobulin in Kombination mit einem oder mehreren weiteren therapeutischen Agenzien verabreicht, einschließlich aber nicht beschränkt auf cytotoxische Agenzien, chemotherapeutische Agenzien, Cytokine, wachstumshemmende Agenzien, anti-hormonelle Agenzien, Kinasehemmer, anti-angiogenetische Agenzien, cardioprotektive Mittel oder weitere therapeutische Agenzien. Die veränderten Immunglobuline können gleichzeitig mit einem oder mehreren therapeutischen Kuren verabreicht werden. Beispielsweise kann eine Antikörpervariante der vorliegenden Erfindung gemeinsam mit Chemotherapie, Strahlungstherapie oder ßowohl Chemotherapie als auch 28

NACHGEREICHT

Strahlungstherapie gemeinsam dem Patienten verabreicht werden. In einer Ausführungsform können die veränderten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit einem oder mehreren Antikörpern verabreicht werden, welche eine Antikörpervariante der vorliegenden Erfindung umfassen können oder nicht. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die veränderten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung sowie ein oder mehrere weitere Anti-Krebstherapien zur Behandlung von Krebszellen ex vivo eingesetzt werden. Es wird in Betracht gezogen, dass eine solche ex vivo Behandlung zur Knochenmarkstransplantation und insbesondere zur autologen Knochenmarkstransplantation nützlich sein kann. Es wird selbstverständlich in Betracht gezogen, dass die Antikörper der Erfindung in Kombination mit darüber hinaus weiteren therapeutischen Techniken, wie etwa der Chirurgie, eingesetzt werden können.

Eine Vielzahl weiterer therapeutischer Agenzien können zur Verabreichung mit den veränderten Immunglobulinen der vorliegenden Erfindung Verwendung finden. In einer Ausführungsform wird das veränderte Immunglobulin mit einem anti-angiogenetischen Agens verabreicht, das eine Verbindung darstellt, welche die Entwicklung von Blutgefäßen blockiert oder diese zu einem gewissen Grade beeinträchtigt. Der anti-angiogenetische Faktor kann beispielsweise ein kleines Molekül oder ein Protein, zum Beispiel ein Antikörper, eine Fc Fusion oder ein Cytokin sein, das an einen Wachstumsfaktor oder einen Rezeptor für einen Wachstumsfaktor bindet, der an der Förderung der Angiogenese beteiligt ist. Der hierin bevorzugte anti-angiogenetische Faktor ist ein Antikörper, der an den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) bindet. In einer alternativen Ausführungsform wird das veränderte Immunglobulin mit einem therapeutischen Agens verabreicht, das eine adaptive Immunantwort induziert oder erhöht, beispielsweise ein Antikörper, der CTLA-4 zum Ziel hat. In 29

NACHGEREICHT

• ♦ • ♦ ♦ • · • ·♦· • · einer alternativen Ausführungsform wird das veränderte Immunglobulin mit einem Tyrosinkinasehemmer verabreicht, wobei es sich um ein Molekül handelt, das zu einem gewissen Grade die Tyrosinkinaseaktivität einer Tyrosinkinase hemmt. In einer alternativen Ausführungsform werden die veränderten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung mit einem Cytokin verabreicht. Mit "Cytokin" wie hierin verwendet wird ein allgemeiner Begriff für Proteine bezeichnet, die von einer Zellpopulation freigesetzt und die auf eine andere Zelle als interzelluläre Botenstoffe, einschließlich Chemokine, wirken.

Es werden pharmazeutische Zusammensetzungen in Betracht gezogen, wobei veränderte Immunglobuline der vorliegenden Erfindung und ein oder mehrere therapeutisch aktive Agenzien formuliert werden. Formulierungen der Antikörpervarianten der vorliegenden Erfindung werden zur Lagerung durch Mischen des veränderten Immunglobulins der vorliegenden Erfindung, welche den gewünschten Reinheitsgrad aufweisen, mit wahlweisen pharmazeutisch verträglichen Trägern,

Bindemitteln oder Stabilisatoren (Remingtons's Pharmaceutical Sciences, 1980, 16. Auflage, Osol, A. Herausg.) in Form lyophilisierter Formulierungen oder wäßriger Lösungen vorbereitet. Die zur in vivo Verabreichung zu verwendenden Formulierungen sind vorzugsweise steril.

Dies wird in einfacher Weise durch Filtration über sterile Filtermembranen oder andere Verfahren erreicht. Die veränderten Immunglobuline und weitere hierin offenbarte therapeutisch aktive Agenzien können ebenso als Immunoliposomen und/oder in Mikrokapseln eingeschlossen formuliert werden.

Die Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein verändertes Immunglobulin der vorliegenden Erfindung umfasst, vorzugsweise in Form einer sterilen wäßrigen Lösung, kann auf eine Vielzahl von Weisen durchgeführt werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf oral, 30

NACHGEREICHT • · ·· · · · · · · · • · t * · ··· · · · « · · · · · · ··· · subkutan, intravenös, intranasal, intraotical, transdermal, topisch (z.B. Gele, Salben, Lotionen, Cremes etc.), intraperitoneal, intramuskulär, intrapulmonar (z.B. AERx™ inhalierbare Technologie, kommerziell erwerbbar von Aradigm, oder In-hance™ Lungenverteilungssystem, kommerziell erwerbbar von In-hale Therapeutics), vaginal, parenteral, rektal oder intraocular.

Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "bindet spezifisch" auf eine Bindungsreaktion, die bestimmend für den passenden Liganden von Interesse in einer heterogenen Population von Molekülen ist. Unter kennzeichnenden Bedingungen (z.B. Immunnachweisverfahrensbedingungen im Fall eines Immunglobulins) bindet der spezifizierte Antikörpers an dessen besonderes "Zielmolekül" und bindet nicht in maßgeblicher Menge an andere in einer Probe vorhandenen Moleküle. Vergleichbar zu CDRs von Antikörpern sind die veränderten Strukturschleifenregionen antigen- oder molekülbindende Proteinanteile und nicht Antigene als solche.

Die Bezeichnung "Expressionssystem" bezieht sich auf Nukleinsäuremoleküle, die eine gewünschte kodierende Sequenz und Kontrollsequenzen in operativer Verbindung enthalten, so dass Wirte, die mit diesen Sequenzen transformiert oder transfiziert sind, zur Produktion der kodierten Proteine befähigt sind. Um eine Transformation zu bewirken kann das Expressionssystem von einem Vektor umfasst werden; die relevante DNS kann dann jedoch auch in das Wirtschromosom eingebaut werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Expressionssystem einen Vektor. Jeder im Stand der Technik bekannte Expressionsvektor kann für diesen Zweck passend sein.

NACHGEREICHT 31 *··*·»· ···· • · ♦ · · ··» · « ♦ • · · · · · 9 ··· · • « ····« · ·

Das veränderte Immunglobulin wird bevorzugt in einem Wirt exprimiert, vorzugsweise in einem Bakterium, einer Hefe, einer Pflanzenzelle, in einer tierischen Zelle oder in einer Pflanze oder einem Tier.

Es kann eine große Vielzahl von geeigneten Wirtszellen zur Expression des veränderten Immunglobulins der Erfindung verwendet werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf Säugerzellen (tierische Zellen), Pflanzenzellen, Bakterien (z.B. Bacillus subtilis, Escherichia coli), Insektenzellen und Hefe (z.B. Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae).

Es werden beispielsweise eine Vielzahl von Zelllinien, die in der vorliegenden Erfindung Anwendung finden können, im ATCC Zelllinienkatalog beschrieben, der von der American Type Culture Collection erhältlich ist. Ferner können ebenso Pflanzen und Tiere als Wirte zur Expression des erfindungsgemäßen Immunglobulins verwendet werden. Die Expressions- ebenso wie die Transfektionsvektoren oder -kassetten können entsprechend des verwendeten Wirts gewählt werden.

Selbstverständlich können auch nicht-zelluläre oder zellfreie Proteinexpressionssysteme verwendet werden. In vitro Transkriptions/Translations-Proteinexpressionsplattformen, die Protein in genügenden Mengen hersteilen, bieten viele Vorteile einer zellfreien Proteinexpression, wodurch der Bedarf an mühsamen stromaufwärtigen und stromabwärtigen Schritten (z.B. Wirtszelltransformation, -kultur oder -lyse), die typischerweise mit Expressionssystemen auf Zellbasis verbunden sind, vermieden wird.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Immunglobulins, oder ein pharmazeutisches Präparat davon umfasst, das mindestens eine Veränderung in einer Strukturschleifenregionen des Immunglobulins umfasst und die Bestimmung der Bindung des 32

NACHGEREICHT

Immunglobulins an ein Epitop eines Antigens, wobei das unveränderte Immunglobulin im wesentlichen nicht an das Epitop bindet, welches die Schritte umfasst:

Bereitstellung einer Nukleinsäure, die ein Immunglobulin kodiert, welche mindestens eine Strukturschleifenregion umfasst,

Veränderung mindestens eines Nukleotidrests in mindestens einer der Strukturschleifenregionen, Übertragung der veränderten Nukleinsäure in ein ExpressionsSystem,

Expression des veränderten Immunglobulins,

Kontaktierung des exprimierten veränderten Immunglobulins mit einem Epitop,

Bestimmung, ob das veränderte Immunglobulin an das Epitop bindet sowie

Bereitstellung des veränderten Immunglobulins, welches an das Epitop bindet und wahlweise Konfektionierung dessen zu einem pharmazeutischen Präparat.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines multi-spezifischen Immunglobulins, welches in spezifischer Weise an mindestens ein erstes Molekül bindet oder eine pharmazeutische Präparation davon, das mindestens eine Veränderung in mindestens einer Strukturschleifenregion des Immunglobulins aufweist sowie die Bestimmung der spezifischen Bindung der mindestens einen Schleifenregionen an mindestens ein zweites, aus Allergenen, Tumor assoziierten Antigenen, Selbstantigenen, Enzymen, Bakterienantigenen, Pilzantigenen, einzelligen Antigenen und viralen Antigen ausgewähltes Molekül, wobei das Immunglobulin, welche eine unveränderte Strukturschleifenregion enthält, nicht in spezifischer Weise an das mindestens eine zweite Molekül bindet. Das Verfahren umfasst die Schritte: 33 I nachgereicht |

Bereitstellung einer Nukleinsäure, welche für ein Immunglobulin kodiert, das spezifisch an mindestens ein erstes Molekül bindet, welches mindestens eine strukturelle Schleifenregion umfasst,

Veränderung mindestens eines Nukleotidrests mindestens einer der Schleifenregionen, die von der Nukleinsäure kodiert werden, Übertragung der veränderten Nukleinsäure in ein Expressionssystem,

Expression des veränderten Immunglobulins,

Kontaktierung des exprimierten veränderten Immunglobulins mit dem mindestens einen zweiten Molekül und

Bestimmung, ob das veränderte Immunglobulin spezifisch an das zweite Molekül bindet sowie

Bereitstellung des veränderten Immunglobulins, welches spezifisch an das mindestens eine zweite Molekül bindet und wahlweise Konfektionierung dessen zu einem pharmazeutischen Präparat.

Die Manipulation von mehr als einer Spezifität in einem Mitglied eines bestimmten Bindungspaares wird bevorzugt (Küfer et al. (2004) Trends in Biotechnology vol. 22 pages 238-244) .

Es wurden zahlreiche Versuche unternommen, um multispezifische, z.B. bispezifische, monoklonale Antikörper oder Antikörperfragmente herzustellen. Ein Problem bei der Herstellung von bispezifischen Antikörpern, die sich aus zwei verschiedenen Polypeptidketten aufbauen (schwere und leichte Kette), besteht in der Notwendigkeit, vier verschiedene Ketten (zwei schwere und zwei leichte Ketten) in einer Zelle zu exprimieren, was eine Anzahl verschiedener Kombinationen von Molekülen zur Folge hat, welche von dem gewünschten bispezifischen Molekül im Gemisch getrennt werden müssen. Auf Grund ihrer Ähnlichkeit ist die Trennung dieser Moleküle schwierig und teuer. Eine Anzahl von

34 NACHGEREICHT

Techniken wurden eingesetzt, um das Auftreten solcher unerwünschter Paarungen zu minimieren (Carter (2001) Journal of Immunological Methods, vol 248, pages 7-15).

Eine Lösung für dieses Problem ist die Herstellung einer Polypeptidkette mit zwei Spezifitäten, wie z.B. zweier miteinander verbundener scFvs oder die Herstellung sogenannter Diabodies. Es wurde gezeigt, dass solche Moleküle von der Faltung natürlicher Moleküle weit entfernt sind und offenkundig schwierig herzustellen sind (LeGall et al. (2004) Protein Engineering, Design & Selection vol. 17 pages 357-366) .

Ein weiteres Problem des derzeitigen Entwurfs bispezi-fischer Antikörper liegt in der Tatsache, dass selbst wenn die Elternantikörper bivalent an ihre jeweilige Bindungspartner (z.B. IgG) binden, der resultierende bispezifische Antikörper für jeden der jeweiligen Bindungspartner monovalent ist.

