JP2008514685A - 治療剤に連結した、非天然型ジスルフィド鎖間結合を含有するｔ細胞レセプター - Google Patents

治療剤に連結した、非天然型ジスルフィド鎖間結合を含有するｔ細胞レセプター Download PDF

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Abstract

本発明は、選択された治療剤と結合した二量体TCR(dTCR)又は単鎖TCR(scTCR)を提供する。ここで、該TCRは、TCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRα鎖可変ドメイン配列に対応するアミノ酸配列により構成される第１のセグメント、TCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRβ鎖可変ドメインに対応するアミノ酸配列により構成される第２のセグメント、第１の鎖と第２の鎖との間のジスルフィド結合を含んでなり、該ジスルフィド結合は、天然型αβＴ細胞レセプター中に等価物を有しないものである。該scTCRが更に第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に又はその逆に連結するリンカー配列を含んでなる場合、該リンカー配列の長さ及びジスルフィド結合の位置は、第１及び第２のセグメントの可変ドメイン配列が天然型αβＴ細胞レセプター中と実質的に同様に互いに配向するような長さ及び位置である。
【選択図】なし

Description

本発明は、治療剤と結合した非天然型ジスルフィド鎖間結合を含有するＴ細胞レセプター(TCR)に関する。
発明の背景
本明細書で開示される新規なTCR−治療剤組合せは、自己免疫疾患、臓器拒絶、対宿主性移植片病(GVHD)及びガンの治療において有用である。本明細書で開示されるTCR治療剤組合せのTCR部が標的付け成分(targeting moiety)である。
発明の簡単な説明
本発明は、治療剤と結合した二量体TCR(dTCR)又は単鎖TCR(scTCR)を初めて利用可能にする。ここで、治療剤は、IL-1、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、IL-23、TGF-β、IFN-γ、リンホトキシン、TNFα、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD44抗体、抗CD45RA抗体、抗CD45RB抗体、抗CD45RO抗体、抗Thy 1.2抗体、抗リンパ球グロブリン、抗αβTCR抗体、抗γδTCR抗体、抗CD49a抗体、抗CD49b抗体、抗CD49c抗体、抗CD49d抗体、抗CD49e抗体、抗CD49f抗体、抗TCR Vβ8抗体、抗CD16抗体、抗CD28抗体、CTLA-4-Ig、抗B7.2抗体、抗CD40L抗体、抗ICAM-1抗体、ICAM-1、抗Mac抗体、抗LFA-1抗体、抗IFN-γ抗体 IFN-γ、IFN-γR/IgG1融合体、抗IL-2R抗体、IL-2R抗体、IL-2 ジフテリアトキシンタンパク質、抗IL-12抗体、IL-12アンタゴニスト(p40)、抗IL-1抗体、IL-1アンタゴニスト、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)、抗GAD抗体、ウイルス性のタンパク質及びペプチド、細菌性のタンパク質若しくはペプチド、Ａ-ガラクトシル-セラミド、カルシトニン、ニコチンアミド、抗酸化剤(ビタミンＥ、プロブコールアナログ、プロブコール＋デフラザコート(deflazacoert)又はアミノグアニジン)、抗炎症剤(ペントキシフィリン(Pentoxifylline)又はロリプラム)、免疫調節剤(リノマイド(Linomide)、Ling-zhi-8、D-グルカン、多機能プロテイン14、シアメクソン(Ciamexon)、コレラ毒Ｂ、バナデート又はビタミンD3アナログ、小分子CD80阻害剤、アンドロゲン、IGF-I、免疫応答力操作(Immunomanipulation)(天然抗体)、狼瘡イディオタイプ(Lupus idiotype)、リポ多糖)、スルファチド、ハチ毒、漢方薬、シリカ、ガングリオシド、抗アシアロGM-1抗体、ヒアルロニダーゼ、コンカナバリンＡ、抗クラスＩ MHC抗体若しくは抗クラスII MHC抗体、シクロスポリン、FK-506、アザチオプリン、ラパマイシン若しくはデオキシスペルグアリン、PE38シュードモナス(Pseudomonas)外毒素、又は前記のものの機能的変形体若しくはフラグメントから選択される。TCRは、TCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRα鎖可変ドメイン配列に対応するアミノ酸配列により構成される第１のセグメント、TCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRβ鎖可変ドメインに対応するアミノ酸配列により構成される第２のセグメント、第１の鎖と第２の鎖との間のジスルフィド結合を含んでなり、前記ジスルフィド結合は天然型αβＴ細胞レセプター中に等価物を有さないものである。scTCRが第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に又はその逆に連結するリンカー配列を更に含んでなる場合には、リンカー配列の長さ及びジスルフィド結合の位置は、第１及び第２のセグメントの可変ドメイン配列同士が天然型αβＴ細胞レセプター中と実質的に同様に互いに配向するような長さ及び位置である。
本発明の詳細な説明
本発明は、治療剤と結合した二量体TCR(dTCR)又は単鎖TCR(scTCR)を提供する。ここで、治療剤は、IL-1、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、IL-23、TGF-β、IFN-γ、リンホトキシン、TNFα、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD44抗体、抗CD45RA抗体、抗CD45RB抗体、抗CD45RO抗体、抗Thy 1.2抗体、抗リンパ球グロブリン、抗αβTCR抗体、抗γδTCR抗体、抗CD49a抗体、抗CD49b抗体、抗CD49c抗体、抗CD49d抗体、抗CD49e抗体、抗CD49f抗体、抗TCR Vβ8抗体、抗CD16抗体、抗CD28抗体、CTLA-4-Ig、抗B7.2抗体、抗CD40L抗体、抗ICAM-1抗体、ICAM-1、抗Mac抗体、抗LFA-1抗体、抗IFN-γ抗体 IFN-γ、IFN-γR/IgG1融合体、抗IL-2R抗体、IL-2R抗体、IL-2 ジフテリアトキシンタンパク質、抗IL-12抗体、IL-12アンタゴニスト(p40)、抗IL-1抗体、IL-1アンタゴニスト、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)、抗GAD抗体、ウイルス性のタンパク質及びペプチド、細菌性のタンパク質若しくはペプチド、Ａ-ガラクトシル-セラミド、カルシトニン、ニコチンアミド、抗酸化剤(ビタミンＥ、プロブコールアナログ、プロブコール＋デフラザコート又はアミノグアニジン)、抗炎症剤(ペントキシフィリン又はロリプラム)、免疫調節剤(リノマイド、Ling-zhi-8、D-グルカン、多機能プロテイン14、シアメクソン、コレラ毒Ｂ、バナデート又はビタミンD3アナログ、小分子CD80阻害剤、アンドロゲン、IGF-I、免疫応答力操作(天然抗体)、狼瘡イディオタイプ、リポ多糖)、スルファチド、ハチ毒、漢方薬、シリカ、ガングリオシド、抗アシアロGM-1抗体、ヒアルロニダーゼ、コンカナバリンＡ、抗クラスＩ MHC抗体若しくは抗クラスII MHC抗体、シクロスポリン、FK-506、アザチオプリン、ラパマイシン若しくはデオキシスペルグアリン、PE38シュードモナス外毒素、又は前記のものの機能的変形体若しくはフラグメントの１つから選択される。TCRは、TCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRα鎖可変ドメイン配列に対応するアミノ酸配列により構成される第１のセグメント、TCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRβ鎖可変ドメインに対応するアミノ酸配列により構成される第２のセグメント、第１の鎖と第２の鎖との間のジスルフィド結合を含んでなり、前記ジスルフィド結合は、天然型αβＴ細胞レセプター中に等価物を有しないものである。scTCRが、第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に又はその逆に連結するリンカー配列を更に含んでなる場合には、リンカー配列の長さ及びジスルフィド結合の位置は、第１及び第２のセグメントの可変ドメイン配列同士が天然型αβＴ細胞レセプター中と実質的に同様に互いに配向するような長さ及び位置である。
本明細書中で使用する場合、用語「治療剤と結合した二量体TCR(dTCR)又は単鎖TCR(scTCR)」は、治療剤に共有結合又はその他の結合をしたTCRを言うと理解される。治療剤は、TCRに直接に連結されていてもよいし、又はリンカー成分を介して間接的に連結されていてもよい。
本明細書中で使用する場合、用語「機能的変形体」は、開示の治療剤の、同じ治療効果を有するアナログを言うと理解される。例えば、当業者に公知のように、開示のものと比較して、該薬剤の治療効果を変化させることなく、その化学構造中又はアミノ酸配列中に軽微な変更が組み込まれている治療物質を作製することは可能であり得る。このような些細な変形体は本発明の範囲に包含される。
機能的抗体フラグメント及び変形体
本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適切な抗体フラグメント及び変形体/アナログは、以下を包含するがそれらに限定されない。
抗体フラグメント
当業者に公知のように、所定の抗体のフラグメントを、該親抗体の結合特性と実質的に同じ結合特性を保持するように作製することは可能である。以下にそのようなフラグメントの詳細を提供する：
ミニボディ(minibody) − この構築物は切断されたFc部分を有する抗体からなる。よって、これは、由来する抗体の完全な結合ドメインを保持する。
Fabフラグメント − これは、免疫グロブリン重鎖の一部に共有結合した単一免疫グロブリン軽鎖を含んでなる。よって、Fabフラグメントは１つの抗原結合部位を含んでなる。Fabフラグメントは、パパイン処理で遊離され得るIgGの部分によって規定されている。このフラグメントは、一般に、組換えDNA技術(Reevesら，(2000) Lecture Notes on Immunology(第４版)Blackwell Science発行)により作製される。
F(ab')2フラグメント − これは、単一抗体に由来する両方の抗原結合部位及びヒンジ領域を含んでなる。F(ab')2フラグメントは、ペプシン処理で遊離され得るIgGの部分によって規定されている。このフラグメントは、一般に、組換えDNA技術(Reevesら，(2000) Lecture Notes on Immunology(第４版)Blackwell Science発行)により作製される。
Fvフラグメント − これは、免疫グロブリン可変軽鎖ドメインに連結した免疫グロブリン可変重鎖ドメインを含んでなる。多くのFv設計がなされてきた。これには、２つのドメイン間の結合が導入ジスルフィド結合により強化されたdsFvが含まれる。或いは、scFvは、ペプチドリンカーを使用して２つのドメインを一緒に単一ポリペプチドとして結合して形成することができる。対応する免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメインに結合した免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の可変ドメインを含有するFv構築物もまた作製されている。Fvはまた多量体化されてダイアボディ(diabody)及びトリアボディ(triabody)に形成されている(Maynardら，(2000) Annu Rev Biomed Eng 2 339-376)。
ナノボディ(商標)(NanobodiesTM) − この構築物はAblynx(ベルギー)から市販されており、ラクダ科動物(例えば、ラクダ又はラマ)の抗体に由来する合成単一免疫グロブリン可変重鎖ドメインを含んでなる。
ドメイン抗体 − この構築物は、Domantis(ベルギー)から市販されており、親和性成熟単一免疫グロブリン可変重鎖ドメイン又は免疫グロブリン可変軽鎖ドメインを含んでなる。
抗体の変形体及びアナログ
本発明に関して規定される抗体の機能的特徴は、標的リガンドに特異的に結合する能力である。当業者に公知のように、種々の他のタンパク質中にそのような結合特性を操作してつくることは可能である。本発明の組成物及び方法での使用に適切な抗体の変形体及びアナログの例には、以下が包含されるがそれらに限定されない。
