JP6734227B2 - 抗ｃｄ２７６抗体（ｂ７ｈ３） - Google Patents

抗ｃｄ２７６抗体（ｂ７ｈ３） Download PDF

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Description

関連出願への相互参照
この特許出願は、２０１４年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／０５１，６５０号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願と同時に提出され、２０１５年９月１６日付の「７２１４８２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられ、１つの３６，２８６ Ｂｙｔｅ ＡＳＣＩＩ （Ｔｅｘｔ）ファイルとして特定された、コンピューターで読取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
がんは公衆衛生上の問題である。化学療法のような治療の進歩にも関わらず、固形腫瘍を含めて多くのがんに対する予後は不良であることがある。約５５９，６５０人のアメリカ人ががんのために死亡していると見積もられており、これは１日当たり１，５００人が死亡していることになる（Ｊｅｍａｌら、ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．、５７巻：４３〜６６頁（２００７年））。したがって、がん、特に固形腫瘍のための別の治療に対して満たされていない要求がある。
Ｊｅｍａｌら、ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．（２００７年）５７巻：４３〜６６頁
本発明のある実施形態は、（ｉ）配列番号１〜６、（ｉｉ）配列番号１１〜１６、または（ｉｉｉ）配列番号２０〜２５を含むポリペプチドを提供する。
本発明の別の実施形態は、（ｉ）配列番号１〜３、（ｉｉ）配列番号１１〜１３、または（ｉｉｉ）配列番号２０〜２２を含む第１のポリペプチド鎖および（ｉ）配列番号４〜６、（ｉｉ）配列番号１４〜１６、または（ｉｉｉ）配列番号２３〜２５を含む第２のポリペプチド鎖を含むタンパク質を提供する。
本発明の別の実施形態は、

（式中、
ｎは、偶数の整数であり、
Ａは、配列番号２６および２７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２７６結合性部分である）
を含むコンジュゲートを提供する。
本発明のさらなる実施形態は、本発明のポリペプチドおよびタンパク質に関する関連の抗ＣＤ２７６結合性部分、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、コンジュゲート、キット、および医薬組成物を提供する。
本発明の追加の実施形態は、哺乳動物において（ａ）がんもしくは（ｂ）腫瘍血管系の存在を検出する方法、および哺乳動物においてがんを治療もしくは予防し、または（ｂ）腫瘍血管系を低減する方法を提供する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
（ｉ）配列番号１〜６、（ｉｉ）配列番号１１〜１６、または（ｉｉｉ）配列番号２０〜２５を含むポリペプチド。
（項目２）
（ｉ）配列番号７および８、（ｉｉ）配列番号１７および１８、または（ｉｉｉ）配列番号２６および２７を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
（ｉ）配列番号１〜３、（ｉｉ）配列番号１１〜１３、または（ｉｉｉ）配列番号２０〜２２を含む第１のポリペプチド鎖および（ｉ）配列番号４〜６、（ｉｉ）配列番号１４〜１６、または（ｉｉｉ）配列番号２３〜２５を含む第２のポリペプチド鎖を含むタンパク質。
（項目４）
配列番号７、１７、または２６を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８、１８、または２７を含む第２のポリペプチド鎖を含む、項目３に記載のタンパク質。
（項目５）
リンカーをさらに含む、項目１もしくは２に記載のポリペプチドまたは項目３もしくは４に記載のタンパク質。
（項目６）
前記リンカーが配列番号９または１０を含む、項目５に記載のポリペプチドまたはタンパク質。
（項目７）
項目１から２および５から６のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは項目３から６のいずれか一項に記載のタンパク質を含む抗ＣＤ２７６結合性部分であって、前記抗ＣＤ２７６結合性部分は、抗体、Ｆａｂ断片（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ’） ２ 断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、またはジスルフィドで安定化された可変領域断片（ｄｓＦｖ）である、抗ＣＤ２７６結合性部分。
（項目８）
（ｂ）エフェクター分子にコンジュゲートされている、（ａ）項目１から２および５から６のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目３から６のいずれか一項に記載のタンパク質、または項目７に記載の抗ＣＤ２７６結合性部分を含む、コンジュゲート。
（項目９）
前記エフェクター分子がピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体である、項目８に記載のコンジュゲート。
（項目１０）
前記エフェクター分子が、薬物、毒素、標識、小分子、または抗体である、項目８に記載のコンジュゲート。
（項目１１）
前記エフェクター分子がモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、項目８に記載のコンジュゲート。
（項目１２）
以下：

を含む、項目８に記載のコンジュゲートであって、式中、
ｎは、偶数の整数であり、
Ａは、配列番号２６および２７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２７６結合性部分である、コンジュゲート。
（項目１３）
（ａ）が次世代部位特異的コンジュゲーションにより（ｂ）にコンジュゲートされている、項目８から１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
（項目１４）
項目１から２および５から６のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目３から６のいずれか一項に記載のタンパク質、項目７に記載の抗ＣＤ２７６結合性部分、または項目８に記載のコンジュゲートをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
（項目１５）
（ｉ）配列番号５３および５４、（ｉｉ）配列番号５５および５６、または（ｉｉｉ）配列番号５７および５８を含むヌクレオチド配列を含む、項目１４に記載の核酸。
（項目１６）
項目１４または１５に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
（項目１７）
項目１６に記載の組換え発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
（項目１８）
項目１７に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団。
（項目１９）
項目１から２および５から６のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目３から６のいずれか一項に記載のタンパク質、項目７に記載の抗ＣＤ２７６結合性部分、項目８から１３のいずれか一項に記載のコンジュゲート、項目１４または１５に記載の核酸、項目１６に記載の組換え発現ベクター、項目１７に記載の単離された宿主細胞、または項目１８に記載の細胞の集団、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
（項目２０）
（ａ）がんを治療もしくは予防するかまたは（ｂ）腫瘍血管系を低減するためのキットであって、前記キットは、項目１から２および５から６のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目３から６のいずれか一項に記載のタンパク質、項目７に記載の抗ＣＤ２７６結合性部分、項目８から１３のいずれか一項に記載のコンジュゲート、項目１４または１５に記載の核酸、項目１６に記載の組換え発現ベクター、項目１７に記載の単離された宿主細胞、項目１８に記載の細胞の集団、または項目１９に記載の医薬組成物を含む、キット。
（項目２１）
前記キットが、以下：

を含むコンジュゲートを含み、式中、
ｎは、偶数の整数であり、
Ａは、配列番号２６および２７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２７６結合性部分である、項目２０に記載のキット。
（項目２２）
哺乳動物において（ａ）がんまたは（ｂ）腫瘍血管系の存在を検出する方法であって、前記方法は、以下：
（ａ）前記哺乳動物に由来する１つまたは複数の細胞を含む試料を、項目１から２および５から６のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目３から６のいずれか一項に記載のタンパク質、項目７に記載の抗ＣＤ２７６結合性部分、項目８から１３のいずれか一項に記載のコンジュゲート、項目１４または１５に記載の核酸、項目１６に記載の組換え発現ベクター、項目１７に記載の単離された宿主細胞、項目１８に記載の細胞の集団、または項目１９に記載の医薬組成物と接触させることにより、複合体を形成するステップ、および
（ｂ）前記複合体を検出するステップ
を含み、前記複合体の検出が前記哺乳動物における（ａ）がんまたは（ｂ）腫瘍血管系の存在を示す、方法。
（項目２３）
哺乳動物において（ａ）がんを治療もしくは予防するかまたは（ｂ）腫瘍血管系を低減するのに使用するための、項目１から２および５から６のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目３から６のいずれか一項に記載のタンパク質、項目７に記載の抗ＣＤ２７６結合性部分、項目８から１３のいずれか一項に記載のコンジュゲート、項目１４または１５に記載の核酸、項目１６に記載の組換え発現ベクター、項目１７に記載の単離された宿主細胞、項目１８に記載の細胞の集団、または項目１８に記載の医薬組成物。
図１Ａは、以下の通り、示されている希釈度でヒトＣＤ２７６と共にインキュベートされた（１）クローンｍ８５２（配列番号７を含む重鎖および配列番号８を含む軽鎖を含む）（四角）、（２）ｍ８５７（配列番号１７を含む重鎖および配列番号１８を含む軽鎖を含む）（「×」）、および（３）ｍ８５２４（ｍ２７６）（配列番号２６を含む重鎖および配列番号２７を含む軽鎖を含む）（丸）のような重鎖および軽鎖アミノ酸配列を含むｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質に対するＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて測定された４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）読み取りを示すグラフである。図１Ｂは、以下の通り、示されている希釈度でマウスＣＤ２７６と共にインキュベートされた（１）クローンｍ８５２（配列番号７を含む重鎖および配列番号８を含む軽鎖を含む）（灰色の四角）、（２）ｍ８５７（配列番号１７を含む重鎖および配列番号１８を含む軽鎖を含む）（黒い四角）、および（３）ｍ８５２４（ｍ２７６）（配列番号２６を含む重鎖および配列番号２７を含む軽鎖を含む）（丸）のような重鎖および軽鎖アミノ酸配列を含むｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質に対するＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて測定された４５０ｎｍでのＯＤ読み取りを示すグラフである。
図２は、表面プラズモン共鳴によりＫＤ＝４．９×１０−１１Ｍで測定された、クローンｍ８５２４（ｍ２７６）（配列番号２６を含む重鎖および配列番号２７を含む軽鎖を含む）のヒトＣＤ２７６に対する結合親和性（応答、（ＲＵ））を経時的に（秒、（ｓ））示すグラフである。この図は、生のデータに対応する線およびフィッティングを行ってＫＤを計算したときにソフトウェアにより作成された線の両方がほとんど同じであることを示している。
図３は、ＨＣＴ１１６ヒト結腸細胞の接種後様々な時点（日）で野生型（ＷＴ）（ひし形）およびＣＤ２７６ノックアウト（ＫＯ）（四角）マウスにおいて測定された腫瘍の体積（ｍｍ３）を示すグラフである。
図４は、フローサイトメトリーにより測定されたカウント数を示すグラフであり、形質導入されてない（ＣＨＯ）またはマウスＣＤ２７６（ＣＨＯ−ｍｓＣＤ２７６）もしくはヒトＣＤ２７６（ＣＨＯ−ｈｕＣＤ２７６）を発現するように形質導入されたチャイニーズハムスター卵巣細胞に対する抗ＣＤ２７６ ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ｍ８５２４）（配列番号２６および２７）の結合のレベルを示している。
図５は、フローサイトメトリーにより測定されたカウント数を示すグラフであり、形質導入されてない（２９３）（陰影をつけたピーク）かまたはヒトＣＤ２７６（２９３／ＣＤ２７６）（陰影をつけてないピーク）を発現するように形質導入されたヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞に対するＦＩＴＣ標識されたヒト抗ＣＤ２７６抗体ｍ８５２４ ＩｇＧ１の結合のレベルを示している。
図６Ａおよび６Ｂは、ラミニン（図６Ａ）またはＦＩＴＣ標識されたヒト抗ＣＤ２７６抗体（ｍ８５２４）（図６Ｂ）で染色されたＭＣ３８結腸がん腫瘍担持マウスの正常肝臓／腫瘍辺縁の試料の写真画像である。Ｎ＝正常肝臓、Ｔ＝腫瘍。
図７は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）（白いひし形）、ｍ２７６（ｍ８５２４）（白三角）、ｍ８２５（無関係の対照抗体）−抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）（白丸）またはｍ８５２４−ＡＤＣ（白四角）で処理された２９３細胞ならびに様々な濃度（ｎＭ）のＭＭＡＥおよびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはＡＤＣのＭＭＡＥ（黒いひし形）、ｍ８５２４（黒三角）、ｍ８２５−ＡＤＣ（黒丸）またはｍ８５２４−ＡＤＣ（黒四角）で処理された、ＣＤ２７６（２９３／ＣＤ２７６）で形質導入された２９３細胞の細胞生存率（対照に対する％）を示すグラフである。
図８および９は、対照（ビヒクル）（ひし形）、ｍ８５２４（Ｍ２７６）単独（３０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ））（丸）または様々な投与量（１ｍｐｋ（四角）、３ｍｐｋ（三角）、１０ｍｐｋ（×）または３０ｍｐｋ（＊））のｍ８５２４（ｍ２７６）−ＭＭＡＥ ＡＤＣで治療されたＨＣＴ−１１６腫瘍担持マウスにおける投与から約１５日後まで（図８）および約７５日後まで（図９）の様々な時点（日）での腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフである。図８では、組成物は１、４、７、および１１日目に投与した。
図８および９は、対照（ビヒクル）（ひし形）、ｍ８５２４（Ｍ２７６）単独（３０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ））（丸）または様々な投与量（１ｍｐｋ（四角）、３ｍｐｋ（三角）、１０ｍｐｋ（×）または３０ｍｐｋ（＊））のｍ８５２４（ｍ２７６）−ＭＭＡＥ ＡＤＣで治療されたＨＣＴ−１１６腫瘍担持マウスにおける投与から約１５日後まで（図８）および約７５日後まで（図９）の様々な時点（日）での腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフである。図８では、組成物は１、４、７、および１１日目に投与した。
図１０および１１は、対照（ビヒクル）（ひし形）、ｍ８５２４（Ｍ２７６）単独（１０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ））（＊）、または様々な投与量（１ｍｐｋ（四角）、３ｍｐｋ（三角）、または１０ｍｐｋ（×）のｍ８５２４（ｍ２７６）−ＭＭＡＥ ＡＤＣで治療された腫瘍担持マウスにおける投与後の様々な時点（日）でのＨＴ−２９（図１０）またはＫＭ１２（図１１）の腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフである。 図１０および１１は、対照（ビヒクル）（ひし形）、ｍ８５２４（Ｍ２７６）単独（１０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ））（＊）、または様々な投与量（１ｍｐｋ（四角）、３ｍｐｋ（三角）、または１０ｍｐｋ（×）のｍ８５２４（ｍ２７６）−ＭＭＡＥ ＡＤＣで治療された腫瘍担持マウスにおける投与後の様々な時点（日）でのＨＴ−２９（図１０）またはＫＭ１２（図１１）の腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフである。
図１２は、対照（ビヒクル）（ひし形）、ｍ８５２４（Ｍ２７６）単独（１０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ））（＊）、ＭＭＡＥ単独（０．２ｍｐｋ）（丸）、または様々な投与量（１ｍｐｋ（四角）、３ｍｐｋ（三角）、または１０ｍｐｋ（×）のｍ８５２４（ｍ２７６）−ＭＭＡＥ ＡＤＣで治療されたＯＶＣＡＲ３腫瘍担持マウスにおける投与後の様々な時点（日）での腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフである。図１２では、組成物は１、４、８、および１１日目に投与した。
図１３は、様々な濃度（ｎＭ）のｍ８５２４−ＭＭＡＥ ＡＤＣで処理されたＨＣＴ１１６（ひし形）、ＨＴ２９（白丸）、ＫＭ１２（四角）およびＯＶＣＡＲ３（黒丸）がん細胞株の細胞生存率（対照に対する％）を示すグラフである。
図１４は、対照（ビヒクル）（四角）またはｍ８５２４（ｍ２７６）−ＰＢＤ ＡＤＣ（三角）で治療されたＭＣ３８腫瘍担持マウスにおけるＭＣ３８細胞接種後の様々な時点（日）での腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフである。
図１５は、対照（ビヒクル）（ひし形）、ｍ８５２４（Ｍ２７６）単独（１０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ））（＊）、ＭＭＡＥ単独（０．２ｍｐｋ）（丸）、または様々な投与量（１ｍｐｋ（四角）、３ｍｐｋ（三角）、または１０ｍｐｋ（×）のｍ８５２４（ｍ２７６）−ＭＭＡＥ ＡＤＣで治療されたＯＶＣＡＲ３腫瘍担持マウスにおける投与後の様々な時点（日）での腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフである。
図１６は、対照（ビヒクル）（ひし形）、ｍ８５２４（Ｍ２７６）単独（１０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ））（＊）、または１ｍｐｋ（四角）もしくは１０ｍｐｋ（×）の投与量のｍ８５２４ （ｍ２７６）−ＭＭＡＥ ＡＤＣで治療されたＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍担持マウスにおける投与後の様々な時点（日）での腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフである。
本発明のある実施形態は、抗ＣＤ２７６抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドおよびタンパク質を提供する。これらのポリペプチドおよびタンパク質は、有利なことにＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３としても公知である）を特異的に認識し、それに高い親和性で結合する。これらのポリペプチドおよびタンパク質は、有利なことに可溶性のＣＤ２７６を特異的に認識しそれに結合し、また細胞表面に発現されたＣＤ２７６を特異的に認識しそれに結合する。ＣＤ２７６は小児固形腫瘍および成人癌を含めて多様なヒト腫瘍で発現または過剰に発現する。ＣＤ２７６を発現または過剰に発現するがんの例としては、限定されることはないが、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、ならびに前立腺、卵巣、結腸直腸、および肺がんがある。ＣＤ２７６はまた腫瘍血管系でも発現され、腫瘍内皮マーカーである。特定の理論または機序に縛られることはないが、ＣＤ２７６を特異的に認識しそれに結合することによって、本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、有利なことに、ＣＤ２７６を発現するがん細胞および／または腫瘍血管系を標的化することができると考えられる。本発明のある実施形態では、本発明のポリペプチドおよびタンパク質はＣＤ２７６に対する抗原特異的応答を引き出すことができる。したがって、特定の理論または機序に縛られることはないが、ＣＤ２７６を特異的に認識しそれに結合することによって、本発明のタンパク質およびポリペプチドは、以下：ＣＤ２７６を発現するがん細胞および／または腫瘍血管系を検出する、ＣＤ２７６を発現するがん細胞および／または腫瘍血管系を標的化し破壊する、がん細胞および／または腫瘍血管系を低減または排除する、免疫細胞および／またはエフェクター分子の腫瘍部位および／または腫瘍血管系への浸潤を容易にする、および抗がんおよび／または抗腫瘍血管系応答を増進／拡大することの１つまたは複数を提供することができると考えられる。
