MX2013014388A

MX2013014388A - Exotoxina a de pseudomonas con epitopos de linfocitos t y/o linfocitos b menos inmunogenicos.

Info

Publication number: MX2013014388A
Application number: MX2013014388A
Authority: MX
Inventors: Richard Beers; Ira H Pastan; Ronit Mazor; Masanori Onda; Aaron Vassall; Jaime Eberle; Wenhai Liu
Original assignee: Health
Priority date: 2011-06-09
Filing date: 2012-06-07
Publication date: 2014-08-21
Also published as: JP2014523237A; CN103748107A; CA2838013C; US10428119B2; RU2627216C2; US9765123B2; ES2635416T3; WO2012170617A1; US20160215025A1; AU2017200541B2; EP3231812B1; US20170369535A1; US9346859B2; JP2017136066A; EP2718308B1; CA2838013A1; CN103748107B; AU2012268013B2; RU2013151655A; EP3231812A1

Abstract

La invención proporciona una exotoxina A de Pseudomonas (PE) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución de uno o más epitopos de los linfocitos B y/o los linfocitos T. La invención proporciona además, moléculas quiméricas relacionadas, así como ácidos nucleicos relacionados, vectores de expresión recombinantes, células hospederas, poblaciones de células y composiciones farmacéuticas. Además, la invención proporciona métodos para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, métodos para inhibir el crecimiento de una célula objetivo, métodos para producir la PE, y métodos para producir la molécula quimérica.

Description

EXOTOXINA A DE PSEUDOMONJÍS CON EPÍTOPOS DE LINFOCITOS T Y/O LINFOCITOS B MENOS INMÜNOGÉNICOS REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud de patente reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. 61/495,085, presentada el 9 de Junio del 2011, y la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. 61/535,668, presentada el 16 de Septiembre del 2011, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

INCORPORACIÓN COMO REFERENCIA DEL MATERIAL PRESENTADO DE MANERA ELECTRÓNICA En la presente, se incorpora como referencia en su totalidad un listado de secuencias nucleotídicas/de aminoácidos legible por computadora, presentado de manera concurrente con la presente e identificado como sigue: un archivo de 53,884 Bytes ASCII (Texto) nombrado "710339 ST25.TXT", con fecha del 2 de Junio del 2012.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La exotoxina A de Pseudomonas (PE) es una toxina bacteriana con actividad citotóxica que puede ser efectiva para destruir o inhibir el crecimiento de células indeseables, por ejemplo, células cancerosas. En consecuencia, la PE puede ser útil para tratar o prevenir enfermedades tales como por ejemplo, el cáncer. Sin embargo, la PE puede ser altamente inmunogénica . En consecuencia, la administración de la PE puede estimular una respuesta inmune anti-PE incluyendo, por ejemplo, la producción de anticuerpos y/o linfocitos T anti-PE, que de manera indeseada, neutralizan la actividad citotóxica de la PE. Tal inmunogenicidad puede reducir la cantidad de PE que puede darse al paciente, lo que a su vez, puede reducir la efectividad de la PE para tratar la enfermedad, por ejemplo, el cáncer. Así, existe la necesidad de una PE mejorada.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN Una modalidad de la invención proporciona una exotoxina A de Pseudomonas (PE) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302, con la condición de que cuando la secuencia de aminoácidos comprende una sustitución de alanina para el residuo de aminoácidos R302, se sustituye al menos uno de los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298 y L299, en donde los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302 se definen con referencia a la SEQ ID NO: 1, opcionalmente con una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1 y/o una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos T dentro de los residuos de aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1.

Otra modalidad de la invención proporciona una PE que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la Fórmula I: FCS - R1-! - R2P - R3„ - dominio funcional III de la PE (Fórmula I) en donde: m, n y p son, de manera independiente, 0 ó 1; FCS comprende una secuencia de residuos de aminoácidos de escisión con furina, secuencia la cual es escindible por la furina; R1 comprende 1 o más residuos de aminoácidos continuos de los residuos 285-293 de la SEQ ID NO: 1; R2 comprende X1VAX2X3X4AAX5LSW (SEQ ID NO: 2), en donde Xi, X2 y X son de manera independiente leucina, alanina, glicina, serina o glutamina; X3 es tirosina, alanina, glicina, serina o glutamina; y X5 es arginina, alanina, glicina, serina o glutamina; con la condición de que la PE no comprenda a LVALYLAARLSW (SEQ ID NO: 3) y que cuando X5 es alanina, al menos uno de Xif X2, X3 y X es alanina, glicina, serina o glutamina; R3 comprende 1 o más residuos de aminoácidos continuos de los residuos 306-394 de la SEQ ID NO: 1; y el dominio funcional III de la PE comprende los residuos 395-613 de la SEQ ID NO: 1, opcionalmente con una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1 y/o a sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos T dentro de los residuos de aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1.

Aún otra modalidad de la invención proporciona una PE que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y 558 de la SEQ ID NO: 1; con la condición de que cuando el residuo de aminoácidos en la posición Q485 o L516 se sustituye con alanina, se sustituye al menos un residuo de aminoácidos adicional en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1, y cuando el residuo de aminoácidos en la posición R427, R467, R490, R505, R513 o R551 se sustituye con alanina, glicina, serina o glutamina o cuando el residuo de aminoácidos en la posición R490 se sustituye con valina, leucina o isoleucina, se sustituye al menos un residuo de aminoácidos adicional en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1, que no incluye una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina para un residuo de aminoácidos en la posición R427, R467, R490, R505, R513 o R551 o una sustitución de valina, leucina o isoleucina para un residuo de aminoácidos en la posición 490, en donde los residuos de aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 se definen con referencia a la SEQ ID NO: 1.

Aún otra modalidad de la invención proporciona una exotoxina A de Pseudomonas (PE) que comprende una secuencia de aminoácidos de PE que tiene una sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos D463, Y481 y L516 como se definió con referencia a la SEQ ID NO: 1, con la condición de que cuando el residuo de aminoácidos en la posición 516 se sustituye con alanina, también se sustituye al menos uno de los residuos de aminoácidos D463 y Y481, en donde la PE tiene opcionalmente una sustitución adicional de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B, y/o una sustitución adicional de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos T, y/o una supresión de uno o más residuos de aminoácidos continuos de los residuos 1-273 y 285-394, como se definió por la SEQ ID NO: 1.

Las modalidades adicionales de la invención proporcionan moléculas quiméricas relacionadas, así como ácidos nucleicos relacionados, vectores de expresión recom inantes, células hospederas, poblaciones de células y composiciones farmacéuticas.

Aún otra modalidad de la invención proporciona un método para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero la PE inventiva, molécula quimérica, ácido nucleico, vector de expresión recombinante , célula hospedera, población de células o composición farmacéutica, en una cantidad efectiva para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero.

Otra modalidad de la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de una célula objetivo, que comprende poner en contacto la célula con la PE inventiva, molécula quimérica, ácido nucleico, vector de expresión recombinante , célula hospedera, población de células o composición farmacéutica, en una cantidad efectiva para inhibir el crecimiento de la célula objetivo.

Las modalidades adicionales de la invención proporcionan métodos para producir la PE inventiva y métodos para producir la molécula quimérica inventiva.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS VARIAS VISTAS DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica que muestra la frecuencia del alelo (eje y) de varios alelos del complejo mayor de histocompatibilidad clase II DR beta 1 (DRB1) (eje x) en la población mundial (barras sin sombrear) y de la cohorte donadora (barras sombreadas) .

La Figura 2A es una gráfica que muestra el número de células que forman puntos (SFC) por 1 x 106 células (eje y) , indicando una respuesta de los linfocitos T 031810aph del donador sin exposición, después de la expansión e incubación in vitro con medio (M) (sin péptido) , agrupación 3 del péptido, agrupación 16 del péptido o agrupación 22 del péptido (eje x) , medida por ELISpot con interleucina (IL)-2.

La Figura 2B es una gráfica que muestra el número de SFC por 1 x 10e células (eje y), indicando una respuesta de los linfocitos T 031810aph del donador sin exposición, tras la incubación sin péptido, agrupación 3 del péptido, agrupación 16 del péptido o agrupación 22 del péptido (eje x) , sin la expansión in vitro, medida mediante ELISpot con IL-2.

La Figura 3 es una gráfica que muestra el número total de SFC por 1 x 106 células (eje y) por los linfocitos T de cada uno de los donadores 1-50 para las agrupaciones sin péptido o cada una de las agrupaciones del péptido 1-22 (eje x) después de 14 días de expansión in vitro. La línea punteada indica tres veces el fondo.

La Figura 4 identifica los péptidos específicos y las regiones dentro de los péptidos (áreas sombreadas) de la agrupación 3 del péptido que estimula la respuesta del linfocito T a varias intensidades para varios donadores.

La Figura 5 es una gráfica que muestra la actividad citotóxica (% de control) (eje y) , con relación a la concentración de HA22 del tipo silvestre (un fragmento de anticuerpo anti-CD22 Fv enlazado al disulfuro conjugado a PE38) (círculos) , L297A HA22 (cuadrados) , O R302A HA22 (diamantes) (ng/ml) (eje x) en células CA46.

La Figura 6A es una gráfica que muestra la respuesta de los linfocitos T para el donador 010710 (SFC por 1 x 106 células) (eje y) , tras la reestimulación sin péptido, el péptido del tipo silvestre (WT15) , o R302A (eje y) después del cultivo durante 14 días con HA22 del tipo silvestre (barras sombreadas) o R302A HA22 (barras sin sombrear) .

La Figura 6B es una gráfica que muestra la respuesta de los linfocitos T para el donador 111909 (SFC por 1 x 10e células) (eje y) , tras la reestimulación sin péptido, el péptido del tipo silvestre (WT15) , o R302A (eje y) después del cultivo durante 14 días con HA22 del tipo silvestre (barras sombreadas) o R302A HA22 (barras sin sombrear) .

La Figura 7A es una gráfica que muestra la respuesta de los linfocitos T para el donador 031510 (SFC por 1 x 10e células) (eje y) , tras la estimulación con HA22 (que contiene PE38) (barras sombreadas) o LR RIT (LR) (que contiene los residuos de aminoácidos 274-284 y 395-613 de la SEQ ID NO: 1) (barras sin sombrear) , y la reestimulación con una de las agrupaciones 1-22 del péptido (eje x) . Los controles incluyeron células que crecieron con ceftazidima (CEFT) , células sin estimulación con el antígeno en el día 0 y sin estimulación con el antígeno en el día 14 ("línea M" ) , y células con estimulación con L B9 en el día 0 y sin estimulación con el antígeno en el día 14 ("sin péptido") .

La Figura 7B es una gráfica que muestra la respuesta de los linfocitos T para el donador 021610 (SFC por 1 x 106 células) (eje y) , tras la estimulación con HA22 (que contiene PE38) (barras sombreadas) o LR RIT (LR) (que contiene los residuos de aminoácidos 274-284 y 395-613 de la SEQ ID NO: 1) (barras sin sombrear) , y la reestimulación sin péptido o cada una de las agrupaciones 1-22 del péptido (eje x) . Los controles incluyeron células que crecieron con ceftazidima (CEFT) , células sin estimulación con el antígeno en el día 0 y sin estimulación con el antígeno en el día 14 ("línea M" ) , y células con estimulación con LMB9 en el día 0 y sin estimulación con el antígeno en el día 14 ("sin péptido" ) .

La Figura 7C es una gráfica que muestra la respuesta de los linfocitos T para el donador 101509 (SFC por 1 x 106 células) (eje y) , tras la estimulación con HA22 (que contiene PE38) (barras sombreadas) o LR RIT (LR) (que contiene los residuos de aminoácidos 274-284 y 395-613 de la SEQ ID NO: i) (barras sin sombrear) , y la reestimulación sin péptido o cada una de las agrupaciones 1-22 del péptido (eje x) . Los controles incluyeron células que crecieron con ceftazidima (CEFT) , células sin estimulación con el antígeno en el día 0 y sin estimulación con el antígeno en el día 14 ("línea M" ) , y células con estimulación con LMB9 en el día 0 y sin estimulación con el antígeno en el día 14 ("sin péptido") .

La Figura 8 identifica los péptidos específicos (áreas sombreadas) de los péptidos de las SEQ ID NOs: 102-111 que estimulan una respuesta de los linfocitos T medida mediante la producción de IL-2 para varios donadores.

La Figura 9 es una gráfica que muestra el porcentaje acumulativo de las respuestas totales por donador para 50 donadores para cada una e las SEQ ID NOs: 31-141.

La Figura 10 es una gráfica que muestra la reactividad del fago anti-PE38 (dominio III) contra HA22 con sustitución puntual. Las células negras representan menos que 10% de reactividad, las células blancas representan más de 10% de reactividad, y las células grises indican que no se probaron. Las sustituciones se ordenaron por su ubicación desde el término N (izquierda) al término C (derecha) .

Las Figuras 11A y 11B son las gráficas de líneas que muestran los resultados de los experimentos de competencia que prueban la concentración de cada una de las inmunotoxinas de HA22 sustituidas ("HA", círculos cerrados), HA22-LR ("LR", círculos abiertos), HA22-L05 ("L05", triángulos cerrados), HA22-L06 ("L06", triángulos abiertos), HA22-LR-8M ( "LR8 " , cuadrados cerrados) y HA22-LO10 ("LO10", cuadrados abiertos) , que redujeron el nivel de anticuerpos que reaccionan con HA22 por 50% (línea punteada) en el suero de un primer (Figura 11A) y segundo (Figura 11B) paciente que se sometió a ensayos clínicos con HA22.

La Figura 12 es una gráfica que muestra el por ciento de unión de los anticuerpos a HA22, HA22-LR-8M, HA22-L010 (HA22-LRLO10) o HA22-LRLO10R en el suero de pacientes tratados utilizando PE38.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La exotoxina A de Pseudomonas ("PE"), es una toxina bacteriana (peso molecular de 66 kD) , secretada por Pseudomonas aeruginosa. La secuencia de PE nativa, del tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) se expone en la Patente de los Estados Unidos 5,602,095, que se incorpora en la presente como referencia. La PE nativa, del tipo silvestre incluye tres dominios estructurales que contribuyen a la citotoxicidad. El dominio la (aminoácidos 1-252) media la unión celular, el dominio II (aminoácidos 253-364) media la translocación en el citosol, y el dominio III (aminoácidos 400-613) media la ribosilación del ADP del factor 2 de alargamiento. Aunque se considera que el límite estructural del dominio III de la PE empieza en el residuo 400, se contempla que el dominio III pueda requerir un segmento del dominio Ib para retener la actividad de ribosilación del ADP. En consecuencia, el dominio III funcional se define como los residuos 395-613 de la PE. La función del dominio Ib (aminoácidos 365-399) permanece no definida. Sin apegarse a una teoría o mecanismo particular,- se cree que la actividad citotóxica de la PE ocurre a través de la inhibición de la síntesis de proteínas en las células eucarióticas , por ejemplo, mediante la activación de la ribosilación del ADP del factor 2 de alargamiento (EF-2) .

Las sustituciones de la PE se definen en la presente con referencia a la secuencia de aminoácidos de la PE. Así, las sustituciones de la PE se describen en la presente con referencia al residuo de aminoácidos presente en una posición particular, seguido por el aminoácido con el cual se ha reemplazado el residuo en la sustitución particular bajo discusión. A este respecto, las posiciones de la secuencia de aminoácidos de una modalidad particular de una PE, se refieren en la presente como las posiciones de la secuencia de aminoácidos de la modalidad particular o como las posiciones definidas por la SEQ ID NO: 1. Cuando las posiciones son como las definidas por la SEQ ID NO: 1, entonces las posiciones reales de la secuencia de aminoácidos de una modalidad particular de una PE, se definen con relación a las posiciones correspondientes de la SEQ ID NO: 1, y pueden representar diferentes números de posición del residuo que los números de posición del residuo de la SEQ ID NO: 1. Así, por ejemplo, las sustituciones se refieren a un reemplazo de un residuo de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de una modalidad particular de una PE, que corresponde a la posición indicada de la secuencia de 613 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, con el entendimiento de que las posiciones reales en las secuencias de aminoácidos respectivas pueden ser diferentes. Por ejemplo, cuando las posiciones son como se define por la SEQ ID NO: 1, el término "R490" se refiere a la arginina presente normalmente en la posición 490 de la SEQ ID NO: 1, "R490A" indica que la arginina normalmente presente en la posición 490 de la SEQ ID NO: 1 se reemplaza por una alanina, mientras que "K590Q" indica que la lisina normalmente presente en la posición 590 de la SEQ ID NO: 1, se ha reemplazado con una glutamina. En el caso de múltiples sustituciones en dos o más posiciones, las dos o más sustituciones pueden ser iguales o diferentes, es decir, cada residuo de aminoácidos de los dos o más residuos de aminoácidos que se están sustituyendo, puede sustituirse con el mismo o diferente residuo de aminoácidos, a menos que se indique de manera explícita de otra manera.

Los términos "exotoxina de Pseudomonas" y "PE" como se utilizan en la presente, incluyen la PE que se ha modificado de la proteína nativa para reducir o eliminar la inmunogenicidad. Tales modificaciones pueden incluir, de manera no exclusiva, la eliminación del dominio la, varias supresiones de aminoácidos en los dominios Ib, II y III, sustituciones de aminoácidos únicos y la adición de una o más secuencias en el término carboxilo tales como DEL y REDL (SEQ ID NO: 7). Véase Siegall et al., J. Biol. Chem. , 264: 14256-14261 (1989) . Tales PE modificadas pueden modificarse adicionalmente, para incluir cualquiera de las sustituciones inventivas para uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos T y/o linfocitos B descritos en la presente. En una modalidad, la PE modificada puede ser un fragmento citotóxico de la PE nativa, del tipo silvestre. Los fragmentos citotóxicos de la PE pueden incluir aquéllos que son citotóxicos con o sin el procesamiento proteolítico subsiguiente u otro procesamiento en la célula objetivo (por ejemplo, como una proteína o preproteína) . En una modalidad preferida, el fragmento citotóxico de la PE retiene al menos aproximadamente 20%, de manera preferida al menos aproximadamente 40%, de manera más preferida aproximadamente 50%, aún de manera más preferida 75%, de manera más preferida al menos aproximadamente 90%, y aún de manera más preferida 95% de la citotoxicidad de la PE nativa. En las modalidades particularmente preferidas, el fragmento citotóxico tiene al menos la citotoxicidad de la PE nativa, y de manera preferida, tiene una citotoxicidad incrementada en comparación con la PE nativa.

La PE modificada que reduce o elimina la inmunogenicidad incluye, por ejemplo, PE4E, PE40, PE38, PE25, PE38QQR, PE38KDEL y PE35. En una modalidad, la PE puede ser cualquiera de PE4E, PE40, PE38, PE25, PE38QQR (en la cual PE38 tiene la secuencia QQR agregada en el término C) , PE38KDEL (en la cual PE38 tiene la secuencia KDEL (SEQ ID NO: 5) agregada en el término C) , PE-LR (resistencia a la degradación lisosomal) y PE35.

En una modalidad, la PE se ha modificado para reducir la inmunogenicidad suprimiendo el dominio la como se describió en la Patente de los Estados Unidos 4,892,827, que se incorpora en la presente como referencia. La PE también puede modificarse sustituyendo ciertos residuos del dominio la. En una modalidad, la PE puede ser PE4E, que es una PE sustituida, en la cual está presente el dominio la, pero en la cual los residuos básicos del dominio la en las posiciones 57, 246, 247 y 249 se reemplazaron con residuos ácidos (por ejemplo, ácido glutámico) , como se describió en la Patente de los Estados Unidos 5,512,658, que se incorpora en la presente como referencia.

PE40 es un derivado trunco de PE (Pai et al., Proc. Nat'l Acad. Sci . USA, 88: 3358-62 (1991) y Kondo et al., Biol. Chem. , 263: 9470-9475 (1988)). PE35 es un fragmento carboxi terminal de 35 kD de la PE, en el cual los residuos de los aminoácidos 1-279 se han suprimido, y la molécula comienza con una Met en la posición 280, seguido por los aminoácidos 281-364 y 381-613 de la PE nativa. PE35 y PE40 se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos 5,602,095 y 4,892,827, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. PE25 contiene el fragmento de 11 residuos del dominio II y todo el dominio III. En algunas modalidades, la PE contiene sólo el dominio III.

En una modalidad preferida, la PE es PE38. PE38 contiene los dominios de translación y ribosilación de ADP de la PE, pero no la porción que se une a la célula (Hwang J. et al., Cell, 48: 129-136 (1987)). PE38 es una preproteína de PE trunca compuesta de los aminoácidos 253-364 y 381-613 (SEQ ID NO: 144) , que es activada a su forma citotóxica tras el procesamiento con una célula (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5,608,039, que se incorpora en la presente como referencia, y Pastan et al., Biochim. Biophys . Acta, 1333: C1-C6 (1997)).