タンパク質足場をベースとした結合性ポリペプチド − このファミリーの結合性構築物は、天然型結合ループを含有するタンパク質の変異アナログを含んでなる。例として、Affibody(スウェーデン)から市販されている、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)プロテインＡのIgG結合ドメインの１つに由来する３へリックスモチーフ(three-helix motif)に基づくアフィボディ(Affibodies)が挙げられる。別の例として、EvoGenix(オーストラリア)から市販されている、抗体結合ループに類似するドメインが移植されているCTLA-4の細胞外ドメインに基づくエビボディ(Evibodies)が提供される。最後の例は、Regeneron Pharmaceuticals(米国)から市販されている、抗体足場にサイトカインレセプタードメインが移植されているサイトカイントラップ(Cytokine Traps)である。Nygrenら(2000)(Current Opinion in Structural biology 7 463-469)は、タンパク質中に新規な結合部位を操作してつくるための足場の使用の総説を提供している。この総説は、足場の供給源として以下のタンパク質を述べている：CP1ジンクフィンガー、テンダミスタット(Tendamistat)、Ｚドメイン(プロテインＡアナログの１つ)、PST1、コイルドコイル、LACI-D1及びシトクロムb562。他のタンパク質足場の研究は、フィブロネクチン、緑色蛍光タンパク質(GFP)及びアンキリンリピートの使用を報告している。
当業者に公知のように、所定のタンパク質リガンドの種々の部分に結合する抗体又はそのフラグメント、変形体若しくはアナログを作製することができる。例えば、抗CD3抗体は、この複合体を形成しているポリペプチド鎖(すなわち、γ、δ、ε、ζ及びηCD3鎖)のいずれに対しても惹起させることができる。εCD3鎖に結合する抗体が、本発明の組成物及び方法での使用に好ましい抗CD3抗体である。
本発明の別の観点により、治療剤がIL-1、IL-1α、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、TGF-β、リンホトキシン、TNFα、抗CD2抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD44抗体、抗CD45RA抗体、抗CD45RB抗体、抗CD45RO抗体、抗Thy 1.2抗体、抗リンパ球グロブリン、抗αβTCR抗体、抗γδTCR抗体、抗CD49a抗体、抗CD49b抗体、抗CD49c抗体、抗CD49d抗体、抗CD49e抗体、抗CD49f抗体、抗TCR Vβ8抗体、抗CD16抗体、抗CD28抗体、CTLA-4-Ig、抗B7.2抗体、抗CD40L抗体、抗ICAM-1抗体、ICAM-1、抗Mac抗体、抗LFA-1抗体、抗IFN-γ抗体 IFN-γ、IFN-γR/IgG1融合体、抗IL-2R抗体、IL-2R抗体、IL-2 ジフテリアトキシンタンパク質、抗IL-12抗体、IL-12アンタゴニスト(p40)、抗IL-1抗体、IL-1アンタゴニスト、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)、抗GAD抗体、ウイルス性のタンパク質及びペプチド、細菌性のタンパク質若しくはペプチド、Ａ-ガラクトシル-セラミド、カルシトニン、ニコチンアミド、抗酸化剤(ビタミンＥ、プロブコールアナログ、プロブコール＋デフラザコート又はアミノグアニジン)、抗炎症剤(ペントキシフィリン又はロリプラム)、免疫調節剤(リノマイド、Ling-zhi-8、D-グルカン、多機能プロテイン14、シアメクソン、コレラ毒Ｂ、バナデート又はビタミンD3アナログ、小分子CD80阻害剤、アンドロゲン、IGF-I、免疫応答力操作(天然抗体)、狼瘡イディオタイプ、リポ多糖)、スルファチド、ハチ毒、漢方薬、シリカ、ガングリオシド、抗アシアロGM-1抗体、ヒアルロニダーゼ、コンカナバリンＡ、抗クラスＩ MHC抗体若しくは抗クラスII MHC抗体、シクロスポリン、FK-506、アザチオプリン、ラパマイシン若しくはデオキシスペルグアリン、又は前記のものの機能的変形体若しくはフラグメントから選択される、治療剤と結合したdTCR又はscTCRが提供される。
「抗Ｔ細胞」抗体
本発明の免疫調節剤性物質の１つの好ましい群は、Ｔ細胞又はナチュラルキラー(NK)細胞によってのみ提示されるエピトープに結合する抗体又はその機能的フラグメント若しくは変形体/アナログである。以下は、これら細胞を特異的に標的する抗体である：
抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗αβTCR抗体、抗CD49a抗体、抗CD49b抗体、抗CD49c抗体、抗CD49d抗体、抗CD49e抗体、抗CD49f抗体、抗γδTCR抗体、抗TCR Vβ8抗体及び抗CD28抗体。
当業者に公知であるように、Ｔ細胞及び/又はNK細胞の特定のサブユニットは、上記抗体の大部分により標的される。唯一抗CD3抗体が全てのNK細胞及びＴ細胞を標的する。
このような抗体は、本発明の二官能性組成物を形成するために可溶性TCRに連結され、該可溶性TCRに関して同族のペプチド−MHCリガンドを発現する細胞へのＴ細胞及び/又はNK細胞の局在化を引き起こす。理論により制限されることは望まないが、Ｔ細胞又はNK細胞へのこれら抗体の結合が、これら細胞の活性化を引き起こし得る。
本発明は別の観点により、IL-10、IL-4若しくはIL-13又は前記のものの機能的変形体若しくはフラグメントから選択される治療剤と結合したdTCR又はscTCRが提供される。
dTCR又はscTCRが組織特異的である本発明の１つの観点が提供される。この観点の１つの実施形態では、dTCR又はscTCRは、自己免疫疾患、臓器拒絶又は対宿主性移植片病(GVHD)において自己反応性Ｔ細胞の標的である組織に特異的である。この観点の特定の実施形態では、dTCR又はscTCRは島細胞特異的である。Ｔ細胞クローンNY8.3(Santamariaら，J. Immunology (1995) 154 2494-2503及びNagataら，(1995) J Immunology 152 2042-2050)及びG9C8(Wongら，J Exp Med 1996 183 67-76)は、島細胞特異的なマウスＴ細胞クローンの例である。NY8.3 Ｔ細胞クローンは、マウスH2-Kd MHCにより提示されるグルコース-6-ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質(IGRP)に由来するペプチドに特異的である。G9C8 Ｔ細胞クローンは、マウスH2-Kd MHCにより提示されるインスリン由来ペプチドに特異的である。
本発明の更に別の観点により、治療剤がIL-15、IL-21、IL-23、PE38シュードモナス外毒素、IFN-γ若しくは抗CD3抗体又は前記のものの機能的変形体若しくはフラグメントから選択される治療剤と結合したdTCR又はscTCRが提供される。
本発明の１つの観点では、治療薬剤と結合したTCRはdTCRである。本発明の代わりの観点では、治療薬剤と結合したTCRはscTCRである。
本発明のTCRと治療剤との結合に好ましい２つのクラスのリンカーが存在する。TCRが治療剤にポリアルキレングリコール鎖により連結されている本発明のTCRは、この観点の１つの実施形態を提供する。ペプチド性リンカーが他方のクラスのTCRリンカーである。これら２つのクラスのリンカーは、TCR多量体の形成における使用に関連して下記で詳細に議論する。本明細書の実施例６は、TCRと治療剤との間の結合を形成するために使用され得るペプチド性リンカーの２つの例を提供する。当業者に公知のように、種々のペプチドリンカーが、TCRβ鎖を所要の治療剤と連結するために適切であり得る。以下は、この目的に使用され得るリンカー配列の更なる例である。
ggcggtccg − これはGly-Gly-Proリンカーをコードする。
cccggg − これはXma1制限酵素部位を含むPro-Glyリンカーをコードする。
上記のように、本明細書に開示されるTCR−治療剤組合せのTCR部分は、標的付け成分である。本発明のTCRはTCRリガンド(例えば、ペプチド−MHC又はCD1−抗原複合体)を標的する。よって、これらTCRは、そのTCRリガンドに関して、同リガンドに特異的な天然型TCRより高い親和性及び/又は遅い解離速度を有していると望ましい。本発明者らの同時係属中の出願WO 2004/044004は、そのTCRリガンドに関して、同リガンドに特異的な天然型TCRより高い親和性及び/又は遅い解離速度を有するTCRを作製する方法を詳述している。好ましくは、TCRのそのTCRリガンドに関する親和性(KD)は１μMより高く、及び/又は解離速度(kOFF)は１×10-3 S-1より遅い。より好ましくは、TCRのそのTCRリガンドに関する親和性(KD)は10nMより高く、及び/又は解離速度(koff)は１×10-4 S-1より遅い。もっとも好ましくは、TCRのそのTCRリガンドに関する親和性(KD)は１nMより高く、及び/又は解離速度(koff)は１×10-5 S-1より遅い。
親和性(KD)及び/又は解離速度(koff)の測定は、公知の方法のいずれかにより行うことができる。好ましい方法は、実施例３の表面プラズモン共鳴(Biacore)法である。
１つの広い観点では、本発明のTCRは、WO 04/033685及びWO 03/020763に記載のような単鎖TCR(scTCR)又は二量体TCR(dTCR)のいずれかの形態である。
適切なscTCR形態は、TCRα鎖可変ドメインに対応するアミノ酸配列により構成される第１のセグメント、TCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRβ鎖可変ドメイン配列に対応するアミノ酸配列により構成される第２のセグメント、及び第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含んでなる。
或いは、第１のセグメントは、TCRβ鎖可変ドメインに対応するアミノ酸配列により構成されてもよく、第２のセグメントは、TCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRα鎖可変ドメイン配列に対応するアミノ酸配列により構成されてもよい。
より具体的には、第１のセグメントは、TCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRα鎖可変ドメイン配列に対応するアミノ酸配列により構成されてもよく、第２のセグメントは、TCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRβ鎖可変ドメインに対応するアミノ酸配列により構成されてもよく、ジスルフィド結合が第１の鎖と第２の鎖との間に提供されてもよく、該ジスルフィド結合は、天然型αβＴ細胞レセプター中に等価物を有しないものである。
上記のscTCR形態では、リンカー配列は、第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結してもよく、式-PGGG-(SGGGG)5-P- (配列番号：１)又は-PGGG-(SGGGG)6-P- (配列番号：２)(式中、Ｐはプロリン、Ｇはグリシン、Ｓはセリンである)を有していてもよい。
本発明のTCRの適切なdTCR形態は、TCRα鎖可変ドメイン配列に対応する配列がTCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合している第１のポリペプチド、及びTCRβ鎖可変ドメイン配列に対応する配列がTCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合している第２のポリペプチドを含んでなり、第１及び第２のポリペプチドは、天然型αβＴ細胞レセプター中に等価物を有しないジスルフィド結合により連結される。
第１のポリペプチドは、TCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合したTCRα鎖可変ドメイン配列を含んでなってもよく、第２のポリペプチドは、TCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合したTCRβ鎖可変ドメイン配列に対応する配列を含んでなってもよく、第１及び第２のポリペプチドは、TRAC*01のエキソン１のThr 48及びTRBC1*01若しくはTRBC2*01のエキソン１のSer 57又はそれらの非ヒト等価物から置換したシステイン残基同士の間のジスルフィド結合により連結されてもよい(本明細書中の「TRAC」などの命名法は、T cell receptor Factsbook，(2001) LeFranc and LeFranc，Academic Press，ISBN 0-12-441352-8の通りである)。
本発明のTCRのdTCR形態又はscTCR形態は、ヒトαβTCR細胞外定常ドメイン配列及び同可変ドメイン配列に対応するアミノ酸配列を有していてもよく、ジスルフィド結合は、前記定常ドメイン配列のアミノ酸残基同士を連結し得る。このジスルフィド結合は、天然型TCR中に等価物を有しない。ジスルフィド結合は、β炭素原子が天然型TCR中で0.6nm未満離れたアミノ酸残基に対応するシステイン残基同士間、例えばTRAC*01のエキソン１のThr 48及びTRBC1*01若しくはTRBC2*01のエキソン１のSer 57又はそれらの非ヒト等価物から置換したシステイン残基同士間にある。システイン残基が導入されてジスルフィド結合を形成することができる他の部位は、TCRα鎖についてはTRAC*01のエキソン１中の、TCRβ鎖についてはTRBC1*01又はTRBC2*01のエキソン１中の以下の残基である：
