ES2342929T3 - Anticuerpos anti-cd22 con afinidad aumentada por las celulas leucemicas que expresan cd22. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-CD22 con una cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia de la cadena VL del anticuerpo RFB4 de la Figura 1 y una cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia de la cadena VH del anticuerpo RFB4 de la Figura 1, siempre que los restos SSY de las posiciones 104, 105 y 106 de CDR3 de la cadena VH de dicho anticuerpo anti-CD22 sean remplazados por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en THW, YNW, TTW y STY.

Description

Anticuerpos anti-CD22 con afinidad aumentada por las células leucémicas que expresan CD22.

Antecedentes de la invención

Las malignidades hematológicas son un grave problema de salud pública. Se ha estimado que en el año 2000, se produjeron más de 50.000 nuevos casos de linfoma no Hodgkin y más de 30.000 nuevos casos de leucemia en los Estados Unidos (Greenlee, R.T. et al., CA Cancer J. Clin., 50:7-33 (2000)) y se esperaban más de 45.000 muertes por estas enfermedades. Muchos más pacientes viven con una morbidez relacionada con enfermedades crónicas. Desafortunadamente, en un elevado porcentaje de pacientes, las terapias convencionales no son capaces de inducir remisiones completas a largo plazo.

En los últimos años se han desarrollado inmunotoxinas como enfoque terapéutico alternativo para tratar estas malignidades. Las inmunotoxinas estaban compuestas originalmente por un anticuerpo conjugado químicamente con una toxina vegetal o bacteriana. El anticuerpo se une al antígeno expresado en la célula diana y la toxina es internalizada ocasionando la muerte celular al detener la síntesis de proteínas e inducir la apoptosis (Brinkmann, U., Mol. Med. Today, 2:439-446 (1996)).

Las malignidades hematológicas son una diana atractiva para las terapias con inmunotoxinas ya que las células tumorales son fácilmente accesibles y tos antígenos diana son altamente expresados (Kreitman, R.J. y Pastan, I., Semin. Cancer. Biol., 6:297-306 (1995)). Uno de estos antígenos es CD25. Una prueba clínica con la inmunotoxina LMB-2 (anti-Tac(Fv)-PE38) que se dirige a CD25 demostró que el agente era bien tolerado y que tenía una actividad anti-tumoral sustancial (Kreitman, R.J. et al., Blood, 94:3340-3348 (1999); Kreitman, R.J. et al., J. Clin. Oncol. 18:16222- 1636 (2000)). Se observó una respuesta completa en un paciente con Leucemia de Células Pilosas y se observaron respuestas parciales en pacientes con Leucemia de Células Pilosas, leucemia linfocítica crónica, linfoma cutáneo de células T, enfermedad de Hodgkin y leucemia de células T adultas.

Otro antígeno que se ha utilizado como diana de inmunotoxinas es CD22, un antígeno de células B restringido por el linaje expresado en 60%-70% de los linfomas y leucemias de células B. CD22 no está presente sobre la superficie celular en las fases tempranas de desarrollo de las células B y no es expresado sobre las células pluripotenciales (Tedder, T.F. et al., Annu. Rev. Immunol, 5:481-504 (1997)). Se han llevado a cabo pruebas clínicas con una inmunotoxina que contiene un anticuerpo anti- CD22, RFB4, o su fragmento Fab, acoplado a ricina A desglicosilada. En estas pruebas se han observado respuestas clínicas sustanciales; no obstante, el síndrome de extravasación capilar, grave y en algunos casos fatal, resultó limitante de la dosis (Sausvilie, E.A. et al., Blood, 85:3457-3465 (1995); Amlot, P.L et al., Blood, 82:2624-2633 (1993); Vitetta, E.S, et al., Cancer Res., 51:4052-4058 (1991)).

Como enfoque alternativo, se utilizó el anticuerpo RFB4 para elaborar una inmunotoxina recombinante en la cual el fragmento Fv en forma de cadena sencilla se fusiona con una forma truncada de 38 kDa de la exotoxina A de Pseudomonas (PE38). PE38 contiene los dominios de translocación y de ribosilación del ADP de PE pero no la porción de unión a la célula (Hwuang, J. et al., Cell, 48:129-136 (1987)). RFB4 (Fv)-PE38 es citotóxico para las células CD22 positivas (Mansfield, E. et al., Biochem. Soc. Trans., 25:709-714 (1997)). Para estabilizar la inmunotoxina Fv de cadena sencilla y hacerla más adecuada para su desarrollo clínico, se diseñaron restos cisteína en regiones marco de V_{H} y V_{L} (Mansfield, E. et al., Blood, 90:2020-2026 (1997)) generando la molécula RFB4(dsFv)-PE38.

RFB4 (dsFv)-PE38 es capaz de eliminar las células leucémicas de pacientes e inducir remisiones completas en ratones que portan xenoinjertos de linfomas (Kretiman, R.J. et al., Clin. Cancer Res., 6:1476-1487 (2000); Kreitman, RJ. et al., Int. J. Cancer, 81:148-155 (1999)). RFB4 (dsFv)-PE38 (BL22) está siendo evaluado actualmente en un ensayo clínico en fase I en el Instituto Nacional del Cancer en pacientes con malignidades hematológicas. Se trataron dieciséis pacientes con leucemia de células pilosas resistente a análogos de purina con BL22 y 11 (86%) alcanzaron remisiones completas (Kreitman, R.J. et al., N. Engl. J. Med. (2001).

Debido a los beneficios clínicos obtenidos con BL22, y debido a que se ha demostrado que la mejora de la afinidad de unión mejora la liberación selectiva en el tumor de los scFv (Adams et al., Cancer Res. 58:485-490 (1998)), la mejora de la afinidad de unión de los scFv y otras fracciones localizadoras (tales como dsFv, Fab, y F(ab')_{2}) de los productos inmunoconjugados pudo mejorar la eficacia de estos agentes al liberar moléculas efectoras para las células B malignas. El direccionamiento mejorado disminuye probablemente la dosis necesaria para lograr la remisión completa de estos cánceres.

Los factores que influyen en la afinidad de unión son afectados de manera múltiple y la obtención de scFv mutantes con una afinidad mejorada no es trivial. Aunque la estructura cristalina del anticuerpo-antígeno puede sugerir qué restos están implicados en la unión, los datos estructurales de la resolución atómica no se encuentran disponibles para la mayoría de los anticuerpos. Por otra parte, incluso cuando tales datos están disponibles generalmente no se puede predecir qué restos y qué mutaciones darán como resultado un anticuerpo con un incremento de la actividad de unión al antígeno.

Breve resumen de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos mejorados para la unión a células que expresan CD22 (una "célula CD22+"), especialmente células cancerosas que expresan CD22 sobre su superficie exterior (una "célula cancerosa CD22+"). Con respecto a esto, la invención proporciona anticuerpos anti-CD22 con una cadena ligera variable (V_{L}) que tiene la secuencia del anticuerpo RFB4 de la Figura 1 y una cadena pesada variable (V_{H}) que tiene la secuencia de un anticuerpo RFB4 de ta Figura 1, pero en los que los restos 100, 100A y 100B de CDR3 de dicha cadena VH enumerada por el sistema de numeración de Kabat y Wu (restos 104, 105 y 106 como se numera de acuerdo con la Figura 1) tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: THW, YNW, TTW, y STY. El anticuerpo puede ser una molécula de anticuerpo completa, pero es preferiblemente un Fv de cadena sencilla ("scFv"), un Fv estabilizado con disulfuro ("dsFv"), un Fab, o un F(ab'). En una forma particularmente preferida, el anticuerpo es dsFv. (Por conveniencia para la referencia, el término "anticuerpo" del texto de más abajo hace referencia a anticuerpos completos y, más preferiblemente, a scFv, dsFv, Fab, o F(ab')).

La invención proporciona adicionalmente composiciones que comprenden uno de estos anticuerpos conjugado o fusionado con un radical terapéutico o una marca detectable. El radical terapéutico puede ser una citotoxina, un fármaco, un radioisótopo, o un liposoma cargado con un fármaco o una citotoxina. En las realizaciones preferidas, el radical efector es una citotoxina. La citotoxina puede ser seleccionada del grupo que consiste en ricina A, abrina, ribotoxina, ribonucleasa, saporina, caliqueamicina, toxina de la difteria o una subunidad citotóxica o uno de sus mutantes, una exotoxina de Pseudomonas, o una de sus porciones citotóxicas, una exotoxina de Pseudomonas mutada, una de sus porciones citotóxicas, y toxinas A a F de botulinum. En las formas preferidas, la citotoxina es una exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos citotóxicos, o una exotoxina de Pseudomonas mutada o uno de sus fragmentos citotóxicos. En formas particularmente preferidas, la exotoxina de Pseudomonas se selecciona del grupo que consiste en PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E, y PE38QQR. En la realización más preferida, la exotoxina de Pseudomonas es PE38. Las composiciones pueden comprender adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona adicionalmente el uso de un anticuerpo anti-CD22 de la invención como se ha descrito antes, para la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa CD22+. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo completo, un scFv, dsFv, Fab, o F(ab')_{2}. En una forma particularmente preferida, el anticuerpo es un dsFv. La invención proporciona adicionalmente el uso de una composición para la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa CD22+, cuya composición comprende un anticuerpo como se acaba de describir conjugado o fusionado con un radical terapéutico o una marca detectable. El radical terapéutico puede ser por ejemplo, una citotoxina, un fármaco, un radioisótopo, o un liposoma cargado con un fármaco o una citotoxina. En las formas preferidas, el radical terapéutico es una citotoxina. La citotoxina se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en ricina A, abrina, ribotoxina, ribonucleasa, saporina, caliqueamicina, toxina de la difteria o una de sus subunidades citotóxicas o uno de sus mutantes, una exotoxina de Pseudomonas, una de sus porciones citotóxicas, una exotoxina de Pseudomonas mutada, una de sus porciones citotóxicas, y toxinas A a F de botulinum. En los usos preferidos, la citotoxina es una exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos citotóxicos, o una exotoxina de Pseudomonas mutada o uno de sus fragmentos citotóxicos y, en los usos particularmente preferidos, se selecciona del grupo que consiste en PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E, y PE38QQR, siendo la más preferida PE38.

En otro grupo de realizaciones, la invención proporciona los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos anti-CD22 de la invención descritos antes. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo completo, o se puede seleccionar del grupo que consiste en un scFv, un dsFv, un Fab, o un F(ab')_{2}. En las formas particularmente preferidas, el anticuerpo es un dsFv. El ácido nucleico puede codificar adicionaímente un polipéptido que es un radical terapéutico o una marca detectable. El radical terapéutico puede ser un fármaco o una citotoxina. La citotoxina puede ser, por ejemplo, una exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos citotóxicos, o una exotoxina de Pseudomonas mutada o uno de sus fragmentos citotóxicos y se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR. En la forma más preferida, la exotoxina de Pseudomonas es PE38. La invención proporciona adicionalmente vectores de expresión que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos descritos antes conectado operablemente a un promotor.

En otro grupo más de realizaciones, la invención proporciona el anticuerpo anti- 0022 de la invención para su uso en un método de inhibición del crecimiento de una célula cancerosa CD22+. Los métodos pueden comprender poner en contacto la célula con el anticuerpo anti-CD22 fusionado o conjugado con un radical terapéutico, cuyo radical terapéutico inhibe el crecimiento de dicha célula. El anticuerpo puede ser un scFv, un dsFv, un Fab, o un F(ab')_{2}. En una forma particularmente preferida, el anticuerpo es un dsFv. El anticuerpo terapéutico puede ser, por ejemplo, una citotoxina, un fármaco, un radioisótopo, o un liposoma cargado con un fármaco o una citotoxina. En las formas preferidas, el radical terapéutico es una citotoxina. La citotoxina puede ser, por ejemplo, ricina A, abrina, ribotoxina, ribonucleasa, saporina, caliqueamicina, toxina de la difteria o una de sus subunidades o mutantes citotóxicos, una exotoxina, de Pseudomonas, una de sus porciones citotóxicas, una exotoxina de Pseudomonas mutada, una de sus porciones citotóxicas, y las toxinas A a F de botulinum. En las formas preferidas, la citotoxina es una exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos citotóxicos, o una exotoxina de Pseudomonas mutada o uno de sus fragmentos citotóxicos. En realizaciones particularmente preferidas, la exotoxina de Pseudomonas se selecciona del grupo que consiste en PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E, y PE38QQR. En la realización más preferida, la exotoxina de Pseudomonas es PE38.

La invención proporciona adicionalmente métodos para detectar la presencia de una célula cancerosa CD22+ en una muestra biológica, comprendiendo dicho método poner en contacto las células de dicha muestra biológica con un anticuerpo anti-CD22 de la invención, estando fusionado o conjugado dicho anticuerpo con una marca detectable; y detectando la presencia o ausencia de dicha marca, donde la detección de la presencia de dicha marca indica la presencia de una célula cancerosa CD22+ en dicha muestra. El anticuerpo puede ser seleccionado, por ejemplo, del grupo que consiste en un scFv, un dsFv, un Fab, o un F(ab')_{2}. En una forma particularmente preferida, el anticuerpo es un dsFv.

En otro grupo de realizaciones, la invención proporciona kits para detectar la presencia de una célula cancerosa CD22+ en una muestra biológica, comprendiendo dicho kit un recipiente, y un anticuerpo anti-CD22 de la invención, cuyo anticuerpo está fusionado o conjugado con una marca detectable. En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un scFv, un dsFv, un Fab, o un F(ab')_{2}.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) y la secuencia de aminoácidos (SEG ID NO: 4) de la región variable de la cadena ligera de RFB4 y la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de la región variable de la cadena pesada de RFB4.

La Figura 2 es un impreso del Número de Entrada 038145 de la base de datos Kabat que muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de la región variable de la cadena ligera de RFB4 y la numeración de las posiciones de Kabat correspondiente a cada residuo aminoácido.

La Figura 3 es un impreso del Número de Entrada 038146 de la base de datos Kabat que muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de la región variable de la cadena pesada de RFB4 y la numeración de las posiciones de Kabat correspondiente a cada residuo aminoácido.

Descripción detallada de la invención Introducción

La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que tienen una afinidad de unión incrementada para las células cancerosas que portan el antígeno CD22 en comparación con el anticuerpo anti-CD22 conocido en la técnica como RFB4. Se han descubierto y aislado scFv mutados que tienen incrementos en la afinidad de 3,5 a 15 veces la afinidad del RFB4 de tipo salvaje. Las inmunotoxinas elaboradas con estas variantes de afinidad elevada presentaban un incremento significativo de la actividad citotóxica en comparación con una inmunoglobulina similar elaborada con RFB4 de tipo salvaje.