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」はオリゴペプチドを含み、１つまたは複数のペプチド結合で連結されたアミノ酸の単鎖を指す。ポリペプチドは抗ＣＤ２７６抗体の抗原結合ドメインの１つまたは複数の可変領域（例えば、２つの可変領域）を含み得、各可変領域は相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。好ましくは、第１の可変領域は、配列番号１、１１、または２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１（第１の可変領域のＣＤＲ１）、配列番号２、１２、または２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２（第１の可変領域のＣＤＲ２）、および配列番号３、１３、または２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３（第１の可変領域のＣＤＲ３）を含み、第２の可変領域は、配列番号４、１４、または２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１（第２の可変領域のＣＤＲ１）、配列番号５、１５、または２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２（第２の可変領域のＣＤＲ２）、および配列番号６、１６、または２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３（第２の可変領域のＣＤＲ３）を含む。この点で、本発明のポリペプチドは配列番号１〜３、４〜６、１１〜１３、１４〜１６、２０〜２２、２３〜２５、１〜６、１１〜１６、または２０〜２５を含むことができる。したがって、本発明のある実施形態は、（ｉ）配列番号１〜６、（ｉｉ）配列番号１１〜１６、または（ｉｉｉ）配列番号２０〜２５を含むポリペプチドを提供する。好ましくは、ポリペプチドは配列番号２０〜２５のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、ポリペプチドは各々が抗ＣＤ２７６抗体の抗原結合ドメインの１つまたは複数の可変領域（例えば、第１および第２の可変領域）を含み、各々上記のようにＣＤＲを含む。第１の可変領域は配列番号７、１７、または２６を含み得る。第２の可変領域は配列番号８、１８、または２７を含み得る。したがって、本発明のある実施形態では、ポリペプチドは配列番号７、配列番号８、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２６、配列番号２７、配列番号７および８、配列番号１７および１８、または配列番号２６および２７を含む。好ましくは、ポリペプチドは配列番号２６および２７を含む。本発明のある実施形態では、第１の可変領域は抗ＣＤ２７６抗体の重鎖であり、第２の可変領域は抗ＣＤ２７６抗体の軽鎖である。
本発明のある実施形態では、ポリペプチドの可変領域はリンカーによって接合することができる。リンカーは任意の適切なアミノ酸配列を含み得る。本発明のある実施形態では、リンカーは配列番号９または１０を含み得る。
ある実施形態では、ポリペプチドはリーダー配列を含む。リーダー配列は軽鎖可変領域のアミノ末端に位置し得る。リーダー配列は任意の適切なリーダー配列を含み得る。ある実施形態では、リーダー配列はヒト顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体配列である。リーダー配列は、例えば、配列番号３９、４０、または４１を含み得る。本発明のある実施形態では、リーダー配列は細胞の表面でのポリペプチドの発現を容易にし得るが、発現されたポリペプチド内のリーダー配列の存在はポリペプチドが機能するために必要なわけではない。本発明のある実施形態では、細胞表面でのポリペプチドの発現の際、リーダー配列はポリペプチドから開裂され得る。したがって、本発明のある実施形態では、ポリペプチドはリーダー配列を欠く。
本発明は、さらに、本明細書に記載されているポリペプチドの少なくとも１つを含むタンパク質を提供する。「タンパク質」とは、１つまたは複数のポリペプチド鎖を含む分子を意味する。
本発明のタンパク質は、（ｉ）配列番号１〜３、（ｉｉ）配列番号１１〜１３、または（ｉｉｉ）配列番号２０〜２２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および（ｉ）配列番号４〜６、（ｉｉ）配列番号１４〜１６、または（ｉｉｉ）配列番号２３〜２５を含む第２のポリペプチド鎖を含むことができる。本発明のタンパク質は、例えば、配列番号７、１７、または２６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８、１８、または２７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含むことができる。この点で、タンパク質は、配列番号７、１７、または２６を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８、１８、または２７を含む第２のポリペプチド鎖を含み得る。
タンパク質は、さらに、本発明の他の態様に関連して本明細書に記載されているリーダー配列および／またはリンカーを含んでいてもよい。ある実施形態では、タンパク質はリーダー配列を欠く。
本発明のタンパク質は、例えば、融合タンパク質であってもよい。例えば、タンパク質が（ｉ）配列番号７、１７、または２６および（ｉｉ）配列番号８、１８、または２７を含む単一のポリペプチド鎖を含む場合、またはタンパク質の第１および／または第２のポリペプチド鎖がさらに他のアミノ酸配列、例えば、免疫グロブリンまたはその一部分をコードするアミノ酸配列を含む場合、本発明のタンパク質は融合タンパク質であってもよい。この点で、本発明はまた、本明細書に記載されている本発明のポリペプチドの少なくとも１つを少なくとも１つの他のポリペプチドと共に含む融合タンパク質も提供する。この他のポリペプチドは融合タンパク質の別個のポリペプチドとして存在することができるか、または本明細書に記載されている本発明のポリペプチドの１つとインフレームで（タンデムで）発現されるポリペプチドとして存在することができる。この他のポリペプチドは、限定されることはないが、免疫グロブリン、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＭＨＣ分子、ＣＤ１分子、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄなどの任意のペプチド性もしくはタンパク質性分子、またはその一部分をコードすることができる。
融合タンパク質は、本発明のポリペプチドの１コピーまたは複数コピーおよび／または他のポリペプチドの１コピーまたは複数コピーを含むことができる。例えば、融合タンパク質は本発明のポリペプチドおよび／または他のポリペプチドの１、２、３、４、５コピー、またはそれ超を含むことができる。融合タンパク質を作製するための適切な方法は当技術分野で公知であり、例えば組換え法がある。例えば、Ｃｈｏｉら、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１巻：１９３〜２０２頁（２００５年）参照。
本発明のポリペプチドおよびタンパク質は抗ＣＤ２７６結合性部分として有用であり得ることが企図される。この点で、本発明のある実施形態は、本明細書に記載されているポリペプチドまたはタンパク質のいずれかを含む抗ＣＤ２７６結合性部分を提供する。本発明のある実施形態では、抗ＣＤ２７６結合性部分は本明細書に記載されているポリペプチドまたはタンパク質のいずれかの抗原結合性の一部分を含む。抗原結合性の一部分は少なくとも１つの抗原結合性部位を有する任意の一部分であってもよい。ある実施形態では、抗ＣＤ２７６結合性部分は抗体、Ｆａｂ断片（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、またはジスルフィドで安定化された可変領域断片（ｄｓＦｖ）である。
ある実施形態では、抗ＣＤ２７６結合性部分は抗体である。抗体は、例えば、本明細書に記載されている本発明のポリペプチドの少なくとも１つを含む組換え抗体であってもよい。本明細書で使用される場合、「組換え抗体」とは、本発明のポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つおよびある抗体の１つまたは複数のポリペプチド鎖、またはその一部分を含む組換え（例えば、遺伝子操作された）タンパク質を指す。抗体のポリペプチド、またはその一部分は、例えば、重鎖もしくは軽鎖の定常領域、または抗体のＦｃ断片などであってもよい。抗体のポリペプチド鎖、またはその一部分は、組換え抗体の別個のポリペプチドとして存在することができる。あるいは、抗体のポリペプチド鎖、またはその一部分は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質とインフレームで（タンデムで）発現されるポリペプチドとして存在することができる。抗体のポリペプチド、またはその一部分は、任意の抗体または任意の抗体断片のポリペプチドであってもよい。
本発明の抗体は、当技術分野で公知のあらゆるタイプの免疫グロブリンであってもよい。例えば、抗ＣＤ２７６結合性部分は任意のアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＭなどであってもよい。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。抗体は天然に存在する抗体、例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなどから単離および／または精製された抗体であってもよい。あるいは、抗体は遺伝子操作された抗体、例えば、ヒト化抗体またはキメラ抗体であってもよい。抗体はモノマー性またはポリマー性の形態であってもよい。また、抗体はＣＤ２７６に対して任意のレベルの親和性またはアビディティを有することができる。
抗体のＣＤ２７６に結合する能力を試験する方法は当技術分野で公知であり、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および競合阻害アッセイのようなあらゆる抗体−抗原結合アッセイが含まれる（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、下記参照、および米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６Ａ１号参照）。
抗体を作製するのに適した方法は当技術分野で公知である。例えば、標準的なハイブリドーマ法は、例えば、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５巻、５１１〜５１９頁（１９７６年）、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ（２０１３年）、ならびにＭｕｒｐｈｙら（編）、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第８版、Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（２０１１年）に記載されている。あるいは、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）−ハイブリドーマ法（ＨａｓｋａｒｄおよびＡｒｃｈｅｒ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、７４巻（２号）、３６１〜６７頁（１９８４年）、ならびにＲｏｄｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１２１巻、１４０〜６７頁（１９８６年））、およびバクテリオファージベクター発現系（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻、１２７５〜８１頁（１９８９年）参照）のような他の方法が当技術分野で公知である。さらに、非ヒト動物で抗体を産生する方法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、および同第５，７１４，３５２号、ならびに米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６Ａ１号に記載されている。
ファージディスプレイはさらに抗体を生成するのに使用することができる。この点で、抗体の抗原結合性可変（Ｖ）ドメインをコードするファージライブラリーは標準的な分子生物学および組換えＤＮＡ技法を使用して生成することができる。例えば、Ｇｒｅｅｎら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２年）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ（２００７年）参照。所望の抗原に対して特異的に結合する所望の特異性を有する可変領域をコードするファージを選択し、選択された可変ドメインを含む完全または部分的な抗体を再構成する。再構成された抗体をコードする核酸配列をハイブリドーマの産生に使用される骨髄腫細胞のような適切な細胞株に導入して、モノクローナル抗体の特徴を有する抗体がその細胞によって分泌されるようにする（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、上記参照、Ｈｕｓｅら、上記参照、および米国特許第６，２６５，１５０号参照）。
抗体は、特異的な重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックであるトランスジェニックマウスにより産生することができる。かかる方法は当技術分野で公知であり、例えば米国特許第５，５４５，８０６号および同第５，５６９，８２５号、ならびにＭｕｒｐｈｙら、上記参照に記載されている。
ヒト化抗体を生成する方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、上記参照、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６１号、欧州特許第０２３９４００Ｂ１号、ならびに英国特許第２１８８６３８号に詳細に記載されている。ヒト化抗体はまた、米国特許第５，６３９，６４１号およびＰｅｄｅｒｓｅｎら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２３５巻、９５９〜９７３頁（１９９４年）に記載されている抗体リサーフェシング（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）技術を使用して生成することもできる。
好ましい実施形態では、抗ＣＤ２７６結合性部分は単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）である。合成ペプチドを介して抗体軽鎖の可変（Ｖ）ドメインに連結された抗体重鎖のＶドメインを含むトランケート型Ｆａｂ断片である単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）抗体断片は、慣用的な組換えＤＮＡ技術技法を使用して生成することができる（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、上記参照）。同様に、ジスルフィドで安定化された可変領域断片（ｄｓＦｖ）を組換えＤＮＡ技術によって製造することができる（例えば、Ｒｅｉｔｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７巻：６９７〜７０４頁（１９９４年）参照）。しかしながら、本発明の抗ＣＤ２７６結合性部分は、これらの代表的なタイプの抗体断片に限定されない。
また、抗ＣＤ２７６結合性部分は、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、および元素粒子（例えば、金粒子）のような検出可能な標識を含むように改変することができる。
本発明の別の実施形態は、（ａ）本明細書に記載されているポリペプチドまたはタンパク質のいずれかを含む抗原結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに連結されたある抗体の抗原結合ドメイン（例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含有する人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。ＣＡＲの特徴には、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用してＴ細胞特異性および反応性を選択された標的に非ＭＨＣ拘束的に向け直す（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）その能力が含まれる。非ＭＨＣ拘束的抗原認識により、ＣＡＲを発現する細胞は、抗原プロセシングとは無関係に抗原を認識する能力が与えられ、したがって腫瘍エスケープの主要な機序を迂回する。また、Ｔ細胞内で発現されたとき、ＣＡＲは有利なことに、内因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファおよびベータ鎖と二量体を形成しない。
本明細書で使用される場合、語句「抗原特異性を有する」および「抗原特異的応答を引き出す」とは、ＣＡＲがある抗原と特異的に結合し免疫学的に認識することができ、ＣＡＲのその抗原への結合が免疫応答を引き出すことを意味する。
本発明のＣＡＲは、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３としても公知である）に対して抗原特異性を有する。特定の理論または機序に縛られることはないが、ＣＤ２７６に対する抗原特異的応答を引き出すことによって、本発明のＣＡＲは、以下：ＣＤ２７６を発現するがん細胞および／または腫瘍血管系を標的化し破壊する、がん細胞および／または腫瘍血管系を低減または排除する、腫瘍部位および／または腫瘍血管系への免疫細胞の浸潤を容易にする、および抗がんおよび抗腫瘍血管系応答を増進／拡大することの１つまたは複数を提供すると考えられる。
本発明のある実施形態は、抗ＣＤ２７６抗体の抗原結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。抗ＣＤ２７６抗体の抗原結合ドメインはＣＤ２７６と特異的に結合する。ＣＡＲの抗原結合ドメインは本明細書に記載されているポリペプチドまたはタンパク質のいずれかを含み得る。本発明のある実施形態では、ＣＡＲは抗ＣＤ２７６単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。この点で、本発明の好ましい実施形態は、本明細書に記載されているポリペプチドまたはタンパク質のいずれかを含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む抗原結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。
本発明の好ましい実施形態では、ＣＡＲは、各々が相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む可変領域を含む重鎖および軽鎖を含む。好ましくは、重鎖は、配列番号１、１１、または２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１（重鎖のＣＤＲ１）、配列番号２、１２、または２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２（重鎖のＣＤＲ２）、および配列番号３、１３、または２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３（重鎖のＣＤＲ３）を含み、軽鎖は、配列番号４、１４、または２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１（軽鎖のＣＤＲ１）、配列番号５、１５、または２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２（軽鎖のＣＤＲ２）、および配列番号６、１６、または２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３（軽鎖のＣＤＲ３）を含む。この点で、本発明のＣＡＲは配列番号１〜３、４〜６、１１〜１３、１４〜１６、２０〜２２、２３〜２５、１〜６、１１〜１６、または２０〜２５を含むことができる。好ましくは、ＣＡＲは配列番号２０〜２５のアミノ酸配列を含む。
ＣＡＲの抗原結合ドメインは各々軽鎖および重鎖を含む。軽鎖は配列番号８、１８、または２７を含み得る。重鎖は配列番号７、１７、または２６を含み得る。したがって、本発明のある実施形態では、抗原結合ドメインは配列番号７、配列番号８、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２６、配列番号２７、配列番号７および８、配列番号１７および１８、または配列番号２６および２７を含む。好ましくは、ＣＡＲは配列番号２６および２７を含む。
ある実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインはリーダー配列を含む。リーダー配列は本発明の他の態様に関連して本明細書に記載されているものでよい。本発明のある実施形態では、ＣＡＲはリーダー配列を欠く。