En otra modalidad preferida, la PE es PE-LR. PE-LR contiene una supresión del dominio II, excepto por una secuencia de escisión con furina (FCS) , que corresponde a los residuos de aminoácidos 274-284 de la SEQ ID NO: 1 (RHRQPRGWEQL (SEQ ID NO: 8)), y una supresión de los residuos de aminoácidos 365-394 del dominio Ib. Así, PE-LR contiene los residuos de aminoácidos 274-284 y 395-613 de la SEQ ID NO: 1. PE-LR se describió en la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional WO 2009/032954, que se incorpora en la presente como referencia. La PE-LR puede, opcionalmente , comprender además, un péptido que se enlaza a GGS entre la FCS y los residuos de aminoácidos 395-613 de la SEQ ID NO: 1.

Como se indicó anteriormente, de manera alterna o adicional, alguno o todo el dominio Ib puede suprimirse con las porciones restantes unidas por un puente o directamente a un enlace peptídico. De manera alterna o adicional, algunas de las porciones amino del dominio II pueden suprimirse. De manera alterna o adicional, el término C puede contener la secuencia nativa de los residuos 609-613 (REDLK) (SEQ ID NO: 6) , o puede contener una variación que puede mantener la capacidad de la PE de translocarse en el citosol, tal como KDEL (SEQ ID NO: 5) o REDL (SEQ ID NO: 7), y repeticiones de estas secuencias. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos 5,854,044; 5,821,238 y 5,602,095 y la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional O 1999/051643, que se incorporan en la presente como referencia. Cualquier forma de PE en la cual la inmunogenicidad se ha eliminado o reducido, puede utilizarse en combinación con cualquiera de las sustituciones inventivas para uno o más de los residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos T y/o linfocitos B descritos en la presente, siempre que permanezca capaz de tener citotoxicidad para las células seleccionadas, por ejemplo, mediante translocación y ribosilación de EF-2 en una célula seleccionada.

Una modalidad de la invención proporciona una exotoxina A de Pseudomonas (PE) , que incluye cualquier PE modificada de la proteína nativa como se describió en la presente, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302, con la condición de que cuando la secuencia de aminoácidos comprende una sustitución de alanina para el residuo de aminoácidos R302, se sustituye al menos un residuo de aminoácidos adicional, en donde los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302 se definen con referencia a la SEQ ID NO: 1, opcionalmente con una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1, y/o una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos T dentro de los residuos de aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554 , 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1. De manera preferida, la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos T, es una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, Y470, 1471, A472, P475, A476, L477, 1493, R494, N495, L498, L499, R500, V501, Y502, V503, R505, L508, P509, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558.

Otra modalidad de la invención proporciona una exotoxina A de Pseudomonas (PE) , que incluye cualquier PE modificada de la proteína nativa como se describe en la presente, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302, con la condición de que cuando la secuencia de aminoácidos comprende una sustitución de alanina para el residuo de aminoácidos R302, se sustituye al menos uno de los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298 y L299, en donde los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302 se definen con referencia a la SEQ ID NO: 1, opcionalmente con una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1, y/o una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos T dentro de los residuos de aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1. Se ha descubierto que los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302 se localizan dentro de uno o más epitopos de los linfocitos T de la PE. Así, una sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302 puede, de manera ventajosa, eliminar uno o más epitopos de los linfocitos T. En consecuencia, las PE inventivas pueden, de manera ventajosa, ser menos inmunogénicas que una PE no sustituida (por ejemplo, del tipo silvestre) .

La sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302 puede ser una sustitución de cualquier residuo de aminoácidos por uno o más de los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302. En una modalidad de la invención, la sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302, es una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina en lugar de uno o más de los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302.

En una modalidad de la invención, la PE comprende X1VAX2X3X4AAX.5LSW (SEQ ID NO : 2 ) , en donde X , X2 y X4 son de manera independiente, leucina, alanina, glicina, serina o glutamina; X3 es tirosina, alanina, glicina, serina o glutamina; y X5 es arginina, alanina, glicina, serina o glutamina; con la condición de que la PE no comprenda a LVALYLAARLS (SEQ ID NO: 3) , y que cuando X5 es alanina, al menos uno de Xi, X2, X3 y X4 es alanina, glicina, serina o glutamina .

Otra modalidad de la invención proporciona una exotoxina A de Pseudomonas (PE) , que comprende una secuencia de aminoácidos de PE que tiene una sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos D463, Y481 y L516, como se define con referencia a la SEQ ID NO: 1, con la condición de que cuando el residuo de aminoácidos en la posición 516 se sustituye con alanina, se sustituye al menos uno de los residuos de aminoácidos D463 y Y481, en donde la PE opcionalmente, tiene una sustitución adicional de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B y/o una sustitución adicional de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos T, y/o una supresión de uno o más residuos de aminoácidos continuos de los residuos 1-273 y 285-394, definidos por la SEQ ID NO: 1. De manera preferida, la sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos D463, Y481 y L51, es una sustitución de manera independiente, de alanina, glicina, serina o glutamina en lugar de uno o más residuos de aminoácidos D463, Y481 y L516. Se ha descubierto que los residuos de aminoácidos D463, Y481 y L516 se localizan dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la PE. Así, una sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos D463, Y481 y L516 puede, de manera ventajosa, eliminar uno o más epitopos de los linfocitos T y/o linfocitos B. En consecuencia, las PE inventivas pueden ser, de manera ventajosa, menos inmunogénicas que una PE no sustituida (por ejemplo, del tipo silvestre) .

En una modalidad de la invención, la sustitución adicional de un aminoácido con uno o más epitopos de los linfocitos B, es una sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos E282, E285, P290, R313, N314, P319, D324, E327, E331, Q332, D403, D406, R412, R427, E431, R432, R458, D461, R467, R490, R505, R513, E522, R538, E548, R551, R576, Q592 y L597, definidos con referencia a la SEQ ID NO: 1. De manera preferida, la sustitución adicional de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B, es una sustitución de manera independiente, de alanina, glicina o serina en lugar de uno o más residuos de aminoácidos R427, R458, R467, R490, R505 y R538. En una modalidad especialmente preferida, la sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos D463, Y481 y L516, es una sustitución de alanina en lugar del residuo de aminoácidos D463, y la sustitución adicional de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B es : (a) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R427; (b) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R458; (c) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R467; (d) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R490; (e) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R505; y (f) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R538, definidos con referencia a la SEQ ID NO: 1.

Además de las sustituciones de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos T y/o linfocitos B de la PE descritas en la presente, la PE inventiva puede, opcionalmente , también incluir sustituciones adicionales para uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1. A este respecto, en una modalidad de la invención, la PE tiene una sustitución de uno o más aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1. En una modalidad preferida de la invención, la sustitución de uno o más aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1, incluye una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina, por uno o más aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1. Las sustituciones dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B pueden, de manera ventajosa, reducir además la inmunogenicidad mediante la eliminación de uno o más epitopos de los linfocitos B. Las sustituciones pueden localizarse dentro de cualquier epitopo de los linfocitos B de la PE adecuado. Los epitopos de los linfocitos B ejemplares se describen en, por ejemplo, las Publicaciones de la Solicitud de Patente Internacional WO 2007/016150, WO 2009/032954, y WO 2011/032022, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. En una modalidad preferida, la sustitución de uno o más aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1, es una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina, de manera independiente, en lugar del uno o más de los residuos de aminoácidos E282, E285, P290, R313, N314, P319, D324, E327, E331, Q332, D403, D406, R412, R427, E431, R432, R458, D461, D463, R467, Y481, R490, R505, R513, L516, E522, R538, E548, R551, R576, K590, Q592 y L597, en donde los residuos de aminoácidos E282, E285, P290, R313, N314, P319, D324, E327, E331, Q332, D403, D406, R412, R427, E431, R432, R458, D461, D463, R467, Y481, R490, R505, R513, L516, E522, R538, E548, R551, R576, K590, Q592 y L597, se definen con referencia a la SEQ ID NO: 1. En una modalidad particularmente preferida, la sustitución de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1, es una sustitución de alanina, glicina o serina en lugar de uno o más residuos de aminoácidos D406, R432, R467, R490, R513, E548, K590 y Q592. En una modalidad especialmente preferida, la sustitución de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1 es: (a) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos D406; (b) una sustitución de glicina por el residuo de aminoácidos R432; (c) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R467; (d) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R490; (e) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R513; (f) una sustitución de serina por el residuo de aminoácidos E548; (g) una sustitución de serina por el residuo de aminoácidos K590; y (h) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos Q592.

En una modalidad de la invención, la PE comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1, sola o en combinación con cualquiera de las otras sustituciones descritas en la presente. En una modalidad de la invención, la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1, es una sustitución de uno o mas residuos de aminoácidos en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, Y470, 1471, A472, P475, A476, L477, 1493, R494, N495, L498, L499, R500, V501, Y502, V503, R505, L508, P509, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558.

La sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1, puede ser una sustitución de cualquier residuo de aminoácidos en lugar de un residuo de aminoácidos en cualquiera o más posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO : 1. La sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1, puede incluir, por ejemplo, una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina en lugar de uno o más residuos de aminoácidos en la posición 421, 422, 423, 425, 427, 429, 439, 440, 443, 444, 446, 447, 450, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 551, 552, 554, 555, 556 y 558 de la SEQ ID NO: 1. En una modalidad preferida, la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1, es una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina en lugar del uno o más de los residuos de aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, Y470, 1471, A472, P475, A476, L477, 1493, R494, N495, L498, L499, R500, V501, Y502, V503, R505, L508, P509, R551, L552, T554 , 1555, L556 y W558. Una o más sustituciones en uno o más epitopos de los linfocitos T localizados en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la PE, definidas con referencia a la SEQ ID NO: 1, pueden reducir además, la inmunogenicidad de la PE. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos no tiene una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en las posiciones 427, 467, 485, 490, 505, 513, 516 y 551.

En otra modalidad de la invención, la PE comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1; con la condición de que cuando el residuo de aminoácidos en la posición Q485 o L516 se sustituye con alanina, se sustituye al menos un residuo de aminoácidos adicional, y cuando el residuo de aminoácidos en la posición R427, R467, R490, R505, R513 o R551 se sustituye con alanina, glicina, serina o glutamina, o cuando el residuo de aminoácidos en la posición R490 se sustituye con valina, leucina o isoleucina, se sustituye al menos un residuo de aminoácidos adicional, que no incluye una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina para un residuo de aminoácidos en la posición 282, 285, 290, 313, 314, 319, 324, 327, 331, 332, 403, 406, 412, 427, 431, 432, 458, 461, 467, 490, 505, 513, 522, 538, 548, 551, 576, 590, 592 ó 597, o una sustitución de valina, leucina o isoleucina por un residuo de aminoácidos en la posición 490, en donde los residuos de aminoácidos 282, 285, 290, 302, 313, 314, 319, 324, 327, 331, 332, 403, 406, 412, 427, 431, 432, 458, 461, 463-519, 522, 538, 548, 551, 576, 590, 592 y 597, se definen con referencia a la SEQ ID NO: 1.

En aún otra modalidad de la invención, la PE comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1; con la condición de que cuando el residuo de aminoácidos en la posición Q485 o L516 se sustituye con alanina, se sustituye al menos un residuo de aminoácidos adicional en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1, y cuando el residuo de aminoácidos en la posición R427, R467, R490, R505, R513 o R551 se sustituye con alanina, glicina, serina o glutamina, o cuando el residuo de aminoácidos en la posición R490 se sustituye con valina, leucina o isoleucina, se sustituye al menos un residuo de aminoácidos adicional en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1, que no incluye una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina por un residuo de aminoácidos en la posición R427, R467, R490, R505, R513, R551, o una sustitución de valina, leucina o isoleucina por un residuo de aminoácidos en la posición R490, en donde los residuos de aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 se definen con referencia a la SEQ ID NO: 1.

De manera preferida, la PE comprende una o más sustituciones que incrementan la citotoxicidad como se describe, por ejemplo, en la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional WO 2007/016150, que se incorpora en la presente como referencia. A este respecto, una modalidad de la invención proporciona una PE con una sustitución de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1, y la sustitución de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1, es una sustitución de valina, leucina o isoleucina en lugar del residuo de aminoácidos R490, en donde el residuo de aminoácidos R490 se define con referencia a la SEQ ID NO: 1. En una modalidad de la invención, la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en las posiciones 313, 327, 331, 332, 431, 432, 505, 516, 538 y 590 definidas con referencia a la SEQ ID NO: 1 con alanina o glutamina, puede proporcionar una PE con una citotoxicidad incrementada, como se describe, por ejemplo, en la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional WO 2007/016150, que se incorpora en la presente como referencia. La actividad citotóxica incrementada y la inmunogenicidad disminuida pueden ocurrir de manera simultánea, y no son mutuamente excluyentes. Las sustituciones que incrementan la actividad citotóxica y disminuyen la inmunogenicidad, tales como las sustituciones de R490 a glicina o, de manera más preferida, alanina, son especialmente preferidas.

En una modalidad de la invención, la PE comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la Fórmula I: FCS - - R2P - R3n - dominio funcional III de la PE (Fórmula I) en donde : m, n y p son, de manera independiente, 0 ó 1; FCS comprende una secuencia de residuos de aminoácidos de escisión con furina, secuencia la cual es escindible por la furina; R1 comprende 1 o más residuos de aminoácidos continuos de los residuos 285-293 de la SEQ ID NO: 1 ; R2 comprende XiVAXaX^AA sLSW (SEQ ID NO: 2), en donde X1# X2 y X4 son de manera independiente leucina, alanina, glicina, serina o glutamina; X3 es tirosina, alanina, glicina, serina o glutamina; y X5 es arginina, alanina, glicina, serina o glutamina; con la condición de que la PE no comprenda a LVALYLAARLS (SEQ ID NO: 3) y que cuando X5 es alanina, al menos uno de ??, X2, X3 y X4 es alanina, glicina, serina o glutamina; R3 comprende 1 o más residuos de aminoácidos continuos de los residuos 306-394 de la SEQ ID NO: 1; y el dominio funcional III de la PE comprende los residuos 395-613 de la SEQ ID NO: 1, opcionalmente con una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1 y/o una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos T dentro de los residuos de aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1. En una modalidad, la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y 558 de la SEQ ID NO: 1, es una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444 , A446, A447, 1450, Y470, 1471, A472, P475, A476, L477, 1493, R494, N495, L498, L499, R500, V501, Y502, V503, R505, L508, P509, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558.

En una modalidad de la invención, m, n, y/o p de la Fórmula I son 0. En una modalidad de la invención, cuando m, n y p son cada uno 0, la PE de Fórmula I puede comprender además, un péptido que se enlaza a GGS entre la FCS y el dominio funcional III de la PE.

Sin apegarse a una teoría o mecanismo particular, se cree que las PE que contienen la secuencia de escisión con furina (FCS) , se someten al procesamiento proteolítico dentro de las células objetivo, activando por lo tanto la actividad citotóxica de la toxina. La FCS de las PE inventivas puede comprender cualquier secuencia de residuos de aminoácidos de escisión con furina adecuada, secuencia la cual es escindible por la furina. Las secuencias de escisión con furina ejemplares se describen en Duckert et al., Protein Engineering, Design & Selection, 17(1) : 107-112 (2004) y la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional O 2009/032954, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. En una modalidad de la invención, la FCS comprende los residuos 274-284 de la SEQ ID NO: 1 (es decir, RHRQPRGWEQL (SEQ ID NO: 8)), en donde la sustitución de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1, es una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina por el residuo de aminoácidos E282 de la SEQ ID NO: 1. Otras secuencias de aminoácidos de la FCS adecuadas incluyen, de manera no exclusiva: R-Xi-X2-R, en donde Xi es cualquier aminoácido natural, y X2 es cualquier aminoácido natural (SEQ ID NO: 9) , RKKR (SEQ ID NO: 10), RRRR (SEQ ID NO: 11), RKAR (SEQ ID NO: 12), SRVARS (SEQ ID NO: 13), TSSRKRRF (SEQ ID NO: 14), ASRRKARSW (SEQ ID NO : 15), RRVKKRFW (SEQ ID NO : 16), RNWRRDW (SEQ ID NO: 17), TRAVRRRSW (SEQ ID NO: 18), RQPR (SEQ ID NO: 19), RHRQPRG (SEQ ID NO: 20), RHRQPRGWE (SEQ ID NO: 21), HRQPRGWEQ (SEQ ID NO: 22) , RQPRGWE (SEQ ID NO: 23) , RHRSKRGWEQL (SEQ ID NO: 24), RSKR (SEQ ID NO: 25), RHRSKRGW (SEQ ID NO: 26), HRSKRGWE (SEQ ID NO: 27), RSKRG EQL (SEQ ID NO: 28), HRSKRGWEQL (SEQ ID NO: 29), RHRSKR (SEQ ID NO: 30) y R-X1-X2-R, en donde Xx es cualquier aminoácido natural y X2 es arginina o lisina (SEQ ID NO: 4) .

En una modalidad de la invención, m de Fórmula I es 1 y R1 de Fórmula I, comprende los residuos 285-293 de la SEQ ID NO: 1, en donde la sustitución de un aminoácido con uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1, incluye una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina por el residuo de aminoácidos E285 y/o P290 de la SEQ ID NO: 1.

En otra modalidad de la invención, n de Fórmula I es 1 y R3 de Fórmula I comprende los residuos 306-394 de la SEQ ID NO: 1, en donde la sustitución de un aminoácido con uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1, incluye una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina por uno o más de los residuos de aminoácidos R313, N314, P319, D324, E327, E331 y Q332 de la SEQ ID NO: 1.

En aún otra modalidad de la invención, el dominio funcional III de la PE comprende los residuos 395-613 de la SEQ ID NO: 1, en donde la sustitución de un aminoácido con uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1, incluye una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina por uno o más de los residuos de aminoácidos D403, D406, R412, R427, E431, R432, R458, D461, D463, R467, Y481, R490, R505, R513, L516, E522, R538, E548, R551, R576, K590, Q592 y L597 de la SEQ ID NO: 1. En una modalidad preferida de la invención, el dominio funcional III de la PE comprende la SEQ ID NO: 142. En una modalidad especialmente preferida de la invención, el dominio funcional III de la PE comprende la SEQ ID NO: 143.

La PE inventiva puede ser menos inmunogénica que una PE no sustituida, de acuerdo con la invención, si la respuesta inmune a la PE inventiva se disminuye, de manera cuantitativa o cualitativa, en comparación con la respuesta inmune a una PE no sustituida. Una disminución cuantitativa en la inmunogenicidad abarca una disminución en la magnitud o grado de la respuesta inmune . La magnitud o grado de inmunogenicidad puede medirse basándose en cualquier número de parámetros conocidos, tales como la disminución en el nivel de citocina (por ejemplo, citocina específica del antígeno) (concentración de citocina) , una disminución en el número de linfocitos activados (por ejemplo, proliferación de linfocitos (por ejemplo, linfocitos específicos del antígeno)) o reclutados, y/o una disminución en la producción de anticuerpos (anticuerpos específicos del antígeno) , etc. Una disminución cualitativa en la inmunogenicidad abarca cualquier cambio en la naturaleza de la respuesta inmune, que vuelve a la respuesta inmune menos efectiva para mediar la reducción de la actividad citotóxica de la PE. Los métodos para medir la inmunogenicidad son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la medición de los tipos y niveles de citocinas producidas puede medir la inmunogenicidad. De manera alterna o adicional, la medición de la unión de la PE a los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos expuestos previamente a la PE) y/o la medición de la capacidad de la PE para inducir los anticuerpos cuando se administra a un mamífero (por ejemplo, humanos, ratones y/o ratones en los cuales el sistema inmune del ratón se reemplaza con un sistema inmune humano) , pueden medir la inmunogenicidad. Una PE menos inmunogénica puede caracterizarse por una disminución en la producción de citocinas, tales como cualquiera o más de IFN-?, TNF-oc y granzima B, y/o una estimulación reducida de una respuesta inmune mediada por las células, tal como una disminución en la proliferación y activación de los linfocitos T y/o los macrófagos específicos para la PE, en comparación con aquélla obtenida con una PE no sustituida. De manera alterna o adicional, la PE menos inmunogénica puede caracterizarse por un incremento en la producción de TGF-beta y/o IL-10, en comparación con aquél obtenida con una PE no sustituida. En una modalidad preferida, la inmunogenicidad reducida está caracterizada por una o más de una disminución en la estimulación de los linfocitos T, una disminución en la proliferación de los linfocitos T, y una disminución en la secreción del IFNy y/o granzima B de los linfocitos T. De manera alterna o adicional, una PE menos inmunogénica puede caracterizarse por una disminución en la estimulación y/o activación de los linfocitos B específicos para la PE, en comparación con aquélla obtenida con una PE no sustituida. Por ejemplo, la PE menos inmunogénica puede caracterizarse por una disminución en la diferenciación de los linfocitos B en las células de plasma que secretan el anticuerpo y/o las células de memoria, en comparación con aquélla obtenida con una PE no sustituida. La inmunogenicidad reducida puede caracterizarse por cualquiera o más de una disminución en la estimulación de los linfocitos B, una disminución en la proliferación de los linfocitos B, y una disminución en la secreción del anticuerpo anti-PE. La disminución cualitativa y cuantitativa de la inmunogenicidad, puede ocurrir de manera simultánea y no son mutuamente excluyentes.