Estos mutantes cambian la secuencia de aminoácidos de los restos de las posiciones 100, 100A, y 100B de CDR3 de la cadena V_{H} de RFB4 de la secuencia de tipo salvaje SSY a THW, YNW, o STY. Un único cambio de aminoácido, por ejemplo, la diferencia de un aminoácido entre la secuencia SSY y STY, redujo la constante de disociación (KD) de una inmunotoxina quimérica elaborada con el scFv resultante a 49 kD, en comparación con los 85 kD de una inmunotoxina similar utilizando la secuencia del anticuerpo RFB4 parental. Un cambio de SSY a TTW disminuyó la kD de la inmunotoxina resultante a 24 kD. Incluso más impresionantemente, la mutación de los restos SSY a YNW mejoró la afinidad de la inmunotoxina resultante de 85 kD de la inmunotoxina empleando el anticuerpo RFB4 de tipo salvaje, parental a 10 kD. Y la sustitución de THW por la secuencia de tipo salvaje SSY mejoró la afinidad incluso más, hasta 6 kD.

Estas afinidades mejoradas se reflejan en una mejor actividad citotóxica de las inmunotoxinas elaboradas fusionando o conjugando los anticuerpos o sus fragmentos que conservan la capacidad de reconocimiento del antígeno con una citotoxina. Por ejemplo, los ensayos de una inmunotoxina ilustrativa elaborada a partir de la combinación de un scFv que tiene una secuencia CDR3 de VH de RFB4, en la cual SSY se había mutado a STY, con una citotoxina demostró que la cantidad de inmunotoxina necesaria para inhibir 50% de la síntesis de proteínas (conocida como la CI_{50} de la inmunotoxina) en células cancerosas que expresan CD22 de pacientes se reducía tanto como 7 veces en comparación con una inmunotoxina similar elaborada con la secuencia SSY de tipo salvaje. Ensayos similares realizados con una inmunotoxina elaborada con la secuencia THW demostraron que la secuencia THW incrementaba la actividad citotóxica de la inmunotoxina para las células de la leucemia linfocítica crónica cancerosa que porta CD22 50 veces. También se elaboró una inmunotoxina con un dsFv que tenía la secuencia THW y se sometió a ensayo en busca de citotoxicidad frente a células de pacientes que tenían leucemia linfocítica crónica (CLL) o leucemia de células pilosas (HCL). La inmunotoxina dsFv THW mostró una citotoxicidad 10 a 40 veces mayor contra las células de CLL de lo que lo hizo la inmunotoxina dsFv RFB4 de tipo salvaje, y una citotoxicidad 4 a 7 veces mayor contra las células de HCL que la inmunotoxina dsFv RFB4 de tipo salvaje.

La mejora de la afinidad del anticuerpo y los fragmentos de anticuerpo mejorados proporcionados por la presente invención se puede incorporar a productos inmunoconjugados quiméricos para mejorar la capacidad del producto inmunoconjugado quimérico para localizar las células B diana que portan el antígeno CD22. Los productos inmunoconjugados pueden llevar, por ejemplo, una marca detectable tal como un radioisótopo o una enzima informadora. Estos productos inmunoconjugados marcados se utilizan, por ejemplo, en análisis in vitro para detectar la presencia de células que expresan CD22 en una muestra biológica. Típicamente, la muestra biológica será una muestra de sangre o linfocitos de una muestra de sangre.

En otro grupo de usos in vitro, el producto inmunoconjugado lleva una citotoxina en lugar de una marca detectable. Tales inmunotoxinas se pueden utilizar para purgar una muestra de sangre o cultivo de linfocitos de un paciente. La muestra o cultivo purgados se pueden volver a administrar después al paciente para reforzar la población de glóbulos blancos funcionales.

En las utilizaciones in vivo, se pueden emplear las inmunotoxinas elaboradas con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención para inhibir el crecimiento y la proliferación de las células cancerosas que portan el antígeno CD22. Como se observa en la sección de Antecedentes, una inmunotoxina elaborada con el anticuerpo parental RFB4, se encuentra actualmente en pruebas clínicas en seres humanos y, cuando se somete a ensayo frente a un cáncer de expresa CD22 ilustrativo, ocasiona remisiones completas en 86% de los pacientes. La mayor afinidad de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención en comparación con el anticuerpo parental, RFB4, y la mayor citotoxicidad de las inmunotoxinas resultantes significa que se pueden administrar cantidades más pequeñas de las inmunotoxinas, logrando de ese modo el mismo efecto terapéutico a la vez que se reduce la oportunidad de efectos secundarios.

En realizaciones preferidas, el anticuerpo es un scFv o un dsFv. Muchas de las inmunotoxinas recombinantes producidas a partir de constructos de scFv tienen un tercio del tamaño de los productos conjugados químicos de IgG-toxina y tienen una composición homogénea. La eliminación de la porción constante de la molécula de IgG del scFv da como resultado un aclaramiento más rápido de la inmunotoxina después de su inyección en animales, incluyendo primates, y el menor tamaño de los productos conjugados mejora la penetración del fármaco en los tumores sólidos. Juntas, estas propiedades disminuyen los efectos secundarios asociados con el radical tóxico reduciendo el tiempo en el que la inmunotoxina (IT) interacciona con los tejidos no diana y los tejidos que expresan niveles muy bajos de antígeno. La elaboración de Fv estabilizados con disulfuro (dsFv) a partir de anticuerpos anti-CD22 se comenta en la solicitud de propiedad compartida de FitzGerald et al., Publicación Internacional Número WO 98/41641.

Sin embargo, estas ventajas son compensadas hasta cierto punto por la pérdida de afinidad de unión al antígeno que se produce cuando las IgG se convierten en scFv (Reiter et al., Nature Biotechnol. 14:239-1245 (1996)). Se ha demostrado que el aumento de afinidad mejora la liberación selectiva en el tumor de los scFv (Adams et al., Cancer Res. 58:485-490 (1998)), y es probable que incremente su utilidad en la formación de imágenes y el tratamiento de tumores. Por lo tanto, el incremento de afinidad de los scFv y otras fracciones localizadoras (tales como dsFv, Fab, y F(ab')_{2}) de los productos inmunoconjugados es deseable para mejorar la eficacia de estos agentes en la liberación de moléculas efectoras, tales como toxinas y otros agentes terapéuticos, en sus dianas pretendidas. Por consiguiente la mejora de la afinidad de los anticuerpos de la invención es un importante avance en la liberación de toxinas, fármacos, y otros agentes terapéuticos para células de cánceres que expresan CD22.

En las siguientes secciones, se definen los términos utilizados en la presente memoria para una mayor claridad. La invención se describe con más detalle. Finalmente, los ejemplos demuestran la construcción y ensayo de las inmunotoxinas ilustrativas utilizando anticuerpos en los cuales STY, YNW, TTW, o THW han sustituido la secuencia SSY del anticuerpo RFB4.

Definiciones

Las unidades, prefijos, y símbolos se indican en la forma aceptada por el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique de otro modo, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi. Los encabezamientos proporcionados en la presente memoria no son limitaciones de los diferentes aspectos de las realizaciones de la invención, que se pueden tomar como referencia para la memoria en su totalidad. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente más abajo se definen más completamente mediante la referencia a la memoria en su totalidad.

"CD22" hace referencia a un antígeno de las células B restringido por el linaje perteneciente a la superfamilia de las Ig. Es expresado en 60-70% de los linfomas y leucemias de las células B y no está presente sobre la superficie celular en las fases tempranas del desarrollo de las células B o sobre las células pluripotenciales. Véase, p. ej., Vaickus et al., Crit. Rev. Oncol/Hematol. 11:267-297 (1991).

Según se utiliza en la presente memoria, el término "anti-CD22" en referencia a un anticuerpo, hace referencia a un anticuerpo que se une específicamente a CD22 e incluye la referencia a un anticuerpo que se genera contra CD22. En las realizaciones preferidas, el CD22 es un CD22 de primate tal como CD22 humano. En una realización particularmente preferida, el anticuerpo se genera contra CD22 humano sintetizado por un mamífero no primate después de la introducción en el animal de un ADNc que codifica CD22 humano.

"RFB4" hace referencia a un anticuerpo monoclonal IgG1 de ratón que se une específicamente a CD22 humano. RFB4 es asequible comercialmente con el nombre RFB4 de diferentes fuentes, tales como Southern Biotechnology Associates, Inc. (Birmingham AL; Núm. de Cat. 9360-01) y Autogen Bioclear UK Ltd. (Clane, Wilts, Reino Unido; Núm. de Cat. AB147). RFB4 es altamente específico para las células de linaje B y no presenta reactividad cruzada con otros tipos de células normales. Li et al., Ceit. Immunol. 118:85-99 (1989). Las cadenas pesada y ligera de RFB4 han sido clonadas. Véase, Mansfield et al., Blood 90:2020-2026 (1997). La secuencia de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de RFB4 son el SEQ ID NO: 1 y el SEQ ID NO: 2, respectivamente. La secuencia de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de RFB4 son el SEQ ID NO: 3 y el SEQ ID NO: 4, respectivamente. Las secuencias se exponen en la Figura 1.

A menos que se indique de otro modo, las referencias de la presente memoria a posiciones de aminoácidos de la cadena pesada o ligera de RFB4 hacen referencia a la numeración de aminoácidos en el sistema de "Kabat y Wu". Véase, Kabat, E., et al., SEGUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, U.S. Government Printing Office, NIH Publication Núm. 91-3242 (1991). Se debe observar que el número asignado a un resto en el sistema de Kabat y Wu no corresponde necesariamente al número que se podría obtener para un resto en una cadena pesada o ligera dadas contando desde el extremo amino de esa cadena. Las Figuras 2 y 3 muestran la correlación entre la numeración sucesiva de los restos de las cadenas ligera y pesada de RFB4 y la numeración de Kabat y Wu de esos restos. Por conveniencia, la numeración de "Kabat y Wu" es referida a veces en la presente memoria como numeración de "Kabat".

Según se utiliza en la presente memoria, "anticuerpo" incluye la referencia a una molécula de inmunoglobulina inmunológicamente reactiva con un antígeno concreto, e incluye anticuerpos tanto policlonales como monoclonales. El término también incluye formas diseñadas genéticamente tales como anticuerpos quiméricos (p. ej., anticuerpos murinos humanizados), anticuerpos heteroconjugados (p. ej., anticuerpos biespecíficos), fragmentos Fv de cadena sencilla recombinante (scFv), y fragmentos Fv estabilizados por disulfuro (dsFv) (véase, la Patente de los Estados Unidos Núm. del mismo propietario Núm. 5.747.654). El término "anticuerpo" también incluye formas de unión al antígeno de los anticuerpos (p. ej., Fab', F(ab')_{2}, Fab, Fv y rlgG. Véase también, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Goldsby et al., eds., Kuby, J., Immunology, 4ª Ed., W.H. Freeman & Co., Nueva York (2000).

Se puede generar un anticuerpo inmunológicamente reactivo con un antígeno concreto mediante métodos recombinantes tales como ta selección de genotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares, véase, p. ej., Huse, et al., Science 246:1275-1281 (1989); Ward, et al., Nature 341:544-546 (1989); y Vaughan, et al., Nature Biotech. 14:309-314 (1996), o inmunizando un animal con el antígeno o con el ADN que codifica el antígeno.

Típicamente, una inmunoglobulina tiene una cadena pesada y una cadena ligera. Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable, (las regiones también son conocidas como "dominio"). Las regiones variables de la cadena ligera y pesada contienen una región "marco" interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". La extensión de la región marco y de las CDR ha sido definida. Véase, Kabat y Wu, más arriba. Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de las especies. La región marco de un anticuerpo, que son las regiones marco combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para situar y alinear las CDR en el espacio tridimensional.

Las CDR son responsables principalmente de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena son referidas típicamente como CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas sucesivamente partiendo del extremo N, y también son identificadas típicamente por la cadena en la cual está localizada la CDR concreta. De este modo, una CDR3 de V_{H} está localizada en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el cual se encuentra, mientras una CDR1 de V_{L} es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el cual se encuentra.

Las referencias a "V_{H}" o una "VH" se refieren a ta región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo un Fv, scFv, dsFv o Fab. Las referencias a "V_{L}" o una "VL" se refieren a la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, incluyendo Fv, scFv, dsFv o Fab.

La expresión "F_{v} de cadena sencilla" o "scFv" hace referencia a un anticuerpo en el que los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de un anticuerpo bicatenario tradicional se han unido para formar una cadena. Típicamente, se inserta un péptido conector entre las dos cadenas para permitir el plegamiento apropiado y la creación de un sitio de unión activo.

El término "péptido conector" incluye la referencia a un péptido dentro de un fragmento de unión al anticuerpo (p. ej., fragmento Fv) que sirve para unir directamente el dominio variable de la cadena pesada al dominio variable de la cadena ligera.

El término "anticuerpo parental" representa cualquier anticuerpo de interés que vaya a ser mutado o variado para obtener anticuerpos o sus fragmentos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo parental, pero con una afinidad mayor.

El término "punto de hipermutabilidad" representa una porción de una secuencia de nucleótidos de una CDR o de una región marco de un dominio variable que es un sitio de variación natural particularmente elevada. Aunque las CDR se consideran en sí mismas regiones de hipervariabilidad, se ha aprendido que las mutaciones no están uniformemente distribuidas a lo largo de todas las CDR. Se han identificado sitios concretos o puntos de hipermutabilidad, como las localizaciones que experimentan mutaciones concentradas. Los puntos de hipermutabilidad se caracterizan por numerosos rasgos estructurales y secuencias. Estos "motivos de puntos de hipermutabilidad" se pueden utilizar para identificar puntos de hipermutabilidad. Dos motivos de secuencias consenso que están especialmente bien caracterizados son la secuencia de tetranucleótidos RGYW y la secuencia de serina AGY, donde R es A o G, Y es C o T, y W es A o T.

Una "fracción localizadora" es la porción de un producto inmunoconjugado destinada a dirigir el producto inmunoconjugado a una célula de interés. Típicamente, la fracción localizadora es un anticuerpo, un scFv, un dsFv, un Fab, o un F(ab')_{2}.

Un "radical tóxico" es la porción de una inmunotoxina que convierte la inmunotoxina en citotóxica para las células de interés.

Un "radical terapéutico" es la porción de un producto inmunoconjugado que se pretende que actúe como agente terapéutico.

El término "agente terapéutico" incluye cualquiera de Sos numerosos compuestos conocidos actualmente o desarrollados más tarde para actuar como anti- neoplásicos, anti-inflamatorios, citoquinas, anti-infecciosos, activadores o inhibidores enzimáticos, modificadores alostéricos, antibióticos u otros agentes administrados para inducir un efecto terapéutico deseado en un paciente. El agente terapéutico también puede ser una toxina o un radioisótopo, cuando el efecto terapéutico deseado es, por ejemplo, la eliminación de una célula cancerosa.

Una "marca detectable" representa, con respecto a un producto inmunoconjugado, una porción del producto inmunoconjugado que tiene la propiedad de hacer detectable su presencia. Por ejemplo, el producto inmunoconjugado puede estar marcado con un isótopo radiactivo que permite que las células en las cuales está presente et producto inmunoconjugado sean detectadas en análisis inmunohistoquímicos.