ある実施形態では、ＣＡＲは免疫グロブリン定常ドメインを含む。好ましくは、免疫グロブリンドメインはヒト免疫グロブリン配列である。ある実施形態では、免疫グロブリン定常ドメインは免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ１）ドメイン配列（ＣＨ２ＣＨ３）を含む。この点で、ＣＡＲは配列番号４５を含む免疫グロブリン定常ドメインを含み得る。特定の理論に縛られることなく、ＣＨ２ＣＨ３ドメインはｓｃＦｖの結合モチーフを、ＣＡＲを発現する細胞の膜から離れて伸長させ、天然のＴＣＲのサイズおよびドメイン構造をより正確に模倣することができると考えられる。一部の実施形態では、ＣＡＲは免疫グロブリン定常ドメインを欠いてもよい。
本発明のある実施形態では、ＣＡＲは膜貫通ドメインを含む。本発明のある実施形態では、膜貫通ドメインはｉ）ＣＤ８および／またはｉｉ）ＣＤ２８を含む。好ましい実施形態では、ＣＤ８およびＣＤ２８はヒトである。ＣＤ８またはＣＤ２８はそれぞれＣＤ８またはＣＤ２８の全体未満を含み得る。この点で、ＣＡＲは、配列番号２９を含むＣＤ８アミノ酸配列、配列番号３０を含むＣＤ２８アミノ酸配列、および配列番号３１を含むＣＤ８アミノ酸配列のいずれか１つまたは複数を含む膜貫通ドメインを含む。
本発明のある実施形態では、ＣＡＲはｉ）ＣＤ２８、ｉｉ）ＣＤ１３７、およびｉｉｉ）ＣＤ３ゼータ（ζ）の１つまたは複数を含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。好ましい実施形態では、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ３ゼータの１つまたは複数はヒトである。ＣＤ２８はＴ細胞共刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）において重要なＴ細胞マーカーである。４−１ＢＢとしても公知であるＣＤ１３７は、強力な共刺激シグナルをＴ細胞に伝達し、分化を促進し、Ｔリンパ球の長期間生存を増進する。ＣＤ３ζはＴＣＲと会合してシグナルを生成し、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ３ゼータの１つまたは複数はそれぞれＣＤ２８、ＣＤ１３７、またはＣＤ３ゼータの全体未満を含み得る。本発明のある実施形態では、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは配列番号３２および／または配列番号３５を含むＣＤ２８アミノ酸配列を含む。本発明の別の実施形態では、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは配列番号３３および／または配列番号３７を含むＣＤ１３７アミノ酸配列を含む。本発明の別の実施形態では、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは配列番号３４、３６、および３８のいずれか１つまたは複数を含むＣＤ３ゼータアミノ酸配列を含む。
本発明のある実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８を含む膜貫通ドメインならびにＣＤ２８およびＣＤ３ゼータを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。この点で、ＣＡＲは配列番号３０、３５、および３６の各々を含み得る。ある実施形態では、ＣＤ２８を含む膜貫通ドメインならびにＣＤ２８およびＣＤ３ゼータを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは配列番号４７を含む。好ましくは、ＣＡＲは、（ａ）配列番号１〜６、４５、３０、３５、および３６の各々；（ｂ）配列番号７、８、４５、３０、３５、および３６の各々；（ｃ）配列番号１１〜１６、４５、３０、３５、および３６の各々；（ｄ）配列番号１７、１８、４５、３０、３５、および３６の各々；（ｅ）配列番号２０〜２５、４５、３０、３５、および３６の各々；または（ｆ）配列番号２６、２７、４５、３０、３５、および３６の各々を含む。
本発明のある実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８を含む膜貫通ドメインならびにＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ３ゼータを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。この点で、ＣＡＲは配列番号２９および３２〜３４の各々を含み得る。ある実施形態では、ＣＤ８を含む膜貫通ドメインならびにＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ３ゼータを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは配列番号４９を含む。好ましくは、ＣＡＲは、（ａ）配列番号１〜６、４５、２９、および３２〜３４の各々；（ｂ）配列番号７、８、４５、２９、および３２〜３４の各々；（ｃ）配列番号１１〜１６、４５、２９、および３２〜３４の各々；（ｄ）配列番号１７、１８、４５、２９、および３２〜３４の各々；（ｅ）配列番号２０〜２５、４５、２９、および３２〜３４の各々；または（ｆ）配列番号２６、２７、４５、２９、および３２〜３４の各々を含む。
本発明のある実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８を含む膜貫通ドメインならびにＣＤ１３７およびＣＤ３ゼータを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。この点で、ＣＡＲは配列番号３１、３７、および３８の各々を含み得る。ある実施形態では、ＣＤ８を含む膜貫通ドメインならびにＣＤ１３７およびＣＤ３ゼータを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは配列番号４８を含む。好ましくは、ＣＡＲは、（ａ）配列番号１〜６、４５、３１、３７、および３８の各々；（ｂ）配列番号７、８、４５、３１、３７、および３８の各々；（ｃ）配列番号１１〜１６、４５、３１、３７、および３８の各々；（ｄ）配列番号１７、１８、４５、３１、３７、および３８の各々；（ｅ）配列番号２０〜２５、４５、３１、３７、および３８の各々；または（ｆ）配列番号２６、２７、４５、３１、３７、および３８の各々の各々を含む。
本明細書に記載されている本発明のポリペプチド、タンパク質、およびＣＡＲの機能性部分が本発明の範囲に包含される。用語「機能性部分」は、ポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲに関して使用されているとき、本発明のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲの任意の一部または断片であって、それが一部となっているポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲ（親ポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲ）の生物学的活性を保持している、一部または断片を指す。機能性部分は、例えば、あるポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲの部分であって、その親ポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲと同様な程度に、同一程度に、またはより高い程度に、標的細胞を認識し、または疾患を検出し、治療し、もしくは予防する能力を保持している部分を包含する。親のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲに対して、機能性部分は親のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲの、例えば、約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％、またはそれ超を含むことができる。
機能性部分は、その部分のアミノもしくはカルボキシ末端、または両末端に、親のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲのアミノ酸配列には見られない追加のアミノ酸を含むことができる。望ましくは、これら追加のアミノ酸は機能性部分の生物学的な機能、例えば、標的細胞を認識する、がんおよび／または腫瘍血管系を検出する、がんを治療または予防する、腫瘍血管系を低減または排除するなどの機能に干渉しない。より望ましくは、追加のアミノ酸は、親のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲの生物学的活性と比較してその生物学的活性を高める。
本明細書に記載されている本発明のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲの機能性変異体が本発明の範囲内に含まれる。用語「機能性変異体」は、本明細書で使用される場合、親のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲに対して実質的または相当の配列同一性または類似性を有するポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲを指し、その機能性変異体は、変異体であるポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲの生物学的活性を保持する。機能性変異体は、例えば、本明細書に記載されているポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲ（親ポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲ）の変異体であって、親のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲと同様な程度に、同一程度に、またはより高い程度に標的細胞を認識する能力を保持する変異体を包含する。親のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲに関して、機能性変異体は親のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲに対してアミノ酸配列が、例えば、少なくとも約３０％、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ超同一であってもよい。
機能性変異体は、例えば、少なくとも１つの保存的なアミノ酸置換を有する親のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲのアミノ酸配列を含むことができる。あるいは、または加えて、機能性変異体は、少なくとも１つの非保存的なアミノ酸置換を有する親のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲのアミノ酸配列を含むことができる。この場合、非保存的なアミノ酸置換が機能性変異体の生物学的活性に干渉したり阻害したりしないことが好ましい。非保存的なアミノ酸置換は、親のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲと比較して機能性変異体の生物学的活性が増大するように機能性変異体の生物学的活性を高めることがある。
本発明のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲのアミノ酸置換は、好ましくは保存的なアミノ酸置換である。保存的なアミノ酸置換は、当技術分野で公知であり、ある特定の物理的および／または化学的特性を有する１つのアミノ酸が、同一または類似の化学的または物理的な特性を有する別のアミノ酸と交換されるアミノ酸置換を含む。例えば、保存的なアミノ酸置換は、酸性の／負に荷電した極性アミノ酸を別の酸性の／負に荷電した極性アミノ酸の代わりに用いること（例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕ）、非極性側鎖を有するアミノ酸を非極性側鎖を有する別のアミノ酸の代わりに用いること（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｖａｌなど）、塩基性の／正に荷電した極性アミノ酸を別の塩基性の／正に荷電した極性のアミノ酸の代わりに用いること（例えば、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇなど）、極性側鎖を有する非荷電アミノ酸を極性側鎖を有する別の非荷電のアミノ酸の代わりに用いること（例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）、ベータ分枝した側鎖を有するアミノ酸をベータ分枝した側鎖を有する別のアミノ酸の代わりに用いること（例えば、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、およびＶａｌ）、芳香族側鎖を有するアミノ酸を芳香族側鎖を有する別のアミノ酸の代わりに用いること（例えば、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒ）などであってもよい。
ポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲは、他の成分、例えば他のアミノ酸がポリペプチド、タンパク質、ＣＡＲ、機能性部分、または機能性変異体の生物学的活性を実質的に変化させないように、本明細書に記載されている特定のアミノ酸配列または配列から本質的になることができる。
本発明の実施形態のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲ（機能性部分および機能性変異体を含む）はいかなる長さであってもよく、すなわち、いかなる数のアミノ酸を含むこともできるが、ただし、ポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲ（またはその機能性部分または機能性変異体）が、その生物学的活性、例えば、抗原と特異的に結合し、哺乳動物において疾患細胞を検出し、または哺乳動物において疾患を治療もしくは予防するなどの能力を保持することを条件とする。例えば、ポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲは５０、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ超の長さのアミノ酸のような約５０〜約５０００のアミノ酸長であってもよい。
本発明の実施形態のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲ（本発明の機能性部分および機能性変異体を含む）は、１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成のアミノ酸を含むことができる。かかる合成のアミノ酸は当技術分野で公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α−アミノｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、トランス−３−およびトランス−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリン β−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リジン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジル−リジン、６−ヒドロキシリジン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロへプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンが含まれる。
本発明の実施形態のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲ（機能性部分および機能性変異体を含む）は、グリコシル化され得るか、アミド化され得るか、カルボキシル化され得るか、リン酸化され得るか、エステル化され得るか、Ｎ−アシル化され得るか、例えばジスルフィド架橋を介して環化され得るか、または酸付加塩に変換され得るか、および／または場合により二量体を形成し得るかもしくは重合体化され得る。
本発明の実施形態のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲ（これらの機能性部分および機能性変異体を含む）は当技術分野で公知の方法によって得ることができる。ポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲはポリペプチドまたはタンパク質を作製するのに適したいかなる方法で作製してもよい。ポリペプチドおよびタンパク質を新たに合成する適切な方法は、Ｃｈａｎら、Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ、２０００年；Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｒｅｉｄ、Ｒ．編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、２０００年；Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ、Ｗｅｓｔｗｏｏｄら編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ、２００１年；および米国特許第５，４４９，７５２号のような文献に記載されている。また、ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書に記載されている核酸を使用して、標準的な組換え方法を使用して組換えで産生することができる。例えば、Ｇｒｅｅｎら、上記、およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記参照。さらに、本発明のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲ（これらの機能性部分および機能性変異体を含む）の一部は、植物、細菌、昆虫、哺乳動物、例えば、ラット、ヒトなどのような供給源から単離および／または精製することができる。単離および精製の方法は当技術分野で周知である。あるいは、本明細書に記載されているポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲ（これらの機能性部分および機能性変異体を含む）は、Ｓｙｎｐｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ）、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、およびＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のような会社により商業的に合成されている。この関係で、本発明のポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲは合成のものであり得るか、組換えのものであり得るか、単離され得るか、および／または精製され得る。
本発明のポリペプチド、タンパク質、ＣＡＲ、抗ＣＤ２７６結合性部分、またはこれらの機能性部分もしくは機能性変異体のいずれかを含むコンジュゲート、例えば、バイオコンジュゲートは本発明の範囲に含まれる。コンジュゲート、ならびに一般にコンジュゲートを合成する方法は当技術分野で公知である（例えば、Ｈｕｄｅｃｚ， Ｆ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９８巻：２０９〜２２３頁（２００５年）およびＫｉｒｉｎら、Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ． ４４巻（１５号）：５４０５〜５４１５頁（２００５年）参照）。この点で、本発明のある実施形態は、本明細書に記載されている（ａ）ポリペプチド、タンパク質、ＣＡＲ、または抗ＣＤ２７６結合性部分のいずれかが（ｂ）エフェクター分子にコンジュゲートされているコンジュゲートを提供する。エフェクター分子は、いかなる治療用分子またはコンジュゲートの検出を容易にする分子であってもよい。エフェクター分子は限定されることはなく、いかなる適切なエフェクター分子であってもよい。例えば、エフェクター分子は、薬物、毒素、標識（例えば、本明細書に記載されている検出可能な標識のいずれか）、小分子、または別の抗体のうちの任意の１つまたは複数であり得る。例えば、毒素は、各々が参照により本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許第４，８９２，８２７号；同第５，５１２，６５８号；同第５，６０２，０９５号；同第５，６０８，０３９号；同第５，８２１，２３８号；同第５，８５４，０４４号；米国特許出願公開第２０１０／０２１５６５６号；および国際公開第２０１２／０４１２３４号に記載されているような、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（「ＰＥ」）または、例えばＰＥ４Ｅ、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ＰＥ２５、ＰＥ３８ＱＱＲ、ＰＥ３８ＫＤＥＬ、ＰＥ−ＬＲ、およびＰＥ３５のいずれかのようなその変異体であってもよい。本発明のコンジュゲートに適し得る薬物の例として、限定されることはないが、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、チューブリン−バインダー、例えば、ドラスタチン１０、モノメチルドラスタチン１０、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｉｎ）Ｅ、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、アウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＦ、ＨＴＩ−２８６、チューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）Ｍ、メイタンシノイドＡＰ−３、クリプトフィシン、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−ＯＨ、チューブリシンＩＭ−１、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ、チューブリシンＩＭ−２、Ｂｏｃ−Ｎｍｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−ＯＨ、チューブリシンＩＭ−３、およびコルヒチンＤＡ；ＤＮＡ−アルキル化剤（デュオカルマイシンアナログ）、例えば、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＣＮ、デュオカルマイシンＤＭＧ、デュオカルマイシンＤＭＡ、デュオカルマイシンＭＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＢ、デュオカルマイシンＧＡ；トマイマイシン（ｔｏｍａｙｍｙｃｉｎ）ＤＭ；ＳＪＧ−１３６；イルジン（ｉｌｌｕｄｉｎ）Ｓ；イロフルベン；アパジクオン；トリプトリド；スタウロスポリン；カンプトテシン；メトトレキサート；ならびにその他の抗がん薬、例えば、キナーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、プロテアソーム阻害剤、およびマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤がある。ある実施形態では、薬物はＭＭＡＥまたはＰＢＤ二量体である。