Die bevorzugten multi-spezifischen Moleküle der vorliegenden Erfindung lösen diese Probleme:

Die Expression eines bispezifischen Moleküls als eine Polypeptidkette ist möglich (eine veränderte IgG Domäne mit zwei Bindungsspezifitäten, siehe Abschnitt Beispiele), was leichter zu erfüllen ist, als die Expression zweier Antikörperpolypeptidketten (Cabilly et al., Proc Natl Acad Sei. USA 81: 3273-3277 (1984)).

Es kann ebenso als Antikörper-ähnliches Molekül (d.h. aus 2 Polypeptidketten aufgebaut) hergestellt werden. Auf Grund der Tatsache, dass sich die zweite Spezifität auf dem nicht-variablen Anteil des Moleküls befindet, besteht kein Bedarf für zwei verschiedene schwere Ketten oder verschiedene leichte Ketten. Folglich gibt es keine Möglichkeit der Fehlpaarung der beiden Ketten.

Ein Antikörper der vorliegenden Erfindung kann aus einer schweren Kette und einer leichten Kette bestehen, die

35 zusammen eine variable Region bilden, welche an einen spezifischen Bindungspartner bindet, und die zweite Spezifität kann durch eine veränderte Schleife irgendeiner der Strukturschleifen entweder der schweren Kette oder der leichten Kette gebildet werden. Die Bindungsstelle kann ebenfalls aus mehr als einer nicht-CDR Schleife gebildet werden (z.B. auf der schweren Kette oder auf der leichten Kette oder auf beiden Ketten), die strukturell benachbart liegen können.

Der veränderte Antikörper oder das Derivat kann ein vollständiger Antikörper oder ein Antikörperfragment (z.B. Fab, CH1-CH2, CH2-CH3) sein.

Er kann mono- oder multivalent an Bindungspartner binden oder sogar mit unterschiedlichen Valenzen für die verschiedenen Bindungspartner, in Abhängigkeit vom Entwurf.

Da es eine Anzahl unterschiedlicher Schleifen gibt, die zur Selektion und zum Entwurf einer spezifischen Bindungsstelle in den nicht-CDR Regionen von schweren und leichten Ketten verfügbar sind, ist es möglich, ohne die oben genannten Pobleme Antikörperderivate mit sogar mehr als zwei Spezifitäten zu entwerfen.

Die spezifischen Bindungsdomänen innerhalb einer Polypeptidkette können mit oder ohne einen Peptidlinker verbunden sein.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Immunglobulin humanen oder murinen Ursprungs.

Da das veränderte Immunglobulin für verschiedene Zwecke, im besonderen in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden kann, ist das Immunglobulin bevorzugt humanen oder murinen Ursprungs. Selbstverständlich kann das veränderte Immunglobulin auch ein humanisiertes oder chimäres Immunglobulin sein.

NACHGEREICHT 36

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das humane Immunglobulin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IgAl, IgA2, IgD,

IgE, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 and IgM.

Das murine Immunglobulin ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IgA, IgD, IgE, IgGl, IgG2A, IgG2B, IgG2C, IgG3 and IgM.

Das veränderte Immunglobulin kann aus einer der oben identifizierten Immunglobulinklassen abstammen.

Das Immunglobulin umfasst bevorzugt eine schwere und/oder leichte Kette des Immunglobulins oder einen Teil davon.

Das veränderte Immunglobulin kann eine schwere und/oder leichte Kette umfassen, mindestens eine variable und/oder konstante Domäne.

Das Immunglobulin gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst bevorzugt mindestens eine konstante und/oder mindestens eine variable Domäne des Immunglobulins oder einen Teil davon inklusive eine Minidomäne.

Eine konstante Domäne ist eine Immunglobulinfaltungseinheit des konstanten Teils eines Immunglobulinmoleküls, auch als Domäne der konstanten Region bezeichnet (z.B. CHI, CH2, CH3, CH4, Ck, CI).

Eine variable Domäne ist eine Immunglobulinfaltungseinheit des variablen Teils eines Immunglobulinmoleküls, auch als Domäne der variablen Region bezeichnet (z.B. Vh, Vk, VI,

Vd) .

Ein bevorzugtes Immunglobulin gemäß der Erfindung besteht aus einer konstanten Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CHI, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C oder eines Teils davon inklusive einer Minidomäne, mit mindestens einer Schleifenregion, und ist dadurch gekennzeichnet dass die 37

NACHGEREICHT mindestens eine Schleifenregion mindestens eine Aminosäureveränderung enthält, die mindestens eine veränderte Schleifenregion bildet, wobei die mindestens eine veränderte Schleifenregion spezifisch an mindestens ein Epitop eines Antigens bindet.

Ein anderes bevorzugtes Immunglobulin gemäß der Erfindung besteht aus einer variablen Domäne einer schweren oder leichten Kette, oder eines Teils davon, inklusive einer Minidomäne, mit mindestens einer Schleifenregion, und ist dadurch gekennzeichnet dass mindestens eine Schleifenregion mindestens eine Aminosäureänderung enthält, die mindestens eine veränderte Schleifenregion bildet, wobei die mindestens eine veränderte Schleifenregion spezifisch an mindestens ein Epitop eines Antigens bindet.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die konstante Domäne aus der Gruppe bestehend aus CHI, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C und Kombinationen davon ausgewählt.

Das veränderte Immunglobulin gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine oder mehrere konstante Domänen umfassen (z.B. mindestens zwei, drei, vier, fünf, sechs, zehn Domänen). Wenn mehr als eine Domäne im veränderten Immunglobulin vorhanden ist, können diese Domänen vom selben Typ oder von verschiedenen Typen sein (Z.B.CH1-CH1-CH2, CH3-CH3). Selbstverständlich kann auch die Anordnung der einzelnen Domänen beliebig sein (z.B. CH1-CH3-CH2, CH4-CH1-CH3-CH2).

Die gesamte Nummerierung der Aminosäuresequenzen der Immnglobuline entspricht dem IMGT Nummerierungsschema (IMGT, the international ImMunoGeneTics Information system@imgt.cines.fr; http://imgt.cines.fr; Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212; Ruiz et al., 2000 Nucleic Acids Res. 28: 219-221; Lefranc et al., 2001,

Nucleic Acids Res. 29: 207-209; Lefranc et al., 2003,

NACHGEREICHT 38 • ···« ·· · ·· · • · · · · ··♦ · · · • · · · t · « ··* ·

Nucleic Acids Res. 31: 307-310; Lefranc et al., 2005, Dev Comp Iminunol 29:185-203).

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung enthalten die veränderten Schleifenregionen des CHI, CH2, CH3 und CH4 die Aminosäuren 7 bis 21, Aminosäuren 25 bis 39, Aminosäuren 41 bis 81, Aminosäuren 83 bis 85, Aminosäuren 89 bis 103 und Aminosäuren 106 bis 117.

Die Schleifenregionen des Igk-C und Igl-C humanen Ursprungs enthalten bevorzugt die Aminosäuren 8 bis 18, Aminosäuren 27 bis 35, Aminosäuren 42 bis 78, Aminosäuren 83 bis 85, Aminosäuren 92 bis 100, Aminosäuren 108 bis 117 und Aminosäuren 123 bis 126.

Die Schleifenregionen des Igk-C und Igl-C murinen Ursprungs enthalten bevorzugt die Aminosäuren 8 bis 20, Aminosäuren 26 bis 36, Aminosäuren 43 bis 79, Aminosäuren 83 bis 85, Aminosäuren 90 bis 101, Aminosäuren 108 bis 116 und Aminosäuren 122 bis 125.

Die Strukturschleifenregionen der variablen Domäne des Immunglobulins menschlichen Ursprungs enthalten bevorzugt die Aminosäuren 8 bis 20, Aminosäuren 44 bis 50, Aminosäuren 67 bis 76 und Aminosäuren 89 bis 101.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung enthalten die Strukturschleifenregionen der variablen Domäne des Immunglobulins murinen Ursprungs die Aminosäuren 6 bis 20, Aminosäuren 44 bis 52, Aminosäuren 67 bis 76 und Aminosäuren 92 bis 101.

Die oben angeführten Aminosäureregionen der jeweiligen Immunglobuline enthalten Schleifenregionen die verändert werden.

Das erfindungsgemäße Immunglobulin stammt bevorzugt vom Kamel.

NACHGEREICHT 39 • · · • ·

• · · · ··· · • · • · ·♦· · • · · % • · · ·

Antikörper aus Kamel enthalten nur eine schwere Kette und haben dieselbe Antigenaffinität wie normale Antikörper bestehend aus leichten und schweren Ketten.

Konsequenterweise sind Kamelantikörper wesentlich kleiner als z.B. humane Antikörper, was ihnen die Durchdringung dichter Gewebe erlaubt, um zum Antigen zu gelangen, wo größere Proteine dies nicht können. Außerdem zeigen die schweren Ketten-Antikörper des Kamels wegen der vergleichsweisen Einfachheit, hohen Affinität und Spezifität und Potential zu aktiven Zielen zu gelangen und mit ihnen zu interagieren, Vorteile gegenüber allgemein bekannten Antikörpern in Format, Produktion und Anwendung von klinisch wertvollen Komponenten.

Das Immunglobulin aus Kamel enthält vorzugsweise mindestens eine konstante Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CHI, CH2 und CH3.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten die Schleifenregionen des CHI, CH2 und CH3 des Kamelimmunglobulins die Aminosäuren 8 bis 20, Aminosäuren 24 bis 39, Aminosäuren 42 bis 78, Aminosäuren 82 bis 85, Aminosäuren 91 bis 103 und Aminosäuren 108 bis 117.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die spezifische Bindung des veränderten Immunglobulins an ein Molekül durch ein

Bindungsnachweisverfahren bestimmt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus immunologischen Nachweisverfahren, vorzugsweise "enzyme linked immunosorbent assays" (ELISA), Oberflächen-Plasmonresonanznachweisverfahren, Nuklear-Magnet-Resonanzspektroskopie des Sättigungstransferunterschieds, Transfer NOE (trNOE) Nuklear-Magnet-Resonanzspektroskopie, kompetitive Nachweisverfahren, Gewebebindungsnachweisverfahren, Lebendzellbindungsnachweisverfahren und Zellex- traktnachweisverfahren

I NACHGEREICHT 40 • · · • ··· · • · » • · ·· · ♦ · · · • · · ·

Bindungsnachweisverfahren können unter Verwendung einer Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf FRET (Fluoreszens-Resonanz-Energietransfer)- und BRET (Biolumineszens-Resonanz-Energietransfer)- basierende Nachweisverfahren, AlphaScreenTM (Amplified Luminescent Proximity Homogenous) Nachweisverfahren, "Scintillation Proximity" Nachweisverfahren, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), SPR (Oberflächen-Plasmonresonanz; bekannt als BIACORETM), isothermale Titrationskalorimetrie, differentielle Scanningkalorimetrie, Gelelektrophorese sowie Chromatographie einschließlich Gelfiltration. Diese und andere Verfahren können den Vorteil des gleichen Fusionspartners oder der gleichen Markierung haben.

Das veränderte Immunglobulin der Erfindung ist vorzugsweise mit einer Markierung verbunden, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus organischen Molekülen, Enzymmarkierungen, radioaktiven Markierungen, Farbmarkierungen, fluoreszenten Markierungen, chromogenen Markierungen, lumineszenten Markierungen, Haptenen, Digoxigenin, Biotin, Metallkomplexen, Metallen, kolloidalem Gold und Gemischen davon.

Das veränderte Immunglobulin kann an andere Moleküle konjugiert sein, die den einfachen Nachweis des Konjugats in, beispielsweise, Bindungsassays (z.B. ELISA) und Bindungsstudien erlauben.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Immunglobulin das aus einer konstanten Domäne besteht, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CHI, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-Cv oder einem Teil davon inklusive Minidomänen, oder Kombinationen davon, mit mindestens einer Schleifenregion, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Schleifenregion mindestens eine Aminosäureveränderung enthält, die mindestens eine veränderte Schleifenregion enthält, wobei die mindestens eirxe verändertes -

NACHGEREICHT 41

Schleifenregion spezifisch an mindestens ein Epitop eines Antigens bindet.

Es wird bevorzugt, auf molekulare Weise mindestens eine veränderte Antikörperdomäne (= die an den spezifischen Partner über die nicht-variablen Sequenzen oder Strukturschleife bindet) mit mindestens einem weiteren Bindungsmolekül zu kombinieren, das ein Antikörper, Antikörperfragment, ein löslicher Rezeptor, ein Ligand oder eine weitere veränderte Antikörperdomäne sein kann.

Das Molekül ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus proteinartigen Molekülen, Nukleinsäuren und Kohlenhydraten.

Die Schleifenregionen der veränderten Immunglobuline können spezifisch an jede Art von Bindungsmolekülen binden, insbesondere an proteinartige Moleküle, Proteine, Peptide, Polypeptide, Nukleinsäuren, Glykane, Kohlenhydrate, Lipide, kleine organische Moleküle, anorganische Moleküle. Selbstverständlich können die veränderten Immunglobuline mindestens zwei Schleifenregionen umfassen, wobei jede der Schleifenregionen spezifisch an unterschiedliche Moleküle oder Epitope binden kann.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Aminosäurereste der Positionen 15 bis 17, 29 bis 34, 85.4 bis 85.3, 92 bis 94, 97 bis 98 und/oder 108 bis 110 des CH3 verändert.