El término "radical efector" representa la porción de un producto inmunoconjugado destinado a tener efecto sobre una célula elegida como diana por la fracción localizadora o para identificar la presencia del producto inmunoconjugado. De este modo, el radical efector puede ser, por ejemplo, un radical terapéutico, una toxina, una radiomarca, o una marca fluorescente.

El término "producto inmunoconjugado" incluye la referencia a una conexión covalente de una molécula efectora a un anticuerpo. La molécula efectora puede ser una inmunotoxina.

Los términos "cantidad eficaz" o "cantidad eficaz para" o "cantidad terapéuticamente eficaz" incluyen la referencia a una dosificación de un agente terapéutico suficiente para producir el resultado deseado, tal como la inhibición de la síntesis de proteínas celular en al menos 50%, o la eliminación de la célula.

El término "toxina" incluye la referencia a abrina, ricina, exotoxina de Pseudomonas (PE), toxina de la difteria (DT), toxina de botulinum, o sus toxinas modificadas. Por ejemplo, PE y DT son compuestos muy tóxicos que ocasionan típicamente la muerte por toxicidad hepática. Sin embargo, PE y DT, pueden ser modificadas a una forma para su uso como inmunotoxina eliminando el componente dirigido nativo de la toxina (p. ej., el dominio la de PE o la cadena B de DT) y remplazándolo por una fracción localizadora diferente, tal como un anticuerpo.

El término "poner en contacto" incluye la referencia a la colocación en asociación física directa.

Un "plásmido de expresión" comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de interés, que está conectada operablemente a un promotor.

Según se utiliza en la presente memoria, "polipéptido", "péptido", y "proteína" se utilizan indistintamente e incluyen la referencia a un polímero de residuos aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos aminoácido son análogos químicos artificiales de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural. Los términos se aplican a polímeros que contienen sustituciones de aminoácidos conservativas de manera que la proteína sigue siendo funcional.

El término "resto" o "residuo aminoácido" o "aminoácido" incluye referencias a un aminoácido que es incorporado a una proteína, polipéptido, o péptido (en conjunto "péptido"). El aminoácido puede ser un aminoácido de origen natural y, a menos que se limite de otro modo, puede incluir análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar de una manera similar a los aminoácidos de origen natural.

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Los aminoácidos y análogos referidos en la presente memoria se describen mediante designaciones taquigráficas como sigue en la Tabla A:

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TABLA A Nomenclatura de Aminoácidos

1

Una "sustitución conservativa", cuando se describe una proteína hace referencia a un cambio en la composición de aminoácidos de la proteína que no altera sustancialmente la actividad de la proteína. De este modo, "variaciones modificadas conservativamente" de una secuencia de aminoácidos concreta hace referencia a sustituciones de aminoácidos de aquellos aminoácidos que no son críticos para la actividad de la proteína o la sustitución de aminoácidos por otros aminoácidos que tengan propiedades similares (p. ej., ácidos, alcalinos, cargados positivamente o negativamente, polares o no polares, etc.) de manera que las sustituciones de aminoácidos incluso críticos no alteran sustancialmente la actividad. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Los siguientes seis grupos de la Tabla B contienen aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:

TABLA B

2

El término "sustancialmente similar" en el contexto de un péptido indica que un péptido comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos 90%, preferiblemente al menos 95% con la secuencia de referencia a lo largo de una ventana de comparación de 10-20 aminoácidos. El porcentaje de identidad de la secuencia se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de una ventana de comparación, donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (esto es, espacios) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se encuentran bases de ácidos nucleicos o residuos aminoácido idénticos en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones de la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de la secuencia.

La expresión "enlace disulfuro" o "enlace disulfuro cisteína-cisteína" hace referencia a una interacción covalente entre dos cisteínas en las que los átomos de azufre de las cisteínas están oxidados para formar un enlace disulfuro. La energía media de enlace de un enlace disulfuro es de aproximadamente 60 kcal/mol en comparación con 1-2 kcal/mol de un enlace de hidrógeno. En el contexto de esta invención, las cisteínas que forman el enlace disulfuro están en las regiones marco del anticuerpo de cadena sencilla y sirven para estabilizar la conformación del anticuerpo.

Los términos "conjugar", "acoplar", "unir" o "conectar" hacen referencia a convertir dos polipéptidos en una molécula de polipéptidos contiguos. En el contexto de la presente invención, los términos incluyen la referencia al acoplamiento de un radical de anticuerpo a una molécula efectora (ME). La conexión puede ser mediante medios químicos o recombinantes. Los medios químicos hacen referencia a una reacción entre el radical de anticuerpo y la molécula efectora de manera que se forma un enlace covalente entre las dos moléculas para formar una molécula.

Según se utiliza en la presente memoria, "recombinante" incluye la referencia a una proteína producida utilizando células que no tienen, en su estado nativo, una copia endógena del ADN capaz de expresar la proteína. Las células producen la proteína recombinante porque han sido alteradas genéticamente mediante la introducción de la secuencia aislada de ácido nucleico apropiada. El término también incluye la referencia a una célula, o ácido nucleico, o vector, que ha sido modificado por la introducción de un ácido nucleico heterólogo o la alteración de un ácido nucleico nativo a una forma no nativa para esa célula, o que la célula deriva de una célula modificada de ese modo. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula, expresan mutantes de genes que se encuentran en la forma nativa, o expresan genes nativos que de otro modo son expresados anormalmente, expresados a la baja o no expresados en absoluto.

Según se utiliza en la presente memoria, "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" incluye la referencia a un polímero desoxirribonucleotídico o ribonucleotídico en forma de hebra sencilla o doble, y a menos que se limite de otro modo, abarca los análogos conocidos de los nucleótidos naturales que hibridan con ácidos nucleicos de una manera similar a los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique de otro modo, una secuencia de ácido nucleico concreta incluye su secuencia complementaria así como las variantes conservativas, esto es, ácidos nucleicos presentes en posiciones tambaleantes de codones y variantes que, cuando se traducen a proteína, dan como resultado una sustitución conservativa de un aminoácido.

Según se utiliza en la presente memoria, "codificante" con respecto a un ácido nucleico especificado, incluye la referencia a ácidos nucleicos que comprenden la información para la traducción a la proteína especificada. La información es especificada por el uso de codones. Típicamente, la secuencia de aminoácidos es codificada por el ácido nucleico utilizando el código genético "universal". No obstante, se pueden utilizar variantes del código universal, tales como la que está presente en mitocondrias de algunas plantas, animales, y hongos, la bacteria Mycoplasma capricolum (Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:2306-2309 (1985), o el ciliado Macronucleus, cuando el ácido nucleico es expresado utilizando la maquinaria traduccional de estos organismos.

La expresión "fusionar en marco" hace referencia al acoplamiento de dos o más secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos de manera que la secuencia de ácido nucleico acoplada se traduce a una proteína monocatenaria que comprende las cadenas polipeptídícas originales.

Según se utiliza en la presente memoria, "expresado" incluye la referencia a la traducción de un ácido nucleico a una proteína. Las proteínas pueden ser expresadas y permanecer intracelulares, convertirse en un componente de la membrana de la superficie celular o ser secretadas a la matriz o medio extracelular.

Por "célula anfitriona" se quiere significar una célula que pueda apoyar la replicación o expresión del vector de expresión. Las células anfitrionas pueden ser células procarióticas tales como E coli, o células eucarióticas tales como células de levadura, insecto, anfibio, o mamífero.

La frase "genoteca de presentación en fagos" hace referencia a una población de bacteriófagos, cada uno de los cuales contiene un ADNc foráneo fusionado recombinantemente en marco a una proteína de la superficie. Los fagos presentan la proteína foránea codificada por el ADNc sobre su superficie. Después de la replicación en un anfitrión bacteriano, típicamente E. coli, los fagos que contienen el ADNc foráneo de interés se seleccionan por medio de la expresión de la proteína foránea sobre la superficie del fago.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, hacen referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos aminoácido o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y se alinean para una máxima correspondencia, como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual.

La expresión "esencialmente idéntico", en el contexto de los ácidos nucleicos o polipéptidos, hace referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen una identidad de nucleótidos o residuos aminoácido de al menos 60%, más preferiblemente 65%, incluso más preferiblemente 70%, aún más preferiblemente 75%, incluso más preferiblemente 80%, y muy preferiblemente 90-95%, cuando se comparan y se alinean para una correspondencia máxima, como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Preferiblemente, la identidad esencial existe a lo largo de una región de las secuencias que tiene al menos aproximadamente 50 restos de longitud, más preferiblemente a lo largo de una región de al menos aproximadamente 100 restos, y muy preferiblemente las secuencias son esencialmente idénticas a lo largo de al menos aproximadamente 150 restos. En una realización muy preferida, las secuencias son esencialmente idénticas a lo largo de toda la longitud de las regiones codificantes.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de las subsecuencias, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias calcula después el porcentaje de identidad de las secuencias para la secuencia o las secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designado.

El alineamiento óptimo de las secuencias para su comparación se puede llevar a cabo, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needlman y Wunsch, J. Mol. Biol, 48:443 (1970), mediante la búsqueda por el método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones cornputarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Soporte Lógico de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), o mediante inspección visual (véase generalmente, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley and Sons, Inc., (Suplemento de 1995) (Ausubel)).

Los ejemplos de los algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que son descritos por Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al., (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, respectivamente. El soporte lógico para realizar los análisis BLAST se encuentra disponible al público a través del Centro nacional para la Información de Biotecnología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica la identificación primero de los pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, que coinciden o satisfacen una cierta puntuación T del umbral de valor positivo alineadas con una palabra de la misma longitud de la secuencia de la base de datos. T es referido como el umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul et al., más arriba). Estos éxitos de la palabra vecina inicial actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar HSP más largas que los contengan. Los éxitos de las palabras se prolongan después en ambas direcciones a lo Sargo de cada secuencia tanto como se puede incrementar la puntuación del alineamiento cumulativo. Las puntuaciones cumulativas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación recompensa para un par de restos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para restos que no coinciden; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación cumulativa. La prolongación de los éxitos de las palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento cumulativo decae en una cantidad X desde su máximo valor alcanzado; la puntuación cumulativa tiende a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una esperanza (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).

Además de calcular el porcentaje de identidad de la secuencia, el algoritmo BLAST también realiza una análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p. ej. Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se produce por casualidad una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01, y muy preferiblemente menor de aproximadamente 0,001.

Una indicación adicional de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son esencialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico presenta reacción cruzada inmunológica con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más abajo. De este modo, un polipéptido es típicamente esencialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solamente en sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son esencialmente idénticas es que las dos moléculas hibridan entre sí en condiciones restrictivas, como se describe más abajo.

El término "in vivo" incluye la referencia al interior del cuerpo del organismo del cual se obtuvo la célula. "Ex vivo" e "in vitro" significa fuera del cuerpo del organismo del cual se obtuvo la célula.

La expresión "célula maligna" o "malignidad" hace referencia a tumores o células tumorales que son invasivas y/o capaces de sufrir metástasis, esto es, una célula cancerosa.

Según se utiliza en la presente memoria, "células de mamífero" incluye la referencia a células derivadas de mamíferos incluyendo seres humanos, ratas, ratones, cobayas, chimpancés, o macacos. Las células se pueden cultivar in vivo o in vitro.

El término "selectivamente reactivo" hace referencia, con respecto a un antígeno, a la asociación preferente de un anticuerpo, en su totalidad o en parte, con una célula o tejido que porta el antígeno y no a las células o tejidos que carecen de ese antígeno. Por supuesto, se reconoce que se puede producir un cierto grado de interacción no específica entre una molécula y una célula o tejido no diana. Sin embargo, la reactividad selectiva se puede distinguir al estar mediada por el reconocimiento específico del antígeno. Aunque los anticuerpos reactivos selectivamente se unen al antígeno, pueden hacerlo con una afinidad baja. Por otra parte, la unión específica da como resultado una asociación mucho más fuerte entre el anticuerpo y las células que portan el antígeno que entre el anticuerpo unido y las células que carecen del antígeno. La unión específica produce típicamente un incremento mayor de 2 veces, preferiblemente mayor de 5 veces, más preferiblemente mayor de 10 veces y muy preferiblemente mayor de 100 veces en la cantidad de anticuerpo unido (por unidad de tiempo) a una célula o tejido que porta CD22 en comparación con una célula o tejido que carece de CD22. La unión específica a una proteína en tales condiciones requiere un anticuerpo que sea seleccionado por su especificidad para una proteína concreta. Son apropiados para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína concreta una variedad de formatos de inmunoanálisis. Por ejemplo, los inmunoanálisis ELISA en fase sólida se utilizan rutinariamente para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Véase Harlow y Lañe, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (1988), para una descripción de formatos de inmunoanálisis y condiciones que se pueden utilizar para determinar la inmunorreactividad específica.

El término "condiciones inmunológicamente reactivas" incluye la referencia a condiciones que permiten que un anticuerpo generado para un epítopo concreto se una a ese epítopo en un grado detectablemente mayor que, y/o hasta la exclusión sustancial, de la unión a sustancialmente todos los demás epítopos. Las condiciones inmunológicamente reactivas dependen del formato de la reacción de unión al anticuerpo y típicamente son aquellas utilizadas en los protocolos de inmunoanálisis o aquellas condiciones encontradas in vivo. Véase Harlow y Lane, más arriba, para una descripción de los formatos y las condiciones de inmunoanálisis. Preferiblemente, las condiciones inmunológicamente reactivas empleadas en los métodos de la presente invención son "condiciones fisiológicas" que incluyen la referencia a las condiciones (p. ej., temperatura, osmolaridad, pH) que son típicas en el interior de un mamífero vivo o una célula de mamífero. Si bien se reconoce que algunos órganos están sujetos a condiciones extremas, el entorno intra-organismo e intracelular se encuentra en torno a pH 7 (esto es, de pH 6,0 a pH 8,0, más típicamente de pH 6,5 a pH 7,5), contiene agua como disolvente predominante, y existe a una temperatura superior a 0ºC e inferior a 50ºC. La osmolaridad se encuentra en un intervalo que apoya la viabilidad y la proliferación celular.