本明細書に記載されているポリペプチド、タンパク質、ＣＡＲ、または抗ＣＤ２７６結合性部分は、直接または間接的に、例えば連結部分を介して、（ｂ）エフェクター分子にコンジュゲートされていてもよい。連結部分は当技術分野で公知のいかなる適切な連結部分であってもよい。ある実施形態では、連結部分は、コンジュゲートを哺乳動物に投与した際に開裂され得る開裂可能なリンカーである。本発明のコンジュゲートに使用するのに適切であり得る連結部分の例には、限定されることはないが、例えば化学構造（１）および（２）を有する連結部分のようなペプチドプロドラッグ連結部分；例えば化学構造（３）および（４）を有する連結部分のようなジスルフィドプロドラッグ連結部分；例えば化学構造（５）および（６）を有する連結部分のような二官能性の連結部分；例えば化学構造（７）および（８）を有する連結部分のようなチオール反応性の連結部分；例えば化学構造（９）および（１０）を有する連結部分のようなオキシム／アルデヒド連結部分；例えば化学構造（１１）を有する連結部分のようなエチレングリコールをベースとする連結部分、ならびに化学構造（１２）を有する連結部分がある：


本発明の別の実施形態は、

（式中、
ｎは、偶数の整数、好ましくは０〜８の偶数の整数、より好ましくは０〜４の偶数の整数であり（例えば、ｎは２、４、６、または８である）、
Ａは、本発明の他の態様に関連して本明細書に記載されているポリペプチド、タンパク質、または抗ＣＤ２７６結合性部分のいずれか、好ましくは配列番号２６および２７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２７６結合性部分である）
を含むコンジュゲートを提供する。
本発明のある実施形態では、本発明のコンジュゲートの抗ＣＤ２７６ポリペプチド、抗ＣＤ２７６タンパク質、または抗ＣＤ２７６結合性部分は、次世代部位特異的コンジュゲーション技術によってエフェクター分子にコンジュゲートされる。次世代部位特異的コンジュゲーション技術の例としては、限定されることはないが、Ｉｇｅｎｉｃａ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）から利用可能なＳＮＡＰ部位特異的抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）リンカー技術およびＣａｔａｌｅｎｔ Ｐｈａｒｍａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＩＬ）から利用可能なＳＭＡＲＴＡＧ技術がある。
さらに、本発明のある実施形態により、ポリペプチド、タンパク質、ＣＡＲ、抗ＣＤ２７６結合性部分、コンジュゲート、またはこれらの機能性部分もしくは機能性変異体のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。本発明の核酸は本明細書に記載されているリーダー配列、リンカー、抗原結合ドメイン、免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、および／または細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含み得る。例えば、核酸は、リーダーをコードするヌクレオチド配列を含み得、このヌクレオチド配列は配列番号４２、４３、または４４を含む。あるいは、または加えて、核酸は、リンカーをコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよく、このヌクレオチド配列は配列番号５９を含む。あるいは、または加えて、核酸は、免疫グロブリン定常ドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよく、このヌクレオチド配列は配列番号４６を含む。あるいは、または加えて、核酸は、ＣＤ２８を含む膜貫通ドメインならびにＣＤ２８およびＣＤ３ゼータを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよく、このヌクレオチド配列は配列番号５０を含む。あるいは、または加えて、核酸は、ＣＤ８を含む膜貫通ドメインならびにＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ３ゼータを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよく、このヌクレオチド配列は配列番号５２を含む。あるいは、または加えて、核酸は、ＣＤ８を含む膜貫通ドメインならびにＣＤ１３７およびＣＤ３ゼータを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよく、このヌクレオチド配列は配列番号５１を含む。
本発明のある実施形態は、本明細書に記載されているポリペプチド、タンパク質、または抗ＣＤ２７６結合性部分のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。この点で、核酸は、それぞれ（ｉ）配列番号５３および５４、（ｉｉ）配列番号５５および５６、または（ｉｉｉ）配列番号５７および５８の、第１および第２の可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されているＣＡＲのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
「核酸」は、本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸分子」を含み、一般にＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味し、これは、一本鎖または二本鎖で、合成することができ、または天然の供給源から得る（例えば、単離および／または精製する）ことができ、天然、非天然のまたは変更されたヌクレオチドを含有することができ、未改変のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見られるホスホジエステルの代わりにホスホロアミデート結合またはホスホロチオエート結合のような天然、非天然のまたは変更されたヌクレオチド間結合を含有することができる。一部の実施形態では、核酸は挿入、欠失、逆位、および／または置換を全く含まない。しかしながら、一部の場合では、本明細書中で述べるように、核酸が１つまたは複数の挿入、欠失、逆位、および／または置換を含むことが適切なことがある。一部の実施形態では、核酸は、ポリペプチド、タンパク質、またはＣＡＲの機能に影響を及ぼすことがなく、宿主細胞による核酸の発現の際に翻訳されたりされなかったりする追加のアミノ酸配列（例えば、ＡＡＡ）をコードしてもよい。本発明のある実施形態では、核酸は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である。本発明のある実施形態では、核酸はコドン最適化されたヌクレオチド配列を含む。
本発明のある実施形態の核酸は組換えであり得る。本明細書で使用される場合、用語「組換え」は、（ｉ）生細胞内で複製することができる核酸分子に天然または合成の核酸セグメントを接合することにより生細胞の外で構築される分子、または（ｉｉ）上の（ｉ）に記載されているものの複製の結果生じる分子を指す。本発明の目的から、複製はｉｎ ｖｉｔｒｏ複製またはｉｎ ｖｉｖｏ複製であってもよい。
核酸は、他の成分、例えば他のヌクレオチドが、コードされているＣＡＲ、ポリペプチド、タンパク質、抗ＣＤ２７６結合性部分、機能性部分、または機能性変異体の生物学的活性を実質的に変化させないように、本明細書に記載されている１つまたは複数の特定のヌクレオチド配列から本質的になることができる。
組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するか、または他の場合には分離されている配列の２つのセグメントの人工の組合せにより作製される配列を有するものであり得る。この人工の組合せは、化学合成によって、または、より一般的には、例えば、Ｇｒｅｅｎら、上記に記載されているもののような遺伝子工学技法により核酸の単離されたセグメントの人工の操作によって、達成されることが多い。核酸は化学合成および／または当技術分野で公知の手法を使用する酵素的なライゲーション反応に基づいて構築することができる。例えば、Ｇｒｅｅｎら、上記、およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記参照。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増大するかまたはハイブリダイゼーションの際に形成される二重鎖の物理的安定性を増大するように設計された様々に改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換されたヌクレオチド）を用いて化学的に合成することができる。核酸を生成するのに使用することができる改変されたヌクレオチドの例として、限定されることはないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケウオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−置換アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケウオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケウオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンがある。あるいは、本発明の核酸の１つまたは複数がＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ）およびＳｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）などの会社から購入することができる。
核酸は、ポリペプチド、タンパク質、ＣＡＲ、抗ＣＤ２７６結合性部分、コンジュゲート、またはこれらの機能性部分もしくは機能性変異体のいずれかをコードするいかなる単離または精製されたヌクレオチド配列を含むことができる。あるいは、ヌクレオチド配列は、上記配列のいずれかと縮重しているヌクレオチド配列または縮重配列の組合せを含むことができる。
また、本発明のある実施形態は、本明細書に記載されている核酸のいずれかのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列または本明細書に記載されている核酸のいずれかのヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離または精製された核酸も提供する。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る。「高いストリンジェンシー条件」とは、ヌクレオチド配列が、標的配列（本明細書に記載されている核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に対して、非特異的なハイブリダイゼーションと比べて検出可能なほどにより強い量で特異的にハイブリダイズすることを意味する。高いストリンジェンシー条件は、正確な相補的配列を有するポリヌクレオチド、またはヌクレオチド配列とマッチする数個の小さい領域（例えば、３〜１０個の塩基）を偶発的に有するランダムな配列とのミスマッチを散在して数個のみ含有するポリヌクレオチドを識別する条件を含む。かかる相補性の小さい領域は１４〜１７個またはそれ超の塩基の全長相補体より容易に融解し、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、それを容易に識別可能にする。比較的高いストリンジェンシー条件は、例えば、約０．０２〜０．１ＭのＮａＣｌまたは同等物により、約５０〜７０℃の温度で提供されるような低塩および／または高温条件を含む。かかる高いストリンジェンシー条件は、ヌクレオチド配列と鋳型または標的鎖との間のミスマッチを、あるにしてもほとんど許容せず、本発明のポリペプチド、タンパク質、ＣＡＲ、抗ＣＤ２７６結合性部分、コンジュゲート、またはこれらの機能性部分もしくは機能性変異体のいずれかの発現を検出するのに特に適している。一般に、条件は増加する量のホルムアミドの添加によってよりストリンジェントにすることができると理解される。
本発明はまた、本明細書に記載されている核酸のいずれかと少なくとも約７０％またはそれ超、例えば、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
ある実施形態では、本発明の核酸は組換え発現ベクターに組み込むことができる。この点で、本発明のある実施形態は、本発明の核酸のいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。本発明の目的から、用語「組換え発現ベクター」とは、遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド構築物であって、この構築物がｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドが細胞内で発現するのに充分な条件下でベクターが細胞と接触したとき、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現を可能にする構築物を意味する。本発明のベクターは全体として天然に存在しない。しかしながら、ベクターの一部は天然に存在してもよい。本発明の組換え発現ベクターは、限定されることはないがＤＮＡおよびＲＮＡを含めて任意のタイプのヌクレオチドを含むことができ、これは一本鎖または二本鎖で、合成され得るるかまたは部分的に天然供給源から取得され得、天然、非天然のまたは変更されたヌクレオチドを含有することができる。組換え発現ベクターは天然に存在するもしくは天然に存在しないヌクレオチド間結合、または両方のタイプの結合を含むことができる。好ましくは、天然に存在しないまたは変更されたヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合はベクターの転写または複製を妨害しない。
ある実施形態では、本発明の組換え発現ベクターは任意の適切な組換え発現ベクターであってもよく、任意の適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするのに使用することができる。適切なベクターには、増殖および拡大増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）もしくは発現またはその両方のために設計されたもの、例えばプラスミドおよびウイルスがある。ベクターはｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ、ＭＤ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、およびｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）からなる群より選択することができる。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、およびλＮＭ１１４９のようなバクテリオファージベクターも使用することができる。植物の発現ベクターの例には、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）がある。動物の発現ベクターの例には、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭ、およびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）がある。組換え発現ベクターはウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターであってもよい。
いくつかのトランスフェクション技法は当技術分野で一般に公知である（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻：４５６〜４６７頁（１９７３年）；Ｇｒｅｅｎら、上記；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６年）；およびＣｈｕら、Ｇｅｎｅ、１３巻：９７頁（１９８１年）参照。トランスフェクション方法には、リン酸カルシウム共沈（例えば、Ｇｒａｈａｍら、上記参照）、培養細胞への直接微量注入（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ、２２巻：４７９〜４８８頁（１９８０年）参照）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：７４２〜７５１頁（１９８８年）参照）、リポソーム媒介遺伝子導入（例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２〜６９０頁（１９８８年）参照）、脂質媒介形質導入（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８４巻：７４１３〜７４１７頁（１９８７年）参照）、および高速微粒子（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）を使用した核酸送達（例えば、Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３２７巻：７０〜７３頁（１９８７年）参照）。
ある実施形態では、本発明の組換え発現ベクターは例えば、Ｇｒｅｅｎら、上記、およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記に記載されている標準的な組換えＤＮＡ技法を使用して製造することができる。環状または線状の発現ベクターの構築物は、原核生物または真核生物宿主細胞で機能性の複製系を含有するように製造することができる。複製系は、例えば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどに由来することができる。
組換え発現ベクターは、必要に応じて、ベクターがＤＮＡまたはＲＮＡをベースとするかどうかを考慮して、ベクターが導入される宿主細胞のタイプ（例えば、細菌、真菌、植物、または動物）に特異的な転写ならびに翻訳開始および停止コドンのような調節配列を含み得る。組換え発現ベクターはクローニングを容易にするために制限部位を含み得る。
組換え発現ベクターは、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つまたは複数のマーカー遺伝子を含むことができる。マーカー遺伝子としては、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主における補完などがある。本発明の発現ベクターに適したマーカー遺伝子には、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびアンピシリン耐性遺伝子がある。
組換え発現ベクターは、ポリペプチド、タンパク質、ＣＡＲ、抗ＣＤ２７６結合性部分、コンジュゲート、またはこれらの機能性部分もしくは機能性変異体をコードするヌクレオチド配列、または本発明のポリペプチド、タンパク質、ＣＡＲ、抗ＣＤ２７６結合性部分、コンジュゲート、またはこれらの機能性部分もしくは機能性変異体をコードするヌクレオチド配列と相補的であるかまたはハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結した天然または非天然のプロモーターを含むことができる。例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的および発生特異的なプロモーターの選択は当業者の通常の技量の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列をプロモーターと組み合わせることも当業者の通常の技量の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、またはネズミの幹細胞ウイルスの長い末端反復内に見られるプロモーターであってもよい。