Figure 2008514685
上記で言及した非天然型ジスルフィド結合に加えて、本発明のTCRのdTCR形態又はscTCR形態は、天然型TCR中のジスルフィド結合により連結される残基に対応する残基間のジスルフィド結合を含み得る。
本発明のTCRのdTCR形態又はscTCR形態は、好ましくは、天然型TCRの膜貫通配列に対応する配列も天然型TCRの細胞質配列に対応する配列も含有しない。
本発明の１つの実施形態は、治療剤がPE38外毒素である、治療剤と結合したTCRを提供する。
PE38外毒素は、シュードモナス外毒素の切断された形態である。天然型ポリペプチドは、ドメインIA、II、IB及びIIIからなる66kDaタンパク質である。PE38誘導体は、ドメインIIとドメインIBのアミノ酸380〜399とドメインIIIとからなる。当業者に自明であるように、シュードモナス外毒素の他の切断形態も本発明において有用であり得る(例えばPE40)。PE38の本発明における使用に好ましい変形体は、ドメインIIIに、Ｃ末端アミノ酸がKDELとなる変異を含有する。これらＣ末端変異は、以前に、シュードモナス外毒素の毒性を増大させることが示されている(Kreitmanら(1995) J Biochem 307 29-37)。
好ましい実施形態では、PE38外毒素と結合したTCRは配列番号：73のアミノ酸配列及び配列番号：71のアミノ酸配列(それぞれ、図29b及び28b)を含んでなる。
PEG化TCR単量体
１つの特定の実施形態では、本発明の治療剤と結合したTCRは、少なくとも１つのポリアルキレングリコール鎖と結合している。この結合は当業者に公知の多くの方法で引き起こされ得る。好ましい実施形態では、ポリアルキレン鎖はTCRに共有結合している。更なる実施形態では、本発明のこの観点のポリエチレングリコール鎖は、少なくとも２つのポリエチレン反復単位を含んでなる。
多価TCR複合体
本発明の１つの観点により、治療剤と結合した少なくとも２つのTCRを含んでなる多価TCR複合体が提供される。この観点の１つの実施形態では、少なくとも２つのTCR分子がリンカー成分を介して連結されて、多価複合体を形成する。このような多価TCR複合体は、非ペプチド性ポリマー鎖又はペプチド性リンカー配列のいずれかにより連結されてもよい。好ましくは複合体は水溶性であり、したがってリンカー成分はそれ相応に選択されるべきである。更に、リンカー成分は、形成される複合体の構造的多様性が最小限化するように、TCR分子上の規定された位置に付着することができることが好ましい。この観点の１つの実施形態は、ポリマー鎖又はペプチド性リンカー配列がTCRの可変領域配列中に位置しない各TCRのアミノ酸残基の間に伸びている本発明のTCR複合体により提供される。
本発明の複合体は医学用であり得るので、リンカー成分は医薬的適合性、例えば免疫原性に関して当然に注意して選択されるべきである。
上記の望まれる基準を満たすリンカー成分の例は、当該分野、例えば抗体フラグメントの連結の分野で公知である。
本発明の多価TCR分子の製造における使用に好ましい２つのクラスのリンカーが存在する。TCRがポリアルキレングリコール鎖により連結されている本発明のTCR複合体はこの観点の１つの実施形態を提供する。
第１は、親水性ポリマー、例えばポリアルキレングリコールである。このクラスの最も一般に使用されるものは、ポリエチレングリコール又はPEG(この構造を下記に示す)をベースにする：
HOCH2CH2O(CH2CH2O)n-CH2CH2OH
(式中、ｎは２より大きい)。しかし、他の適切な(任意に置換されていてもよい)ポリアルキレングリコール(ポリプロピレングリコーを含む)及びエチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーをベースにするものもある。
このようなポリマーは、治療剤、特にポリペプチド治療剤又はタンパク質治療剤を処理するか又はこれに接合するかして、該治療剤のPKプロフィールに有益な変化を達成するために使用され得る。PEG−治療剤接合体のPKプロフィールのこのような改善は、PEG分子が該治療剤の周囲に、免疫系との反応を立体的に障害し、タンパク質分解性分解を減少させる「殻」を形成することに起因すると考えられる(Caseyら，(2000) Tumor Targetting 4 235-244)。使用する親水性ポリマーのサイズは、具体的には、TCR複合体の意図する治療用途に基づいて選択し得る。したがって、例えば、製品が、例えば腫瘍治療における使用のために、循環中を出て組織に浸潤するよう意図される場合、５KDaのオーダーの低分子量ポリマーを使用することが有利であり得る。医薬製剤におけるPEG及び類似分子の使用を詳述する多くの総説論文及び本が存在する。例えば、Harris & Zalipsky (1997) Chemistry and Biological Applications of Polyethylene Glycol ACS Books，Washington，D.C.を参照。
使用するポリマーは、直鎖状又は分枝状の構造を有することができる。分枝状PEG分子又はその誘導体は、グリセロール及びグリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトール、ソルビトール並びにリジンを含む分枝成分の付加により誘導することができる。
通常、ポリマーは、該ポリマーがTCR中の標的部位へ連結することが可能となるように、その構造中、例えば一方又は両方の端部及び/又は主鎖からの分枝上に、化学反応性の基を有する。下記に示すように、この化学反応性の基は親水性ポリマーに直接結合させてもよいし、又は親水性ポリマーと反応性化学成分との間にスペーサ基/成分が存在していてもよい：
反応性化学成分−親水性ポリマー−反応性化学成分
反応性化学成分−スペーサ−親水性ポリマー−スペーサ−反応性化学成分
上記で概説したタイプの構築物の形成に使用するスペーサは、非反応性の化学的に安定な鎖である任意の有機成分であり得る。このようなスペーサには、以下が含まれるがそれらに限定されない：
-(CH2)n- (式中、ｎ=２〜５)
-(CH2)3NHCO(CH2)2
二価アルキレンスペーサ基がポリアルキレングリコール鎖と治療剤に結合したTCRへの結合点との間に位置する本発明の多価TCR複合体は、この観点の更なる実施形態を提供する。
ポリアルキレングリコール鎖が少なくとも２つのポリエチレングリコール反復単位を含んでなる本発明の多価TCR複合体は、この観点の更なる実施形態を提供する。
広範な種々のカップリング化学成分が、ポリマー分子をタンパク質治療剤及びペプチド治療剤にカップリングするために使用できる。最も適切なカップリング化学成分の選択は、所望のカップリング部位に大きく依存する。例えばN-マレイミド、ビニルスルホン、炭酸ベンゾトリアゾール、プロピオン酸スクシンイミド、ブタン酸スクシンイミド、チオエステル、アセトアルデヒド、アクリレート、ビオチン及び一級アミンカップリング化学成分が、PEG分子の１又はそれより多い末端に付着するために使用されている(出典：Nektar Molecular Engineering Catalogue 2003)。
上記のように、非PEGベースのポリマーもまた、本発明のTCRを多量化するために適切なリンカーを提供する。例えば、脂肪族鎖により連結されたマレイミド末端を含有する成分、例えばBMH及びBMOE(Pierce，製品番号22330及び22323)が使用できる。
ペプチド性リンカーが他方のクラスのTCRリンカーである。これらリンカーは、アミノ酸の鎖から構成され、単純なリンカーを作製するために機能するか、又はTCR分子を結合させることができる多量体化ドメインを作製するために機能する。ビオチン/ストレプトアビジン系は、以前に、インビトロ結合研究用のTCR四量体(WO/99/60119を参照)を作製するために使用された。しかし、ストレプトアビジンは微生物由来のポリペプチドであり、よって治療剤における使用に理想的には適していない。
TCRがヒト多量体化ドメインに由来するペプチド性リンカーにより連結されている本発明のTCR複合体は、この観点の更なる実施形態を提供する。多価TCR複合体の作製に使用できる多量体化ドメインを含有する多くのヒトタンパク質が存在する。例えば、p53の四量体化ドメインは、単量体scFvフラグメントと比較して、増大した血清残存率及び有意に減少した解離速度を示すscFv抗体フラグメント四量体を作製するために利用されている(Willudaら(2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392)。ヘモグロビンもまた、この種の適用におそらく使用できる四量体化ドメインを有する。
本発明の可溶性TCR又は多価TCR複合体は、プロドラッグを薬物に変換することができる酵素に連結されてもよい。これにより、薬物を必要とする部位(すなわち、sTCRにより標的される部位)でのみプロドラッグを薬物に変換することが可能となる。
治療用途
本発明はまた、治療剤を標的細胞に送達するための方法を提供する。この方法は、潜在標的細胞を本発明によるTCR又は多価TCR複合体と、標的細胞へのTCR又は多価TCR複合体の結合を可能にする条件下で接触させることを含んでなる。ここで、TCR又は多価TCR複合体は所定のペプチド−MHC複合体に特異的である。
具体的には、本発明の可溶性TCR又は多価TCR複合体は、治療剤を特定の抗原を提示する細胞の位置に送達するために使用することができる。このことは、多くの状況で、例えば、腫瘍に対して、又は自己免疫疾患の部位で、有用である。治療剤は、局所的にではあるが該治療剤が結合する細胞に限らずその効果を発揮するように送達され得る。
したがって、１つの特定のストラテジーとして、腫瘍抗原に特異的な本発明によるTCR又は多価TCR複合体に連結した免疫刺激性分子が考えられる。ガン治療のためには、腫瘍又は転移の近傍での局在化が毒素又は免疫刺激物質の効果を増強する。或いは、本発明の可溶性TCR又は多価TCR複合体は、自己免疫疾患に関連する特定の抗原を提示する細胞の位置に免疫阻害剤を送達するために使用することができる。例えば、島細胞に特異的なTCRは、免疫阻害剤(例えば、IL-10、IL-4若しくはIL-13又は前記のものの機能的変形体若しくはフラグメント)を、糖尿病を患う患者の島細胞に送達するために使用することができる。
ワクチン送達のためには、ワクチン抗原は、抗原提示細胞の近傍に局在化されて、抗原の効力を増強することができる。
治療剤と結合したTCRの投与の前及び/又は該投与と同時の患者へのインターフェロン(IFN)(例えば、IFN-γ)の投与は、標的細胞でのペプチド−MHC発現レベルを増加させ得ると考えられる。このことはガンの治療において特に有益であり得る。
本発明の更なる実施形態は、治療剤と結合したTCR又はその多価TCR複合体を医薬的に許容されるキャリアと共に含んでなる医薬組成物により提供される。
本発明はまたガンの治療法を提供し、この方法は、ガン疾患を患う対象に、治療剤と結合したTCR又はその多価TCR複合体の有効量を投与することを含んでなる。関連する実施形態では、本発明は、ガンの治療用組成物の製造における、治療剤と結合したTCR又はその多価TCR複合体の使用を提供する。IL-15、IL-21若しくは抗CD3抗体又は前記のものの機能的変形体若しくはフラグメントは、ガン治療における使用に特に好ましい治療剤である。
本発明はまた、自己免疫疾患、臓器拒絶又はGVHDの治療法を提供し、この方法は、自己免疫疾患、臓器拒絶又はGVHDを患う対象に、治療剤と結合したTCR又はその多価TCR複合体の有効量を投与することを含んでなる。関連する実施形態では、本発明は、自己免疫疾患、臓器拒絶又はGVHDの治療用組成物の製造における、治療剤と結合したTCR又はその多価TCR複合体の使用を提供する。自己免疫疾患、臓器拒絶又はGVHDの治療における使用に好ましい治療剤は、IL-10、IL-4及びIL-13又は前記のものの機能的変形体若しくはフラグメントである。別の関連する実施形態では、本発明のdTCR又はscTCRは組織特異的である。更なる関連の実施形態では、dTCR又はscTCRは、自己免疫疾患、臓器拒絶又は対宿主性移植片病(GVHD)において自己反応性Ｔ細胞の標的である組織に特異的である。特定の実施形態では、本発明は糖尿病の治療法を提供し、ここでdTCR又はscTCRは島細胞に特異的である。
本発明の方法が有益であり得るガンには、白血病、頭部、頸部、肺、胸部、結腸、子宮頸部、肝臓、膵臓、卵巣、及び精巣が挙げられる。
本発明の方法が有益であり得る自己免疫疾患には、
急性散在性脳炎
副腎不全
アレルギー性脈管炎及び肉芽腫症
アミロイドーシス
強直性脊椎炎
喘息
自己免疫性アディソン病
自己免疫性脱毛症
自己免疫性慢性活動性肝炎
自己免疫性溶血性貧血
自己免疫性好中球減少症
自己免疫性血小板減少性紫斑病
ベーチェット病
小脳変性
慢性活動性肝炎
慢性炎症性脱髄性多発根神経障害
単クローン性高ガンマグロブリン血症を伴う慢性ニューロパシー
古典的結節性多発性動脈炎
先天性副腎過形成
寒冷症
疱疹状皮膚炎
糖尿病
イートン‐ランバート筋無力症症候群
脳脊髄炎
後天性表皮水疱症
結節性紅斑
グルテン過敏性腸症
グッドパスチャー症候群
ギヤン‐バレー症候群
橋本甲状腺炎
甲状腺機能亢進
特発性ヘモクロマトーシス
特発性膜性糸球体腎炎
中枢神経系の孤立性脈管炎(isolated vasculitis)
川崎病
微少変化腎疾患
雑多の脈管炎