Numeración de restos aminoácido en las cadenas pesada y ligera de RFB4

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Las posiciones de los residuos aminoácido en una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo son referidas convenientemente en la técnica mediante numeraciones convencionales como exponen Kabat, E., et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, U.S. Government Printing Office, NIH Publication Núm. 91-3242 (1991). Véase también, Johnson, G. y Wu, T., Nuc. Acids Res. 29:205-206 (2001). La base de datos de Kabat et al. es referida típicamente en la técnica como "Kabat" o "Kabat y Wu". Se mantiene en la actualidad en línea en http://immuno.bme.nwu.edu. Las cadenas pesada y ligera de RFB4 han sido clonadas. Véase, Mansfield et al., Blood 90:2020-2026 (1997). Las secuencias de aminoácidos de las cadenas V_{L} y V_{H} de RFB4 y una lista de la numeración de Kabat de la posición de cada residuo aminoácido se exponen en la base de datos de Kabat con los Números de Entrada 038145 y 038146, respectivamente. La Figura 2 muestra la comparación de la numeración de los aminoácidos de la cadena VL de RFB4 con las correspondientes posiciones de Kabat expuestas en la Entrada de Kabat 038145; la Figura 3 muestra la misma comparación para los aminoácidos de la cadena VH de RFB4, expuestas en la Entrada de Kabat 038146.

Unión de anticuerpos e inmunoanálisis A. Afinidad de Unión de los Anticuerpos

Los anticuerpos de esta invención se unen a sus antígenos diana con una afinidad mejor que la del anticuerpo RFB4 parental. Los anticuerpos son anticuerpos anti-CD22 que se unen a un epítopo extracelular de CD22. La afinidad de unión para un antígeno diana se mide o determina típicamente mediante análisis anticuerpo- antígeno convencionales, tales como análisis competitivos, análisis de saturación, o inmunoanálisis tales como ELISA o RIA.

Tales análisis se pueden utilizar para determinar la constante de disociación del anticuerpo. La expresión "constante de disociación" hace referencia a la afinidad de un anticuerpo por un antígeno. La especificidad de unión entre un anticuerpo y un antígeno existe si la constante de disociación (K_{D} = 1/K, donde K es la constante de afinidad) del anticuerpo es < 1 \muM, preferiblemente < 100 nM, y muy preferiblemente < 0,1 nM. Las moléculas de anticuerpo tendrán típicamente una K_{D} en los intervalos inferiores. K_{D} = [Ab-Ag]/[Ab][Ag] donde [Ab] es la concentración en equilibrio del anticuerpo, [Ag] es la concentración en equilibrio del antígeno y [Ab-Ag] es la concentración en equilibrio del complejo anticuerpo-antígeno. Típicamente, las interacciones de unión entre antígeno y anticuerpo incluyen asociaciones no covalentes reversibles tales como la atracción electrostática, las fuerzas de Van der Waals y los enlaces de hidrógeno. Este método de definir la especificidad de unión se aplica a las cadenas pesadas y/o ligeras individuales, las CDR, las proteínas de fusión o los fragmentos de las cadenas pesadas y/o ligeras, que son específicos para CD22 si se unen a CD22 solo o combinado.

B. Inmunoanálisis

Los anticuerpos pueden ser detectados y/o cuantificados utilizando cualquiera de los numerosos análisis de unión inmunológica bien conocidos (véanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288; y 4.837.168). Para una revisión de los inmunoanálisis generales, véase también METHODS IN CELL BIOLOGY, VOL. 37, Asai, ed. Academic Press, Inc. Nueva York (1993); BASIC AND CLIN1CAL 1MMUNOLOGY 7ª EDICIÓN, Stites y Ter, eds. (1991). Los análisis de unión inmunológica (o inmunoanálisis) utilizan típicamente un ligando (p. ej., CD22) para unirse específicamente a, y a menudo inmovilizar, un anticuerpo. Los anticuerpos empleados en los inmunoanálisis de la presente invención se comentan con mayor detalle más arriba.

Los inmunoanálisis también utilizan a menudo un agente de mareaje para unirse específicamente y para marcar el complejo de unión formado por el ligando y el anticuerpo. El agente de mareaje puede ser a su vez uno de los radicales que comprenden el complejo anticuerpo/analito, esto es, el anticuerpo anti-CD22. Alternativamente, el agente de mareaje puede ser un tercer radical, tal como otro anticuerpo, que se une específicamente al complejo anticuerpo/proteína CD22.

En un aspecto, se contempla un análisis competitivo en el que el agente de mareaje es un segundo anticuerpo anti-CD22 que porta una marca. Los dos anticuerpos compiten después por la unión al CD22 inmovilizado. Alternativamente, en un formato no competitivo, el anticuerpo para CD22 carece de marca, pero un segundo anticuerpo específico para los anticuerpos de la especie de la cual deriva el anticuerpo anti-CD22, p. ej., murino, y que se une al anticuerpo anti-CD22, está marcado.

Otras proteínas capaces de unirse específicamente a regiones constantes de inmunoglobulina, tales como la Proteína A o la Proteína G también pueden ser utilizadas como agente de mareaje. Estas proteínas son constituyentes normales de las paredes celulares de las bacterias estreptocócicas. Muestran una fuerte reactividad no inmunogénica con las regiones constantes de las inmunoglobulinas de una variedad de especies (véase, generalmente Kronval, et al., J. Immunol. 111:1401-1406 (1973); y Akerstrom, et al., J. Immunol. 135:2589-2542 (1985)).

En los análisis, se pueden requerir etapas de incubación y/o lavado después de cada combinación de reactivos. Las etapas de incubación pueden variar de aproximadamente 5 segundos a varias horas, preferiblemente de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. No obstante, el tiempo de incubación dependerá del formato de análisis, el anticuerpo, el volumen de solución, las concentraciones, y similares. Normalmente, los análisis se llevarán a cabo
a la temperatura ambiente, aunque se pueden llevar a cabo en un intervalo de temperaturas, por ejemplo de 10º a 40ºC.

Si bien los detalles de los inmunoanálisis de la presente invención pueden variar con el formato concreto empleado, el método de detección de los anticuerpos anti-CD22 en una muestra que contiene los anticuerpos comprende generalmente las etapas de poner en contacto la muestra con un anticuerpo que reacciona específicamente, en condiciones inmunológicamente reactivas, con el complejo CD22/anticuerpo.

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Producción de productos inmunoconjugados

Los productos inmunoconjugados incluyen, pero no está limitados a, moléculas en las que hay un enlace covalente de un agente terapéutico a un anticuerpo. Un agente terapéutico es un agente con una actividad biológica concreta dirigida contra una molécula diana particular o una célula que porta una molécula diana. Un experto en la técnica apreciará que los agentes terapéuticos pueden incluir diferentes fármacos tales como vinblastina, daunomicina y similares, citotoxinas tales como la exotoxina de Pseudomonas o la toxina de la Difteria nativa o modificada, agentes encapsulantes, (p. ej., liposomas) que contienen composiciones farmacológicas, agentes radiactivos tales como I^{125}, P^{32}, C^{14}, H^{3} y S^{35} y otras marcas, fracciones localizadores y ligandos.

La elección de un agente terapéutico concreto depende de la molécula o célula diana concreta y del efecto biológico que se desea evocar. De este modo, por ejemplo, el agente terapéutico puede ser una citotoxina que se utiliza para ocasionar la muerte de una célula diana concreta. Por el contrario, cuando solamente se desea evocar una respuesta biológica no letal, el agente terapéutico puede ser conjugado con un agente farmacológico no letal o un liposoma que contiene un agente farmacológico no letal.

Con los agentes terapéuticos y los anticuerpos proporcionados en la presente memoria, un experto en la técnica puede construir fácilmente una variedad de clones que contienen ácidos nucleicos funcionalmente equivalentes, tales como ácidos nucleicos que difieren en la secuencia pero que codifican la misma ME o secuencia de anticuerpo. De este modo, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican anticuerpos y productos conjugados y sus proteínas de fusión.

A. Métodos Recombinantes

Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención se pueden preparar mediante cualquier método adecuado incluyendo, por ejemplo, la clonación de las secuencias apropiadas o mediante síntesis química directa por métodos tales como el método del fosforotriéster de Narang, et al., Meth. Enzymol, 68:90-99 (1979); el método del fosfodiéster de Brown, et al., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979); el método de la dietilfosforamidita de Beaucage, et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862 (1981); el método del triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetr. Letts. 22(20): 1859-1862 (1981), p. ej., utilizando un sintetizador automatizado como describen, por ejemplo, Needham-VanDervanter, et al., Nucl. Acids Res. 12:6159-6168 (1984); y el método del soporte sólido de la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.458.066. La síntesis química produce un oligonucleótido de cadena sencilla. Este se puede convertir en un ADN de doble hebra mediante hibridación con una secuencia complementaría, o mediante polimerización con una ADN polimerasa utilizando la hebra sencilla como molde. Un experto en la técnica reconocería que si bien la síntesis química del ADN está limitada a secuencias de aproximadamente 100 bases, se pueden obtener secuencias más largas mediante ligación de secuencias más cortas.

En una realización preferida, las secuencias de ácido nucleico de esta invención se preparan mediante técnicas de clonación. Los ejemplos de las técnicas de clonación y secuenciación apropiadas, y las instrucciones suficientes para dirigir a los expertos a través de muchos ejercicios de clonación se encuentran en Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ª ED.), Volúmenes 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Berger y Kimmel (eds.), GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, Academic Press, Inc. San Diego CA (1987)), o Ausubel, et al., (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing y Wiley-Interscience, NY (1987). La información sobre el producto de los fabricantes de reactivos biológicos y equipos experimentales también proporcionan información útil. Tales fabricantes incluyen la compañía química SIGMA (Sant Louis, MO), R&D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem. Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza), Invitrogen, San Diego, CA, y Applied Biosystems (Foster City, CA), así como muchas otras fuentes comerciales conocidas por los expertos.

Los ácidos nucleicos que codifican una ME nativa o anticuerpos anti-CD22 se pueden modificar para formar ME, anticuerpos, o productos inmunoconjugados de la presente invención. La modificación mediante mutagénesis dirigida al sitio es bien conocida en la técnica. Los ácidos nucleicos que codifican ME o anticuerpos anti- CD22 se pueden amplificar mediante métodos in vitro. Los métodos de amplificación incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS), el sistema de replicación de secuencia auto-sostenida (3SR). Una amplia variedad de métodos de clonación, células anfitrionas, y metodologías de amplificación in vitro son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En una realización preferida, los productos inmunoconjugados se preparan insertando el ADNc que codifica un anticuerpo scFv anti-CD22 en un vector que comprende el ADNc que codifica la ME. La inserción se realiza de manera que el scFv y la ME se leen en marco, esto es en un polipéptido continuo que contiene una región Fv funcional y una región ME funcional. En una realización particularmente preferida, el ADNc que codifica un fragmento de la toxina de la difteria se liga a un scFv de manera que la toxina esté localizada en el extremo carboxilo del scFv. En realizaciones más preferidas, el ADNc que codifica PE se liga a un scFv de manera que la toxina esté localizada en el extremo amino del scFv.

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Una vez que los ácidos nucleicos que codifican una ME, un anticuerpo anti- CD22, o un producto inmunoconjugado de la presente invención son aislados y clonados, se puede expresar la proteína deseada en una célula diseñada recombinantemente tal como en células de bacterias, plantas, levaduras, insectos y mamíferos. Se espera que los expertos en la técnica sean profundos conocedores de los numerosos sistemas de expresión asequibles para la expresión de proteínas incluyendo E. coli, otros anfitriones bacterianos, levaduras, y diferentes células eucarióticas superiores tales como COS, CHO, HeLa y líneas celulares de mieloma. No se realizarán esfuerzos para describir en detalle los diferentes métodos conocidos para la expresión de proteínas en procariotas o eucariotas. En resumen, la expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican las proteínas aisladas de la invención se logrará típicamente conectando operablememente el ADN o ADNc a un promotor (que es constitutivo o inducible), seguido de la incorporación a una cásete de expresión. Las casetes pueden ser adecuadas para la replicación e integración en otros procariotas o eucariotas. Las casetes de expresión típicas contienen terminadores de la transcripción y traducción, secuencias de inicio, y promotores útiles para la regulación de la expresión del ADN que codifica la proteína. Para obtener un elevado nivel de expresión de un gen clonado, es deseable construir casetes de expresión que contengan, como mínimo, un promotor fuerte para dirigir la transcripción, un sitio de unión al ribosoma para la inhibición de la traducción, y un terminador de la transcripción/traducción. Para E. coli esto incluye un promotor tal como el promotor de T7, trp, lac, o lambda, un sitio de unión al ribosoma y preferiblemente una señal de terminación de la transcripción. Para las células eucarióticas, las secuencias de control pueden incluir un promotor y preferiblemente un intensificador derivado de los genes de inmunoglobulina, SV40, citomegalovirus, y una secuencia de poliadenilación, y pueden incluir secuencias donadoras y aceptoras de empalmes. Las casetes de la invención pueden ser transferidas a la célula anfitriona seleccionada mediante métodos bien conocidos tales como la transformación con cloruro de calcio o la electroporación para E. coli y el tratamiento con fosfato de calcio, la electroporación o la lipofección para células de mamífero. Las células transformadas por las casetes se pueden seleccionar mediante la resistencia a antibióticos conferida por genes contenidos en las casetes, tales como los genes amp, gpt, neo y hyg.

Un experto reconocería que se pueden realizar modificaciones en un ácido nucleico que codifique un polipéptido de la presente invención (esto es, anticuerpo anti-CD22, PE, o un producto inmunoconjugado formado a partir de su combinación) sin disminuir su actividad biológica. Se pueden realizar algunas modificaciones para facilitar la clonación, expresión, o incorporación de la molécula diana a una proteína de fusión. Tales modificaciones son bien conocidas por el experto en la técnica e incluyen, por ejemplo, codones de terminación, una metionina añadida al extremo amino para proporcionar un sitio de iniciación, aminoácidos adicionales colocados en cualquier extremo para crear sitios de restricción convenientemente localizados, o aminoácidos adicionales (tales como poli His) como ayuda en las etapas de purificación.

Además de los métodos recombinantes, los productos inmunoconjugados, ME, y anticuerpos de la presente invención también pueden ser construidos en su totalidad o en parte utilizando la síntesis peptídica convencional. La síntesis en fase sólida de los polipéptidos de la presente invención de menos de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud se puede completar anclando el aminoácido C-terminal de la secuencia a un soporte insolubie seguido de la adición sucesiva del resto de los aminoácidos de la secuencia. Las técnicas para la síntesis en fase sólida son descritas por Barany y Merrifield, THE PEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY. VOL. 2: SPECIAL METHODS IN PEPTIDE SYNTHESIS, PARTE A. págs. 3-284; Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963), y Stewart, et al. SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2ª Ed., Pierce chem. Co., Rockford, IIl (1984). Las proteínas de mayor longitud se pueden sintetizar mediante condensación de los extremos amino y carboxilo de fragmentos más cortos. Los métodos de formación de enlaces peptídicos mediante activación de un extremo carboxilo terminal (p. ej., mediante el uso del reactivo de acoplamiento N,N'-diciclohexilcarbodiimida) son conocidos por los expertos en la técnica.