本発明の組換え発現ベクターは一過性の発現、安定な発現、または両方のために設計することができる。また、組換え発現ベクターは構成的な発現または誘導性の発現用に作製することができる。
さらに、組換え発現ベクターは自殺遺伝子を含むように作製することができる。本明細書で使用される場合、用語「自殺遺伝子」とは、自殺遺伝子を発現する細胞を死滅させる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、その遺伝子を発現する細胞に、作用物質、例えば薬物に対する感受性を付与し、その細胞がその作用物質に接触するかまたは曝露されたときにその細胞を死滅させる遺伝子であってもよい。自殺遺伝子は当技術分野で公知であり（例えば、Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｊ． （Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｔ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｕｔｔｏｎ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００４年参照）、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ（ｄａｍｉｎａｓｅ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、およびニトロレダクターゼを含む。
本発明のある実施形態は、本明細書に記載されている組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」とは、本発明の組換え発現ベクターを含有することができる任意のタイプの細胞を指す。宿主細胞は真核生物細胞、例えば、植物、動物、真菌、もしくは藻類であってもよく、または原核生物細胞、例えば、細菌もしくは原生生物であってもよい。宿主細胞は、培養細胞または初代細胞であってもよく、すなわち、生物、例えばヒトから直接単離され得る。宿主細胞は、接着細胞または浮遊細胞、すなわち懸濁物中で増殖する細胞であってもよい。適切な宿主細胞は当技術分野で公知であり、例えば、ＤＨ５α Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などがある。組換え発現ベクターを増幅または複製する目的からは、宿主細胞は原核生物の細胞、例えば、ＤＨ５α細胞でよい。組換えポリペプチド、タンパク質、ＣＡＲ、抗ＣＤ２７６結合性部分、コンジュゲート、またはこれらの機能性部分もしくは機能性変異体を産生する目的では、宿主細胞は哺乳動物の細胞であり得る。宿主細胞はヒト細胞であってもよい。宿主細胞はあらゆる細胞型のものであってもよく、任意のタイプの組織に由来することができ、任意の発生段階にあることができるが、宿主細胞は末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり得る。宿主細胞はＢ細胞でもＴ細胞でもよい。
本発明の目的から、Ｔ細胞は任意のＴ細胞であってもよく、例えば培養されたＴ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、または培養されたＴ細胞株に由来するＴ細胞、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１など、または哺乳動物から得られたＴ細胞であってもよい。哺乳動物から得る場合、Ｔ細胞は、限定されることはないが血液、骨髄、リンパ節、胸腺、もしくは他の組織または流体を始めとする多数の供給源から得ることができる。Ｔ細胞はまた、濃縮もしくは精製することもできる。Ｔ細胞はヒトＴ細胞であってもよい。Ｔ細胞はヒトから単離されたＴ細胞でもよい。Ｔ細胞は任意のタイプのＴ細胞であってもよく、任意の発生段階にあることができ、例えば、限定されることはないが、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋ダブルポジティブＴ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞などであってもよい。Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞であってもよい。
また、本発明のある実施形態により、本明細書に記載されている少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団も提供される。細胞の集団は、記載されている組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を、少なくとも１つの他の細胞、例えば、組換え発現ベクターを一切含まない宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）、またはＴ細胞以外の細胞、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞などを加えて含む、不均質な集団であってもよい。あるいは、細胞の集団は、集団が、組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主として含む（例えば、上記宿主細胞から本質的になる）、実質的に均質な集団であってもよい。集団はまた、集団の全ての細胞が、組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであって、結果として集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含む、細胞のクローンの集団であってもよい。本発明の一実施形態では、細胞の集団は、本明細書に記載されている組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローンの集団である。
ポリペプチド、タンパク質、ＣＡＲ（これらの機能性部分および変異体を含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（これらの集団を含む）、抗ＣＤ２７６結合性部分、およびコンジュゲートは、以後すべて総称して「本発明の抗ＣＤ２７６材料」と称するが、単離および／または精製することができる。用語「単離された」とは、本明細書で使用される場合、その天然環境から取り出されていることを意味する。用語「精製された」または「単離された」は絶対的な純度も単離も必要とせず、むしろ、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製された（または単離された）宿主細胞調製物は、宿主細胞が身体内の天然の環境にある細胞よりも純粋であるものである。かかる宿主細胞は、例えば、標準的な精製技法によって産生され得る。一部の実施形態では、宿主細胞の調製物は、宿主細胞が調製物の総細胞含量の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７０％となるように精製される。例えば、純度は少なくとも約５０％であってもよく、約６０％、約７０％または約８０％超であってもよく、または約１００％であってもよい。
本発明の抗ＣＤ２７６材料は、医薬組成物のような組成物に製剤化することができる。この点で、本発明のある実施形態は、本明細書に記載されている本発明の抗ＣＤ２７６材料のいずれかおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明の抗ＣＤ２７６材料のいずれかを含有する本発明の医薬組成物は、１つより多くの本発明の抗ＣＤ２７６材料、例えば、コンジュゲートおよび核酸、または２つまたはそれ超の異なるコンジュゲートを含むことができる。あるいは、医薬組成物は化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどのような他の薬学的に活性な作用物質または薬物と組み合わせて本発明の抗ＣＤ２７６材料を含むことができる。好ましい実施形態では、医薬組成物は本発明のコンジュゲートを含む。
本発明の抗ＣＤ２７６材料は、塩、例えば薬学的に許容される塩の形態で提供することができる。適切な薬学的に許容される酸付加塩には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、および硫酸のような鉱酸、ならびに酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、およびアリールスルホン酸、例えばｐ−トルエンスルホン酸のような有機酸から誘導される塩がある。
医薬組成物に関連して、薬学的に許容される担体は、慣習的に使用されているもののいずれかであってもよく、溶解度および活性な作用物質との反応性の欠如のような物理化学的な観点、ならびに投与経路によってのみ制限される。本明細書に記載されている薬学的に許容される担体、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、および希釈剤は当業者に周知であり、公に容易に利用可能である。薬学的に許容される担体は、活性な作用物質に対して化学的に不活性であるものおよび使用条件下で有害な副作用も毒性も有さないものであることが好ましい。
担体の選択は部分的に、特定の本発明の抗ＣＤ２７６材料により、ならびに本発明の抗ＣＤ２７６材料を投与するのに使用される特定の方法により、決定される。したがって、本発明の医薬組成物に適した様々な製剤がある。保存剤を使用し得る。適切な保存剤として、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムを挙げることができる。任意選択で、２種またはそれ超の保存剤の混合物を使用し得る。保存剤またはその混合物は通例、全組成の約０．０００１％〜約２重量％の量で存在する。
適切な緩衝剤としては、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに様々な他の酸および塩を挙げることができる。任意選択で、２つまたはそれ超の緩衝剤の混合物も使用できる。緩衝剤またはその混合物は通例全組成の約０．００１％〜約４重量％の量で存在する。
医薬製剤中の本発明の抗ＣＤ２７６材料の濃度は、例えば、約１重量％未満、通常約１０重量％または少なくとも約１０重量％から、例えば約２０重量％〜約５０重量％またはそれ超までも変化することができ、主として流体体積、および粘度により、選択された特定の投与様式に従って選択することができる。
投与可能な（例えば、非経口で投与可能な）組成物を製造する方法は当業者に公知または明白であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆
Ｗｉｌｋｉｎｓ、第２１版（２００５年５月１日）により詳細に記載されている。
経口、エアゾール、非経口（例えば、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および髄腔内）、および局所投与用の以下の製剤は単に代表例であり、いかなる意味でも限定することはない。１つより多くの経路を使用して本発明の抗ＣＤ２７６材料を投与することができ、ある特定の場合では、特定の経路が別の経路より即時でより有効な応答を提供することができる。
経口投与に適した製剤は、（ａ）水、食塩水、またはオレンジジュースのような希釈剤に溶解した有効量の本発明の抗ＣＤ２７６材料のような液体溶液；（ｂ）各々が固体または顆粒として所定量の有効成分を含有するカプセル、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤、ロゼンジ、およびトローチ；（ｃ）散剤；（ｄ）適当な液体中の懸濁物；および（ｅ）適切な乳剤を含むかまたはこれからなることができる。液体製剤は、薬学的に許容される界面活性剤を添加したかまたはしてない、水ならびにアルコール、例えば、エタノール、ベンジルアルコール、およびポリエチレンアルコールのような希釈剤を含み得る。カプセル形態は、例えば、界面活性剤、滑沢剤、ならびにラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、およびコーンスターチのような不活性充填剤を含有する通常の硬質または軟質シェルのゼラチンタイプのものであってもよい。錠剤形態は、１つまたは複数のラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、ならびに他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、保存剤、矯味矯臭剤、および他の薬理学的に適合性の賦形剤を含むことができる。ロゼンジ形態は、矯味矯臭薬、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に本発明の抗ＣＤ２７６材料を含むことができ、同様にトローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅ）は当技術分野で公知のかかる賦形剤を含有するか、またはこれに加えて、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア、乳剤、ゲルなどの不活性な基剤中に本発明の抗ＣＤ２７６材料を含むことができる。
非経口投与に適した製剤としては、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を意図された受容者の血液と等張にする溶質を含有する水性および非水性の等張性で無菌の注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含むことができる水性および非水性の無菌懸濁物がある。本発明の抗ＣＤ２７６材料は、生理学的に許容可能な希釈剤中、無菌の液体または液体の混合物のような医薬担体において投与することができ、かかる担体には、水、食塩水、水性デキストロースおよび関連の糖溶液、アルコール、例えばエタノールまたはヘキサデシルアルコール、グリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、ケタール、例えば２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステルもしくはグリセリド、またはアセチル化脂肪酸グリセリドがあり、薬学的に許容される界面活性剤、例えば石ケンまたは洗浄剤、懸濁化剤、例えばペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロース、または乳化剤および他の医薬アジュバントを添加してもしなくてもよい。
非経口製剤に使用することができる油には、石油、動物、植物、または合成の油がある。油の具体的な例として、ピーナッツ油、ダイズ油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ペトロラタム、および鉱油がある。非経口製剤に使用するのに適した脂肪酸にはオレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸がある。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは適切な脂肪酸エステルの例である。
非経口製剤に使用するのに適した石ケンには脂肪酸のアルカリ金属（ｆａｔｔｙ ａｌｋａｌｉ ｍｅｔａｌ）、アンモニウム、およびトリエタノールアミン塩があり、適切な洗浄剤としては（ａ）例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド、およびアルキルピリジニウムハライドのようなカチオン性の洗浄剤、（ｂ）例えば、アルキル、アリール、およびオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテル、およびモノグリセリドスルフェート、およびスルホスクシネートのようなアニオン性の洗浄剤、（ｃ）例えば、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、およびポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマーのような非イオン性の洗浄剤、（ｄ）例えば、アルキル−β−アミノプロピオネート、および２−アルキル−イミダゾリン第四級アンモニウム塩のような両性洗浄剤、ならびに（ｅ）これらの混合物がある。
非経口製剤は、通例、例えば約０．５％〜約２５重量％の本発明の抗ＣＤ２７６材料を溶液中に含有する。保存剤および緩衝液を使用し得る。注射部位における刺激を最小にするかまたは排除するために、かかる組成物は、例えば、約１２〜約１７の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１つまたは複数の非イオン性界面活性剤を含有し得る。かかる製剤中の界面活性剤の量は、通例、例えば約５％〜約１５重量％の範囲である。適切な界面活性剤としては、ソルビタンモノオレエートのようなポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ならびにプロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合により形成される疎水性ベースを有するエチレンオキシドの高分子量付加物がある。非経口製剤は、アンプルおよびバイアルのような単位用量または複数用量の密封容器で提供することができ、使用直前に無菌の液体賦形剤、例えば注射用水の添加を要するだけである凍結乾燥（凍結乾燥）条件で貯蔵することができる。即時注射溶液および懸濁物は既に記載した種類の無菌の散剤、顆粒、および錠剤から製造することができる。
注射可能な製剤は本発明のある実施形態に従う。注射可能な組成物に有効な医薬担体としての要件は当業者に周知である（例えば、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第３版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、ＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＤａｖｉｄｏｗ、編、（２００９年）、およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ、Ｔｒｉｓｓｅｌ、第１６版、（２０１０年）参照）。
経皮薬物放出に有用なものを含めて局所製剤は当業者に周知であり、皮膚への適用のための本発明の実施形態との関連で適切である。単独または他の適切な成分と組み合わせた本発明の抗ＣＤ２７６材料は、吸入によって投与されるエアゾール製剤として作製することができる。これらのエアゾール製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素、などのような加圧された許容可能な噴霧体中に入れることができる。これらはまた、ネブライザーまたはアトマイザーのような加圧されていない調製物用の医薬品として製剤化してもよい。かかるスプレー製剤はまた粘膜に噴霧するために使用してもよい。
「有効量」または「治療するのに有効な量」とは、個体において（ａ）がんを予防または治療するか、または（ｂ）腫瘍血管系を低減または排除するのに適切な用量を指す。治療または予防での使用のために有効な量は、例えば、治療される疾患または傷害の段階および重症度、患者の年齢、体重、および一般的な健康状態、ならびに処方する医師の判断に依存する。用量のサイズはまた、選択された活性剤（ａｃｔｉｖｅ）、投与方法、投与のタイミングおよび頻度、特定の活性剤の投与に伴う可能性がある何らかの有害な副作用の存在、性質、および程度、ならびに所望の生理学的効果によっても決定される。当業者には理解されるように、様々な疾患または傷害は、投与の各々または様々なラウンドにおける、おそらく本発明の抗ＣＤ２７６材料を使用する複数の投与を含む長期の治療を必要とする可能性がある。本発明を限定する意図がない例を示すと、本発明の抗ＣＤ２７６材料の用量は治療される被験体の体重ｋｇ当たり１日毎に約０．００１〜約１０００ｍｇ、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日であってもよい。
本発明の目的から、投与される本発明の抗ＣＤ２７６材料の量または用量は妥当な時間枠にわたって被験体または動物において治療または予防上の応答をもたらすのに充分であるべきである。例えば、本発明の抗ＣＤ２７６材料の用量は、投与の時から約２時間またはそれより長い期間、例えば、約１２〜約２４またはそれ超の時間、抗原に結合し、腫瘍血管系を検出し、低減し、もしくは排除し、または疾患を検出し、治療し、または予防するのに充分であるべきである。ある特定の実施形態では、期間はさらに長くなる可能性がある。用量は、特定の本発明の抗ＣＤ２７６材料の効力および動物（例えば、ヒト）の状態、ならびに治療される動物（例えば、ヒト）の体重によって決定される。
本発明の目的のために、例えば、各々いろいろな用量の本発明の抗ＣＤ２７６材料を与えられた一組の哺乳動物のうちで、所与の用量の本発明の抗ＣＤ２７６材料が哺乳動物に投与された際に標的細胞が死滅した程度を比較することを含むアッセイを使用して、哺乳動物に投与される開始用量を決定することができよう。ある特定の用量の投与の際に標的細胞が死滅した程度は当技術分野で公知の方法によってアッセイすることができる。
前述の医薬組成物に加えて、本発明の抗ＣＤ２７６材料はシクロデキストリン包接複合体のような包接複合体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）、またはリポソームとして製剤化することができる。リポソームは、特定の組織に対して本発明の抗ＣＤ２７６材料を標的化させるのに役立つことができる。リポソームはまた本発明の抗ＣＤ２７６材料の半減期を増大するのに使用することもできる。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｅｎｇ．、９巻、４６７頁（１９８０年）ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載されているように多くの方法が、リポソームを調製するのに利用可能である。