Die Veränderung des Immunglobulins gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise eine Deletion, Substitution oder Insertion.

Gemäß der vorliegenden Erfindung sind mindestens 1, bevorzugt mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 und 15 Aminosäuren deletiert, mit anderen Aminosäuren substituiert (auch mit veränderten Aminosäuren) oder insertiert in die Schleifenregion des Immunglobulins. Allerdings sollte die maximale Zahl der in eine Schleifenregion insertierten Aminosäuren die Zahl von 30, bevorzugt 25, mehr bevorzugt 20 42

NACHGEREICHT

Aminosäuren nicht übersteigen. Die Substitution und die Insertion der Aminosäuren erfolgt bevorzugt zufällig durch im Stand der Technik bekannte Verfahren und wie in der vorliegenden Patentanmeldung beschrieben.

Das veränderte Immunglobulin ist vorzugsweise mit einer Markierung oder einem Reportermolekül verbunden, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus organischen Molekülen, Enzymmarkierungen, radioaktiven Markierungen, Farbmarkierungen, fluoreszenten Markierungen, chromogenen Markierungen, lumineszenten Markierungen, Haptenen,

Digoxigenin, Biotin, Metallkomplexen, Metallen, kolloidalem Gold und Gemischen davon.

Veränderte Immunglobuline, die mit oben angegebenen Markierungen verbunden sind, können beispielsweise in diagnostischen Verfahren verwendet werden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen oder eines mit einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Immunglobulins zur Herstellung eines Impfstoffs zur aktiven Immunisierung.

Dabei wird das Immunglobulin entweder als antigene Medikamentensubstanz zur Formulierung eines Impfstoffs verwendet oder zum Herausfischen oder Abfangen antigener Strukturen zur Verwendung in einer Impfstoffformulierung verwendet.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen oder eines mit einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Immunglobulins zur Herstellung einer Proteinbibliothek von Immunglobulinen.

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Bindung und/oder zum Nachweis eines Moleküls, das die Schritte umfasst: (a) In Kontakt bringen eines erfindungsgemäßen veränderten

Immunglobulins oder eines Immunglobulins, erhältlich nach einem erfindungsgemäßen Verfahren, mit einer 43

Γnachgereioht I

Testprobe welches in Verdacht ist, das Molekül zu enthalten und (b) Nachweis der potentiellen Bildung eines spezifischen Immunglobulin/Molekül-Komplexes.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Isolierung eines Moleküls, das die Schritte umfasst: (a) In Kontakt bringen eines erfindungsgemäß veränderten

Immunglobulins oder eines veränderten Immunglobulins, eerhältlich nach einem erfindungsgemäßen Verfahren mit einer Probe, welche das Molekül enthält, (b) Abtrennung des gebildeten spezifischen

Immunglobulin/Molekül-Komplexes (c) wahlweise Isolierung des Moleküls aus dem Komplex.

Die erfindungsgemäßen Imunglobuline können zur spezifischen Isolierung von Molekülen aus einer Probe verwendet werden. Wenn multi-spezifische Immunglobuline verwendet werden, kann mehr als ein Zielmolekül aus einer Probe isoliert werden. Es ist besonders vorteilhaft Immunglobuline in solchen Verfahren zu verwenden, weil dadurch z.B. eine Matrix erzeugt werden kann, die eine homogene Oberfläche mit definierten Mengen von darauf immobilisierten Bindungspartnern (d.h. veränderten Immunglobulinen) aufweist, welche dazu in der Lage sind, die zu isolierenden Zielmoleküle zu binden. Im Gegensatz dazu kann, wenn monospezifische Bindungspartner verwendet werden, keine homogene Matrix erzeugt werden, da die einzelnen Bindungspartner nicht mit derselben Wirksamkeit an die Matrix binden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum zielgerichteten Hinleiten einer Verbindung auf ein Zielmolekül, das die Schritte umfasst: 44

NACHGEREICHT (a) In Kontakt bringen eines erfindungsgemäß veränderten

Immunglobulins oder eines veränderten Immunglobulins, erhältlich nach einem erfindungsgemäßen Verfahren das in der Lage ist, spezifisch an die Verbindung zu binden, (b) Hinleiten des Immunglobulin/Verbindungs-Komplexes zu dem

Zielmolekül.

Erfindungsgemäße veränderte Immunglobuline können zum Hinleiten mindestens einer Verbindung, die an die CDRs und/oder veränderten Schleifenregionen gebunden ist, zu dem Zielmolekül verwendet werden. Solche Immunglobuline können dazu verwendet werden, therapeutische Substanzen in zielgerichteter Weise zu einem bevorzugten Wirkungsort im Laufe der Behandlung von Krankheiten zu leiten.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Proteinbibliothek, die ein erfindungsgemäßes oder mit einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliches Immunglobulin umfasst.

Bevorzugte Verfahren zur Herstellung der Bibliothek können oben und in den Beispielen gefunden werden. Die erfindungsgemäße Bibliothek kann zur Identifizierung von Immunglobulinen verwendet werden, die an ein bestimmtes Molekül binden.

Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung einer Proteinbibliothek welche ein erfindungsgemäßes oder mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliches Immunglobulin umfasst, zum Entwurf von Immunglobulinderivaten. Ein bestehendes Immunglobulin kann verändert werden, um Antigenbindungsstellen in jede Domäne oder Minidomäne einzuführen, unter Verwendung einer Proteinbibliothek der betreffenden Domäne von mindestens 10, vorzugsweise 100, besonders bevorzugt 1 000, besonders bevorzugt 10 000, besonders bevorzugt 100 000, insbesondere mehr als 1 000 000 Domänvarianten mit mindestens einer veränderten Schleife.

45 NACHGEREICHT

Die Bibliothek wird daraufhin auf Bindung an das spezifische Antigen gescreent. Nach molekularer Charakterisierung auf die gewünschten Eigenschaften wird die ausgewählte Domäne oder Minidomäne durch gentechnische Verfahren in das ursprüngliche Immunglobulin kloniert, so dass es die Wildtypregion ersetzt. Alternativ kann nur die DNS, welche für die Schleifen kodiert oder für die mutierten Aminosäuren kodiert ausgetauscht werden, zum Erhalt eines Immunglobulins mit der zusätzlichen Bindungsstelle für das spezifische Antigen.

Die Wahl der Stelle der mutierten, antigen-spezifischen Strukturschleife ist abhängig von der Struktur des ursprünglichen Immunglobulins und vom Zweck der zusätzlichen Bindungsstelle. Wenn, beispielsweise, das ursprüngliche Molekül ein vollständiges Immunglobulin ist, das eine zusätzliche Antigenbindungsstelle ohne Störung der Effektorfunktion benötigt, werden die zu verändernden Schleifen aus Domänen ausgewählt, die entfernt von CH2 und CH3 sind, die die natürlichen Bindungspartner der Fc-Effektormoleküle sind. Wenn das ursprüngliche Immunglobulin ein Fab ist, ist eine Veränderung in den konstanten Domänen der leichten Ketten oder der schweren Ketten oder der entsprechenden variablen Domänen möglich.

Zur Erzeugung einer Bibliothek können Bibliotheken von mutierten ursprünglichen Molekülen hergestellt werden, die Mutationen in einer oder mehreren Strukturschleifen einer oder mehrerer Domänen aufweisen. Die Selektion mit vollständigen mutierten ursprünglichen Molekülen kann einige Vorteile aufweisen, da die Selektion auf Antigenbindung mit einer veränderten Strukturschleife die sterisch vorteilhaften Veränderungen liefert wenn sie auch für andere Eigenschaften getestet werden, die das mutierte Immunglobulin zeigen soll.

NACHGEREICHT 46

Die Größenanforderung (d.h. die Anzahl von Proteinvarianten) einer Proteinbibliothek, von einer mutierten Domäne oder einer Minidomäne oder einem Fusionsmolekül einer Domäne ist abhängig von der Aufgabe. Im allgemeinen muss eine Bibliothek zur de novo Erzeugung einer Antigenbindungsstelle größer sein als eine Bibliothek, die zur weiteren Veränderung einer bereits bestehenden manipulierten Antigenbindungsstelle, die durch eine veränderte Strukturschleife gebildet wird, verwendet wird (z.B. zur Steigerung der Affinität oder die Veränderung der Feinspezifität gegenüber dem Antigen) verwendet wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine Immunglobulinbibliothek oder eine Nukleinsäurebibliothek, die mehrere Immunglobuline umfasst, z.B. eine konstante oder variable Domäne, eine Minidomäne und/oder mindestens eine Strukturschleifenregion enthalten in einer Minidomäne, oder Nkleinsäuren die dafür kodieren. Die Bibliothek enthält Mitglieder mit unterschiedlichen Veränderungen, wobei die Vielzahl durch die Veränderungen in der mindestens einen Strukturschleifenregion bestimmt wird. Die Nukleinsäurebibliothek umfasst vorzugsweise mindestens 10 verschiedene Mitglieder (mit mindestens einer Aminosäureveränderung) und umfasst besonders bevorzugt mindestens 100, besonders bevorzugt 1 000 oder 10 000 unterschiedliche Mitglieder (z.B. entworfen durch "Randomisierungsstrategien" oder kombinatorische Techniken). Noch stärker diversifizierte individuelle Mitgliederanzahlen, wie etwa mindestens 1 000 000 oder mindestens 10 000 000 werden ebenfalls bevorzugt.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Kombination zweier verschiedener Domänen oder Minidomänen, die aus mindestens zwei erfindungsgemäßen Bibliotheken ausgewählt sind, um multispezifische Immunglobuline zu erzeugen. Diese ausgewählten spezifischen Immunglobuline können miteinander 47

NACHGEREICHT

oder mit anderen Molekülen kombiniert werden, ähnlich wie Bausteine, um die optimale Anordnung der Domänen oder Minidomänen zu entwerfen, um die erwünschten Eigenschaften zu erlangen.

Ferner können ein oder mehrere erfindungsgemäße veränderte Immunglobuline an zahlreichen oder allen unterschiedlichen Stellen eines Proteins eingeführt werden, ohne die Struktur des Proteins zu zerstören. Durch eine solche „Domänenshuffling"-Technik werden neue Bibliotheken erschaffen, die wiederum auf die erwünschten Eigenschaften selektiert werden können.

Die bevorzugte Bibliothek enthält erfindungsgemäße Immunglobuline ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Domänen eines Immunglobulins, Minidomänen oder Derivative davon.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Bindungsmolekül für ein Antigen (Antigen-bindendes Molekül), das mindestens eine Immunglobulindomäne und eine Strukturschleifenregionen umfasst, die erfindungsgemäß zur Bindung an das Antigen verändert wurden, wobei das Bindungsmolekül keine variablen Domänen eines Antikörpers enthält. Es kann weitere Anteile umfassen, die für Antikörperaktivitäten nützlich sind (z.B. wie etwa natürliche oder veränderte Effektorregionen (Sequenzen)), es fehlt ihm jedoch die "natürliche" Bindungsregion für Antikörper, d.h. variable Domänen in ihrer natürlicherweise auftretenden Position. Diese erfindungsgemäßen Antigenbindenden Moleküle weisen die im obigen für die vorliegenden Moleküle beschriebenen Vorteile auf, aber ohne die spezifische Bindungsaktivität von Antikörpern; jedoch mit einer neu eingeführten spezifischen Bindungsaktivität in der Strukturschleifenregion. r_ NACHGEREICi IT 1 48

Bevorzugt enthalten diese erfindungsgemäßen Antigenbindungsmoleküle CHI, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C und Kombinationen davon; wobei diese Kombinationen mindestens zwei, bevorzugt mindestens vier, insbesondere mindestens sechs konstante Domänen und mindestens eine erfindungsgemäß veränderte Strukturschleifenregion enthalten.

Vorzugsweise sind diese Stukturschleifenregionen entweder durch eine erfindungsgemäß veränderte Strukturschleifenregion verbunden oder durch Strukturschleifen die natürlich zwischen diesen zwei konstanten Domänen Vorkommen. Eine Ausführungsform dieser antigenbindenen Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung besteht aus der Fc Region eines Antikörpers mit mindestens einer Veränderung in einer Strukturschleife gemäß der vorliegenden Erfindung. Auch für die antigenbindenden Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt, dass die neuen antigenbindenen Stellen in den Strukturschleifen durch Randomisierungstechnologien, d.h. durch Austauschen einer oder mehrer Aminosäurereste der Schleife durch Randomisierungstechnologien oder durch Einfügen zufällig generierter Inserte in diese Strukturschleifen. Alternativ bevorzugt ist die Verwendung von kombinatorischen Ansätzen.