Alguien con experiencia ordinaria en la técnica apreciará fácilmente que las PE inventivas pueden modificarse de varias formas, de manera que la eficacia terapéutica o profiláctica de las PE inventivas se incrementa a través de la modificación. Por ejemplo, las PE inventivas pueden conjugarse o fusionarse ya sea de manera directa o indirecta a través de un enlazante a una porción localizada. A este respecto, una modalidad de la invención proporciona una molécula quimérica que comprende (a) una porción seleccionada conjugada o fusionada a (b) cualquiera de las PE inventivas descritas en la presente. La práctica de conjugar los compuestos, por ejemplo, PE inventivas, a las porciones focalizadas, se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting, 3: 111 (1995), y la Patente de los Estados Unidos 5,087,616.

El término "porción seleccionada" como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier molécula o agente que reconoce de manera específica y se une a un marcador de la superficie celular, de manera que la porción seleccionada dirige el suministro de la PE inventiva a una población de células en la superficie que expresa el receptor. Las porciones seleccionadas incluyen, de manera no exclusiva, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) , o fragmentos de los mismos, péptidos, hormonas, factores de crecimiento, citocinas y cualquier otro ligando natural o n o natural .

El término "anticuerpo" , como se utiliza en la presente, se refiere a anticuerpos completos (también conocidos como "intactos") o porciones que se unen al antígeno de los mismos, que retienen la capacidad de reconocimiento y unión al antígeno. El anticuerpo o las porciones que se unen al antígeno del mismo, pueden ser un anticuerpo o porción que se une al antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo o porción que se une al antígeno del mismo, aislada y/o purificada de un mamífero, por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, pollo, hámster, humano, etc. El anticuerpo o porción que se une al antígeno del mismo, puede estar en forma monomérica o polimérica. También, el anticuerpo o porción que se une al antígeno del mismo, puede tener cualquier nivel de afinidad o avidez por el marcador de la superficie celular. De manera deseable, el anticuerpo o porción que se une al antígeno del mismo, es específico para el marcador de la superficie celular, de manera que hay una reacción cruzada mínima con otros péptidos o proteínas.

El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y de cualquier isotipo, por ejemplo, IgM, IgG (por ejemplo, IgG, IgG2, IgG3 o IgG4) , IgD, IgA o IgE. Las regiones que determinan la complementariedad (CDR) de un anticuerpo o fragmentos variables de cadena única (Fv) de un anticuerpo contra un marcador de la superficie de la célula objetivo, pueden injertarse o diseñarse en un anticuerpo de elección, para conferir especificidad por el marcador de la superficie de la célula objetivo para ese anticuerpo. Por ejemplo, las CDR de un anticuerpo contra un marcador de la superficie de la célula objetivo, puede injertarse en un marco de un anticuerpo humano de una estructura tridimensional conocida (véase, por ejemplo, las Publicaciones de la Solicitud de Patente Internacional WO 1998/045322 y O 1987/002671; las Patentes de los Estados Unidos 5,859,205; 5,585,089; y 4,816,567; la Publicación de la Solicitud de Patente Europea 0173494; Jones et al., Nature, 321 :522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534 (1988), Riechmann et al., Nature, 332: 323 (1988); y Winter & Milstein, Nature, 349: 293 (1991) ) , para formar un anticuerpo que puede provocar poca o ninguna respuesta inmunogénica cuando se administra a un humano. En una modalidad preferida, la porción seleccionada es un anticuerpo monoclonal.

La porción que se une al antígeno puede ser cualquier porción que tenga al menos un sitio de unión al antígeno, tal como, por ejemplo, las regiones variables o CDR del anticuerpo intacto. Los ejemplos de porciones que se unen al antígeno de los anticuerpos incluyen, de manera no exclusiva, una cadena pesada, una cadena ligera, una región variable o constante de una cadena pesada o ligera, un fragmento variable de una sola cadena (scFv) , o un fragmento Fe, Fab, Fab' , Fv o F(ab)2'; anticuerpos de un solo dominio (véase, por ejemplo, Wesolowski, Med Microbiol Immunol., 198(3): 157-74 (2009); Saerens et al., Curr. Opin. Pharmacol., 8 (5) :6 00-8 (2008); Harmsen y de Haard, Appl. Microbiol. Biotechnol . , 77(1): 13-22 (2007), anticuerpos estabilizados con hélice (véase, por ejemplo, Arndt et al., J. Mol. Biol., 312: 221-228 (2001); triacuerpos ; diacuerpos (Publicación de la Solicitud de Patente Europea 0404097; Publicación de la Solicitud de Patente Internacional WO 1993/011161; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)); moléculas de anticuerpo de una sola cadena ("scFvs", véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5,888,773); anticuerpos estabilizados con disulfuro ("dsFvs", véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos 5,747,654 y 6,558,672), y anticuerpos de dominio ("dAbs", véase, por ejemplo, Holt et al., Trends Biotech, 21 (11) :484-490 (2003), Ghahroudi et al., FEBS Lett . , 414:521-526 (1997), Lauwereys et al., EMBO J 17:3512-3520 (1998), Reiter et al., J. Mol. Biol. 290:685-698 (1999); y Davies y Riechmann, Biotechnology, 13:475-479 (2001)).

Los métodos para probar los anticuerpos o las porciones que se unen al antígeno de los mismos, para la capacidad para unirse a cualquier marcador de la superficie celular, son conocidos en la técnica, e incluyen cualquier ensayo de unión al anticuerpo-antígeno, tal como, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA) , ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación, y ensayos de inhibición competitivos (véase, por ejemplo, Janeway et al., infra, y la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 2002/0197266 Al) .

Los métodos adecuados para hacer los anticuerpos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos de hibridoma estándar se describen en, por ejemplo, Kóhler y Milstein, Eur. J. Immunol., 5, 511-519 (1976), Harlow y Lañe (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), y C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5a Ed. , Garland Publishing, New York, NY (2001) ) . De manera alterna, otros métodos, tales como los métodos de EBV-hibridoma (Haskard y Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984) y Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)), y los sistemas de expresión del vector del bacteriófago (véase, por ejemplo, Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)), son conocidos en la técnica. Además, los métodos para producir los anticuerpos en los animales no humanos se describen en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos 5,545,806, 5,569,825 y 5,714,352, y la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 2002/0197266 Al.

La representación del fago también puede utilizarse para generar el anticuerpo que puede utilizarse en las moléculas quiméricas de la invención. A este respecto, las bibliotecas del fago que codifican los dominios variables (V) que se unen al antígeno de los anticuerpos, pueden generarse utilizando técnicas de biología molecular y de ADN recombinante estándar (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)). Los fagos que codifican una región variable con especificidad deseada, se seleccionan para la unión específica al antígeno deseado, y se reconstituye un anticuerpo completo o parcial, que comprende el dominio variable seleccionado. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo reconstituido se introducen en una línea celular adecuada, tal como una célula de mieloma utilizada para la producción del hibridoma, de manera que los anticuerpos que tienen las características de los anticuerpos monoclonales se secretan por la célula (véase, por ejemplo, Janeway et al., supra, Huse et al., supra, y la Patente de los Estados unidos 6, 265, 150) .

De manera alterna, los anticuerpos pueden producirse mediante ratones transgénicos que son transgénicos para los genes de la inmunoglobulina de cadena pesada y ligera específicos. Tales métodos son conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos 5,545,806 y 5,569,825, y en Janeway et al., supra.

De manera alterna, el anticuerpo puede ser un anticuerpo diseñado genéticamente, por ejemplo, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. Los anticuerpos humanizados proporcionan de manera ventajosa un riesgo menor de efectos secundarios, y pueden permanecer en la circulación durante más tiempo. Los métodos para generar los anticuerpos humanizados se conocen en la técnica, y se describen con detalle en, por ejemplo, Janeway et al., supra, las Patentes de los Estados Unidos 5,225,539, 5,585,089 y 5,693,761, la Patente Europea 0239400 Bl, y la Patente del Reino Unido 2188638. Los anticuerpos humanizados también pueden generarse utilizando la tecnología de reconstrucción del anticuerpo descrita en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5,639,641 y Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959-973 (1994) .

La porción seleccionada puede unirse de manera específica a cualquier marcador de la superficie celular adecuado. La elección de una porción seleccionada y/o marcador de la superficie celular particular, puede elegirse dependiendo de la población de células particular a ser seleccionada. Los marcadores de la superficie celular son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Mufson et al., Front. Biosci., 11 : 337-43 (2006); Frankel et al., Clin. Cáncer Res., 6:326-334 (2000); y Kreitman et al., AAPS Journal, 8(3): E532-E551 (2006)), y pueden ser, por ejemplo, una proteína o un carbohidrato. En una modalidad de la invención, la porción seleccionada es un ligando que se une de manera específica a un receptor en una superficie de la célula. Los ligandos ejemplares incluyen, de manera no exclusiva, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , Fas, ligando que induce la apoptosis relacionado con TNF (TRAIL) , una citocina (por ejemplo, IL-2, IL-15, IL-4, IL- 13), una linfocina, una hormona y un factor de crecimiento (por ejemplo, un factor de crecimiento transformante (TGFa) , factor de crecimiento neuronal, factor de crecimiento epidérmico) .

El marcador de la superficie celular puede ser, por ejemplo, un antígeno para el cáncer. El término "antígeno para el cáncer" como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier molécula (por ejemplo, proteína, péptido, lípido, carbohidrato, etc.), expresado o sobreexpresado de manera única o predominante por una célula tumoral o una célula cancerígena, de manera que el antígeno se asocie con el tumor o el cáncer. El antígeno para el cáncer puede, adicionalmente, expresarse por células normales, no tumorales o no cancerosas. Sin embargo, en tales casos, la expresión del antígeno para el cáncer por las células normales, no tumorales o no cancerosas, no es tan robusta como la expresión por las células tumorales o cancerosas. A este respecto, las células tumorales o cancerosas pueden sobreexpresar el antígeno o expresar el antígeno a un nivel significativamente mayor, en comparación con la expresión del antígeno por las células normales, no tumorales o no cancerosas. También, el antígeno para el cáncer puede además, expresarse por las células de un estado diferente de desarrollo o maduración. Por ejemplo, el antígeno para el cáncer puede expresarse adicionalmente por las células de la etapa embriónica o fetal, células las cuales no se encuentran normalmente en un hospedero adulto. De manera alterna, el antígeno para el cáncer puede expresarse de manera adicional por las células germinales o células precursoras, células las cuales no se encuentran normalmente en un hospedero adulto.

El antígeno para el cáncer puede ser un antígeno expresado por cualquier célula de cualquier cáncer o tumor, incluyendo los cánceres y tumores descritos en la presente. El antígeno para el cáncer puede ser un antígeno para el cáncer de solo un tipo de cáncer o tumor, de manera que el antígeno para el cáncer se asocia con o es característico de sólo un tipo de cáncer o tumor. De manera alterna, el antígeno para el cáncer puede ser un antígeno para el cáncer (por ejemplo, puede ser característico) de más de un tipo de cáncer o tumor. Por ejemplo, el antígeno para el cáncer puede expresarse por- células de cáncer de mama o próstata, y no expresarse por las células normales, no tumorales o no cancerígenas.

Los antígenos para el cáncer ejemplares a los cuales la porción seleccionada puede unirse de manera específica incluyen, de manera no exclusiva, mucina 1 (MUC1) , antígeno asociado con el melanoma (MAGE) , antígeno del melanoma expresado de manera preferencial (PRAME) , antígeno carcinoembriónico (CEA) , antígeno específico de la próstata (PSA) , antígeno de la membrana específico de la próstata (PSMA) , receptor del factor que estimula la colonia del granulocito-macrófago (GM-CSFR) , CD56, receptor 2 del factor del crecimiento epidérmico humano (HER2/neu) (también conocido como erbB-2) , CD5, CD7, antígeno del tumor de la tirosinasa, proteína relacionada con la tirosinasa (TRP)l, TRP2, NY-ESO-1, telomerasa y p53. En una modalidad preferida, el marcador de la superficie celular, al cual se une de manera específica la porción seleccionada, se selecciona del grupo que consiste de la agrupación de diferenciación (CD) 19, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD79b, receptor de la transíerrina, receptor de EGF, mesotelina cadherina y Lewis Y. La mesotelina se expresa en, por ejemplo, el cáncer de ovario, mesotelioma, cáncer de pulmón de las células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de las trompas de Falopio, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cervical y cáncer pancreático. CD22 se expresa en, por ejemplo, leucemia de las células pilosas, leucemia linfocítica crónica (CLL) , leucemia prolinfocítica (PLL) , linfoma no de Hodgkin, linfoma linfocítico pequeño (SLL) , y leucemia linfática aguda (ALL) . CD25 se expresa en, por ejemplo, leucemias y linfornas, incluyendo leucemia de las células pilosas y linfoma de Hodgkin. El antígeno de Lewis Y se expresa en, por ejemplo, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer de pulmón y cáncer pancreático. CD33 se expresa en, por ejemplo, leucemia mieloide aguda (AML) , leucemia mielomonocítica crónica (CML) y trastornos mieloproliferativos .

En una modalidad de la invención, la porción seleccionada es un anticuerpo que se une de manera especifica a un antígeno para el cáncer. Los anticuerpos ejemplares que se unen a los antígenos para el cáncer incluyen, de manera no exclusiva, anticuerpos contra el receptor de la transferrina (por ejemplo, HB21 y variantes del mismo) , anticuerpos contra CD22 (por ejemplo, RFB4 y variantes del mismo) , anticuerpos contra CD25 (por ejemplo, anti-Tac y variantes del mismo) , anticuerpos contra la mesotelina (por ejemplo, SS1, MORA -009, SS, HN1, HN2 , MN, MB y variantes del mismo), y anticuerpos contra el antígeno de Lewis Y (por ejemplo, B3 y variantes del mismo) . A este respecto, la porción seleccionada puede ser un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de B3 , RFB4 , SS, SS1, MN, MB, HN1, HN2 , HB21 y MORAb-009, y porciones que se unen al antígeno del mismo.

Las porciones seleccionadas ejemplares adicionales, adecuadas para utilizarse en las moléculas quiméricas inventivas, se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos 5,242,824 (receptor antitransferrina) ; 5,846,535 (anti-CD25); 5,889,157 (anti-Lewis Y); 5,981,726 (anti-Lewis Y); 5,990,296 (anti-Lewis Y); 7,081,518 (anti-mesotelina) ; 7,355,012 (anti-CD22 y anti-CD25) ; 7,368,110 (anti-mesotelina) ; 7,470,775 (anti-CD30) ; 7,521,054 (anti-CD25) ; y 7,541,034 (anti-CD22 ) ; la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 2007/0189962 (anti-CD22) ; Frankel et al., Clin. Cáncer Res., 6: 326-334 (2000), y Kreitman et al., AAPS Journal, 8(3) : E532-E551 (2006), cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. En otra modalidad, la porción seleccionada puede incluir la porción seleccionada de las inmunotoxinas conocidas en la técnica. Las inmunotoxinas ejemplares incluyen, de manera no exclusiva, LMB-2 (Anti-Tac (FV) -PE38) , BL22 y HA22 (RFB4 (dsFv) -PE38) , SS1P (SS 1 (dsFv) -PE38) , HB21-PE40 y variantes de los mismos. En una modalidad preferida, la porción seleccionada es la porción que se une al antígeno de HA22. HA22 comprende un fragmento del anticuerpo Fv anti-CD22 enlazado al disulfuro conjugado a PE38. HA22 y las variantes del mismo, se describen en las Publicaciones de la Solicitud de Patente internacional WO 2003/027135 y WO 2009/032954, que se incorporan en la presente como referencia.

En una modalidad de la invención, la molécula quimérica comprende un enlazante. El término "enlazante" como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier agente o molécula que conecta la PE inventiva con la porción seleccionada. Alguien con experiencia ordinaria en la técnica, reconocerá que los sitios en la PE inventiva, que no son necesarios para la función de la PE inventiva, son sitios ideales para unir un enlazante y/o una porción seleccionada, con la condición de que el enlazante y/o porción seleccionada, una vez unido a la PE inventiva, no interfiera con la función de la PE inventiva, es decir, la actividad citotóxica, inhibir el crecimiento de una célula objetivo, o para tratar o prevenir el cáncer. El enlazante puede ser capaz de formar enlaces covalentes con la PE y la porción seleccionada. Los enlazantes adecuados son conocidos en la técnica e incluyen, de manera no exclusiva, enlazantes de carbono de cadena lineal o ramificada, enlazantes de carbono heterocíclicos y enlazantes peptídicos. En donde la PE y la porción seleccionada son polipéptidos, la porción enlazante puede unirse a los aminoácidos a través de los grupos laterales (por ejemplo, a través de un enlace de disulfuro a la cisteína) . De manera preferida, los enlazantes se unirán al carbono alfa de los grupos amino y carboxilo de los aminoácidos terminales .

Se incluyen en el alcance de la invención las porciones funcionales de las PE inventivas y las moléculas quiméricas descritas en la presente. El término "porción funcional" cuando se utiliza con referencia a una PE o molécula quimérica, se refiere a cualquier parte o fragmento de la PE o molécula quimérica de la invención, parte o fragmento el cual retiene la actividad biológica de la PE o la molécula quimérica de la cual es parte (la PE o molécula quimérica original) . Las porciones funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas partes de una PE o molécula quimérica que retiene la capacidad para unirse de manera especifica a, y destruir o inhibir el crecimiento de las células objetivo o tratar o prevenir el cáncer, a un grado similar, al mismo grado, o a un grado mayor, que la PE o molécula quimérica original. Con referencia a la PE o molécula quimérica original, la porción funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente 10% o más, aproximadamente 25% o más, aproximadamente 30% o más, aproximadamente 50% o más, aproximadamente 68% o más, aproximadamente 80% o más, aproximadamente 90% o más, o aproximadamente 95% o más de la PE o molécula quimérica original.

La porción funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el término amino o carboxi de la porción, o en ambos términos, aminoácidos adicionales los cuales no se encuentran en la secuencia de aminoácidos de la PE o molécula quimérica original. De manera deseable, los aminoácidos adicionales no interfieren con la función biológica de la porción funcional, por ejemplo, se unen de manera especifica, y destruyen o inhiben el crecimiento de las células objetivo, tienen la capacidad para tratar o prevenir el cáncer, etc. De manera más deseable, los aminoácidos adicionales mejoran la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica de la PE o molécula quimérica original .

Se incluyen en el alcance de la invención las variantes funcionales de las PE inventivas y las moléculas quiméricas descritas en la presente . El término "variante funcional", como se utiliza en la presente, se refiere a una PE o molécula quimérica que tiene identidad o similitud a la secuencia sustancial o significativa con una PE o molécula quimérica original, variante funcional la cual retiene la actividad biológica de la PE o la molécula quimérica de la cual es una variante. Las variantes funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas variantes de la PE o molécula quimérica descritas en la presente (la PE o molécula quimérica original) , que retiene la capacidad para unirse de manera específica a, y destruir o inhibir el crecimiento de las células objetivo a un grado similar, al mismo grado, o a un grado mayor, que la PE o molécula quimérica original. Con referencia a la PE o molécula quimérica original, la variante funcional puede, por ejemplo, ser aproximadamente 30% o más, aproximadamente 50% o más, aproximadamente 75% o más, aproximadamente 80% o más, aproximadamente 90% o más, aproximadamente 95% o más, aproximadamente 96% o más, aproximadamente 97% o más, aproximadamente 98% o más, o aproximadamente 99% o más idéntica en la secuencia de aminoácidos a la PE o molécula quimérica original.

La variante funcional puede, por ejemplo, comprender la secuencia de aminoácidos de la PE o molécula quimérica original con al menos una sustitución conservadora del aminoácido. Las sustituciones conservadores de aminoácidos son conocidas en la técnica, e incluyen sustituciones de aminoácidos en las cuales un aminoácido que tiene una cierta propiedad química y/o física, se intercambia por otro aminoácido que tiene las mismas propiedades físicas o químicas. Por ejemplo, la sustitución conservadora del aminoácido puede ser un aminoácido ácido sustituido por otro aminoácido ácido (por ejemplo, Asp o Glu) , un aminoácido con una cadena lateral no polar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral no polar (por ejemplo, Ala, Gly, Val, lie, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, etc.), un aminoácido básico sustituido por otro aminoácido básico (Lys, Arg, etc.), un aminoácido con una cadena lateral polar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral polar (Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr, etc.), etc.