本発明の実施形態との関連で有用な送達系として、治療される部位の感作の前に、かつ感作を引き起こすのに充分な時間で、本発明の組成物の送達がおこるように、時限放出（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅｄ）、遅延放出、および持続放出送達系が含まれ得る。本発明の組成物は他の治療剤または療法と併せて使用することができる。かかる系は本発明の組成物の反復投与を回避することができ、そのため被験体および医師に対する利便性が増大し、本発明のある特定の組成物の実施形態にとっては特に適切であり得る。
多くのタイプの放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。それらには、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物のようなポリマーベースの系がある。薬物を含有する上記ポリマーのマイクロカプセルが、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達系にはまた、コレステロール、コレステロールエステルのようなステロール、ならびに脂肪酸またはモノ−、ジ−およびトリ−グリセリドのような中性脂肪を始めとする脂質である非ポリマー系；ヒドロゲル放出系；サイラスティック（ｓｙｌａｓｔｉｃ）系；ペプチドベースの系；ワックスコーティング；慣用のバインダーおよび賦形剤を用いる圧縮錠剤；部分的に融合したインプラントなどもある。具体的な例として、限定されることはないが：（ａ）米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６６７，０１４号、同第４，７４８，０３４号、および同第５，２３９，６６０号に記載されているもののような、活性な組成物がマトリックス内である形態で含有されている浸食系、ならびに（ｂ）米国特許第３，８３２，２５３号および同第３，８５４，４８０号に記載されているもののような、活性成分が制御された速度でポリマーから浸透する拡散系がある。さらに、ポンプをベースとするハードウェア送達系を使用することができ、そのうちの幾つかは移植に適している。
当業者には容易に理解されるように、本発明の抗ＣＤ２７６材料は、改変により本発明の抗ＣＤ２７６材料の治療効力または予防効力が増大するように、あらゆる方法で改変することができる。例えば、本発明の抗ＣＤ２７６材料は、本発明の抗ＣＤ２７６材料が投与された身体中に放出される方式が時間および身体内の位置に関連して制御されるように、デポー形態に改変することができる（例えば、米国特許第４，４５０，１５０号参照）。デポー形態の本発明の抗ＣＤ２７６材料は、例えば、本発明の抗ＣＤ２７６材料およびポリマーのような多孔質または非多孔質材料を含む移植可能な組成物であってもよく、ここで本発明の抗ＣＤ２７６材料は、材料によりカプセル化されているか、または材料全体に拡散しており、および／または非多孔質材料の分解。このデポーはその後身体内の所望の位置に移植され、本発明の抗ＣＤ２７６材料はインプラントから所定の速度で放出される。
本発明の抗ＣＤ２７６材料を１つまたは複数の追加の治療剤と共に投与するとき、１つまたは複数の追加の治療剤は哺乳動物に共投与する（ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）ことができる。「共投与する」とは、本発明の抗ＣＤ２７６材料が１つまたは複数の追加の治療剤の効果を増進することができるか、またはその逆も同様に行われるように、１つまたは複数の追加の治療剤および本発明の抗ＣＤ２７６材料を時間的に充分近接して投与することを意味する。この点で、本発明の抗ＣＤ２７６材料を最初に投与し、１つまたは複数の追加の治療剤を次に投与するか、またはその逆も同様にすることができる。あるいは、本発明の抗ＣＤ２７６材料および１つまたは複数の追加の治療剤は、同時に投与することができる。抗ＣＤ２７６材料と共投与することができる代表的な治療剤はＩＬ−２である。ＩＬ−２は本発明の抗ＣＤ２７６材料の治療効果を高めると考えられる。本発明の方法の目的から、宿主細胞または細胞の集団を哺乳動物に投与する場合、細胞は哺乳動物に対して同種異系または自家の細胞であってもよい。
本発明の抗ＣＤ２７６材料および医薬組成物は哺乳動物において疾患を治療または予防する方法に使用することができると企図される。特定の理論または機序に縛られることはないが、本発明の抗ＣＤ２７６材料は生物学的活性、例えば、抗原、例えばＣＤ２７６を認識する能力を有し、その結果、抗ＣＤ２７６材料はエフェクター分子を標的細胞または標的組織に向かわせることができる。この点で、本発明のある実施形態は、本発明のポリペプチド、タンパク質、ＣＡＲ、機能性部分、機能性変異体、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗ＣＤ２７６結合性部分、コンジュゲート、および／または医薬組成物のいずれかを、哺乳動物において（ａ）がんを治療もしくは予防するかまたは（ｂ）腫瘍血管系を低減もしくは排除するのに有効な量で哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において（ａ）がんを治療もしくは予防するかまたは（ｂ）腫瘍血管系を低減もしくは排除する方法を提供する。
本発明のある実施形態は、さらに、本発明の抗ＣＤ２７６材料を投与する前に哺乳動物をリンパ枯渇させる（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｅ）ことを含む。リンパ枯渇の例としては、限定されることはないが、骨髄非破壊的なリンパ枯渇化学療法、骨髄破壊的なリンパ枯渇化学療法、全身照射などがある。
本発明の方法の目的にとって、宿主細胞または細胞の集団を投与する場合、細胞は哺乳動物に対して同種異系または自家の細胞であってもよい。好ましくは、細胞は哺乳動物に対して自家である。
本明細書でいう哺乳動物はあらゆる哺乳動物であってもよい。本明細書で使用される場合、用語「哺乳動物」とは、限定されることはないが、マウスおよびハムスターのようなげっ歯目の哺乳動物、ならびにウサギのようなウサギ（Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）目の哺乳動物を含めたあらゆる哺乳動物を指す。哺乳動物はネコ（Ｆｅｌｉｎｅ）（ネコ（ｃａｔ））およびイヌ（Ｃａｎｉｎｅ）（イヌ（ｄｏｇ））を含む食肉目でもよい。哺乳動物はウシ（Ｂｏｖｉｎｅ）（ウシ（ｃｏｗ））およびブタ（Ｓｗｉｎｅ）（ブタ（ｐｉｇ））を含む偶蹄目、またはウマ（Ｅｑｕｉｎｅ）（ウマ（ｈｏｒｓｅ））を含む奇蹄目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）でもよい。哺乳動物は霊長目、Ｃｅｂｏｉｄ、もしくはＳｉｍｏｉｄ（サル）または真猿亜目（Ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄ）（ヒトおよび類人猿）でもよい。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
本発明の方法に関連して、がんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、横紋筋肉腫、膀胱がん（例えば、膀胱癌）、骨がん、脳がん（例えば、髄芽腫、神経芽細胞腫、およびグリア芽腫）、乳がん、肛門、肛門管、または肛門直腸（ａｎｏｒｅｃｔｕｍ）のがん、目のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、首、胆嚢、または胸膜のがん、鼻、鼻腔、または中耳のがん、口腔のがん、陰門のがん、慢性のリンパ球性白血病、慢性の骨髄性がん、結腸がん、ユーイング肉腫、食道がん、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、線維肉腫、胃腸のカルチノイド、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮細胞癌）、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、液体腫瘍（ｌｉｑｕｉｄ
ｔｕｍｏｒ）、肝臓がん、肺がん（例えば、非小細胞肺癌）、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ−慢性のリンパ球性白血病、ヘアリーセル白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、およびバーキットリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、腹膜、網、および腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟組織がん、固形腫瘍、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、および尿管がんを含むあらゆるがんであってもよい。好ましくは、がんは固形腫瘍（例えば、小児固形腫瘍）、成人癌、神経芽細胞腫、グリア芽腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、前立腺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、または肺がんである。ある実施形態では、がんはＣＤ２７６の発現または過剰発現を特徴とする。
特定の理論または機序に縛られることはないが、血管系（例えば、腫瘍血管系）はＣＤ２７６を発現する標的であり得ると考えられる。したがって、本発明のある実施形態では、がんは腫瘍血管系以外の領域におけるＣＤ２７６の発現または過剰発現を特徴としない。
用語「治療する」および「予防する」ならびにそれから派生する語は、本明細書で使用される場合、必ずしも１００％または完全な治療または予防を意味しない。むしろ、当業者が潜在的な利益または治療効果を有すると認識する治療または予防の様々な程度がある。この関係で、本発明の方法は哺乳動物においてがんの治療または予防の任意のレベルの任意の量を提供することができる。なお、本発明の方法により提供される治療または予防は、治療または予防される疾患、例えばがんの１つまたは複数の状態または症状の治療または予防を含むことができる。また、本発明の目的にとって、「予防」は、疾患、またはその症状もしくは状態の発現を遅らせることを包含することができる。
本発明の別の実施形態は、（ａ）がんを治療もしくは予防するかまたは（ｂ）腫瘍血管系を低減するためのキットであって、本発明の他の態様に関連して本明細書に記載されているポリペプチド、タンパク質、抗ＣＤ２７６結合性部分、コンジュゲート、核酸、組換え発現ベクター、単離された宿主細胞、細胞の集団、または医薬組成物のいずれかを含むキットを提供する。好ましい実施形態では、キットは

（式中、
ｎは偶数の整数であり、
Ａは配列番号２６および２７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２７６結合性部分である）
を含むコンジュゲートを含む。キットのある実施形態は、（ａ）本発明の他の態様に関連して本明細書に記載されている薬学的に許容される担体（例えば、緩衝剤）、（ｂ）キットを使用するための印刷された指示、（ｃ）本発明の他の態様に関連して本明細書に記載されている化学療法剤のような１つまたは複数の他の薬学的に活性な作用物質または薬物のいずれか１つまたは複数をさらに含み得る。キットを使用するための印刷された指示は、本発明の他の態様に関連して本明細書に記載されている本発明の抗ＣＤ２７６材料を投与する方法を説明している。キットのある実施形態は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体の各々、１つまたは複数の本発明の抗ＣＤ２７６材料の各々、および１つまたは複数の他の薬学的に活性な作用物質または薬物の各々を保つための別個の容器をさらに含む。
本発明の別の実施形態は、哺乳動物における（ａ）がんの治療もしくは予防、または（ｂ）腫瘍血管系の低減もしくは排除のための、本発明のポリペプチド、タンパク質、ＣＡＲ、機能性部分、機能性変異体、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗ＣＤ２７６結合性部分、コンジュゲート、または医薬組成物のいずれかの使用を提供する。
本発明の別の実施形態は、哺乳動物において（ａ）がんまたは（ｂ）腫瘍血管系の存在を検出する方法であって、（ａ）哺乳動物に由来する１つまたは複数の細胞を含む試料を、本発明のポリペプチド、タンパク質、ＣＡＲ、機能性部分、機能性変異体、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗ＣＤ２７６結合性部分、またはコンジュゲートと接触させることにより複合体を形成するステップ、および（ｂ）複合体を検出するステップを含み、複合体の検出は哺乳動物における（ａ）がんまたは（ｂ）腫瘍血管系の存在を示す、方法を提供する。
試料は、何らかの適切な方法、例えば生検または剖検によって得ることができる。生検は、個体から組織および／または細胞を取り出すことである。かかる取り出しは、取り出された組織および／または細胞に対して実験を行うために、個体から組織および／または細胞を収集することであり得る。この実験は、個体がある特定の状態または疾患状態を有するか、および／または罹患しているかを決定するための実験を含み得る。この状態または疾患は、例えば、がんであり得る。
哺乳動物において（ａ）がんまたは（ｂ）腫瘍血管系の存在を検出する本発明の方法のある実施形態に関連して、哺乳動物の細胞を含む試料は全細胞、その溶解物、または全細胞溶解物の画分、例えば、細胞核もしくは細胞質画分、全タンパク質画分、もしくは核酸画分を含む試料であってもよい。試料が全細胞を含む場合、細胞は哺乳動物のあらゆる細胞、例えば、血液細胞または内皮細胞を含む任意の器官もしくは組織の細胞であってもよい。
本発明の検出方法の目的から、接触は哺乳動物に対してｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。好ましくは、接触はｉｎ ｖｉｔｒｏである。
また、複合体の検出は当技術分野で公知のあらゆる方法で実施することができる。例えば、本明細書に記載されている本発明のＣＡＲ、ポリペプチド、タンパク質、機能性部分、機能性変異体、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗ＣＤ２７６結合性部分、またはコンジュゲートは、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、および元素粒子（例えば、金粒子）のような検出可能な標識で標識することができる。
抗ＣＤ２７６材料の標的細胞を認識する能力および抗原特異性を試験する方法は当技術分野で公知である。例えば、Ｃｌａｙら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６３巻：５０７〜５１３頁（１９９９年）は、サイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ−α）またはインターロイキン２（ＩＬ−２））の放出を測定する方法を教示している。さらに、抗ＣＤ２７６材料の機能はＺｈａｏら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７４巻：４４１５〜４４２３頁（２００５年）に記載されているように細胞傷害の測定によって評価することができる。
以下の実施例は本発明をさらに例証するが、当然、いかなる意味でもその範囲を限定すると解釈されるべきではない。
（実施例１）
この実施例は、抗ＣＤ２７６結合ドメインの同定、精製、および特徴付けを実証する。
酵母ディスプレイナイーブヒト抗体ライブラリー、抗体、ビオチン化キット、細胞
ファージディスプレイＦａｂライブラリーの構築に使用した遺伝子を含むヒト抗体遺伝子レパートリーのコレクションを使用して大きい酵母ディスプレイナイーブ単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ヒト抗体ライブラリーを構築した（Ｚｈｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、５２５巻：１２９〜１４２頁、ｘｖ（２００９年））。
マウスモノクローナル抗ｃ−Ｍｙｃ抗体はＲｏｃｈｅ（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。ＰＥコンジュゲートストレプトアビジンおよびＡｌｅｘａ−４８８コンジュゲートヤギ抗マウス抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。プロテインＧカラムはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｗａｕｋｅｓｈａ、ＷＩ）から購入した。Ａｖｉ−タグ特異的ビオチン化キットはＡｖｉｄｉｔｙ（Ａｕｒｏｒａ、ＣＯ）から購入した。酵母プラスミド抽出キットはＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）から購入した。２９３フリースタイルタンパク質発現キットはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＡｕｔｏＭＡＣＳ ＳｙｓｔｅｍはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
初期酵母ディスプレイヒト抗体ライブラリーのＭＡＣＳ選別のダウンサイズ
ビオチン化したヒトおよびマウスＣＤ２７６細胞外ドメインを３回の選別の標的として使用して、初期酵母ディスプレイナイーブヒト抗体ライブラリーをダウンサイズした。初期ナイーブ抗体ライブラリーに由来するおよそ１０１０の細胞および１０μｇのビオチン化したＣＤ２７６細胞外ドメインを、５０ｍｌのＰＢＳＡ（０．１％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝化食塩水）中室温（ＲＴ）で２ｈｒ回転させながらインキュベートした。ライブラリーからの細胞上にディスプレイした抗体に結合したビオチン化ＣＤ２７６細胞外ドメインの混合物を３回ＰＢＳＡで洗浄し、１００μｌのストレプトアビジンとコンジュゲートしたマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と共にＲＴでインキュベートした。得られた混合物を１回ＰＢＳＡで洗浄し、１回目の選別のためにＡｕｔｏＭＡＣＳシステムにロードした。選別した細胞を、ＳＤＣＡＡ培地（１リットル水中における２０ｇのデキストロース、６．７ｇのアミノ酸不含（ｗ／ｏ）ＤＩＦＣＯ酵母ニトロゲンベース、５ｇのＢＡＣＴＯカザミノ酸、５．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４および８．５６ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ）中で、３０℃、２５０回転／分（ｒｐｍ）で２４時間（ｈｒ）増幅した。その後、ＳＧＣＡＡ培地（１リットル水中における２０ｇのガラクトース、２０ｇのラフィノース、１ｇのデキストロース、６．７ｇのアミノ酸不含ＤＩＦＣＯ酵母ニトロゲンベース、５ｇのＢＡＣＴＯカザミノ酸、５．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４および８．５６ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ）中、２０℃、２５０ｒｐｍで１６〜１８ｈｒ培養を誘発した。
同じ量の抗原およびインキュベーション体積を次の２回の選別のために使用した。これら２回の選別に用いた細胞数を、前回の選別から選別したプールのサイズの１００倍に設定して各々の選別したプールの多様性を保った。
ｓｃＦｖ−Ｆｃタンパク質の発現と精製
酵母プラスミド抽出キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用し、製造業者の指示に従って、同定された酵母クローンからプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドをさらなる増幅のために１０Ｇ化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）に形質転換した。細菌から抽出されたプラスミドをＤＮＡ配列決定に使用し、陽性のバインダー抗体をコードする核酸配列を得た。
３つの抗ＣＤ２７６抗体が同定され、各々、以下の通り、（１）クローンｍ８５２（配列番号７を含む重鎖および配列番号８を含む軽鎖を含む）、（２）クローンｍ８５７（配列番号１７を含む重鎖および配列番号１８を含む軽鎖を含む）、および（３）クローンｍ８５２４（ｍ２７６）（配列番号２６を含む重鎖および配列番号２７を含む軽鎖を含む）の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を含む。
ユニークなクローンのｓｃＦｖをコードするインサートをＳｆｉＩで消化し、同じセットのＳｆｉＩ部位および可溶性発現のためのＦｃ−Ａｖｉタグを担持する改変されたｐＳｅｃＴａｇにライゲーションした。これらの構築物を、製造業者のプロトコルに従って発現用の２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。７２ｈｒの増殖後、培養培地中のｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質をＥＬＩＳＡ結合アッセイに使用した。
ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