Gemäß eines weiteren Aspekts betrifft die vorliegende Erfindung ein verändertes Immunglobulin, das eine Antigenbindungsstelle aufweist, die dem unveränderten Immunglobulin fremd ist und in eine oder mehrere Strukturschleifen eingesetzt ist. Die Bezeichnung "fremd" bedeutet, dass die Antigenbindungsstelle nicht natürlicherweise durch die spezifischen Region des Immunglobulins gebildet wird und ein fremder Bindungspartner, aber nicht der natürlicherweise vorkommende Bindungspartner des Immunglobulins durch die Antigenbindungsstelle gebunden wird. Das bedeutet, dass es nicht in Betracht kommt, dass ein Bindungspartner wie ein 49 [nachgereicht 1

Fc-Rezeptor oder eine Effektor des Immunsystems durch die antigenbindende Stelle gebunden wird, die dem zu unveränderten Immunglobulin fremd ist.

Bevorzugte Immunglobuline gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten mindestens zwei Antigenbindungsstellen, wobei die erste Seite an ein erstes Epitop bindet und die zweite Seite an ein zweites Epitop.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das vorliegende Immunglobulin mindestens zwei Schleifenregionen, wobei die erste Schleifenregion an ein erstes Epitop bindet und die zweite Schleifenregion an ein zweites Epitop. Entweder die mindestens erste oder die mindestens zweite Schleifenregion oder beide können eine Strukturschleife enthalten. Die erfindungsgemäßen Immunglobuline umfassen die im Stand der Technik bekannten funktionellen Fragmente davon, welche die essentiellen Elemente gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten: die veränderte Stukturschleifenregion gemäß der vorliegenden Erfindung.

Bevorzugt ist das Immunglobulin gemäß der vorliegenden Erfindung aus mindestens zwei Immunglobulindomänen zusammengesetzt, oder einem Teil davon inklusive einer Minidomäne, und jede Domäne enthält mindestens eine Antigenbindungsstelle.

Weiters bevorzugt ist ein Immunglobulin gemäß der vorliegenden Erfindung, welche mindestens eine Domäne der konstanten Region und /oder mindestens eine Domäne der variablen Region des Immunglobulins enthält, oder einen teil davon, inklusive einer Minidomäne. Daher sind eine variable Domäne, die beispielsweise in der C-terminalen Region verändert ist oder die variable Domäne, die an eine veränderte CHI Region gebunden ist, zum Beispiel eine veränderte CHI Minidomäne, eine der bevorzugten Ausführungsformen.

50

Das bevorzugte erfindungsgemäße Immunglobulin enthält eine Domäne mit mindestens 50% Homologie zur unveränderten Domäne.

Eine "homologe Immunglobulindomäne" bezeichnet eine erfindungsgemäße Immunglobulindomäne, die mindestens 50 % Identität der Aminosäuresequenz hinsichtlich einer nativen Volllängensequenz einer Immunglobulindomäne aufweist oder jedes beliebige andere Fragment einer Volllängensequenz einer Immunglobulindomäne wie hierein offenbart.

Vorzugsweise weist eine homologe Immunglobulindomäne mindestens etwa 50 % Identität der Aminosäuresequenz, besonders bevorzugt mindestens etwa 55 % Identität der Aminosäurensequenz, besonders bevorzugt mindestens etwa 60 % Identität der Aminosäurensequenz, besonders bevorzugt mindestens etwa 65 % Identität der Aminosäurensequenz, besonders bevorzugt mindestens etwa 70 % Identität der Aminosäurensequenz, besonders bevorzugt mindestens etwa 75 % Identität der Aminosäurensequenz, besonders bevorzugt mindestens etwa 80 % Identität der Aminosäurensequenz, besonders bevorzugt mindestens etwa 85 % Identität der Aminosäurensequenz, besonders bevorzugt mindestens etwa 90 % Identität der Aminosäurensequenz, besonders bevorzugt mindestens etwa 95 % Identität der Aminosäurensequenz mit einer nativen Sequenz einer Immunglobulindomäne auf oder mit jedem beliebigen anderen spezifisch definierten Fragment einer Volllängensequenz einer Immunglobulindomäne wie hierin offenbart.

Die "Prozentuale (%) Identität der Aminosäuresequenz" ist in Hinsicht auf die hierin bezeichneten Immunglobulinsequenzen als Prozentsatz der Aminosäurereste in einer Anwärtersequenz definiert, der mit den Aminosäureresten in der spezifischen Sequenz der variablen Domäne eines Immunglobulins identisch ist, nach Sequenzvergleich der Sequenz und, falls 51 NACHQEREIC! !T ] erforderlich, Einführung von Lücken, um die maximale prozentuale Sequenzidentität zu erhalten, und wobei beliebige konservative Substitutionen nicht als Teil der Sequenzidentität in Betracht gezogen werden. Ein Sequenzvergleich zum Zweck der Bestimmung der prozentualen Identität der Aminosäuresequenz kann auf zahlreiche Weisen erreicht werden, die dem Fachmann geläufig sind, beispielsweise unter Verwendung öffentlich zugänglicher Computersoftware wie etwa BLAST, BLAST-2, ALIGN oder Megalign (DNASTAR) Software. Der Fachmann kann die angemessenen Parameter zur Messung des Sequenzvergleichs bestimmen, einschließlich von beliebigen Algorithmen, die zum Erhalt der maximalen Sequenzübereinstimmung über die gesamte Länge der verglichenen Sequenzen benötigt wird.

Die Werte der % Sequenzidentität der Aminosäuren können wie unten beschrieben unter Verwendung des WU-BLAST-2 Computerprogramms erhalten werden (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Die meisten der WU-BLAST-2 Suchparameter sind auf die voreingestellten Werte eingestellt. Solche, die nicht auf die Ausgangswerte eingestellt sind, d.h. die anpassbaren Parameter, sind auf die folgenden Werte eingestellt: Überlappungsbereich=l, überlappungsfraktion=0,125, Wortschwelle (T)=11 und Treffermatrix= BLOSUM62. Wenn WU-BLAST-2 eingesetzt wird, wird ein Wert der % Identität der Aminosäuren bestimmt durch Teilung (a) der Anzahl der übereinstimmenden identischen Aminosäurereste zwischen der Aminosäuresequenz der interessierenden Domäne eines Immunglobulins, das eine Sequenz aufweist, die von der nativen Domäne des Immunglobulins abgeleitet ist, und der zu vergleichenden interessierenden Aminosäuresequenz (d.h. die Sequenz, mit der die interessierende Domäne des Immunglobulins verglichen wird, wobei es sich um die unveränderte Domäne des Immunglobulins handeln kann), wie mit WU-BLAST-2 bestimmt, 52 NACHGEfE: 1 φφ φφ • φ φ φ φ

• · · • φφφ · • · · durch (b) die gesamte Anzahl von Aminosäureresten der nicht-randomisierten Anteile der interessierenden Domäne des Immunglobulins. Beispielsweise ist in der Aussage "ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz X aufweist, die mindestens 80 % Identität der Aminosäuresequenz zu einer Aminosäuresequenz Y aufweist" die Aminosäuresequenz A die interessierende Vergleichsaminosäuresequenz, und die Aminosäuresequenz B ist die Aminosäuresequenz der interessierenden Domäne des Immunglobulins.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Immunglobulin ein bispezifischer Antikörper oder ein bispezifischer einzelkettiger Antikörper. Es wird ferner bevorzugt, dass das Immunglobulin eine bispezifische Domäne oder einen Teil davon inklusive einer Minidomäne umfasst.

Das erfindungsgemäße Immunglobulin kann für einen beliebigen im Stand der Technik für Immunglobuline bekannten Zweck verwendet werden, aber erlaubt auch Anwendungen, die von der Kombination der durch die vorliegende Erfindung eingeführten Spezifitäten abhängig sind. Demgemäß werden die erfindungsgemäßen Immunglobuline vorzugsweise zur therapeutischen und vorbeugenden Anwendung verwendet (z.B. als eine aktive oder passive Immuntherapie); zur präparativen und analytischen Anwendung und zur diagnostischen Anwendung.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit von Bindungspartnern, der enthält (a) ein verändertes Immunglobulin, das eine in eine oder mehrere Strukturschleifen eingebaute Antigenbindungsstelle aufweist, die dem Immunglobulin fremd ist, und 53

NACHGEREICHT • ·

·· ·· • · 0 • · • · · · ·· ·· ··· ·· (b) ein Bindungsmolekül, das ein Epitop des Antigens enthält.

Ein solches Bindungsmolekül des erfindungsgemäßen Kits kann zur Identifizierung der Bindungsspezifität des erfindungsgemäß veränderten Immunglobulins verwendet werden. Durch Verwendung des Bindungsmoleküls des erfindungsgemäßen Kits kann die Potenz des erfindungsgemäßen veränderten Immunglobulins bestimmt werden.

Die Potenz ist, wie hier definiert, die Bindungsfähigkeit des veränderten Moleküls der Erfindung an dessen Antigen.

Die Bindung kann quantitativ und/oder qualitativ bestimmt werden, hinsichtlich der Spezifität und/oder Affinität und/oder Avidität, wie für Zwecke der Qualitätsprüfung verwendet.

Ferner kann das Bindungsmolekül eines erfindungsgemäßen Kits zur Selektion des erfindungsgemäß veränderten Immunglobulins aus einer Bibliothek verwendet werden, die aus mindestens 10, vorzugsweise mindestens 100, besonders bevorzugt mindestens 1 000, besonders bevorzugt mindestens 10 000, insbesondere mindestens 100 000 Immunglobulinen mit unterschiedlichen Veränderungen in den Strukturschleifen besteht.

Erfindungsgemäß ist es eines der Schlüsselmerkmale der vorliegenden Erfindung, dass die Manipulation der Immunglobulindomäne in Bereichen stattfindet, die normalerweise nicht an der Antigenbindung beteiligt sind, mit anderen Worten, in anderen Bereichen als den CDRs eines Antikörpers. Es wurde beobachtet, dass die spezifische Faltung von Immunglobulindomänen die Einführung von zufälligen Mutationen in Bereiche erlaubt, die strukturell zu den CDRs analog sind, sich aber in der Position in Sequenz unterscheiden. Die durch die vorliegende Erfindung 54

NACHGEREICHT identifizierten Bereiche sind, wie CDRs, Schleifenregionen, welche die Beta-Stränge der Immunglobulinfalte verbinden.

Genauer wird hier beschrieben, dass durch Einführen von Zufallsmutationen in die die Betastränge verbindenden A-B und E-F einer humanen IgGl CH3 Domäne, veränderte CH3 Domänen ausgewählt werden, die spezifisch an entweder einen Toll-ähnlichen Rezeptor 9-Peptid (TLR-9) oder an Hühnereierlysozym binden, ein Peptid und ein Protein, die normalerweise durch humane CH3 Regionen des IgGl erkannt und gebunden werden.

Die Mutationen, die durch uns eingeführt wurden, beinhalten Mutationen bei denen ausgewählte Aminosäurereste in der Wildtypsequenz durch zufällig ausgewählte Reste ersetzt wurden, und die auch Insertionen von zusätzlichen Aminosäureresten in den oben erwähnten Schleifen beinhalten. In analoger Weise sind Domänen von Immunglobulinen aus jeder beliebigen Klasse von Immunglobulinen und von Immunglobulinen jeder beliebigen Species für diese Art von Manipulation zugänglich. Ferner können nicht nur die in den Beispielen der vorliegenden Erfindung angesteuerten spezifischen Schleifen manipuliert werden, sondern es kann jede beliebige Schleife, die Beta-Stränge in Domänen von Immunglobulinen verbindet, auf dieselbe Weise manipuliert werden.

Manipulierte Immunglobulindomänen aus jedem beliebigen Organismus und aus jeder beliebigen Immunglobulinklasse können erfindungsgemäß entweder als solche (als Einzeldomänen) oder als Teil eines größeren Moleküls verwendet werden. Beispielsweise können sie Teil eines intakten Immunglobulins sein, welches dementsprechend seine "normale", durch die 6 CDRs gebildete Antigenbindungsregion sowie die neue, manipulierte Antigenbindungsregion aufweist. Auf diese Weise könnte ein multispezifisches, z.B. bispezifisches Immunglobulin erzeugt werden. Die manipulierten Immunglobulindomänen können auch Teil eines

55 ···· ·· · · · • · · # ··· · · * · · ·· Γ' · # # • · · · · · · • ··· ·· ·· ·« ··· beliebigen Fusionsproteins sein. Die Verwendung dieser manipulierten Immunglobulindomänen liegt im allgemeinen Gebiet der Verwendung von Immunglobulinen.

Beispiel 1: Herstellung der CH3 Bibliothek und Phagenoberflächenpräsentation):

Die Kristallstruktur eines IgGl Fragments, das in der Brookhaven Datenbank als Eintrag 10Q0 publiziert wurde, wurde verwendet, um das Design der mutierten CH3 Domäne zu unterstützen.