混合結合組織病
伝導ブロックを伴う多病巣性運動神経障害(multifocal motor neuropathy)
多発性硬化症
重症筋無力症
眼球クローヌス-筋クローヌス症候群
類天疱瘡
天疱瘡
悪性貧血
多発性筋炎/皮膚筋炎
感染後関節炎
原発性胆汁性硬化症
乾癬
反応性関節炎
ライター病
網膜症
慢性関節リウマチ
硬化性胆管炎
シェーグレン症候群
スティッフマン症候群
亜急性甲状腺炎
全身性エリテマトーデス
全身性壊死性脈管炎
全身性硬化症(強皮症)
高安動脈炎
側頭動脈炎
閉塞性血栓性血管炎
Ｉ型及びII型自己免疫性多内分泌腺症候群
潰瘍性結腸炎
ブドウ膜炎
ヴェーゲナー肉芽腫症
が挙げられる。
本発明による治療用組成物は、通常、医薬的に許容されるキャリアを標準的には含む滅菌医薬組成物の一部として供給される。この医薬組成物は任意の適切な剤形であり得る(該医薬組成物を患者に投与する望ましい方法に依存する)。医薬組成物は単位剤形で提供されてもよく、一般には密封された容器中で提供される。医薬組成物はキットの一部として提供されてもよい。このようなキットは、標準的には(必ずしも要しないが)、使用指示書を含む。キットは複数の単位剤形を含み得る。
医薬組成物は、任意の適切な経路、例えば、非経口経路、経皮経路、又は吸入を介する経路、好ましくは非経口経路(皮下経路、筋肉内経路、又は最も好ましい静脈内経路を含む)による投与に適合され得る。このような組成物は、薬学分野で公知の任意の方法により、例えば滅菌条件下で活性成分をキャリア又は賦形剤と混合することにより製造され得る。
本発明の物質の投薬量は、治療すべき疾患又は障害、治療すべき個体の年齢及び症状などに依存して広範囲に変わることがある。医師が、使用すべき適切な投薬量を最終的に決定する。
更なる観点
治療剤と結合したscTCR又はdTCR(このTCRは好ましくはヒト配列に対応する定常配列及び可変配列により構成される)は、実質的に純粋な形態で提供されてもよいし、精製又は単離された調製物として提供されてもよい。例えば、他のタンパク質を実質的に含まない形態で提供されてもよい。
本発明の各観点の好ましい特徴は、その他の観点の各々についても、必要な変更を加えてではあるが同様である。本明細書で言及する先行技術文献は、法が許す最大範囲で本明細書中に援用される。
実施例
以下の実施例で本発明を更に説明するが、本発明の範囲は実施例により如何なる様式であっても制限されない。
下記で添付図面に言及する：
図1a及び図1bは、それぞれ、システインコドンを導入するように変異した可溶性A6 TCRのα鎖及びβ鎖の核酸配列を示す。導入したシステインコドンを影付きで示す；
図2aは、新規なジスルフィド鎖間結合を作製するために使用するT48→Ｃ変異(下線部)を含むA6 TCRα鎖細胞外アミノ酸配列を示す。図2bは、新規なジスルフィド鎖間結合を作製するために使用するS57→Ｃ変異(下線部)を含むA6 TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列を示す；
図3aは、BamH1制限部位が組み込まれるように変異した新規システイン残基を含むA6 TCRα鎖配列を示す。BamH1制限部位を形成するために導入した変異を影付きで示す。
図3b及び図3cは、非天然型ジスルフィド結合を形成するための追加のシステイン残基を含むように変異したJM22 TCRのα鎖及びβ鎖のDNA配列を示す；
図4a及び図4bは、それぞれ、図3b及び図3cのDNA配列から作製したJM22 TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列を示す；
図5a及び図5bは、それぞれ、新規システインコドン(影付きで示す)を導入するように変異した可溶性AH-1.23 TCRのα鎖及びβ鎖のDNA配列を示す。
図6a及び図6bは、それぞれ、図5a及び図5bのDNA配列から作製したAH-1.23 TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列を示す；
図7a − 成熟ヒトIL-10のDNA配列。
図7b − 成熟ヒトIL-10のアミノ酸配列。
図8a − Pro-Glyリンカーを介して成熟ヒトIL-10に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列。導入システインを影付きで示す。Pro-GlyリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。
図8b − Pro-Glyリンカーを介して成熟ヒトIL-10に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列。導入システインを影付きで示す。Pro-Glyリンカーに下線を付す。
図9a − Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-10に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。
図9b − Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-10に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーに下線を付す。
図10a − Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-10に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。
図10b − Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-10に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーに下線を付す。
図11a − 成熟ヒトIL-4のDNA配列。
図11b − 成熟ヒトIL-4のアミノ酸配列。
図12a − Pro-Glyリンカーを介して成熟ヒトIL-4に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列。導入システインを影付きで示す。Pro-GlyリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。
図12b − Pro-Glyリンカーを介して成熟ヒトIL-4に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列。導入システインを影付きで示す。Pro-Glyリンカーに下線を付す。
図13a − Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-4に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。
図13b − Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-4に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーに下線を付す。
図14a − Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-4に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。
図14b − Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-4に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーに下線を付す。
図15a − 成熟ヒトIL-13のDNA配列。
図15b − 成熟ヒトIL-13のアミノ酸配列。
図16a − Pro-Glyリンカーを介して成熟ヒトIL-13に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列。導入システインを影付きで示す。Pro-GlyリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。
図16b − Pro-Glyリンカーを介して成熟ヒトIL-13に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列。導入システインを影付きで示す。Pro-Glyリンカーに下線を付す。
図17a − Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-13に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。
図17b − Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-13に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーに下線を付す。
図18a − Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-13に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。
図18b − Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-13に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーに下線を付す。
図19は、pEX821プラスミドのDNA配列を詳述する。
図20は、pEX821ベクターのプラスミド地図を提供する。このプラスミドのDNA配列は図19に提供される。
図21はpEX954プラスミドのDNA配列を詳述する。
図22は、pEX954プラスミドのプラスミド地図を提供する。このプラスミドのDNA配列は図21に提供される。
図23aは、高親和性c61 NY-ESO MTCRβ鎖をコードするDNA配列を詳述する。図23bは、図23aのDNA配列によりコードされるAA配列を詳述する。
図24aは、Ｃ末端でペプチドリンカーを介してIL-18に連結した高親和性c61 NY-ESO MTCRβ鎖をコードするDNA配列を詳述する。図24bはこの融合タンパク質のAA配列を詳述する。ペプチドリンカーに下線を付す。
図25aは、Ｃ末端でペプチドリンカーを介して高親和性c61 NY-ESO MTCRβ鎖に連結したIL-18プロタンパク質をコードするDNA配列を詳述する。プロIL-18 DNAは、第Ｘ因子の開裂部位をコードするように変更されている。図25bは、この融合タンパク質のAA配列を詳述する。ペプチドリンカーに下線を付す。
図26aは、Ｃ末端でペプチドリンカーを介してIL-10に連結した高親和性c61 NY-ESO MTCRβ鎖をコードするDNA配列を詳述する。図26bはこの融合タンパク質のAA配列を詳述する。ペプチドリンカーに下線を付す。
図27aは、Ｃ末端でペプチドリンカーを介してIL-13に連結した高親和性c61 NY-ESO MTCRβ鎖をコードするDNA配列を詳述する。図27bはこの融合タンパク質のAA配列を詳述する。ペプチドリンカーに下線を付す。
図28aは、Ｃ末端でペプチドリンカーを介してPE38外毒素の「KDEL」変形体に連結した高親和性c61 NY-ESO MTCRβ鎖をコードするDNA配列を詳述する。図28bはこの融合タンパク質のAA配列を詳述する。ペプチドリンカーに下線を付す。
図29aは、高親和性c58 NY-ESO MTCRα鎖をコードするDNA配列を詳述する。図29bは、図29aのDNA配列によりコードされるAA配列を詳述する。
実施例１ − A6 Tax TCRα鎖及びβ鎖のプライマー及び変異誘発の設計
TRAC*01中のエキソン１のA6 Taxスレオニン48をシステインに変異させるために、以下のプライマーを設計した(変異を小文字で示す)：
5'-C ACA GAC AAA tgT GTG CTA GAC AT (配列番号：３)
5'-AT GTC TAG CAC Aca TTT GTC TGT G (配列番号：４)
TRBC1*01中及びTRBC2*01中の両方のエキソン１のA6 Taxセリン57をシステインに変異させるために、以下のプライマーを設計した(変異を小文字で示す)：
5'-C AGT GGG GTC tGC ACA GAC CC (配列番号：５)
5'-GG GTC TGT GCa GAC CCC ACT G (配列番号：６)
PCR変異誘発：
A6 Tax TCRα鎖又はβ鎖の遺伝子を含有する発現プラスミドを、それぞれα鎖プライマー又はβ鎖プライマーを用いて以下のとおり変異させた。100ngのプラスミドを５μlの10mM dNTP、25μlの10×Pfu緩衝液(Stratagene)、10ユニットのPfuポリメラーゼ(Stratagene)と混合し、最終容量をH2Oで240μlに調整した。48μlのこの混合物に、50μlの最終反応容量中0.2μMの最終濃度となるように希釈したプライマーを補充した。95℃にて30秒間の最初の変性工程の後、反応混合物を、Hybaid PCR迅速PCR機において、変性(95℃、30秒間)とアニーリング(55℃、60秒間)と伸長(73℃、8分間)とに15回供した。次いで、産物を、10ユニットのDpnI制限酵素(New England Biolabs)を用いて37℃にて５時間消化した。10μlの消化反応物をコンピテントなXL1-Blue細菌中に形質転換し、37℃にて18時間増殖させた。１つのコロニーを選択し、５mlのTYP＋アンピシリン(16g/lのBacto-Tryptone、16g/lの酵母抽出物、５g/lのNaCl、2.5g/lのK2HPO4、100mg/lのアンピシリン)中で一晩増殖させた。Qiagen mini-prepカラムで製造業者の指示に従ってプラスミドDNAを精製し、その配列を自動配列決定により検証した。変異した核酸配列及びアミノ酸配列のそれぞれを、α鎖については図1a及び図2aに、β鎖については図1b及び図2bに示す。