B. Purificación

Una vez expresados, los productos inmunoconjugados recombinantes, anticuerpos, y/o moléculas efectoras de la presente invención se pueden purificar de acuerdo con los procedimientos convencionales de la técnica, incluyendo la precipitación con sulfato de amonio, las columnas de afinidad, la cromatografía en columna, y similares (véase, en general, R. Scopes, PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Se prefieren las composiciones esencialmente puras con una homogeneidad de al menos aproximadamente 90 a 95%, y son muy preferidas las que tienen una homogeneidad del 98 al 99% o más para usos farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente o hasta una homogeneidad deseada, si se van a utilizar terapéuticamente, los polipéptidos deben estar esencialmente libres de endotoxinas.

Los métodos para la expresión de anticuerpos de cadena sencilla y/o el replegamiento a una forma activa apropiada, incluyendo los anticuerpos de cadena sencilla, a partir de bacterias tales como E.coli han sido descritos y son bien conocidos y son aplicables a los anticuerpos de esta invención. Véase, Buchner, et al., Anal. Biochem. 205:263-270 (1992);
Pluckthun, Biotechnology 9:545 (1991); Huse, et al., Science 246:1275 (1989) y Ward, et al., Nature 341:544 (1989).

A menudo, las proteínas heterólogas funcionales de E. coli y otras bacterias se aislan de los cuerpos de inclusión y requieren solubilización utilizando desnaturalizantes fuertes, y posterior replegamiento. Durante la etapa de solubilización, como es bien sabido en la técnica, debe estar presente un agente reductor para separar los enlaces disulfuro. Un tampón ilustrativo con un agente reductor es: Tris 0,1 M pH 8,6, guanidina 6 M, EDTA 2 mM, DTE (ditioeritritol) 0,3 M. La reoxidación de los enlaces disulfuro se puede producir en presencia de reactivos tiólicos de bajo peso molecular en forma reducida y oxidada, como describen Saxena, et al., Biochemistry 9:5015-5021 (1970) y especialmente como describen Buchner, et al., más arriba.

La renaturalización se completa típicamente mediante dilución (p. ej., 100 veces) de la proteína desnaturalizada y reducida en tampón de replegamiento. Un tampón ilustrativo es Tris 0,1 M, pH 8,0, L-arginina 0,5 M, glutatión oxidado 8 mM (GSSG), y EDTA 2 mM.

Como modificación del protocolo de purificación del anticuerpo bicatenario, las regiones de la cadena pesada y ligera se solubilizan por separado y se reducen y luego se combinan en la solución de replegamiento. Se obtiene un rendimiento preferido cuando estas dos proteínas se mezclan a una razón molar tal que no se exceda un exceso molar de 5 veces de una proteína sobre la otra. Es deseable añadir glutatión oxidado en exceso u otros compuestos de bajo peso molecular oxidantes a la solución de replegamiento después de completar la redistribución redox.

Exotoxina de Pseudomonas y otras toxinas

Se pueden emplear toxinas con anticuerpos de la presente invención para producir inmunotoxinas. Las toxinas ilustrativas incluyen ricina, abrina, toxina de la difteria y sus subunidades, así como las toxinas A a F de botulinum. Estas toxinas son fácilmente asequibles de fuentes comerciales (p. ej., Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). La toxina de la difteria se aisla de Corynebacterium diphteriae. La ricina es la lectina RCA60 de Ricinus communis (semilla de Ricino). El término también hace referencia a sus variantes tóxicas. Por ejemplo, véanse las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.079.163 y 4.689,401. La aglutinina de Ricinus communis (RCA) existe en dos formas denominadas RCA_{60} y RCA_{120} según sus pesos moleculares de aproximadamente 65 y 120 kD, respectivamente (Nicholson y Blaustein, J. Biochim. Biophys. Acta 266:543 (1972)). La cadena A es responsable de la inactivación de la síntesis de proteínas y la eliminación de las células. La cadena B une la ricina a los residuos galactosa de la superficie de la célula y facilita el transporte de la cadena A al citosol (Olsnes, et al., Nature 249:627-631 (1974) y Patente de los Estados Unidos Núm. 3.060.165).

La abrina incluye lectinas tóxicas de Abrus precatorius. Los principios tóxicos, abrina a, b, c, y d, tiene un peso molecular de aproximadamente 63 y 67 kD y están compuestos por dos cadenas polipeptídicas A y B unidas por disuifuro. La cadena A inhibe la síntesis de proteínas; la cadena B (abrina b) se une a los restos D-galactosa (véase, Funatsu, et al., Agr. Biol. Chem. 52:1095 (1988); y Olsnes, Methods Enzymol. 50:330-335(1978)).

En realizaciones preferidas de la presente invención, la toxina es exotoxina de Pseudomonas (PE). El término "exotoxina de Pseudomonas" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a una PE nativa completa (de origen natural) o a una PE que ha sido modificada. Tales modificaciones pueden incluir, pero no están limitadas a, eliminación del dominio la, deleciones de diferentes aminoácidos en los dominios Ib, II y III, sustituciones de un único aminoácido y la adición de una o más secuencias en el extremo carboxilo tal como KDEL (SEQ ID NO: 5) y REDL (SEQ ID NO: 6). Véase Siegall, et al., J. Biol. Chem, 264:14256-14261 (1989). En una realización preferida, el fragmento citotóxico de PE conserva al menos 50%, preferiblemente 75%, más preferiblemente al menos 90%, y muy preferiblemente 95% de la citotoxicidad de la PE nativa. En una realización muy preferida, el fragmento citotóxico es más tóxico que la PE nativa.

La exotoxina A de Pseudomonas nativa (PE) es una proteína monomérica extremadamente activa (peso molecular 66 kD), secretada por Pseudomonas aeruginosa, que inhibe la síntesis de proteínas en células eucarióticas. La secuencia de PE nativa es proporcionada en la Patente de los Estados Unidos del Mismo Propietario Núm. 5.602.095. El método de acción es la inactivación de la ribosilación del ADP del factor de elongación 2 (EF-2). La exotoxina contiene tres dominios estructurales que actúan en concierto para causar la citotoxicidad. El dominio la (aminoácidos 1-252) media la unión celular. El dominio II (aminoácidos 253-364) es responsable de la translocación en el citosol y el dominio III (aminoácidos 400-613) media la ribosilación del ADP del factor de elongación 2. La función del dominio Ib (aminoácidos 365-399) permanece indefinida, aunque una gran parte de él, aminoácidos 365-380, puede ser suprimida sin pérdida de citotoxicidad. Véase Siegall, et al, (1989), más arriba.

Las PE empleadas en la presente invención incluyen la secuencia nativa, fragmentos citotóxicos de la secuencia nativa, y variantes modificadas conservativamente de la PE nativa y sus fragmentos citotóxicos. Los fragmentos citotóxicos de PE incluyen aquellos que son citotóxicos con o sin procesamiento proteolítico posterior u otro en la célula diana (p. ej., como proteína o pre-proteína). Los fragmentos citotóxicos de PE incluyen PE40, PE38, y PE35.

En las realizaciones preferidas, la PE ha sido modificada para reducir o eliminar la unión a células no específicas, frecuentemente suprimiendo el dominio la, como se ilustra en la Patente de los Estados Unidos 4.892.827, aunque esto también se puede lograr, por ejemplo, mutando ciertos restos del dominio la. La Patente de los Estados Unidos 5.512.658, por ejemplo, describe que una PE mutada en la que el Dominio la está presente pero en la que los restos alcalinos del dominio la de las posiciones 57, 246, 247, y 249 se remplazan por restos ácidos (ácido glutámico, o "E")) muestra una citotoxicidad no específica enormemente disminuida. Esta forma muíante de PE es referida a veces como PE4E.

PE40 es un derivado truncado de PE como se ha descrito previamente en la técnica. Véase, Pai, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3358-62 (1991); y Kondo, et al., J. Biol. Chem. 263:9470-9475 (1988). PE35 es un fragmento carboxilo terminal de 35 kD de PE en el que los residuos aminoácido 1-279 han sido suprimidos y la molécula comienza con una met en posición 280 seguida de los aminoácidos 281-364 y 381-613 de la PE nativa. PE35 y PE40 se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos 5.602.095 y 4.892.827.

En algunas realizaciones preferidas, se emplea el fragmento citotóxico PE38. PE38 es una pro-proteína de PE truncada compuesta por los aminoácidos 253-364 y 381-613 que es activada a su forma citotóxica tras el procesamiento dentro de una célula (véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.608.039, y Pastan et al., Biochim. Biophys. Acta 1333:C1-C6 (1997)).

Como se ha indicado antes, se puede suprimir parte o todo el dominio Ib, y unir las porciones restantes por medio de un conector o directamente mediante un enlace peptídico. Parte de la porción amino del dominio II puede ser suprimida. Y, el extremo C-terminal puede contener la secuencia nativa de los restos 609-613 (REDLK (SEQ ID NO: 7)), o puede contener una variación que se ha encontrado que mantiene la capacidad del constructo para translocarse al citosol, tal como REDL (SEQ ID NO: 6) o KDEL (SEQ ID NO: 5), y las repeticiones de estas secuencias. Véanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos 5.854.044; 5.821.238; y 5.602.095 y el documento WO 99/51643. Si bien en las realizaciones preferidas, la PE es PE4E, PE40, o PE38, cualquier forma de PE en la que se haya eliminado la citotoxicidad no específica o reducido a niveles en los que no se produzca toxicidad significativa para las células diana se puede utilizar en las inmunotoxinas de la presente invención con tal que siga siendo susceptible de translocación y ribosilación de EF-2 en una célula diana.

A. Variantes de PE Modificadas Conservativamente

Las variantes de PE modificadas conservativamente o sus fragmentos citotóxicos tienen una similitud de secuencia de al menos 80%, preferiblemente una similitud de secuencia de al menos 85%, más preferiblemente una similitud de secuencia de al menos 90%, y muy preferiblemente una similitud de secuencia de al menos 95% a nivel de aminoácidos, con la PE de interés, tal como PE38.

El término "variantes modificadas conservativamente" de aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos concretas, las variantes modificadas conservativamente hacen referencia a aquellas secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o si el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias de ácidos nucleicos esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier polipéptido dado. Por ejemplo, los codones OCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. De este modo, en cada posición en la que una alanina es especificada por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas conservativamente. Cada secuencia de ácido nucleico de la presente memoria que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón de un ácido nucleico (excepto AUG, que es normalmente el único codón para la metionina) puede ser modificado para proporcionar una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto en la técnica reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales en una secuencia de ácido nucleico, péptidos, polipéptidos, o proteínas que alteran, añaden, o suprimen un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada conservativamente" cuando la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar.

B. Análisis de la Citotoxicidad de PE

Las exotoxinas de Pseudomonas empleadas en la invención pueden ser analizadas en busca del nivel deseado de citotoxicidad mediante análisis bien conocidos por los expertos en la técnica. De este modo, los fragmentos citotóxicos de PE y las variantes modificadas conservativamente de tales fragmentos se pueden analizar fácilmente en cuanto a la citotoxicidad. Se puede analizar un gran número de moléculas de PE candidato simultáneamente en cuanto a la citotoxicidad mediante métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede analizar la citotoxicidad de los subgrupos de moléculas candidato. Los subgrupos que reaccionan positivamente de las moléculas candidato se puede subdividir continuamente y volver a analizar hasta que se identifican los fragmentos citotóxicos deseados. Tales métodos permiten el rápido escrutinio de grandes números de fragmentos citotóxicos o variantes conservativas de PE.

C. Otros Radicales Terapéuticos

Los anticuerpos de la presente invención también se pueden utilizar para dirigir cualquiera de los numerosos compuestos diagnósticos o terapéuticos diferentes a células que expresan CD22 sobre su superficie. De este modo, un anticuerpo de la presente invención, tal como un scFv anti-CD22, se puede anclar directamente o a través de un conector a un fármaco que se vaya a liberar directamente en las células que portan CD22. Los agentes terapéuticos incluyen compuestos tales como ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, aminoácidos o derivados, glicoproteínas, radioisótopos, lípidos, carbohidratos, o virus recombinantes. Los radicales terapéuticos y diagnósticos de ácidos nucleicos incluyen ácidos nucleicos antisentido, oligonucleótidos derivatizados para el entrecruzamiento covalente con ADN sencillo o dúplex, y oligonucleótidos formadores de tríplex.

Alternativamente, la molécula conectada a un anticuerpo anti-CD22 puede ser un sistema de encapsulación, tal como un liposoma o una micela que contiene una composición terapéutica tal como un fármaco, un ácido nucleico (p. ej. un ácido nucleico antisentido), u otro radical terapéutico que está protegido preferiblemente de la exposición directa al sistema circulatorio. Los medios para preparar liposomas anclados a anticuerpos son bien conocidos para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.957.735; y Connor, et al., Pharm. Ther. 28:341-365 (1985).

D. Marcas Detectables

Los anticuerpos de la presente invención pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a una marca detectable. Las marcas detectables adecuadas para semejante uso incluyen cualquier composición detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Las marcas útiles en la presente invención incluyen cuentas magnéticas (p. ej., DYNABEADS), colorantes fluorescentes (p. ej., isotiocianato de fluoresceína, rojo Texas, rodamina, proteína fluorescente verde, y similares), radiomarcas (p. ej., H^{3}, I^{125}, S^{35}, C^{14}, o P^{32}), enzimas (p. ej., peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otras utilizadas comúnmente en un ELISA), y marcas colorimétricas tales como oro coloidal o cuentas de vidrio o plástico coloreadas (p. ej., poliestireno, polipropileno, látex, etc.).

Los métodos para detectar tales marcas son bien conocidos por los expertos en la técnica. De este modo, por ejemplo, se pueden detectar radiomarcas utilizando películas fotográficas o contadores de centelleo, se pueden detectar los marcadores fluorescentes utilizando un fotodetector para detectar la iluminación emitida. Las marcas enzimáticas se detectan típicamente proporcionando a la enzima un sustrato y detectando el producto de reacción producido por la acción de la enzima sobre el sustrato, y las marcas colorimétricas se detectan visualizando simplemente la marca coloreada.

E. Conjugación con el Anticuerpo

En una realización no recombinante de la invención, las moléculas efectoras, p. ej., radicales terapéuticos, diagnósticos, o de detección, se conectan a los anticuerpos anti-CD22 de la presente invención utilizando cualquiera de los numerosos métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se pueden utilizar métodos de anclaje tanto covalente como no covalente con los anticuerpos anti-CD22 de la presente invención.

El procedimiento para anclar una molécula efectora a un anticuerpo variará de acuerdo con la estructura química de la ME. Los polipéptidos contienen típicamente una variedad de grupos funcionales; p. ej., grupos ácido carboxílico (COOH), amina libre (-NH_{2}) o sulfidrilo (-SH), que están disponibles para reaccionar con un grupo funcional adecuado sobre un anticuerpo para dar como resultado la unión de la molécula efectora.

Alternativamente, el anticuerpo se derivatiza para exponer o para anclar grupos funcionales reactivos adicionales. La derivatización puede implicar el anclaje de numerosas moléculas conectoras tales como las asequibles de Pierce Chemical Company, Rockford Illinois.