De manera alterna o adicional, las variantes funcionales pueden comprender las secuencias de aminoácidos de la PE o molécula quimérica original, con al menos una sustitución no conservadora del aminoácido. En este caso, es preferible que la sustitución no conservadora del aminoácido no interfiera con, o inhiba la actividad biológica de la variante funcional. De manera preferida, la sustitución no conservadora del aminoácido mejora la actividad biológica de la variante funcional, de manera que la actividad biológica de la variante funcional se incrementa en comparación con la PE o molécula quimérica original .

La PE o molécula quimérica de la invención, puede consistir esencialmente de la secuencia o secuencias de aminoácidos especificadas descritas en la presente, de manera que otros componentes de la variante funcional, por ejemplo, otros aminoácidos, no cambian materialmente la actividad biológica de la variante funcional.

La PE o molécula quimérica de la invención (incluyendo las porciones funcionales y las variantes funcionales) de la invención, pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos naturales. Tales aminoácidos sintéticos son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexan carboxílico, norleucina, ácido a-amino n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometil-ciste na, trans-3- y trans-4 -hidroxiprolina, 4 -aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, ß-fenilserina, ß-hidroxifenilalanina, fenilglicina, a-naftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolin-2-carboxílico, ácido 1, 2, 3 , 4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, ácido aminomalónico, ácido aminomalónico, monoamida del ácido aminomalónico, ' -bencil-N' -metil-lisina, ' , N' -dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido -aminociclopentan carboxílico, ácido a-aminociclohexan carboxílico, ácido a-aminocicloheptan carboxílico, ácido a-(2-amino-2-norbornan) -carboxílico, ácido a,?-diaminobutírico, ácido a, ß-diaminopropiónico, homofenilalanina y a-ter-butilglicina .

La PE o molécula quimérica de la invención (incluyendo las porciones funcionales y variantes funcionales) , puede ser glucosilada, amidada, carboxilada, fosforilada, esterificada, N-acilada, ciclizada vía, por ejemplo, un puente de disulfuro, o convertirse en una sal de adición de ácido y/o dimerizarse o polimerizarse opcionalmente, o conjugarse.

Una modalidad de la invención proporciona un método para producir la PE inventiva que comprende (a) expresar de manera recombinante la PE y (b) purificar la PE. Las PE y moléculas quiméricas de la invención (incluyendo las porciones funcionales y variantes funcionales) , pueden obtenerse mediante métodos para producir proteínas y polipéptidos conocidos en la técnica. Los métodos adecuados para sintetizar de novo los polipéptidos y proteínas, se describen en las referencias, tales como Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis , Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis , ed. Reid, R. , Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed.

Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2000; y la Patente de los Estados Unidos 5,449,752. También, las PE y las moléculas quiméricas de la invención pueden expresarse de manera recombinante utilizando los ácidos nucleicos descritos en la presente, utilizando métodos recombinantes estándar. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed. , Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, NY, 1994.

El método comprende además, purificar la PE. Una vez expresadas, las PE inventivas pueden purificarse de acuerdo con las técnicas de purificación conocidas en la técnica. Las técnicas de purificación ejemplares incluyen, de manera no exclusiva, precipitación con sulfato de amonio, columnas por afinidad y cromatografía en columna, o mediante procedimientos descritos en, por ejemplo, R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982) .

Otra modalidad de la invención proporciona un método para producir la molécula quimérica inventiva, que comprende (a) expresar de manera recombinante la molécula quimérica y (b) purificar la molécula quimérica. La molécula quimérica puede expresarse de manera recombinante y purificarse como se describe en la presente, con respecto a los otros aspectos de la invención. En una modalidad de la invención, la expresión recombinante de la molécula quimérica, comprende insertar una secuencia nucleotídica que codifica una porción seleccionada y una secuencia nucleotídica que codifica una PE en un vector. El método puede comprender insertar la secuencia nucleotídica que codifica la porción seleccionada y la secuencia nucleotídica que codifica la PE, en un marco, de manera que codifica un polipéptido continuo que incluye una región de la porción seleccionada funcional y una región de la PE funcional. En una modalidad de la invención, el método comprende ligar una secuencia nucleotídica que codifica la PE a una secuencia nucleotídica que codifica una porción seleccionada de manera que, tras la expresión, la PE se localiza en el término carboxilo de la porción seleccionada. En una modalidad alterna, el método comprende ligar una secuencia nucleotídica que codifica la PE a una secuencia nucleotídica que codifica una porción seleccionada, de manera que tras la expresión, la PE se localiza en el término amino de la porción seleccionada .

Aún otra modalidad de la invención proporciona un método para producir la molécula quimérica inventiva, que comprende (a) expresar de manera recombinante la PE inventiva, (b) purificar la PE, y (c) enlazar de manera covalente una porción seleccionada a la PE purificada. La PE inventiva puede expresarse de manera recombinante como se describe en la presente con respecto a otros aspectos de la invención. El método comprende además, enlazar de manera covalente una porción seleccionada a la PE purificada. El método de unir una PE a una porción seleccionada puede variar, de acuerdo con la estructura química de la porción seleccionada. Por ejemplo, el método puede comprender hacer reaccionar uno o más de una variedad de grupos funcionales, por ejemplo, grupos de ácido carboxílico (COOH) , amina libre (-NH2) , o sulfhidrilo (-SH) presentes en la PE, con un grupo funcional adecuado en la porción seleccionada, formando por lo tanto, un enlace covalente entre la PE y la porción seleccionada. De manera alterna o adicional, el método puede comprender derivar la porción seleccionada o la PE para exponer o unir grupos funcionales reactivos adicionales. La derivación puede también incluir unir uno o más enlazantes a la porción seleccionada o PE.

En otra modalidad de la invención, las PE y moléculas quiméricas inventivas pueden producirse utilizando métodos no recombinantes . Por ejemplo, las PE y moléculas quiméricas inventivas descritas en la presente (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales) , pueden sintetizarse comercialmente por compañías, tales como Synpep (Dublin, CA) , Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, D) , y Múltiple Peptide Systems (San Diego, CA) . A este respecto, Las PE y moléculas quiméricas inventivas pueden ser sintéticas, recombinantes, aisladas y/o purificadas.

Puede ser deseable, en algunas circunstancias, liberar la PE de la porción seleccionada cuando la molécula quimérica ha alcanzado una o más células objetivo. A este respecto, las moléculas quiméricas inventivas pueden comprender un enlazante escindible . El enlazante puede ser escindible por cualquier medio, por ejemplo, enzimáticamente . Por ejemplo, cuando la célula objetivo es una célula cancerosa (por ejemplo, tumor) , la molécula quimérica puede incluir un enlazante escindible bajo condiciones presentes en el sitio del tumor (por ejemplo, cuando se expone a las enzimas asociadas con el tumor o a pH ácido) .

Una modalidad de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica cualquiera de las PE inventivas o las moléculas quiméricas inventivas descritas en la presente . El término "ácido nucleico", como se utiliza en la presente, incluye "polinucleótido" , "oligonucleótido" y "molécula de ácido nucleico", y significa generalmente un polímero de ADN o ARN, que puede ser de una sola hebra o de doble hebra, que puede sintetizarse u obtenerse (por ejemplo, aislarse y/o purificarse) de fuentes naturales, que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que puede contener un enlace internucleótido natural, no natural o alterado, tal como un enlaces de fosforoamidato a un enlace de fosforotioato, en lugar del fosfodiéster encontrado entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado. Se prefiere generalmente que el ácido nucleico no comprenda ninguna inserción, supresión, inversiones y/o sustituciones. Sin embargo, puede ser adecuado en algunos casos, como se discute en la presente, que el ácido nucleico comprenda una o más inserciones, inversiones y/o sustituciones.

De manera preferida, los ácidos nucleicos de la invención son recombinantes . Como se utiliza en la presente, el término "recombinante" se refiere a (i) moléculas que son construidas fuera de las células vivientes, uniendo segmentos de ácidos nucleicos naturales o sintéticos, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de aquellos descritos en (i) anterior. Para propósitos de la presente, la replicación puede ser replicación in vitro o replicación in vivo.

Los ácidos nucleicos pueden construirse basándose en la síntesis química y/o reacciones de ligadura enzimática utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra, y Ausubel et al., supra . Por ejemplo, un ácido nucleico puede sintetizarse químicamente, utilizando nucleótidos naturales o varios nucleótidos modificados diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas, o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado tras la hibridación (por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina) . Los ejemplos de los nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar los ácidos nucleicos incluyen, de manera no exclusiva, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroximetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2, 2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina N6 sustituida, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2 -metiltio-Ne-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v) , wibutoxosina, seudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo y 2 , 6-diaminopurina. De manera alterna, uno o más de los ácidos nucleicos de la invención, pueden comprarse de compañías tales como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, TX) .

La invención también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que es complementaria a la secuencia nucleotídica de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente, o una secuencia nucleotídica que se híbrida bajo condiciones rigurosas a la secuencia nucleotídica de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente.

La secuencia nucleotídica que se híbrida bajo condiciones rigurosas de manera preferida, se híbrida bajo condiciones de alto rigor. Por "condiciones de alto rigor", se quiere decir que la secuencia nucleotídica se híbrida de manera específica a una secuencia objetivo (la secuencia nucleotídica de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente) en una cantidad que es más fuerte de manera detectable, que la hibridación no específica. Las condiciones de alto rigor, incluyen condiciones que distinguirían un polinucleótido con una secuencia complementaria exacta, o uno que contiene sólo unas cuantas malas correspondencias dispersas, de una secuencia aleatoria que tiene sólo unas cuantas regiones pequeñas (por ejemplo, 3-10 bases) que corresponden con la secuencia nucleotídica. Tales regiones pequeñas de complementariedad son fundidas más fácilmente que un complemento de longitud completa de 14-17 o más bases, y la hibridación con alto rigor las hace más fácilmente distinguibles. Las condiciones de rigor relativamente alto incluirían, por ejemplo, condiciones con baja sal y/o alta temperatura, tales como las proporcionadas por aproximadamente NaCl 0.02-0.1 M o lo equivalente, a temperaturas de aproximadamente 50-70°C. Tales condiciones de alto rigor toleran pocas, si las hay, malas correspondencias entre las secuencias nucleot dicas y la plantilla o hebra objetivo, y son particularmente adecuadas para detectar la expresión de cualquiera de las PE o moléculas quiméricas inventivas. Se aprecia generalmente que las condiciones pueden volverse más rigurosas mediante la adición de cantidades que se incrementan de formamida.

La invención también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que es aproximadamente 70% o más, por ejemplo, aproximadamente 80% o más, aproximadamente 90% o más, aproximadamente 91% o más, aproximadamente 92% o más, aproximadamente 93% o más, aproximadamente 94% o más, aproximadamente 95% o más, aproximadamente 96% o más, aproximadamente 97% o más, aproximadamente 98% o más, o aproximadamente 99% o más idéntica a cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente .

Los ácidos nucleicos de la invención pueden incorporarse en un vector de expresión recombinante . A este respecto, la invención proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención. Para propósitos de la presente, el término "vector de expresión recombinante" , significa un constructo de oligonucleótido o polinucleótido modificado genéticamente, que permite la expresión de un AR , proteína, polipéptido o péptido por una célula hospedera, cuando el constructo comprende una secuencia nucleotídica que codifica el AR ra, proteína, polipéptido o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula bajo condiciones suficiente para hacer que el ARNm, proteína, polipéptido o péptido se expresen dentro de la célula. Los vectores de la invención son no naturales como un todo. Sin embargo, partes de los vectores pueden ser naturales. Los vectores de expresión recombinantes inventivos pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, incluyendo, de manera no exclusiva, ADN y ARN, que puede ser de una sola hebra o de doble hebra, que puede sintetizarse u obtenerse en parte de fuentes naturales, y que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender enlaces internucléotido naturales, no naturales o ambos tipos de enlaces. De manera preferida, . los nucleótidos o enlaces internucléotido no naturales o alterados no impiden la transcripción o replicación del vector.

El vector de expresión recombinante de la invención puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado, y puede utilizarse para transformar o transfectar cualquier célula hospedera adecuada. Los vectores adecuados incluyen aquéllos diseñados para la propagación o expansión o para la expresión o para ambas, tales como plásmidos y virus. El vector puede seleccionarse del grupo que consiste de la serie pUC (Fermentas Life Sciences) , la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA) , la serie pET (Novagen, Madison, WI) , la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) , y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA) . Los vectores del bacteriófago, tales como AGTIO, AGTll, AZapII (Stratagene) , AEMBL4 y ANM1149, también pueden utilizarse. Los ejemplos de vectores de expresión en plantas incluyen pBIOl, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión en animales incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech) . De manera preferida, el vector de expresión recombinante es un vector viral, por ejemplo, un vector retroviral .

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden prepararse utilizando técnicas de ADN recombinante estándar, descritas en, por ejemplo, Sambrook et al., supra, y Ausubel et al., supra. Los constructos de los vectores de expresión, que son circulares o lineales, pueden prepararse para contener un sistema de replicación funcional en una célula hospedera procariótica o eucariótica. Los sistemas de replicación pueden derivarse, por ejemplo, de ColEl, plásmido 2 µ, ?, SV40, virus del papiloma bovino y lo similar.

De manera deseable, el vector de expresión recombinante comprende secuencias regulatorias, tales como codones de inicio y de terminación de la transcripción y traducción, que son específicos para el tipo de hospedero (por ejemplo, bacterias, hongos, plantas o animales), en el cual se va a introducir el vector conforme sea apropiado, y tomando en consideración si el vector se basa en ADN o ARN.

El vector de expresión recombinante puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de hospederos transformados o transíectados . Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, por ejemplo, resistencia a los antibióticos, metales pesados, etc., complementación en un hospedero autotrófico para proporcionar prototrofía y lo similar. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión inventivos incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a la neomicina/G418 , genes de resistencia a la higromicina, genes de resistencia al histidinol, genes de resistencia a la tetraciclina y genes de resistencia a la ampicilina.

El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor nativo o no nativo enlazado de manera operable a la secuencia nucleotídica que codifica la PE inventiva o molécula quimérica (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales) , o a la secuencia nucleotídica que es complementaria a, o que se híbrida a la secuencia nucleotídica que codifica la PE o molécula quimérica. La selección de los promotores, por ejemplo, fuertes, débiles, inducibles, específicos del tejido y específicos del desarrollo, están dentro de la experiencia ordinaria del técnico. De manera similar, la combinación de una secuencia nucleotídica con un promotor, también está dentro de la experiencia ordinaria del técnico. El promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral, por e emplo, un promotor del citomegalovirus (CMV) , un promotor de SV40, un promotor de RSV, o un promotor encontrado en la repetición terminal larga del virus de las células germinales murinas .

Los vectores de expresión recombinantes inventivos pueden diseñarse para la expresión transitoria, para la expresión estable o para ambas. También, los vectores de expresión recombinantes pueden hacerse para la expresión constitutiva o para la expresión inducible.

Otra modalidad de la invención proporciona además, una célula hospedera que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos en la presente. Como se utiliza en la presente, el término "célula hospedera", se refiere a cualquier tipo de célula que puede contener el vector de expresión recombinante inventivo. La célula hospedera puede ser una célula eucariótica, por ejemplo, una célula de planta, animal, hongos o algas, o puede ser procariótica, por ejemplo, bacterias o protozoarios . La célula hospedera puede ser una célula cultivada, una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. Para el propósito de introducir una PE o molécula quimérica inventiva recombinante, la célula hospedera es de manera preferida una célula procariótica, por ejemplo, una célula de E. coli.

También se proporciona por la invención, una población de células que comprende al menos una célula hospedera descrita en la presente. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula hospedera que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos, además de al menos otra célula, por ejemplo, una célula hospedera que no comprende ninguno de los vectores de expresión recombinantes . De manera alterna, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, en la cual la población comprende principalmente (por ejemplo, consiste esencialmente de) células hospederas que comprenden el vector de expresión recombinante. La población también puede ser una población de células clónales, en las cuales todas las células de la población son clonas de una sola célula hospedera que comprende un vector de expresión recombinante, de manera que todas las células de la población comprenden el vector de expresión recombinante. En una modalidad de la invención, la población de células es una población clonal de células hospederas que comprende un vector de expresión recombinante como se describe en la presente.

Las PE inventivas, moléculas quiméricas (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales) , ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células hospederas (incluyendo las poblaciones de las mismas) , y las poblaciones de células inventivas, pueden ser aisladas y/o purificadas. El término "aislado", como se utiliza en la presente, significa que se han retirado de su medio ambiente natural. El término "purificado" como se utiliza en la presente, significa que se han incrementado en pureza, en donde "pureza" es un término relativo, y no necesariamente interpretado como una pureza absoluta. Por ejemplo, la pureza puede ser de aproximadamente 50% o más, aproximadamente 60% o más, aproximadamente 70% o más, aproximadamente 80% o más, aproximadamente 90% o más, o aproximadamente 100%. La pureza de manera preferida es de aproximadamente 90% o más (por ejemplo, de aproximadamente 90% a aproximadamente 95%) , y de manera más preferida de aproximadamente 98% o más (por ejemplo, de aproximadamente 98% a aproximadamente 99%) .

Las PE inventivas, moléculas quiméricas (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales) , ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospederas (incluyendo poblaciones de las mismas) , y poblaciones de células, todos los cuales se refieren de manera colectiva como "materiales de PE inventivos" aquí posteriormente, pueden formularse en una composición, tal como una composición farmacéutica. A este respecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las PE, moléculas quiméricas (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales) , ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes , células hospederas (incluyendo poblaciones de las mismas) , y poblaciones de células y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica inventiva que contiene cualquiera de los materiales de PE inventivos, pueden comprender más de un material de PE inventivo, por ejemplo, un polipéptido y un ácido nucleico, o dos o más diferentes PE. De manera alterna, la composición farmacéutica puede comprender un material de PE Inventivo en combinación con uno o más de otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, tales como agentes quimioterapéuticos , por ejemplo, asparaginasa, busulfan, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc.

De manera preferida, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable . Con respecto a las composiciones farmacéuticas, el portador puede ser cualquiera de aquellos utilizados convencionalmente y está limitado solo por las consideraciones quimicofísicas , tales como solubilidad y falta de reactividad con los compuestos activos, y por la ruta de administración. Los portadores farmacéuticamente aceptable descritos en la presente, por ejemplo, vehículos, adyuvantes, excipientes y diluyentes, son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica, y están fácilmente disponibles al público. Se prefiere que el portador farmacéuticamente aceptable sea uno que sea químicamente inerte para los agentes activos, y uno que no tenga efectos secundarios dañinos o toxicidad bajo las condiciones de uso.

La elección del portador se determinará en parte por el material de PE inventivo particular, así como por el método particular utilizado para administrar el material de PE inventivo. En consecuencia, existe una variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la invención. Las siguientes formulaciones para la administración parenteral (por ejemplo, subcutánea, intravenosa, intraarterial , intramuscular, intradérmica, interperitoneal e intratecal) , oral y en aerosol, son ejemplares, y de ninguna manera son limitantes. Puede utilizarse más de una ruta para administrar los materiales de PE inventivos, y en ciertos casos, una ruta particular puede proporcionar una respuesta más inmediata y más efectiva que otra ruta.

Las formulaciones tópicas son bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. Tales formulaciones son particularmente adecuadas en el contexto de la invención para la aplicación a la piel.

Las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden incluir (a) soluciones líquidas, tales como una cantidad efectiva del material de PE inventivo disuelto en diluyentes, tales como agua, solución salina o jugo de naranja; (b) cápsulas, sobres, tabletas, pastillas para chupar y comprimidos, cada uno que contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo, como sólidos o gránulos; (c) polvos; (d) suspensiones en un líquido apropiado y (e) emulsiones adecuadas. Las formulaciones líquidas pueden incluir diluyentes, tales como agua y alcoholes, por ejemplo, etanol, alcohol bencílico y alcoholes de polietileno, ya sea con o sin la adición de un agente tensoactivo farmacéuticamente aceptable. Las formas de cápsula pueden ser del tipo ordinario de gelatina con cubierta dura o blanda, que contienen, por ejemplo, agentes tensoactivos , lubricantes y rellenos inertes, tales como lactosa, sacarosa, fosfato de calcio y almidón de maíz. Las formas de tableta pueden incluir uno o más de lactosa, sacarosa, manitol, almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico, celulosa microcristalina, acacia, gelatina, goma guar, dióxido de silicio coloidal, croscarmelosa sódica, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de zinc, ácido esteárico y otros excipientes, colorantes, diluyentes, agentes amortiguadores, agentes desintegrantes, agentes humectantes, conservadores, agentes saborizantes y otros excipientes farmacológicamente compatibles . Las formas de pastillas para chupar pueden comprender el material de PE inventivo en un sabor, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto, asi como pastillas que comprenden el material de PE inventivo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia, emulsiones, geles, y lo similar, que contienen adicionalmente tales excipientes como se conoce en la técnica.