Die Sequenz, die als Grundlage für die Konstruktion der CH3 Bibliothek verwendet wurde, ist in SEQ ID Nr. 1 gegeben. In dieser Sequenz, die erste Aminosäure entspricht Prolin 343 der A Kette des Brookhaven Datenbankeintrags loqo.pdb. Der letzte Rest enthalten in loqo.pdb ist Serin 102 der SEQ ID Nr. 1. Nach genauer Analyse der Struktur des loqo.pdb und durch visuelle Prüfung der Reste, die die Schleifen bilden, die die Betastränge miteinander verbinden, wurde entschieden, die Reste 17, 18 und 19, die Teil der den Betastrang A-B verbindenden Schleife sind, zu randomisieren, sowie 71, 72, 73, 76, and 77, die Teil der den Betastrang E-F der SEQ ID Nr. 1 verbindenden Schleife sind. Ein molekulares Modell der manipulierten CH3-Domäne mit dem randomisierten Teil gekennzeichnet durch eine Lösungsmittelzugängliche Oberfläche, ist in Figur 3 gezeigt. Das manipulierte Gen wurde durch eine Serie von PCR Reaktionen gefolgt von Ligationen der erhaltenen PCR Produkte hergestellt. Um die Ligation zu erleichtern, wurden einige Kodons der für die SEQ ID Nr. 1 kodierenden Nukleotidsequenz verändert, um Restriktionsschnittstellen ohne Veränderung der Aminosäuresequenzen (stille Mutationen) herzustellen. Für die Insertion in den Klonierungsvektor pHENl (Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11;19(15):4133-7. Proteine aus vielen Untereinheiten auf der Oberfläche von filamentösen Phagen: 56

NACHGEREICHT ·· • · • · • · • · ··

Für Verfahren für die Präsentation von leichten und schweren Ketten eines Antikörpers (Fab)Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G.), wurden "in frame" mit dem pelB Sekretionssignal zusätzliche Met-Ala kodierende Nukleotidreste an das 5'Ende der Sequenz angehängt, um eine Ncol Restriktionsschnittstelle herzustellen. Für die randomisierten Reste, wurden das Kodon NNS (IUPAC code, wobei mit S, C oder G gemeint ist) ausgewählt, das alle 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren kodiert aber 2 von 3 Stop-Kodons vermeidet. Die manipulierte Sequenz ist in SEQ ID Nr. 2 dargestellt und als Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 3. Der Buchstabe X in der SEQ ID Nr. 3 bezeichnet randomisierte Aminosäurereste. Die Sequenzen der für den Zusammenbau der mutierten CH3 verwendeten PCR Primer ist in SEQ ID Nr. 4 bis 9 dargestellt.

Figur 4 zeigt eine schematische Darstellung der PCR Fragmente welche für den Zusammenbau des mutierten Gens verwendet wurden, und die dafür verwendeten Primer.

Die cDNS der schweren Kette des humanen monoklonalen Antikörpers 3D6 (Felgenhauer M, Kohl J, Rüker F. Nucleotide sequences of the cDNAs encoding the V-regions of H- and L-chains of a human mono-clonal antibody specific to HIV-1-gp41. Nucleic Acids Res. 1990 Aug 25;18(16):4927.) wurde als Vorlage für die PCR Reaktionen verwendet. Die 3 PCR Produkte wurden mit SacI und/oder Hindlll verdaut und miteinander ligiert. Das Ligationsprodukt wurde weiter mit Ncol und Not I verdaut und in den Oberflächenpräsentationsphagemidvektor pHenl ligiert, der vorher mit Ncol und Not I verdaut worden war. Eine Anzahl von ausgewählten Klonen wurden durch Restriktionsanalyse und durch DNS Sequenzierung kontrolliert und es wurde gefunden, das sie das Insert wie geplant, inklusive der korrekt insertierten Zufallssequenzen enthalten. Für die folgenden Schritte der Phagenpräparation wurde Standardprotokollen gefolgt. Kurzgefasst, die 57 I naqhgereici-it |

Ligationsmischung wurde in E. coli TG1 Zellen durch Elek-troporation transformiert/ die Phagenpartikel daraufhin von den E. coli TG1 Zellen mit dem Helferphagen M13-K07 isoliert. Die Phagenpartikel wurden dann aus dem Kulturüberstand mit PEG/NaCl in 2 Schritten präzipitiert, in Wasser gelöst und für die Selektion durch Panning verwendet oder alternativ bei minus 80°C aufbewahrt.

Beispiel 2: Konstruktion der CH3+3 Bibliothek

Diese Bibliothek wurde auf dieselbe Weise konstruiert und kloniert wie die CH3 Bibliothek. Die Aminosäuresequenz des Konstrukts ist in der SEQ ID Nr. 10 gezeigt, die korrespondierende Nukleotidsequenz in der SEQ ID Nr. 11, und die für die Konstruktion verwendeten Primer werden in der SEQ ID Nr. 4-7, SEQ ID Nr. 9 und SEQ ID Nr. 12 gezeigt.

Beispiel 3: Konstruktion der CH3+5 Bibliothek

Diese Bibliothek wurde auf dieselbe Weise konstruiert und kloniert wie die CH3 Bibliothek. Die Aminosäuresequenz des Konstrukts ist in der SEQ ID Nr. 13 gezeigt, die korrespondierende Nukleotidsequenz in der SEQ ID Nr. 14, und die für die Konstruktion verwendeten Primer werden in der SEQ ID Nr. 4-7, SEQ ID Nr. 9 und SEQ ID Nr. 15 gezeigt.

Beispiel 4; Konstruktion einer CHI Bibliothek

In der humanen IgGl CHI Bibliothek werden Ser93, Ser94, Ser95, Gly98, Thr99 und GlnlOO randomisiert und 3 Randomisierungsreste zusätzlich durch gerichtete Zufallsmutagenese insertiert. Leu96 wurde nicht mutiert. In einer anderen humanen IgGl CHI Bibliothek wurden Pro92, Ser93, Ser94, Ser95 Leu96 ThrlOl, Gly98, Thr99 und GlnlOO randomisiert und 3 Randomisierungsreste zusätzlich durch gerichtete Zufallsmutagenese insertiert. Die für die 58

NACHGEREICHT

• · ·· • · · • · * • · ·

Bibliotheken kodierenden Gene wurden „in frame" mit dem pelB Leader am N-Terminus und „in frame" mit dem Protein III des fd Phagen am C-Terminus kloniert, wobei die Restriktionsstellen Ncol und Notl des Phagemidvektors pHENl verwendet wurden.

Die Präparation der Phagenpartikel, Panning und Selektion der spezifisch bindenden Klone wurde gemäß Standardverfahren durchgeführt.

Bibliothekssequenz:

Nukleotidsequenz der ersten CHI Bibliothek:

1 GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCACCCT CCTCCAAGAG CACCTCTGGG GGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC

101 CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA GGACTCTACT CCCTCAGCAG

201 CGTGGTGACC GTGCCCNNSN NSNNSTTGNN SKNSMHSNMS NNSNNSACCT ACATCTGCAA CGTGAATCAC AAGCCCAGCA ACACCAAGGT GGACAAGAAA

301 GTTOAGCCCA AATCTGCGGC CGCA

Aridnosäuresequenz dder ersten CHI Bibliothek

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV

VTVPXXXLXXXXXXTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSAAA

Nukleotidsequenz der zweiten CHI Bibliothek:

1 GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCACCCT CCTCCAAGAG CACCTCTGGG GGCACAGCAG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC 101 CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT GCAGTCCTCA GGACTCTACT CCCTCAGCAG 201 CGTGGTGACC GTGNNflNNSN NSNNSNNSNH SNN8NNSNHS NNSNNSNN8T ACATCTGCAA CGTGAATCAC AAGCCCAGCA ACACCAAGGT GGACAAGAAA 301 GTTGAGCCCA AATCTGCGGC CGCT

Arainosäuresequenz nder zweiten CHI Bibliothek

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVXSCXXXXXXXXXXYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSAAA

Beispiel 4: Konstruktion einer CL Bibliothek

In der humanen IgGl CL Bibliothek werden Ser92, Lys93,

Ala94, Asp95, Glu97, Lys98 und His99 randomisiert und 3 Randomisierungsreste zusätzlich durch gerichtete Zufallsmutagenese zwischen Serl6 und Glyl7 insertiert. Die für die Bibliotheken kodierenden Gene wurden „in frame" mit dem pelB Leader am N-Terminus und „in frame" mit dem Protein III des fd Phagen am C-Terminus kloniert, wobei die Restriktionsstellen Ncol und Notl des Phagemidvektors pHENl verwendet wurden.

I NACHGEREICHT 59

Die Präparation der Phagenpartikel, Panning und Selektion der spezifisch bindenden Klone wurde gemäß Standardverfahren durchgeführt.

Nukleotidseuenz der CL Bibliothek

1 GTGGCTGCAC CATCTGTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTNNSNNS NNSGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT

101 ATCCCAGAGA GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA

201 CAGCCTCAGG TCGACCCTGA CGCTGNNSKN SNNSNNSTAC NNSNNSNNSA AAGTCTACGC CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA

301 AAGAGCTTCA ACAGGGGAGA G

Aminosäuresequenz der CL Bibliothek

VAAPSVPIFPPSDEQLKSXXXGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGHSQESVTEQDSKDSTYSLRSTLTLXXXXYXXXKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE

Beispiel 5: Panning der CH3-Phagenbibliothek auf RplO-L Peptid 3 Panningrunden wurden durchgeführt. Maleimid aktivierte Platten (Pierce) wurden mit einem synthetischen Peptid RplO-L beschichte, welches ein B-Zell Mimotop des molekularen Markers CD20 darstellt (Perosa et al. Ann N Y Acad Sei. (2005) 51:672-83). Seine abgeleitete Aminosäuresequenz lautet wie folgt: ITPWPHWLERSS. 200 μΐ der folgenden Lösung wurden pro Vertiefung zugegeben: PBS, pH=7.2, mit den folgenden Konzentrationen des gelösten Peptids lte Panningrunde: 100 pg/ml - 2te Panningrunde: 100 pg/ml - 3te Panningrunde: 50 pg/ml.

Die Inkubation erfolgt über Nacht bei 4°C, gefolgt von einer Blockierung mit 10 pg/ml Cystein-HCl in PBS, mit 200 μΐ pro Vertiefung für 2 h bei Raumtemperatur.

Der Oberflächenpräsentationsphagenbibliothek, die gleiche Konzentrationen an Phagen der Bibliotheken CH3, CH3+3, CH3+5, und CH3+7 enthält, wurde dann erlaubt, mit dem gebundenen Peptid zu reagieren, indem eine Phagensuspension und 2% BSA-PBS auf bis zu 200 μΐ zugegeben wurde, gefolgt

NACHGEREICHT 60 von Inkubation bei Raumtemperatur für 45 min unter Schütteln und 90 min ohne Schütteln.

Ungebundene Phagenpartikel wurden wie folgt weggewaschen:

- nach der 1. Panningrunde: 15x200 μΐ T-PBS, 5x200 μΐ T-PBS

- nach der 1. Panningrunde: 15x200 μΐ T-PBS, 10x200 μΐ T-PBS - nach der 1. Panningrunde: 20x200 μΐ T-PBS, 20x200 μΐ T-PBS.

Die Elution der gebundenen Partikel wurde durch Zugabe von 200 μΐ 0.1 M Glycin, pH=2.2 pro Vertiefung durchgeführt, und unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die Phagensuspension durch Zugabe von 60 μΐ 2M Tris-Base neutralisiert, gefolgt von der Infektion von E. coli TG1 Zellen durch Mischen von 10 ml exponentiell wachsender Kultur mit 0,5 ml eluierten Phagen und Inkubation für 30 min bei 37°C. Zuletzt werden die infizierten Bakterien auf TYE Medium mit 1% Glukose und 100 pg/ml Ampicillin plattiert und bei 30°C über Nacht inkubiert.

Ergebnisse des Pannings der CH3-Phagenbibliothek auf RplO-L Peptid

Phagentiter

Panningrunde Konzentration RplO-L Input (Phage/ml) Output (Phage/ml) 1. 100 pg/ml 2xl0l4 2xl010 2. 100 pg/ml 3xl0lv 3xl010 3. 50 pg/ml 6.02xl014 1.5xl010

Beispiel 6: Klonieren von ausgewählten Klonen für die lösliche Expression

Veränderte CH3 Domäne kodierende Sequenzen, die in den eluierten Phagenpartikeln enthalten waren, wurden chargenweise mit PCR amplifiziert. Nach Restriktion mit Ncol 61 I NACHGEREICHT 1 and NotI wurden sie in pNOTBAD (Invitrogen Vektor pBAD mit darauffolgend insertierter Not I Stelle) insertiert. Nach Transformation in E. coli E104 wurden die Zellen auf TYE Medium mit 1% Glukose und 100 pg/ml Ampicillin bei 30 °C selektiert. Lösliche Expression von ausgewählten Klonen und Screening 4x 96 ampicillinresistente Kolonnien wurden in 200 μΐ 2xYT Medium mit Ampicillin in Mikrotiterplatten auf einem Schüttler über nacht kultiviert. Sie wurden dann durch Zugabe von L-Arabinose bis zu einer Endkonzentration von 0,1% induziert. Nach einer weitern Inkubation über Nacht wurden die Zellen durch 15 min Zentrifugieren bei 2000 rpm bei Raumtemperatur gesammelt und ihre periplasmatischen Proteine durch Resuspendieren in 100 μΐ Na-boratpuffer (160 mM Na-borat, 200 mM NaCl, pH=8.0) und Inkubieren für mindestens 6 Stunden freigesetzt. Für das Screenen wurden 4 Maleimidplatten mit 100 μg/ml Lösung von 50 μg/ml Peptid RplO-L, gelöst in PBS, pH=7.2, über Nacht bei 4°C gelöst. Die Platten wurden danach mit 10 pg/ml Cystein-HCl in PBS, mit 200 μΐ pro Vertiefung für 2 h bei Raumtemperatur blockiert.