２μｇ／ｍｌでＰＢＳに希釈したヒト（図１Ａ）またはマウス（図１Ｂ）ＣＤ２７６−ＡＰ融合タンパク質５０μｌを９６ウェルプレートに４℃で一晩コートした。培養培地中の一過性に発現したｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質を連続的に希釈し、標的タンパク質をコートしたウェルに加えた。洗浄後、１：３０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を１ｈｒ、ＲＴで加えた。洗浄後、３，３，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を加え、光学密度（Ｏ．Ｄ．）を４５０ｎｍで読み取った。結果を図１Ａおよび１Ｂに示す。図１Ａおよび１Ｂに示されているように、以下の通り、各々ヒト（図１Ａ）およびマウス（図１Ｂ）ＣＤ２７６の両方に結合した（１）クローンｍ８５２（配列番号７を含む重鎖および配列番号８を含む軽鎖を含む）、（２）ｍ８５７（配列番号１７を含む重鎖および配列番号１８を含む軽鎖を含む）、および（３）ｍ８５２４（ｍ２７６）（配列番号２６を含む重鎖および配列番号２７を含む軽鎖を含む）の重鎖および軽鎖アミノ酸配列をｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質。
表面プラズモン共鳴による親和性決定
ヒトＣＤ２７６細胞外ドメインに対するヒト抗ＣＤ２７６ｓｃＦｖ ｍ８５２４の結合親和性をＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴技術によって分析した。ヒトＣＤ２７６可溶性細胞外ドメインを、カルボジイミドカップリング化学反応を使用してセンサーチップ（ＣＭ５）上に共有結合により固定化した。非特異的な結合および屈折率の変化のために対照の基準表面を調製した。相互作用の動力学の分析のために、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％の界面活性剤Ｐ−２０（ｐＨ７．４）を含有する泳動緩衝液を使用して様々な濃度の抗原を３０μｌ／ｍｉｎの流量で注入した。会合および解離相データを、非線形データ解析プログラムＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．２を使用して１：１のＬａｎｇｕｍｉｒグローバルモデルに同時にフィットさせた。実験は全て２５℃で行った。抗体ｍ８５２４（ｍ２７６）（配列番号２６を含む重鎖および配列番号２７を含む軽鎖を含む）の親和性を図２に示す。図２は、生のデータに対応する線とＫＤを計算するためにフィッティングを実行したときにソフトウェアによって作成された線とがいずれも実際上同じであることを示している。
（実施例２）
この実施例は、皮下のＨＣＴ１１６ヒト結腸異種移植腫瘍の増殖がＣＤ２７６ノックアウト（ＫＯ）マウスで損なわれることを実証する。
野生型（ＷＴ）およびＣＤ２７６ ＫＯマウスに、ＨＴＣ１１６ヒト結腸腫瘍細胞を接種し、接種後約１ヶ月の期間にわたって腫瘍体積を約３日毎に測定した。結果を図３に示す。図３に示されているように、皮下のＨＣＴ１１６ヒト結腸異種移植腫瘍の増殖はＣＤ２７６ ＫＯマウスでは損なわれる。
（実施例３）
この実施例は、細胞表面に発現したマウスおよびヒトＣＤ２７６に対する抗ＣＤ２７６ｓｃＦｖ−Ｆｃ ｍ８５２４（ｍ２７６）の結合を実証する。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を形質導入しないかまたは形質導入してマウスＣＤ２７６またはヒトＣＤ２７６を発現させた。細胞を、１μｇ／１００μｌの抗ＣＤ２７６ｓｃＦｖ−Ｆｃ ｍ８５２４（ｍ２７６）（配列番号２６および２７）（一次抗体）およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）Ｇｔ抗ヒト抗体（Ｈ＋Ｌ）（二次抗体として）と共に培養した。細胞表面上に発現したマウスまたはヒトＣＤ２７６に対する抗ＣＤ２７６ｓｃＦｖ−Ｆｃ ｍ８５２４（ｍ２７６）の結合をフローサイトメトリーにより測定した。結果を図４に示す。図４に示されているように、抗ＣＤ２７６ｓｃＦｖ−Ｆｃ ｍ８５２４（ｍ２７６）は細胞表面上に発現したマウスおよびヒトＣＤ２７６に結合した。
（実施例４）
この実施例は、Ｐａｎ０２膵臓腺癌腫瘍を有するＷＴおよびＣＤ２７６ ＫＯマウスにおける腫瘍血管系に対するヒト抗ＣＤ２７６抗体ｍ８５２４ ＩｇＧ１の特異的な結合を実証する。
各々Ｐａｎ０２膵臓腺癌腫瘍を担持するＣＤ２７６ ＫＯマウスおよびＣＤ２７６ ＷＴマウスに、ＦＩＴＣで標識した８５２４ＩｇＧ１（配列番号２６および２７）および抗ＣＤ３１／抗Ｍｅｃａ３２を注射した（ＩＰ）。抗Ｍｅｃａ３２は、マウス内皮に対する特異性を有するモノクローナル抗体である。免疫蛍光染色により、ＣＤ２７６ ＷＴマウスにおいてヒト抗ＣＤ２７６抗体ｍ８５２４ ＩｇＧ１（緑色染色）と抗ＣＤ３１／抗Ｍｅｃａ３２陽性腫瘍血管系（赤色染色）との共局在が明らかになった。赤色染色はＣＤ２７６ ＫＯマウスの腫瘍血管系で観察された。しかしながら、ＣＤ２７６ ＫＯマウスにおける緑色染色の欠如により、抗体の宿主血管系に対する特異性が確かめられた。
（実施例５）
この実施例は、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞の表面に発現したヒトＣＤ２７６に対するＦＩＴＣで標識されたヒト抗ＣＤ２７６抗体ｍ８５２４ ＩｇＧ１の特異的な結合を実証する。
ＨＥＫ２９３細胞を形質導入しないかまたはヒトＣＤ２７６を発現するように形質導入した。細胞を、ＦＩＴＣで標識したヒト抗ＣＤ２７６抗体ｍ８５２４ ＩｇＧ１（配列番号２６および２７）と共に培養した。細胞表面に発現したヒトＣＤ２７６に対するＦＩＴＣで標識されたヒト抗ＣＤ２７６抗体ｍ８５２４ ＩｇＧ１の結合をフローサイトメトリーで測定した。結果を図５に示す。図５に示されているように、フローサイトメトリーにより、トランスフェクトしてない親の２９３細胞と比較してＣＤ２７６でトランスフェクトされた２９３細胞（２９３／ＣＤ２７６）に対するヒト抗ＣＤ２７６抗体ｍ８５２４の増大した結合が明らかになった。
（実施例６）
この実施例は、腫瘍担持ＣＤ２７６ ＫＯマウスに腹腔内（ＩＰ）注射後、ＦＩＴＣで標識したヒト抗ＣＤ２７６抗体（ｍ８５２４ ＩｇＧ１）が血管系ではなくヒト腫瘍細胞に局在することを実証する。
ＣＤ２７６陽性のＰａｎ０２膵臓腺癌腫瘍を担持するＣＤ２７６ ＫＯマウスに、ＦＩＴＣで標識した８５２４ ＩｇＧ１（配列番号２６および２７）（緑色染色）および抗ＣＤ３１／抗Ｍｅｃａ３２（赤色染色）を注射した（ＩＰ）。ＣＤ３１／Ｍｅｃａ３２陽性血管は赤色に染色した。ヒト腫瘍細胞は緑色に染色した。緑色および赤色染色の別々の写真画像を撮り、赤色および緑色染色の画像を合わせて、赤色および緑色染色の共局在が黄色のシグナルを与える第３の画像を得た。宿主に由来するＣＤ２７６ヌルの血管にはＣＤ２７６発現が欠如するため合わせた画像で黄色シグナルが観察されず、合わせた画像に共局在（黄色シグナル）が得られなかった。これらの画像は、ＦＩＴＣで標識したヒト抗ＣＤ２７６抗体（ｍ８５２４ ＩｇＧ１）が、腫瘍担持ＣＤ２７６ ＫＯマウスへの注射後に、血管系ではなくヒト腫瘍細胞に局在することを示していた。
（実施例７）
この実施例は、ＦＩＴＣ標識したヒト抗ＣＤ２７６抗体（ｍ８５２４ ＩｇＧ１）が、腫瘍担持ＣＤ２７６ ＷＴマウスへのＩＰ注射後、ヒト腫瘍細胞および血管系の両方に局在することを実証する。
ＣＤ２７６陽性のＰａｎ０２膵臓腺癌腫瘍を担持するＣＤ２７６ ＷＴマウスに、ＦＩＴＣ標識した８５２４ ＩｇＧ１（配列番号２６および２７）（緑色染色）および抗ＣＤ３１／抗Ｍｅｃａ３２（赤色染色）を注射した（ＩＰ）。ＣＤ３１／Ｍｅｃａ３２陽性血管は赤色に染色した。ヒト腫瘍細胞は緑色に染色した。緑色および赤色染色の別々の写真画像を撮り、赤色および緑色染色の画像を合わせて、赤色および緑色染色の共局在が黄色シグナルを与える第３の画像を得た。宿主に由来するＣＤ２７６陽性血管ではＣＤ２７６の発現が存在するため、合わせた画像では黄色シグナルが観察され、合わせた画像に共局在（黄色シグナル）が生じた。これらの画像は、ＦＩＴＣ標識したヒト抗ＣＤ２７６抗体（ｍ８５２４ ＩｇＧ１）が、腫瘍担持ＣＤ２７６ ＷＴマウスへの注射後、ヒト腫瘍細胞および腫瘍血管系の両方に局在することを示していた。
（実施例８）
この実施例は、抗ＣＤ２７６抗体（ｍ８５２４ ＩｇＧ１）が、腫瘍細胞および腫瘍血管系を染色するが正常な肝臓は染色しないことを実証する。
各々Ｐａｎ０２膵臓腺癌腫瘍を担持するＣＤ２７６ ＫＯマウスおよびＣＤ２７６ ＷＴマウスに、ＦＩＴＣ標識した８５２４ＩｇＧ１（配列番号２６および２７）および抗ＣＤ３１／抗Ｍｅｃａ３２を注射した（ＩＰ）。ＣＤ２７６ ＫＯおよびＣＤ２７６ ＷＴマウスの両方の正常な肝臓ならびにＣＤ２７６ ＷＴマウスの腫瘍血管系におけるＣＤ３１／Ｍｅｃａ３２陽性血管は赤色に染色された。ヒト腫瘍細胞および腫瘍血管系はＣＤ２７６ ＷＴマウスで緑色に染色された。ＣＤ２７６ ＷＴマウスの腫瘍における緑色および赤色染色の別々の写真画像を撮り、赤色および緑色染色の画像を合わせて、赤色および緑色染色の共局在が黄色シグナルを与える第３の画像を得た。抗ＣＤ２７６ ｍＡｂ（ｍ８５２４ ＩｇＧ１；緑色）は、ＣＤ２７６ ＷＴマウスにおいて腫瘍細胞および腫瘍血管系を染色したが、ＣＤ２７６ ＷＴまたはＣＤ２７６ ＫＯマウスの正常な肝臓は染色しなかったことが観察された。ＣＤ２７６ ＷＴマウスの腫瘍の合わせた画像では黄色シグナルが観察された。黄色シグナルはＣＤ３１／Ｍｅｃａ３２染色（赤色）とＣＤ２７６染色（緑色）との共局在を示していた。
（実施例９）
この実施例は、抗ＣＤ２７６抗体（ｍ８５２４ ＩｇＧ１）が腫瘍細胞および腫瘍血管系を染色するが正常な組織は染色しないことを実証する。
Ｐａｎ０２膵臓腺癌腫瘍を担持するＣＤ２７６ ＷＴマウスに、ＦＩＴＣ標識した８５２４ＩｇＧ１（配列番号２６および２７）および抗ＣＤ３１／抗Ｍｅｃａ３２を注射した（ＩＰ）。ＣＤ２７６ ＷＴマウスの脳、心臓、腸、肝臓、筋肉、脾臓、および胃を含む正常な組織内のＣＤ３１／Ｍｅｃａ３２陽性血管を赤色に染色した。Ｐａｎ０２腫瘍を全ての正常な組織の染色のための陽性対照として使用した。ＣＤ２７６ ＷＴマウスの腫瘍血管系内のＣＤ３１／Ｍｅｃａ３２陽性血管も赤色に染色した。ヒト腫瘍細胞および腫瘍血管系はＣＤ２７６ ＷＴマウス内で緑色に染色した。ＣＤ２７６ ＷＴマウスの腫瘍における緑色および赤色染色の別々の写真画像を撮り、緑色および赤色染色の画像を合わせて、赤色および緑色染色の共局在が黄色シグナルを与える第３の画像を得た。抗ＣＤ２７６ｍＡｂ（ｍ８５２４）はＣＤ２７６ ＷＴマウスで腫瘍細胞（緑色）および腫瘍血管系（黄色シグナル、抗ＣＤ３１／抗Ｍｅｃａ３２の共局在を示す）を染色することが観察された。しかし、抗ＣＤ２７６ｍＡｂ（ｍ８５２４）はＣＤ２７６ ＷＴマウスの正常な組織のいずれも染色しなかった。
（実施例１０）
この実施例は、抗ＣＤ２７６抗体（ｍ８５２４ ＩｇＧ１）による正常な肝臓／腫瘍辺縁における肝臓内のＭＣ３８腫瘍の共免疫蛍光標識を実証する。
ＭＣ３８（結腸がん）腫瘍担持ＷＴマウスの正常な肝臓／腫瘍辺縁の試料を、ＦＩＴＣ標識したヒト抗ＣＤ２７６抗体（ｍ８５２４ ＩｇＧ１）（配列番号２６および２７）（図６Ｂ）またはラミニン（図６Ａ）で事後染色した（ｐｏｓｔ−ｓｔａｉｎ）。写真画像を撮った。結果は図６Ａおよび６Ｂに示す。図６Ａに示されているように、ラミニンは正常および腫瘍組織の両方で血管を染色した。図６Ｂに示されているように、抗ＣＤ２７６抗体（ｍ８５２４ ＩｇＧ１）は腫瘍細胞を染色したが正常な肝臓／腫瘍辺縁に位置する正常な組織は染色しなかった。
（実施例１１）
この実施例は、抗ＣＤ２７６抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の調製を実証する。
ＭＭＡＥに連結部分を介してコンジュゲートしたｍ８５２４抗体を含むＡＤＣ（ｍ８５２４−ＡＤＣ）を調製した。ｍ８５２４−ＡＤＣを調製するのに使用した試薬は、化学構造（１２）を有する連結部分、化学構造（１３）を有するＭＭＡＥ、および化学構造（１４）を有する、連結部分にコンジュゲートしたＭＭＡＥを含んだ：
ｍ８５２４−ＡＤＣは化学構造（１５）

（式中、
ｎは、２、４、６、または８であり、
Ａは、配列番号２６および２７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２７６抗体である）
を有した。
（実施例１２）
この実施例は、ＣＤ２７６に対する免疫蛍光染色で、ＨＥＫ２９３非形質導入細胞における低レベルのＣＤ２７６およびＣＤ２７６で安定にトランスフェクトされた２９３／ＣＤ２７６細胞における高レベルのＣＤ２７６が明らかになることを実証する。
ＨＥＫ２９３細胞またはＣＤ２７６を形質導入したＨＥＫ２９３細胞（２９３／ＣＤ２７６）を無関係のヒトＩｇＧ対照抗体、無関係のＡＤＣ対照、またはｍ８５２４−ＡＤＣと共に共培養した。ＡＤＣの薬物はＭＭＡＥであった。
細胞の核をＤＡＰＩで青色に対比染色した。写真画像を撮った。ＣＤ２７６に対する免疫蛍光染色（緑色）により、形質導入されてない２９３細胞における低レベルのＣＤ２７６およびＣＤ２７６で形質導入された２９３細胞における高レベルのＣＤ２７６が明らかになった。
（実施例１３）
この実施例は、ｍ８５２４抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）がＣＤ２７６を発現する細胞に対して選択的に細胞傷害性であることを実証する。
ＨＥＫ２９３細胞（２９３）またはＣＤ２７６で形質導入されたＨＥＫ２９３細胞（２９３／ＣＤ２７６）を、ＭＭＡＥ単独、ｍ８５２４（ｍ２７６）（配列番号２６および２７）抗体単独、ｍ８２５（無関係の対照抗体）−ＡＤＣ、またはｍ８５２４−ＡＤＣで処理した。ＡＤＣの薬物はＭＭＡＥであった。細胞を、図７に示す様々な濃度のＭＭＡＥ、ＡＤＣ、または抗体で処理した。図７に示されているように、ＭＭＡＥを含まない薬物は全ての細胞に対して細胞傷害性であり、ＣＤ２７６を発現する細胞に対する選択性を示さなかった。２９３細胞および２９３／ＣＤ２７６細胞はＣＤ２７６裸抗体（ｍ８５２４）または別の標的に対するＭＭＡＥコンジュゲート抗体による死滅に抵抗性であった。ＭＭＡＥとコンジュゲートした抗ＣＤ２７６抗体（ｍ８５２４−ＡＤＣ）は２９３／ＣＤ２７６および２９３細胞に対して選択的に細胞傷害性であり、毒性はＣＤ２７６の発現レベルに対応していた。
（実施例１４）
この実施例は、無胸腺ヌードマウスにおけるヒト結腸がん異種移植片に対するＣＤ２７６ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ効力を実証する。
ＨＣＴ−１１６ヒト結腸がん異種移植片を担持する無胸腺ヌードマウスを、対照（ビヒクル）、ｍ８５２４（ｍ２７６）（配列番号２６および２７）単独（３０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ））、または様々な投与量（１ｍｐｋ、３ｍｐｋ、１０ｍｐｋ、または３０ｍｐｋ）のｍ８５２４（ｍ２７６）−ＭＭＡＥ ＡＤＣで週２回３週間治療した。投与後の様々な時点で腫瘍体積を測定した。結果を図８および９に示す。図８および９に示されているように、ｍ８５２４（ｍ２７６）−ＭＭＡＥ ＡＤＣで治療したマウスの腫瘍体積は、対照またはｍ８５２４（ｍ２７６）単独で治療したマウスの腫瘍体積と比較して減少した。
ＨＴ２９ヒト結腸直腸腺癌異種移植片を担持する無胸腺ヌードマウスを、対照（ビヒクル）、ｍ８５２４（ｍ２７６）（配列番号２６および２７）単独（１０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ））、または様々な投与量（１ｍｐｋ、３ｍｐｋ、または１０ｍｐｋ）のｍ８５２４（ｍ２７６）−ＭＭＡＥ ＡＤＣで週２回３週間治療した。投与後の様々な時点で腫瘍体積を測定した。結果を図１０に示す。図１０に示されているように、ｍ８５２４（ｍ２７６）−ＭＭＡＥ ＡＤＣで治療したマウスの腫瘍体積は、対照またはｍ８５２４（ｍ２７６）単独で治療したマウスの腫瘍体積と比較して減少した。
ＫＭ１２ヒト結腸がん腫異種移植片を担持する無胸腺ヌードマウスを、対照（ビヒクル）、ｍ８５２４（ｍ２７６）（配列番号２６および２７）単独（１０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ））、または様々な投与量（１ｍｐｋ、３ｍｐｋ、または１０ｍｐｋ）のｍ８５２４（ｍ２７６）−ＭＭＡＥ ＡＤＣで週２回３週間、次いで２日間中断、その後、別の用量で週２回３週間治療した。投与後の様々な時点で腫瘍体積を測定した。結果を図１１に示す。図１１に示されているように、ｍ８５２４（ｍ２７６）−ＭＭＡＥ ＡＤＣで治療したマウスの腫瘍体積は、対照またはｍ８５２４（ｍ２７６）単独で治療したマウスの腫瘍体積と比較して減少した。
（実施例１５）
この実施例は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒト卵巣がん異種移植片に対するＣＤ２７６ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ効力を実証する。
ＯＶＣＡＲ３ヒト卵巣異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスを、対照（ビヒクル）、ｍ８５２４（ｍ２７６）（配列番号２６および２７）単独（１０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ））、ＭＭＡＥ単独（０．２ｍｐｋ）、または様々な投与量（１ｍｐｋ、３ｍｐｋ、または１０ｍｐｋ）のｍ８５２４（ｍ２７６）−ＭＭＡＥ ＡＤＣで１、４、８および１１日目に治療した。投与後の様々な時点で腫瘍体積を測定した。結果を図１２（１１日目まで）および図１５（５３日目まで）に示す。図１２および１５に示されているように、ｍ８５２４（ｍ２７６）−ＭＭＡＥ ＡＤＣで治療したマウスの腫瘍体積は、対照、ＭＭＡＥ単独、またはｍ８５２４（ｍ２７６）単独で治療したマウスの腫瘍体積と比較して減少した。
（実施例１６）
この実施例は、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、およびＯＶＣＡＲ３がん細胞株に対するＣＤ２７６ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性の効力を実証する。
ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＫＭ１２またはＯＶＣＡＲ３細胞を図１３に示す濃度のｍ８５２４−ＭＭＡＥ ＡＤＣと共に培養した。細胞生存率を測定し、その結果を図１３に示す。図１３に示されているように、ｍ８５２４−ＭＭＡＥ ＡＤＣ処理はＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、およびＯＶＣＡＲ３細胞の生存率を低下させた。
（実施例１７）
この実施例は、免疫応答性マウスにおける結腸がんに対するＣＤ２７６ ＡＤＣのｉｎ
ｖｉｖｏ効力を実証する。
同系のＭＣ３８ネズミ結腸がん腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスを、対照（ビヒクル）、または１ｍｐｋのｍ８５２４（ｍ２７６）−ＰＢＤ ＡＤＣで週２回２週間治療した。治療は、腫瘍接種１１日後に開始した。投与後の様々な時点で腫瘍体積を測定した。図１４に示されているように、ｍ８５２４（ｍ２７６）−ＰＢＤ ＡＤＣで治療したマウスの腫瘍体積はビヒクル単独で治療したマウスの腫瘍体積と比較して減少した。
（実施例１８）
この実施例は、無胸腺ヌードマウスにおけるヒト乳がん異種移植片に対するＣＤ２７６
ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ効力を実証する。
ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳がん細胞を無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪パッドに移植した（同所性モデル）。腫瘍担持マウスを対照（ビヒクル）、ｍ８５２４（ｍ２７６）（配列番号２６および２７）単独（１０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ））、またはｍ８５２４（ｍ２７６）−ＭＭＡＥ ＡＤＣ（用量１ｍｐｋまたは１０ｍｐｋ）で週２回３週間治療した。投与後の様々な時点で腫瘍体積を測定した。結果を図１６に示す。図１６に示されているように、ｍ８５２４（ｍ２７６）−ＭＭＡＥ ＡＤＣで治療したマウスの腫瘍体積は対照またはｍ８５２４（ｍ２７６）単独で治療したマウスの腫瘍体積と比較して減少した。
刊行物、特許出願、および特許を含めて本明細書で引用した全ての文献は、あたかも各々の文献が参照により組み込まれると個別かつ具体的に表示され、その全体が本明細書に記載されているのと同程度に、ここで参照により組み込まれる。
本発明の記載との関連で（とりわけ以下の特許請求の範囲との関連で）用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに類似の指示対象の使用は、本明細書中で他に示されない限り、または文脈から明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方を網羅するものと解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する」は、他に断りのない限り、オープンエンド用語（すなわち、「限定されることなく含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書で値の範囲の引用は、本明細書中で他に示されない限り、各々の個別の値をそれぞれ参照する簡潔な方法として役立つことを意図しているに過ぎず、各々の個別の値は、あたかもそれぞれ本明細書で個々に述べられているかのごとく、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されている全ての方法は、本明細書中で他に示されない限り、または文脈から明らかに矛盾しない限り、あらゆる適切な順序で実施することができる。本明細書で提示するいずれかおよび全ての例、または例示の言語（例えば、「のような」）の使用は、他に断りのない限り、単に、本発明の理解を容易にすることを意図したものであり、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、特許請求の範囲に記載されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるものではない。