実施例２ − 可溶性TCRの発現、リフォールディング及び精製
変異α鎖及び変異β鎖をそれぞれ含有する発現プラスミドを、別々にE.coli株BL21pLysSに形質転換し、１つのアンピシリン耐性コロニーを、TYP(アンピシリン100μg/ml)培地中で37℃にて0.4のOD600まで増殖させた後、0.5mMのIPTGでタンパク質発現を誘導した。誘導の３時間後に細胞をBeckman J-6B中での4000rpmにて30分間の遠心分離により採集した。細胞ペレットを、50mMのTris-HCl、25％(w/v)のスクロース、１mMのNaEDTA、0.1％(w/v)のNaAzide、10mMのDTTを含有する緩衝液(pH8.0)中に再懸濁した。一晩の凍結−解凍工程の後、再懸濁細胞を、Milsonix XL2020ソニケータ中での標準の12mm径プローブを使用する１分間のバーストで合計約10分間の超音波処理に付した。封入体ペレットを、Beckman J2-21遠心機における13000rpmにて30分間の遠心分離により回収した。次いで、３回の界面活性剤での洗浄を行い、細胞残渣及び膜成分を除去した。各回、封入体ペレットをTriton緩衝液(50mMのTris-HCl、0.5％のTriton-X100、200mMのNaCl、10mMのNaEDTA、0.1％(w/v)のNaAzide、２mMのDTT、pH8.0)中でホモジナイズした後、Beckman J2-21における13000rpmにて15分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、以下の緩衝液中での同様な洗浄により界面活性剤及び塩を除去した：50mMのTris-HCl、１mMのNaEDTA、0.1％(w/v)のNaAzide、２mMのDTT、pH8.0。最後に、封入体を30mgずつ小分けし、−70℃にて凍結させた。封入体タンパク質の収率を、６Ｍグアニジン-HClで可溶化し、Bradford色素結合アッセイ(PerBio)で測定することにより定量した。
可溶性TCRの変性：30mgの可溶化TCRβ鎖封入体及び60mgの可溶化TCRα鎖封入体を凍結ストックから解凍した。封入体を、６Ｍグアニジン溶液中５mg/mlの最終濃度に希釈し、DTT(２Ｍストック)を10mMの最終濃度まで添加した。混合物を37℃にて30分間インキュベートした。
可溶性TCRのリフォールディング：１Ｌのリフォールディング緩衝液を５℃±３℃にて勢いよく撹拌した。レドックスカップル(2-メルカプトエチルアミン及びシスタミン)を約５分間加えた(それぞれ6.6mM及び3.7mMの最終濃度まで)後、変性TCR鎖を添加した。次いで、タンパク質を、５℃±３℃にて撹拌しながら、約５時間±15分間リフォールディングさせた。
リフォールディングした可溶性TCRの透析：リフォールディングしたTCRを、Spectrapor 1メンブレン(Spectrum；製品番号132670)において、10Ｌの10mM Tris(pH8.1)に対して、５℃±３℃にて18〜20時間透析した。その後、透析緩衝液を新鮮な10mM Tris(pH8.1)(10Ｌ)に交換し、透析を５℃±３℃にて更に20〜22時間続けた。
実施例３ − 特異pMHCへのsTCR結合のBIAcore表面プラズモン共鳴特徴付け
表面プラズモン共鳴バイオセンサ(BIAcore 3000TM)を使用して、ペプチド−MHCリガンドへのsTCRの結合を分析した。これは、半配向様式(semi-oriented fashion)でストレプトアビジン被覆結合表面に固定した単一pMHC複合体(下記で説明)を作製し、同時に４つまでの異なるpMHC(別個のフローセルに固定)への可溶性Ｔ細胞レセプターの結合の効率的な試験を可能にすることにより容易となった。HLA複合体の手動での注入により、正確なレベルの固定化クラスＩ分子を容易に操作することが可能となった。
この固定化複合体は、Ｔ細胞レセプター及びコレセプターCD8αα(共に可溶相に注入され得る)の両方に結合することができる。TCRの特異的結合は低濃度(少なくとも40μg/ml)でさえ得られ、このことはTCRが比較的安定であることを示唆する。sTCRのpMHC結合特性は、sTCRが可溶相又は固定相のいずれかで使用される場合、量的及び質的に類似していることが観察される。このことは、可溶種の部分的活性についての重要なコントロールであり、またビオチン化pMHC複合体が非ビオチン化複合体と同様に生物学的に活性であることを示唆する。
ビオチン化クラスＩ HLA-A2−ペプチド複合体を、構成サブユニットタンパク質及び合成ペプチドを含有する細菌発現封入体から、インビトロでリフォールディングさせ、続いて精製及びインビトロ酵素ビオチン化した(O'Callaghanら(1999) Anal. Biochem. 266: 9-15)。前記タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインと置換したＣ末端ビオチン化タグを有するHLA−重鎖を適切な構築物中で発現させた。〜75mg/リットル細菌培養物の封入体発現レベルが得られた。HLA−軽鎖又はβ2-ミクログロブリンもまた、E.coli中で適切な構築物から封入体として〜500mg/リットル細菌培養物のレベルで発現させた。
E. coli細胞を溶解し、封入体を約80％純度まで精製した。封入体からのタンパク質を６Ｍのグアニジン-HCl、50 mMのTris(pH8.1)、100mMのNaCl、10mMのDTT、10mMのEDTA中で変性させ、５℃より低いリフォールディング緩衝液中に変性タンパク質の単一パルス(single pulse of denatured protein)を添加することにより、0.4ＭのL-アルギニン-HCl、100mMのTris(pH8.1)、3.7mMのシスタミン、４mg/mlのペプチド(例えば、tax 11-19)中で30mg/リットルの重鎖、30mg/リットルのβ2mの濃度にてリフォールディングさせた。リフォールディングは、４℃にて少なくとも１時間で完了に到達させた。
緩衝液を、10容量の10mM Tris(pH8.1)での透析により交換した。溶液のイオン強度を十分に減少させるために、２回の緩衝液交換が必要であった。次いで、タンパク質溶液を1.5μm酢酸セルロースフィルターに通して濾過し、POROS 50HQアニオン交換カラム(８ml床容量)に充填した。タンパク質を０〜500mMのNaCl線形勾配で溶出させた。HLA-A2−ペプチド複合体は約250mM NaClで溶出した。ピーク画分を収集し、プロテアーゼインヒビターのカクテル(Calbiochem)を加え、画分を氷上で冷却した。
ビオチン化タグを付したHLA複合体を、10mM Tris(pH8.1)、５mM NaCl中に、同じ緩衝液中で平衡化したPharmacia迅速脱塩カラムを使用して移して緩衝液を交換した。溶出に際して即座に、タンパク質含有画分を氷上で冷却し、プロテアーゼインヒビターカクテル(Calbiochem)を加えた。次いで、ビオチン化試薬を加えた：１mMビオチン、５mM ATP(pH８に緩衝化)、7.5mM MgCl2及び５μg/ml BirA酵素(O’Callaghanら(1999）Anal．Biochem．266：9-15に従って精製)。次いで、混合物を室温にて一晩インキュベートした。
ゲル濾過クロマトグラフィーを使用してビオチン化HLA複合体を精製した。Pharmacia Superdex 75 HR 10/30カラムを濾過PBSで予め平衡化し、１mlのビオチン化反応混合物を充填し、カラムをPBSで0.5ml/分にて展開した。ビオチン化HLA複合体は、約15mlで単一ピークとして溶出した。タンパク質を含む画分をプールし、氷上で冷却し、プロテアーゼインヒビターカクテルを加えた。クーマシー結合アッセイ(PerBio)を使用してタンパク質濃度を測定し、ビオチン化HLA複合体のアリコートを−20℃で凍結保存した。標準的なアミンカップリング法によりストレプトアビジンを固定化した。
新規な鎖間結合を含むA6 Tax scTCRとそのリガンド/MHC複合体又は無関係のHLA−ペプチド組合せ(これらの製造は上記で説明)との間の相互作用を、BIAcore 3000TM表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサで分析した。SPRは、レセプターリガンド相互作用を検出しその親和性及び動力学的パラメータを分析するために使用することができる原理である、小さなフローセル内のセンサ表面近くでの屈折率の変化(応答単位(RU)で表示)を測定する。β2mに架橋したビオチンとフローセルの活性化表面に化学的に架橋されているストレプトアビジンとの間の結合を介して、個々のHLA−ペプチド複合体を別個のフローセルに固定化することにより、プローブフローセルを準備した。次いで、異なるフローセルの表面上にscTCRを一定流速で通過させ、そうしている間のSPR応答を測定することにより、アッセイを実施した。最初に、sTCRを５μl/分の一定流速で２つの異なる表面(一方は〜5000RUの特異ペプチド−HLA複合体を被覆し、２つめは〜5000RUの非特異ペプチド−HLA複合体を被覆)上を通過させることにより、相互作用の特異性を検証した。ペプチド−HLA複合体上に一定流速で異なる濃度の可溶性sTCRを注入してバックグランドの共鳴を規定した。これらコントロールの測定値を、特異ペプチド−HLA複合体を用いて得られた値から減算し、これを使用して解離定数Kdとして表される結合親和性を算出した(Price及びDwek、Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists(第２版)1979，Clarendon Press、Oxford)。
得られたKd値(1.8μM)は、新規ジスルフィド結合を有しないA6 Tax sTCRとpMHCとの間の相互作用について報告された値(0.91μM − Dingら，1999，Immunity 11:45-56)に近い。
実施例４ − 新規なジスルフィド結合を含有する可溶性JM22 TCRの作製
実施例１で調製した可溶性A6 TCRのβ鎖は、その天然型配列に、連結部位としての使用に適切なBglII制限部位(AAGCTT)を含有する。
PCR変異誘発を下記に詳述するように行い、可溶性A6 TCRのα鎖中に新規システインコドンの5'側でBamH1制限部位(GGATCC)を導入した。図1aに記載する配列をこの変異誘発のテンプレートとして使用した。以下のプライマーを使用した：
Figure 2008514685
100ngのプラスミドを５μlの10mM dNTP、25μlの10×Pfu緩衝液(Stratagene)、10ユニットのPfuポリメラーゼ(Stratagene)と混合し、最終容量をH20で240μlに調整した。48μlのこの混合物に、50μlの最終反応容量中0.2μMの最終濃度が得られるように希釈したプライマーを補充した。30秒間95℃の最初の変性工程の後、反応混合物を、Hybaid PCR迅速PCR装置で、15回の変性(95℃、30秒間)、アニーリング(55℃、60秒間)及び伸長(73℃、８分間)に付した。次いで、産物を、10ユニットのDpnI制限酵素(New England Biolabs)で５時間37℃にて消化した。10μlの消化反応物をコンピテントなXL1-Blue細菌中に形質転換させ、37℃にて18時間増殖させた。１つのコロニーを採取し、５ml TYP＋アンピシリン(16g/l Bacto-Tryptone、16g/l酵母抽出物、５g/l NaCl、2.5g/l K2HPO4、100mg/lアンピシリン)中で一晩増殖させた。プラスミドDNAをQiagen mini-prepカラム上で製造業者の指示に従って精製し、配列を自動配列決定により検証した。α鎖中に導入した変異は「サイレント」であったので、この鎖のアミノ酸配列は図2aで詳述したものから変化しないままであった。この変異α鎖のDNA配列を図3aに示す。
新規ジスルフィド結合が組み込まれている可溶性JM22 TCRを作製するため、α鎖BamHI及びβ鎖BglII制限部位を含有するA6 TCRプラスミドをテンプレートとして使用した。以下のプライマーを使用した：
Figure 2008514685
JM22 TCRα鎖及びβ鎖の構築物を、以下のとおりのPCRクローニングにより取得した。PCR反応を上記のプライマー及びJM22 TCR鎖を含有するテンプレートを使用して行った。PCR産物を該当する制限酵素で制限消化し、pGMT7中にクローニングして発現プラスミドを取得した。プラスミド挿入物の配列を、自動DNA配列決定により確証した。図3b及び図3cはそれぞれ、JM22 TCRの変異したα鎖及びβ鎖のDNA配列を示し、図4a及び図4bは得られるアミノ酸配列を示す。
それぞれのTCR鎖を、実施例１及び２に記載のように、発現させ、同時リフォールディングさせ、精製した。