El material de PE inventivo, solo o en combinación con otros componentes adecuados, puede hacerse en formulaciones en aerosol para ser administrados vía inhalación. Estas formulaciones en aerosol pueden colocarse en propelentes presurizados aceptables, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y lo similar. Las formulaciones en aerosol también pueden formularse como productos farmacéuticos para preparaciones no presurizadas , tales como en un nebulizador o un atomizador. Tales formulaciones de rocío también pueden utilizarse para rociar las mucosas .

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas y no acuosas, isotónicas, estériles, para inyección, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostatos y solutos que vuelven a la formulación isotónica con la sangre del receptor pretendido, y suspensiones acuosas y no acuosas estériles que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes , agentes espesantes, estabilizantes y conservadores. El material de PE inventivo pueden administrarse en un diluyente fisiológicamente aceptable en un portador farmacéutico, tal como un líquido estéril o mezcla de líquidos, incluyendo agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones de azúcar relacionadas, un alcohol, tal como etanol o alcohol hexadecílico, un glicol, tal como propilenglicol o polietilenglicol, sulfóxido de dimetilo, glicerol, cetales tales como 2, 2-dimetil-l, 3-dioxolan-4-metanol, éteres, poli (etilenglicol) 400, aceites, ácidos grasos, ásteres de ácido graso o glicéridos, o glicéridos de ácido graso acetilados con o sin la adición de un agente tensoactivo farmacéuticamente aceptable, tal como un jabón o detergente, agente de suspensión tal como pectina, carbómeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa, o agentes emulsificantes y otros adyuvantes farmacéuticos.

Los aceites que pueden utilizarse en las formulaciones parenterales, incluyen aceites de petróleo, animales, vegetales o sintéticos. Los ejemplos específicos de aceites incluyen de cacahuate, soya, sésamo, semilla de algodón, maíz, oliva, petrolato y mineral. Los ácidos grasos adecuados para utilizarse en las formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico y ácido isoesteárico . El oleato de etilo y el miristato de isopropilo son ejemplos de ésteres de ácido graso adecuados.

Los jabones adecuados para utilizarse en las formulaciones parenterales incluyen sales de metal alcalino graso, amonio, y trietanolamina, y los detergentes adecuados incluyen (a) detergentes catiónicos tales como, por ejemplo, haluros de dimetil dialquil amonio y haluros de alquilo piridinio, (b) detergentes aniónicos tales como, por ejemplo, sulfonatos de alquilo, arilo y olefina, sulfatos de alquilo, olefina, éter y monoglicérido y sulfosuccinatos , (c) detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, óxidos de amina grasos, alcanolamidas de ácido graso y copolímeros de polioxietilenpolipropileno, (d) detergentes anfotéricos tales como, por ejemplo, alquil-ß-aminopropionatos y sales de 2-alquil-imidazolina de amonio cuaternario, y (e) mezclas de los mismos.

Las formulaciones parenterales contendrán típicamente de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 25% en peso del material de PE inventivo en solución. Pueden utilizarse conservadores y amortiguadores. Con el fin de reducir al mínimo o eliminar la irritación en el sitio de la inyección, tales composiciones pueden contener uno o más agentes tensoactivos no iónicos que tienen un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) de aproximadamente 12 a aproximadamente 17. La cantidad de agente tensoactivo en tales formulaciones variará típicamente de aproximadamente 5% a aproximadamente 15% en peso. Los agentes tensoactivos adecuados incluyen ásteres de ácido graso de polietilenglicol sorbitan, tales como monooleato de sorbitan y los aductos de alto peso molecular de óxido de etileno con una base hidrofóbica, formada por la condensación del óxido de propileno con -propilenglicol . Las formulaciones parenterales pueden presentarse en recipientes sellados de una dosis unitaria o de múltiples dosis, tales como ampollas y viales, y pueden almacenarse en una condición secada por congelación ( liofilizada) , que requiere sólo la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo, agua, para las inyecciones, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporánea pueden prepararse a partir de polvos, granulos y tabletas estériles de la clase descrita previamente. Los requisitos para lo portadores f rmacéuticos efectivos para las composiciones parenterales son bien conocidos por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica (véase, por ejemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Filadelfia, PA, Banker y Chalmers, eds . , páginas 238-250 (1982), y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4a ed., páginas 622-630 (1986)).

Se apreciará por alguien con experiencia en la técnica que, además de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente, los materiales de PE inventivos de la invención pueden formularse como complejos de inclusión, tales como complejos de inclusión de ciclodextrina o lippsomas .

Para propósitos de la invención, la cantidad o dosis del material de PE inventivo administrado, debe ser suficiente para efectuar una respuesta deseada, por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica, en el mamífero durante un marco de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del material de PE inventivo deberá ser suficiente para inhibir el crecimiento de una célula objetivo o para tratar o prevenir el cáncer en un periodo de aproximadamente 2 horas o más, por ejemplo, 12 a 24 o más horas, desde el momento de la administración. En ciertas modalidades, el periodo de tiempo podría ser incluso mayor. La dosis se determinará por la eficacia del material de PE inventivo particular y la condición del mamífero (por ejemplo, humano) , así como el peso corporal del mamífero (por ejemplo, humano) a ser tratado .

Muchos ensayos para determinar una dosis administrada se conocen en la técnica. Una dosis administrada puede determinarse in vitro (por ejemplo, cultivos celulares) o in vivo (por ejemplo, estudios con animales) . Por ejemplo, una dosis administrada puede determinarse determinando la IC50 (la dosis que alcanza una inhibición máxima a la mitad de los síntomas) , LD50 (la dosis letal para 50% de la población) , la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) , y el índice terapéutico en estudios de cultivo celular y/o con animales. El índice terapéutico es la relación de LD50 a ED50 (es decir, LD5o/ED5o) .

La dosis del material de PE inventivo también se determinará por la existencia, naturaleza y grado de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar la administración de un material de PE inventivo particular. Típicamente, el médico que atiende decidirá la dosificación del material de PE inventivo con la cual tratar a cada paciente individual, tomando en consideración una variedad de factores, tales como la edad, peso corporal, salud general, dieta, sexo, material de PE inventivo a ser administrado, ruta de administración y la severidad de la condición siendo tratada. A manera de ejemplo y sin pretender limitar la invención, la dosis del material de PE inventivo puede ser de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal del sujeto siendo tratado/día, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 1 a aproximadamente a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 25 a aproximadamente 150 mg/kg de peso corporal/día, o de aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día.

De manera alterna, los materiales de PE inventivos pueden modificarse en forma de depósito, de forma que la manera en la cual el material de PE inventivo se libera en el cuerpo al cual se administra, se controla con respecto al tiempo y ubicación dentro del cuerpo (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 4,450,150). Las formas de depósito de los materiales de PE inventivos pueden, por ejemplo, ser una composición implantable que comprende los materiales de PE inventivos y un material poroso o no poroso, tal como un polímero, en donde los materiales de PE inventivos se encapsulan por, o se difunden a través del material y/o la degradación del material no poroso. El depósito se implanta a continuación en la ubicación deseada dentro del cuerpo, y los materiales de PE inventivos se liberan del implante a una velocidad predeterminada.

Los materiales de PE inventivos pueden probarse para la citotoxicidad mediante ensayos conocidos en la técnica. Los ejemplos de ensayos de citotoxicidad incluyen un ensayo WST, que mide la proliferación celular utilizando la sal de tetrazolio WST-1 (reactivos y equipos disponibles de Roche Applied Sciences) , como se describe en la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional WO 2011/032022.

Esta contemplado que las composiciones farmacéuticas, PE, moléculas quiméricas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes , células hospederas o poblaciones de células inventivos, puedan utilizarse en los métodos para tratar o prevenir el cáncer. Sin estar apegado a una teoría o mecanismo particular, se cree que las PE inventivas destruyen o inhiben el crecimiento de las células a través de la inhibición de la síntesis de las proteínas en las células eucarióticas , por ejemplo, mediante la inactivación de la ribosilación del ADP del factor 2 de alargamiento (EF-2) . Sin estar apegado a una teoría o mecanismo particular, las moléculas quiméricas inventivas, reconocen y se unen de manera específica a los marcadores de la superficie celular, suministrando por lo tanto la PE citotóxica a la población de células que expresan el marcador de la superficie celular con mínima o ninguna reactividad cruzada con las células que no expresan el marcador de la superficie celular. De esta manera, la citotoxicidad de la PE puede dirigirse para destruir o inhibir el crecimiento de una población de células particular, por ejemplo, células cancerosas. A este respecto, la invención proporciona un método para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero cualquiera de las PE, moléculas quiméricas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospederas, poblaciones de células o composiciones farmacéuticas descritas en la presente, en una cantidad efectiva para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero.

Los términos "tratar" y "prevenir" , así como las palabras que se derivan de los mismos, como se utilizan en la presente, no necesariamente implican un tratamiento o prevención al 100% o completo. En su lugar, hay varios grados de tratamiento o prevención de los cuales alguien con experiencia en la técnica reconocerá como que tienen un beneficio potencial o efecto terapéutico. A este respecto, los métodos inventivos pueden proporcionar cualquier cantidad de cualquier nivel de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero. Además, el tratamiento o prevención proporcionado por el método inventivo, puede incluir el tratamiento o prevención de una o más condiciones o síntomas de la enfermedad, por ejemplo, cáncer, que se está tratando o previniendo. También, para propósitos de la presente, "prevención" puede abarcar retrasar el inicio de la enfermedad, o un síntoma o condición de la misma.

Para propósitos de los métodos inventivos, en donde las células hospederas o las poblaciones de células se administran, las células pueden ser células que son alogeneicas o autólogas para el hospedero. De manera preferida, las células son autólogas para el hospedero.

Con respecto a los métodos inventivos, el cáncer puede ser cualquier cáncer, incluyendo cualquiera de cáncer de las glándulas adrenales, sarcomas (por ejemplo, sarcoma sinovial, sarcoma osteogénico, leiomiosarcoma uteri, angiosarcoma, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, liposarcoma, mixoma, rabdomioma, fibroma, lipoma y teratoma) , linfornas (por ejemplo, linforna linfocítico pequeño, linforna de Hodgkin y linfoma no de Hodgkin) , carcinoma hepatocelular, glioma, cánceres de cabeza (por ejemplo, carcinoma de las células escamosas) , cánceres de cuello (por ejemplo, carcinoma de las células escamosas) , cáncer linfocítico agudo, leucemias (por ejemplo, leucemia de las células pilosas, leucemia mieloide (aguda y crónica) , leucemia linfática (aguda y crónica) , leucemia prolinfocítica (PLL) , leucemia mielomonocítica (aguda y crónica) , y leucemia linfocítica (aguda y crónica) ) , cáncer de huesos (sarcoma osteogénico, fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, linfoma maligno (sarcoma de las células del retículo) , mieloma múltiple, tumor maligno de las células gigantes, cordoma, osteocondroma (exostosis osteocartilaginosa) , condroma benigno, condroblastoma, fibroma condromixoide , osteoma osteoide y tumores de las células gigantes) , cáncer de cerebro (astrocítoma, meduloblastoma, glioma, ependimoma, germinoma (pinealoma) , glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, schwannoma y retinoblastoma) , cáncer de las trompas de Falopio, cáncer de mama, cáncer del ano, canal anal o anorrecto, cáncer del ojo, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de las articulaciones, cáncer de cuello, vesícula o pleura, cáncer de la nariz, cavidad nasal u oído medio, cáncer de la cavidad oral, cáncer de la vulva (por ejemplo, carcinoma de las células escamosas, carcinoma intraepitelial, adenocarcinoma y fibrosarcoma) , trastornos mieloproliferativos (por ejemplo, cáncer mieloide crónico) , cánceres de colon (por ejemplo, carcinoma de colon) , cáncer esofágico (por ejemplo, carcinoma de las células escamosas, adenocarcinoma, leiomiosarcoma y linfoma) , cáncer cervical (carcinoma cervical y displasia cervical preinvasiva) , cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, cáncer de hipofaringe, cáncer de laringe, cáncer del hígado (por ejemplo, carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, hepatoblastoma, angiosarcoma, adenoma hepatocelular y hemangioma) , cánceres de pulmón (por ejemplo, carcinoma bronquiogénico (células escamosas, células pequeñas no diferenciadas, células grandes no diferenciadas y adenocarcinoma) , carcinoma alveolar (bronquiolar) , adenoma bronquial, hamartoma condromatoso, cáncer de pulmón de las células pequeñas, cáncer de pulmón de las células no pequeñas y adenocarcinoma de pulmón) , mesotelioma maligno, cáncer de piel (por ejemplo, melanoma, carcinoma de las células básales, carcinoma de las células escamosas, sarcoma de Kaposi, nevos, nevos displásicos, lipoma, angioma, dermatofibroma y queloides) , mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, cáncer de ovario (por ejemplo, carcinoma de ovario (cistadenocarcinoma ceroso, cistadenocarcinoma mucinoso, carcinoma endometrioide y adenocarcinoma de las células transparentes) , tumores de las células granulosas-tecales, tumores de las células de Sertoli-Leydig, disgerminoma y teratoma maligno) , cáncer pancreático (por ejemplo, adenocarcinoma ductal, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, tumores carcinoides y VIPoma) , cáncer de peritoneo, epiplón, mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata (por ejemplo, adenocarcinoma y sarcoma) , cáncer rectal, cáncer de riñon (por ejemplo, adenocarcinoma, tumor de Wilms (nefroblastoma) , y carcinoma de las células renales) , cáncer del intestino delgado (adenocarcinoma, linfoma, tumores carcinoides, sarcoma de Kaposi, leiomioma, hemangioma, lipoma, neurofibroma y fibroma) , cáncer del tejido blando, cáncer de estómago (por ejemplo, carcinoma, linfoma y leiomiosarcoma) , cáncer testicular (por ejemplo, seminoma, teratoma, carcinoma embrional, teratocarcinoma, coriocarcinoma, sarcoma, tumor de las células de Leydig, fibroma, fibroadenoma, tumores adenomatoides y lipoma) , cáncer del útero (por ejemplo, carcinoma endometrial) , cáncer de tiroides y cánceres uroteliales (por ejemplo, carcinoma de las células escamosas, carcinoma de las células de transición, adenocarcinoma, cáncer de uréter y cáncer de la vejiga urinaria) .

Como se utiliza en la presente, el término "mamífero", se refiere a cualquier mamífero, incluyendo, de manera no exclusiva, mamíferos del orden Rodentia , tales como ratones y hámsters, y mamíferos del orden Logomorpha , tales como conejos. Se prefiere que los mamíferos sean del orden Carnívora, incluyendo Felinos (gatos) y Caninos (perros). Se prefiere más que los mamíferos sean del orden ñrtiodactyla , incluyendo Bovinos (vacas) y Porcinos (cerdos) o del orden Perssodactyla , incluyendo Equinos (caballos) . Se prefiere aún más que los mamíferos sean del orden Primates, Ceboides o Simoides (monos) o del orden Anthropoides (humanos y simios) . Un mamífero especialmente preferido es el humano.

También se proporciona un método para inhibir el crecimiento de una célula objetivo, que comprende poner en contacto la célula con la PE de cualquiera de las PE, moléculas quiméricas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospederas, poblaciones de células o composiciones farmacéuticas descritas en la presente, en una cantidad efectiva para inhibir el crecimiento de la célula objetivo. El crecimiento de la célula objetivo puede inhibirse por cualquier cantidad, por ejemplo. por aproximadamente 10% o más , aproximadamente 15% o más , aproximadamente 20% o más , aproximadamente 25% o más , aproximadamente 30% o más, aproximadamente 35% o más, aproximadamente 40% o más , aproximadamente 45% o más , aproximadamente 50% o más, aproximadamente 55% o más, aproximadamente 60% o más , aproximadamente 65% o más, aproximadamente 70% o más , aproximadamente 75% o más , aproximadamente 80% o más, aproximadamente 85% o más , aproximadamente 90% o más , aproximadamente 95% o más , o aproximadamente 100%. La célula objetivo puede proporcionarse en una muestra biológica. Una muestra biológica puede obtenerse de un mamífero de cualquier manera adecuada y de cualquier fuente adecuada. La muestra biológica puede, por ejemplo, obtenerse mediante una extracción de sangre, leucaferesis, y/o biopsia o necropsia del tumor. El paso de poner en contacto puede tener lugar in vitro o in vivo con respecto al mamífero. De manera preferida, el contacto es in vitro.

En una modalidad de la invención, la célula objetivo es una célula cancerosa. La célula objetivo puede ser una célula cancerosa de cualquiera de los cánceres descritos en la presente. En una modalidad de la invención, el objetivo puede expresar un marcador de la superficie celular. El marcador de la superficie celular puede ser cualquier marcador de la superficie celular descrito en la presente, con respecto a otros aspectos de la invención. El marcador de la superficie celular puede, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste de CD19, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD79b, receptor de la transferrina, receptor de EGF, mesotelina, cadherina y Lewis Y.

Los siguientes ejemplos ilustran además la invención, pero por supuesto, no deben interpretarse de ninguna manera como que limitan su alcance.

EJEMPLO 1 Este ejemplo demuestra la frecuencia de los alelos de HLA clase 2 en una cohorte de donadores sin exposición, en comparación con aquélla de la población mundial.

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , se aislaron de 65 donadores sanos obtenidos del banco de sangre de NIH y 50 pacientes que se sometieron a tratamiento con inmunotoxina en NCI. Las PBMC se aislaron de la capa leucocitaria mediante centrifugación con densidad de Ficoll. Los haplotipos de HLA clase I y clase II de las PBMC de los pacientes y los donadores sanos se identificaron utilizando un equipo de tipificación del tejido basado en PCR-SSP/SSO. Las PBMC se congelaron a continuación en suero humano AB inactivado con calor y medio de congelación estándar, y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta el uso.

Una cohorte de 65 donadores sanos se estudió para proporcionar información sobre el número y frecuencia de alotipos de HLA DR expresados en la población mundial. El análisis de los alotipos expresados en la cohorte de donadores sin exposición se comparó con la población mundial (Middleton, D. et al., New Alíele Frequency Datábase: www.allelefrequencies.net, Tissue Antigens, 61(5): 403-7(20*03)), que mostró que había una representación razonable de los alelos de DRBl de HLA clase II principales en la cohorte de donadores sin exposición. El análisis estadístico mostró una correlación entre la población mundial y la cohorte de donadores de R2 = 0.52. La Figura 1 compara la frecuencia de los diferentes tipos de alelos de HLA clase 2 en la población mundial con la cohorte de. donadores sin exposición. La Tabla 1 muestra los haplotipos de DRBl de HLA clase II de la población donadora.

TABLA 1 EJEMPLO 2 Este ejemplo demuestra la preparación de una biblioteca peptídica para utilizarse para estimular los linfocitos T.

Para determinar la inmunogenicidad de la porción de toxina, se diseñó una biblioteca de 111 péptidos, que abarca toda la secuencia de PE38. Cada péptido tenía un tamaño de 15 aminoácidos y se superponía por 12 aminoácidos con la excepción del péptido de las SEQ ID NOs: 31 y 32, que se superponían por 11 aminoácidos. Los péptidos se sintetizaron a una pureza >95% como se determinó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) (American Peptide Co. Inc., Sunnyvale, CA) . Los péptidos' sintéticos liofilizados se disolvieron en sulfóxido de dimetilo (DMSO) para hacer soluciones madre 10 µ?.

Los péptidos se agruparon en 22 agrupaciones como se muestra en la Tabla 2. La Tabla 2 muestra las secuencias, SEQ ID NOs, y los números de agrupación de los péptidos utilizados para el trazado del mapa del epitopo.

TABLA 2 EJEMPLO 3 Este ejemplo demuestra que la expansión in vi tro de los linfocitos T de donadores sin exposición mejora el nivel de sensibilidad y respuesta de los linfocitos T a las agrupaciones de péptidos.

Con el fin de imitar la respuesta inmune que ocurre en pacientes después del tratamiento, y para superar la baja sensibilidad y falta de respuesta en las muestras de donadores sin exposición en el ensayo a corto plazo, se empleó un paso de expansión de 17 días in vitro para expandir la población de linfocitos T específica (Oseroff et al., J. Immunol., 185(2): 943-55 (2010)). Las células se incubaron durante 14-17 días después de la estimulación con inmunotoxina . Para la estimulación, se utilizó la inmunotoxina LMB9 o B3 (dsFv) -PE38 que selecciona a LeY (Brinkmann et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90(16): 7538-42 (1993)), un antígeno no presente en las células inmunes humanas. En el día 14-17, las células se recolectaron y probaron mediante un ensayo ELISpot con interleucina (IL) -2 utilizando las 22 agrupaciones de péptidos de la Tabla 2. La adición del paso de expansión in vitro mejoró el nivel de sensibilidad y respuesta del ensayo ELISpot (por ejemplo, se observaron más células que forman puntos (SFC) ) . El paso de expansión in vitro permitió la detección de una respuesta específica de CD4 de los donadores voluntarios y también redujo el número de células utilizadas para cada ensayo.