本発明者らが知る限り本発明を実施する上での最良の形態を含めて本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。好ましい実施形態の変形は以上の記載に接した当業者には明白であろう。本発明者らは、当業者が必要に応じてかかる変形を利用することを期待しており、また本発明者らは本発明が具体的に本明細書に記載されているのとは異なって実施され得ることを意図している。したがって、本発明は、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載の主題のあらゆる改変形態および均等物を適用可能な法で許されるように含む。また、あらゆる可能な変形における上記要素の任意の組合せが、本明細書中で他に示されない限り、または文脈と矛盾しない限り、本発明に包含される。

Claims (63)

  1. 抗ＣＤ２７６結合性部分およびＴ細胞シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
    前記抗ＣＤ２７６結合性部分は、３つのＣＤＲを含む重鎖の可変領域および３つのＣＤＲを含む軽鎖の可変領域を含み、
    前記重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１であり、前記重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２であり、前記重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号３であり、
    前記軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４であり、前記軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号５であり、かつ前記軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号６である、
    ＣＡＲ。
  2. 前記重鎖の可変領域および前記軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号７および８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
  3. リンカーをさらに含む、請求項１または２に記載のＣＡＲ。
  4. 前記リンカーが配列番号９または１０を含む、請求項３に記載のＣＡＲ。
  5. 前記抗ＣＤ２７６結合性部分は、抗体、Ｆａｂ断片（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ’） ２ 断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、またはジスルフィドで安定化された可変領域断片（ｄｓＦｖ）である、請求項１から４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  6. 前記抗ＣＤ２７６結合性部分は、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１から４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  7. 免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  8. 前記免疫グロブリン定常ドメインが、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ１）ドメイン配列（ＣＨ２ＣＨ３）を含む、請求項７に記載のＣＡＲ。
  9. 前記免疫グロブリン定常ドメインが、配列番号４５を含む、請求項７に記載のＣＡＲ。
  10. ＣＤ８および／またはＣＤ２８の配列を含む膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  11. 配列番号２９を含むＣＤ８アミノ酸配列、配列番号３０を含むＣＤ２８アミノ酸配列、および配列番号３１を含むＣＤ８アミノ酸配列のうちの１つまたは複数を含む膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  12. 前記細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７およびＣＤ３ゼータ（ζ）のうちの１つまたは複数からの配列を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  13. 前記細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、配列番号３２および／または配列番号３５を含むＣＤ２８アミノ酸配列、配列番号３３および／または配列番号３７を含むＣＤ１３７アミノ酸配列、および配列番号３４、３６および３８のうちのいずれか１つまたは複数を含むＣＤ３ゼータアミノ酸配列を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  14. 請求項１から１３のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
  15. それぞれ配列番号５３および５４に示される、前記重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列および前記軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載の核酸。
  16. 請求項１４または１５に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
  17. 請求項１６に記載の組換え発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
  18. 請求項１７に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団。
  19. 請求項１から１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１４または１５に記載の核酸、請求項１６に記載の組換え発現ベクター、請求項１７に記載の単離された宿主細胞、または請求項１８に記載の細胞の集団、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  20. （ａ）がんを治療もしくは予防するかまたは（ｂ）腫瘍血管系を低減するためのキットであって、前記キットは、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１４または１５に記載の核酸、請求項１６に記載の組換え発現ベクター、請求項１７に記載の単離された宿主細胞、請求項１８に記載の細胞の集団、または請求項１９に記載の医薬組成物を含む、キット。
  21. 哺乳動物における（ａ）がんの治療もしくは予防または（ｂ）腫瘍血管系の低減において使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１４または１５に記載の核酸、請求項１６に記載の組換え発現ベクター、請求項１７に記載の単離された宿主細胞、請求項１８に記載の細胞の集団、または請求項１９に記載の医薬組成物。
  22. 抗ＣＤ２７６結合性部分およびＴ細胞シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
    前記抗ＣＤ２７６結合性部分は、３つのＣＤＲを含む重鎖の可変領域および３つのＣＤＲを含む軽鎖の可変領域を含み、
    前記重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１１であり、前記重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１２であり、前記重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１３であり、
    前記軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１４であり、前記軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１５であり、かつ前記軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１６である、
    ＣＡＲ。
  23. 前記重鎖の可変領域および前記軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１７および１８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のＣＡＲ。
  24. リンカーをさらに含む、請求項２２または２３に記載のＣＡＲ。
  25. 前記リンカーが配列番号９または１０を含む、請求項２４に記載のＣＡＲ。
  26. 前記抗ＣＤ２７６結合性部分は、抗体、Ｆａｂ断片（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ’） ２ 断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、またはジスルフィドで安定化された可変領域断片（ｄｓＦｖ）である、請求項２２から２５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  27. 前記抗ＣＤ２７６結合性部分は、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）である、請求項２２から２５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  28. 免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む、請求項２２から２７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  29. 前記免疫グロブリン定常ドメインが、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ１）ドメイン配列（ＣＨ２ＣＨ３）を含む、請求項２８に記載のＣＡＲ。
  30. 前記免疫グロブリン定常ドメインが、配列番号４５を含む、請求項２８に記載のＣＡＲ。
  31. ＣＤ８および／またはＣＤ２８の配列を含む膜貫通ドメインをさらに含む、請求項２２から２８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  32. 配列番号２９を含むＣＤ８アミノ酸配列、配列番号３０を含むＣＤ２８アミノ酸配列、および配列番号３１を含むＣＤ８アミノ酸配列のうちの１つまたは複数を含む膜貫通ドメインをさらに含む、請求項２２から３０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  33. 前記細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７およびＣＤ３ゼータ（ζ）のうちの１つまたは複数からの配列を含む、請求項２２から３２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  34. 前記細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、配列番号３２および／または配列番号３５を含むＣＤ２８アミノ酸配列、配列番号３３および／または配列番号３７を含むＣＤ１３７アミノ酸配列、および配列番号３４、３６および３８のうちのいずれか１つまたは複数を含むＣＤ３ゼータアミノ酸配列を含む、請求項２２から３２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  35. 請求項２２から３４のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
  36. それぞれ配列番号５３および５４に示される、前記重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列および前記軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３５に記載の核酸。
  37. 請求項３５または３６に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
  38. 請求項３７に記載の組換え発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
  39. 請求項３８に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団。
  40. 請求項２２から３４のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項３５または３６に記載の核酸、請求項３７に記載の組換え発現ベクター、請求項３８に記載の単離された宿主細胞、または請求項３９に記載の細胞の集団、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  41. （ａ）がんを治療もしくは予防するかまたは（ｂ）腫瘍血管系を低減するためのキットであって、前記キットは、請求項２２から３４のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項３５または３６に記載の核酸、請求項３７に記載の組換え発現ベクター、請求項３８に記載の単離された宿主細胞、請求項３９に記載の細胞の集団、または請求項４０に記載の医薬組成物を含む、キット。
  42. 哺乳動物における（ａ）がんの治療もしくは予防または（ｂ）腫瘍血管系の低減において使用するための、請求項２２から３４のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項３５または３６に記載の核酸、請求項３７に記載の組換え発現ベクター、請求項３８に記載の単離された宿主細胞、請求項３９に記載の細胞の集団、または請求項４０に記載の医薬組成物。
  43. 抗ＣＤ２７６結合性部分およびＴ細胞シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
    前記抗ＣＤ２７６結合性部分は、３つのＣＤＲを含む重鎖の可変領域および３つのＣＤＲを含む軽鎖の可変領域を含み、
    前記重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号２０であり、前記重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２１であり、前記重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２２であり、
    前記軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号２３であり、前記軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２４であり、かつ前記軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２５である、
    ＣＡＲ。
  44. 前記重鎖の可変領域および前記軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号２６および２７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載のＣＡＲ。
  45. リンカーをさらに含む、請求項４３または４４に記載のＣＡＲ。
  46. 前記リンカーが配列番号９または１０を含む、請求項４５に記載のＣＡＲ。
  47. 前記抗ＣＤ２７６結合性部分は、抗体、Ｆａｂ断片（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ’） ２ 断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、またはジスルフィドで安定化された可変領域断片（ｄｓＦｖ）である、請求項４３から４６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  48. 前記抗ＣＤ２７６結合性部分は、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）である、請求項４３から４６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  49. 免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む、請求項４３から４８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  50. 前記免疫グロブリン定常ドメインが、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ１）ドメイン配列（ＣＨ２ＣＨ３）を含む、請求項４９に記載のＣＡＲ。
  51. 前記免疫グロブリン定常ドメインが、配列番号４５を含む、請求項４９に記載のＣＡＲ。
  52. ＣＤ８および／またはＣＤ２８の配列を含む膜貫通ドメインをさらに含む、請求項４３から５１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  53. 配列番号２９を含むＣＤ８アミノ酸配列、配列番号３０を含むＣＤ２８アミノ酸配列、および配列番号３１を含むＣＤ８アミノ酸配列のうちの１つまたは複数を含む膜貫通ドメインをさらに含む、請求項４３から５１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  54. 前記細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７およびＣＤ３ゼータ（ζ）のうちの１つまたは複数からの配列を含む、請求項４３から５３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  55. 前記細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、配列番号３２および／または配列番号３５を含むＣＤ２８アミノ酸配列、配列番号３３および／または配列番号３７を含むＣＤ１３７アミノ酸配列、および配列番号３４、３６および３８のうちのいずれか１つまたは複数を含むＣＤ３ゼータアミノ酸配列を含む、請求項４３から５３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  56. 請求項４３から５５のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
  57. それぞれ配列番号５３および５４に示される、前記重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列および前記軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項５６に記載の核酸。
  58. 請求項５６または５７に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
  59. 請求項５８に記載の組換え発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
  60. 請求項５９に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団。
  61. 請求項４３から５５のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項５６または５７に記載の核酸、請求項５８に記載の組換え発現ベクター、請求項５９に記載の単離された宿主細胞、または請求項６０に記載の細胞の集団、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  62. （ａ）がんを治療もしくは予防するかまたは（ｂ）腫瘍血管系を低減するためのキットであって、前記キットは、請求項４３から５５のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項５６または５７に記載の核酸、請求項５８に記載の組換え発現ベクター、請求項５９に記載の単離された宿主細胞、請求項６０に記載の細胞の集団、または請求項６１に記載の医薬組成物を含む、キット。
  63. 哺乳動物における（ａ）がんの治療もしくは予防または（ｂ）腫瘍血管系の低減において使用するための、請求項４３から５５のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項５６または５７に記載の核酸、請求項５８に記載の組換え発現ベクター、請求項５９に記載の単離された宿主細胞、請求項６０に記載の細胞の集団、または請求項６１に記載の医薬組成物。
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