Un "conector", según se utiliza en la presente memoria, es una molécula que se utiliza para unir el anticuerpo a la molécula efectora. El conector es capaz de formar enlaces covalentes tanto con el anticuerpo como con la molécula efectora. Los conectores adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, conectores carbonados de cadena lineal o ramificada, conectores carbonados heterocíclicos, o conectores peptídicos. Cuando el anticuerpo y la molécula efectora son polipéptidos, los conectores se pueden unir a los aminoácidos constituyentes a través de sus grupos laterales (p. ej., a través de un enlace disulfuro con una cisteína). No obstante, en una realización preferida, los conectores se unirán a los grupos amino y carboxilo del carbono alfa de los aminoácidos terminales.

En algunas circunstancias, es deseable liberar la molécula efectora del anticuerpo cuando el producto inmunoconjugado ha alcanzado su sitio diana. Por lo tanto, en estas circunstancias, los productos inmunoconjugados comprenderán conexiones que sean escindibles en las proximidades del sitio diana. La escisión del conector para liberar la molécula efectora del anticuerpo puede ser ocasionada por la actividad enzimática o las condiciones a las que se somete el producto inmunoconjugado dentro de la célula diana o en las proximidades del sitio diana. Cuando el sitio diana es un tumor, se puede utilizar un conector que es escindible en las condiciones presentes en el sitio del tumor (p. ej. cuando se expone a enzimas asociadas a tumores o a pH ácido).

A la vista del gran número de métodos que se han referido para anclar una variedad de compuestos radiodiagnósticos, compuestos radioterapéuticos, fármacos, toxinas, y otros agentes a anticuerpos, un experto en la técnica será capaz de determinar un método adecuado para anclar un agente dado a un anticuerpo u otro polipéptido.

Composiciones farmacéuticas y administración

Las composiciones de anticuerpo y/o producto conjugado de esta invención (esto es, PE conectada a un anticuerpo anti-CD22 de la invención) son particularmente útiles para la administración parenteral, tal como la administración intravenosa o la administración en una cavidad corporal.

Las composiciones para la administración comprenderán comúnmente una solución del anticuerpo y/o el producto inmunoconjugado disueltos en un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Se pueden utilizar una variedad de portadores acuosos, p. ej., solución salina tamponada y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de materia no deseable. Estas composiciones se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas por ejemplo ajustando el pH y agentes tamponadores, agentes para el ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración de proteína de fusión en estas formulaciones puede variar ampliamente, y se seleccionará principalmente basándose en los volúmenes de fluido, las viscosidades, el peso corporal y similares de acuerdo con el modo concreto de administración seleccionado y con las necesidades del paciente.

De este modo, una composición de inmunotoxina farmacéutica típica de la presente invención para la administración intravenosa sería de aproximadamente 0,1 a 10 mg por paciente por día. Se pueden utilizar dosificaciones de 0,1 a aproximadamente 100 mg por paciente por día. Los métodos actuales para preparar composiciones administrables serán conocidos o evidentes para los expertos en la técnica y se describen con más detalle en publicaciones tales como REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 19ª ED., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1995).

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar para tratamientos terapéuticos. En las aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que padece una enfermedad, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para completar esto se define como una "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado de salud general del paciente. Una cantidad eficaz del compuesto es aquella que proporciona un alivio subjetivo de uno o varios síntomas o una mejora identificable objetivamente observada por el médico clínico u otro observador cualificado.

Las administraciones únicas o múltiples de las composiciones se administran dependiendo de la dosificación y la frecuencia requerida y tolerada por el paciente. En cualquier caso, la composición debe proporcionar una cantidad suficiente de las proteínas de esta invención para tratar eficazmente al paciente. Preferiblemente, la dosificación se administra de una vez pero se puede aplicar periódicamente hasta que se logra cualquier resultado terapéutico o hasta que los efectos secundarios justifican la interrupción de la terapia. Generalmente, la dosis es suficiente para tratar o aliviar los síntomas o signos de la enfermedad sin producir una toxicidad inaceptable en el paciente.

Las formulaciones parenterales de liberación controlada de las composiciones de producto inmunconjugado de la presente invención se pueden elaborar en forma de implantes, inyecciones oleosas, o en forma de sistemas particulados. Para una visión general mas amplia de los sistemas de liberación de proteínas véase, Banga, A.J., THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Company, Inc; Lancaster, PA, (1995). Los sistemas particulados incluyen microesferas, micropartículas, microcápsulas, nanocápsulas, nanoesferas, y nanopartículas. Las microcápsulas contienen la proteína terapéutica como núcleo central. En las microesferas el agente terapéutico está disperso por toda la partícula. Las partículas, microesferas, y microcápsulas más pequeñas de aproximadamente 1 \mum son referidas generalmente como nanopartículas, nanoesferas, y nanocápsulas, respectivamente. Los capilares tienen un diámetro de aproximadamente 5 \mum de manera que solamente las nanopartículas se administran intravenosamente. Las micropartículas tienen típicamente en tomo a 100 \mum de diámetro y se administran subcutáneamente o intramuscularmente. Véase, p. ej., Kreuter, J., COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, págs. 219-342 (1994); y Tice y Tabibi, TREATISE ON CONTROLLED DRUG DELIVERY, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, inc. Nueva York, NY, págs. 315-339, (1992).

Se pueden utilizar polímeros para la liberación controlada por iones de las composiciones de producto inmunoconjugado de la presente invención. Se conocen en la técnica diferentes matrices poliméricas degradables y no degradables para su uso en la liberación controlada de fármacos (Langer, R., Accounts Chem. Res. 26:537-542 (1993)). Por ejemplo, el polímero de bloques Polaxamer 407 existe en forma de un líquido viscoso todavía móvil a bajas temperaturas pero forma un gen semisólido a la temperatura corporal. Se ha demostrado que es un vehículo eficaz para la formulación y la liberación sostenida de interleuquina-2 recombinante y ureasa (Johnston, et al., Pharm. Res. 9:425-434 (1992); y Pee, et al., J. Parent Sci. Tech. 44(2):58-65 (1990)). Alternativamente, se ha utilizado hidroxiapatita como microportador para la liberación controlada de proteínas (Ijntema, et al., Int. J. Pharm. 112:215-224 (1994)). En otro aspecto más, se utilizan liposomas para la liberación controlada así como para el direccionamiento de fármacos de fármacos encapsulados en lípidos (Betageri, et al., UPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993)). Se conocen numerosos sistemas adicionales para la liberación controlada de proteínas terapéuticas. Véanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.055.303; 5.188.837; 4.235.871; 4.501.728; 4.837.028; 4.957.735 y 5.019.369; 5.055.303; 5.514.670; 5.413.797; 5.268.164; 5.004.697; 4.902.505; 5.506.206; 5.271.961; 5.254.342 y 5.534.496.

Entre los diferentes usos de las inmunotoxinas de la presente invención se incluyen una variedad de enfermedades causadas por células humanas específicas que pueden ser eliminadas por la acción tóxica de la proteína de fusión. Una aplicación preferida para las inmunotoxinas de la invención es el tratamiento de células malignas que expresan CD22. Las células malignas ilustrativas incluyen las de la leucemia linfocítica crónica y de la leucemia de las células pilosas.

Kits de diagnóstico y usos in vitro

En otra realización, esta invención proporciona kits para la detección de CD22 o uno de sus fragmentos inmunorreactivos, (esto es, en conjunto, una "proteína CD22") en una muestra biológica. Una "muestra biológica" según se utiliza en la presente memoria es una muestra de tejido o fluido biológico que contiene CD22. Tales muestras incluyen, pero no están limitadas a, tejidos de biopsias, sangre, y células sanguíneas (p. ej., glóbulos blancos). Preferiblemente, las células son linfocitos. Las muestras biológicas también incluyen secciones de tejidos, tales como secciones congeladas tomadas para fines histológicos. Una muestra biológica se obtiene típicamente de un eucariota multicelular, preferiblemente un mamífero tal como una rata, ratón, vaca, perro, cobaya, o conejo, y más preferiblemente un primate, tal como un macaco, chimpancé, o ser humano. Muy preferiblemente, la muestra es de un ser humano.

Los kits comprenderán típicamente un anticuerpo anti-CD22 de la presente invención. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD22 será un fragmento Fv anti-CD22, tal como un fragmento scFv o dsFv.

Además los kits incluirán típicamente instrucciones que describan los métodos de uso de un anticuerpo de la presente invención (p. ej., para la detección de células mesoteliales en una muestra). Los kits también pueden incluir componentes adicionales para facilitar la aplicación concreta para la cual está diseñado el kit. De este modo, por ejemplo, el kit puede contener adicionalmente medios para detectar la marca (p. ej., sustratos de enzimas para marcas enzimáticas, grupos de filtros para detectar marcas fluorescentes, marcas secundarias apropiadas tales como HRP-anti-ratón de cabra, o similar). Los kits pueden incluir adicionalmente tampones y otros reactivos utilizados rutinariamente para la práctica de un método concreto. Tales kits y contenidos apropiados son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En una realización de la presente invención, el kit de diagnóstico comprende un inmunoanálisis. Como se ha descrito antes, aunque los detalles de los inmunoanálisis de la presente invención pueden variar con el formato concreto empleado, el método de detección de CD22 en una muestra biológica comprende generalmente las etapas de poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo de la presente invención que reacciona específicamente, en condiciones inmunológicamente reactivas, con CD22. Se deja que el anticuerpo se una a CD22 en condiciones inmunológicamente reactivas, y se detecta la presencia del anticuerpo unido directa o indirectamente.

Debido al aumento de afinidad de los anticuerpos de la invención, los anticuerpos serán especialmente útiles como agentes de diagnóstico y en análisis in vitro para detectar la presencia de CD22 en las muestras biológicas Por ejemplo, los anticuerpos ilustrados en la presente memoria se pueden utilizar como fracciones localizadoras de productos inmunoconjugados en análisis inmunohistoquímicos para determinar si una muestra contiene células que expresan CD22. La detección de CD22 en los linfocitos indicaría o bien que el paciente tiene un cáncer caracterizado por la presencia de células que expresan CD22, o bien que el tratamiento de semejante cáncer todavía no ha tenido éxito en la erradicación del cáncer.

En otro grupo de usos de la invención, se pueden utilizar inmunotoxinas dirigidas por anticuerpos de la invención para purgar células elegidas como diana de una población de células en un cultivo. De este modo, por ejemplo, fas células cultivadas de un paciente que tiene un cáncer que expresa CD22 pueden ser purgadas de las células cancerosas poniendo en contacto el cultivo con las inmunotoxinas que utilizan los anticuerpos de la invención como fracción localizadora.

Ejemplos Ejemplo 1

Los experimentos referidos en este ejemplo demuestran la creación y uso de genotecas de presentación en fagos para seleccionar RFB4-Fv que se unen al antígeno CD22 de las células Daudi con una afinidad incrementada sobre el RFB4-Fv de tipo salvaje.

La CDR3 de la cadena pesada variable (V_{H}) de RFB4 (Fv) se mutó en un intento de crear Fv con una mayor afinidad de unión al antígeno. La secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de V_{H}CDR3 de RFB4 (Fv) contiene 14 aminoácidos, como se muestra más abajo en la Tabla 1.

TABLA 1 Secuencias de ADN (SEQ ID NO: 37) v de aminoácidos (SEQ ID NO: 38^ de la CDR3 de la cadena pesada de RFB4

3

Los puntos de hipermutabilidad de la V_{H} de CDR3 de RFB4 están subrayados en la Tabla. Se eligió como diana para la mutagénesis un subgrupo seleccionado de los puntos de hipermutabilidad: G99 (GGT), S100 (AGT), S100A (AGC), e Y100B (TAC) se mutaron al azar y se produjo una genoteca de 1,6x10^{5} clones. Los restos mutados se muestran en negrita en la Tabla. La numeración de los restos sigue el formato de Kabat.

Para crear un molde para la construcción de la genoteca, se utilizó la PCR para amplificar RFB4-Fv a partir del plásmido pEM10 [RFB4 (scFv)-PE38KDELj. Se utilizaron los siguientes oligómeros, que introdujeron sitios de restricción SfiI y NotI en el producto de la PCR para esta amplificación.

4

El producto de la PCR resultante se digirió con Sfil y NotI y se insertó en el vector, pCANTABSE (Pharmacia). El fagémido resultante, pCANTAB5E-RFB4, se modificó después insertando un codón de terminación (TAA) en la posición 99 (GGT) utilizando la mutagénesis dirigida al sitio (Kit de mutagénesis dirigida al sitio Quick Change®, Stratagene). El producto fagémido final, pCANTAB5E-RFB4-1, se utilizó como molde para la introducción de los cuatro aminoácidos al azar en la región V_{H}CDR3.

Se diseñaron oligómeros de ADN de doce nucleótidos de longitud para generar una genoteca con los cuatro aminoácidos consecutivos elegidos al azar. Se utilizaron oligómeros degenerados con la secuencia NNS, donde N es cualquiera de los cuatro nucleótidos, y donde S es C o G. Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos para crear la genoteca:

5

La genoteca se construyó empleando dos reacciones de PCR sucesivas. En la primera PCR, se combinaron 50 pg del molde de fagémido, pCANTAB5E-RFB4-1, con 20 pmoles de cada uno de los oligómeros de ADN de los SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11, mezclados con dos cuentas para PCR Ready-To-go (Pharmacia) en un volumen de 50 \mul y se sometieron a ciclos utilizando el siguiente perfil: 1 ciclo a 95ºC durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos a 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto, y 72ºC durante 1 minuto. La reacción de PCR generó un producto de 402 pares de bases que contenía las mutaciones. El producto se purificó utilizando una columna Qiagen Quick Spin y se cuantificó mediante visualización sobre un gel de agarosa al 1%. El producto purificado se utilizó como cebador en una segunda PCR.

En la segunda PCR, se combinaron 2 pmoles de producto de la primera reacción de PCR con 20 pmoles del oligómero de ADN de SEQ ID NO: 12, 50 pg del molde de fagémido pCANTB5E-RFB4-1, se mezclaron con dos cuentas para PCR en un volumen de 50 \mul, y se sometieron a un ciclo utilizando el perfil descrito antes. La reacción generó una genoteca con insertos de 884 pares de bases. El producto de la PCR de 884 pb se digirió con SfiI y NotI, se purificó utilizando una columna Qiaquick (Qiagen), y se ligaron 150 ng en 250 ng del vector de presentación en fagos pCANTABSE, y se eliminaron las sales. Se utilizaron 40 ng de la ligación para transformar E. coli TG1. Se realizaron diez transformaciones para dar una genoteca que contenía 8x10^{5} clones. La genoteca de fagos se rescató de la bacteria transformada, como se ha descrito previamente (Beers, R. et al., Clin. Cancer Res., 6:2835-2843 (2000)), se tituló y se almacenó a 4ºC. Para someter a ensayo si la genoteca estaba aleatorizada apropiadamente, se secuenciaron 16 clones a lo largo de la región mutada. Cada clon tenía una secuencia de ADN diferente, indicando de este modo que se había creado una genoteca bien aleatorizada para la selección de scFv con una elevada afinidad para ta unión del antígeno CD22.