Los datos representativos se muestran en las Figuras 2A y 2B. La Figura 2A muestra la enumeración de los pozos de ELISpot con IL-2 indicando una respuesta de los linfocitos T del donador sin exposición 031810aph a la estimulación inicial de LMB9 (1.6 pg/ml) , seguido por la reestimulación con el medio solo (sin péptido) (M) , o las agrupaciones 3, 16 ó 22 de péptidos, después de 17 días de expansión in vitro. La Figura 2B muestra la enumeración de los pozos de ELISpot con IL-2, que indican una respuesta de los linfocitos T del donador sin exposición 031810aph a la estimulación inicial de LMB9 (1.6 pg/ml), seguido por la reestimulación con el medio solo (sin péptido) (M) , o las agrupaciones 3, 16 ó 22 del péptido sin expansión in vitro.

Sin desear apegarse a una teoría o mecanismo particular, se cree que este enfoque imitó la respuesta inmune debido a que, in vivo, la inmunotoxina recombinante completa (RIT) se internalizó por la célula que presenta el antígeno (APC) , se procesó y presentó durante los primeros pocos días de cultivo. Los linfocitos T específicos que respondieron a los péptidos presentados naturalmente, se mantuvieron y expandieron utilizando IL-2. Los epitopos que reconocen esos linfocitos T después de los 17 días de expansión, fueron péptidos procesados naturalmente y presentados naturalmente .

EJEMPLO 4 Este ejemplo demuestra que LVALYLAARLSW (SEQ ID NO: 3) , estimula una respuesta de los linfocitos T para la mayoría de los donadores .

Después de la estimulación inicial con inmunotoxina y 14 días de expansión, la mitad de las células se recolectaron y expusieron a las agrupaciones de péptidos para una selección de la agrupación inicial con ELISpot con IL-2. En el día 17, las células restantes se utilizado para repetir la selección de la agrupación, y se realizó una selección fina para las agrupaciones positivas observadas. Se observaron diferentes patrones de respuesta para los 28 donadores en el día 14 del ensayo. Algunas selecciones del donador revelaron una respuesta a una sola agrupación (por ejemplo, donadores 1, 4, 7 y 8), mientras que otros donadores (por ejemplo, donadores 15, 16 y 23) , revelaron respuestas a 3-4 agrupaciones. Debido a que los péptidos se superponían, también hubo una superposición entre las agrupaciones tales como, por ejemplo, casos en los cuales las agrupaciones secuenciales tenían respuestas (por ejemplo, la respuesta a las agrupaciones 15 y 16 para los donadores 15 y 18). Se determinó que el umbral es de 85 SFC/(1 x 106) .

Este umbral se determinó debido a que para los valores por debajo de 85 SFC/ (1 x 106) , ninguna de las respuestas del día 14 fueron reproducibles en el día 17, o cuando la expansión in vitro se repitió. Las respuestas de más de 85 SFC/(1 x 106) fueron reproducibles.

Cuatro donadores (donadores 25-28) , no tuvieron respuesta (sobre el umbral determinado) a ninguna agrupación, y se consideraron como sin respuesta. De los 28 donadores iniciales que se seleccionaron completamente, 24 donadores tuvieron una respuesta a al menos una agrupación. Diferentes donadores tuvieron diferentes niveles de respuesta máxima. Algunos donadores (por ejemplo, los donadores 2, 7 y 10) , tuvieron una respuesta máxima alta (más de 1100 SFC para la agrupación 3), mientras que otros donadores (por ejemplo, los donadores 3 y 9) , tuvieron una respuesta de 250-320 SFC a la misma agrupación.

El número de donadores seleccionados se incrementó a 50. El número de células que forman puntos observadas entre todos los 50 donadores, se totalizó para cada una de las 22 agrupaciones de péptidos . Los resultados se muestran en la Tabla 3 y la Figura 3. Un análisis de todos los 50 donadores, mostró que la agrupación 3 (en el dominio II de PE), proporcionó la mayoría de las respuestas (Tabla 3 ; Figura 3) . Los resultados sugieren que la agrupación 3 fue una agrupación inmunodominante , que tiene respuestas estimuladas de muchos donadores con diferentes HLA.

TABLA 3 Una selección fina de la agrupación 3 para encontrar las regiones inmunodominante, mostró que la para la mayoría de los donadores, los péptidos de las SEQ ID NOs : 44 y 45 fueron responsables de la respuesta dentro de la agrupación 3 (Figura 4) . La Figura 4 muestra que los péptidos de las SEQ ID NOs : 44 y 45 contenían una región común (LVALYLAARLSW) (SEQ ID NO: 3), para estimular los linfocitos T en la mayoría de los pacientes, a pesar de tener un diferente estado de HLA.

EJEMPLO 5 Este ejemplo demuestra que las sustituciones L294A, L297A, Y298A, L299A O R302A en LVALYLAARLSW (SEQ ID NO: 3) , reducen la inmunogenicidad de LVALYLAARLSW (SEQ ID NO: 3) .

Los péptidos de las SEQ ID NOs : 44 y 45 (dentro de la agrupación 3) , tienen 12 aminoácidos en común. Esta área común, LVALYLAARLSW (SEQ ID NO: 3) , corresponde a las posiciones de los residuos de aminoácidos 294-305 de la SEQ ID NO: 1, y contiene tanto el sitio de unión al MHC, así como el sitio de unión al receptor de los linfocitos T. Cada aminoácido en LVALYLAARLSW (SEQ ID NO: 3) se sustituyó con alanina. Las muestras de 9 donadores sin exposición y 2 pacientes se estimularon con LMB9 durante 17 días, y se probaron utilizando ELISpot con IL-2 como se describió en el Ejemplo 3. La Tabla 4 resume los datos de la selección de 11 muestras contra los péptidos sustituidos. Para 10 de 11 muestras, una o más sustituciones disminuyeron la respuesta a debajo de 7% de la respuesta al tipo silvestre (WT) . Para todos los donadores menos uno, la sustitución L297A redujo la respuesta a7% o menos. Y298A redujo la respuesta en 9 de las 11 muestras, y R302A redujo la respuesta en 7 de las 11 muestras. La Tabla 4 muestra el por ciento de respuesta de la respuesta obtenida con el péptido WT.

TABLA 4 15 Sin estar apegado a una teoría o mecanismo particular, se cree que la respuesta disminuida después de un cambio en un solo aminoácido, puede atribuirse a una interrupción de la unión del péptido a las hendiduras de la molécula de HLA o a una incapacidad del receptor del linfocito T para reconocer el péptido cambiado. En cualquier caso, los péptidos sustituidos L279A y Y298A, causaron una respuesta disminuida y, por lo tanto, puede considerarse que proporcionan una inmunogenicidad reducida.

EJEMPLO 6 Este ejemplo demuestra que la sustitución R302A no crea ningún nuevo epitopo de los linfocitos T, y proporciona una respuesta de los linfocitos T reducida.

Se utilizó la mutagénesis dirigida al sitio para preparar a HA22 RIT R302 y HA22 L297A como se describió previamente (Pastan et al., Methods Mol. Biol., 248: 503-18 (2004) ) . La actividad citotóxica en las células CA46 se comparó con aquélla de HA22 del tipo silvestre (Figura 5) . La Figura 5 muestra que los constructos de HA22 con la sustitución L297A o R302A fueron citotóxicos. La IC50 de la HA22, L297A HA22 y R302A HA22, fue de 1.1, 1.8 y 1.8 ng/ml , respectivamente .

Las PBMC de los donadores 010710 y 111909, se cultivaron durante 14 días con WT HA22 o con HA22-R302A, y se probaron para la respuesta de los linfocitos T tras la reestimulación sin péptido, péptido del tipo silvestre LVALYLAARLSWNQV (SEQ ID NO: 45) (WT15), o LVALYLAAALSWNQV (SEQ ID NO: 145) (R302A) . Para ambos de los donadores 010710 (Figura 6A) y 111909 (Figura 6B) , no se observaron nuevos epitopos, y la respuesta de los linfocitos T al péptido sustituido fue disminuida.

EJEMPLO 7 Este ejemplo demuestra que la supresión de la porción del dominio II que contiene el epitopo inmunodominante , reduce la respuesta de los linfocitos T a los péptidos de PE38.

Como se muestra en el Ejemplo 4, el dominio II contiene un epitopo inmunodominante y promiscuo (contenido en las SEQ ID NOs: 44 y 45 de la agrupación 3). PE-LR (resistencia a la degradación lisosomal) (también conocida como LR o LR RIT) , contiene una supresión del dominio II, excepto por la secuencia de escisión con furina RHRQPRGWEQL (SEQ ID NO: 8), que está presente en las SEQ ID NOs : 37 y 38. Asi, LR RIT contiene los residuos de los aminoácidos 274-284 y 395-613 de la SEQ ID NO: 1.

La respuesta de los linfocitos T del donador que se estimuló por HA22 (que contiene PE38) a las 22 agrupaciones de péptidos de la Tabla 2, se comparó con aquélla de los linfocitos T del donador que se estimuló por PE-LR (que carecía completamente del epitopo inmunodominante) .

En el Día 0, los linfocitos T de tres donadores (Donador 031510, Donador 021610 o Donador 101509), se emplacaron en placas de 6 pozos, y se estimularon con 10 pg/ml de HA22 o PE-LR. En el día 14, las células se recolectaron y emplacaron en una placa ELISpot con IL-2 y se incubaron con los péptidos de una de cada una de las 22 agrupaciones de la Tabla 2 en replicas de 4. Los controles incluyeron células que crecieron con ceftazidima (CEFT) , células sin estimulación con el antígeno en el día 0 y sin estimulación con el antígeno en el día 14 ("línea M" ) , y células con estimulación con LMB9 en el día 0 y sin estimulación con el antígeno en el día 14 ("sin péptido").

Los resultados se muestran en las Figuras 7A (Donador 031510) , 7B (Donador 021610) y 7C (Donador 101509) . Los linfocitos T de todos los tres donadores demostraron una respuesta tras la estimulación con HA22 (que contiene PE38) , y la reestimulación con los péptidos de la agrupación 3. No se observó respuesta para las células que se estimularon con PE-LR.

EJEMPLO 8 Este ejemplo demuestra la identificación de los epitopos de los linfocitos T en el dominio III de la PE.

Después de la estimulación inicial con inmunotoxina y 14 días de expansión, los linfocitos T de 20 donadores se recolectaron y expusieron a las agrupaciones de péptidos para una selección de la agrupación inicial con ELISpot con IL-2, como se describió en el Ejemplo 4. En el día 17, las células restantes se utilizaron para repetir la selección de la agrupación y se realizó una selección fina con los péptidos de las SEQ ID NOs : 102-111. Los resultados se muestran en la Figura 8. Los péptidos que estimularon la producción de IL-2 por los linfocitos T de cada uno de los donadores 1-20, están sombreados en la Figura 8.

EJEMPLO 9 Este ejemplo demuestra que una sustitución de la alanina en lugar de 1493, R494, N495, G496, L498, L499, R500, V501 o Y502, reduce la respuesta de los linfocitos T, medida por la producción de IL-2, en comparación con la respuesta al péptido del tipo silvestre (WT) .

Cada aminoácido que no es alanina en el péptido del tipo silvestre IRNGALLRVYVPRSS (SEQ ID NO: 106) , se sustituyó con alanina. Las muestras de los donadores sin exposición se estimularon con LMB9 durante 17 días, y se probaron utilizando ELISpot con IL-2, como se describió en el Ejemplo 3. La Tabla 5 resume los datos de la selección de seis muestras con los péptidos sustituidos.

TABLA 5 10 Como se muestra en la Tabla 5, para todas las seis muestras, una o más sustituciones disminuyeron la respuesta a 10-30% de la respuesta a WT. Para cinco de seis muestras, una o más sustituciones disminuyeron la respuesta a menos de 10% de la respuesta a WT. La sustitución I493A, R494A, N495A, G496A, L498A, L499A, R500A, V501A o Y502A, reduce la respuesta a los linfocitos T por 70% o más, en comparación con la respuesta a WT en al menos tres de seis muestras. La Tabla 5 muestra el por ciento de respuesta de la respuesta obtenida con el péptido WT.

EJEMPLO 10 Este ejemplo demuestra que las SEQ ID NOs : 38, 39, 44, 45, 81, 82, 86-88, 97, 98, 105-108 y 123-125, contienen epitopos de los linfocitos T.

Se realizaron selecciones finas de todas las agrupaciones positivas para 50 donadores, para determinar las regiones inmunodominantes . Para cada donador, el número de SFC se totalizó, y cada parte relativa del péptido del número total de SFC, se calculó y normalizó de acuerdo con la fórmula (I) siguiente, en donde D representa el donador, y x representa uno de los 50 donadores, P representa el péptido, y representa uno de los péptidos de las SEQ ID NOs: 31-141, y Sy representa el número de SFC para el péptido y: El valor normalizado representa el nivel de inmunogenicidad de cada péptido, y la cuenta de estos valores relativos para 50 donadores se muestra en la Figura 9. La Figura 9 muestra que los siguientes péptidos contienen epitopos de los linfocitos T: SEQ ID NOs : 38, 39, 44, 45, 81, 82, 86, 87, 88, 97, 98, 105, 106, 107, 108, 123, 124 y 125.

Los péptidos más inmunogénicos en el dominio III, se seleccionaron basándose en el conjunto de datos expuesto en la Figura 9. Los péptidos, el número de donadores y los pacientes que respondieron al péptido, y las secuencias comunes a los péptidos se exponen en la Tabla 6. Los pacientes en la Tabla 6 se trataron previamente con PE38, y la respuesta mostrada en la Tabla 6 es una respuesta de memoria. En la Tabla 6, una respuesta se define como 5% de las SFC del donador o el paciente que responde al péptido.

TABLA 6 # de AgrupaNúmero de Número de Secuencia Secuencia Común Epitopo ción donadores pacientes que que respondieron respondieron al péptido al péptido (n=50) (n=12) 5 1 15 3 6 RGRIRNGALLRVYVP (SEQ ID NO: 105) IRNGALLRVYVP 16 5 5 IRNGALLRVYVPRSS (SEQ ID NO: 106) (SEQ ID NO: 190) 4 6 GALLRVYVPRSSLPG (SEQ ID NO: 107) LRVYVPRSSLPG 5 7 LRVYVPRSSLPGFYR (SEQ ID NO: 108) (SEQ ID NO: 191) 2 14 4 5 RGFYIAGDPALAYG (SEQ ID NO: 97) FYIAGDPALAYG 5 3 FYIAGDPALAYGYAQ (SEQ ID NO: 98) (SEQ ID NO: 192) 3 11 4 4 TVERLLQAHRQLEER (SEQ ID NO: 81) RLLQAHRQLEER 3 4 RLLQAHRQLEERGYV (SEC ID NO 2) (SEQ ID NO: 193) 10 4 19 1 0 EEGGRLETILGW GPEEEGGRLETILGW (SEQ ID NO: 123) ? t (SEQ ID NO: 194) EEGGRLETILGWPLA (SEQ ID NO: 124) 2 4 GRLETILGWPLA GRLETILGWPLAERT (SEQ ID NO: 125) (SEQ ID NO: 195) 5 12 4 4 FVGYHGTFLEAA ¿ r GYVFVGYHGTFLEAA (SEQ ID NO: 86) (SEQ ID NO: 196) FVGYHGTFLEAAQSI (SEQ ID NO: 87) 3 3 YHGTFLEAAQSI YHGTFLEAAQSIVFG (SEQ ID NO: 88) (SEQ ID NO: 197) 15 EJEMPLO 11 Este ejemplo demuestra que las sustituciones R421A, L422A, L423A, A425G, R427A, L429A, Y470A, I471A, A472G, P475A, A476G, L477A, I493A, N495A, R494A, L498A, L499A, R500A, V501A, Y502A, V503A, R505A, L508A o P509A definidas con referencia a la SEQ ID NO: 1, reducen la inmunogenicidad de la PE.

La SEQ ID NO: 106 corresponde a las posiciones de los residuos de aminoácidos 493-507 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 107 corresponde a las posiciones de los residuos de aminoácidos 496-510 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 97 corresponde a las posiciones de los residuos de aminoácidos 466-480 de la SEQ ID NO: 1, y la SEQ ID NO: 81 corresponde a las posiciones de los residuos de aminoácidos 418-432 de la SEQ ID NO: 1. Cada aminoácido en la SEQ ID NO: 106 y la SEQ ID NO: 107 se sustituyó con alanina. Las muestras de los donadores y los pacientes se estimularon con LMB9 durante 17 días, y se probaron utilizando el ELISpot con IL-2 como se describió en el Ejemplo 3. La Tabla 7 (SEQ ID NO: 106), la Tabla 8 (SEQ ID NO: 107), Tabla 9 (SEQ ID NO: 97) y la Tabla 10 (SEQ ID NO: 81) , resumen los datos (% de la respuesta al péptido del tipo silvestre ( T) ) de la selección de las muestras contra los péptidos sustituidos.

TABLA 7 (SEQ ID NO: 106) Como se muestra en la Tabla 7, la sustitución I493A, R494A, N495A, L498A, L499A, R500A Y502A, V501A o Y502A, reduce la respuesta de los linfocitos T por 70% o más, en comparación con la respuesta al péptido WT.

TABLA 8 (SEQ ID NO: 107) Como se muestra en la Tabla 8, la sustitución L498A, L499A, R500A, V501A, Y502A, V503A, R505A, L508A o P509A, reduce la respuesta de los linfocitos T por 70% o más, en comparación con la respuesta al péptido WT.

TABLA 9 (SEQ ID NO: 97) 15 Como se muestra en la Tabla 9, la sustitución Y470A, I471A, A472G, P475A, A476G o L477A, reduce la respuesta de los linfocitos T por 70% o más, en comparación con la respuesta al péptido WT.

TABLA 10 (SEQ ID NO: 81) Como se muestra en la Tabla 10, la sustitución R421A, L422A L423A, A425G, R427A o L429A, reduce la respuesta de los linfocitos T por 70% o más, en comparación con la respuesta al péptido WT.

EJEMPLO 12 Este ejemplo demuestra que las sustituciones Y439A, H440A, F443A, L444A, A446G, A447A, I450A, R551A, L552A, T554A, I555A, L556A o W558A, definidas con referencia a la SEQ ID NO: 1, reducen la inmunogenicidad de la PE.

Un péptido de 18 meros (GPEEEGGRLETILGWPLA) (SEQ ID NO:198), se sintetizó para incluir los residuos de aminoácidos de ambas de las SEQ ID NOs: 123 y 124. Un péptido de 18 meros (FVGYHGTFLEAAQSIVFG) (SEQ ID NO: 199), se sintetizó para incluir residuos de aminoácidos de ambas de las SEQ ID NOs : 87 y 88. La SEQ ID NO: 198 corresponde a las posiciones de los residuos de aminoácidos 544-561 de la SEQ ID NO: 1, y la SEQ ID NO: 199 corresponde a las posiciones del residuo de aminoácidos 436-453 de la SEQ ID NO: 1. Cada aminoácido en la SEQ ID NO: 198 y 199 se sustituyó con alanina. Las muestras de los donadores y pacientes se estimularon con LMB9 durante 17 días, y se probaron utilizando ELISpot con IL-2, como se describió en el Ejemplo 3. La Tabla 11 (SEQ ID NO: 198) y la Tabla 12 (SEQ ID NO: 199) , resumen los datos (% de la respuesta al péptido de tipo silvestre (WT) ) de la selección de las muestras contra los péptidos sustituidos.

TABLA 11 Como se muestra en la Tabla 11, la sustitución R551A, L552A, T554A, I555A, L556A y W558A, reduce la respuesta de los linfocitos T por 70% o más, en comparación con la respuesta al péptido WT.

TABLA 12 Como se muestra en la Tabla 12, la sustitución Y439A, H440A, F443A, L444A, A446G, A447A, o I450A, reduce la respuesta de los linfocitos T por 70% o más, en comparación con la respuesta al péptido WT.

EJEMPLO 13 Este ejemplo demuestra la identificación de los epitopos de los linfocitos T en la PE.

Basándose en los resultados obtenidos en los Ejemplos 4-12, las secuencias de aminoácidos expuestas en la Tabla 13, se identificaron como epitopos de los linfocitos T de la PE.

TABLA 13 EJEMPLOS 14-16 Los siguientes materiales y métodos se utilizaron para los Ejemplos 14-16: Recolección , Almacenamiento y Aislamiento del ARN de la Muestra de Sangre Completa del Paciente: Las muestras de sangre se obtuvieron de 6 pacientes que se trataron con las inmunotoxinas recombinantes (RIT) . Se recolectaron muestras de 2.5 mi de sangre en tubos PAXGENE que contienen un detergente catiónico y sales aditivas (PreAnalytiX GmbH, Hombrechtikon, Suiza) , se mezclaron completamente invirtiendo el tubo suavemente 4-6 veces, y se incubaron a temperatura ambiente 10 horas, y a continuación se almacenaron a -80 °C. El ARN intracelular de las muestras de la sangre completa del paciente se purificó utilizando el Equipo para ARN en Sangre PAXGENE (PreAnalytiX) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se almacenó a -80 °C.