Die freigesetzten periplasmatischen Proteine durften dann mit dem gebundenen Peptid reagieren, indem 50 μΐ Lysat und 50 μΐ 2% BSA-PBS zugegeben wurde, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur.

Die Bindung des his-tagged Proteins wurde durch 90-minütige Inkubation mit 100 μΐ Antikörperlösung pro Vertiefung gegen tetra-his (QIAgen), 1:1000 in 1% BSA-PBS verdünnt und eine 90-minütige Inkubation mit 100 μΐ Ziege anti-Maus Antikörpern, markiert mit HRP (Sigma), 1:1000 in 1%BSA-PBS verdünnt, durchgeführt. Signale wurden nach Zugabe des 62

NACHGEREICHT

Substrats (3 mg/ml) in Na-Citrat/Phosphatpuffer, pH=4.5, und 0.4 μΐ/ml H202 beobachtet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μΐ 1,25M H2SC>4 gestoppt.

Ergebnisse des Screenings auf Bindung von RplO-L auf ein einzelnes Vertiefung pro Klon

Klon A21 A57 B63 B78 C50 C55 D5 D37 D39 D80 D83 D91 Ä492/620 0.395 0.039 0.063 0.075 0.190 0.045 0.644 0.071 0.448 0.077 0.426 0.142

Hintecgrundr«aktion

Platte A492/620 A 0.027 B 0.035 C 0.037 D 0.035

Klone die ein positives Signal zeigten, wurden über Nacht in 20ml 2xYT mit Ampicillin, bei 30°C kultiviert. Dann wurden sie 1:20 in frisches Medium inokuliert, und nach 3 h bei 30°C mit einer Endkonzentration von 0.1% L-Arabinose induziert und durften die rekombinante CH3-Domäne über Nacht bei 16°C exprimieren. Das Periplasma der exprimierenden Zellen wurde dann in 1 ml Na-Boratpuffer, pH=8.0 für mindestens 6 h lysiert. Periplasmatisches Extrakt durfte mit RplO-L Peptid reagieren und die Bindung wurde exakt wie oben beschrieben ermittelt.

Ergebnisse des Screenings auf Bindung an RplO-L

NACHGEREIC! ST

Klon A21 A57 B63 B78 C50 C55 D5 D37 D39 D80 D83 D91 ΚρΙΟ- Ι pg/ml 0.265 0.006 0.006 0.005 0.803 0.006 0.035 0.006 0.469 0.004 0.088 0.009 0.81 0.362 0.005 0.007 0.006 1.202 0.008 0.052 0.008 0.660 0.007 0.106 0.009 1.63 0.383 0.006 0.007 0.006 1.308 0.014 0.050 0.014 0.719 0.008 0.129 0.005 3.13 0.352 0.008 0.010 0.005 1.453 0.006 0.060 0.006 0.719 0.008 0.210 0.006 6.25 0.343 0.005 0.008 0.006 1.516 0.007 0.057 0.007 0.694 0.006 0.114 0.008 12.5 0.315 0.007 0.009 0.006 1.495 0.007 0.064 0.007 0.770 0.007 0.130 0.009 25.0 0.335 0.008 0.010 0.008 1.603 0.009 0.063 0.009 0.868 0.008 0.120 0.007 50.0 0.398 0.009 0.011 0.009 1.632 0.009 0.070 0.009 0.765 0.008 0.125 0.008

Klonierung von ausgewählten Klonen für die lösliche Expression in pET27b

Veränderte CH3 Domäne kodierende Sequenzen, die in Klonen enthalten waren, die ein wesentliches Bindungssignalan RplO-L produzierten , wurden mit PCR amplifiziert. Nach Schneiden mit Ncol und NotI wurden sie in pET27b (Novagen) insertiert. Nach Transformation in E. coli BL21 (DE3) wurden die transformierten Zellen auf TYE Medium mit 1% Glukose und 50 pg/ml Kanamycin bei 30°C selektiert.

Klone die ein positives Signal zeigten, wurden in 20 ml M9ZB Medium mit 2% Glukose und Kanamycin, mit 30°C über Nacht kultiviert. Dann wurden sie 1:20 in frischem Medium inokuliert, und nach 3 h bei 30 °C wurden sie mit Medium enthaltend 1% Glycerin anstelle von Glukose, Kanamycin und ImM IPTG induziert, und durften die rekombinante CH3-Domäne über Nacht bei 16°C exprimieren. Das Periplasma der exprimierenden Zellen wurde dann in 1 ml Na-Boratpuffer, pH=8.0 für mindestens 6 h lysiert. Periplasmatisches Extrakt wurde auf die Anwesenheit von rekombinantem Protein durch Westernblotting analysiert und mit anti-Tetra-his Antikörpern (QIAgen) detektiert.

Nuklotidsequenzen und abgeleitete Proteinsequenzen der CD-20 bindenden Klone

NACHGEREICHT

Klon 1. Gruppe 2. Gruppe 3. Gruppe Quell bibliothek A21 VDG PWGPRD WP CH3+3 C50 * LTH ALCRWF VQ CH3+3 D5 ALR FCGGW GL CH3+3 D39 GWW QQKPFA TD CH3+3 64 I D83_|äPP_I DLVHVA_[MV_[CH3+3_| * eine Insertion von 2 Nukleotiden in der 2. Gruppe der mutierten Reste führt zur Insertion von G zwischen sonst konstanten Resten R und W, trennend die 2. und 3. Gruppe der mutierten Reste.

Proteinsequenz des CD20 spezifischen Klons D83 der CH3+3 Bibliothek (IMGT Nummerierung) 15-17 92-94

MAPREPQVYTLPPSRDELAPPQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV

DLV 97-98

HVARWMVGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAAA

Analyse der Bindung von auf Zellen exprimier-tem CD-20 unter Verwendung von FACS

Ungefähr 101 2 3 Daudi Zellen wurden mit PBS (800 rpm, 5 min, Raumtemperatur) gewaschen und die rekombinante CH3 Domäne in 1%BSA-PBS durfte für 2h auf Eis binden. Die Zellen wurden wieder mit PBS gewaschen und durften mit 2 pg/ml Anti-penta His-Alexa fluor 488 Antikörper (QIAgen), verdünnt in 1% BSA-PBS, für 30 min auf Eis binden. Nach dem Waschen wurden die Zellen in FACS analysiert. Unmarkierte Zellen, Wildtyp CH3 Domäne und Zelllinie K562 wurden als Kontrollen verwendet. Das Ergebnis wird in Figur 1 gezeigt.

Beispiel 7: Isolierung von an CD20 Antigen bindenden CHI-Mutantenproteinen 65

NACHGEREICHT 1

Panningrunden wurden durchgeführt. Maleimid-aktivierte 2

Platten (Pierce) wurden mit einem synthetischen Peptid beschichtet, das ein Mimotop des molekularen B-Zellmarkers 3 CD20 darstellt. 200 μΐ der folgenden Lösung wurde pro

Vertiefung zugegeben: PBS, pH 7,2 mit folgenden Konzentrationen an gelöstem Peptid: - 1. Panningrunde: 100 pg/ml - 2. Panningrunde: 100 pg/ml - 3. Panningrunde: 50 pg/ml.

Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 4°C, gefolgt vom Blocken mit 10 pg/ml Cystein-HCl in PBS, mit 200 μΐ pro Vertiefung für 2 h bei Raumtemperatur.

Die Phagenoberflächenpräsentationsbibliothek, die die mutierte CHI Domäne präsentiert, durfte dann mit dem gebundenen Peptid reagieren indem Phagensuspension und bis zu 200 μΐ 2% BSA-PBS zugegeben wurde, gefolgt von 45 min Inkubation unter Schütteln und 90 min ohne Schütteln bei Raumtemperatur.

Ungebundene Phagenpartikel wurden wie folgt weggewaschen;

- nach der 1. Panningrunde: 10x200 μΐ T-PBS, 5x200 μΐ T-PBS

- nach der 1. Panningrunde: 15x200 μΐ T-PBS, 10x200 μΐ T-PBS - nach der 1. Panningrunde: 20x200 μΐ T-PBS, 20x200 μΐ T-PBS.

Die Elution der gebundenen Partikel wurde durch Zugabe von 200 μΐ 0.1 M glycine, pH=2.2 pro Vertiefung durchgeführt, und die Inkubation erfolgte unter 30 min Schütteln bei Raumtemperatur. Danach wurde die Phagensuspension durch Zugabe von 60 μΐ 2M Tris-Base neutralisiert, gefolgt von einer Infektion von E. coli TG1 Zellen durch Mischen von 10 ml exponentiell wachsender Kultur mit 0.5 ml eluiertem Phagen und 30 min Inkubation bei 37°C. Zuletzt wurden die infizierten Bakterien auf TYE Medium mit 1% Glukose und 100 pg/ml Ampicillin plattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. 1 NACHGEREICHT |

Ergebnisse der Pannings der CHI-Phagenbibliothek auf RplO-L Peptid

Phagentiter

Panning runde Konzentration RplO-L Input (Phage/ml) Output (Phage/ml) 1. 100 μg/ml 5.6xl013 1.6xl0lu 2. 100 μg/ml 4.04xl014 8.55xlOö 3. 50 μg/ml 3.53xl014 1.19xl0lz

Klonieren der ausgewählten Klone für die lösliche Expression

Veränderte CHI Domäne kodierende Sequenzen, die in eluierten Phagenpartikeln enthalten waren, wurden mit PCR amplifiziert. Nach Schneiden mit Ncol und NotI wurden sie in pNOTBAD (Invitrogen Vektor pBAD mit anschließend insertierter Notl Stelle) insertiert. Nach Transformation in E. coli E 104) wurden die transformierten Zellen auf TYE Medium mit 1% Glukose und 100 pg/ml Ampicillin bei 30°C selektiert. Lösliche Expression von ausgewählten Klonen und Screening 4x 96 ampicillinresistente Kolonnien wurden in 200 μΐ 2xYT Medium mit Ampicillin in Mikrotiterplatten auf einem Schüttler über Nacht bei 30°C kultiviert. Sie wurden dann durch Zugabe von L-Arabinose bis zu einer Endkonzentration von 0,1% induziert. Nach einer weiteren Inkubation über Nacht wurden die Zellen durch 15 min Zentrifugieren bei 2000 rpm bei Raumtemperatur gesammelt und ihre periplasmatischen Proteine durch Resuspendieren in 100 μΐ Na-boratpuffer (160 mM Na-borat, 200 mM NaCl, pH=8.0) und Inkubieren für mindestens 6 Stunden freigesetzt. nachgereicht ] 67 Für das Screenen wurden 4 Maleimidplatten mit 100 pg/ml Lösung von 50 pg/ml Peptid RplO-L, gelöst in PBS, pH=7.2, über Nacht bei 4°C gelöst. Die Platten wurden danach mit 10 pg/ml Cystein-HCl in PBS, mit 200 μΐ pro Vertiefung für 2 h bei Raumtemperatur blockiert.

Die freigesetzten periplasmatischen Proteine durften dann mit dem gebundenen Peptid reagieren, indem 50 μΐ Lysat und 50 μΐ 2% BSA-PBS zugegeben wurde, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur.

Die Bindung des his-tagged Proteins wurde durch 90-minütige Inkubation mit 100 μΐ Antikörperlösung pro Vertiefung gegen tetra-his (QIAgen), 1:1000 in 1% BSA-PBS verdünnt und eine 90-minütige Inkubation mit 100 μΐ Ziege-anti-Maus Antikörpern, markiert mit HRP (Sigma), 1:1000 in 1%BSA-PBS verdünnt. Signale wurden nach Zugabe des Substrats OPD(3 mg/ml) in Na-Citrat/Phosphatpuffer, pH=4.5, und 0.4 μΐ/ml H2C>2 beobachtet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μΐ 1.25 M H2SO4 gestoppt.

Ergebnisse des Screenings auf Bindung des RplO-L an eine einzelne Vertiefung pro Klon

Klon Al 3 A79 A96 B6 B17 B19 B21 B23 A4 92/620 0.027 0.353 0.023 0.038 0.036 0.037 0.032 0.035 clone C14 C45 C49 C68 C79 C81 D36 D82 A492/620 0.025 0.021 0.044 0.025 0.051 0.021 0.027 0.086

Hintergrundreaktion

Platte A492/620 A 0.008 B 0.012 C 0.015 D 0.015

Klone die ein positives Signal zeigten, wurden in 20 ml 2xYT Medium mit Ampicillin, bei 30°C über Nacht kultiviert. Dann 68

NACHGEREICHT wurden sie 1:20 in frischem Medium inokuliert, und nach 3 h bei 30 °C wurden sie mit einer Endkonzentration von L-Arabinose induziert und durften die rekombinante CHl-Domäne über Nacht bei 16°C exprimieren. Das Periplasma der exprimierenden Zellen wurde dann in 1 ml Na-Boratpuffer, pH=8.0 für mindestens 6 h lysiert. Periplasmatisches Extrakt durfte mit RplO-L Peptid reagieren, die Bindung wurde genau wie oben beschrieben ermittelt.