Los fagos fueron rescatados de la genoteca y seleccionados repetitivamente "pannned" sobre células Daudi, que tienen 1 x 10^{5} sitios de unión a CD22 (Shen, G.L. et al., Int. J. Cancer, 42:792-797 (1988)). Las células (2x10^{7}) se sedimentaron, se resuspendieron en 10 ml de tampón de bloqueo frío (DPBS+BSA al 0,5%+EDTA 5 mM) y se hicieron girar lentamente durante 90 minutos a 4ºC. Las células se sedimentaron después y se resuspendieron en 1 ml de tampón de bloqueo frío. Los fagos (1x10^{12}) de la genoteca se añadieron a la suspensión celular y la mezcla se hizo girar lentamente a 4ºC durante 90 minutos. Las células se lavaron cinco veces con 10 ml de tampón de bloqueo frío. Los fagos unidos se hicieron eluir resuspendiendo las células lavadas en 1,5 ml de HCl 50 mM enfriado con hielo e incubando sobre hielo durante 10 minutos. Las células Daudi se sedimentaron y los fagos eluidos se transfirieron a un tubo que contenía 200 \mul de TRIS 1 M pH 8. Los fagos eluidos se titularon para determinar el número de fagos capturados. Se re-infectaron 1,5 ml de los fagos eluidos en E. coli y se amplificaron para su uso en la siguiente ronda de selección repetitiva. Para evitar la posible pérdida de Fv de elevada afinidad, se limitó la selección repetitiva a dos rondas solamente (Beers, R. et al., Clin. Cancer. Res., 6:2835-2843 (2000)). Se logró un enriquecimiento de 60 veces entre la ronda 1 y la ronda 2.

Después de la segunda ronda de selección repetitiva, se prepararon soluciones de partida de fagos a partir de veinticuatro clones individuales y se sometieron a ensayo en busca de su capacidad para unirse a células Daudi mediante citometría de flujo. Las colonias individuales de E. coli TG1 que contenían fagémidos seleccionados en la 2^{a} ronda de selección repetitiva se hicieron crecer a una DO_{600} = 0,3 en 15 ml de medio 2xYT con un suplemento de glucosa al 2% y ampicilina (100 \mug/ml). Se añadió el fago coadyuvante M13KO7 (10^{10} UFP) a la suspensión y las células se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Después de la incubación, la mezcla se centrifugó, se resuspendió en 30 ml de 2xYT más ampicilina (100 \mug/ml) y kanamicina (50 \mug/ml) y se hizo crecer 16 horas a 37ºC. Después del crecimiento, los cultivos se sedimentaron y los fagos se hicieron precipitar del sobrenadante con PEG/NaCl. Después de la centrifugación se suspendieron cada uno de los sedimentos de fago en 1 mL de NTE (NaC1100 mM, Tris 10 mM [pH 7,5] y EDTA 1 mM) y se titularon.

Para determinar las propiedades de unión de las soluciones de partida de 24 fagos adquiridas después de la segunda ronda de selección repetitiva, se mezclaron los fagos con células Daudi, se hicieron reaccionar con un anticuerpo anti-M13 primario seguido de reacción con anticuerpo marcado con FITC secundario y finalmente, se midió la fluorescencia mediante citometría de flujo.

Se incubaron 5x10^{5} células Daudi con 8x10^{8} fagos a la temperatura ambiente durante 60 minutos, las células se lavaron dos veces con tampón de bloqueo (DPBS+BSA al 0,5%+EDTA 5 mM) y se añadieron a cada muestra 5 \mug de anticuerpo anti-M13 de ratón (Amersham). La mezcla se incubó a la temperatura ambiente durante 20 minutos, después se lavó dos veces con tampón de bloqueo. Se añadió un anticuerpo marcado con FITC anti-ratón de cabra (Jackson ImmunoResearch) y las células se incubaron durante 20 minutos a la temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces y el análisis se realizó en un citómetro de flujo FACSort (Becton Dickinson). Los datos se adquirieron utilizando el soporte lógico Cell Quest. Para el experimento de competición, se incubaron 5x10^{6} células con 8x10^{10} fagos de cadena sencilla (scFv) de RFB4 de tipo salvaje y con 63 \mug de inmunotoxina RFB4 (exceso de 100 veces). La muestra se trató como las células incubadas solamente con fago.

Las células Daudi incubadas sin fago generaron solamente una señal de fondo cuando se analizaron mediante citometría de flujo. Por el contrario, la señal de intensidad de la fluorescencia generada por las células incubadas con fago que tenía un scFv que portaba V_{H}CDR3 (GSSY) de tipo salvaje (SEQ ID NO: 13) de RFB4 fue significativa. Las células que fueron incubadas simultáneamente con fago que portaba un scFv con V_{H}CDR3 (GSSY) de tipo salvaje (SEQ ID NO: 13) de RFB4 y GSSY parental (SEQ ID NO: 13) que contenía inmunotoxina [RFB4-(Fv)-PE38], produjeron una señal de fluorescencia similar a la de las células incubadas sin fago. De este modo, el fago que tiene un scFv que porta V_{H}CDR3 (GSSY) de tipo salvaje (SEQ ID NO: 13) de RFB4 se une específicamente al antígeno CD22 de las células Daudi.

La intensidad de fluorescencia generada por las células Daudi que se incubaron con fagos que presentaban un scFv con V_{H}CDR3 (GSSY) de tipo salvaje (SEQ ID NO: 13) de RFB4 se comparó con la señal de intensidad de fluorescencia generada mediante la incubación de las células Daudi con uno cualquiera de los otros tres fagos (A, B, y C) seleccionados de la genoteca aleatorizada mediante selección repetitiva. La intensidad de fluorescencia generada por la incubación del fago A y el fago B con células Daudi fue mayor que la señal de intensidad de fluorescencia generada por las células Daudi incubadas con fagos que tenían un scFv que portaba VHCDR3 (GSSY) de tipo salvaje (SEQ ID NO: 13) de RFB4. De este modo, los fagos A y B portan scFv que se unen al antígeno CD22 de las células Daudi mejor que los fagos que portan un scFv con VHCDR3 (GSSY) de tipo salvaje (SEQ ID NO: 13) de RFB4. Las células incubadas con fago C tenían una intensidad de fluorescencia similar a la de las células incubadas sin fago, sugiriendo que este mutante no se unía a las células. El fago C se clasificó como un mal ligante y no se utilizó más. Solamente dos de los veinticuatro fagos no se unieron a las células.

Veintidós de los fagos estudiados se comportaron como fagos A y B. Los Fv de estos 22 fagos se secuenciaron utilizando PE® Applied Biosystems Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit. Las muestras se hicieron circular y se analizaron en un secuenciador automático PE Applied Biosystem Modelo 310. Los residuos aminoácido de la región mutada en V_{H} CDR3 que se habían deducido de las secuencias de ADN se muestran más abajo en la Tabla 2.

TABLA 2 Secuencias de fagos mulantes obtenidos después de la selección repetitiva

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Se muestran las secuencias de aminoácidos de los fagos aislados después de dos rondas de selección repetitiva. Se secuenció el Fv completo de cada fago, no obstante, solamente se muestra la secuencia de la región diana.

La genoteca aleatorizada produjo una abundancia de mutaciones que dio como resultado un aparente aumento de la afinidad de unión de V_{H}CDR3 de RBF4 Fv para el antígeno CD22 de las células Daudi. De este modo, se creó una genoteca de presentación en fagos de mutantes al azar de la región CDR3 de la V_{H} de RFB4 y se utilizó para seleccionar los scFv de RFB4 con una afinidad de unión mejorada al antígeno CD22.

Ejemplo 2

Los estudios referidos en este Ejemplo demuestran que la incorporación de scFv mutantes seleccionados en el Ejemplo 1 a la estructura de una molécula de inmunotoxina quimérica aumenta la actividad citotóxica de las inmunotoxinas quiméricas hacia las células cultivadas que presentan el antígeno CD22, inhibiendo de ese modo el crecimiento de los cultivos.

Se prepararon las inmunotoxinas de cada una de las tres sustituciones 100B principales GTTW (SEQ ID NO: 16), GYNW (SEQ ID NO: 15), GTHW (SEQ ID NO: 14), GSTY (SEQ ID NO: 17) y GKNR (SEQ ID NO: 18). Los scFv de los fagémidos seleccionados fueron amplificados mediante PCR utilizando cebadores que introducían los sitios de restricción NdeI y HindIII en el producto final de la PCR. Los productos de la reacción se purificaron, se digirieron con NdeI y HindIII y se clonaron en un vector de expresión de T7 en el que scFv se fusionó en marco con una versión truncada de la exotoxina A de Pseudomonas (PE38) (Brinkmann, U., Mol. Med. Today, 2:439-446 (1996)). La expresión y purificación de las inmunotoxinas recombinantes resultantes se realizó como se ha descrito previamente (Beers, R. et al., Clin. Cancer Res., 6:2835-2843 (2000)).

Cada inmunotoxina fue purificada hasta una homogeneidad de más de 95% y se hizo eluir como monómero utilizando la cromatografía de filtración en gel TSK. Las inmunotoxinas purificadas se utilizaron en análisis de citotoxicidad en un panel de seis líneas celulares de linfoma positivas para el antígeno.

La citotoxicidad sobre las líneas celulares se midió mediante análisis de inhibición de la síntesis de proteínas. Las células se cultivaron en placa en placas de 96 pocillos a una concentración de 5x10^{4} células/pocillo. Las inmunotoxinas, preparadas como se ha descrito antes, se diluyeron seriadamente en solución salina tamponada con fosfato (PBS)/seralbúmina humana (HSA) al 2% y se añadieron a cada pocillo 20 \mul. Las placas se incubaron durante 20 horas a 37ºC y después se pulsaron con 1 \muCi/pocillo de leucina-H^{3} en 20 \mul de PBS/HSA al 2% durante 2,5 horas a 37ºC. El material radiomarcado se capturó sobre esteras de filtro "Filtermat" y se contó en un contador de centelleo Betaplate (Pharmacia, Gaithersburg, MD). Los valores de las muestras por triplicado se promediaron y se determinó la inhibición de la síntesis de proteínas calculando el porcentaje de incorporación en comparación con los pocillos de control sin la toxina añadida. La actividad de la molécula se define por su CI_{50}, definida como la concentración de toxina que reducía la incorporación de radiactividad en un 50% en comparación con las células que no se trataron con la toxina. La Tabla 3 muestra los valores de CI_{50} de varios experimentos.

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TABLA 3 Actividad citotóxica (CI50) en ng/ml de mutantes RFB4-PE38 seleccionados sobre seis líneas celulares positivas para CD22 diferentes

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Todas las inmunotoxinas mutantes excepto GKNR (SEQ ID NO: 18) fueron más citotóxicas para las líneas celulares que portaban el antígeno CD22 de lo que lo fue la inmunotoxina que incorporaba un scFv con la secuencia de tipo salvaje del V_{H}CDR3 de RFB4. Puesto que el mutante GKNR (SEQ ID NO: 18) fue seleccionado debido a un evidente aumento de la afinidad de unión, cabría esperar que fuera más citotóxico cuando se incorporara a la estructura de una inmunotoxina quimérica como fue el caso para los otros scFv mutantes. No obstante, la presentación en fagos selecciona un incremento de la expresión así como un incremento de la afinidad de unión al anticuerpo. Por lo tanto se realizó un análisis de transferencia puntual para comparar el número relativo de scFv de tipo salvaje (GSSY) (SEQ ID NO: 13) presentados sobre fagos con respecto al número de scFv mutantes GNKR (SEQ ID NO: 18) presentados sobre fagos. La hibridación puntual indicó que el scFv mutante GNKR (SEQ ID NO: 18) era expresado en exceso sobre el fago. El GKNR (SEQ ID NO: 18) no se analizó más.

Las inmunotoxinas mutantes no fueron citotóxicas para la línea celular negativa para CD22 HUT-102, indicando que el efecto citotóxico de las inmunotoxinas es selectivo para las células positivas para el antígeno CD22.

De este modo, incorporando los scFv mutantes con una mayor afinidad de unión por el antígeno CD22 a la estructura de las inmunotoxinas RFB4-PE38 quiméricas, se intensifica la citotoxicidad de las inmunotoxinas hacía las células que portan el antígeno CD22. Por lo tanto, las citotoxinas mutantes son más eficaces al inhibir el crecimiento de las células portadoras de antígeno que la inmunotoxina con V_{H}CDR3 de RFB4 de tipo salvaje (GSSY) (SEQ ID NO: 13).

Ejemplo 3

Los estudios referidos en este Ejemplo demuestran que las inmunotoxinas RFB4-PE38 mutantes del Ejemplo 2 son más eficaces al inhibir el crecimiento de las células malignas tomadas de pacientes con una enfermedad linfocítica avanzada que la inmunotoxina quimérica que porta V_{H}CDR3 de RFB4 de tipo salvaje, RFB4-PE38.

La actividad citotóxica de las inmunotoxinas mutantes sobre las células malignas aisladas de pacientes se midió en muestras de sangre recogidas de pacientes como parte de protocolos clínicos aprobados en el NIH. Los pacientes 1, 2, 3 y 4 tienen leucemia linfocítica crónica (CLL). El paciente 4 tiene leucemia de las células pilosas (HCL). Las muestras fueron procesadas como se ha descrito previamente (Kreitman, R.J. et al., Clin. Cancer Res., 6:1476-1487 (2000)). Brevemente, se midió la síntesis de proteínas contando las cpm de leucina[H^{3}] incorporada a la proteína. La inhibición de la síntesis de proteínas del 50%, definida por estar a medio camino entre el nivel de incorporación de la leucina[H^{3}] en ausencia de toxina y el nivel de incorporación de leucina[H^{3}] en presencia de 10 \mug/ml de cicloheximida, se determinó capturando el material radiomarcado sobre esteras de filtro, que se contaron después en un contador de centelleo Betapiate (Wallac).

La actividad sintética de proteínas de las células mononucleares purificadas con Ficoll de cos cuatro pacientes con leucemia linfocítica crónica y del paciente con leucemia de las células pilosas se determinó incubando las células con inmunotoxinas durante tres días y pulsando con leucina-H^{3} durante 6-8 horas. Cada análisis se realizó por triplicado. Como se puede observar en la Tabla 4, todas las inmunotoxinas que portaban scFv mutados fueron más citotóxicas que la inmunotoxina quimérica que portaba RFB4-PE38 de tipo salvaje con la secuencia de aminoácidos GSSY (SEQ ID NO: 13) en la región V_{H}CDR3.