Síntesis del ADNc de Cadena Pesada y Cadena Ligera, amplificación con PCR y montaje de los genes ScFv. Un sitio de la enzima de restricción o un enlazante del vector se conectó (Tabla 15) a algunos cebadores. Los repertorios de cadena pesada y los repertorios de cadena ligera se prepararon de manera separada y se conectaron con un enlazante para proporcionar la formación ScFv. Los repertorios de cadena pesada se prepararon de la IgG que tiene linfocitos B maduros. La síntesis del ADNc de primera hebra se realizó utilizando un equipo para la síntesis del ADNc de primera hebra (GE Healthcare, NJ) , con un cebador de región constante de la IgG: HuIgGl-4CHlF0R (Tabla 15) . Los repertorios de cadena ligera se prepararon de los genes VK, utilizando un cebador de la región constante : HUGKFOR (Tabla 15) . Se agregaron 40 pmoles de los cebadores a 15 µ? de la mezcla de reacción para la síntesis del ADNc.

Los genes VH y VK se amplificaron de manera separada mediante un proceso de tres pasos, utilizando la producción de la síntesis del ADNc de primera hebra. El cebador de la región constante de la IgG: HuIgGl-4CHlFOR y una mezcla equimolar de los cebadores hacia atrás VH humanos apropiados, basados en la familia (Tabla 15) , se utilizaron como la PCR del primer paso para cubrir el gen VH en el ARN intracelular de las muestras de sangre completa del paciente. Un cebador de la región constante ?;: HUGK;F0R y los cebadores hacia atrás VK; humanos apropiados basados en la familia apropiados (Tabla 15) , se utilizaron para el gen VK- La PCR del primer paso, se llevó a cabo utilizando polimerasa de alta fidelidad PHUSION (New England Biolabs, Ipswich, MA) en un volumen final de 50 µ? de la mezcla de reacción con 10 pmoles de cada cebador, de acuerdo con la recomendación del fabricante .

La polimerasa de alta fidelidad PRIMESTAR (Takara, Kyoto, Japón) , se utilizó para la PCR del segundo paso, PCR de Empalme Mediante Extensión de la Superposición (SOE) , y el último paso para insertar la preparación con 10 pmoles de cada cebador de acuerdo con la recomendación del fabricante. La secuencia de 5'-GCC CAG CCG GCC_ATG_GCC-3 ' (SEQ ID NO: 185) , que incluye un sitio Ncol (subrayado) , se conectó a los cebadores hacia atrás VH humanos para los cebadores neo hacia atrás VH humanos (Tabla 15) . El vector pCANTAB se utilizó para la construcción de la biblioteca del fago. La secuencia de 5'-ACC TCC AGA TCC GCC ACC ACC GGA TCC GCC TCC GCC-3' (SEQ ID NO: 186) que incluye un enlazante pCANTAB, se conectó a los cebadores hacia delante JH humanos para los cebadores del enlazante hacia delante JH humano. Los cebadores neo hacia atrás VH humanos y los cebadores del enlazante JH humanos, se utilizaron en la segunda PCR para agregar un sitio Neo I en la parte trasera del gen VH y un enlazante pCANTAB hacia delante en el gen VH.

En el segundo paso para amplificar el gen VK, la secuencia de 5' -GGA TCC GGT GGT GGC GGA TCT GGA GGT GGC GGA AGC-3' (SEQ ID NO: 187), que incluye un enlazante pCANTAB, se conectó a los cebadores hacia atrás VK humanos para los cebadores del enlazante hacia atrás VK; humanos. La secuencia de 5'-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC-3' (SEQ ID NO: 184), que incluye un sitio Notl (subrayado doble) , se conectó a los cebadores hacia delante JK humanos para los cebadores Not hacia delante JK humanos. Los cebadores hacia atrás VK humanos y los cebadores hacia delante JK humanos se utilizaron en la segunda PCR para agregar un sitio Not I hacia delante y un enlazante pCANTAB en la parte trasera del gen V .

Los genes VH y VK; se prepararon en este tercer paso de manera separada utilizando (a) el par de cebadores de los cebadores Neo hacia atrás VH humanos y un cebador del enlazante pCA TAB del enlazante R' (Tabla 15) para el gen VH/ y (b) el par de cebadores de los cebadores not hacia delante JK humanos, y un cebador del enlazante pCANTAB del enlazante F' (Tabla 15) para el gen VK.

Los cebadores del enlazante R' y el enlazante F' que se utilizaron en el tercer paso, son cebadores complementarios. Los genes VH y VK se combinaron para proporcionar una formación ScFv utilizando- SOE-PCR. Finalmente, el fragmento de la biblioteca ScFv se amplificó utilizando los cebadores de VHIgGFOR y VLREV (Tabla 15) para la preparación del inserto.

Construcción de la Biblioteca del Fago: El fragmento ScFv amplificado se digirió con Ncol y Notl, y se subclonó en pCANTAB 5E, digerido con las mismas enzimas para construir la biblioteca de ScFv utilizando la ligasa T4. La solución de ligadura se purificó mediante extracción con una columna giratoria QIAQUICK (Qiagen, Valencia, CA) , y se resuspendió en agua. La concentración resultante fue de aproximadamente 50 ng/ml. Muestras de 4 µ? se electroforaron en 50 µ? de células electrocompetentes TG1 (Lucigen, WI) , utilizando un pulsador de genes y una unidad de controlador del pulso (Bio-Rad Laboratories) , y se repitió 6 veces para una biblioteca de tamaño grande . Las células se incubaron en 6 mi de SOC (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 1 hora a 37 °C con agitación a aproximadamente 250 rpm. Se recolectó una muestra de 20 µ?, se diluyó y se empacó en una placa con ampicilina TYE para calcular el tamaño de la biblioteca. Se agregó medio 2YT en una cantidad de 6 mi con 200 g/ml de ampicilina y glucosa al 4%, y se incubó otra hora. El medio se aforó a 200 mi con medio 2YT con 100 mg/ml de ampicilina y glucosa al 2%. Las células se cultivaron a OD60o = 0.4 y se infectaron con 1011 pfu del fago auxiliar M13K07 (New England Biolaboratories) con agitación a 250 rpm durante 30 minutos después de reposar 30 minutos. Las células se recolectaron durante 5 minutos a 5,000 rpm en un rotor GSA y se resuspendieron en medio 2YT en una cantidad de 100 mi con 100 g/ml de ampicilina y 50 pg/ml de kanamicina durante la noche a 30°C con agitación a 250 rpm.

Los fagos se precipitaron del sobrenadante con 1/5 del volumen de PEG/NaCl (polietilenglicol 6000 al 20%, NaCl 2.5 M) , y se resuspendieron con medio 2YT. El título de la biblioteca del fago se resuspendió haciendo diluciones en serie de 10 µ? del fago, y agregando 90 µ? de las células TG1, OD600 = 0.4 , emplacadas en agar LB suplementado con 100 g/ml de Amp y glucosa al 1%. El número de colonias se determinó después del crecimiento durante la noche, y se calculó el título.

Análisis de la Biblioteca del Fago: Se utilizó LMB-9 (B3 (dsFv) -PE38 , específica para un antígeno de LewisY) como un antígeno para el análisis de la biblioteca del fago. LMB9 se biotiniló utilizando sulfo-NHS-Biotina EZ-Link (Thermo Scientific, Rockford, IL) a una relación molar de 50:1, y el número de grupos biotina en cada LMB9-biotina se determinó utilizando el equipo de cuantificación de la biotina (Thermo Scientific, Rockford, IL) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 350 mi del fago y perlas magnéticas modificadas con estreptavidina (perlas DYNABEADS MYONE Streptavidin TI, diámetro de 1 µ??, capacidad de unión de la Ig biotinilada 40-50 g mg_1, hidrofóbicas , activadas con tosilo (Invitrogen) ) , se prebloquearon en BSA/PBST al 3% (tween-20 al 0.1%) . El fago se aplicó para deseleccionar con las perlas.

Se utilizó un soporte magnético para separar las perlas de la fase líquida haciendo que las perlas se inmovilicen a lo largo del lado del tubo. El amortiguador de bloqueo se eliminó, y las perlas se resuspendieron en la solución del fago y se incubaron a temperatura ambiente en un rotor durante 30 minutos. La solución del fago se paso a otro tubo con perlas prebloqueadas para la reselección adicional. La deselección se repitió con 1 mg de perlas dos veces y 2 mg de perlas una vez . El fago se pasó a un tubo prebloqueado, y el antígeno de LMB9-biotina biotinilado se agregó para permitir que se formaran los complejos de fago-antígeno-biotina con L B9-biotina en una cantidad de 10 pg para la primera ronda y 5 pg para las rondas subsiguientes. La solución de reacción se incubó a temperatura ambiente en el rotor durante 2 horas, y se retiró a un tubo con 2 mg de perlas para una incubación adicional de 45 minutos en el rotor. El sobrenadante se eliminó, y las perlas se lavaron 12 veces utilizando PBST. El fago se liberó de las perlas mediante la adición de HC1 0.1 M frío en una cantidad de 1 µ?, y el pH se neutralizó con 200 µ? de una solución de Tris-HC1 (pH 8.0). Este es el resultado del análisis, y se rescató para las rondas de análisis adicionales, y se calculó el título. El fago resultante en una cantidad de 0.6 µ?, se utilizó para infectar 5 mi de TG1 (OD600 = 0.4) para el rescate.

ELISA del Fago y Secuenciamiento de la Clona del Fago:. Después de tres o cuatro rondas de análisis y rescate del fago, 198 clonas únicas de la ronda final del análisis, se seleccionaron para un análisis adicional. Una clona de la señal se retiró a una placa de 96 pozos con fondo redondo con 150 µ? de medio 2YT (100 g/ml de ampicilina, glucosa al 2%) durante 4 horas a 37 °C con agitación a 250 rpm, y se agregaron 108 pfu del fago auxiliar M13K07 en 50 µ? de medio 2YT (100 g/ml de ampicilina, glucosa al 2%) , al pozo con agitación a 250 rpm durante 30 minutos después de reposar 30 minutos. Las células se recolectaron mediante 2700 rpm durante 10 minutos con insertos para las placas de 96 pozos, y se resuspendieron en medio 2YT en una cantidad de 200 µ? con 100 g/ml de ampicilina y 50 µ/ml de kanamicina durante la noche a 30°C con agitación a 250 rpm. La pelotilla se resuspendió con 100 µ? de medio 2YT con 100 µg/ml de ampicilina, glucosa al 2%, y glicerol al 30%, y se almacenó a -80°C para la reserva. Los fagos se precipitaron del sobrenadante para la ELISA del fago con 2700 rpm durante 10 minutos. Una placa NUNC MAXISORP de fondo plano de 96 pozos (Nunc USA, Rochester, NY) , se recubrió con LMB9 (5 µg/ml en PBS) durante la noche a 4°C. La placa se lavó y bloqueó con leche descremada al 2% (señalización de la célula) . El sobrenadante con el fago (50 µ?) y leche al 2% (50 µ?) , se agregaron e incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con PBST, y se agregó anti-M13 conjugado con peroxidasa (1:1000, GE Healthcare, aukesha, WI) durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con Solución Salina Amortiguada con Fosfato y Tween 20 (PBST), y se agregó el sustrato de 3, 3 ',5, 5'- tetrametilbencidina (TMB) (Thermo Scientific, Rockford, IL) durante 15 minutos. Los resultados se leyeron en un espectrofotómetro a 450 nm para determinar las clonas positivas y negativas. La clona positiva se recolectó para el aislamiento del fago a pequeña escala del pozo apropiado de la placa de la reserva, y el secuenciamiento se realizó utilizando el Equipo de Secuenciamiento en Ciclos BIGDYE Terminator vi .1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Las clonas con la misma secuencia se retiraron, y las secuencias resultantes se alinearon con IMGT/V-Quest (www.imgt.org/lMGT_vquest/vquest) .

ICC-ELISA de Competencia: El fago-anticuerpo se hizo con el método mencionado anteriormente con un cultivo a • escala de 20 mi. La dilución del fago-anticuerpo se determinó con ELISA. El anticuerpo SS1P, 50 µ?/????, 1 g/ml en leche descremada al 2%, se agregó a las placas de ELISA recubiertas durante la noche a 4°C con rFc-mesotelina en una cantidad de 50 µ?/???? a una concentración de 4 pg/ml en PBS. La placa se lavó 3 veces con PBST; el fago-anticuerpo con varias diluciones se agregó y se detectó utilizando sustrato anti-M13 conjugado con HRP y TMB. La dilución del fago- anticuerpo se determinó mediante una curva de dilución, y la A450 deseada se ajustó a aproximadamente 1.0. Se realizó un ensayo de ICC-ELISA de competencia para determinar el epitopo que se une al fago-anticuerpo del antígeno de PE38 utilizando el suero del paciente, PE38 sin Fv, o la mutación de la señal en PE38. El fago-anticuerpo se mezcló con diluciones en serie del mutante único durante la noche a 4°C, y se agregó a la placa de ELISA con la combinación de SSlP-rFc-Mesotelina. La competencia del mutante único para la unión del fago-anticuerpo a SS1P, se determinó midiendo la unión restante del fago-anticuerpo utilizando anti-M13 conjugado con HRP. El efecto de la competencia se normalizó a la unión a HA22-LR en la cual PE38 carecía de una sustitución.

Antigenicidad del suero: La unión de HA22 o HA22 sustituida a los anticuerpos en el suero humano se analizó en un ensayo de desplazamiento. El suero humano se obtuvo bajo el protocolo 10C0066. Se agregó mesotelina-rFc a la placa de ELISA (100 ng en 50 µ? de PBS/pozo) y se incubó durante la noche a 4°C. Después del lavado, se agregó antimesotelina/SSIP (100 ng en 50 µ? de amortiguador de bloqueo/pozo) durante 1 hora para capturar los anticuerpos anti-PE38 humanos no unidos. En tubos separados, el suero (diluciones de 97 a 30658 veces) , se mezcló con 2 g/ml de HA22 o HA22 sustituida, y se incubó durante la noche a 4°C.

Después de lavar la placa, 50 µ? de las mezclas de inmunotoxina-anticuerpo se transfirieron a cada pozo. Los anticuerpos humanos no unidos a HA22 o HA22 sustituida, se capturaron mediante SS1P y se detectaron mediante Fe de IgG antihumana de conejo conjugada con HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) , seguida por el equipo del sustrato TMB (Thermo Scientific Inc., Waltham, MA) . Las curvas de unión se ajustaron utilizando un modelo de curva logística con cuatro parámetros mediante SoftMaxPro 4.0 (Molecular Devices). Los valores de IC50 indican la concentración de RIT que inhibe 50% de la reactividad del anticuerpo con SS1P.

Estadísticas : Se utilizó el método no paramétrico de Mann-Whitney; p < 0.05 se consideró estadísticamente significativo.

EJEMPLO 14 Este ejemplo demuestra el aislamiento y secuenciamiento de ScFv humano específico para PE38.

Las muestras de sangre se obtuvieron de 6 pacientes que se trataron con diferentes inmunotoxinas recombinantes (RIT) que contienen PE38 (Tabla 14) . El ARN se aisló de las muestras de sangre utilizando los Equipos para ARN en Sangre PAXGENE (PreAnalytiX GmbH, Hombrechtikon, Suiza) . El ADNc de primera hebra se sintetizó del ARN utilizando los cebadores con la región constante apropiada (Tabla 15) . Las bandas únicas de tamaño correcto para el ADNc VH y VK se obtuvieron utilizando el ADN de primera hebra como la plantilla. Los fragmentos VH y VL se amplificaron de manera individual en tres pasos. El sitio de la enzima de restricción y el enlazante se agregaron al fragmento. 100 ng de los fragmentos VH y VL se combinaron en una Reacción en Cadena de la Polimerasa de Empalme mediante Extensión de la Superposición (SOE-PCR) para la formación de scFv. El fragmento scFv se digirió con Neo I y Not I, y se subclonó en pCANTAB 5E, digerido con las mismas enzimas para construir una biblioteca de scFv.

TABLA 14 TABLA 15 SEQ ID Síntesis del ADNc de la primera hebra NO: Cebador de la región constante de cadena pesada humana 146 HuIgGl-4CHlFOR 5' GTC CAC CTT GGT GTT GCT GGG CTT 3' Cebador de la región constante x; humana 147 HUGKFOR 5' AGA CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT 3' PCR del primer paso Cebadores hacia atrás VH humanos 148 HuVHlaBACK 5' CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG 3' 149 HuVH2aBACK 5' CAG GTC AAC TTA AGG GAG TCT GG 3 ' 150 HuVH3aBACK 5' GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG 3' 151 HuVH4aBACK 5' CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GG 3 ' 152 HuVH5aBACK 5' GAG GTG CAG CTG TTG CAG TCT GC 3 ' 153 HuVH6aBACK 5' CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG 3 ' Cebadores hacia atrás ??? humanos 154 HUVK; 1aBACK 5' GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CC 3' 155 HUVK, 2aBACK 5' GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CC 3' 156 HUVK 3aBACK 5' GAA ATT GTG TTG ACG CAG TCT CC 3' 157 HUVK; 4aBACK 5' GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT CC 3 ' 158 HUVK 5aBACK 5' GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT CC 3 ' 159 HUVK 6aBACK 5' GAA ATT GTG CTG ACT CAG TCT CC 3 ' La inmunotoxina LMB-9 biotinilada (B3-Fv-PE38) se utilizó como el antígeno para la selección del fago que expresa a Fvs que se une a PE38. Cada molécula de LMB-9 contenía 6 biotinas. Se obtuvieron 6 bibliotecas del anticuerpo humano mediante electroporaciones en TG1 de Escherichia coli (E. coli.) que contienen 7.3 x 107 - 1.27 x 108 clonas de scFv VH-VL (Tabla 15) . La biblioteca del fago se rescató mediante superinfección con el fago auxiliar (Tabla 15) , y 350 mi de cada biblioteca obtuvieron aproximadamente 7 x 1012 fragmentos scFv representados en la superficie del fago. 710 clonas del fago que contienen Fv se obtuvieron y secuenciaron. El secuenciamiento reveló que hay 103 secuencias únicas de cadena pesada humanas y de cadena ligera kappa humanas presentes, excepto por 2 clonas que tenían la misma secuencia de cadena ligera. Para mostrar que los Fv se derivaban de los linfocitos B haciendo anticuerpos anti-inmunotoxina, se realizaron estudios de competencia, y mostraron que el antisuero inmune bloqueó la unión del fago a la porción de PE38 de LMB-9, y ninguna de las clonas se unió a la porción Fv de la inmunotoxina . La fuerza de la unión se midió entonces utilizando un ICC-ELISA. 47 clonas tenían una unión débil y no se estudiaron adicionalmente . Las otras 56 clonas se utilizaron para determinar los epitopos específicos para el humano en PE38.

EJEMPLO 15 Este ejemplo demuestra la ubicación de los epitopos de los linfocitos B humanos .

LMB-9 contiene ambos dominios II y III de la PE. Para identificar el fago que sólo se une al dominio III, se midió la unión de cada clona a HA22-LR, que sólo tenía el dominio III y carece del dominio II. Quince de las 56 clonas del fago no pudieron unirse a HA22-LR, indicando que los epitopos reconocidos por estas 15 clonas del fago se localizaban en el dominio II. Las 41 clonas del fago restantes se utilizaron para identificar los residuos que constituyen los epitopos de los linfocitos B en el dominio III, midiendo su unión a las proteínas sustituidas, en las cuales los aminoácidos individuales en la superficie del dominio III de la proteína, se cambiaron de un aminoácido voluminoso grande a alanina o glicina. Estas sustituciones eliminaron las cadenas laterales voluminosas grandes que están implicadas en el reconocimiento y unión del anticuerpo. Los datos se muestran en la Figura 10, en donde las clonas con unión deficiente (<10%) se muestran en células negras y las proteínas sustituidas con reactividad normal se muestran con células blancas. Los resultados muestran que una sola sustitución disminuye la unión de muchas clonas, indicando por lo tanto, que están en el mismo grupo del epitopo.

La ubicación de los residuos que cuando se sustituyen, reducen la unión por >90% a varios epitopos, se muestran en la Tabla 16. Los aminoácidos asociados con cada epitopo humano (Hl, H2, H3 , H4 , H5 y H6) y de ratón (2c, 4a, 4b, 5, 6a, 6b y 7) se muestran en la Tabla 16. El epitopo humano Hl contenía a D403, R427 y E431. R427 y E431 pertenecían al epitopo de ratón 4a, y estos residuos estaban involucrados en la unión al anticuerpo de ratón y de humano. El epitopo humano H2 contenía los residuos R467 y D463, que pertenecían al epitopo de ratón 2c, y E548, que pertenecía al epitopo de ratón 6a. Y481, L516, E522 y R551 fueron epitopos específicos para el humano. El epitopo humano H3 contenía sólo a R458, que pertenecía al epitopo de ratón 4b. El epitopo humano H4 contenía a R432 y R505. R432 pertenecía al epitopo de ratón 4a y R505 era un residuo específico para los humanos. El epitopo humano H5 estaba compuesto de R490 y R576, que pertenecían al epitopo de ratón 5. El epitopo humano H6 incluía a R538. R538 pertenece al epitopo de ratón 2c. D406, R412, R513, L597, Q592 y K590 fueron epitopos específicos del ratón y no estaban involucrados en la unión al epitopo humano.