Ergebnisse des Screenings auf Bindung von RplO-L

Klon + - Klon + - Al 3 -0.002 -0.006 C14 0.015 0.017 A79 0.004 0.001 C45 0.004 0.001 A96 0.010 0.006 C49 0.005 -0.001 B6 0.004 0.001 C68 0.003 0.001 B17 0.002 0.007 C79 0.005 0.002 B19 -0.002 0.007 C81 0.004 0.002 B21 0.002 0.001 D36 0.029 0.019 B23 0.055 0.020 D62 0.137 0.126

Klonierung von ausgewählten Klonen für die lösliche Expression in pET27b

Veränderte CHI Domäne kodierende Sequenzen, die in eluierten Klonen enthalten waren, die ein signfikantes Signal im Hinblick auf Bindung an RplO-L produzierten, wurden mit PCR amplifiziert. Nach Schneiden mit Ncol und NotI wurden sie in pET27b (Novagen) insertiert. Nach Transformation in E. coli BL21 (DE3) wurden die transformierten Zellen auf TYE Medium mit 1% Glukose und 50 pg/ml Kanamycin bei 30°C selektiert.

Klone die ein positives Signal zeigten, wurden in 20 ml M9ZB Medium mit 2% Glukose und Kanamycin, bei 30°C über Nacht kultiviert. Dann wurden sie 1:20 in frischem Medium inokuliert, und nach 3 h bei 30°C wurden sie mit Medium enthaltend 1% Glycerin anstelle von Glukose, Kanamycin und ImM IPTG induziert, und durften die rekombinante CHl-Domäne 69

NACHGEREICHT über Nacht bei 16°C exprimieren. Das Periplasma der exprimierenden Zellen wurde dann in 1 ml Na-Boratpuffer, pH=8.0 für mindestens 6 h lysiert. Periplasmatisches Extrakt wurde auf die Anwesenheit von rekombinantem Protein durch Westernblotting analysiert und mit anti-Tetra-his Antikörpern (QIAgen) detektiert.

Sequenz des CD20 spezifischen CHI SMID, Klon C45 LOCUS C45 324 bp dS-DNA SYN 4-JUL-2006 1 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 61 ggcacagcag ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 121 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct gcagtcctca 181 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtggcccctc tgggtgttgg tgggcatctc 241 gtcctgcact acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 301 gttgagccca aatctgcggc cgct // ENTRY C45 5 10 15 20 25 30

1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK 31 DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS 61 GLYSLSSVVTVAPLGVGGHLVLHYICNVNH 91 KPSNTKVDKKVEPKSAAA

Analyse der Bindung des auf Zellen exprimierten CD-20 unter Verwendung von FACS

Ungefähr 105 Daudi Zellen wurden mit PBS (800 rpm, 5 min, Raumtemperatur) gewaschen und die rekombinante CH3 Domäne in 1%BSA-PBS durfte für 2h auf Eis binden. Die Zellen wurden wieder mit PBS gewaschen und durften mit 2 pg/ml Anti-penta His-Alexa fluor 488 Antikörper (QIAgen), verdünnt in 1% BSA-PBS, für 30 min auf Eis binden. Nach dem Waschen wurden die Zellen in FACS analysiert. Unmarkierte Zellen, Wildtyp CHI Domäne und Zelllinie K562 wurden als Kontrollen verwendet.

Das Ergebnis wird in Figur 2 gezeigt.

Beispiel 8: Isolierung von an CD20 Antigen bindenden CL-Mutantenproteinen

NACHGEREICHT 70 3 Panningrunden wurden durchgeführt. Maleimid-aktivierte Platten (Pierce) wurden mit einem synthetischen Peptid beschichtet, das ein Mimotop des molekularen B-Zellmarkers CD20 darstellt. 200 μΐ der folgenden Lösung wurde pro Vertiefung zugegeben: PBS, pH=7.2, mit folgenden Konzentrationen an gelöstem Peptid: - 1. Panningrunde: 100 pg/ml - 2. Panningrunde: 100 μg/ml - 3. Panningrunde: 50 μg/ml.

Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 4°C, gefolgt vom Blocken mit 10 μg/ml Cystein-HCl in PBS, mit 200 μΐ pro Vertiefung für 2 h bei Raumtemperatur.

Die Phagenoberflächenpräsentationsbibliothek, die die mutierte CL Domäne präsentiert, durfte dann mit dem gebundenen Peptid reagieren, indem Phagensuspension und bis zu 200 μΐ 2% BSA-PBS zugegeben wurde, gefolgt von 45 min Inkubation unter Schütteln und 90 min ohne Schütteln bei Raumtemperatur.

Ungebundene Phagenpartikel wurden wie folgt weggewaschen;

- nach der 1. Panningrunde: 10x200 μΐ T-PBS, 5x200 μΐ T-PBS

- nach der 1. Panningrunde: 15x200 μΐ T-PBS, 10x200 μΐ T-PBS - nach der 1. Panningrunde: 20x200 μΐ T-PBS, 20x200 μΐ T-PBS.

Die Elution der gebundenen Partikel wurde durch Zugabe von 200 μΐ 0.1 M glycine, pH=2.2 pro Vertiefung durchgeführt, und die Inkubation erfolgte unter 30 min Schütteln bei Raumtemperatur. Danach wurde die Phagensuspension durch Zugabe von 60 μΐ 2M Tris-Base neutralisiert, gefolgt von einer Infektion von E. coli TG1 Zellen durch Mischen von 10 ml exponentiell wachsender Kultur mit 0.5 ml eluiertem Phagen und 30 min Inkubation bei 37°C. Zuletzt wurden die 71

NACHGEREICHT infizierten Bakterien auf TYE Medium mit 1% Glukose und 100 pg/ml Ampicillin plattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert.

Ergebnisse des Pannings der CL-Phagenbibliothek auf RplO-L Peptid

Phagentiter

Panning runde Konzentration RplO-L Input (Phage/ml) Output (Phage/ml) 1. 100 μg/ml 2.8xl0i;i 3.6xl07 2. 100 μg/ml 4.29x10“ 6.88xlOs 3. 50 μg/ml lxlO“ 6.54x10“

Klonieren der ausgewählten Klone für die lösliche Expression

Veränderte CL Domäne kodierende Sequenzen, die in eluierten Phagenpartikeln enthalten waren, wurden chargenweise mit PCR amplifiziert. Nach Schneiden mit Ncol und NotI wurden sie in pNOTBAD (Invitrogen Vektor pBAD mit anschließend insertierter Notl Stelle) insertiert. Nach Transformation in E. coli E 104) wurden die Zellen auf TYE Medium mit 1% Glukose und 100 pg/ml Ampicillin bei 30°C selektiert. Lösliche Expression von ausgewählten Klonen und Screening 4x 96 ampicillinresistente Kolonnien wurden in 200 μΐ 2xYT Medium mit Ampicillin in Mikrotiterplatten auf einem Schüttler über Nacht bei 30°C kultiviert. Sie wurden dann durch Zugabe von L-Arabinose bis zu einer Endkonzentration von 0,1% induziert. Nach einer weiteren Inkubation über Nacht wurden die Zellen durch 15 min zentrifugieren bei 2000 rpm bei Raumtemperatur gesammelt und ihre periplasmatischen Proteine durch Resuspendieren in 100 μΐ Na-boratpuffer (160 72 j NACHGEREiC; ;r j

··*·#· · · · ♦ • · · e ··· · * · • · « · · t ··♦ ♦ • ···«♦ · · mM Na-borat, 200 mM NaCl, pH=8.0) und Inkubieren für mindestens 6 Stunden freigesetzt. Für das Screenen wurden 4 Maleimidplatten mit 100 pg/ml Lösung von 50 pg/ml Peptid RplO-L, gelöst in PBS, pH=7.2, über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Platten wurden danach mit 10 pg/ml Cystein-HCl in PBS, mit 200 μΐ pro Vertiefung für 2 h bei Raumtemperatur blockiert.

Das freigesetzte periplasmatische Protein durfte dann mit dem gebundenen Peptid reagieren, indem 50 μΐ Lysat und 50 μΐ 2% BSA-PBS zugegeben wurde, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur.

Die Bindung des his-tagged Proteins wurde durch 90-minütige Inkubation mit 100 μΐ Antikörperlösung pro Vertiefung gegen tetra-his (QIAgen), 1:1000 in 1% BSA-PBS verdünnt und eine 90-minütige Inkubation mit 100 μΐ Ziege-anti-Maus Antikörpern, markiert mit HRP (Sigma), 1:1000 in 1%BSA-PBS verdünnt. Signale wurden nach Zugabe des Substrats OPD (3 mg/ml) in Na-Citrat/Phosphatpuffer, pH=4.5, und 0.4 μΐ/ml H2O2 beobachtet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μΐ 1.25 M H2SO4 gestoppt.

Ergebnisse des Screenings auf Bindung des PplO-L an eine einzelne Vertiefung pro Klon

Klon A2 A51 A57 A64 B21 B23 B44 B92 A492/6 20 0.048 0.083 0.035 0.032 0.037 0.036 0.041 0.154 clone C18 C19 C28 C56 C76 D2 D51 D82 A492/6 20 0.153 0.033 0.042 0.062 0.030 0.016 0.033 0.046 73

NACHGEREICHT • · · · ·· » • · · · • · · · • I · · • ·· • ·· ·· • · · e ♦ ·· • · • • · ··· · • e · e ·

Hintergrundreaktion

Plate A492/620 A 0.016 B 0.016 c 0.012 D 0.014

Klone die ein positives Signal zeigten, wurden über Nacht in 20ml 2xYT mit Ampicillin, bei 30°C kultiviert. Dann wurden sie 1:20 in frisches Medium inokuliert, und nach 3 h bei 30°C mit einer Endkonzentration von 0.1% L-Arabinose induziert und durften die rekombinante CL-Domäne über Nacht bei 16°C exprimieren. Das Periplasma der exprimierenden Zellen wurde dann in 1 ml Na-Boratpuffer, pH=8.0 für mindestens 6 h lysiert. Periplasmatisches Extrakt durfte mit RplO-L Peptid reagieren und die Bindung wurde exakt wie oben beschrieben ermittelt.

Ergebnisse des Screenings auf Bindung des RplO-L

Klon + - Klon + — A2 0.002 0.001 C18 0.025 0.041 A57 0.006 0.004 C19 0.006 0.003 A62 0.016 0.005 C28 0.010 0.003 A64 0.006 0.006 C56 0.026 0.010 B21 0.005 -0.002 C76 0.075 0.034 B23 0.004 0.004 D2 0.003 0.002 B44 0.007 0.002 D82 0.007 -0.007 B92 0.038 0.017

Klonierung von ausgewählten Klonen für die lösliche Esqpression in pET27b

NACHGEREIC: !T 74

Veränderte CL Domäne kodierende Sequenzen, die in eluierten Klonen enthalten waren, die ein signfikantes Signal im Hinblick auf Bindung an RplO-L produzierten, wurden mit PCR amplifiziert. Nach Schneiden mit Ncol und Notl wurden sie in pET27b (Novagen) insertiert. Nach Transformation in E. coli BL21 (DE3) wurden die transformierten Zellen auf TYE Medium mit 1% Glukose und 50 pg/ml Kanamycin bei 30°C selektiert.

Klone die ein positives Signal zeigten, wurden in 20 ml M9ZB Medium mit 2% Glukose und Kanamycin, bei 30°C über Nacht kultiviert. Dann wurden sie 1:20 in frischem Medium inokuliert, und nach 3 h bei 30°C wurden sie mit Medium enthaltend 1% Glycerin anstelle von Glukose, Kanamycin und ImM IPTG induziert, und durften die rekombinante CL-Domäne über Nacht bei 16°C exprimieren. Das Periplasma der exprimierenden Zellen wurde dann in 1 ml Na-Boratpuffer, pH=8.0 für mindestens 6 h lysiert. Periplasmatisches Extrakt wurde auf die Anwesenheit von rekombinantem Protein durch Westernblotting analysiert und mit anti-Tetra-his Antikörpern (QIAgen) detektiert.