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TABLA 4 Actividad citotóxica (CI50) en ng/ml de inmunotoxinas mutantes sobre células de pacientes

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Las células mononucleares de pacientes purificadas con Ficoil se obtuvieron mediante un protocolo aprobado en el NIH. Las células se incubaron con inmunotoxinas durante tres días a 37ºC y se pulsaron con leucina[H^{3}] durante 6-8 horas; se midió la síntesis de proteínas. Las CI_{50} se expresan en ng/ml,se muestran las desviaciones típicas. Cada análisis se realizó por triplicado. Los pacientes 1, 2, 3, y 5 se diagnosticaron de CLL, el paciente 4 de variante de HCL. N.D.: no determinado.

Cuando se sometió a ensayo sobre las células del paciente 2, la inmunotoxina quimérica que portaba la secuencia de aminoácidos GSSY de tipo salvaje (SEQ ID NO: 13) en la región V_{H}CDR3 de RFB4 tenía una CI_{50} de 490 ng/ml, el mutante GTHW (SEQ ID NO: 14) tenía una CI_{50} de 22 ng/ml, el GYNW (SEQ ID NO: 15) tenía una CI_{50} e 40 n/ml, y el mutante GTTW (SEQ ID NO: 16) tenía una CI_{50} de 95 ng/ml. De un modo similar, sobre las muestras aisladas del paciente 5 la inmunotoxina quimérica que portaba la secuencia de aminoácidos GSSY de tipo salvaje (SEQ ID NO: 13) en la V_{H}CDR3 de RFB4 tenía una CI_{50} > 1000 ng/ml mientras la inmunotoxina con GTHW (SEQ ID NO: 14) tenía una CI_{50} de 28 ng/ml y la inmunotoxina GYNW (SEQ ID NO: 15) tenía una CI_{50} de 41 ng/ml y el mutante GTTW (SEQ ID NO: 16) tenía una CI_{50} de 76 ng/ml.

En la mayor parte de los pacientes, la inmunotoxina parental que portaba la secuencia de aminoácidos GSSY (SEQ ID NO: 13) en la región V_{H}CDR3 de RFB4 no fue capaz de inhibir la síntesis de proteínas en 50% a las concentraciones sometidas a ensayo, por lo tanto, en su lugar, se determinó la CI_{40}, la concentración de toxina que reducía la incorporación de leucina-H^{3} en 40%.

De este modo, en cada caso sometido a ensayo, las inmunotoxinas quiméricas que portaban scFv mutantes, fueron más eficaces al inhibir la síntesis de proteínas de las células leucémicas que la inmunotoxina quimérica que portaba el scFv de tipo salvaje.

Ejemplo 4

Los experimentos referidos en este ejemplo demuestran que las inmunotoxinas RFB4-PE38 quiméricas, GTHW (SEQ ID NO: 14), GYNW (SEQ ID NO: 15), GTTW (SEQ ID NO: 16), y GSTY (SEQ ID NO: 17), que portan los scFv mutantes, se unen al antígeno CD22 recombinante con más afinidad que la inmunotoxina RFB4-PE-38 quimérica con el V_{H}CDR3 de RFB4 tipo salvaje (GSSY, SEQ ID NO: 13).

La afinidad de unión de las inmunotoxinas quiméricas se determinó mediante resonancia de plasmón superficial (Biacore). Primero, se preparó la proteína recombinante CD22 y se inmovilizó sobre un chip CMS. El dominio extracelular de la proteína CD22 se expresó como una fusión a un Fe de IgG humana en células 293T transfectadas. El fragmento Fe humano del plásmido Ret-Fc se amplificó mediante PCR utilizando cebadores (proporcionados por M. Billaud, Laboratoire de Genetique, Lyon, Francia) que introdujeron sitios de restricción 5' NotI y 3' XbaI:

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Tras la digestión con NotI y XbaI, el producto de la PCR se purificó y se clonó en los sitios NotI y XbaI del vector pCDNA1.1 para crear el plásmido pCDNA1,1-Fc. A continuación, se fusionó la porción extracelular de CD22 pCDNA1.1-Fc en marco con el Fe amplificando el dominio extracelular de CD22 a partir del plásmido pRKm22 utilizando los siguientes oligómeros:

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pRKm22 es un plásmido que codifica CD22\beta humana completa obtenida clonando a partir de la genoteca de clones Daudi dDNA Quick (CSontech). Los oligómeros introdujeron sitios de restricción EcoRI y NotI, que se utilizaron para clonar el producto de la PCR purificado en pCDNA1.1-Fc para crear pCDNA1.1-22-Fc. Las células 293T se transfectaron con el plásmido pCDNA1.1-22-Fc mediante precipitación con CaPO_{4} convencional.

Se midieron las cinéticas de unión de las inmunotoxinas quiméricas utilizando BIAcore 2000 Biosensor. Se diluyó la proteína CD22-Fc a 50 \mug/ml en tampón de acopiamiento de amina y se inmovilizó en un chip sensor BIAcore CM5. Las inmunotoxinas quiméricas se diluyeron a 25 \mug/ml en solución salina tamponada con HEPES, y se midieron las velocidades de conexión y desconexión inyectando 50 \mug de inmunotoxina sobre la superficie del chip a 10 \mul/min, y dejando después que el material unido se disociara durante 5 minutos o más. El material unido restante se separó de la proteína CD22 inyectando 10 \mul de ácido fosfórico 20 mM. Cada inmunotoxina se inyectó y se analizó al menos tres veces. Se determinaron las cinéticas de unión utilizando el soporte lógico 2.1 de evaluación BIA.

La comparación de los perfiles de unión de las inmunotoxinas que portaban la secuencia de aminoácidos GSSY de tipo salvaje (SEQ ID NO: 13) en la región V_{H}CDR3 con el perfil de unión de las inmunotoxinas mutantes con GTTW (SEQ ID NO: 16), GYNW (SEQ ID NO: 15) y GTHW (SEQ ID NO: 14) en la región V_{H}CDR3 reveló que estas tres inmunotoxinas mutantes tenían velocidades de disociación más lentas que GSSY (SEQ ID NO: 13) de tipo salvaje. En algunos casos las inmunotoxinas mutantes también tenían velocidades de asociación más rápidas en comparación con la inmunotoxina que contenía GSSY de tipo salvaje (SEQ ID NO: 13). No obstante en cada caso, la afinidad de unión total de las inmunotoxinas quiméricas mutantes superaba la del tipo salvaje. Se calculó la Kd dividiendo K_{desconexión} por K_{conexión}. Las constantes de unión, la K_{desconexión}, la K_{conexión} y la Kd se muestran más abajo en la Tabla 5.

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TABLA 5 Resumen del análisis Biacore de los mutantes RFB4-PE38

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La inmunotoxina GSSY de tipo salvaje (SEQ ID NO: 13) tenía una Kd de 85 nM, mientras el mutante con la afinidad más alta, GTHW (SEQ ID NO: 14), tenía una Kd de 6 nM, el mutante GYNW (SEQ ID NO: 15) tenía una Kd de 10 nM y el mutante GTTW (SEQ ID NO: 16) tenía una Kd de 24 nM. El mutante GSTY (SEQ ID NO: 17) tenía una Kd de 49 nM.

De este modo, las inmunotoxinas quiméricas que portan los scFv mutantes GTHW (SEQ ID NO: 14), GYNW (SEQ ID NO: 15), GTTW (SEQ ID NO: 16), y GSTY (SEQ ID NO: 17), se unen al antígeno CD22 recombinante con una mayor afinidad que la inmunotoxina quimérica que porta un scFv con el V_{H}CDR3 de RFB4 de tipo salvaje por medio de diferentes combinaciones de velocidades de asociación más rápidas y velocidades de disociación más lentas de las inmunotoxinas mutantes con respecto a la de la inmunotoxina quimérica de tipo salvaje.

Ejemplo 5

Los estudios referidos en este Ejemplo demuestran que una inmunotoxina RFB4-PE38 estabilizada con disulfuro (dsFv) quimérica ilustrativa elaborada con la secuencia GTHW (SEQ ID NO: 14) era sorprendentemente más eficaz inhibiendo el crecimiento de las células malignas tomadas de pacientes con enfermedades linfocíticas avanzadas que una inmunotoxina dsFv quimérica similar que portaba V_{H}CDR3 de RFB4 de tipo salvaje (GSSY, SEQ ID NO: 13).

Los Fv estabilizados con disulfuro de ambas secuencias se elaboraron como se ha descrito previamente para elaborar RFB4(dsFv)-PE38. Véase, Kreitman et al., Clin Cancer Res 6(4): 1476-87 (2000). Véanse también, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.747.654, 6.147.203, 6.074.644, y 5.980.895. Las inmunotoxinas se sometieron a ensayo contra células tomadas de siete pacientes con CLL, y contra células tomadas de dos pacientes con HCL. Los análisis de citotoxicidad se realizaron como se muestra en el Ejemplo 3, más arriba.

Como se muestra en la Tabla 6, la inmunotoxina dsFv elaborada con la secuencia GTHW (SEQ ID NO: 14) era de 10 a 40 veces más citotóxica para las células de pacientes con CLL que la inmunotoxina dsFv elaborada con la secuencia RFB4 de tipo salvaje. De un modo similar, la inmunotoxina dsFv elaborada con la secuencia GTHW (SEQ ID NO: 14) era de 4 a 7 veces más citotóxica para las células de los pacientes con HCL que la inmunotoxina dsFv elaborada a partir de la secuencia RFB4 de tipo salvaje. De este modo, las inmunotoxinas dsFv elaboradas con las secuencias RFB4 mutadas de la invención demuestran una citotoxicidad sorprendentemente mayor para las células de pacientes con una enfermedad linfocítica avanzada que las inmunotoxinas dsFv elaboradas con la secuencia RFB4 de tipo salvaje.

TABLA 6 Actividad Citotóxica mejorada de la inmunotoxina dsFv Mutante GTHW (SEQ ID NO: 14) Hacia Células de Pacientes con CLL o HCL

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Claims (26)

1. Un anticuerpo anti-CD22 con una cadena ligera variable (V_{L}) que tiene la secuencia de la cadena V_{L} del anticuerpo RFB4 de la Figura 1 y una cadena pesada variable (V_{H}) que tiene la secuencia de la cadena V_{H} del anticuerpo RFB4 de la Figura 1, siempre que los restos SSY de las posiciones 104, 105 y 106 de CDR3 de la cadena V_{H} de dicho anticuerpo anti-CD22 sean remplazados por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en THW, YNW, TTW y STY.

2. Un anticuerpo de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un scFv, un dsFv, un Fab y un F(ab')_{2}.

3. Un anticuerpo de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo tiene una metionina añadida en el extremo N.

4. Un anticuerpo que es una forma humanizada del anticuerpo murino de la reivindicación 1.

5. Una composición que comprende un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 conjugado o fusionado con un radical terapéutico o una marca detectable.

6. Una composición de la reivindicación 5, donde el radical terapéutico se selecciona del grupo que consiste en una citotoxina, un fármaco, un radioisótopo y un liposoma cargado con un fármaco o una citotoxina.

7. Una composición de la reivindicación 6, donde el radical terapéutico es una citotoxina.

8. Una composición de la reivindicación 7, donde la citotoxina se selecciona del grupo que consiste en ricina A, abrina, ribotoxina, ribonucleasa, saporina, caliqueamicina, toxina de la difteria o una de sus subunidades citotóxicas o mutantes, una exotoxina de Pseudomonas, una de sus porciones citotóxicas, una exotoxina de Pseudomonas mutada, una de sus porciones citotóxicas y las toxinas A a F de botulinum.

9. Una composición de la reivindicación 8, donde dicha citotoxina es una exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos citotóxicos, o una exotoxina de Pseudomonas mutada o uno de sus fragmentos citotóxicos.

10. Una composición de la reivindicación 9, donde dicha exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos se selecciona del grupo que consiste en PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR.

11. Una composición de la reivindicación 10, donde el fragmento de exotoxina de Pseudomonas es PE38.

12. Una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, que comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.

13. El uso de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12 para la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa CD22+.

14. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-CD22 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

15. Un ácido nucleico de la reivindicación 14, donde adicionalmente dicho ácido nucleico codifica un polipéptido que es un radical terapéutico o una marca detectable.

16. Un ácido nucleico de la reivindicación 15, donde adicionalmente dicho radical terapéutico es un fármaco o una citotoxina.

17. Un ácido nucleico de la reivindicación 16, donde dicha citotoxina es una exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos citotóxicos, o una exotoxina de Pseudomonas mutada o uno de sus fragmentos citotóxicos.

18. Un ácido nucleico de la reivindicación 17, donde dicha exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos se seleccionan del grupo que consiste en PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR.

19. Un ácido nucleico de la reivindicación 18, donde el fragmento de exotoxina de Pseudomonas es PE38.

20. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19 conectado operablemente a un promotor.

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21. Un método para detectar la presencia de una célula cancerosa CD22+ en una muestra biológica, comprendiendo dicho método:

(a)

poner en contacto células de dicha muestra biológica con un anticuerpo anti-CD22 con una cadena ligera variable (V_{L}) que tiene la secuencia de la cadena V_{L} del anticuerpo RFB4 de la Figura 1 y una cadena pesada variable (V_{H}) que tiene la secuencia de la cadena V_{H} del anticuerpo RFB4 de la Figura 1, siempre que los restos SSY de las posiciones 104, 105 y 106 de CDR3 de la cadena V_{H} de dicho anticuerpo anti-CD22 sean remplazados por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en THW, YNW, TTW y STY, estando fusionado o conjugado dicho anticuerpo con una marca detectable; y

(b)

detectar la presencia o ausencia de dicha marca,

donde la detección de la presencia de dicha marca indica la presencia de una célula cancerosa CD22+ en dicha muestra.

22. Un método de la reivindicación 21, donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un scFv, un dsFv, un Fab y un F(ab')_{2}.

23. Un kit para detectar la presencia de una célula cancerosa CD22+ en una muestra biológica, comprendiendo dicho kit:

(a)

un recipiente; y

(b)

un anticuerpo anti-CD22 con una cadena ligera variable (V_{L}) que tiene la secuencia de la cadena V_{L} del anticuerpo RFB4 de la Figura 1 y una cadena pesada variable (V_{H}) que tiene la secuencia de la cadena V_{H} del anticuerpo RFB4 de la Figura 1, siempre que los restos 104, 105 y 106 de CDR3 de la cadena V_{H} de dicho anticuerpo anti-CD22 sean remplazados por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en THW, YNW, TTW y STY, cuyo anticuerpo está fusionado o conjugado con una marca detectable.

24. Un kit de la reivindicación 23, donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un scFv, un dsFv, un Fab, y un F(ab')_{2}.

25. Un método de inhibición del crecimiento de una célula cancerosa CD22+ poniendo en contacto dicha célula in vitro con un anticuerpo anti-CD22 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el anticuerpo está fusionado o conjugado con una citotoxina, cuya citotoxina inhibe el crecimiento de dicha célula.

26. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, para su uso en un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa CD22+.