TABLA 16 Las clonas del fago que reaccionan con el epitopo Hl fueron afectadas por las sustituciones en los residuos D403, R427 y E431. Una sustitución de cualquiera de estos residuos con alanina, afectó en gran medida la unión de muchos fagos que reconocieron el epitopo (Figura 10). Como se esperaba para las sustituciones que constituyen un epitopo, estos residuos estaban espacialmente adyacentes en el dominio III. El epitopo H2 era complejo. Los fagos que reaccionan con el epitopo H2 fueron afectados por las sustituciones en 8 residuos. La sustitución de R467 con alanina destruyó la unió de seis de los ocho fagos que definían al epitopo H2. La sustitución del residuo D463 evitó la unión de cuatro fagos, la sustitución de Y481 evitó la unión de tres fagos, la sustitución de R551 evitó la unión de dos fagos y la sustitución de los residuos D461, L516, E522 o E5 8 evitó la unión de un fago. Estructuralmente , estos residuos residían en un área restringida y formaban una agrupación. El epitopo H3 fue reconocido por 2 fagos que se unen a R458. El epitopo H4 fue reconocido por 11 fagos y la unión se destruyó por una sustitución de R505A. Una sustitución en R432, que estaba cerca de R505, afectó la unión de 1 de los 11 fagos. El epitopo H5 fue reconocido por 4 fagos . La unión a todos los cuatro fue afectada por una sustitución en R490 y una sustitución en R576 afectó la unión de tres de los cuatro fagos. Estos residuos estaban espacialmente adyacentes en el dominio III, aunque estaban separados por 86 aminoácidos en la secuencia. Una sustitución en R538 eliminó la unión de uno de dos fagos. En resumen, la sustitución de los residuos superficiales altamente expuestos con alanina, identificó a los residuos que se unen a los fagos que se unen al dominio III, mostrando que los epitopos se localizaban en distintos sitios en la superficie del dominio III.

EJEMPLO 16 Este ejemplo demuestra la producción de una inmunotoxina recombinante (RIT) poco antigénica para humanos.

La identificación de los residuos individuales que estaban implicados en la unión al antisuero humano se utilizó para diseñar y construir las inmunotoxinas con sustituciones que eliminaron la reactividad con el antisuero humano, pero que retuvieron la actividad citotóxica y que pudieran producirse en cantidades suficientes para ser útiles. En la mayoría de los casos, los residuos se reemplazaron con alanina, debido a que su cadena lateral pequeña reacciona de manera deficiente con los anticuerpos y usualmente no afecta el plegado de la proteína. La serina también se utilizó para evitar especialmente una superficie hidrofóbica.

Basándose en la información en los estudios de trazado del mapa del epitopo, las sustituciones seleccionadas de los diferentes aminoácidos que destruyeron la unión de los Fv humanos al dominio III de HA22-LR se combinaron. Las sustituciones se muestran en la Tabla 17 siguiente. LR05 tenía todas las sustituciones presentes en HA22-LR-8M y 4 nuevas sustituciones, LR06 tenía sólo 2 sustituciones de HA22-LR-8M y 4 nuevas sustituciones y LO10 fue como LR06, pero tenía una sustitución de 463A adicional (Tabla 17) .

TABLA 17 TABLA 18 Las proteínas sustituidas se expresaron y purificaron. El análisis con gel de SDS mostró que las proteínas sustituidas eran más que 95% homogéneas. Las proteínas purificadas se analizaron entonces para la actividad citotóxica en varias líneas de células positivas CD22 y para la antigenicidad, en términos de su capacidad par unirse a los anticuerpos presentes en el suero de pacientes que habían creado anticuerpos neutralizantes para las inmunotoxinas que contienen PE38. Se analizaron 25 sueros de los pacientes que habían recibido varias inmunotoxinas diferentes (LMB-9, SS1P y HA22) .

Los datos en la Tabla 19 muestran que todas las 3 nuevas inmunotoxinas fueron activas en las líneas de linfoma positivas CD22, con una IC50 de alrededor de 1 ng/ml, pero menos activas que HA22-LR. La más activa fue HA22-LO10, que era 60% tan activa como HA22-LR en células Daudi, 27% tan activa en células R j i y 29% tan activas en células CA46. Estas nuevas inmunotoxinas fuero específicas de CD22 y no tenían actividad en las células A431 que no expresaban a CD22 (Tabla 19) .

TABLA 19 La antigenicidad se define como la unión de los inraunogenos a los anticuerpos preexistentes. Para valorar la antigenicidad de HA22-LO sustituida con el suero del paciente humano, se llevaron experimentos de competencia, en los cuales se midió la concentración de cada una de las inmunotoxinas sustituidas que redujeron el nivel de los anticuerpos que reaccionan con HA22 por 50%. Los resultados de la competencia típica con dos sueros de pacientes se muestran en las Figuras 11A y 11B. La Figura 11A muestra que la concentración de HA22, HA22-LR, HA22-L05, HA22-L06, HA22-LR-8M y HA22-LO10 a la cual la unión a PE38 se inhibió por 50% (IC50) , era 84.8, 38.1, 4580, 1440, 3610, >396000 nM, respectivamente. La relación de unión (IC50) de HA22 a HA22-LR, HA22-L05, HA22-L06, HA22-LR-8 y HA22-LO10 era 223, 1.85, 5.89, 2.35 y <0.0214 %, respectivamente. La Figura 11B muestra que la concentración de HA22, HA22-LR, HA22-L05, HA22-L06, HA22-LR-8 y HA22-LO10 a la cual la unión a PE38 se inhibió por 50% (IC50) , era 50.9, 67700, >396000, >396000, >396000, >396000 nM, respectivamente. La relación de la unión (IC50) de HA22 a HA22-LR, HA22-L05, HA22-L06, HA22-LR-8M y HA22-LO10 era 0.752, <0.0129, <0.0129, <0.0129 y <0.0129%.

En general, se analizó el suero de 32 pacientes que se trataron durante más de 10 años con PE38 que contiene las inmunotoxinas SS1P, HA22 y LMB9. Las relaciones de la unión utilizando las inmunotoxinas sustituidas se muestran en la Tabla 20. Se encontró que la antigenicidad de HA22-LR-LO10 con el suero humano se reducía sustancialmente en comparación con HA22, HA22-LR y HA22-LR8M. La Figura 12 es una gráfica que muestra el por ciento de unión de los anticuerpos a HA22, HA22-LR-8M, HA22-LRL010 o HA22-LR-LO10R en el suero de los pacientes tratados utilizando PE38. HA22-LR-LO10R es similar a HA22-LO10, excepto que HA22-LR-LO10R carece de la sustitución R458A que está presente en HA22-LO10 (Tablas 17 y 18) . La Figura 12 muestra que veintitrés de treinta y dos pacientes demostraron unión (antigenicidad) que se redujo por más de 100 veces (100 - 10000 veces) . Sólo en cuatro de los treinta y dos pacientes, no pudo detectarse una disminución en la antigenicidad.

TABLA 20 5 15 Todas las referencias, incluyendo las publicaciones, solicitudes de patente y patentes citadas en la presente, se incorporan como referencia en la presente, al mismo grado como si cada referencia se indicara de manera individual y específica como incorporada como referencia y se expusiera en su totalidad en la presente.

El uso de los términos "un, una" y "el, la" y las referencias similares en el contexto de describir la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) , debe interpretarse como que cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otra manera en la presente o se contradiga claramente por el contexto. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" deben interpretarse como términos abiertos (es decir, significan "incluyendo, de manera no exclusiva") a menos que se indique de otra manera. La exposición de los intervalos de valores en la presente, pretende simplemente servir como un método abreviado de referirse de manera individual a cada valor separado que caiga dentro del intervalo, a menos que se indique de otra manera en la presente, y cada valor separado se incorpora en al especificación como si se expusiera de manera individual en la presente. Todos los métodos descritos en la presente pueden realizarse en cualquier orden adecuado, a menos que se indique de otra manera en la presente o se contradiga claramente de otra manera por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o el lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado en la presente, pretende simplemente iluminar mejor la invención y no plantea una limitación al alcance de la invención, a menos que se reclame de otra manera. Ningún lenguaje en la especificación deberá interpretarse como que indica cualquier elemento no reclamado, como esencial para la práctica de la invención.

Las modalidades preferidas de esta invención se describen en la presente, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Las variantes de esas modalidades preferidas pueden volverse evidentes para aquellos con experiencia ordinaria en la técnica, tras la lectura de la descripción anterior. Los inventores esperan que los expertos empleen tales variantes conforme sea apropiado, y los inventores pretenden que la invención sea practicada de otra manera que la descrita de manera específica en la presente. En consecuencia, esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia objeto expuesta en las reivindicaciones anexas, como permitidas por la ley aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas las posibles variantes de los mismos, está abarcada por la invención, a menos que se indique de otra manera en la presente o se contradiga claramente de otra manera por el contexto.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una exotoxina A de Pseudomonas (PE) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302, con la condición de que cuando la secuencia de aminoácidos comprende una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R302, se sustituye al menos uno de los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298 y L299, en donde los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302 se definen con referencia a la SEQ ID NO: 1, opcionalmente con una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1 y/o una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos T dentro de los residuos de aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1.

2. La PE de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302 es una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina en lugar del uno o más de los residuos de aminoácidos L294, L297, Y298, L299 y R302.

3. La PE de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque comprende X1VAX2X3X4AAX5LSW (SEQ ID NO: 2) , en donde Xi, X2 y X4 son de manera independiente leucina, alanina, glicina, serina o glutamina; X3 es tirosina, alanina, glicina, serina o glutamina; y X5 es arginina, alanina, glicina, serina o glutamina; con la condición de que la PE no comprenda a LVALYLAARLSW (SEQ ID NO : 3) y que cuando X5 es alanina, al menos uno de ??, X2, X3 y X4 es alanina, glicina, serina o glutamina .

4. La PE de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la PE tiene una sustitución de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1.

5. La PE de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque la PE tiene una sustitución de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1, y la sustitución de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1 es una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina en lugar del uno o más de los residuos de aminoácidos E282, E285, P290, R313, N314, P319, D324, E327, E331, Q332, D403, D406, R412, R427, E431, R432, R458, D461, D463, R467, Y481, R490, R505, R513, L516, E522, R538, E548, R551, R576, K590, Q592 y L597, en donde los residuos de aminoácidos E282, E285, P290, R313, N314, P319, D324 , E327, E331, Q332, D403, D406, R412, R427, E431, R432, R458, D461, D463, R467, Y481, R490, R505, R513, L516, E522, R538, E548, R551, R576, K590, Q592 y L597 se definen con referencia a la SEQ ID NO: 1.

6. La PE de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la sustitución de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1 es una sustitución de alanina, glicina o serina en lugar de uno o más residuos de aminoácidos D406, R432, R467, R490, R513, E548, K590 y Q592.

7. La PE de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la sustitución adicional de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B es una sustitución de manera independiente de, alanina, glicina o serina en lugar de uno o más residuos de aminoácidos R427, R458, D463, R467, R490, R505 y R538.

8. La PE de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la PE tiene una sustitución de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1 y la sustitución de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1 es una sustitución de valina, leucina o isoleucina en lugar del residuo de aminoácidos R490, en donde el residuo de aminoácidos R490 se define con referencia a la SEQ ID NO: 1.

9. La PE de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque la PE tiene una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos T de la SEQ ID NO: 1 y la sustitución de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos T de la SEQ ID NO: 1 es una sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, Y470, 1471, A472, P475, A476, L477, 1493, R494, N495, L498, L499, R500, V501, Y502, V503, R505, L508, P509, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558.

10. La PE de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la sustitución de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1 es : (a) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos D406 ; (k>) una sustitución de glicina por el residuo de aminoácidos R432; (c) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R467; (d) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R490 ; (e) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R513; (f) una sustitución de serina por el residuo de aminoácidos E548; (g) una sustitución de serina por el residuo de aminoácidos K590; y (h) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos Q592.

11. Una exotoxina A de Pseudomonas (PE) que comprende una secuencia de aminoácidos de PE que tiene una sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos D463, Y481 y L516 como se definió con referencia a la SEQ ID NO: 1, con la condición de que cuando el residuo de aminoácidos en la posición 516 se sustituye con alanina, también se sustituye al menos uno de los residuos de aminoácidos D463 y Y481, en donde la PE tiene opcionalmente una sustitución adicional de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B, y/o una sustitución adicional de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos T, y/o una supresión de uno o más residuos de aminoácidos continuos de los residuos 1-273 y 285-394 como se definió por la SEQ ID NO: 1.

12. La PE de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la PE tiene la sustitución adicional de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B, y la sustitución adicional de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B es una sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos E282, E285, P290, R313, N314, P319, D324, E327, E331, Q332, D403, D406, R412, R427, E431, R432, R458, D461, R467, R490, R505, R513, E522, R538, E548, R551, R576, K590, Q592 y L597, como se definió con referencia a la SEQ ID NO: 1.

13. La PE de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos D463, Y481 y L516 es una sustitución de manera independiente de alanina, glicina, serina o glutamina en lugar del uno o más de los residuos de aminoácidos D463, Y481 y L516.

14. La PE de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, caracterizada porque la sustitución adicional de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B es una sustitución de manera independiente de alanina, glicina o serina en lugar de uno o más residuos de aminoácidos R427, R458, R467, R490, R505 y R538.

15. La PE de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la sustitución de uno o más de los residuos de aminoácidos D463, Y481 y L516 es una sustitución de alanina en lugar del residuo de aminoácidos D463, y la sustitución adicional de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B es: (a) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R427; (b) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R458; (c) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R467; (d) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R490; (e) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R505; y (f) una sustitución de alanina por el residuo de aminoácidos R538, como se definió con referencia a la SEQ ID NO: 1.

16. Una PE que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la Fórmula I: FCS - R - R2P - R3n - dominio funcional III de la PE (Fórmula I) en donde: m, n y p son, de manera independiente, 0 ó 1; FCS comprende una secuencia de residuos de aminoácidos de escisión con furina, secuencia la cual es escindible por la furina; R1 comprende 1 o más residuos de aminoácidos continuos de los residuos 285-293 de la SEQ ID NO: 1; R2 comprende XiVAXzXsX-iAAXsLSW (SEQ ID NO: 2) , en donde Xi, X2 y X4 son de manera independiente leucina, alanina, glicina, serina o glutamina; X3 es tirosina, alanina, glicina, serina o glutamina; y X5 es arginina, alanina, glicina, serina o glutamina; con la condición de que la PE no comprenda a LVALYLAARLSW (SEQ ID NO: 3) y que cuando X5 es alanina, al menos uno de Xi, X2, X3 y X4 es alanina, glicina, serina o glutamina; R3 comprende 1 o más residuos de aminoácidos continuos de los residuos 306-394 de la SEQ ID NO: 1; y el dominio funcional III de la PE comprende los residuos 395-613 de la SEQ ID NO: 1, opcionalmente con una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1 y/o una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro de uno o más epitopos de los linfocitos T dentro de los residuos de aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1.

17. La PE de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la FCS comprende los residuos 274-284 de la SEQ ID NO: 1, en donde la sustitución opcional de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1 es una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina por el residuo de aminoácidos E282 de la SEQ ID NO: 1.

18. La PE de conformidad con la reivindicación 16 ó 17, caracterizada porque m es l y R1 comprende los residuos 285-293 de la SEQ ID NO: 1, en donde la sustitución opcional de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1 es una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina por el residuo de aminoácidos E285 y/o P290 de la SEQ ID NO: 1.

19. La PE de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-18, caracterizada porque n es 1 y R3 comprende los residuos 306-394 de la SEQ ID NO: 1, en donde la sustitución opcional de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1 es una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina por uno o más de los residuos de aminoácidos R313, N314, P319, D324, E327, E331 y Q332 de la SEQ ID NO: 1.

20. La PE de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-19, caracterizada porque el dominio funcional III de la PE comprende los residuos 395-613 de la SEQ ID NO: 1, en donde la sustitución opcional de un aminoácido dentro de uno o más epitopos de los linfocitos B de la SEQ ID NO: 1 es una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina por uno o más de los residuos de aminoácidos D403, D406, R412, R427, E431, R432, R458, D461, D463, R467, Y481, R490, R505, R513, L516, E522, R538, E548, R551, R576," K590, Q592 y L597 de la SEQ ID NO: 1 y/o una sustitución de valina, leucina o isoleucina en lugar del residuo de aminoácidos R490, en donde el residuo de aminoácidos R490 se define con referencia a la SEQ ID NO: 1.

21. La PE de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16, 17 y 20, caracterizada porque m, n y/o p son 0.

22. Una PE que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1; con la condición de que cuando el residuo de aminoácidos en la posición Q485 o L516 se sustituye con alanina, se sustituye al menos un residuo de aminoácidos adicional en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y 558 de la SEQ ID NO: 1, y cuando el residuo de aminoácidos en la posición R427, R467, R490, R505, R513 o R551 se sustituye con alanina, glicina, serina o glutamina, o cuando el residuo de aminoácidos en la posición R490 se sustituye con valina, leucina o isoleucina, se sustituye al menos un residuo de aminoácidos adicional en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 de la SEQ ID NO: 1, que no incluye una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina para un residuo de aminoácidos en la posición R427, R467, R490, R505, R513 o R551, o una sustitución de valina, leucina o isoleucina por un residuo de aminoácidos en la posición R490, en donde los residuos de aminoácidos R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444 , A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554, 1555, L556 y W558 se definen con referencia a la SEQ ID NO: 1.

23. La PE de conformidad con la reivindicación 1 ó 22, caracterizada porque la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en las posiciones R421, L422, L423, A425, R427, L429, Y439, H440, F443, L444, A446, A447, 1450, 463-519, R551, L552, T554 , 1555, L556 y 558 de la SEQ ID NO: 1 es una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina en lugar del uno o más de los residuos de aminoácidos 1493, R494, N495, G496, L498, L499, R500, V501 y Y502.

24. Una molécula quimérica que comprende (a) una porción seleccionada conjugada o fusionada a (b) la PE de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23.

25. La molécula quimérica de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la porción seleccionada es un anticuerpo monocional.

26. La molécula quimérica de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el anticuerpo monoclonal se une de manera específica a un marcador de la superficie celular seleccionado del grupo que consiste de CD19, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD79b, receptor de la transferrina, receptor de EGF, mesotelina, cadherina y Lewis Y.

27. La molécula quimérica de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la porción seleccionada es un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de B3, RFB4, SS, SS1, MN, MB, HN1, HN2 , HB21, MORAb-009, HA22 y porciones que se unen al antígeno del mismo.

28. La molécula quimérica de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la porción seleccionada es la porción que se une al antígeno de HA22.

29. Un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la PE de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-22 o la molécula quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-28.

30. Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 29.

31. Una célula hospedera, que comprende el vector de expresión recombinante de conformidad con la reivindicación 30.

32. Una población de células que comprende al menos una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 31.

33. Una composición farmacéutica que comprende (a) la PE de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-22, la molécula quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-28, el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 29, el vector de expresión recombinante de conformidad con la reivindicación 30, la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 31, o la población de células de conformidad con la reivindicación 32, y (b) un portador farmacéuticamente aceptable.

34. El uso de la PE de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23, la molécula quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-28, el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 29, el vector de expresión recombinante de conformidad con la reivindicación 30, la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 31, o la población de células de conformidad con la reivindicación 32, o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 33, en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir el cáncer en un a mamífero .

35. Un método para inhibir el crecimiento de una célula objetivo, método el cual comprende poner en contacto la célula con la PE de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23, la molécula quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-28, el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 29, el vector de expresión recombinante de conformidad con la reivindicación 30, la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 31, o la población de células de conformidad con la reivindicación 32, o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 33, en una cantidad efectiva para inhibir el crecimiento de la célula objetivo.

36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la célula objetivo es una célula cancerosa .

37. El método de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, caracterizado porque la célula objetivo expresa un marcador de la superficie celular seleccionado del grupo que consiste de CD19, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD79b, receptor de la transíerrina, receptor de EGF, mesotelina, cadherina y Lewis Y.

38. Un método para producir la PE de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23, que comprende (a) expresar de manera recombinante la PE y (b) purificar la PE.

39. Un método para producir la molécula quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-28, que comprende (a) expresar de manera recombinante la molécula quimérica y (b) purificar la molécula quimérica.

40. El método para producir la molécula quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-28, que comprende (a) expresar de manera recombinante la PE de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23, (b) purificar la PE y (c) enlazar de manera covalente una porción seleccionada a la PE purificada.