NACHGEREICHT

Claims (19)

1. Ansprüche: 1. Ein multivalentes Immunglobulin oder ein Teil davon, das spezifisch an mindestens zwei Zelloberflächenmoleküle einer einzelnen Zelle bindet, mit mindestens einer Veränderung in mindestens einer Strukurschleifenregion des Immunglobulins, das die Bindung an ein Epitop des Zelloberflächenmoleküls festlegt, wobei das unveränderte Immunglobulin im wesentlichen nicht an das Epitop bindet.
2. 2. Immunglobulin nach Anspruch 1 wobei die veränderte Strukturschleifenregion innerhalb der konstanten Domäne des Immunglobulins liegt, bevorzugt innerhalb von CHI, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C oder einem Teil davon.
3. 3. Immunglobulin nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet dass die veränderte Strukturschleifenregion mindestens 6 Aminosäureänderungen enthält.
4. 4. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet dass die veränderten Schleifenregionen eines CHI, eines CH2, eines CH3 oder eines CH4 humanen oder murinen Ursprungs mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 7 bis 21, Aminosäuren 25 bis 39, Aminosäuren 41 bis 81, Aminosäuren 83 bis 85, Aminosäuren 89 bis 103 oder Aminosäuren 106 bis 117 enthalten.
5. 5. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet dass die Schlaufenregionen von Igk-C oder Igl-C humanen Ursprungs mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 8 bis 18, Aminosäuren 27 bis 35, Aminosäuren 42 bis 78, Aminosäuren 83 bis 85, Ami nosäuren 92 bis 100, Aminosäuren 108 bis 117 oder Aminosäuren 123 bis 126 enthalten. 76 | NACHGEREICHT ······· · · · ♦ • · · · m ··· · · · • · · · · · « ··* # ·· · · · · · · ·
6. 6. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet dass die Schleifenregionen von Igk-C oder Igl-C murinen Ursprungs mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 8 bis 20, Aminosäuren 26 bis 36, Aminosäuren 43 bis 79, Aminosäuren 83 bis 85, Aminosäuren 90 bis 101, Aminosäuren 108 bis 116 oder Aminosäuren 122 bis 125 enthalten.
7. 7. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet dass die konstante Domäne des Immunglobulins vom Kamel stammt.
8. 8. Immunglobulin nach Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet dass das Immunglobulin mindestens eine veränderte konstante Domäne enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CHI, CH2 und CH3.
9. 9. Immunglobulin nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet dass die veränderten Schleifenregionen eines CHI, eines CH2 und/oder eines CH3 mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 8 bis 20, Aminosäuren 24 bis 39, Aminosäuren 42 bis 78, Aminosäuren 82 bis 85, Aminosäuren 91 bis 103 oder Aminosäuren 108 bis 117 enthalten.
10. 10. Immunglobulin nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet dass die variable Domäne ausgewählt ist aus der Gruppe von VH, Vkappa, Vlambda, VHH und Kombinationen davon.
11. 11. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 10 dadurch gekennzeichnet dass die veränderten Schleifenregionen eines VH, Vkappa, Vlambda oder eines VHH mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 7 bis 21, Aminosäuren 25 bis 39, Aminosäuren 41 bis 81, Aminosäuren 83 bis 85, Aminosäuren 89 bis 103 oder Aminosäuren 106 bis 117 77 NACHGEREICHT ······· · · · · • · · · «··· · · · • · · · · · · ··· · enthalten, wobei die Nummerierung der Aminosäureposition der Domänen die des IMGT ist.
12. 12. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 10 dadurch gekennzeichnet dass die Schleifenregionen des VH or Vkappa oder Vlambda humanen Ursprungs mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 8 bis 20, Aminosäuren 44 bis 50, Aminosäuren 67 bis 76 und Aminosäuren 89 bis 101, insbesondere die Aminosäurepositionen 12 bis 17, Aminosäurepositionen 45 bis 50, Aminosäurepositionen 69 bis 75 und Aminosäurepositionen 93 bis 98 enthalten, wobei die Nummerierung der Aminosäureposition der Domänen die des IMGT ist.
13. 13. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 10 dadurch gekennzeichnet dass die Schleifenregionen des VH murinen Ursprungs mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 6 bis 20, Aminosäuren 44 bis 52, Aminosäuren 67 bis 76 und Aminosäuren 92 bis 101 enthalten, wobei die Nummerierung der Aminosäureposition der Domänen die des IMGT ist.
14. 14. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 10 dadurch gekennzeichnet dass die veränderten Schleifenregionen eines VHH vom Kamel mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 7 bis 18, Aminosäuren 43 bis 55, Aminosäuren 68 bis 75 und Aminosäuren 91 bis 101 enthalten, wobei die Nummerierung der Aminosäureposition der Domänen die des IMGT ist.
15. 15. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 10 dadurch gekennzeichnet dass das veränderte Immunglobulin weiters mit einem oder mehreren veränderten Immunglobulinen oder mit unveränderten Immunglobulinen oder Teilen davon kombiniert ist, um ein Kombinationsimmunglobulin zu erhalten. 78 I NACHGEREICHT
16. 16. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 15 dadurch gekennzeichnet dass die Veränderung eine Deletion, eine Substitution, eine Insertion oder eine Kombination davon ist.
17. 17. Nukleinsäure kodierend für ein Immunglobulin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 oder ein Teil davon.
18. 18. Verfahren zur Manipulation eines multivalenten Immunglobulins nach einem der Ansprüche 1 bis 16, welches die Schritte umfasst: - Bereitstellung einer Nukleinsäure, die für ein Immunglobulin kodiert, welche mindestens eine Strukturschleifenregion enthält, Veränderung mindestens eines Nukleotidrests der Strukturschleifenregionen, Übertragung der veränderten Nukleinsäure in ein Expressionssystem, Expression des multivalenten Immunglobulins, Kontaktierung des exprimierten multivalenten Immunglobulins mit einem Epitop, Bestimmung, ob das multivalente Immunglobulin an das Epitop bindet sowie

    19. Verwendung eines multivalenten Immunglobulins nach einem der Ansprüche 1 bis 16 für die Herstellung eines Medikaments. NACHGERE(CHT 79 1 • ··· • · Geschäftszahl 4A A 1147/2006 - 1, 2, 3, 4 IPC: C07K Anmeldedatum 5.7.2006 Antwort auf den 1. Vorbescheid vom 15.6.2007 Geänderte Ansprüche vom 10.8.2007: 1. Ein multivalentes Immunglobulin oder ein Teil davon, jnit einer Spezifität. .für mindestens zwei Zelloberflächenmoleküle einer ^Zelle geeignet zur Bindung der Zelloberflächenmoleküle in einem Zell—basierenden Testsystenu mit mindestens einer Veränderung in mindestens einer Strukurschleifenregion des Immunglobulins, das die Bindung an ein Epitop .eines Zelloberflächenmoleküls festlegt, wobei das unveränderte Immunglobulin in dieser St.rukturschleifenreqion im wesentlichen nicht an das Epitop bindet. f Gelöscht: das (Gewacht! einzelnen föetaaditi'i lbindet Gelöscht: des 2. Immunglobulin nach Anspruch 1, wobei die veränderte Strukturschleifenregion innerhalb der konstanten Domäne des Immunglobulins liegt, bevorzugt innerhalb von CHI, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C oder einem Teil davon. 3. Immunglobulin nach Anspruch 2,_ dadurch gekennzeichnet dass die veränderte Strukturschleifenregion mindestens 6 Aminosäureänderungen enthält. 4. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 3JL dadurch gekennzeichnet dass die veränderten Schleifenregionen eines CHI, eines CH2, eines CH3 oder eines CH4 humanen oder murinen Ursprungs mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 7 bis 21, Aminosäuren 25 bis 39, Aminosäuren 41 bis 81, Aminosäuren 83 bis 85, Aminosäuren 89 bis 103 oder Aminosäuren 106 bis 117 enthalten, wobei die Nummerierung der Aminosäureposition der Domänen die des IMGT ist. NACHGEREICHT 2 2 • · • · • · Gelöscht: Schlaufenregione n 5. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 3^ dadurch gekennzeichnet dass die jSchleifenreqionen von Igk-C oder Igl-C humanen Ursprungs mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 8 bis 18, Aminosäuren 27 bis 35, Aminosäuren 42 bis 78, Aminosäuren 83 bis 85, Aminosäuren 92 bis 100, Aminosäuren 108 bis 117 oder Aminosäuren 123 bis 126 enthalten, wobei die Nummerierung der Aminosäureposition die des IMGT ist. 6. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 3^ dadurch gekennzeichnet dass die Schleifenregionen von Igk-C oder Igl-C murinen Ursprungs mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 8 bis 20, Aminosäuren 26 bis 36, Aminosäuren 43 bis 79, Aminosäuren 83 bis 85, Aminosäuren 90 bis 101, Aminosäuren 108 bis 116 oder Aminosäuren 122 bis 125 enthalten,_wobei_ die Nummerierung der Aminosäureposition die des IMGT ist. 7. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 3^ dadurch gekennzeichnet dass die konstante Domäne des Immunglobulins vom Kamel stammt. 8. Immunglobulin nach Anspruch 7j_ dadurch gekennzeichnet dass das Immunglobulin mindestens eine veränderte konstante Domäne enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CHI, CH2 und CH3. 9. Immunglobulin nach Anspruch 8^ dadurch gekennzeichnet dass die veränderten Schleifenregionen eines CHI, eines CH2 und/oder eines CH3 mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 8 bis 20, Aminosäuren 24 bis 39, Aminosäuren 42 bis 78, Aminosäuren 82 bis 85, Aminosäuren 91 bis 103 oder Aminosäuren 108 bis 117 enthalten, wobei die Nummerierung der Aminosäureposition der Domänen die des IMGT ist. 3 • · • · Ο • ·♦· • · • · ι 10. Immunglobulin nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet dass die variable Domäne ausgewählt ist aus der Gruppe von VH, Vkappa, Vlambda, VHH und Kombinationen davon. i Gelöscht: oder eines VHH ] (Gelöscht: 7 bis 21 Gelöscht: 25 bis 39 Gelöscht: 41 bis 81 ..........wxni:i:Hii:uuRiiiiiiiei:ii.................. Gelöscht: 83 bis 85 Gelöscht: Aminosäuren 89 bis 103 oder Aminosäuren 106 bis 117 enthalten, (Gelöscht: o Gelöscht: 8 bis 20, Aminosäuren 44 bis 50, Aminosäuren 67 bis 76 und Aminosäuren 89 bis 101, insbesondere die Aminosäurepositionen 11. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 10^_ dadurch gekennzeichnet dass die veränderten Schleifenregionen eines VH, Vkappa, Vlambda mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren ß_ bis 20, Aminosäuren .4 4 bis 50, Aminosäuren T67 bis 76, Aminosäuren .89 bis 101, ^obei die Nummerierung der Aminosäureposition der Domänen die des IMGT ist. 12. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 11^_ dadurch gekennzeichnet dass die Schleifenregionen des VH or Vkappa oder Vlambda humanen Ursprungs mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren ^2 bis 17, Aminosäurepositionen 45 bis 50, Aminosäurepositionen 69 bis 75 und Aminosäurepositionen 93 bis 98 enthalten, wobei die Nummerierung der Aminosäureposition der Domänen die des IMGT ist. 13. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 10^ dadurch gekennzeichnet dass die Schleifenregionen des VH murinen Ursprungs mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 6 bis 20, Aminosäuren 44 bis 52, Aminosäuren 67 bis 76 und Aminosäuren 92 bis 101 enthalten, wobei die Nummerierung der Aminosäureposition der Domänen die des IMGT ist. 14. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 10^ dadurch gekennzeichnet dass die veränderten Schleifenregionen eines VHH vom Kamel mindestens eine Veränderung innerhalb der Aminosäuren 7 bis 18, Aminosäuren 43 bis 55, Aminosäuren 68 bis 75 und Aminosäuren 91 bis 101 enthalten, wobei die Nummerierung der Aminosäureposition der Domänen die des IMGT ist. jslACHGETC* 4 4 • · · • ··· » · · I • · · • · · 15. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 10^ dadurch gekennzeichnet dass das veränderte Immunglobulin weiters mit einem oder mehreren veränderten Immunglobulinen oder mit unveränderten Immunglobulinen oder Teilen davon kombiniert ist, um ein Kombinationsimmunglobulin zu erhalten. 16. Immunglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 15^ dadurch gekennzeichnet dass die Veränderung eine Deletion, eine Substitution, eine Insertion oder eine Kombination davon ist. 17. Nukleinsäure kodierend für ein Immunglobulin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 oder ein Teil davon. 18. Verfahren zur .Herstellung eines multivalenten Immunglobulins nach einem der Ansprüche 1 bis 16, welches die Schritte umfasst: - Bereitstellung einer Nukleinsäure, die für ein Immunglobulin kodiert, welche mindestens eine Strukturschleifenregion enthält, Veränderung mindestens eines Nukleotidrests der StrukturSchleifenregionen, Übertragung der veränderten Nukleinsäure in ein ExpressionsSystem, Expression des multivalenten Immunglobulins, Kontaktierung des exprimierten multivalenten Immunglobulins mit einem Epitop eines Ze11ober f1ä chenmo1e kü1s,. - ____________Bestimmung, ob das multivalente Immunglobulin an das Epitop bindet^ - _ Bestimmung der Bindung des multivalenten Immunglobulins an das Zelloberflächenmolekül .in einem Zell-basierenden Testsystem.. { Gelöscht: Manipulation [ ΪΒβϊΟΜΜ: 1 [ Gelöscht: sowie nachgef; 5 • ··· • · • « • ·
19. 19. Verwendung eines multivalenten Immunglobulins nach einem der Ansprüche 1 bis 16 für die Herstellung eines Medikaments. NACHGEREICHT