pMHCへのJM22 TCRの結合のBiacore分析を、実施例３に記載のように実施した。HLA−flu複合体に関するこのジスルフィド連結TCRのKdは、7.9±0.51μMであると決定された。
実施例５ − 新規ジスルフィド鎖間結合を含有する可溶性AH-1.23 TCRの作製
AH-1.23 TCRをコードするcDNAを、Hill Gaston(Medical School，Addenbrooke's Hospital，Cambridge)より供給されたＴ細胞から、公知技術に従って単離した。NY-ESO TCRをコードするcDNAは、mRNAの逆転写酵素での処理により作製した。
新規ジスルフィド結合が組み込まれている可溶性AH-1.23 TCRを作製するため、α鎖BamHI制限部位及びβ鎖BglII制限部位を含有するTCRプラスミドを、実施例４に記載のようにフレームワークとして使用した。以下のプライマーを使用した：
Figure 2008514685
AH-1.23 TCRα鎖及びβ鎖の構築物を、以下のとおりのPCRクローニングにより取得した。
PCR反応を上記のプライマー及びAH-1.23 TCR鎖を含有するテンプレートを使用して行った。PCR産物を該当する制限酵素で制限消化し、pGMT7中にクローニングして発現プラスミドを取得した。プラスミド挿入物の配列を、自動DNA配列決定により確証した。図5a及び図5bはそれぞれ、AH-1.23 TCRの変異したα鎖及びβ鎖のDNA配列を示し、図6a及び図6bは得られるアミノ酸配列を示す。
それぞれのTCR鎖を、実施例２に記載のように、発現させ、同時リフォールディングさせ、精製した。
実施例６ − 可溶性AH-1.23 TCR−IL-10融合タンパク質の作製
次いで、図7aに詳述する成熟ヒトIL-10 DNA配列を含み、該IL-10 DNA配列の5’末端に多くのDNA伸長物のうちの１つを含む合成遺伝子を作製することができる。5'DNA伸長物は、IL-10 DNAをAH1.23 TCRβ鎖をコードするDNAに付着させるために使用するリンカー配列である。
リンカー配列：
cccggg − これは、Xma1制限酵素部位を含むPro-Glyリンカーをコードする。
ggatccggcggtccg (配列番号：17) − これは、BamH1制限酵素部位を含むGly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：18)リンカーをコードする。
ggatccggtgggggcggaagtggaggcagcggtggatccggcggtccg (配列番号：19) − これは、２つのBamH1制限酵素部位を含むGly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：20)リンカーをコードする。
次いで、上記合成遺伝子の１つを、実施例５に記載のように作製したAH1.23 TCRβ鎖を含有するpGMT7プラスミド中にサブクローニングし、TCRβ鎖−リンカー−IL-10融合タンパク質をコードするDNA配列を生成する。
AH1.23 TCRβ鎖−Pro-Gly−IL-10融合体のDNA配列及びアミノ酸配列を図8a及び図8bにそれぞれ詳述する。
AH1.23 TCRβ鎖−Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：18)−IL-10融合体のDNA配列及びアミノ酸配列を図9a及び図9bにそれぞれ詳述する。
AH1.23 TCRβ鎖−Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：20)−IL-10融合体のDNA配列及びアミノ酸配列を図10a及び図10bにそれぞれ詳述する。
次いで、これらAH1.23 TCRβ鎖−リンカー−IL-10融合タンパク質を、実施例２に詳述した方法を使用して、AH1.23 TCRα鎖と共にリフォールディングさせて、完全な可溶性AH1.23 TCR−IL-10融合タンパク質を作製する。
上記に詳述した方法は、IL-10モノマーがTCRβ鎖のＣ末端に付着した可溶性αβTCRの作製を説明する。IL-10は、ホモダイマーの形態で見出されることが多い。したがって、可溶性AH1.23 TCRに付着させたIL-10ポリペプチドを二量体化することは有利であり得る。これは多くの方法で達成することができる。例えば、成熟形態ヒトIL-10ホモダイマーの単鎖形をTCRβ鎖に融合した後にTCRα鎖とリフォールディングさせることができる。或いは、溶液状態の成熟形態ヒトIL-10を、可溶性TCRα鎖とのリフォールディングの前の上記のように形成したTCRβ鎖−IL-10融合タンパク質に、又はリフォールディングしたαβTCR−IL-10融合タンパク質に添加することができる。或いは、本実施例においてTCRβ鎖−IL-10融合タンパク質の作製について記載した方法を使用して、追加のIL-10分子をTCRα鎖に融合タンパク質として付加することができる。次いで、実施例２に記載の方法を使用して、２つのTCR鎖−IL-10融合タンパク質を一緒にリフォールディングさせることができる。最後に、各々がTCRβ鎖に連結した１つのIL-10ポリペプチドを含有する２つのTCRを含んでなる複合体は、IL-10ポリペプチドのホモ二量体化により形成してもよい。これにより以下のタイプの複合体の形成が生じる：
αβTCR−IL-10ホモダイマー−αβTCR
実施例７ − 可溶性のAH-1.23 TCR−IL-4融合タンパク質及びAH-1.23 TCR−IL-13融合タンパク質の作製
実施例６で詳述した方法はまた、他のペプチドに連結した可溶性AH-1.23 TCRを含有する融合タンパク質を作製するためにも使用することができる。
図11aに詳述する成熟ヒトIL-4 DNA配列及び実施例６で列挙した5'DNA伸長配列の１つを含む合成遺伝子を構築し、実施例５で記載したように作製したAH1.23 TCRβ鎖を含有するpGMT7プラスミド中にサブクローニングして、TCRβ鎖−リンカー−IL-4融合タンパク質をコードするDNA配列を生成することができる。
AH1.23 TCRβ鎖−Pro-Gly−IL-4融合体のDNA配列及びアミノ酸配列をそれぞれ図12a及び図12bに詳述する。
AH1.23 TCRβ鎖−Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：18)−IL-4融合体のDNA配列及びアミノ酸配列をそれぞれ図13a及び図13bに詳述する。
AH1.23 TCRβ鎖−Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：20)−IL-4融合体のDNA配列及びアミノ酸配列をそれぞれ図14a及び図14bに詳述する。
図15aに詳述した成熟ヒトIL-13 DNA配列及び実施例６に列挙した5'DNA伸長配列の１つを含む合成遺伝子を構築し、実施例５で記載したように作製したAH1.23 TCRβ鎖を含有するpGMT7プラスミド中にサブクローニングして、TCRβ鎖−リンカー−IL-13融合タンパク質をコードするDNA配列を生成することができる。
AH1.23 TCRβ鎖−Pro-Gly−IL-13融合体のDNA配列及びアミノ酸配列をそれぞれ図16a及び図16bに詳述する。
AH1.23 TCRβ鎖−Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：18)−IL-13融合体のDNA配列及びアミノ酸配列をそれぞれ図17a及び図17bに詳述する。
AH1.23 TCRβ鎖−Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：20)−IL-13融合体のDNA配列及びアミノ酸配列をそれぞれ図18a及び図18bに詳述する。
次いで、これらAH1.23 TCRβ鎖−リンカー−インターロイキン融合タンパク質を、実施例２に詳述した方法を使用して、AH1.23 TCRα鎖と共にリフォールディングさせて、完全な可溶性AH1.23 TCR−インターロイキン融合タンパク質を作製する。
実施例10 − AH1.23 TCR−IL-10融合タンパク質がマスト細胞増殖を引き起こす能力を評価するためのチミジン組込みアッセイ
IL-4の存在下でヒトIL-10に応答して増殖するD36マウスマスト細胞株の５×106細胞を、RPMI 1640培地で培養する。
実施例９で記載のように作製した一連(０、0.01、0.1、0.5及び１μM)のAH1.23 TCR−IL-10融合タンパク質及びIL-4を上記培養物に加える(Schlaakら，(1994) J Immunological Methods 168 49-54)。
次いで、1.85MBq/mlのH3チミジンを、96ウェルプレート中の上記培養物１×105細胞に加える。次いで、これら培養物を37℃、５％CO2にて更に８時間インキュベートする。細胞採集機を用いて細胞を採集し、細胞中へのチミジン組込みレベルをTop Count βカウンターを用いて測定する。
AH1.23 TCR−IL-10融合タンパク質の不在下で観察される組込みと比較して、該融合タンパク質の存在下でのD36細胞中へのチミジン組込みの減少は、該融合タンパク質のIL-10部分が活性であり、D36マスト細胞の増殖を引き起こすことを示している。
実施例11 − 高親和性NY-ESO MTCR−治療剤融合タンパク質の作製
多くの免疫調節剤をコードするDNAにペプチドリンカーをコードするDNA配列を介して連結した図23aに詳述した可溶性高親和性c61 NY-ESO TCRβ鎖をコードするDNA配列を含んでなる合成遺伝子を合成した：
適切なDNAサービスを提供する多くの会社(例えばGeneart(ドイツ))が存在する。
図24aは、IL-18にペプチドリンカーを介してＣ末端で連結した高親和性c61 NY-ESO MTCRβ鎖をコードするDNA配列を詳述する。図24bは、この融合タンパク質のAA配列を詳述する。ペプチドリンカーに下線を付している。
図25aは、高親和性c61 NY-ESO MTCRβ鎖にペプチドリンカーを介してＣ末端で連結したIL-18プロタンパク質コードするDNA配列を詳述する。プロIL-18 DNA配列は、プロ配列内のアミノ酸の翻訳後除去を容易にする第Ｘ因子開裂部位をコードするように変更されている。図25bは、この融合タンパク質のAA配列を詳述する。ペプチドリンカーに下線を付している。
図26aは、IL-10にペプチドリンカーを介してＣ末端で連結した高親和性c61 NY-ESO MTCRβ鎖をコードするDNA配列を詳述する。図26bは、この融合タンパク質のAA配列を詳述する。ペプチドリンカーに下線を付している。
図27aは、IL-13にペプチドリンカーを介してＣ末端で連結した高親和性c61 NY-ESO MTCRβ鎖をコードするDNA配列を詳述する。図27bは、この融合タンパク質のAA配列を詳述する。ペプチドリンカーに下線を付している。
図28aは、PE38外毒素の「KDEL」変形体にペプチドリンカーを介してＣ末端で連結した高親和性c61 NY-ESO MTCRβ鎖をコードするDNA配列を詳述する。図28bは、この融合タンパク質のAA配列を詳述する。ペプチドリンカーに下線を付している。
上記c61 NY-ESO TCRβ鎖のDNA配列は、pEX821ベクター中にライゲートすることができる(このベクターのDNA配列及びプラスミドマップについてはそれぞれ図19及び図20を参照)。
次いで、ジスルフィド連結αβTCR−治療剤は、実施例２で実質的に記載された方法に従って作製される。簡潔には、図29aに詳述した高親和性c61 NY-ESOα鎖をコードするDNAを合成し、pEX954ベクター中にライゲートする(このベクターのDNA配列及びプラスミドマップについてはそれぞれ図21及び図22を参照)。次いで、上記のTCRβ鎖融合タンパク質を、c61 NY-ESO TCRα鎖の存在下でリフォールディングさせる。
図29aは高親和性c58 NY-ESO MTCRα鎖をコードするDNA配列を詳述し、図29bは、図29aのDNA配列によりコードされるAA配列を詳述する。
実施例12 − MTCR−PE-38融合タンパク質の細胞毒性アッセイ
１×10-6の所要の標的細胞(例えば、SK-MEL腫瘍細胞又はJ82細胞)を10mlのRPMI培地＋10％ウシ胎仔血清(FCS)中に懸濁した。要すれば、次いで、標的細胞を10μMの同族ペプチドで２時間37℃にてパルスした。次いで、サンプルをRPMI＋10％FCS中で３回洗浄し、各洗浄と洗浄の間に1200rpmにて５分間遠心分離した。次いで、洗浄した細胞を再度計数し、適切な容量のRPMI＋10％FCS培地中に再懸濁して、２×105細胞/mlの最終細胞密度を得た。
実施例11に記載のように作製したMTCR−PE38融合タンパク質をRPMI培地＋10％FCS中で２×10-6Ｍの最終濃度に希釈し、作業標準(working standard)を得た。その後、この作業標準を使用して系列希釈物のセットを作製した。
マイクロタイタープレートウェル中における実験サンプル及びコントロールサンプルの作製：
96ウェル平底白色不透明壁プレート(Nunc 136101)において、実験サンプルウェルに50μlの培地中のmTCR−PE38及び50μlの培地中の細胞を満たし総容量100μlとした。上記のように作製したmTCR−PE38系列希釈物を使用して、これらのウェル中にmTCR−PE38の一連の濃度を得た。
コントロールサンプルウェルは、100μlの細胞(細胞のみのコントロール)又は100μlのmTCR−PE38及び培地(エフェクターのみのコントロール)のいずれかを用いて準備した。
次いで、実験サンプル及びコントロールサンプルを37℃、５％CO2にて48時間又は96時間インキュベートした。次いで、各ウェル中に残存する生存細胞の数を、CellTiter-Glo(登録商標)Luminescentアッセイ(Promega カタログ番号：G7572)を製造業者の指示に従って用いて評価した。
結果
図30a及び図30bにより、NY-ESO+ SK-MEL 37腫瘍細胞株及びMel 624腫瘍細胞株は1G4 MTCR−PE38融合タンパク質により殺傷できることが証明される。
それぞれ5.9×10-9Ｍ及び１×10-8Ｍの48時間インキュベーション後のSK-MEL 37腫瘍細胞株及びMel 624腫瘍細胞株に対する1G4 MTCR−PE38融合タンパク質の効果に関するEC50値を、図30aに示したデータから算出した。
それぞれ5.7×10-9Ｍ及び2.1×10-8Ｍの96時間インキュベーション後のSK-MEL 37腫瘍細胞株及びMel 624腫瘍細胞株に対する1G4 MTCR−PE38融合タンパク質の効果に関するEC50値を、図30bに示したデータから算出した。
図30a及び図30bにより提供される結果は共に、J82標的細胞の同族SLLMWITQC NY-ESOペプチドでのパルスが、パルスしていないJ82標的細胞で観察される殺傷と比較して、NY-ESO TCR−PE38構築物によるこれら細胞のより効率的な殺傷を導くことを証明する。
図1a及び図1bは、それぞれ、システインコドンを導入するように変異した可溶性A6 TCRのα鎖及びβ鎖の核酸配列を示す。導入したシステインコドンを影付きで示す。 図2aは、新規なジスルフィド鎖間結合を作製するために使用するT48→Ｃ変異(下線部)を含むA6 TCRα鎖細胞外アミノ酸配列を示す。図2bは、新規なジスルフィド鎖間結合を作製するために使用するS57→Ｃ変異(下線部)を含むA6 TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列を示す。 図3aは、BamH1制限部位が組み込まれるように変異した新規システイン残基を含むA6 TCRα鎖配列を示す。BamH1制限部位を形成するために導入した変異を影付きで示す。図3b及び図3cは、非天然型ジスルフィド結合を形成するための追加のシステイン残基を含むように変異したJM22 TCRのα鎖及びβ鎖のDNA配列を示す。 図4a及び図4bは、それぞれ、図3b及び図3cのDNA配列から作製したJM22 TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列を示す。 図5a及び図5bは、それぞれ、新規システインコドン(影付きで示す)を導入するように変異した可溶性AH-1.23 TCRのα鎖及びβ鎖のDNA配列を示す。 図6a及び図6bは、それぞれ、図5a及び図5bのDNA配列から作製したAH-1.23 TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列を示す。 図7aは成熟ヒトIL-10のDNA配列を示し、図7bは成熟ヒトIL-10のアミノ酸配列を示す。 図8aは、Pro-Glyリンカーを介して成熟ヒトIL-10に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列を示す。導入システインを影付きで示す。Pro-GlyリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。 図8bは、Pro-Glyリンカーを介して成熟ヒトIL-10に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列を示す。導入システインを影付きで示す。Pro-Glyリンカーに下線を付す。 図9aは、Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-10に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列を示す。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。 図9bは、Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-10に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列を示す。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーに下線を付す。 図10a − Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-10に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列を示す。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。 図10b − Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-10に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列を示す。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーに下線を付す。 図11aは成熟ヒトIL-4のDNA配列を示し、図11bは成熟ヒトIL-4のアミノ酸配列を示す。 図12aは、Pro-Glyリンカーを介して成熟ヒトIL-4に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列を示す。導入システインを影付きで示す。Pro-GlyリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。 図12bは、Pro-Glyリンカーを介して成熟ヒトIL-4に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列を示す。導入システインを影付きで示す。Pro-Glyリンカーに下線を付す。 図13aは、Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-4に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列を示す。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。図13bは、Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-4に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列を示す。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーに下線を付す。 図14aは、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-4に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列を示す。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。図14bは、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-4に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列を示す。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーに下線を付す。 図15aは成熟ヒトIL-13のDNA配列を示し、図15bは成熟ヒトIL-13のアミノ酸配列を示す。 図16aは、Pro-Glyリンカーを介して成熟ヒトIL-13に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列を示す。導入システインを影付きで示す。Pro-GlyリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。図16bは、Pro-Glyリンカーを介して成熟ヒトIL-13に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列を示す。導入システインを影付きで示す。Pro-Glyリンカーに下線を付す。 図17aは、Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-13に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列を示す。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。図17bは、Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-13に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列を示す。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーに下線を付す。 図18aは、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-13に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するAH1.23 TCRβ鎖のDNA配列を示す。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列に下線を付す。図18bは、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーを介して成熟ヒトIL-13に連結した、新規鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するAH1.23 TCRβ鎖のアミノ酸配列を示す。導入システインを影付きで示す。Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーに下線を付す。 図19はpEX821プラスミドのDNA配列を詳述する。 図19-1の続きである。 図20はpEX821ベクターのプラスミド地図を提供する。このプラスミドのDNA配列は図19に提供される。 図21はpEX954プラスミドのDNA配列を詳述する。 図21-1の続きである。 図22はpEX954プラスミドのプラスミド地図を提供する。このプラスミドのDNA配列は図21に提供される。 図23aは、高親和性c61 NY-ESO MTCRβ鎖をコードするDNA配列を詳述する。図23bは、図23aのDNA配列によりコードされるAA配列を詳述する。 図24aは、Ｃ末端でペプチドリンカーを介してIL-18に連結した高親和性c61 NY-ESO MTCRβ鎖をコードするDNA配列を詳述する。図24bはこの融合タンパク質のAA配列を詳述する。ペプチドリンカーに下線を付す。 図25aは、Ｃ末端でペプチドリンカーを介して高親和性c61 NY-ESO MTCRβ鎖に連結したIL-18プロタンパク質をコードするDNA配列を詳述する。プロIL-18 DNAは、第Ｘ因子の開裂部位をコードするように変更されている。図25bは、この融合タンパク質のAA配列を詳述する。ペプチドリンカーに下線を付す。 図26aは、Ｃ末端でペプチドリンカーを介してIL-10に連結した高親和性c61 NY-ESO MTCRβ鎖をコードするDNA配列を詳述する。図26bはこの融合タンパク質のAA配列を詳述する。ペプチドリンカーに下線を付す。 図27aは、Ｃ末端でペプチドリンカーを介してIL-13に連結した高親和性c61 NY-ESO MTCRβ鎖をコードするDNA配列を詳述する。図27bはこの融合タンパク質のAA配列を詳述する。ペプチドリンカーに下線を付す。 図28aは、Ｃ末端でペプチドリンカーを介してPE38外毒素の「KDEL」変形体に連結した高親和性c61 NY-ESO MTCRβ鎖をコードするDNA配列を詳述する。図28bはこの融合タンパク質のAA配列を詳述する。ペプチドリンカーに下線を付す。 図29aは、高親和性c58 NY-ESO MTCRα鎖をコードするDNA配列を詳述する。図29bは、図29aのDNA配列によりコードされるAA配列を詳述する。 図30はMTCR−PE-38融合タンパク質の細胞毒性アッセイの結果を示す。

Claims (37)

  1. 治療剤が、IL-1、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、IL-23、TGF-β、IFN-γ、リンホトキシン、TNFα、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD44抗体、抗CD45RA抗体、抗CD45RB抗体、抗CD45RO抗体、抗Thy 1.2抗体、抗リンパ球グロブリン、抗αβTCR抗体、抗γδTCR抗体、抗CD49a抗体、抗CD49b抗体、抗CD49c抗体、抗CD49d抗体、抗CD49e抗体、抗CD49f抗体、抗TCR Vβ8抗体、抗CD16抗体、抗CD28抗体、CTLA-4-Ig、抗B7.2抗体、抗CD40L抗体、抗ICAM-1抗体、ICAM-1、抗Mac抗体、抗LFA-1抗体、抗IFN-γ抗体 IFN-γ、IFN-γR/IgG1融合体、抗IL-2R抗体、IL-2R抗体、IL-2 ジフテリアトキシンタンパク質、抗IL-12抗体、IL-12アンタゴニスト(p40)、抗IL-1抗体、IL-1アンタゴニスト、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)、抗GAD抗体、ウイルス性のタンパク質及びペプチド、細菌性のタンパク質又はペプチド、Ａ-ガラクトシル-セラミド、カルシトニン、ニコチンアミド、抗酸化剤(ビタミンＥ、プロブコールアナログ、プロブコール＋デフラザコート又はアミノグアニジン)、抗炎症剤(ペントキシフィリン又はロリプラム)、免疫調節剤(リノマイド、Ling-zhi-8、D-グルカン、多機能プロテイン14、シアメクソン、コレラ毒Ｂ、バナデート又はビタミンD3アナログ、小分子CD80阻害剤、アンドロゲン、IGF-I、免疫応答力操作(天然抗体)、狼瘡イディオタイプ、リポ多糖)、スルファチド、ハチ毒、漢方薬、シリカ、ガングリオシド、抗アシアロGM-1抗体、ヒアルロニダーゼ、コンカナバリンＡ、抗クラスＩ MHC抗体又は抗クラスII MHC抗体、シクロスポリン、FK-506、アザチオプリン、ラパマイシン又はデオキシスペルグアリン、PE38シュードモナス外毒素から選択され、
    TCRが、
    TCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRα鎖可変ドメイン配列に対応するアミノ酸配列により構成される第１のセグメント、
    TCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRβ鎖可変ドメインに対応するアミノ酸配列により構成される第２のセグメント、
    天然型αβＴ細胞レセプター中に等価物を有しないジスルフィド結合である第１の鎖と第２の鎖との間のジスルフィド結合
    を含んでなり、
    第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に又はその逆に連結するリンカー配列を更に含んでなるscTCRの場合には、リンカー配列の長さ及びジスルフィド結合の位置は、第１及び第２のセグメントの可変ドメイン配列が天然型αβＴ細胞レセプター中と実質的に同様に互いに配向するような長さ及び位置である、
    治療剤と結合した二量体TCR(dTCR)又は単鎖TCR(scTCR)。
  2. 治療剤がIL-1、IL-1α、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、TGF-β、リンホトキシン、TNFα、抗CD2抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD44抗体、抗CD45RA抗体、抗CD45RB抗体、抗CD45RO抗体、抗Thy 1.2抗体、抗リンパ球グロブリン、抗αβTCR抗体、抗γδTCR抗体、抗CD49a抗体、抗CD49b抗体、抗CD49c抗体、抗CD49d抗体、抗CD49e抗体、抗CD49f抗体、抗TCR Vβ8抗体、抗CD16抗体、抗CD28抗体、CTLA-4-Ig、抗B7.2抗体、抗CD40L抗体、抗ICAM-1抗体、ICAM-1、抗Mac抗体、抗LFA-1抗体、抗IFN-γ抗体 IFN-γ、IFN-γR/IgG1融合体、抗IL-2R抗体、IL-2R抗体、IL-2 ジフテリアトキシンタンパク質、抗IL-12抗体、IL-12アンタゴニスト(p40)、抗IL-1抗体、IL-1アンタゴニスト、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)、抗GAD抗体、ウイルス性のタンパク質及びペプチド、細菌性のタンパク質又はペプチド、Ａ-ガラクトシル-セラミド、カルシトニン、ニコチンアミド、抗酸化剤(ビタミンＥ、プロブコールアナログ、プロブコール＋デフラザコート又はアミノグアニジン)、抗炎症剤(ペントキシフィリン又はロリプラム)、免疫調節剤(リノマイド、Ling-zhi-8、D-グルカン、多機能プロテイン14、シアメクソン、コレラ毒Ｂ、バナデート又はビタミンD3アナログ、小分子CD80阻害剤、アンドロゲン、IGF-I、免疫応答力操作(天然抗体)、狼瘡イディオタイプ、リポ多糖)、スルファチド、ハチ毒、漢方薬、シリカ、ガングリオシド、抗アシアロGM-1抗体、ヒアルロニダーゼ、コンカナバリンＡ、抗クラスＩ MHC抗体又は抗クラスII MHC抗体、シクロスポリン、FK-506、アザチオプリン、ラパマイシン又はデオキシスペルグアリンから選択される請求項１に記載の治療剤と結合したdTCR又はscTCR。
  3. 治療剤がIL-10、IL-4又はIL-13の１つである請求項１に記載の治療剤と結合したdTCR又はscTCR。
  4. dTCR又はscTCRが組織特異的である請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療剤と結合したdTCR又はscTCR。
  5. dTCR又はscTCRが自己免疫疾患、臓器拒絶又は対宿主性移植片病(GVHD)における自己反応性Ｔ細胞の標的である組織に特異的である請求項４に記載の治療剤と結合したdTCR又はscTCR。
  6. dTCR又はscTCRが島細胞特異的である請求項４又は５に記載の治療剤と結合したdTCR又はscTCR。
  7. 治療剤がIL-15、IL-21、IL-23、PE38シュードモナス外毒素、IFN-γ又は抗CD3抗体の１つからなる請求項１記載の治療剤と結合したdTCR又はscTCR。
  8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の治療剤と結合したdTCR。
  9. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の治療剤と結合したscTCR。
  10. リンカー配列が第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結している請求項９に記載の治療剤と結合したscTCR。
  11. リンカー配列が式-PGGG-(SGGGG)n-P- (式中、ｎは５又は６であり、Ｐはプロリンであり、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンである)を有する請求項９に記載の治療剤と結合したscTCR。
  12. dTCRが、
    TCRα鎖可変ドメイン配列に対応する配列がTCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合している第１のポリペプチド、及び
    TCRβ鎖可変ドメイン配列に対応する配列がTCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合している第２のポリペプチド
    を含んでなり、
    第１及び第２のポリペプチドは、天然型αβＴ細胞レセプター中に等価物を有しないジスルフィド結合により連結されている、請求項８に記載の治療剤と結合したdTCR。
  13. dTCRが、
    TCRα鎖可変ドメイン配列に対応する配列がTCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合している第１のポリペプチド、及び
    TCRβ鎖可変ドメイン配列に対応する配列がTCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合している第２のポリペプチド
    を含んでなり、
    第１及び第２のポリペプチドがTRAC*01のエキソン１のThr 48及びTRBC1*01若しくはTRBC2*01のエキソン１のSer 57又はそれらの非ヒト等価物に置換したシステイン残基同士間のジスルフィド結合により連結されている、請求項８に記載の治療剤と結合したTCR。
  14. dTCR又はscTCRがヒトαβTCRの細胞外定常ドメイン配列及び可変ドメイン配列に対応するアミノ酸配列を有する請求項１〜１３のいずれか１項に記載の治療剤と結合したTCR。
  15. ジスルフィド結合が定常ドメイン配列のアミノ酸残基同士を連結し、該ジスルフィド結合は天然型TCR中に等価物を有しない、請求項１４に記載の治療剤と結合したTCR。
  16. ジスルフィド結合が、β炭素原子が天然型TCR中で0.6nm未満離れたアミノ酸残基に対応するシステイン残基同士間にある、請求項１５に記載の治療剤と結合したTCR。
  17. ジスルフィド結合が、TRAC*01のエキソン１のThr 48及びTRBC1*01若しくはTRBC2*01のエキソン１のSer 57又はそれらの非ヒト等価物に置換したシステイン残基同士間にある、請求項１５に記載の治療剤と結合したTCR。
  18. dTCR又はscTCRが、天然型TCR中のジスルフィド結合により連結される残基に対応する残基同士間のジスルフィド結合を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の治療剤と結合したTCR。
  19. dTCR又はscTCRが、天然型TCRの膜貫通配列に対応する配列も天然型TCRの細胞質配列に対応する配列も含有しない、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の治療剤と結合したTCR。
  20. 治療剤がPE38外毒素である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の治療剤と結合したTCR。
  21. 配列番号：73のアミノ酸配列及び配列番号：71のアミノ酸配列を含んでなる、請求項２０に記載のPE38外毒素と結合したTCR。
  22. TCRが少なくとも１つのポリアルキレングリコール鎖と結合している、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の治療剤と結合したTCR。
  23. ポリアルキレングリコール鎖がTCRに共有結合している、請求項２２に記載の治療剤と結合したTCR。
  24. ポリアルキレングリコール鎖が少なくとも２つのポリエチレングリコール反復単位を含んでなる、請求項２２又は２３に記載の治療剤と結合したTCR。
  25. 少なくとも２つの請求項１〜２４のいずれかに記載の治療剤と結合したTCRを含んでなる多価TCR複合体。
  26. 非ペプチド性ポリマー鎖又はペプチド性リンカー配列により連結した少なくとも２つの請求項１〜２４のいずれかに記載の治療剤と結合したTCRを含んでなる多価TCR複合体。
  27. ポリマー鎖又はペプチド性リンカー配列が、治療剤又はその機能的変形体若しくはフラグメントと結合したTCRの各々の可変領域配列中に位置しないアミノ酸残基同士間に伸びる、請求項２６に記載の多価TCR複合体。
  28. 治療剤と結合したTCRが、ヒト多量体化ドメインに由来するポリアルキレングリコール鎖又はペプチド性リンカーにより連結されている、請求項２６又は２７に記載の多価TCR複合体。
  29. 二価アルキレンスペーサ基が、複合体のポリアルキレングリコール鎖と、複合体の治療剤と結合したTCRへの結合点との間に位置している、請求項２８に記載の多価TCR複合体。
  30. ポリアルキレングリコール鎖が少なくとも２つのポリエチレングリコール反復単位を含んでなる、請求項２８又は２９に記載の多価TCR複合体。
  31. 請求項１〜２４のいずれか１項に記載の治療剤と結合したTCR又は請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の多価TCR複合体を、医薬的に許容されるキャリアと共に含んでなる、医薬組成物。
  32. 治療剤が請求項２に規定の治療剤から選択される請求項１〜２４のいずれか１項に記載の治療剤と結合したTCR又は請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の多価TCR複合体の有効量を、ガンを患う対象に投与することを含んでなるガンの治療法。
  33. 治療剤が請求項２に規定の治療剤から選択される請求項１〜２４のいずれか１項に記載の治療剤と結合したTCR又は請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の多価TCR複合体の、ガンの治療用組成物の製造における使用。
  34. 請求項２０又は２１に記載の融合タンパク質の有効量を、ガンを患う対象に投与することを含んでなるガンの治療法。
  35. ガンの治療用組成物の製造における請求項２０又は２１に記載の融合タンパク質の使用。
  36. 治療剤が請求項３に規定の治療剤から選択される請求項１〜２４のいずれか１項に記載の治療剤と結合したTCR又は請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の多価TCR複合体の有効量を、自己免疫疾患、臓器拒絶又はGVHDを患う対象に投与することを含んでなる、自己免疫疾患、臓器拒絶又はGVHDの治療法。
  37. 治療剤が請求項３に規定の治療剤から選択される請求項１〜２４のいずれか１項に記載の治療剤と結合したTCRの、自己免疫疾患、臓器拒絶又はGVHDの治療用組成物の製造における使用。
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